CN121263210A - 抗体和抗体-药物偶联物以及使用方法和合成工艺及中间体 - Google Patents

抗体和抗体-药物偶联物以及使用方法和合成工艺及中间体

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CN121263210A CN202480035735.XA CN202480035735A CN121263210A CN 121263210 A CN121263210 A CN 121263210A CN 202480035735 A CN202480035735 A CN 202480035735A CN 121263210 A CN121263210 A CN 121263210A
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Abstract

本发明提供了抗体、包含与下式的药物部分偶联(直接或通过接头偶联)的抗体的抗体‑药物偶联物：

Description

抗体和抗体-药物偶联物以及使用方法和合成工艺及中间体
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年4月17日提交的美国临时申请号63/459,961和2023年4月17日提交的美国临时申请号63/459,956的优先权。上述引用的申请的全部内容特此以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及细胞毒性化合物、与Trop2结合的抗体以及包含偶联至抗体(包括与Trop2结合的抗体)的细胞毒性化合物的抗体-药物偶联物(ADC)。本发明还涉及使用抗体-药物偶联物化合物治疗包括过度增殖性病症(诸如癌症)的疾病的方法；制备抗体和抗体-药物偶联物、抗体-接头-药物中间体的方法；以及制备抗体-接头-药物中间体的方法。
背景技术
药物与抗体的偶联(直接或经由接头偶联)涉及多种因素的考虑，包括用于偶联药物的化学基团的身份和位置、药物释放机制、提供药物释放的结构元件以及对所释放的游离药物的结构修饰。此外，如果药物要在抗体内化后释放，那么药物释放机制必须与偶联物的细胞内运输相一致。
抗体-药物偶联物(ADC)作为抗癌剂已显示出相当大的效用。在ADC中，将治疗剂(也称为细胞毒性药物、有效载荷(payload)或毒素)共价连接至抗体，该抗体的抗原由癌细胞或其他增殖细胞表达(肿瘤相关抗原)；例如，在肿瘤中、直接在癌细胞上或在肿瘤微环境中的细胞上表达的抗原(肿瘤相关抗原)。通过结合至抗原，抗体将ADC递送至癌症部位。在此处，共价连接的裂解或抗体的降解导致治疗剂的释放。另一方面，尽管ADC在血液系统中循环，但治疗剂由于其与抗体的键联而无活性。因此，ADC中所使用的治疗剂可能由于其高度局部释放而比普通化疗剂更有效。
尽管已尝试经由抗体递送许多不同的药物类别，但仅少数药物类别已证实作为抗体-药物偶联物有效，同时具有合适的毒性概况。一种药物类别包括FR901464的类似物，诸如司普利斯他汀C (spliceostatin C)和泰兰斯他汀A (thailanstatin A)，它们是真核RNA剪接的极强效抑制剂。这些化合物与U2 snRNA亚复合物的SF3b亚基紧密结合，该亚基为剪接体的基本组分(Puthenveetil, S.,等人,Bioconjugate Chem.,2016, 27:1880-1888)。国际专利申请公开号WO 20019/060398公开了被报道可用作ADC中的有效载荷的某些基于泰兰斯他汀的化合物，以及可与ADC结合使用的有效载荷-接头化合物。这些ADC被报道可用于治疗疾病，诸如癌症。
国际专利申请公开号WO 2019/060398也公开了制备其中所公开的化合物的合成方法以及中间体。一种特定的化合物为下式III的化合物：
III
持续需要新型抗体-药物偶联物来治疗疾病，诸如癌症。还需要可用于制备抗体-药物偶联物的新型药物部分和抗体。目前需要可以用于制备式8*和式I的化合物(或其非对映异构体)及其盐以及本文所述的其他化合物及其盐的合成方法和中间体。还需要用于制备可以用于制备式8*和式I的化合物及其盐的中间体化合物的改进方法。改进方法和中间体可以减少与用于制备上述化合物中的一种或多种的现有方法相关的合成步骤的数目、成本、时间、杂质、纯化步骤和/或废物量。
发明内容
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含直接(即，不通过接头)或通过式I的接头共价连接至药物部分的抗体：
I
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
L为接头；
n为0或1；
p为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；并且
Ab为抗体。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含直接(即，不通过接头)或通过式I的接头共价连接至药物部分的抗体：
I
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
L为接头；
n为0或1；
p为1或更大(例如1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
Ab为与Trop2结合的抗体。
一个实施方案提供了一种抗体或其片段，其包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含互补决定区1 (HCDR1)，其包含与NYGMN(SEQ ID NO: 14)具有至少90%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (HCDR2)，其包含与WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)具有至少90%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (HCDR3)，其包含与GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)具有至少90%同一性的氨基酸序列；并且/或者
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含互补决定区1 (LCDR1)，其包含与KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 27)具有至少90%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (LCDR2)，其包含与SASYRYT (SEQ ID NO: 29)具有至少90%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3(LCDR3)，其包含与QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
一个实施方案提供了一种式II化合物
II
或其盐，
其中
W为离去基团或-L-X；
L为接头；并且
X为反应性基团。
一个实施方案提供了下式化合物
、
、
、
，或
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)。
一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含式I的抗体-药物偶联物化合物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
一个实施方案提供了用于治疗有需要的患者(例如哺乳动物患者，诸如人类患者)的癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的如本文所述的式I的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐。
一个实施方案提供了用于治疗患者(例如哺乳动物患者，诸如人类患者)的癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的如本文所述的式I的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐。
一个实施方案提供了用于治疗有需要的哺乳动物(例如，人)的癌症的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的式I的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐。
一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物(例如，人)的癌症的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的式I的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐。
一个实施方案提供了一种用于医学疗法的式I的抗体-药物偶联物化合物或如本文所述的药学上可接受的盐。
一个实施方案提供了一种如本文所述的式I的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐，其用于癌症的治疗性治疗。
一个实施方案提供了式I的抗体-药物偶联物化合物或如本文所述的药学上可接受的盐用于制造用于治疗哺乳动物(例如，人)的癌症的药物的用途。
一个实施方案提供了一种用于制备如本文所述的式I的抗体-药物偶联物化合物的中间体。
一个实施方案提供了一种用于制备如本文所述的式I的抗体-药物偶联物化合物或式II化合物的方法。
一个实施方案提供了一种制品，其包含含有式I的抗体-药物偶联物化合物的药物组合物、容器以及指示该药物组合物可用于治疗癌症的包装说明书或标签。
本发明还提供了可用于制备式8*和I的化合物或其盐的新的合成工艺和合成中间体。本发明还提供了可用于制备如本文所述的另外的化合物的新的合成工艺和合成中间体。
因此，一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
其中：
P为胺氮保护基团；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基；
或其盐。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
其中：
P为胺氮保护基团；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基或苯基，其中所述苯基任选地被一个或多个卤代基或硝基取代；
或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式8*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式7*化合物：
或其盐转化为所述式8*化合物或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式7*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式6a*化合物：
或其盐转化为式7化合物或其盐，其中R2为(C1-C6)烷基。
一个实施方案提供了一种用于制备式6a*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式5a*化合物：
或其盐转化为所述式6a*化合物或其盐，
其中：
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基。
一个实施方案提供了一种用于制备式5a*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式4a*化合物：
4a*
或其盐转化为所述式5a化合物或其盐，
其中：
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基。
一个实施方案提供了一种用于制备式4a*化合物：
4a*
或其盐的方法，其包括将对应的式3a*化合物：
3a*
或其盐转化为所述式4a*化合物或其盐，
其中：
P为胺保护基团；并且
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
一个实施方案提供了一种用于制备式3a*化合物：
3a*
或其盐的方法，其包括将对应的式2a*化合物：
2a*
或其盐转化为所述式3a*化合物或其盐，
其中：
P为胺保护基团；并且
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
一个实施方案提供了本文所述的新型合成中间体以及制备这些中间体的方法。
附图说明
图1A-图1B. Trop2 ADC接头筛选。图1A示出具有不可裂解接头的赖氨酸偶联物具有最高效力。将PH-1家族的接头-毒素(L-T)偶联至Trop2特异性单克隆抗体(hRS7)，并且测试所得ADC对小鼠中预先植入的表达Trop2的NCI-N87胃癌肿瘤的治疗功效。不可裂解的赖氨酸连接的PH-1接头-毒素在体内与最大肿瘤生长抑制(TGI)相关。L2 (Lys不可裂解)DAR8示出约88% TGI。L2 (Lys不可裂解) DAR4示出约77% TGI。L22 (Lys不可裂解)示出约82% TGI。L92 (Lys可裂解)示出约68% TGI。L18 (Cys不可裂解)示出约65% TGI。图1B示出ADC的实验性药物抗体比(DAR)。
图2A-图2E. Trop2的抗体结合概况和结合亲和力。图2A示出具有Kd(M): 2.46 E-08的Daiichi mAb (TINA)的结合概况。图2B示出具有Kd(M): 2.50 E-09的ImmunomedicsmAb (hRS7)的结合概况。图2C示出具有Kd(M): 1.17 E-08的M2.1的结合概况。图2D示出具有Kd(M): 1.32 E-08的M2.2的结合概况。图2E示出具有Kd(M): 8.97 E-09的M2.8的结合概况。
图3A-图3D. M2.1和M2.8 mAb识别人和食蟹猴Trop2。将抗体与用物种特异性Trop2 cDNA瞬时转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞一起培育，以测试抗体与人、食蟹猴或小鼠Trop2蛋白的结合概况。图3A示出M2.1 mAb结合概况。图3B示出hRS7 (IMMU-132) mAb结合概况。图3C示出REA916 Ab (阳性对照)结合概况。图3D示出TINA (DS-1062) mAb结合概况。
图4示出对荧光标记的Peak Trop2抗体结合胃癌细胞的能力的评估，这些胃癌细胞与Daiichi或Immunomedics Trop2抗体预结合。即使在Trop2被Daiichi mAb (TINA)饱和后，Peak Bio mAb的适度结合也表明略微不同的表位或表位的部分重叠。在Trop2与Immunomedics Trop2抗体(hRS7)预结合后，Peak Bio mAb (M2.8)没有结合或急剧下降，表明对相同表位的潜在竞争性结合。M2.8 mAb表位可能与hRS7的表位相同，但需要进一步的验证研究。
图5示出Trop2抗体和ADC的代表性凝胶电泳表征。M2.1抗体(泳道1)以2 (泳道2)或4 (泳道3)的DAR与式8*化合物偶联。使用替代接头，将不可裂解的M2.1-式8*偶联物与可裂解的ADC进行比较。将泰兰斯他汀半胱氨酸偶联物(泳道4)或赖氨酸偶联物(泳道5)依次与通过类似的机制释放有效载荷的药物级Trodelvy (泳道6)和Enhertu (泳道7)进行比较。赖氨酸偶联的ADC在非还原条件下更稳定。
图6A-图6F示出显示接头毒素(化合物8*称为PH1)与Trop2 mAb的有效偶联以及DAR2和DAR4 ADC的表征的质谱。图6A-图6C示出具有1.73的实际DAR和67%的偶联效率的Trop2 PH1 ADC (DAR2)。特别地，图6A示出Trop2 PH1 ADC (DAR2)的疏水性相互作用色谱(HIC)图。图6B示出Trop2 PH1 ADC (DAR2)的尺寸排阻色谱(SEC)图。图6C示出Trop2 PH1ADC (DAR2)的如通过质谱法测定的DAR群体分布。图6D-图6F示出具有3.62的实际DAR和67%的偶联效率的Trop2 PH1 ADC (DAR4)。特别地，图6D示出Trop2 PH1 ADC (DAR4)的疏水性相互作用色谱(HIC)图。图6E示出Trop2 PH1 ADC (DAR4)的尺寸排阻色谱(SEC)图。图6F示出Trop2 PH1 ADC (DAR4)的如通过质谱法测定的DAR群体分布。
图7示出Trop2 mAB在NCI-N87细胞中与靶受体接合后的内化。用以下Trop2 mAb进行内化测定：hRS7、M2.1、M2.3、T6-16、TINA。所使用的对照Ab为靶向鸡溶菌酶的HuLys 11。T6-16和TINA似乎内化得更快，但T6-16示出最高的内化百分比。
图8示出特异性结合并靶向人Trop2的TROP2 ADC的内化。由于可以蛋白水解裂解人癌细胞系中的细胞表面Trop2并且某些抗体结合表位可能丢失，因此在稳定过表达全长人Trop2的小鼠细胞系CT26上测试抗hTrop2 ADC的内化。使用下式计算内化百分比：[V(tx)/M(tx)] - [V(t0)/M(t0)]* 100，其中V为淬灭样品的GMFI (在给定时间点)，并且M为在淬灭为0时的最大GMFI/信号(在给定时间点)。M2.1和M2.8 ADC的内化和积累在过表达hTrop2的CT26细胞中相当。
图9示出PH1 (当在IMMU-132抗体hRS7上偶联时)相对于IMMU-132抗体上的SN-38的有效载荷优势(蜘蛛图(spider plot)，每组n=10)。将PH1与抗RSV抗体偶联作为对照ADC。
图10示出Trop-2 PH1 ADC相对于IMMU-132的优势(蜘蛛图，每组n=10)。将PH1与抗RSV抗体偶联作为对照ADC。
图11示出所有测试的Trop2 PH1 ADC在3 mg/kg下均使单个肿瘤消退。将PH1与抗RSV抗体偶联作为对照ADC。
图12示出测试的Trop2 ADC。M2.1 PH1示出比M2.3 PH1更高的TGI。对于M2.1 PH1和M2.3 PH1，DAR4示出比DAR2更高的TGI。
图13示出Trop2 PH1 ADC (M2.8 PH1)在体外针对多种适应症的各种癌细胞系显示出纳摩尔级效力。
图14A-图14F示出靶向Trop2的ADC具有差异化的在靶和脱靶活性。图14A-图14C示出差异化的ADC靶向Trop2在靶活性。特别地，图14A示出使用NCI-N87胃细胞系(Trop2高)的细胞毒性数据。图14B示出使用BxPC3胰腺细胞系(Trop2高)的细胞毒性数据。图14C示出使用RT112/84膀胱细胞系(Trop2异源)的细胞毒性数据。图14D-图14F示出差异化的ADC靶向Trop2脱靶活性。特别地，图14D示出使用786-0细胞系(Trop2阴性)的细胞毒性数据。图14E示出使用BJ正常人成纤维细胞的细胞毒性数据。图14F示出使用HS27正常人成纤维细胞的细胞毒性数据。
图15示出处于3mg/kg QWx2剂量方案下的Trop2 PH1 ADC与最高TGI相关。在Trop2阳性肿瘤模型中，向小鼠施用不同剂量(例如，0.5、1或3mg/kg)和方案(例如，SD、QW x 2或QW x 3)的ADC。监测肿瘤生长抑制(TGI)。在这项研究中，与DAR2 ADC治疗相比，DAR4 ADC治疗具有更高的TGI。还观察到剂量依赖性和/或方案依赖性TGI (3mg/kg>1mg/kg>0.5mg/kg；并且QW x 2>SD)。
图16示出Trop2 PH1 ADC可以在较低的药物-抗体比(DAR)下实现持久的肿瘤消退。在Trop2阳性肿瘤模型(携带具有表达水平IHC3+的人NCI-N87胃肿瘤的裸鼠)中，以QW，持续2周(QWx2)的给药方案向小鼠给药。水平虚线指示开始治疗时200 mm3的平均肿瘤体积。低于这条线的肿瘤缩小被视为消退。监测肿瘤大小。在用3mg/kg的Trop2 PH1 (DAR4)ADC治疗的组中，在约5个月的时段内，在50%的治疗小鼠中观察到长期肿瘤消退(TR)。在用3mg/kg的Trop2 PH1 (DAR2) ADC治疗的组中，在约5个月的时段内，在50%的治疗小鼠中观察到稳定疾病。在较低DAR (2或4对比于7.6)和/或较低剂量(3mg/kg对比于10 mg/kg)下，Trop2 PH1的两个治疗组都优于IMMU-132*的治疗组。IMMU-132*表示临床级IMMU-132或沙西妥珠单抗-戈维替康(Sacituzumab govitecan)。
图17示出化合物2A (也称为ThA13D2L2)对比于化合物2B (也称为ThA13D1L2)和非对映异构体混合物(也称为ThA13L2)的细胞活力活性(HCT116细胞系)。
图18示出接头-毒素的某些示例性结构。
图19示出接头筛选研究、抗体结合亲和力和抗体内化测定。
图20示出ADC的TGI功效的比较和抗体跨物种结合概况。
图21A-图21B示出Trop2 PH1 ADC的差异化NHP安全性概况。
图22示出低脱靶活性以及各种适应症中的体外效力。
图23示出M2.8 PH1 ADC的体内效力。
图24A-图24B示出化合物3*的NMR光谱。图24A示出化合物3*的质子NMR光谱，并且图24B示出化合物3*的碳NMR光谱。
图25A-图25B示出化合物4*的NMR光谱。图25A示出化合物4*的质子NMR光谱，并且图25B示出化合物4*的碳NMR光谱。
图26A-图26B示出化合物5*的NMR光谱。图26A示出化合物5*的质子NMR光谱，并且图26B示出化合物5*的碳NMR光谱。
图27A-图27B示出化合物6*的NMR光谱。图27A示出化合物6*的质子NMR光谱，并且图27B示出化合物6*的碳NMR光谱。
图28示出化合物7*的质子NMR光谱。
图29A-图29B示出化合物8*的NMR光谱。图29A示出化合物8*的质子NMR光谱，并且图29B示出化合物8*的碳NMR光谱。
图30A-图30E示出MDR1-低MES-SA子宫肉瘤细胞和同基因MDR1-高MES-SA/ MX2细胞在存在或不存在不同的ADC有效载荷或其活性有效载荷组分的情况下生长。图30A示出ThA13 d2甲酯，其为赖氨酸偶联物的膜渗透性代表。赖氨酸加合物是不可渗透的。图30B示出由半胱氨酸接头释放的ThA13 d2 301 (醇)物质。图30C示出MMAE (vedotin ADC)。图30D示出SN38 (例如Trodelvy)。图30E示出DXd (例如DS-1062)。插图中提供了化学结构以及其对应图。此外，MES-SA/ MX2细胞也在存在或不存在MDR1特异性抑制剂依克立达(Elacridar)和他芮喹达(Tariquidar)以及MDR1加CYP 3A4抑制剂伐司扑达(Valspodar)的情况下生长，这些抑制剂阻断p-糖蛋白泵出表达高水平MDR1的细胞系中的ADC有效载荷。
具体实施方式
现在将详细参考本发明的某些实施方案，其实施例在所附的结构和化学式中说明。虽然将结合例示的实施方案描述本发明，但将要理解的是，它们并不旨在将本发明限于这些实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有的替代方案、修改和等效物，它们可以被包括在如由权利要求书界定的本发明范围内。
本领域技术人员将会认识到，许多方法和材料类似或等同于本文描述的那些，它们可用于实施本发明。本发明决不限于所描述的方法和材料。
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属的本领域普通技术人员通常所理解相同的含义，并且符合：Singleton等人(1994) Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版, J. Wiley&Sons, New York, NY；和Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology,第5版,Garland Publishing, New York。
定义
除非另有说明，本文中所用的以下术语和短语旨在具有下列含义：
当在本文中使用商品名时，申请人意欲独立地包括商品名产品制剂、仿制药以及商品名产品的(多种)活性药物成分。
用于本文目的的“受体人框架”是包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些实施方案中，VL受体人框架序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文中描述的那些方法)进行测量。用于测量结合亲和力的特定的说明性和示例性实施方案如以下所述。
在某些实施方案中，如本文所述的抗体的解离常数(Kd)为≤ 1μM、≤ 100 nM、≤10 nM、≤ 5 nm、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001nM (例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)具有一个或多个改变的抗体，此类改变导致抗体对抗原的亲和力改进。
术语“抗体”在本文以最广义使用并涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。
术语“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，该分子包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中一般以失调的细胞生长/增殖为特征的生理状况。“肿瘤”包括一种或更多种癌细胞。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
术语“早期乳腺癌(early stage breast cancer，EBC)”或“早期乳腺癌(earlybreast cancer)”在本文中用于指未扩散到乳房或腋窝淋巴结之外的乳腺癌。这包括导管原位癌以及I期、IIA期、IIB期和IIIA期乳腺癌。
提及肿瘤或癌症为“0期”、“I期”、“II期”、“III期”或“IV期”，以及这个分类中的各种亚分期，指示使用本领域中已知的总分期分组或罗马数字分期方法对肿瘤或癌症进行分类。尽管癌症的实际分期取决于癌症的类型，但一般来说，0期癌症为原位病变，I期癌症为小型局部肿瘤，II期和III期癌症为局部晚期肿瘤(其表现为局部淋巴结受累)，而IV期癌症代表转移性癌症。熟练的临床医生知道每种类型的肿瘤的具体分期。
术语“转移性乳腺癌”意指乳腺癌的状态，其中癌细胞通过血管或淋巴管从原始部位转移至身体其他部位的一个或多个部位，以在除乳房以外的一个或多个器官中形成一个或多个继发性肿瘤。
“晚期”癌症为通过局部侵袭或转移已经扩散至原始部位或器官之外的癌症。因此，术语“晚期”癌症包括局部晚期疾病和转移性疾病。
“复发性”癌症为在对初始疗法(诸如手术)有反应后，在初始部位或远处部位重新生长的癌症。
“局部复发性”癌症为在与先前治疗的癌症相同的位置治疗后复发的癌症。
“可手术的”或“可切除的”癌症为局限于主要器官并适于手术(切除)的癌症。
“不可切除(non-resectable)”或“不能切除(unresectable)”的癌症不能通过手术移除(切除)。
术语“嵌合”抗体是指其中一部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链衍生自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链所拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloid) (长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C (mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他插入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如核酸分解酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文所公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应功能”是指由抗体的Fc区引起的那些生物活性，其随抗体同种型而发生变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞激活。
试剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指以剂量和在需要的时间段内能有效获得所需的治疗或预防结果的量。有效量的用于治疗癌症的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；并且/或者在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。就药物可防止现有癌细胞生长和/或杀伤现有癌细胞的程度而言，其可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。有效量可以延长无进展存活期(例如，如通过实体瘤的反应评估标准RECIST或CA-125变化测量)，引起客观反应(包括部分反应PR或完全反应CR)，增加总存活时间，并且/或者改善癌症的一种或多种症状(例如，如通过FOSI评估)。
术语“表位”是指抗原分子上与抗体结合的特定位点。
本文的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非另有具体说明，Fc区或恒定区的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如描述于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
“框架”或“FR”是指可变结构域残基而不是高变区(HVR)残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以以下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”“完整抗体”和“全抗体”在本文中可以互换使用以指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且是指已经引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初始转化细胞以及由此衍生的后代，而不考虑传代的次数。后代的核酸含量不可能与亲代细胞完全相同，但可能含有突变。本文包括所筛选的或所选择的与初始转化的细胞具有相同功能或生物活性的突变体后代。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞所产生的抗体的氨基酸序列或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最通常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版, NIH出版91-3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人，同上的亚组κ I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人，同上的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个以及通常两个可变结构域，其中所有的或者基本上所有的HVR (例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有的或者基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”(例如，非人抗体)是指已经经历人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，它们在序列上是高变的并且/或者形成结构上确定的环(“高变环”)。一般来说，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH (H1、H2、H3)中，并且三个在VL (L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性并且/或者参与抗原识别。
“免疫偶联物”是偶联至一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
“患者”或“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于：家畜(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人的灵长类诸如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，患者、个体或受试者为人。在一些实施方案中，患者可以是“癌症患者”，即罹患癌症(特别是胃癌或乳腺癌)的一种或多种症状或有罹患该一种或多种症状的风险的患者。
“患者群体”是指一组癌症患者。此类群体可以用于证明药物的统计学显著功效和/或安全性。
“复发”患者为在缓解后具有癌症的病征或症状的患者。任选地，患者在辅助或新辅助疗法后复发。
“显示HER表达、扩增或活化”的癌症或生物样品为在诊断测试中表达(包括过表达) HER受体，具有扩增的HER基因并且/或者另外证实HER受体的活化或磷酸化的癌症或生物样品。
本文的“新辅助疗法”或“术前疗法”是指手术前给予的疗法。新辅助疗法的目标是提供即时的全身治疗，从而潜在地根除微转移，否则如果遵循手术、然后为全身治疗的标准顺序，那么这些微转移会增殖。新辅助疗法还可以帮助缩小肿瘤尺寸，从而允许完全切除最初不能切除的肿瘤或者保留部分器官和其功能。此外，新辅助疗法允许对药物功效进行体内评估，这可以指导后续治疗的选择。
本文的“辅助疗法”是指在确定性手术(definitive surgery)后给予的疗法，其中没有检测到残留疾病的证据，以降低疾病复发的风险。辅助疗法的目标是防止癌症复发，并且因此降低癌症有关的死亡的几率。本文的辅助疗法明确排除了新辅助疗法。
“确定性手术”是作为医学界内所使用的术语使用。确定性手术包括例如导致肿瘤移除或切除的程序(手术或其他程序)，包括导致所有肉眼可见肿瘤移除或切除的那些程序。确定性手术包括例如肿瘤的完全或治愈性切除或者肉眼完全切除(complete grossresection)。确定性手术包括发生在一个或多个阶段中的程序，并且包括例如多阶段手术程序，其中在切除肿瘤之前进行一个或多个手术程序或其他程序。确定性手术包括移除或切除肿瘤的程序，该肿瘤包括受累的器官、部分器官和组织以及周围的器官，诸如淋巴结、部分器官或组织。移除可能不完全，使得即使未被检测到，肿瘤细胞也可能残留。
“存活期”是指患者仍然存活，并且包括无疾病存活期(DFS)、无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。可以通过Kaplan-Meier方法估算存活期，并且使用分层对数秩检验计算存活期的任何差异。
“无进展存活期”(PFS)为从治疗的第一天到记录的疾病进展(包括孤立的CNS进展)或研究中因任何原因导致的死亡(以先发生者为准)的时间。
“无疾病存活期(DFS)”是指患者从治疗开始起或从初始诊断起，在限定的时间段(诸如约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年等)内仍然存活，没有复发癌症。在本发明的一个方面，根据意向性治疗原则分析DFS，即基于患者的指定治疗对其进行评估。在DFS分析中使用的事件可以包括癌症的局部、区域和远处复发、继发性癌症的发生以及在没有前期事件(例如，乳腺癌复发或第二原发性癌症)的患者因任何原因导致的死亡。
“总存活期”是指患者从治疗开始起或从初始诊断起，在限定的时间段(诸如约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年等)内仍然存活。在基于本发明的研究中，用于存活期分析的事件为因任何原因导致的死亡。
“延长存活期”意指相对于未治疗的患者或相对于对照治疗方案，增加治疗患者的DFS和/或OS。在治疗开始后或在初始诊断后，存活期监测至少约6个月、或至少约1年、或至少约2年、或至少约3年、或至少约4年、或至少约5年、或至少约10年等。
“单一疗法”意指在治疗期的过程期间，仅包括用于治疗癌症或肿瘤的单一治疗剂的治疗方案。
“维持疗法”意指用于降低疾病复发或进展的可能性的治疗方案。维持疗法可以提供任何时长，包括延长至受试者终身的时间段。维持疗法可以在初始疗法后提供，或者与初始或附加疗法一起提供。用于维持疗法的剂量可以变化，并且可以包括与用于其他类型的疗法的剂量相比减少的剂量。
“分离的抗体”为已经从其天然环境的组分中分离的抗体。在一些实施方案中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定，抗体被纯化至大于95%或99%的纯度。对于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人，J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。
“分离的核酸”是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置。
“分离的编码抗体的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或不同载体上的此类核酸分子和存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同种抗体的群体获得的抗体，所述基本上同种抗体即组成所述群体的单个抗体是相同的并且/或者结合相同的表位，除了可能的突变抗体，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间出现的突变，此类突变通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特性并且不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法如本文所述。
“裸抗体”是指不与异种部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记偶联的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由通过二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N-至C-末端，每条重链具有可变区(VH) (也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-至C-末端，每条轻链具有可变区(VL) (也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被指定为两种类型(称为κ和λ)中的一种。
“小瓶”为适于容纳液体或冻干制剂的容器。在一个实施方案中，小瓶为一次性小瓶，例如具有塞子的20-cc一次性小瓶。
使用术语“包装说明书”是指通常在治疗产品的商业包装中包括的说明，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”被定义为在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比的序列同一性之后，并在不将任何保守取代视为序列同一性的部分的情况下，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、Clustal X、Clustal W、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。
术语“药物制剂”是指以允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式的制剂，并且其不含有对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分。
“药学上可接受的载体”是指对受试者无毒的药物制剂中活性成分以外的成分。药学上可接受的载体包括但不限于：缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文使用的“治疗(treatment)”(及其语法变形诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变被治疗的个体的自然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。理想的治疗效果包括但不限于：防止疾病的发生或复发、缓解症状、消除疾病的任何直接或间接的病理学后果、防止转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进程。
“共同施用”意指在同一施用期间静脉内施用两种(或更多种)药物，而不是两种或更多种药物的相继输注。一般来说，这将涉及在其共同施用前将两种(或更多种)药物合并至同一IV袋中。
在同一治疗周期内、在与一种或多种其他药物相同的治疗日以及任选地在与一种或多种其他药物相同的时间施用与一种或多种其他药物“同时”施用的药物。例如，对于每3周给予的癌症疗法，同时施用的药物各自在3周周期的第1天施用。
“化疗剂”是指用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN®)；烷基磺酸酯类，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；多聚乙酰(acetogenin) (特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin) (包括合成类似物托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN®)、CPT-11 (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065 (包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycin) (特别为隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多米卡星(duocarmycin) (包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加苷素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲(nitrosurea)类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，特别为加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1 (参见，例如，Nicolaou等人, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994))；CDP323 (一种口服的α-4整联蛋白抑制剂)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C (cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D (dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN®、吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉基-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)、盐酸多柔比星脂质体注射液(DOXIL®)、脂质体多柔比星TLC D-99 (MYOCET®)、聚乙二醇化脂质体多柔比星(CAELYX®)和去氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins) (诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine) (GEMZAR®)、替加氟(tegafur) (UFTORAL®)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA®)、埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和美登木素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2'-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene) (尤其是T-2毒素、疣孢菌素A (verracurin A)、杆孢菌素A (roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL®)、白蛋白工程改造的纳米颗粒制剂型紫杉醇(albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel (ABRAXANETM))和多西他赛(docetaxel) (TAXOTERE®)；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin) (例如，ELOXATIN®)和卡铂(carboplatin)；阻止微管蛋白聚合形成微管的长春碱(vincas)，包括长春花碱(VELBAN®)、长春新碱(ONCOVIN®)、长春地辛(vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®)和长春瑞滨(vinorelbine) (NAVELBINE®)；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄素(retinoid)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene) (TARGRETIN®)；双膦酸盐类，诸如氯膦酸盐(例如，BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸盐(etidronate)(DIDROCAL®)、NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)(ZOMETA®)、阿仑膦酸盐(alendronate) (FOSAMAX®)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIA®)、替鲁膦酸盐(tiludronate) (SKELID®)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL®)；曲沙他滨(troxacitabine) (一种1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制与异常细胞增殖有关的信号传导路径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE®疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗和VAXID®疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，LURTOTECAN®)；rmRH (例如，ABARELIX®)；BAY439006 (索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248 (舒尼替尼(sunitinib), SUTENT®, Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂(例如，塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))、蛋白酶体抑制剂(例如，PS341))；硼替佐米(bortezomib) (VELCADE®)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib) (R11577)；奥拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如奥利默森钠(oblimersen sodium) (GENASENSE®)；匹杉琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见下文的定义)；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin) (西罗莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®)；法尼基转移酶抑制剂(farnesyltransferase inhibitor)，诸如洛那法尼(lonafarnib) (SCH 6636、SARASARTM)；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两者或更多者的组合，诸如CHOP，即环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写；和FOLFOX，即奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的治疗方案的缩写。
如本文定义的化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，它们用于调节、减少、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用。它们本身可以是激素，包括但不限于：具有混合激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX®)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene) (FARESTON®)、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA®)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，诸如SERM3；不具有激动剂性质的纯抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant) (FASLODEX®)和EM800 (此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，增加ER周转率(turnover)并且/或者抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾族芳香酶抑制剂，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)(AROMASIN®)；和非甾族芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑(anastrazole) (ARIMIDEX®)、来曲唑(letrozole) (FEMARA®)和氨鲁米特；以及其他芳香酶抑制剂，包括伏氯唑(vorozole)(RIVISOR®)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE®)、法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide) (LUPRON®和ELIGARD®)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇，包括孕激素(诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate))、雌激素(诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和倍美力(premarin))和雄激素/类视黄素化合物(诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式维A酸(all transretionicacid)和芬维A胺(fenretinide))；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素类(诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide))；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两者或更多者的组合。
本文的治疗剂的“固定(fixed)”或“固定(flat)”剂量是指在不考虑患者的体重(WT)或体表面积(BSA)的情况下，向人类患者施用的剂量。因此，固定剂量(fixed dose)或固定剂量(flat dose)不是以mg/kg剂量或mg/m2剂量提供，而是以治疗剂的绝对量提供。
本文的“负载”剂量一般包括向患者施用的治疗剂的初始剂量，并且然后是它的一个或多个维持剂量。一般来说，施用单一负载剂量，但是本文考虑了多个负载剂量。通常，所施用的负载剂量的量超过所施用的维持剂量的量，并且/或者负载剂量比维持剂量更频繁地施用，以便比维持剂量更早达到治疗剂的所需稳态浓度。
本文的“维持”剂量是指在治疗期间向患者施用的治疗剂的一个或多个剂量。通常，维持剂量以分隔的治疗间隔施用，诸如大约每周、大约每2周、大约每3周或大约每4周，优选地每3周。
“输注(Infusion)”或“输注(infusing)”是指出于治疗目的通过静脉将含有药物的溶液引入体内。一般来说，这是经由静脉注射(IV)袋实现的。
“静脉注射袋(intravenous bag)”或“静脉注射袋(IV bag)”是一种可以容纳溶液的袋子，该溶液可以经由患者的静脉施用。在一个实施方案中，溶液为盐溶液(例如，约0.9%或约0.45% NaCl)。任选地，IV袋由聚烯烃或聚氯乙烯形成。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域一般具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，Kuby Immunology,第6版, W.H. Freeman and Co.,第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域以分别筛选互补的VL或VH结构域文库可以分离结合特定抗原的抗体。参见，例如，Portolano等人，J. Immunol.150:880-887 (1993)；Clarkson等人，Nature352:624-628 (1991)。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另外的核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及并入已经引入该载体的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够引导与其可操作性连接的核酸的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。
“游离的半胱氨酸氨基酸”是指已经被工程改造至亲本抗体中，具有硫醇官能团(-SH)，并且不作为分子内或分子间二硫键配对的半胱氨酸氨基酸残基。
“接头”、“接头单元”或“连接”意指包含共价连接抗体与药物部分的原子链的化学部分。
当指示取代基的数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基至最高可能取代数的范围，即一个氢被取代基置换直到所有氢被取代基置换。术语“取代基”表示置换亲本分子上的氢原子的一个原子或一组原子。术语“取代的”表示特定的基团带有一个或多个取代基。当任何基团可以携带多个取代基并且提供多种可能的取代基时，取代基是独立选择的并且无需相同。术语“未取代的”意指特定的基团不带有取代基。术语“任选取代的”意指特定的基团是未取代的或者被一个或多个独立地选自该组可能的取代基取代。当表示取代基的数目时，术语“一个或多个”意指从一个取代基至最高可能取代数，即一个氢被取代基置换直到所有氢被取代基置换。
如本文所用的术语“烷基”是指具有一个至十二个碳原子(C1-C12)的任何长度的饱和直链或支链单价烃基，其中烷基可以任选地独立地被一个或多个下述取代基取代。在另一个实施方案中，烷基是一个至八个碳原子(C1-C8)，或者一个至六个碳原子(C1-C6)。烷基的实例包括但不限于甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、1-庚基、1-辛基等。
如本文所用的术语“亚烷基”是指具有一个至十二个碳原子(C1-C12)的任何长度的饱和直链或支链二价烃基，其中亚烷基可以任选地独立地被一个或多个下述取代基取代。在另一个实施方案中，亚烷基是一个至八个碳原子(C1-C8)，或者一个至六个碳原子(C1-C6)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。
术语“烯基”是指具有两个至八个碳原子(C2-C8)的任何长度和至少一个不饱和位点(即，碳-碳sp2双键)的直链或支链单价烃基，其中烯基可以任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代，并且包括具有“顺式”和“反式”取向，或者“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于乙烯基(ethylenyl)或乙烯基(vinyl) (-CH=CH2)、烯丙基(-CH2CH=CH2)等。
术语“亚烯基”是指具有两个至八个碳原子(C2-C8)的任何长度和至少一个不饱和位点(即，碳-碳sp2双键)的直链或支链二价烃基，其中亚烯基可以任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代，并且包括具有“顺式”和“反式”取向，或者“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于亚乙烯基(ethylenylene)或亚乙烯基(vinylene) (-CH=CH-)、烯丙基(-CH2CH=CH-)等。
术语“炔基”是指具有两个至八个碳原子(C2-C8)的任何长度和至少一个不饱和位点(即，碳-碳sp三键)的直链或支链单价烃基，其中炔基可以任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基，-CH2C≡CH)等。
术语“亚炔基”是指具有两个至八个碳原子(C2-C8)的任何长度和至少一个不饱和位点(即，碳-碳sp三键)的直链或支链二价烃基，其中亚炔基可以任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。实例包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(亚炔丙基(propargylene)，-CH2C≡C-)等。
术语“碳环(carbocycle)”、“碳环基”、“碳环(carbocyclic ring)”和“环烷基”是指具有3至12个碳原子(C3-C12)作为单环或者7至12个碳原子作为双环的单价非芳族、饱和或部分不饱和的环。具有7至12个原子的双环碳环可以排列成例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，并且具有9或10个环原子的双环碳环可以排列成双环[5,6]或[6,6]系统，或者排列成桥联系统，诸如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。螺环部分也包括在此定义的范围内。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。碳环基任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。
“芳基”意指通过从亲本芳族环系统的单个碳原子上移除一个氢原子得到的6-20个碳原子(C6-C20)的单价芳族烃基。一些芳基在示例性结构中表示为“Ar”。芳基包括包含稠合到饱和、部分不饱和环或芳族碳环的芳环的双环基团。典型的芳基包括但不限于衍生自苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯、茚基、茚满基、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘基等的基团。芳基任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。
“亚芳基”意指通过从亲本芳族环系统的两个碳原子上移除两个氢原子得到的6-20个碳原子(C6-C20)的二价芳族烃基。一些亚芳基在示例性结构中表示为“Ar”。亚芳基包括包含稠合到饱和、部分不饱和环或芳族碳环的芳环的双环基团。典型的亚芳基包括但不限于衍生自苯(亚苯基)、取代的苯、萘、蒽、亚联苯基、亚茚基、亚茚满基、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘基等的基团。亚芳基任选地被一个或多个本文所述的取代基取代。
术语“杂环”、“杂环基”和“杂环状环”在本文中可互换使用，并且是指饱和或部分不饱和(即，在环内具有一个或多个双键和/或三键)的3至约20个环原子的碳环基团，其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和硫的杂原子，其余环原子是C，其中一个或多个环原子任选地被一个或多个下述取代基独立地取代。杂环可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子和1至4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至6个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂环描述于Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W.A.Benjamin, New York, 1968),特别是第1、3、4、6、7和9章；“The Chemistry ofHeterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley&Sons, New York,1950年至今),特别是第13、14、16、19和28卷；以及J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566中。“杂环基”还包括其中杂环基团与饱和的、部分不饱和的环或芳族碳环或杂环状环稠合的基团。杂环状环的实例包括但不限于吗啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫代吗啉-4-基、S-二氧代硫吗啉-4-基、氮杂环辛烷-1-基、氮杂环丁烷-1-基、八氢吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮杂环庚烷-1-基、吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫代吗啉代、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂䓬基、二氮杂䓬基、硫氮杂䓬基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、氮杂双环[2.2.2]己烷基、3H-吲哚基喹嗪基和N-吡啶基脲。螺环部分也包括在此定义的范围内。其中2个环原子被氧代(=O)部分取代的杂环基团的实例是嘧啶酮基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。本文的杂环基团任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。
术语“杂芳基”是指5、6或7元环的单价芳族基团，并且包括5-20个原子的稠环系统(其中的至少一个是芳族的)，含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。杂芳基的实例是吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、1-甲基-1H-苯并[d]咪唑，[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋呫基、苯并呋呫基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。杂芳基任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。
杂环或杂芳基在可能的情况下可以是碳(碳连接)或氮(氮连接)键合的。举例而非限制，碳键合的杂环或杂芳基键合在吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮丙啶的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位；喹啉的2、3、4、5、6、7或8位；或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。
举例而非限制，氮键合的杂环或杂芳基键合在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉的2位；吗啉的4位；和咔唑或β-咔啉的9位。
术语“手性”是指具有镜像配偶体(mirror image partner)的不可重叠(non-superimposability)特性的分子，而术语“非手性”是指在其镜像配偶体上可以重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但是关于原子或基团在空间上的排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性和反应性。可在高分辨率分析方法(诸如电泳和色谱法)下可分离非对映异构体的混合物。
“对映异构体”是指化合物的彼此为不可重叠的镜像的两个立体异构体。
除非另有说明，否则使用以下定义：卤代基或卤素是氟、氯、溴或碘。烷基和烷氧基等表示直链基团与支链基团两者，但提及诸如丙基的单个基团仅包括直链基团(明确提及诸如异丙基的支链异构体)。
如本文所用，其中a和b为整数的术语“(Ca-Cb)烷基”是指具有a至b个碳原子的直链或支链烷基。因此当a为1且b为6时，例如，所述术语包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
术语“氨基氮保护基团”(P)是指在合成过程中可以保护胺基的任何保护基团(例如，BOC基团)。
以下关于基团、取代基以及范围所列的特定值仅用于说明；它们不排除用于基团和取代基的其他确定值或确定范围内的其他值。
具体地说，(C1-C6)烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基。
本文使用的立体化学定义和惯例通常遵循S. P. Parker编辑,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984) McGraw-Hill Book Company, New York；以及Eliel, E和Wilen, S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994) John Wiley&Sons, Inc., New York。许多有机化合物以光学活性形式存在，即，它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物的平面偏振光的旋转标记，其中用(-)或1表示化合物是左旋的。具有(+)或d前缀的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体是相同的，不同之处在于它们为彼此的镜像。还可以将特定的立体异构体称为对映异构体，以及此类异构体的混合物经常被称为对映异构体混合物。50:50的对映异构体混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，其可以出现在化学反应或过程中一直没有立体选择性或立体特异性的情况下。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种没有光学活性的对映异构体种类的等摩尔混合物。
如本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指抗体-药物偶联物(ADC)的药学上可接受的有机或无机盐。示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、反式丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐(glucuronate)、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可能涉及包括另一种分子，诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可以是稳定亲本化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个带电原子。在多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况下，药学上可接受的盐可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
以下缩写用于本文并具有指定的定义：BME为β-巯基乙醇，Boc为N-(叔丁氧基羰基)，cit为瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)，DCC为1,3-二环己基碳二亚胺，DCM为二氯甲烷，DEA为二乙胺，DEAD为偶氮二甲酸二乙酯，DEPC为磷酰基氰酸二乙酯，DIAD为偶氮二甲酸二异丙酯，DIEA为N,N-二异丙基乙胺，DMA为二甲基乙酰胺，DMAP为4-二甲基氨基吡啶，DME为乙二醇二甲基醚(或1,2-二甲氧基乙烷)，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，DMSO为二甲亚砜，DTT为二硫苏糖醇，EDCI为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，EEDQ为2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉，ES-MS为电喷射质谱法，EtOAc为乙酸乙酯，Fmoc为N-(9-芴基甲氧基羰基)，gly为甘氨酸，HATU为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐，HOBt为1-羟基苯并三唑，HPLC为高压液相色谱法，ile为异亮氨酸，lys为赖氨酸，MeCN(CH3CN)为乙腈，MeOH为甲醇，Mtr为4-茴香基二苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，PBS为磷酸盐缓冲盐水(pH 7)，PEG为聚乙二醇或乙二醇单元(-OCH2CH2-)，Ph为苯基，Pnp为对硝基苯基，MC为6-马来酰亚胺基己酰基，phe为L-苯丙氨酸，PyBrop为三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐，SEC为尺寸排阻色谱法，Su为琥珀酰亚胺，TFA为三氟乙酸，TLC为薄层色谱法，UV为紫外线，并且val为缬氨酸。
抗体单元(Ab或AB)
如上所述，本文的术语“抗体”(或“Ab”或“AB”)以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及表现出所需生物活性的抗体片段。因此，术语“抗体”包括其抗体片段，并且因此与术语“抗体或其片段”互换使用。此外，尽管本文所述的本发明的某些方面涉及抗体-药物偶联物，但还预想到，偶联物的抗体部分可以用与受体、抗原或与给定靶细胞群体相关的其他接受部分特异性结合或反应性缔合或复合的任何物质代替。例如，代替含有抗体，本发明的偶联物可以含有靶向分子(也称为结合剂)，该靶向分子与受体、抗原或寻求进行治疗或生物修饰的细胞群体的其他接受部分结合、复合或反应。此类分子的实例包括较小分子量的蛋白质、多肽或肽、凝集素、糖蛋白、非肽、维生素、营养物质转运分子(诸如但不限于转铁蛋白)或者任何其他细胞结合分子或物质。在某些方面，抗体或其他此类靶向分子用于将药物递送至与抗体或其他靶向分子相互作用的特定靶细胞群体。
在另一方面，本发明涉及抗体-药物偶联物化合物，其中抗体AB选自：吉妥珠单抗(gemtuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab) (Herceptin®)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(Perjeta®)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊诺珠单抗(inotuzumab)、匹那妥珠单抗(pinatuzumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、维泊妥珠单抗(polatuzumab)、考妥昔单抗(coltuximab)、洛沃妥珠单抗(lovotuzumab)、沙西妥珠单抗(sacituzumab)、阿奈妥单抗(anetumab)、阿普卢妥单抗(aprutumab)、达雷木单抗(aratumumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿妥昔珠单抗(azintuxizumab)、贝伐单抗(bevacizumab) (Avastin®)、比伐单抗(bivatuzumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、卡米丹卢单抗(camidanlumab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab) (Erbitux®)、考非妥珠单抗(cofetuzumab)、地宁妥珠单抗(denintuzumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)、恩福妥珠单抗(enfortumab)、格巴妥木单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、艾妥珠单抗(iladatuzumab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、英达斯妥珠单抗(industuzumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、纬拉妥珠单抗(ladiratuzumab)、拉妥昔单抗(laprituximab)、利法妥珠单抗(lifastuzumab)、朗妥昔单抗(loncastuximab)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)、鲁帕妥单抗(lupartumab)、米拉组单抗(milatuzumab)、索米妥昔单抗(mirvetuximab)、那妥昔单抗(naratuximab)、那他珠单抗(natalizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞利珠单抗(ocrelizumab)、奥法妥木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗、利妥昔单抗(rituximab) (Rituxan®)、洛伐妥珠单抗(rovalpituzumab)、斯妥尤单抗(sirtratumab)、索非妥珠单抗(sofituzumab)、特利妥珠单抗(telisotuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗和伐达妥昔单抗(vadastuximab)。在某些实施方案中，抗体AB选自由以下组成的组：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、吉妥珠单抗和伐达妥昔单抗。
在另一方面，本发明涉及抗体-药物偶联物化合物，其中抗体AB选自：吉妥珠单抗、曲妥珠单抗(Herceptin®)、帕妥珠单抗(Perjeta®)、伊妥木单抗、伊诺珠单抗、匹那妥珠单抗、艾那妥单抗(enapotamab)、依帕珠单抗、维泊妥珠单抗、考妥昔单抗、洛沃妥珠单抗、沙西妥珠单抗、阿奈妥单抗、阿普卢妥单抗、达雷木单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、阿妥昔珠单抗、贝伐单抗(Avastin®)、玛贝兰妥单抗(belantamab)、比伐单抗、本妥昔单抗、卡米丹卢单抗、坎妥珠单抗、西妥昔单抗(Erbitux®)、考非妥珠单抗、德达博妥单抗(datopotamab)、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)、地宁妥珠单抗、迪西妥单抗(disatamab)、度伐利尤单抗、埃洛妥珠单抗、恩福妥珠单抗、法妥珠单抗(farletuzumab)、吉姆单抗(gemtuzumab)、格巴妥木单抗、替伊莫单抗、艾菲那塔单抗(ifinatamab)、艾妥珠单抗、英达妥昔单抗、英达斯妥珠单抗、英度妥单抗(indusatumab)、拉贝珠单抗、纬拉妥珠单抗、拉妥昔单抗、利法妥珠单抗、朗妥昔单抗、洛沃妥珠单抗、鲁帕妥单抗、鲁韦妥单抗(luveltamab)、米拉组单抗、索米妥昔单抗、美博妥单抗(mecbotamab)、莫塞妥莫单抗(moxetumomab)、那妥昔单抗、那他珠单抗、耐昔妥珠单抗、奥妥珠单抗、奥瑞利珠单抗、奥法妥木单抗、奥拉单抗、奥培吉巴特(opelkibart)、欧瑞氟他马(ozuriftamab)、帕尼单抗、帕曲妥单抗(patritumab)、普罗妥单抗(praluzatamab)、利妥昔单抗(Rituxan®)、瑞鲁妥昔单抗(Raludotatug)、洛伐妥珠单抗、斯妥尤单抗、西戈妥妥珠单抗(sigvotatugum)、索非妥珠单抗、特利妥珠单抗、替索妥单抗(tisotumab)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、特赛妥单抗(tusamitamab)、伐达妥昔单抗、沃布拉米塔木单抗(vobramitamab)、沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)、泽罗妥单抗(zilovertamab)和伦康依隆妥单抗(zalontamab)。在某些实施方案中，抗体AB选自由以下组成的组：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、吉妥珠单抗和伐达妥昔单抗。
抗体单元上可能存在的杂原子包括硫(在一个实施方案中，来自抗体的巯基)、氧(在一个实施方案中，来自抗体的羰基、羧基或羟基)和氮(在一个实施方案中，来自抗体的伯或仲氨基)。这些杂原子可以抗体的天然状态存在于抗体上，或者可以经由化学修饰引入抗体中。
在一个实施方案中，抗体单元具有巯基，并且抗体单元经由巯基的硫原子结合。
在另一个实施方案中，抗体具有赖氨酸残基，其可以与活化酯(此类酯包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯基和对硝基苯基酯)反应，并因此形成由抗体单元的氮原子和羰基组成的酰胺键。在另一个实施方案中，活化酯包括N-羟基琥珀酰亚胺和苯基酯(-C(=O)OPh)，其中苯基任选地被一个或多个氟、氯、溴、碘或硝基取代。
在又一方面，抗体单元具有一个或多个可以被化学修饰以引入一个或多个巯基的赖氨酸残基。可以用于修饰赖氨酸的试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯(NHS酯)、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)和2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(特劳特试剂(Traut's Reagent))。
在另一个实施方案中，抗体单元可以具有一个或多个可以被化学修饰以具有一个或多个巯基的碳水化合物基团。
在又一个实施方案中，抗体单元可以具有一个或多个可以被氧化以提供醛基的碳水化合物基团。对应的醛可以与反应位点形成键，诸如例如肼和羟胺。用于修饰蛋白质以连接或缔合药物的其他方案描述于Coligan等人，Current Protocols in Protein Science,第2卷, John Wiley&Sons (2002)中。
有用的多克隆抗体是来源于免疫动物血清的抗体分子的异质群体。有用的单克隆抗体是针对特定抗原决定簇(例如，癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学物质、核酸或其片段)的抗体的同质群体。针对感兴趣的抗原的单克隆抗体(mAb)可以通过使用本领域已知的任何技术来制备，该技术通过培养中的连续细胞系来提供抗体分子的生产。
有用的单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合单克隆抗体。人单克隆抗体可以通过本领域已知的多种技术中的任何一种来制备。
抗体也可以是双特异性抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。
抗体可以是与靶细胞(例如，肿瘤相关抗原、癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)免疫特异性结合的抗体或者与肿瘤细胞或基质结合的其他抗体的功能活性片段、衍生物或类似物。“功能活性”片段、衍生物或类似物能够与完整抗体结合相同的抗原/表位。在某些实施方案中，“功能活性”片段、衍生物或类似物能够引发抗-抗独特型抗体，这些抗体识别与衍生该片段、衍生物或类似物的抗体所识别的抗原相同的抗原。具体来说，在一个示例性实施方案中，免疫球蛋白分子独特型的抗原性可以通过缺失框架和CDR序列来增强，所述框架和CDR序列位于特异性识别抗原的CDR序列的C末端。为了确定哪些CDR序列结合抗原，含有CDR序列的合成肽可以通过本领域已知的任何结合测定方法(例如BIA核心测定)用于与抗原的结合测定。
其他有用的抗体包括抗体片段，诸如但不限于F(ab′)2片段、Fab片段、单链抗体、双抗体、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、scFv、scFv-Fc或具有与抗体相同的特异性的任何其他分子。
另外，包含人和非人部分的重组抗体(诸如嵌合和人源化单克隆抗体)是有用的抗体，这些重组抗体可以使用标准重组DNA技术制备。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同的动物物种的分子，诸如例如具有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些嵌合抗体。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。此类嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。
完全人抗体是特别需要的，并且可以使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因，但是可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来产生。用选择的抗原以正常方式使转基因小鼠免疫，例如以产生本发明的全部或部分多肽。可以使用传统的杂交瘤技术获得针对该抗原的单克隆抗体。通过转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能使用本领域技术人员已知的方法产生治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。可以从许多公司商业获得其他人抗体。
可以使用被称为“导向选择”的技术生成识别选择的表位的完全人抗体。在这种方法中，选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择。也可以使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库产生人抗体。
在其他实施方案中，抗体是抗体的融合蛋白或其功能活性片段，例如其中抗体经由共价键(例如肽键)在N-末端或C-末端与并非来自抗体的另一种蛋白质(或其部分，优选该蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列融合。
抗体包括被修饰，即通过共价连接任何类型的分子而被修饰的类似物和衍生物，只要这种共价连接允许抗体保持其抗原结合免疫特异性。例如，而非作为限制，抗体的衍生物和类似物包括已被进一步修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、与细胞抗体单元或其他蛋白质的连接等进行进一步修饰的衍生物和类似物。许多化学修饰中的任何一种都可以通过已知技术进行，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、在衣霉素(tunicamycin)存在下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可以含有一个或多个非天然氨基酸。
抗体可以在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如，取代、缺失或添加)。特别地，抗体可以在被鉴定为参与和FcRn受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰。
对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可以商业获得或者通过本领域技术人员已知的任何方法产生，诸如例如化学合成或重组表达技术。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可以从例如GenBank数据库或类似数据库、文献出版物中获得，或者通过常规克隆和测序获得。
在一个具体实施方案中，可以使用用于治疗癌症的已知抗体。对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可以商业获得或者通过本领域技术人员已知的任何方法产生，诸如例如重组表达技术。编码对癌细胞抗原(肿瘤相关抗原)具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可以从例如GenBank数据库或类似数据库、文献出版物中获得，或者通过常规克隆和测序获得。
肿瘤相关抗原(TAA)的实例包括但不限于本文列出的TAA (1)-(100)。为了方便起见，在大多数情况下，与这些抗原有关的信息(所有这些信息都是本领域已知的)在本文中列出，并且在大多数情况下包括名称、替代名称、GenBank登录号和主要参考文献，遵循国家生物技术信息中心(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定惯例。可在公共数据库，诸如GenBank中获得对应于TAA (1)-(100)的核酸和蛋白质序列。抗体靶向的肿瘤相关抗原包括相对于引用的参考文献中鉴定的序列具有至少约70%、80%、85%、90%或95%序列同一性，或者表现出与具有引用的参考文献中发现的序列的TAA基本上相同的生物学特性或特征的所有氨基酸序列变体和同种型。例如，具有变异序列的TAA一般能够与抗体特异性结合，该抗体与具有所列的对应序列的TAA特异性结合。本文具体引用的参考文献中的序列和公开内容明确以引用的方式并入。
TAA的具体的非限制性实例包括：
(1) BMPR1B (骨形态发生蛋白受体-IB型，GenBank登录号NM_001203)；tenDijke, P.等人,Science, 1994,264(5155):101-104；Oncogene, 1997,14(11):1377-1382)；WO 2004/063362 (权利要求2)；WO 2003/042661 (权利要求12)；US 2003/134790(第38-39页)；WO 2002/102235 (权利要求13；第296页)；WO 2003/055443 (第91-92页)；WO2002/99122 (实施例2；第528-530页)；WO 2003/029421 (权利要求6)；WO 2003/024392(权利要求2；图112)；WO 2002/98358 (权利要求1；第183页)；WO 2002/54940 (第100-101页)；WO 2002/59377(第349-350页)；WO 2002/30268 (权利要求27；第376页)；WO 2001/48204 (实施例；图4) NP_001194骨形态发生蛋白受体, IB型/pid=NP_001194.1 -交叉引用：MIM:603248；NP_001194.1；AY065994。
(2) E16 (LAT1, SLC7A5，GenBank登录号NM_003486);Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999,255(2), 283-288；Nature, 1998,395(6699):288-291；Gaugitsch, H.W.等人,J. Biol. Chem., 1992,267(16):11267-11273)；WO 2004/048938 (实施例2)；WO2004/032842 (实施例IV)；WO 2003/042661 (权利要求12)；WO 2003/016475 (权利要求1)；WO 2002/78524 (实施例2)；WO 2002/99074 (权利要求19；第127-129页)；WO 2002/86443 (权利要求27；第222、393页)；WO 2003/003906 (权利要求10；第293页)；WO 2002/64798 (权利要求33；第93-95页)；WO 2000/14228 (权利要求5；第133-136页)；US 2003/224454 (图3)；WO 2003/025138 (权利要求12；第150页)；NP_003477溶质载体家族7 (阳离子氨基酸转运蛋白, y+系统),成员5 /pid=NP_003477.3 -智人交叉引用：MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1。
(3) STEAP1 (前列腺的六跨膜上皮细胞抗原，GenBank登录号NM_012449)；Cancer Res., 2001,61(15), 5857-5860；Hubert, R.S.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,96(25):14523-14528)；WO 2004/065577 (权利要求6)；WO 2004/027049 (图1L)；EP1394274 (实施例11)；WO 2004/016225 (权利要求2)；WO 2003/042661 (权利要求12)；US2003/157089 (实施例5)；US 2003/185830 (实施例5)；US 2003/064397 (图2)；WO 2002/89747 (实施例5；第618-619页)；WO 2003/022995 (实施例9；图13A，实施例53；第173页，实施例2；图2A)； NP_036581前列腺的六跨膜上皮细胞抗原交叉引用：MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1。
(4) 0772P (CA125，MUC16，GenBank登录号AF361486)；J. Biol. Chem., 2001,276(29):27371-27375；WO 2004/045553 (权利要求14)；WO 2002/92836 (权利要求6；图12)；WO 2002/83866 (权利要求15；第116-121页)；US 2003/124140 (实施例16)。交叉引用：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1。
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR,巨核细胞强化因子,间皮蛋白(mesothelin)，GenBank登录号NM_005823)；Yamaguchi, N.等人,Biol. Chem., 1994,269(2), 805-808；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1999,96(20):11531-11536；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996,93(1):136-140；J. Biol. Chem., 1995,270(37):21984-21990；WO 2003/101283 (权利要求14)；(WO 2002/102235 (权利要求13；第287-288页)；WO 2002/101075(权利要求4；第308-309页)；WO 2002/71928 (第320-321页)；WO 9410312 (第52-57页)；交叉引用：MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1。
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2,溶质载体家族34 (磷酸钠),成员2,II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b，GenBank登录号NM_006424)；J. Biol. Chem., 2002,277(22):19665-19672；Genomics, 1999,62(2):281-284；Feild, J.A.等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999,258(3):578-582)；WO 2004/022778 (权利要求2)；EP1394274 (实施例11)；WO 2002/102235 (权利要求13；第326页)；EP 875569 (权利要求1；第17-19页)；WO 2001/57188 (权利要求20；第329页)；WO 2004/032842 (实施例IV)；WO200175177 (权利要求24；第139-140页)；交叉引用：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1。
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG,脑信号蛋白(Semaphorin) 5b Hlog, sema结构域,七个血小板反应蛋白重复序列(1型和类1型),跨膜结构域(TM)和短胞质结构域, (脑信号蛋白) 5B，GenBank登录号AB040878)；Nagase T.等人,DNA Res., 2000,7(2):143-150)；WO 2004/000997 (权利要求1)；WO 2003/003984 (权利要求1)；WO 2002/06339 (权利要求1；第50页)；WO 2001/88133 (权利要求1；第41-43、48-58页)；WO 2003/054152 (权利要求20)；WO 20031/01400 (权利要求11)；登录号：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1. Genew；HGNC:10737。
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12,RIKEN cDNA 2700050C12基因，GenBank登录号AY358628)；Ross等人,Cancer Res., 2002,62:2546-2553；US 2003/129192 (权利要求2)；US 2004/044180 (权利要求12)；US 2004/044179 (权利要求11)；US 2003/096961 (权利要求11)；US 2003/232056 (实施例5)；WO2003/105758 (权利要求12)；US 2003/206918 (实施例5)；EP 1347046 (权利要求1)；WO2003/025148 (权利要求20)；交叉引用：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1。
(9) ETBR (内皮缩血管肽B型受体，GenBank登录号AY275463)；Nakamuta M.等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991,177:34-39；Ogawa Y.等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991,178, 248-255；Arai, H.等人,Jpn. Circ. J., 1992,56:1303-1307；Arai, H.等人,J. Biol. Chem., 1993,268:3463-3470；Sakamoto A., YanagisawaM.等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991,178:656-663；Elshourbagy N.A.等人,J. Biol. Chem., 1993,268:3873-3879；Haendler B.等人,J. Cardiovasc. Pharmacol.,1992,20:s1-S4；Tsutsumi M.等人,Gene, 1999,228:43-49；Strausberg, R.L.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002,99:16899-16903；Bourgeois C.等人,J. Clin. Endocrinol. Metab., 1997,82, 3116-3123；Okamoto Y.等人,Biol. Chem., 1997,272:21589-21596；Verheij, J.B.,Am. J. Med. Genet., 2002,108:223-225；Hofstra,R.M.W.等人,Eur. J. Hum. Genet., 1997,5:180-185；Puffenberger E.G.等人,Cell,1994,79:1257-1266；Attie T.等人,Hum. Mol. Genet., 1995,4:2407-2409；AuricchioA.等人,Hum. Mol. Genet., 1996,5:351-354；Amiel J.等人, Hum. Mol. Genet. 5,355-357, 1996；Hofstra R.M.W.等人, Nat. Genet., 1996,12:445-447；Svensson, P.J.等人,Hum. Genet., 1998,103:145-148；Fuchs, S.等人,Mol. Med., 2001,7:115-124；Pingault V.等人, Hum. Genet., 2002, 111:198-206；WO 2004/045516 (权利要求1)；WO2004/048938 (实施例2)；WO 2004/040000 (权利要求151)；WO 2003/087768 (权利要求1)；WO 2003/016475 (权利要求1)；WO 2003/016475 (权利要求1)；WO 2002/61087 (图1)；WO 2003/016494 (图6)；WO 2003/025138 (权利要求12；第144页)；WO 2001/98351 (权利要求1；第124-125页)；EP 522868 (权利要求8；图2)；WO 2001/77172 (权利要求1；第297-299页)；US 2003/109676；US 6,518,404 (图3)；US 5,773,223 (权利要求1a；Col 31-34)；WO 2004/001004。
(10) MSG783 (RNF124,假定蛋白(hypothetical protein) FLJ20315，GenBank登录号NM_017763)；WO 2003/104275 (权利要求1)；WO 2004/046342 (实施例2)；WO 2003/042661 (权利要求12)；WO 2003/083074 (权利要求14；第61页)；WO 2003/018621 (权利要求1)；WO 2003/024392 (权利要求2；图93)；WO 2001/66689 (实施例6)；交叉引用：LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1。
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP,前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮抗原2，六跨膜前列腺蛋白，GenBank登录号AF455138) Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002))；WO 2003/087306；US 2003/064397 (权利要求1；图1)；WO 2002/72596 (权利要求13；第54-55页)；WO 2001/72962 (权利要求1；图4B)；WO 2003/104270 (权利要求11)；WO 2003/104270 (权利要求16)；US 2004/005598 (权利要求22)；WO 2003/042661 (权利要求12)；US 2003/060612(权利要求12；图10)；WO 2002/26822 (权利要求23；图2)；WO 2002/16429 (权利要求12；图10)；交叉引用：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1。
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B,瞬时受体电位阳离子通道,亚族M,成员4，GenBank登录号NM_017636) Xu, X.Z.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001,98(19):10692-10697；Cell, 2002,109(3):397-407；J. Biol. Chem.,2003,278(33):30813-30820；US 2003/143557 (权利要求4)；WO 2000/40614 (权利要求14；第100-103页)；WO 2002/10382 (权利要求1；图9A)；WO 2003/042661 (权利要求12)；WO2002/30268 (权利要求27；第391页)；US 2003/219806 (权利要求4)；WO 2001/62794 (权利要求14；图1A-D)；交叉引用：MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1。
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1,畸胎瘤衍生的生长因子，GenBank登录号NP_003203或NM_003212)；Ciccodicola, A.等人,EMBO J., 1989,8(7):1987-1991；Am. J. Hum. Genet., 1991,49(3):555-565；US 2003/224411 (权利要求1)；WO 2003/083041 (实施例1)；WO 2003/034984 (权利要求12)；WO 2002/88170 (权利要求2；第52-53页)；WO 2003/024392 (权利要求2；图58)；WO 2002/16413 (权利要求1；第94-95、105页)；WO 2002/22808 (权利要求2；图1)；US 5,854,399 (实施例2；Col 17-18)；US5,792,616 (图2)；交叉引用：MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1。
(14) CD21 (CR2 (补体受体2)或C3DR (C3d/EB病毒受体(Epstein Barr virusreceptor))或Hs.73792 GenBank登录号M26004)；Fujisaku等人,J. Biol. Chem., 1989,264(4):2118-2125)；Weis J.J.等人,J. Exp. Med., 1988,167:1047-1066；Moore M.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1987,84:9194-9198；Barel M.等人,Mol. Immunol., 1998,35:1025-1031；Weis J.J.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,1986,83:5639-5643；Sinha S.K.等人,J. Immunol., 1993,150:5311-5320；WO 2004/045520 (实施例4)；US 2004/005538 (实施例1)；WO 2003/062401 (权利要求9)；WO 2004/045520 (实施例4)；WO 9102536 (图9.1-9.9)；WO 2004/020595 (权利要求1)；登录号：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1。
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (免疫球蛋白相关β), B29，GenBank登录号NM_000626或11038674)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2003,100(7):4126-4131；Blood,2002,100(9):3068-3076；Muller等人,Eur. J. Immunol., 1992,22(6):1621-1625；WO2004/016225 (权利要求2，图140)；WO 2003/087768、US 2004/101874 (权利要求1，第102页)；WO 2003/062401 (权利要求9)；WO 2002/78524 (实施例2)；US 2002/150573 (权利要求5，第15页)；US 5,644,033；WO 2003/048202 (权利要求1，第306和309页)；WO 99/558658、US 6,534,482 (权利要求13，图17A/B)；WO 2000/55351 (权利要求11，第1145-1146页)；交叉引用：MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1。
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a),SPAP1B, SPAP1C，GenBank登录号NM_030764、AY358130)；Genome Res., 2003,13(10):2265-2270；Immunogenetics, 2002,54(2):87-95；Blood, 2002,99(8):2662-2669；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001,98(17):9772-9777；Xu, M.J.等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001,280(3):768-775；WO 2004/016225 (权利要求2)；WO 2003/077836；WO 2001/38490 (权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO 2003/097803 (权利要求12)；WO 2003/089624 (权利要求25)；交叉引用：MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1。
(17) HER2 (ErbB2，GenBank登录号M11730)；Coussens, L.等人,Science, 1985,230(4730):1132-1139)；Yamamoto, T.等人,Nature, 1986,319:230-234；Semba, K.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985,82:6497-6501；Swiercz, J.M.等人,J. Cell Biol.,2004,165:869-880；Kuhns, J.J.等人,J. Biol. Chem., 1999,274:36422-36427；Cho H.-S.等人,Nature, 1993,421:756-760；Ehsani, A.等人,Genomics, 1993,15:426-429；WO 2004/048938 (实施例2)；WO 2004/027049 (图1I)；WO 2004/009622；WO 2003/081210；WO 2003/089904 (权利要求9)；WO 2003/016475 (权利要求1)；US 2003/118592；WO 2003/008537 (权利要求1)；WO 2003/055439 (权利要求29；图1A-B)；WO 2003/025228(权利要求37；图5C)；WO 2002/22636 (实施例13；第95-107页)；WO 2002/12341 (权利要求68；图7)；WO 2002/13847 (第71-74页)；WO 2002/14503 (第114-117页)；WO 2001/53463(权利要求2；第41-46页)；WO 2001/41787 (第15页)；WO 2000/44899 (权利要求52；图7)；WO 2000/20579 (权利要求3；图2)；US 5,869,445 (权利要求3；Col 31-38)；WO 9630514(权利要求2；第56-61页)；EP 1439393 (权利要求7)；WO 2004/043361 (权利要求7)；WO2004/022709；WO 2001/00244 (实施例3；图4)；登录号：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1。
(18) NCA (CEACAM6，GenBank登录号M18728)；Barnett T.等人,Genomics, 1988,3:59-66；Tawaragi, Y.等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988,150:89-96；Strausberg, R.L.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002,99:16899-16903；WO2004/063709；EP 1439393 (权利要求7)；WO 2004/044178 (实施例4)；WO 2004/031238；WO2003/042661 (权利要求12)；WO 2002/78524 (实施例2)；WO 2002/86443 (权利要求27；第427页)；WO 2002/60317 (权利要求2)；登录号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728。
(19) MDP (DPEP1，GenBank登录号BC017023)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,2002,99(26):16899-16903；WO 2003/016475 (权利要求1)；WO 2002/64798 (权利要求33；第85-87页)；JP 05003790 (图6-8)；WO 9946284 (图9)；交叉引用：MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1。
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7，GenBank登录号AF184971)；Clark H.F.等人,Genome Res., 2003,13:2265-2270；Mungall A.J.等人,Nature, 2003,425:805-811；Blumberg H.等人,Cell,2001,104:9-19；Dumoutier L.等人,J. Immunol., 2001,167:3545-3549；Parrish-Novak J.等人,J. Biol. Chem., 2002,277:47517-47523；Pletnev,S.等人,Biochemistry, 2003,42:12617-12624；Sheikh F.等人,J. Immunol., 2004,172:2006-2010；EP 1394274 (实施例11)；US 2004/005320 (实施例5)；WO 2003/029262 (第74-75页)；WO 2003/002717 (权利要求2；第63页)；WO 2002/22153 (第45-47页)；US 2002/042366 (第20-21页)；WO 2001/46261 (第57-59页)；WO 2001/46232 (第63-65页)；WO9837193 (权利要求1；第55-59页)；登录号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1。
(21) 短蛋白聚糖(Brevican) (BCAN, BEHAB，GenBank登录号AF229053)；GaryS.C.等人,Gene,2000,256:39-147；Clark H.F.等人,Genome Res.,2003,13:2265-2270；Strausberg, R.L.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,2002,99:16899-16903；US2003/186372 (权利要求11)；US 2003/186373 (权利要求11)；US 2003/119131 (权利要求1；图52)；US 2003/119122 (权利要求1；图52)；US 2003/119126 (权利要求1)；US 2003/119121 (权利要求1；图52)；US 2003/119129 (权利要求1)；US 2003/119130 (权利要求1)；US 2003/119128 (权利要求1；图52)；US 2003/119125 (权利要求1)；WO 2003/016475(权利要求1)；WO 2002/02634 (权利要求1)。
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5，GenBank登录号NM_004442)Chan, J.和Watt, V.M.,Oncogene, 1991,6(6): 1057-1061;Oncogene, 1995,10(5):897-905；Annu. Rev. Neurosci., 1998,21:309-345;Int. Rev. Cytol., 2000,196:177-244；WO 2003/042661 (权利要求12)；WO 2000/53216 (权利要求1；第41页)；WO 2004/065576(权利要求1)；WO 2004/020583 (权利要求9)；WO 2003/004529 (第128-132页)；WO 2000/53216 (权利要求1；第42页)；交叉引用：MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1。
(23) ASLG659 (B7h，GenBank登录号AX092328) US20040101899 (权利要求2)；WO2003/104399 (权利要求11)；WO 2004/000221 (图3)；US 2003/165504 (权利要求1)；US2003/124140 (实施例2)；US 2003/065143 (图60)；WO 2002/102235 (权利要求13；第299页)；US 2003/091580 (实施例2)；WO 2002/10187 (权利要求6；图10)；WO 2001/94641 (权利要求12；图7b)；WO 2002/02624 (权利要求13；图1A-1B)；US 2002/034749 (权利要求54；第45-46页)；WO 2002/06317 (实施例2；第320-321页，权利要求34；第321-322页)；WO2002/71928 (第468-469页)；WO 2002/02587 (实施例1；图1)；WO 2001/40269 (实施例3；第190-192页)；WO 2000/36107 (实施例2；第205-207页)；WO 2004/053079 (权利要求12)；WO 2003/004989 (权利要求1)；WO 2002/71928 (第233-234、452-453页)；WO 0116318。
(24) PSCA (前列腺干细胞抗原前体，GenBank登录号AJ297436) Reiter R.E.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,1998,95:1735-1740；Gu Z.等人,Oncogene, 2000,19:1288-1296；Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000,275(3):783-788；WO 20040/22709；EP 1394274 (实施例11)；US 2004/018553 (权利要求17)；WO 2003/008537 (权利要求1)；WO 2002/81646 (权利要求1；第164页)；WO 2003/003906 (权利要求10；第288页)；WO 2001/40309 (实施例1；图17)；US 2001/055751 (实施例1；图1b)；WO 2000/32752 (权利要求18；图1)；WO 1998/51805 (权利要求17；第97页)；WO 1998/51824 (权利要求10；第94页)；WO 1998/40403 (权利要求2；图1B)；登录号：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1。
(25) GEDA (GenBank登录号AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合伴侣样蛋白/pid=AAP14954.1 -智人物种：智人(人) WO 2003/054152 (权利要求20)；WO 2003/000842(权利要求1)；WO 2003/023013 (实施例3，权利要求20)；US 2003/194704 (权利要求45)；交叉引用：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1。
(26) BAFF-R (B细胞-活化因子受体, BLyS受体3, BR3, GenBank登录号AF116456)；BAFF受体/pid=NP_443177.1 -智人Thompson, J.S.等人,Science, 2001,293(5537):2108-2111；WO 2004/058309；WO 2004/011611；WO 2003/045422 (实施例；第32-33页)；WO 2003/014294 (权利要求35；图6B)；WO 2003/035846 (权利要求70；第615-616页)；WO 2002/94852 (Col 136-137)；WO 2002/38766 (权利要求3；第133页)；WO 2002/24909(实施例3；图3)；交叉引用：MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600。
(27) CD22 (B细胞受体CD22-B同种型, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2,FLJ22814, GenBank登录号AK026467)；Wilson等人,J. Exp. Med., 1991,173:137-146；WO2003/072036 (权利要求1；图1)；交叉引用：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1。
(28) CD79a (CD79A, CD79α,免疫球蛋白相关α,一种B细胞特异性蛋白，其与Igβ(CD79B)共价相互作用并与Ig M分子在表面上形成复合物，转导参与B细胞分化的信号),pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Gene Chromosome: 19q13.2, GenBank登录号NP_001774.10) WO 2003/088808；US 2003/0228319；WO 2003/062401 (权利要求9)；US 2002/150573 (权利要求4，第13-14页)；WO 9958658 (权利要求13，图16)；WO 9207574 (图1)；US5,644,033；Ha等人,J. Immunol., 1992,148(5):1526-1531；Mueller等人,Eur. J. Biochem., 1992,22:1621-1625；Hashimoto等人,Immunogenetics, 1994,40(4):287-295；Preud’homme等人,Clin. Exp. Immunol., 1992,90(1):141-146；Yu等人,J. Immunol.,1992,148(2) 633-637；Sakaguchi等人,EMBO J., 1988,7(11):3457-3464。
(29) CXCR5 (伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)受体1,一种G蛋白偶联受体，其由CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用，在HIV-2感染中以及可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中起作用)；372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7[P] Gene Chromosome: 11q23.3, GenBank登录号NP_001707.1) WO 2004/040000；WO2004/015426；US 2003/105292 (实施例2)；US 6,555,339 (实施例2)；WO 2002/61087 (图1)；WO 2001/57188 (权利要求20，第269页)；WO 2001/72830 (第12-13页)；WO 2000/22129(实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页)；WO 1999/28468 (权利要求1，第38页)；US5,440,021 (实施例2, col 49-52)；WO 9428931 (第56-58页)；WO 1992/17497 (权利要求7，图5)；Dobner等人,Eur. J. Immunol., 1992,22:2795-2799；Barella等人,Biochem. J., 1995,309:773-779。
(30) HLA-DOB (结合肽并将其呈递至CD4+ T淋巴细胞的MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；273 aa, pI: 6.56 MW: 30820 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 6p21.3,GenBank登录号NP_002111.1)；Tonnelle等人,EMBO J., 1985,4(11):2839-2847；Jonsson等人,Immunogenetics,1989,29(6):411-413；Beck等人,J. Mol. Biol., 1992,228:433-441；Strausberg等人,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2002,99:16899-16903；Servenius等人,J. Biol. Chem., 1987,262:8759-8766；Beck等人,J. Mol. Biol., 1996,255:1-13；Naruse等人,Tissue Antigens, 2002,59:512-519；WO 9958658 (权利要求13，图15)；US6,153,408 (Col 35-38)；US 5,976,551 (col 168-170)；US 6,011,146 (col 145-146)；Kasahara等人,Immunogenetics, 1989,30(1):66-68；Larhammar等人,J. Biol. Chem.,1985,260(26):14111-14119。
(31) P2X5 (嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5,一种由胞外ATP门控的离子通道,其可能参与突触传递和神经发生，其缺陷可能造成自发性逼尿肌不稳定的病理生理学); 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 17p13.3, GenBank登录号NP_002552.2)；Le等人,FEBS Lett., 1997,418(1-2):195-199；WO 2004/047749；WO2003/072035 (权利要求10)；Touchman等人,Genome Res., 2000,10:165-173；WO 2002/22660 (权利要求20)；WO 2003/093444 (权利要求1)；WO 2003/087768 (权利要求1)；WO2003/029277 (第82页)。
(32) CD72 (B细胞分化抗原CD72, Lyb-2), pI: 8.66, MW: 40225 TM: 1 [P]Gene Chromosome: 9p13.3, GenBank登录号NP_001773.1) WO 2004042346 (权利要求65)；WO 2003/026493 (第51-52、57-58页)；WO 2000/75655 (第105-106页)；Von Hoegen等人,J. Immunol., 1990,144(12):4870-4877；Strausberg等人,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2002,99:16899-16903。
(33) LY64 (淋巴细胞抗原64 (RP105),富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白，其调节B细胞活化和凋亡，功能丧失与患有系统性红斑狼疮的患者的疾病活动增加相关)；661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 5q12, GenBank登录号NP_005573.1) US 2002/193567；WO 9707198 (权利要求11，第39-42页)；Miura等人,Genomics, 1996,38(3):299-304；Miura等人,Blood, 1998,92:2815-2822；WO 2003/083047；WO 9744452 (权利要求8，第57-61页)；WO 2000/12130 (第24-26页)。
(34) FcRH1 (Fc受体样蛋白1,一种含有C2型Ig样结构域和ITAM结构域的免疫球蛋白Fc结构域的推定受体,其可能在B淋巴细胞分化中起作用)；429 aa, pI: 5.28, MW:46925 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21-1q22, GenBank登录号NP_443170.1) WO2003/077836；WO 2001/38490 (权利要求6，图18E-1-18-E-2)；Davis等人,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2001,98(17):9772-9777；WO 2003/089624 (权利要求8)；EP 1347046(权利要求1)；WO 2003/089624 (权利要求7)。
(35) IRTA2 (免疫球蛋白超家族受体易位相关2,一种在B细胞发育和淋巴瘤生成中具有可能的作用的推定的免疫受体；由于易位所导致的基因失调在一些B细胞恶性肿瘤中发生)；977 aa, pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21, GenBank登录号人:AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085；小鼠:AK089756、AY158090、AY506558；NP_112571.1. WO2003/024392 (权利要求2，图97)；Nakayama等人,Biochem. Biophys. Res. Commun.,2000,277(1):124-127；WO 2003/077836；WO 2001/38490 (权利要求3，图18B-1-18B-2)。
(36) TENB2 (TMEFF2,脑肿瘤抑癌蛋白(tomoregulin), TPEF, HPP1, TR,与生长因子的EGF/调蛋白(heregulin)家族和卵泡抑素(follistatin)有关的推定的跨膜蛋白聚糖)；374 aa, NCBI登录号：AAD55776、AAF91397、AAG49451、NCBI RefSeq: NP_057276；NCBI基因: 23671；OMIM: 605734；SwissProt Q9UIK5；GenBank登录号AF179274；AY358907、CAF85723、CQ782436 WO 2004/074320；JP 2004113151；WO 2003/042661；WO 2003/009814；EP 1295944 (第69-70页)；WO 2002/30268 (第329页)；WO 2001/90304；US 2004/249130；US 2004/022727；WO 2004/063355；US 2004/197325；US 2003/232350；US 2004/005563；US2003/124579；Horie等人,Genomics, 2000,67:146-152；Uchida等人,Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999,266:593-602；Liang等人,Cancer Res., 2000,60:4907-12；Glynne-Jones等人, Int. J. Cancer, 2001,94(2):178-84。
(37) PMEL17 (银同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey, R.P.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2009,106(33):13731-13736；Kummer, M.P.等人,J. Biol. Chem.,2009,284(4):2296-2306。
(38) TMEFF1 (具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；脑肿瘤抑癌蛋白-1)；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961；NM_080655；NM_003692；Harms, P.W.,Genes Dev., 2003,17(21):2624-2629；Gery, S.等人, Oncogene, 2003,22(18):2723-2727。
(39) GDNF-Ra1 (GDNF家族受体α 1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；U95847；BC014962；NM_145793 NM_005264；Kim, M.H.等人,Mol. Cell. Biol., 2009,29(8):2264-2277；Treanor, J.J.等人,Nature, 1996,382(6586):80-83。
(40) Ly6E (淋巴细胞抗原6复合物,基因座E；Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen, A.G.等人,Int. J. Cancer, 2003,103(6): 768-774；Zammit, D.J.等人, Mol. Cell. Biol., 2002,22(3):946-952。
(41) TMEM46 (shisa同源物2 (非洲蟾蜍(Xenopus laevis))；SHISA2)；NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima, K.等人,Dev. Biol., 2007,306(2):480-492；Clark, H.F.等人,Genome Res., 2003,13(10):2265-2270。
(42) Ly6G6D (淋巴细胞抗原6复合物,基因座G6D；Ly6-D, MEGT1)；NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya, M.等人,Genomics, 2002,80(1):113-123；Ribas, G.等人,J. Immunol., 1999,163(1):278-287。
(43) LGR5 (含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49, GPR67)；NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti, G.等人, Am. J. Epidemiol., 2009,170(5):537-545；Yamamoto, Y.等人, Hepatology, 2003,37(3):528-533。
(44) RET (ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto, H.等人,Cancer Sci.,2009100(10):1895-1901；Narita, N.等人,Oncogene, 2009,28(34):3058-3068。
(45) LY6K (淋巴细胞抗原6复合物,基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa, N.等人,Cancer Res., 2007,67(24):11601-11611；deNooij-van Dalen, A.G.等人,Int. J. Cancer, 2003,103(6):768-774。
(46) GPR19 (G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit, A.和Sinnett, D.,Hum. Genet., 1999,105(1-2):162-164；O'Dowd, B.F.等人,FEBS Lett., 1996,394(3):325-329。
(47) GPR54 (KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot, J.M.等人,Mol. Pharmacol., 2009,75(6):1300-1306；Hata, K.等人,Anticancer Res.2009,29(2):617-623。
(48) ASPHD1 (含有天冬氨酸β-羟化酶结构域1；LOC253982)；NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard, D.S.等人,Genome Res., 2004,14(10B):2121-2127。
(49) 酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop, D.T.等人,Nat. Genet., 2009,41(8):920-925；Nan, H.等人,Int. J. Cancer, 2009,125(4):909-917。
(50) TMEM118 (环指蛋白,跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark, H.F.等人,Genome Res., 2003,13(10):2265-2270；Scherer, S.E.等人,Nature, 2006,440(7082):346-351。
(51) GPR172A (G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson, T.A.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2003,100(11):6759-6764；Takeda, S.等人,FEBS Lett., 2002,520(1-3):97-101。
(52) CD33 (唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素家族的成员)为67-kDa糖基化跨膜蛋白。在除了定向粒单核细胞和红系祖细胞之外的大多数骨髓和单核细胞白血病细胞上表达CD33。在最早的多能干细胞、成熟粒细胞、淋巴样细胞或非造血细胞上没有发现(Sabbath等人,J. Clin. Invest., 1985,75:756-56；Andrews等人,Blood, 1986,68:1030-5)。CD33在其胞质尾部含有两个酪氨酸残基，每个残基后面都有类似于在许多抑制受体中看到的免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)的疏水残基。
(53) CLL-1 (CLEC12A、MICL和DCAL2)编码C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的成员。这个家族的成员共享共同的蛋白质折叠并且具有不同功能，诸如细胞粘附、细胞间信号传导、糖蛋白周转以及在炎症和免疫反应中的作用。由该基因编码的蛋白质是粒细胞和单核细胞功能的负调节因子。已经描述了该基因的几种选择性剪接的转录物变体，但是这些变体中的一些变体的全长性质尚未确定。该基因与染色体12p13上的自然杀伤基因复合区中的其他CTL/CTLD超家族成员紧密连接(Drickamer, K.,Curr. Opin. Struct. Biol., 1999,9(5):585–90；van Rhenen, A.等人, Blood, 2007,110(7):2659–66；Chen, C.H.等人,Blood, 2006,107(4):1459–67；Marshall, A.S.等人,Eur. J. Immunol., 2006,36(8):2159–69；Bakker, A.B.等人,Cancer Res., 2005,64(22):8443–50；Marshall, A.S.等人,J. Biol. Chem., 2004,279(15):14792–802)。CLL-1已示出为II型跨膜受体，其包括单个C型凝集素样结构域(不能预测它结合钙或糖)、茎区、跨膜结构域和含有ITIM基序的短胞质尾。
(54) CD70 (CD27配体；CD27-L)；与CD27结合的细胞因子)在T细胞活化中起作用，并且诱导共刺激的T细胞的增殖，并增强溶细胞性T细胞的产生。CD70蛋白在高度活化的淋巴细胞，诸如T细胞和B细胞淋巴瘤上表达(Israel, B.F.等人,Mol. Cancer Ther., 2005,4(12):2037–44；O'Neill, R.E.等人,J. Immunol., 2017,199(10):3700-3710；Leigh, N.D.等人,J. Immunol., 2017,199(1):336-347；Itani, H. A.等人,Circ. Res., 2016,118(8):1233-43；Burchill, M.A.等人,Eur. J. Immunol.,2015,45(11):3140-9；Allam, A.等人,J. Immunol.,2014,193(2):871-8)。
(55) CLDN18.2 (密封蛋白(Claudin)-18剪接变体2)；CLDN18编码人基因密封蛋白18。它也可能被称为：密封蛋白-18；SFTA5；和SFTPJ。编码的蛋白质的氨基酸长度为261，并且质量为27.9 kDa。CLDN18为密封蛋白家族的成员(WO 2013/167295；WO 2016/166122)。紧密连接分子密封蛋白18同种型2 (CLDN 18.2)为密封蛋白18的癌症相关剪接变体。CLDN18.2为27.8 kDa跨膜蛋白，其包含四个跨膜结构域和两个小的胞外环(环1被疏水区1和疏水区2包围；环2被疏水区3和4包围)。CLDN 18.2为高度选择性的胃谱系抗原，其仅在短期分化的胃上皮细胞上表达并且在任何其他正常人组织中检测不到。该抗原在多种人癌症，包括胃食管癌和胰腺癌中以显著水平异位表达(Sahin, U.等人,Clin. Cancer Res., 2008,14(23):7624-34)。还经常在胃癌的淋巴结转移和远处转移(distant metastase)中检测到CLDN18.2蛋白。CLDN 18.2似乎涉及CLDN 18.2阳性肿瘤细胞的增殖，因为通过siRNA技术下调靶标导致胃癌细胞增殖的抑制。1MAB362是针对CLDN 18.2的IgGl亚型的嵌合单克隆抗体。1MAB362以高亲和力和特异性识别CLDN 1 8.2的第一个胞外结构域，并且不与任何其他密封蛋白家族成员(包括紧密相关的密封蛋白18的剪接变体1)结合。
(56) CD151(分化簇151, Tspan24, PETA-3, SFA-1)；来自Raph血型的人基因。由CD151基因编码的蛋白质为四次跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily) (也被称为四跨膜蛋白(tetraspanin)家族)的成员。这些成员中的大多数是细胞表面蛋白，其特征在于存在四个疏水结构域。这些蛋白质介导在调节细胞发育、活化、生长和运动中起作用的信号转导事件。这种编码的蛋白质为已知与整联蛋白和其他四次跨膜蛋白超家族蛋白复合的细胞表面糖蛋白。它参与包括细胞粘附的细胞过程，并可能调节整联蛋白运输和/或功能。这种蛋白质增强癌细胞的细胞能动性、侵袭和转移。编码相同蛋白质的多种选择性剪接的转录物变体已被描述用于该基因(Berditchevski F.,J. Cell Sci., 2002,114(Pt23):4143–51；Ashman, L.K.,J. Biol. Regul. Homeost. Agents,2003,16(3):223–6；Sincock, P.M.等人,J. Histochem. Cytochem., 1997,45(4):515–25；Fitter S等人,Biochim. Biophys. Acta., 1998,1398(1):75–85；Sincock, P.M.等人,J. Cell Sci.,1999,112(Pt 6):833–44；Sterk, L.M.等人,J. Cell Biol., 2000,149(4):969–82；Zhang, X.A.,Mol. Biol. Cell., 2002,13(1):1–11)。
(57) ITGaV (整联蛋白α-V,CD51；MSK8；VNRA；VTNR)；人中的蛋白质由ITGAV基因编码(Sosnoski, D. M.等人,J. Clin. Invest.,1988,81(6):1993–8)。ITGAV编码整联蛋白α链V。整联蛋白是由α链和β链构成的异二聚体整合膜蛋白。α V经历翻译后裂解以产生二硫键连接的重链和轻链，这些重链和轻链与多条整联蛋白β链结合以形成不同的整联蛋白。在已知的缔合β链(β链1、3、5、6和8；‘ITGB1’、‘ITGB3’、‘ITGB5’、‘ITGB6’和‘ITGB8’)中，每一者都可以与胞外基质配体相互作用；α V β 3整联蛋白(可能是其中研究最多的)被称为玻连蛋白受体(Vitronectin receptor，VNR)。除了粘附之外，已知许多整联蛋白促进信号转导。ITGAV基因的过表达与结肠直肠癌(Waisberg, J.等人,Anticancer Res., 2014,34(10):5599–607)和前列腺癌(Cooper, C. R.等人,Neoplasia,2002,4(3):191–4)的进展和扩散相关。单克隆抗体英妥木单抗(intetumumab)和阿比妥珠单抗(abituzumab)靶向这种在一些肿瘤细胞上发现的蛋白质(Élez, E.等人,Ann. Oncology, 2015,26(1):132–40)。
其他示例性抗原包括但不限于：(58)连接蛋白-4 (Nectin-4)；(59) FGFR2；(60)FGFR3；(61) gpNMB；(62) GUCY2C；(63) CLDN6；(64) cMET；(65) CEACAM4；(66) CEACAM5；(67) CD29；(68) CD37；(69) CD352；(70) CD248；(71) MUC1；(72) CD123；(73) BCMA；(74)ADAM9；(75) 5T4；(76) P-钙黏着蛋白；(77) CA9；(78) CD138；(79) CD166；(80) CD71；(81) CD22；(82) CD20；(83) CD74；(84) DLL3；(85)叶酸受体α；(86) ITGa2；(87) ITGa3；(88) LAMP1；(89) LIV-1；(90) MMP14；(91) LRCC15；(92) MSLN；(93) PMSA；(94) PRLR；(95) PTK7；(96) SLAMF7；(97) SCL44A4；(98) SLTRK5；(99) TM4SF1；和(100) TROP2。
在本发明的某些实施方案中，TAA选自由以下组成的组：TROP2、HER2、CD33、CD70、MUC1/CanAg、MUC16、CD151和ITGaV。
示例性抗体(例如，抗Trop2抗体)
本发明的某些实施方案提供了抗体或其片段(例如，抗原结合结构域)。在某些实施方案中，抗体或其片段不与有效载荷药物偶联。在某些实施方案中，抗体或其片段与有效载荷药物偶联。例如，本发明的抗体-药物偶联物包含抗体或其片段。
本发明的实施方案的范围包括本文所述的抗体或抗原结合结构域的功能变体。如本文所用的术语“功能变体”是指具有与亲本抗体或抗原结合结构域具有实质或显著序列同一性或相似性的抗原结合结构域的抗体，所述功能变体保留了其为变体的抗体或抗原结合结构域的生物活性。功能变体涵盖例如本文所述的抗体或抗原结合结构域(亲本抗体或抗原结合结构域)的那些变体，其以与亲本抗体或抗原结合结构域相似的程度、相同的程度或更高的程度保留了识别表达TAA (诸如Trop2)的靶细胞的能力。
关于抗体或抗原结合结构域，功能变体与该抗体或抗原结合结构域在氨基酸序列上可以例如具有至少约30%、约50%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的同一性。在某些实施方案中，抗体或抗原结合结构域或其功能变体与本文所述的抗体或抗原结合结构域在氨基酸序列上可以具有至少约75% (例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)或更高的同一性。
功能变体可例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列。替代地或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可增强功能变体的生物活性，使得功能变体的生物活性与亲本抗体或抗原结合结构域相比增加。
包括本发明的抗体-药物偶联物的抗体包括经Fc工程改造的变体。在一些实施方案中，Fc区中导致与一种或多种Fc受体的结合受到调节的突变可包括以下突变中的一者或多者：SD (S239D)、SDIE (S239D/I332E)、SE (S267E)、SELF (S267E/L328F)、SDIE (S239D/I332E)、SDIEAL (S239D/I332E/A330L)、GA (G236A)、ALIE (A330L/I332E)、GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)、V9 (G237D/P238D/P271G/A330R)和V11 (G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)，和/或在以下氨基酸处的一个或多个突变：E345R、E233、G237、P238、H268、P271、L328和A330。用于调节Fc受体结合的另外的Fc区修饰描述于例如美国专利申请公布2016/0145350以及美国专利7,416,726和5,624,821中，上述专利文献特此以全文引用的方式并入本文。
包括本发明的抗体-药物偶联物的抗体包括聚糖变体，诸如糖基化。在一些实施方案中，结合剂的Fc区被修饰成与天然未修饰的Fc区相比具有改变的Fc区糖基化模式。
本发明的抗体或抗原结合结构域的氨基酸取代可以为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包括这样的氨基酸取代，其中具有某些物理和/或化学特性的氨基酸被交换为具有相同或相似化学或物理特性的另一种氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸取代为另一种酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸取代为另一种具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸取代为另一种碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷的氨基酸取代为另一种具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β-支链侧链的氨基酸取代为另一种具有β-支链侧链的氨基酸(例如，Ile、Thr和Val)、具有芳族侧链的氨基酸取代为另一种具有芳族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)等。
抗体或抗原结合结构域可基本上由本文所述的一个或多个指定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如，其他氨基酸)不实质性改变抗体或抗原结合结构域功能变体的生物活性。
用于产生抗体的方法描述于例如Köhler和Milstein,Eur. J. Immunol., 5:511-519 (1976)；Harlow和Lane (编辑),Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press(1988)；以及Janeway等人(编辑),Immunobiology,第9版, Garland Publishing, NewYork, NY (2017)。在某些实施方案中，可以使用转基因动物(例如小鼠)生成人或嵌合抗体或抗体片段，其中一种或多种内源免疫球蛋白基因被一种或多种人免疫球蛋白基因置换。其中内源抗体基因被人抗体基因有效置换的转基因小鼠的实例包括但不限于MedarexHUMAB-MOUSE™、Kirin TC MOUSE™和Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (参见例如，Lonberg,Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005)和Lonberg,Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008))。人源化抗体可以使用本领域已知的任何合适的方法生成(参见例如An, Z.(编辑),Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley&Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009))，包括例如将非人CDR移植至人抗体支架上(参见例如Kashmiri等人,Methods, 36(1): 25-34 (2005)；和Hou等人,J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)以及使用噬菌体展示(参见例如Fellouse等人,Journal of Molecular Biology, 373(4): 924-940 (2007)和Glanville等人, PNAS, 106(48):20216-20221 (2009))。
在一个示例性实施方案中，本发明的抗体或ADC包含含有抗原结合结构域的抗体，该抗原结合结构域特异性识别并结合人和非人灵长类Trop2 (也称为肿瘤相关的钙信号转导子2，还参见NCBI登录号NP_002344和XP_005543292)。
在一些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体或其片段)与人Trop2，例如包含SEQID NO: 38的蛋白质结合。然而，也涵盖与任何Trop2同源物或旁系同源物结合的结合剂。在一些实施方案中，Trop2蛋白与SEQ ID NO: 38包含至少约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的序列同一性。在一些实施方案中，结合剂结合人Trop2和食蟹猴Trop2；或人、食蟹猴和小鼠Trop2。
SEQ ID NO: 38
提供了一种用于将有效载荷递送至表达Trop2的细胞的方法，其包括向该细胞或包含该细胞的哺乳动物施用ADC，该ADC包含共价连接至有效载荷(例如，经由接头或不通过接头)的抗Trop2抗体。
本发明还提供了包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽的Trop2结合剂(例如，抗体或其片段)。
Trop2结合剂特异性结合Trop2。药剂的结合特异性允许靶向表达Trop2的细胞，例如以将治疗有效载荷递送至此类细胞。
在一些实施方案中，Trop2结合剂结合Trop2，而基本上不抑制或防止Trop2与其一种或多种配体(例如密封蛋白1、密封蛋白7或IGF-1)结合。然而，在其他实施方案中，Trop2结合剂可以完全或部分阻断(抑制或防止) Trop2与其结合伴侣中的一种或多种(诸如纤连蛋白(fibronectin)受体a5b1 (整联蛋白α5β1))的结合，使得该抗体可以用于抑制Trop2介导的癌细胞迁移或转移(Trerotola M.等人, Cancer Research, 2013, 5月15日；73(10):3155-67)，或者可完全或部分阻断Trop2受体的胞外域的顺式二聚化或反式二聚化(Sun M.等人, iScience, 2021, 10月22日；24(10): 103190)。
抗体或抗原结合抗体片段可以对Trop2是单特异性的，或者可以是双特异性的或多特异性的。例如，在二价或多价抗体或抗体片段中，结合结构域可以是不同的，靶向相同抗原的不同表位或者靶向不同的抗原。构建多价结合构建体的方法是本领域已知的。双特异性和多特异性抗体是本领域已知的。此外，可以提供双抗体、三抗体或四抗体，它们是多肽链的二聚体、三聚体或四聚体，其各自包含VH通过肽接头连接至VL，该肽接头太短以至于不允许相同多肽链上的VH与VL之间的配对，从而驱动不同的VH-VL多肽链上的互补结构域之间的配对，以生成具有两个、三个或四个功能性抗原结合位点的多聚体分子。另外，可以产生双scFv片段，即具有两个不同可变结构域的小scFv片段，以产生能够结合两个不同表位的双特异性双scFv片段。可以采用基因工程方法产生Fab二聚体(Fab2)和Fab三聚体(Fab3)，以创建基于Fab片段的多特异性构建体。
Trop2结合剂也可以是抗体偶联物。在这方面，Trop2结合剂可以是(1)抗体、替代支架或其片段，以及(2)蛋白质或非蛋白质部分的偶联物。例如，Trop2结合剂可以偶联至肽、荧光分子、化疗剂、放射性同位素或其他细胞毒性有效载荷剂。
Trop2结合剂可以是或可得自人抗体、非人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或相应的抗体片段。“嵌合”抗体是通常包含人恒定区和非人可变区的抗体或其片段。“人源化”抗体是通常包含人抗体支架且在至少一个CDR (例如，1、2、3、4、5或所有六个CDR)中具有非人来源氨基酸或序列的克隆抗体。
此外，在一些实施方案中，本文提供的Trop2结合剂可在结合至细胞表面上的Trop2时引起Trop2或结合剂复合物的细胞内化。在不希望被任何特定的理论或作用机制所束缚的情况下，据信根据该实施方案的某些Trop2结合剂可在结合时引起Trop2内化，并且在内化期间保持与Trop2结合，导致结合剂与Trop2一起内化。Trop2和结合的Trop2结合剂的细胞内化可以通过任何合适的方法(诸如本文所述的方法)，或者测定细胞表面上的持久性并且/或者检测内化的抗体来确定。在一些实施方案中，Trop2结合剂足够强地内化，使得至少约25% (例如，至少约35%、至少约50%、至少约75%或至少约90%)的结合细胞表面上的Trop2的Trop2结合剂被内化(例如，使用表面持久性分析，在测定开始时约75%或更少、约65%或更少、约50%或更少、约25%或更少或约10%或更少的与细胞表面上的Trop2结合的Trop2结合剂分子在测定结束时保持结合)。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)如本文所述的互补决定区(CDR) (例如，如表S1-表S6中所描述)。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含如本文所述的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或如本文所述的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)的免疫球蛋白重链可变区多肽包含
互补决定区1 (HCDR1)，其包含与NYGMN (SEQ ID NO: 14)具有至少75% (例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列；
互补决定区2 (HCDR2)，其包含与WINTKTGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO: 16)或WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)具有至少75% (例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列；以及
互补决定区3 (HCDR3)，其包含与GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)具有至少75%(例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)的免疫球蛋白轻链可变区多肽包含
互补决定区1 (LCDR1)，其包含与KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 27)具有至少75%(例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列；
互补决定区2 (LCDR2)，其包含与SASYRYT (SEQ ID NO: 29)具有至少75% (例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列；以及
互补决定区3 (LCDR3)，其包含与QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)具有至少75% (例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含
免疫球蛋白重链可变区多肽，该免疫球蛋白重链可变区多肽包含互补决定区1(HCDR1)，其包含与NYGMN (SEQ ID NO: 14)具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (HCDR2)，其包含与WINTKTGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO: 16)或WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (HCDR3)，其包含与GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列；和/或
免疫球蛋白轻链可变区多肽，该免疫球蛋白轻链可变区多肽包含互补决定区1(LCDR1)，其包含与KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 27)具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (LCDR2)，其包含与SASYRYT (SEQ ID NO: 29)具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (LCDR3)，其包含与QQHYITPLT (SEQ IDNO: 31)具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含
免疫球蛋白重链可变区多肽，该免疫球蛋白重链可变区多肽包含互补决定区1(HCDR1)，其包含与NYGMN (SEQ ID NO: 14)具有至少90%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (HCDR2)，其包含与WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)具有至少90%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (HCDR3)，其包含与GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)具有至少90%同一性的氨基酸序列；和/或
免疫球蛋白轻链可变区多肽，该免疫球蛋白轻链可变区多肽包含互补决定区1(LCDR1)，其包含与KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 27)具有至少90%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (LCDR2)，其包含与SASYRYT (SEQ ID NO: 29)具有至少90%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (LCDR3)，其包含与QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含
免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含含有NYGMN (SEQ ID NO: 14)的互补决定区1(HCDR1)、含有WINTKTGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO: 16)或WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO:21)的互补决定区2 (HCDR2)，以及含有GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)的互补决定区3(HCDR3)；和/或
免疫球蛋白轻链可变区多肽，其包含含有KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 27)的互补决定区1 (LCDR1)、含有SASYRYT (SEQ ID NO: 29)的互补决定区2 (LCDR2)，以及含有QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)的互补决定区3 (LCDR3)。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含含有SEQ ID NO: 14的互补决定区1 (HCDR1)、含有SEQID NO: 16的互补决定区2 (HCDR2)，以及含有SEQ ID NO: 18的互补决定区3 (HCDR3)。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含含有SEQ ID NO: 14的互补决定区1 (HCDR1)、含有SEQID NO: 21的互补决定区2 (HCDR2)，以及含有SEQ ID NO: 18的互补决定区3 (HCDR3)。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白轻链可变区多肽，其包含含有SEQ ID NO: 27的互补决定区1 (LCDR1)、含有SEQID NO: 29的互补决定区2 (LCDR2)，以及含有SEQ ID NO: 31的互补决定区3 (LCDR3)。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含一个或多个如本文所述的互补决定区(CDR)和/或框架区(FR) (例如，如表S1-表S6中所描述)。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)如本文所述的框架区(FR) (例如，如表S1-表S6中所描述)。
在特定实施方案中，结合剂包含免疫球蛋白重链多肽和免疫球蛋白轻链多肽，其中免疫球蛋白重链多肽包含第一框架区、第二框架区、第三框架区和/或第四框架区；并且/或者免疫球蛋白轻链多肽包含第一框架区、第二框架区、第三框架区和/或第四框架区；并且/或者免疫球蛋白重链多肽和轻链多肽包含表S1-表S6中列出的框架区的任何组合。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO: 1-4中的任一者具有至少80% (例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少80% (例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO: 1-4中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO: 4具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO:5-6中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO: 1-4中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含免疫球蛋白重链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO: 2或4中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链可变区多肽，其包含与SEQ ID NO:6具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 1-4中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO: 5-6中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 2或4的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:5-6中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO: 5-6中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 2或4的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如抗体或其片段，诸如抗原结合结构域)包含含有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和/或含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含人IgG1 Fc结构域。在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区多肽的免疫球蛋白重链多肽。在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有人IgG1 Fc区多肽的免疫球蛋白重链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含人κ轻链多肽。在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含人λ轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含免疫球蛋白重链多肽，其包含与SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者具有至少80% (例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链多肽，其包含与SEQ ID NO: 8或12中的任一者具有至少80%(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含免疫球蛋白重链多肽，其包含与SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链多肽，其包含与SEQ ID NO: 8或12中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含免疫球蛋白重链多肽，其包含与SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链多肽，其包含与SEQ ID NO:8具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含免疫球蛋白重链多肽，其包含与SEQ ID NO: 7、10、35或37中的任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链多肽，其包含与SEQ ID NO:8具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含免疫球蛋白重链多肽，其包含与SEQ ID NO: 7或37具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链多肽，其包含与SEQ ID NO:8或12具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO: 8或12中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 7或37中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO: 8或12中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 7、10、35或37中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO: 8或12中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 9或34的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 10或35的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 11或36的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 7或37的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 7、10、35或37中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 10或35的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在某些实施方案中，Trop2结合剂(例如，抗体)包含含有SEQ ID NO: 7或37的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和/或含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:1的可变重链(VH)：QIQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAEEFKGRFVFSLETSASTAYLQISSLKAEDMAMYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:1)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:13-19的一个或多个重链CDR (互补决定区)或重链框架(HFR)序列。
表S1.
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:2的可变重链(VH)：QVQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDMAVYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:2)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:14、15、18、19、20、21或22的一个或多个重链CDR (互补决定区)或重链框架(HFR)序列。
表S2.
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:3的可变重链(VH)：QVQLVQSGHELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDMAVYYCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:3)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:14、15、18、19、21、23或24的一个或多个重链CDR (互补决定区)或重链框架(HFR)序列。
表S3.
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:4的可变重链(VH)：QVQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:4)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:14、15、18、19、20、21或25的一个或多个重链CDR (互补决定区)或重链框架(HFR)序列。
表S4.
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:5的可变轻链(VL)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKVLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAVYYCQQHYITPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:5)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO.26-32的一个或多个轻链CDR (互补决定区)或轻链框架(LFR)序列。
表S5.
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6的可变轻链(VL)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKVLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAVYYCQQHYITPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:6)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:26-29或31-33的一个或多个轻链CDR (互补决定区)或轻链框架(LFR)序列。
表S6.
在本发明的一个实施方案中，LFR4区域包括FGGGTKVEIK。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:39的可变轻链(VL)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKVLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAVYYCQQHYITPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:39)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:40的可变轻链(VL)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKVLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAVYYCQQHYITPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:40)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:9的重链：QIQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAEEFKGRFVFSLETSASTAYLQISSLKAEDMAMYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:9)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:10的重链：QVQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDMAVYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:10)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:11的重链：QVQLVQSGHELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDMAVYYCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:11)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:7的重链：QVQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:7)。
在本发明的一个实施方案中，重链多肽的c-末端不是赖氨酸残基。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:34的重链：QIQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAEEFKGRFVFSLETSASTAYLQISSLKAEDMAMYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:34)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:35的重链：QVQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDMAVYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:35)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:36的重链：QVQLVQSGHELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDMAVYYCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:36)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:37的重链：QVQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAQEFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:37)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:12的轻链：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKVLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAVYYCQQHYITPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:12)。
在本发明的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含SEQ ID NO:8的轻链：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKVLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAVYYCQQHYITPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:8)。
在本发明的ADC的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含hRS7 (即沙西妥珠单抗-戈维替康的mAb，也称为IMMU-132)的CDR区、FR区、H和/或L可变区、重链和/或轻链，如美国专利7,238,785和美国专利10,130,626中所描述，上述专利文献以引用的方式并入本文。
在本发明的ADC的一个实施方案中，Trop2靶向抗体(hRS7)包含重链序列：
QIQLVQSGHEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEPTYAEEFKGRFVFSLETSASTAYLQISSLKAEDMAMYFCGRGGYGSSYWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:40)，
和轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKVLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAVYYCQQHYITPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO:41)。
在本发明的ADC的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含T6-16的CDR区、FR区、H和/或L可变区、重链和/或轻链，如美国专利10,202,461中所描述，该专利以引用的方式并入本文。
在本发明的ADC的一个实施方案中，Trop2靶向抗体(T6-16)包含重链序列：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKNLEWIGYIYPYNGGTGYNQRFKSRATMTVDKSSSTAYMELRSLTSDDSAVYYCAREDYGSSPSYAMDYWGQGTSVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:42)，
和轻链序列：
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHGNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:43)。
在本发明的ADC的一个实施方案中，Trop2靶向抗体包含DS1062a的CDR区、FR区、H和/或L可变区、重链和/或轻链，如国际专利申请WO 2020/240467中所描述，该专利以引用的方式并入本文。
在本发明的ADC的一个实施方案中，Trop2靶向抗体(TINA)包含重链序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:44)，
和轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO:45)。
抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段以及以下所述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat. Med.9:129-134 (2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷, Rosenburg和Moore编辑, (Springer-Verlag, New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体为具有可以为二价的或双特异性的两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat. Med.9:129-134 (2003)；以及Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448 (1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson等人,Nat. Med.9:129-134 (2003)中。
单结构域抗体为包含抗体的所有或一部分重链可变结构域或所有或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis,Inc., Waltham, MA；参见例如美国专利号6,248,516 B1)。
抗体片段可以通过各种技术来制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E. coli)或噬菌体)产生，如本文所述。嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为“类型转换(classswitched)”抗体，其中类或亚类已从亲本抗体的类或亚类而改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR (或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基来源于其中的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和它们的制备方法综述于例如，Almagro和Fransson,Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)，并且还描述于例如，Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods36:25-34 (2005)(描述SDR (a-CDR)移植)；Padlan,Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (描述“表面重塑(resurfacing)”); Dall’Acqua等人,Methods36:43-60 (2005) (描述“FR改组(FRshuffling)”)；以及Osbourn等人,Methods36:61-68 (2005)和Klimka等人,Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (描述FR改组的“导向选择(guided selection)”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳适配”方法选择的框架区(参见例如, Sims等人J. Immunol.151:2296 (1993))；来源于具有轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列的框架区(参见例如, Carter等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285 (1992)；和Presta等人J. Immunol., 151:2623 (1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如, Almagro和Fransson,Front. Biosci.13:1619-1633(2008))；以及从筛选FR文库中获得的框架区(参见例如, Baca等人,J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997)和Rosok等人,J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996))。
人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体为人抗体。可以使用本领域已知的各种技术生产人抗体。人抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol.5:368-74 (2001)以及Lonberg,Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008)。
可以通过将免疫原施用于已被改性以产生对抗原激发应答的完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备人抗体。此类动物通常含有全部或一部分的人免疫球蛋白基因座，该基因座代替内源免疫球蛋白基因座或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法综述，参见Lonberg,Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005)。还参见例如描述XENOMOUSE™技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述HuMab®技术的美国专利号5,770,429；描述K-M MOUSE®技术的美国专利号7,041,870，和描述VelociMouse®技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可以例如通过与不同的人恒定区组合被进一步改性。
也可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如, KozborJ. Immunol., 133: 3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；以及Boerner等人,J. Immunol., 147: 86 (1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体还描述于Li等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)中。另外的方法包括描述于例如美国专利号7,189,826 (描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (描述人-人杂交瘤)的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)以及Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)。
也可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆的可变结构域序列来产生人抗体。然后此类可变结构域序列可与期望的人恒定结构域组合。从抗体文库选择人抗体的技术如下所述。
来源于文库的抗体
可以通过筛选具有所需的一种或多种活性的抗体的组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库和筛选具有所需结合特性的抗体的此类文库。此类方法综述于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien等人，编，Human Press, Totowa, NJ, 2001)并且还描述于例如McCafferty等人，Nature348:552-554；Clackson等人，Nature352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992)；Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology248:161-175 (Lo,编，Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等人，J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004)；Lee等人，J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA101(34): 12467-12472 (2004)；以及Lee等人，J. Immunol. Methods284(1-2): 119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的库(repertoire)通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，然后其可以用来筛选抗原结合噬菌体，如描述于Winter等人，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库给免疫原提供高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如，从人)克隆初始库(naive repertoire)以给多种非自体抗原也和没有任何免疫作用的自体抗原提供单一来源的抗体，如Griffiths等人，EMBO J,12: 725-734 (1993)所述。最后，还可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因片段和使用含有编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的随机序列的PCR引物来通过合成制备初始文库，如Hoogenboom和Winter,J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为本文的人抗体或人抗体片段。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为具有对至少两个不同位点的结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与同一靶标的两个不同表位结合。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达靶标的细胞。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature305: 537 (1983))、WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.10: 3655 (1991))，和“结进孔(knob-in-hole)”工程改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)。如本文所用的术语“杵臼结构(knob-into-hole)”或“KnH”技术是指通过在多肽相互作用的界面处将突起(杵状结构(knob))引入一种多肽中并且将空腔(臼状结构(hole))引入另一种多肽中来在体外或体内指导两种多肽配对在一起的技术。例如，KnH已被引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面中(参见例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431、Zhu等人, 1997,Protein Science 6:781-788以及WO 2012/106587)。在一些实施方案中，在制造多特异性抗体期间，KnH驱动两条不同的重链配对在一起。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与每个Fc区连接的单一可变结构域，或者进一步包含与类似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。KnH技术也可以用于将两种不同的受体胞外结构域配对在一起或者将包含不同靶标识别序列的任何其他多肽序列配对(例如，包括亲和体、肽体和其他Fc融合体)。
如本文所用的术语“杵突变(knob mutation)”是指在多肽与另一多肽相互作用的界面处将突起(杵状结构)引入多肽中的突变。在一些实施方案中，另一种多肽具有臼突变(hole mutation)。
如本文所用的术语“臼突变”是指在多肽与另一多肽相互作用的界面处将空腔(臼状结构)引入多肽中的突变。在一些实施方案中，另一种多肽具有杵突变。
下面提供了简要的非限制性论述。
“突起”是指至少一个氨基酸侧链，其从第一多肽的界面突出并因此可定位在相邻界面(即，第二多肽的界面)的补偿腔(compensatory cavity)中，以便稳定异多聚体，从而例如有利于异源多聚体(heteromultimer)的形成而不是同源多聚体(homomultimer)的形成。突起可以存在于原始界面中，或者可以合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，编码第一多肽的界面的核酸被改变以编码突起。为此，编码第一多肽界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸被编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸置换，该至少一个“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积。应当理解，可以有多于一个原始和对应的输入残基。各种氨基残基的侧链体积示出于例如US2011/0287009的表1中。引入“突起”的突变可被称为“杵突变”。
在一些实施方案中，用于形成突起的输入残基是选自以下的天然存在的氨基酸残基：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一些实施方案中，输入残基为色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，用于形成突起的原始残基具有小的侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“空腔”是指至少一个氨基酸侧链，其从第二多肽的界面凹陷，并因此容纳第一多肽的相邻界面上的对应突起。空腔可以存在于原始界面中，或者可以合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码空腔。为此，编码第二多肽界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸被编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA置换，该至少一个“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。应当理解，可以有多于一个原始和对应的输入残基。在一些实施方案中，用于形成空腔的输入残基是选自以下的天然存在的氨基酸残基：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，输入残基为丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，用于形成空腔的原始残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突变可被称为“臼突变”。
突起可“定位”在空腔中，这意指突起和空腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置以及突起和空腔的尺寸使得突起可位于空腔中，而不会显著干扰第一多肽和第二多肽在界面处的正常缔合。由于突起(诸如Tyr、Phe和Trp)通常不从界面的轴垂直延伸，并具有优选的构象，所以在一些情况下，突起与对应空腔的对齐可能依赖于基于三维结构，诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的三维结构对突起/空腔对进行建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来实现。
在一些实施方案中，IgG1恒定区中的杵突变为T366W (EU编号)。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V (EU编号)的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的臼突变包含T366S、L368A和Y407V (EU编号)。
在一些实施方案中，IgG4恒定区中的杵突变为T366W (EU编号)。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V (EU编号)的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的臼突变包含T366S、L368A和Y407V (EU编号)。
多特异性抗体还可以通过以下方式制备：工程化静电操纵效应(engineeringelectrostatic steering effect)用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229: 81 (1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人,J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))和使用单链Fv (sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人,J. Immunol., 152:5368 (1994))；以及制备三特异性抗体，如例如描述于Tutt等人J. Immunol.147: 60 (1991)。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼(Octopus)抗体”，也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用FAb (Dual Acting FAb)”或“DAF”，其包含与靶标以及另一个不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。
抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修改引入到编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修改包括例如在抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，前体条件是最终的构建体具有所需的特性，例如，抗原结合。
取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代突变的目标位点包括HVR和FR。保守取代示于表1中的“优选的取代”的标题下。更实质的变化在表1中在“示例性取代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别来进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
根据共同的侧链特性，氨基酸可以被如下分组：
(1) 疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2) 中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3) 酸性的：Asp、Glu；
(4) 碱性的：His、Lys、Arg；
(5) 影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6) 芳族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物学特性的修改(例如，改善) (例如，升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008))和/或SDR (a-CDR)，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建次级文库并从次级文库中重新选择的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien等人编,Human Press, Totowa, NJ, (2001)。)中在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定涉及抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生取代、插入或缺失，只要此类改变不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR进行不实质性降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可以在HVR “热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells (1989)Science, 244:1081-1085所述。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)取代以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代的候选。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有100个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列以使得创建或除去一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或缺失。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N键连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人，TIBTECH15:26-32 (1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏连接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通过相对于连接于Asn 297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，例如如描述于WO 2008/077546。Asn297是指位于Fc区中大约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中较小的序列变异，Asn297也可能位于位置297的上游或下游约± 3个氨基酸处，即在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108 (Presta, L.)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704;US 2004/0110282; US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Yamane-Ohnuki等人J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1, Presta, L；和WO 2004/056312 A1, Adams等人，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-藻糖基转移酶基因FUT8,敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人,Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；以及WO 2003/085107)。
进一步提供具有两分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中连接于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684 (Umana等人)；以及US 2005/0123546 (Umana等人)。还提供在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964(Raju, S.)；以及WO 1999/22764 (Raju, S.)。
Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但不是所有效应功能的抗体变体，所述效应功能使其成为用于如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)的第464页上的表3中。评估感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362 (参见例如Hellstrom, I.等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986))和Hellstrom, I等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA82:1499-1502 (1985)；5,821,337(参见Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI™非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc. Mountain View, CA；和CytoTox 96®非放射性细胞毒性测定(Promega, Madison,WI)。对于此类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，可在体内，例如在动物模型中，诸如Clynes等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998)中公开的动物模型中评估感兴趣的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人,Blood101:1045-1052 (2003)；以及Cragg, M.S.和M.J. Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova, S.B.等人，Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006))。
在一些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc部分中，以增加IgG与新生儿Fc受体的结合。在某些实施方案中，抗体包含根据EU编号的以下三种突变：M252Y、S254T和T256E (“YTE突变”) (美国专利号8,697,650；还参见Dall'Acqua等人, Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006)。在某些实施方案中，YTE突变不会影响抗体与其同源抗原结合的能力。在某些实施方案中，与天然(即，非YTE突变体)抗体相比，YTE突变增加抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，与天然(即，非YTE突变体)抗体相比，YTE突变使抗体的血清半衰期增加3倍。在一些实施方案中，与天然(即，非YTE突变体)抗体相比，YTE突变使抗体的血清半衰期增加2倍。在一些实施方案中，与天然(即，非YTE突变体)抗体相比，YTE突变使抗体的血清半衰期增加4倍。在一些实施方案中，与天然(即，非YTE突变体)抗体相比，YTE突变使抗体的血清半衰期增加至少5倍。在一些实施方案中，与天然(即，非YTE突变体)抗体相比，YTE突变使抗体的血清半衰期增加至少10倍。参见例如美国专利号8,697,650；还参见Dall'Acqua等人, Journal of BiologicalChemistry 281(33):23514-23524 (2006)。
在某些实施方案中，YTE突变体提供了调节抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的手段。在某些实施方案中，YTEO突变体提供了调节针对人抗原的人源化IgG抗体的ADCC活性的手段。参见例如美国专利号8,697,650；还参见Dall'Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006)。
在某些实施方案中，YTE突变体允许同时调节血清半衰期、组织分布和抗体活性(例如，IgG抗体的ADCC活性)。参见例如美国专利号8,697,650；还参见Dall'Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006)。
具有降低的效应功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓的“DANA” Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
在某些实施方案中，在野生型人Fc区的位置329 (EU编号) (P329)处的脯氨酸被甘氨酸或精氨酸或足够大以破坏Fc/Fc γ受体界面内的脯氨酸夹层的氨基酸残基取代，该脯氨酸夹层在Fc的P329与FcgRIII的色氨酸残基W87和W110之间形成(Sondermann等人:Nature 406, 267-273 (2000年7月20日))。在另一个实施方案中，Fc变体中的至少一个另外的氨基酸取代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在又一个实施方案中，该至少一个另外的氨基酸取代为人IgG1 Fc区的L234A和L235A或者人IgG4 Fc区的S228P和L235E，所有这些都根据EU编号(美国专利号8,969,526，其以全文引用的方式并入)。
在某些实施方案中，多肽包含野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中该多肽具有被甘氨酸取代的人IgG Fc区的P329，并且其中该Fc变体包含在人IgG1 Fc区的L234A和L235A或者人IgG4 Fc区的S228P和L235E处的至少两个另外的氨基酸取代，并且其中这些残基根据EU编号进行编号(美国专利号8,969,526，其以全文引用的方式并入)。在某些实施方案中，包含P329G、L234A和L235A (EU编号)取代的多肽表现出对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力降低，从而将ADCC下调至由包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20%，并且/或者下调ADCP (美国专利号8,969,526，其以全文引用的方式并入)。
在一个具体实施方案中，包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽包含三重突变：根据EU编号，在位置Pro329处的氨基酸取代、L234A和L235A突变(P329 / LALA) (美国专利号8,969,526，其以全文引用的方式并入)。在具体实施方案中，多肽包含以下氨基酸取代：根据EU编号的P329G、L234A和L235A。
描述了与FcR的结合改善或减弱的某些抗体变体。(参见，例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人,J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如Fc区的位置298、333和/或334 (残基的EU编号方式)的取代的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，这导致改变(即，增加或降低) C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人，J. Immunol.164: 4178-4184 (2000)中所描述。
具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体描述于US2005/0014934A1 (Hinton等人)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J. Immunol.117:587 (1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249 (1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一处或多处取代的Fc区。此类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有取代，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)的那些变体。
还参见Duncan和Winter,Nature322:738-40 (1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351，其涉及Fc区变体的其他实例。
经半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程改造的抗体，例如，“THIOMAB™”或TDC，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在可用于偶联的抗体的位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)偶联，以创建免疫偶联物，如本文进一步所描述。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的K149 (Kabat编号)；轻链的V205 (Kabat编号)；重链的A118 (EU编号)；重链的A140 (EU编号)；重链的L174 (EU编号)；重链的Y373 (EU编号)；以及重链Fc区的S400 (EU编号)。在具体实施方案中，本文所述的抗体包含HC-A140C(EU编号)半胱氨酸取代。在具体实施方案中，本文所述的抗体包含LC-K149C (Kabat编号)半胱氨酸取代。在具体实施方案中，本文所述的抗体包含HC-A118C (EU编号)半胱氨酸取代。可以如例如美国专利号7,521,541所述生成经半胱氨酸工程改造的抗体。
抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知的且易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1, 3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。连接到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果连接了一个以上的聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于确定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质部分的偶联物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA102: 11600-11605 (2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质部分加热至抗体-非蛋白质部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如描述于美国专利号4,816,567。在一个实施方案中，提供了编码本文所述抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码组成抗体VL的氨基酸序列和/或组成抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在另一实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含编码组成抗体的VL的氨基酸序列和组成抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码组成抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码组成抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码如上文所提供的抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地，从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗体的重组生产，将编码例如如上所述的抗体的核酸分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规程序将此类核酸容易地分离并进行测序(例如，通过使用寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因)。
适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237, 5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C. Lo编辑, Humana Press,Totowa, NJ, 2003),第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌(E. coli)中的表达。)在表达后，可从细菌细胞糊状物的可溶性部分中分离抗体并可以进一步纯化。
除了原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”从而导致产生具有部分或完全人糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat. Biotech.22:1409-1414 (2004)和Li等人，Nat. Biotech.24:210-215 (2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429 (其描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES™技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40 (COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(如例如Graham等人,J. Gen Virol.36:59 (1977)中所描述的293或293细胞；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(sertoli cell) (如例如Mather,Biol. Reprod.23:243-251 (1980)中所描述的TM4细胞；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等人,Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所描述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C. Lo编辑, Humana Press, Totowa, NJ),第255-268页(2003)。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明的抗体-药物偶联物(ADC)化合物包含对共价连接至、连接至有效毒素的肿瘤相关抗原具有特异性的抗体
应当理解，当抗体的多于一个亲核赖氨酸氮(例如，侧链胺氮)或半胱氨酸硫醇基团与药物-接头中间体或接头试剂反应时，所得产物是ADC化合物的混合物，其中分布有一个或多个连接至抗体的药物部分。(DAR)可以通过双重ELISA抗体测定由混合物计算每个抗体的药物(DAR)平均数，所述双重ELISA抗体测定对于抗体是特异性的，并且对于药物是特异性的。可以通过质谱法来鉴定混合物中的单个ADC分子，并通过HPLC例如疏水性相互作用色谱法来分离(参见，例如，McDonagh等人(2006)Prot. Engr. Design&Selection19(7):299-307；Hamblett等人(2004)Clin. Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett, K.J.等人“Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicityof an anti-CD30 antibody-drug conjugate,”文摘号624, American Association forCancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日，Proceedings of theAACR,第45卷，2004年3月；Alley, S.C.等人“Controlling the location of drugattachment in antibody-drug conjugates,”文摘号627, American Association forCancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日，Proceedings of theAACR,第45卷，2004年3月)。在某些实施方案中，可以通过电泳或色谱法从偶联混合物中分离具有单负载值的均匀的ADC。
接头为双功能或多功能化合物，其可以用于连接活性剂(例如药物)和抗体以形成抗体-药物偶联物(ADC)。此类偶联物可用于例如形成针对肿瘤相关抗原的免疫偶联物。此类偶联物允许将细胞毒性药物选择性递送至肿瘤细胞。在ADC中，接头用于将毒素连接至抗体。接头还可以将活性剂连接至反应性基团，其中反应性基团可以与抗体反应以形成ADC。
“接头”(L)为双功能或多功能部分，其可以用于将一个或多个毒素药物部分连接至抗体(Ab)以形成式III的抗体-药物偶联物(ADC)。在一些实施方案中，可以使用具有反应性官能团用于共价连接至药物和至抗体的接头来制备抗体-药物偶联物(ADC)。例如，在一些实施方案中，抗体(Ab)的赖氨酸的侧链胺可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键，以制备ADC。在另一个实例中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键，以制备ADC。
接头L经由双功能化合物的一个反应位点共价结合，留下另一个功能位点用于随后与抗体的连接。接头L是具有1-200个选自C、N、O、S或卤素的非氢原子的部分，并且任选地掺入醚、氧代、羧基、羧酰胺、羧酰胺基、脲烷基、支链、环状、不饱和、氨基酸、杂环、芳族或杂芳族部分。接头L可以是无支链的或支链的、柔性的或刚性的、短的或长的，并且可以掺入被认为有用的部分的任何组合。在一些实施方案中，至少一部分接头L可以具有聚氧化烯聚合区，这可以增强化合物的溶解度。在一些实施方案中，接头L可以具有乙二醇的重复单元，并且其重复乙二醇单元的数目可为约1至约25，或者其间的任何数值。在一些实施方案中，L可包括约1至约4、约3至约20、约4至约15、约5至约12或约6至约10个乙二醇单元。
在一些实施方案中，至少一部分接头L可包括一个或多个氨基酸部分，其可为化合物提供增强的溶解度，或者可提供氨基酸序列以增强靶标结合，增强与靶标结合剂的相容性或者增强靶标结合识别。在其他实施方案中，接头L可以包括一个或多个氨基酸部分，其为蛋白酶提供合适的底物基序。此类实施方案包括选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。当将一组氨基酸部分掺入至提供对选择的蛋白酶具有特异性的底物基序的接头L中时，细胞毒性药物化合物可以从靶标结合偶联物中释放以提供局部细胞毒性作用。此类底物基序是本领域已知的，并且可以根据需要将其掺入至接头L中，以实现从靶标结合偶联物中的选择性释放。这种选择性可以基于药物-抗体偶联物的局部递送区内所需的蛋白酶的已知存在。其他聚合类型的部分可以掺入至接头L中，诸如多元酸、多糖或聚胺。其他部分，诸如取代的芳族或杂芳族部分可用于增强刚性或者在其中的取代基上提供易于合成的位点，用于连接至反应性部分或化合物。
接头L的另一个第二功能位点可用于随后与抗体的连接，从而经由接头将本发明的毒素共价结合至抗体。该第二反应位点是例如对抗体单元(例如抗体)上存在的亲核基团具有反应性的亲电基团。抗体上有用的亲核基团包括但不限于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子对接头单元上的亲电基团具有反应性，并形成与接头单元的共价键。有用的亲电基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。亲电基团为抗体连接提供便利场所。
在另一个实施方案中，接头单元具有反应位点，该反应位点具有与抗体上存在的亲电基团具有反应性的亲核基团。抗体上有用的亲电基团包括但不限于醛和酮羰基。接头单元的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电基团反应，并形成与抗体的共价键。接头单元上的有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
抗体上的亲电基团为与接头单元的连接提供便利位点。在一些实施方案中，亲电基团包括：
、和
其中波浪线指示与L的连接，并且
R4为NO2、Cl、F、CN或Br，并且q为0、1或2。
氨基官能团也为接头单元的有用的反应位点，因为它们可以与羧酸或化合物的活化酯反应以形成酰胺键。通常，本发明的基于肽的化合物可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。
一方面，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团。此类反应性官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、活化酯(诸如琥珀酰亚胺酯)、N-羟基琥珀酰亚胺、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。参见，例如，Klussman,等人,Bioconjugate Chemistry, 2004,15(4):765-773的第766页的偶联方法和本文中的实施例。在一些实施方案中，接头具有能够与存在于抗体上的亲电基团反应的官能团。此类亲电基团的实例包括但不限于醛和酮的羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可以与抗体上的亲电基团反应并形成至抗体单元的共价键。反应性官能团的非限制性实例包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
接头可包含一种或多种接头组分，包括但不限于延伸单元、肽模拟物单元、肽单元和间隔单元。参见J. Lu.等人，(Int. J. Mol. Sci., 2016,17:561)。示例性接头组分和接头试剂包括但不限于对氨基苯甲酸-缬氨酸-瓜氨酸(“PABA-val-cit”)、6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、缬氨酸-丙氨酸(“val-ala”或“va”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)、甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(“GFLG”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯(“MCC”)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(“SMCC”)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(“SPDB”)和4-(2-吡啶基二硫代)丁酸磺基-N-琥珀酰亚胺酯(“磺基-SPDB”)。各种接头组分是本领域已知的，其在本文中有所描述。示例性接头组分包括但不限于“VC-2xPEG”、“VA-2xPEG”和“VC-8xPEG”，以及“VA-8xPEG”，其中缬氨酸-瓜氨酸单元连接至两个或更多个乙烯氧基单元(PEG)，例如2个至10个PEG单元。
接头可以是促进药物或毒素释放的“可裂解接头”。可裂解接头的非限制性实施包括酸不稳定的接头(例如，包括腙)、蛋白酶敏感的(例如，肽酶敏感的)接头、光不稳定接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Research, 1992,52:127-131；美国专利号5,208,020)。接头的实例方案的另外的实例描述于美国专利号7,498,298中，其以引用的方式明确并入本文。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含直接(即，不通过接头)或通过式I的接头共价连接至药物部分的抗体：
I
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中所述药物部分为：
；
L为接头；
n为0或1；
p为1至10 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
Ab为抗体。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含直接(即，不通过接头)或通过式I的接头共价连接至药物部分的抗体：
I
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中所述药物部分为：
；
L为接头；
n为0或1；
p为1至10 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
Ab为与Trop2结合的抗体。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含直接(即，不通过接头)或通过式I的接头共价连接至药物部分的抗体：
I
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
L为接头；
n为0或1；
p为1至10 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
Ab为与Trop2结合的抗体。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物，其包含共价连接至一个或多个式II的药物部分的抗Trop2抗体：
II
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物，其包含共价连接至一个或多个式II的药物部分的抗体：
II
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物(或抗体-药物偶联物的混合物)，其包含共价连接至一个或多个式II的药物部分的抗Trop2抗体：
II
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中平均DAR (药物抗体比)为1-15、1-12、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-12、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-12、3-10、3-8、3-6、3-5或3-4。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物(或抗体-药物偶联物的混合物)，其包含共价连接至一个或多个式II的药物部分的抗体：
II
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中平均DAR (药物抗体比)为1-15、1-12、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-12、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-12、3-10、3-8、3-6、3-5或3-4。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含共价连接至式Ia的药物部分的抗体：
Ia
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
p为1-20或者1至10 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
Ab为抗Trop2抗体。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含共价连接至式Ia的药物部分的抗体：
Ia
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
p为1-20或者1至10 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
Ab为抗体。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含共价连接至式Ib的药物部分的抗体：
Ib
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
p为1-20或者1至10 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
-NHAb*为抗Trop2抗体，其中每个-NH-为抗体的赖氨酸残基的侧链胺。
一个实施方案提供了一种抗体-药物偶联物化合物，其包含共价连接至式Ib的药物部分的抗体：
Ib
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
p为1-20或者1至10 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；并且
-NHAb*为抗体，其中每个-NH-为抗体的赖氨酸残基的侧链胺。
在一个实施方案中，L为0。
在一个实施方案中，L不存在(即，n为0)。
在一个实施方案中，抗体通过抗体的赖氨酸残基的侧链氮连接至药物部分。
在一个实施方案中，抗体通过抗体的半胱氨酸残基的侧链硫连接至药物部分。
在一个实施方案中，抗体通过抗体的氨基酸残基的侧链氮连接至药物部分。
在一个实施方案中，抗体通过抗体的氨基酸残基的侧链硫连接至药物部分。
在一个实施方案中，n为1。
在一个实施方案中，接头L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个碳原子任选地被(-O-)、
(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)；
其中X1、X2或X3中的至少一者不为键。
在一个实施方案中，L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)。
在一个实施方案中，L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至60个碳原子(或者2-50、2-40、5-60、5-50、5-0、5-30或5-20个碳原子)的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)；
其中X1、X2或X3中的至少一者不为键。
在一个实施方案中，n为0 (即，L不存在)或者n为1，并且L为选自由以下组成的组的接头：
、
、
、
、
、
、
和
，
其中：
每个m独立地是1、2、3或4；
每个n1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个t独立地是1、2、3或4；
每个n2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p2独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个q2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个s独立地是1、2、3或4；并且
每个AA1和AA2独立地是氨基酸的侧链。
在一个实施方案中，
每个m独立地是1、2、3、4、5或6；
每个n1独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个p1独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个t独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个n2独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个p2独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
每个q2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个s独立地是1、2、3、4、5或6；并且
每个AA1和AA2独立地是氨基酸的侧链。
在一个实施方案中，n为0 (即，L不存在)或者n为1，并且L为选自由以下组成的组的接头：
、
、
、、
、
、
、
、
、
、
和
。
在一个实施方案中，n为0 (即，L不存在)或者n为1，并且L为选自由以下组成的组的接头：
和
。
一个实施方案提供了一种式II化合物
II
或其盐，
其中
W为离去基团或-L-X；
L为接头；并且
X为反应性基团。
在一个实施方案中，W为离去基团。
在一个实施方案中，离去基团为卤代基、-O(C1-C6)烷基、-O芳基、-O杂芳基或-O杂环基，其中所述-O(C1-C6)烷基、-O芳基、O杂芳基或O杂环基各自任选地被一个或多个独立地选自由氧代、卤代基、(C1-C6)烷基和-O(C1-C6)烷基组成的组的取代基取代，
在一个实施方案中，W与其所连接的羰基一起形成活化酯。
在一个实施方案中，W为任选地被一个或多个卤代基取代的-O苯基，或者2,5,二氧代吡咯烷氧基。
在一个实施方案中，W为任选地被一个或多个卤代基取代的-O苯基。
在一个实施方案中，W为任选地被一个或多个氟取代的-O苯基。
在一个实施方案中，W为2,3,5,6,-四氟苯氧基。
在一个实施方案中，W为2,5,二氧代吡咯烷氧基。
在一个实施方案中，W为L-X。
在一个实施方案中，L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个碳原子任选地被(-O-)、
(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)；
其中X1、X2或X3中的至少一者不为键。
在一个实施方案中，L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)。
在一个实施方案中，L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子(或者2-30、2-20、5-30或5-20个碳原子)的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至60个(或者2-50、2-40、5-60、5-50、5-40、5-30或5-20个碳原子)的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)；
其中X1、X2或X3中的至少一者不为键。
在一个实施方案中，氨基酸残基为天然氨基酸或瓜氨酸的残基。在一个实施方案中，氨基酸残基为天然氨基酸或瓜氨酸或其立体异构体的残基。在一个实施方案中，氨基酸残基为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或瓜氨酸残基。
在一个实施方案中，W选自由以下组成的组：
、
、
、
和
其中：
每个m独立地是1、2、3或4；
每个n1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个t独立地是1、2、3或4；
每个n2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p2独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个q2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个s独立地是1、2、3或4；并且
每个AA1和AA2独立地是氨基酸的侧链。
在一个实施方案中，
每个m独立地是1、2、3、4、5或6；
每个n1独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个p1独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个t独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个n2独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个p2独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
每个q2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个s独立地是1、2、3、4、5或6；并且
每个AA1和AA2独立地是氨基酸的侧链。
在一个实施方案中，氨基酸的侧链是天然氨基酸或瓜氨酸的侧链。在一个实施方案中，氨基酸(AA1和AA2)的每个侧链独立地是H、甲基、异丙基或-(CH2)3-NH-C(=O)-NH2。
在一个实施方案中，每个X独立地选自酯、活化酯、卤代乙酰胺、卤代基和二硫烷基杂芳基。
在一个实施方案中，每个X选自苯氧基羰基、2,5-二氧代吡咯烷基氧基羰基、二硫烷基吡啶基和溴乙酰基，其中苯氧基羰基任选地被一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)卤代基、硝基或(C1-C6)烷基取代。
在一个实施方案中，每个X选自2,3,5,6,-四氟苯氧基羰基、2,5-二氧代吡咯烷基氧基羰基、二硫烷基吡啶基和溴乙酰基。
在一个实施方案中，每个X选自2,3,5,6,-四氟苯氧基羰基和溴乙酰基，
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
和
或其盐。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
和
或其盐。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
、
、
、
和
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)。
在一个实施方案中，p为1、2、3、4或5。
在一个实施方案中，p为1、2、3、4、5、6、7或8。
在一个实施方案中，p为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方案中，提供了式I的抗体-药物偶联物化合物的混合物，其中抗体-药物偶联物化合物的混合物中每个抗体的平均药物载量为约1至约5。
下面提供了本发明的某些非限制性实施方案。应了解，可将两个或更多个实施方案组合。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
其中：
P为胺氮保护基团；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基；
或其盐。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
或其盐。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
或其盐。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
或其盐。
一个实施方案提供了一种选自由以下组成的组的化合物：
和
或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式8*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式7*化合物：
或其盐转化为式8化合物或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式7*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式6a*化合物：
或其盐转化为所述式7*化合物或其盐，
其中R2为(C1-C6)烷基。
一个实施方案提供了一种其中制备式7*化合物或其盐的方法，其包括将对应的式6a*化合物：
或其盐转化为所述式7*化合物或其盐，
其中R2为(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，式6a*化合物为式6*化合物：
或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式6a*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式5a*化合物：
或其盐转化为所述式6a*化合物或其盐，
其中：
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基。
一个实施方案提供了一种其中制备式6a*化合物或其盐的方法，其包括将对应的式5a*化合物：
或其盐转化为所述式6a*化合物或其盐，
其中每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
在一个实施方案中，式6a*化合物为式6*化合物：
或其盐。
在一个实施方案中，式5a*化合物为式5*化合物：
或其盐。
一个实施方案提供了一种其中制备式6a*化合物的方法，其包括使式5a*化合物或其盐与式Ba化合物：
或其盐反应，以得到式6a*化合物，
其中R2为(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，式Ba*化合物为式B*化合物：
或其盐。
一个实施方案提供了一种其中制备式6*化合物的方法，其包括使式5a*化合物或其盐与式B*化合物：
或其盐反应，以得到所述式6*化合物。
一个实施方案提供了一种用于制备式5a*化合物：
5a*
或其盐的方法，其包括将对应的式4a*化合物：
4a*
或其盐转化为所述式5a化合物或其盐，
其中每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
一个实施方案提供了一种其中制备式5a*化合物或其盐的方法，其包括将对应的式4a*化合物：
4a*
或其盐转化为所述式5a*化合物或其盐。
在一个实施方案中，式5a*化合物为式5*化合物：
或其盐，并且所述式4a*化合物为式4*化合物：
或其盐。
一个实施方案提供了一种其中制备式5a*化合物的方法，其包括使式4a*化合物或其盐与下式化合物：
A*
或其盐反应，以得到所述式5a*化合物或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式5*化合物的方法，其包括使式4*化合物或其盐与式A*化合物：
A*
或其盐反应，以得到所述式5*化合物或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式4a*化合物：
4a*
或其盐的方法，其包括将对应的式3a*化合物：
3a*
或其盐转化为所述式4a*化合物或其盐，
其中：
P为胺氮保护基团；并且
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
一个实施方案提供了一种其中制备式4a*化合物或其盐的方法，其包括将对应的式3a*化合物：
3a*
或其盐转化为所述式4a*化合物或其盐，
其中每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
在一个实施方案中，式4a*化合物或其盐为式4*化合物：
或其盐，并且所述式3a*化合物或其盐为式3*化合物：
3*
或其盐。
一个实施方案提供了一种用于制备式3a*化合物：
3a*
或其盐的方法，其包括将对应的式2a*化合物：
2a*
或其盐转化为所述式3a*化合物或其盐，
其中：
P为胺氮保护基团；并且
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
一个实施方案提供了一种其中制备式3a*化合物或其盐的方法，其包括将对应的式2a*化合物：
2a*
或其盐转化为所述式3a*化合物或其盐，
其中P为胺氮保护基团。
在一个实施方案中，式3a*化合物或其盐为式3*化合物：
3
或其盐，并且所述式2a*化合物为式2化合物：
或其盐。
应当理解，可以组合2个或更多个上述实施方案。
本文所述的化合物或其盐可以如方案1或方案2所示进行制备。
方案1
方案2
药物制剂
本发明的治疗性抗体-药物偶联物(ADC)的药物制剂通常制备用于肠胃外施用，即与药学上可接受的肠胃外媒介物一起并以单位剂量可注射形式进行推注、静脉内、肿瘤内注射。将具有所需纯度的抗体-药物偶联物(ADC)以冻干制剂或水溶液的形式任选地与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)第16版, Osol, A.编辑)。
抗体-药物偶联物治疗方法
预期本发明的抗体-药物偶联物(ADC)可用于治疗各种疾病或病症，例如以肿瘤抗原的过表达为特征的过度增殖性疾病或病症。示例性病状或过度增殖性病症包括良性或恶性实体瘤和血液学病症，如白血病和淋巴样恶性肿瘤。
本发明的抗体-药物偶联物(ADC)可以通过适于待治疗的病状的任何途径施用。将通常肠胃外施用，即输注、皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外施用ADC。
一般来说，待治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病，诸如癌症。本文中要治疗的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
本发明的某些实施方案提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本文所述的抗体(例如，抗Trop2抗体)或包含该抗体的药物组合物。在某些实施方案中，抗体与有效载荷药物偶联。在某些实施方案中，抗体是裸抗体或其片段(不与有效载荷药物偶联)。在某些实施方案中，药物组合物包含裸抗体，并且不包含与有效载荷药物偶联的抗体。在某些实施方案中，抗体可以调节(例如，降低)细胞膜表面上的靶抗原(例如，Trop2)水平，例如，抗体可以诱导靶抗原的内化。在某些实施方案中，抗体可以调节(例如，减少)靶抗原介导的信号传导，例如，抗体可以阻断靶抗原(例如，Trop2)与其内源配体之间的结合。在某些实施方案中，抗体可以调节(例如，增强)针对表达靶抗原的细胞的ADCC和/或CDC活性。
本发明的某些实施方案提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本文所述的抗体-药物偶联物化合物或包含ADC的药物组合物。
在某些实施方案中，癌症选自肺癌(例如非小细胞肺癌)、胰腺癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌和头颈癌。
在某些实施方案中，癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌、肺腺癌和大细胞肺癌)、胰腺癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌和子宫癌。
在某些实施方案中，患者具有Trop2阳性肿瘤细胞。
在某些实施方案中，患者具有包含一个或多个突变的肿瘤细胞，该一个或多个突变为肿瘤抑制基因中的功能丧失性突变(loss-of-function mutation)，和/或致癌驱动基因中的功能获得性突变(gain-of-function mutation)和/或致癌驱动基因的扩增。
在某些实施方案中，患者具有包含一个或多个如表B3中列出的遗传畸变或突变的肿瘤细胞。
在某些实施方案中，患者具有包含选自由以下组成的组的基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞：KRAS、BRAF、EGFR、ERBB2、ERBB3、APC、CNGA2、ARID1A、SLC34A2、ROS1、FGFR3、TACC3、BAIAP2L1、PIK3CA、PIK3R1、BRCA2、PTEN、STK11、CDKN2A、SMAD4、TP53、UGT2B17、SMARCA2和SMARCA4。
在某些实施方案中，患者具有包含选自由以下组成的组的基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞：ATM、NF1、AKT1/2、CLPTM1L和PVT1、NSD1以及MRE11A。
在某些实施方案中，一个或多个突变包含点突变。
在某些实施方案中，一个或多个突变包含选自由以下组成的组的突变：KRasG12V、BRAF G466V、EGFR L861Q、PIK3CA E545K、APC R1450*、PIK3R1 R386fs、PIK3R1R639ter、TP53 V218、ARID1A L649fs/R693ter和SMARCA4 G1162C。
在某些实施方案中，一个或多个突变包含功能获得性突变。
在某些实施方案中，患者具有包含选自由以下组成的组的基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞：KRAS、BRAF、EGFR、SLC34A2、ROS1、FGFR3、TACC3、BAIAP2L1、PIK3CA、PIK3R1和BRCA2。
在某些实施方案中，一个或多个突变包含功能丧失性突变。
在某些实施方案中，受试者(例如患者)具有包含选自由以下组成的组的基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞：PTEN、STK11、CDKN2A、SMAD4和TP53。
在某些实施方案中，一个或多个突变包含两个基因的融合突变。
在某些实施方案中，一个或多个突变包含选自由以下组成的组的融合突变：SLC34A2-ROS1、FGFR3-TACC3和FGFR3-BAIAP2L1。
在某些实施方案中，一个或多个突变包含BRCA缺陷型突变、FGFR3功能获得性突变、TP53功能丧失性突变或SMARCA4功能丧失性突变。
在某些实施方案中，一个或多个突变为拷贝数变异(copy number variation，CNV)。
在某些实施方案中，一个或多个拷贝数变异(CNV)包含PTEN、STK11、CDKN2A、CNGA2、SMAD4、UGT2B17的部分或全部丢失；或者ERBB2、ERBB3、PIK3CA的增益/扩增。
在某些实施方案中，患者具有HPV阳性肿瘤细胞。在某些实施方案中，患者具有HPV39阳性肿瘤细胞。
在某些实施方案中，患者对护理标准(SOC)疗法无反应。术语“护理标准”或“SOC”是指被医学专家承认为某种类型的疾病(例如癌症)的正确治疗并且被相关领域的医学专家广泛用作可能的最佳实践和/或标准疗法的治疗。
在某些实施方案中，对护理标准无反应的患者(例如，具有肿瘤细胞)可能示出对(例如，在肺腺癌中的)MEK或BET抑制剂疗法、(例如，在NSCLC中的)抗EGFR疗法或者多激酶抑制剂疗法(诸如索拉非尼或AZ628抑制剂(例如，在胃癌中))的抗性。
为疾病的预防或治疗，ADC的适当剂量将取决于如上文定义的要治疗疾病的类型、疾病的严重性和病程、分子是出于预防还是治疗的目的施用、先前疗法、患者的临床病史和对抗体反应，以及主治医师的判断。同时或通过一系列治疗将分子适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，例如无论是否通过一次或多次分开的施用或者通过连续输注，约1 μg/kg至15 mg/kg (例如0.1-20 mg/kg)的分子可以为施用于患者的初始候选剂量。典型的日剂量范围可以为约1 μg/kg至100 mg/kg或更多，这取决于上面提到的因素。向患者施用的ADC的示例性剂量在约0.1至约10 mg/kg患者体重的范围内。
本发明的抗体或免疫偶联物在治疗中可单独使用或与其他药剂组合。例如，本发明的抗体或免疫偶联物可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上述此类联合疗法涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂被包括在相同或不同的制剂中)和独立施用，在此情况下，本发明的抗体或免疫偶联物的施用可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后。本发明的抗体或免疫偶联物也可以与放射治疗组合使用。
本发明的抗体或免疫偶联物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括胃肠外、肺内和鼻内，并且如果需要进行局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径，例如通过注射(诸如静脉内或皮下注射)来给药，这部分地取决于施用是短暂或长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
本发明的抗体或免疫偶联物可以与良好的医学实践一致的方式被配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括受治疗的具体病症、受治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的起因、药剂的递送部位、施用方法、施用时程以及从业医生已知的其他因素。抗体或免疫偶联物不需要但是可以任选地与一种或多种目前用于预防或治疗讨论的病症的药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体或免疫偶联物的量、病症或治疗的类型和上面讨论的其他因素。通常以相同的剂量和用如本文所述的施用途径，或约1%至99%的本文所述的剂量，或以任何剂量和通过经经验/临床确定为合适的任何途径来使用这些。
对于疾病的预防和治疗，本发明的任何抗体或免疫偶联物的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体或免疫偶联物的类型、疾病的严重性和进展、是否施用抗体或免疫偶联物用于预防和治疗目的、先前的治疗、患者的临床史和对抗体或免疫偶联物的应答以及参与医生的判断。同时或通过一系列治疗将抗体或免疫偶联物适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1 μg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)的抗体或免疫偶联物可以为施用于患者的初始候选剂量，例如无论是否通过一次或多次分开的施用或者通过连续输注。一种典型的日剂量范围可以为约1 μg/kg至100 mg/kg或更多，这取决于上面提到的因素。对于几天或更长时间内的重复施用(这取决于条件)，将通常维持治疗直到疾病症状发生所需的抑制。抗体或免疫偶联物的一个示例性剂量将在约0.05 mg/kg至约10 mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任意组合)的一个或多个剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周一次(例如以使患者接受约两个至约二十个，或例如约六个剂量的抗体)。可以施用初始较高的负载剂量，然后是一个或多个较低的剂量。然而，可以使用其他的给药方案。通过常规技术和测定容易监控这种治疗的进程。
制品
在本发明的另一实施方案中，提供含有用于治疗上述病症的物质的制品。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。该容器装有可有效治疗病状的抗体-药物偶联物(ADC)组合物，并且可具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为ADC。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选的病状，诸如癌症。替代地或另外地，制品还可以包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer's)溶液以及葡萄糖溶液。它还可以包括在商业和使用者看来所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
实施例
本发明的本文所述的抗Trop2抗体-药物偶联物的某些示例性实施方案可被称为Trop2 PH1 ADC或PH Trop2 ADC，其中新的有效载荷(例如，PH1或化合物3A)偶联至PeakTrop2抗体(也称为PH抗体(例如，M2.8 mAb))。例如，与PH1有效载荷偶联的示例性M2.8 mAb的某些实施方案在实施例4中被称为M2.8 PH1，或者在实施例12中被称为M2.8 L22 ADC。泰兰斯他汀(PH1)有效载荷也称为PH1-3或A13d2Th。
本发明的本文所述的抗Trop2抗体-药物偶联物的某些示例性实施方案可包含本文所述的偶联至已知抗体的新的有效载荷(例如，泰兰斯他汀(PH1))。已知的抗体可以是hRS7 (也称为沙西妥珠单抗，即IMMU-132的抗体单元)。已知的抗体可以是TINA (也称为DS1062a或德达博妥单抗，即DS-1062的抗体单元)。已知的抗体可能是2G10 (即LCB84的抗体单元)。已知的抗体可能是T6-16。
实施例1. Trop2 ADC接头筛选。
该实施例评估各种接头-毒素作为ADC的功效。抗体是抗TROP2 hRS7 (沙西妥珠单抗，IMMU-132的抗体),并且被评估的毒素是泰兰斯他汀(PH1，也称为PH1-3或A13d2Th)。
L2 (NHS)和L22 (TFP)经由不可裂解的赖氨酸偶联，并且在细胞内消化ADC后，可能细胞内释放相同的分解代谢物。L92 (Val-Ala TFP)经由可裂解的赖氨酸偶联，并且可能释放不同的分解代谢物。L18经由不可裂解的半胱氨酸偶联，并且可能释放与L2/22不同的分解代谢物。
该实施例评估接头毒素组合对N87胃癌的功效，该胃癌表达高水平的Trop2和Her2并且因此对Trop2-ADC或Her2-ADC抑制敏感。用3 mg/kg的各种接头毒素ADC对带有预植入的N87肿瘤的无胸腺小鼠进行静脉内处理，并且随时间推移读取随肿瘤体积而变的功效。在实验中包括DAR 4/8版本的Trop2 PH1 ADC。在3 mg/kg下，抗Trop2 ADC在与不可裂解接头L-2 (77% TGI)和L-22 (82% TGI)在随机赖氨酸上偶联时是最有效的。L-22 (DAR 4.5)接头的活性略高于L-2 (DAR 3.65) Trop2 PH1 ADC可能是由于偶联期间的DAR较高，参见图1。
使用L-2接头，Trop2 PH1 ADC作为DAR8比DAR4组分更有效(88%对比于77% TGI)。虽然在该实施例的这种模型中，DAR8 ADC可能比DAR4更有效，但是出于治疗指数的考虑，还需要平衡前者的稳定性和毒性。
在相同剂量下，上述抗Trop2 ADC的活性与Kadcyla相当，Kadcyla靶向表达Her2的细胞并且是批准用于治疗胃癌的药物。
相比之下，通过使用可裂解接头L-92将相同毒素偶合至随机赖氨酸或者使用不可裂解接头L-18将相同毒素偶合至半胱氨酸而制备的抗Trop2 ADC分别示出约68%和65% TGI的较低功效。总的来说，在该实施例中，具有不可裂解接头的赖氨酸偶联物具有最高效力。
实施例2. Trop2的抗体结合概况和结合亲和力
该实施例涉及抗Trop2抗体作为裸mAb的表征和分析。特别是，结合亲和力/结合概况也分别与mAb TINA和hRS7进行比较。
通过生物膜干涉测量法(BLI)确定结合亲和力和结合概况。在Octet Red仪器上于25℃下进行结合测定。将抗体负载至抗人IgG Fc捕获生物传感器上，持续300秒。将负载配体的传感器浸入Trop2的3倍系列稀释液(在0.1% BSA、1X PBS、0.02% Tween20和0.05%NaN3中以300 nM开始)中持续200秒，然后解离400秒。使用单价(1:1)结合模型计算动力学常数。
从CHO细胞中产生PH抗体(例如，M2.1、M2.2、M2.8)以及mAb TINA和hRS7，用于比较对Trop2的结合亲和力。选择的PH抗体和其他抗体的结合分析在Octet感应图(sensogram)上示出不同概况(图2)。虽然抗体都具有类似的kon值，但解离值明显不同。TINA抗体迅速解离，而hRS7抗体解离几乎停滞。相比之下，PH抗体示出TINA和hRS7抗体之间的中度解离。根据结合亲和力的计算分析，hRS7抗体和选择的Peak Bio抗体(例如，M2.8)具有低于10 nM的结合亲和力(表A1)。TINA抗体在24.61 nM下结合不太紧密(表A1)。
表A1
用单价模型(1:1)计算mAb与抗原的结合亲和力。
虽然所有的M2抗体具有类似的结合行为，但M2.8最终具有略微较高的结合亲和力。
实施例3. PH抗体(例如，M2.1、M2.8)结合人和食蟹猴Trop2
为了评估PH抗体(例如，M2.1、M2.8) mAb与人、食蟹猴和小鼠Trop2的结合，用Trop2 cDNA构建体转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，以瞬时过表达人、食蟹猴或小鼠Trop2。将抗体与瞬时过表达Trop2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞一起培育，以使用流式细胞术测试抗体与人、食蟹猴或小鼠Trop2的结合概况。
PH抗体(例如，M2.1)结合人和食蟹猴，但不结合啮齿动物Trop2 (图3A)。hRS7(IMMU-132) mAb结合人和食蟹猴Trop2 (图3B)。REA916抗体与所有上述组分共有的表位结合，并用作阳性对照(图3C)。TINA (DS-1062) mAb结合人和食蟹猴Trop2 (图3D)。
实施例4. 接头毒素与Trop2 mAb的有效偶联以及ADC (DAR2或DAR4版本)的表征
PH1与PH抗体的偶联物(例如，M2.8)
在Amicon浓缩器(30 kDa，再生纤维素)中将M2.8抗体缓冲液交换成50 mM硼酸盐/50 mM NaCl pH 8.5缓冲液(BB)。用另外的BB将BB中的抗体小心地调节至10 mg/mL，然后在冰上冷却至4℃。将PH1L2以2.2、2.6、4.2或4.8的不同摩尔过量添加至抗体中，并快速混合。将反应物在4℃下保持过夜，以确保偶联反应进行完全。收获偶联的M2.8 PH1，并且用上述方法将其缓冲液交换成磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并最后通过0.22 μm PES过滤器过滤。偶联物的DAR分析显示2.2、2.6、4.2和4.8的摩尔过量分别产生1.6、2.0、3.3和3.6的实验性DAR。小批量偶联中的实验性DAR的成功的摩尔过量用于驱动大批量偶联。靶标DAR ± 0.5被视为是可接受的。例如，发布3.5-4.5的实验性DAR，作为DAR4 ADC进行测试。在10-25mg规模下，使用5、6和8 PH1的摩尔过量来驱动偶联，以实现4的DAR。
高效液相色谱法
在PBS中稀释的ADC在具有Agilent 1100 HPLC机器的尺寸排阻柱(SEC)上运行。在280 nm处用二极管阵列检测器获取的读数用于鉴定蛋白质以及是否有聚集物。类似地，ADC在疏水性相互作用柱(HIC) HPLC上运行。
质谱仪
用电喷雾电离液相色谱质谱仪对ADC进行表征。
M2.8 PH1 (DAR2或DAR4版本)表征的结果
在M2.8抗体与PH1有效载荷偶联后，M2.8 PH1在HIC (图6，A和D)和SEC (图6，B和E)上被表征。图6A和图6D (DAR2或DAR4版本)示出在2.2分钟时间点附近洗脱出的分析物，随后此后的多个峰形成单个大峰，指示在不同赖氨酸处偶联的异源ADC群体具有数目逐渐增加的PH1有效载荷。鉴于不同PH1群体对M2.8的接近程度，使用质谱法(MS)来阐明M2.8PH1群体的准确平均药物抗体比(DAR)。ESI-MS提供每个DAR群体的分布的细分(图6C或图6F，对于DAR2或DAR4版本)，其中观察到0至4 DAR (DAR 2)或者1至7 DAR (DAR 4)的范围。DAR2版本或DAR4版本的每个群体的平均DAR分别为约1.7或3.6。因此，可以控制M2.8 PH1ADC以产生最少聚集(<1.5%，如通过SEC-HPLC测量)，并且可重复地产生1.5-2或3.5-4.0的DAR (通过LC-MS)。可以通过ESI-MS可靠地验证M2.8与PH1的偶联效率。
实施例5. Trop2 mAB和ADC的细胞内化
用以下Trop2 mAb进行内化测定：hRS7、M2.1、M2.3、T6-16、TINA。所使用的对照Ab为靶向鸡溶菌酶的HuLys 11。hRS7和TINA似乎内化更快，但T6-16示出最高的内化百分比(图7)。
M2.1和M2.8 ADC在细胞中显示出类似的内化(积累)速率(图8)。
方法
基于时间x时内化的比率减去开始时内化的比率，然后乘以100，使用下式计算内化百分比：([V(tx)/M(tx)] - [V(t0)/M(t0)]) * 100，其中V和M为与表达抗原的细胞结合的Alexa 488偶联的mAb或ADC的平均几何平均荧光强度信号(GMFI)；而淬灭光漂白了细胞表面上的荧光标记的抗原-抗体复合物，留下仅获自内化的复合物的信号。V(t0)和M(t0)表示在追踪开始时，在开始时间t0处的脉冲标记的受体-mAb复合物的量，这些复合物分别被淬灭和未淬灭。V(tx)和M(tx)表示来自mAb标记的受体的对应淬灭的和未淬灭的荧光值，这些受体在时间t0处平行起始，但分别在时间x、tx后淬灭。V(tx)和M(tx)的GMFI表示在追踪期结束时淬灭的和未淬灭的复合物的量。在x=0.5、3和6小时的时间间隔淬灭样品
将细胞胰蛋白酶化并在前一晚接种(50-100k个细胞/孔)。将板、培养基和1X PBS在冰上预冷15分钟。将细胞用冷PBS洗涤1次，然后吸出PBS。将Ab在预冷的无指示剂培养基中稀释至1.5 ug/ml。将稀释的初级Ab以200微升/孔转移至各孔中。将细胞在冰上培育30min。将细胞用冷PBS洗涤1次，然后吸出PBS (重复步骤)。如上所述在预冷的无指示剂培养基中稀释淬灭抗体。
对于T0板，将淬灭抗体以200微升/孔转移至时间点0板中。将细胞在冰上培育30min。将细胞用冷PBS洗涤1次，然后吸出PBS。将细胞胰蛋白酶化并转移至V形底部聚苯乙烯板中。在以1200 rpm旋转5 min后，吸出缓冲液，并且保留细胞沉淀。将细胞用冷PBS洗涤1次，然后以1200 rpm旋转5 min。将细胞沉淀再悬浮在200 ul无指示剂培养基中。使用GuavaEasycyte Plus HT流式细胞仪读取细胞样品，并且使用Guava Cytosoft软件套件分析数据。
对于所有其他时间点板，将200 uL预热的培养基添加至所有剩余板的孔中，将其在37℃培养箱中放置0.5小时、3小时或6小时。从培养箱中取出板，并且添加过量的预冷的PBS。将板在冰上放置15分钟。吸出缓冲液。将淬灭抗体以200微升/孔转移至每个板中。将板在冰上培育30 min。将细胞用冷PBS洗涤1次，然后吸出缓冲液。将细胞胰蛋白酶化并转移至V形底部聚苯乙烯板中。在以1200 rpm旋转5 min后，吸出缓冲液，并且保留细胞沉淀。将细胞用冷PBS洗涤1次，然后以1200 rpm旋转5 min。将细胞沉淀再悬浮在200 ul无指示剂培养基中。使用Guava Easycyte Plus HT流式细胞仪读取细胞样品，并且使用Guava Cytosoft软件套件分析数据。
实施例6. PH1 (当在IMMU-132抗体hRS7上偶联时)相对于IMMU-132抗体上的SN-38的有效载荷优势
为了确定具有泰兰斯他汀有效载荷的PH Trop2 ADC是否具有与同类最佳(best-in-class)抗Trop2 ADC IMMU-132 (在DAR8下在hRS7上偶联的SN-38)相当(或更好)的活性，使用相同的hRS7抗体但不同的有效载荷(PH1对比于SN-38)，将IMMU-132在其10mpk QWx2的有效剂量下的肿瘤抑制功效与PH1有效载荷ADC在较低剂量(1mpk QW x3或3mpk QWx2)和较低DAR (DAR4)下的功效进行比较。群组中肿瘤消退的小鼠数目表示为总数的比率。
结果
PH1作为hRS7 mAb上的有效载荷显示出显著TGI。hRS7 mAb (其为首个(first-in-class) IMMU-132 (沙西妥珠单抗-戈维替康)的一部分)在DAR4下具有PH1有效载荷的情况下显示出比在DAR8下的临床批准的SN38偶联物显著更好的抗肿瘤功效(图9)，表明与SN-38相比，PH1有效载荷ADC可以在较低剂量和/或较低DAR下提供更好的功效。
结论
使用相同的hRS7 mAb，即使IMMU-132在DAR8下与SN38偶联，而PH1在DAR 4下偶联，与PH1有效载荷偶联的ADC也显示出比含有SN38的IMMU-132显著更好的活性。当以3mpkQWx2施用时，具有PH1有效载荷的ADC表现出比10mpk QWx2下的IMMU-132更大的TGI。与1mpk下的IMMU-132相比，具有PH1有效载荷的ADC在1mpk的次优剂量下也表现得更好。
方法
N87胃癌细胞表达高水平的内源性Trop2蛋白。IMMU-132目前是使用以8的药物-抗体比(DAR)与伊立替康代谢物有效载荷SN-38偶联的mAB hRS7的首个(FIC)Trop2 ADC。它是用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的护理标准(SOC)，并且目前正在临床中测试其对表达Trop2的水平升高的胃癌的活性。在临床前胃癌模型N87中，10mpk QWx2被确定为IMMU-132的有效剂量。
在雌性BALB/c裸鼠中测试ADC对皮下NCI-N87胃癌异种移植模型的治疗。
细胞培养
将NCI-N87肿瘤细胞系在37℃/5% CO2的空气气氛下体外维持在补充有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。通过胰蛋白酶-EDTA处理，每周两次常规传代培养肿瘤细胞。收获在指数生长期中生长的细胞，并且进行计数以用于肿瘤接种。
肿瘤接种
在每只小鼠的右侧区域皮下接种含肿瘤细胞(1*107)的0.1 ml与基质胶(1:1)混合的PBS，用于肿瘤发育。
随机化
当平均肿瘤大小达到大约195.81 mm3时，开始随机化。所有动物被随机分配至研究组中。基于“匹配分布”方法(StudyDirectorTM软件，版本3.1.399.19)进行随机化。
观察和数据收集
在肿瘤细胞接种后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测期间，检查动物的肿瘤生长和治疗对行为的任何影响，诸如移动性、食物和水消耗、体重增加/减少(在随机化后每周两次测量体重)、眼睛/毛发消光以及任何其他异常。详细记录每只动物的死亡率和观察到的临床病征。
在随机化后，在两个维度上使用卡尺每周两次测量肿瘤体积，并且使用下式以mm3表示体积：V = (L x W x W)/2，其中V为肿瘤体积，L为肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)，并且W为肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。在层流柜中进行给药以及肿瘤和体重测量。通过使用StudyDirectorTM软件(版本3.1.399.19)测量体重和肿瘤体积。
ADC施用
按照研究设计，在随机化的同一天(第7天)开始治疗。
肿瘤生长抑制(TGI)：TGI%是抗肿瘤活性的指标，并表示为：TGI (%) =100 x (1-T/C)。T和C分别是在给定日治疗组和对照组的平均肿瘤体积(或重量)。
使用以下方法进行组间平均肿瘤体积差异的统计分析：使用在最后观察日收集的数据以用于每个单一的组，尽管个体终止日期不同。
为了比较不同组在预先指定的一天的肿瘤体积，首先使用巴特利特检验(Bartlett's test)来检查所有组之间的方差均匀性(homogeneity)的假设。当巴特利特检验的p值>= 0.05时，进行单向ANOVA以检验所有组的平均值的总体相等性。如果单向ANOVA的p值<0.05，则通过运行图基HSD (Tukey's HSD) (真实显著差异)检验进行所有成对比较并且运行邓尼特检验(Dunnett's test)以将每个治疗组与媒介物组进行比较来进行事后检验。当巴特利特检验的p值<0.05时，进行克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallistest)以检验所有组中中位数的总体相等性。如果克鲁斯卡尔-沃利斯检验的p值<0.05，则通过运行康诺弗非参数检验(Conover's non-parametric test)进行所有成对比较或以将每个治疗组与媒介物组进行比较来进行事后检验，上述比较均采用单步p值调整。
此外，在没有多重比较校正的情况下进行成对比较，并且根据韦尔奇t检验(Welch's t-test)或曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)直接报告标称/未校正的p值。具体来说，首先使用巴特利特检验来检查一对组的方差均匀性的假设。当巴特利特检验的p值≥0.05时，进行韦尔奇t检验，否则进行曼-惠特尼U检验以获得标称p值。
所有的统计分析都是在R-a语言和统计计算与图形(版本3.3.1)的环境中进行的。除非另有说明，否则所有测试都是双侧的，并且p值<0.05被认为是统计上显著的。
实施例7. Trop-2 PH1 ADC (M2.1)相对于IMMU-132的优势
为了确定具有泰兰斯他汀(PH1)有效载荷的PH Trop2 ADC (M2.1 mAb)是否具有与同类最佳抗Trop2 ADC IMMU-132相当(或更好)的活性，将IMMU-132在其10mpk QW x2的有效剂量下的肿瘤抑制功效与在较低剂量(3mpk QW x2)和较低DAR (DAR2或DAR4)下与PH1有效载荷偶联的M2.1 mAb的PH ADC的功效进行比较。还研究了1mpk QW x3比较下的次优剂量。群组中肿瘤消退的小鼠数目表示为总数的比率。
方法
N87胃癌细胞表达高水平的内源性Trop2蛋白。IMMU-132目前是使用以8的药物-抗体比(DAR)与伊立替康代谢物有效载荷SN-38偶联的mAB hRS7的同类最佳(BIC) Trop2ADC。它是用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的护理标准(SOC)，并且目前正在临床中测试其对表达Trop2的水平升高的胃癌的活性。在临床前胃癌模型N87中，10mpk QWx2被确定为IMMU-132的有效剂量。
结果
当评估TGI的持久性时，PH Trop2 ADC(与PH1有效载荷偶联的mAb M2.1)在预防肿瘤生长方面的表现显著优于IMMU-132。结果支持在DAR2或DAR4下使用M2.1 PH Trop2 mAb泰兰斯他汀ADC作为候选物进行进一步评估。与含有SN38有效载荷的IMMU-132相比，PH1有效载荷显示出对PH mAb (M2.1)的显著改善的功效(图10)。
结论
即使IMMU-132在DAR8下偶联，而PH Trop2 ADC在DAR 4和2下偶联，与PH1有效载荷偶联的PH Trop2 ADC也显示出比含有SN38的IMMU-132显著更好的活性。当以3mpk QWx2施用时，PH Trop2 ADC表现出比10mpk QWx2下的IMMU-132更大的TGI。
当在剂量匹配的次优设置中，在1mpk QWx3剂量下比较与PH1有效载荷偶联的PHTrop2 ADC时，偶联PH1有效载荷的Trop2 ADC的功效高于IMMU-132，后者在该剂量下基本上无活性，而PH1-Trop2 ADC (M2.1在DAR2或DAR4下与PH1偶联)具有约45-70%的TGI。
在次优剂量下，M2.1 ADC在DAR4下比DAR2表现出更好的功效。然而，当剂量足够高(诸如3mpk QWx2)时，M2.1 DAR4与DAR2 ADC在早期抗肿瘤功效或肿瘤再生长特性方面没有显著差异。
实施例8. 具有PH1有效载荷的Trop2 ADC使肿瘤消退
使用与实施例6-7中所描述相同的模型。PH mAb M2.1和M2.3在DAR 4或DAR 2下与PH1有效载荷偶联。抗Trop2 mAb T6-16和hRS7在DAR4下与PH1有效载荷偶联。群组中肿瘤消退的小鼠数目表示为总数的比率。指示与同种型对照抗RSV PH1 ADC具有在p<0.05下显著的肿瘤体积差异的群组。
所有测试的具有PH1有效载荷的Trop2 ADC在3 mg/kg下使单个肿瘤消退(图11)。即使IMMU-132在较高的DAR 8下偶联并且以10mpk的较高剂量施用，所有与PH1有效载荷偶联的抗Trop2 ADC也显示出比含有SN38的IMMU-132显著改善的功效。
实施例9. 在次优剂量下，具有PH1有效载荷的Trop2 ADC相对于IMMU-132的优势
使用与实施例6-7中所描述相同的模型。PH mAb M2.1和M2.3在DAR 4或DAR 2下与PH1有效载荷偶联。抗Trop2 mAb TINA、T6-16和hRS7在DAR4下与PH1有效载荷偶联。
当在剂量匹配的次优设置中，在1mpk QWx3剂量下比较所有具有PH1的Trop2 ADC时，所有偶联PH1有效载荷的Trop2 ADC的功效更高。这个剂量下的IMMU-132基本上无活性，而所有PH1-Trop2 ADC具有45-70% TGI (图12)。M2.1 PH1示出比M2.3 PH1更高的TGI。对于M2.1 PH1和M2.3 PH1，DAR4示出比DAR2更高的TGI。
实施例10. Trop2 PH1 ADC (M2.8 PH1)为多种来源的癌症的有效抑制剂。
为了评估ADC对多种癌症适应症的细胞毒性，对一组70个细胞系进行了无偏细胞毒性筛选(表B1)。在代表9种适应症的30种细胞系中观察到Trop2 PH1 ADC活性(表B2)。其中，27种细胞系的IC50低于100nM。在来自8种适应症的19种细胞系中观察到一位数纳摩尔抑制。在图13中示出25种具有一位数或两位数IC50的细胞系的代表性列表(对于使用NCI-N87细胞、BxPC3细胞或RT112/84细胞的代表性测定，还参见图14A-图14C)。
另一方面，与IMMU-132相比，Trop2 PH1 ADC对Trop2阴性细胞显示出较低的脱靶毒性(对于使用786-0细胞、BJ正常人成纤维细胞或HS27正常人成纤维细胞的测定，参见图14D-图14F)。
此外，在具有致癌驱动基因(oncogenic driver)的癌症，诸如KRas G12V、BRAFG466V (索拉非尼耐药性)、EGFR L861Q、SLC34A2-ROS1融合、FGFR3 GOF或FGFR3融合(FGFR3-TACC3和FGFR3-BAIAP2L1融合两者)、PI-3K信号传导突变(PIK3CA E545K和PIK3R1R386fs/R639ter)、BRCA2缺陷型(家族性)以及HPV39阳性(病毒性)癌症中观察到Trop2 PH1ADC功效。
此外，在具有功能丧失的肿瘤抑制因子，诸如PTEN、STK11、CDKN2A、SMAD4、TP53LOF或TP53 V218突变的癌症中观察到Trop2 PH1 ADC功效。在UGT2B17功能丧失的癌症中观察到Trop2 PH1 ADC功效。在由于SMARCA2、SMARCA4 G1162C或LOF缺失而具有补偿性活化的癌症中也观察到Trop2 PH1 ADC的功效。
方法
该实施例的目的是探索ADC对70种癌细胞系的细胞活力的潜在影响。在与不同浓度的ADC或对照培育后，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定在癌细胞系中测定50%抑制浓度(IC50)。
将每种细胞系用ADC处理，标准化疗药物作为参考对照，并且培养基作为媒介物对照。A549和Calu-6是不表达靶蛋白Trop2的阴性对照细胞系。所有剩余的细胞系在RNA和/或蛋白质水平上表达一些靶蛋白Trop2。
将所有细胞在温度为37℃、5% CO2和95%湿度下在补充有10-15% FBS的培养基中培养。使用CellTiter-Glo®发光细胞活力测定(Cat# G7572, Promega)。
半数最大抑制浓度IC50的测定
1. 在对数生长期期间收获细胞，并使用Count-star计数细胞数。
2. 用各自的培养基将细胞浓度调节至4.44×104个细胞/毫升。
3. 将90 μL细胞悬浮液添加至两个96孔板(板A和B)中，最终细胞密度为4×103个细胞/孔(可根据数据库或密度优化测定调节细胞浓度)。
4a. 第二天：对于T0读数的板：
1) 将10 μL培养基添加至板A的每个孔中，用于T0读数。
2) 在室温下平衡板及其内容物，持续大约30 min。
3) 将50 μL CellTiter-Glo试剂添加至每个孔中。
4) 在轨道振荡器上将内容物混合5 min以诱导细胞裂解。
5) 使板在室温下培育20 min，以稳定发光信号。
6) 使用EnVision多标签读取器记录发光(T0)。
4b. 对于测试读数的板：
1) 制备10× ADC溶液(最高工作浓度：200 nM ADC在培养基中，10倍系列稀释，达到9个剂量水平。
2) 制备10×参考对照溶液顺铂(最高工作浓度：100 μM在培养基中，3.16倍系列稀释，达到9个剂量水平。
3) 将ADC和参考对照的10 μL (10×)药物溶液分配至板B的每个孔中(每个药物浓度一式三份)。
4) 将测试板在37℃、5% CO2下在潮湿的培养箱中培育120小时。
5) 在室温下平衡板及其内容物，持续大约30 min。
6) 将50 μL CellTiter-Glo试剂添加至每个孔中。
7) 在轨道振荡器上将内容物混合5 min以诱导细胞裂解。
8) 使板在室温下培育20 min，以稳定发光信号。
9) 使用EnVision多标签读取器记录发光(T5)。
数据分析
使用GraphPad Prism 5.0显示或分析数据。为了计算绝对IC50 (EC50)，将使用具有s形剂量反应的非线性回归模型来拟合剂量反应曲线。用于计算存活率的公式如下所示，并且将根据由GraphPad生成的剂量反应曲线计算绝对IC50 (EC50)。
存活率(%) = (Lum测试品-Lum培养基对照)/ (Lum未处理-Lum培养基对照) ×100%。
表B1. 针对一组70种细胞系的细胞毒性筛选
表B2. 关于30种响应细胞系的代表性列表的细胞毒性数据
表B3. 对抗Trop2 PH1 ADC有反应的代表性细胞系以及这些细胞系的突变。
实施例12Trop2阳性胃异种移植物模型中的持久消退
在该实施例中，使用雌性BALB/c裸鼠的皮下NCI-N87胃癌异种移植物模型，针对用于人临床试验并且随后被批准用于人使用的Trodelvy (药物级IMMU-132)，测试Trop2 PH1ADC (M2.8 mAb与PH1有效载荷偶联，也称为M2.8 L22 ADC)在DAR2和DAR4下的功效。即使在较低剂量(3mpk对比于10mpk)和DAR (2或4对比于8)下，Trop2 PH1 ADC也优于医药级IMMU-132。
方法
细胞培养
将NCI-N87肿瘤细胞系在37℃/5% CO2的空气气氛下体外维持在补充有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。通过胰蛋白酶-EDTA处理，每周两次常规传代培养肿瘤细胞。收获在指数生长期中生长的细胞，并且进行计数以用于肿瘤接种。
肿瘤接种
在每只小鼠的右侧区域皮下接种含肿瘤细胞(1*107)的0.1 ml与基质胶(1:1)混合的PBS，用于肿瘤发育。
随机化
当平均肿瘤大小达到大约192.40 mm3时，开始随机化。100只小鼠参加该研究。所有动物被随机分配至12个研究组中。基于“匹配分布”方法(StudyDirectorTM软件，版本3.1.399.19)进行随机化。
观察和数据收集
在肿瘤细胞接种后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测期间，检查动物的肿瘤生长和治疗对行为的任何影响，诸如移动性、食物和水消耗、体重增加/减少(在随机化后每周两次测量体重)、眼睛/毛发消光以及任何其他异常。详细记录每只动物的死亡率和观察到的临床病征。
在随机化后，在两个维度上使用卡尺每周两次测量肿瘤体积，并且使用下式以mm3表示体积：V = (L x W x W)/2，其中V为肿瘤体积，L为肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)，并且W为肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。在层流柜中进行给药以及肿瘤和体重测量。
按照研究设计，在随机化的同一天(第6天)开始治疗。
肿瘤生长抑制(TGI)：TGI%是抗肿瘤活性的指标并表示为：TGI (%) =100 x (1-T/C)。T和C分别是在给定日治疗组和对照组的平均肿瘤体积(或重量)。
使用以下方法进行组间平均肿瘤体积差异的统计分析：使用在最后观察日收集的数据以用于每个单一的组，尽管个体终止日期不同。
统计学分析
为了比较不同组在预先指定的一天的肿瘤体积，首先使用巴特利特检验来检查所有组之间的方差均匀性的假设。当巴特利特检验的p值>= 0.05时，进行单向ANOVA以检验所有组的平均值的总体相等性。如果单向ANOVA的p值<0.05，则通过运行图基HSD (真实显著差异)检验进行所有成对比较并且运行邓尼特检验以将每个治疗组与媒介物组进行比较来进行事后检验。当巴特利特检验的p值<0.05时，进行克鲁斯卡尔-沃利斯检验以检验所有组中中位数的总体相等性。如果克鲁斯卡尔-沃利斯检验的p值<0.05，则通过运行康诺弗非参数检验进行所有成对比较或以将每个治疗组与媒介物组进行比较来进行事后检验，上述比较均采用单步p值调整。此外，在没有多重比较校正的情况下进行成对比较，并报告直接来自韦尔奇t检验或曼-惠特尼U检验的标称/未校正的p值。具体来说，首先使用巴特利特检验来检查一对组的方差均匀性的假设。当巴特利特检验的p值≥0.05时，进行韦尔奇t检验，否则进行曼-惠特尼U检验以获得标称p值。
所有的统计分析都是在R-a语言和统计计算与图形(版本3.3.1)的环境中进行的。除非另有说明，否则所有测试都是双侧的，并且p值<0.05被认为是统计上显著的。
结果
在Trop2阳性肿瘤模型(携带具有表达水平IHC3+的人NCI-N87胃肿瘤的裸鼠)中，以QW，持续2周(QWx2)的给药方案向小鼠给药。水平虚线指示开始治疗时200 mm3的平均肿瘤体积。低于这条线的肿瘤缩小被视为消退。监测肿瘤大小。
M2.8 L22 ADC DAR4的早期功效表现为约90% TGI，并且从D21至D41观察到。尽管Trodelvy的TGI为约80%,但在这个早期阶段期间，由2种药物引起的抑制没有统计学差异。
在用3mg/kg的Trop2 PH1 (DAR4) ADC治疗的组中，在约5个月的时段内，在50%的治疗小鼠中观察到长期肿瘤消退(TR) (图16)。在用3mg/kg的Trop2 PH1 (DAR2) ADC治疗的组中，在约5个月的时段内，在50%的治疗小鼠中观察到稳定疾病。在较低DAR (2或4对比于7.6)和较低剂量(3mg/kg对比于10 mg/kg)下，Trop2 PH1的两个治疗组都优于IMMU-132*的治疗组。IMMU-132*表示临床级IMMU-132 (沙西妥珠单抗-戈维替康)。
结论
M2.8 L22 ADC对NCI-N87胃癌模型表现出有效的抗肿瘤功效。
在5个月(160天)的时段内，Trodelvy (临床级IMMU-132)在植入尺寸低于200mm3时示出较少的肿瘤消退(2/10),并且比M2.8 L22 ADC (DAR4)反弹得更快，后者在50%所治疗的动物中表现出肿瘤消退。在DAR2下，在用M2.8 L22 ADC治疗的动物中观察到稳定疾病，因为50%的肿瘤不能生长超过400mm3。
由于两种药剂hRS7和M2.8的抗体竞争相同的结合位点或/表位(图4)，该差异可归因于PH1的有效载荷功效优于SN-38。
实施例14抗Trop2抗体(例如，M2.8等)的产生
利用不同的限制性酶切割位点生成SEQ ID NO: 1-6的基因块，以确保一致地插入到所需载体中用于表达重链和轻链。对于初始表达，将可变区基因(VH或VL)插入到pcDNA3.3载体中，用于抗体(具有如本文所述的可变区和hIgG1/Ck的恒定区)的瞬时表达(在HEK293细胞中)。类似地，使用Lonza的GS Xceed™表达系统和载体按照制造商的说明书制备稳定的细胞系。
实施例15
使用手性色谱法分离化合物1A和1B (国际专利申请公开号WO 20019/060398)的非对映异构体混合物，并且分离为纯的非对映异构体。
化合物1A
化合物1B
出乎意料地发现，化合物1A (也称为ThA13D2)的活性显著高于化合物1B (也称为ThA13D1)。表3示出化合物1A对比于化合物1B和非对映异构体混合物(也称为ThA13)对各种细胞系的活性。
表X3 (IC50nM)
也使用手性色谱法分离化合物2A和2B的非对映异构体混合物，并且分离为纯的非对映异构体。
化合物2A
化合物2B
发现化合物2A (也称为ThA13D2L2)的活性显著高于化合物2B (也称为ThA13D1L2)。图17示出化合物2A对比于化合物2B和非对映异构体混合物(也称为ThA13L2)对HCT116细胞活力的活性。
实施例16. 中间体A的制备
中间体A
步骤1：3-(羟基氨基)-3-亚氨基-2-甲基丙酸乙酯(2)的合成。
在0℃下，向2-氰基丙酸乙酯(20 g，15.7 mmol)在THF (500 mL)中的搅拌溶液中添加KOtBu (314 mL，31.4 mmol，1 M在THF中)溶液。在10 min后，添加羟基胺盐酸盐(27 g，39.3 mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌48 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.1，KMnO4活性(active))。
在减压下蒸发反应物质，通过二氧化硅柱使用40%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化残余物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈无色油状物的3-(羟基氨基)-3-亚氨基-2-甲基丙酸乙酯(5.5 g，21.8%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.17 (t,J= 7.15 Hz, 3 H), 1.24 (d,J=7.15 Hz, 3 H), 3.10 - 3.20 (m, 1 H), 3.92 - 4.23 (q, 2 H), 5.31 - 5.45 (br, 2H)。
LCMS: 43.4% (161.13, M+H), RT = 0.37 min以及49.48% (161.13, M+H), RT= 0.41 min
步骤2：2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸乙酯(3)的合成
在室温下，向3-(羟基氨基)-3-亚氨基-2-甲基丙酸乙酯(5.5 g，34.3 mmol)在吡啶(50 mL)中的搅拌溶液中添加在密封管中的乙酸酐(9.7 mL，10.3 mmol)。将反应混合物在120℃下加热24 h，通过TLC监测反应进程。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.5，KMnO4活性)。
在减压下蒸发反应物质，通过二氧化硅柱使用20%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化残余物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈黄色油状物的2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸乙酯(4.5 g，71.4%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.26 (t,J= 7.09 Hz, 3 H), 1.58 - 1.62(d, 3 H), 2.61 (s, 3 H), 3.89 - 4.00 (q, 1 H), 4.15 - 4.26 (q, 2 H)。
LCMS: 86.56% (185.22, M+H), RT = 1.48 min。
步骤3：2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(4)的合成。
在0℃下，向2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸乙酯(4.5 g，24.4 mmol)在MeOH:THF:H2O (45 ml，4:4:1)中的搅拌溶液中添加LiOH.H2O (4 g，9.7 mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌12 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.1，KMnO4活性)。
在减压下蒸发反应物质，使用6N HCl (约10 ml)将残余物的pH调节至约1，然后用乙酸乙酯(25 ml x 2)萃取。使用Na2SO4干燥合并的有机层，并在减压下浓缩，得到呈无色油状物的2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(3.5 g，92%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.41 (d,J= 7.23 Hz, 3 H), 2.57 (s, 3H), 3.88 - 3.97 (q, 1 H), 12.65 - 12.82 (br s, 1 H)。
LCMS: 94.38% (157.1, M+H), RT = 1.05 min。
步骤4：N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺(5)的合成。
在0℃下，向2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(3.5 g，22.4 mmol)在DCM (100ml)中的搅拌溶液中添加EDC.HCl (6.4 g，33.6 m mol)、HOBt (4.5 g，33.6 mmol)、DIPEA(11.7 ml，67.2 mmol)。在10 min后，在0℃下添加N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(3.2 g，33.6mol)。将反应混合物在室温下搅拌12 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.2，KMnO4活性)。
将反应物质用DCM (40 mL)稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液(30 ml)洗涤。将有机层分离，并经硫酸钠干燥。在减压下蒸发有机层，并获得5 g粗N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺。通过二氧化硅柱，使用40%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈无色油状物的N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺(2.2 g，50%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.57 (d,J= 7.03 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3H), 3.26 (s, 3 H), 3.72 (s, 3 H), 4.34 - 4.42 (q, 1 H)。
LCMS: 96.65% (200.16, M+H), RT = 1.21 min。
步骤5：2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛(6)的合成。
在0℃下，向LAH (380 mg，10 mmol)在THF (10 ml)中的搅拌溶液中缓慢添加含N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺(1 g，50 mmol)的THF (20 ml)。将反应混合物在室温下搅拌1 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(40%EtOAc/己烷，Rf: 0.3，KMnO4活性和2,4-DNP略微活性)。
将反应混合物在0℃下使用1 N HCl (~3 ml)淬灭，并搅拌10 min并添加乙酸乙酯(20 ml)。将反应混合物通过硅藻土床过滤。使用硫酸钠干燥滤液，并将体积减至4 mL (约800 mg，粗品)的2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛。因此，粗2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛用于步骤6。
ESMS: 40.4% (141.1, M+H), RT = 2.24 min。(粗品)
步骤6：(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯(7)的合成。
在0℃下，向18-冠-6-醚(7.5 g，28.5 m mol)在无水THF (30 ml)中的搅拌溶液中添加2-(双(2,2,2-三氟乙氧基)磷酰基)乙酸甲酯(1.3 ml，6.2 m mol)，然后在-78℃下添加含1 M KHMDS的THF (6.2 ml，6.2 mmol)。将反应混合物在-78℃下维持30 min，然后在-78℃下添加含2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛(约800 mg)的无水THF (10 ml)，并且使反应混合物在室温下逐渐升温并在相同温度下搅拌2 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(30% EtOAc/己烷，Rf: 0.5，KMnO4活性)。
将反应混合物使用H2O (30 ml)淬灭，并在乙酸乙酯(50 ml x 2)中萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到600 mg粗(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯。通过二氧化硅柱，使用10%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈黄色油状物的(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯(420 mg，LCMS纯度为59%，37%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.44 - 1.48 (d, 3 H), 2.57 (s, 3 H)3.74 (s, 3 H), 5.01 - 5.10 (q, 1 H), 5.92 – 5.89 (d,J= 10 Hz, 1 H), 6.35 -6.46 (dd,J= 10 Hz, 1 H)。
LCMS: 59% (197.21, M+H), RT = 1.57 min。
由烯烃键的JJ偶合常数证实的Z几何异构体: 10 Hz
步骤7：(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(8)的合成。
将(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯(550 mg，28 mmol，LCMS的粗品纯度为80%)添加在二噁烷(10 ml)和2 N HCl (5 ml)中。将反应混合物在55℃下搅拌48 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(30% EtOAc/己烷，Rf: 0.1，KMnO4活性)。
将反应混合物在减压下浓缩，并使用制备型HPLC纯化，得到呈无色油状物的纯(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(138 mg，28.6%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.33 (d,J= 7.02 Hz, 3 H), 2.55 (s, 3H), 4.86 - 5.08 (q, 1 H), 5.84 (dd,J= 11.40 Hz, 1 H), 6.24 (m,J= 10.52 Hz, 1H), 11.64 - 12.96 (br s, 1 H)。
LCMS: 98.59% (183.21, M+H), RT = 1.4 min。
步骤8：合成
来自步骤7的甲基(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(8)的外消旋混合物经受手性色谱法，得到所需对映异构体(中间体A)。
实施例17. 中间体B的制备
步骤1：(4S,5R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-3,4-二甲酸3-叔丁酯4-甲酯(2)的合成。
在23℃下，将2,2-二甲氧基丙烷(159.1 mL，1285 mmol)添加至(2S,3R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-羟基丁酸甲酯(150 g，642 mmol)在DCM (1500 mL)中的搅拌溶液中，并添加三氟化硼乙醚(3.96 mL，32.13 mmol)。然后将反应混合物在23℃下搅拌30 min。通过TLC监测反应的进展。TLC系统(50 % EtOAc/己烷, Rf= 0.6, PMA可见)。在反应完成后，用盐水(1000 ml)淬灭。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，得到粗化合物。通过在二氧化硅(100-200目)上的快速色谱法(1至5% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈无色油状物的(4S,5R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-3,4-二甲酸3-叔丁酯4-甲酯(145 g，82.85%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.36 - 1.42 (m, 9 H) 1.48 (s, 3 H) 1.54- 1.67 (m, 6 H) 3.76 (s, 3 H) 3.86 - 4.02 (m, 1 H) 4.07 - 4.19 (m, 1 H)。
步骤2：(4S,5R)-4-甲酰基-2,2,5-三甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(3)的合成。
在-78℃下，向(4S,5R)-4-甲酰基-2,2,5-三甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(130 g，475.6mmol)在无水甲苯(750 mL)中的搅拌溶液中添加DIBAL-H (1 M在甲苯中) (713 mL，713 mmol)。在添加后，将混合物在-78℃下再搅拌10 min，并通过在-78℃下缓慢添加冷MeOH (220 mL)来淬灭。将所得白色乳液倒入冰冷的1N HCl (2000 mL)中，搅拌15 min，并且然后用EtOAc (1000 mL x 2)萃取水性混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，得到粗化合物。TLC系统(30 % EtOAc/己烷, Rf=0.55, 2,4-DNP可见)通过在二氧化硅(100-200目)上的快速色谱法(1至5% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈无色油状物的(4S,5R)-4-甲酰基-2,2,5-三甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(100 g，86.95%)。1H NMR (400MHz,氯仿-d) δ ppm 1.36 (d, J=6.10 Hz, 3 H) 1.40 - 1.52 (m, 9 H) 1.57 - 1.72(m, 6 H) 3.67 - 3.84 (m, 1 H) 4.02 - 4.10 (m, 1 H) 9.36 - 9.47 (m, 1 H)。
步骤3：(4R,5R)-2,2,5-三甲基-4-乙烯基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(4)的合成。
在0℃下，向甲基三苯基溴化鏻(293 g，822 mmol)在THF (750 mL)中的溶液中一次性添加KOtBu (92 g，822 mmol)。将所得混合物在相同温度下再搅拌1小时。在相同温度下1 h后，添加含(4S,5R)-4-甲酰基-2,2,5-三甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(100 g，411mmol)的THF (250 mL)，并将混合物在50℃下搅拌12 h。通过TLC监测反应的进展。TLC系统(10 % EtOAc/己烷, RF=0.5, PMA可见)。在冷却至23℃后，将反应混合物用饱和NH4Cl溶液(1000 ml)淬灭，用EtOAc (1000 mL x 2)萃取。将合并的有机层用盐水(1000 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，得到粗化合物。通过在二氧化硅(100-200目)上的快速色谱法(1至5% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈无色油状物的(4R,5R)-2,2,5-三甲基-4-乙烯基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(80 g，80.80%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm1.28 (d, J=5.99 Hz, 3 H) 1.38 - 1.49 (m, 9 H) 1.51 (s, 3 H) 1.56 - 1.63 (m, 3H) 3.72 (br d, J=1.31 Hz, 1 H) 3.78 - 3.86 (m, 1 H) 5.16 (br d, J=7.85 Hz, 2H) 5.66 (br d, J=6.43 Hz, 1 H)。
步骤4：(3R,4R)-4-羟基戊-1-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯(5)的合成。
在23℃下，向(4R,5R)-2,2,5-三甲基-4-乙烯基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(80 g，331.4 mmol)在MeOH (2.0 L)中的搅拌溶液中添加樟脑磺酸(7.7 g，33.14 mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌48 h。通过TLC监测反应的进展。TLC系统(40 % EtOAc/己烷, RF=0.25,PMA可见)。在完成后，用饱和NaHCO3溶液(1000 ml)淬灭反应混合物，并在真空中去除大部分溶剂。用EtOAc (1000 mL x 2)萃取水性残余物。将合并的有机层用盐水(1000 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，得到粗化合物。通过在二氧化硅(100-200目)上的快速色谱法(10 → 40% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈无色油状物的(3R,4R)-4-羟基戊-1-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯(58 g，86.95%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.23 (d, J=6.32 Hz, 3 H) 1.46 (s, 9 H)1.94 (br s, 1 H) 3.87 (br dd, J=5.99, 3.05 Hz, 1 H) 4.02 - 4.12 (m, 1 H) 4.87(br s, 1 H) 5.21 - 5.26 (m, 1 H) 5.28 - 5.31 (m, 1 H) 5.84 (ddd, J=17.19,10.49, 5.12 Hz, 1 H); LCMS: 94.36% (202.14, M+H), RT: 1.50 min。
步骤5：(3R,4R)-4-(2-甲基烯丙基氧基)戊-1-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯(6)的合成。
在23℃下，向(3R,4R)-4-羟基戊-1-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯5 (40 g，198.73mmol)在DMF (250 mL)中的搅拌溶液中添加甲代烯丙基溴(107.3 g，795.9 mmol)。用铝箔包裹烧瓶，并且添加氧化银(69 g，298 mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌24 h。通过TLC监测反应的进展。TLC系统(10 % EtOAc/己烷, RF=0.4, PMA可见)。在23℃下24 h后，将反应混合物用乙醚(500 mL)稀释，通过硅藻土过滤并用另外的乙醚(500 mL)洗涤。然后用水(5 ×500 mL)、盐水(50 mL)萃取滤液，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过在二氧化硅(100-200目)上的快速色谱法(2.5 → 10% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈无色油状物的(3R,4R)-4-(2-甲基烯丙基氧基)戊-1-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯6 (40.5 g，79.88%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.16 (d, J=6.32 Hz, 3 H) 1.45 (s, 9 H)1.68 - 1.77 (m, 3 H) 3.51 - 3.63 (m, 1 H) 3.75 - 3.86 (m, 1 H) 3.89 - 4.01(m, 1 H) 4.12 (br d, J=7.08 Hz, 1 H) 4.79 - 4.91 (m, 2 H) 4.94 (d, J=0.87 Hz,1 H) 5.09 - 5.25 (m, 2 H) 5.89 (ddd, J=17.22, 10.46, 5.45 Hz, 1 H); LCMS:78.48% (256.33, M+H), RT: 2.69 min。
步骤6：((2R,3R)-2,5-二甲基-3,6-二氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(7)的合成。
在23℃下，在氮气气氛下，向((3R,4R)-4-((2-甲基烯丙基)氧基)戊-1-烯-3-基)氨基甲酸叔丁酯6 (35 g，137 mmol)在苯(500 mL)中的搅拌溶液中添加格拉布第二代催化剂(Grubb’s 2ndgeneration catalyst) (2.3 g，2.74 mmol)。然后将反应物回流3 h。在冷却至23℃后，添加四乙酸铅(1.8 g，4.11 mmol)，并在23℃下再搅拌12 h。TLC系统(10 %EtOAc/己烷, RF=0.3, PMA可见)。然后在真空中去除溶剂，并且通过在二氧化硅(100-200目)上的快速色谱法(2.5 → 10% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈白色固体的((2R,3R)-2,5-二甲基-3,6-二氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯7 (26 g，83.60%)。1H NMR(400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.16 - 1.22 (m, 3 H) 1.44 (s, 9 H) 1.61 (s, 3 H) 3.57- 3.66 (m, 1 H) 3.86 - 3.94 (m, 1 H) 3.97 (s, 1 H) 3.98 - 4.06 (m, 1 H) 4.60(br d, J=9.66 Hz, 1 H) 5.56 - 5.62 (m, 1 H); LCMS: 94.00% (228.29, M+H), RT:2.35 min。
步骤7：((2R,3R)-2,5-二甲基-6-氧代-3,6-二氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(8)的合成。
在23℃下，向((2R,3R)-2,5-二甲基-3,6-二氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯7(30 g，132.1 mmol)在苯(1200 mL)中的搅拌溶液中添加硅藻土(120 g)、重铬酸吡啶鎓(99.3 g，364.3 mmol)和叔丁基过氧化氢(70 wt%在水中，47.5 mL，528.6 mmol)。在23℃下5 h后，通过硅藻土过滤反应混合物，用乙酸乙酯(500 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。TLC系统(30 % EtOAc/己烷, RF=0.4, UV可见)。通过在硅胶(100-200目)上的快速色谱法(7.5 → 30% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈白色固体的((2R,3R)-2,5-二甲基-6-氧代-3,6-二氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯8 (18 g，56.60%)。1H NMR (400MHz,氯仿-d) δ ppm 1.38 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 1.42 - 1.49 (m, 9 H) 1.92 - 1.97(m, 3 H) 4.21 - 4.31 (m, 1 H) 4.51 - 4.65 (m, 2 H) 6.63 (dd, J=6.32, 1.43 Hz,1 H); LCMS: 96.91% (242.17, M+H), RT: 1.68 min。
步骤8：((2R,3R,5S)-2,5-二甲基-6-氧代四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(9)的合成。
在23℃下，向((2R,3R)-2,5-二甲基-6-氧代-3,6-二氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(25 g，103.61 mmol)在乙醇(500 mL)中的搅拌溶液中添加PtO2(470 mg，2.07mmol)，并将反应烧瓶中的气氛改变为氢气。将反应混合物在23℃下搅拌24 h。TLC系统(30% EtOAc/己烷, RF=0.35, PMA可见)。在23℃下24 h后，通过滤纸过滤反应混合物，并在真空中去除溶剂，得到呈白色固体的((2R,3R,5S)-2,5-二甲基-6-氧代四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯9 (25g，99%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.16 - 1.25 (m, 4 H)1.29 - 1.38 (m, 5 H) 1.39 - 1.54 (m, 12 H) 2.49 - 2.71 (m, 2 H) 4.03 - 4.19(m, 1 H) 4.41 - 4.55 (m, 1 H) 4.64 - 4.82 (m, 1 H)。
步骤9：((2R,3R,5S)-6-烯丙基-6-羟基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(10)的合成。
在氮气气氛下，在-78℃下，向((2R,3R,5S)-2,5-二甲基-6-氧代四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯9 (25 g，102.7 mmol)在THF (300 mL)中的搅拌溶液中，沿烧瓶侧面添加烯丙基氯化镁(1.4 M溶液在THF中，146 mL，205.4 mmol)。在相同温度下1.5 h后，用饱和NH4Cl水溶液(500 mL)淬灭反应物。用EtOAc (2 × 500 mL)萃取水性残余物。将合并的有机层用盐水(500 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。TLC系统(40 % EtOAc/己烷, RF=0.25, PMA可见)。通过在二氧化硅(100-200目)上的快速色谱法(10 → 50%EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈浅黄色油状物的((2R,3R,5S)-6-烯丙基-6-羟基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯10 (20 g，68.25%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.13 (d, J=7.2 Hz, 3 H) 1.16 (d, J=6.3 Hz, 3 H) 1.45 (s, 9 H) 1.93 -2.03 (m, 1 H) 2.10 - 2.29 (m, 1 H) 2.68 - 2.80 (m, 1 H) 3.24 - 3.39 (m, 2 H)3.65 - 3.76 (m, 1 H) 4.71 (br d, J=9.06 Hz, 1 H) 5.05 - 5.22 (m, 2 H) 5.78 -6.02 (m, 1 H)。
步骤10. ((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(11)的合成。
在23℃下，在氮气气氛下，向((2R,3R,5S)-6-烯丙基-6-羟基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯10 (5 g，17.54 mmol)在DCM (50 mL)中的搅拌溶液中添加2,2,2-三氟乙醇(10 mL，140.3 mmol)和三乙基硅烷(28 mL，175.4 mmol)。将反应物冷却至-78℃，并且沿烧瓶侧面缓慢添加BF3• OEt2复合物(8.6 mL，70.16 mmol)。在相同温度下另外3 h后，在-78℃下添加饱和NaHCO3水溶液(100 mL)，并分离各层。用EtOAc (3 × 50mL)萃取水性残余物。将合并的有机层用盐水(100 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。TLC系统(10 % EtOAc/己烷, RF=0.3, PMA可见)。通过在硅胶(100-200目)上的快速色谱法(2 → 12.5% EtOAc/己烷)纯化所得残余物，得到呈无色油状物的((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯11 (1.8 g，38.29%)。1HNMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 0.98 - 1.07 (m, 3 H) 1.10 - 1.21 (m, 3 H) 1.45 (d,J=1.43 Hz, 9 H) 1.68 - 1.81 (m, 1 H) 1.95 (br d, J=2.74 Hz, 2 H) 2.03 - 2.20(m, 1 H) 2.24 - 2.41 (m, 1 H) 3.37 - 3.68 (m, 3 H) 4.78 (br d, J=9.06 Hz, 1H) 4.98 - 5.15 (m, 2 H) 5.71 - 5.88 (m, 1 H); LCMS: 60.33% (270.33, M+H), RT:2.74 min。
步骤11：((2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-((E)-3-甲基-4-氧代丁-2-烯-1-基)四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体B)的合成。
向((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3基)氨基甲酸叔丁酯(900 mg，3.345毫摩尔)在DCM (10 mL)中的搅拌溶液(在0℃下搅拌)中添加TFA在DCM (10mL)中的溶液，然后在2 h内使其缓慢达到室温，此时TLC指示反应完成(TLC系统：30%EtOAc/石油醚, Rf: 0.1, PMA活性)。在28℃下在减压下浓缩反应混合物，得到粗产物，将该粗产物在高真空下进一步干燥，得到呈浅棕色液体的1-(((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-l4-氮烷基)-2,2,2-三氟乙-1-酮(1 g粗品)，其不经进一步纯化即可用于后续反应中。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 5.71 - 5.84 (m, 1 H)4.99 - 5.16 (m, 2 H) 3.71 - 3.82 (m, 1 H) 3.51 - 3.64 (m, 1 H) 3.32 - 3.45(m, 1 H) 2.25 - 2.45 (m, 1 H) 2.06 - 2.21 (m, 3 H) 1.86 - 1.97 (m, 1 H) 1.23- 1.34 (m, 4 H) 0.99 - 1.10 (m, 4 H); LCMS: 90.2% (170.2, M+H), RT: 2.59 min。
实施例18. 中间体C的制备。
步骤1：(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(2)的合成。
在室温下，向化合物1 (137.5 g，0.941摩尔)、Pd(OAc)2(5.9 g，0.026摩尔)在ACN(550 ml)中的混合物中添加乙酸乙烯酯(250 g，2.907摩尔)。将反应混合物在60℃下搅拌24 h。将反应混合物通过硅藻土过滤，并用EtOAc (100 ml)洗涤。在减压下浓缩溶剂，得到残余物。用丙酮(68 ml)、EtOAc (68 ml)的混合物重结晶残余物。得到呈灰白色固体的(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(75 g，55%)。TLC系统(EtOAc, RF=0.39, UV活性)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.60 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 5.61 (d, J = 4.9Hz, 1H), 5.30 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.00 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.16 - 4.06 (m,2H), 3.82 - 3.76 (m, 1H), 3.73 - 3.66 (m, 1H)。
步骤2：(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(3)的合成。
在室温下，向化合物(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(100 g，0.69摩尔)在DMF (1900 ml)中的溶液中添加TBS-Cl (277 g，2.65摩尔)、咪唑(140.9 g，2.07摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌24 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(5% EtOAc/石油醚, RF=0.5, UV活性)。在反应完成后，将反应混合物用乙醚(2500ml)稀释，并用水(1000 ml)、盐水(1000 ml)洗涤。乙醚层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂2% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈灰白色固体的(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(200 g，77.5%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 7.30 - 7.25(m, 1H), 5.30 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.45 - 4.40 (m, 1H), 4.18 (td, J = 2.6,12.2 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 0.91 (d, J = 2.5 Hz, 18H), 0.23 (s,3H), 0.11 - 0.05 (m, 6H); LCMS: 99.48% (373.37, M+H), RT: 3.47 min。
步骤3：2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(4)的合成。
在室温下，向(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(55 g，0.147摩尔)在DCM (2000 ml)中的搅拌溶液中添加叔丁基(1-甲氧基乙烯基氧基)二甲基硅烷(55 g，0.292摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌2 h。在-78℃下将BF3.Et2O (63.25 g，3.03摩尔)添加至反应混合物中后。将反应混合物在-78℃下搅拌1 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(15% EtOAc/石油醚,RF=0.5, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (500 ml)淬灭，并用DCM (2x250 ML)萃取。用饱和NaHCO3(500 ml)、盐水(500 ml)洗涤DCM层。DCM层经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，浓缩，并形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂3% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗物质，得到呈透明胶状物的2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(25 g，37.9%)。1H NMR (400MHz,氯仿-d) δ = 4.92 - 4.72 (m, 1H), 4.33 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.91 - 3.78(m, 2H), 3.74 - 3.58 (m, 4H), 2.83 - 2.60 (m, 2H), 2.52 - 2.38 (m, 2H), 0.99- 0.79 (m, 18H), 0.15 (s, 3H), 0.11 - 0.01 (m, 9H)
步骤4：2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(5)的合成。
在0℃下，向甲基三苯基溴化鏻(12 g，0.033摩尔)在THF (180 ml)中的悬浮液中添加KOtBu (3.33 g，0.029摩尔)的THF (80 ml)溶液。在1 h后，逐滴添加2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(10 g，0.022摩尔)的THF (60 ml)溶液。然后将反应混合物加热至25℃并搅拌1小时。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(5% EtOAc/石油醚, RF=0.3, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (100 ml)淬灭，并用EtOAc (2x150 ml)萃取。EtOAc层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂5% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(4 g，40.4%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 5.07 (s, 1H), 4.89 - 4.86 (m, 1H),4.30 - 4.23 (m, 1H), 4.02 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 3.75 - 3.66 (m, 5H), 3.47 (td,J = 4.7, 6.4 Hz, 1H), 2.65 (dd, J = 7.3, 15.0 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 6.8,15.0 Hz, 1H), 2.42 - 2.28 (m, 2H), 0.95 - 0.84 (m, 18H), 0.12 - 0.01 (m, 12H)
步骤5：2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(6)的合成。
在室温下，向化合物2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(75.1 g，0.168摩尔)在MeOH (751 ml)中的搅拌溶液中添加PPTS (59.4 g，0.236摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌16 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(25% EtOAc/石油醚, RF=0.3, PMA活性)。将反应混合物用饱和NaHCO3(1270 ml)淬灭，并用EtOAc (2x 1500 ml)萃取。EtOAc层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂25% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色胶状物的2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(39 g，69.8%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 5.11 (s, 1H), 4.88 (s, 1H), 4.42 - 4.35 (m, 1H),3.93 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 3.71 - 3.64 (m, 5H), 3.56 - 3.50 (m, 1H), 2.73 (dd,J = 8.8, 15.4 Hz, 1H), 2.51 - 2.42 (m, 2H), 2.31 (dd, J = 3.8, 13.4 Hz, 1H),2.15 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 0.94 - 0.91 (m, 9H), 0.10 - 0.08 (m, 3H), 0.05 -0.03 (m, 3H)。LCMS: 80.17% (331.39, M+H), RT: 2.78 min
步骤6：2-((2S,5S,6S)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(7)的合成。
在-78℃下，向草酰氯(17.2 g，0.136摩尔)在DCM (214 ml)中的搅拌溶液中缓慢添加DMSO (21 g，0.27摩尔)。将反应混合物在-78℃至-60℃下搅拌20 min。然后逐滴添加2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯的化合物(30 g，0.09摩尔)在DCM (414 ml)中的溶液。将反应混合物在30 min内缓慢升温至-45℃。在-45℃下添加TEA (52.8 g，0.522摩尔)后，并将反应混合物在10min内升温至0℃。通过TLC监测反应进展。TLC示出SM被消耗。TLC系统(20% EtOAc/石油醚,RF=0.35, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (500 ml)淬灭，并用DCM (2x500 ML)萃取。用盐水(1000 ml)洗涤DCM层。DCM层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂20% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色胶状物的2-((2S,5S,6S)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(22 g，73.8%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 9.76 - 9.73 (m, 1H), 5.05 -5.00 (m, 1H), 4.93 - 4.87 (m, 1H), 4.36 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.29 - 4.20 (m,1H), 4.12 - 4.08 (m, 1H), 3.73 - 3.67 (m, 4H), 2.78 - 2.69 (m, 1H), 2.55 -2.40 (m, 1H), 2.27 - 2.20 (m, 2H), 0.96 - 0.87 (m, 9H), 0.12 - -0.02 (m, 6H);LCMS: 97.53% (329.34, M+H), RT: 2.60 min
步骤7：2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(8)的合成。
向2-((2S,5S,6S)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(2 g，6.088毫摩尔)在THF (140 mL)中的搅拌溶液(在26℃下搅拌)中添加CrCl2 (4.489 g，36.531毫摩尔)和CHI3 (7.191 g，18.265毫摩尔)，并在相同温度下搅拌16 h。TLC指示反应完成(TLC系统：20% EtOAc/石油醚, Rf: 0.7, PMA活性)。用冰冷的水(50 mL)稀释反应混合物，并用EtOAc (2x50 mL)萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物(2.8 g)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和4%EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。在28℃下在减压下蒸发收集的级分，得到呈浅黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(800 mg，产率28%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.49 -6.62 (m, 1 H) 6.31 - 6.44 (m, 1 H) 5.09 - 5.22 (m, 1 H) 4.83 - 4.96 (m, 1 H)4.35 - 4.45 (m, 1 H) 3.84 - 3.92 (m, 1 H) 3.75 - 3.82 (m, 1 H) 3.65 - 3.72(m, 3 H) 2.63 - 2.72 (m, 1 H) 2.42 - 2.55 (m, 2 H) 2.25 - 2.36 (m, 1 H) 0.87- 0.96 (m, 9 H) -0.01 - 0.02 (m, 6 H); LCMS: 85.58% (453, M+H&475 M+23 (Na加合物), RT: 2.8 min。
步骤8：2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(9)的合成。
在0℃下，向2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(800 mg，1.768毫摩尔)在THF (40 mL)中的溶液中添加TBAF (1M在THF中，2.122 mL，2.122毫摩尔)，然后在2 h内使其缓慢达到室温，此时TLC指示反应完成(TLC系统：30% EtOAc/石油醚, Rf: 0.2, PMA活性)。通过添加NH4Cl(水溶液) (20 mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc (2x20mL)萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物(2 g)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和20%EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。蒸发收集的级分，得到呈浅黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(450 mg，产率76%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.67 (br d, J=4.80 Hz, 2 H) 5.11 - 5.15 (m, 1H) 4.95 - 5.00 (m, 1 H) 4.26 - 4.34 (m, 1 H) 4.08 - 4.16 (m, 1 H) 3.88 - 3.95(m, 1 H) 3.66 - 3.73 (m, 3 H) 2.60 - 2.70 (m, 1 H) 2.44 - 2.51 (m, 1 H) 2.35- 2.42 (m, 2 H) 1.96 - 2.00 (m, 1 H); LCMS: 89% (339.04, M+H), RT: 1.69 min
步骤9：2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(中间体C)的合成。
向2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(450 mg，1.33毫摩尔)在DCM (27 mL)中的溶液(在0℃下搅拌)中添加V(acac)2(35.2 mg，0.133毫摩尔)，然后添加叔BuOOH (5-6 M在癸烷中，0.53 mL，2.66毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌4 h，此时TLC指示反应完成(TLC系统：50% EtOAc/石油醚, Rf: 0.3,PMA活性)。通过硅藻土过滤反应混合物，用DCM (20 mL)洗涤。浓缩滤液，得到粗产物(500mg)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和25% EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。蒸发收集的级分，得到呈浅黄色胶状物的2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(220 mg，产率46%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d)δ ppm 6.70 (dd, J=14.60, 4.90 Hz, 1 H) 6.49 - 6.57 (m, 1 H) 4.55 (s, 1 H)4.08 - 4.13 (m, 1 H) 3.47 - 3.52 (m, 1 H) 2.97 - 3.01 (m, 1 H) 2.88 - 2.96(m, 1 H) 2.59 - 2.69 (m, 2 H) 2.18 (dd, J=14.17, 5.34 Hz, 1 H) 1.79 - 1.86(m, 1 H) 1.68 - 1.76 (m, 1 H)
实施例19. 中间体D的制备。
步骤1：(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(2)的合成。
在室温下，向化合物1 (137.5 g，0.941摩尔)、Pd(OAc)2(5.9 g，0.026摩尔)在ACN(550 ml)中的混合物中添加乙酸乙烯酯(250 g，2.907摩尔)。将反应混合物在60℃下搅拌24 h。将反应混合物通过硅藻土过滤，并用EtOAc (100 ml)洗涤。在减压下浓缩溶剂，得到残余物。用丙酮(68 ml)、EtOAc (68 ml)的混合物重结晶残余物。得到呈灰白色固体的(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(75 g，55%)。TLC系统(EtOAc, RF=0.39, UV活性)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.60 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 5.61 (d, J = 4.9Hz, 1H), 5.30 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.00 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.16 - 4.06 (m,2H), 3.82 - 3.76 (m, 1H), 3.73 - 3.66 (m, 1H)。
步骤2：(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(3)的合成：
在室温下，向化合物(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(100 g，0.69摩尔)在DMF (1900 ml)中的溶液中添加TBS-Cl (277 g，2.65摩尔)、咪唑(140.9 g，2.07摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌24 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(5% EtOAc/石油醚, RF=0.5, UV活性)。在反应完成后，将反应混合物用乙醚(2500ml)稀释，并用水(1000 ml)、盐水(1000 ml)洗涤。乙醚层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂2% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈灰白色固体的(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(200 g，77.5%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 7.30 - 7.25(m, 1H), 5.30 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.45 - 4.40 (m, 1H), 4.18 (td, J = 2.6,12.2 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 0.91 (d, J = 2.5 Hz, 18H), 0.23 (s,3H), 0.11 - 0.05 (m, 6H); LCMS: 99.48% (373.37, M+H), RT: 3.47 min。
步骤3：2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(4)的合成。
在室温下，向(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(55 g，0.147摩尔)在DCM (2000 ml)中的搅拌溶液中添加叔丁基(1-甲氧基乙烯基氧基)二甲基硅烷(55 g，0.292摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌2 h。在-78℃下将BF3.Et2O (63.25 g，3.03摩尔)添加至反应混合物中后。将反应混合物在-78℃下搅拌1 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(15% EtOAc/石油醚,RF=0.5, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (500 ml)淬灭，并用DCM (2x250 ML)萃取。用饱和NaHCO3(500 ml)、盐水(500 ml)洗涤DCM层。DCM层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂3% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈透明胶状物的2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(25 g，37.9%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 4.92 - 4.72 (m, 1H), 4.33 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.91 - 3.78 (m, 2H),3.74 - 3.58 (m, 4H), 2.83 - 2.60 (m, 2H), 2.52 - 2.38 (m, 2H), 0.99 - 0.79(m, 18H), 0.15 (s, 3H), 0.11 - 0.01 (m, 9H)。
步骤4：2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(5)的合成：
在0℃下，向甲基三苯基溴化鏻(12 g，0.033摩尔)在THF (180 ml)中的悬浮液中添加KOtBu (3.33 g，0.029摩尔)的THF (80 ml)溶液。在1 h后，逐滴添加2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(10 g，0.022摩尔)的THF (60 ml)溶液。然后将反应混合物加热至25℃并搅拌1小时。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(5% EtOAc/石油醚, RF=0.3, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (100 ml)淬灭，并用EtOAc (2x150 ml)萃取。EtOAc层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂5% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(4 g，40.4%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 5.07 (s, 1H), 4.89 - 4.86 (m, 1H),4.30 - 4.23 (m, 1H), 4.02 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 3.75 - 3.66 (m, 5H), 3.47 (td,J = 4.7, 6.4 Hz, 1H), 2.65 (dd, J = 7.3, 15.0 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 6.8,15.0 Hz, 1H), 2.42 - 2.28 (m, 2H), 0.95 - 0.84 (m, 18H), 0.12 - 0.01 (m,12H)。
步骤5：2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(6)的合成。
在室温下，向化合物2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(75.1 g，0.168摩尔)在MeOH (751 ml)中的搅拌溶液中添加PPTS (59.4 g，0.236摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌16 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(25% EtOAc/石油醚, RF=0.3, PMA活性)。将反应混合物用饱和NaHCO3(1270 ml)淬灭，并用EtOAc (2x 1500 ml)萃取。EtOAc层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂25% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色胶状物的2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(39 g，69.8%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 5.11 (s, 1H), 4.88 (s, 1H), 4.42 - 4.35 (m, 1H),3.93 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 3.71 - 3.64 (m, 5H), 3.56 - 3.50 (m, 1H), 2.73 (dd,J = 8.8, 15.4 Hz, 1H), 2.51 - 2.42 (m, 2H), 2.31 (dd, J = 3.8, 13.4 Hz, 1H),2.15 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 0.94 - 0.91 (m, 9H), 0.10 - 0.08 (m, 3H), 0.05 -0.03 (m, 3H)。LCMS: 80.17% (331.39, M+H), RT: 2.78 min。
步骤6：2-((2S,5S,6S)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(7)的合成。
在-78℃下，向草酰氯(17.2 g，0.136摩尔)在DCM (214 ml)中的搅拌溶液中缓慢添加DMSO (21 g，0.27摩尔)。将反应混合物在-78℃至-60℃下搅拌20 min。然后逐滴添加2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯的化合物(30 g，0.09摩尔)在DCM (414 ml)中的溶液。将反应混合物在30 min内缓慢升温至-45℃。在-45℃下添加TEA (52.8 g，0.522摩尔)后，并将反应混合物在10min内升温至0℃。通过TLC监测反应进展。TLC示出SM被消耗。TLC系统(20% EtOAc/石油醚,RF=0.35, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (500 ml)淬灭，并用DCM (2x500 ML)萃取。用盐水(1000 ml)洗涤DCM层。DCM层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂20% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色胶状物的2-((2S,5S,6S)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(22 g，73.8%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 9.76 - 9.73 (m, 1H), 5.05 -5.00 (m, 1H), 4.93 - 4.87 (m, 1H), 4.36 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.29 - 4.20 (m,1H), 4.12 - 4.08 (m, 1H), 3.73 - 3.67 (m, 4H), 2.78 - 2.69 (m, 1H), 2.55 -2.40 (m, 1H), 2.27 - 2.20 (m, 2H), 0.96 - 0.87 (m, 9H), 0.12 - -0.02 (m, 6H);LCMS: 97.53% (329.34, M+H), RT: 2.60 min。
步骤7：2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(8)的合成。
向2-((2S,5S,6S)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(2 g，6.088毫摩尔)在THF (140 mL)中的搅拌溶液(在26℃下搅拌)中添加CrCl2 (4.489 g，36.531毫摩尔)和CHI3 (7.191 g，18.265毫摩尔)，并在相同温度下搅拌16 h。TLC指示反应完成(TLC系统：20% EtOAc/石油醚, Rf: 0.7, PMA活性)。用冰冷的水(50 mL)稀释反应混合物，并用EtOAc (2x50 mL)萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物(2.8 g)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和4%EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。在28℃下在减压下蒸发收集的级分，得到呈浅黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(800 mg，产率28%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.49 -6.62 (m, 1 H) 6.31 - 6.44 (m, 1 H) 5.09 - 5.22 (m, 1 H) 4.83 - 4.96 (m, 1 H)4.35 - 4.45 (m, 1 H) 3.84 - 3.92 (m, 1 H) 3.75 - 3.82 (m, 1 H) 3.65 - 3.72(m, 3 H) 2.63 - 2.72 (m, 1 H) 2.42 - 2.55 (m, 2 H) 2.25 - 2.36 (m, 1 H) 0.87- 0.96 (m, 9 H) -0.01 - 0.02 (m, 6 H); LCMS: 85.58% (453, M+H&475 M+23 (Na加合物), RT: 2.8 min。
步骤8：2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(9)的合成。
在0℃下，向2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(800 mg，1.768毫摩尔)在THF (40 mL)中的溶液中添加TBAF (1M在THF中，2.122 mL，2.122毫摩尔)，然后在2 h内使其缓慢达到室温，此时TLC指示反应完成(TLC系统：30% EtOAc/石油醚, Rf: 0.2, PMA活性)。通过添加NH4Cl(水溶液) (20 mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc (2x20mL)萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物(2 g)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和20%EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。蒸发收集的级分，得到呈浅黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(450 mg，产率76%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.67 (br d, J=4.80 Hz, 2 H) 5.11 - 5.15 (m, 1H) 4.95 - 5.00 (m, 1 H) 4.26 - 4.34 (m, 1 H) 4.08 - 4.16 (m, 1 H) 3.88 - 3.95(m, 1 H) 3.66 - 3.73 (m, 3 H) 2.60 - 2.70 (m, 1 H) 2.44 - 2.51 (m, 1 H) 2.35- 2.42 (m, 2 H) 1.96 - 2.00 (m, 1 H); LCMS: 89% (339.04, M+H), RT: 1.69 min。
步骤9：2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸(10)的合成。
在0℃下，向2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(4.35 g，12.86毫摩尔)在THF (30 mL)和水(30 mL)中的搅拌溶液中添加LiOH.H2O (2.165 g，51.6毫摩尔)，然后在3 h内使其缓慢达到室温，此时TLC指示反应完成(TLC系统：50% EtOAc/石油醚, Rf: 0.1, PMA活性)。在0℃下使用柠檬酸溶液(水溶液)中和反应混合物，并用EtOAc (3x40 mL)萃取。有机层经Na2SO4干燥，并在30℃下在减压下浓缩，得到呈浅黄色胶状物的2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸(4.1 g粗品)，其不经进一步纯化即可用于后续反应中。1H NMR (400MHz,氯仿-d) δ ppm 6.53 - 6.66 (m, 2 H) 5.14 - 5.17 (m, 1 H) 5.01 (s, 1 H)4.32 (dq, J=7.83, 5.71 Hz, 1 H) 4.09 - 4.16 (m, 1 H) 3.93 - 3.97 (m, 1 H)2.71 (dd, J=15.65, 7.83 Hz, 1 H) 2.51 - 2.60 (m, 1 H) 2.43 (d, J=5.38 Hz, 2H); LCMS: 87.45% (323, M-H), RT: 1.42 min。
步骤10：2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(11)的合成。
向2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸(4 g，12.345毫摩尔)在DCM (80 mL)中的溶液(在25℃下搅拌)中添加EDC.HCl (3.559g，18.518毫摩尔)和N-羟基琥珀酰胺(2.131 g，18.518毫摩尔)，并在相同温度下搅拌3 h，此时TLC指示反应完成(TLC系统：60% EtOAc/石油醚, Rf: 0.5, UV和PMA活性)。在30℃下在减压下浓缩反应混合物。通过正相色谱法(通过Combi-Flash)使用24 g硅胶柱和40%EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化获得的残余物。蒸发收集的级分，得到呈浅黄色胶状物的2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(3.5 g，产率68%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.55 - 6.67(m, 2 H) 5.16 (s, 1 H) 5.04 (s, 1 H) 4.30 - 4.40 (m, 1 H) 4.14 - 4.21 (m, 1H) 3.92 - 4.00 (m, 1 H) 2.82 - 2.90 (m, 6 H) 2.51 - 2.59 (m, 1 H) 2.38 - 2.46(m, 1 H) 2.27 - 2.34 (m, 1 H); LCMS: 93.7% (422.02, M+H), RT: 1.64 min。
步骤11：2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(中间体D)的合成。
向2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(3.5 g，8.31毫摩尔)在DCM (180 mL)中的溶液(在0℃下搅拌)中添加乙酰丙酮氧钒(330 mg，1.245毫摩尔)，然后添加tBuOOH (4 mL，5-6 M在癸烷中，20.75毫摩尔)，然后使其在室温下缓慢搅拌4 h，此时TLC指示反应完成。通过硅藻土过滤反应混合物，用DCM (20 mL)洗涤。在30℃下浓缩滤液，得到粗产物(3.8 g)，其通过正相硅胶色谱法(通过Combi-Flash)使用24 g硅胶柱和50% EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。蒸发收集的级分，得到呈灰白色泡沫状固体的2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸酯(1.2 g，产率33%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δppm 6.68 - 6.77 (m, 1 H) 6.59 - 6.66 (m, 1 H) 4.52 - 4.61 (m, 1 H) 4.08 -4.13 (m, 1 H) 3.52 (dd, J=9.05, 7.52 Hz, 1 H) 3.13 - 3.23 (m, 1 H) 2.93 -3.04 (m, 2 H) 2.67 - 2.72 (m, 1 H) 2.17 - 2.24 (m, 1 H) 1.93 - 1.99 (m, 1 H)1.81 - 1.88 (m, 1 H); LCMS: 90.47% (438.14, M+H), RT: 1.49 min。
实施例20. 化合物1A的制备
1A
步骤1：(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺的合成。
在室温下，向(S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(300 mg，1.65 mmol)在THF (30 mL)中的搅拌溶液中添加(2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-胺(528 mg，1.9 mmol)、DIPEA (1279 mg，9.9 m mol)和T3P (50%在EtOAc中)(1575 mg，4.95 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3 h。通过TLC监测反应。TLC示出SM不存在。TLC系统：50% EtOAc/己烷(Rf= 0.5, UV可见)。在减压下浓缩反应混合物，得到400 mg呈棕色胶状物的粗化合物。通过二氧化硅柱色谱法，使用30%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发(低于30℃)，得到呈浅黄色胶状物的(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺。LCMS (SM-14644-111-1): 79.67%, RT: 2.84min, [M+H]+: 334.48
步骤2：(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-((E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丁-2-烯-1-基)四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(1A)的合成。
向(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(260 mg，0.78 mmol)在DCM (20 mL)中的搅拌溶液中添加4,4,5,5-四甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(1311 mg，7.8 mmol)和硝基-格雷拉催化剂(Nitro-Grela catalyst) (104 mg，0.16 mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌3 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(30% EtOAc/己烷, Rf:0.3, UV可见)。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并蒸发滤液，得到粗化合物。通过快速二氧化硅柱色谱法，使用50%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈棕色胶状物的(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-((E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丁-2-烯-1-基)四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺。LCMS (SM-14644-114-1): 60.12%, RT: 3.39min, [M+H]+: 474.61。
步骤3：2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯的合成。
在室温下，向(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-((E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丁-2-烯-1-基)四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯胺(100 mg，0.21 mmol)在DMF (6 mL)和水(0.4 mL)中的搅拌溶液中添加2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(74.3 mg，0.21 mmol)，并用氩气脱气20 min，然后添加K3PO4 (89 mg，0.42 mmol)和Pd(dppf)Cl2-DCM (17 mg，0.021 mmol)，并且将反应物在室温下搅拌5 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：80%EtOAc/己烷(Rf: 0.3, UV可见)。将反应混合物用EtOAc (20 mL)稀释，用盐水(20 mL)和冷水(2 x 20 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到呈棕色胶状物的粗化合物(SR-12580-124-A1)。通过制备型HPLC技术纯化粗残余物，得到呈灰白色固体的2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(SR-12580-124-A2)。
LCMS (SR-12580-124-A2): 98.03%, RT: 2.55min, [M+H]+: 574.72。
实施例21. 化合物2A的制备
除了使用实施例16的中间体A代替外消旋化合物1之外，通过该实施例中描述的方法制备化合物2A。
2A
步骤1：(Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺的合成。
向(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(500 mg，2.75 mmol)在THF(30 ml)中的搅拌溶液中添加(2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-胺(726.28 mg，2718.76 mmol)、DIPEA (806.98 mg，3.02 mmol)和T3P (50%在EtOAc中)(2624.98 mg，8.25 mmol)。将反应混合物搅拌16小时。通过TLC监测反应。TLC示出SM不存在。TLC系统：50% EtOAc/石油醚。在减压下浓缩反应混合物，得到600 mg呈棕色胶状物的粗化合物。通过二氧化硅柱，使用30%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发(低于30℃)，得到呈浅黄色胶状物的(Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(450 mg，产率：49%)。
1H NMR (500 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.36 - 6.49 (m, 1 H) 6.00 - 6.18 (m, 2H) 5.73 - 5.86 (m, 2 H) 5.02 - 5.15 (m, 2 H) 3.96 (dtd, J=8.87, 4.61, 4.61,2.67 Hz, 1 H) 3.62 - 3.69 (m, 1 H) 3.50 - 3.57 (m, 1 H) 2.53 - 2.59 (m, 3 H)2.27 - 2.37 (m, 1 H) 2.06 - 2.17 (m, 1 H) 1.89 - 2.03 (m, 2 H) 1.72 - 1.82(m, 1 H) 1.48 (t, J=6.56 Hz, 3 H) 1.23 - 1.33 (m, 1 H) 1.13 - 1.19 (m, 2 H)1.08 - 1.12 (m, 2 H) 1.01 - 1.07 (m, 2 H) 0.90 - 0.99 (m, 3 H)
步骤2：(Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺的合成。
向化合物(Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(450 mg，1.35 mmol)在DCM (50 mL)中的搅拌溶液中添加4,4,5,5-四甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,3,2-二氧杂环戊硼烷(2269.4 mg，13.5mmol)和硝基-格雷拉催化剂(181.17 mg，0.27 mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌3 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(30% EtOAc/己烷, Rf: 0.3, UV活性)。通过硅藻土垫过滤反应混合物，在真空中浓缩滤液，得到粗化合物。
通过二氧化硅柱，使用40%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发(低于30℃)，得到呈棕色胶状物的(Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-((E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丁-2-烯-1-基)四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(187 mg，产率：29%)。
1H NMR (500 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.21 - 6.29 (m, 1 H) 6.10 - 6.19 (m, 1H) 5.99 - 6.08 (m, 1 H) 5.78 - 5.87 (m, 1 H) 5.05 - 5.16 (m, 1 H) 4.85 - 4.95(m, 1 H) 4.08 - 4.20 (m, 1 H) 3.89 - 4.01 (m, 1 H) 3.56 - 3.71 (m, 2 H) 2.56(s, 3 H) 2.32 - 2.41 (m, 1 H) 2.21 - 2.31 (m, 1 H) 2.03 - 2.07 (m, 1 H) 1.88- 1.96 (m, 3 H) 1.80 (br dd, J=14.50, 3.05 Hz, 1 H) 1.70 (br s, 2 H) 1.48 (brt, J=6.48 Hz, 4 H) 1.36 - 1.44 (m, 2 H) 1.21 - 1.31 (m, 19 H) 1.17 (br d, J=6.41 Hz, 2 H) 1.11 (br d, J=6.26 Hz, 2 H) 1.04 (br d, J=7.48 Hz, 2 H) 0.93 -1.00 (m, 2 H)
步骤3：2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的合成。
在室温下，向(Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-((E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)丁-2-烯-1-基)四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯胺(50 mg，0.105 mmol)在DMF 94 mL)和水(0.2 mL)中的搅拌溶液中添加2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(45 mg，0.105 mmol)，并用氩气脱气20 min，然后添加K3PO4 (33mg，0.157 mmol)和Pd(dppf)Cl2-DCM (4.3 mg，0.005 mmol)，并且将反应物在室温下搅拌5h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：80%EtOAc/己烷(Rf; 0.2, UV可见)。将反应混合物用EtOAc (10 mL)稀释，用盐水(20 mL)和冷水(2 x 20 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到50 mg呈棕色胶状物的粗化合物。通过制备型HPLC技术纯化粗残余物，收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。
附上1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm光谱(化合物为非对映异构体混合物)。LCMS (SR-12580-6-A3): 91.68% (36.46% + 55.22%), RT: 2.03和2.05 min, [M+H]+:657.31。
实施例22. 化合物3A的制备
3A
除了使用实施例21的化合物2A代替化合物2B之外，通过该实施例中描述的方法制备化合物3A。
步骤1：2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸的合成。
在室温下，向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(45mg，0.068 mmol)在乙腈(1.0 mL)和水(0.5 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (13 mg，0.102mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6 h。通过LCMS监测反应混合物。粗LCMS示出57%的所需产物质量。通过制备型HPLC纯化直接纯化反应混合物。在-78℃下收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸(8 mg，21%)。
LCMS (SR-12580-250-A3): 99.20%, 2.22min, M+H: 560.38。
步骤2：2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,3,5,6-四氟苯酯的合成。
向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸(16 mg，0.03 mmol)在DMF (1.5 mL)中的搅拌溶液中添加2,3,5,6-四氟苯酚(10 mg，0.06 mmol)和DCC (9.3 mg，0.045 mmol)，在室温下搅拌4 h。通过LCMS监测反应的进展。粗LCMS示出49%的所需产物质量。通过制备型HPLC纯化直接纯化反应混合物。在-78℃下收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的2,3,5,6-四氟苯基-2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸酯(7 mg，34.65%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.96 - 7.05 (m, 1 H), 6.40 (d, J=15.74Hz, 1 H), 6.14 (dd, J=11.32, 9.78 Hz, 1 H), 6.06 (br d, J=9.18 Hz, 1 H), 5.81(dd, J=11.32, 0.83 Hz, 1 H), 5.65 (dd, J=15.74, 5.96 Hz, 1 H), 5.49 (br t, J=7.15 Hz, 1 H), 5.05 - 5.14 (m, 1 H), 4.60 - 4.67 (m, 1 H), 4.26 (t, J=6.62Hz, 1 H), 3.95 - 4.00 (m, 1 H), 3.63 - 3.68 (m, 1 H), 3.58 (dd, J=8.40, 7.57Hz, 1 H), 3.52 (td, J=7.21, 2.62 Hz, 1 H), 3.32 (dd, J=15.62, 8.34 Hz, 1 H),2.98 - 3.06 (m, 2 H), 2.69 (d, J=4.53 Hz, 1 H), 2.56 (s, 3 H), 2.33 - 2.41(m, 1 H), 2.16 - 2.29 (m, 2 H), 1.91 - 1.95 (m, 2 H), 1.73 - 1.86 (m, 6 H),1.47 (d, J=7.03 Hz, 3 H), 1.16 (d, J=6.44 Hz, 3 H), 0.97 (d, J=7.39 Hz, 3 H)。
LCMS: 99.40%, RT: 2.93 min, M+H: 708.44。
实施例23. 化合物4A的制备。
4A
除了使用实施例21的化合物2A代替化合物2B之外，通过该实施例中描述的方法制备化合物4A。
步骤1：(2-(2-溴乙酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
在0℃下，向2-溴乙酸(2 g，14.5 mmol)和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.32 g，14.5 mmol)在DCM (80 mL)中的搅拌溶液中添加DCC (2.98 g，14.5 mmol)。将反应在室温下搅拌16 h。通过TLC监测反应的进展。过滤沉淀的固体，并在减压下浓缩滤液，得到粗化合物(SR-12580-176-A1)。通过在硅胶(100-200目)上的快速柱色谱法(50%至100% EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈白色固体的(2-(2-溴乙酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.5 g，38%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm: 7.08 (br s, 1 H), 4.85 (br s, 1 H),3.87 (s, 2 H), 3.38 - 3.42 (m, 2 H), 3.30 - 3.35 (m, 2 H), 1.45 (s, 9 H)
LCMS (SR-12580-176-A2): 91.20%, RT: 1.48 min, M+H: 281.00
步骤2：N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺的合成。
在室温下，向(2-(2-溴乙酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(500 mg，1.785 mmol)在DCM (10 mL)中的搅拌溶液中添加三氟乙酸(2 mL，17.5 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3 h。通过TLC监测反应进展。TLC流动相：50% EtOAc/己烷(Rf: 0.1, UV可见)。在减压下浓缩反应混合物，得到呈浅黄色胶状物的N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(350 mg，TFA盐)。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8.46 (br t, J=5.14 Hz, 1 H), 7.80 (brs, 2 H), 3.88 (s, 2 H), 3.27 - 3.40 (m, 2 H), 2.82 - 2.91 (m, 2 H)。
LCMS (SR-12580-179-A2): 96.75%, 0.27 min, M+H: 181.04。
步骤3：(R,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-((2E,4E)-5-((3R,4R,5R,7S)-7-(2-((2-(2-溴乙酰胺基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺的合成。
在室温下，向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(70mg，0.11 mmol)和N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(39 mg，0.22 mmol)在乙腈(2 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (21 mg，0.165 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2 h。通过LCMS监测反应的进展。粗LCMS示出49%的所需产物质量。通过制备型HPLC纯化直接纯化反应混合物。在-78℃下收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的(R,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-((2E,4E)-5-((3R,4R,5R,7S)-7-(2-((2-(2-溴乙酰胺基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(16 mg，21%) (SR-12580-300-A2)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm: 7.10 (br s, 1 H), 6.60 - 6.68 (m, 1H), 6.37 (d, J=15.74 Hz, 1 H), 6.15 (dd, J=11.32, 9.78 Hz, 1 H), 6.04 (br d,J=9.06 Hz, 1 H), 5.81 (dd, J=11.44, 0.72 Hz, 1 H), 5.63 (dd, J=15.74, 6.44Hz, 1 H), 5.49 - 5.55 (m, 1 H), 5.07 - 5.14 (m, 1 H), 4.39 - 4.43 (m, 1 H),4.32 (t, J=6.02 Hz, 1 H), 3.95 - 4.00 (m, 1 H), 3.85 (s, 2 H), 3.65 - 3.69(m, 1 H), 3.46 - 3.55 (m, 4 H), 3.34 - 3.40 (m, 2 H), 2.97 (d, J=4.53 Hz, 1H), 2.72 (d, J=4.41 Hz, 1 H), 2.60 - 2.69 (m, 2 H), 2.56 (s, 3 H), 2.33 -2.41 (m, 1 H), 2.18 - 2.26 (m, 1 H), 2.08 (d, J=6.91 Hz, 1 H), 1.90 - 1.96(m, 4 H), 1.75 - 1.79 (m, 4 H), 1.47 (d, J=7.03 Hz, 3 H), 1.16 (d, J=6.44 Hz,3 H), 0.97 - 1.00 (m, 3 H)
LCMS (SR-12580-300-A2): 95.44%, RT: 3.60min, M+H: 722.43。
实施例24. 化合物5A的制备。
5A
根据以下合成方案，使用本文所述的化合物和中间体，并且不使用与本文所提供类似的合成程序来制备化合物5A。
实施例25. 化合物6A的制备。
除了使用实施例21的化合物2A代替化合物2B之外，通过该实施例中描述的方法制备化合物6A。
6A
步骤1：(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的合成。
在冰浴下，向(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸(10 g，29.5 mmol)和N-羟基琥珀酰胺(3.73 g，32.45 mmol)在THF (200 mL)中的搅拌溶液中分批添加DCC (6.69 g，32.45 mmol)。在添加后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC系统：50% EtOAc/己烷(Rf:0.5, UV可见)。将反应混合物冷却至-5℃，过滤并用冷THF (50 mL)洗涤，在真空中浓缩滤液，得到粗化合物。通过用MTBE和正戊烷研磨来纯化粗残余物，得到呈白色固体的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(12.2 g，95.31%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 7.77 (d, J=7.63 Hz, 2 H) 7.59 (br d, J=7.41 Hz, 2 H) 7.37 - 7.43 (m, 2 H) 7.29 - 7.35 (m, 2 H) 5.25 (br d, J=9.16Hz, 1 H) 4.69 (dd, J=9.26, 4.80 Hz, 1 H) 4.45 (d, J=6.65 Hz, 2 H) 4.21 - 4.28(m, 1 H) 3.21 (s, 1 H) 2.82 - 2.88 (m, 5 H) 2.29 - 2.40 (m, 1 H) 1.19 (s, 3H) 1.06 (br dd, J=9.81, 6.98 Hz, 6 H)。
LCMS (C3783-015-A2): 98.92% (437.27, M+H), RT: 2.61 min。
步骤2：(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酰-L-丙氨酸的合成。
将含Fmoc-Val-NHS (5 g，11.5 mmol)的30 mL DME添加至L-丙氨酸(1.07 g，12.07 mmol)在20 mL THF中和NaHCO3 (1.01 g，12.07 mmol)在30 mL水中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.1 , UV可见)。通过TLC监测反应的进展。添加柠檬酸水溶液(150 mL的15%水溶液)，并且将沉淀过滤并干燥，得到白色固体。将所得固体用200 mL乙醚研磨并过滤，得到呈白色固体的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酰-L-丙氨酸(3.0 g，64%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12.27 - 12.53 (m, 1 H), 8.21 (br d, J=7.34 Hz, 1 H), 7.89 (d, J=7.34 Hz, 2 H), 7.75 (br t, J=6.60 Hz, 2 H), 7.38 -7.44 (m, 3 H), 7.28 - 7.36 (m, 2 H), 4.14 - 4.32 (m, 4 H), 3.89 (dd, J=8.80,7.34 Hz, 1 H), 1.97 (dq, J=13.63, 6.70 Hz, 1 H), 1.27 (d, J=7.34 Hz, 3 H),0.88 (dd, J=13.69, 6.85 Hz, 6 H)。
LCMS (SR-12580-168-A2): 92.75%, RT: 1.96 min, M+H: 410.94。
步骤3：((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成。
向(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(3 g，7.3 mmol)在DCM和MeOH (2:1) (45 mL)的混合物中的搅拌溶液中添加4-氨基苄醇(1.07 g，8.76 mmol)和EEDQ (3.6 g，14.6 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.4, UV可见)。去除溶剂，并且向残余物中添加乙醚(100 mL)并超声处理5至10分钟。将固体过滤，用另外的醚洗涤并干燥，得到呈白色固体的((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.0 g，81%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 9.92 (s, 1 H), 8.16 (d, J=6.85 Hz, 1H), 8.15 - 8.18 (m, 1 H), 7.89 (d, J=7.34 Hz, 2 H), 7.73 - 7.76 (m, 2 H),7.53 (br d, J=8.31 Hz, 2 H), 7.39 - 7.46 (m, 4 H), 7.30 - 7.34 (m, 2 H), 7.24(d, J=8.31 Hz, 2 H), 5.08 - 5.11 (m, 1 H), 4.44 (s, 1 H), 4.28 - 4.31 (m, 1H), 4.22 - 4.26 (m, 2 H), 3.90 (br d, J=8.31 Hz, 1 H), 1.97 - 2.02 (m, 1 H),1.30 (d, J=7.34 Hz, 3 H), 0.84 - 0.90 (m, 6 H)
LCMS (SR-12580-172-A2): 94.86%, RT: 2.40 min, M+H: 516.27。
步骤4：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成。
在23℃下，向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3 g，5.8 mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(3.52 g，11.6 mmol)在DMF (20 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (1.49 g，11.6mmol)，并将混合物在室温下搅拌1小时。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM(Rf: 0.5, UV可见)。在完成后，将反应混合物倒入冰冷的水中，过滤沉淀的固体，并且用乙醚(100 mL)洗涤固体，干燥，得到呈灰白色固体的((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.0 g，77%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm: 8.52 (br s, 1 H), 8.23 - 8.30 (m, 2H), 7.76 (br d, J=7.83 Hz, 2 H), 7.50 - 7.65 (m, 4 H), 7.27 - 7.44 (m, 8 H),6.40 (br d, J=6.36 Hz, 1 H), 5.24 (br s, 3 H), 4.58 - 4.69 (m, 1 H), 4.43 -4.54 (m, 2 H), 4.20 (br t, J=6.36 Hz, 1 H), 3.94 - 4.03 (m, 1 H), 2.11 - 2.23(m, 1 H), 1.46 (br d, J=6.85 Hz, 3 H), 0.94 (br dd, J=11.74, 5.38 Hz, 6 H)。
LCMS (SR-12580-173-A2): 81.50%, RT: 2.32 min, M+H: 681.53。
步骤5：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯的合成。
在0℃下，向((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3 g，4.4mmol)在DMA (30 mL)中的搅拌溶液中添加HOAt (0.65 g，4.84 mmol)和2,6-二甲基吡啶(1.88 g，17.6 mmol)，并在0℃下搅拌5 min，然后添加(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.77g，4.84 mmol)和DIPEA (1.70 g，13.2 mmol)，并且使其在23℃下搅拌2 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.4, UV可见)。在完成后，将反应混合物倒入MTBE(200 mL)中并搅拌1 h，将所得固体过滤，用MTBE洗涤并干燥，得到呈浅黄色固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯(SR-12580-188-A2) (2.0 g，65%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.95 - 10.04 (m, 1 H), 8.18 (d, J=6.87Hz, 1 H), 7.89 (d, J=7.52 Hz, 2 H), 7.74 (t, J=7.03 Hz, 2 H), 7.57 (d, J=8.39Hz, 2 H), 7.37 - 7.47 (m, 3 H), 7.24 - 7.35 (m, 4 H), 7.13 - 7.22 (m, 1 H),6.80 (br d, J=5.01 Hz, 1 H), 4.89 - 5.01 (m, 2 H), 4.37 - 4.47 (m, 1 H), 4.18- 4.34 (m, 3 H), 3.87 - 3.95 (m, 1 H), 2.91 - 3.05 (m, 4 H), 1.92 - 2.05 (m,1 H), 1.37 (s, 9 H), 1.30 (d, J=7.08 Hz, 3 H), 0.87 (dd, J=12.53, 6.76 Hz, 6H)。
LCMS (SR-12580-188-A2): 98.33%, RT: 2.21 min, M+H: 702.56。
步骤6：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯的合成。
在室温下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯(2 g，2.9 mmol)在DMF (20 mL)中的搅拌溶液中添加哌啶(1.23 g，14.5 mmol)，并将混合物在室温下搅拌1 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.1)。将反应混合物倒入乙醚(100 mL)中，并且将沉淀的固体过滤并干燥，得到呈白色固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯(1.0 g，73.5%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.05 (s, 1 H), 8.09 - 8.20 (m, 1 H),7.57 (d, J=8.50 Hz, 2 H), 7.28 (d, J=8.50 Hz, 2 H), 7.18 (br s, 1 H), 6.72 -6.85 (m, 1 H), 4.89 - 5.01 (m, 2 H), 4.41 - 4.52 (m, 1 H), 2.91 - 3.05 (m, 5H), 1.85 - 1.98 (m, 1 H), 1.69 (br s, 2 H), 1.37 (s, 9 H), 1.30 (d, J=6.98Hz, 3 H), 0.88 (d, J=6.87 Hz, 3 H), 0.78 (d, J=6.76 Hz, 3 H)。
LCMS: 98.63%, RT: 1.78 min, M+H: 480.73。
步骤7：4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(10,10-二甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯的合成。
在室温下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-苄酯叔丁酯(900 mg，1.878 mmol)和琥珀酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯甲酯(516 mg，2.25 mmol)在THF (20 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (0.72 g，0.5.63 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3 h。通过TLC监测反应的进展。TLC系统：10%MeOH/DCM (Rf:0.5, UV可见)。在真空中浓缩反应混合物，得到粗化合物(1.3 g)。用乙醚研磨粗残余物，得到呈浅黄色固体的4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(10,10-二甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(1.0 g，90%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 8.41 - 8.47 (m, 1 H), 7.70 (d, J=8.61Hz, 2 H), 7.29 (s, 2 H), 7.14 - 7.20 (m, 1 H), 6.06 - 6.13 (m, 1 H), 5.08 -5.15 (m, 1 H), 5.04 (s, 2 H), 4.80 - 4.88 (m, 1 H), 4.65 - 4.75 (m, 1 H),4.24 (dd, J=6.21, 4.47 Hz, 1 H), 3.67 - 3.76 (m, 2 H), 3.50 (s, 3 H), 3.44 -3.49 (m, 1 H), 3.20 - 3.34 (m, 4 H), 3.15 (q, J=7.41 Hz, 2 H), 2.86 - 2.97(m, 1 H), 2.64 (s, 9 H), 2.57 - 2.62 (m, 1 H), 2.39 - 2.56 (m, 4 H), 1.51 (d,J=7.30 Hz, 3 H), 1.43 (s, 7 H), 1.39 (d, J=6.65 Hz, 12 H), 1.21 (t, J=7.03Hz, 1 H), 1.06 (d, J=6.98 Hz, 3 H), 1.00 (d, J=6.98 Hz, 3 H)。
LCMS: 94.33%, RT: 1.73 min, M+H: 594.49。
步骤8：4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(10,10-二甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸的合成。
在室温下，向4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(10,10-二甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(900 mg，1.52 mmol)在THF (15 mL)和水(5 mL)中的搅拌溶液中添加氢氧化锂一水合物(255 mg，6.08 mmol)，将反应混合物在室温下搅拌3 h。通过TLC监测反应的进展。TLC系统：10%甲醇/DCM (RF: 0.1，紫外可见)。在真空中浓缩反应混合物，得到粗化合物。将残余物用15%柠檬酸溶液酸化，并用含10%甲醇的DCM (3 X 50 mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，得到呈灰白色固体的4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(10,10-二甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(800 mg，91%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 9.80 - 9.89 (m, 1 H), 8.13 (d, J=6.91Hz, 1 H), 7.93 (d, J=8.34 Hz, 1 H), 7.59 (d, J=8.58 Hz, 2 H), 7.28 (d, J=8.46Hz, 2 H), 7.14 - 7.21 (m, 1 H), 6.71 - 6.85 (m, 1 H), 4.89 - 5.00 (m, 2 H),4.38 (quin, J=7.06 Hz, 1 H), 4.17 (dd, J=8.11, 6.79 Hz, 1 H), 4.03 (q, J=7.07Hz, 2 H), 2.91 - 3.06 (m, 4 H), 2.43 (s, 3 H), 1.93 - 2.02 (m, 4 H), 1.34 -1.40 (m, 9 H), 1.28 - 1.33 (m, 3 H), 1.22 - 1.26 (m, 1 H), 1.17 (t, J=7.15Hz, 3 H), 0.86 (dd, J=14.19, 6.79 Hz, 6 H)。
LCMS: 91.6%, RT: 1.60 min, M+H: 580.26。
步骤9：4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-氨基乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸的合成。
将4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(10,10-二甲基-3,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一烷基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(400 mg，0.69 mmol)在DCM (25 mL)中的搅拌溶液冷却至0℃，向其中添加TFA (1.179g，10.35 m.mol)，并在10℃下搅拌4 h。通过TLC监测反应的进展。TLC流动相：15%甲醇/DCM(RF: 0.1，紫外可见)。将反应混合物在真空中浓缩并与乙醚(3 X 10 mL)共沸，得到呈TFA盐形式的粗化合物。通过制备型HPLC技术纯化粗化合物，得到呈灰白色固体的4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-氨基乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(100 mg，30%)。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 10.60 - 10.76 (m, 1 H), 8.08 - 8.20(m, 1 H), 7.45 - 7.97 (m, 6 H), 6.84 - 6.95 (m, 1 H), 6.23 - 6.35 (m, 1 H),4.04 - 4.24 (m, 3 H), 3.53 - 3.72 (m, 2 H), 3.21 - 3.29 (m, 2 H), 3.17 (d, J=5.50 Hz, 2 H), 1.32 (br d, J=6.97 Hz, 9 H)。
LCMS: 96%, RT: 1.58 min, M+H: 480.35。
步骤10：4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸的合成。
在室温下，向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(80mg，0.12 mmol)和4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-氨基乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(40.2 mg，0.084mmol)在DMF (4 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (61.9 mg，0.48 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1 h。通过LCMS监测反应的进展。通过制备型HPLC技术直接纯化粗反应混合物，得到呈灰白色固体的4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(30 mg，24.19%)。
LCMS: 74%, RT: 3.73, M+H: 1021.69。
步骤11：4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸2,3,5,6-四氟苯酯的合成。
向4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(30 mg，0.03 mmol)在DMF (2 mL)中的搅拌溶液中添加2,3,5,6-四氟苯酚(10 mg，0.06 mmol)、EDC.HCl (11.5 mg，0.06 mmol)，在室温下搅拌3 h。通过LCMS监测反应的进展。通过制备型HPLC条件直接纯化反应物质，并且在-78℃下收集级分并冻干，得到呈白色固体的4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((R,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸2,3,5,6-四氟苯酯(8 mg，23.2%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 8.44 - 8.56 (m, 1 H), 7.57 - 7.69 (m, 2H), 7.29 (br d, J=8.46 Hz, 2 H), 6.93 - 7.05 (m, 1 H), 6.82 (br d, J=7.03 Hz,1 H), 6.56 - 6.66 (m, 1 H), 6.27 - 6.42 (m, 2 H), 6.15 (dd, J=11.15, 9.95 Hz,1 H), 5.99 - 6.08 (m, 1 H), 5.76 - 5.87 (m, 1 H), 5.60 (br dd, J=15.38, 6.08Hz, 1 H), 5.48 (br t, J=6.44 Hz, 1 H), 5.26 (br s, 1 H), 5.12 - 5.21 (m, 1H), 5.00 - 5.08 (m, 2 H), 4.53 - 4.66 (m, 1 H), 4.21 - 4.41 (m, 3 H), 3.83 -3.96 (m, 1 H), 3.54 - 3.63 (m, 1 H), 3.40 - 3.52 (m, 3 H), 3.20 - 3.37 (m, 3H), 2.98 - 3.18 (m, 2 H), 2.92 (d, J=4.41 Hz, 1 H), 2.59 - 2.76 (m, 5 H),2.46 - 2.55 (m, 2 H), 2.31 - 2.41 (m, 1 H), 2.13 - 2.30 (m, 2 H), 1.78 - 1.95(m, 4 H), 1.69 - 1.77 (m, 5 H), 1.46 (d, J=6.91 Hz, 5 H), 1.36 (d, J=7.03 Hz,3 H), 1.14 (d, J=6.44 Hz, 3 H), 0.98 (d, J=6.68 Hz, 3 H), 0.96 (s, 3 H), 0.90- 0.94 (m, 3 H)。
LCMS: RT: 4.69, M+H: 1169.74。
实施例26. 化合物7A的制备。
7A
步骤1：4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的合成。
向4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(19 mg，0.0029 mmol)在DMF (1.0 mL)中的搅拌溶液中添加DCC (1.8mg，0.0087 mmol)、N-羟基琥珀酸酯(1.7 mg，0.014 m.mol)，在室温下搅拌8 h，通过LCMS监测反应的进展。粗LCMS示出54%的所需产物质量。通过制备型HPLC纯化阳离子直接纯化反应混合物。在-78℃下收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的4-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-4-氧代丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4 mg，18.2%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 8.52 (s, 1 H), 7.61 (br d, J=8.28 Hz, 2H), 7.29 (br d, J=8.28 Hz, 3 H), 6.88 (br d, J=7.08 Hz, 1 H), 6.62 (br d, J=4.47 Hz, 1 H), 6.42 (br d, J=6.87 Hz, 1 H), 6.32 (br d, J=15.80 Hz, 1 H),6.15 (dd, J=11.23, 9.92 Hz, 1 H), 6.01 - 6.07 (m, 1 H), 5.81 (br d, J=11.23Hz, 1 H), 5.60 (br dd, J=16.35, 5.78 Hz, 1 H), 5.49 (br t, J=6.38 Hz, 1 H),5.27 (br t, J=5.23 Hz, 1 H), 5.12 - 5.20 (m, 1 H), 5.04 (s, 2 H), 4.60 - 4.69(m, 1 H), 4.22 - 4.38 (m, 3 H), 3.87 - 3.93 (m, 1 H), 3.59 - 3.63 (m, 1 H),3.43 - 3.49 (m, 3 H), 3.24 - 3.34 (m, 3 H), 2.91 - 3.03 (m, 3 H), 2.81 (s, 3H), 2.56 - 2.71 (m, 9 H), 2.18 - 2.39 (m, 3 H), 1.81 - 1.93 (m, 3 H), 1.74(s, 4 H), 1.43 - 1.49 (m, 6 H), 1.14 (d, J=6.32 Hz, 3 H), 0.94 - 1.00 (m, 9H)
LCMS: 95.05%纯度, M+H: 1118.76
实施例27. 化合物8A的制备。
除了使用实施例20的化合物2A代替2A/2B的外消旋物之外，通过该实施例中描述的方法制备化合物8A。
8A
步骤1：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸叔丁酯(4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄基)酯的合成。
在23℃下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(200 mg，0.35 mmol)和3-氧代-1-(吡啶-2-基二硫烷基)-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-4-氮杂三十一烷-31-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(257 mg，0.35 mmol)在THF (2 mL)中的搅拌溶液中添加DCC (108 mg，0.525 mmol)和DIPEA (135 mg，1.05 mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌16 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.3, UV可见)。在完成后，将乙醚(50 mL)添加至反应混合物中，将固体过滤，在减压下干燥，得到呈灰白色胶质固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸叔丁酯(4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄基)酯(330 mg，产率：81%)。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.94 - 10.01 (m, 1 H) 8.46 (br d, J=4.27 Hz, 1 H) 8.08 - 8.14 (m, 1 H) 7.99 - 8.05 (m, 1 H) 7.80 - 7.90 (m, 2 H)7.73 - 7.79 (m, 1 H) 7.59 (br d, J=8.39 Hz, 2 H) 7.22 - 7.31 (m, 3 H) 7.18(br s, 1 H) 6.76 - 6.83 (m, 1 H) 5.93 - 6.00 (m, 1 H) 5.36 - 5.44 (m, 2 H)4.90 - 4.98 (m, 2 H) 4.34 - 4.42 (m, 1 H) 4.19 - 4.26 (m, 1 H) 3.56 - 3.64(m, 2 H) 3.40 (br t, J=5.80 Hz, 2 H) 3.16 - 3.23 (m, 2 H) 2.91 - 3.06 (m, 9H) 2.42 - 2.55 (m, 33 H) 2.34 - 2.41 (m, 2 H) 1.93 - 2.00 (m, 1 H) 1.64 -1.74 (m, 1 H) 1.54 - 1.63 (m, 1 H) 1.41 - 1.47 (m, 1 H) 1.37 (s, 11 H) 0.84(br dd, J=16.17, 6.71 Hz, 6 H)。
步骤2：4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯的合成。
在0℃下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸叔丁酯(4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄基)酯(330 mg，0.28 mmol)在DCM (10 mL)中的搅拌溶液中添加TFA (0.47 g，4.2 mmol)，并将反应物在室温下搅拌3 h。通过TLC监测反应的进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.05, UV可见)。在反应完成后，在减压下浓缩，得到呈TFA盐形式的粗化合物。通过制备型HPLC技术纯化粗化合物，得到呈TFA盐形式的(2-氨基乙基)氨基甲酸4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄酯(140 mg，产率：47%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.95 - 10.00 (m, 1 H) 8.42 - 8.48 (m,1 H) 8.08 - 8.15 (m, 1 H) 7.99 - 8.05 (m, 1 H) 7.80 - 7.90 (m, 2 H) 7.73 -7.78 (m, 1 H) 7.59 (d, J=8.56 Hz, 2 H) 7.22 - 7.31 (m, 3 H) 7.17 (br t, J=5.38 Hz, 1 H) 5.94 - 6.01 (m, 1 H) 5.35 - 5.44 (m, 2 H) 4.90 - 4.97 (m, 2 H)4.33 - 4.42 (m, 1 H) 4.19 - 4.25 (m, 1 H) 3.56 - 3.63 (m, 3 H) 3.45 - 3.53(m, 30 H) 3.37 - 3.42 (m, 4 H) 3.16 - 3.23 (m, 3 H) 2.91 - 3.03 (m, 6 H) 2.56(br t, J=6.42 Hz, 2 H) 2.30 - 2.42 (m, 2 H) 1.92 - 2.00 (m, 1 H) 1.89 (s, 2H) 1.51 - 1.75 (m, 2 H) 1.29 - 1.49 (m, 2 H) 0.84 (dd, J=13.02, 6.79 Hz, 6 H)
步骤3：(2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨基甲酸4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄酯的合成。
在0℃下，向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(25mg，0.038 mmol)和(2-氨基乙基)氨基甲酸4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄酯(49 mg，0.045 mmol)在乙腈(1.5 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(14 mg，0.114 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2 h。通过TLC和LCMS监测反应的进展。粗LCMS示出30%的所需产物质量。通过制备型HPLC技术直接纯化反应混合物，得到呈白色固体的(2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨基甲酸4-((2S,5S)-5-异丙基-4,7,35-三氧代-37-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄酯(11 mg，产率：18%)。
1H NMR (500 MHz,氯仿-d) δ ppm 9.03 - 9.09 (m, 1 H) 8.45 - 8.50 (m, 1H) 7.64 - 7.75 (m, 4 H) 7.52 - 7.60 (m, 2 H) 7.06 - 7.14 (m, 1 H) 6.68 - 6.75(m, 1 H) 6.30 - 6.38 (m, 1 H) 6.03 (s, 1 H) 5.75 - 5.91 (m, 2 H) 5.63 (br dd,J=15.34, 5.87 Hz, 1 H) 5.49 - 5.56 (m, 1 H) 5.38 - 5.45 (m, 1 H) 5.12 - 5.20(m, 2 H) 5.00 - 5.07 (m, 2 H) 4.63 - 4.73 (m, 1 H) 4.35 - 4.42 (m, 1 H) 4.31(dt, J=16.82, 6.62 Hz, 2 H) 3.93 - 4.01 (m, 1 H) 3.82 - 3.90 (m, 1 H) 3.61 -3.73 (m, 29 H) 3.52 - 3.60 (m, 8 H) 3.46 (q, J=5.09 Hz, 4 H) 3.23 - 3.34 (m,5 H) 3.02 - 3.10 (m, 3 H) 2.91 (d, J=4.58 Hz, 1 H) 2.62 - 2.69 (m, 4 H) 2.55- 2.61 (m, 6 H) 2.34 (s, 1 H) 2.20 - 2.31 (m, 2 H) 2.01 - 2.10 (m, 1 H) 1.89- 1.98 (m, 2 H) 1.72 - 1.82 (m, 6 H) 1.50 (dd, J=6.79, 6.03 Hz, 5 H) 1.18 (d,J=6.41 Hz, 2 H) 1.10 - 1.14 (m, 2 H) 1.06 (d, J=7.48 Hz, 2 H) 0.95 - 1.04 (m,9 H)
化合物E的制备：
步骤-1：(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1)：
在冰浴下，向(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸(10 g，29.5 mmol)和N-羟基琥珀酰胺(3.73 g，32.45 mmol)在THF (200 mL)中的搅拌溶液中分批添加DCC (6.69 g，32.45 mmol)。在添加后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC系统：50% EtOAc/己烷(RF:0.5, UV可见)。将反应混合物冷却至-5℃，过滤并用冷THF (50 mL)洗涤，在真空中浓缩滤液，得到粗化合物。通过用MTBE和正戊烷研磨来纯化粗残余物，得到呈白色固体的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(12.2 g，95.31%) (C3783-015-A2)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 7.77 (d, J=7.63 Hz, 2 H) 7.59 (br d, J=7.41 Hz, 2 H) 7.37 - 7.43 (m, 2 H) 7.29 - 7.35 (m, 2 H) 5.25 (br d, J=9.16Hz, 1 H) 4.69 (dd, J=9.26, 4.80 Hz, 1 H) 4.45 (d, J=6.65 Hz, 2 H) 4.21 - 4.28(m, 1 H) 3.21 (s, 1 H) 2.82 - 2.88 (m, 5 H) 2.29 - 2.40 (m, 1 H) 1.19 (s, 3H) 1.06 (br dd, J=9.81, 6.98 Hz, 6 H); LCMS (C3783-015-A2): 98.92% (437.27, M+H), RT: 2.61 min。
步骤2：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(3)：
将含Fmoc-Val-NHS (15 g，34.4 mmol)的90 mL DME添加至L-瓜氨酸(6.32 g，36.12 mmol)在50 mL THF中和NaHCO3 (3.03 g，36.12 mmol)在90 mL水中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (RF: 0.1, UV可见)。添加柠檬酸水溶液(450 mL的15%水溶液)，并用10% IPA/EtOAc (2 x 500 mL)萃取混合物。用水(3 x 500 mL)洗涤有机层，并在真空下蒸发溶剂。将所得固体用500 mL乙醚研磨并过滤，得到产物。将所得固体用500 mL乙醚研磨并过滤，得到呈白色固体的(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(11.5 g，67.64%)(C3783-023-A2)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.33 - 12.64 (m, 1 H) 8.15 (brd, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (d, J=7.70 Hz, 2 H) 7.60 - 7.80 (m, 2 H) 7.21 - 7.50(m, 4 H) 5.93 (br t, J=5.69 Hz, 1 H) 5.37 (s, 2 H) 4.07 - 4.41 (m, 4 H) 3.92(br dd, J=8.80, 6.97 Hz, 1 H) 3.20 - 3.47 (m, 6 H) 2.95 (q, J=6.24 Hz, 2 H)1.89 - 2.07 (m, 1 H) 1.48 - 1.79 (m, 2 H) 1.30 - 1.47 (m, 2 H) 1.00 - 1.14(m, 1 H) 0.87 (dd, J=9.35, 6.79 Hz, 6 H); LCMS (C3783-023-A2): 97.37%(497.06, M+H), RT: 1.75 min。
步骤3：((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(4)。
向(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(12 g，24.2 mmol)在DCM和MeOH (2:1) (150 mL)的混合物中的搅拌溶液中添加4-氨基苄醇(3.57 g，29.04 mmol)和EEDQ (11.9 g，48.4 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (RF: 0.4, UV可见)。去除溶剂，并且向残余物中添加乙醚(500 mL)并超声处理5至10分钟。将固体过滤，用另外的醚洗涤并干燥，得到呈白色固体的((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(11 g，75.86%)。1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.92 - 10.01 (m, 1 H) 8.09 (br d, J=7.70 Hz, 1 H)7.89 (d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.74 (br t, J=6.79 Hz, 2 H) 7.54 (br d, J=8.07 Hz, 2H) 7.41 (br t, J=7.70 Hz, 3 H) 7.28 - 7.36 (m, 2 H) 7.23 (br d, J=8.44 Hz, 2H) 5.96 (br t, J=5.32 Hz, 1 H) 5.40 (s, 2 H) 5.09 (t, J=5.69 Hz, 1 H) 4.36 -4.48 (m, 3 H) 4.18 - 4.33 (m, 3 H) 3.93 (br dd, J=8.62, 7.15 Hz, 1 H) 2.87 -3.09 (m, 3 H) 1.91 - 2.08 (m, 1 H) 1.55 - 1.78 (m, 2 H) 1.29 - 1.51 (m, 2 H)0.87 (br t, J=7.34 Hz, 6 H); LCMS: 85.44%, RT: 1.80 min, M+H: 602.36。
步骤4：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(5):
在23℃下，向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(11 g，18.3 mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(11.12 g，36.6 mmol)在DMF (60 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (4.72g，36.6 mmol)，并将混合物在室温下搅拌1小时。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10%MeOH/DCM (RF: 0.4, UV可见)。在完成后，将乙醚(200 mL)添加至反应物中并搅拌30 min。将固体过滤，用另外的乙醚洗涤并干燥，得到呈白色固体的((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(10 g，71.42%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm10.14 (s, 1 H) 8.26 - 8.37 (m, 2 H) 8.14 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (br d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.70 - 7.80 (m, 2 H) 7.53 - 7.68 (m, 4 H) 7.26 - 7.48 (m, 6 H)5.93 - 6.04 (m, 1 H) 5.37 - 5.46 (m, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 4.38 - 4.49 (m, 1 H)4.17 - 4.35 (m, 3 H) 3.88 - 4.01 (m, 1 H) 2.91 - 3.09 (m, 2 H) 1.99 (dt, J=13.39, 6.88 Hz, 1 H) 1.56 - 1.75 (m, 2 H) 1.31 - 1.50 (m, 2 H) 0.88 (br t, J=7.52 Hz, 6 H); LCMS: 91.44%, RT: 2.16min, 767.11。
步骤5：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(6)。
在0℃下，向((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(5 g，6.5 mmol)在DMA (50 mL)中的搅拌溶液中添加HOAt (0.97 g，7.15 mmol)和2,6-二甲基吡啶(2.78 g，26 mmol)，并在0℃下搅拌5 min，然后添加(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.14 g，7.15 mmol)和DIPEA (2.51 g，19.5 mmol)，并且使其在23℃下搅拌2 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM。在完成后，将反应混合物倒入MTBE (1000 mL)中并搅拌1 h，将所得固体过滤，用MTBE洗涤并干燥，得到呈浅黄色固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(5 g，97%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.06 (s, 1 H)8.12 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.74 (br t, J=6.60 Hz, 2H) 7.53 - 7.62 (m, 2 H) 7.42 (br t, J=8.07 Hz, 3 H) 7.23 - 7.36 (m, 4 H) 7.19(br s, 1 H) 6.80 (br s, 1 H) 5.98 (br t, J=5.50 Hz, 1 H) 5.41 (s, 2 H) 4.94(s, 2 H) 4.36 - 4.49 (m, 1 H) 4.17 - 4.34 (m, 3 H) 3.93 (br dd, J=8.80, 7.34Hz, 1 H) 2.94 - 3.09 (m, 6 H) 2.78 (s, 1 H) 1.91 - 2.07 (m, 2 H) 1.56 - 1.76(m, 2 H) 1.37 (s, 10 H) 1.18 (br d, J=5.14 Hz, 2 H) 0.87 (br t, J=7.34 Hz, 6H); LCMS: 85.27%, RT: 2.01min, M+H: 788.43。
步骤6：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(化合物-E)。
在室温下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯在DMF (50 mL)中的搅拌溶液中添加哌啶，并将混合物在室温下搅拌1 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10%MeOH/DCM。在1 h后，将反应混合物倒入乙醚(500 mL)中，搅拌1 h，将固体过滤并干燥，得到呈浅黄色固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(2.4 g，68.5%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.11 (s,1 H) 8.12 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.58 (d, J=8.80 Hz, 2 H) 7.28 (br d, J=8.44Hz, 2 H) 7.19 (br s, 1 H) 6.79 (br s, 1 H) 5.91 - 6.02 (m, 1 H) 5.40 (s, 2 H)4.94 (s, 2 H) 4.47 (br s, 1 H) 2.90 - 3.08 (m, 8 H) 2.74 (br d, J=6.60 Hz, 1H) 1.93 (br dd, J=11.74, 6.97 Hz, 1 H) 1.53 - 1.74 (m, 3 H) 1.37 (s, 12 H)0.88 (d, J=6.60 Hz, 3 H) 0.78 (d, J=6.97 Hz, 3 H); LCMS: 87.71%, RT: 1.31min,M+H: 566.27。
实施例28. 化合物9A的制备
9A
步骤1：2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯的合成。
在室温下，向((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(87 mg，0.114 mmol)在DMA (5.0 mL)中的搅拌溶液中添加HOAt (25 mg，0.190 mmol)、二甲基吡啶(40 mg，0.38 mmol)、(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-((2E,4E)-5-((3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(55mg，0.095 mmol)和DIPEA (49 mg，0.38 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3 h。通过LCMS监测反应的进展。在3 h后，粗LCMS示出35%的所需产物m/z峰。通过制备型HPLC技术直接纯化粗反应混合物，并将收集的级分冻干，得到呈白色固体的2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(35 mg，33%)。LCMS: 74.35%, RT: 2.41 min, M+H:1201.86。
步骤2：2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯的合成。
向2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(40 mg，0.033 mmol)在DMF (2.0 mL)中的搅拌溶液中添加哌啶(14 mg，0.165 mmol)，并将反应物在室温下搅拌1 h。通过LCMS监测反应的进展。粗LCMS示出36%的所需产物质量。通过制备型HPLC技术直接纯化反应混合物，并将收集的纯级分冻干，得到呈白色固体的2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(16 mg，50%)。LCMS: 84.64%, 1.87min, M+H: 979.64
步骤3：2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(5-氧代-5-(2,3,5,6-四氟苯氧基)戊酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯的合成。
在室温下，向2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(15 mg，0.015 mmol)在DMF (1.5mL)中的搅拌溶液中添加戊二酸双(2,3,5,6-四氟苯基)酯(32 mg，0.075 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30 min。通过LCMS监测反应的进展。粗LCMS示出26%的所需产物质量。通过制备型HPLC技术直接纯化反应混合物，并且在-78℃下收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰基)肼-1-甲酸4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(5-氧代-5-(2,3,5,6-四氟苯氧基)戊酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯(1 mg)。LCMS: 92.48%, 1.89min, M+H: 1241.80
Val-Cit-接头的合成：
步骤1：(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯的合成。
在冰浴下，向(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸(10 g，29.5 mmol)和N-羟基琥珀酰胺(3.73 g，32.45 mmol)在THF (200 mL)中的搅拌溶液中分批添加DCC (6.69 g，32.45 mmol)。在添加后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC系统：50% EtOAc/己烷(Rf:0.5, UV可见)。将反应混合物冷却至-5℃，过滤并用冷THF (50 mL)洗涤，在真空中浓缩滤液，得到粗化合物。通过用MTBE和正戊烷研磨来纯化粗残余物，得到呈白色固体的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(12.2 g，95.31%) (C3783-015-A2)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 7.77 (d, J=7.63 Hz, 2 H) 7.59 (br d, J=7.41 Hz, 2 H) 7.37 - 7.43 (m, 2 H) 7.29 - 7.35 (m, 2 H) 5.25 (br d, J=9.16Hz, 1 H) 4.69 (dd, J=9.26, 4.80 Hz, 1 H) 4.45 (d, J=6.65 Hz, 2 H) 4.21 - 4.28(m, 1 H) 3.21 (s, 1 H) 2.82 - 2.88 (m, 5 H) 2.29 - 2.40 (m, 1 H) 1.19 (s, 3H) 1.06 (br dd, J=9.81, 6.98 Hz, 6 H)
LCMS (C3783-015-A2): 98.92% (437.27, M+H), RT: 2.61 min。
步骤2：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸的合成。
将含Fmoc-Val-NHS (15 g，34.4 mmol)的90 mL DME添加至L-瓜氨酸(6.32 g，36.12 mmol)在50 mL THF中和NaHCO3 (3.03 g，36.12 mmol)在90 mL水中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.1, UV可见)。添加柠檬酸水溶液(450 mL的15%水溶液)，并用10% IPA/EtOAc (2 x 500 mL)萃取混合物。用水(3 x 500 mL)洗涤有机层，并在真空下蒸发溶剂。将所得固体用500 mL乙醚研磨并过滤，得到产物。将所得固体用500 mL乙醚研磨并过滤，得到呈白色固体的(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(11.5 g，67.64%)(C3783-023-A2)。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.33 – 12.64 (m, 1 H) 8.15 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (d, J=7.70 Hz, 2 H) 7.60 – 7.80 (m, 2 H) 7.21 – 7.50 (m, 4H) 5.93 (br t, J=5.69 Hz, 1 H) 5.37 (s, 2 H) 4.07 – 4.41 (m, 4 H) 3.92 (brdd, J=8.80, 6.97 Hz, 1 H) 3.20 – 3.47 (m, 6 H) 2.95 (q, J=6.24 Hz, 2 H) 1.89– 2.07 (m, 1 H) 1.48 – 1.79 (m, 2 H) 1.30 – 1.47 (m, 2 H) 1.00 – 1.14 (m, 1H) 0.87 (dd, J=9.35, 6.79 Hz, 6 H)
LCMS (C3783-023-A2): 97.37% (497.06, M+H), RT: 1.75 min。
步骤3：((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成。
向(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(12 g，24.2 mmol)在DCM和MeOH (2:1) (150 mL)的混合物中的搅拌溶液中添加4-氨基苄醇(3.57 g，29.04 mmol)和EEDQ (11.9 g，48.4 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (Rf: 0.4, UV可见)。去除溶剂，并且向残余物中添加乙醚(500 mL)并超声处理5至10分钟。将固体过滤，用另外的醚洗涤并干燥，得到呈白色固体的((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(11 g，75.86%)。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.92 - 10.01 (m, 1 H) 8.09 (br d, J=7.70 Hz, 1 H) 7.89 (d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.74 (br t, J=6.79 Hz, 2 H) 7.54 (brd, J=8.07 Hz, 2 H) 7.41 (br t, J=7.70 Hz, 3 H) 7.28 - 7.36 (m, 2 H) 7.23 (brd, J=8.44 Hz, 2 H) 5.96 (br t, J=5.32 Hz, 1 H) 5.40 (s, 2 H) 5.09 (t, J=5.69Hz, 1 H) 4.36 - 4.48 (m, 3 H) 4.18 - 4.33 (m, 3 H) 3.93 (br dd, J=8.62, 7.15Hz, 1 H) 2.87 - 3.09 (m, 3 H) 1.91 - 2.08 (m, 1 H) 1.55 - 1.78 (m, 2 H) 1.29- 1.51 (m, 2 H) 0.87 (br t, J=7.34 Hz, 6 H)
LCMS: 85.44%, RT: 1.80 min, M+H: 602.36
步骤4：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成。
在23℃下，向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(11 g，18.3 mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(11.12 g，36.6 mmol)在DMF (60 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (4.72g，36.6 mmol)，并将混合物在室温下搅拌1小时。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10%MeOH/DCM (Rf: 0.4, UV可见)。在完成后，将乙醚(200 mL)添加至反应物中并搅拌30 min。将固体过滤，用另外的乙醚洗涤并干燥，得到呈白色固体的((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(10 g，71.42%)。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.14 (s, 1 H) 8.26 - 8.37 (m, 2 H)8.14 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (br d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.70 - 7.80 (m, 2 H)7.53 - 7.68 (m, 4 H) 7.26 - 7.48 (m, 6 H) 5.93 - 6.04 (m, 1 H) 5.37 - 5.46(m, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 4.38 - 4.49 (m, 1 H) 4.17 - 4.35 (m, 3 H) 3.88 - 4.01(m, 1 H) 2.91 - 3.09 (m, 2 H) 1.99 (dt, J=13.39, 6.88 Hz, 1 H) 1.56 - 1.75(m, 2 H) 1.31 - 1.50 (m, 2 H) 0.88 (br t, J=7.52 Hz, 6 H)
LCMS (SR-12580-7-A2): 91.44%, RT: 2.16min, 767.11。
中间体F的制备。
(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-((2E,4E)-5-((3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺的合成。
向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(20 mg，0.03mmol)在DCM (2 mL)中的搅拌溶液中添加肼(1M在THF中) (70 µL，0.3 mmol)，在室温下搅拌30 min，通过LCMS监测反应进展。粗LCMS示出68%的所需产物质量。在减压下蒸发反应混合物，得到粗化合物(20 mg)，通过制备型HPLC纯化粗化合物。在-78℃下收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-((2E,4E)-5-((3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺(9.4 mg，53.7%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 7.29 (br s, 1 H), 6.36 (d, J=15.80 Hz,1 H), 6.14 - 6.18 (m, 1 H), 6.05 (br d, J=9.05 Hz, 1 H), 5.81 (dd, J=11.34,0.76 Hz, 1 H), 5.59 - 5.65 (m, 1 H), 5.52 (br t, J=6.98 Hz, 1 H), 5.09 - 5.14(m, 1 H), 4.44 - 4.48 (m, 1 H), 4.22 (t, J=6.43 Hz, 1 H), 3.89 - 3.99 (m, 3H), 3.66 - 3.70 (m, 1 H), 3.51 - 3.55 (m, 2 H), 3.00 (d, J=4.47 Hz, 1 H),2.68 - 2.73 (m, 2 H), 2.60 (d, J=6.10 Hz, 1 H), 2.56 (s, 3 H), 2.34 - 2.41(m, 1 H), 2.19 - 2.26 (m, 1 H), 2.02 - 2.04 (m, 1 H), 1.91 - 1.95 (m, 3 H),1.77 - 1.82 (m, 2 H), 1.76 (s, 3 H), 1.47 (d, J=6.98 Hz, 3 H), 1.16 (d, J=6.32 Hz, 3 H), 0.98 (d, J=7.30 Hz, 3 H)
LCMS: 90.9%纯度, M+H: 574.5, RT: 2.05。
实施例29. 化合物10A的制备。
10A
(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-((2E,4E)-5-((3R,4R,5R,7S)-7-(2-(2-(2-溴乙酰基)肼基)-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺的合成。
向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(14 mg，0.02mmol)在DMF (1.5 mL)中的搅拌溶液中添加2-溴乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(7.1 mg，0.03 mmol)，在室温下搅拌1h，此时LCMS指示反应完成，用0.1%甲酸溶液(10 uL)淬灭反应物质，通过制备型HPLC直接纯化反应物质，在-78℃下收集级分并冻干，得到呈灰白色固体的(S,Z)-N-((2R,3R,5S,6S)-6-((2E,4E)-5-((3R,4R,5R,7S)-7-(2-(2-(2-溴乙酰基)肼基)-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 8.71 (br s, 1 H), 8.55 (br s, 1 H),6.40 (br d, J=15.65 Hz, 1 H), 6.15 (dd, J=11.25, 9.78 Hz, 1 H), 6.04 (br d, J=8.80 Hz, 1 H), 5.81 (d, J=11.25 Hz, 1 H), 5.64 (dd, J=15.65, 6.36 Hz, 1 H),5.54 (br t, J=6.85 Hz, 1 H), 5.06 - 5.14 (m, 1 H), 4.42 - 4.49 (m, 1 H), 4.25- 4.31 (m, 1 H), 3.87 - 4.01 (m, 3 H), 3.67 (td, J=6.36, 4.40 Hz, 1 H), 3.49- 3.57 (m, 2 H), 3.02 (d, J=4.40 Hz, 1 H), 2.78 - 2.87 (m, 2 H), 2.70 - 2.77(m, 1 H), 2.56 (s, 3 H), 2.34 - 2.42 (m, 1 H), 2.16 - 2.26 (m, 2 H), 2.11 (brdd, J=14.43, 5.14 Hz, 1 H), 1.91 - 2.03 (m, 3 H), 1.76 (s, 4 H), 1.47 (d, J=7.34 Hz, 3 H), 1.17 (d, J=6.36 Hz, 3 H), 0.98 (d, J=7.34 Hz, 3 H)
LCMS: 98.18%纯度, M+H: 694.37, RT: 3.58
实施例30. 化合物11A的制备。
11A
步骤1：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯的合成。
在室温下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯(500 mg，1.04 mmol)在THF (15 mL)中的搅拌溶液中添加2-溴乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(369 mg，1.56 mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌12 h。通过TLC监测反应的进展。TLC流动相：10% MeOH/DCM (Rf: 0.5, UV活性)。在减压下浓缩反应混合物，得到粗化合物。将粗化合物用乙醚(50 mL)研磨并干燥，得到呈灰白色固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯(400 mg，63%)。
LCMS (BT-17195-82-A1): 96.61%, RT: 2.18min, M+H: 600.30。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.92 - 10.01 (m, 1 H), 8.28 - 8.37 (m,2 H), 7.57 (d, J=8.50 Hz, 2 H), 7.28 (d, J=8.50 Hz, 2 H), 7.11 - 7.22 (m, 1H), 6.75 - 6.86 (m, 1 H), 4.88 - 4.99 (m, 2 H), 4.33 - 4.44 (m, 1 H), 4.24(dd, J=8.72, 6.76 Hz, 1 H), 3.89 - 4.02 (m, 2 H), 3.38 (q, J=7.01 Hz, 1 H),2.92 - 3.04 (m, 4 H), 1.93 - 2.04 (m, 1 H), 1.37 (s, 9 H), 1.31 (d, J=7.08Hz, 3 H), 1.09 (t, J=7.03 Hz, 1 H), 0.86 (dd, J=17.77, 6.76 Hz, 6 H)
步骤2：(2-氨基乙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯的合成。
在0℃下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯叔丁酯(350 mg，0.58 mmol)在DCM (10 mL)中的搅拌溶液中添加三氟乙酸(991 mg，8.6 mmol)，并在室温下搅拌3 h。通过TLC监测反应的进展。TLC流动相：10% MeOH/DCM (Rf: 0.5, UV活性)。在减压下浓缩反应混合物，得到粗化合物(300mg)。将粗化合物通过用乙醚进行研磨来纯化并干燥，得到呈浅黄色固体的(2-氨基乙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯(200 mg，TFA盐) (BT-17195-87-A1)。
LCMS (BT-17195-87-A1): 84.48%, RT: 1.64min, M+H: 500.26。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.98 (s, 1 H), 8.32 - 8.32 (m, 1 H),8.29 - 8.37 (m, 1 H), 7.73 (br d, J=0.87 Hz, 3 H), 7.58 (d, J=8.61 Hz, 2 H),7.26 - 7.38 (m, 3 H), 4.97 (s, 2 H), 4.34 - 4.44 (m, 1 H), 4.23 (dd, J=8.72,6.76 Hz, 1 H), 3.90 - 4.04 (m, 2 H), 3.19 - 3.27 (m, 2 H), 2.86 (br d, J=2.94Hz, 2 H), 1.93 - 2.04 (m, 2 H), 1.31 (d, J=7.08 Hz, 3 H), 1.17 (t, J=7.08 Hz,1 H), 0.87 (dd, J=17.22, 6.76 Hz, 6 H)
步骤3：(2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨基甲酸44-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯的合成。
在0℃下，向2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(90mg，0.137 mmol)和(2-氨基乙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯(102 mg，0.205 mmol)在DMF (2.0 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.026 g，0.205 mmol)。在0℃下15 min后，用0.1M甲酸淬灭反应混合物。粗LCMS示出20%的所需产物质量。对反应混合物直接进行制备型HPLC纯化。在-78℃下收集纯级分并冻干，得到呈白色固体的(2-(2-((3R,5S,7R,8R)-7-((1E,3E)-5-((2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-((S,Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酰胺基)乙基)氨基甲酸44-((S)-2-((S)-2-(2-溴乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄酯。
LCMS: 94.49%, RT: 2.47 min, M+H: 1041.58。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 8.37 (s, 1 H), 7.53 - 7.65 (m, 2 H),7.31 (br d, J=7.96 Hz, 3 H), 7.04 - 7.13 (m, 1 H), 6.51 - 6.65 (m, 2 H), 6.25- 6.39 (m, 1 H), 6.09 - 6.20 (m, 1 H), 6.00 - 6.08 (m, 1 H), 5.76 - 5.86 (m,1 H), 5.43 - 5.67 (m, 2 H), 5.12 - 5.28 (m, 2 H), 5.01 - 5.09 (m, 2 H), 4.56- 4.70 (m, 1 H), 4.19 - 4.43 (m, 4 H), 3.82 - 3.98 (m, 3 H), 3.54 - 3.64 (m,2 H), 3.40 - 3.51 (m, 4 H), 3.20 - 3.36 (m, 4 H), 2.89 - 2.95 (m, 1 H), 2.46- 2.75 (m, 9 H), 2.31 - 2.42 (m, 2 H), 2.13 - 2.26 (m, 2 H), 1.87 - 1.98 (m,1 H), 1.79 - 1.85 (m, 2 H), 1.69 - 1.77 (m, 6 H), 1.46 (d, J=6.98 Hz, 8 H),1.23 - 1.32 (m, 2 H), 1.10 - 1.18 (m, 4 H), 0.89 - 1.03 (m, 11 H)
实施例31. 化合物12A的制备。
12A
根据以下合成方案，使用本文所述的化合物和中间体，并且不使用与本文所提供类似的合成程序来制备化合物12A。
实施例32. 化合物13A的制备。
根据以下合成方案，使用本文所述的化合物和中间体，并且使用与本文所提供类似的合成程序来制备化合物13A。
13A
中间体的制备。
步骤1：(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1)的合成。
在冰浴下，向(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸(10 g，29.5 mmol)和N-羟基琥珀酰胺(3.73 g，32.45 mmol)在THF (200 mL)中的搅拌溶液中分批添加DCC (6.69 g，32.45 mmol)。在添加后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC系统：50% EtOAc/己烷(RF:0.5, UV可见)。将反应混合物冷却至-5℃，过滤并用冷THF (50 mL)洗涤，在真空中浓缩滤液，得到粗化合物。通过用MTBE和正戊烷研磨来纯化粗残余物，得到呈白色固体的(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(12.2 g，95.31%) (C3783-015-A2)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 7.77 (d, J=7.63 Hz, 2 H) 7.59 (br d, J=7.41 Hz, 2 H) 7.37 - 7.43 (m, 2 H) 7.29 - 7.35 (m, 2 H) 5.25 (br d, J=9.16Hz, 1 H) 4.69 (dd, J=9.26, 4.80 Hz, 1 H) 4.45 (d, J=6.65 Hz, 2 H) 4.21 - 4.28(m, 1 H) 3.21 (s, 1 H) 2.82 - 2.88 (m, 5 H) 2.29 - 2.40 (m, 1 H) 1.19 (s, 3H) 1.06 (br dd, J=9.81, 6.98 Hz, 6 H); LCMS (C3783-015-A2): 98.92% (437.27, M+H), RT: 2.61 min。
步骤2：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(3)的合成。
将含Fmoc-Val-NHS (15 g，34.4 mmol)的90 mL DME添加至L-瓜氨酸(6.32 g，36.12 mmol)在50 mL THF中和NaHCO3 (3.03 g，36.12 mmol)在90 mL水中的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (RF: 0.1, UV可见)。添加柠檬酸水溶液(450 mL的15%水溶液)，并用10% IPA/EtOAc (2 x 500 mL)萃取混合物。用水(3 x 500 mL)洗涤有机层，并在真空下蒸发溶剂。将所得固体用500 mL乙醚研磨并过滤，得到产物。将所得固体用500 mL乙醚研磨并过滤，得到呈白色固体的(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(11.5 g，67.64%)(C3783-023-A2)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.33 - 12.64 (m, 1 H) 8.15 (brd, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (d, J=7.70 Hz, 2 H) 7.60 - 7.80 (m, 2 H) 7.21 - 7.50(m, 4 H) 5.93 (br t, J=5.69 Hz, 1 H) 5.37 (s, 2 H) 4.07 - 4.41 (m, 4 H) 3.92(br dd, J=8.80, 6.97 Hz, 1 H) 3.20 - 3.47 (m, 6 H) 2.95 (q, J=6.24 Hz, 2 H)1.89 - 2.07 (m, 1 H) 1.48 - 1.79 (m, 2 H) 1.30 - 1.47 (m, 2 H) 1.00 - 1.14(m, 1 H) 0.87 (dd, J=9.35, 6.79 Hz, 6 H); LCMS (C3783-023-A2): 97.37%(497.06, M+H), RT: 1.75 min。
步骤3：((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(4)的合成：
向(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(12 g，24.2 mmol)在DCM和MeOH (2:1) (150 mL)的混合物中的搅拌溶液中添加4-氨基苄醇(3.57 g，29.04 mmol)和EEDQ (11.9 g，48.4 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM (RF: 0.4, UV可见)。去除溶剂，并且向残余物中添加乙醚(500 mL)并超声处理5至10分钟。将固体过滤，用另外的醚洗涤并干燥，得到呈白色固体的((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(11 g，75.86%)。1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.92 - 10.01 (m, 1 H) 8.09 (br d, J=7.70 Hz, 1 H)7.89 (d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.74 (br t, J=6.79 Hz, 2 H) 7.54 (br d, J=8.07 Hz, 2H) 7.41 (br t, J=7.70 Hz, 3 H) 7.28 - 7.36 (m, 2 H) 7.23 (br d, J=8.44 Hz, 2H) 5.96 (br t, J=5.32 Hz, 1 H) 5.40 (s, 2 H) 5.09 (t, J=5.69 Hz, 1 H) 4.36 -4.48 (m, 3 H) 4.18 - 4.33 (m, 3 H) 3.93 (br dd, J=8.62, 7.15 Hz, 1 H) 2.87 -3.09 (m, 3 H) 1.91 - 2.08 (m, 1 H) 1.55 - 1.78 (m, 2 H) 1.29 - 1.51 (m, 2 H)0.87 (br t, J=7.34 Hz, 6 H); LCMS: 85.44%, RT: 1.80 min, M+H: 602.36。
步骤4：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(5)的合成。
在23℃下，向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(11 g，18.3 mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(11.12 g，36.6 mmol)在DMF (60 mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA (4.72g，36.6 mmol)，并将混合物在室温下搅拌1小时。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10%MeOH/DCM (RF: 0.4, UV可见)。在完成后，将乙醚(200 mL)添加至反应物中并搅拌30 min。将固体过滤，用另外的乙醚洗涤并干燥，得到呈白色固体的((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(10 g，71.42%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm10.14 (s, 1 H) 8.26 - 8.37 (m, 2 H) 8.14 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (br d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.70 - 7.80 (m, 2 H) 7.53 - 7.68 (m, 4 H) 7.26 - 7.48 (m, 6 H)5.93 - 6.04 (m, 1 H) 5.37 - 5.46 (m, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 4.38 - 4.49 (m, 1 H)4.17 - 4.35 (m, 3 H) 3.88 - 4.01 (m, 1 H) 2.91 - 3.09 (m, 2 H) 1.99 (dt, J=13.39, 6.88 Hz, 1 H) 1.56 - 1.75 (m, 2 H) 1.31 - 1.50 (m, 2 H) 0.88 (br t, J=7.52 Hz, 6 H); LCMS: 91.44%, RT: 2.16min, 767.11。
步骤5：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(6)的合成。
在0℃下，向((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(5 g，6.5 mmol)在DMA (50 mL)中的搅拌溶液中添加HOAt (0.97 g，7.15 mmol)和2,6-二甲基吡啶(2.78 g，26 mmol)，并在0℃下搅拌5 min，然后添加(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.14 g，7.15 mmol)和DIPEA (2.51 g，19.5 mmol)，并且使其在23℃下搅拌2 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10% MeOH/DCM。在完成后，将反应混合物倒入MTBE (1000 mL)中并搅拌1 h，将所得固体过滤，用MTBE洗涤并干燥，得到呈浅黄色固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(5 g，97%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.06 (s, 1 H)8.12 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.89 (d, J=7.34 Hz, 2 H) 7.74 (br t, J=6.60 Hz, 2H) 7.53 - 7.62 (m, 2 H) 7.42 (br t, J=8.07 Hz, 3 H) 7.23 - 7.36 (m, 4 H) 7.19(br s, 1 H) 6.80 (br s, 1 H) 5.98 (br t, J=5.50 Hz, 1 H) 5.41 (s, 2 H) 4.94(s, 2 H) 4.36 - 4.49 (m, 1 H) 4.17 - 4.34 (m, 3 H) 3.93 (br dd, J=8.80, 7.34Hz, 1 H) 2.94 - 3.09 (m, 6 H) 2.78 (s, 1 H) 1.91 - 2.07 (m, 2 H) 1.56 - 1.76(m, 2 H) 1.37 (s, 10 H) 1.18 (br d, J=5.14 Hz, 2 H) 0.87 (br t, J=7.34 Hz, 6H); LCMS: 85.27%, RT: 2.01min, M+H: 788.43。
步骤6：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(化合物-E)的合成。
在室温下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯在DMF (50 mL)中的搅拌溶液中添加哌啶，并将混合物在室温下搅拌1 h。通过TLC监测反应进展。TLC系统：10%MeOH/DCM。在1 h后，将反应混合物倒入乙醚(500 mL)中，搅拌1 h，将固体过滤并干燥，得到呈浅黄色固体的乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(2.4 g，68.5%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.11 (s,1 H) 8.12 (br d, J=7.34 Hz, 1 H) 7.58 (d, J=8.80 Hz, 2 H) 7.28 (br d, J=8.44Hz, 2 H) 7.19 (br s, 1 H) 6.79 (br s, 1 H) 5.91 - 6.02 (m, 1 H) 5.40 (s, 2 H)4.94 (s, 2 H) 4.47 (br s, 1 H) 2.90 - 3.08 (m, 8 H) 2.74 (br d, J=6.60 Hz, 1H) 1.93 (br dd, J=11.74, 6.97 Hz, 1 H) 1.53 - 1.74 (m, 3 H) 1.37 (s, 12 H)0.88 (d, J=6.60 Hz, 3 H) 0.78 (d, J=6.97 Hz, 3 H); LCMS: 87.71%, RT: 1.31min,M+H: 566.27。
步骤7：乙烷-1,2-二基二氨基甲酸叔丁酯(4-((32S,35S)-1-碘-32-异丙基-2,30,33-三氧代-35-(3-脲基丙基)-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3,31,34-三氮杂三十六烷-36-酰胺基)苄酯) (7)的合成。
在室温下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯叔丁酯(1 g，1.8 m mol)、1-溴-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(3.54 g，6.3 m mol)在THF(30 ml)中的搅拌溶液中添加DCC (0.74 g，3.6 m mol)和DIPEA (0.696 g，5.4 m mol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。将乙醚(75 ml)添加至反应混合物中。将获得的固体过滤，并用乙醚(40 ml)洗涤。在高真空下干燥固体，得到产物(2 g，LCMS示出79.7%的所需产物，产率79%)。TLC示出复合物。TLC：流动相：10% MeOH/DCM。化合物呈白色固体。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.98 (s,1 H) 8.22 - 8.39 (m, 1 H) 8.11 (br d, J=7.30 Hz, 1 H) 7.87 (br d, J=8.50 Hz,1 H) 7.59 (br d, J=8.17 Hz, 2 H) 7.27 (br d, J=8.17 Hz, 2 H) 7.18 (br s, 1 H)6.79 (br s, 1 H) 5.99 (br s, 1 H) 5.58 (br d, J=7.74 Hz, 1 H) 5.41 (br s, 2H) 4.94 (br s, 2 H) 4.34 - 4.43 (m, 1 H) 4.23 (br t, J=7.57 Hz, 1 H) 3.86 (s,1 H) 3.57 - 3.64 (m, 3 H) 3.39 - 3.55 (m, 33 H) 3.11 - 3.27 (m, 4 H) 2.99 (brdd, J=11.28, 5.83 Hz, 7 H) 2.32 - 2.42 (m, 1 H) 1.97 (dq, J=13.00, 6.35 Hz, 1H) 1.47 - 1.80 (m, 8 H) 1.32 - 1.44 (m, 12 H) 1.25 (br d, J=5.78 Hz, 9 H)0.94 - 1.15 (m, 4 H) 0.85 (br dd, J=12.70, 6.70 Hz, 7 H); LCMS: 79.73%(1109.3, M+H), RT: 2.83 min。
步骤8 4-((32S,35S)-1-碘-32-异丙基-2,30,33-三氧代-35-(3-脲基丙基)-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3,31,34-三氮杂三十六烷-36-酰胺基)苄基(2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)乙基)氨基甲酸酯(单体-2-溴接头)的合成。
在0℃下，向乙烷-1,2-二基二氨基甲酸4-((32S,35S)-1-溴-32-异丙基-2,30,33-三氧代-35-(3-脲基丙基)-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3,31,34-三氮杂三十六烷-36-酰胺基)苄酯叔丁酯(2 g，1.8毫摩尔)在DCM(43 ml)中的溶液中添加TFA (3.078 g，27毫摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌4 h。通过LCMS和TLC监测反应进展。LCMS示出SM被消耗。TLC示出复合物。TLC：流动相：10% MeOH/DCM。在减压下浓缩反应溶剂，得到粗品。向粗品中添加水(5 ml)，并过滤获得的固体。对固体(1 g)进行LCMS和1HNMR分析，没有示出所需产物。将水冻干，得到2g (LCMS示出为60)的所需产物)。2g (LCMS示出为60%)通过制备型HPLC纯化。将获得的级分冻干，得到呈TFA盐形式的纯产物(600 mg，LCMS 95%，产率30%)，为灰白色胶状物。制备型HPLC条件：流动相A: - 0.1%T FA (水溶液)，流动相B: -乙腈，柱: -xselectPhenyl hexyle (150*25) mm, 5u，流速: - 16ml/min，方法:-(t/%B): 0/20, 2/20, 10/60，溶解度: - ACN + THF +水，温度: -室温。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm9.95 - 10.02 (m, 1 H) 8.22 - 8.37 (m, 1 H) 8.11 (d, J=7.52 Hz, 1 H) 7.87 (d,J=8.72 Hz, 1 H) 7.72 (br s, 2 H) 7.60 (d, J=8.50 Hz, 2 H) 7.25 - 7.39 (m, 3H) 5.09 - 6.22 (m, 18 H) 4.31 - 4.43 (m, 1 H) 4.22 (dd, J=8.45, 6.81 Hz, 1 H)3.86 (s, 2 H) 3.56 - 3.66 (m, 2 H) 3.39 - 3.55 (m, 32 H) 3.17 - 3.27 (m, 4 H)2.90 - 3.08 (m, 2 H) 2.81 - 2.90 (m, 2 H) 2.29 - 2.46 (m, 2 H) 1.89 - 2.02(m, 1 H) 1.52 - 1.77 (m, 2 H) 1.30 - 1.48 (m, 2 H) 0.85 (dd, J=12.37, 6.81Hz, 6 H); LCMS: 95.3% (1009.2, M+H), RT: 3.29 min。
制备
步骤1A：2-溴乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2A)的合成。
向250 mL圆底烧瓶中装入2-溴乙酸(4 g，29 mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(3.67 g，31.9 mmol)和DCM (40 ml)。在冰浴中搅拌溶液，同时添加N-N二环己基碳二亚胺(6.58 g，31.9 mmol)。将反应物在冰浴中搅拌1小时，并在室温下再搅拌1小时。TLC：流动相- 10%MeOH/DCM, Rf- 0.15。将反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，并在真空中浓缩，得到粗白色固体。将固体溶解在温热的DCM (40 mL)中，并用己烷(33 mL)重结晶。通过过滤收集固体，用己烷(20 ml)洗涤并在真空中干燥，得到呈白色固体的2-溴乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(6 g，1HNMR，产率88%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 4.10 (s, 2 H) 2.82 - 2.95(m, 4 H)
步骤1：1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(2)的合成。
在0℃下，向2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-5-氮杂三十二烷-32-酸(6 g，11.1毫摩尔)在DCM (400 mL)中的溶液中添加TFA (40 mL)。当TLC指示反应完成时，将反应混合物在0℃下搅拌1 h。流动相：10% MeOH/DCM, RF: 0.15。在减压下浓缩反应混合物，得到呈黄色胶状物的1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸。(5.5 g，产率：92%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.55 -7.91 (m, 4 H) 3.55 - 3.65 (m, 8 H) 3.44 - 3.55 (m, 24 H) 2.91 - 3.05 (m, 2 H)2.44 (t, J=6.38 Hz, 2 H)。
步骤2：1-溴-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(Int-3)的合成。
在室温下，向1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(2.4 g，4.5 m mol)在THF (48 ml)中的溶液中添加DIPEA (2.9 g，22.5 m mol)。将反应混合物在室温下搅拌5 min。在室温下，将2-溴乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.38 g，5.85毫摩尔)添加至反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2 h。通过TLC监测反应进展。TLC示出复合物。通过LCMS监测反应进展(LCMS示出2%的SM)。将反应混合物再搅拌30 min。在减压下浓缩反应混合物，得到粗品(7 g，LCMS示出41%的所需产物)。将粗品(7g)溶解在DCM (300 ml)中，并用水(30 ml)洗涤。DCM层经硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，得到(250 mg，LCMS示出7.9%的所需产物)。将H2O层冻干，得到5 g (LCMS示出38.6%)的所需产物。将产物(5 g)溶解在EtOAc (500 ml)中，并用10 ml水洗涤。乙酸乙酯层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到呈灰白色胶状物的用于后续反应中的产物(3.5 g，产率62%)。LCMS:62.42% (562.1, M+H), RT: 2.471 min。
实施例33. 化合物14A的制备
根据以下合成方案，使用实施例21的化合物2A制备化合物14A。
LCMS: 88.10%纯度, M+H: 688.44, RT: 1.96。
实施例34. 化合物2*的制备。
在0℃下，向化合物1* (50 g，24.17 mol)和无水DCM中依序添加DIPEA (4当量)和Boc2O (2当量)，并在室温下搅拌16 h。在40℃下浓缩反应混合物，得到粗产物(160 g)。通过combiflash色谱法(使用330 g，二氧化硅装载器230-400二氧化硅，对于slury 60-120200 g二氧化硅，5% EA/己烷溶液作为洗脱剂(1375 mL EtOAc和11.25 L己烷)纯化粗产物，得到呈浅黄色液体的化合物2* (产率：60.59 g (93.2%)；GC纯度– 95.14%)
实施例35. 化合物3*的制备。
如以下步骤所描述制备化合物3*。
1 将化合物2* (20 g，1.0当量)添加至惰性化的3 L反应容器中。
2. 将二氯甲烷(2 L，100 mL/g)添加至反应容器中，并用表面下氮气流脱气至少20 min。
3. 将硝基-格雷拉催化剂(10 g，0.50 g/g)添加至惰性化的反应容器中，并用表面下氮气流脱气至少10 min。
4. 将异丙烯基硼酸频哪醇酯(140 mL，7.08 mL/g)添加至反应容器中。
5. 将反应混合物加热至回流。
6. 将反应物在60℃下保持至少3小时。
7. 将反应混合物冷却至15至25℃。
8. 将粗反应混合物添加至硅胶(500 g，25 g/g化合物2*)中，并浓缩旋转蒸发烧瓶中的内容物，直到去除所有溶剂。
9. 通过硅胶色谱法纯化粗产物。
10. 将含有级分的产物浓缩至干燥，得到呈黄色粘性液体(低熔点固体)的化合物2* (11.6 g，23%产率)。
图24A示出分离的化合物3*的1H NMR光谱，而图24B示出分离的化合物3*的13C NMR光谱。
在一个实施方案中，催化剂为复分解催化剂(例如，钌复分解催化剂)。在一个实施方案中，溶剂为烃溶剂、醚(环状和非环状醚)溶剂、卤化溶剂或者其他极性非质子溶剂或水或其混合物。
实施例36. 化合物4*的制备。
如以下步骤所描述制备化合物4*。
1. 将化合物3 (6.6 g，1.0当量)添加至惰性化的100 mL反应容器中。
2. 将1,4-二噁烷(33.0 mL，5.0 mL/g)添加至反应容器中，并冷却至0-5℃。
3 将4N HCl/二噁烷(13.2 mL，2.0 mL/g)添加至反应容器中并搅拌。使反应混合物加热至15-25℃。
4. 将反应混合物在15至25℃下保持至少3小时。
5. 将反应混合物浓缩至干燥。
7. 将MTBE (33.0 mL，5.0 mL/g)添加至反应容器中。
8. 将反应混合物浓缩至干燥。
9. 将固体在40℃下在真空下干燥，得到呈灰白色固体的化合物4 (5.1 g，88%产率)。
图25A示出分离的化合物4的1H NMR光谱，而图25B示出分离的化合物4*的13C NMR光谱。
在一个实施方案中，酸为无机酸。在一个实施方案中，溶剂为烃溶剂、醚(环状和非环状醚)溶剂、卤化溶剂或者其他极性非质子溶剂或水或其混合物。
实施例37. 化合物5*的制备。
如以下步骤所描述制备化合物5*。
1. 将中间体A* (0.78 g，1.05当量)添加至惰性化的50 mL玻璃容器中。
2. 将二氯甲烷(14 mL，10 mL/g)添加至容器中。
3. 将化合物4 (1.4 g，1.0当量)添加至容器中，并冷却至-25至-15℃。
4. 将三乙胺(1.14 mL，0.81 mL/g)添加至容器中。
5. 在10 min内将正丙基膦酸酐(4.83 mL，3.45 mL/g)添加至容器中。
6. 将反应混合物在-25至-15℃下保持至少2小时。
7. 将饱和氯化铵(28 mL，20 mL/g)添加至第二玻璃容器中。
8. 将反应混合物转移至第二玻璃容器中，并使搅拌的混合物温热至15-25℃。
9. 停止搅拌，并使各层分离。去除底部有机层并将其转移至第三玻璃容器中。
10. 将二氯甲烷(28 mL，20 mL/g)添加至第二玻璃容器中，并搅拌至少5 min。
11. 停止搅拌，并使各层分离。去除底部有机层并将其转移至第三玻璃容器中。
12. 将二氯甲烷(28 mL，20 mL/g)添加至第二玻璃容器中，并搅拌至少5 min。
13. 停止搅拌，并使各层分离。去除底部有机层并将其转移至第三玻璃容器中。
14. 将无水硫酸钠(10 g，7.1 g/g)添加至含粗反应混合物的第三玻璃容器中。将混合物过滤并且将滤液浓缩。
15. 将内容物过滤并且将滤液浓缩至干燥，得到呈棕色固体的化合物5 (0.95 g，50%产率-校正的)。
在一个实施方案中，偶合剂为酸酐(例如，烷基膦酸酐)或碳二亚胺。在一个实施方案中，溶剂为烃溶剂、醚(环状和非环状醚)溶剂、卤化溶剂或者其他极性非质子溶剂或水或其混合物。在一个实施方案中，碱为胺碱。
图26A示出分离的化合物5*的1H NMR光谱，而图26B示出分离的化合物5*的13C NMR光谱。
实施例38. 化合物6*的制备。
如以下步骤所描述制备化合物6*。
1. 将化合物5* (2.0 g，1.0当量)和中间体B (1.8 g，0.98当量)添加至惰性化的100 mL玻璃容器中。
2. 将1,4-二噁烷(16 mL，8 mL/g)和水(4 mL，2 mL/g)添加至玻璃容器中，并用表面下氮气流脱气至少10 min。
3. 将Pd(dppf)Cl2-DCM (0.35 g，0.17 g/g)添加至玻璃容器中。
4. 将100 mL碳酸铊(5.9 g，3.0 g/g)添加至玻璃容器中，并用表面下氮气流脱气至少10 min。
5. 将反应组分保持在15-25℃并搅拌至少4小时。
6. 将EtOAc (20 mL，10 mL/g)添加至玻璃容器中，并将反应组分在15-25℃下搅拌至少5 min。
7. 将反应混合物过滤至干净的容器中。
8. 将水(20 mL，10 mL/g)添加至玻璃容器中，并将反应组分在15-25℃下搅拌至少10 min。
9. 停止搅拌，使各层分离至少10 min。
10. 去除并丢弃底层。
11. 将饱和NaCl (20 mL，10 mL/g)添加至玻璃容器中，并在15-25℃下搅拌至少10 min。
12. 停止搅拌，并使各层分离至少10 min。
13. 去除并丢弃底层。
14. 将无水硫酸钠(5 g，2.5 g/g)添加至玻璃容器中，并将反应组分在15-25℃下搅拌至少10分钟。
15. 将容器的内容物过滤，并将滤液转移至干净的旋转蒸发器烧瓶中。
16. 浓缩旋转蒸发器烧瓶的内容物，直到去除所有溶剂，得到呈棕色粘性液体的化合物6 (3.0 g，86%产率)。
图27A示出分离的化合物6*的1H NMR光谱，而图27B示出粗化合物6*的13C NMR光谱。
在一个实施方案中，催化剂为金属偶合催化剂(例如，钯催化剂)。在一个实施方案中，溶剂为烃溶剂、醚(环状和非环状醚)溶剂、卤化溶剂或者其他极性非质子溶剂或水或其混合物。
实施例39. 化合物7*的制备
如以下步骤所描述制备化合物7*。
1. 将化合物6* (2.4 g，1.0当量)和THF (72 mL，30 mL/g)添加至惰性化的500mL玻璃容器中。
2. 将氢氧化锂(150 mg，0.062 g/g)和水(72 mL，30 mL/g)的溶液添加至容器中，并在15-25℃下搅拌2小时。
3. 将MTBE (144 mL，60 mL/g)添加至容器中，并将反应组分在15-25℃下搅拌至少10 min。
4. 停止搅拌，并使各层分离至少10 min。
5. 将各层分离，并将底部水层转移回玻璃容器中。
6. 将85% NaH2PO4水溶液(30 mL，12.5 mL/g，pH 7)添加至容器中。
7. 将EtOAc (144 mL，60 mL/g)添加至容器中，并在15-25℃下搅拌至少10分钟。
8. 停止搅拌，并使其分层至少10分钟。
9. 将各层分离，并将有机层转移回玻璃容器中。
10. 将无水硫酸钠(1 g，0.4 g/g)添加至容器中，并将反应组分在15-25℃下搅拌至少10 min。
11. 将玻璃容器的内容物过滤，并将滤液转移至干净的旋转蒸发器烧瓶中。
12. 浓缩旋转蒸发器烧瓶的内容物，直到去除所有溶剂，得到呈棕色固体的化合物7 (1.2 g，50%产率)。
图28示出粗化合物7*的1H NMR光谱。
在一个实施方案中，碱为氢氧化物碱。在一个实施方案中，溶剂为烃溶剂、醚(环状和非环状醚)溶剂、卤化溶剂或者其他极性非质子溶剂或水或其混合物。
实施例40. 化合物8*的制备
如以下步骤所描述制备化合物8*。
1. 在搅拌下，将化合物7* (1.2 g，1.0当量)和二氯甲烷(60 mL，50 mL/g)添加至惰性化的250 mL玻璃容器中。
2. 将HATU (0.90 g，0.75 g/g)添加至容器中。
3. 将DIPEA (0.7 mL，0.58 mL/g)添加至容器中。
4. 将四氟苯酚(0.36 g，0.30 g/g)添加至玻璃容器中，并将反应组分在15-25℃下搅拌至少1小时。
5. 将水(50 mL，41.7 mL/g)添加至容器中
6. 将二氯甲烷(50 mL，41.7 mL/g)添加至容器中，并将反应组分在15-25℃下搅拌至少10 min。
7. 停止搅拌，并使其分层至少10分钟。
8. 将各层分离，并将底部有机层转移至干净的烧瓶中。
9. 将无水硫酸钠(5 g，4.2 g/g)添加至有机层中，并将混合物在15-25℃下搅拌至少5 min。
10. 将烧瓶的内容物过滤，并将滤液转移至干净的旋转蒸发器烧瓶中。
11. 浓缩旋转蒸发器烧瓶的内容物，直到去除所有溶剂。
13. 通过制备型HPLC纯化粗产物
14. 合并所有含有产物的级分，并将EtOAc (750 mL)和10% NaHCO3水溶液(750mL)添加至合并的级分中。搅拌双相混合物，使各层分离。
15. 分离各层，并用硫酸钠(5 g，4.2 g/g)干燥有机层
16. 将混合物过滤并且将有机层浓缩至干燥，得到呈灰白色固体的化合物8 (0.4g，45%产率)。
图29A示出化合物8的1H NMR光谱，而图29B示出化合物8*的13C NMR光谱。
在一个实施方案中，碱为胺碱。在一个实施方案中，偶合剂为脲鎓偶合剂。在一个实施方案中，溶剂为烃溶剂、醚(环状和非环状醚)溶剂、卤化溶剂或者其他极性非质子溶剂或水或其混合物。
实施例41. 化合物A*的制备。
A*
步骤1：3-(羟基氨基)-3-亚氨基-2-甲基丙酸乙酯(2)的合成。
在0℃下，向2-氰基丙酸乙酯(20 g，15.7 mmol)在THF (500 mL)中的搅拌溶液中添加KOtBu (314 mL，31.4 mmol，1 M在THF中)溶液。在10 min后，添加羟基胺盐酸盐(27 g，39.3 mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌48 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.1，KMnO4活性)。
在减压下蒸发反应物质，通过二氧化硅柱使用40%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化残余物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈无色油状物的3-(羟基氨基)-3-亚氨基-2-甲基丙酸乙酯(5.5 g，21.8%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.17 (t,J= 7.15 Hz, 3 H), 1.24 (d,J=7.15 Hz, 3 H), 3.10 - 3.20 (m, 1 H), 3.92 - 4.23 (q, 2 H), 5.31 - 5.45 (br, 2H)。
LCMS: 43.4% (161.13, M+H), RT = 0.37 min以及49.48% (161.13, M+H), RT= 0.41 min
步骤2：2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸乙酯(3)的合成
在室温下，向3-(羟基氨基)-3-亚氨基-2-甲基丙酸乙酯(5.5 g，34.3 mmol)在吡啶(50 mL)中的搅拌溶液中添加在密封管中的乙酸酐(9.7 mL，10.3 mmol)。将反应混合物在120℃下加热24 h，通过TLC监测反应进程。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.5，KMnO4活性)。
在减压下蒸发反应物质，通过二氧化硅柱使用20%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化残余物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈黄色油状物的2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸乙酯(4.5 g，71.4%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.26 (t,J= 7.09 Hz, 3 H), 1.58 - 1.62(d, 3 H), 2.61 (s, 3 H), 3.89 - 4.00 (q, 1 H), 4.15 - 4.26 (q, 2 H)。
LCMS: 86.56% (185.22, M+H), RT = 1.48 min。
步骤3：2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(4)的合成。
在0℃下，向2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸乙酯(4.5 g，24.4 mmol)在MeOH:THF:H2O (45 ml，4:4:1)中的搅拌溶液中添加LiOH.H2O (4 g，9.7 mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌12 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.1，KMnO4活性)。
在减压下蒸发反应物质，使用6N HCl (约10 ml)将残余物的pH调节至约1，然后用乙酸乙酯(25 ml x 2)萃取。使用Na2SO4干燥合并的有机层，并在减压下浓缩，得到呈无色油状物的2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(3.5 g，92%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.41 (d,J= 7.23 Hz, 3 H), 2.57 (s, 3H), 3.88 - 3.97 (q, 1 H), 12.65 - 12.82 (br s, 1 H)。
LCMS: 94.38% (157.1, M+H), RT = 1.05 min。
步骤4：N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺(5)的合成。
在0℃下，向2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(3.5 g，22.4 mmol)在DCM (100ml)中的搅拌溶液中添加EDC.HCl (6.4 g，33.6 m mol)、HOBt (4.5 g，33.6 mmol)、DIPEA(11.7 ml，67.2 mmol)。在10 min后，在0℃下添加N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(3.2 g，33.6mol)。将反应混合物在室温下搅拌12 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(50% EtOAc/己烷，Rf: 0.2，KMnO4活性)。
将反应物质用DCM (40 mL)稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液(30 ml)洗涤。将有机层分离，并经硫酸钠干燥。在减压下蒸发有机层，并获得5 g粗N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺。通过二氧化硅柱，使用40%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈无色油状物的N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺(2.2 g，50%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.57 (d,J= 7.03 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3H), 3.26 (s, 3 H), 3.72 (s, 3 H), 4.34 - 4.42 (q, 1 H)。
LCMS: 96.65% (200.16, M+H), RT = 1.21 min。
步骤5：2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛(6)的合成。
在0℃下，向LAH (380 mg，10 mmol)在THF (10 ml)中的搅拌溶液中缓慢添加含N-甲氧基-N-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺(1 g，50 mmol)的THF (20 ml)。将反应混合物在室温下搅拌1 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(40%EtOAc/己烷，Rf: 0.3，KMnO4活性和2,4-DNP略微活性)。
将反应混合物在0℃下使用1 N HCl (~3 ml)淬灭，并搅拌10 min并添加乙酸乙酯(20 ml)。将反应混合物通过硅藻土床过滤。使用硫酸钠干燥滤液，并将体积减至4 mL (约800 mg，粗品)的2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛。因此，粗2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛用于步骤6。
ESMS: 40.4% (141.1, M+H), RT = 2.24 min。(粗品)
步骤6：(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯(7)的合成。
在0℃下，向18-冠-6-醚(7.5 g，28.5 m mol)在无水THF (30 ml)中的搅拌溶液中添加2-(双(2,2,2-三氟乙氧基)磷酰基)乙酸甲酯(1.3 ml，6.2 m mol)，然后在-78℃下添加含1 M KHMDS的THF (6.2 ml，6.2 mmol)。将反应混合物在-78℃下维持30 min，然后在-78℃下添加含2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛(约800 mg)的无水THF (10 ml)，并且使反应混合物在室温下逐渐升温并在相同温度下搅拌2 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(30% EtOAc/己烷，Rf: 0.5，KMnO4活性)。
将反应混合物使用H2O (30 ml)淬灭，并在乙酸乙酯(50 ml x 2)中萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到600 mg粗(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯。通过二氧化硅柱，使用10%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂来纯化粗化合物。收集纯级分并在减压下蒸发，得到呈黄色油状物的(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯(420 mg，LCMS纯度为59%，37%)。
1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 1.44 - 1.48 (d, 3 H), 2.57 (s, 3 H)3.74 (s, 3 H), 5.01 - 5.10 (q, 1 H), 5.92 – 5.89 (d,J= 10 Hz, 1 H), 6.35 -6.46 (dd,J= 10 Hz, 1 H)。
LCMS: 59% (197.21, M+H), RT = 1.57 min。
由烯烃键的JJ偶合常数证实的Z几何异构体: 10 Hz
步骤7：(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(8)的合成。
将(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯(550 mg，28 mmol，LCMS的粗品纯度为80%)添加在二噁烷(10 ml)和2 N HCl (5 ml)中。将反应混合物在55℃下搅拌48 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(30% EtOAc/己烷，Rf: 0.1，KMnO4活性)。
将反应混合物在减压下浓缩，并使用制备型HPLC纯化，得到呈无色油状物的纯(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(138 mg，28.6%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.33 (d,J= 7.02 Hz, 3 H), 2.55 (s, 3H), 4.86 - 5.08 (q, 1 H), 5.84 (dd,J= 11.40 Hz, 1 H), 6.24 (m,J= 10.52 Hz, 1H), 11.64 - 12.96 (br s, 1 H)。
LCMS: 98.59% (183.21, M+H), RT = 1.4 min。
步骤8：合成
来自步骤7的甲基(Z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸(8)的外消旋混合物经受手性色谱法，得到所需对映异构体(中间体A*)。
实施例42. 化合物B*的制备。
B*
步骤1：(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(2)的合成。
在室温下，向化合物1 (137.5 g，0.941摩尔)、Pd(OAc)2(5.9 g，0.026摩尔)在ACN(550 ml)中的混合物中添加乙酸乙烯酯(250 g，2.907摩尔)。将反应混合物在60℃下搅拌24 h。将反应混合物通过硅藻土过滤，并用EtOAc (100 ml)洗涤。在减压下浓缩溶剂，得到残余物。用丙酮(68 ml)、EtOAc (68 ml)的混合物重结晶残余物。得到呈灰白色固体的(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(75 g，55%)。TLC系统(EtOAc, RF=0.39, UV活性)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.60 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 5.61 (d, J = 4.9Hz, 1H), 5.30 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.00 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.16 - 4.06 (m,2H), 3.82 - 3.76 (m, 1H), 3.73 - 3.66 (m, 1H)。
步骤2：(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(3)的合成。
在室温下，向化合物(2R,3R)-3-羟基-2-(羟甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(100 g，0.69摩尔)在DMF (1900 ml)中的溶液中添加TBS-Cl (277 g，2.65摩尔)、咪唑(140.9 g，2.07摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌24 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(5% EtOAc/石油醚, RF=0.5, UV活性)。在反应完成后，将反应混合物用乙醚(2500ml)稀释，并用水(1000 ml)、盐水(1000 ml)洗涤。乙醚层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂2% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈灰白色固体的(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(200 g，77.5%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 7.30 - 7.25(m, 1H), 5.30 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.45 - 4.40 (m, 1H), 4.18 (td, J = 2.6,12.2 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 0.91 (d, J = 2.5 Hz, 18H), 0.23 (s,3H), 0.11 - 0.05 (m, 6H); LCMS: 99.48% (373.37, M+H), RT: 3.47 min。
步骤3：2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(4)的合成。
在室温下，向(2R,3R)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-2H-吡喃-4(3H)-酮(55 g，0.147摩尔)在DCM (2000 ml)中的搅拌溶液中添加叔丁基(1-甲氧基乙烯基氧基)二甲基硅烷(55 g，0.292摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌2 h。在-78℃下将BF3.Et2O (63.25 g，3.03摩尔)添加至反应混合物中后。将反应混合物在-78℃下搅拌1 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(15% EtOAc/石油醚,RF=0.5, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (500 ml)淬灭，并用DCM (2x250 ML)萃取。用饱和NaHCO3(500 ml)、盐水(500 ml)洗涤DCM层。DCM层经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，浓缩，并形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂3% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗物质，得到呈透明胶状物的2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(25 g，37.9%)。1H NMR (400MHz,氯仿-d) δ = 4.92 - 4.72 (m, 1H), 4.33 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.91 - 3.78(m, 2H), 3.74 - 3.58 (m, 4H), 2.83 - 2.60 (m, 2H), 2.52 - 2.38 (m, 2H), 0.99- 0.79 (m, 18H), 0.15 (s, 3H), 0.11 - 0.01 (m, 9H)
步骤4：2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(5)的合成。
在0℃下，向甲基三苯基溴化鏻(12 g，0.033摩尔)在THF (180 ml)中的悬浮液中添加KOtBu (3.33 g，0.029摩尔)的THF (80 ml)溶液。在1 h后，逐滴添加2-((2S,5R,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(10 g，0.022摩尔)的THF (60 ml)溶液。然后将反应混合物加热至25℃并搅拌1小时。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(5% EtOAc/石油醚, RF=0.3, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (100 ml)淬灭，并用EtOAc (2x150 ml)萃取。EtOAc层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂5% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(4 g，40.4%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 5.07 (s, 1H), 4.89 - 4.86 (m, 1H),4.30 - 4.23 (m, 1H), 4.02 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 3.75 - 3.66 (m, 5H), 3.47 (td,J = 4.7, 6.4 Hz, 1H), 2.65 (dd, J = 7.3, 15.0 Hz, 1H), 2.48 (dd, J = 6.8,15.0 Hz, 1H), 2.42 - 2.28 (m, 2H), 0.95 - 0.84 (m, 18H), 0.12 - 0.01 (m, 12H)
步骤5：2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(6)的合成。
在室温下，向化合物2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(75.1 g，0.168摩尔)在MeOH (751 ml)中的搅拌溶液中添加PPTS (59.4 g，0.236摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌16 h。通过TLC监测反应的进展。TLC指示SM被消耗。TLC系统(25% EtOAc/石油醚, RF=0.3, PMA活性)。将反应混合物用饱和NaHCO3(1270 ml)淬灭，并用EtOAc (2x 1500 ml)萃取。EtOAc层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂25% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色胶状物的2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(39 g，69.8%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 5.11 (s, 1H), 4.88 (s, 1H), 4.42 - 4.35 (m, 1H),3.93 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 3.71 - 3.64 (m, 5H), 3.56 - 3.50 (m, 1H), 2.73 (dd,J = 8.8, 15.4 Hz, 1H), 2.51 - 2.42 (m, 2H), 2.31 (dd, J = 3.8, 13.4 Hz, 1H),2.15 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 0.94 - 0.91 (m, 9H), 0.10 - 0.08 (m, 3H), 0.05 -0.03 (m, 3H)。LCMS: 80.17% (331.39, M+H), RT: 2.78 min
步骤6：2-((2S,5S,6S)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(7)的合成。
在-78℃下，向草酰氯(17.2 g，0.136摩尔)在DCM (214 ml)中的搅拌溶液中缓慢添加DMSO (21 g，0.27摩尔)。将反应混合物在-78℃至-60℃下搅拌20 min。然后逐滴添加2-((2S,5S,6R)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-(羟甲基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯的化合物(30 g，0.09摩尔)在DCM (414 ml)中的溶液。将反应混合物在30 min内缓慢升温至-45℃。在-45℃下添加TEA (52.8 g，0.522摩尔)后，并将反应混合物在10min内升温至0℃。通过TLC监测反应进展。TLC示出SM被消耗。TLC系统(20% EtOAc/石油醚,RF=0.35, PMA活性)。将反应混合物用饱和NH4Cl (500 ml)淬灭，并用DCM (2x500 ML)萃取。用盐水(1000 ml)洗涤DCM层。DCM层经无水硫酸钠干燥。然后过滤，浓缩，形成粗品。通过柱色谱法(100-200硅胶/洗脱剂20% EtOAc的石油醚溶液)纯化粗品，得到呈黄色胶状物的2-((2S,5S,6S)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(22 g，73.8%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ = 9.76 - 9.73 (m, 1H), 5.05 -5.00 (m, 1H), 4.93 - 4.87 (m, 1H), 4.36 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.29 - 4.20 (m,1H), 4.12 - 4.08 (m, 1H), 3.73 - 3.67 (m, 4H), 2.78 - 2.69 (m, 1H), 2.55 -2.40 (m, 1H), 2.27 - 2.20 (m, 2H), 0.96 - 0.87 (m, 9H), 0.12 - -0.02 (m, 6H);LCMS: 97.53% (329.34, M+H), RT: 2.60 min
步骤7：2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(8)的合成。
向2-((2S,5S,6S)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(2 g，6.088毫摩尔)在THF (140 mL)中的搅拌溶液(在26℃下搅拌)中添加CrCl2(4.489 g，36.531毫摩尔)和CHI3(7.191 g，18.265毫摩尔)，并在相同温度下搅拌16 h。TLC指示反应完成(TLC系统：20% EtOAc/石油醚, Rf: 0.7, PMA活性)。用冰冷的水(50 mL)稀释反应混合物，并用EtOAc (2x50 mL)萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物(2.8 g)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和4% EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。在28℃下在减压下蒸发收集的级分，得到呈浅黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(800 mg，产率28%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.49 -6.62 (m, 1 H) 6.31 - 6.44 (m, 1 H) 5.09 - 5.22 (m, 1 H) 4.83 - 4.96 (m, 1 H)4.35 - 4.45 (m, 1 H) 3.84 - 3.92 (m, 1 H) 3.75 - 3.82 (m, 1 H) 3.65 - 3.72(m, 3 H) 2.63 - 2.72 (m, 1 H) 2.42 - 2.55 (m, 2 H) 2.25 - 2.36 (m, 1 H) 0.87- 0.96 (m, 9 H) -0.01 - 0.02 (m, 6 H); LCMS: 85.58% (453, M+H&475 M+23 (钠加合物), RT: 2.8 min。
步骤8：2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(9)的合成。
在0℃下，向2-((2S,5S,6R)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(800 mg，1.768毫摩尔)在THF (40 mL)中的溶液中添加TBAF (1M在THF中，2.122 mL，2.122毫摩尔)，然后在2 h内使其缓慢达到室温，此时TLC指示反应完成(TLC系统：30% EtOAc/石油醚, Rf: 0.2, PMA活性)。通过添加NH4Cl(水溶液) (20 mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc (2x20mL)萃取产物。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物(2 g)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和20%EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。蒸发收集的级分，得到呈浅黄色液体的2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(450 mg，产率76%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d) δ ppm 6.67 (br d, J=4.80 Hz, 2 H) 5.11 - 5.15 (m, 1H) 4.95 - 5.00 (m, 1 H) 4.26 - 4.34 (m, 1 H) 4.08 - 4.16 (m, 1 H) 3.88 - 3.95(m, 1 H) 3.66 - 3.73 (m, 3 H) 2.60 - 2.70 (m, 1 H) 2.44 - 2.51 (m, 1 H) 2.35- 2.42 (m, 2 H) 1.96 - 2.00 (m, 1 H); LCMS: 89% (339.04, M+H), RT: 1.69 min
步骤9：2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(中间体C)的合成。
向2-((2S,5S,6R)-5-羟基-6-((E)-2-碘乙烯基)-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸甲酯(450 mg，1.33毫摩尔)在DCM (27 mL)中的溶液(在0℃下搅拌)中添加V(acac)2(35.2 mg，0.133毫摩尔)，然后添加叔BuOOH (5-6 M在癸烷中，0.53 mL，2.66毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌4 h，此时TLC指示反应完成(TLC系统：50% EtOAc/石油醚, Rf: 0.3,PMA活性)。通过硅藻土过滤反应混合物，用DCM (20 mL)洗涤。浓缩滤液，得到粗产物(500mg)，其通过正相色谱法使用二氧化硅(100-200目)和25% EtOAc/石油醚作为洗脱剂来纯化。蒸发收集的级分，得到呈浅黄色胶状物的2-((3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-((E)-2-碘乙烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(220 mg，产率46%)。1H NMR (400 MHz,氯仿-d)δ ppm 6.70 (dd, J=14.60, 4.90 Hz, 1 H) 6.49 - 6.57 (m, 1 H) 4.55 (s, 1 H)4.08 - 4.13 (m, 1 H) 3.47 - 3.52 (m, 1 H) 2.97 - 3.01 (m, 1 H) 2.88 - 2.96(m, 1 H) 2.59 - 2.69 (m, 2 H) 2.18 (dd, J=14.17, 5.34 Hz, 1 H) 1.79 - 1.86(m, 1 H) 1.68 - 1.76 (m, 1 H)。
实施例43. MDR研究。
方法：
同基因MDR1-低MES-SA和MDR1-高MES-SA/ MX2子宫肉瘤细胞系均购自ATCC购买。通过对亲本MES-SA细胞进行米托蒽醌选择，直至获得对II型拓扑异构酶I抑制剂的抗性而获得MES-SA/ MX2细胞系，并且该抗性与MDR1过表达相关。依克立达和他芮喹达是对MDR1抑制具有高度特异性的第三代抑制剂，而伐司扑达是也与CYP 3A4相互作用的第二代p-糖蛋白抑制剂。
MES-SA细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)的麦科伊氏5A培养基(McCoy’s 5Amedium)中生长，而MES-SA/ MX2在补充有45%韦氏MB 752/1 (Waymouth’s MB 752/1)(Sigma-Aldrich)和10% FBS的麦科伊氏5A培养基中生长。同基因系在存在0.013纳摩尔至5微摩尔浓度的ADC有效载荷SN38、DXd、MMAE和泰兰斯他汀ADC代谢物(一种代表赖氨酸偶联的膜可渗透的ThA13 d2甲酯)以及由半胱氨酸偶联物释放的301-代谢物的情况下生长。5天后，使用ATP-cell titer glo荧光素酶读数法测量细胞毒性。每个数据点代表每种细胞系-有效载荷组合的三个复孔的平均值。对于每种细胞系的总细胞数(100%存活)，未处理的孔用于对照。
结论：
ADC有效载荷的活性物质是各种p-糖蛋白(诸如MDR1)的底物。相对于亲本MES-SA(MDR1-低)细胞，MMAE杀死MES-SA/ MX2细胞(MDR1-高)所需的IC50增加282倍(图30C，实心正方形对比于圆形)。这归因于MDR1特异性活性，因为这种增加被MDR-1抑制剂依克立达、他芮喹达和伐司扑达阻断。在用MDR1抑制剂处理的MES-SA/ MX2细胞中，甚至在存在MDR1过表达的情况下，MMAE的效力返回到基线MES-SA对照IC50 (图C，实心正方形对比于三角形)，表明效力的丧失是由MDR1转运蛋白过表达驱动的。
类似地，在将MES-SA/MX2与其对应MES-SA曲线(实心正方形对比于圆形)进行比较时，在存在SN38 (5.2倍，图30D)、DXd (9.67倍，图30E)、ThA13 d2甲酯(0.75倍，图30A)和ThA13 d2 301(图30B，8.48倍)的情况下观察到杀死MES-SA/ MX2细胞所需的ADC-有效载荷IC50的增加，这些曲线在用多种MDR1抑制剂处理时返回到基线。结果表明，泰兰斯他汀ADC释放的有效载荷是多药耐药性转运蛋白MDR1的不良底物，特别是由赖氨酸偶联物释放的物质。
虽然出于清楚理解的目的已通过说明和实施例相当详细地描述了上述发明，但这些描述和实施例不应当被解释为限制本发明的范围。整个说明书中所引用的所有专利、专利申请和参考文献都明确以引用的方式并入。

Claims (111)

1.一种抗体-药物偶联物化合物，其包含直接(即，不通过接头)或通过式I的接头共价连接至药物部分的抗体：
I
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
L为接头；
n为0或1；
p为1至20；并且
Ab为抗体。
2.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物化合物，其包含直接(即，不通过接头)或通过式I的接头共价连接至药物部分的抗体：
I
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
所述药物部分为：
；
L为接头；
n为0或1；
p为1至20；并且
Ab为与Trop2结合的抗体。
3. 如权利要求1或权利要求2所述的抗体-药物偶联物化合物，其中n为0 (即，所述接头(L)不存在)。
4.如权利要求1或权利要求2所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体通过所述抗体的赖氨酸残基的侧链氮连接至所述药物部分。
5. 如权利要求1所述的抗体-药物偶联物化合物，其中n为1。
6. 如权利要求1、2或5中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述接头L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至60个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)；
其中X1、X2或X3中的至少一者不为键。
7. 如权利要求1或权利要求2所述的抗体-药物偶联物化合物，其中n为0 (即，L不存在)或者n为1并且L为选自由以下组成的组的接头：
、
、
、
、
、
、
、
和
，
其中：
每个m独立地是1、2、3或4；
每个n1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个t独立地是1、2、3或4；
每个n2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p2独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个q2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个s独立地是1、2、3或4；并且
每个AA1和AA2独立地是氨基酸的侧链。
8. 如权利要求1所述的抗体-药物偶联物化合物，其中n为0 (即，L不存在)或者n为1并且L为选自由以下组成的组的接头：
、
、
、
、、
、
、
、
、
、
、
和
。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含互补决定区1 (HCDR1)，其包含与NYGMN (SEQ IDNO: 14)具有至少75%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (HCDR2)，其包含与WINTKTGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO: 16)或WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)具有至少75%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (HCDR3)，其包含与GGYGSSYWYFDV (SEQ IDNO: 18)具有至少75%同一性的氨基酸序列；并且/或者
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含互补决定区1 (LCDR1)，其包含与KASQDVSIAVA(SEQ ID NO: 27)具有至少75%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (LCDR2)，其包含与SASYRYT (SEQ ID NO: 29)具有至少75%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (LCDR3)，其包含与QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)具有至少75%同一性的氨基酸序列。
10. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含互补决定区1 (HCDR1)，其包含与NYGMN (SEQ IDNO: 14)具有至少85%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (HCDR2)，其包含与WINTKTGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO: 16)或WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)具有至少85%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (HCDR3)，其包含与GGYGSSYWYFDV (SEQ IDNO: 18)具有至少85%同一性的氨基酸序列；并且/或者
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含互补决定区1 (LCDR1)，其包含与KASQDVSIAVA(SEQ ID NO: 27)具有至少85%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (LCDR2)，其包含与SASYRYT (SEQ ID NO: 29)具有至少85%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (LCDR3)，其包含与QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)具有至少85%同一性的氨基酸序列。
11. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含含有NYGMN (SEQ ID NO: 14)的互补决定区1(HCDR1)、含有WINTKTGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO: 16)或WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO:21)的互补决定区2 (HCDR2)，以及含有GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)的互补决定区3(HCDR3)；并且/或者
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含含有KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 27)的互补决定区1 (LCDR1)、含有SASYRYT (SEQ ID NO: 29)的互补决定区2 (LCDR2)，以及含有QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)的互补决定区3 (LCDR3)。
12.如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含含有SEQ ID NO: 14的互补决定区1 (HCDR1)、含有SEQ ID NO: 16的互补决定区2 (HCDR2)，以及含有SEQ ID NO: 18的互补决定区3(HCDR3)。
13.如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含含有SEQ ID NO: 14的互补决定区1 (HCDR1)、含有SEQ ID NO: 21的互补决定区2 (HCDR2)，以及含有SEQ ID NO: 18的互补决定区3(HCDR3)。
14.如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含含有SEQ ID NO: 27的互补决定区1 (LCDR1)、含有SEQ ID NO: 29的互补决定区2 (LCDR2)，以及含有SEQ ID NO: 31的互补决定区3(LCDR3)。
15. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含含有与SEQ ID NO: 1-4中的任一者具有至少90%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和含有与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少90%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
16. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含含有与SEQ ID NO: 1-4中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和含有与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
17. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含含有与SEQ ID NO: 1-4中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和含有与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
18. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有与SEQ ID NO: 1-4中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和含有与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
19. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含含有SEQ ID NO: 1-4中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和含有SEQ ID NO: 5-6中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
20. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体或其片段，并且包含含有SEQ ID NO: 2或4中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区多肽，和含有SEQ ID NO: 5-6中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区多肽。
21. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域的免疫球蛋白重链多肽。
22. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有与SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者具有至少90%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有与SEQ ID NO: 8或12中的任一者具有至少90%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
23. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有与SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有与SEQ ID NO: 8或12中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
24. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有与SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有与SEQ ID NO: 8或12中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
25. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有与SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有与SEQ ID NO: 8或12中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
26. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有SEQ ID NO: 7、9、10、11或34-37中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽。
27. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有SEQ ID NO: 8或12中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
28. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有SEQ ID NO: 7、10、35或37中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有SEQ ID NO: 8或12中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
29. 如权利要求1至8中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中所述抗体为抗Trop2抗体，并且包含含有SEQ ID NO: 7或37中的任一者的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
30. 一种抗体或其片段，其包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含互补决定区1 (HCDR1)，其包含与NYGMN (SEQ IDNO: 14)具有至少90%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (HCDR2)，其包含与WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)具有至少90%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (HCDR3)，其包含与GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)具有至少90%同一性的氨基酸序列；并且/或者
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含互补决定区1 (LCDR1)，其包含与KASQDVSIAVA(SEQ ID NO: 27)具有至少90%同一性的氨基酸序列；互补决定区2 (LCDR2)，其包含与SASYRYT (SEQ ID NO: 29)具有至少90%同一性的氨基酸序列；以及互补决定区3 (LCDR3)，其包含与QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)具有至少90%同一性的氨基酸序列。
31. 如权利要求30所述的抗体或其片段，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含含有NYGMN (SEQ ID NO: 14)的互补决定区1(HCDR1)、含有WINTKTGEPTYAQEFTG (SEQ ID NO: 21)的互补决定区2 (HCDR2)，以及含有GGYGSSYWYFDV (SEQ ID NO: 18)的互补决定区3 (HCDR3)；并且/或者
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含含有KASQDVSIAVA (SEQ ID NO: 27)的互补决定区1 (LCDR1)、含有SASYRYT (SEQ ID NO: 29)的互补决定区2 (LCDR2)，以及含有QQHYITPLT (SEQ ID NO: 31)的互补决定区3 (LCDR3)。
32. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体或其片段，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95%同一性的氨基酸序列，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列；或者
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少95%同一性的氨基酸序列，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含与SEQ ID NO: 6中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列。
33. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体或其片段，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少97%同一性的氨基酸序列，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列；或者
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少97%同一性的氨基酸序列，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含与SEQ ID NO: 6中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列。
34. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体或其片段，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少99%同一性的氨基酸序列，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含与SEQ ID NO: 5-6中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列；或者
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少99%同一性的氨基酸序列，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含与SEQ ID NO: 6中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列。
35. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体或其片段，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含SEQ ID NO:4，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含SEQ ID NO: 5或6；或者
如权利要求30至31中任一项所述的抗体或其片段，其中：
所述免疫球蛋白重链可变区多肽包含SEQ ID NO:4，并且
所述免疫球蛋白轻链可变区多肽包含SEQ ID NO: 6。
36. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域的免疫球蛋白重链多肽。
37. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有与SEQ ID NO: 7或37中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有与SEQID NO: 8或12中的任一者具有至少95%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
38. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有与SEQ ID NO: 7或37中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有与SEQID NO: 8或12中的任一者具有至少97%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
39. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有与SEQ ID NO: 7或37中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白重链多肽，和含有与SEQID NO: 8或12中的任一者具有至少99%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链多肽。
40. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO: 7或37中的任一者的免疫球蛋白重链多肽，和含有SEQ ID NO: 8或12中的任一者的免疫球蛋白轻链多肽。
41. 如权利要求30至31中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO: 7或37中的任一者的免疫球蛋白重链多肽，和含有SEQ ID NO: 8的免疫球蛋白轻链多肽。
42.一种式II化合物
II
或其盐，
其中
W为离去基团或-L-X；
L为接头；并且
X为反应性基团。
43.如权利要求42所述的化合物，其中W为离去基团。
44.如权利要求42或43所述的化合物，其中所述离去基团为卤代基、-O(C1-C6)烷基、-O芳基、-O杂芳基或-O杂环基，其中所述-O(C1-C6)烷基、-O芳基、O杂芳基或O杂环基各自任选地被一个或多个独立地选自由氧代、卤代基、(C1-C6)烷基和-O(C1-C6)烷基组成的组的取代基取代。
45.如权利要求42所述的化合物，其中W与其所连接的羰基一起形成活化酯。
46.如权利要求42所述的化合物，其中W为任选地被一个或多个卤代基取代的-O苯基，或者W为2,5,二氧代吡咯烷氧基。
47.如权利要求42所述的化合物，其中W为任选地被一个或多个卤代基取代的-O苯基。
48.如权利要求42所述的化合物，其中W为任选地被一个或多个氟取代的-O苯基。
49.如权利要求42所述的化合物，其中W为2,3,5,6,-四氟苯氧基。
50.如权利要求42所述的化合物，其中W为2,5,二氧代吡咯烷氧基。
51. 如权利要求42所述的化合物，其中W为L-X。
52. 如权利要求42或权利要求51所述的化合物，其中L具有下式
-X1-X2-X3-X4-
其中，
X1为键、-N(Ra)-、-N(Ra)-N(Ra)-、-O-、-N-O-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)N(Ra)、C(=S)N(Ra)-、-C(=O)O-、-C(=O)S-、-N(Ra)SO2-、-OC(=O)N(Ra)-、-(Ra)HC(=O)N(Ra)-或-N(Ra)C(=S)N(Ra)-，其中Ra为H或(C1-C6)烷基；
X2为键或具有1至30个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)、-N(Rb)-、二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基置换，其中Rb为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)，并且其中所述二价6元至10元芳基或二价5元至20元杂芳基任选地被一个或多个卤代基或(C1-C6)烷基取代；
X3为键或肽(例如，包含1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的肽)；并且
X4为键或具有1至60个碳原子的二价、支链或无支链、饱和或不饱和烃链，其中所述碳原子中的一个或多个碳原子任选地被(-O-)、(-S-)或-N(Rc)-置换，其中Rc为H或(C1-C6)烷基，其中所述烃链在碳上任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤代基、羟基、巯基、氧代(=O)和硫代(=S)；
其中X1、X2或X3中的至少一者不为键。
53. 如权利要求42、51或52中任一项所述的化合物，其中W选自由以下组成的组：
、
、
、
、
、
、
和
其中：
每个m独立地是1、2、3或4；
每个n1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p1独立地是1、2、3、4、5或6；
每个t独立地是1、2、3或4；
每个n2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个p2独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个q2独立地是1、2、3、4、5或6；
每个s独立地是1、2、3或4；并且
每个AA1和AA2独立地是氨基酸的侧链。
54.如权利要求42、51或52中任一项所述的化合物，其中每个X独立地选自酯、活化酯、卤代乙酰胺、卤代基和二硫烷基杂芳基。
55.如权利要求42、51或52中任一项所述的化合物，其中每个X选自2,3,5,6,-四氟苯氧基羰基、2,5-二氧代吡咯烷基氧基羰基、二硫烷基吡啶基和溴乙酰基。
56.如权利要求42、51或52中任一项所述的化合物，其中每个X选自2,3,5,6,-四氟苯氧基羰基和溴乙酰基。
57. 如权利要求42所述的化合物，其选自由以下组成的组：
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
，和
或其盐。
58. 一种选自由以下组成的组的化合物：
、
、
、
和
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)。
59.如权利要求1至29中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其中p为1、2、3、4、5、6、7或8。
60.如权利要求1至29中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，其包含所述抗体-药物偶联物化合物的混合物，其中抗体-药物偶联物化合物的所述混合物中每个抗体的平均药物载量为约1至约5。
61.一种药物组合物，其包含如权利要求1至29、59或60中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
62.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向所述有需要的患者施用治疗有效量的如权利要求1至29、59或60中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物，或如权利要求61所述的药物组合物。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌和头颈癌。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌、肺腺癌和肺大细胞癌)、胰腺癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌和子宫癌。
65.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述患者具有Trop2阳性肿瘤细胞。
66.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述患者具有包含一个或多个突变的肿瘤细胞，所述一个或多个突变为肿瘤抑制基因中的功能丧失性突变，和/或致癌驱动基因中的功能获得性突变和/或致癌驱动基因的扩增。
67.如权利要求62至66中任一项所述的方法，其中所述患者具有包含选自由以下组成的组的基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞：KRAS、BRAF、EGFR、ERBB2、ERBB3、APC、CNGA2、ARID1A、SLC34A2、ROS1、FGFR3、TACC3、BAIAP2L1、PIK3CA、PIK3R1、BRCA2、PTEN、STK11、CDKN2A、SMAD4、TP53、UGT2B17、SMARCA2和SMARCA4。
68.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个突变包含点突变。
69. 如权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个突变包含选自由以下组成的组的突变：KRas G12V、BRAF G466V、EGFR L861Q、PIK3CA E545K、APC R1450*、PIK3R1 R386fs、PIK3R1 R639ter、TP53 V218、ARID1A L649fs/R693ter和SMARCA4 G1162C。
70.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个突变包含功能获得性突变。
71.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述患者具有包含选自由以下组成的组的基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞：KRAS、BRAF、EGFR、SLC34A2、ROS1、FGFR3、TACC3、BAIAP2L1、PIK3CA、PIK3R1和BRCA2。
72.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个突变包含功能丧失性突变。
73.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中受试者具有包含选自由以下组成的组的基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞：PTEN、STK11、CDKN2A、SMAD4和TP53。
74.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个突变包含两个基因的融合突变。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述一个或多个突变包含选自由以下组成的组的融合突变：SLC34A2-ROS1、FGFR3-TACC3和FGFR3-BAIAP2L1。
76.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个突变包含BRCA缺陷型突变、FGFR3功能获得性突变、TP53功能丧失性突变或SMARCA4功能丧失性突变。
77.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中一个或多个拷贝数变异(CNV)包含PTEN、STK11、CDKN2A、CNGA2、SMAD4、UGT2B17的部分或全部丢失；或者ERBB2、ERBB3、PIK3CA的增益/扩增。
78.如权利要求62至77中任一项所述的方法，其中所述患者具有HPV阳性肿瘤细胞。
79.如权利要求62至77中任一项所述的方法，其中所述患者具有HPV39阳性肿瘤细胞。
80.如权利要求62至79中任一项所述的方法，其中所述患者对护理标准(SOC)疗法无反应。
81.如权利要求62至80中任一项所述的方法，其中所述患者的肿瘤对(例如，在肺腺癌中的)MEK或BET抑制剂疗法、(例如，在NSCLC中的)抗EGFR疗法或多激酶抑制剂疗法(例如，诸如胃癌中的索拉非尼或AZ628抑制剂)具有抗性。
82.一种制品，其包含如权利要求61所述的药物组合物、容器以及指示所述药物组合物能够用于治疗癌症的包装说明书或标签。
83.如权利要求1至29、59或60中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗哺乳动物的癌症的药物中的用途。
84.如权利要求1至29、59或60中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐，其用于癌症的治疗性治疗。
85.如权利要求1至29、59或60中任一项所述的抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐用于医学疗法的用途。
86.一种化合物，其选自由以下组成的组：
其中：
P为胺氮保护基团；
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基或苯基，其中所述苯基任选地被一个或多个卤代基或硝基取代；
或其盐。
87.如权利要求86所述的化合物，其选自由以下组成的组：
或其盐。
88.如权利要求86所述的化合物，其选自由以下组成的组：
或其盐。
89.如权利要求86所述的化合物，其选自由以下组成的组：
或其盐。
90.一种用于制备式8*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式7*化合物：
或其盐转化为所述式8*化合物或其盐。
91.一种用于制备式7*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式6a*化合物：
或其盐转化为所述式7*化合物或其盐，
其中R2为(C1-C6)烷基。
92.如权利要求90所述的方法，其中制备所述式7*化合物或其盐，所述方法包括将对应的式6a*化合物：
或其盐转化为所述式7*化合物或其盐，
其中R2为(C1-C6)烷基。
93.如权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述式6a*化合物为式6*化合物：
或其盐。
94.一种用于制备式6a*化合物：
或其盐的方法，其包括将对应的式5a*化合物：
或其盐转化为所述式6a*化合物或其盐，
其中：
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基；并且
R2为(C1-C6)烷基。
95.如权利要求91或权利要求92所述的方法，其中制备所述式6a*化合物或其盐，所述方法包括将对应的式5a*化合物：
或其盐转化为所述式6化合物或其盐，
其中每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
96.如权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述式6a*化合物为式6*化合物：
或其盐。
97.如权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述式5a*化合物为式5*化合物：
或其盐。
98.如权利要求94或权利要求95所述的方法，其中制备所述式6a*化合物，所述方法包括使所述式5a*化合物或其盐与式Ba*化合物：
或其盐反应，以得到所述式6a*化合物，
其中R2为(C1-C6)烷基。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述式Ba*化合物为式B*化合物：
或其盐。
100.如权利要求96所述的方法，其中制备所述式6*化合物，所述方法包括使所述式5a*化合物或其盐与式B*化合物：
或其盐反应，以得到所述式6*化合物。
101.一种用于制备式5a*化合物：
5a*
或其盐的方法，其包括将对应的式4a*化合物：
4a*
或其盐转化为所述式5a*化合物或其盐，
其中每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
102.如权利要求94或权利要求95所述的方法，其中制备所述式5a*化合物或其盐，所述方法包括将对应的式4a*化合物：
4a*
或其盐转化为所述式5a*化合物或其盐。
103.如权利要求101或权利要求102所述的方法，其中所述式5a*化合物为式5*化合物：
或其盐，并且所述式4a*化合物为式4*化合物：
或其盐。
104.如权利要求101或权利要求102所述的方法，其中制备所述式5a*化合物，所述方法包括使所述式4a*化合物或其盐与下式化合物
A*
或其盐反应，以得到所述式5a*化合物或其盐。
105.如权利要求103所述的方法，其包括使所述式4*化合物或其盐与式A*化合物：
A*
或其盐反应，以得到所述式5*化合物或其盐。
106.一种用于制备式4a*化合物：
4a*
或其盐的方法，其包括将对应的式3a*化合物：
3a*
或其盐转化为所述式4a*化合物或其盐，
其中：
P为胺氮保护基团；并且
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
107.如权利要求101或权利要求102所述的方法，其中制备所述式4a*化合物或其盐，所述方法包括将对应的式3a*化合物：
3a*
或其盐转化为所述式4a*化合物或其盐，
其中P为胺氮保护基团；并且
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
108.如权利要求106或权利要求107所述的方法，其中所述式4a*化合物或其盐为式4*化合物：
或其盐，并且所述式3a*化合物或其盐为式3*化合物：
3*
或其盐。
109.一种用于制备式3a*化合物：
3a*
或其盐的方法，其包括将对应的式2a*化合物：
2a*
或其盐转化为所述式3a*化合物或其盐，
其中：
P为胺氮保护基团；并且
每个R1独立地是(C1-C6)烷基，或者两个R1基团与它们所连接的原子一起形成任选地被一个或多个(C1-C6)烷基取代的杂环基。
110.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中制备所述式3a*化合物或其盐，所述方法包括将对应的式2a*化合物：
2a*
或其盐转化为所述式3a*化合物或其盐，
其中P为胺氮保护基团。
111.如权利要求109或权利要求110所述的方法，其中所述式3a*化合物或其盐为式3*化合物：
3*
或其盐，并且所述式2a*化合物为式2*化合物：
或其盐。
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