CZ284650B6 - Nové demethoxyderiváty rapamycinu, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje - Google Patents

Abstract

Popisují se nové demethoxyderiváty rapamycinu obecného vzorce I, které mají farmaceutické využití, konkrétně jako imunosupresíva. V obecném vzorci I R.sub.2.n. představuje skupinu obecného vzorce II nebo obecného vzorce III a symboly X, Y, R.sub.1.n., R.sub.2.n., R.sub.3.n., R.sub.4.n. a R.sub.5.n. mají specifický význam. Dále se popisuje způsob přípravy těchto sloučenin a farmaceutický prostředek, který je obsahuje. ŕ

Description

Demethoxyderiváty rapamycinu, farmaceutický prostředek, který je obsahuje, a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká nových demethoxyderivátů rapamycinu, které mají farmaceutické využití, zvláště jako imunosupresíva.

Dosavadní stav techniky

Rapamycin je známé makrolidové antibiotikum produkované baktérií Streptomyces hygroscopicus, které má vyobrazenou strukturu ve vzorci A:

Viz např., McAlpine, J. B., a kol., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S. L., a kol., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; US patent č. 3 929 992. (Existuje množství různých schémat číslování navržených pro rapamycin. Aby se předešlo omylu, tak jména, zde jmenovaných specifických derivátů rapamycinu, jsou uváděna vzhledem k rapamycinu za použití schématu číslování vzorce A.) Rapamycin je extrémně silné imunosupresívum a bylo také prokázáno, že má protinádorovou a antifungální aktivitu. Přesto jeho použití jako farmaka je omezeno jednak velmi nízkou a proměnlivou biologickou dostupností a jednak vysokou toxicitou. Nadto je rapamycin vysoce nerozpustný a je obtížné vytvořit stálé galenické kompozice. Je známa řada derivátů rapamycinu. Některé 16-O-substituované rapamyciny jsou popsané v WO 94/02136, jehož obsah je sem tímto odkazem včleněn. 40-O-substituované rapamyciny jsou popsány např. v US 5 258 389 aWO 94/09010 (O-aryl a O-alkylrapamyciny), WO 92/05179 (estery karboxylových kyselin), US 5 118 677 (amid-estery), US 5 118 678 (karbamáty), US 5 100 883 (fluorované estery), US 5 151 413 (acetaly) a US 5 120 842 (silylethery). 32-O-dihydro nebo -substituovaný rapamycin je popsán např. v US 5 256 790. Další deriváty rapamycinu jsou popsány v US 5 262 423 a US 5 221 670. Nicméně deriváty rapamycinu, popsané ve všech těchto dokumentech, nevykazují znaky charakteristické pro 16-demethoxyderiváty rapamycinu podle vynálezu.

- 1 CZ 284650 B6

Podstata vynálezu

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že některé nové demethoxyderiváty rapamycinu (nové sloučeniny) mají zlepšený farmakologický profil ve srovnání s rapamycinem, vykazují větší stabilitu a biologickou dostupnost, což umožňuje snazší vytvoření galenických kompozic a jsou silnějšími imunosupresívy. Nové sloučeniny zahrnují rapamyciny, kde methoxyskupina (methoxyskupiny) v poloze 16 a/nebo v poloze 39 rapamycinu je deletována a nahrazena vybraným substituentem. Aniž by byl vynález vázán jakoukoliv konkrétní teorií, předpokládá se, že tyto konkrétní methoxyskupiny na rapamycinu jsou terči pro metabolický atak a mohou být nahrazeny konkrétními vybranými substituenty, popřípadě v kombinaci s určitými dalšími modifikacemi v molekule tak, že se zachová aktivita nebo dokonce v některých případech se aktivita zvýší a zároveň se sníží citlivost k metabolickému ataku.

Nové sloučeniny zahrnují zejména rapamyciny (i), kde methoxyskupina v poloze 16 je nahrazena jiným substituentem, výhodně alkinyloxyskupinou (popřípadě hydroxysubstituovanou) a/nebo (ii), kde methoxyskupina v poloze 39 je deletována společně s uhlíkem 39 tak, že cyklohexylový kruh rapamycinu se stane cyklopentylovým kruhem postrádajícím methoxyskupinu v poloze 39 (tj. 39-demethoxy-40-desoxy-39-substituované-42-noaapamyciny, někdy zde zjednodušeně označované jako cyklopentylrapamyciny). Zbytek molekuly je jako u rapamycinu nebo jeho imunosupresivních derivátů a analogů, např. jak jsou popsány výše. Popřípadě je molekula dále modifikována, např. tak, že hydroxyskupina v poloze 40 rapamycinu je alkylována a/nebo je karbonylová skupina v poloze 32 redukována.

Nové sloučeniny odpovídají obecnému vzorci I

kde

Ri představuje alkinylovou nebo hydroxyalkinylovou skupinu,

R₂ je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny obecného vzorce II a obecného vzorce III

-2CZ 284650 B6

(IX) (III)

R₃ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, alkinylové skupiny, arylové skupiny, thioalkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyarylalkylové skupiny, hydroxyarylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylamidoalkylové skupiny, acylamidoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu, alkoxykarbonylalkylové skupiny a alkylsilylové skupiny,

Rj představuje atom vodíku, methylovou skupinu nebo společně s R₃ tvoří alkylenovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku,

R, představuje (i) skupinu R^O-CFL-, kde R_ó je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, alkinylové skupiny, arylové skupiny, aminoskupinu, alkylkarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, pyridylkarbonylovou skupinu, hydroxyalkylkarbonylové skupiny, aminoalkylkarbonylové skupiny, formylovou skupinu, thioalkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyarylalkylové skupiny, hydroxyarylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylamidoalkylové skupiny, acylamidoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu, alkoxykarbonylalkylové skupiny a alkylsilylové skupiny, (ii) skupinu R7CO-, kde R₇ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, hydroxyskupinu, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, amidoskupiny, alkamidoskupiny, zbytky aminokyselin a Ν,Ν-disubstituované amidoskupiny, kde substituenty (a) jsou vybrány ze souboru zahrnujícího alkylové skupiny, arylové skupiny, arylalkylové skupiny a alkylarylové skupiny nebo (b) tvoří morfolinoskupinu nebo piperazinoskupinu, (iii) skupinu RgNCH-, kde R₈ představuje alkylovou skupinu, arylovou skupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, arylaminoskupinu nebo arylsulfonylaminoskupinu, a

X aY jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny zahrnující atom kyslíku, kombinaci vodík a hydroxylová skupina a kombinaci vodík a skupina OR₉, kde R₉ je vybrán ze souboru zahrnujícího alkylové skupiny obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku, alkylkarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, pyridylkarbonylovou skupinu, hydroxyalkylkarbonylové skupiny, aminoalkylkarbonylové skupiny, formylovou skupinu a arylové skupiny, přičemž termín alk- nebo alkyl označuje alkylový substituent obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, který je rozvětvený, lineární nebo cyklický, a popřípadě přerušený oxy-vazbou (-O-), termín acyl” označuje alkylkarbonylovou nebo arylkarbonylovou skupinu, a termín ar- nebo aryl označuje tolylovou, fenylovou nebo benzylovou skupinu.

Výhodné jsou demethoxyderiváty rapamycinu obecného vzorce I, kde

-3 CZ 284650 B6

Ri představuje popřípadě hydroxysubstituovanou alkinylovou skupinu,

R₂ znamená skupinu obecného vzorce II,

R₃ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, hydroxyalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, acylaminoalkylové skupiny a aminoalkylové skupiny,

Rt představuje methylovou skupinu, a

X aY jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny zahrnující atom kyslíku, kombinaci vodík a hydroxylová skupina a kombinaci vodík a alkoxylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž termíny alk nebo alkyl, acyl a aryl mají výše definované významy.

Výhodné jsou dále demethoxyderiváty rapamycinu odpovídající obecnému vzorci la

(la) kde

Ri představuje alkinylovou nebo hydroxyalkinylovou skupinu, přičemž termín alk má výše definovaný význam.

Výhodné jsou též demethoxyderiváty rapamycinu obecného vzorce I, kde symboly R_b X a Y mají významy definované výše, a

R₂ představuje skupinu obecného vzorce II, jak je definována výše, nebo skupinu obecného vzorce III, kde

Rs představuje (i) skupinu RO-CH?-, kde Rý je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, alkinylové skupiny, arylové skupiny, aminoskupinu,

-4 CZ 284650 B6 alkylkarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, pyridylkarbonylovou skupinu, hydroxyalkylkarbonylové skupiny, aminoalkylkarbonylové skupiny, formylovou skupinu, thioalkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyarylalkylové skupiny, hydroxyarylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylamidoalkylové skupiny, acylamidoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu, alkoxykarbonylalkylové skupiny a alkylsilylové skupiny, (ii) skupinu R.₇CO-, kde R7 je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, hydroxyskupinu, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, amidoskupiny, alkamidoskupiny, zbytky aminokyselin a Ν,Ν-disubstituované amidoskupiny, kde substituenty (a) jsou vybrány ze souboru zahrnujícího alkylové skupiny, arylové skupiny, arylalkylové skupiny a alkylarylové skupiny nebo (b) tvoří morfolinoskupinu nebo piperazinoskupinu, (iii) skupinu R_gNCH- kde R₈ představuje alkylovou skupinu, arylovou skupinu nebo aminoskupinu, přičemž termíny alk nebo alkyl, acyl a aryl mají výše definované významy.

Demethoxyderiváty rapamycinu obecného vzorce I také zahrnují (a) 16-O-substituované rapamyciny, kde Ri výhodně představuje alk-2-inylovou skupinu (popřípadě substituovanou hydroxyskupinou), zvláště prop-2-inylovou skupinu, but-2-inylovou skupinu, pent-2-inylovou skupinu nebo 4-hydroxy-but-2-inylovou skupinu; R₂ znamená skupinu obecného vzorce II; R₃ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, hydroxyalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, acylaminoalkylové skupiny a aminoalkylové skupiny; R4 představuje methylovou skupinu, a X a Y jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, kombinaci vodík a hydroxylová skupina a kombinaci vodík a alkoxylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

a nej výhod něj i 16-O-substituované rapamyciny, kde Rj představuje alk-2-inylovou skupinu obsahující 3 až 6 atomů uhlíku (popřípadě substituovanou hydroxyskupinou); R₂ znamená skupinu obecného vzorce II; R₃ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, hydroxyalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny; R4 představuje methylovou skupinu; a X a Y představují atom kyslíku;

(b) 16-O-substituované rapamyciny, kde Rj představuje alkinylovou nebo hydroxyalkinylovou skupinu, R₂ znamená skupinu obecného vzorce II; R₃ představuje atom vodíku; R4 představuje methylovou skupinu; a X a Y představují atom kyslíku; a (c) cyklopentylrapamyciny, kde R₂ znamená skupinu obecného vzorce III, a symboly R_b R₅, X a Y mají výše definované významy.

Mezi zvláště výhodné sloučeniny obecného vzorce I patří:

1. 16-demethoxy-l 6-(pent-2-inyl)oxyrapamycin,

2. 16-demethoxy-l 6-(but-2-inyl)oxyrapamycin,

3. 16-demethoxy-16-(propargyl)oxyrapamycin, a

4. 16-demethoxy-l 6-(4-hydroxybut-2-inyl)oxyrapamycin.

Sloučeniny podle vynálezu se vyrábějí z rapamycinu nebo derivátu rapamycinu obecně následovně:

1. Modifikace na atomu kyslíku v poloze 16 může být vytvořena buďto (i) reakcí rapamycinu, nebo derivátu rapamycinu s oxidem seleničitým a sloučeninou R|—OH za vhodných reakčních podmínek, např. při zvýšených teplotách, kde Ri je definováno výše; nebo výhodně (ii) reakcí

- 5 CZ 284650 B6 rapamycinu nebo derivátu rapamycinu s kyselinou, např. kyselinou p-toluensulfonovou a nukleofilním činidlem, např. R]-OH, při teplotě místnosti ve vhodném aprotickém rozpouštědle, např. dichlormethanu, acetonitrilu nebo tetrahydrofuranu.

2. Pokud požadovanou sloučeninou je sloučenina obecného vzorce I, kde Roje obecného vzorce II aR₃ představuje jiný substituent než atom vodíku, provede se např. O-alkylace hydroxyskupiny na atomu uhlíku v poloze 40 reakcí s organickým zbytkem navázaným na odštěpitelnou skupinu (např. R₃-Z, kde R₃ představuje organický zbytek definovaný výše, např. alkylový, allylový nebo benzylový zbytek, který je požadován jako O-substituent a Z představuje odštěpitelnou skupinu, např. CC1₃C(NH)O nebo CF₃SO₃) za vhodných reakčních podmínek, např. za přítomnosti kyseliny jako je kyselina trifluormethansulfonová, kyselina kafrsulfonová, kyselina p-toluensulfonová nebo jejich pyridiniové nebo substituované pyridiníové soli, pokud Z představuje CC1₃C(NH)O nebo za přítomnosti báze jako je pyridin, substituovaný pyridin, diisopropylethylamin nebo pentamethylpiperidin, pokud Z představuje CF₃SO₃, nebo analogicky k metodám popsaným v US 5 258 389 nebo PCT/EP 93/02604 pro O-alkylaci na atomu uhlíku v poloze 40 rapamycinu.

3. Pokud požadovanou sloučeninou je sloučenina obecného vzorce I, kde R₂ znamená skupinu obecného vzorce III, provede se přeměna cyklohexylového kruhu obecného vzorce II na cyklopentylový kruh obecného vzorce III reakcí s morfolinosulfur-trifluoridem a získá se aldehydová sloučenina (např. kde R5 představuje formylovou skupinu). Takto získaná sloučenina se může pak oxidovat z aldehydu na karboxylovou kyselinu (např. kde R₅ představuje karboxyskupinu) nebo redukovat z aldehydu na alkohol (např. kde R₅ představuje hydroxymethylovou skupinu). Další O-substituce nebo modifikace pro získání dalších sloučenin podle vynálezu se uskutečňuje podle způsobů známých odborníkovi, např. následujícími obecnými postupy: (i) pro získání oxymethylových derivátů se alkohol podrobí reakci analogicky jak bylo popsáno výše pro 40-O-substituci; (ii) pro získání acylových derivátů se karboxylová kyselina podrobí reakci s požadovaným aminem nebo alkoholem za přítomnosti aktivačního nebo kopulačního činidla, např. oxalylchloridu nebo dicyklohexylkarbodiimidu, za vzniku požadovaných amidových respektive esterových sloučenin; a (iii) pro získání iminomethylových nebo dioxymethylinových sloučenin, se aldehydová sloučenina kondenzuje s požadovaným aminem nebo alkylendiolem za kyselých podmínek.

4. Pokud požadovanou sloučeninou je sloučenina obecného vzorce I, kde X představuje jiný substituent než atom kyslíku, 32-O-dihydrosloučenina (kde X představuje kombinaci vodíku a hydroxyskupiny) se připraví O-chráněním hydroxyskupin, např. v polohách 28 a 40 rapamycinu, např. za použití triethylsilyletherových chránících skupin, redukováním chráněné sloučeniny, např. za použití L-selektridu a popřípadě odstraněním chránících skupin např. za mírně kyselých podmínek, analogicky k metodám popsaným v US 5 256 790 pro přípravu 32-0dihydro-rapamycinu z rapamycinu. Jestliže je požadována substituce hydroxyskupiny v poloze 32, 28,40-0, O-chráněná sloučenina se alkyluje, např. jak bylo popsáno výše pro 40-0 alkylaci, acyluje nebo jinak O-substituuje, např. analogicky k metodám popsaným v US 5 256 790.

Výše popsané postupy se mohou uskutečnit v jakémkoliv pořadí, výhodně za použití rapamycinu jako základního počátečního materiálu. Jestliže je to nutné, počáteční materiály a meziprodukty mohou být chráněny (např. O-chráněny jak bylo popsáno v postupu 4) před uskutečněním výše popsané reakce (reakcí) a pak odstraněny chránící skupiny k získání požadovaného konečného produktu.

Nové sloučeniny jsou zejména užitečné pro následující stavy:

a) Léčba a prevence orgánové nebo tkáňové transplantační rejekce, např. pro léčbu příjemců transplantátů např. srdce, plíce, kombinované srdce-plíce, jater, ledviny, slinivky břišní, kůže nebo rohovky; zahrnující léčbu a prevenci akutní rejekce; léčbu a prevenci hyperakutní rejekce

-6CZ 284650 B6 např. související s rejekcí štěpu; a léčbu a prevenci chronické rejekce např. související s onemocněním štěp-céva (graft-vessel disease). Nové sloučeniny jsou také indikovány pro léčbu a prevenci onemocnění štěp versus hostitel (grafit versus host disease), jako je onemocnění následující transplantaci kostní dřeně.

b) Léčba a prevence autoimunních onemocnění a zánětlivých stavů, zejména zánětlivých stavů s etiologií zahrnující autoimunní komponentu jako je artritida (např. revmatoidní artritida, chronická progredující artritida a arthritis deformans) a revmatická onemocnění. Specifická autoimunní onemocnění, pro která sloučeniny podle vynálezu mohou být použity, zahrnují autoimunní hematologické poruchy (včetně např. hemolytické anémie, aplastické anémie, samotné anémie a idiopatické trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondrititidu, sklerodomu, Wegenerovu granulomatózu, dermatomyosititidu, chronickou aktivní hepatitidu, myasthenia gravis, psoriázu, Steven-Johnsonův syndrom, idiopatickou sprue, autoimunní zánětlivé střevní onemocnění (včetně ulcerativní kolitidy a Krohnovy nemoci), endokrinní oftalmopatii, Gravesovu chorobu, sarkoidózu, roztroušenou sklerózu, primární biliámí cirhózu, juvenilní diabetes (diabetes mellitus I typu), uveitidy (přední a zadní), suché keratokonjunktivitidy a jarní keratokonjunkivitidy, intersticiální plicní fíbrózy, psoriatické artritidy, glomerulonefritidy (s nebo bez nefrotického syndromu, např. včetně idiopatického nefrotického syndromu nebo nefropatie minimální výměny _s(minimal change nephropathy)) a juvenilní dermatomyositidy.

c) Léčba a prevence astmatu.

d) Léčba rezistence vůči více léčivům (multi-drug resistance, MDR). Nové sloučeniny potlačují P-glykoproteiny (Pgp), které jsou membránovými transportními molekulami souvisejícími s MDR. MDR je zejména problematická u pacientů s rakovinou a pacientů s AIDS, kteří neodpovídají na konvenční chemoterapii, protože medikace je vypumpována z buněk Pgp. Nové sloučeniny jsou proto užitečné pro zvýšení účinnosti jiných chemoterapeutických činidel v léčbě a kontrole chorob rezistentních vůči více léčivům jako je rakovina rezistentní vůči více léčivům nebo AIDS rezistentní vůči více léčivům.

e) Léčba proliferativních poruch, např. nádorů, hyperproliferativní kožní poruchy, aj.

f) Léčba plísňových infekcí.

g) Léčba a prevence zánětu, zvláště v umocnění činnosti steroidů.

h) Léčba a prevence infekce, zvláště infekce patogeny, které mají potenciátor infektivity makrofágů (Mip) nebo Mipu podobné faktory.

Vynález tedy zahrnuje zde popsané nové sloučeniny pro použití jako nové meziprodukty nebo jako léčiva, způsoby léčby a prevence výše zmíněných poruch podáním účinného množství nové sloučeniny pacientovi, který to potřebuje, použití nové sloučeniny ve výrobě léků pro léčbu nebo prevenci výše zmíněných poruch a farmaceutických prostředků obsahujících novou sloučeninu v kombinaci nebo ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

Nové sloučeniny se používají podáním farmaceuticky účinné dávky ve farmaceuticky přijatelné formě pacientovi, který potřebuje léčbu. Příslušné dávky nových sloučenin budou samozřejmě různé, např. závisející na onemocnění, které má být léčeno (např. na typu onemocnění nebo povaze rezistence), na požadovaném účinku a způsobu podání.

Obecně se však uspokojivých výsledků dosáhne orálním podáním dávek řádově od 0,05 do 5 nebo až do 10 mg/kg/den, např. řádově od 0,1 do 2 nebo až do 7,5 mg/kg/den, které byly podány najednou nebo v rozdělených dávkách 2 až 4x denně, nebo parenterálním podáním, např.

-7CZ 284650 B6 nitrožilně, např. infuzí, dávek řádově od 0,01 do 2,5 až do 5 mg/kg/den, např. řádově od 0,05 nebo 0,1 až do 1,0 mg/kg/den. Vhodné denní dávky pro pacienty jsou tedy řádově 500 mg perorálně, např. řádově od 5 do 100 mg perorálně, nebo řádově od 0,5 do 125 až do 250 mg nitrožilně, např. řádově od 2,5 do 50 mg nitrožilně.

Alternativně a dokonce výhodně se dávkování provádí podle konkrétního pacienta, pro dosažení předem stanovených krevních hladin, jak se stanoví např. pomocí RIA techniky. Takto může být dávkování pacientovi upraveno pro dosažení pravidelných trvalých krevních hladin, měřených pomocí RIA techniky od 50 nebo 150 až do 500 nebo 1000 ng/ml, tj. analogicky k metodám dávkování v současné době používaným pro imunosupresivní terapii Ciclosporinem.

Nové sloučeniny mohou být podány jako jediná účinná složka nebo společně s dalšími léky. Např. v imunosupresivních aplikacích jako je prevence a léčba onemocnění štěp versus hostitel, transplantační rejekce nebo autoimunního onemocnění, nové sloučeniny mohou být použity v kombinaci s cyklosporiny nebo askomyciny nebo jejich imunosupresivními analogy, např. cyklosporinem A, cyklosporinem G, FK-506 atd.; kortikosteroidy: cyklofosfamidem; azathioprenem; methotrexátem; breguinarem; leflunomidem; mizoribinem; imunosupresivními monoklonálními protilátkami, např. monoklonálními protilátkami na leukocytámí receptory, např. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, CTLA4, B7, CD45 nebo CD58 nebo jejich ligandy; nebo jinými imunomodulačními sloučeninami. Pro imunosupresivní aplikace, např. léčbu a prevenci orgánových nebo tkáňových transplantačních rejekcí, je nejvýhodnější kombinace s IL-2 transkripčními inhibitory jako jsou imunosupresivní cyklosporiny (např. cyklosporin A) a askomyciny (např. FK-506). Pro protizánětlivé aplikace, nové sloučeniny mohou být použity rovněž společně s protizánětlivými činidly, např. kortikosteroidy. Pro protiinfekční aplikace mohou být nové sloučeniny použity v kombinaci s jinými protiinfekčními činidly, např. antivirovými léky nebo antibiotiky.

Nové sloučeniny se podávají jakýmikoliv konvenčními cestami, zejména enterálně, např. orálně, např. ve formě roztoků k pití, tablet nebo kapslí nebo parenterálně, např. ve formě injekčních roztoků nebo suspenzí. Vhodné jednotkové dávkovači formy pro orální podání obsahují např. od 1 do 50 mg sloučeniny podle vynálezu, obvykle 1 až 10 mg. Farmaceutické prostředky obsahující nové sloučeniny se mohou připravit analogicky k farmaceutickým prostředkům obsahujícím rapamycin, např. jak bylo popsáno v EPA 0 041 795, což je odborníkovi zřejmé.

Farmakologické aktivity nových sloučenin jsou demonstrovány na např. následujících testech:

1. Směsná lymfocytámí reakce (mixed lymphocyte reaction, MLR)

Směsná lymfocytámí reakce byla původně vyvinuta v souvislosti s allogeními štěpy ke stanovení tkáňové kompatibility mezi potenciálními orgánovými dárci a příjemci a je jedním z nejužívanějších modelů imunní reakce in vitro. Myší model MLR, např. jak popsal T. Meo v Immunological Methods, L. Lefkovits aB. Peris, Eds., Academie Press, N. Y. str. 227-239 (1979), se používá k demonstraci imunosupresivního účinku nových sloučenin. Buňky sleziny (0,5 x 10⁶) z Balb/c myši (samička, 8-10 týdnů) se inkubují po dobu 5 dnů společně s 0,5 x 10⁶ ozářenými (2000 rad) nebo mitomycinem C ošetřenými buňkami sleziny z myši CBA (samička, 8-10 týdnů). Ozářené allogenní buňky vyvolají proliferativní odpověď v slezinných buňkách Balb/c, což se může změřit začleněním značeného prekurzoru do DNA. Jelikož stimulátorové buňky jsou ozářeny (nebo ošetřeny mitomycinem C) neodpovídají na buňky Balb/c proliferací, ale zachovávají si svoji antigenicitu. Antiproliferativní účinek nových sloučenin na buňky Balb/c se měří v různých ředěních a vypočítá se koncentrace, která způsobuje 50% inhibici buněčné proliferace (IC₅₀). Všechny nové sloučeniny uvedené v příkladech jsou v tomto testu aktivní. Zejména účinnými imunosupresívy jsou alkinylové deriváty z příkladů, které vykazují v tomto testu IC₅₀ v porovnání s rapamycinem 0,3 - 0,8, tj. jsou až 3x více aktivní než rapamycin.

-8CZ 284650 B6

2. IL-6 zprostředkovaná proliferace

Kapacita nových sloučenin narušovat signální dráhy související s růstovým faktorem, se stanoví pomocí myší hybridomatické buněčné linie závislé na interleukinu-6 (IL-6). Zkouška se uskuteční v mikrotitračních deskách s 96 jamkami. 5000 buněk/jamku se kultivuje v médiu bez séra (jak popsali Μ. H. Schreier a R. Tees v Immunological Methods, I. Lefkovits a B. Pemis, eds., Academie Press 1981, Sv. II, str. 263-275), doplněném 1 ng rekombinantního IL-6/ml. Následovala 66 hodin trvající inkubace za nepřítomnosti nebo přítomnosti testovaného vzorku, na buňky se působí 1 uCi (3-H)-thymidinu/jamku po dalších 6 hodin, provede se sklizeň kultury a buňky se spočítají pomocí scintilace v kapalině. Začlenění (3-H)-thymidinu do DNA koreluje se vzestupem počtu buněk a je takto měřítkem buněčné proliferace. Série ředění testovaného vzorku umožňuje počítání koncentrace vyvolávající 50% inhibici buněčné proliferace (IC50). Všechny nové sloučeniny uvedené v příkladech jsou v tomto testu aktivní. Zejména účinnými imunosupresívy jsou alkinylové deriváty z příkladů, které vykazují v tomto testu IC50 v porovnání s rapamycinem 0,2 - 0,9, tj. jsou až 5x více aktivní než rapamycin.

3. Test vazby na makrofilin

Rapamycin a strukturálně příbuzné imunosupresívum, FK-506, jsou známé tím, že se váží in vivo na makrofilin-12 (také známý jako FK-506 vázající protein nebo FKBP-12), a má se za to, že tato vazba souvisí s imunosupresivní aktivitou těchto sloučenin. Nové sloučeniny se také pevně váží na makrofilin-12, jak se demonstruje v kompetitivním vazebném testu. V tomto testu se FK506 navázaná na albumin hovězího séra použije na potažení mikrotitračních jamek. Biotinylovanému rekombinantnímu lidskému makrofilinu-12 (biot-MAP) se umožní se vázat za přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaného vzorku k imobilizovanému FK-506. Po promytí (aby se odstranil nespecificky vázaný makrofilin), se navázaný biot-MAP stanoví pomocí inkubace s konjugátem streptavidin-alkalická fosfatáza, s následným promytím a následujícím přidáním p-nitrofenyl-fosfátu jako substrátu. Měřenou hodnotou je optická hustota při 405 nm. Vazba testovaného vzorku na biot-MAP vede ke snížení množství biot-MAP vázaného na FK-506 a tudíž ke snížení optické hustoty při 405 nm. Série ředění testovaného vzorku umožňuje stanovení koncentrace, která způsobuje 50% inhibici vazby biot-MAP na imobilizovaný FK-506 (IC50). Všechny nové sloučeniny uvedené v příkladech vykazují v tomto testu dobrou vazbu na FKBP.

4. Lokalizovaná reakce štěp versus hostitel (graft versus host reaction)

Účinnost nových sloučenin in vivo se demonstruje na vhodném živočišném modelu, jak popsali např. Ford a kol., Transplantation 10 (1970), 258. Buňky sleziny (1 χ 10⁷) z 6 týdnů starých samiček krys Wistar/Furth se injikují subkutánně ve dni 0 do levé zadní tlapy samiček krys (F344 x WF) F[ o hmotnosti asi 100 g. Zvířata se léčí po dobu 4 následujících dní a podkolenní lymfatické uzliny se odstraní a zváží 7. den. Rozdíl v hmotnosti mezi dvěmi lymfatickými uzlinami se bere jako parametr pro ohodnocení reakce.

5. Ledvinová alloštěpová reakce u krysy

Jedna ledvina ze samičky krysy fisher 344 se transplantuje na renální cévu jednostranně (levá strana) nefrektomizovaného WF krysího příjemce za použití anastomózy end-to-end. Anastomóza močovodu je také end-to-end. Léčba se započne v den transplantace a pokračuje po dobu 14 dnů. Druhostranná nefrektomie se provede sedmý den po transplantaci, čímž je příjemce závislý na činnosti darované ledviny. Příjemci štěpů, kteří přežili, se berou jako parametr pro funkční štěp.

-9CZ 284650 B6

6. Experimentálně vyvolaná alergická encefalomyelitida (EAE) u krys

Účinnost nových sloučenin v EAE se měří, např. postupem popsaným Levine & Wenk, Amer. J. Path 47 (1965) 61; McFarlin a kol., J. Immunol. 113 (1974) 712; Borel Transplant & Clin.

Immunol. 13 (1981) 3. EAE je široce akceptovaný model pro roztroušenou sklerózu. Samečci krys Wistar se injikují do zadní tlapy směsí hovězí míchy a kompletního Freundova adjuvans. Symptomy nemoci (paralýza ocasu a obou zadních končetin) se obvykle projeví během 16 dnů. Zaznamená se počet onemocnělých zvířat jakož i čas nástupu nemoci.

io 7. Freundova adjuvantní artritida (Freund s Adjuvant Arthritis)

Účinnost proti experimentálně vyvolané artritidě se demonstruje postupem popsaným např. Winter & Nuss, Arthritis & Rheumatism 9 (1966) 394; Billingham & Davies, Handbook of Experimental Pharmacol (Vane & Ferreira Eds, Springer-Verlag Berlin) 50/II (1979) 108-144.

Krysy OFA a Wistar (samci nebo samičky, 150 g tělesné hmotnosti) se injikují intrakutánně ke kořeni ocasu nebo do zadní tlapy 0,1 ml minerálního oleje obsahujícího 0,6 mg lyofilizovaného tepelné usmrceného Mycobacterium smegmatis. V modelu rozvíjející se artritidy se léčba začne bezprostředně po injekci adjuvans (dny 1-18); v modelu rozvinuté artritidy se léčba začíná 14. den, když je sekundární zánět dobře vyvinut (dny 14-20). Na konci experimentu se měří zduření kloubů pomocí mikrokaliperu. ED₅o je orální dávka v mg/kg, která redukuje zduření (primární nebo sekundární) na polovinu ve srovnání s kontrolami.

8. Protinádorová a MDR aktivita

Protinádorová aktivita nových sloučenin ajejich schopnost zvýšit činnost protinádorových činidel zmenšením rezistence vůči více léčivům se demonstruje např. podáním protirakovinného činidla, např. kolchicinu nebo etoposidu, buňkám rezistentním vůči více léčivům a buňkám citlivým na léčivo in vitro nebo zvířatům s nádory nebo infekcemi, které jsou rezistentní vůči více léčivům nebo citlivé na léčiva, s nebo bez současného podání nových sloučenin, které jsou testovány a podáním nové sloučeniny samotné. Takové testování in vitro se provádí za použití vhodné buněčné linie rezistentní vůči léčivům a kontrolní buněčné linie (rodičovské), vytvořené, např. jak popsali Ling a kol., J. Cell. Physiol. 83, 103-116 (1974) a Bech-Hansen a kol., J. Cell. Physiol. 88, 23-32 (1976). Konkrétními vybranými klony jsou linie CHR rezistentní vůči více léčivům (např. rezistentní na kolchicin) (subklon C5S3.2) a rodičovská senzistivní linie AUX B1 (subklon AB1 Sil). In vivo protinádorová a proti-MDR aktivita se prokáže např. u myši, které byly injikovány rakovinné buňky rezistentní vůči více léčivům a rakovinné buňky senzitivní na léčivo. Sublinie Ehrlichova rakovinného ascites (EA) (Ehrlich ascites carcinoma) rezistentní na lékové substance DR, VC, AM, ET, TE nebo CC se vyvinou postupným přenosem buněk EA na další generace myši BALB/c sloužící jako hostitel podle metod popsaných Slater a kol., J. Clin.

Invest, 70 1131 (1982). Ekvivalentní výsledky se mohou získat za použití nových sloučenin v testovacích modelech srovnatelného typu, např. in vitro nebo za použití testovacích zvířat infikovaných virovými kmeny rezistentními vůči více léčivům nebo virovými kmeny senzitivními na léčiva, bakteriálními kmeny rezistentními a senzitivními na antibiotika (např. penicilín), fungálními kmeny rezistentními a senzitivními na antimykotika jakož i protozoální kmeny rezistentními na léčiva, např. kmeny Plasmodial, např. v přírodě se vyskytujícími subkmeny Plasmodium falciparum vykazujícími získanou chemoterapeutickou, antimalarickou rezistenci vůči lékům.

9. Steroidní potenciace

Aktivita nových sloučenin při vazbě makrofilinu rovněž způsobuje, že jsou vhodné pro zvýšení nebo potenciaci činnosti kortikosteroidů. Kombinovaná léčba sloučeninami podle vynálezu a kortikosteroidy, jako je dexamethazon, má za následek velmi zesílenou steroidální aktivitu. Toto může být prokázáno např. v testu s reportérovým genem chloramfenikol-acetyltransferázy

-10 CZ 284650 B6 myšího viru nádoru mléčné žlázy (murine mammary tumor virus-chloramphenicol acetyltransferase; MMTV-CAT), např. jak popsali Ning a kol,. J. Biol. Chem. (1993) 268: 6073. Tento synergický účinek umožňuje používat snížené dávky kortikosteroidů, čímž se v některých případech snižuje riziko vedlejších účinků.

10. Inhibice Mip a Mipu podobného faktoru

Dále nové sloučeniny vážou a blokují řadu faktorů Mip (potenciátor infektivity makrofágů, macrophage infectivity potentiator) a Mipu podobných faktorů, které jsou strukturálně podobné makrofilinu. Mip a Mipu podobné faktory jsou virulentní faktory produkované řadou patogenů, včetně patogenů rodu Chlamidia, např. Chlamidia trachomatis, Neisseria, např. Neisseria meningitidis; a Legionella, např. Legionnela pneumophilia; a také obligátně parazitickými členy řádu Rickettsiales. Tyto faktory hrají klíčovou roli ve stanovení nitrobuněčné infekce. Účinnost nových sloučenin ve snížení infekčnosti patogenů, které produkují Mip nebo Mipu podobné faktory může být prokázána srovnáním infekčnosti patogenů v buněčné kultuře za přítomnosti a nepřítomnosti makrolidů, např. pomocí metod popsaných Lundemose a kol., Mol. Microbiol. (1993)7: 777.

Nové sloučeniny jsou také užitečné v testech pro stanovení přítomnosti nebo množství makrofilin vázajících sloučenin, např. v kompetitivních testech pro diagnostické účely nebo pro účely vyhledávacích testů. V dalším provedení tedy vynález zahrnuje použití nových sloučenin jako nástroje pro vyhledávací testy ke stanovení přítomnosti makrofilin vázajících sloučenin v testovaném roztoku, např. krvi, krevním séru nebo testovaném vývaru. Výhodně je nová sloučenina imobilizována v mikrotitračních jamkách a pak se nechá navázat na značený makrofilin-12 (FKBP-12) za přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaného roztoku. Alternativně se FKBP-12 imobilizuje v mikrotitračních jamkách a nechá se vázat za přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaného roztoku na novou sloučeninu, která byla označena, např. fluorem, enzymaticky nebo radiooznačena, např. novou sloučeninu obecného vzorce I, kde Ri obsahuje značící skupinu. Desky se promyjí a změří se množství vázané značené sloučeniny. Množství makrofilin vázající látky v testovaném roztoku je zhruba nepřímo úměrný k množství vázané značené sloučeniny. Pro kvantitativní analýzu se vytvoří standardní vazebná křivka pomocí známých koncentrací makrofilin vázající sloučeniny.

Následující příklady jsou určeny k ilustraci vynálezu, v žádném směru ho však neomezují. Charakteristické spektroskopické údaje jsou uvedeny pro usnadnění identifikace sloučenin.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

16-demethoxy-l 6-(pent-2-inyl)oxy-rapamycin

K roztoku 0,6 ml 2-pentin-l-olu v 5 ml dichlormethanu se přidá 456 mg rapamycinu a následně 5 mg kyseliny p-toluensulfonové. Směs se míchá po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Pak se k reakční směsi přilije 7 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se oddělí a extrahuje 2x 10 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 3 : 2 jako elučního činidla. Surový produkt se nakonec vyčistí preparativní kapalinovou chromatografii s vysokou rozlišovací schopností (HPLC) (RP-18, 250 x 10 mm, eluční činidlo: methanol: voda v poměru 80 : 20, průtok 3 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 972 (M+Li)

- 11 CZ 284650 B6

H-NMR (deuterochloroform) (hlavní izomer) delta: 0,67 (1H, q); 1,13 (3H, t); 1,67 (3H, s); 1,74 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,40 (3H, s); 3,73 (1H, d); 3,77 (1H, dm); 4,01 (1H, dm); 4,16 (1H, d); 4,66 (1H, s).

Příklad 2

16-demethoxy-l 6-(but-2-inyl)oxyrapamycin

K roztoku 0,4 ml 2-butin-l-olu ve 3 ml CH₂C1₂ se přidá 251 mg rapamycinu a následně 4 mg kyseliny p-toluensulfonové. Směs se míchá po dobu 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se k reakční směsi přilije 7 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se oddělí a extrahuje 2x 10 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 3 : 2 jako elučního činidla. Surový produkt se nakonec vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250 x 10 mm, eluční činidlo: methanol : voda v poměru 80 : 20, průtok 3 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 958 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) (hlavní izomer) delta: 0,67 (1H, q); 1,67 (3H, s); 1,74 (3H, s); 1,83 (1H, široké s); 3,33 (3H, s); 3,40 (3H, s); 3,72 (1H, d); 3,75 (lH,dm); 4,01 (1H, dm); 4,16 (1H, d); 4,73 (1H, s).

Příklad 3

16-demethoxy-l 6-(propargyl)oxyrapamycin

K roztoku 0,3 ml propargylalkoholu v 3 ml dichlormethanu se přidá 251 mg rapamycinu a následně 4 mg kyseliny p-toluensulfonové. Směs se míchá po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Pak se k reakční směsi přilije 7 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se oddělí a extrahuje 2x 10 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 3 : 2 jako elučního činidla. Surový produkt se nakonec vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250x 10 mm, eluční činidlo: methanol: voda v poměru 80 : 20, průtok 3 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 944 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) (hlavní izomer) delta: 0,68 (1H, q); 1,66 (3H, s); 1,74 (3H, s); 2,32 (1H, široké t); 3,34 (3H, s); 3,41 (3H, s); 3,67 (lH,d); 3,83 (1H, dm); 4,08 (lH,dm); 4,16 (1H, d); 4,84 (1H, s).

Příklad 4

16-demethoxy-l 6-(4-hydroxy-but-2-inyl)oxyrapamycin

K. suspenzi 940 mg 2-butin-l,4-diolu v 6 ml dichlormethanu se přidá 502 mg rapamycinu a následně 5 mg kyseliny p-toluensulfonové. Směs se míchá po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Pak se k reakční směsi přilije 10 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se oddělí a2x extrahuje 10 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají,

- 12 CZ 284650 B6 vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 4 : 1 jako elučního činidla. Surový produkt se nakonec vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250x25 mm, eluční činidlo: methanol: voda v poměru 75 : 25, průtok 7 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 974 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) (hlavní izomer) delta: 0,67 (1H, q); 1,67 (3H, s); 1,75 (3H, s); 3,33 (3H,s); 3,41 (3H, s); 3,73 (lH,d); 3,81 (lH,dm); 4,08 (lH,dm); 4,17 (lH,d); 4,28 (2 H, široké s); 4,67 (1H, s).

Příklad 5

16-demethoxy-l 6-benzyloxy-40-O-(2-hydroxyethyl)rapamycin

K roztoku 0,6 ml benzylalkoholu v 3 ml dichlormethanu se přidá 264 mg 40-O-(2-hydroxyethyl)rapamycinu (připraveného jak je popsáno v WO 94/09010) a následně 5 mg kyseliny p-toluensulfonové. Směs se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pak se k reakční směsi přilije 7 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se oddělí a 2x extrahuje 10 ml diethyletheru. Organické fáze se smíchají, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi ethylhexanu a acetonu v poměru 4:1a následně směsi hexanu a acetonu v poměru 1 : 1 jako elučního činidla. Surový produkt se nakonec vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250x25 mm, eluční činidlo: acetonitril : voda v poměru 75 : 25, průtok 8 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 1040 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) (hlavní izomer) delta: 0,72 (1H, q); 1,73 (6 H, s); 3,32 (3H, s); 3,43 (3H, s); 3,7 (4 H, m); 4,15 (1H, d); 4,18 (1H, d); 4,47 (1H, d); 4,80 (1H, s); 7,3 (5 H, m).

Příklad 6

16-demethoxy-l 6-benzyloxyrapamycin mmol rapamycinu se rozpustí v 50 ml methylenchloridu obsahujícího 3 ml benzylalkoholu. Přidá se 0,1 mmol kyseliny p-toluensulfonové a reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 2-10 hodin. Pak se reakční směs nalije do nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Oddělí se organická vrstva, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Surový produkt se nakonec vyčistí pomocí HPLC, čímž se získá čistá sloučenina uvedená v názvu ve formě bílého prášku.

Příklad 7

16-demethoxy-16-(ortho-methoxybenzyl)oxyrapamyc in

K roztoku 0,76 g ortho-methoxybenzylalkoholu v 3 ml dichlormethanu se přidá 250 mg rapamycinu a následně 5 mg kyseliny p-toluensulfonové. Směs se míchá po dobu 8 hodin při teplotě místnosti a k reakční směsi se přilije 5 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se 2x extrahuje 10 ml etheru. Smíchaný organický roztok se vysuší nad síranem sodným, zfiltruje a zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se chromatografuje na silikagelu pomocí směsi hexanu a acetonu v poměru 4 : 1 až 3 : 2

- 13 CZ 284650 B6 jako elučního činidla. Výsledný produkt se dále vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250 x 25 mm, eluční činidlo: acetonitril: voda v poměru 75 : 25, průtok 8 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 1026 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) (hlavní izomer) delta: O,67(1H, q); 1,73 a 1,74 (6H,2s); 3,33 (3H, s); 3,41 (3H, s); 3,72 (1H, d); 3,81 (3H, s); 4,18 (1H, široké d); 4,26 (1H, d); 4,45 (1H, d); 4,72 (1H, široké s); 6,83 (1H, d); 6,92 (1H, m); 7,23 (1H, m); 7,32 (1H, m).

Příklad 8

16-demethoxy-40-O-(2-methoxyethyl)-l 6-(pent-2-inyl)oxyrapamycin

K roztoku 0,7 ml 2-pentin-l-olu v 5 ml dichlormethanu se přidá 486 mg 40-O-(2-methoxyethyl)rapamycinu a následně 5 mg kyseliny p-toluensulfonové. Směs se míchá po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Pak se k reakční směsi přilije 7 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se oddělí a 2x extrahuje 10 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 1 : 1 jako elučního činidla. Surový produkt se nakonec vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250x25 mm, eluční činidlo: methanol: voda v poměru 83 : 17, průtok 7 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 1030 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) (hlavní izomer) delta: 0,72 (1H, q); 1,14 (3H, t); 1,67 (3H, s); 1,74 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,38 (3H, s); 3,45 (3H, s); 3,73 (1H, d); 3,77 (1H, dm); 4,01 (1H, dm); 4,17 (1H, dm); 4,65 (1H, s).

Příklad 9

39-demethoxy-40-desoxy-39-formyl—42-nor-rapamycin

K roztoku 1,85 g rapamcinu v 40 ml acetonitrilu při teplotě -30 °C se přidá 365 μΙ morfolinosulfur-trifluoridu. Reakční směs se udržuje po dobu 1 hodiny při teplotě -30 °C a po dobu další 1 hodiny při teplotě 0 °C a pak se k reakční směsi přilije nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze se 3x extrahuje 30 ml ethylacetátu a organické fáze se smíchají a vysuší se nad síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla se surový produkt vyčistí sloupcovou chromatografii na silikagelu za použití směsi hexanu a acetonu v poměru 4 : 1 jako elučního činidla.

Hmotová spektrometrie (FAB, matrice Lil): 888 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform): 3,13 (s, 3H); 3,34 (s, 3H); 9,62 (d, 1H); bez dalších singletů mezi 3,0 a 3,6 ppm. Bez signálu mezi 0,6 a 0,85 ppm.

- 14CZ 284650 B6

Příklad 10

39-demethoxy-40-desoxy-39-hydroxymethyl—42-nor-rapamycin

Na roztok 44 mg 39-demethoxy—40-desoxy-39-formyl-42-nor-rapamycinu v 1,2 ml směsi tetrahydrofuranu a vody v poměru 5 : 1 se působí 1,5 mg terč, butylamin-boranového komplexu po dobu 2 hodin při teplotě 0 °C. Pak se reakční směs nalije do 2 ml 0,lN kyseliny chlorovodíkové a3x extrahuje 5 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají, promyjí se 2 ml nasyceného roztoku bikarbonátu sodného a vysuší se nad síranem sodným. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a surový produkt se vyčistí sloupcovou chromatografii na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 1 : 1 jako elučního činidla.

Hmotová spektrometrie (FAB, matrice Lil): 890 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform): 3,13 (s,3H); 3,33 (s, 3H); 4,18 (m, 2H). Bez signálu mezi 0,5 a 0,85 ppm. Bez aldehydového protonu v 9,62 ppm.

Příklad 11

39-demethoxy-40-desoxy-39-karboxy-42-nor-rapamycin

Roztok 85 mg NaOCl a 113 mg dihydrogenfosforečnanu sodného v 2 ml vody se přidá k roztoku 111 mg 39-demethoxy-40-desoxy-39-formyl—42-nor-rapamycinu a 0,2 ml 2-methyl-2-butenu v 4-ml terc.butanolu. Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Rozpouštědla se pak odpaří a zbytek se 3x extrahuje 5 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají, vysuší se nad bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Produkt se vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250 x 10 mm, eluční činidlo: acetonitril: voda v poměru 60 : 40, průtok 3 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB, matrice Lil): 904 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform): 1,65 (s, 3H); 1,78 (s, 3H); 3,13 (s, 3H); 3,33 (s, 3H); 3,75 (d, 1H); 4,18 (d, 1H). Bez signálu pod 0,85 ppm. Žádné další singlety v oblasti 3,0-3,6 ppm.

Příklad 12

39-demethoxy-40-desoxy-39-(4-methylpiperazin-l-yl)karbonyl^l2-nor-rapamycin

K míchanému roztoku 180 mg 39-karboxy-39-demethoxy-40-desoxy-42-nor-rapamycinu v 4 ml tetrahydrofuranu při teplotě -75 °C se přidá 0,08 ml pyridinu a následně 0,04 ml oxalylchloridu. Reakční směs se udržuje při teplotě -75 °C po dobu 30 minut a poté se přidá 0,09 ml N-methylpiperazinu. Reakční směs se míchá po dobu další hodiny a pak se do ní přilije 5 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 5 ml ethylacetátu. Vodná fáze se oddělí a 2x extrahuje 5 ml ethylacetátu. Organické fáze se smíchají, vysuší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Surový produkt se vyčistí preparativní HPLC (RP-18, 250 x 10 mm, eluční činidlo: methanol: voda v poměru 85 : 15, průtok 3 ml/min).

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 986 (M+Li)

- 15 CZ 284650 B6

H-NMR (deuterochloroform) delta: 1,65 (3H, s); 1,78 (3H, s); 2,31 (3H, s); 2,4 (4H, m); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,79 (1H, d); 4,21 (1H, d); 4,68 (1H, široké s).

Příklad 13

39-demethoxy-40-desoxy-39-(morfolin-4-yl)karbonyl^l2-nor-rapamycin

Tato sloučenina se získá způsobem z příkladu 11 za použití morfolinu místo N-methylpiperazinu.

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 973 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) delta: 1,65 (3H, s); 1,77 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,6 (4H, m); 3,77 (1H, d); 4,19 (1H, d); 4,66 (1H, široké s).

Příklad 14

39-demethoxy-40-desoxy-39-(N-methyl,N-(2-pyridin-2-yl-ethyl))karbamoyl-42-norrapamycin

Tato sloučenina se získá způsobem z příkladu 11 za použití (2-pyridin-2-yl-ethyl)methylaminu místo N-methylpiperazinu.

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 1022 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) delta: 1,66 (3H, s); 1,78 (3H, s); 2,93 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 4,23 (1H, m); 4,67 (1H, s); 7,1 (2H, m); 7,6 (1H, m); 8,51 (1H, d).

Příklad 15

39-demethoxy-40-desoxy-39-(p-toluensulfonylhydrazonomethyl)-42-nor-rapamycin

Ke směsi 523 mg 39-demethoxy-40-desoxy-39-formyM2-nor-rapamycinu v 10 ml acetonitrilu se přidá 156 mg p-toluensulfonylhydrazidu. Reakční směs se míchá po dobu 30 minut při teplotě místnosti a pak se rozpouštědlo odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi hexanu a acetonu v poměru 5 : 1 jako elučního činidla, čímž se získá sloučenina uvedená v názvu.

Hmotová spektrometrie (FAB): m/z 1056 (M+Li)

H-NMR (deuterochloroform) delta: 1,64 (3H, s); 1,76 (3H, s); 2,43 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,79 (1H, d); 4,18 (1H, d); 4,69 (1H, široké s); 7,13 (1H, d); 7,32 (2H, d); 7,56 (1H, s); 7,80 (2H, d).

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Demethoxyderivát rapamycinu obecného vzorce I (I) kde

   Ri představuje alkinylovou nebo hydroxyalkinylovou skupinu,

   R₂ je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny obecného vzorce II a obecného vzorce III (II) (III) kde

   R₃ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, alkinylové skupiny, arylové skupiny, thioalkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyarylalkylové skupiny, hydroxyarylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylamidoalkylové skupiny, acylamidoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu, alkoxykarbonylalkylové skupiny a alkylsilylové skupiny,

   R4 představuje atom vodíku, methylovou skupinu nebo společně s R₃ tvoří alkylenovou skupinu obsahující 2 až 6 atomů uhlíku,

   - 17CZ 284650 B6

   R₅ představuje (i) skupinu R^O-CLf-, kde Reje vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, alkinylové skupiny, arylové skupiny, aminoskupinu, alkylkarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, pyridylkarbonylovou skupinu, hydroxyalkylkarbonylové skupiny, aminoalkylkarbonylové skupiny, formylovou skupinu, thioalkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyarylalkylové skupiny, hydroxyarylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylamidoalkylové skupiny, acylamidoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu, alkoxykarbonylalkylové skupiny a alkylsilylové skupiny, (ii) skupinu R₇CO, kde R₇ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, hydroxyskupinu, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, amidoskupiny, alkamidoskupiny, zbytky aminokyselin aN,N-disubstituované amidoskupiny, kde substituenty (a) jsou vybrány ze souboru zahrnujícího alkylové skupiny, arylové skupiny, arylalkylové skupiny a alkylarylové skupiny nebo (b) tvoří morfolinoskupinu nebo piperazinoskupinu, (iii) skupinu R₈NCH-, kde R₈ představuje alkylovou skupinu, arylovou skupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, arylaminoskupinu nebo arylsulfonylaminoskupinu, a

   X a Y jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny zahrnující atom kyslíku, kombinaci vodík a hydroxylová skupina a kombinaci vodík a skupina OR₉, kde R₉ je vybrán ze souboru zahrnujícího alkylové skupiny obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku, alkylkarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, pyridylkarbonylovou skupinu, hydroxyalkylkarbonylové skupiny, aminoalkylkarbonylové skupiny, formylovou skupinu a arylové skupiny, přičemž termín alk- nebo alkyl označuje alkylový substituent obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, který je rozvětvený, lineární nebo cyklický, a popřípadě přerušený oxy-vazbou (-O-), termín acyl označuje alkylkarbonylovou nebo arylkarbonylovou skupinu, a termín ar- nebo aryl označuje tolylovou, fenylovou nebo benzylovou skupinu.
2. 2. Demethoxyderivát rapamycinu obecného vzorce I podle nároku 1, kde

   Ri představuje popřípadě hydroxysubstituovanou alkinylovou skupinu,

   R₂ znamená skupinu obecného vzorce II,

   R₃ je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, hydroxyalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, acylaminoalkylové skupiny a aminoalkylové skupiny,

   R4 představuje methylovou skupinu, a

   X aY jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny zahrnující atom kyslíku, kombinaci vodík a hydroxylová skupina a kombinaci vodík a alkoxylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž termíny alk nebo alkyl, acyl a aryl mají významy definované v nároku 1.

   - 18CZ 284650 B6
3. 3. Demethoxyderivát rapamycinu podle nároku 1 odpovídající obecnému vzorci Ia (Ia) kde

   Ri představuje alkinylovou nebo hydroxyalkinylovou skupinu, přičemž termín alk má význam definovaný v nároku 1.
4. 4. Demethoxyderivát rapamycinu obecného vzorce I podle nároku 1, kde symboly R_b X a Y mají významy definované v nároku 1, a

   R₂ představuje skupinu obecného vzorce II definovanou v nároku 1 nebo skupinu obecného vzorce III kde

   R₅ představuje (i) skupinu RéO-CH₂-, kde Rs je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, alkinylové skupiny, arylové skupiny, aminoskupinu, alkylkarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, pyridylkarbonylovou skupinu, hydroxyalkylkarbonylové skupiny, aminoalkylkarbonylové skupiny, formylovou skupinu, thioalkylové skupiny, arylalkylové skupiny, hydroxyarylalkylové skupiny, hydroxyarylové skupiny, hydroxyalkylové skupiny, dihydroxyalkylové skupiny, hydroxyalkoxyalkylové skupiny, hydroxyalkylarylalkylové skupiny, dihydroxyalkylarylalkylové skupiny, alkoxyalkylové skupiny, acyloxyalkylové skupiny, aminoalkylové skupiny, alkylaminoalkylové skupiny, alkoxykarbonylamidoalkylové skupiny, acylamidoalkylové skupiny, arylsulfonamidoalkylové skupiny, allylovou

   - 19CZ 284650 B6 skupinu, dihydroxyalkylallylové skupiny, dioxolanylallylovou skupinu, alkoxykarbonylalkylové skupiny a alkylsilylové skupiny, (ii) skupinu R7CO-, kde R7 je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, alkylové skupiny, hydroxyskupinu, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, amidoskupiny, alkamidoskupiny, zbytky aminokyselin a Ν,Ν-disubstituované amidoskupiny, kde substituenty (a) jsou vybrány ze souboru zahrnujícího alkylové skupiny, arylové skupiny, arylalkylové skupiny a alkylarylové skupiny nebo (b) tvoří morfolinoskupinu nebo piperazinoskupinu, (iii) skupinu RgNCH-, kde Rg představuje alkylovou skupinu, arylovou skupinu nebo aminoskupinu, přičemž termíny alk nebo alkyl, acyl a aryl mají významy definované v nároku 1.
5. 5. Demethoxyderivát rapamycinu obecného vzorce I podle nároku 1 vybraný ze skupiny zahrnující

   i. 16-demethoxy-l 6-(pent-2-inyl)oxyrapamycin, ii. 16-demethoxy-l 6-(but-2-inyl)oxyrapamcin, iii. 16-demethoxy-l6-(propargyl)oxyrapamycin, a iv. 16-demethoxy-l 6-(4-hydroxybut-2-inyl)oxyrapamycin.
6. 6. Demethoxyderivát rapamycinu podle libovolného z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo.
7. 7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje demethoxyderivát rapamycinu podle libovolného z nároků 1 až 4 společně s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.
8. 8. Použití demethoxyderivátu rapamycinu podle libovolného z nároků 1 až 5 k výrobě léčiva pro léčbu nebo prevenci libovolné z poruch vybraných ze skupiny zahrnující

   i) autoimunní onemocnění, ii) akutní rejekce orgánového nebo tkáňového transplantátu, iii) hyperakutní rejekce orgánového nebo tkáňového transplantátu, iv) chronické rejekce orgánového nebo tkáňového transplantátu,

   v) onemocnění štěp versus hostitel, vi) astma, vii) rezistenci vůči více léčivům, viii) nádory nebo hyperproliferativní poruchy, ix) fungální infekce,

   x) záněty a xi) infekce patogeny, které mají Mip nebo Mipu podobné faktory.
9. 9. Demethoxyderivát rapamycinu podle libovolného z nároků 1 až 5 pro použití jako léčivo v kombinaci s cyklosporinem nebo askomycinem nebo jejich imunosupresivním analogem, kortikosteroidem, cyklofosfamidem, azathiofenem, methotrexatem, brequinarem, leflunomidem, mizoribinem, imunosupresivními monoklonálními protilátkami, antivirovým léčivem nebo antibiotikem.