BRPI0821949A2

BRPI0821949A2 - Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes, seus usos, seu método de preparação, suas composições farmacêuticas, ácidos nucleicos, células e hibridomas

Info

Publication number: BRPI0821949A2
Application number: BRPI0821949-4A
Authority: BR
Inventors: Dale B. Schenk; Peter A. Seubert; Jonathan Wall; Jose W. Saldanha
Original assignee: Elan Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2008-12-29
Publication date: 2020-12-22
Also published as: MX384227B; EA201790858A3; HK1156365A1; NZ586875A; EP2730659A2; EP2237803A4; EP2237803A2; IL232956A0; CA2710984A1; US20090202432A1; US8404815B2; EA201070812A1; WO2009086539A3; EP3693470A1; US20120189624A1; EA036059B1; KR101603076B1; AU2008345022A1; US20150158937A1; IL206641A0

Abstract

anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes, seus usos, seu método de preparação, suas composições farmacêuticas, ácidos nucleicos, células e hibridomas. a presente invenção refere-se a métodos úteis para efetuar a profilaxia ou o tratamento de amiloidose, incluindo amiloidose aa e amiloidose al, pela administração de peptídeos compreendendo neoepitopos, tais como fragmentos aa de uma região c-terminal de aa, e anticorpos específicos para neoepitopos em de proteínas amiloides agregadas, por exemplo, anticorpos específicos para a região c-terminal de fibrilas aa. anticorpos para inibição de formação e/ou aumento da depuração dos depósitos amiloides em um paciente dessa forma efetuando profilaxia ou tratando a doenças amiloide.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATA- MENTO E PROFILAXIA DE AMILOIDOSE".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS Prioridade é reivindicada sobre o Pedido de Patente Provisória Americana Nº 61/095.932, depositado em 10 de setembro de 2008, e sobre o Pedido de Patente Provisória Americana Nº 61/007.544 depositado em 28 de dezembro de 2007, cada um dos quais é incorporado neste pedido por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO A invenção reside nos campos técnicos de imunologia e medi- cina.

ANTECENDENTES DA INVENÇÃO Amiloidose é um termo geral que descreve diversas doenças caracterizadas pela existência de formas patológicas de proteínas amiloides, muitas vezes envolvendo a deposição extracelular de fibrilas proteicas, que formam "numerosos depósitos amiloides" ou "placas amiloides" que podem ocorrer em sítios locais ou sistematicamente. Estes depósitos ou placas são compostos principalmente de uma proteína ou peptídeo solúvel que ocorre naturalmente, montados em depósitos insolúveis extensos de 10 a 100 um de diâmetro em uma variedade de sítios de tecido. Os depósitos são com- postos geralmente de agregados laterais de fibrilas que têm aproximada- mente 10 a 15 nm de diâmetro. Fibrilas amiloides produzem uma caracterís- tica birrefringência de maçã verde à luz polarizada, quando marcado com o corante Congo Red. Geralmente, a composição fibrilar destes depósitos é uma identificação característica das várias formas da doença amiloide. Os peptídeos ou proteínas que formam os depósitos de placa muitas vezes são produzidos a partir de uma proteína precursora maior. Mais especificamente, a patogênese de agregados amiloides, tais como de- pósitos de fibrila geralmente envolvem a clivagem proteolítica de uma pro- teína precursora "anormal" em fragmentos que agregam-se em folhas É an- tiparalelas dobradas. A composição fibrilar destes depósitos é uma identificação ca-

racterística de várias formas da doença amiloide. Por exemplo, depósitos intracerebrais e cerebrovasculares compostos principalmente de fibrilas do peptídeo beta amiloide (B-AP) são característicos da mal de Alzheimer (tanto formas familiais como esporádicas), peptídeo de proteína amiloide de ilhota (IAPP; amilina) é característico das fibrilas em depósitos amiloides de célula de ilhota pancreática associados com diabetes tipo Il, e B2-microglobulina é um dos principais componentes de depósitos amiloides que se formam como consequência do tratamento de hemodiálise de longo prazo. Mais recente- mente, doenças associadas a príon, tais como doença de Creutzfeld-Jacob, também foram reconhecidas como doenças amiloides.

Em geral, amiloidoses primárias da doença são caracterizadas pela presença de fibrilas de proteína "tipo cadeia leve de amiloide" (tipo AL), como denominadas para a homologia da região N-terminal das fibrilas AL ao fragmento variável da cadeia leve da imunoglobulina (capa ou lambda).

As várias formas de doença foram divididas em classes, a maio- ria com base em se a amiloidose está associada com uma doença sistemá- tica subjacente. Dessa forma, certas desordens são consideradas ser ami- loidoses primárias, nas quais não há nenhuma evidência de doença pré- existente ou coexistente. Em amiloidose secundária ou reativa (tipo AA) ca- racterizada pela presente deposição de fibrilas de proteína A amiloide (AA), há um estado de doença inflamatório ou infeccioso crônico subjacente ou associado.

Amiloidoses heredofamiliais podem ter associadas depósitos neuropáticos, renais, ou cardiovasculares do tipo de transtiretina ATTR. Ou- tras amiloidoses heredofamiliais incluem outras síndromes e podem ter componentes amiloides diferentes (por exemplo, Febre mediterrânea famiílial que é caracterizada por fibrilas AA). Outras formas de amiloidose incluem formas locais, caracterizadas por depósitos focais, muitas vezes similares a tumor que ocorrem em órgãos isolados. Outras amiloidoses são associadas como envelhecimento, e são comumente caracterizadas pela formação de placa no coração ou cérebro. Também são comuns depósitos amiloides as- sociados com hemodiálise de longo prazo. Estas e outras formas da doença amiloide são resumidas na Tabela 1 (Tan, S.Y. and Pepys, Histopathology 25:403-414, 1994; Harrison's Handbook of Internal Medicine, 13!" Ed,, Issel- bacher, K.J. et al, eds, McGraw-Hill, San Francisco, 1995) e são descritos nas Patentes Americanas Nºº 6.875.434, 6.890.535, 6.913.745, 6.923.964, e

6.936.246, que são incorporados por referência neste pedido em sua totali- dade. Tabela 1 Proteína/ Proteína Proteínas Vari- | Clínica Peptídeo Precursora antes Amiloide AA Proteína Ami- Amiloidose Reativa (se- loide A Sérica cundária): (ApoSSA) Febre Mediterrânea Fa- milial Neuropatia amiloide fa- milial com urticária e surdez (Síndrome de (Muckle-Wells) AA Proteína Ami- Amiloidose reativa sis- loide A Sérica têmica associada com (ApoSSA) doenças — inflamatórias sistêmicas AL Cadeias leves de [AkK, A, (por|Amiloidose Idiopática imunoglobulina exemplo, AKklIll) | (primária): associada a monoclo- mieloma ou macroglo- nal(capa, lamb- bulinemia; amiloidose da) sistêmica associada com discrasia imunocí- tica; gamopatia mono- clonal; discrasia oculta, amiloidose nodular local associada com doenças inflamatórias crônicas AH 196 (1(71)) Avi Amiloidose de cadeia pesada associada com diversas discrasias ATTR Transtiretina Pelo menos 30 | Poloneuropatia amiloide (TTR) mutações pon- |familial (por exemplo, tuais co- | Met 30, Portuguesa) nhecidas ATTR Transtiretina por exemplo, | Cardiopatia amiloide (TTR) Met 111 famiílial (Dinamarquesa)

(TTR) ou Ile 122 mica

AapoAl ApoAl Arg 26 Polineuropatia amiloide familial

Agel Gelsolina Asn 187 Amiloidose famiílial (Fin-

landesa)

Acys Cistatina C Gln 68 Hemorragia cerebral he-

reditária com amiloidose (Islandesa)

AB Precursor de | Diversos: Gln | Mal de Alzheimer proteína amiloide | 618, Síndrome de Down B (por exemplo, Hemorragia cerebral he- B-APP695) reditária com amiloidose

(Holandesa)

Angiopatia amiloide ce- rebral esporádica Miosite por corpúsculo de inclusão

AB2oM Betar —microglo- Associada com hemodi- bulina álise crônica

Acal (Pro)calcitonin (Pró)calcitonina | Carcinoma medular de tireoide

AANF Fator natriurético Amiloidoses Senis Fo-

AB atrial cais:

Proteína precur- Amiloide atrial isolada

SVEP? sora B-amiloide Cérebro

AB2oM 7 Betar —microglo- Vesículas seminais bulina Próstata Queratina Amiloide cutânea primá-

ria localizada (macular, papular) Proteína —precir- | Proteína de | Doença esporádica de sora de príon| scrapie Creutzfeldt-Jacob (forma celular de | 27 a 30 kDa Doença Kuru (encefalo- 33 a 35 kDa) patias espongiformes transmissíveis, doenças de príon)

AIAPP Polipeptídeo Ilhotas de Langerhans amiloide de ilho- Diabetes tipo Il, Insuli- ta (IAPP) noma

Hormônios, | por exemplo, Amiloidose exócrina,

fragmentos | pré-calcitonina associada com APU-

peptídicos Domas aProteína exócrina de vesícula seminal Muitas vezes, fibrilas formando a maioria de um depósito ami- loide são derivadas de uma ou mais proteínas ou peptídeos precursores primárioss, e associados normalmente com glicoaminoglicanos sulfatados. 5 Além disso, depósitos amiloides podem incluir proteínas e peptídeos meno- res de vários tipos, junto com outros componentes, tais como proteoglicanos, gangliosídeos e outros açúcares, como descrito em mais detalhes nas se- ções que seguem.

Fibrilas AA são compostas de fragmentos peptídicos que variam de tamanho, mas têm geralmente aproximadamente 8000 daltons (peptídeo ou proteína AA) formadas pela clivagem proteolítica da proteína amiloide A sérica (SSA), uma apolipoproteína circulante que está presente em partícu- las HDL e que é sintetizada em hepatócitos em resposta a tais citocinas co- mo interleucina (IL)-1 e IL-6, bem como fator de necrose tumoral a.

Ver Husby,G.etal.

Amyloid 1, 119-137 (1994). A clivagem proteolítica resulta na deposição patológica de dois terços do N-terminal de —76 resíduos de uma proteína SAA.

Em humanos, a concentração plasmática de SAA normal- mente é -0,1 mg/ml mas pode aumentar acima de 1.000 vezes em resposta a um estímulo inflamatório.

Como parte deste processo, a molécula SAA sofre proteólise e o produto de clivagem N-terminal é depositado sistemica- mente como fibrilas AA em órgãos vitais, incluindo fígado, baço, rins, e glân- dulas adrenais.

A deposição é também comum no coração e trato gastrin- testinal.

Geralmente, amiloidose AA é uma manifestação de doenças que provocam uma resposta de fase aguda sustentada.

Tais doenças incluem desordens inflamatórias crônicas, infecções microbianas locais ou sistêmicas crônicas e neoplasias malignas.

Doenças amiloides AA incluem, mas não são limitadas a doenças inflamatórias, tais como artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondilite anquilosante, psoríase, artropatia psoriática, sín- drome de Reiter, doença de Still do Adulto, síndrome de Behcet e doença de Crohn.

Depósitos de AA também são produzidos em consequência de infec- ções microbianas crônicas, tais como lepra, tuberculose, bronquiectasia, úl-

ceras de decúbito, polinefrite crônica, osteomielite e doença de Whipple. Certas neoplasias malignas também podem resultar em depósitos amiloides de fibrila AA. Estas incluem condições, tais como linfoma de Hodgkin, carci- noma renal, carcinomas de intestino, pulmão e trato urogenital, carcinoma de célula basal, e leucemia de célula cabeluda. Doença amiloide AA também pode resultar de doenças inflamatórias herdadas, tais como Febre Mediter- rânea Familial. Adicionalmente, doença amiloide AA pode resultar de desor- dens linfoproliferativas, tais como Doença de Castleman. Amiloidose AA é insidiosa e progressiva. Sintomas são geral- mente apresentados em estágios tardios da doença. Frequentemente o pa- ciente não é diagnosticado até que dano significativo ao órgão tenha ocorri- do. Fibrilas AA são depositadas em órgãos vitais levando a disfunção do ór- gão e posteriormente à morte. A taxa de sobrevida em cinco anos é 45 a 50%. A sobrevida mediana após diagnóstico é 4 a 8 anos. Doença Renal em estágio terminal é a causa da morte em 40 a 60% de casos. Ver Gillmore J.D. et al., Lancet 358:24-9 (2001). Atualmente, não há nenhum tratamento específico, direcionado a amiloide aprovado para nenhuma das doenças amiloides, incluindo Amiloi- dose AA. Ver Gillmore J.D. et al., Lancet 358:24-9 (2001). Onde há um esta- do de doença subjacente ou associado, terapia direcionada em direção à redução da produção da proteína amiloidogênica pelo tratamento da doença subjacente. Por exemplo, estratégia de tratamento corrente da Amiloidose AA é visar a inflamação subjacente, reduzindo níveis de ADoSSA abaixo de 10mg/l. Terapias atualmente empregadas incluem quimioterapia (clorambucil eMTX), imunossupressores (azatioprina), fármacos anti-inflamatórios (col- chicina) e inibidores de TNF. A invenção dessa forma cumpre uma necessi- dade existente há muito tempo de regimes terapêuticos para prevenir ou me- lhorar os efeitos de Amiloidose AA.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um anticorpo humano, humaniza- do, ou quimérico isolado, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A humano, por exemplo, um epitopo nos resíduos 70 a 76 da SEQ ID Nº: 2 ou um epitopo compreendendo resíduos apresentados como SEQ ID Nºs: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Anticorpos ou fragmentos de ligação a antí- geno da invenção incluem aqueles que competem pela ligação ao peptídeo amiloide A humano com o anticorpo 2A4 produzido pelo Número de acesso no ATCC — — oucomo anticorpo 7D8 produzido pelo Número de acesso noATCC — Anticorpos adicionais da invenção competem pela ligação ao peptídeo amiloide A humano com um anticorpo tendo uma região variável da cadeia leve apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou re- síduos 20 a 131 da 153 e uma região variável da cadeia pesada apresenta- da como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154.

Os anticorpos revelados incluem versões humanizadas e quimé- ricas do anticorpo 2A4 produzido pelo Número de acesso no ATOC— ou uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 7D8 produzido pelo Nú- merodeacessonoATCC = Por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno re- presentativos compreendem uma região variável da cadeia leve compreen- dendo uma ou mais regiões de complementaridade de uma região variável da cadeia leve de 2A4 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Ne: 152 0uuma ou mais regiões de complementaridade de uma região variável da cadeia leve de 7D8 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº:

153. Como outro exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno representativos compreendem uma região variável da cadeia leve compre- endendo duas regiões de complementaridade de uma região variável da ca- deialeve de 2A4 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou duas regiões de complementaridade de uma região variável da cadeia leve de 7D8 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153. Anti- corpos e fragmentos de ligação a antígeno representativos adicionais com- preendem uma região variável da cadeia leve compreendendo três regiões de complementaridade de uma região variável da cadeia leve de 2A4 apre- sentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou três regiões de com- plementaridade de uma região variável da cadeia leve de 7D8 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153. Versões humanizadas repre- sentativas de um anticorpo 2A4 ou 7D8 compreende pelo menos um resíduo de região conservada da cadeia leve selecionado a partir do grupo consis- tindo em L87 e L90 (convenção de numeração Kabat), que é ocupado por Y erF, respectivamente, e em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana.

Anticorpos e fragmentos de liga- ção a antígeno representativos compreendem pelo menos um resíduo de região conservada da cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em+7,+14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, + 92 e +109 (numeração linear), que é ocupado por T, S, L, D, Q, K, Y, L, Fe L, respectivamente, e em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo corres- pondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana.

Por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno repre- sentativos compreendem pelo menos um resíduo de região conservada da cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em +75 e +92 (nume- ração linear), que é ocupado por Y e F, respectivamente, e em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana.

Em outros anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno representativos da invenção, a região variável da cadeia leve compreende um resíduo de região conservada em +105 (numeração linear) ocupado por Q.

Por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno da invenção incluem aqueles compreendendo uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +7 (numeração linear) ocupado por T, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de liga- ção a antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +14 (numeração linear) ocupado por S, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia leve que compreende um resíduo de região con- servada em +15 (numeração linear) ocupado por L, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticor- pos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +17 (numeração linear) ocupado por D, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de liga- ção a antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +18 (numeração linear) ocupado por OQ,

em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conser-

vada em +50 (numeração linear) ocupado por K, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticor-

pos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia leve que compreende um resíduo de região conservada em +75 (numeração linear) ocupado por Y, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de liga-

çãoa antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +88 (numeração linear) ocupado por L, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo cor- respondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina acep-

tora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +92 (numeração linear) ocupado por F, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +109 (numeração linear) ocupado por L, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana; e anticorpos e fragmentos de liga- ção a antígeno de uma região variável da cadeia leve compreendendo um resíduo de região conservada em +105 (numeração linear) ocupado por Q, em que o resto da região variável da cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana.

Regiões variáveis da cadeia leve da imunoglobulina aceptora humana usadas na invenção incluem a região variável da cadeia leve capa subgrupo 2 humana (convenção Kabat), por exemplo, região variável da ca- deialeve subgrupo 2 humana da linhagem germinativa humana VKIIA19/A3, tal como região variável da cadeia leve VKk humana compreendendo uma sequência apresentada como SEQ ID NO: 166 ou 167. Em aspectos particu- lares da invenção, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno compreen- dem uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152, resí- duos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153, ou apresentadas como SEQ ID Nº: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 ou 176.

Anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno representativos da invenção também incluem aqueles compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma ou mais regiões de complementari- dade de uma região variável da cadeia pesada de 2A4 apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada compreendendo duas regiões de complementaridade de uma região variável da cadeia pesada de 2A4 apresentada como resíduos 20 a 138daSEQID Nº: 154, ou uma região variável da cadeia pesada compre- endendo três regiões de complementaridade de uma região variável da ca- deia pesada de 2A4 apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nºe:

E

154. Anticorpos 2A4 e 7D8 e fragmentos de ligação a antígeno humanizados representativos compreendem pelo menos um resíduo de região conservada da cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em H37, H49, H70 e H93 (convenção de numeração Kabat), que é ocupado por |, A, F ou V,respectivamente, e em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana. Anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno humanizados representativos compreendem pelo menos um resíduo de região conservada da cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em +10, +15, +19, +37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99, +119 (numeração linear), que é ocupado por R K K, 1, A,F,Q,S, M, N, M, V ou A, respectivamente, e em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana. Por exem- plo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno humanizados representa- tivos compreendem pelo menos um resíduo de região conservada da cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em +37, +49, +73 e +99 (numeração linear), que é ocupado por |, A, F ou V, respectivamente, e em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana.

Por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno da invenção incluem aqueles compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conservada em +10 (numera- çãolinear) ocupado por R, em que o resto da região variável da cadeia pe- sada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreen- dendo um resíduo de região conservada em +15 (numeração linear) ocupa- doporK,em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antí-

geno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conservada em +19 (numeração linear) ocupado por K, em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo corres- pondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina acep-

tora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conserva-

da em +37 (numeração linear) ocupado por |, em que o resto da região vari-

ável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anti-

corpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conservada em +49 (numera-

ção linear) ocupado por A, em que o resto da região variável da cadeia pe-

sada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreen- dendo um resíduo de região conservada em +73 (numeração linear) ocupa-

do por F, em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antí-

geno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conservada em +78 (numeração linear) ocupado por Q, em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo corres- pondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina acep-

tora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conserva- da em +79 (numeração linear) ocupado por S, em que o resto da região va- riável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anti- corpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conservada em +80 (numera- ção linear) ocupado por M, em que o resto da região variável da cadeia pe-

sada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreen- dendo um resíduo de região conservada em +87 (numeração linear) ocupa- do por N, em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antí- geno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conservada em +95 (numeração linear) ocupado por M, em que o resto da região variável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo corres- —pondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina acep- tora humana; anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conserva- da em +99 (numeração linear) ocupado por V, em que o resto da região va- riável da cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana; e anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de uma região variável da cadeia pesada compreendendo um resíduo de região conservada em +109 (numeração linear) ocupado por A, em que o resto da região variável da ca- deia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região vari-

ávelda cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana.

Regiões variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina aceptora humana incluem uma região variável da cadeia pesada gama subgrupo 3 humana (convenção Kabat), por exemplo, região variável da cadeia pesada gama subgrupo 3 humana compreendendo uma sequência apresentada co- —moSEQID Nº 165, tal como uma região variável da cadeia pesada com- preendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154 ou apresentada como SEQ ID Nº: 161, 162 ou 163. Anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno representativos adicionais compreendem uma região variável da cadeia leve compreenden- dotrêsregiões de determinação de complementaridade de uma região vari- ável da cadeia leve de 2A4 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou três regiões de complementaridade de uma região variável da cadeia leve de 7D8 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo três regiões de complementaridade de uma região variável da cadeia pesada de 2A4 apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154. Por exemplo, tais anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno incluem aqueles tendo uma região variável da cadeia leve compreendendo três regiões de determinação de complementaridade apresentadas como SEQ ID Nºs: 168, 169 e 170, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo três regiões de com- plementaridade apresentadas como SEQ ID Nº: 171, 172 e 173. Como ou- tro exemplo, tais anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno incluem aqueles tendo uma região variável da cadeia leve compreendendo três regi- ões de determinação de complementaridade apresentadas como SEQ ID Nº: 177, 169 e 170, e uma região variável da cadeia pesada compreenden- do três regiões de complementaridade apresentadas como SEQ ID Nº*: 171,

1726173. Como outro exemplo, tais anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno incluem aqueles compreendendo uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou como resíduos 20 a 131 da SEQID Nº: 153, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154. Como outro exemplo, tais anticorpos e fragmentos de ligação a an- tígeno incluem aqueles tendo uma região variável da cadeia leve compreen- dendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175 ou 176, e região variável da cadeia pesa- da compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161, 162 ou 163.

Em aspectos particulares da invenção, um anticorpo ou fragmen- to de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº 155,e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161; uma região va- riável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apre-

sentada como SEQ ID Nº: 155, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID

Nº: 162; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 155, e uma região variável da cadeiapesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresen- tada como SEQ ID Nº: 163; uma região variável da cadeia leve compreen- dendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 156, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161; uma região variável da ca-

deialeve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada co- mo SEQ ID Nº: 156, e uma região variável da cadeia pesada compreenden-

do uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 162; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoáci-

dos apresentada como SEQ ID Nº: 156, e uma região variável da cadeia pe-

sada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 157, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 157, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 162; uma região va- riável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apre- sentada como SEQ ID Nº: 157, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 158, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresen-

tada como SEQ ID Nº: 161; uma região variável da cadeia leve compreen-

—dendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 158, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 162; uma região variável da ca-

deia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada co-

mo SEQ ID Nº: 158, e uma região variável da cadeia pesada compreenden-

do uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoáci-

dos apresentada como SEQ ID Nº: 159, e uma região variável da cadeia pe- sada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 159, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 162; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID

Nº: 159, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163; uma região va- riável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apre-

sentada como SEQ ID Nº: 160, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID

Nº: 161; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 160, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresen-

tada como SEQ ID Nº: 162; uma região variável da cadeia leve compreen- dendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 160, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163; SEQ ID Nº: 174, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de amino-

ácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 174, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 162; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoáci-

dos apresentada como SEQ ID Nº: 174, e uma região variável da cadeia pe- sada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 175, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº 175,e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 162; uma região va- riável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apre- sentada como SEQ ID Nº: 175, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº 163; uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 176, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresen- tada como SEQ ID Nº: 161; uma região variável da cadeia leve compreen- dendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 176, e uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 162; ou uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 176, e uma região variável da cadeia pesada compreen- dendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163. Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam um anticorpo humano, humanizado ou quimérico, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A humano, incluindo tais anticorpos e fragmen- tos de ligação a antígeno como descrito neste pedido acima e como apre- sentados nas reivindicações. Ainda são fornecidas células expressando tais ácidos nucleicos.

Em outros aspectos, a presente invenção fornece um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especifi- camente a um epitopo compreendendo X:-EDX2 em um agregado de proteína amiloide, em que X' e X2> são qualquer aminoácido. Tais anticorpos e frag- mentos de ligação a antígeno incluem anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos, e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo,

aqueles que se ligam especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A humano.

Anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno representativos adicionais incluem aqueles em que X: é H, T, FE, S, PA LC, Q,R E, K,D, GV,Y, louW,eemqueXéT,S,E,RI,)V,F,D,A,G, ML N,P,C,K,Y, ou Q; ou X1 é H, T, FE, S, P, ou A e em que X2 é T, S, E, RI, V, FE, Dou A; ou X1 é H, T, Fou A; ou Xc é T, S, E, D ou A; ou X1 é H, T, F, ou A e X2 são T, S, E, D ou A; ou X1 é H, Tou A e Xe são T, S, E ou A; ou Kré Hou A e Xp é T, Sou A; ou Xré He X é Tou A; ou XrÉé Ae Xc2 É S, TT, EouV;ou XxX é Ae X2éS TouE ouXxéTeXéE ouXéFeXxéD ouXxéSeXéE,F ou A; ou Xré Pe X2c é E, l ou F.

Por exemplo, tais anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno ligam-se a um epitopo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT (SEQ ID Nº: 3), HEDT (SEQ ID Nº: 12), AEDS (SEQ ID Nº: 13), AEDT (SEQ ID Nº: 14), HEDA (SEQ ID Nº: 15), TEDE (SEQ ID Nº: 16), FEDD (SEQ ID Nº: 17), SEDE (SEQ ID Nº: 18), AEDE (SEQ ID Nº: 19), PEDE (SEQ ID Nº: 20), PE- DI (SEQ ID Nº: 21), PEDF (SEQ ID Nº: 22), AEDV (SEQ ID Nº: 23), SEDF (SEQ ID Nº: 24) e SEDA (SEQ ID Nº: 25); ou um epitopo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT (SEQ ID Nº: 3), HEDT (SEQ ID Nº: 12), AEDS (SEQ ID Nº: 13), AEDT (SEQ ID Nº: 14), HEDA (SEQ ID Nº: 15), TEDE (SEQ ID Nº: 16), FEDD (SEQ ID Nº: 17), SEDE (SEQ ID Nº: 18), AEDE (SEQ ID Nº: 19), PE- DE (SEQ ID Nº: 20), PEDI (SEQ ID Nº: 21), PEDF (SEQ ID Nº: 22), SEDF (SEQ ID Nº: 24) e SEDA (SEQ ID Nº: 25); ou um epitopo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT (SEQ ID Nº: 3), HEDT (SEQ ID Nº: 12), AEDS (SEQ ID Nº: 13), AEDT (SEQ ID Nº: 14), HEDA (SEQ ID Nº: 15) e TEDE (SEQ ID Nº: 16). Os epitopos revelados podem ser encontrados em um agregado de proteína amiloide, por exemplo, um epitopo compreendendo uma sequência de ami- —noácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHGAEDS (SEQ ID Nº: 4), GHDAEDS (SEQ ID Nº: 5), GDHAEDS (SEQ ID Nº: 7), STVIEDS (SEQ ID Nº: 8) e GRGHEDT (SEQ ID Nº: 9); ou um epitopo compreendendo uma sequência de aminoácidos GHGAEDS (SEQ ID Nº:4); ou um epitopo compreendendo aminoácidos HEDT (SEQ ID Nº: 12); ou um epitopo com- preendendo aminoácidos HEDA (SEQ ID Nº: 15); ou um epitopo compreen- dendo aminoácidos AEDS (SEQ ID Nº: 13) ou um epitopo compreendendo aminoácidos AEDT (SEQ ID Nº: 14); ou um epitopo compreendendo amino- ácidos TEDE (SEQ ID Nº: 16); ou um epitopo compreendendo a sequência de aminoácidos AEDV (SEQ ID Nº: 23); ou um epitopo compreendendo a sequência de aminoácidos SEDF (SEQ ID Nº: 24) ou PEDF (SEQ ID Nº: 22); ou um epitopo compreendendo uma sequência amino selecionada a partir do grupo consistindo em PEDS (SEQ ID Nº: 26), PEDL (SEQ ID Nº: 27), TEDV (SEQ ID Nº: 28), AEDE (SEQ ID Nº: 19), SEDI (SEQ ID Nº: 29) e TEDT (SEQ ID Nº: 30); ou um epitopo compreendendo uma sequência ami- no selecionada a partir do grupo consistindo em LEDG (SEQ ID Nº: 31), AEDM (SEQ ID Nº: 32), HEDS (SEQ ID Nº: 33), CEDD (SEQ ID Nº: 34), QEDS (SEQ ID Nº: 35), REDS (SEQ ID Nº: 36), TEDG (SEQ ID Nº: 16), QEDR (SEQ ID Nº: 38), TEDL (SEQ ID Nº: 39), PEDN (SEQ ID Nº: 40), EEDP (SEQ ID Nº: 41), LEDL (SEQ ID Nº: 42), KEDA (SEQ ID Nº: 43), SEDC (SEQ ID Nº: 44), EEDD (SEQ ID Nº: 45), SEDK (SEQ ID Nº: 46), DEDD (SEQ ID Nº: 47), DEDG (SEQ ID Nº: 13), LEDE (SEQ ID Nº: 49), GEDA(SEQID Nº: 13), VEDF (SEQ ID Nº: 51), YEDE (SEQ ID Nºe: 52), IEDL (SEQ ID Nº: 53), WEDY (SEQ ID Nº: 54), DEDW (SEQ ID Nº: 55), SEDL (SEQ ID Nº: 56), YEDO (SEQ ID Nº: 57), LEDW (SEQ ID Nº: 58), YEDR

(SEQ ID Nº: 59) e PEDK (SEQ ID Nº: 60). Os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno descritos nes- te pedido incluem aqueles que se ligam à proteína amiloide em forma mo- nomérica com uma afinidade de menos de aproximadamente 107 M.

Prote- íÍnas amiloides representativas incluem a proteína amiloide A sérica (SAA), proteína da cadeia leve da imunoglobulina (tal como VA6 Wil e VK, polipeptí- deo precursor amiloide de ilhota humana (IAPP), peptídeo amiloide beta,

transtiretina (TTR) e ApoA1. Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se ligam especificamente a um epitopo compreendendo X:EDX2 em um agregado de proteína amiloide, em que X: e X2 são qualquer aminoácido, incluindo todos tais anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno como descrito neste pe- dido acima e como apresentados nas reivindicações. Além disso são forne- cidas células que expressam tais ácidos nucleicos.

A presente invenção fornece ainda métodos para tratar terapeu- ticamente ou tratar profilaticamente um indivíduo tendo amiloidose AA usan- do um anticorpo humano, humanizado ou quimérico, ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A humano, por exemplo, um epitopo nos resíduos 70 a 76 da SEQ ID Nº: 2. Indivíduos que podem beneficiar-se dos métodos terapêuticos revelados de tratamento da amiloidose AA inclu- em aqueles indivíduos que sofrem de uma doença amiloide selecionada a partir do grupo consistindo em artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, es- pondilite anquilosante, psoríase, artropatia psoriática, síndrome de Reiter, doença de Still do Adulto, síndrome de Behcet, doença de Crohn, lepra, tu- berculose, bronquiectasia, úlceras de decúbito, polinefrite crônica, osteomie- lite, doença de Whipple, linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intestino, pulmão e trato urogenital, carcinoma de célula basal, leucemia de célula cabeluda, Febre Mediterrânea Famiílial e Doença de Castleman. Indi- víduos que podem beneficiar-se dos métodos profiláticos revelados incluem aqueles indivíduos suscetíveis a ou em risco de desenvolver alguma das desordens precedentes.

Também são fornecidos métodos para tratar terapeuticamente outratar profilaticamente um indivíduo tendo amiloidose associada com um agregado de proteína amiloide compreendendo a sequência de aminoácidos ED usando um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga es- pecificamente a um epitopo compreendendo X:EDX2> em um agregado de proteína amiloide, em que X: e X2 são qualquer aminoácido. Indivíduos que podem beneficiar-se dos métodos terapêuticos revelados de tratamento da amiloidose associada com um agregado de proteína amiloide incluem aque- les indivíduos sofrendo de amiloidose AA, amiloidose AL, mal de Alzheimer,

Déficit Cognitivo Brando, polineuropatia amiloide, febre Mediterrânea, sín- drome de Muckle-Wells, amiloidose sistêmica reativa associada com doen- ças inflamatórias sistêmicas, mieloma ou macroglobulinemia associada à amiloidose, amiloidose associada à discrasia de imunócito, gamopatia mo- noclonal, discrasia oculta, e amiloidose nodular local associada com doen- ças inflamatórias crônicas.

Indivíduos que podem beneficiar-se dos métodos profiláticos revelados incluem aqueles indivíduos suscetíveis a ou em risco de desenvolver alguma das desordens precedentes.

Em um aspecto da in- venção, a proteína amiloide compreende a sequência AEDV (SEQ ID Nº: 23),eadoença amiloidogênica tratada terapeuticamente ou profilaticamente usando os métodos revelados é amiloidose AA, amiloidose AL, polineuropa- tia amiloide, febre Mediterrânea, síndrome de Muckle-Wells, amiloidose sis- têmica reativa associada com doenças inflamatórias sistêmicas, mieloma ou macroglobulinemia associada com amiloidose, amiloidose associada com discrasia de imunócito, gamopatia monoclonal, discrasia oculta, e amiloidose nodular local associada com doenças inflamatórias crônicas.

Os métodos terapêuticos e profiláticos revelados são úteis para tratar indivíduos humanos.

Índices representativos do tratamento terapêutico eficaz incluem aredução de velocidade da progressão de amiloidose, inibição da deposição de agregados amiloides fibrilares, e/ou depuração de agregados amiloides fibrilares.

Índices representativos de tratamento profilático eficaz incluem retardo do início de um risco de amiloidose e/ou redução da amiloidose.

Ainda são fornecidos métodos de detecção de um depósito ami- —loide associado com amiloidose AA em um indivíduo com anticorpo humano, humanizado, ou quimérico, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A humano, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno o qual está ligado a uma marcação detectável, e então detecção da marcação de- tectável no indivíduo.

Os métodos adicionais compreendem a detecção de um agregado de proteína amiloide compreendendo a sequência de aminoá- cidos ED usando um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente a um epitopo compreendendo X:EDX>2 em um agregado de proteína amiloide, em que X: e X2 são qualquer aminoácido. Os métodos de detecção precedentes podem ser usados, por exemplo, para monitorar o início ou progressão da doença ou terapia em alguma das doenças e desor- dens acima observadas. Quanto aos métodos de tratamento revelados neste pedido, tal monitoramento pode ser realizado em humanos bem como indiví- duos não humanos. Marcações detectáveis úteis incluem radiomarcações, tais como 1?l. Na execução de tais métodos de detecção, a etapa de detec- ção da marcação detectável pode ser realizada por técnicas não invasivas, tais como visualização de SPECT/CT e espectroscopia por RMN. Ainda são fornecidos métodos de imunoterapia ativa de um indivíduo tendo amiloidose AA usando um agente que induz uma resposta imune a resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A eficaz para induzir uma resposta imune compreendendo anticorpos contra resíduos 70 a 76 de um peptídeo amiloide A. Agentes re- presentativos para induzir a resposta imune incluem resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A ou um subfragmento de pelo menos 3 resíduos contí- guos do mesmo tendo menos de 20 aminoácidos contíguos de um peptídeo AA. Estes métodos são úteis tanto terapeuticamente como profilaticamente para o tratamento dos indivíduos descritos neste pedido acima com respeito àimunoterapia passiva, isto é, pela administração de um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno que se liga especificamente a resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide A. Os índices de eficácia terapêutica e profilática tam- bém são como observados neste pedido acima com respeito à imunoterapia passiva. O precedente resume aspectos particulares da invenção, e os aspectos adicionais da invenção são descritos neste pedido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1: Alinhamento de sequência de SAAM1 humana, SAA2 humanao, SAA3 humana e SAM humana. Figura 2: Alinhamento de sequência de SAA1 humana e AA1 humana. Figura 3: Alinhamento de sequência de SAA2 humana e AA2 humana.

Figura 4: Alinhamento t de sequência de SAA3 humana e AA3 humana.

Figura 5: Alinhamento de sequência de SAM4 humana e AA4 hHumana.

Figura 6: Alinhamento de sequência de AM1 humana, AA2 hu- mana, AA3 humana e AA4 humana.

Figura 7: Alinhamento de sequência dos últimos sete resíduos de AA1 humana, AA2 hHumana, AA3 humana e AA4 humana.

Figura 8: Alinhamento de sequência de SAA1 de camundongo, SAA2 de camundongo, SAA3 de camundongo e SAA4 de camundongo.

Figura 9: Alinhamento de sequência de SAA1 de camundongo e AA1 de camundongo.

Figura 10: Alinhamento de sequência de SAA2 de camundongo eAA2 de camundongo.

Figura 11: Alinhamento de sequência de SAA3 de camundongo e AA3 de camundongo.

Figura 12: Alinhamento de sequência de SAA4 de camundongo e AA4 de cCamundongo.

Figura 13: Alinhamento de sequência de AA1 de camundongo, AA2 de camundongo, AA3 de camundongo, AA4 de camundongo.

Figura 14: Alinhamento de sequência dos últimos sete resíduos de AA1I de camundongo, AA2 de camundongo, AA3 de camundongo, AA4 de camundongo.

Figura 15: Alinhamento de sequência de SAM1 humana e SAA1 de camundongo.

Figura 16: Alinhamento de sequência de AAM1 humana e AA1 de camundongo.

Figura 17: Alinhamento de sequência de SAA1 humana e Frag- —mentode SAA1 de camundongo.

Figura 18: Alinhamento de sequência SAA1 alfa humana, SAA1 beta humana e SAA1 gama humana.

Figura 19: Alinhamento de sequência de SAA2 alfa humana e SAA2 beta humana.

Figura 20: Comparação de sequência de proteínas SAA. A regi- ão peptídica usada para gerar 2A4, 8G9 e 7D8 é mostrada em linhas trace- jadas. A inserção de 8 aminoácidos entre as posições 67 e 68 na sequência de Shar Pei é indicada pelo sublinhado e flecha. O alinhamento executado com CLUSTALW.

Figura 21: Sequências de linhagem germinativa de cadeias leves VK.

Figura 22: Sequências de linhagem germinativa de cadeias leves VA.

Figura 23: Sequência de aminoácidos de VA6 Wil.

Figura 24: Cristal de raio X de VA6 Wil mostrando posição de Glu50-Asp51.

Figura 25: Cristal de raio X de VA6 Wil mostrando posição de Glu81-Asp82 Figura 26: Cinética de ligação de mAbs Elan a fibrilas VA6 Wil sintéticas. Medidas de BlAcore da interação de mAbs 2A4, 7D8 e 8G9 em 6,6 nM a fibrilas VA6 Wil imobilizadas. O KD calculado de cada interação foi -1nNM.

Figura 27: Cinética de ligação dependente da concentração de mAb 7DB8 a fibrilas VA6 Wil sintéticas. A interação de anticorpo em uma con- centração de 6,6 a 33,3 nM a fibrilas VA6 Wil imobilizadas foi medida por BlAcore.

Figura 28: Cinética de ligação de mAb 7D8 a fibrilas VA6 Wil sin- téticas na presença dos peptídeos p39 e p41. A interação do mAb 7D8 em 6,6 nM com fibrilas VA6 Wil imobilizadas foi medida por BlAcore na presença de peptídeos p39 e p41 em 1 ou 20 ug/mL.

Figura 29: Reatividade de anticorpos monoclonais com depósi- tos amiloides teciduais ALA.

Figura 30: Biodistribuição de mAb 7D8 marcado com *?*| em camundongos carregando um amiloidoma ALA humano.

Figura 31: Interação de anti-ANA de sobrenadantes de cultura com fibrilas AA derivadas de murino. Resultados da ligação a AEF AA muri- na ao mAb dos sobrenadantes da cultura. Painéis superiores e inferiores são dados sobre a primeira e segunda coleta de fluido de cultura, respectivamen- te Figura 32: Análise por SDS-PAGE de mAbs 2A4, 8G9 e 7D8 purificados por proteína A.

Figura 33: Ligação de mAbs purificados ao peptídeo de imuniza- ção (p nº39) e controle (p nº41).

Figura 34: Ligação a extrato amiloide AA murino (AEF).

Figura 35: Ligação de mAbs purificados a extrato amiloide AA renal humano.

Figuras 36A-36E: Sequências das regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada de 2A4, 7D8 e 8G9 murinos (figura 36A); sequências deregiões variáveis de cadeia leve de 2A4/8G9 e 7D8 humanizados (figuras 36B a 36C); sequências das regiões variáveis da cadeia leve humana usa- das como regiões conservadas aceptoras (figura 36D); sequências de regi- ões variáveis da cadeia pesada de 2A4/7D8/8G9 humanizados e região va- riável da cadeia pesada humana usada como região conservada aceptora (figura 36E). Sublinhadas, CDRs; duplamente sublinhadas, sequências líder; minúsculas, retromutações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epitopo incluin- doXEDX:zem um agregado de proteína amiloide, em que X1: e X2 são qual- quer aminoácido.

Anticorpos representativos da invenção também incluem anti- corpos ou fragmentos dos mesmos que (a) competem por ligação a um epi- topo incluindo XtEDX2 com um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9; (b) ligam-se ao —mesmo epitopo incluindo XtEDX2 como um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9; (c) incluem um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9; ou (d) incluem as seis regiões de determinação de complementaridade

(CDRs) de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9.

A invenção também fornece uma região variável de anticorpo isolada incluindo (a) uma região variável da cadeia leve de um anticorpo de- rivado de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9; ou (b) uma região variável da ca- deiapesada de um anticorpo derivado de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9.

A invenção também fornece um ácido nucleico isolado que codi- fica uma região variável da cadeia leve ou região variável da cadeia pesada de anticorpo incluindo (a) uma sequência nucleotídica que codifica uma regi- ão variável da cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo 7D8, 2A4 ou 8G9;(b) uma sequência nucleotídica que é idêntica a uma sequência nu- cleotídica de um anticorpo 7D8, um 2A4, ou um 8G9 que codifica uma região variável da cadeia leve ou cadeia pesada; (c) uma sequência nucleotídica que é substancialmente idêntica a uma sequência nucleotídica de (a) ou (b); ou (d) um ácido nucleico que especificamente hibridiza a um ácido nucleico quetem uma sequência nucleotídica que é o complemento de uma sequên- cia nucleotídica de (b) sob condições de hibridização estringentes.

Células expressando os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno da presente invenção também são fornecidas. A invenção fornece ainda células expressando ácidos nucleicos da invenção.

A invenção também inclui métodos de tratamento de doenças amiloides e métodos de profilaxia de doenças amiloides usando os anticor- pos e fragmentos de ligação a antígeno da invenção. Atualmente, não há tratamentos direcionados para amiloide específicos aprovados para nenhu- ma das doenças amiloides, incluindo Amiloidose AA e amiloidose AL. Ver Gillmore J.D.etal,, Lancet 358:24-9 (2001). Onde há um estado de doença subjacente ou associado, terapia direcionada em direção à redução da pro- dução da proteína amiloidogênica pelo tratamento da doença subjacente. Por exemplo, a estratégia de tratamento corrente para Amiloidose AA é visar a inflamação subjacente, reduzindo níveis de ApoSSA para abaixo de 10mg/l. Terapias correntemente empregadas incluem quimioterapia (cloram- bucil e MTX), imunossupressores (azatioprina), fármacos anti-inflamatórios (colchicina) e inibidores de TNF. A invenção fornece composições farmacêu-

ticas e métodos para tratamento de diversas doenças amiloides, incluindo amiloidose, tal como, por exemplo, amiloidose AA e amiloidose AL.

De acor- do com um aspecto, a invenção inclui composições farmacêuticas que inclu- em, como um ingrediente ativo, um agente que é eficaz para induzir uma resposta imune em um paciente contra um componente amiloide.

O agente pode ser um peptídeo compreendendo um fragmento consistindo da se- quência de aminoácidos X:EDX, derivado de uma proteína amiloide.

O agen- te pode ser um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo compre- endendo X:EDX>2. Em outras modalidades, o agente pode ser um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo.

Tais composições também incluirão geralmente excipientes e em modalidades preferenciais podem incluir adju- vantes.

Em modalidades adicionais preferenciais, os adjuvantes incluem, por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, MPLº, QS-21 (STIMU- LONº) ou adjuvante de Freund incompleto.

De acordo com uma modalidade relacionada, tais composições farmacêuticas podem incluir uma pluralidade de agentes eficazes para induzir uma resposta imune contra mais de um componente amiloide no paciente.

Em uma modalidade relacionada, o agente é eficaz para produ- zir uma resposta imune direcionada contra um agregado de proteína amiloi- de,talcomoum componente amiloide de peptídeo ou proteína fibrilar.

Prefe- rencialmente, tal peptídeo ou proteína fibrilar é derivado de uma proteína precursora fibrilar conhecida por ser associada com certas formas de doen- ças amiloides, como descrito neste pedido.

Tais proteínas precursoras inclu- em, mas não são limitadas a, proteína Amiloide A Sérica (ApoSSA), cadeia leve daimunoglobulina, cadeia pesada de imunoglobulina, ApoaAl, transtireti- na, lisozima, cadeia a de fibrogênio, gelsolina, cistatina C, proteína precurso- ra Amiloide B (B-APP), microglobulina Beta>2, proteína precursora de príon (PrP), fator natriurético atrial, queratina, polipeptídeo amiloide de ilhota, um hormônio peptídico e sinucleína.

Tais precursores também incluem proteínas mutantes, fragmentos proteicos e peptídeos proteolíticos de tais precursores.

Em uma modalidade preferencial, o agente é eficaz para induzir uma respos- ta imune direcionada contra um neoepitopo formado por uma proteína ou peptídeo fibrilar, com respeito a uma proteína precursora fibrilar. Isto é, como descrito em mais detalhes neste pedido, muitos peptídeos ou proteínas for- madores de fibrila são fragmentos de tais proteínas precursoras, tais como aquelas listadas acima. Quando tais fragmentos são formados, tal como pela clivagem proteolítica podem ser revelados epitopos que não estão presentes no precursor e não estão, por isso, imunologicamente disponíveis para o sistema imune quando o fragmento é uma parte da proteína precursora. Agentes dirigidos a tais epitopos podem ser agentes terapêuticos preferenci- ais, uma vez que menos provavelmente podem induzir uma resposta autoi- —mune no paciente. Preferencialmente, tais agentes preferencialmente produ- zem uma resposta imune direcionada contra uma forma patológica da prote- íÍna amiloide, por exemplo, um agregado de proteína amiloide, em relação a formas não patológicas da proteína amiloide.

De acordo com uma modalidade relacionada, as composições farmacêuticas da invenção incluem agentes dirigidos a agregados amiloides, tais como aqueles selecionados a partir do grupo incluindo, mas não limita- dos aos seguintes peptídeos ou proteínas agregados (por exemplo, fibrila): fragmento AA, AL, ATTR, AApoA1, Alys, Agel, Acys, AB, AB2M, AScr, Acal, AIAPP e sinucleína-NAC. Os nomes e composições completos destes peptí- deos são descritos neste pedido. Tais peptídeos podem ser feitos de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica, como descrito neste pedido. Os métodos compreendem administração ao paciente de uma dosagem eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo compreendendo X:EDX? em uma proteína amiloide, em que Xx é H, T,F,S, P,A ou qualquer outro resíduo de aminoácido precedendo imediatamente ED em tal proteína amiloide; e em que X2 é T, S, E, R, 1, V, F, A ou qualquer outro resíduo de aminoácido imediatamente após ED em tal proteína amiloi- de. Em alguns métodos, o paciente está sofrendo de uma amiloidose asso- ciada com um agregado de proteína amiloide compreendendo sequência de aminoácidos ED. Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epitopo consistindo em tal XtEDX2. Em alguns anticorpos, X: é H, T, E, S, P,ouÃe X2 é T,S,E, D, RI, V, F ou A. Em alguns anticorpos, quando X: é H, Xcé T ou A; quando X1: é A, Xco é S, T, E ou V; quando X: é T, X2 é E; quando X: é F, X2 é D; quando X: é S, X2 é E, F ou A; e quando X1 é P, 2 é E, Il ou F. Em alguns anticorpos, X1 é H, T, FE, S, PPouAe X2 é T, S, E, D,R, 1, V,F ou A, com a ressalva que se X1 for A, X2 não é V. Em alguns anticorpos, quan- doXéA XéS,TouE.

Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epitopo com- preendendo a sequência de aminoácidos GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT (SEQ ID Nº: 14), HEDA (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nº: 17), SEDE, (SEQID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), PEDE, (SEQ ID Nº: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22), AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF (SEQ ID Nº: 24) ou SEDA, (SEQ ID Nº: 25). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo com- preendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nº: 17), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), PEDE, (SEQ ID Nº: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22), SEDF, (SEQ ID Nº: 24), e SEDA, (SEQ ID Nº: 25). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT, (SEQ ID Nº: 3, HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), e TEDE, (SEQ ID Nº: 16). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 de AA. Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epitopo nos resíduos 71 a 75 de AA. Alguns anticorpos são construídos para um peptídeo compreendendo GHEDT, (SEQ ID Nº: 3). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo com- preendendo a sequência de aminoácidos PEDS, (SEQ ID Nº: 26), PEDL, (SEQID Nº: 27), TEDV, (SEQ ID Nº: 28), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), SEDI, (SEQ ID Nº: 29) e TEDT, (SEQ ID Nº: 30). Alguns anticorpos se ligam espe- cificamente a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos

LEDG, (SEQ ID Nº: 31), AEDM, (SEQ ID Nº: 32), HEDS, (SEQ ID Nº: 33), CEDD, (SEQ ID Nº: 34), QEDS, (SEQ ID Nº: 35), REDS, (SEQ ID Nº: 36), TEDG, (SEQ ID Nº: 37), QEDR, (SEQ ID Nº: 38), TEDL, (SEQ ID Nº: 39), PEDN, (SEQ ID Nº: 40), EEDP, (SEQ ID Nº: 41), LEDL, (SEQ ID Nº: 42), —KEDA,(SEQID Nº 43), SEDC, (SEQ ID Nº: 44), EEDD, (SEQ ID Nº: 45), SEDK, (SEQ ID Nº: 46), DEDD, (SEQ ID Nº: 47), DEDG, (SEQ ID Nº: 48), LEDE, (SEQ ID Nº: 49), GEDA, (SEQ ID Nº: 50), VEDF, (SEQ ID Nº: 51), YEDE, (SEQ ID Nº: 52), IEDL, (SEQ ID Nº: 53), WEDY, (SEQ ID Nº: 54), DEDW, (SEQ ID Nº: 55), SEDL, (SEQ ID Nº: 56), YEDO, (SEQ ID Nº: 57), LEDW,(SEQID Nº: 58), YEDR, (SEQ ID Nº: 59) e PEDK, (SEQ ID Nº: 60).

Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo com- preendendo a sequência de aminoácidos AEDV, (SEQ ID Nº: 23). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo a se- quência de aminoácidos SEDF, (SEQ ID Nº: 24) ou PEDF, (SEQ ID Nº: 22).

Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos AEDS, (SEQ ID Nº: 13). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo a sequência de ami- noácidos PEDI (SEQ ID Nº: 21), AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF, (SEQ ID Nº: 24), SEDA, (SEQ ID Nº: 25), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19) ePEDE,(SEQ ID Nº: 20). Alguns anticorpos ligam-se a um peptídeo com- preendendo a sequência de aminoácidos TEDE, (SEQ ID Nº: 16).

Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo com- preendendo a sequência de aminoácidos AEDV, (SEQ ID Nº: 23). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo a se- —quênciade aminoácidos SEDF, (SEQ ID Nº: 24) ou PEDF, (SEQ ID Nº: 22). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos AEDS, (SEQ ID Nº: 13). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo a sequência de ami- noácidos PEDI (SEQ ID Nº: 21), AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF, (SEQ ID Nº: 24), SEDA, (SEQID Nº: 25), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19) e PEDE, (SEQ ID Nº: 20). Alguns anticorpos ligam-se a um peptídeo com- preendendo a sequência de aminoácidos TEDE, (SEQ ID Nº: 16).

Qualquer um dos anticorpos descritos acima pode ser adminis- trado nos métodos descritos acima para tratar ou efetuar profilaxia de uma doença caracterizada pela deposição de uma proteína amiloide, tal como, por exemplo, uma proteína amiloide compreendendo a sequência de amino- ácidos ED. Em alguns métodos, se a proteína amiloide compreende a se- quência de aminoácidos AEDV, (SEQ ID Nº: 23), então o anticorpo não é administrado para tratar ou efetuar profilaxia de mal de Alzheimer ou Déficit Cognitivo Brando. A proteína amiloide pode ser qualquer uma de proteína À amiloide sérica, proteína da cadeia leve da imunoglobulina, tal como, por exemplo, VA6 Wil ou VK, polipeptídeo precursor de amiloide de ilhota huma- na (IAPP), peptídeo amiloide beta, transtiretina (TTR) ou ApoA1.

Opcionalmente, o paciente é humano. Opcionalmente, o anticor- po se liga especificamente a um peptídeo cujos resíduos consistem das SEQ ID Nºs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Opcionalmente, o anticorpo se liga especifi- camente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 da (SEQ ID Nº: 2). Opcional- mente, o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado ou anti- corpo quimérico. Opcionalmente, o anticorpo humano é do isotipo humano I9G1, IgG4, IgG2 ou I9G3. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é do iso- tipo humano IgG1, IgG4, I9gG2 ou IgG3. Opcionalmente, o anticorpo quiméri- coé do isotipo humano IgG1, IgG4, IgG2 ou IgG3. Opcionalmente, o anti- corpo é um anticorpo de camundongo. Opcionalmente, o anticorpo é um an- ticorpo policlonal. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Em alguns métodos de tratamento, o anticorpo compreende du- as cópias do mesmo par de cadeias leves e pesadas. Em outros métodos, o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo um primeiro par da cadeia leve e pesada que se liga especificamente ao epitopo de AB e um segundo par da cadeia leve e pesada que se liga especificamente a um re- ceptor de Fc em células microgliais. Em outros métodos, uma cadeia do an- ticorpo é fusionada a um polipeptídeo heterólogo.

Alguns métodos de tratamento, a dosagem do anticorpo é pelo menos 1 mg/kg de peso corporal do paciente. Em outros métodos, a dosa- gem do anticorpo é pelo menos 10 mg/kg de peso corporal do paciente.

Em alguns métodos, de tratamento, o anticorpo é administrado com um veículo como uma composição farmacêutica. Em outros métodos, em que o anticorpo é um anticorpo humano para AA preparado a partir de células B de um humano imunizado com um peptídeo AA. Opcionalmente, o humano imunizado com peptídeo AA é o paciente. Em alguns métodos, o anticorpo é administrado intraperitonialmente, oralmente, intranasalmente, subcutaneamente, intramuscularmente, topicamente ou intravenosamente.

Em alguns métodos de tratamento, o anticorpo é administrado pela administração de um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma ca- deiade anticorpo ao paciente e o polinucleotídeo é expresso para produzir a cadeia de anticorpo no paciente. Opcionalmente, o polinucleotídeo codifica cadeias pesadas e leves do anticorpo e o polinucleotídeo é expresso para produzir as cadeias pesadas e leves no paciente.

Alguns métodos de tratamento acima compreendem ainda ad- ministração de uma dosagem eficaz de pelo menos um outro anticorpo que se liga a um epitopo diferente de AA. Alguns dos métodos de tratamento acima compreendem ainda monitoramento do paciente para o nível do anti- corpo administrado no sangue do paciente. Em outros métodos, o anticorpo é administrado em múltiplas dosagens por um período de pelo menos seis meses. Em outros métodos, o anticorpo é administrado como uma composi- ção de liberação sustentada.

A invenção fornece ainda métodos de efetuar profilaxia da ami- loidose AA em um paciente suscetível à amiloidose AA. Os métodos com- preendem administração ao paciente de uma dosagem eficaz de um anticor- po que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 de AA. Opcionalmente, o paciente é humano. Opcionalmente, o anticorpo se liga especificamente a um peptídeo cujos resíduos consistem das SEQ ID Nºs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Opcionalmente, o anticorpo se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 da (SEQ ID Nº: 2). Em alguns métodos, o paciente sofre de uma doença amiloide subjacente selecionada a partir do grupo consistindo em artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondilite anquilosante, psoríase, artropatia psoriática, síndrome de Reiter, doença de

Still do Adulto, síndrome de Behcet, doença de Crohn, lepra, tuberculose, bronquiectasia, úlceras de decúbito, polinefrite crônica, osteomielite, doença de Whipple, linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intestino, pulmão e trato urogenital, carcinoma de célula basal, leucemia de célula ca- beluda, Febre Mediterrânea Familial e Doença de Castleman.

A invenção fornece ainda um anticorpo humano, humanizado, ou quimérico que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 de AA. Opcionalmente, o anticorpo humanizado se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 de AA. Opcionalmente, o anticorpo humaniza- doé uma versão humanizada do anticorpo 7D8 (Número de Acesso no ATCC ). Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humani- zada do anticorpo 7D29. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 7D19. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 7D47. Opcionalmente, o anticorpo humani- zado é versão humanizada do anticorpo 7D39. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 7D66. Opcionalmente, o an- ticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 8G9. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 8G3. Opcional- mente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 8G4. Op- cionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 8G51. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do an- ticorpo 8G22. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 8G30 humanizado. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 8G46. Opcionalmente, o anticorpo humani- zado é versão humanizada do anticorpo 2A4 (Número de Acesso no ATCC ). Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 2A20. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humani- zada do anticorpo 2A44. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 2A77. Opcionalmente, o anticorpo humanizado é versão humanizada do anticorpo 2A13. Opcionalmente, o anticorpo humani- zado é versão humanizada do anticorpo 2A14. A invenção fornece ainda composições farmacêuticas. As com-

posições farmacêuticas compreendem um anticorpo que se liga especifica- mente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 de AA, e um veículo farmaceuti- camente aceitável. Algumas composições farmacêuticas compreendem um anticorpo humano, humanizado, ou quimérico que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 de AA, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Outras composições farmacêuticas compreendem um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 de AA e um veículo farmaceuticamente aceitável, onde o isotipo do anticorpo é I9G1 hu- mano, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas composições farmacêuticas, o isotipo do anticorpo é I9gG2, IgG3 ou I9gG4 humano. Em al- gumas composições farmacêuticas, o anticorpo é humano. Em algumas composições farmacêuticas, o anticorpo é humanizado. Em algumas com- posições farmacêuticas, o anticorpo é quimérico. Em algumas composições farmacêuticas, o anticorpo é um anticorpo policlonal. Em algumas composi- çõesfarmacêuticas, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Em algumas composições farmacêuticas, o anticorpo compre- ende duas cópias do mesmo par de cadeias leves e pesadas. Em algumas composições farmacêuticas, o anticorpo é um anticorpo biespecífico com- preendendo um primeiro par da cadeia leve e pesada que se liga especifi- camente ao epitopo de AA e um segundo par da cadeia leve e pesada que se liga especificamente a um receptor de Fc em células microgliais. Em al- gumas composições farmacêuticas, uma cadeia do anticorpo é fusionada a um polipeptídeo heterólogo. Em algumas composições farmacêuticas, o veí- culo é um diluente fisiologicamente aceitável para administração parenteral.

Algumas composições farmacêuticas são adaptadas para serem administra- das intraperitonialmente, oralmente, intranasalmente, subcutaneamente, in- tramuscularmente, topicamente ou intravenosamente. Algumas composições farmacêuticas são adaptadas para serem administradas em múltiplas dosa- gens por um período de pelo menos seis meses. Algumas composições far- —macêuticas são adaptadas para serem administradas como uma composi- ção de liberação sustentada. Algumas composições farmacêuticas compre- endem ainda pelo menos um outro anticorpo que se liga a um epitopo di-

ferente de AA.

A invenção fornece métodos de tratamento de amiloidose AA em um paciente. Os métodos compreendem administração de um agente que induz uma resposta imune a AA70-76 em um regime eficaz para induzir uma resposta imune compreendendo anticorpos contra AA70-76 em um regime eficaz para induzir uma resposta imune compreendendo anticorpos contra AATO-76. Em alguns métodos, o paciente é humano. Opcionalmente, o agente compreende AA70-76 ou um subfragmento de pelo menos 3 resí- duos contíguos do mesmo e tem menos de 20 aminoácidos contíguos de um peptídeo AA. Opcionalmente, o agente é um peptídeo tendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID Nºs 4, 5, 6, 7, 8,9, 10 e 11 e subfragmentos de pelo menos 3 resíduos contíguos do mesmo e têm menos de 20 aminoácidos de um peptídeo AA. Opcionalmente, o agente é ligado em seus N e C terminais ao primeiro e segundo polipeptídeos heteró- logos. Opcionalmente, o agente é ligado em seu N terminal a um polipeptí- deo heterólogo, e em seu C-terminal a pelo menos uma cópia adicional do segmento N-terminal. Em alguns métodos, o polipeptídeo heterólogo induz uma resposta de célula T contra o polipeptídeo heterólogo e por meio disso uma resposta de célula B contra AA. Em alguns métodos, o polipeptídeo compreende ainda pelo menos uma cópia adicional de AA. Opcionalmente, o polipeptídeo compreende do N-terminal ao C-terminal, AA, uma pluralidade de cópias adicionais de AA, e o segmento de aminoácido heterólogo.

Em alguns métodos de tratamento, o polipeptídeo é administra- do com um adjuvante que aumenta uma resposta imune para o segmento N- terminal. Opcionalmente, o adjuvante e o polipeptídeo são administrados em conjunto como uma composição. Opcionalmente, o adjuvante é administrado antes do polipeptídeo. Opcionalmente, o adjuvante é administrado após o polipeptídeo. Em alguns métodos, o adjuvante é alúmen. Em alguns méto- dos, o adjuvante é MPL. Em alguns métodos, o adjuvante é QS-21. Em al- guns métodos, o adjuvante é o adjuvante de Freund incompleto. Em alguns métodos, a resposta imune compreende células T que se ligam ao peptídeo AA como um componente de um complexo MHC | ou MHC Il.

A invenção fornece métodos de efetuar profilaxia de amiloidose AA em um paciente. Os métodos compreendem administração de um agente que induz uma resposta imune a AA70-76 em um regime eficaz para induzir uma resposta imune compreendendo anticorpos contra AA70-76 em um re- gime eficaz para induzir uma resposta imune compreendendo anticorpos contra AA70-76. Em alguns métodos, o paciente é humano. Em alguns mé- todos, o paciente é assintomático. Em alguns métodos, o paciente sofre de uma doença amiloide subjacente selecionada a partir do grupo consistindo em artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondilite anquilosante, psorí- asse, artropatia psoriática, síndrome de Reiter, doença de Still do Adulto, sín- drome de Behcet, doença de Crohn, lepra, tuberculose, bronquiectasia, úlce- ras de decúbito, polinefrite crônica, osteomielite, doença de Whipple, linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intestino, pulmão e trato uroge- nital, carcinoma de célula basal, leucemia de célula cabeluda, Febre Mediter- rânea Familial e Doença de Castleman.

Em alguns métodos de efetuar profilaxia, o agente compreende AATO-76 ou um subfragmento de pelo menos 3 resíduos contíguos do mes- mo e tem menos de 20 aminoácidos contíguos de um peptídeo AA. Opcio- nalmente, o agente é um peptídeo tendo uma sequência selecionada a partir dogrupo consistindo das SEQ ID Nºs 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 e subfragmen- tos de pelo menos 3 resíduos contíguos do mesmo e têm menos de 20 ami- noácidos de um peptídeo AA. Opcionalmente, o agente é ligado em seus Ne C terminais ao primeiro e segundo polipeptídeos heterólogos. Opcionalmen- te, o agente é ligado em seu terminal N a um polipeptídeo heterólogo, e em seu C-terminal a pelo menos uma cópia adicional do segmento N-terminal. Em alguns métodos, o polipeptídeo heterólogo induz uma resposta de célula T contra o polipeptídeo heterólogo e por meio disso uma resposta de célula B contra AA. Em alguns métodos, o polipeptídeo compreende ainda pelo menos uma cópia adicional de AA. Opcionalmente, o polipeptídeo compre- ende do N-terminal ao C-terminal, AA, uma pluralidade de cópias adicionais de AA, e o segmento de aminoácido heterólogo. A invenção fornece ainda composições farmacêuticas. As com-

posições farmacêuticas compreendem um fragmento AA consistindo em re- síduos que começam no resíduo 70 de AA e terminam no resíduo 76 de AA. Opcionalmente, o fragmento AA é ligado em seu C-terminal a um polipeptí- deo heterólogo. Opcionalmente, o fragmento AA é ligado em seu N-terminal aum polipeptídeo heterólogo. Opcionalmente, o fragmento AA é ligado em seus N e C terminais ao primeiro e segundo polipeptídeos heterólogos. Op- cionalmente, o fragmento AA é ligado em seu N terminal a um polipeptídeo heterólogo, e em seu C-terminal a pelo menos uma cópia adicional do seg- mento N-terminal. Opcionalmente, o polipeptídeo compreende ainda pelo menos uma cópia adicional do segmento N-terminal. Opcionalmente, o poli- peptídeo compreende do N-terminal ao C-terminal, AA, uma pluralidade de cópias adicionais do segmento N-terminal, e o segmento de aminoácido he- terólogo. Em algumas composições farmacêuticas, o polipeptídeo heterólogo induz uma resposta de célula T contra o polipeptídeo heterólogo e por meio dissouma resposta de célula B contra o segmento N-terminal.

Algumas composições farmacêuticas compreendem ainda um adjuvante que aumenta uma resposta imune a AA. Opcionalmente, o adju- vante é alúmen. Opcionalmente, o adjuvante é MPL. Opcionalmente, o adju- vante é QS-21. Opcionalmente, o adjuvante é o adjuvante de Freund incom- pleto. Opcionalmente, o adjuvante compreende ainda GM-CSF. Opcional- mente, o adjuvante é M-CSF. Opcionalmente, a composição compreende mais do que 10 microgramas do polipeptídeo.

A invenção fornece métodos de tratamento de amiloidose AA em um paciente. Os métodos compreendem administração de um agente eficaz para induzir uma resposta imune contra um componente peptídico de um depósito amiloide no paciente e um agente diferente que trata uma doença subjacente, e por meio disso tratando amiloidose AA no paciente. Em alguns métodos, a doença subjacente é selecionada a partir do grupo consistindo em artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondilite anquilosante, psorí- ase, artropatia psoriática, síndrome de Reiter, doença de Still do Adulto, sín- drome de Behcet, doença de Crohn, lepra, tuberculose, bronquiectasia, úlce- ras de decúbito, polinefrite crônica, osteomielite, doença de Whipple, linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intestino, pulmão e trato uroge- nital, carcinoma de célula basal, leucemia de célula cabeluda, Febre Mediter- rânea Familial e Doença de Castleman.

A invenção fornece métodos de efetuar profilaxia de amiloidose AAemunm paciente. Os métodos compreendem administração de um agente eficaz para induzir uma resposta imune contra um componente peptídico de um depósito amiloide no paciente e um agente diferente que trata uma do- ença subjacente, e por meio disso tratando amiloidose AA no paciente. Em alguns métodos, a doença subjacente é selecionada a partir do grupo con- sistindo em artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondilite anquilo- sante, psoríase, artropatia psoriática, síndrome de Reiter, doença de Still do Adulto, síndrome de Behcet, doença de Crohn, lepra, tuberculose, bron- quiectasia, úlceras de decúbito, polinefrite crônica, osteomielite, doença de Whipple, linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intestino, pul- mãoe trato urogenital, carcinoma de célula basal, leucemia de célula cabe- luda, Febre Mediterrânea Familial e Doença de Castleman.

A invenção fornece métodos de rastreamento de um anticorpo para atividade no tratamento de um paciente tendo amiloidose AA. Os méto- dos compreendem contato do anticorpo com o peptídeo AA e determinação seo anticorpo especificamente se liga a AA, ligação específica fornecendo uma indicação que o anticorpo tem atividade no tratamento de amiloidose AA. A invenção fornece métodos de rastreamento de um anticorpo para atividade na depuração de uma entidade biológica fisicamente associa- dacom um antígeno. Os métodos compreendem a combinação da entidade biológica associada a antígeno, o anticorpo e células fagocíticas carregando receptores de Fc em um meio; e monitoramento da quantidade da entidade biológica associada a antígeno que permanece no meio, uma redução da quantidade da entidade biológica associada a antígeno indicando que o anti- corpo tem atividade de depuração contra o antígeno. Em alguns métodos, a etapa de monitoramento monitora a quantidade do antígeno que permanece no meio. Em alguns métodos, a combinação compreende adição da entida-

de biológica associada a antígeno ao meio, e contato do meio com as célu- las fagocíticas carregando receptores de Fc.

Em alguns métodos, a entidade biológica associada a antígeno é fornecida como uma amostra tecidual.

Em alguns métodos, o antígeno é a entidade biológica.

Em alguns métodos, a amostra tecidual compreende um depósito amiloide.

Opcionalmente, a amostra tecidual é do paciente ou um mamífero tendo patologia Amiloidose AA.

Em alguns métodos, o antígeno é AA.

Em alguns métodos, as células fagocíticas são células microgliais.

Em alguns métodos, a amostra tecidual é selecionada a partir do grupo consistindo em uma amostra tecidual cancero- sa, uma amostra tecidual viralmente infectada, uma amostra tecidual com- preendendo células inflamatórias, um crescimento celular anormal não ma- ligno, e uma amostra tecidual compreendendo uma matriz extracelular anormal.

A invenção fornece métodos de detecção de um depósito ami- loide em um paciente.

Os métodos compreendem administração ao paciente de um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo nos aminoácidos 70 a 76 de AA e a detecção da presença do anticorpo no paciente.

Opcio- nalmente, o anticorpo é marcado.

Opcionalmente, o anticorpo é marcado com uma marcação paramagnética.

Opcionalmente, o anticorpo marcado é detectado pela ressonância magnética nuclear.

Opcionalmente, o anticorpo marcado é detectado com visualização SPECT/CT.

Em alguns métodos, o anticorpo não tem capacidade de induzir uma resposta de depuração na |i- gação a um depósito amiloide no paciente.

A invenção fornece conjuntos diagnósticos.

Os conjuntos com- preendem um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo com resí- duos 70 a 76 de AA.

Alguns conjuntos adicionais compreendem uso de mar- cações descritas do anticorpo para diagnóstico ou monitoramento in vivo de uma doença associada com depósitos amiloides de AA em um paciente.

Em algumas modalidades, os conjuntos incluem instruções de uso do anticorpo oufragmento de ligação a antígeno do mesmo na detecção de AA.

A invenção fornece ainda um método de diagnóstico de amiloi- dose em um indivíduo compreendendo: (a) administração ao indivíduo de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que está ligado a uma marcação detectável, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga especificamente a um epitopo compreendendo X:EDX>2 em um agregado de proteína amiloide, em que X: e X2 são qualquer aminoácido; e (b) detec- çãoda presença ou ausência do anticorpo ou fragmento ligado do mesmo, em que a presença do anticorpo ou fragmento ligado indica um diagnóstico de amiloidose AA. Ainda é fornecido neste pedido um método de tratamento ou profilaxia de amiloidose usando um anticorpo ou fragmento de ligação a an- tígenodo mesmo, que se liga especificamente a um epitopo compreendendo X1EDX? em um agregado de proteína amiloide, em que X: e X2> são qualquer aminoácido.

A presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um epitopo com- preendendo X1IEDX>2, em um agregado de proteína amiloide, em que X1 e X2 são qualquer aminoácido. Por exemplo, X: inclui H, T, FE, S, PR, A LC, Q,R, E, K, D, G, V, Y, | ou W, tal como H, T, F, S, P, ou A, ou, tal como H, T, F, ou A. X2 inclui T, S, E, RI, V, E, D/ A, G, M, L, N, P, C, K, Y ou Q, tal como T, S, E, RI, V, F, Dou A, ou, tal como T, S, E, D ou A. Em outros exemplos, X: éH TouAeXéT,S,EouaA, talcomo Xr é HouAe Xcé T, Sou A. Em exemplos ainda adicionais, X1 é He Hé Tou A; ou XKr é Ae X2 é S, T, E, ou V, tal como X1 é Ae X2 é S, Tou E, ou KXré Te I2 é E, ou Kr é Fe IC É D, ou X1té Se Xcé E, Fou A;ouX é Pe X2o é E, IouF.

Em particular, os epitopos incluem sequências de aminoácido, tais como aquelas apresentadas nas SEQ ID Nº: 3 a SEQ ID Nº: 25, tais como SEQ ID Nºs: 3, 12, 13, 14, 15 e 16. Exemplos adicionais incluem SEQ ID Nºs: 4, 5,7, 8 e 9, tais como SEQ ID Nº: 4. Anticorpos da invenção que se ligam aos epitopos, tal como a SEQ ID Nº: 3, incluem os anticorpos 2A4, 7D8 e 8G9.

Os agregados de proteínas amiloides aos quais os anticorpos da invenção se ligam são proteínas não monoméricas. Tais agregados de pro- teínas amiloides incluem proteína amiloide A sérica (SAA), proteína da ca-

deia leve da imunoglobulina, polipeptídeo precursor amiloide de ilhota hu- mana (IAPP), peptídeo amiloide beta, transtiretina (TTR) e ApoA1, tal como SAA.

A invenção fornece ainda anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo que (a) competem por ligação a um epitopo que inclui X1EDX2 com um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9; (b) ligam-se ao mesmo epitopo que inclui XtEDX2 que um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9; (c) têm um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9; ou (d) incluem as seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de um anticor- po 2A4,7D8 ou 8G9. A invenção também fornece versões quiméricas ou humanizadas de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9.

Anticorpos representativos, que se ligam especificamente a um epitopo que inclui X1IEDX>2, também incluem anticorpos que têm pelo menos uma, duas ou três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma cadeia leve de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9. Os anticorpos da invenção, que se ligam especificamente a um epitopo que inclui XtEDX,>, também incluem anticorpos que têm pelo menos uma, duas ou três das CDRs de uma cadeia pesada de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9.

CDRs podem ser identificadas de acordo com métodos conheci- dos na técnica. Por exemplo, sistemas de numeração para identificar CDRs são de uso comum. A definição Kabat é baseada na variabilidade de se- quência, e a definição Chothia é baseada na posição das regiões de alça estrutural. A definição ADM é um ajuste entre as abordagens de Chothia e Kabat. As CDRs da região variável da cadeia leve são limitadas pelos resí- duosnas posições 24 e 34 (CDR1-L), 50 e 56 (CDR2-L), e 89 e 97 (CDR3-L) de acordo com algoritmo de Kabat, Chothia ou ADM. De acordo com a defi- nição Kabat, as CDRs da região variável da cadeia pesada são delimitadas pelos resíduos nas posições 31 e 35B (CDR1-H), 50 e 65 (CDR2-H), e 95 e 102 (CDR3-H) (numeração de acordo com Kabat). De acordo com a defini- ção de Chothia, as CDRs da região variável da cadeia pesada são delimita- das pelos resíduos nas posições 26 e 32 (CDR1-H), 52 e 56 (CDR2-H), e 95 e 102 (CDR3-H) (numeração de acordo com Chothia). De acordo com a de-

finição ADM, as CDRs da região variável da cadeia pesada são limitadas pelos resíduos nas posições 26 e 35B (CDR1-H), 50 e 58 (CDR2-H), e 95 e 102 (CDR3-H) (numeração de acordo com Kabat). Ver Martin et al. (1989) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) Methods En- zymol.203:121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1: 126; e Rees et al. (1996) em Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172. Os anticorpos da invenção incluem ainda um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo compreendendo X:EDX>2, em um agrega- do de proteína amiloide, em que X1: e X2> são qualquer aminoácido, tendo regiões variáveis derivadas de regiões variáveis de um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9. Anticorpos tendo regiões variáveis de anticorpos 2A4, 7D8 ou 8G9 também são incluídos.

Os anticorpos da invenção incluem ainda anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única, anticorpos tetraméricos, anticorpos tetravalentes, anticorpos multiespeciífi- cos, anticorpos domínio-específicos, anticorpos domínio-deletados ou prote- nas de fusão.

Fragmentos dos anticorpos da invenção também são fornecidos.

Os fragmentos da invenção podem ser fragmentos Fab, fragmento Fab', fra- gmentos F(ab')2, fragmentos Fv ou fragmentos ScFv.

Tais anticorpos ou fra- gmentos dos mesmos podem ser ligados com um agente citotóxico, um agente radioterápico ou uma marcação detectável.

A invenção também fornece uma região variável de anticorpo isolada compreendendo (a) uma região variável da cadeia leve derivada de uma região variável da cadeia leve de anticorpo 7D8, 2A4 ou 8G9, ou (b) uma região variável da cadeia pesada derivada de uma região variável da cadeia leve de anticorpo 7D8, 2A4, ou 8G9. As regiões variáveis isoladas também são fornecidas tendo uma região variável da cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo 7D8, 2A4 ou 8G9. As regiões variáveis de anticorpo isoladas são úteis na produção de anticorpo.

A invenção também fornece ácidos nucleicos isolados que codi-

ficam uma região variável da cadeia leve de anticorpo ou uma região variá- vel da cadeia pesada tendo (a) uma sequência nucleotídica que codifica uma região variável da cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo 7D8, 2A4 ou 8G9; (b) uma sequência nucleotídica que é idêntica a uma sequência nu- cleotídicade um anticorpo 7D8, um 2A4 ou um 8G9 que codifica uma região variável da cadeia leve ou pesada; ou (c) uma sequência nucleotídica que é substancialmente idêntica, isto é, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, ou 99% a uma sequência nucleotídica de (a) ou (b); ou(d)um ácido nucleico que especificamente hibridiza a um ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica que é o complemento de uma sequência nucleotídica de (a) ou (b) sob condições de hibridização estringentes, por exemplo, condições finais de lavagem de SSC 0,1x a 65ºC.

A presente invenção fornece ainda células e linhagens celulares expressando os anticorpos ou ácidos nucleicos da invenção.

Células hospe- deiras representativas incluem células mamíferas e humanas, tais como cé- lulas CHO, células HEK-293, células HeLa, células CV-1 e células COS.

Mé- todos para geração de uma linhagem celular estável após transformação de um construto heterólogo em uma célula hospedeira são conhecidos na téc- nica.

Células hospedeiras não mamíferas representativas incluem células de inseto (Potter et al. (1993) /nt.

Rev.

Immunol. 10 (2-3): 103-112). Anticorpos também podem ser produzidos em animais transgênicos (Houdebine (2002) Curr.

Opin.

Biotechnol. 13 (6):625-629) e plantas transgênicas (Schillberg et al. (2003) Cell Mol.

Life.

Sci. 60 (3):433-45). A invenção também fornece métodos de tratamento ou efetua- ção de profilaxia de amiloidose associada usando fragmentos imunogênicos da proteína amiloide compreendendo X:EDX>2, em que X1t é H, T, EF, S,P, A ou qualquer outro resíduo de aminoácido imediatamente precedendo ED em tal proteína amiloide; e em que X2 é T, S, E, R, 1, V, F, A ou qualquer outro resíduo de aminoácido imediatamente após ED em tal proteína amiloide.

Sem desejar estar ligado por uma teoria particular, acredita-se que um epi- topo compreendendo X:EDX>2 pode tornar-se exposto quando uma proteína amiloide agrega-se, ou sofre fibrilogênese ou de outra maneira introduz uma estrutura fibrilar, se pela clivagem de uma proteína precursora maior ou pela modificação conformacional. Por exemplo, métodos representativos de tra- tamento ou profilaxia de amiloidose AA incluem administração de fragmentos AA 70-76 ou fragmentos imunogênicos dos mesmos. A invenção também fornece métodos de tratamento ou efetuação de profilaxia de amiloidose as- sociada com a deposição da proteína amiloide usando anticorpos reativos com X:EDX>? em um agregado de proteína amiloide, em que X: é H, T,F,S, P, A ou qualquer outro resíduo de aminoácido imediatamente precedendo EDemtal agregado de proteína amiloide; e em que X2c é T,. SÓS ER I,V,F, A ou qualquer outro resíduo de aminoácido imediatamente após ED em tal agregado de proteína amiloide. Preferencialmente, tais anticorpos são prefe- rencialmente reativos com agregado de proteína amiloide em relação à pro- teína amiloide não patológica. Por exemplo, métodos de tratamento ou profi- laxia de amiloidose AA associada com fibrilas AA podem incluir administra- ção de anticorpos específicos para a região C-terminal de fibrilas AA (resíduos 70 a 76 de AA). Os anticorpos podem inibir a formação de agre- gados AA (por exemplo, fibrilas) ou resultam em sua desagregação e depu- ração dessa forma tratando ou efetuando profilaxia de amiloidose AA.

|. Definições O termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando alinhadas otimamente, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna pré-configurados, compartilham identi- dade de sequência de pelo menos 65 porcento, preferencialmente identida- dede sequência de pelo menos 80 ou 90 porcento, mais preferencialmente identidade de sequência de pelo menos 95 porcento ou mais (por exemplo, identidade de sequência de 99 porcento ou superior). Preferencialmente, as posições de resíduo, que não são idênticas diferenciam-se por substituições de aminoácido conservativas.

Para a comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, a qual as sequências teste são comparadas. Usando um algoritmo de comparação de sequência, sequên-

cias teste e de referência são introduzidas em um computador, as coordena- das de subsequência são indicadas, se necessário, e os parâmetros de pro- grama de algoritmo de sequência são indicados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula a identidade de sequência percentual da se- quência(s)teste em relação à sequência de referência, com base nos parâ- metros de programa indicados.

Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Wa- terman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de —homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela méto- do de busca de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algorit- mos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Programa de Genéti- ca de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou pela inspeção visual (ver geralmente Ausubel et al., supra). Um exemplo de algoritmo que é adequado para determinar a identidade de sequência percentual e similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O programa para realizar análises por BLAST está publicamente disponível através de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tipicamente, os parâmetros de programa pré-configurados podem ser usados para realizar a comparação de sequência, embora os parâmetros construídos também pos- sam ser usados. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como um wordlength pré-configurado (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de classificação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)) Para fins de classificação de substituições de aminoácidos como conservativas ou não conservativas, os aminoácidos são agrupados como se segue: Grupo | (cadeias laterais hidrofóbicas: norleucina, met, ala, val, leu,ile; Grupo |l (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo Ill (cadeias laterais acídicas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam na orientação da ca-

deia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. Substi- tuições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. Substituições não conservativas constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra. O termo "todo-D" refere-se a peptídeos tendo 2 75%, > 80%, > 85%, > 90%, > 95%, e 100% de aminoácidos de configuração D.

O termo "agente" é usado para descrever um composto que tem ou pode ter uma atividade farmacológica. Os agentes incluem compostos que são fármacos conhecidos, compostos para os quais a atividade farma- cológica foi identificada, mas que estão sofrendo avaliação terapêutica adici- onal, e compostos que são membros de coleções e bibliotecas que devem ser rastreadas para uma atividade farmacológica.

"Doença amiloide" ou "amiloidose" referem-se a qualquer núme- ro de desordens que tem como um sintoma ou como parte da sua patologia o acúmulo ou formação de placas amiloides. Uma "placa amiloide" é um de- pósito extracelular composto principalmente de fibrilas proteicas. Geralmen- te, as fibrilas são compostas de uma proteína ou peptídeo dominante; entre- tanto, a placa também pode incluir componentes adicionais que são molécu- las peptídicas ou não peptídicas, como descrito neste pedido.

Uma "proteína amiloide" ou "peptídeo amiloide" é uma proteína ou peptídeo capaz de sofrer clivagem, modificação conformacional, agrega- ção ou fibrilogênese, resultando na formação de oligômeros patológicos, fi- brilas amiloides, placas amiloides e/ou componentes amiloides.

Um "componente amiloide" é qualquer entidade molecular que está presente em uma placa amiloide incluindo porções antigênicas de tais moléculas. Componentes amiloides incluem, mas não são limitados a proteí- nas, peptídeos, proteoglicanos e carboidratos.

Um "agente antiamiloide" é um agente que é capaz de produzir uma resposta imune contra um componente de placa amiloide em um indiví- duo vertebrado, quando administrado por técnicas de imunização ativas ou passivas.

Uma "proteína AA" ou "peptídeo AA" refere-se à forma da prote-

ína ou peptídeo A de proteína amiloide formado pela clivagem proteolítica de proteína A amiloide sérica (SAA), se monomérica ou agregada, solúvel ou insolúvel.

Um "agregado de proteína amiloide" ou "agregado de peptídeo amiloide" ou "agregado amiloide" refere-se a uma forma agregada patológi- ca, não monomérica de uma proteína amiloide ou peptídeo amiloide.

Os agregados de proteínas amiloides e peptídeos amiloide podem ser solúveis ou insolúveis.

Alguns agregados de proteínas amiloides e agregados de pep- tídeos amiloide podem formar oligômeros, fibrilas e/ou placas amiloides.

Exemplos de tais agregados de proteínas amiloides e peptídeos amiloides, incluindo peptídeos e proteínas fibrilares são fornecidos neste pedido.

Um "agregado de AA" refere-se a uma forma agregada de AA.

Os agentes terapêuticos da invenção são tipicamente substanci- almente puros do contaminante indesejado.

Isto significa que um agente tem tipicamente pureza de pelo menos aproximadamente 50% p/p (peso/peso), bem como sendo substancialmente livre de proteínas e contaminantes inter- ferentes.

Às vezes, os agentes têm pureza pelo menos de aproximadamente 80% p/p e, mais preferencialmente pelo menos 90 ou aproximadamente 95% p/p.

Entretanto, usando técnicas de purificação proteicas convencionais, peptídeos homogêneos de pelo menos 99% p/p podem ser obtidos.

Agentes terapêuticos da invenção podem impedir, efetuar profilaxia, ou tratar uma doença associada com depósitos amiloides.

Ligação específica entre duas entidades significa que as entida- des têm uma afinidade mútua entre si que é pelo menos 10-, 100- ou 100 vezes maior do que afinidade de entidade por um controle, tal como antíge- no não relacionado ou anticorpo para um antígeno diferente.

A afinidade mú- tua das duas entidades entre si é normalmente pelo menos 107 M!, 108º M, 10º M, ou 10*º M!. Afinidades maiores do que 10º M são preferenciais.

O termo "imunoglobulina" ou "anticorpo" (usado intercambiavel- mente neste pedido) refere-se a uma proteína de ligação a antígeno tendo uma estrutura de cadeia de quatro polipeptídeos básicos consistindo em du- as cadeias pesadas e duas leves, as ditas cadeias sendo estabilizadas, por exemplo, por ligações dissulfeto intercadeia, que tem a capacidade de ligar- se especificamente ao antígeno. Tanto as cadeias pesadas como leves são dobradas em domínios. O termo "domínio" refere-se a uma região globular de um polipeptídeo da cadeia pesada ou leve compreendendo alças peptídi- cas (por exemplo, compreendendo 3 a 4 alças peptídicas) estabilizadas, por exemplo, folha B dobrada e/ou ligação dissulfeto peptídicas intracadeia. Os domínios são referidos ainda neste pedido como "constantes" ou "variáveis", baseados na falta relativa da variação de sequência dentro dos domínios de vários membros de classe no caso de um domínio "constante", ou a variação significante dentro dos domínios de vários membros de classe no caso de um domínio "variável". "Domínios constantes" na cadeia leve são referidos intercambiavelmente como "regiões constantes da cadeia leve", "domínios constantes da cadeia leve", regiões "CL" ou domínios "CL". Domínios "cons- tantes" na cadeia pesada são referidos intercambiavelmente como "regiões constantes da cadeia pesada", "domínios constantes da cadeia pesada", regiões "CH" ou domínios "CH". Domínios "variáveis" na cadeia leve são re- feridos intercambiavelmente como "regiões variáveis da cadeia leve", "domí- nios variáveis da cadeia leve", regiões "VL" ou domínios "VL". Domínios "va- riáveis" na cadeia pesada são referidos intercambiavelmente como "regiões constantes da cadeia pesada", "domínios constantes da cadeia pesada", regiões "CH" ou domínios "CH".

O termo "região" refere-se a uma parte ou porção de uma cadeia de anticorpo e inclui domínios constantes ou variáveis como definidos neste pedido, bem como partes ou porções mais discretas dos ditos domínios. Por exemplo, domínios ou regiões variáveis da cadeia leve incluem "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs" entremeadas entre "regi- ões conservadas" ou "FRs", como definido neste pedido.

Imunoglobulinas ou anticorpos podem existir na forma monomé- rica ou polimérica. O termo "fragmento de ligação a antígeno" refere-se a um fragmento polipeptídico de uma imunoglobulina ou anticorpo que se liga ao antígeno ou compete com o anticorpo intacto (isto é, com o anticorpo intacto do qual foram derivados) pela ligação ao antígeno (isto é, ligação especiífi-

ca). O termo "conformação" refere-se à estrutura terciária de uma proteína ou polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo, cadeia de anticorpo, domínio ou região do mesmo). Por exemplo, a frase "conformação da cadeia leve (ou pesada)" refere à estrutura terciária de uma região variável da cadeia leve (ou pesada), e a frase "conformação de anticorpo" ou "conformação de fra- gmento de anticorpo" refere-se à estrutura terciária de um anticorpo ou fra- gmento do mesmo. "Ligação específica" de um anticorpo significa que o anticorpo exibe afinidade apreciável pelo antígeno ou um epitopo preferencial e, prefe- rencialmente, não exibe reatividade cruzada significante. Ligação "apreciá- vel" ou preferencial inclui ligação com uma afinidade de pelo menos 106, 107, 108, 10º M? ou 10*º M. Afinidades maiores do que 107 M, preferencial- mente maiores do que 10º M são mais preferenciais. Valores intermediários daqueles apresentados neste pedido também são destinados a estar no es- copo da presente invenção e uma afinidade de ligação preferencial pode ser indicada como uma faixa de afinidades, por exemplo, 106 a 10ºº M, prefe- rencialmente 107 a 10ºº M, mais preferencialmente 108 a 10ºº M. Um anti- corpo que "não exibe reatividade cruzada significante" é aquele que não se ligará apreciavelmente a uma entidade indesejável (por exemplo, uma enti- dade proteica indesejável). Por exemplo, um anticorpo que se liga especifi- camente a AA se ligará apreciavelmente a AA, mas não reagirá significati- vamente com proteínas ou peptídeos não AA (por exemplo, proteínas ou peptídeos não AA incluídos em placas). Um anticorpo específico para um epitopo preferencial vai, por exemplo, não significativamente reagir cruza- damente com epitopos remotos na mesma proteína ou peptídeo. A ligação específica pode ser determinada de acordo com qualquer meio reconhecido na técnica para determinar tal ligação. Preferencialmente, a ligação específi- ca é determinada de acordo com a análise Scatchard e/ou ensaios de liga- ção competitiva.

Fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou pela clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. Fragmentos de ligação incluem Fab, Fab',

F(ab')2, Fabc, Fv, cadeias únicas, e anticorpos de cadeia única. Fragmentos de anticorpo adicionais e variantes de função efetora são discutidos neste pedido na seção intitulada "Anticorpos". Além de imunoglobulinas ou anti- corpos "biespecíficas" ou "bifuncionais", uma imunoglobulina ou anticorpo é entendido ter cada um dos seus sítios de ligação idênticos. Um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial que tem dois pares da cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de méto- dos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

O termo "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humaniza- do" refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo que inclui pelo menos uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo humanizada (isto é, pelo menos uma cadeia leve ou pesada humanizada). O termo "cadeia de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia de anticorpo humanizada" (isto é, uma "cadeia leve da imunoglobulina humanizada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina hu- manizada") refere-se a uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo (isto é, uma cadeia leve ou pesada, respectivamente) tendo uma região variável que incluiuma região conservada variável substancialmente de uma imunoglobu- lina ou anticorpo humano e regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (por exemplo, pelo menos uma CDR, preferencialmente duas CDRs, mais preferencialmente três CDRs) substancialmente de uma imunoglobuli- na ou anticorpo não humano, e além disso, inclui regiões constantes (por exemplo, pelo menos uma região constante ou porção da mesma, no caso de uma cadeia leve, e preferencialmente três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). O termo "região variável humanizada" (por exemplo, "região variável da cadeia leve humanizada" ou "região variável da cadeia pesada humanizada") refere-se a uma região variável que inclui uma região conservada variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humano e regiões de determinação de complementaridade (CDRs) substan- cialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humano.

A frase "substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humano" ou "substancialmente humano" significa que, quando alinhado a uma sequência amino de imunoglobulina ou anticorpo humano para fins de comparação, a região compartilha identidade de pelo menos 80 a 90%, pre- ferencialmente 90 a 95%, mais preferencialmente de 95 a 99% (isto é, iden- tidade de sequência local) com a região conservada humana ou sequência de região constante, permitindo, por exemplo, para substituições conservati- vas, substituições de sequência consenso, substituições de linhagem germi- nativa, retromutações e similares. A introdução de substituições conservati- vas, substituições de sequência consenso, substituições de linhagem germi- nativa, retromutações e similares, é muitas vezes referida como "otimização" de um anticorpo ou cadeia humanizada. A frase "substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humano" ou "substancialmente não huma- no" significa ter uma imunoglobulina ou sequência de anticorpo pelo menos 80a95%, preferencialmente 90 a 95%, mais preferencialmente, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticos àquela de um organismo não humano, por exemplo, um mamífero não humano.

Consequentemente, todas regiões ou resíduos de uma imuno- globulina ou anticorpo humanizado, ou de uma cadeia de imunoglobulina ou anticorpo humanizado, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmen- te idênticas às regiões ou resíduos correspondentes de uma ou mais se- quências de imunoglobulina humana nativa. O termo "região corresponden- te" ou "resíduo correspondente" refere-se a uma região ou resíduo em um segundo aminoácido ou sequência nucleotídica que ocupa a mesma (isto é, equivalente) posição como uma região ou resíduo em um primeiro aminoáci- do ou sequência nucleotídica, quando a primeira e segunda sequência são otimamente alinhadas para fins de comparação. Os termos "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humani- zado" não são destinados a englobar imunoglobulinas ou anticorpos quimé- ricos, como definido infra. Embora as imunoglobulinas ou anticorpos huma- nizados sejam quiméricos em sua construção (isto é, compreende regiões de mais de uma espécie de proteína), incluem características adicionais (isto é, regiões variáveis compreendendo resíduos de CDR doadora e resíduos de região conservada aceptora) não encontradas em imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, como definido neste pedido.

O termo "imunoglobulina quimérica" ou anticorpo refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo cujas regiões variáveis derivam de uma primeira espécie e cujas regiões constantes derivam de uma segunda espé- cie. Imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos podem ser construídos, por exemplo, pela engenharia genética, de segmentos gênicos de imunoglobuli- na pertencendo a espécies diferentes.

Um "antígeno" é uma entidade (por exemplo, uma entidade pro- teica ou peptídeo) ao qual um anticorpo especificamente se liga.

O termo "epitopo" ou "determinante antigênico" refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmen- to de ligação a antígeno do mesmo) se ligam especificamente. Epitopos po- dem ser formados tanto de aminoácidos contíguos como aminoácidos não contíguos justapostos pelo enovelamento terciário de uma proteína. Epitopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente conservados na expo- sição a solventes desnaturantes ao passo que epitopos formados pelo eno- velamento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação da conformação espacial de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia de raio x e ressonância magnética nuclear bidimensi- onal. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, volume 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Anticorpos representativos da invenção incluem um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a um epitopo que inclui X1EDX? em um agregado de proteína amiloide, que se liga ao epitopo inclu- indo X1EDX? que também está ligado, por exemplo, por um anticorpo 2A4, 7D8 ou8G9. Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo podem ser iden- tificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anti- corpo de bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno-alvo, isto é,

um ensaio de ligação competitiva. A ligação competitiva é determinada em um ensaio no qual a imunoglobulina no teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como AB. Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: ra- dioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio de en- zima direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em san- duíche (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de bioti- na-avidina direto em fase sólida (ver Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio de marcação direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de marcação direta em fase sólida (ver Harlow and Lane, Antibodies: A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcação direta em fase sólida usando marcação com |-125 (ver Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1):7 (1988)); EIA direto biotina-avidina em fase sólida (Cheung et al., Viro- logy 176:546 (1990)); e RIA de marcação direta. (Moldenhauer et al., Scand.

15. dJ Immunol. 32:77 (1990)). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso do antíge- no purificado ligado a uma superfície sólida ou células carregando qualquer destes, uma imunoglobulina teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de marcação ligada à superfície sólida ou células na presença da —imunoglobulina teste. Normalmente a imunoglobulina teste está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um an- tígeno comum em pelo menos 50 a 55%, 55 a 60%, 60 a 65%, 65 a 70%, 70 a 75% ou mais.

Um epitopo também é reconhecido por células imunológicas, por exemplo, células B e/ou células T. O reconhecimento celular de um epitopo pode ser determinado por ensaios in vitro que medem a proliferação depen- dente do antígeno, como determinado pela incorporação de %H-timidina, pela secreção de citocina, pela secreção de anticorpo, ou pela eliminação depen- dente de antígeno (ensaio de linfócito T citotóxico).

O termo "neoepitopo" refere-se a um novo e/ou único sítio em um antígeno no qual células B e/ou T respondem.

O termo "anticorpos de neoepitopo" refere-se a anticorpos que especificamente reconhecem uma nova sequência de aminoácidos de N- ou C-terminal exposta pela clivagem proteolítica de uma molécula, mas não se liga a tal epitopo na molécula (não clivada) nativa.

O termo "anticorpos de neoepitopo" pode referir-se a anticorpos que especificamente reconhecem uma nova sequência de aminoácidos de N- ou C-terminal exposta pela cli- vagem proteolítica de SAA, mas não se ligam a tal epitopo na molécula SANA (não clivada) nativa.

Alguns anticorpos de neoepitopo ligam-se a AA solúvel ou insolúvel e resultam na dissociação de agregados AA, incluindo fibrilas AA.

Um "anticorpo de neoepitopo" também pode ser um anticorpo que espe- cificamente reconhece um novo epitopo que está somente disponível para ligar-se a um anticorpo após uma proteína sofrer uma modificação de con- formação, por exemplo, como no caso de amiloidose AL e cadeia leve, quando somente a cadeia leve é expressa e forma o amiloide.

O termo "imunológico" ou resposta "imune" é o desenvolvimento de uma resposta humoral benéfica (mediada por anticorpo) e/ou uma celular (mediada por células T específicas para o antígeno ou seus produtos de secreção) direci- onada contra um peptídeo amiloide em um paciente recipiente.

Tal resposta pode ser uma resposta ativa induzida pela administração de imunógeno ou uma resposta passiva induzida pela administração de anticorpo ou células T preparadas.

Uma resposta imune celular é obtida pela apresentação de epi- topos polipeptídicos em associação com moléculas MHC Classe | ou Classe Il para ativar células T auxiliares CD4* e/ou células T citotóxicas CD8* antí- geno-específicas.

A resposta também pode envolver a ativação de monóci- tos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrócitos, célu- las microgliais, eosinófilos ou outros componentes de imunidade inata.

À presença de uma resposta imunológica mediada por célula pode ser deter- minada por ensaios de proliferação (células T CD4*) ou ensaios de CTL (lin- fócito T citotóxico) (ver Burke, supra; Tigges, supra). As contribuições relati- vas de respostas celulares e humorais ao efeito protetor ou terapêutico de um imunógeno podem ser distinguidas isolando separadamente anticorpos e células T de um animal singeneico imunizado e medindo efeito protetor ou terapêutico em um segundo indivíduo.

Um "agente imunogênico" ou "imunógeno" é capaz de induzir uma resposta imunológica contra si mesmo na administração a um mamiífe- ro, opcionalmente em conjunto com um adjuvante.

O termo "polinucleotídeo nu" refere-se a um polinucleotídeo não complexado com materiais coloidais. Polinucleotídeos nus são às vezes clo- nados em um vetor plasmidial.

O termo "adjuvante" refere-se a um composto que quando admi- nistrado em conjunto com um antígeno aumenta a resposta imune ao antí- geno, mas quando administrado sozinho não gera uma resposta imune ao antígeno. Os adjuvantes podem aumentar uma resposta imune por vários mecanismos incluindo recrutamento de linfócito, estimulação de células B e/ou T, e estimulação de macrófagos.

O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para alcançar ou pelo menos parcialmente alcançar o efeito desejado. O termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente deter a doença e suas complicações em um paciente que já sofre da doença. Quan- tidades eficazes para este uso dependerão da severidade da infecção e o estado geral do sistema imune do próprio paciente.

O termo "paciente" inclui indivíduos mamíferos humanos e ou- tros que recebem o tratamento profilático ou terapêutico.

A invenção fornece anticorpos ou fragmentos de ligação a antí- geno do mesmo que se ligam especificamente a um epitopo que inclui X1EDX: em um agregado de proteína amiloide, e que compete pela ligação ao epitopo compreendendo X:EDX2 com, por exemplo, um anticorpo 2A4, 7D8 ou 8G9. A competição entre anticorpos é determinada por um ensaio no qual a imunoglobulina sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como AA. Numerosos tipos de en- —saios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al., Methods in Enzymology, 9:242-253 (1983)); EIA de biotina-avidina di- reto em fase sólida (ver Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensaio de marcação direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de marca- ção direta em fase sólida (ver Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcação direta em fase sólida usando marcação com 1-125 (ver Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1):7-15 (1988)); EIA com biotina-avidina direto em fase sólida (Cheung et al., Virology, 176:546-552 (1990)); e RIA de marcação direta (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol., 32:77-82 (1990)). Tipicamente, tal ensaio envolve ouso do antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que expressam o antígeno, uma imunoglobulina teste não marcada e uma imu- noglobulina de referência marcada. A inibição competitiva é medida pela de- terminação da quantidade de marcação ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina teste. Normalmente a imunoglobulina teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados pelo ensaio de com- petição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam no mesmo epitopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epitopo adjacente suficientemente proximal ao epitopo ligado pelo anti- corpo de referência para o impedimento estérico ocorrer. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50% a 75%.

Um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína ami- loide significa um anticorpo que se liga à proteína amiloide com uma afinida- dede pelomenos 10” M. Alguns anticorpos ligam-se à proteína amiloide com afinidades entre 10º M e 10" M'.

Um anticorpo que se liga especificamente ao agregado de prote- íÍna amiloide tal como agregado AA sem ligar-se especificamente à proteína amiloide monomérica significa um anticorpo que se liga ao agregado de pro- teína amiloide, tal como, por exemplo, fibrilas (por exemplo, AA em folha B em forma dobrada agregada tal como de um cadáver de um paciente de Amiloidose AA prévia ou um modelo animal transgênico) como descrito aci-

ma e tem pelo menos dez vezes e normalmente pelo menos de 100 vezes afinidade de ligação menor específica para formas monoméricas da proteína amiloide. Por exemplo, tal anticorpo poderia ligar-se a AA solúvel com uma afinidade de 10º M' e a placas com uma afinidade menor que 107 M. À afinidade de tais anticorpos por placas é normalmente menos de 107 ou 106 M. Tais anticorpos são adicionalmente ou alternativamente definidos pela intensidade de fluorescência em relação a um anticorpo de controle irrele- vante (por exemplo, um anticorpo ou mistura de anticorpos policlonais a um peptídeo AA reversâmero) quando os anticorpos são contatados com fibrilas eligação avaliada por marcação fluorescente. A intensidade de fluorescên- cia de anticorpos que se ligam ao peptídeo AA solúvel sem ligar-se a placas está em um fator de cinco, às vezes em um fator de dois e às vezes indistin- guível dentro do erro experimental daquele do anticorpo de controle. Composições ou métodos "compreendendo" um ou mais ele- mentos citados podem incluir outros elementos não especificamente citados. Por exemplo, uma composição que compreende o peptídeo AA engloba tan- to um peptídeo AA isolado como peptídeo AA como um componente de uma sequência polipeptídica maior. Il. Doenças amiloides

1. Panorama e Patogênese Doenças amiloides ou amiloidoses incluem diversos estados de doença que têm uma larga variedade de sintomas externos. Estas desor- dens têm em comum a presença de depósitos extracelulares anormais de fibrilas proteicas, conhecidas como "depósitos amiloides" ou "placas amiloi- des" que têm normalmente aproximadamente 10 a 100 um de diâmetro e são localizadas em órgãos ou regiões teciduais específicos. Tais placas são compostas principalmente de uma proteína ou peptídeo solúvel que ocorre naturalmente. Estes depósitos insolúveis são geralmente compostos de agregados laterais de fibrilas que têm aproximadamente 10 a 15 nm de diâ- metro. As fibrilas amiloides produzem uma característica birrefringência ma- çã verde em luz polarizada, quando marcadas com o corante Congo Red. As desordens são classificadas com base nos principais componentes fibrilares que formam os depósitos de placa, como discutido abaixo.

Os peptídeos ou proteínas que formam os depósitos de placa muitas vezes são produzidos a partir de uma proteína precursora maior. Mais especificamente, a patogênese de depósitos de fibrila amiloide geral- mente envolve a clivagem proteolítica de uma proteína precursora "anormal" em fragmentos. Estes fragmentos geralmente agregam-se em folhas dobra- das B antiparalelas; entretanto, foi relatada que certas formas não degrada- das da proteína precursora agregam-se e formam fibrilas na polineuropatia amiloide familial (fibrilas de transtiretina variante) e amiloidose relacionada à diálise (fibrilas de B2 microglobulina) (Tan, et a/., 1994, supra).

2. Síndromes Clínicas Esta seção fornece descrições dos principais tipos de amiloido- ses, incluindo suas composições fibrilares de placa características. É uma descoberta geral da presente invenção que as doenças amiloides podem ser tratadas pela administração de agentes que servem para estimular uma res- posta imune contra um componente ou componentes dos vários depósitos amiloides doença-específicos. Como discutido em mais detalhes na Seção C abaixo, tais componentes são preferencialmente constituintes de fibrilas que formam as placas. As seções abaixo servem para exemplificar as principais formas de amiloidose e não são destinadas a limitar a invenção.

a. Amiloidoses AL A deposição amiloide AL está associada geralmente com quase toda discrasia da linhagem de linfócito B, variando da malignidade de células plasmáticas (mieloma múltiplo) à gamopatia monoclonal benigna. De vez em quando, a presença de depósitos amiloides pode ser um indicador primário da discrasia subjacente.

Fibrilas de depósitos amiloides AL são compostas de cadeias leves de imunoglobulina monoclonais ou fragmentos das mesmas. Mais es- pecificamente, os fragmentos são derivados da região N-terminal da cadeia leve (capa ou lambda) e contêm todo ou parte do domínio variável (V.) do mesmo. Os depósitos geralmente ocorrem nos tecidos mesenquimais, cau- sando neuropatia periférica e autônoma, síndrome de túnel do carpo, ma-

croglossia, cardiomiopatia restritiva, artropatia de grandes articulações, dis- crasias imunes, mielomas, bem como discrasias ocultas.

Entretanto, deve ser observado que quase qualquer tecido, particularmente órgãos viscerais, tais como coração, podem ser envolvidos. b.

Amiloidoses Sistêmicas Hereditárias Há muitas formas de amiloidoses sistêmicas hereditárias.

Embo-

ra sejam condições relativamente raras, o início adulto de sintomas e seus padrões de herança (normalmente dominante autossômico) leva à persis- tência de tais desordens na população geral.

Geralmente, as síndromes são atribuíveis a mutações pontuais em proteína precursora levando à produção de peptídeos ou proteínas amiloidogênicos variantes.

A tabela 2 resume a composição fibrilar de formas exemplares destas desordens.

Tabela 2 Amiloidoses Hereditárias?

Peptídeo/Proteína Fibrilar | Variante genética

Transtiretina e fragmentos | Met30, muitos ou- | Polineuropatia amiloide

(ATTR) tros famíilial (FAP), (princi- palmente nervos perifé- ricos)

Transtiretina e fragmentos | Thr45, Ala60, | Predominante — envolvi-

(ATTR) Ser84, Met111, | mento cardiac sem neu-

lle122 ropatia

Fragmento N-terminal Apo- | Arg 26 Polineuropatia amiloide lipoproteína A1 (apoAl) famíilial (FAP), (princi- palmente nervos perifé- ricos)

Fragmento N-terminal Apo- | Arg26, Arg50, Arg | Tipo Ostertag, não neu-

lipoproteína A1 (AapoAl) 60, outros ropática (envolvimento predominantemente visceral)

Lisozima (Alys) Thr56, His67 Tipo Ostertag, não neu- ropática (envolvimento predominantemente visceral)

Fragmento de cadeia a de | Leu554, Val 526 Tipo Ostertag, não neu-

fibrinogênio ropática (envolvimento predominantemente visceral)

Peptídeo/Proteína Fibrilar | Variante genética Fragmento de gelsolina | Asn187, Tyr1i87 Neuropatia craniana (Agel) com distrofia corneana lattice Fragmento de cistatina C Glu68 Hemorragia cerebral hereditária — (angiopatia amiloide cerebral)-Tipo islandesa Proteína B-amiloide (AB) | Gln693 Hemorragia cerebral derivada de Proteína Pre- hereditária — (angiopatia cursora Amiloide (APP) amiloide cerebral)-Tipo holandesa Proteína B-amiloide (AB) | lleri7, Phe7i7,|Malde Alzheimer Fami- derivada de Proteína Pre- | Gly717 lial cursora Amiloide (APP) Proteína B-amiloide (AB) | Asn670, Leu671 Demência Familial- derivada de Proteína Pre- provável Mal de Alzhei- cursora Amiloide (APP) mer Proteína Príon (PrP) deri- |Leu102, Val167,| Doença de Creutzfeldt- vada da inserção 51-91 a | Asn178, Lys200 Jakob Familial; Síndro- proteína precursora de PrP me de Gerstmann- Strãussler-Scheinker (encefalopatias esp- pongiformes, — doenças de príon) AA derivada de Proteína Febre Mediterrânea amiloide A sérica (ApoS- Familial, predominante SA) envolvimento renal (au- tossômica recessiva) AA derivada de Proteína Síndrome de Muckle- amiloide A sérica (ApoS- Well, nefropatia, surdez, SA) urticária, — dores nos membros Desconhecido Cardiomiopatia com paralisia atrial persisten- te Desconhecido Depósitos cutâneos (bo- lhosos, papulares, pus- tulodérmicos) aDados derivada de Tan & Pepys, 1994, supra.

Os dados fornecidos na Tabela 2 são exemplares e não são destinados a limitar o escopo da invenção. Por exemplo, mais de 40 muta- ções pontuais separadas no gene de transtiretina foram descritas, todas as quaisdão origem a formas clinicamente similares de polineuropatia amiloide familial.

Transtiretina (TTR) é uma proteína de 14 kilodaltons que é tam- bém às vezes referida como pré-albumina. É produzida pelo fígado e plexo coroide, e funciona no transporte de hormônios tireoidianos e vitamina A.

Pelomenos 50 formas de variantes da proteína, cada uma caracterizada por uma modificação de aminoácido única, são responsáveis por várias formas de polineuropatia amiloide familial. Por exemplo, a substituição de prolina por leucina na posição 55 resulta em uma forma particularmente progressiva de neuropatia; a substituição de metionina por leucina na posição 111 resul- tou em uma cardiopatia severa em pacientes dinamarqueses. Depósitos amiloides isolados em tecido cardíaco de pacientes com amiloidose sistêmi- ca revelaram que os depósitos são compostos de uma mistura heterogênea de TTR e fragmentos da mesma, coletivamente referidos como ATTR, as sequências completas das quais foram caracterizadas. Os componentes fi- brilares de ATTR podem ser extraídos de tais placas e sua estrutura e se- quência determinada de acordo com métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Gustavsson, A., et al., Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995; Kametani, F., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 622-628, 1984; Pras, M., et al., PNAS 80: 539-42, 1983).

Pessoas que têm mutações pontuais na molécula apolipoproteí- na Al (por exemplo, Gly>Arg26; Trp > Arg50; Leu — Arg60) exibem uma forma da amiloidose (tipo Ôstertag") caracterizada por depósitos da proteína apolipoproteína Al ou fragmentos da mesma (AApoAl). Estes pacientes têm baixos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) e apresentam uma neuropatia periférica ou falência renal.

Uma mutação na cadeia alfa da enzima lisozima (por exemplo, Ile>Thr56 ou Asp>His57) é a base de outra forma amiloide hereditária não neuropática tipo Óstertag relatada em famílias inglesas. Aqui, as fibrilas da proteína lisozima mutante (Alys) são depositadas, e os pacientes geralmente exibem função renal prejudicada. Esta proteína, diferentemente da maioria das proteínas formadoras de fibrila descritas neste pedido, está presente normalmente na forma inteira (não fragmentada) (Benson, M.D., et al. CIBA

Fdn. Symp. 199: 104-131, 1996).

Peptídeo Bamiloide (AB) é um peptídeo de 39 a 43 aminoácidos derivado por proteólise de uma grande proteína conhecida como proteína precursora beta amiloide (BAPP). Mutações em BAPP resultam em formas familialis de mal de Alzheimer, síndrome de Down e/ou demência senil, ca- racterizadas pela deposição cerebral de placas compostas de fibrilas AB e outros componentes, que são descritos em detalhes adicionais abaixo. Mu- tações conhecidas em APP associadas com mal de Alzheimer ocorrem pró- ximas aos sítios de clivagem B ou y secretase, ou dentro de AB. Por exem- plo, a posição 717 está próxima ao sítio y-secretase de clivagem de APP em seu processamento em AB e as posições 670/671 são próximas ao sítio de clivagem da B-secretase. Mutações em qualquer destes resíduos podem resultar na mal de Alzheimer, presumivelmente causando um aumento da quantidade da forma de 42/43 aminoácidos de AB gerada a partir de APP. À estrutura e sequência de peptídeos AB de vários comprimentos são bem co- nhecidas na técnica. Tais peptídeos podem ser feitos de acordo com os mé- todos conhecidos na técnica (por exemplo, Glenner and Wong, Biochem Bi- ophys. Res. Comm. 129: 885-890, 1984; Glenner and Wong, Biochem Bi- ophys. Res. Comm. 122: 1131-1135, 1984). Além disso, várias formas dos peptídeos estão comercialmente disponíveis.

Sinucleína é uma proteína associada à sinapse que se parece com uma alipoproteína e é abundante em citossol neuronal e terminais pré- sinápticos. Um fragmento peptídico derivado de a-sinucleína, denominado NAC, é também um componente de placas amiloides da mal de Alzheimer.

(Clayton, et al., 1998). Este componente também serve como um alvo para tratamentos baseados imunologicamente da presente invenção, como deta- lhado abaixo.

Gelsolina é uma proteína de ligação a cálcio que se liga a e fra- gmenta filamentos de actina. Mutações na posição 187 (por exemplo, —Asp>Asn; Asp>Tyr) da proteína resultam em uma forma de amiloidose sis- têmica hereditária, normalmente encontrada em pacientes da Finlândia, bem como pessoas de origem holandesa ou japonesa. Em indivíduos afligidos,

fibrilas formadas a partir de fragmentos de gelsolina (Agel), normalmente consistem de aminoácidos 173 a 243 (fragmento carboxiterminal de 68 kDa) e são depositados em vasos sanguíneos e membranas basais, resultando em distrofia corneana e neuropatia cranial que progride à neuropatia periféri- ca, modificações distróficas cutâneas e deposição em outros órgãos. (Kan- gas, H., et al. Human Mol. Genet. 5 (9): 1237-1243, 1996).

Outras proteínas mutadas, tais como a cadeia alfa mutante de fibrinogênio (AfibA) e cistatina C mutante (Acys) também formam fibrilas e produzem desordens hereditárias características. Fibrilas AfibA formam de- pósitos característicos de um amiloide hereditário não neuropático com do- ença renal; os depósitos de Acys são característicos de uma angiopatia de amiloide cerebral hereditária relatada na Islândia. (Isselbacher, et al., Harri- son's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson, et al., supra.). Em pelo menos alguns casos, foi mostrado que paci- entes com angiopatia amiloide cerebral (CAA) têm fibrilas amiloides conten- do uma forma não mutante de cistatina C em conjunto com proteína beta.

(Nagai, A., et al. Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63-78, 1998). Considera-se agora que certas formas da doença de príon são hereditárias, contabilizando até 15% dos casos, que foram anteriormente pensados ser predominantemente de natureza infecciosos. (Baldwin, et al., em Research Advances in Alzheimer Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). Em tais desordens de príon, os pacientes desenvolvem placas compostas de isoformas anormais da proteína príon normal (PrPº). Uma isoforma mutante predominante, PrPSº, também referida como AScr, se diferencia da proteína celular normal em sua resistência à degradação por protease, insolubilidade após extração com detergente, de- posição em lisossomas secundários, síntese pós-traducional, e alto conteú- do de folha B dobrada. Ligação genética foi estabelecida em pelo menos cinco mutações resultando em doença de Creutzfeldt-Jacob (CJD), síndrome de Gerstmann-Strâussler-Scheinker (GSS), e insônia familial fatal (FFI). (Baldwin). Métodos para extrair peptídeos fibrilares de fibrilas de scrapie, determinar sequências e construir tais peptídeos são conhecidos na técnica.

(por exemplo, Beekes, M., et al.

J.

General.

Virol. 76: 2567-76, 1995). Por exemplo, uma forma de GSS foi ligada a uma mutação de PrP no códon 102, enquanto GSS telencefálica segrega com uma mutação no códon 117. Mutações nos códons 198 e 217 resultam em uma forma de GSS em que placas neuríticas características da mal de Alzheimer contêm PrP em vez de um peptídeo AB.

Certas formas de CJD familial estão associ- adas com mutações nos códons 200 e 210; mutações nos códons 129 e 178 foram encontradas tanto em CJD famiílial como em FFI. (Baldwin, supra). c.

Amiloidose Sistêmica Senil Deposição amiloide, sistêmica ou focal, aumenta com a idade.

Por exemplo, fibrilas da transtiretina selvagem (TTR) são comumente encon- tradas no tecido cardíaco de indivíduos idosos.

Estas podem ser assintomá- ticos, clinicamente silenciosos, ou podem resultar na falência cardíaca.

De- pósitos focais fibrilares assintomáticos também podem ocorrer no cérebro (AB), corpos amiláceos da próstata (microglobulina AB), articulações e vesí- culas seminais. d.

Amiloidose Cerebral A deposição local de amiloide é comum no cérebro, particular- mente em indivíduos idosos.

O tipo mais frequente de amiloide no cérebro é composto principalmente de fibrilas peptídicas AB, resultando em demência ou mal de Alzheimer esporádica (não hereditária). De fato, a incidência da mal de Alzheimer esporádica excede grandemente as formas mostradas se- rem hereditárias.

Peptídeos fibrilares que formam estas placas são muito similares aos descritos acima, com referência a formas hereditárias da mal de Alzheimer (AD). e.

Amiloidose relacionada à Diálise Placas compostas fibrilas de microglobulina B2 (AB2M) comu- mente desenvolvem-se em pacientes que recebem hemodiálise ou diálise peritoneal em longo prazo.

Microglobulina B2 é um polipeptídeo de 11,8 kilo- daltonse é a cadeia leve de antígenos de MHC Classe |, que estão presen- tes em todas as células nucleadas.

Sob circunstâncias normais, é continua- mente dispersa de membranas celulares e é normalmente filtrada pelo rim.

À falência da depuração, tal como no caso da função renal prejudicada, leva à deposição no rim e outros sítios (principalmente em tecidos ricos em coláge- no das articulações). Diferentemente de outras proteínas fibrilares, as molé- culas de AB2M estão presentes geralmente na forma não fragmentada nas fibrilas. (Benson, supra). f.

Amiloidoses derivadas de Hormônio Órgãos endócrinos podem abrigar depósitos amiloides, particu- larmente em indivíduos idosos.

Tumores secretores de hormônio também podem conter placas amiloides derivadas de hormônio, as fibrilas dos quais são compostas de hormônios polipeptídicos, tais como calcitonina (carcino- ma medular da tireoide), polipeptídeo amiloide de ilhota (amilina; ocorrendo na maioria de pacientes com diabetes Tipo Il), e peptídeo natriurético atrial (amiloidose atrial isolada). Sequências e estruturas destas proteínas são bem conhecidas na técnica. g.

Amiloidoses Diversas Há uma variedade de outras formas de doença amiloide que são normalmente manifestadas como depósitos localizados de amiloide.

Em ge- ral, estas doenças são provavelmente o resultado da produção localizada e/ou falta do catabolismo de precursores de fibrila específicos ou uma pre- disposição de um tecido particular (tais como a articulação) para deposição fibrilar.

Exemplos de tal deposição idiopática incluem amiloide AL nodular, amiloide cutâneo, amiloide endócrino e amiloide relacionado ao tumor.

Ill.

Doenças amiloides de AA Amiloidose AA, outrora chamada amiloidose secundária ou rea- tiva porque se desenvolve secundariamente a uma doença pré-existente ou coexistente.

Tais doenças incluem, mas não são limitadas a doenças infla- matórias, tais como artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondilite an- quilosante, psoríase, artropatia psoriática, síndrome de Reiter, doença de Still do Adulto, síndrome de Behcet e doença de Crohn.

Depósitos de AA também são produzidos como resultado de infecções microbianas crônicas, tais como lepra, tuberculose, bronquiectasia, úlceras de decúbito, polinefrite crônica, osteomielite e doença de Whipple.

Certas neoplasias malignas tam-

bém podem resultar em depósitos amiloides de fibrila AA. Estes incluem tais condições como linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intesti- no, pulmão e trato urogenital, carcinoma de célula basal, e leucemia de célu- la cabeluda. A doença amiloide AA também pode resultar de doenças infla- matórias herdadas, tais como Febre Mediterrânea Familial. Adicionalmente, a doença amiloide AA pode resultar de desordens linfoproliferativas, tais co- mo Doença de Castleman.

1. Doenças Inflamatórias Associadas com Amiloidose AA Artrite reumatoide é uma doença sistêmica crônica principalmen- te das articulações. Os sintomas da artrite reumatoide são marcados por modificações inflamatórias nas membranas sinoviais e estruturas articulares (articulações) e por atrofia e rarefação (reduções de densidade óssea) dos ossos. Em estágios tardios de artrite reumatoide, deformidade e anquilose (imobilidade da articulação) desenvolvem-se. Um modelo de artrite reuma- toide pode ser induzido em camundongos ou ratos pela administração de colágeno tipo |l em adjuvante de Freund completo.

Artrite crônica juvenil aparece em muitas formas; a mais comum sendo artrite reumatoide juvenil. Pode ocorrer em crianças em qualquer ida- de, mas primeiro aparece mais comumente entre as idades de 2 e 6 anos.

Há3 tipos principais de artrite reumatoide juvenil, ou seja, artrite pauciarticu- lar, artrite poliarticular e artrite sistêmica (também conhecida como doença de Still). A artrite pauciarticular tipicamente afeta 4 ou menos articulações, normalmente as maiores, tais como os joelhos. Pode ser acompanhada por rigidez, fazendo a criança mancar. A artrite poliarticular é caracterizada por 5 oumais articulações que são afetadas, as mais comumente as menores arti- culações nas mãos e pés. Crianças com artrite poliarticular muitas vezes têm uma forma mais severa da doença. Artrite sistêmica é caracterizada pela inchação da articulação em combinação com febre e uma erupção rósea. As articulações podem não começar a inchar até alguns meses ou anos após o início das febres. Também pode afetar órgãos internos, tais como fígado, coração, baço e linfonodos, e anemia é comum. Enquanto a artrite sistêmica tende a diminuir por conta própria, uma pequena porcentagem destas crian-

ças pode ter artrite severa que continua na idade adulta.

Espondilite anquilosante é uma doença reumática que causa artrite das articulações espinhais e sacroilíacas e pode causar a inflamação dos olhos, pulmões, e valvas cardíacas. Varia de episódios intermitentes de dornas costas que ocorrem ao longo da vida a uma doença crônica severa que ataca a espinha, articulações periféricas e outros órgãos corporais, re- sultando em rigidez articular e rigidez nas costas, perda de movimento e de- formidade conforme a vida progride.

Psoríase é uma dermatose crônica, escamosa comum, marcada por exacerbação e remissões e tendo um padrão de herança poligênica. Os sintomas da psoríase são marcados pela presença de fragmentos de des- camação seca, arredondados de vários tamanhos, cobertos por escalas de branco acinzentado ou branco prateado que têm uma predileção por superfí- cies extensoras, unhas, escalpo, genitálias e região lombossacral.

Artropatia psoriática é uma desordem na qual a psoríase é liga- da ao desenvolvimento de artrite. A desordem pode ser exibida em uma va- riedade de maneiras. A artrite é geralmente branda e envolve somente al- gumas articulações. Em alguns pacientes, a doença é severa e normalmente afeta os dedos e a espinha. Quando a espinha é afetada, os sintomas pare- cem-se muito com aqueles da espondilite anquilosante.

A síndrome de Reiter é um grupo de sintomas consistindo em artrite, uretrite (inflamação do trato urogenital), conjuntivite (inflamação do revestimento ocular), e lesões da pele e membranas mucosas. A síndrome de Reiter também é referida como artrite reativa, que significa que a artrite ocorrecomo "uma reação" a uma infecção que começou em outro lugar no corpo. Chlamydia trachomatis é a bactéria muitas vezes associada com a síndrome de Reiter adquirida pelo contato sexual. Várias bactérias diferentes estão associadas com a síndrome de Reiter adquirida através do trato diges- tório, incluindo Salmonella, Shigella, Yersinia e Campylobacter.

A doença de Still do Adulto, também chamada Doença de Still de Início Adulto é uma condição inflamatória rara que ataca órgãos internos, articulações e outras partes do corpo. Pode aparecer e desaparecer repenti-

namente. Em casos muito severos, a doença de Still do Adulto torna-se crô- nica e extremamente debilitante, causando dor terrível e rigidez. Após muitos anos, a doença mutila órgãos vitais, tais como coração e pulmões. A síndrome de Behcet é uma desordem multissistêmica presente em ulcerações orais e/ou genitais recorrentes, uveites recidivantes crônicas que podem causar cegueira e prejuízos neurológicos. É caracterizada por 4 sintomas principais: úlceras aftosas orais, lesões cutâneas, sintomas ocula- res e ulcerações genitais, e ocasionalmente por inflamação em tecidos e órgãos ao longo do corpo, incluindo o trato gastrintestinal, sistema nervoso central, sistema vascular, pulmões e rins. A artrite da síndrome de Behcet é normalmente febre intermitente, autolimitada, não deformante e localizada nos joelhos e tornozelos. A doença de Crohn é uma doença inflamatória granulomatosa crônica (corpo ou crescimento similar a pequeno grão) envolvendo qualquer partedo trato gastrintestinal da boca ao ânus; mas comumente envolvendo o ileo (três-quintos inferiores do intestino delgado) com escoriações e espes- samento da parede intestinal. Os sintomas da doença de Crohn incluem a presença de diarreia crônica, sons intestinais aumentados, ter cólicas, possi- velmente evidenciados por perda de peso e aversão à comida.

2. Doenças de Infecção Microbiana Crônicas Associadas com Amiloidose AA Lepra é uma doença infecciosa caracterizada chagas desfigu- rantes cutâneas, dano neural periférico, e debilitação progressiva. A lepra é causada pelo organismo Mycobacterium leprae, que não é muito contagioso etem um período de incubação longo. Lepra tem duas formas comuns, tu- berculoide e lepromatosa. Ambas as formas produzem chagas na pele, mas a forma lepromatosa é a mais severa, produzindo grandes nódulos, desfigu- rantes (protuberâncias e inchaços). Lepra consequentemente causa dano neurológico periférico. Os pacientes com lepra de longo prazo podem perder ousodassuasmãos ou pés devido à injúria repetida resultando na perda de sensação. Tuberculose é uma infecção bacteriana contagiosa causada por

Mycobacterium tuberculosis. A doença é caracterizada pelo desenvolvimento de granulomas (tumores granulares) nos tecidos infectados. Os pulmões são principalmente envolvidos, mas a infecção pode estender-se a outros ór- gãos.

Bronquiectasia é uma destruição anormal e dilatação das vias aéreas superiores. Bronquiectasia muitas vezes é causada por inflamação ou infecção recorrente das vias aéreas. Uma bactéria clássica que é vista em pacientes com bronquiectasia é Pseudomonas aeruginosa, que é notori- amente difícil de erradicar. Infecções repetidas das vias aéreas por esta bac- téria podem levar à colonização dos brônquios por este organismo que pre- dispõe tais pessoas a pneumonias Pseudomônicas, que requerem antibióti- Cos especiais para tratamento.

Úlcera de decúbito também conhecida como úlcera ou ferida de pres- são é uma ulceração da pele e tecidos subjacentes causados pela pressão prolongada sobre a área afetada. Começam como pele ruborizada, mas tor- nam-se progressivamente piores, formando uma bolha, então uma chaga aberta, e finalmente uma cratera. Estas ulcerações normalmente ocorrem sobre proeminências ósseas, tais como calcanhar, área coccígena da náde- ga e atrás da cabeça.

Polinefrite crônica é uma infecção do rim e dos ureteres (tubos que carregam a urina para fora do rim). A polinefrite muitas vezes ocorre como resultado da infecção do trato urinário, particularmente na presença de retrofluxo de urina ocasional ou persistente da bexiga nos ureteres ou pelve renal.

Osteomielite é uma infecção óssea aguda ou crônica, normal- mente causada por bactérias. Muitas vezes, a infecção inicia em outra parte do corpo e espalha-se para o osso através do sangue. Quando o osso é in- fectado, pus é produzido dentro do osso, que pode resultar em um abcesso. O abcesso então priva o osso da sua provisão de sangue. Osteomielite crô- nica resulta quando o tecido ósseo morre como resultado da perda da provi- são sanguínea. A infecção crônica pode persistir intermitentemente por anos.

A doença de Whipple é uma condição rara que causa absorção inadequada de nutrientes do trato intestinal devido à infecção do intestino. É causado pelas bactérias, Tropheryma whippelii. Os sintomas incluem diar- reia, hemorragia intestinal, dor abdominal, perda de apetite, perda de peso, fadiga e fraqueza. Artrite e febre muitas vezes ocorrem vários anos antes que os sintomas intestinais se desenvolvam. Os pacientes podem experi- mentar sintomas neurológicos também. O diagnóstico é baseado em sinto- mas e nos resultados de uma biópsia do tecido do intestino delgado ou ou- tros órgãos que são afetados. Quando reconhecida e tratada, a doença de Whipple pode ser normalmente curada. Sem tratamento, a condição é nor- malmente fatal.

3. Neoplasias Malignas Associadas com Amiloidose AA Linfoma de Hodgkin é um câncer do tecido linfático encontrado nos linfonodos, baço, fígado e medula óssea. O primeiro sinal deste câncer é muitas vezes um linfonodo aumentado. A doença pode estender-se a linfo- nodos próximos e após pode estender-se aos pulmões, fígado, ou medula Óssea. Carcinoma renal é o câncer do rim. As células cancerosas são encontradas no revestimento de túbulos no rim. O primeiro sintoma é nor- malmente sangue na urina. Às vezes ambos os rins estão envolvidos. O câncer espalha-se facilmente, muitas vezes aos pulmões e outros órgãos. Carcinoma de célula renal é tipo mais comum do câncer de rim seguido pelo carcinoma de célula renal papilar, carcinoma renal cromófobo e carcinoma renal de ducto coletor. Aproximadamente 5% dos carcinomas renais são não classificados porque sua aparência não se ajusta em nenhuma das outras categorias. Carcinomas do intestino incluem cânceres gastrintestinais tais como colorretal, pancreático, estomacal e esofágico. O câncer colorretal é o câncer que surge no intestino grosso ou no reto. Quase todos os cânceres colorretais começam como pólipos benignos que, durante o período de mui- tos anos, se desenvolvem em cânceres. A maioria dos casos de câncer co- lorretal não têm sintomas. Câncer pancreático é uma malignidade do pân-

creas. Os sintomas incluem dor abdominal, perda do apetite, perda de peso significante e icterícia indolor. Câncer de estômago, também chamado cân- cer gástrico, pode desenvolver-se em qualquer parte do estômago e pode espalhar-se ao longo do estômago e para outros órgãos; particularmente o esôfago e intestino delgado. Também pode espalhar-se, através da parede do estômago, a linfonodos próximos e órgãos, tais como fígado, pâncreas, e pulmões, ou a órgãos distantes, tais como os linfonodos acima da clavícula, cólon e ovários. Câncer de estômago é muitas vezes assintomático. Câncer esofágico é malignidade do esôfago. Sintomas incluem disfagia (dificuldade de engolir), dor e perda de peso substancial.

Carcinomas do pulmão são um câncer dos pulmões caracteriza- dos pela presença de tumores malignos. Há dois tipos principais do câncer de pulmão: câncer de não pequenas células de pulmão e câncer de peque- nas células de pulmão. Sintomas dependem de tipo específico do câncer, mas podem incluir tosse crônica, tosse com sangue, falta de ar, respiração ofegante, dor no peito, perda de apetite, perda de peso e fadiga.

Carcinomas do trato urogenital incluem, mas não são limitados a câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer do endométrio, câncer cervical e câncer ovariano. Câncer de próstata envolve um crescimento tumoral ma- ligno dentro da glândula próstata. Sintomas podem incluir urinação frequen- te, dificuldade em iniciar e manter uma corrente constante de urina, sangue na urina, urinação dolorosa, dificuldade de alcançar ereção ou ejaculação dolorosa. Câncer de bexiga refere-se a algum dos vários tipos de crescimen- tos malignos da bexiga urinária. Sintomas incluem sangue na urina, urinação frequente, urinação dolorosa e urgência urinária. Câncer do endométrio en- volve crescimento canceroso do endométrio (revestimento do útero). Ocorre principalmente após menopausa, e apresenta-se hemorragia vaginal. Câncer cervical é uma malignidade do cérvix. Os estágios iniciais do câncer cervical podem ser completamente assintomáticos. Hemorragia vaginal pode indicar a presença de malignidade. Em estágios avançados, metástases podem es- tar presentes no abdômen, pulmões ou em outro lugar. Câncer ovariano é uma neoplasia maligna dos ovários. Sintomas de câncer ovariano são mui-

tas vezes vagos e não específicos, que incluem desconforto vago abdominal inferior, sentido de peso pélvico, ciclo menstrual anormal, hemorragia vagi- nal, ganho ou perda de peso, sintomas gastrintestinais não específicos. Cânceres ovarianos liberam células de câncer que muitas vezes se implan- tam no útero, bexiga, intestino e revestimento da parede intestinal. Estas células de câncer podem começar a formar novos tumorais que crescem antes que o câncer seja até suspeito. Carcinoma de célula basal é um tumor de pele de crescimento lento envolvendo modificações cancerosas em células cutâneas basais. Sin- tomas incluem lesões cutâneas localizadas no rosto, orelha, pescoço, peito, costas ou escalpo; vasos sanguíneos visíveis na lesão ou pele adjacente; e chagas persistentes, que não se curam. Este câncer normalmente permane- ce local e quase nunca se espalha a partes distantes do corpo, mas pode continuar crescendo e invadir tecidos e estruturas próximas, incluindo ner- vos, ossos e cérebro. Leucemia de célula cabeluda é um câncer de linfócitos (células B) que leva a contagens sanguíneas baixas. A doença é causada pelas célu- las B anormalmente formadas com projeções similares a cabelo. Sintomas são muitas vezes vagos. As contagens sanguíneas baixas causadas pela leucemia de célula cabeluda podem levar a infecções, fadiga e hemorragia excessiva.

4. Doença Inflamatória Herdada Associada com AA Febre Mediterrânea Famiílial é uma desordem herdada caracteri- zada por febre e inflamação recorrentes, muitas vezes envolvendo o abdô- menouo pulmão. Sintomas incluem inflamação no revestimento da cavida- de abdominal, cavidade torácica, pele, ou articulações ocorrem, junto com febres altas que normalmente chegam ao ponto máximo em 12 a 24 horas. Ataques podem variar na severidade de sintomas, e pessoas são normal- mente livres de sintoma entre os ataques. Esta doença é muito rara. Fatores de riscos incluem uma história familiar de Febre Mediterrânea Famiílial ou tendo ancestralidade Mediterrânea.

5. Desordens Linfoproliferativas Associadas com Amiloidose AA

Doença de Castleman é uma forma patologicamente caracteri- zada de desordem linfoproliferativa pela presença de hiperplasia do linfono- do gigante com infiltração celular plasmática. Pacientes com Doença de Castleman comumente têm febre, anemia, hipergamaglobulinemia, e um aumento nas concentrações séricas de proteínas de reagente de fase agu- da, todas as quais são referidas à grande quantidade de IL-6 produzida nos linfonodos. IV. Amiloide Sérica A

1. Amiloide Sérica Humana À Amiloide sérica (SAA) é o precursor circulante da proteína ami- loide A, o componente fibrilar de depósitos amiloides. Os estudos estruturais mostraram que a SAA humana é heterogênea e representa uma família de genes SAA polimórficos e produtos proteicos. A superfamília gênica SAA compreende um grupo de genes estreitamente ligados localizados em 11p15.1. Ver Sellar, GC et al. Genomics 19: 221-227 (1994). Quatro genes SAA foram descritos em humanos. Sequências de aminoácido representati- vas de proteínas codificadas por quatro genes SAA são ilustradas pela figura

1. Dois genes (SAA1 e SAA2Z) codificam amiloide sérica A de fase aguda (A- SAA) e são coordenadamente induzidos em resposta à inflamação. SAA1 e —SAA2Z compartilham identidade de sequência de 95% tanto em regiões codi- ficantes como em não codificantes. Há isoformas alfa, beta e gama de SAA1 humana e isoformas alfa e beta de SAA2 humana como ilustradas pelas Fi- guras 18 e 19. SAA3 é um pseudogene. SAA4 codifica SAA constitutivo e é minimamente induzível. Ver Cunnane G. Bailliere's Clin. Rheumatol. 13 (4): 615-628. Todas as moléculas SANW/AA humanas contêm uma ligação de se- quência tetrapeptídica de cálcio teórica, Gly-Pro-Gly-Gly, de importância possível para autoagregação e com porções extrafibrilares de amiloide em fibrilogênese. Ver Fykse, E.M. et al. Biochem. J. 256:973-980 (1988) e Tur- nell et al. Mol. Biol. Med. 3:387-407 (1986). A porção N terminal de SAW/AA é fortemente hidrofóbica, provavelmente de importância para autoagregação e outros componentes em depósitos amiloides. Ver Husby et al. Clin. Immu- nol. Immunopathol. 70 (1):2-9 (1994). A sequência de cada isoforma de AA e sua relação à sua isoforma SAA correspondente é ilustrada pelas figuras 2 a

5. Por exemplo, a isoforma SAA1 alfa humana tem sequência: H2oN-Met-Lys-Leu-Leu-Thr-Gly-Leu-Val-Phe-Cys-Ser-Leu-Val-Leu-Gly-Val- Ser-Ser-Arg-Ser-Phe-Phe-Ser-Phe-Leu-Gly-Glu-Ala-Phe-Asp-Gly-Ala-Arg- Asp-Met-Try-Arg-Ala-Tyr-Ser-Asp-Met-Arg-Glu-Ala-Asn-Tyr-lle-Gly-Ser-Asp- Lys-Tyr-Phe-His-Ala-Arg-Gly-Asn-Tyr-Asp-Ala-Ala-Lys-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly- Ala-Try-Ala-Ala-Glu-Val-Ile-Ser-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-lle-GIn-Arg-Phe-Phe- Gly-His-Gly-Ala-Glu-Asp-Ser-Leu-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Asn-Glu-Try-Gly-Arg- Ser-Gly-Lys-Asp-Pro-Asn-His-Phe-Arg-Pro-Ala-Gly-Leu-Pro-Glu-Lys-Tyr-OH (SEQIDNº*:1).

AA, que é um fragmento proteolítico de SAA, é também hetero- gêneo. O peptídeo AA humano predominante consiste de 76 aminoácidos. Um exemplo de AA tem a sequência: H2N-Arg-Ser-Phe-Phe-Ser-Phe-Leu-Gly-Glu-Ala-Phe-Asp-Gly-Ala-Arg-Asp- Met-Try-Arg-Ala-Tyr-Ser-Asp-Met-Arg-Glu-Ala-Asn-Tyr-lle-Gly-Ser-Asp-Lys- Tyr-Phe-His-Ala-Arg-Gly-Asn-Tyr-Asp-Ala-Ala-Lys-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Ala- Try-Ala-Ala-Glu-Val-Ile-Ser-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-lle-GIn-Arg-Phe-Phe-Gly- His-Gly-Ala-Glu-Asp-Ser-OH (SEQ ID Nºe:2).

AATO-76 refere-se a um fragmento AA que começa no resíduo 70 e termina no resíduo 76 da (SEQ ID Nº:2) consistindo da sequência GHGAEDS, (SEQ ID Nº: 4), ou segmento correspondente de outra proteína de AA que ocorre naturalmente de uma espécie humana ou outra quando a sequência daquela proteína é maximamente alinhada com SEQ ID Nº:2.

2. Amiloide Sérica Murina A No camundongo, quatro genes SAA foram descritos. sequências de aminoácido representativas de proteínas codificadas por quatro genes de SAA murinos são ilustradas pela figura 8. A família gênica de SAA de ca- mundongo compreende quatro membros que são estreitamente ligados no cromossomo 7. Dois destes genes que codificam os principais isotipos de —SAA de camundongo (SAA1I e SAA2) compartilham alta identidade de se- quência não somente em éxons, mas também em íntrons e regiões flanque- adoras e são induzidos em quantidades aproximadamente iguais em respos-

ta a modelos de indução de amiloide. Estes dois isotipos diferenciam-se em somente 9 dos 103 resíduos de aminoácidos; entretanto, somente SAA2 é seletivamente depositado em fibrilas amiloides. Ver de Beer M.C. Biochem J. 1991 280 (Pt 1): 45-49 (1991); Hoffman J.S. et al. J Exp Med. 159:641-646 (1984); Shiroo M et al. Scand J. Immunol. 26:709-716 (1987). SAA3 é uma apolipoproteína HDL menor e perifericamente produziu a fase aguda. SAM4 é uma subfamília constitutiva que é uma apolipoproteína HDL normal menor compreendendo mais de 90% de SAA durante a homeostase. Ver Stearman R.S et al. Nucleic Acids Research, 14(2)797-809 (1986) e de Beer M.C. Ge- —nomics, 34 (1):139-42 (1996). AA murina que é um fragmento proteolítico de SAA é também heterogêneo. A sequência de cada isoforma murina de AA e sua relação à sua isoforma de SAA correspondente é ilustrada pelas figuras 9 a 12. Um alinhamento de sequência de AA1, AAZ2, AA3 e AA4 murina é ilustrado pela figura 13. AA1 murina é a equivalente murina de AA1 humana. Ver figura

16. Em particular, resíduos 69 a 75 de AA1 murina (GRGHEDT, SEQ ID Nº: 9) são maximamente alinhados com resíduos 70 a 76 de AAI humana (GHGAEDS, SEQ ID Nº: 4). Ver também figura 17.

3. Amiloide A Sérica de Shar Pei A sequência de Shar Pei é indicada na figura 20. Curiosamente, a região homóloga na proteína SAA humana-AEDS, (SEQ ID Nº: 13) contém um substituição conservada Thr para Ser na posição 76, bem como cadeia lateral significativamente diferente do resíduo na posição 73 (His para Ala; figura 1). O-AEDS, (SEQ ID Nº: 13), a sequência também é observada nas espécies caninas Shar Pei, uma raça que é particularmente suscetível à AA- amiloidose e pode fornecer um modelo de ocorrência natural de AA sistêmi- co para avaliar novas aplicações diagnósticas e terapêuticas de anticorpos específicos para amiloide AA e outros compostos.

4. O Segmento N-terminal de Proteína AA Determina sua Pro- priedade Fibrilogênica A proteína fibrilar amiloide AA consiste de uma parte do N-

terminal longa variada da proteína precursora sérica AA.

Evidência mostra que a parte amiloidogênica da molécula é o segmento N-terminal de 10 a 15 aminoácidos de comprimento.

Substituições de aminoácido nesta parte da molécula podem explicar porque somente uma das duas isoformas de SAA de camundongo é amiloidogênica.

Ver Westermark G.T.

Biochem Biophys Res Commun. 182 (1):27-33 (1992). V.

Outras Proteínas Amiloidogênicas Humanas Os Números de acesso no Genbank e sequências X1IEDX> são fornecidos abaixo na Tabela 3 para várias proteínas amiloidogênicas huma- nas, incluindo algumas daquelas listadas acima na Tabela 2. Tabela 3 Proteínas Amiloidogênicas Humanas Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank SAA1 AEDS, (SEQ ID Nº: 13) SAA2 AEDS, (SEQ ID Nº: 13) SAA3 AEDS, (SEQ ID Nº: 13) SAA4 AEDS, (SEQ ID Nº: 13) região V da cadeia leve capa da | AEDV, (SEQ ID Nº: | AAB26897 imunoglobulina anti-Sm; cadeia ca- | 23) pa doanticorpo monoclonal 4B4 região variável da imunoglobulina | PEDS, (SEQ ID Nº: | AAC61608 usada pela cadeia leve capa ITC52 | 26) (subgrupo V capa Illb) região variável da imunoglobulina | AEDV, (SEQ ID Nº: |AAC61606 usada pela cadeia leve capa ITC48 | 23) (subgrupo V capa |V) precursor da cadeia leve capa de | SEDF, (SEQ ID Nº: | AAW82027 anti-RhD monoclonal T125 24) precursor da cadeia leve capa da | AEDV, (SEQ ID Nº: | CAAM45496 imunoglobulina 23) região variável da cadeia leve capa | PEDF, (SEQ ID Nº: | AAT44350 da imunoglobulina 22) região variável da cadeia leve capa | PEDF, (SEQ ID Nº: | AAT44349 da imunoglobulina 22)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank da imunoglobulina 22) 22) 24) da imunoglobulina 24) anti-rábica SOJA 22) da imunoglobulina antiestreptocóci- | 24) ca/antimiosina da imunoglobulina antiestreptocóci- | 22) ca/antimiosina da imunoglobulina anti-HLA-A2/anti- | 22) HLA-A28 imunoglobulina; anticorpo anti-DNA | 22) 18/2 22) 48d anti-gp120 de HIV-1 22) 27) anti-Entamoeba histolytica 22) anti-Entamoeba histolytica 28) 22) da IgM monoclonal anti- | 23) glangliosídeo GM2 da imunoglobulina anti-<SARS-CoV 151) da imunoglobulina anti-SARS-CoV |22) imunoglobulina 22)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank imunoglobulina 24) 47e anti-gp120 de HIV-1 22) 16c anti-gp120 de HIV-1 22) 411g anti-gp120 de HIV-1 24) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 22) imunoglobulina 21) 22) 23) anti-Entamoeba histolytica 22) da imunoglobulina 23) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 24) da imunoglobulina 24) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 22)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank região variável capa da cadeia leve | LEDG, (SEQ ID Nº: | AAL65709 da imunoglobulina 31)

PEDF, (SEQ ID Nº

22) região variável capa da cadeia leve | LEDG, (SEQ ID Nº: | AAL65708 da imunoglobulina 31)

PEDF, (SEQ ID Nº:

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank noglobulina 23) noglobulina 21) da imunoglobulina 22) da imunoglobulina 23) imunoglobulina Fab G1 23) imunoglobulina Fab G1 22) imunoglobulina Fab G1 22) 32) imunoglobulina Fab G1 24) imunoglobulina Fab G1 22) de lg 23) 23) lg 29) lg (EVI-15) 22) (Dep) 23) (Fue) 23) (Pec) 23) ção a Cd25). 62) gação a Cd25). 33) agrupada secretada 34) noglobulina 23)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank recombinante do anticorpo mono- | 22) clonal IgM 12

19) leve da imunoglobulina 19) leve da imunoglobulina 19) leve da imunoglobulina 19) leve da imunoglobulina 16) leve da imunoglobulina 19) leve da imunoglobulina 18) leve da imunoglobulina 18) leve da imunoglobulina 18) leve da imunoglobulina 19) leve da imunoglobulina 19) noglobulina 22) noglobulina 19) noglobulina 19) noglobulina 22) noglobulina 22) noglobulina 23) noglobulina 21) leve da imunoglobulina 30 19)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank PREDITO: similar ao precursor de | QEDS, (SEQ ID Nº: | XP 00112958 receptor Il-a da região gama de Fc | 35) 4 da imunoglobulina de Baixa afinida- de (Fc-gama Rll-a) (FCRll-a) (recep- tor ll-a de Fc de IgG) (Fc-gama- Rlla) (antígeno CD32) (CDw32) fragmento Fc de IgG, la de alta afi- [REDS, (SEQ ID|NP 000557 nidade, receptor (CD64) Nº:36) TEDG, (SEQ ID Nº: 37) QEDR, (SEQ ID Nº: 38) fragmento Fc de IgG, llb de baixa | QEDS, (SEQ ID Nº: | NP 00100227 afinidade, receptor para (CD32) iso- | 35) 3 XP 943944 forma 2 fragmento Fc de IgG, llb de baixa | QEDS, (SEQ ID Nº: | NP 003992 afinidade, receptor para (CD32) iso- | 35) forma 1 fragmento Fc de IgG, llb de baixa | QEDS, (SEQ ID Nº: | NP 00100227 afinidade, receptor para (CD32) iso- | 35) 5 forma 4 fragmento Fc de IgG, llb de baixa | QEDS, (SEQ ID Nº: | NP 00100227 afinidade, receptor para (CD32) iso- | 35) 4 forma 3 XP 00112959 2 fragmento Fc de IgG, lb de alta afi- | QEDR, (SEQ ID Nº: | NP 00101798 nidade, receptor (CD64) isoforma a |/38) 6 fragmento Fc de IgG, lb de alta afi- | QEDR, (SEQ ID Nº: | NP 00100434 nidade, receptor (CD64) isoforma b |38) O XP 496386 fragmento Fc de IgG, lla de baixa | QEDS, (SEQ ID Nº: | NP 067674 afinidade, receptor (CD32) 35) XP 943942 precursor III-B de receptor de região | TEDL, (SEQ ID Nº: | NP 000561 Fc gama de imunoglobulina de bai- | 39) xa afinidade PEDN, (SEQ ID Nº: 40) EEDP, (SEQ ID Nº: 41) fragmento Fc de IgG, lIlla de baixa | TEDL, (SEQ ID Nº: | NP 000560 afinidade, receptor para (CD16) 39) XP 00113375 PEDN, (SEQ ID Nº: | O 40) EEDP, (SEQ ID Nº: 41)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank precursor ll-a de receptor de região | QEDS, (SEQ ID Nº: | P12318 Fc gama de imunoglobulina de bai- | 35) xa afinidade (Fc-gama Rll-a) (FCRII- a) (receptor Il-a de Fc de IgG) (Fc- gama-Rlla) (antígeno CD32) (CDw32) precursor III-B de receptor de região | TEDL, (SEQ ID Nº | 075015 Fc gama de imunoglobulina de bai- | 39) xa afinidade (IG Fc receptor 111I-1) | PEDN, (SEQ ID Ne: (Fc-gama Rill-beta) (Fc-gama Rillb) | 40) (FCRIIIb) (Fc-gama RiIII) (FCRI!)| EEDP, (SEQ ID Nº: (FcR-10) (antígeno CD16b) 41) precursor II|-A de receptor de região | TEDL, (SEQ ID Nº: | PO8637 Fc gama de imunoglobulina de bai- | 39) xa afinidade (IG Fc receptor 111-2) | PEDN, (SEQ ID Ne: (Fc-gama — Rill-aAlbha) (Fc-gama | 40) Rlilla) (FcRllla) (Fc-gama RIll)| EEDP, (SEQ ID Nº: (FER) (FecR-10) (antígeno CD16a) | 41) precursor | de receptor de Fc gama | REDS, (SEQ ID Nº: | P12314 de imunoglobulina de alta afinidade | 36) (Fc-gama RI) (FcRI) (IGG Fc recep- | TEDG, (SEQ ID Nº: tor 1) (antígeno CD64). 37) QEDR, (SEQ ID Nº: 38) gama 1 constante pesada da imu- | AEDT, (SEQ ID Nº: | O6PJA4 noglobulina IGHG1 (marcador G1m) | 14) 42) apolipoproteína — precursora — C-Ill | AEDA, (SEQ ID Nº: | NP 000031 [Homo sapiens] 62) apolipoproteína — precursora — A-IV | AEDV, (SEQ ID Nº: | NP 000473 [Homo sapiens]. 23) gelsolina (amiloidose, tipo finlande- | TEDT, (SEQ ID Nº: | CAM20459 sa) [Homo sapiens] 30) KEDA, (SEQ ID Nº: 43) SEDC, (SEQ ID Nº: 44) QEDL, (SEQ ID Nº: 63)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank gelsolina (amiloidose, tipo finlande- | TEDT, (SEQ ID Nº: | CAI14413 sa) [Homo sapiens] 30) KEDA, (SEQ ID Nº: 43) SEDC, (SEQ ID Nº: 44) QEDL, (SEQ ID Nº: 63) gelsolina (amiloidose, tipo finlande- | TEDT, (SEQ ID Nº: | EAW87491 sa), isoforma CRA c [Homo sapi- | 30) ens]. KEDA, (SEQ ID Nº: 43) SEDC, (SEQ ID Nº: 44) QEDL, (SEQ ID Nº: 63) gelsolina (amiloidose, tipo finlande- | TEDT, (SEQ ID Nº: | EAW87490 sa), isoforma CRA b [Homo sapi- | 30) ens] KEDA, (SEQ ID Nº: 43) SEDC, (SEQ ID Nº: 44) QEDL, (SEQ ID Nº: 63) gelsolina (amiloidose, tipo finlande- | TEDT, (SEQ ID Nº: | EAW87489 sa), isoforma CRA a [Homo sapi- | 30) ens] KEDA, (SEQ ID Nº: 43) SEDC, (SEQ ID Nº: 44) QEDL, (SEQ ID Nº: 63) [Homo sapiens]. 23) [Homo sapiens]. 23) 23)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank Proteína precursora amiloide beta [EEDD, (SEQ ID /P05067 A4 (APP) (ABPP) (proteína amiloide | Nº:45) da doença de Alzheimer) (Peptídeo | SEDK, (SEQ ID Nº: amiloide cerebral vascular) (CVAP) | 46) (Nexina-ll protease) (PN-II) (APPI) | DEDD, (SEQ ID Nº: (PreA4) [Contém: APP-alfa solúvel | 47) (S-APP-alfa); APP-beta solúvel (S- | DEDG, (SEQ ID Nº: APP-beta); C99; Proteína beta- 48) amiloide 42 (Beta-APP42); Proteína AEDV, (SEQ |D Ne: beta-amiloide 40 (Beta-APP40); 23) Cc83; P3(42)) P3(40) Gama- CTF(59) (fragmento 59 de gama- secretase — C-terminal). (Domínio intracelular amiloide59) (AID(59)) (AICD-59); Gama-CTF(57) (frag- mento 57 de gama-secretase C- terminal) (Domínio intracelular ami- loide 57) (AID(57)) (AICD-57); Ga- ma-CTF(50) (fragmento 50 de ga- ma-secretase C-terminal) (Domínio intracelular amiloide 50) (AID(50)) (AICD-50); C31]. proteína APP [Homo sapiens]. EEDD, (SEQ ID Nº: | AAH65523 45) SEDK, (SEQ ID Nº: 46) DEDD, (SEQ ID Nº: 47) DEDG, (SEQ ID Nº: 48) proteína APP [Homo sapiens]. EEDD, (SEQ ID Nº: | AAHO04369 45) SEDK, (SEQ ID Nº: 46) DEDD, (SEQ ID Nº: 47) DEDG, (SEQ ID Nº: 48)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank proteína precursora amiloide beta | EEDD, (SEQ ID Nº: | AAW82435 (A4) (nexina-ll protease, doença de | 45) Alzheimer) [Homo sapiens]. SEDK, (SEQ ID Nº: 46) DEDD, (SEQ ID Nº: 47) DEDG, (SEQ ID Nº: 48) AEDV, (SEQ ID Nº: 23) 18) 18) 18) 18) precursor de calcitonina [Contém: | SEDE, (SEQ ID Nº: | P01258 Calcitonina; Katacalcina (peptídeo | 18) carbóxi-terminal! da Calcitonina) (CCP) (PDN-21)] calcitonina isoforma CALCA pré- | SEDE, (SEQ ID Nº: | NP 00102912 pró-proteína [Homo sapiens]. 18) 4 calcitonina isoforma CALCA pré- | SEDE, (SEQ ID Nº: | NP 001732 pró-proteína [Homo sapiens]. 18) calcitonina isoforma CGRP pré-pró- | SEDE, (SEQ ID Nº: | NP 00102912 proteína [Homo sapiens]. 18) 5 Precursor de peptídeo 1 relaciona- | SEDE, (SEQ ID Nº: | PO6881 do ao gene da calcitonina (peptídeo | 18) | relacionado ao gene da calcitoni- na) (CGRP-I) (CGRP tipo Alfa).

49) pró-peptídeo de fator natriurético |LEDE, (SEQ ID Nº: | CAA25700 atrial [Homo sapiens]. 49) 49) Precursor de fator natriurético atrial | LEDE, (SEQ ID Nº: | P01160 (ANF) (Peptídeo natriurético atrial) | 49) (ANP) (Pré-pró-natriodilatina) (CDD- ANF) [Contém: Peptídeo relaciona- do à cardiodilatina (CDP)].

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank 49) 50) queratina [Homo sapiens]. VEDF, (SEQ ID Nº | CAA3S1I1695 51) YEDE, (SEQ ID Nº: 52) Queratina IEDL, (SEQ ID Nº | AAB59562 53) GEDA, (SEQ ID Nº: 50) Queratina, tipo Il citoesquelética 6C | VEDL, (SEQ ID Nº: | P48668 (Citoqueratina-6C) (CK 6C) (K6c | 64) queratina) (Citoqueratina-6E) (CK |YEDE, (SEQ ID Nº: 6E) (Queratina K6h). 52) LEDA, (SEQ ID Nº: 65) 54) subunidade alfa do precursor de | DEDW, (SEQ ID Nº: | AAC97142 fibrinogênio [Homo sapiens]. 55) SEDL, (SEQ ID Nº: 56) YEDO, (SEQ ID Nº: 57) SEDG, (SEQ ID Nº: 66) LEDW, (SEQ ID Nº: 58) cadeia alfa de fibrinogênio [Homo | DEDW, (SEQ ID Nº: | AAI01936 sapiens] 55) SEDL, (SEQ ID Nº: 56) YEDO, (SEQ ID Nº: 57) SEDG, (SEQ ID Nº: 66)

Proteína Amiloidogênica Humana Sequência consenso | Número de acesso no Genbank cadeia alfa de fibrinogênio [Homo | DEDW, (SEQ ID Nº: | AAH98280 sapiens] 55) SEDL, (SEQ ID Nº: 56) YEDO, (SEQ ID Nº: 57) SEDG, (SEQ ID Nº: 66) cadeia alfa de fibrinogênio, isoforma | DEDW, (SEQ ID Nº: | EAX04926 CRA b [Homo sapiens]. 55) SEDL, (SEQ ID Nº: 56) YEDO, (SEQ ID Nº: 57) SEDG, (SEQ ID Nº: 66) LEDW, (SEQ ID Nº: 58) cadeia alfa de fibrinogênio, isoforma | DEDW, (SEQ ID Nº: | EAX04928 CRA c [Homo sapiens]. 55) SEDL, (SEQ ID Nº: 56) YEDO, (SEQ ID Nº: 57) SEDG, (SEQ ID Nº: 66) cadeia alfa de fibrinogênio, isoforma | DEDW, (SEQ ID Nº: | EAX04924 CRA a [Homo sapiens] 55) SEDL, (SEQ ID Nº: 56) [Homo sapiens] 59) pal (PrP) (PrP27-30) (PrP33-35C) | 59) (ASCR) (CD230 antígeno) [Homo sapiens]. 59) 60) 60) VI.

Peptídeos Amiloides para Imunização Ativa Agentes terapêuticos para uso nos métodos da invenção são peptídeos imunogênicos, tais como peptídeos AA e peptídeos AL, que na administração a um paciente geram anticorpos que se ligam especificamente a um ou mais epitopos compreendendo X:EDX,, tal como, por exemplo, epi- topos entre resíduos 70 a 76 de AA ("agentes AA"). Exemplos adicionais de agentes incluem peptídeos imunogênicos que compreendem um fragmento consistindo em X:EDX, derivado de outras proteínas amiloides ("fragmentos de X1EDX?2", tais como fragmentos VK de AL consistindo da sequência de aminoácidos PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nºe: 22), AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF, (SEQ ID Nº: 24), ou SEDA, (SEQ ID Nº: 25), e fragmentos VAde AL consistindo da sequência de aminoácidos SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE;, (SEQ ID Nº: 19), TEDE, (SEQ ID Nº: 16) ou PEDE, (SEQ ID Nº: 20). Um fragmento VA de AL consistindo da sequência de aminoácidos FEDD, (SEQ ID Nº: 17) também pode ser usado.

Algumas proteínas amiloides ade- quadas incluem Proteína amiloide A sérica, proteína da cadeia leve da imu- —noglobulina, polipeptídeo precursor amiloide de ilhota humana (IAPP), peptí- deo amiloide beta, transtiretina (TTR), ApoA1 e outras proteínas amiloides listadas na Tabela 1 e que compreendem a sequência XtEDX2. Em alguns agentes X: é H, T, F, S, P, A ou qualquer outro resíduo de aminoácido pre- cedendo imediatamente ED em uma proteína amiloide; e Xc é T,. S, E, R, |, V,F,D,A ou qualquer outro resíduo de aminoácido imediatamente após ED em tal proteína amiloide.

Em alguns agentes, X1 é H, T, FE, S, PouAe X é T,S, E, D, RI, V, Fou A.

Em tais agentes, quando X: é H, Xcoé Tou A; quando X: é A, X2 é S, T, E ou V; quando X' é T, X2 é E; quando X: é F, Xo é D; quando X: é S, Xcé E, F ou A; e quando X1: é P, X2o é E, l ou F.

Em alguns agentes,X1 éH,T,F,S,P,ouAe X2 é T, S, E, D,R, 1, V, Fou A, com a res- salva que se X1 for A, X2 não seja V.

Em alguns agentes, quando X: é A, X2 éS,TouE.

Alguns agentes compreendem a sequência de aminoácidos GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), —AEDT,(SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nº: 17), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), PEDE, (SEQ ID Nº: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22),

AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF, (SEQ ID Nº: 24) ou SEDA, (SEQ ID Nº: 25). Alguns agentes consistem de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT, (SEQ ID Nº: 3, HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nº: 17), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), PEDE, (SEQ ID Nº: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22), AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF, (SEQ ID Nº: 24), ou SEDA, (SEQ ID Nº: 25), ligada a um veículo para formar um conjugado. Al- guns agentes compreendem a sequência de aminoácidos GHEDT, (SEQ ID Nº 3,HEDT,(SEQID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nºe: 17), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), PEDE, (SEQ ID Nºe: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22), AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF, (SEQ ID Nº: 24) ou SEDA, (SEQ ID Nº: 25). Alguns agentes consis- tem de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consis- tindo em GHEDT, (SEQ ID Nº: 3, HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nº: 17), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nºe: 19), PEDE, (SEQ ID Nº: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22), SEDF,(SEQID Nº: 24) e SEDA, (SEQ ID Nº: 25), ligada a um veículo para formar um conjugado. Alguns agentes compreendem a sequência de amino- ácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT, (SEQ ID Nº: 3, HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15) e TEDE, (SEQ ID Nº: 16).

Fragmentos AA preferenciais são resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de AA1 humana (HAA1) (GHGAEDS, SEQ ID Nº:4), resíduos 70 a 76 da isoforma beta de HAA1 (GHDAEDS, SEQ ID Nº:5), resíduos 70 a 76 da iso- forma gama de HAA1 (GHDAEDS, SEQ ID Nº: 5), e resíduos 70 a 76 das isoformas alfa e beta de HAA2 (GHGAEDS, SEQ ID Nº: 4), resíduos 70 a 76 deHAA3(GDHAEDS, SEQ ID Nº:7), resíduos 78 a 84 de HAA4 (STVIEDS, SEQ ID Nº8), resíduos 69 a 75 de AA1I de camundongo (MAAI1) (GRGHEDT, SEQ ID Nº:9), resíduos 69 a 75 de MAA2 (GRGHEDT, SEQ ID

Nº: 9), resíduos 62 a 68 de MAA3 (GHGAEDS, SEQ ID Nº:10) e resíduos 76 a 82 de MAA4 (NHGLETL, SEQ ID Nº:11) ou subfragmentos de pelo menos três aminoácidos contíguos de algum destes. Alguns fragmentos AA não contêm resíduo de um peptídeo de amiloidose AA além do segmento indica- do acima. Outros fragmentos AA contêm resíduos flanquedores adicionais de um peptídeo de amiloidose AA, mas contêm não mais do que 20 ou pre- ferencialmente não mais do que 10 resíduos contíguos em total de um pep- tídeo de amiloidose AA. Fragmentos X:EDX,> e AL preferenciais adicionais incluem GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), e TEDE, (SEQ ID Nºe: 16).

Agentes terapêuticos para uso nos métodos da invenção tam- bém incluem peptídeos AA imunogênicos que na administração a um paci- ente geram anticorpos que se ligam especificamente a epitopos N-terminais deAA. Agentes preferenciais induzem uma resposta imunogênica direciona- da a um epitopo nos resíduos 1 a 15 de AA humana.

Preferencialmente, o fragmento de AA ou AL ou outros agentes, tais como fragmentos de X:EDX> administrados na falta de um epitopo que geraria uma resposta de célula T ao fragmento. Geralmente, epitopos de célulaT são maiores do que 10 aminoácidos contíguos. Por isso, fragmentos preferenciais de proteínas amiloides, tais como fragmentos AA ou X:EDX2 têm tamanho de 4 a 10 ou preferencialmente de 7 a 10 aminoácidos contí- guos; isto é, comprimento suficiente para gerar uma resposta ao anticorpo sem gerar uma resposta de célula T. Ausência de epitopos de célula T é pre- ferencial porque estes epitopos não são necessários para atividade imuno- gênica de fragmentos, e podem causar uma resposta inflamatória indesejada em um subconjunto de pacientes (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1,3).

Fragmentos AA preferenciais são resíduos 70 a 76 da isoforma —alfade AA1I humana (HAA1) (GHGAEDS) (SEQ ID Nº: 4), resíduos 70 a 76 da isoforma beta de HAA1 (GHDAEDS) (SEQ ID Nº:5), resíduos 70 a 76 da isoforma gama de HAA1 (GHDAEDS, SEQ ID Nº: 5), resíduos 70 a 76 das isoformas alfa e beta de HAA2 (GHGAEDS, SEQ ID Nº: 4), resíduos 70 a 76 de HAA3 (GDHAEDS) (SEQ ID Nº:7), resíduos 78 a 84 de HAA4 (STVIEDS) (SEQ ID Nº:8), resíduos 69 a 75 de AA1I de camundongo (MAAI) (GRGHEDT) (SEQ ID Nº:9), resíduos 69 a 75 de MAA2 (GRGHEDT, SEQ ID Nº9), resíduos 62 a68 de MAA3 (GHGAEDS) (SEQ ID Nº:10) e resíduos 76 a 82 de MAA4 (NHGLETL) (SEQ ID Nº:11) ou subfragmentos de pelo menos três aminoácidos contíguos de algum destes. Alguns fragmentos AA não contêm resíduos de um peptídeo de amiloidose AA além do segmento indicado acima. Outros fragmentos AA contêm resíduos flanqueadores adi- cionais de um peptídeo de amiloidose AA, mas contêm não mais do que 20 ou preferencialmente não mais do que 10 resíduos contíguos no total de um peptídeo de amiloidose AA. Fragmentos X:EDX> e AL adicionais preferenci- ais incluem GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15) e TEDE, (SEQ IDNº*16).

Análogos de amiloidose AA natural, amiloidose AL, e outros pep- tídeos de amiloidose também podem ser usados para induzir uma resposta imune nos métodos e nas composições da invenção. Análogos incluindo es- pécies alélicas e variantes induzidas. Análogos de AA induzem anticorpos que se ligam especificamente com um peptídeo AA 70-76 natural. Tais aná- logos falham em induzir anticorpos que se ligam especificamente a epitopos fora de AA70-76. Análogos de AA tipicamente diferenciam-se de peptídeos de ocorrência natural em até 30% das posições de aminoácido por até 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9 ou 10 modificações de posição. Cada deleção ou substitui- çãode um resíduo de aminoácido natural é considerada uma modificação de posição como é a inserção de um resíduo sem substituição. Substituições de aminoácidos são substituições muitas vezes conservativas.

Alguns análogos de AA ou fragmentos de AA ou fragmentos de AL ou AL ou outros fragmentos de proteína amiloide, tais como fragmentos de X:EDX?, também incluem aminoácidos não naturais ou modificações de aminoácidos N ou C terminais em um, dois, cinco, dez ou até todas as posi- ções. Por exemplo, o resíduo ácido aspártico natural pode ser substituído com ácido isoaspártico. Exemplos de aminoácidos não naturais são D, alfa, aminoácidos alfadissubstituídos, aminoácidos N-alquila, ácido láctico, 4- hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, epsilon-N,N N-trimetilisina, epsilon-N- acetilisina, —O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, = 3-metil- histidina, 5-hidroxilisina, omega-N-metilarginina, B-alanina, ornitina, norleuci- na, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido gama-aminobutírico, homosseri- na, citrulina e ácido isoaspártico. Alguns agentes terapêuticos da invenção são peptídeos todo-D, por exemplo, AA todo-D ou fragmentos AA todo-D, e análogos peptídicos todo-D. Alguns agentes terapêuticos da invenção são 90% peptídeos todo-D, por exemplo, 90% AA todo-D ou 90% fragmentos AA todo-D, e 90% de análogos peptídicos todo-D. Alguns agentes terapêuticos da invenção são 80% de peptídeos todo-D, por exemplo, 80% AA todo-D ou 80% de fragmentos AA todo-D, e 80% análogos peptídicos todo-D. Frag- mentos e análogos podem ser rastreados para eficácia profilática ou tera- pêutica em modelos animais transgênicos em comparação com controles não tratado ou placebo como descrito abaixo.

AA, AL, seus fragmentos, e análogos e fragmentos X:IEDX> e seus análogos podem ser sintetizados por síntese peptídica em fase sólida ou expressão recombinante, ou podem ser obtidos de fontes naturais. Sinte- tizadores de peptídeo automáticos estão comercialmente disponíveis em numerosos fornecedores, tais como Applied Biosystems, Foster City, Cali- fórnia. A expressão recombinante pode ser em bactérias, tais como E. coli, levedura, células de inseto ou células mamíferas. Procedimentos da expres- são recombinante são descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989.) Agentes terapêuticos também incluem polipeptídeos mais longos que incluem, por exemplo, um fragmento imunogênico de peptídeo AA, pep- tídeo AL ou um fragmento de X:EDX>2, em conjunto com um ou mais amino- ácidos que flanqueiam o peptídeo AA, peptídeo AL ou fragmento de X:EDX>2 emum ou um ou ambos os lados. Por exemplo, agentes preferenciais inclu- em proteínas de fusão compreendendo um segmento de AA, AL ou fragmen- to de X1EDX> fusionado a uma sequência de aminoácidos heteróloga que induz uma resposta de célula T auxiliar contra a sequência de aminoácidos heteróloga e por meio disso uma resposta de célula B contra o segmento de AA, segmento de AL ou fragmento de X:IEDX2. Um ou mais aminoácidos heterólogos flanqueadores também podem ser usados para cobrir um peptí- deoAAouAL ou fragmento de XIEDX>? para protegê-lo da degradação na produção, armazenamento ou uso. Tais polipeptídeos podem ser rastreados para eficácia profilática ou terapêutica em modelos animais em comparação com controles não tratados ou placebo como descrito abaixo. Agentes tera- pêuticos da invenção incluem um fragmento imunogênico de AA ou AL ou fragmento de X1IEDX>flanqueado de sequências de polilisina. As sequências de polilisina podem ser fusionadas ao N-terminal, ao C terminal, ou tanto N- como C-terminal de AA ou AL ou um fragmento imunogênico de AA ou AL ou fragmento de X1EDX>. O peptídeo AA ou AL, fragmento de XtEDX>, aná- logo, fragmento ativo de AA ou outro polipeptídeo podem ser administrados em forma associada ou multimérica ou em forma dissociada. Agentes tera- pêuticos também incluem multímeros de agentes imunogênicos monoméri- Cos.

Em uma variação adicional, um fragmento imunogênico de AA ou AL ou fragmento de X1EDX2 podem ser apresentados por um vírus ou uma bactéria como parte de uma composição imunogênica. Um ácido nu- cleico que codifica o peptídeo imunogênico é incorporado em um genoma ou epissoma de vírus ou bactérias. Opcionalmente, o ácido nucleico é incorpo- rado de tal maneira que o peptídeo imunogênico é expresso como uma pro- teína secretada ou como uma proteína de fusão com uma proteína de super- fície externa de um vírus ou uma proteína transmembrana de uma bactéria para que o peptídeo seja exposto. Vírus ou bactérias usados em tais méto- dos devem ser não patogênicos ou atenuados. Vírus adequados incluem adenovírus, HSV, vírus de encefalite equina venezuelana e outros vírus alfa, vírus de estomatite vesicular, e outros vírus rabdo, vacínia e varíola aviária. Bactérias adequadas incluem Salmonella e Shigella. Fusão de um peptídeo imunogênico a HBsAg de HBV é particularmente adequada. Agentes terapêuticos também incluem peptídeos e outros com-

postos que não necessariamente têm uma similaridade de sequência de aminoácidos significante com AA ou AL ou fragmento de X:EDX>2, mas no entanto servem como miméticos de AA ou AL ou fra gmento de X:EDX>2 e induzem uma resposta imune similar. Por exemplo, quaisquer peptídeos e proteínas formando folhas B dobradas podem ser ras- treadas para conveniência. Anticorpos anti-idiotípicos contra anticorpos mo- noclonais para AA ou AL ou outros peptídeos amiloidogênicos tais como ou fragmentos X:EDX>2 também podem ser usados. Tais anticorpos anti-ld mi- metizam o antígeno e geram uma resposta imune a ele (ver Essential Immu- —nology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.), p. 181). Agentes além de peptídeos AA devem induzir uma resposta imunogênica contra um ou mais dos segmentos preferenciais de AA listados acima (por exemplo, AA7O0-76 ou GHEDT, (SEQ ID Nº: 3) ou AL ou fragmento de X1EDX, listados acima, tais como, por exemplo, HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS,(SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15) e TEDE, (SEQ ID Nº: 16).

Preferencialmente, tais agentes induzem uma resposta imuno- gênica que é especificamente direcionada a um destes segmentos sem ser direcionada a outros segmentos de AA ou AL ou proteína amiloide da qual o fragmento de XIEDX>2foi derivado.

As bibliotecas randômicas de peptídeos ou outros compostos também podem ser rastreadas para conveniência. Bibliotecas combinatórias podem ser produzidas para muitos tipos de compostos que podem ser sinte- tizados de uma maneira gradual. Tais compostos incluem polipeptídeos, mi- —méticos de ligações entre folhas beta, polissacarídeos, fosfolipídeos, hormô- nios, prostaglandina, esteroides, compostos aromáticos, compostos hetero- cíclicos, benzodiazepinas, glicinas oligoméricas N-substituídas e oligocar- bamatos. Grandes bibliotecas combinatórias dos compostos podem ser construídas pelas bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) método descrito em Afíymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, universidade de Colum- bia, WO 94/08051, Farmacopéia, WO 95/35503 e Scripps, WO 95/30642 (cada um dos quais é incorporado por referência para todos os fins). Biblio-

tecas peptídicas também podem ser geradas por métodos de exposição de fago.

Ver, por exemplo, Devlin, WO 91/18980. Bibliotecas combinatórias e outros compostos são inicialmente rastreados para conveniência pela determinação de sua capacidade de ligar- se especificamente a anticorpos ou linfócitos (B ou T) conhecidos por serem específicos para AA ou outros peptídeos amiloidogênicos.

Por exemplo, ras- treamentos iniciais podem ser realizados com qualquer anticorpo policlonal ou monoclonal sérico a AA ou AL ou um fragmento do mesmo ou a um fra- gmento de X:EDX>2. Os compostos podem então ser rastreados para ligação específica a um epitopo específico dentro de AA (por exemplo, AA70-76 ou GHEDT, (SEQ ID Nº: 3) ou AL ou a um fragmento de X:EDX,> listado acima, tal como, por exemplo, HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15) e TEDE, (SEQ ID Nº: 16). Os compostos podem ser testados pelos mesmos procedimen- tos descritos para mapear as especificidades do anticorpo para epitopo.

Os compostos identificados por tais rastreamentos então são analisados ainda para a capacidade de induzir anticorpos ou linfócitos reativos a AA ou AL ou fragmentos dos mesmos ou a um fragmento de X:EDX>. Por exemplo, dilui- ções múltiplas de soro podem ser testadas em placas de microtítulo que fo- ram pré-cobertas de AA ou AL ou um fragmento do mesmo ou um fragmento de X1EDX2 e um ELISA-padrão pode ser realizado para teste de anticorpos reativos a AA ou AL ou o fragmento ou ao fragmento de X:tEDX2. Os com- postos então podem ser testados para eficácia profilática e terapêutica em animais transgênicos predispostos a amiloidose, tais como, por exemplo, —Amiloidose AA ou amiloidose AL.

A mesma abordagem de rastreamento po- de ser usada em outros agentes potenciais, análogos de AA, análogos de AL e peptídeos mais longos, incluindo fragmentos AA, AL e fragmentos X:EDX,, descritos acima.

VII.

Conjugados Alguns agentes para induzir uma resposta imune contêm o epi- topo apropriado para induzir uma resposta imune contra AA, mas são muito pequenos para serem imunogênicos.

Nesta situação, um imunógeno peptí-

dico pode ser ligado a uma molécula veículoveículo adequada para formar um conjugado que ajuda a provocar uma resposta imune. Um agente único pode ser ligado a um veículo único, múltiplas cópias de um agente podem ser ligadas a múltiplas cópias de um veículo, que são por sua vez ligadas entresi, múltiplas cópias de um agente podem ser ligadas a uma cópia única de um veículo, ou uma cópia única de um agente pode ser ligada a múltiplas cópias de um veículo, ou veículos diferentes. Veículos adequados incluem albuminas séricas, hemocianina de keyhole limpet, moléculas de imunoglo- bulina, tiroglobulina, ovalbumina, tétano toxoide, ou um toxoide de outras bactérias patogênicas, tais como difteria, E. coli, cólera, ou H. pylori, ou um derivado de toxina atenuada. Epitopos de células T são também moléculas de veículo adequadas. Alguns conjugados podem ser formados pela ligação dos agentes da invenção a uma molécula polimérica imunoestimulatória (por exemplo, tripalmitoil-S-glicerina cisteína (Pam3Cys), manana (um polímero de manose), ou glicano (um polímero beta 1-2)), citocinas (por exemplo, IL- 1, IL-1 alfa e peptídeos-beta, IL-2, INF gama, IL-10, GM-CSF), e quimiocinas (por exemplo, MIP1alfa e beta, e RANTES). Agentes imunogênicos também podem ser ligados a peptídeos que aumentam o transporte através de teci- dos, como descrito em O'Mahony, WO 97/17613 e WO 97/17614. Os imunógenos podem ser ligados aos veículos com ou sem aminoácidos es- paçadores externos (por exemplo, gly-gly).

Alguns conjugados podem ser formados pela ligação de agentes da invenção a pelo menos um epitopo de célula T. Alguns epitopos de célu- las T são promíscuos enquanto outros epitopos de células T são universais.

—Epitopos de células T promíscuos são capazes de aumentar a indução da imunidade de célula T em uma larga variedade de indivíduos exibindo vários tipos de HLA. Em contraste com epitopos de células T promíscuos, os epito- pos de células T universais são capazes de aumentar a indução da imunida- de de célula T em uma grande porcentagem, por exemplo, pelo menos 75%, de indivíduos exibindo várias moléculas de HLA codificadas por alelos de HLA-DR diferentes.

Um grande número de epitopos de célula T de ocorrência natural existe, tal como, tétano toxoide (por exemplo, os epitopos P2 e P30), antíge- no de superfície de Hepatite B, coqueluche, toxoide, proteína F de vírus de sarampo, proteína principal de membrana externa de Chlamydia trachomitis, difteria toxoide (por exemplo, CRM197), circumsporozoíto T de Plasmodium falciparum, antígeno CS de Plasmodium falciparum, triose fosfato isomerase de Schistosoma mansoni, TraT de Escherichia coli e hemaglutinina de vírus de Influenza (HA). Peptídeos imunogênicos da invenção também podem ser conjugados aos epitopos de célula T descritos em Sinigaglia F. et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz R.M. et al., J.

Exp.

Med., 178:27-47 (1993); Hammer J. et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Inmunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; Southwood S. et al.

J.

Immunology; 160:3363-3373 (1998); e, Giannini, G. et al.

Nucleic Acids Res. 12: 4063- 4069 (1984), (cada um dos quais é incorporado neste pedido por referência para todos os fins). Exemplos adicionais incluem: Hemaglutinina de Influenza: HA307-319 CS de Malária: epitopo T3 EKKIAKMEKASSVFNV, (SEQ ID Nº: 67). Antígeno de superfície Hepatite B: HBsAg1s-28 FFLLTRILTI, (SEQ ID Nº: 68). Proteína de Choque Térmico 65: hsp65153-1711 DOSIGDLIAE- AMDKVGNEG, (SEQID Nº:69). bacilo Calmette-Guerin QVHFQPLPPAVVKL, (SEQ ID Nº: 70). Tétano toxoide: TTg30-8244 QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID Nº: 71). Tétano toxoide: TT947-.67 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (SEQ IDNº“72). gp120 de HIV T1: KQINMWQEVGKAMYA, (SEQ ID Nº: 73). Tétano toxoide: TT947-w67 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE gp120 de HIV T1: KQINMWQEVGKAMYA.

Alternativamente, os conjugados podem ser formados pela liga- ção dos agentes da invenção a pelo menos um epitopo de célula T artificial capaz de ligar-se a uma grande proporção de moléculas MHC da Classe Il, tais como a epitopo pan DR ("PADRE"). PADRE é descrito em US 5.736141,

WO 95/07707, e Alexander J et al., Inmunity, 1:751-761 (1994) (cada um dos quais é incorporado neste pedido por referência para todos os fins). Um peptídeo PADRE preferencial é AKXVAAWTLKAAA, (SEQ ID Nº: 74), (resi- duos comuns em negrito) em que X é preferencialmente ciclo-hexilalanina tirosina ou fenilalanina, com ciclo-hexilalanina sendo mais preferencial.

Agentes imunogênicos podem ser ligados a veículos por interli- gação química.

Técnicas para ligação de um imunógeno a um veículo inclu- em a formação de ligações dissulfeto usando n-succinimidil-3-(2-piridil-tio) propionato (SPDP) e succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (SMCC) (se o peptídeo necessitar de um grupo sulfidrila, este pode ser fornecido pela adição de um resíduo cisteína). Estes reagentes cri- am uma ligação dissulfeto entre eles e o peptídeo cisteína reside em uma proteína e uma ligação amida através da epsilon-amino em uma lisina, ou outro grupo amino livre em outros aminoácidos.

Uma variedade de tais agen- tes formadores dissulfeto/amida é descrita por Immun.

Rev. 62, 185 (1982). Outros agentes de acoplamento bifuncionais formam um tioéter em vez de uma ligação dissulfeto.

Muitos destes agentes formadores tio-éter estão co- mercialmente disponíveis e incluem ésteres reativos de ácido 6- maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, e ácido 2-iodoacético, ácido 4-(N- maleimido-metil)ciclo-hexano-1-carboxílico.

Os grupos carboxila podem ser ativados pela sua combinação com sal sódico de succinimida ou ácido 1- hidroxil-2-nitro-4-sulfônico.

A imunogenicidade pode ser melhorada através da adição de resíduos espaçadores (por exemplo, Gly-Gly) entre o epitopo Tn e o imunó- geno peptídico da invenção.

Além de separar fisicamente o epitopo Tn do epitopo de célula B (isto é, o imunógeno peptídico), os resíduos glicina po- dem interromper quaisquer estruturas secundárias artificiais criadas pela junção do epitopo Tn com o imunógeno peptídico, e por meio disso eliminar a interferência entre as respostas de célula T e/ou B.

A separação conformaci- onal entre o epitopo auxiliar e o domínio de produção de anticorpo dessa forma permite interações mais eficientes entre o imunógeno apresentado e as células The B apropriadas .

Para aumentar a indução da imunidade de célula T em uma grande porcentagem de indivíduos exibindo vários tipos de HLA a um agente da presente invenção, uma mistura de conjugados com epitopos celulares Tn diferentes pode ser preparada. A mistura pode conter uma mistura de pelo menos dois conjugados com epitopos de célula Tr diferentes, uma mistura de pelo menos três conjugados com epitopos de célula Tr diferentes, ou uma mistura de pelo menos quatro conjugados com epitopos de célula Tn diferen- tes. A mistura pode ser administrada com um adjuvante.

Peptídeos imunogênicos também podem ser expressos como proteínas de fusão com veículos (isto é, peptídeos heterólogos). O peptídeo imunogênico pode ser ligado em seu terminal amino, seu terminal carboxila, ou ambos a um veículo. Opcionalmente, múltiplas repetições do peptídeo imunogênico podem estar presentes na proteína de fusão. Opcionalmente, um peptídeo imunogênico pode ser ligado a múltiplas cópias de um peptídeo heterólogo, por exemplo, em ambos terminais N e C do peptídeo. Opcional- mente, múltiplas cópias de um peptídeo imunogênico podem ser ligadas a múltiplas cópias de um peptídeo heterólogo que são ligados entre si. Alguns peptídeos veículos servem para induzir uma resposta de célula T auxiliar contra o peptídeo veículo. As células T auxiliares induzidas por sua vez in- duzem uma resposta de célula B contra o peptídeo imunogênico ligado ao veículo.

Alguns exemplos de proteínas de fusão adequadas para uso na invenção são mostrados abaixo. Algumas destas proteínas de fusão com- preendem segmentos de AA ligados aos epitopos de tétano toxoide tal como descrito em US 5.196.512, EP 378.881 e EP 427.347. Algumas proteínas de fusão compreendem segmentos de AA ligados a pelo menos um peptídeo PADRE descrito em US 5.736.142. Alguns peptídeos heterólogos são epito- pos de célula T promíscuos, enquanto outros peptídeos heterólogos são epi- topos de célula T universais. Em alguns métodos, o agente de administração é simplesmente uma proteína de fusão única com um segmento de AA liga- do a um segmento heterólogo em configuração linear. Os agentes terapêuti- cos da invenção podem ser representados usando uma fórmula. Por exem-

plo, em alguns métodos, o agente é multímero de proteínas de fusão repre- sentadas pela fórmula 2, em que x é um número inteiro de 1 a 5. Preferen- cialmente x é 1, 2 ou 3, com 2 sendo o mais preferencial. Quando x é dois, tal multímero tem quatro proteínas de fusão ligadas em uma configuração preferencial referida como MAP4 (ver US 5.229.490).

A configuração MAP4 é mostrada abaixo, onde as estruturas ramiíificadas são produzidas pelo início da síntese peptídica tanto nas aminas de cadeia terminais como em N laterais da lisina. Dependendo do número de vezes, a lisina é incorporada na sequência e permitida ramiíficar, a estrutura resultante apresentará múltiplos terminais N. Neste exemplo, quatro termi- nais N idênticos foram produzidos no núcleo ramificado que contém a lisina. Tal multiplicidade aumenta muito a sensibilidade de células B cognatas. Nos exemplos abaixo, Z refere-se a um fragmento imunogênico de AA, AL ou um fragmento de X:EDX>2, e Z1 a 4 refere-se ao fragmento(s) imunogênico de AA, AL ou um fragmento de XtEDX>2. Os fragmentos podem ser os mesmos entre si ou diferentes. Zi Do KGG. z2 PD dA

KA ZOO PÁ

KGG za PD Outros exemplos de proteínas de fusão incluem: Z-tétano toxoide 830 a 844 em uma configuração MAPA4: Z-QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID Nº: 71) Z-tétano toxoide 947 a 967 em uma configuração MAPA4: Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (SEQ ID Nº: 72) Z-tétano toxoide 830 a 844 em uma configuração MAPA4: Z-QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID Nº: 71) Z-tétano toxoide 830 a 844 + 947 a 967 em uma configuração linear:

Z-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, (SEQ ID Nº: 75). Peptídeo PADRE (todos em configurações lineares), em que X é preferencialmente ciclo-hexilalanina, tirosina ou fenilalanina, com ciclo- hexilalanina sendo o -Z mais preferencial: AKXVAAWTLKAAA-Z, (SEQ ID Nº: 74). Z x 3-peptídeo PADRE: Z- ovalbumina 323 a 339 em uma configuração linear: Z-ISQAVHAAHAEINEAGR, (SEQ ID Nº: 76).

Exemplos adicionais de proteínas de fusão incluem: AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z, (SEQ ID Nº: 74). Z-AKXVAAWTLKAAA, (Z-(SEQ ID Nº: 74). PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z, (SEQ ID Nº: 77). Z-PKYVKQNTLKLAT-Z, (SEQ ID Nº: 77).

Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT, (SEQ ID Nº: 77). Z-Z-PKYVKQNTLKLAT, (Z-Z-(SEQ ID Nº: 77) Z-PKYVKQONTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV- QYIKANSKFIGITEL- FNNFTVSFWLRVPKVSASH- LE - (SEQ ID Nº: 78) Z-Z-Z-QYIKANSKFIGITEL- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE ,(SEQ ID Nº: 79). Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z, (SEQ ID Nº: 79). QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z, (SEQ IDNº“79) Z-QYIKANSKFIGITEL, (SEQ ID Nº: 71) em uma resina 2 rami- ficada: fragmentos pode ser os mesmos entre si ou diferentes.

DZ DD Lys-Gly-Cys

Z As mesmas ou similares proteínas veículo e métodos da ligação podem ser usados para gerar imunógenos a serem usados na geração de anticorpos contra AA ou um fragmento imunogênico de AA, AL ou um frag- mento de X:EDX2. Por exemplo, um fragmento imunogênico de AA ou AA, ALlouum fragmento de X:tEDX>2 ligado a um veículo pode ser administrado a um animal de laboratório na produção de anticorpos monoclonais para AA ou um fragmento imunogênico de AA, AL ou um fragmento de X:tEDX,. VIII. Ácido Nucleico que Codifica Agentes Terapêuticos Os agentes terapêuticos da invenção também incluem ácidos —nucleicos. Respostas imunes contra depósitos amiloides também podem ser induzidas pela administração de ácidos nucleicos que codificam segmentos do peptídeo AA, e fragmentos dos mesmos, outros imunógenos peptídicos, tais como fragmentos de X:EDX>2, ou anticorpos e suas cadeias componen- tes, tais como anticorpos 2A4, 8G9 e 7D8, usadas para imunização passiva. Tais agentes para uso nos métodos da invenção incluem ácidos nucleicos que codificam peptídeos AA que na administração a um paciente geram an- ticorpos que se ligam especificamente a um ou mais epitopos entre os resí- duos 70 a 76 de AA, AL ou ácidos nucleicos que codificam peptídeos com- preendendo fragmentos de X:EDX>2. Tais agentes para uso nos métodos da invenção também incluem ácidos nucleicos que codificam anticorpos que se ligam especialmente a um neoepitopo do C-terminal de AA ou a XIEDX2. Em particular, tais ácidos nucleicos codificam anticorpos que se ligam especifi- camente a isoforma alfa de HAA1 nos resíduos 70 a 76 (GHGAEDS, (SEQ ID Nº: 4), isoforma beta de HAA1 nos resíduos 70 a 76 (GHDAEDS, (SEQ ID Nº5),isoforma gama de HAAI nos resíduos 70 a 76 (GHDAEDS, (SEQ ID Nº: 5), isoformas alfa e beta de HAA2 nos resíduos 70 a 76 (GHGAEDS, (SEQ ID Nº: 4), HAA3 nos resíduos 70 a 76 (GDHAEDS, (SEQ ID Nº: 7), HAA4 nos resíduos 78 a 84 (STVIEDS, (SEQ ID Nº: 8), AMI de camundongo (MAA1) nos resíduos 69 a 75 (GRGHEDT, (SEQ ID Nº: 9), MAA2 nos resí-

duos 69 a 75 (GRGHEDT, (SEQ ID Nº: 9), MAA3 nos resíduos 62 a 68 (GHGAEDS, (SEQ ID Nº: 4), e MAM nos resíduos 76 a 82 (NHGLETL, (SEQ ID Nº: 11). Tais ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA.

Ácidos nu- cleicos preferenciais adicionais codificam anticorpos que se ligam especifi- camenteaHEDT,(SEQID Nº 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15) ou TEDE, (SEQ ID Nº: 16) ou outros peptí- deos X1EDX, listados acima.

Um segmento de ácido nucleico que codifica um imunógeno é tipicamente ligado a elementos reguladores, tal como um promotor e potencializador, que permitem a expressão do segmento de DNA nas células alvo desejadas de um paciente.

Para expressão em células san- guíneas, como é desejável para a indução de uma resposta imune, elemen- tos promotores e potencializadores de genes da cadeia leve ou pesada da imunoglobulina ou o principal promotor e potencializador precoce intermediá- rio CMV são adequados para dirigir a expressão.

Os elementos regulatórios ligados e sequências de codificação muitas vezes são clonados em um ve- tor.

Para administração de anticorpos de cadeia dupla, as duas cadeias po- dem ser clonadas nos mesmos vetores ou separadas.

Ácidos nucleicos que codificam os agentes terapêuticos da invenção também podem codificar pelo menos um epitopo de célula T.

As revelações neste pedido que se relacio- nam ao uso de adjuvantes e ao uso de veículoes aplicam mutatis mutandis ao seu uso com ácidos nucleicos que codificam os agentes terapêuticos da presente invenção.

Diversos sistemas de vetor viral estão disponíveis incluindo sis- temas retrovirais (ver, por exemplo, Lawrie and Tumin, Cur.

Opin.

Genet.

Develop.3,102-109 (1993)); vetores adenovirais (ver, por exemplo, Bett et al., J.

Virol. 67, 5911 (1993)); vetores virais adeno-associados (ver, por exemplo, Zhou et al., J.

Exp.

Med. 179, 1867 (1994)), vetores virais da famí- lia de varíola incluindo o vírus de vacínia e os vírus de varíola aviária, veto- res virais do gênero de vírus alfa, tais como os derivados de Sindbis e Vírus Florestais Semliki (ver, por exemplo, Dubensky et al., J.

Virol. 70, 508-519 (1996)), vírus da encefalite equina venezuelana (ver US 5.643.576) e rabdo- vírus, tais como vírus de estomatite vesicular (ver WO 96/34625) e papilo-

mavírus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al., WO 94/12629 e Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)). O DNA que codifica um imunógeno, ou um vetor contendo o mesmo, pode ser empacotado em lipossomas. Lipídios adequados e análo- gos relacionados são descritos por US 5.208.036, 5.264.618, 5.279.833 e

5.283.185. Os vetores e o DNA que codificam um imunógeno também po- dem ser adsorvidos a ou associados com veículos particulados, exemplos dos quais incluem polímeros de metacrilato de polimetila e polilactideos e poli(lactídeo-co-glicolídeos), ver, por exemplo, McGee et al., J. Encap Micro. (1996).

Vetores de terapia gênica ou DNA nu podem ser entregues in vivo pela administração a um paciente individual, tipicamente pela adminis- tração sistêmica (por exemplo, intravenosa, intraperitonial, nasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica ou infusão intracraniana) ou aplica- ção tópica (ver, por exemplo, US 5.399.346). Tais vetores podem incluir ain- da agentes facilitadores, tais como bupivacina (US 5.593.970). DNA também pode ser administrado usando uma arma gênica. (Ver Xiao & Brandsma, supra.) O DNA que codifica um imunógeno é precipitado na superfície de contas metálicas microscópicas. Os microprojéteis são acelerados com uma onda de choque ou gás hélio expandido, e penetram tecidos em uma pro- fundidade de várias camadas celulares. Por exemplo, o Dispositivo de En- trega Gênica Accel& produzido por Agacetus, Inc. Middleton WI é adequado. Alternativamente, DNA nu pode passar através da pele na corrente sanguí- nea simplesmente pela colocação do DNA sobre a pele com irritação quími- ca ou mecânica (ver WO 95/05853).

Em uma variação adicional, vetores que codificam imunógenos podem ser entregues a células ex vivo, tal como células explantadas de um paciente individual (por exemplo, linfócitos, aspirados de medula óssea, bi- ópsia tecidual) ou células de tronco hematopoiéticas doadoras universais, seguida pela reimplantação das células em um paciente, normalmente após seleção das células que incorporaram o vetor.

IX.

Adjuvantes

Agentes imunogênicos da invenção, tal como peptídeos, são às vezes administrados na combinação com um adjuvante.

O adjuvante aumen- ta o título de anticorpos induzidos e/ou a afinidade de ligação de anticorpos induzidos em relação à situação se o peptídeo foi usado sozinho.

Uma vari- edade de adjuvantes pode ser usada em combinação com um fragmento imunogênico de AA, para provocar uma resposta imune.

Adjuvantes prefe- renciais aumentam a resposta intrínseca a um imunógeno sem causar modi- ficações conformacionais no imunógeno que afetem a forma qualitativa da resposta.

Adjuvantes preferenciais incluem hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, 3 monofosforil lipídio De-O-acilado (MPLº) (ver GB 2220211 (RIBIl InmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, agora parte de Cori- xa), RC-529 (Corixa, Hamilton, Montana). STIMULONº QS-21 é um triterpe- no glicosídico ou saponina isolado da casca da árvore Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (ver Kensil et al. em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds.

Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Patente Americana Nº 5.057.540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Outros adjuvantes são emulsões óleo em água (tais co- mo esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, tais como monofosforil lipídio A (ver Stoute et al., N.

Engl.

J.

Med. 336, 86-91 (1997)), polímeros pluronic, e micobactérias mor- tas.

Outro adjuvante é CpG (WO 98/40100). Os adjuvantes podem ser admi- nistrados como um componente de uma composição terapêutica com um agente ativo ou podem ser administrados separadamente, antes, concorren-

temente ou após administração do agente terapêutico.

Uma classe preferencial de adjuvantes são sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alúmen, fosfato de alúmen, sulfato de alú- men.

Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imu- noestimuladores específicos, tais como MPL ou 3-DMP, QS-21, aminoácidos —poliméricos ou monoméricos, tais como ácido poliglutâmico ou polilisina.

Ou- tra classe de adjuvantes são formulações de emulsão óleo-em-água.

Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulado-

res específicos, tais como peptídeos de muramila (por exemplo, N- acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina — (thr-MDP), — N-acetil-normuramil-L- alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L- alanina-2-(1"-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglicosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitóxi propila- mida (DTP-DPP) THERAMIDES), ou outros componentes da parede celular bacteriana.

Emulsões óleo-em-água incluem (a) MF59 (WO 90/14837), con- tendo Esqualeno 5%, Tween 80 0,5%, e Span 85 0,5% (opcionalmente con- tendo várias quantidades de MTP-PE) formuladas em partículas submícron usando um microfluidizador, tal como o microfluidizador Modelo 110Y (Micro- fluidics, Newton MA), (b) SAF, contendo Esqualeno 10%, Tween 80 0,4%, polímero pluronic-bloqueado L121 5%, e thr-MDP, microfluidizados em uma emulsão submícron ou vortexados para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante RIBIO (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) contendo esqualeno 2%, Tween 80 0,2%, e um ou mais com- ponentes de parede celular bacteriana do grupo consistindo em monofosfo- ril-lipídeo (MPL), trehalose dimicolato (TDM), e esqueleto de parede celular

(CWS), preferencialmente MPL + CWS (DETOXO). Outra classe de adjuvantes preferenciais são adjuvantes saponi- na,tais como STIMULONGO (QS-21, Aquila, Framingham, MA) ou partículas geradas a partir deste, tais como ISCOMs (complexos imunoestimuladores) e ISCOMATRIX.

Outros adjuvantes incluem RC-529, GM-CSF e Adjuvante de Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). Ou- tros adjuvantes incluem citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1 ae peptídeos BB, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL13 e IL-15), fator estimulante de co- lônia de macrófago (M-CSF), fator estimulante de colônia de macrófago e granulócito (GM-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), quimiocinas, tais co- mo MIP1a e B e RANTES.

Outra classe de adjuvantes são os análogos de glicolipídeo incluindo N-glicosilamidas, N-glicosiluréias e N- glicosilcarbamatos, cada um dos qual é substituído no resíduo de açúcar por um aminoácido, como imunomoduladores ou adjuvantes (ver Patente Ameri- cana Nº 4.855.283). Proteínas de choque térmico, por exemplo, HSP70 e

HSP90, também podem ser usadas como adjuvantes.

Um adjuvante pode ser administrado com um imunógeno como uma composição única, ou pode ser administrado antes, concorrente ou após administração do imunógeno. O imunógeno e o adjuvante podem ser empacotados e fornecidos no mesmo frasco ou podem ser empacotados em frascos separados e misturados antes do uso. O imunógeno e o adjuvante são tipicamente empacotados com uma etiqueta que indica a aplicação tera- pêutica desejada. Se o imunógeno e o adjuvante forem empacotados sepa- radamente, a embalagem tipicamente inclui instruções para mistura antes do uso. A escolha de um adjuvante e/ou veículo depende da estabilidade da formulação imunogênica contendo o adjuvante, a via de administração, o esquema de dosagem, a eficácia do adjuvante na espécie que é vacinada, e, em humanos, um adjuvante farmaceuticamente aceitável é aquele que tenha sido aprovado ou é aprovável para administração humana por corpos regu- ladores pertinentes. Por exemplo, o Adjuvante completo de Freund não é adequado para administração humana. Alúmen, MPL e QS-21 são preferen- ciais. Opcionalmente, dois ou mais adjuvantes diferentes podem ser usados simultaneamente. Combinações preferenciais incluem alúmen com MPL, alúmen com QS-21, MPL com QS-21, MPL ou RC-529 com GM-CSF, e alú- men, QS-21 e MPL em conjunto. Além disso, o Adjuvante incompleto de Freund pode ser usado (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente em combinação com algum de alúmen, QS- 21 e MPL e todas as combinações dos mesmo. X. Administração Passiva de Anticorpos Agentes terapêuticos da presente invenção incluem anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo compreendendo X:EDX2 em um agregado de proteína amiloide, em que X: é H, T, F, S, P, A ou qualquer ou- tro resíduo de aminoácido que imediatamente precede ED em tal agregado de proteína amiloide; e em que X2 é T, S, E, R, 1, V, F, A ou qualquer outro resíduo de aminoácido imediatamente após ED em tal agregado de proteína amiloide, incluindo epitopos dentro de peptídeos amiloides, tais como AA. Os anticorpos usados para administração passiva podem ser anticorpos que se ligam a epitopos do N-terminal ou C-terminal de AA. Outras proteínas ami- loides além da proteína amiloide A Sérica incluem proteína amiloide A séri- ca, proteína da cadeia leve da imunoglobulina, tal como, por exemplo, VA6 Wil ou VK, polipeptídeo precursor amiloide de ilhota humana (IAPP), peptí- deoamiloide beta, transtiretina (TTR) e ADoA1, bem como outros listados na Tabela 1 acima.

AA é formada pela clivagem proteolítica de SAA. Anticorpos pre- ferenciais se ligam especificamente à neoepitopos de AA que se formam na clivagem proteolítica de SAA. Anticorpos preferenciais ligam-se especial- mente aum neoepitopo do C-terminal de AA, especialmente, tais anticorpos se ligam especificamente nos resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 (GHGAEDS, SEQ ID Nº:4), nos resíduos 70 a 76 da isoforma beta de HAA1 (GHDAEDS, SEQ ID Nº:5), nos resíduos 70 a 76 da isoforma gama de HAA1 (GHDAEDS, SEQ ID Nº: 5), nos resíduos 70 a 76 das isoformas alfa e beta de HAA2 (GHGAEDS, SEQ ID Nº: 10), nos resíduos 70 a 76 de HAA3 (GDHAEDS, SEQ ID Nº:7), nos resíduos 78 a 84 de HAM (STVIEDS, SEQ ID Nº:8), nos resíduos 69 a 75 de AA1 de camundongo (MAA1) (GRGHEDT, SEQ ID Nº:9), nos resíduos 69 a 75 de MAA2 (GRGHEDT, SEQ ID Nº: 9), nos resíduos 62 a 68 de MAA3 (GHGAEDS, SEQ ID Nº:10), e nos resíduos 76a82deMAA4(NHGLETL, SEQ ID Nº:11). Alguns anticorpos somente se ligam a um epitopo em um destes peptídeos. Outros anticorpos se ligam a epitopos em mais de um destes peptídeos. Por exemplo, alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo GHGAEDS, (SEQ ID Nº: 4) e peptí- deo GHDAEDS, SEQ ID Nº: 5). Alguns anticorpos se ligam a um peptídeo GHGAEDS, SEQ ID Nº: 4) sem se ligar especificamente a um peptídeo GHDAEDS, SEQ ID Nº: 5). A ligação a pelo menos um dos peptídeos AA humanos é preferível. A ligação a pelo menos um dos peptídeos AA huma- nos e um peptídeo de camundongo correspondente é útil em que o mesmo anticorpo pode ser testado em um modelo de camundongo e posteriormente usado em humanos. Alguns anticorpos preferenciais se ligam especifica- mente a epitopos nos resíduos da isoforma alfa de HAA1 71 a 76,72 a76, 73 a 76,74 a 76,70 a 75, 70 a 74,70 a 73,70 a 72,71 a 75,72a75,73a

75, 711 a 74,71 a 73, 72 a 74, ou resíduos de MAA1 70 a 75,71 a75,72a 75,73 a 75, 69 a 74, 69 a 73, 69 a 72, 69 a 71, 70 a 74,71 a 74,72 a 74,70 a 73,70 a 72. Tais anticorpos tipicamente se ligam especificamente a depó- sitos amiloides, mas pode ou pode não ligar-se a AA solúvel. Quando um anticorpo é dito ligar-se especificamente a um epitopo nos resíduos especifi- cados, tal como resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1, por exemplo, o que está entendido é que o anticorpo especificamente se liga a um polipep- tídeo contendo os resíduos especificados (isto é, resíduos 70 a 76 da iso- forma alfa de HAA1 neste exemplo). Tal anticorpo não necessariamente con- tata com cada resíduo nos resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1. Nem cada substituição de aminoácido ou deleção nos resíduos 70 a 76 da isofor- ma alfa de HAA1 necessariamente significativamente afeta a afinidade de ligação. Tais anticorpos para o neoepitopo ligam-se a AA, mas não a SAA. À especificidade do epitopo de um anticorpo pode ser determinada, por exem- plo, como descrito por WO 00/72880.

Os anticorpos usados para a administração passiva podem ser anticorpos para epitopos do N-terminal de AA. Anticorpos preferenciais se ligam especificamente a um neoepitopo do N-terminal de AA, especialmente, tais anticorpos se ligam especificamente aos resíduos 1 a 15 de HAA1 (RSFFSFLGEAFDGAR, SEQ ID Nº 80), resíduos 1 a 15 de HAA2 (RSFFS- FLGEAFDGAR, SEQ ID Nº 80), resíduos 1 a 15 de HAA3 (QGWLTFLKA- AGQGAK, SEQ ID Nº 81), resíduos 1 a 15 de HAA4 (ESWRSFFKEA, (SEQ ID Nº 82), resíduos 1 a 15 de MAA1 (GFFSFVHEAFQGAGD, SEQ ID Nº 83), resíduos 1 a 15 de MAA2 (GFFSFVHEAFOQGAGD, SEQ ID Nº 83), resíduos 1a9deMAA3 (EAGQGSRD, (SEQ ID Nº 84), e resíduos 1 a 14 de MAAM4 (WYSFFREAVQGTWD, SEQ ID Nº 85). Alguns anticorpos somente se ligam a um epitopo dentro de um destes peptídeos. Outros anticorpos se ligam a epitopos dentro de mais de um destes peptídeos. Por exemplo, alguns anti- corpos se ligam especificamente a um peptídeo RSFFSFLGEAFDGAR, SEQ ID Nº 380)e peptídeo QGWLTFLKAAGQOGAK, SEQ ID Nº: 81). Alguns anti- corpos se ligam a um peptídeo RSFFSFLGEAFDGAR, SEQ ID Nº: 80) sem se ligar especificamente a um peptídeo QGWLTFLKAAGQGAK, SEQ ID Nº:

81). A ligação de pelo menos um dos peptídeos AA humanos é preferível. A ligação a pelo menos um dos peptídeos AA humanos e um peptídeo de ca- mundongo correspondente é útil em que o mesmo anticorpo pode ser testa- do em um modelo de camundongo e posteriormente usado em humanos.

Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epitopo com- posto de tal XIEDX> preferencialmente tais anticorpos se ligam especifica- mente a tal epitopo em um agregado de proteína amiloide. Alguns de tais anticorpos preferencialmente se ligam especificamente a um agregado de proteína amiloide em relação à forma monomérica de tal proteína amiloide.

Em alguns anticorpos, X: é HT, FE, S, PPouAe X é T, S, E, D,R, 1, V,F ou A. Em tais anticorpos, quando X: é H, X2 é T ou A; quando X1 É A, X2 é S, T, E ou V; quando X: é T, X> é E; quando X1: é F, Xo é D; quando X: é S, Xo é E, F ou A; e quando X: é P, Xoé E, l ou F. Em alguns anticorpos, X: é H, T, F,S, P,ouAeX éT,S,E,D,R, Il, V, F ou A, com a ressalva que se X: for A, ,X2não seja V. Em alguns anticorpos, quando X: é A, Xcé S, Tou E. Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epitopo com- preendendo a sequência de aminoácidos GHEDT, (SEQ ID Nº 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nº: 17), SEDE, (SEQID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), PEDE, (SEQ ID Nº: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22), AEDV, (SEQ ID Nº: 23), SEDF, (SEQ ID Nº: 24) ou SEDA, (SEQ ID Nº: 25). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo com- preendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13), AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15), TEDE, (SEQ ID Nº: 16), FEDD, (SEQ ID Nº: 17), SEDE, (SEQ ID Nº: 18), AEDE, (SEQ ID Nº: 19), PEDE, (SEQ ID Nº: 20), PEDI, (SEQ ID Nº: 21), PEDF, (SEQ ID Nº: 22), SEDF, (SEQ ID Nº: 24) e SEDA, (SEQ ID Nº: 25). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), HEDT, (SEQ ID Nº: 12), AEDS, (SEQ ID Nº: 13),

AEDT, (SEQ ID Nº: 14), HEDA, (SEQ ID Nº: 15) e TEDE, (SEQ ID Nº: 16).

Alguns anticorpos são contruídos para peptídeo compreendendo GHEDT, (SEQ ID Nº: 3), tal como, por exemplo, 2A4, 7D8 e 8G9, ou são humanizados ou versões quiméricas dos mesmos.

Anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Soros policlo- nais tipicamente contêm populações mistas de anticorpos que se ligam es- pecificamente a vários epitopos ao longo de AA. Entretanto, os soros poli- clonais podem ser específicos para um segmento específico de AA, tal como resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1. Anticorpos preferenciais são quiméricos, ou humanizados (ver Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) e WO 90/07861, US 5.693.762, US 5.693.761, US

5.585.089, US 5.530.101 e Winter, US 5.225.539), ou humanos (Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US

5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US

5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnol- ogy 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)). Uma abordagem alternativa para humanizar um anticorpo, também conhecida como "venee- ring", é descrita em US 6.797.492. Vários anticorpos de camundongo de es- pecificidades de ligação diferentes estão disponíveis como materiais iniciais para produzir anticorpos humanizados.

Anticorpos humanizados representativos são a versão humani- zada de anticorpo 7D8 (Número de acesso no ATCC ), versão hu- manizada do anticorpo 7D29, versão humanizada do anticorpo 7D19, versão humanizada do anticorpo 7D47, versão humanizada do anticorpo 7D39, ver- são humanizada do anticorpo 7D66, versão humanizada do anticorpo 8G9, versão humanizada do anticorpo 8G3, versão humanizada do anticorpo 8G4, versão humanizada do anticorpo 8G51, versão humanizada do anticorpo 8G22, versão humanizada humanizou do anticorpo 8G30, versão humaniza- da do anticorpo 8G46, versão humanizada do anticorpo 2A4 (Número de acessonoATCC ), versão humanizada do anticorpo 2A20, versão humanizada do anticorpo 2A44, versão humanizada do anticorpo 2A77, ver- são humanizada do anticorpo 2A13, versão humanizada do anticorpo 2A14.

Os hibridomas que produzem o anticorpo 7D8 (JH80 7D8.29.19.47) e o anti- corpo 2A4 (JH80 2A4.20.44077) foram depositados no dia 4 de setembro de 2008, e no dia 17 de dezembro de 2008, respectivamente, no American Type Culture Collection (ATCC), atualmente localizado em 10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209, sob as provisões do Tratado de Bu- dapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro- organismos para os Fins de Procedimento de Patente ("Tratado de Buda- peste"). O ATCC designou o hibridoma produtor de 7D8 Nº de Acesso no ATCC , € O hibridoma produtor de 2A4 Nº de Acesso no ATCC 10 .

O isotipo humano IgG1 é preferencial para anticorpos para a região C terminal de AA por por ter a mais alta afinidade dos isotipos huma- nos para o receptor FCcRI em células fagocíticas. Alguns anticorpos se ligam especificamente a AA com uma afinidade de ligação maior ou igual a apro- ximadamente 107, 108, 10º ou 10ºº M.

A imunização ativa com fragmentos de AA pode ser combinada com a administração passiva de anticorpos. Exemplos de combinações es- pecíficas incluem fragmentos AA compreendendo resíduos 70 a 76 da iso- forma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compre- endendo 70 a 76 resíduos da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos 71 a 76 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo 70 a 76 resíduos da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resí- duos72a76 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos 73 a 76 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos 74a76 da isoforma alfa de HAA1I; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam es- pecificamente ao epitopo nos resíduos 70 a 75 da isoforma alfa de HAA1;

fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos

70 a 74 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam es-

pecificamente ao epitopo nos resíduos 70 a 73 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos

70 a 72 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam es-

pecificamente ao epitopo nos resíduos 71 a 75 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos

72 a 75 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam es-

pecificamente ao epitopo nos resíduos 73 a 75 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos

73 a 75 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam es-

pecificamente ao epitopo nos resíduos 71 a 74 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo nos resíduos

71 a 73 da isoforma alfa de HAA1; fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1 com anticorpos que se ligam es-

pecificamente ao epitopo nos resíduos 72 a 74 da isoforma alfa de HAA1. Adicionalmente, fragmentos de AA compreendendo os resíduos 71 a 76, 72 a 76,73 a 76,74 a 76,70 a 75,70 a 74,70 a 73,70 a 72,71 a 75,72 a75,

73 a 75, 711 a 74, 71 a 73, 72 a 74 da isoforma alfa de HAA1 podem ser combinados com anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo nos resíduos 71 a 76,72 a76,73a76,74a76,70a75,70a74,70a73,70a 72,71 a75,72a75,73 a 75,71 a 74,71 a 73,72 a 74 da isoforma alfa de HAA1. Fragmentos de AA compreendendo os resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1, os resíduos 70 a 76 da isoforma beta de HAA1, os resíduos 70 a 76 da isoforma gama de HAAJ1, os resíduos 70 a 76 das isoformas alfa e beta de HAA?2Z, os resíduos 69 a 75 de MAA1, os resíduos 69 a 75 de MAA2, ou os resíduos 62 a 68 de MAA3 podem ser combinados com anti- corpos que se ligam especificamente a um epitopo nos resíduos 70 a 76 da isoforma alfa de HAA1, resíduos 70 a 76 da isoforma beta de HAA1, resí- duos 70 a 76 da isoforma gama de HAA1, resíduos 70 a 76 das isoformas alfa e beta de HAA?2, resíduos 69 a 75 de MAA1, resíduos 69 a 75 de MAA?Z, ou resíduos 62 a 68 de MAA3.

Alguns anticorpos descritos acima não se ligam especificamente à forma monomérica ou à forma precursora da proteína amiloide. Alguns de tais anticorpos se ligam especificamente a um neoepitopo gerado na cliva- gem da proteína precursora resultando em uma proteína amiloide. Por exemplo, alguns anticorpos se ligam especificamente aos resíduos do C- terminal fibrilas AA de camundongo-HEDT, (SEQ ID Nº: 12), mas não se ligam especificamente a um peptídeo que se estende na porção não amiloi- de de SAA (GHEDTMADQE, SEQ ID Nº: 61). Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epitopo conformacional. Alguns de tais epitopos con- formacionais são lineares. Alguns de tais epitopos conformacionais são ex- postos quando uma proteína amiloide entra em uma estrutura agregada (por exemplo, fibrilar) ou torna-se parcialmente desnaturada. Exemplos de tais anticorpos incluem anticorpos monoclonais murinos 2A4 (Número de acesso no ATCC ),. 8G9 (Número de acesso no ATCC ) e 7D8 (Número de acesso no ATCC ), formas humanas, humanizadas e quiméricas dos mesmos, outros anticorpos que se ligam especificamente ao mesmo epitopo que 2A4, 8G9 ou 7D8, e fragmentos de ligação a antígeno de tais anticorpos. Alguns anticorpos se ligam especificamente a uma prote- íÍna amiloide compreendendo a sequência de aminoácidos ED. Alguns anti- corpos se ligam especificamente a uma proteína amiloide selecionada a par- tir do grupo consitindo da proteína da cadeia leve da imunoglobulina, poli- peptídeo precursor amiloide de ilhota humana (IAPP), peptídeo amiloide be- ta, transtiretina (TTR) e ApoA1.

Sabe-se que a unidade estrutural básica do anticorpo compre- ende um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (aproximadamente 25 kDa) e uma "pesada" (aproximadamente 50 a 70 kDa).A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis principal- mente pelo reconhecimento do antígeno. A porção carbóxi terminal de cada cadeia define uma região constante responsável principalmente pela função efetora.

1. Anticorpos A invenção inclui anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno, bem como anticorpos pegilados e fragmentos de anti- corpo, bem como anticorpos com função efetora alterada (por exemplo, re- duzida ou eliminada), por exemplo, anticorpos compreendendo mutações ou resíduos substituídos na região Fc. Exemplos de porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina incluem fragmentos F(ab) e F(ab')2tri-dFab', Fab', Fv, scFv, di-Fab' que podem ser gerados pelo trata- mento do anticorpo com uma enzima, tal como pepsina ou produzidos por técnicas de engenharia recombinantes reconhecidas na técnica. Fragmentos de anticorpos de ligação a antígeno adicionais da invenção incluem fragmen- tos de anticorpo terapêuticos, incluindo fragmentos de anticorpo pegilatdos, tais como Fab' PEGilado e di-Fab' PEGilado. Exemplos de mutantes de fun- ção efetora são descritos na Patente Americana Nº 5.624.821, que é incor- porada por referência neste pedido em sua totalidade. Alguns anticorpos têm reduzida afinidade de ligação pelo receptor RI gama Fc. Anticorpos de fun- ção efetora mutante incluem anticorpos compreendendo mutações na região de dobradiça. Alguns anticorpos IgG mutantes compreendem uma mutação na região constante da cadeia pesada em uma ou mais das posições 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322. Em alguns anticorpos um ou mais dos resíduos 234, 236 e 237 são substituídos por alanina. Em alguns anticorpos, o resíduo 235 é substituído por glutamina. Em alguns anticorpos, o resíduo 297 é substituído por alanina. Em alguns anticorpos, os resíduos 318, 320 e

322 são substituídos por alanina. Em alguns anticorpos, o resíduo 318 é substituído por valina. Em alguns anticorpos, o resíduo 322 é substituído por glutamina. Anticorpos com a função efetora aumentada incluem anticorpos únicos S239D e 1332E e os duplo e triplo mutantes S239D/1332E e S239D/I332E/A330L (numeração Kabat).

2. Anticorpos Policlonais Anticorpos policlonais podem ser preparados como descrito aci- ma pela imunização de um indivíduo adequado com um imunógeno. O título de anticorpo no indivíduo imunizado pode ser monitorado em algum tempo por técnicas padrão, tais como com um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) usando o antígeno alvo imobilizado. Se desejado, as molé- culas de anticorpo direcionadas contra o antígeno-alvo podem ser isoladas do mamífero (por exemplo, do sangue) e ainda purificadas por técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia em Sepharose proteína A um para ob- tenção da fração anticorpo, por exemplo, IgG... Em um tempo apropriado após imunização, por exemplo, quando os títulos de anticorpo antiantígeno são os mais altos, células produtoras do anticorpo podem ser obtidas do in- divíduo e usadas para preparar anticorpos monoclonais por técnicas-padrão, tal como a técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497) (ver também, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem.255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; e Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269 a 75). Para a preparação de anticorpos policlonais quiméricos, ver Buechler et al. Patente Americana Nº 6.420.113.

3. Anticorpos Monoclonais Qualquer dos muitos protocolos bem conhecidos usados para fusionar linfócitos e linhagens celulares imortalizadas pode ser aplicado com o objetivo de gerar um anticorpo monoclonal (ver, por exemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., citado supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado supra). Além disso, a pessoa versada apreciará que há muitas varia- ções de tais métodos que também seriam úteis. Tipicamente, a linhagem celular imortal (por exemplo, uma linhagem celular de mieloma) é derivadaa da mesmas espécie mamiífera que os linfócitos. Por exemplo, hibridomas murinos podem ser feitos pela fusão de linfócitos de um camundongo imuni- zado com uma preparação imunogênica da presente invenção com uma |i- nhagem celular de camundongo imortalizada. Linhagens celulares imortais preferenciais são linhagens celulares de mieloma de camundongo que são sensíveis ao meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"). Alguma de diversas linhagens celulares de mieloma pode ser usada como um parceiro de fusão de acordo com técnicas-padrão, por exemplo, as linhagens de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 ou Sp2/O0-Ag14. Estas linhagens de mieloma estão disponíveis no ATCC. Tipi- camente, células de mieloma de camundongo sensíveis a HAT são fusiona- das aos esplenócitos de camundongo usando polietilenoglicol ("PEG"). As células de hibridoma que resultam da fusão então são selecionadas usando meio de HAT, que mata as células de mieloma não fusionadas e improduti- vamente fusionadas (esplenócitos não fusionados morrem após vários dias porque não estão transformados). As células de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal da invenção são detectadas pelo rastreamento dos sobrenadantes da cultura de hibridoma por anticorpos que se ligam a um antígeno-alvo, por exemplo, um AB, usando um ensaio ELISA padrão.

4. Anticorpos Recombinantes Em alternativa à preparação de hibridomas secretores de anti- corpos monoclonais, um anticorpo monoclonal pode ser identificado e isola- do pelo rastreamento de uma biblioteca de imunoglobulina combinatória re- combinante (por exemplo, uma biblioteca de exposição de fago de anticorpo) com um antígeno-alvo para isolar por meio disso, membros da biblioteca de imunoglobulina que se ligam ao antígeno-alvo. Conjuntos para geração e rastreamento de bibliotecas de exposição de fago estão comercialmente dis- poníveis (por exemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Nº de Catálogo 27-9400-01; e Stratagene SurfZAPO Phage Display Kit, Nº de Catálogo 240612). Adicionalmente, exemplos de métodos e reagentes parti- cularmente acessíveis para uso na geração e rastreamento de biblioteca de exposição de anticorpo podem ser encontrados em, por exemplo, Ladner et al. Patente Americana Nº 5.223.409; Kang et al. Publicação Internacional PCT Nº WO 92/18619; Dower et al. Publicação Internacional PCT Nº WO 91/17271; Winter et al. Publicação Internacional PCT WO 92/20791; Markland et al. Publicação Internacional PCT Nº WO 92/15679; Breitling et al. Publicação Internacional PCT WO 93/01288; McCatfferty et al. Publicação Internacional PCT Nº WO 92/01047; Garrard et al. Publicação Internacional PCT Nº WO 92/09690; Ladner et al. Publicação Internacional PCT Nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et a/. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et a/. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978- 7982; e McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554.

5. Anticorpos Quiméricos e Humanizados Adicionalmente, anticorpos recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, compreendendo tanto porções hu- —manas como não humanas, que podem ser feitas usando técnicas de DNA recombinante padrão, estão dentro do escopo da invenção.

O termo "imunoglobulina humanizada" ou "anticorpo humaniza- do" refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo que inclui pelo menos uma imunoglobulina ou cadeia de anticorpo humanizada (isto é, pelo menos uma cadeia leve ou pesada humanizada). O termo "cadeia de imunoglobulina humanizada" ou "cadeia do anticorpo humanizado" (isto é, "uma cadeia leve da imunoglobulina humanizada" ou "cadeia pesada da imunoglobulina hu- manizada") refere-se a uma imunoglobulina ou cadeia de anticorpo (isto é, uma cadeia leve ou pesada, respectivamente) tendo uma região variável que inclui uma região variável de região conservada substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões de determinação de com- plementaridade (CDRs) (por exemplo, pelo menos uma CDR, preferencial-

mente duas CDRs, mais preferencialmente três CDRs) substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos, e além disso inclui regiões constantes (por exemplo, pelo menos uma região constante ou porção da mesma, no caso de uma cadeia leve, e três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). O termo "região variável humanizada" (por exemplo, a "região variável da cadeia leve humanizada" ou "região variável da cadeia pesada humanizada") refere-se a uma região variável que inclui uma região conservada variável substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos e regiões de determinação de complementaridade (CDRs) subs- tancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo não humanos.

A frase "substancialmente de uma imunoglobulina ou anticorpo humanos" ou "substancialmente humano" significa que, quando alinhada a uma sequência amino humana de imunoglobulina ou anticorpo para fins de comparação, a região compartilha identidade de pelo menos 80 a 90%, 90 a 95%, ou 95 a 99% (isto é, identidade de sequência local) com a região se- quência da região conservada ou constante humana, permitindo, por exem- plo, substituições conservativas, substituições de sequência consenso, subs- tituições de linhagem germinativa, retromutações e similares. A introdução de substituições conservativas, substituições de sequência consenso, substi- tuições de linhagem germinativa, retromutações, e similares, é muitas vezes referida como "otimização" de um anticorpo ou cadeia humanizada. A frase "substancialmente de uma imunoglobulina não humana ou anticorpo" ou "substancialmente não humano" significa ter uma sequência de imunoglobu- lina ou anticorpo pelo menos 80 a 95%, preferencialmente pelo menos 90 a 95%, mais preferencialmente, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico àquela de um organismo não humano, por exemplo, um mamífero não humano. Consequentemente, todas as regiões ou resíduos de uma imu- noglobulina ou anticorpo humanizados, ou de uma imunoglobulina ou cadeia de anticorpo humanizado, exceto as CDRs, são substancialmente idênticos àsregiões correspondentes ou aos resíduos de uma ou mais sequências de imunoglobulina humana nativas. O termo "região correspondente" ou "resí- duo correspondente" refere-se a uma região ou resíduo em um segundo aminoácido ou sequência nucleotídica que ocupa a mesma (isto é, equiva- lente) posição que uma região ou resíduo em um primeiro aminoácido ou sequência nucleotídica, quando as primeiras e segundas sequências são otimamente alinhadas para fins de comparação.

O termo "identidade significante" significa que duas sequências polipeptídicas, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando de pesos de lacuna pré-configurados, comparti- lhando identidade de sequência de pelo menos 50 a 60%, identidade de se- quência preferencialmente de pelo menos 60 a 70%, identidade de sequên- ciamais preferencialmente de pelo menos 70 a 80%, identidade de sequên- cia mais preferencialmente de pelo menos 80 a 90%, identidade de sequên- cia ainda mais preferencialmente de pelo menos 90 a 95%, e identidade de sequência ainda mais preferencialmente de pelo menos 95% ou mais (por exemplo, identidade de sequência de 99% ou mais). O termo "identidade substancial" significa que duas sequências polipeptídicas, quando otima- mente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna pré-configurados, compartilhando identidade de sequência de pelo menos 80 a 90%, identidade de sequência preferencialmente de pelo menos 90 a 95%, e identidade de sequência mais preferencialmente de pelo menos 95% ou mais (por exemplo, identidade de sequência de 99% ou mais). Para a comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são compara- das. Usando um algoritmo de comparação de sequência, as sequências tes- te e de referência são introduzidas em um computador, as coordenadas de subsequência são indicadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são indicados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula a identidade de sequência percentual da sequên- cia(s) teste em realção à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa indicados.

O alinhamento ótimo de sequências por comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Wa- terman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman & Wunsch, J.

Mol.

Biol. 48:443 (1970), pela busca do método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc.

Nat'l.

Acad.

Sci.

USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Programas Wisconsin Ge- netics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou pela inspeção visual (ver genericamente Ausubel et al., Current Protocols in Mo- lecular Biology). Um exemplo do algoritmo que é adequado para determinar a identidade de sequência percentual e a similaridade de sequência é o al- goritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J.

Mol.

Biol. 215:403 (1990). O programa para realizar análises no BLAST é publicamente dispo- nível pelo Natinal Center for Biotechnology Information (publicamente aces- sível pelo servidor de Internet do National Institutes of Health NCBI). Tipica- mente, parâmetros de programa de pré-configurados podem ser usados pa- ra realizar a comparação de sequência, embora parâmetros personalizados também possam ser usados.

Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como pré-configurados um wordlength (W) de 3, uma expecta- tiva (E) de 10, e a matriz de marcação BLOSUM6?2 (ver Henikoff & Henikoff,

Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 89:10915 (1989)). Preferencialmente, as posições de resíduo que não são idênti- cas diferenciam-se por substituições de aminoácido conservativas.

Para fins de classificar substituições de aminoácidos como conservativas ou não con- servativas, os aminoácidos são agrupados como se segue: Grupo | (cadeias laterais hidrofóbicas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo Il (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo Ill (cadeias laterais acídicas): asp, glu; Grupo |V (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resí- duos que influenciam na orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe.

Substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos da mesma classe.

Substituições não con- servativas constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra.

Preferencialmente, imunoglobulinas ou anticorpos humanizados se ligam ao antígeno com uma afinidade que está dentro de um fator de três,

quatro ou cinco daquela do anticorpo não humanizado correspondente.

Por exemplo, se o anticorpo não humanizado tiver uma afinidade de ligação de 10º M, os anticorpos humanizados terão uma afinidade de ligação de pelo menos 3 x 108 M, 4 x 108 M, 5 108 x M, ou 10º M.

Descrevendo as proprie- dades de ligação de uma imunoglobulina ou cadeia de anticorpo, a cadeia pode ser descrita com base na sua capacidade de "dirigir a ligação ao antí- geno (por exemplo, AB)". Uma cadeia é dita "dirigir a ligação ao antígeno" quando confere a uma imunoglobulina ou anticorpo intacto (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) uma propriedade de ligação ou afinidade de ligação específicas.

Uma mutação é dita (por exemplo, uma retromutação) afetar substancialmente a capacidade de uma cadeia pesada ou leve de di- rigir a ligação ao antígeno se ela afetar (por exemplo, reduz) a afinidade de ligação de uma imunoglobulina ou anticorpo intacta (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) compreendendo a dita cadeia em pelo menos uma ordem de magnitude em comparação com aquela do anticorpo (ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo) compreendendo de uma cadeia equi- valente sem a dita mutação.

Uma mutação "não afeta substancialmente (por exemplo, reduz) a capacidade de uma cadeia de dirigir a ligação ao antíge- no" se ela afetar (por exemplo, reduzir) a afinidade de ligação de uma imu- —noglobulina ou anticorpo intacta (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) compreendendo a dita cadeia em somente um fator de dois, três ou quatro daquela do anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mes-

mo) compreendendo uma cadeia equivalente sem a dita mutação.

O termo "imunoglobulina quimérica" ou anticorpo refere-se a uma imunoglobulina ou anticorpo cujas regiões variáveis derivam de uma primeira espécie e cujas regiões constantes derivam de uma segunda espé- cie.

As imunoglobulinas quiméricas ou os anticorpos podem ser construídos, por exemplo, por engenharia genética, a partir de segmentos gênicos de imunoglobulina pertencentes a espécies diferentes.

Os termos "imunoglobu- linahumanizada" ou "anticorpo humanizado" não são destinados a englobar imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, como definidos infra.

Embora imunoglobulinas ou anticorpos humanizados sejam quiméricos na sua cons-

trução (isto é, compreendem regiões da proteína de mais de uma espécie), eles incluem características adicionais (isto é, regiões variáveis compreen- dendo os resíduos da CDR doadora e resíduos da região conservada acep- tora) não encontradas em imunoglobulinas ou anticorpos quiméricos, como definido neste pedido.

Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, usando métodos descritos em Robinson et al. Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US86/02269; Akira, et al. Pedido de Patente Europeia 184.187; Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeia 171.496; Morrison et a/. Pedido de Patente Europeia 173.494; Neuberger et al. Publi- cação Internacional PCT Nº WO 86/01533; Cabilly et al. Patente Americana No. 4.816.567; Cabilly et al. Pedido de Patente Europeia 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sol et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; e Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter Patente Americana 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-

4060. Os agentes terapêuticos também incluem miméticos de anticorpos, tais como miméticos da região de determinação de complementaridade (CDR).

6. Anticorpos Humanos de Animais Transgênicos e Exposição de Fago Alternativamente, é agora possível produzir animais transgêni- cos (por exemplo, camundongos) que são capazes, sob imunização, de pro- duzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produ- ção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (Jr) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção endógena de anticorpo. A transferência do arranjo gênico de imunoglobulina de linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes de linhagem germinativa resulta na produção de anticorpos humanos sob o desafio por antígeno. Ver, por exemplo, Patentes Americanas Nº 6.150.584; 6.114.598 e 5.770.429.

Anticorpos totalmente humanos também podem ser derivados de bibliotecas de exposição de fago (Hoogenboom et a/., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et a/., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)). Anticorpos policlonais quiméricos também podem ser obtidos a partir de bibliotecas de exposição de fago (Buechler et al. Patente Americana Nº 6.420.113).

7. Anticorpos Biespecíficos, Polipeptídeos de Fusão a Anticorpo e Anticorpos de Cadeia Única Anticorpos biespecíficos (BsAbs) são anticorpos que têm especi- ficidades de ligação por pelo menos dois epitopos diferentes. Tais anticorpos podem ser derivados de anticorpos de completos ou fragmentos de anticor- po (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab)2). Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional anticorpos biespecíficos completos é baseada na coexpressão de dois pares de cadeias leves e cadeias pesadas de imunoglobulina, onde as duas cadei- as têm especificidades diferentes (Millstein et a/., Nature, 305:537-539 (1983)). Por causa da variedade randômica das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura po- tencial de diferentes moléculas de anticorpo (ver, WO 93/08829 e em Trau- necker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)).

Anticorpos biespecíficos também incluem anticorpos interligados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser ligado a avidina, o outro à biotina ou outra carga útil. Os anticorpos do heteroconjugado podem ser feitos usando qualquer método de interliga- ção adequado. Agentes de interligação adequados são bem conhecidos na técnica, e são revelados na Patente Americana Nº 4.676.980, junto com di- versas técnicas de interligação.

Ainda em outro aspecto, o anticorpo pode ser fusionado, química ou geneticamente, a uma carga útil, tal como uma porção reativa, detectável ou funcional, por exemplo, uma imunotoxina para produzir um polipeptídeo de fusão ao anticorpo. Tais cargas úteis incluem, por exemplo, imunotoxinas, quimioterápicos, e radioisótopos, todos os quais são bem conhecidos na técnica.

Anticorpos de cadeia única são também adequados para estabi- lização de acordo com a invenção. Os fragmentos compreendem um domí- nio variável da cadeia pesada (VH) unido a um domínio variável da cadeia leve (VL) com um ligador, que permite a cada região variável interrelacionar- se uma coma outra e recriar a bolsa de ligação ao antígeno do anticorpo parental do qual as regiões VL e VH são derivadas. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

É entendido que qualquer molécula polipeptídica precedente, sozinha ou em combinação, é adequada para a preparação como formula- ções estabilizadas de acordo com a invenção. XI. Indivíduos Sucetíveis ao Tratamento Indivíduos ou pacientes sucetíveis ao tratamento incluem indiví- duos em risco de doença, mas não exibindo sintomas, bem como pacientes há pouco exibindo sintomas. Por isso, os presentes métodos podem ser ad- ministrados profilaticamente à população geral sem a necessidade de qual- quer estimativa do risco do paciente sujeito. Os presentes métodos são es- pecialmente úteis para indivíduos que realmente têm um risco genético co- nhecido de desordens autoimunes. Tais indivíduos incluem aqueles tendo parentes que experimentaram esta doença e aqueles cujo risco é determi- nado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos.

Pacientes que sofrem de amiloidose AA podem ser assintomáti- cos por um período de tempo prolongado. Por isso, o diagnóstico clínico da amiloidose AA muitas vezes é retardado ou não obtido até que os depósitos amiloides sejam extensos. Para aqueles pacientes que são sintomáticos, estima-se que somente 53% dos casos são diagnosticados. Ver L.E.K. Con- sulting, Independent Market Research (2003).

A invenção fornece métodos úteis para tratar ou efetuar profila-

xia de uma doença caracterizada pela deposição de uma proteína amiloide, tal como, por exemplo, as doenças descritas acima, incluindo as listadas na Tabela 1. Alguns métodos são úteis para tratar ou efetuar profilaxia de uma doença caracterizada pela deposição de uma proteína amiloide compreen- dendoa sequência de aminoácidos ED.

Em alguns métodos, se a proteína amiloide compreender a sequência de aminoácidos AEDV, então o anticorpo não é administrado para tratar ou efetuar profilaxia de mal de Alzheimer ou Déficit Cognitivo Brando.

A proteína amiloide pode ser alguma das proteínas amiloides descritas acima, incluindo as listadas na Tabela 1, tal como, por exemplo, proteína amiloide A sérica, proteína da cadeia leve da imunoglobu- lina, tal como, por exemplo, VA6 Wil ou VK, polipeptídeo precursor amiloide da ilhota humana (IAPP), peptídeo amiloide beta, transtiretina (TTR) ou

ApoA1. Os presentes métodos são especialmente úteis para indivíduos que realmente têm um risco conhecido, são suspeitos de ter, ou foram diag- nosticados com amiloidose AA ou amiloidose AL.

Tais indivíduos incluem, mas não são limitados aos que têm doenças inflamatórias crônicas, doenças inflamatórias hereditárias e infecções microbianas crônicas, tais como artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondilite anquilosante, psoríase, artro- patia psoriática, síndrome de Reiter, doença de Still do Adulto, síndrome de Behcet, doença de Crohn, Febre Mediterrânea Familial, lepra, tuberculose, bronquiectasia, úlceras de decúbito, polinefrite crônica, osteomielite, doença de Whipple, mieloma, macroglobulinemia, discrasia de imunócito, gamopatia monoclonal, discrasia oculta.

Condições inflamatórias e infecciosas crônicas são pré-requisito para o desenvolvimento de amiloidose AA e amiloidose AL manifestada pela amiloidose nodular local pode ser associada com doenças inflamatórias crônicas.

Indivíduos que realmente têm risco conhecido de ami- loidose AA também incluem, mas não são limitados aos que têm neoplasias malignas como linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intesti- no, pulmão e trato urogenital, carcinoma de célula basal e leucemia de célula cabeluda.

Adicionalmente, indivíduos que realmente têm risco conhecido de amiloidose AA também incluem, mas não são limitados aos que têm desor-

dens linfoproliferativas, tais como Doença de Castleman.

Tanto em pacientes assintomáticos como em sintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer momento antes ou após diagnóstico de doenças amiloides AA ou AL subjacentes.

O tratamento tipicamente im- plicamúltiplas dosagens por um período de tempo.

O tratamento pode ser monitorado pela análise de anticorpo, das respostas de célula T (um efeito colateral) ou de célula B ativadas pelo agente terapêutico (por exemplo, pep- tídeo AA), ou empregando Cintilografia de SAP radiomarcada ao longo do tempo.

Se a resposta cair, uma dosagem de reforço auxiliar é indicada.

XIl.

Regimes de Tratamento Em geral, regimes de tratamento envolvem a administração de um agente eficaz para induzir uma resposta imunogênica a uma proteína amiloide, e preferencialmente a uma forma agregada de tal proteína amiloi- de, tal como, por exemplo, AA ou AL.

Preferencialmente um fragmento imu- —nogênico de AA ou AL ou um fragmento de X1EDX>2 são administrados a um paciente.

Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou me- dicamentos são administrados a um paciente suscetível, ou de outra manei- ra em risco de, amiloidose, tal como Amiloidose AA ou amiloidose AL, em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a severi- dade ou retardar o início da doença, incluindo sintomas fisiológicos, bioquí- micos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e apresentação de fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença.

Em aplicações terapêuticas, um agente é administrado a um paciente suspeito, ou já sofrendo de tal doença em um regime compreendendo uma quantidade e frequência de administração do agente suficientes para curar, ou pelo menos parcialmente deter, ou inibir a deterioração dos sintomas da doença (fisiológicos, bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

Em alguns métodos, a admi- nistração do agente reduz ou elimina a sintomatologia precoce em pacientes que ainda não desenvolveram patologia característica de amiloidose Al ou AA.

Uma quantidade adequada para realizar o tratamento terapêutico ou profilático é definida como uma dose terapeuticamente ou profilaticamente eficaz.

Una combinação de quantidade e frequência de dosagem adequa- das para realizar o tratamento terapêutico ou profilático é definida como um regime terapeuticamente ou profilaticamente eficaz.

Tanto em regimes profi- láticos como terapêuticos, os agentes são normalmente administrados em várias dosagens até que uma resposta imune suficiente tenha sido alcança- da.

Uma dosagem e frequência de administrações adequadas para realizar o tratamento terapêutico ou profilático são definidas como um regime terapeu- ticamente ou profilaticamente eficaz.

Tipicamente, a resposta imune do paci- enteé monitorada e dosagens repetidas são fornecidas se a resposta imune começar a declinar.

A resposta imune pode ser monitorada pela detecção de anticorpos, por exemplo, para AA ou AL no sangue no paciente ou pela de-

tecção de níveis de, por exemplo, AA ou AL.

Doses eficazes dos agentes e composições da presente inven- ção, para o tratamento das condições descritas acima variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio visado, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico.

Normalmente, o paciente é um mamífero humano, mas não humanos inclu- indo mamiíferos transgênicos também podem ser tratados.

Dosagens de tra- tamento têm que ser tituladas para otimizar segurança e eficácia.

A quanti- dade do imunógeno depende de se o adjuvante também é administrado, com dosagens superiores sendo necessárias na ausência do adjuvante.

À quantidade de um imunógeno para administração às vezes varia de 1 a 500 ugpor paciente e mais usualemnte de 5 a 500 ug por injeção para adminis- tração humana.

Ocasionalmente, uma dose superior de 1 a 2 mg por injeção é usada.

Tipicamente pelo menos 10, 20, 50 ou 100 ug são usados para ca- da injeção humana.

A massa do imunógeno também depende da proporção de massa do epitopo imunogênico no imunógeno para a massa do imunóge- noem conjunto.

Tipicamente, 103 a 105 micromols de epitopo imunogênico são usados por micrograma de imunógeno.

A determinação do tempo das injeções pode variar significativamente de uma vez por dia, a uma vez por ano, a uma vez por década. Em qualquer dado dia que uma dosagem do imunógeno é dada, a dosagem é maior do que 1 ug/paciente e normalmente maior do que 10 ug/paciente se o adjuvante também for administrado, e maior do que 10 ug/paciente e normalmente maior do que 100 ug/paciente na ausência do adjuvante. Um regime típico consiste de uma imunização seguida por injeções de reforço em intervalos de tempo, tais como intervalos de 6 semanas. Outro regime consiste em uma imunização seguida por inje- ções de reforço 1, 2 e 12 meses depois. Outro regime implica uma injeção a cada dois meses de vida. Alternativamente, as injeções de reforço podem serem uma base irregular como indicado pelo monitoramento da resposta imune.

Doses de ácidos nucleicos que codificam imunógenos variam de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 ug a 10 mg, ou 30 a 300 ug de DNA por paciente. Doses de vetores virais infecciosos variam de 10 a 100,ou mais, vírions por dose. Para imunização passiva com um anticorpo (em terapias de combinação), a dosagem varia de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, 0,5 a menos de 5 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg, 0,5 a 3 mg/kg, de peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 1 a 10 mg/kg ou em outras palavras, 70 mg ou 700 mg ou na faixa de 70 a 700 mg, respectivamente, para um paciente de 70 kg. Como um exemplo adicional, dosagens podem ser de menos de 5 mg/kg de peso corporal ou 1,5 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 0,5 a 1,5 mg/kg, preferencialmente pelomenos 1,5mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica na admi- nistração de uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos mo- noclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados si- multaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado está incluída nas faixas indicadas. O anticorpo é normalmente administrado em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser se- manais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares,

como indicado pela medida dos níveis sanguíneos do anticorpo para AA no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmática de anticorpo de 1 a 1000 ug/ml e em alguns méto- dos 25 a 300 ug/ml. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que administração menos frequente é necessária. A dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram meia-vida mais longa, seguida por anticorpos humanizados, anti- corpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente não frequentes ao longo de um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam recebendo o tratamen- to pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem rela- tivamente alta em intervalos relativamente curtos é às vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou descontinuada, e preferenci- almente até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sinto- mas da doença. Após isso, a patente pode ser administrada em um regime profilático.

Agentes para induzir uma resposta imune podem ser adminis- trados por meios parenterais, tópicos, intravenosos, orais, subcutâneos, in- tra-arteriais, intracranianos, intraperitoniais, intranasais ou intramusculares para tratamento profilático e/ou terapêutico. A via de administração mais típi- ca para um agente imunogênico é a subcutânea, embora outras vias possam ser igualmente eficazes. A próxima via mais comum é a injeção intramuscu- lar. Este tipo de injeção é mais tipicamente realizado nos músculos da perna ou braço. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente em um tecido específico onde os depósitos acumularam-se, por exemplo, injeção intracraniana. Injeção intramuscular ou infusão intravenosa são preferenciais para administração de anticorpo (em terapias de combinação). Em alguns métodos, anticorpos terapêuticos específicos são injetados diretamente no crânio. Em alguns métodos, os anticorpos são administrados como uma composição ou dispositivo de liberação sustentada, tal como um dispositivo MEDIPADO. Agentes da invenção muitas vezes são administrados como composições farmacêuticas compreendendo um agente terapêutico ativo, isto é, e uma variedade de outros componentes farmaceuticamente aceitá- veis. Ver Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). A forma preferencial depende do modo de administração e aplicação terapêutica desejada. As composições também podem incluir, dependendo da formulação desejado, veículos ou diluentes, farmaceuticamente aceitáveis, não tóxicos, que são definidos co- mo veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. O diluente é selecionado para não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, salina tamponada em fosfato fisiológica, soluções de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank. Além disso, a composição ou for- mulação farmacêutica também pode incluir outros veículos, adjuvantes, ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos e similares.

Composições farmacêuticas também podem incluir grandes ma- cromoléculas, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacarí- deos,taiscomo quitosana, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos e copolí- meros (tais como SEPHAROSE?º látex funcionalizada, agarose, celulose e similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, e agrega- dos lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Adicionalmente, estes veículos podem funcionar como agentes imunoestimuladores (isto é, adjuvantes).

Para administração parenteral, os agentes da invenção podem ser administrados como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão da substância em um diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril, tal como óleos aquosos, salina, glicerol ou etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes ou emulsionantes, tensoativos, substâncias de tamponamento de pH e similares podem estar presentes em composições. Outros compo-

nentes de composições farmacêuticas são aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, glicóis, tais como propilenoglicol ou polietilenoglico! são veículos líquidos preferenciais, particularmente para soluções injetáveis. Os anticorpos podem ser administrados na forma de uma preparação de implante ou injeção de armazenamento que pode ser formulada de tal ma- neira a permitir uma liberação sustentada do ingrediente ativo. Uma compo- sição exemplar compreende o anticorpo monoclonal em 5 mg/mL, formulado em tampão aquoso composto de L-histidina 50 MM, NaCl 150 mM, ajustado ao pH6,0com HCl. Composições de administração parenteral são tipica- mente substancialmente estéreis, isotônicas e produzidas sob condições GMP do FDA ou corpo similar.

Tipicamente, as composições são preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para so- lução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsula- da em lipossomas ou micropartículas, tais como polilactídeo, poliglicolídeo ou copolímero de efeito adjuvante aumentado, como discutido acima (ver Langer, Science 249, 1527 (1990) e Hanes, Advanced Drug Delivery Revi- ews28,97-119 (1997). Os agentes desta invenção podem ser administrados na forma de uma preparação de implante ou injeção de armazenamento que pode ser formulada de tal maneira a permitir uma liberação sustentado ou pulsátil do ingrediente ativo.

Formulações adicionais adequadas para outros modos de admi- nistração incluem formulações orais, intranasais e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas.

Para supositórios, ligadores e veículos incluem, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, preferencial- mente 1% a 2%. Formulações orais incluem excipientes, tais como classes farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose e carbonato de magnésio. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós e contêm 10% a 95% do ingrediente ativo, preferencialmente 25% a 70%. Aplicação tópica pode resultar em entrega transdérmica ou in- tradérmica. Administração tópica pode ser facilitada pela coadministração do agente com toxina colérica ou derivados detoxificados ou subunidades dos mesmos ou outras toxinas bacterianas similares (Ver Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). A coadministração pode ser alcançada usando os compo- nentes como uma mistura ou como moléculas ligadas obtidas por interliga- ção química ou expressão como uma proteína de fusão. Alternativamente, a entrega transdérmica pode ser alcançada usando uma via cutânea ou usando transferossomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

15. XIll. Regimes de Tratamento de Terapia de Fármaco Combinatória Terapia de combinação de acordo com a invenção pode ser rea- lizada sozinha ou em conjunto com outra terapia para tratar ou efetuar profi- laxia de amiloidose AA. Terapia de combinação de acordo com a invenção também pode ser realizada em conjunto com outra terapia que trata ou efe- tuaa profilaxia de uma doença amiloide subjacente, tal como doenças infla- matórias, infecções microbianas crônicas, neoplasias malignas, doenças inflamatórias hereditárias e desordens linfoproliferativas. Há grandes quanti- dades de tratamentos disponíveis em uso comercial, em avaliação clínica e em desenvolvimento pré-clínico, que podem ser selecionados para uso com ainvenção então revelada para efetuar profilaxia e tratamento da amiloidose AA pela terapia de combinação de fármaco. Tais tratamentos podem ser um ou mais compostos selecionados a partir de, mas não limitados a várias ca- tegorias principais, a saber, (i) fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs; por exemplo, detoprofeno, diclofenaco, diflunisal, etodolac, fenopro- feno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenameato, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumeona, naproxeno de sódio, oxaprozi- na, piroxicam, sulindac, tolmetina, celecoxibe, rofecoxibe, aspirina, salicilato de colina, salsalto, e salicilato de sódio e magnésio); (ii) esteroides (por exemplo, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, pred- nisolona, prednisona, triancinolona); (iii) DMARDs isto é, fármacos modifica- dores antirreumáticos (por exemplo, ciclosporina, azatioprina, metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, hidroxicloroquina, sulfasalazina, D-penicilamina, minociclina e ouro); ou (iv) proteínas recombinantes (por exemplo, EN- BRELO (etanercept, um receptor de TNF solúvel) e REMICADEPO (inflixima- be) um anticorpo anti-TNF monoclonal quimérico). A duração da terapia de combinação depende do tipo de doença subjacente que é tratada, a idade e condição do paciente, o estágio e tipo da doença do paciente, e como o paciente responde ao tratamento.

O médico pode observar estreitamente os efeitos da terapia e fazer qualquer ajuste que seja necessário.

Adicionalmente, uma pessoa que tem um maior risco de desenvolver Amiloidose AA (por exemplo, uma pessoa que é genetica- mente predisposta ou anteriormente tinha uma desordem inflamatória ou outras doenças subjacentes) ou amiloidose AL pode receber tratamento pro- filático para inibir ou retardar o desenvolvimento de agregados AL AA, tais como fibrilas.

A dosagem, a frequência e o modo de administração de cada componente da combinação podem ser controlados independentemente.

Por exemplo, um composto pode ser administrado oralmente três vezes por dia, enquanto o segundo composto pode ser administrado intramuscularmente uma vez por dia.

Terapia de combinação pode ser dada em ciclos periódicos que incluem períodos de descanso.

Compostos também podem ser formula- dosem conjunto tal que uma administração entregue ambos os compostos.

A combinação da invenção também pode ser fornecida como componentes do pacote farmacêutico.

Os fármacos podem ser formulados em conjunto ou separadamente e em quantidades de dosagem individuais.

Cada composto é misturado com uma substância veículo adequada, e está presente geral- mente em uma quantidade de 1 a 95% por peso do peso total da composi- ção.

A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que seja adequada para administração oral, parenteral (por exemplo, intra- venosa, intramuscular, subcutânea), retal, transdérmica, nasal, vaginal, ina- lações ou ocular. Dessa forma, a composição pode estar na forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, cu- rativos, banhos líquidos, dispositivos de entrega, supositórios, clísteres, inje- táveis, implantes, pulverizadores ou aerossóis. Composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed)ed.A R. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa. e En- cyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boy- lan, 1988-1999, Marcel Dekker, N.Y.

XIV. Métodos de Monitoramento ou Diagnóstico de Amiloidose AA ou AL Métodos de monitoramento ou diagnóstico de amiloidose AA ou AL incluem a medida das concentrações plasmáticas de SAA e proteína C- reativa, execução de biópsia tecidual (renal, retal, gástrico, gengival, gordu- ra, glândulas salivares, labiais) e histologia com marcação com Congo Red e/ou imunomarcação com anticorpos específicos dirigidos contra agregados de AA ou AL, tal como fibrilas. A invenção fornece métodos de detecção de uma resposta ao anticorpo contra o peptídeo AA em um paciente que sofre de ou suscetível à Amiloidose AA. Os métodos são particularmente úteis para monitorar um curso de tratamento que é administrado a um paciente. Os métodos podem ser usados para monitorar tanto o tratamento terapêuti- co em pacientes sintomáticos como o tratamento profilático em pacientes assintomáticos. Alguns métodos envolvem a determinação de um valor de base de uma resposta ao anticorpo em um paciente antes da administração de uma dosagem de um agente imunogênico, e compará-lo com um valor de resposta imune após o tratamento. Um aumento significante (isto é, maior do que a margem típica de erro experimental em medidas repetidas da mesma amostra, expressa em um desvio-padrão das médias de tais medidas) no valor da resposta do anticorpo sinaliza um resultado de tratamento positivo (isto é, que a administração do agente alcançou ou aumentou uma resposta imune). Se o valor da resposta do anticorpo não se modificar significativa- mente, ou reduzir, um resultado de tratamento negativo é indicado.

Em ge- ral, é esperado que pacientes que sofrem um curso inicial de tratamento com um agente imunogênico mostrem um aumento na resposta ao anticorpo com dosagens sucessivas, que eventualmente alcança um platô.

A administração do agente é geralmente continuada enquanto a resposta ao anticorpo está aumentando.

A obtenção do platô é um indicador de que o tratamento admi-

nistrado pode ser descontinuado ou reduzido em dosagem ou frequência.

Em outros métodos, um valor controle (isto é, uma média e des- vio-padrão) de uma resposta ao anticorpo é determinado para uma popula- ção controle.

Tipicamente os indivíduos na população controle não recebe- ram tratamento prévio.

Os valores medidos da resposta ao anticorpo em um paciente após administração de um agente terapêutico então são compara- dos com o valor controle.

Um aumento significante em relação ao valor con- trole (por exemplo, maior do que o desvio-padrão da média) sinaliza um re- sultado de tratamento positivo.

Uma falta de aumento significante ou uma redução sinaliza um resultado de tratamento negativo.

A administração do agente é geralmente continuada enquanto a resposta ao anticorpo está au- mentando em relação ao valor controle.

Como antes, a obtenção de um pla- tôem relação aos valores controle é um indicador de que a administração do tratamento pode ser descontinuada ou reduzida em dosagem ou frequência.

Em outros métodos, um valor controle de resposta ao anticorpo (por exemplo, uma média e desvio-padrão) é determinado a partir de uma população controle de indivíduos que sofreram o tratamento com um agente terapêutico e cujas respostas ao anticorpo alcançaram um platô em resposta ao tratamento.

Os valores medidos de resposta ao anticorpo em um paciente são comparados com o valor controle.

Se o nível medido em um paciente não for significativamente diferente (por exemplo, mais de um desvio- padrão) do valor controle, o tratamento pode ser descontinuado.

Se o nível em um paciente estiver significativamente abaixo do valor controle, a admi- nistração continuada do agente é garantida.

Se o nível no paciente persistir abaixo do valor controle, então uma modificação no regime de tratamento,

por exemplo, uso de um adjuvante diferente, fragmento ou desvio da admi- nistração passiva pode ser indicado.

Em outros métodos, um paciente que não está recebendo atua- lemnte o tratamento, mas sofreu um curso prévio de tratamento é monitora- do pararesposta ao anticorpo para determinar se um recomeço do tratamen- to é necessário. O valor medido da resposta ao anticorpo no paciente pode ser comparado com um valor de resposta ao anticorpo anteriormente alcan- çado no paciente após um curso prévio de tratamento. Uma redução signifi- cante em relação à medida prévia (isto é, maior do que uma margem típica deerroem medidas repetidas da mesma amostra) é uma indicação que o tratamento pode ser retomado. Alternativamente, o valor medido em um pa- ciente pode ser comparado com um valor controle (média mais desvio- padrão) determinado em uma população de pacientes após sofrer um curso do tratamento. Alternativamente, o valor medido em um paciente pode ser comparado com um valor controle em populações de pacientes profilatica- mente tratados que permanecem sem os sintomas da doença, ou popula- ções de pacientes terapeuticamente tratados que mostram melhora de ca- racterísticas de doença. Em todos estes casos, uma redução significante em relação ao nível controle (isto é, mais que um desvio-padrão) é um indicador dequeo tratamento deve ser retomado em um paciente.

Alguns métodos empregam Cintilografia de componente P ami- lóide sérico marcado com iodo-123 ou marcado com iodo-125 (23|-SAP ou 1251-SAP). 123|-SAP ou 1?S|-SAP são injetados intravenosamente em pacien- tes e examinados com câmera gama. A cintilografia com SAP radiomarcada é um método útil para monitorar a progressão de amiloidose em pacientes e avaliar tratamentos. É específica para o amiloide e pode ser usada para mo- nitorar quantitativamente a posição e a quantidade de depósitos amiloides em pacientes. 1º2º|-SAP e 1?!|-SAP não se acumulam em indivíduos saudá- veis ou em pacientes não amiloides. Cintilografia com SAP radiomarcada pode ser usada para monitorar a renovação dinâmica do amiloide, e pode avaliar a eficácia de tratamentos direcionados a depósitos amiloides regredi- dos. Além disso, cintilografia com SAP radiomarcada é não invasiva e forne-

ce rastreamento de corpo inteiro. Os métodos da invenção envolvem a de- terminação de um valor de base de uma resposta ao anticorpo em um paci- ente antes da administração de uma dosagem de um agente, e comparação disto com um valor de resposta imune após o tratamento em um paciente. Um aumento significante (isto é, maior do que a margem típica de erro expe- rimental em medidas repetidas da mesma amostra, expressa em um desvio- padrão das médias de tais medidas) no valor da resposta ao anticorpo transmite um resultado de tratamento positivo (isto é, aquela administração do agente alcançou ou aumentou uma resposta imune). Se o valor da res- posta ao anticorpo não se modificar significativamente, ou reduzir, um resul- tado de tratamento negativo é indicado. Em geral, espera-se que pacientes que sofrem um curso inicial de tratamento com um agente imunogênico mos- trem um aumento na resposta ao anticorpo com dosagens sucessivas, que consequentemente alcançam um platô. A administração do agente é geral- mente continuada enquanto a resposta ao anticorpo está aumentando. À obtenção do platô é um indicador que o tratamento administrado pode ser descontinuado ou reduzido em dosagem ou frequência.

A amostra tecidual para análise é tipicamente sangue, plasma, soro, fluido de mucosa ou cerebroespinhal do paciente. A amostra é analisa- da paraa indicação de uma resposta imune a qualquer forma de peptídeo AL ou AA. A resposta imune pode ser determinada pela presença de anti- corpos que se ligam especificamente ao peptídeo AL ou AA. Anticorpos po- dem ser detectados em um ensaio de ligação a um ligante que se liga espe- cificamente aos anticorpos. Tipicamente o ligante é imobilizado. A ligação pode ser detectada usando um anticorpo anti-idiotípico marcado.

Em regimes de combinação que empregam tanto administração ativa como passiva, abordagens análogas podem ser usadas para monitorar níveis do anticorpo resultantes de administração passiva.

Métodos de diagnóstico de amiloidose também podem ser em- pregados, por exemplo, pela administração a um indivíduo de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que esteja ligado a uma marcação detectável, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga especificamente a um epitopo incluindo X1EDX2 em um agragado de proteí- na amiloide, em que X: e X2 são qualquer aminoácido, e detecção da pre- sença ou ausência do anticorpo ligado ou fragmento do mesmo. A detecção do anticorpo ligado ou fragmento apoia um diagnóstico de amiloidose. Anti- corpos e fragmentos úteis no diagnóstico de amiloidose incluem os anticor- pos revelados da invenção.

Os anticorpos ou fragmentos diagnósticos da invenção podem ser administrados, por exemplo, por injeção intravenosa no corpo de um pa- ciente, ou diretamente no cérebro por injeção intracraniana. A dosagem de anticorpo é prontamente determinada por um versado na técnica. Tipicamen- te, o anticorpo é marcado, embora em alguns métodos, o anticorpo não seja marcado e um agente de marcação secundário seja usado para ligação ao anticorpo. A escolha da marcação depende dos meios de detecção. Por exemplo, uma marcação fluorescente é adequada para detecção ótica. O usode marcações paramagnéticas é adequado para a detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Radiomarcações podem ser usadas incluindo 211At, 212Bj, Cu, 1251, 131, Vin, 32P, 212Pb, 186Re, 188Re, 158Sm, 2 mTE ou 2oy. Tais marcações podem ser detectadas usando PET ou SPECT ou outra téc- nica adequada.

Diagnóstico também pode ser realizado pela comparação de número, tamanho e/ou intensidade de locais marcados, a valores de base correspondentes. Os valores de referência podem representar os níveis mé- dios em uma população de indivíduos não doentes. Os valores de base tam- bém podem representar níveis prévios determinados no mesmo paciente.

Por exemplo, os valores de base podem ser determinados em um paciente, e os valores medidos após isso comparados com os valores de base. Um aumento nos valores em relação aos sinais de base apoia um diagnóstico de amiloidose AA.

Os métodos diagnósticos da invenção podem ser usados para diagnosticar doenças de amiloidose incluindo amiloidose AA, amiloidose AL, mal de Alzheimer, Déficit Cognitivo Brando, polineuropatia amiloide, febre Mediterrânea, síndrome de Muckle-Wells, amiloidose sistêmica reativa asso-

ciada com doenças inflamatórias sistêmicas, mieloma ou macroglobulinemia associada à amiloidose, amiloidose associada com discrasia imunociítica, gamopatia monoclonal, discrasia oculta, ou amiloidose nodular local associ- ada com doenças inflamatórias crônicas.

XV. Modelos Animais de Amiloidose AA Amiloidose AA pode ser induzida experimentalmente em ca- mundongos nos quais as concentrações de SAA são marcadamente aumen- tadas pela injeção de nitrato de prata, caseína ou lipopolissacarídeo. Estes agentes estimulam a produção de citocinas. Ver Skinner et al. Lab Invest.

36:420-427 (1997) e Kisilevsky et al. Bailliere's Clin. Immunol. Immuno- pathol. 8 (3) 613-626 (1994). Dentro de 2 ou 3 semanas após estímulo infla- matório, os animais desenvolvem depósitos de AA sistêmicos, como encon- trado em pacientes com Amiloidose AA. Esta fase de latência é dramatica- mente encurtada quando fornece-se a camundongos, concomitantemente, uma injeção intravenosa de proteína extraída de baço ou fígado carregado com amiloide AA de camundongo. Ver Axelrad et al. Lab Invest. 47(2):139- 46 (1982). A atividade de aceleração amiloidogênica de tais preparações foi denominada "fator de potencialização amiloide" (AEF). Lundmark et al.relatam que o princípio ativo de AEF é inequivocamente a própria fibra AA.

Além disso, demonstraram que este material é extremamente potente, sendo ativo em doses menores que 1 ng, e que conservou sua atividade biológica ao longo de um tempo considerável. Notavelmente, AEF também foi eficaz quando administrado oralmente. Eles concluiram que AA e possivelmente outras formas de amiloidose são doenças transmissíveis, similares a desor- dens associadas a príon. Ver Lundmark et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 6979- 6984 (2002).

A amiloide AA também pode ser induzida em linhagens transgê- nicas de camundongos que carregam o gene de interleucina 6 humana sob controle do promotor de metalotioneína-l resultando em concentrações mar- cadamente aumentadas de SAA e desenvolvendo amiloide no baço, fígado e rins aos 3 meses de idade. No momento da morte, em aproximadamente 8 a 9 meses, os órgãos destes camundongos transgênicos têm extensos depósi-

tos amiloides. Ver Solomon et al., Am. J. Pathol. 154 (4):1267-1272 (1999). O modelo de camundongo transgênico de Doença Amiloide Ra- pidamente Induzida Transgênica (TRIAD) é uma melhoria do modelo de ca- mundongo transgênico acima descrito. Camundongos TRIAD carregam o gene de interleucina 6 humana sob controle do promotor de histocompatibili- dade H-2LP. A administração de AEF a camundongos TRIAD de 8 semanas de idade resulta em depósitos amiloides AA esplênicos e hepáticos proemi- nentes em 3 a 4 semanas. Posteriormente, este processo progride para ou- tros órgãos, levando a morte 4 a 6 semanas depois. O desenvolvimento da amiloidose sistêmica é acelerado em comparação com o modelo de camun- dongo transgênico descrito acima. Ver University of. Tennessee Research Corporation, WO 01/77167, Farmacopéia, WO 95/35503 e Scripps, WO 95/30642 Wall et al. Amyloid 12(3):149-156 (2005) (cada um dos quais é incorporado por referência para todos os fins).

O sagui comum (Callithrix jacchus) é um pequeno primata do Novo Mundo natural do Brasil que tem sido extensivamente usado em pes- quisa biomédica. Ludlage et al. relatam que foi encontrado que o sagui co- mum tem depósitos amiloides em um ou mais órgãos, incluindo fígado, glân- dulas adrenais, rins e intestino. Os autores colocam que fatores hereditários poderiam ser responsáveis pelo desenvolvimento de amiloidose AA neste primata. Neste sentido, o sagui comum pode servir como um modelo experi- mental único para estudo da patogênese e terapia de AA e outras desordens amiloides sistêmicas. Ver Ludlage et al. Vet Pathol 42:117-124 (2005).

A espécie Shar Pei de cão, uma raça que tem uma sequência AA como motivo-AEDS e é particularmente suscetível à amiloidose AA, for- nece um modelo que ocorre naturalmente de AA sistêmica em que avalia novas aplicações diagnósticas e terapêuticas de anticorpos específicos para a amiloide AA e outros compostos.

EXEMPLOS Exemplol.Fragmentos de AA.

Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 71 a 75 - GHEDT, como descrito por Yamamoto e Migita Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2915-

2919 foram sintetizados por AnaSpec, San Jose, CA, EUA. Anticorpos poli- clonais (Pab) para AA foram construídos e a fração de imunoglobulina isola- da, como anteriormente descrito por Bard, F. et al., (2000) Nat. Med. 6, 916-

919. Exemplo ll. Imunógeno para Preparação de Anticorpos Murinos. O epitopo usado foi GHEDT, (SEQ ID Nº: 3) com um ligador CG no seu N terminal. O peptídeo EPRB-39 que contém o epitopo é ligado a anticorpo anticamundongo de ovelhas. EPRB-39 é obtido de Anasec, San Jose, CA. Os anticorpos produzidos parecem ser específicos para o neoepi- topo porque não se ligam especificamente a um peptídeo que atravessa a região GHEDTIADOQE, (SEQ ID Nº: 89). Exemplo Ill. Procedimentos de Imunização. Camundongos A/J de seis semanas foram injetados intraperito- nialmente com 50 ug de IgG anticamundongo de ovelha/EPRB-39 com o Adjuvante Completo de Freund (CFA) seguido pelo adjuvante Incompleto de Freund (IFA) uma vez a cada duas semanas em um total de três injeções. Três dias antes da fusão, a veia da cauda foi injetada com 50 ug de IgG EPRB-39 para SAM em 90 ul de PBS. O título foi estimado em 1/10000 de ELISA com alto fundo. JH80 é a quantidade de fusão de EPRB-39. A seguinte é uma lista dos clones e clones de diluição limitante que são ativos: 7D8.29.19.47*, 39,66 — IgG2bk 8G9.3.4.51.22*, 30, 46 IgG2bk 2A4.20.44.77*, 13,14 / IgG2bk 7D47, 8G9 e 2A77 indicam subclones preferenciais. Os anticor- pos produzidos parecem ser específicos para o neoepitopo porque não rea- gem com um peptídeo que atravessa o sítio de clivagem C-terminal de SAA. Exemplo IV. Anticorpo de ligação a AA Agregada e Solúvel. Títulos séricos (determinados por diluição seriada) e ligação de anticorpo monoclonal a agregado de AA foram realizados por ELISA como anteriormente descrito por Schenk D. et al., (1999) Nature 400, 173-177. AA solúvel refere-se às fibrilas AA sonicadas em dimetil sulfóxido. Diluições se-

riadas do anticorpo foram incubadas com 50.000 cpm de 1?5|-AA durante a noite à temperatura ambiente. 50 ul de uma pasta fluida contendo sefarose proteína A 75 mg/ml (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia)/200 ug de IgG de coelho anticamundongo (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA) foram incubados com os anticorpos diluídos por 1 hora à temperatura ambiente, lavados duas vezes e contados com um contador gama Wallac (PerkinElmer Life Science, Grove, IL, EUA). Todas as etapas foram realizadas em tampão de radioimunoensaio composto de Tris 10 mM, NaCl 0,5 M, gelatina 1 mg/ml, e Nonidet P-40 0,5%, pH 8,0.

Exemplo V. Análise da Estrutura de VA6 Wil.

As sequências dos genes de linhagem germinativa da cadeia leve da imunoglobulina humana VK e VA expressas são como ilustradas nas Figuras 21 e 22. Com exceção dos subgrupos K1a, Ma, A3a, e Adc há um resíduo Glu-Asp pareando nas posições 81 e 82 em todas, sequências gêni- cas de linhagem germinativa VK e VA (figuras 21 e 22). Além disso, uma se- gunda linhagem germinativa que codificou o pareamento de Glu-Asp nas posições 50 e 51 é única para o gene de linhagem germinativa VA6. Dessa forma, VA6 Wil contém tanto os pares de Glu-Asp 50 a 51 como 81 a 82. As cadeias laterais dos resíduos 50 e 51 são ambas acessíveis na superfície de VA6WI, como mostrado pela cristalografia de raio x (figura 24). Ao contrário, somente a cadeia lateral Glu81 é exposta na superfície e a cadeia lateral Asp82 é parcialmente incorporada e parece interagir (por interações eletros- táticas ou por ligação de H) com as cadeias laterais de Lys79 e Arg61 (figura 25).

Com base nestas análises da estrutura de cristal de ralo xe a disponibilidade relativa das cadeias laterais de Glu-Asp, os Requerentes concluem que o Glu81 incorporado torna-se acessível já que o domínio in- troduzido em uma estrutura agregada (por exemplo, fibrilar) (ou torna-se parcialmente desnaturado), dessa forma expondo o que é de outra maneira um epitopo escondido, críptico.

Exemplo VI. Análise da Ligação do Anticorpo Monoclonal Anti-AA a VA6.

A. Ressonância de plásmons de superfície

Ressonância de plásmons de superfície foi usada para estabele- cer a cinética de ligação de vários anticorpos monoclonais com fibrilas e mo- nômero VA6 Wil. Em uma concentração de 6,6 nM, os 3 anticorpos ligados às fibrilas VA6 Wil sintéticas imobilizadas com um KD de — 1 nM - um valor comparável com aquele encontrado para sua reatividade com fibrilas AA mu- rinas (figura 26). A deflexão (expressa em RU) durante a fase de ligação foi similar para os mAbs 7D8 e 2A4 mas foi 50% mais baixa para 8G9. Isto su- gere que a densidade deste anticorpo nas fibrilas fosse mais baixa do que os outros 2 reagentes, já que as afinidades calculadas foram similares para os 3 anticorpos. Um mAb de IgG1 serviu como um controle e não exibiu ligação a fibrilas VA6 Wil.

Titulação do mAb 7D8 ao longo da faixa de 6,6 nM a 33,3 nM produziu a redução esperada na deflexão máxima associada com kon (figura 27). Em geral, a cinética de ligação foi similar em cada concentração, embo- ra neste teste piloto, o valor de KD para 7D8 em 26,6 nM realmente diferen- ciou-se daquele obtido em outras concentrações.

Para avaliar a especificidade da reação e assegurar que a liga- ção de mAbs com as fibrilas ocorreu através da interação clássica F(ab)- antígeno (ao contrário da ligação mediada por Fc ou adsorção não especifi- ca), os dados de ligação foram adquiridos na presença do peptídeo imunó- geno (p39) em 20 e 1 ug/mL (figura 8). O peptídeo p41 que não se liga ao mAb 7D8 em baixas concentrações, serviu como um controle. Na presença de peptídeo p41 20 ug/mL, a cinética de ligação de mAb 7D8 com fibrilas VA6 Wil foi idêntica a 7D8 sozinho. Ao contrário, o peptídeo imunógeno p39 em1 ug/ml causou redução > 2 vezes no ponto de ligação como julgado pela deflexão do sinal medido (figura 28). Inibição da ligação de fibrila por 7D8 foi quase completamente inibida quando 20 ug/mL do peptídeo p39 fo- ram usados. Estes dados indicaram que mAb 7D8 ligou-se a fibrilas através da região da molécula F(ab) já que esta interação pode ser completamente inibida pelo peptídeo imunógeno.

A reatividade do mAb 7D8 com o monômero VA6 imobilizado em um chip foi examinada usando BlAcore. O anticorpo não reagiu com a prote-

ína monomérica. Estes dados indicam que o sítio de ligação reconhecido pelo mAb 7D8 está presente nas fibrilas, mas não na proteína precursora solúvel, implicando que o antígeno seja de natureza conformacional ou críp- tico. B. Imunohistoquímica Imunohistoquímica foi realizada como se segue: 6 um de seções espessas, cortadas de blocos fixados em formalina, introduzidos na parafina, foram submetidos à recuperação antigênica por incubação com CitraPlus (BioGenex, San Ramon, CA) por 30 min a 90ºC. Tecidos foram imunomar- cados com uma solução de 3 ug/uml de mAbs 2A4, 7D8 ou 8G9. O mAb IgG2a TY11 serviu como um controle. Um anticorpo lg de cavalo anticamun- dongo conjugado a HRPO (IMmMPRESS Universal Reagent, Vector Labs, Burlingame, CA) foi usado como reagente secundário. Lâminas foram de- senvolvidas usando 3,3'diaminobezideno (Vector Labs) e examinadas usan- do um microscópio Leica DM500. A interação dos anticorpos monoclonais com depósitos de tecidos amiloide ALK e ALA também foi estudada usando imunohistoquímica. Como ilustrado na figura 29, depósitos amiloides na glândula tireóide de um paciente que foram compostos de fragmentos A2 foram imunomarcados por 7D8, 2A4 e 8G9. As áreas de reatividade correla- cionadas com depósitos amiloides, indicados pela birrefringência ouro-verde vista na seção tecidual marcada com Congo Red. A reatividade mais im- pressionante foi alcançada com os mAbs 7D8 e 2A4 enquanto 8G9, embora positivo, foi consideravelmente mais fraco. Estes dados qualitativos corres- pondem bem com as análises por BlAcore em que 8G9 ligou-se menos a fibrilas VA6 Wil do que os outros 2 reagentes (figura 26). O isotipo combina- do com mAb TY11 que serviu como um controle não exibiu imunorreativida- de amiloide.

A sequência de aminoácidos desta preoteína 12 (SEQ ID Nº: 86) (mostrada abaixo) contém os resíduos de linhagem germinativa Asp e Glu codificados na posição 81 e 82, respectivamente.

1 1 21 27d 35

GSVVIQPPS VSGAPROTVA ISCSGSSSNI GNNAVN WYQQLPGKAP 4s 55 es 73 83

KVLIYYDDLL PAGVSDRESG SKSGTSAS LAIRGLOSED EGDYYCAAKD s3

DSLSAL O exame de depósito de tecido amiloide ALK revelou 2A4, e em um menor grau 7D8 e 8G9, ter reatividade positiva. Novamente houve con- cordância entre a imunomarcação e birefringentes regiões amiloides, congo- fílicas. OmAb TY11 foi não reativo. C. Radiovisualização Amiloidoma Al usando 7D8 marcado com 125] O modelo experimental in vivo de amiloidoma AL foi usado para estudar se mAb 7D8 radiomarcado seria visualizaria amiloide AL humana. À eficiência de radiomarcação de 7D8, como determinada por SDS-PAGE, revelou que tanto as cadeias de IgH como de IgL incorporaram a marcação de |-125, e nenhuma evidência de bandas associadas com fragmentação ou agregação foi observada. A visualização de SPECT/CT de um camundongo carregando amiloidoma AL induzido revelou que o anticorpo marcado com 125] localizou-se na massa amiloide induzida, dorsalmente localizada, como evidenciado pelo acúmulo de anticorpos radiomarcados na amiloide, em re- lação a tecidos sem amiloide (por exemplo, fígado, coração, baço e rins). mAb IgG radiomarcado irrelevante não se acumulou na massa; entretanto radioiodo livre foi observado acumular-se na tireóide, indicativo de catabo- lismoe desalogenação do anticorpo IgG. A distribuição do mAb *L.7D8 nos camundongos carregando amiloidoma foi quantificada pela medida da ativi- dade associada com a massa amiloide comparada com aquela de fígado, baço, rim, estômago, coração e pulmão. Estes dados confirmaram o estudo de visualização por SPETC/CT. Em 72h pós-injeção (tempo no qual as ima- gens foram adquiridas e os tecidos coletados), o amiloidoma continha ID de —8% que é — 4 vezes mais alta do que aquela vista no fígado - sítio do cata- bolismo de mAb - e no coração onde a atividade de agrupamento do sangue residual seria esperado ser alto. A atividade mostrada no pulmão foi devida ao modo de eutanásia (dados não mostrados).

Para confirmar os dados de biodistribuição, o amiloidoma bem como fígado, baço, coração e rins foram coletados e seções de tecido prepa- radas para a análise autorradiográfica. Radiomarcação foi realizada como se segue: o anticorpo 7D8 foi marcado com 2 mCi de ás livre de redutor (Per- kin Elmer) que usa quantidades limitantes de Cloramina T e suspenso em PBS contendo 5 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA/PBS). O isótopo não ligado e os agregados proteicos foram removidos por cromatografia líquida por exclusão de tamanho por uma coluna Ultrogel ACA34 (Amersham Phar- macia). As frações contendo monômero de IgG foram agrupadas para expe- rimentos de visualização. O rendimento do radioquímico foi -50%, fornecen- do uma atividade específica de -25 uCi/vg. mAb marcado com ás foi sub- metido a SDS/PAGE (géis de 10%) na presença ou na ausência de um agente redutor e analisado com um visualizador de fósforo Cyclone. Con- forme a visualização por SPECT e medidas de biodistribuição, autoradiogra- fias confirmaram o acúmulo significante de PL7D8 no amiloidoma, em rela- ção ao fígado. Não houve evidência da entrada de anticorpo 7D8 radiomar- cado com | em qualquer outro órgão (além da atividade hepática esperada com o catabolismo do anticorpo). Embora mAb 7D8 fosse relativamente uni- formemente distribuído em todas as partes do volume da massa amiloide, uma densidade moderadamente mais alta foi observada nas áreas periféri- cas no limite abdômen-amiloide. Não houve entrada de IgG controle radio- marcada em qualquer órgão.

D. Sumário e Conclusões Ressonância de plásmons de superfície, imunohistoquímica e radiovisualização in vivo estabelecem que os anticorpos 2A4, 7D8 e 8G9 reativos para AA se ligam ao amiloide e fibrilas AL (Kd — 1 nM) derivados de cadeias leves da imunoglobulina. Esta interação provavelmente ocorre nos aminoácidos Asp e Glu altamente conservados na posição 81 e 82, respecti- vamente, que formam um epitopo linear críptico que fica exposto somente quando a cadeia leve amiloidogênica é incorporada nas fibrilas.

Exemplo VII. Análise de ELISA Demonstra Ligação de Anticorpo a Peptídeos

X1EDX>.

Análise por BlAcore foi realizada para avaliar a ligação de anti- corpos 2A4, 7D8 e 8G4 em peptídeos de várias sequências. Como mostrado abaixo na Tabela 4, foi encontrado que os anticorpos reagiam com peptí- deostendoa sequência XIEDX>2. Curiosamente, os anticorpos não reagiram com peptídeos tendo resíduos C-terminais adicionais. Isto sugere que os anticorpos se ligam especificamente a um neoepitopo gerado da clivagem de SAA para gerar uma extremidade C-terminal livre. Entretanto, como demons- trado no Exemplo V, a extremidade livre não é essencial para ligação estes anticorpos a VA6 Wil, mas de preferência um domínio X:EDX>2 adota uma conformação favorável para a ligação aos anticorpos como introduz uma estrutura agregada (por exemplo, fibrilar) (ou torna-se parcialmente desnatu- rada), expondo um epitopo de outra maneira escondido, críptico. Tabela 4 Anticorpo Peptídeo pos/neg 2A4(39) CGGHEDT, (SEQ ID Nº: 87) POS 40 CGGAEDS, (SEQ ID Nº: 88) pos 41 GHEDTIADOQE, (SEQ ID Nº: 89) NEG 64 CGGAEDT, (SEQ ID Nº: 90) POS 65 CGGHADT, (SEQ ID Nº: 91) FRACO 66 CGGHEAT, (SEQ ID Nº: 92) NEG 67 CGGHEDA, (SEQ ID Nº: 93) POS 68 CGGHEDTM, (SEQ ID Nº: 94) NEG 69 CGGHEDTMA, (SEQ ID Nº: 95) NEG 70 CGGHEDTMAD, (SEQ ID Nº: 96) NEG 71 CGGHED, (SEQ ID Nº: 97) FALSO POS? 7d8 (39) CGGHEDT, (SEQ ID Nº: 87) POS 40 CGGAEDS, (SEQ ID Nº: 88) POS 41 GHEDTIADOQE;, (SEQ ID Nº: 89) NEG 64 CGGAEDT, (SEQ ID Nº: 90) POS

Anticorpo Peptídeo pos/neg 65 CGGHADT, (SEQ ID Nº: 91) NEG 66 CGGHEAT, (SEQ ID Nº: 92) NEG 67 CGGHEDA, (SEQ ID Nº: 93) POS 68 CGGHEDTM, (SEQ ID Nº: 94) NEG 69 CGGHEDTMA, (SEQ ID Nº: 95) NEG 70 CGGHEDTMAD, (SEQ ID Nº: 96) NEG 71 CGGHED, (SEQ ID Nº: 97) NEG 894 (39) CGGHEDT, (SEQ ID Nº: 87) POS 40 CGGAEDS, (SEQ ID Nº: 88) POS 41 GHEDTIADOQE, (SEQ ID Nº: 89) NEG 64 CGGAEDT, (SEQ ID Nº: 90) POS 65 CGGHADT, (SEQ ID Nº: 91) NEG 66 CGGHEAT, (SEQ ID Nº: 92) NEG 67 CGGHEDA, (SEQ ID Nº: 93) FRACO 68 CGGHEDTM, (SEQ ID Nº: 94) FALSO +? 69 CGGHEDTMA, (SEQ ID Nº: 95) FALSO +? 70 CGGHEDTMAD, (SEQ ID Nº: 96) NEG 71 CGGHED, (SEQ ID Nº: 97) NEG Exemplo VIII. Análise Imuno-histoquímica de Camundongo AA.

A reatividade de sobrenadantes de hibridomas expressando an- ticorpos 2A4, 8G9 e 7D8 para depósitos amiloides hepáticos e esplênicos AA murino (os principais sítios de deposição amiloide) foi documentada imu- — no-histoquimicamente. Para estes estudos, seções teciduais coletadas de um camundongo TRIAD com amiloide AA espalhado no fígado e baço (como evidenciado por depósitos birrefringentes verdes Congofílicos) foram marca- das com sobrenadantes contendo mAb. Todos os 3 ligaram-se da amiloide hepática e esplênica. Ao contrário não houve reatividade com sobrenadantes de cultura derivados de hibridomas irrelevantes. A capacidade do amiloide usando 2A4, 8G9 e 7D8 para imunomarcação de amiloide em fígado murino fresco (não fixado), fígado e baço murinos embebidos em OCT foi testada. Houve evidência de que os mAbs conservaram sua capacidade de ligação à amiloide AA no sinusoide hepático. Além disso, a reatividade de anticorpo como tecido esplênico foi mais fácil de interpretar, e o amiloide perifolicular foi intensamente imunomarcado. Para demonstrar que os mAbs estavam especificamente ligados ao amiloide AA, os sobrenadantes de mAb em uma diluição 1:25 foram pré-incubados com 50 pug/mL de peptídeo nº39 (p nº39) ou de nº41 (p nº41) por 1h à temperatura ambiente. Com tecido fixado em formalina como um substrato, o peptídeo p nº39 (50 ug/mL) inibiu significati- vamente a reatividade de amiloide de ambos os mAbs 2A4 e 7D8 (os resul- tados com 8G9 estão pendentes). Ao contrário, o peptídeo p nº41 foi inefi- caz. Resultados comparáveis foram obtidos com tecidos frescos.

Exemplo IX. Análise Imunohistoquímica de AA Humana.

Comparação da sequência de aminoácidos de SAA de camun- dongo e humana da posição 73 a 76 revela 2 resíduos idênticos, uma substi- tuição conservada de Ser para Thr, e uma troca não conservada de Ala para His. Para testar se os mAbs 2A4, 8G9 e 7D8 reagiriam cruzadamente com depósitos amiloides AA humanos, testamos sua reatividade em rim, glândula suprarrenal, ovário e fígado humanos contendo AA. Em todos os casos, os sobrenadantes de mAb imunomarcaram os depósitos amiloides. No tecido ovariano, o peptídeo p nº39 bloqueou efetivamente a ligação de mAbs à AA amiloide perivascular, ao passo que o peptídeo p nº41 não inibiu esta rea- ção.

Exemplo X. Interação de Sobrenadantes de Cultura Anti-AA com Fibrilas AA Derivadas de Murino.

A interação dos mAbs 2A4, 8G9 e 7D8 com amiloide AA foi inici- almente testada por ELISA e os dados, fornecidos na Figura 31, analisadas usando SigmaPlot (SPSS Inc) . Cada ponto representa média + SE (n = 3).

Um sobrenadante de cultura de um hibridoma irrelevante foi usado como um controle (Controle de Sobrenadante de Cultura). Houve uma razão ruído- sinal extremamente baixa e os resultados mostraram que a primeira coleta continha mais mAb em relação à segunda, como evidenciado pelo maior sinal de absorvância em relação ao sobrenadante controle. (Além disso, a reatividade imuno-histoquímica do material do dia 1 foi maior do que nas amostras do dia 2). Embora os valores de SE fossem grandes, pareceu a partir destes dados que a afinidade de ligação de 2A4, 8G9 e 7D8 foi apro- ximadamente equivalente à reatividade ausente após diluição —-1:64. Os da- dos de ligação também sugerem que a capacidade, isto é, a quantidade de MmAb ligado, variou com 7D8> 8G9> 2A4; entretanto, estes dados não foram corrigidos para a concentração de mAb e em estudos subsequentes esta tendência não foi observada.

Por causa do baixo sinal e alta variabilidade encontrada nos sobrenadantes de cultura e para determinar mais exatamen- te a afinidade de ligação relativa dos mAbs às fibrilas amiloides AA murinas e humanas (bem como fornecer material para estudos de biodistribuição in vivo) foi necessário isolar os mAbs por cromatografia por afinidade em prote- ína A.

À pureza do mAbs isolados foi estabelecida por SDS-PAGE usando géis de acrilamida 10% em condições redutoras e não redutoras (figura 32). Amostras nas colunas 1 a 4 tratadas com mercaptoetanol, linhas 5 a 9 sem.

O gel foi marcado com azul de Coomassie: mAb 8G9, colunas 1 e 6; mAb 2AA4, colunas 2 e 7; mAb 7D8, colunas 3 e 8; sobrenadante controle SP2/0, colunas 4 e 89; branco, coluna 5. Marcadores de proteína Mr. (Pad) estão, ordenados do superior para o inferior: 176, 119, 75, 49, 39, 256 19 kDa.

A interação dos mAbs purificados com peptídeo de imunização p nº39, peptí- deo controle (p nº41), extratos de AA murinos e humanos foram determina- dos por ELISA como descrito acima.

Estes dados foram analisados pelo ajustede uma curva sigmoidal usando o programa SigmaPlot e a concentra-

ção de mAb em saturação de 50% (EC50), (Tabela 5) determinada.

Tabela 5 Valores de ECr5o para ligação de mAb purificado Substrato mAb AA humana AA de camundongo Peptídeo 39 Peptídeo

EM 8G9 31,7NM 5,64 nM 4,0 nM >> 100 nM 2A4 264nNM 4,09 nM 3,4 NM >> 100 nM 7D8 133nM 1,84 nM 2,3 NM >> 100 nM A interação dos 3 mAbs com o peptídeo p nº39 exibiu ligação saturável com valores de EC50 em baixa faixa nanomolar (ver Tabela 5 aci- ma). Ao contrário, até na concentração mais alta de mAb usada (100 nM) houve pouca ligação detectável ao peptídeo p nº41 (figura 33 - Cada ponto representa média + SE, (n = 3 em cada concentração)). Estes dados confir- maram os resultados imunohistoquímicos descritos acima, isto é, aquele peptídeo p nº39 foi capaz de bloquear completamente a ligação de mAbs aos tecidos carregados com amiloide AA. As EC50s calculadas a partir da ligação de cada mAb com o peptídeo p nº39 foram essencialmente idênticas como foi no caso quando um extrato amiloide AA murina foi usado como substrato (figura 34 - Cada ponto representa média + SE (n = 3 em cada concentração)). Os valores de EC50 calculados a partir de ligação de mAbs ao extrato de AA de camundongo foram essencialmente idênticos aos obti- dos quando o peptídeo p nº39 foi usado como substrato (figura 34; Tabela 5). Ao contrário, quando o extrato amiloide AA humana foi seco nos poços da microplaca, os valores de EC50 foram entre 5 e 7x menores do que aqueles observados para AA de camundongo e peptídeo p nº39 (figura 35 - Cada ponto representa média + SE (n = 3 em cada concentração); Tabela 5). Como o valor de EC50 para ligação de mAb 7D8 foi o mais baixo dos 3 anticorpos testados, os Requerentes selecionaram este reagente para estu- dos de visualização e colocalização in vivo. As 2 substituições de aminoáci- do na sequência de SAA humana com relação à proteína murina afetaram os valoresdeEC50.Não desejando estar ligados por uma teoria específica, os Requerentes atribuem a EC50 maior para AA humana a um pior "ajuste"

das cadeias laterais de aminoácidos no sítio de ligação ao antígeno.

Entre- tanto, este efeito corresponde somente a uma redução de 5 vezes na afini- dade relativa quando os extratos amiloides são adsorvidos pela superfície, como no ELISA.

Além disso, estes dados apoiam a observação de que os 3 —mAbs se ligaram tanto aos depósitos amiloides AA de tecido murino como aos humanos.

Exemplo XI.

Ligação Competitiva de Mabs à Amiloide AA de Camundongo e Humana.

Para determinar o efeito, se houver algum, da desnaturação po- tencial quando adsorvido à superfície do poço de microtítulo, a reatividade de 2A4, 8G9 e 7D4 foi avaliada usando um ELISA de competição no qual o extrato amiloide AA murino ou humano foi usado como um competidor solú- vel para a interação de mAbs com o extrato de AA ligada à superfície.

Em todos os casos, fibrilas amiloides AA solúveis (não adsorvi- das)tanto de origem humana como de camundongo foram capazes da com- petir pelos 3 mAbs, indicando que o epitopo reconhecido pelos reagentes não depende da desnaturação parcial que resulta da adsorção superficial.

Em geral, o extrato de AA murina (AEF) foi um competidor melhor do que a AA humana (Tabela 6). Tabela6 Valores de IC5o (vg/mL) da ligação de mAb à amiloide AA mAb AA humana? AA de camundongo (AEF)t 8G9 > 119,5 17,3 2A4 > 211,7 14,7 7D8 > 8111 26,8 tAmiloide AA humana em solução competindo por AA de camundongo (AEF) adsorvida; tAA de camundongo (AEF) em solução competindo pelo extrato amiloide AA — humano adsorvido na placa.

Os valores de IC50 (concentração de AA (por peso) que reduziu a ligação de mAb em 50%) para AEF murina na solução foram -20 ug/mL, ao passo que para AA humana os valores foram 6 a 44 vezes maiores (ao contrário, as EC50s de AA humana foram somente 7 vezes menores do que aquelas para a AA de camundongo). Isto pode refletir o fato de que, quando em solução, o epitopo nas fibrilas amiloides é menos acessível em prepara- ções de AA humana comparadas com AA murina.

Como esperado, o mAb 7D8 que exibiu a maior afinidade relati- va por fibrilas AA humanas e murinas quando foram adsorvidas pela superfí- cie requereu a concentração mais alta da amiloide AA para alcançar a com- petição.

Exemplo XII. mAb 7D8 radiomarcado.

A eficiência da radiomarcação de 7D8 foi determinada por SDS- PAGE. MAb reduzidos e nativos foram analisados e as proteínas visualiza- das usando um visualizador de fósforo. Tanto cadeias IgH como IgL incorpo- raram a marcação com |-125, e nenhuma evidência de bandas associadas com fragmentação ou agregação foi observada.

Exemplo XIII. Visualização de amiloide AA usando 7D8 marcado com 1281.

Para estudar a localização in vivo de mAb 7D8 radiomarcado, três grupos de camundongos foram usados: IL-6 transgênico; AgNO3/AEF induzido, e controles sem amiloide (Selvagem). A visualização por SPECT/CT revelou que mAb 1?51-7D8 localizou-se em depósitos amiloides AA murinos no baço e fígado, como evidenciado pelo acúmulo do mAb radi- omarcado nestes tecidos em relação ao camundongo controle, que mostrou somente baixa atividade de agrupamento sanguíneo no fígado e iodo livre na glândula tireoide.

Em contraste com estes camundongos, o camundongo injetado com AgNO3 mostrou entrada de iodo livre na tireoide, alguma atividade he- pática, mas o sítio principal de ligação de 1251-7D8 foi visto no sítio de injeção s.c. de AgNO3 (área dorsal direita inferior). A atividade nesta área é clara- mente circunscrita pela solução de prata atenuadora de raio x como visto por CT. O mAb 7D8 foi mostrado ligar-se a depósitos amiloides AA tanto no fí- gado como no baço na presença de sAA circulante no camundongo TRIAD, como evidenciado nas imagens de SPECT.

A. Biodistribuição De 123|-7D8 Em Camundongos.

48 h pós-injeção de 12*1-7D8 havia radioatividade no agrupamen- to sanguíneo, que contabilizou entrada relativamente alta no pulmão (que se enchem de sangue quando os camundongos são sacrificados). Importante, o acúmulo hepatoesplênico de mAb em camundongo IL-6 é indicativo de pre- sença do amiloide.

As imagens de SPECT/CT confirmaram a distribuição de mAb nestes órgãos. 72 h pós-injeção, os valores de agrupamento sanguíneo modificaram-se pouco como evidenciado pela atividade inalterada no cora- ção e pulmão em relação aos camundongos sacrificados em 48 h, devido a Ti26io relativamente longa deste mAb (-60 h). Houve acúmulo significante de —mAb radiomarcado no camundongo IL-6, que correlacionou-se com as ima- gens de SPECT que foram adquiridas mostrando impressionante entrada esplênica e, em um menor grau, hepática.

De outros órgãos, o mai importan- te foi o fígado (que é o sítio do catabolismo de IgG e fonte de sAA durante a resposta de fase aguda). Nos camundongos selvagens, sem desafio inflama- tório ou amiloide, o fígado continha < 6% 1D/g, que é comparável ao rim e coração onde o agrupamento sanguíneo contribui quase exclusivamente para o sinal.

B.

Análises Autorradiográficas E Histoquímicas.

A fim de determinar se o acúmulo hepático aumentado de 12º|- 7D8 nos camundongos IL-6 e AgNO; resultou da entrada amiloide, depura- ção catabólica ou ligação de sAA recentemente sintetizada, fígado bem co- mo outros tecidos foram submetidos à análise autorradiográfica.

Com base na visualização por SPECT e medidas de biodistribui- ção, foi suposto que maior quantidade de amiloide nos camundongos IL-6 transgênicos estava no fígado e baço.

Esta suposição foi confirmada em se- ções marcadas com Congo Red nas quais amiloide significante foi observa- da em todas as partes da polpa vermelha bem como nas regiões perivascu- lares e sinusoides do fígado.

Depósitos birrefringentes adicionais, mais dis- cretos estavam presentes nos rins e coração.

A distribuição de "21-7D8 den- tro destes tecidos também se correlacionaram com o material Congo Red e reativo para AA.

Não houve acúmulo em hepatócitos que foram destituídos de amiloide.

Com base nos dados de biodistribuição, o camundongo tratado com AgNO; tinha mais entrada de 12*1-7D8 no fígado do que no baço, que foi inesperado uma vez que isto não é o padrão normal de acúmulo de AA em tais animais. Marcação com Congo Red revelou pequenas quantidades ami- loides em uma região perifolicular única no baço (canto direito superior) e depósito perivascular hepático extenso, ambos os quais foram evidentes nas autorradiografias. Adicionalmente, o sítio de injeção s.c. de AgNO; foi visto nas imagens de SPECT tendo uma concentração significante de 125|-7D8 (também observamos isto quando SAP radioiodetada foi usada como agente de visualização). Este sítio não contém amiloide (isto é, material Congo Red birrefringente); entretanto, foi imunomarcado pelo mAb anti-AA. Sem desejar estar ligado a uma teoria específica, é possível que mAb 7D8 localize-se nos sítios de inflamação ou "pré-amiloides" (bem como depósitos amiloides ma- duros). Em contraste com o impressionante acúmulo de 7D8 nos órgãos de camundongo IL-6, foi encontrado que os tecidos dos camundongos controle tinham muito pouco ou nada de traçador em qualquer órgão além do agru- pamento sanguíneo. Nenhuma amiloide foi achada nas seções marcadas com Congo red de qualquer órgão destes controles.

C. Farmacocinética de 12º1-7D8.

Após injeção do anticorpo 7D8 radiomarcado, a taxa de desapa- recimento da molécula foi determinada e as determinações de meia-vida resumidas na Tabela 7. Estes resultados indicaram que Tio de 7D8 foi -60 h, compatível com aquela de um mAb IgG2b murino (nota, 7D8 é da sub- classe I9gG2b). A depuração ligeiramente mais rápida de 121|-7D8 nos ca- —mundongos |L-6(TRIAD) não foi considerada significante. Com base nestes dados, a retenção de mAb pela amiloide tecidual, como evidenciado nos da- dos de SPECT, por 72 h não influenciam na taxa de excreção.

Tabela 7 análise da meia-vida de 125/|-7D8 em camundongos Camundongo A(S.E.) K(S.E. x 10º) R? ti2bvio tire IL-6, 48h 191,7 (2,96) 0,0117(7,0) 0,98 59,2h 56,2 IL-6, 72h 175,2 (3,99) 0,012(8,9) 0,97 57,7 h

Camundongo A(S.E.) K(S.E. x 10º) R? ti2bvio tire AgNOS3, 48h 181,0 (1,99) 0,0106(4,9) 0,99 65,8h 61,1 AgNOS3, 72h 174,1 (297) 0,0112(5,8) 0,98 62,2h Ctrl, 48h 185,1 (3,19) 0,0108(7,6) 0,98 64,3h 61,3 Ctrl, 72h 185,1 (3,09) 0,0109(5,6) 0,98 63,7 h

1. Método de Identificação de Agentes que Previnem ou Tratam Amiloidose Usando Camundongo Transgênico ou TRIAD. Procedimentos para preparação de agentes são descritos em Schenk et al. Nature 400:173-

177. Agentes são emulsionados 1:1 (v/v) com o adjuvante completo de Freund para a primeira imunização de camundongos transgênicos, seguida por um reforço em adjuvante completo de Freund em 2 semanas e mensal- mente após isso. Injeções de PBS seguiram o mesmo esqeuma e os ca- mundongos foram injetados com mistura de PBS/adjuvante 1:1 para contro- le. A sobrevidavida dos camundongos transgênicos é comparada para de- terminar se os agentes são eficazes na prevenção de Amiloidose AA aumen- tando a vida do animal.

2. Histopatologia. Para microscopia ótica e polarizada, seções de tecido de 4 a 6 um de espessura foram cortadas e marcadas com hema- toxilina e eosina (HE) e uma solução alcalina de Congo Red recentemente preparada, respectivamente. Para a microscopia eletrônica de transmissão, as seções foram introduzidas em Epon (Ted Pella, Redding, CA), secciona- das, e examinadas com um microscópio eletrônico de transmissão JEOL

1008. Ver Ludlage et al. Vet Pathol 42:117-124 (2005).

3. Imuno-histoquímica. Seções de tecido introduzido em parafina (64um de espessura) foram cortadas em um micrótomo, montadas em lâmi- nas recobertas com poli-L-lisina, secas durante a noite à temperatura ambi- ente, e desparafinizadas. Imunomarcação foi realizada usando a técnica do complexo avidinabiotina (ABC-elite) como descrito anteriormente. Os anti- corpos primários foram antisoros de camundongo antiamiloide A humana (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) e anti-SAA de camundongo policlonais. Imunoglobulina-G (IG) de cavalo anti-

camundongo purificada por afinidade conjugada à peroxidase de rábano sil- vestre (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ou IgG de cabra anticoelho, - camundongo ou -rato conjugada a peroxidase de rábano silvestre(BioRad Laboratories, Richmond, CA) foram usadas como anticorpos secundários.

4. Quantificação de SAA por ELISA. Concentrações de SAA fo- ram medidas por um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) usando o conjunto Multispecies SAA ELISA de acordo com as orientações fornecidas pelo fabricante (Biosource, Camarillo, CA). Curvas-padrão foram preparadas usando quantidades conhecidas de proteína SAA humana e ab- —sorvância foi medida em 405 nm com leitor de placa modelo 4450 da BioRad (Fullerton, CA).

5. Estudos de Renovação por Cintilografia de SAP radiomarcada em Camundongos. SAP foi oxidativamente iodetada com 11 (2 a 5 MBq/mg) pelo uso de N-bromossuccinimida. Camundongos de 6 a 12 semanas rece- beram2a10 ug de'?l-SAP em 200 uL intravenosamente. Sangrias de cau- da precisamente medidas (0,01 a 0,04 g) foram tomadas em intervalos de tempo específicos e radioatividade precipitável em ácido tricloroacético foi contada na mesma corrida no fim de cada experimento em conjunto com alíquotas-padrão do traçador injetado. Pepys et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:5602-5606 (1994).

6. Renovação por Cintilografia de SAP radiomarcada e Estudos de Visualização no Homem. SAP para uso no homem foi isolada do plasma de um doador acreditado normal único e foi oxidativamente iodetada com 1251 (2 a 5 MBa/mg) ou *º*I (110 MBq/50 ug de proteína) usando N- —bromossuccinimida. Após injeção de 1º?31 SAP, os dados foram adquiridos e processados em uma câmera gama IGE Starcam (IGE Medical Systems, Slough, UK). A depuração de SAP marcada com 1251 foi estudada em indi- víduos saudáveis e pacientes sofrendo de amiloidose AA. Pepys et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:5602-5606 (1994).

7. Extração e Purificação de Amiloide. Os métodos usados para extrair a amiloide do tecido foram como descritos por Pras et al. Ver Pras et al. J. Clin. Invest. 47:924-933 (1968). Em resumo, uma porção do fígado ou tecidos de outros órgãos obtidos em necropsia e mantidos a -80 C foi homo- geneizada com salina gelada em um banho de gelo usando um misturador Omni (Omni Internacional, Waterbury, CT). O extrato foi centrifugado em

10.000 rpm por 30 minutos a 4 C e o precipitado re-extraído mais duas ve- zes com salina gelada, uma vez com citrato de sódio 0,1 M salina Tris- tamponada, pH 8,0, e então novamente com salina até que a A280 do so- brenadante fosse <0,10. O precipitado resultante foi homogeneizado com água destilada gelada, e a mistura centrifugada em 35.000 rpm por 3 horas a 4 C. O precipitado obtido do extrato de água foi então liofilizado.

8. Ressonância de plásmons de superfície. A cinética de ligação foi medida em uma ferramenta BlAcore X. As fibrilas preparadas a partir de VA6 Wil foram sonicadas ligeiramente com uma sonda sonicadora e então ligadas a um chip CM-5 usando química de amina, de acordo com o protoco- lo BlAcore. Este processo utiliza EDC e NHS para ativar os grupos carboxila do chip para acoplamento com os grupos amino livres das fibrilas. O aco- plamento foi conduzido em um tampão de NaOAc, pH 4,0 em uma concen- tração de 100 pug/mL. O canal controle foi "ligado vazio" e ambos os canais foram reagidos com etanolamina para saturar os sítios não reagidos. Apro- ximadamente 16.000 RU de fibrilas VA6 Wil foram ligadas.

Sensogramas foram dirigidos no tampão HBS-EP de BlAcore em 20 ulL/min no Fc1 (fibrilas VA6 Wil) menos modo Fc-2 (controle). Amostras contendo mAb ou mAb mais inibidores de peptídeo foram injetadas (70 uL) e sensogramas coletados usando a função de lavagem retardada por 200 se- gundos. Os dados foram analisados no programa BlAevalutation, usando o —modelode Langmuir1:1com correção de ação de massa.

9. MicroSPECT/CT. Duas coortes de 3 camundongos cada uma foram injetadas s.c. com 50 mg do extrato amiloide de AL humana entre as escápulas. Após 7 dias, um grupo de camundongos recebeu uma injeção iv na veia da cauda de — 300 pCi de mAb 7D8 marcado com *?I. O segundo grupo foi administrado e quantidade igual de mAb murino MOPC 31C como um controle. Após 72 horas, os camundongos foram sacrificados por dose excessiva de isoflurano e imagens de SPECT/CT adquiridas. Para fornecer o aumento de contraste vascular nas imagens CT, foi dada aos camundongos uma dose iv de 200 uL de Fenestra VCO (Advanced Research Technologi- es, Montreal, Canadá) 5 minutos antes da varredura.

Os dados de SPECT foram coletados com uma plataforma de visualização microCAT Il + SPECT de modalidade dual (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN), capaz de resolução espacial submilimétrica quan- do equipado com um orifício de colimador de diâmetro de poro de 0,5 mm. Na vizualização, os 2 detectores (compostos de um tubo foto-multiplicador multianodo Hamamatsu R2486-02 de diâmetro 50 mm ligado a um tabela de arranjo cristalino de 1x 1x8mm Csl (TI) em uma grade de 1,2 mm?) foi posicionada -45 mm do centro da rotação. Cada conjunto de dados de SPECT compreendeu 45 projeções coletadas em 360º durante o curso de —B50 minutos. As imagens foram reconstruídas usando uma implementação do algoritmo de probabilidade máxima de maximização de expectativa (EM- ML).

Após coleta de dados por SPECT, imagens CT de alta resolução foram obtidas. O microCAT Il scanner tem uma geometria de raio de cone de órbita circular, equipada de uma fonte de raio x de microfoco de 20 a 80 kVp, e captura um campo de 60 mm * 90 mm da visão usando um detector CCD 2048x3072 de tabela, oticamente ligado a uma tela de fósforo minR através de um pacote de fibra ótica. Cada conjunto de dados CT, composto de 360 projeções em azimutes de 1º, foi adquirido em 8 minutos. As imagens foram reconstruídas em tempo real em voxels isotrópicos de 77 um usando uma implementação do algoritmo de retroprojeção de Feldkamp.

Para facilitar o corregistro do SPECT reconstruído e imagens CT, fontes de Co-57 seladas foram colocadas no leito de visualização. Os conjuntos de dados microSPECT e CT foram visualizados e corregistrados manualmente com um pacote de programa de análise de imagem 3D (Amira, Versão 3.1: Mercury Computer Systems).

10. Biodistribuição. Amostras de fígado, baço, rim, coração, pul- mão e tumores amiloides implantados (isto é, amiloidoma) foram coletadas dos camundongos e colocadas em frascos tarados, pesados, e a radioativi-

dade medida. Os valores de índice primário foram expressos como % da dose de tecido injetado/g (% 1ID/g).

11. Autorradiografia. Seções de cortes de 6 um de espessura de blocos fixados em formalina, introduzidos em parafina de tecido obtido de camundongos sacrificados 72 h pós-injeção de “*L.7D8 foram colocados nas lâminas de microscópio Probond (Fisher Scientific), mergulhadas em emul- são NTB-2 (Eastman Kodak), armazenadas no escuro, e reveladas após uma exposição de 24h. As seções foram contramarcadas com hematoxilina e eosina (H&E), usando cobertura Permount (Fisher Scientific), e examina- das por microscopia ótica. Além disso, a lâmina consecutiva foi marcada com Congo Red alcalino e examinada sob iluminação cruzada polarizada. Finalmente, uma terceira lâmina foi imunomarcada usando como reagente primário o nosso mAb reativo para AA. Imagens microscópicas da câmera digital foram tomadas e avaliadas usando um pacote de programas de análi- sedeimagem (Imagem Pro Plus, Media, Cybernetics). Exemplo XIV. Preparação de Anticorpos Humanizados 2A4 e 7D8. Anticorpos 2A4, 7D8 e 8G9 humanizados foram preparados pelo enxerto de CDRs de 2A4, 7D8 e 8G9 murinas em regiões conservadas aceptoras humanas de acordo com técnicas conhecidas na técnica. Retro- mutações foram feitas para rduzir a antigenicidade conservando a afinidade de ligação. As regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada de 2A4 mu- rino são apresentadas como os resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 e co- mo os resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154, respectivamente. As regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada de 7D8 são apresentadas como os resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153 e como os resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154, respectivamente. As regiões variáveis da cadeia leve de 2M e 8G9 murino são idênticas entre si e diferenciam-se da região variável da ca- deia leve de 7D8 em um resíduo único na CDR1. As regiões variáveis da cadeia pesada de cada um de 2A4, 7D8, e 8G9 são idênticas. A variável capa (Vk) de 2A4 e 7D8 pertence ao subgrupo 2 de camundongo, que corresponde ao subgrupo 2 humano e a variável pesada (Vh) ao subgrupo 3c de camundongo que corresponde ao subgrupo 3 hu-

mano (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition.

Publicação do NIH Nº 91-3242). CDR-L1 inclui 16 resíduos e pertence à classe 4 canônica em Vk.

CDR-L2 inclui 7 resíduos e pertence à classe 1 em Vk.

CDR-L3 inclui 9 resíduos e pertence à classe 1 em Vk.

Ver Martin AC, Thornton JM. (1996) J Mol Biol. 263, 800-15. A leucina na posi- ção 27 no 7D8 é bastante incomum, e a glutamina no 2A4 é mais habitual.

Um modelo mostra que a cadeia lateral está na superfície do sítio de ligação, e por isso deve ser importante para a ligação ao antígeno.

CDR-H1 inclui 5 resíduos e pertence à classe 1, e CDR-H2 inclui 19 resíduos e pertence à classe4 (Martin & Thornton, 1996). CDR-H3 não tem nenhuma classe canô- nica, mas a alça 8 do resíduo provavelmente tem uma base ligada de acordo com as regras de Shirai et al. (1999) FEBS Lett. 455, 188-97. Este é conser- vado em um modelo embora a conformação do ápice da CDR-H3 possa ser diferente.

Os resíduos na interface entre os domínios Vk e Vh são aqueles comumente encontrados em Vk de 2A4, Vk de 7D8 e Vh de 2A4. Uma busca foi feita no banco de dados PDB (Deshpande et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33: D233-7) para encontrar estruturas que guiari- am a escolha de retromutações.

Uma busca no banco de dados de sequên- cia proteica não redundante do NCBI permitiu a seleção de regiões conser- vadas humanas adequadas em que enxertar as CDRs murinas.

Para Vk, uma cadeia leve capa humana com código de acesso no NCBI BACO01562 (gi:21669075) (SEQ ID Nº: 166) foi escolhida.

Esta tem o mesmo compri- mento de CDR-L3 e pertence à linhagem germinativa humana VKIIA19/A3 e subgrupo capa humano 2. Uma região conservada similar que somente se diferenciou na região J também foi encontrada com o código de acesso no NCBI BACO01733 (gi:21669417) (SEQ ID Nº: 167). BAC01562 foi usada co- mo uma região conservada para Vk de 2A4, e BACO01733 foi usada como uma região conservada para Vk de 7D8. Para Vh, a cadeia pesada de lg humana AACS51024 (gi:1791061) (SEQ ID Nº: 165) foi usada.

Ver Glas et al. (1997) Clin.

Exp.

Immunol. 107: 372-380. Esta pertence à linhagem germina-

tiva humana VH3-72 e subgrupo pesado humano 3. Regiões variáveis da cadeia leve representativas humanizadas de 2A4 são apresentadas como as SEQ ID Nº: 155, 156 e 157. Regiões variáveis da cadeia leve representativas humanizadas 7D8 são apresenta- das como as SEQ ID Nºs: 158, 159, 160, 174, 175 e 176. Regiões variáveis da cadeia pesada representativas humanizadas 2A4/7D8 são apresentadas comoas&SEQID Nº: 161, 162 e 163. Ver figuras 36A a 36E.

Anticorpos representativos humanizados da invenção incluem anticorpos que têm uma região variável da cadeia leve selecionada a partir de um dos resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152, resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153, e SEQ ID Nº: 155, 156, 157, 157, 159, 160, 174, 175 e 176; e uma região variável da cadeia pesada selecionada a partir de um dos resí- duos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154 e SEQ ID Nº*: 161, 162 e 163. Exemplo XV. Efeitos Terapêuticos de MAb 2A4 em Camundongos com Ami- loidose AA Sistêmica Severa.

A eficácia terapêutica de mAb 2A4 foi avaliada em camundongos H2/hull-6 com amiloidose sistêmica severa. Camundongos H2/hulL-6 trans- gênicos, que constitutivamente expressam um transgene de IL-6 humana, tendem a amiloidose AA sistêmica rápida e irrevogável. Em um primeiro e segundo estudo, camundongos tratados com mAb combinado com isotipo TY-11, que não tem nenhuma atividade relatada em camundongos, foi usa- do como um controle. Antes de administrar o fator de aumento amiloide para induzir AA, camundongos H2/hulL-6 foram escolhidos e sangrados através do seio retro-orbital, o soro preparado, e a concentração de sAA determina- da usando um conjunto ELISA comercialmente disponível. Os valores repre- sentativos foram como se segue: 2196,7 pug/mL, 823,91 ug/mL, 1415,00 ugml, 1673,01 po/ml, 814,53 pg/ml, 1088,18 po/mL, 736,34 upo/mL, 1546,35 po/mL, 953,70 pug/mL, 886,46 ug/mL, média = 1213,4 + 478 po/mL.

No início do segundo estudo (semana O), camundongos H2/hulL-6 foram injetados iv com 100 ug do fator de aumento amiloide (AEF). Após indução da patologia de AA pela injeção de AEF, aos camun- dongos foram administradas 5 injeções de 100 ug subcutaneamente em membros alternados de mAb 2A4 (13 animais) ou TY11 (11 animais). A te- rapia foi iniciada em aproximadamente 1 semana após a injeção de AEF. À sobrevida dos animais em cada grupo de tratamento foi traçada e analisada.

Os resultados são mostrados na Tabela 7. Somente 45% dos camundongos tratados com mAb TY11 sobreviveram até o fim do estudo.

Ao contrário, ne- nhum dos camundongos tratados com 2A4 foi perdido ao longo do curso do estudo.

A análise dos dados de sobrevida usando métodos-padrão mostrou uma diferença significante nas curvas de sobrevida (P <0,0025) em ambos os grupos.

A sobrevida mediana dos camundongos tratados com TY11 foi calculada para ser 41 dias, comparável com aquela observada em um estu- do prévio (38,5 dias). Tabela7 lo oo jim | Na semana 6, pós-AEF, os camundongos foram sangrados e sacrificados, e seus órgãos coletados para análise adicional.

Para a quantifi- cação amiloide no fígado e baço, birrefringência de Congo Red foi visualiza- da microscopicamente sob iluminação cruzada polarizada e digitalmente re- gistrada.

A área do material birrefringente foi determinada pela seleção (usando um método de segmentação espectral) e a quantificação dos pixels associados a amiloide.

O índice de carga amiloide (ABI), medida a partir do conteúdo amiloide, foi expresso como a área percentual ocupada pela ami- loide em cada órgão.

A quantificação de amiloide nos fígados e baços de camundongos tratados com 2A4 e com TY11 não revelou nenhuma diferen- ça significante entre os dois tratamentos.

Entretanto, os camundongos trata- dos com TY11 que sobreviveram ao dia 42 para comparação com camun- dongos tratados com 2A4 foram aqueles que não desenvolveram um grau mórbido ou distribuição de amiloide AA para resultar por meio disso em mor-

bidez.

A carga amiloide hepatoesplênica também é monitorada durante o curso do estudo de sobrevida para avaliar um aumento na carga amiloide correlacionada com a morbidez.

Em um terceiro estudo, mAb 2A4 em comparação ao mAb JH70 combinado ao isotipo, que não tem nenhuma reatividade relatada em ca- mundongos.

Além disso, a química sanguínea e outros parâmetros foram monitorados ao longo do período de tratamento.

Camundongos machos e fêmeas H2/hulL-6 nascidos entre 1/8/08 e 7/9/08 foram usados neste estu- do.

Vinte e três camundongos fêmeas e 16 camundongos machos foram sangrados através do seio retro-orbital.

Sangue total foi usado para a carac- terização química do nitrogênio de ureia sanguínea (BUN) e alanina amino- transferase (ALT) para medir a função renal e hepática usando VetScan VS2 (Abaxis, Union City, CA). A concentração sérica de 12 outras proteínas e analitos foi simultaneamente medida.

Uma contagem de sangue total (CBC) foirealizada usando a plataforma VetScan HM5. Além disso, a cada camun- dongo foi administrada uma dose baixa (-50 a 60 yuCi) de componente ami- loide P sérico humano radioiodetado (*??I|-SAP) em albumina sérica bovina 5 mg/mL para avaliar a carga amiloide dos camundongos antes do início do processo de doença.

O percentual de 12??|-SAP conservado em 24 h pós- injeção (pi) foi medido colocando cada camundongo em um calibrador de dose.

A retenção de *??I-SAP maior do que aquela observada nos camun- dongos não transgênicos (controle) foi indicativa de doença amiloide.

Final- mente, soro foi usado para medir a concentração da proteína amiloide sérica (SAA) usando um ensaio ELISA comercial.

Um sumário destes dados pré- tratamento, valores de química sanguínea selecionados, e os tratamentos dados a cada camundongo é mostrado abaixo nas Tabelas 8 e 9. Tabela 8 Sumário dos Dados Pré-tratamento E Terapia com MAb De Cada Animal Camundongo conc.desAA Sexo DOB Retenção de Terapia H (vg/mL) 125)-SAP (%) — (Grupo Nº) 3488 360 F 1/8/08 9 2A4 (1) 3489 996 F 1/8/08 29 2A4 (1)

Camundongo conc.desAA Sexo DOB Retenção de Terapia H (vg/mL) 125)-SAP (%) — (Grupo Nº) 3490 472 F 1/8/08 10 2A4 (1) 3492 2068 M 1/8/08 13 2A4 (1) 3493 1740 M 1/8/08 E JH70 (1) 3494 1272 M 1/8/08 10 JH70 (1) 3495 1436 M 1/8/08 13 JH70 (1) 3496 2080 M 1/8/08 9 2A4 (1) 3498 268 M 1/8/08 9 2A4 (1) 3500 700 F 11/8/08 11 JH70 (1) 3501 ND F 11/8/08 9 JH70 (1) 3503 1040 F 11/8/08 11 JH70 (1) 3504 960 F 11/8/08 10 JH70 (1) 3513! 4400 M 13/8/08 60 2A4 (1) 3514 4400 M 13/8/08 40 2A4 (1) 3515 2800 M 13/8/08 13 2A4 (1) 3521 1480 M 18/8/08 11 2A4 (1) 3524 1680 M 18/8/08 9 2A4 (1) 3549 720 F 6/9/08 9 284 (2) 3550 760 F 6/9/08 9 284 (2) 3552? o F 6/9/08 E 284 (2) 3553 1160 F 6/9/08 12 284 (2) 3558 1660 M 6/9/08 9 JH70 (2) 3559 3520 M 6/9/08 12 JH70 (2) 3562 1312 F 6/9/08 E JH70 (2) 3563 1120 M 6/9/08 9 JH70 (2) 3564 2512 M 6/9/08 E 284 (2) 3565 1960 M 6/9/08 10 284 (2) 3567 1880 F 6/9/08 12 284 (2) 3570 792 F 7/9/08 13 284 (2) 3573 700 F 7/9/08 8 284 (2) 3577? o F 7/9/08 10 2A4 (2)

Camundongo conc.desAA Sexo DOB Retenção de Terapia H (vg/mL) 125)-SAP (%) — (Grupo Nº) 3578? o F 7/9/08 9 284 (2) 3579 1120 F 7/9/08 10 284 (2) 3580? o F 7/9/08 8 JH70 (2) 3581 700 F 7/9/08 9 JH70 (2) 3582 1680 F 7/9/08 9 JH70 (2) 3583 804 F 7/9/08 9 JH70 (2) 3584 1040 F 7/9/08 14 JH70 (2) 1, animais IL-6 homozigotos com altos níveis de sAA e doença amiloide pre- coce em vida. 2, camundongos selvagens sem sAA circulante e nenhuma doença amiloide. Retenção de 1?5|-SAP nestes animais é considerada normal e não reflete carga amiloide. Tabela 9 Valores Normais de Parâmetros de Química Sanguínea em Camundongos H2/hulL-6 BUN GLI (mg/dL) ALT(U/L) ALB TP GLOB (mg/dL) (9/dL) (gdl) (gd)

F M F M F M F MF MEF NM Média 211 23,8 144,7 151,2 37,6 423 2,5 1,9 5,6 622 31 44 DP 4,0 27 140 176 16,3 243 0,3 04 0,2 06 04 06 n 18 13 18 13 18 13 18 13 18 13 18 13 Alto 28,0 30,0 184,0 179,0 79,0 105,0 3,0 2,6 6,0 74 3,7 5,8 Baixo 15,0 20,0 126,0 119,0 21,0 230 20 1,2 51 5,5 26 34 Mediana 20,0 24,0 143,0 154,0 32,5 320 24 1,9 56 6,00 32 43 BUN, nitrogênio de ureia sanguínea; GLI, glicose; ALT, alanina aminotrans- ferase; ALB, albumina; TP, proteína sérica total; GLOB, imunoglobulina; F, fêmea; M, macho; DP, desvio-padrão; n é o número de camundongos usa- dos para determinar os valores. No início do terceiro estudo (semana 0), todos os camundongos H2/hulL-6 receberam 100 ug iv de fator de aumento amiloide (1 mg/mL). Uma semana depois disso, a terapia começou e a cada camundongo foram administrados 100 ug de mAb 2A4 ou JH70 sc como delineado na Tabela 8.

As injeções de mAb continuaram semanalmente por 7 semanas.

Em 2 sem medidas pós-AEF, CBC, química sanguínea e sSAA sérica foram feitas usando sangue coletado através do seio retro-orbital. Neste tempo também, os camundongos no grupo 1 foram administrados com- 60 puCide ?l-SAP em BSA como antes, para avaliar o acúmulo ami- loide como evidenciado pela retenção de SAP radiomarcada. Vários dos animais mostraram um efeito adverso de sofrimento extremo, e por isso, a avaliação de 1??|-SAP usando carga amiloide foi descontinuada. Os resulta- dos de parâmetros de química sanguínea selecionados, adquiridos 2 sema- naspós-AEF são mostrados na Tabela 10. Tabela 10 BUN (mg/dL) — GLI ALT (U/L) ALB TP(g/dl) GLOB (mg/dL) (g/dL) (g/dL)

F M F M F M F M F M F M Média 314 521 145,1 1298 33,9 633 23 1,8 65 81 42 62 DP 24,3 391 166 256 69 306 03 05 10 17 11 15 n 15 13 15 13 15 13 15 13 15 13 15 12 Alto 100,0 159,0 177,0 178,0 46,0 1340 2,77 30 86 11,7 70 96 Baixo 16,0 20,0 104,0 820 220 32,0 1,7 1,0 52 60 31 45 Mediana 220 31,0 150,0 120,0 320 540 23 1,7 65 7,5 40 60 BUN, nitrogênio de ureia sanguínea; GLI, glicose; ALT, alanina aminotrans- ferase; ALB, albumina; TP, proteína sérica total; GLOB, imunoglobulina; F, fêmea; M, macho; DP, desvio padrão; n é o número de camundongos usa- dos para determinar os valores.

Em 8 semanas pós-AEF, os camundongos foram sangrados um tempo final e imediatamente após isso foram administrados -200 pCi de 1251- SAP usando soro de camundongo normal 5% como veículo. Em resposta a este tratamento, alguns animais mostraram algum comportamento incomum que diminuíram em 30 min. Vinte e quatro horas depois, os camundongos foram injetados com agente de contraste de raio X de CT (- 200 yuL iv na veia da cauda) e então foram sacrificados por dose excessiva de isoflurano. Imagens de emissão de fóton única (SPECT) e de raio X (CT) tomográficas de cada animal foram adquiridas. Os órgãos foram coletados e a quantidade de radioatividade em cada amostra foi calculada e expressa como % de do- se injetada por grama de tecido. Adicionalmente, uma porção de cada tecido foi fixada durante a noite em formalina tamponada em preparação para o seccionamento e análise microscópica. Durante as 7 sem de estudo de terapia, 2 camundongos foram achados mortos e 3 camundongos foram sacrificados porque foram conside- rados improváveis de sobreviver durante a noite e tinham um escore de con- dição corporal desfavorável (<2; associado com perda de peso > 15%). Camundongos que experimentaram uma reação adversa à injeção de 125|- SAP e 1 camundongo que foi sacrificado devido a complicações que resulta- ram de um sangramento retro-orbital não foram avaliados como parte da análisede sobrevida. A sobrevida dos camundongos em cada grupo de tra- tamento com mAb é mostrada na Tabela 11.

Tabela 11 e do ao | [ar o | e ooo | Aproximadamente 65% dos tratados camundongos com mAb JH70 que foram avaliáveis sobreviveram ao fim do estudo. Ao contrário, ne- nhum dos camundongos tratados 2A4 que foram avaliáveis morreu durante os 57 dias. A análise dos dados de sobrevida usando os métodos padrão demonstrou uma diferença significante nas curvas de sobrevida (P=0,015 usando teste de Cox-Mantel e P=0,016 usando o teste de Wilcoxon Grehan- Breslow).

Os dados de química sanguínea finais foram analisados de acordo com a terapia que cada camundongo recebeu. Por causa de diferen- ças nos valores de parâmetro médios associados com camundongos

H2/hulL-6 machos e fêmeas (no momento do sacrifício, os níveis de BUN em camundongos fêmeas foram mais altos tanto para camundongos trata- dos com 2A4 como tratados com JH70), somente os camundongos fêmeas que sobreviveram estão incluídos na Tabela 12 abaixo.

Tabela 12 o BUN(mgdL) —Gu(mgdo) —ALT(UL) — ALB(QAL) — TP(QdL) —— GLOB(G/db) | 2A4 JH70 2A4 JH70 —2A4 JH70 2M4 JH7O 2AM JH7O 2AM JH70

Média 60,7 73,3 107,8 1001 45,5 119,7 2,3 2,2 9,2 9,1 7,0 71

DP 27,2 25,7 27,0 13,3 6,2 123,1 0,5 0,6 1,5 1,5 2,0 2,1 n 6,0 7,0 6,0 7,0 6,0 7,0 6,0 7,0 6,0 7,0 6,0 7,0

Alto 95,0 120,0 160,0 1230 52,0 381,0 2,9 3,0 11,7 11,9 10,1 10,6

Baixo 17,0 36,0 83,0 83,0 35,0 33,0 1,5 12 7,2 7,5 4,3 5,3 a Mediana 66,5 70,0 99,5 98,0 46,5 65,0 2,2 21 9,1 8,9 71 6,2 S

BUN, nitrogênio de ureia sanguínea; GLI, glicose; ALT, alanina aminotrans- ferase; ALB, albumina; TP, proteína sérica total; GLOB, imunoglobulina; F, fêmea; M, macho; DP, desvio padrão; n é o número de camundongos usa- dos para determinar os valores.

Camundongos tratados com 2A4 mostraram níveis séricos de nitrogênio de ureia sanguínea (BUN) e alanina aminotransferase (ALT) redu- zidos em comparação com camundongos tratados com JH70. BUN e ALT são marcadores de função renal e hepática, respectivamente, e seus níveis reduzidos indicam que a função do órgão pode ter sido mais bem conserva- da pelo tratamento com 2A4.

PARA: ESCRITÓRIO INTERNACIONAL DE OMPI 34, chemin des Colombettes 1211 Geneva 20 Suíça No. de Fac-símile: +44 22 338 82 70 Pedido de Patente No.: PCT/US2008/088493 Depósito: 29 de dezembro de 2008 Requerente: Elan Pharmaceuticals, Inc. Título: TRATAMENTO E PROFILAXIA DE AMILOIDOSE TOTAL DE PÁGINAS: 5

REFERÊNCIA A MATERIAL BIOLÓGICO DEPOSITADO DE ACORDO COM A REGRA 13bis De acordo com a regra 13 de Regulamentos sob o Tratado de Cooperação de Patente, o requerente desde já submete detalhes do material biológico referenciado de acordo com o Tratado de Budapeste, as linhagens celulares que produzem anticorpos monoclonais 2A4 e 7D8 são depositadas no American Type Culture Collection (“ATCCP&”) que se situa na 10801, Uni- versity Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos da Amé- rica.

O hibridoma murino JH807D8.29.19.47 (“7D8”) foi depositado em 5 de setembro de 2008 e atribuído o No. de Depósito no ATCCO PTA-

9648. A linhagem celular JH802A4.20.44.77 (“2A44”) foi depositada em 17 de dezembro de 2008 e atribuído o No. de Depósito no ATCCO PTA-9662. Cópias dos certificados do depósito são submetidas juntamente.

Os anticorpos monoclonais 2A4 e 7D8, e anticorpos humaniza- dos e quiméricos preparados destes, são referenciados no pedido de paten- te originalmente depositado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo humanizado ou quimérico de ocorrência não natural 2 ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 70 a 76 da SEQ ID : 5 Nº2.

2. Anticorpo humanizado ou quimérico de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que compete pela ligação ao peptídeo A amiloide humano com o anticorpo 2A4 (número de acesso ATCC 9662).

3. Anticorpo humanizado ou quimérico de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que compete pela ligação ao peptídeo A amiloide humano com um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 e uma região variável de cadeia pesada apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154.

4. Anticorpo humanizado ou quimérico de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que compete pela ligação ao peptídeo A amiloide humano com o anticorpo 7D8 (número de acesso ATCC 9468).

5. Anticorpo humanizado ou quimérico de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que compete pela ligação ao peptídeo A amiloide humano com um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153 e uma região variável de cadeia pesada apresentada como resíduos 20 a138da SEQID Nº: 154.

6. Anticorpo humanizado ou quimérico de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que é uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 2A4 (número de acesso ATCC 9662) ou uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 7D8 (número de acesso ATCC 9468).

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi-

' 2 ão variável de cadeia leve compreendendo três regiões de determinação de complementaridade de uma região variável de cadeia leve de 2A4 apresen- . tada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou três regiões de determi- nação de complementaridade de uma região variável de cadeia leve de 7D8 : 5 apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me- nos um resíduo de região conservada de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em L87 e L90 (convenção da numeração Kabat) ocupado porYerF, respectivamente, em que o resto da região variável de cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina aceptora humana.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me- nos um resíduo de região conservada de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em +7, +14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, + 92 e +109 (numeração linear) ocupado por T, S, L, D, Q, K Y, L Fe L, respectivamen- te, em que o resto da região variável de cadeia leve é ocupado por um resí- duo correspondente em uma região variável de cadeia leve de imunoglobuli- na aceptora humana.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me- nos um resíduo de região conservada de cadeia leve selecionado a partir do grupo consistindo em +75 e +92 (numeração linear) ocupado por Y e F, res- —pectivamente, em que o resto da região variável de cadeia leve é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina aceptora humana.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região variável de — cadeia leve de imunoglobulina aceptora humana sendo uma região variável de cadeia leve humana subgrupo capa 2 (convenção de Kabat).

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo

| 3 com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve subgrupo 2 humana sendo da linhagem germinativa humana : VKIIA19/A3.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo : 5 coma reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve subgrupo 2 humana da linhagem germinativa humana VKII- A19/A3 sendo uma sequência apresentada como SEQ ID Nº: 166 ou 167.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152, resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153, ou apresentada como SEQ ID Nº: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175, ou 176.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo coma reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão variável de cadeia pesada compreendendo três regiões de determinação de complementaridade de uma região variável de cadeia pesada de 2A4 a- presentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo coma reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um resíduo de região conservada de cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em H37, H49, H70 e H93 (Convenção de nume- ração Kabat) ocupado por |, A, F ou V, respectivamente, em que o resto da região variável de cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina aceptora hu- mana.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me- nos um resíduo de região conservada de cadeia pesada selecionado a partir —do grupo consistindo em H37, H49, H70 e H93 (Convenção de numeração Kabat) ocupado por |, A, F ou V, respectivamente, em que o resto da região variável de cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina aceptora humana.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo : com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um resíduo de região conservada de cadeia pesada selecionado a | 5 —partirdo grupo consistindo em +10, +15, +19, + 37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99, +119 (numeração linear) ocupado por RK KI AF QSS, M, N, M, V ou A, respectivamente, em que o resto da região variável de ca- deia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região vari- ável de cadeia pesada de imunoglobulina aceptora humana.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende pelo me- nos um resíduo de região conservada de cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em +10, +15, +19, + 37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99, +119 (numeração linear) ocupado por R, K K, 1, A, FO SMN, M,VouaA, respectivamente, em que o resto da região variável de cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina aceptora humana.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um resíduo de região conservada de cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em +37, +49, +73 e +99 (numeração linear) ocu- pado por |, A, F ou V, respectivamente, em que o resto da região variável de cadeia pesada é ocupado por um resíduo correspondente em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina aceptora humana.

21. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina aceptora humana sendo uma região variá- vel de cadeia pesada humana subgrupo gama 3 (convenção de Kabat).

22. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo coma reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada humana subgrupo gama 3 sendo uma sequência apresenta- da como SEQ ID Nº: 165.

: 5

23. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- - ão variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoáci- dos apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154 ou apresenta- e 5 dacomoSEQID Nº: 161,162, ou 163.

24. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão variável de cadeia leve compreendendo três regiões de determinação de complementaridade de uma região variável de cadeia leve de 2A4 apresen- tada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou três regiões de determi- nação de complementaridade de uma região variável de cadeia leve de 7D8 ' apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153, e uma região vari- ável de cadeia pesada compreendendo três regiões de determinação de complementaridade de uma região variável de cadeia pesada de 2A4 apre- sentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154.

25. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão variável de cadeia leve compreendendo três regiões de determinação de complementaridade apresentadas como SEQ ID Nº: 168, 169 e 170, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo três regiões de determi- nação de complementaridade apresentadas como SEQ ID Nº: 171, 172, e

173.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão variável de cadeia leve compreendendo três regiões de determinação de complementaridade apresentadas como SEQ ID Nº: 177, 169 e 170, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo três regiões de determi- nação de complementaridade apresentadas como SEQ ID Nº: 171, 172 e

173.

27. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoáci-

: 6 dos apresentada como resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 152 ou resíduos 20 a 131 da SEQ ID Nº: 153, e uma região variável de cadeia pesada compre- - endendo uma sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 20 a 138 da SEQ ID Nº: 154.

f 5

28. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoáci- dos apresentada como SEQ ID Nº: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175, ou 176; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma se- —quênciade aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 161, 162 ou 163.

29. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 157, e a região variável de cadeia pesada compreende uma se- quênciade aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163.

30. Anticorpo de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de se que se liga especificamente a um epitopo compreendendo X;EDX, em um agregado de proteína amiloi- de, X x é H, T, F, P, A, L C, O, R K, G, V, Y, lou W, e em que 6c é T, S, E, RIF,AMLN P,C,YouQ.

31. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de se que se liga especifi- camente a um epitopo compreendendo X;EDX; em um agregado de proteí- na amiloide, em que X; é Hou Ae Xç é T, Sou A.

32. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de se que se liga especifi- camente a um epitopo consistindo de uma sequência de aminoácidos sele- cionada a partir do grupo consistindo em GHEDT (SEQ ID Nº: 3), HEDT (SEQ ID Nº: 12), AEDS (SEQ ID Nº: 13), AEDT (SEQ ID Nº: 14), HEDA (SEQIDN* 15) eTEDE(SEQID Nº: 16).

33. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de se que se liga especifi-

: 7 camente a proteína amiloide na forma monomérica com uma afinidade de menos de aproximadamente 107 M. : 34. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de se que se liga especifi- : 5 camentea proteína amiloide A sérica (SAA).

35. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de se que se liga especifi- camente a uma proteína amiloide selecionada a partir do grupo consistindo em proteína de cadeia leve de imunoglobulina, polipeptídeo precursor ami- loidedeilhota humana (IAPP), transtirretina (TTR) e ApoA1.

36. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que se liga especifica- mente a proteína de cadeia leve de imunoglobulina.

37. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo coma reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a proteína de cadeia leve de imunoglobulina é VA6 Wil.

38. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a proteína de cadeia leve de imunoglobulina é Vx.

39. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo hu- manizado ou quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno.

40. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado —pelofatode ser na fabricação de um medicamento útil no tratamento de ami- loidose AA ou amiloidose AL em um indivíduo.

41. Uso, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento útil no tratamento de amiloido- se AA ou amiloidose AL em um indivíduo humano.

42. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento útil no tratamento profilá-

! 8 tico de amiloidose AA ou amiloidose AL em um indivíduo.

43. Uso, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo r fato de ser na fabricação de um medicamento útil no tratamento profilático de amiloidose AA ou amiloidose AL em um indivíduo humano.

: 5 44. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que é uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 2A4 (número de acesso ATCC PTA-9662) ou uma versão humanizada ou quimérica do anti- corpo 7D8 (número de acesso ATCC PTA-9468), caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de amiloidose AA ou —amiloidose AL em um indivíduo humano.

45. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que é uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 2A4 (número de acesso ATCC PTA-9662) ou uma versão humanizada ou quimérica do anti- corpo 7D8 (número de acesso ATCC PTA-9468), caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento profilático de um in- divíduo humano suscetível a amiloidose AA ou amiloidose AL.

46. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, o qual está ligado a uma marcação detectável, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição útil na detecção de um depósito amiloide associado com amiloidose AA ou amiloidose AL em um indivíduo.

47. Uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição útil na detecção de um depósi- to amiloide associado com amiloidose AA ou amiloidose AL em um indivíduo humano.

48. Uso, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de a marcação detectável é uma radiomarcação.

49. Uso, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de a radiomarcação é **l.

50. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que é uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 2A4 (número de acesso ATCC PTA-9662) ou uma versão humanizada ou quimérica do anti-

: 9 corpo 7D8 (número de acesso ATCC PTA-9468), o qual anticorpo ou frag- mento de ligação ao antígeno está ligado a uma marcação detectável, carac- - terizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para detectar um depósito amiloide associado à agregação de proteína amiloide AA ou proteí- : 5 naamiloide AL em um indivíduo humano.

51. Método para preparar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de sintetizar ou recombinantemente ex- pressar um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 e recuperar o anticorpo.

52. Uso de um anticorpo de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 157 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID Nº: 163, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de ami- loidose AA ou amiloidose AL em um indivíduo humano.

53. Uso de um anticorpo de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº 157 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID Nº: 163, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento profiláti- co de amiloidose AA ou amiloidose AL em um indivíduo humano.

54. Uso de um anticorpo de ocorrência não natural ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 157 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma se- quência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID Nº: 163, o qual anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno está ligado a uma marcação de- tectável, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para detectar um depósito amiloide associado à agregação de proteína ami- loide AA ou proteína amiloide AL em um indivíduo humano.

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55. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como defi- : nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.

: 5 56. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo humanizado ou quimérico compreendendo uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 2A4 (número de acesso ATCC PTA-9662) ou uma versão humanizada ou quimérica do anticorpo 7D8 (número de acesso ATCC PTA-9468) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

57. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 157 e uma região variável de cadeia pesada compreen- dendo uma sequência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID Nº: 163 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

58. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizado pelo fato de ser formulada para administração parente- ral.

59. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 157.

60. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a se- quência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163.

61. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre- ende um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos apresen- tada como SEQ ID Nº: 157.

62. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 61, carac- terizada pelo fato de que é uma célula de mamífero selecionada a partir do grupo consistindo em células CHO, células HEK-293, células HeLa, células CV-1ecélulasCOS.

63. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 61, carac- terizada pelo fato de que expressa uma região variável de cadeia leve de

: n anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada co- mo SEQ ID Nº: 157. :z 64. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre- ende um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos apresen- : 5 tadacomoSEQID Nº: 163.

65. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 64, carac- terizada pelo fato de que é uma célula de mamífero selecionada a partir do grupo consistindo em células CHO, células HEK-293, células HeLa, células CV-1 e células COS.

66. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 64, carac- terizada pelo fato de que expressa uma região variável de cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada co- mo SEQ ID Nº: 163.

67. Célula CHO, caracterizada pelo fato de que compreende pe- lo menos um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos apre- sentada como SEQ ID Nº: 157 e a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163.

68. Célula CHO, de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- da pelo fato de que expressa um anticorpo compreendendo uma região vari- ávelde cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos apre- sentada como SEQ ID Nº: 157 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID Nº: 163.

69. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que expressa anticor- —pomonoclonal murino 2A4 (número de acesso ATCC PTA-9662).

70. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que expressa anticor- po monoclonal murino 7D8 (número de acesso ATCC PTA-9468).

71. Método de tratamento terapêutico ou profilático de um indiví- duo tendo amiloidose AA ou AL, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma dose eficaz do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

39.

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72. Método para detectar um depósito amiloide associado com amiloidose AA ou AL em um indivíduo, caracterizado pelo fato de administrar : ao indivíduo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como defini- do em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, o qual está ligado a uma : 5 marcação detectável, e detecção da marcação detectável no indivíduo.

73. Método de tratamento terapêutico ou profilático de um indiví- duo tendo amiloidose AA ou AL, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um agente que induz uma resposta imune aos resí- duos 70 a 76 do peptídeo A amiloide compreendendo anticorpos que se |i- gam especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 70 a 76 do peptídeo amiloide.