CN109678945A - 一种血清淀粉样蛋白a抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种血清淀粉样蛋白a抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法，预测与验证方法为预测血清淀粉样蛋白A抗原的表面可及性、弹性序列区域、β转角、抗原性、亲水性、线性表位、长片段表位，分别获得多个表位序列；去除多个表位序列中的重复的表位和包含在其他较长表位中的序列，得到多个非冗余预测表位；采用ELISA验证多个非冗余预测表位是否为抗体的识别表位。本发明克服了单一方法预测准确率低的问题；并通过实验验证，解决了SAA抗原表位未知的问题；应用合成的抗原表位多肽制备单克隆抗体，克服了SAA难以纯化获取的困难的问题，使成本降低一倍以上。

Description

一种血清淀粉样蛋白A抗原表位、其预测与验证方法及单克隆 抗体的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术制备体外诊断原料领域，属于体外诊断行业临床诊断试剂盒制备的原料，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法。
背景技术
体液免疫或抗体产生主要由B细胞介导，B细胞识别抗原通过膜结合抗体或B细胞受体 (B cell receptor，BCR)来识别抗原，所结合的抗原部位即为B细胞表位，最终诱导抗体基因的编辑和抗体的分泌，分泌的抗体结合抗原从而失活或消除抗原。
免疫信息学是利用计算机方法在免疫学上应用并解决免疫问题的信息学方法，是生物信息学的一个分支。免疫信息学的两个中心目标就是B细胞表位和T细胞表位的预测，为实际可行的成果转化提供了非常重要的预测参考结果。源于近年来高通量测序技术的迅猛发展，生物信息研究人员开发了多种免疫信息学工具，但是，这种工具都是独立的针对高通量数据的某一特定特性或特征进行的大数据分析，目前缺少对特定抗原的表位分析，更重要的是缺少对所分析的表位进行筛选验证和抗体制备等实际应用。目前血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)的抗原表位(或B细胞表位)未经免疫信息学预测和实验筛选验证。
体内稳态对于包括人在内的所有生物系统都是必须的，而急性时相反应(acute-phase response，APR)是一种原始的体内稳态被破坏条件下重建稳态的机制之一。在急性时相反应中血清变化最显著的是血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)。
SAA由104个氨基酸组成，在机体受感染后，SAA在4-6h内即可迅速升高约1000倍，清除病原体后又可迅速的降低至正常水平，是新兴的反映机体感染情况和炎症恢复的灵敏指标。SAA与目前临床最广泛使用的CRP相比较，有其明显的优势：(1)SAA升高见于病毒、支原体、细菌感染，且敏感性高于CRP；(2)在细菌感染性疾病中，SAA比CRP上升早、幅度大、灵敏度高，尤其是在急性细菌感染早期，SAA检测结果更加显著；(3)SAA在病毒感染性疾病中，SAA显著升高，CRP不升高，因此SAA可以作为诊断病毒感染的敏感指标。此外，SAA水平还与多种肿瘤、肥胖及其代谢合并症、继发性淀粉样变、冠心病、移植排斥反应，动脉粥样硬化等诸多疾病密切相关，能为临床诊断提供众多有价值的参考信息。
SAA水溶性差一直是阻碍其功能研究和抗原纯化的重要阻碍，也正是因此，人SAA和重组SAA(rSAA)的获取是SAA诊断抗体研发制备过程中的重要困难。
SAA是一种亲油性蛋白，且超过95％和高密度脂蛋白及胆固醇等脂类结合在一起，也和多种细胞受体、粘多糖、胱抑素C等拥有相互作用和结合，游离的SAA很少且极易被细胞吞噬降解为组织淀粉样蛋白A(AA)。SAA与HDL等的结合也使得只有部分的抗原表位序列处于临床诊断中的表面可及性状态下，而截至目前未见已确定的SAA抗原表位(或B细胞表位)报道。
综上所述，现有技术主要存在如下问题：
1、目前的免疫信息学方法和工具主要针对高通量数据的B细胞抗原表位一般性预测，预测准确率低，且缺少对抗原表位的实验筛选验证，亦缺少对应用已验证抗原表位制备抗体的应用。
2、截至目前未见SAA抗原表位的研究报道，SAA抗原表位的免疫信息学分析及后续实验筛选验证也处于空白状态。
3、SAA是一种新兴的反映机体感染情况和炎症恢复的灵敏指标，但是目前市场已有抗 SAA抗体灵敏度不高、特异性不好，且大多为科研用抗体，能够应用体外诊断的SAA抗体匮乏，且抗体决定簇识别表位未知。
4、人体血液中SAA半衰期约为1天，且超过95％和高密度脂蛋白及胆固醇等脂类结合在一起，也和多种细胞受体、粘多糖、胱抑素C等拥有相互作用和结合，另外血液游离SAA极易被蛋白酶快速降解，所以纯化人体血液SAA困难巨大。
5、重组SAA(rSAA)由于SAA具有亲油性而纯化困难，价格昂贵，且重组SAA一般呈现六聚体、四聚体、八聚体等形式，缺乏人体血液SAA天然构象，抗原性差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种明确有效的血清淀粉样蛋白A抗原表位，该抗原表位的预测与验证方法，以及采用该抗原表位制备单克隆抗体的方法，该制备方法成本低。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
本发明的第一个目的在于提供一种血清淀粉样蛋白A抗原表位，所述的抗原表位包括如 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的序列。
本发明的第二个目的在于提供一种血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法，包括如下步骤：
(1)预测血清淀粉样蛋白A抗原的表面可及性，获得多个第一表位序列；
(2)预测血清淀粉样蛋白A抗原的弹性序列区域，获得多个第二表位序列；
(3)预测血清淀粉样蛋白A抗原的β转角，获得多个第三表位序列；
(4)预测血清淀粉样蛋白A抗原的抗原性，获得多个第四表位序列；
(5)预测血清淀粉样蛋白A抗原的亲水性，获得多个第五表位序列；
(6)预测血清淀粉样蛋白A抗原的线性表位，获得多个第六表位序列；
(7)预测血清淀粉样蛋白A抗原的长片段表位，获得多个第七表位序列；
(8)去除所述的第一表位序列、所述的第二表位序列、所述的第三表位序列、所述的第四表位序列、所述的第五表位序列、所述的第六表位序列、所述的第七表位序列中的重复的表位和包含在其他较长表位中的序列，得到多个非冗余预测表位；
(9)采用ELISA验证所述的多个非冗余预测表位是否为抗体的识别表位。
优选地，步骤(1)采用Emini Surface Accessibility Prediction进行预测。
优选地，步骤(2)采用Karplus&Schulz Flexibility Prediction进行预测。
优选地，步骤(3)采用Chou&Fasman Beta-Turn Prediction进行预测。
优选地，步骤(4)采用Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity进行预测。
优选地，步骤(5)采用Parker Hydrophilicity Prediction进行预测。
优选地，步骤(6)采用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0进行预测。
优选地，步骤(7)采用ABCpred Prediction进行预测。
优选地，所述的第一表位序列为阈值≥1的序列。
优选地，所述的第二表位序列为阈值≥0.999的序列。
进一步优选地，所述的第二表位序列为得分高的十个表位序列。
优选地，所述的第三表位序列为阈值≥1.041的序列。
进一步优选地，所述的第三表位序列为得分高的十个表位序列。
优选地，所述的第四表位序列为阈值≥0.976的序列。
优选地，所述的第五表位序列为阈值≥2.410的序列。
进一步优选地，所述的第五表位序列为得分高的十个表位序列。
优选地，所述的第六表位序列为阈值≥0.500的序列。
优选地，所述的第七表位序列为阈值≥0.51的序列。
进一步优选地，所述的第七表位序列的长度为16。
优选地，步骤(9)的具体实施方式包括依次进行的如下步骤：
(a)采用固相合成法合成多个非冗余预测表位多肽；
(b)分别将多个所述的非冗余预测表位多肽与牛血清蛋白进行偶联，然后回收偶联有所述的非冗余预测表位多肽的牛血清蛋白，其中，控制所述的非冗余预测表位多肽与所述的牛血清蛋白的摩尔比为90～110:1，采用的偶联剂为戊二醛；
(c)将步骤(b)制得的偶联有所述的非冗余预测表位多肽的牛血清蛋白溶解于pH7～7.5 的PBS buffer，配制成0.8～1.2μg/ml的待测溶液，空白对照为与所述的待测溶液相同浓度的牛血清蛋白溶液，然后将所述的待测溶液和所述的牛血清蛋白溶液分别加入到ELISA平板的孔中，36～38℃处理1～3h，然后置于2～6℃包被过夜；
(d)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(e)添加4～6wt％的脱脂奶粉-PBS，密封条件下，36～38℃封闭1～3h；
(f)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(g)每孔加入PBS稀释的鼠抗人血清淀粉样蛋白A抗体稀释液，36～38℃孵育1～1.5h；
(h)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(i)每孔加入PBS稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体稀释液，36～38℃孵育40～60min；
(j)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(k)加入TMB显色液，显色10～30min，然后加入显色终止液，450nm测定相应孔的吸光值；
(l)ELISA检测结果为阳性的非冗余预测表位多肽为所述的血清淀粉样蛋白A抗原表位。
本发明的第三个目的在于提供一种鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别合成如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示序列的多肽；
(2)将步骤(1)合成的多肽分别与载体蛋白进行偶联，纯化后，用PBS稀释至0.8～1.2 mg/ml的多肽溶液，然后将所述的多肽溶液等体积混合得到混合液；
(3)用所述的混合液对小鼠进行免疫；
(4)小鼠末次免疫后三天制取免疫脾细胞；
(5)将骨髓瘤细胞和所述的免疫脾细胞进行融合培养后，筛选分泌抗血清淀粉样蛋白A 抗体的阳性杂交瘤细胞；
(6)将所述的阳性杂交瘤细胞进一步培养以筛选能够稳定分泌抗血清淀粉样蛋白A抗体的细胞株；
(7)对小鼠接种所述的细胞株后，收集小鼠的腹水，对所述的腹水进行离心、过滤、亲和层析，收集洗脱液，将所述的洗脱液中和得到所述的鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。
优选地，步骤(2)中，所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白，所述的多肽与所述的载体蛋白按照分子数比为90～110:1的量进行添加。
优选地，所述的制备方法的具体实施方式为：
(1)用固相合成法分别合成如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4 所示序列的多肽；
(2)将所述的多肽分别与匙孔血蓝蛋白按照分子数比100:1进行偶联得到多肽偶联产物；将所述的多肽偶联产物纯化后，用PBS稀释至1mg/ml的多肽溶液，然后将所述的多肽溶液等体积混合得到混合液；
(3)将所述的混合液与弗氏完全佐剂等体积混合，得到油状乳液；将所述的油状乳液以 0.1mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠背部位点，第一次免疫14天后，用所述的混合液与弗氏不完全佐剂混合后腹腔增强免疫，增强免疫到三针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求，融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射冲击免疫；
(4)小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI1640基础培养液多次重悬，得到骨髓瘤细胞；
(5)将步骤(3)的小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，用RPMI1640基础培养液冲洗，然后磨碎过滤，制成细胞悬液，离心，弃上清，RPMI1640基础培养液多次重悬，得到免疫脾细胞；
(6)将所述的骨髓瘤细胞与所述的免疫脾细胞按1:10比例混合，用RPMI1640基础培养液洗涤，1200rpm，离心5分钟，弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL 50wt％的PEG-2000融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI1640基础培养液终止细胞融合，1000rpm，离心5分钟，弃上清，用50mL的RPMI1640筛选培养液轻轻重悬，平分于多块96孔板，50μL/孔， 37℃，5％CO2培养，培养6天，换HAT培养液，继续培养并换液一次；
(7)用所述的混合液包被ELISA平板，筛选分泌抗血清淀粉样蛋白A抗体的阳性杂交瘤细胞克隆，RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性细胞孔；
(8)将所述的阳性细胞孔内的细胞以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，扩大培养后，用含10wt％DMSO的培养液冻存，细胞密度为106个/mL，得到能稳定分泌抗血清淀粉样蛋白A抗体的细胞株；
(9)选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射1×106个步骤(8)筛选到的杂交瘤细胞，待产生腹水且小鼠频于死亡之前，处死小鼠，收集腹水，离心取上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤，将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱，然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸收值达到基线为止，再用0.1M的甘氨酸洗脱液洗脱并回收洗脱液，所述的洗脱液用pH8.8、0.1M的Tris中和，得到鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1，采用多种免疫信息学方法首次预测SAA抗原表位，克服了单一方法预测准确率低的问题。
2，采用实验对抗原表位进行了验证，解决了SAA抗原表位未知的问题。
3，应用合成的抗原表位多肽制备单克隆抗体，克服了SAA难以纯化获取的困难，也即解决了抗原制备的困难，成本降低一倍以上。
附图说明
图1为Emini Surface Accessibility Prediction预测表面可及性的结果图；
图2为Karplus&Schulz Flexibility Prediction预测SAA弹性序列区域的结果图；
图3为Chou&Fasman Beta-Turn Prediction预测β转角的结果图；
图4为Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity抗原性预测的结果图；
图5为Parker Hydrophilicity Prediction亲水性预测的结果图；
图6为Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0表位预测的结果图；
图7为所有预测表位在SAA上重叠显示图。
图8为鼠抗人SAA单抗与市售两种鼠抗人SAA抗体的显色结果图。
具体实施方式
以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
一、SAA抗原表位预测
1、通过UniProtKB数据库获得SAA序列信息。
蛋白序列：
RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAIS DARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKY(SEQ ID NO.5)。
(备注参考信息：SAA前体蛋白全长为122个氨基酸，N段18个氨基酸为信号肽，体内蛋白在合成分泌过程中切除形成如上104个氨基酸的成熟形式)。
2、Emini Surface Accessibility Prediction预测表面可及性
结果如图1(阈值为1)，预测表位序列见表1。
表1
序号 开始 结束 多肽 长度
1 20 27 AYSDMREA 8
2 43 48 DAAKRG 6
3 60 65 DARENI 6
4 87 95 RSGKDPNHF 9
3、Karplus&Schulz Flexibility Prediction预测SAA弹性序列区域
结果如图2(阈值为0.999)，预测表位结果如表2(取得分最高的前十个表位)。
表2
位置 残基 开始 结束 多肽 得分
89 G 86 92 GRSGKDP 1.1
88 S 85 91 WGRSGKD 1.09
90 K 87 93 RSGKDPN 1.087
48 G 45 51 AKRGPGG 1.08
49 P 46 52 KRGPGGV 1.078
87 R 84 90 EWGRSGK 1.066
91 D 88 94 SGKDPNH 1.062
47 R 44 50 AAKRGPG 1.057
50 G 47 53 RGPGGVW 1.052
62 R 59 65 SDARENI 1.047
4、Chou&Fasman Beta-Turn Prediction预测β转角
结果如图3(阈值为1.041)，预测表位结果见表3(取取得分最高的前十个表位)。
表3
5、Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity抗原性预测
结果如图4(阈值：0.976)，预测表位见表4。
表4
序号 开始 结束 多肽 长度
1 4 10 FSFLGEA 7
2 32 39 SDKYFHAR 8
3 49 60 PGGVWAAEAISD 12
4 66 71 QRFFGH 6
5 74 80 EDSLADQ 7
6、Parker Hydrophilicity Prediction亲水性预测
结果如图5(阈值：2.410)，预测表位结果见表5(取取得分最高的前十个表位)。
表5
7、Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0表位预测
结果如图6(阈值：0.500)，预测表位见表6。
表6
序号 开始 结束 多肽 长度
1 57 63 AISDARE 7
2 77 89 LADQAANEWGRSG 13
8、ABCpred Prediction长片段表位预测(阈值：0.51，预测表位长度设置为16)，预测表位见表7。
表7
9，所有预测表位见表8。
表8
所有预测表位在SAA上重叠显示图7。
去除重复的表位和包含在其它预测的较长表位中的序列，得到以下非冗余预测表位，见表9。
表9
编号 起始位点 结束位点 多肽 长度
E1 4 10 FSFLGEA 7
E2 7 22 LGEAFDGARDMWRAYS 16
E3 15 30 RDMWRAYSDMREANYI 16
E5 21 36 YSDMREANYIGSDKYF 16
E7 27 42 ANYIGSDKYFHARGNY 16
E10 39 54 RGNYDAAKRGPGGVWA 16
E22 49 60 PGGVWAAEAISD 12
E23 50 65 GGVWAAEAISDARENI 16
E27 60 75 DARENIQRFFGHGAED 16
E29 69 84 FGHGAEDSLADQAANE 16
E34 77 92 LADQAANEWGRSGKDP 16
E43 86 101 GRSGKDPNHFRPAGLP 16
二、ELISA验证非冗余预测表位是否为抗体识别表位
1，非冗余预测多肽合成采用固相合成法合成上述非冗余预测多肽E1、E2、E3、E5、E7、E10、E22、E23、E27、E29、E34、E43。
2，偶联抗原载体 将合成的非冗余预测多肽与牛血清蛋白BSA进行偶联，多肽与BSA 摩尔比例为100:1，偶联剂为戊二醛，偶联后回收偶联有相应多肽的BSA。
3，包被 将偶联多肽的BSA溶解于PBS buffer(pH 7.4)，配制成1μg/ml溶液，空白对照为1μg/ml BSA溶液，按照100μl/孔加入到ELISA平板中，每组设置3个平行，37℃， 2h，然后置于4℃包被过夜。
4，洗涤 弃掉包被液，用0.05％Tween20-PBS进行洗涤，每孔200μl，静置5min，弃掉洗液，重复洗涤步骤3次。
5，封闭 添加200μl 5％脱脂奶粉(PBS)，密封,37℃，封闭2h。
6，洗涤 弃掉封闭液，用0.05％Tween20-PBS进行洗涤，每孔200μl，静置5min，弃掉洗液，重复洗涤步骤3次。
7，一抗孵育 每孔加入PBS稀释的鼠抗人SAA抗体稀释液100μl。37℃孵育1h。
8，洗涤 弃掉一抗孵育液，用0.05％Tween20-PBS进行洗涤，每孔200μl，静置5min，弃掉洗液，重复洗涤步骤3次。
9，二抗孵育 每孔加入PBS稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体稀释液100μl。37℃孵育45min。
10，洗涤 弃掉二抗孵育液，用0.05％Tween20-PBS进行洗涤，每孔200μl，静置5min，弃掉洗液，重复洗涤步骤5次
11，显色 加入100μl TMB显色液，显色20min，然后加入100μl显色终止液，450 nm测定相应孔的吸光值。
12，结果 ELISA检测结果见表10，结果表明E5(SEQ ID NO.1：YSDMREANYIGSDKYF)、E7(SEQ ID NO.2：ANYIGSDKYFHARGNY)、E34(SEQ ID NO.3：LADQAANEWGRSGKDP)、E43(SEQ ID NO.4：GRSGKDPNHFRPAGLP)偶联BSA检测为阳性。
表10
三、应用多肽E5、E7、E34、E43制备鼠抗人SAA单克隆抗体
1,多肽偶联载体蛋白将多肽E5、E7、E34、E43分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)按照分子数比100:1进行偶联得到多肽与KLH偶联产物E5-KLH、E7-KLH、E34-KLH、E43-KLH。将偶联后后产物纯化后，用PBS稀释至1mg/ml，然后将E5-KLH、E7-KLH、E34-KLH、E43-KLH 等体积混合得到混合液mix-KLH。
2，小鼠免疫抗原免疫将mixKLH与弗氏完全佐剂(外观：琥珀色细胞悬浮液；组份：Paraffin Oil 85％，Mannide Monooleate 15％，Mycobacterium smegmatis 1mg/mL)等体积混合，得到油状乳液。将该乳液以0.1mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(等量抗原与弗氏不完全佐剂混合)，增强免疫到三针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射冲击免疫。
3，骨髓瘤细胞准备小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。
4，B细胞制备小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640 基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清， RPMI1640基础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。
5，细胞融合及杂交瘤细胞筛选将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL 无菌离心管内用RPMI1640基础培养液洗1次，1200rpm，离心5分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50％的PEG-2000融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI1640筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养6天，换HAT培养液(含HAT的RPMI1640完全培养液)，继续培养并换液一次。
6，阳性克隆筛选mix-KLH蛋白包被ELISA平板，筛选分泌抗SAA抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1(即P/N≥2/1)为阳性细胞孔。
7，杂交瘤细胞亚克隆筛选分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10％DMSO的培养液冻存，细胞密度为106个/mL。最终共筛选到5株能稳定分泌抗体的细胞株：SAA-L1、SAA-L2、SAA-L3、SAA-L4、SAA-L5。
8，单克隆抗体制备选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7-10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5-10mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G 吸附的物质直至在OD280nm下的吸收值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液(pH2.5) 洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M Tris(pH8.8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度。将五株杂交瘤细胞纯化的抗体进行等比例混合得到鼠抗人SAA单抗，-20℃分装冻存。
9，单克隆抗体评价用诊断用SAA标准品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶，0.5％BSA-PBS 封闭30min，加入等质量鼠抗人SAA单抗与市售两种鼠抗人SAA抗体，4℃孵育过夜，用0.05％Tween20-PBS进行洗涤3min，洗涤3次，之后加入等量AP标记羊抗鼠二抗于0.5％BSA-PBS中孵育45min，0.05％Tween20-PBS进行洗涤3次后用AP显示也显色，结果见图 8，其中，条带1：鼠抗人SAA单抗；条带2和3：两种市售SAA单抗。
10，应用多肽制备鼠抗人SAA单克隆抗体成本优势评价本发明SAA单克隆抗体制备方法相比于以往单克隆制备方法差别在于抗原的不同，本发明所需抗原具有明显价格优势：合成多肽价格约为100元每毫克，而重组SAA价格不低于2000元每毫克，而人血浆纯化SAA 则没有市场销售产品。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司
<120> 一种血清淀粉样蛋白A抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser Asp Lys Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
Ala Asn Tyr Ile Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro
1 5 10 15
<210> 5
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp
1 5 10 15
Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser
20 25 30
Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn
50 55 60
Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg
85 90 95
Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr
100

Claims (9)

1.一种血清淀粉样蛋白A抗原表位，其特征在于：所述的抗原表位包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的序列。
2.一种血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)预测血清淀粉样蛋白A抗原的表面可及性，获得多个第一表位序列；
(2)预测血清淀粉样蛋白A抗原的弹性序列区域，获得多个第二表位序列；
(3)预测血清淀粉样蛋白A抗原的β转角，获得多个第三表位序列；
(4)预测血清淀粉样蛋白A抗原的抗原性，获得多个第四表位序列；
(5)预测血清淀粉样蛋白A抗原的亲水性，获得多个第五表位序列；
(6)预测血清淀粉样蛋白A抗原的线性表位，获得多个第六表位序列；
(7)预测血清淀粉样蛋白A抗原的长片段表位，获得多个第七表位序列；
(8)去除所述的第一表位序列、所述的第二表位序列、所述的第三表位序列、所述的第四表位序列、所述的第五表位序列、所述的第六表位序列、所述的第七表位序列中的重复的表位和包含在其他较长表位中的序列，得到多个非冗余预测表位；
(9)采用ELISA验证所述的多个非冗余预测表位是否为抗体的识别表位。
3.根据权利要求2所述的血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法，其特征在于：步骤(1)采用Emini Surface Accessibility Prediction进行预测；步骤(2)采用Karplus&Schulz Flexibility Prediction进行预测；步骤(3)采用Chou&Fasman Beta-TurnPrediction进行预测；步骤(4)采用Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity进行预测；步骤(5)采用Parker Hydrophilicity Prediction进行预测；步骤(6)采用Bepipred LinearEpitope Prediction 2.0进行预测；步骤(7)采用ABCpred Prediction进行预测。
4.根据权利要求2或3所述的血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法，其特征在于：所述的第一表位序列为阈值≥1的序列；所述的第二表位序列为阈值≥0.999的序列；所述的第三表位序列为阈值≥1.041的序列；所述的第四表位序列为阈值≥0.976的序列；所述的第五表位序列为阈值≥2.410的序列；所述的第六表位序列为阈值≥0.500的序列；所述的第七表位序列为阈值≥0.51的序列。
5.根据权利要求4所述的血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法，其特征在于：所述的第二表位序列为得分高的十个表位序列；所述的第三表位序列为得分高的十个表位序列；所述的第五表位序列为得分高的十个表位序列；所述的第七表位序列的长度为16。
6.根据权利要求2所述的血清淀粉样蛋白A抗原表位的预测与验证方法，其特征在于：步骤(9)的具体实施方式包括依次进行的如下步骤：
(a)采用固相合成法合成多个非冗余预测表位多肽；
(b)分别将多个所述的非冗余预测表位多肽与牛血清蛋白进行偶联，然后回收偶联有所述的非冗余预测表位多肽的牛血清蛋白，其中，控制所述的非冗余预测表位多肽与所述的牛血清蛋白的摩尔比为90～110:1，采用的偶联剂为戊二醛；
(c)将步骤(b)制得的偶联有所述的非冗余预测表位多肽的牛血清蛋白溶解于pH 7～7.5的PBS buffer，配制成0.8～1.2μg/ml的待测溶液，空白对照为与所述的待测溶液相同浓度的牛血清蛋白溶液，然后将所述的待测溶液和所述的牛血清蛋白溶液分别加入到ELISA平板的孔中，36～38℃处理1～3h，然后置于2～6℃包被过夜；
(d)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(e)添加4～6wt％的脱脂奶粉-PBS，密封条件下，36～38℃封闭1～3h；
(f)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(g)每孔加入PBS稀释的鼠抗人血清淀粉样蛋白A抗体稀释液，36～38℃孵育1～1.5h；
(h)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(i)每孔加入PBS稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体稀释液，36～38℃孵育40～60min；
(j)用0.04～0.06wt％的Tween20-PBS进行多次洗涤；
(k)加入TMB显色液，显色10～30min，然后加入显色终止液，450nm测定相应孔的吸光值；
(l)ELISA检测结果为阳性的非冗余预测表位多肽为所述的血清淀粉样蛋白A抗原表位。
7.一种鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别合成如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示序列的多肽；
(2)将步骤(1)合成的多肽分别与载体蛋白进行偶联，纯化后，用PBS稀释至0.8～1.2mg/ml的多肽溶液，然后将所述的多肽溶液等体积混合得到混合液；
(3)用所述的混合液对小鼠进行免疫；
(4)小鼠末次免疫后三天制取免疫脾细胞；
(5)将骨髓瘤细胞和所述的免疫脾细胞进行融合培养后，筛选分泌抗血清淀粉样蛋白A抗体的阳性杂交瘤细胞；
(6)将所述的阳性杂交瘤细胞进一步培养以筛选能够稳定分泌抗血清淀粉样蛋白A抗体的细胞株；
(7)对小鼠接种所述的细胞株后，收集小鼠的腹水，对所述的腹水进行离心、过滤、亲和层析，收集洗脱液，将所述的洗脱液中和得到所述的鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白，所述的多肽与所述的载体蛋白按照分子数比为90～110:1的量进行添加。
9.根据权利要求7所述的鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的制备方法的具体实施方式为：
(1)用固相合成法分别合成如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示序列的多肽；
(2)将所述的多肽分别与匙孔血蓝蛋白按照分子数比100:1进行偶联得到多肽偶联产物；将所述的多肽偶联产物纯化后，用PBS稀释至1mg/ml的多肽溶液，然后将所述的多肽溶液等体积混合得到混合液；
(3)将所述的混合液与弗氏完全佐剂等体积混合，得到油状乳液；将所述的油状乳液以0.1mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠背部位点，第一次免疫14天后，用所述的混合液与弗氏不完全佐剂混合后腹腔增强免疫，增强免疫到三针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求，融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射冲击免疫；
(4)小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI1640基础培养液多次重悬，得到骨髓瘤细胞；
(5)将步骤(3)的小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，用RPMI1640基础培养液冲洗，然后磨碎过滤，制成细胞悬液，离心，弃上清，RPMI1640基础培养液多次重悬，得到免疫脾细胞；
(6)将所述的骨髓瘤细胞与所述的免疫脾细胞按1:10比例混合，用RPMI1640基础培养液洗涤，1200rpm，离心5分钟，弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL 50wt％的PEG-2000融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI1640基础培养液终止细胞融合，1000rpm，离心5分钟，弃上清，用50mL的RPMI1640筛选培养液轻轻重悬，平分于多块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养，培养6天，换HAT培养液，继续培养并换液一次；
(7)用所述的混合液包被ELISA平板，筛选分泌抗血清淀粉样蛋白A抗体的阳性杂交瘤细胞克隆，RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性细胞孔；
(8)将所述的阳性细胞孔内的细胞以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，扩大培养后，用含10wt％DMSO的培养液冻存，细胞密度为106个/mL，得到能稳定分泌抗血清淀粉样蛋白A抗体的细胞株；
(9)选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射1×106个步骤(8)筛选到的杂交瘤细胞，待产生腹水且小鼠频于死亡之前，处死小鼠，收集腹水，离心取上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤，将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱，然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸收值达到基线为止，再用0.1M的甘氨酸洗脱液洗脱并回收洗脱液，所述的洗脱液用pH8.8、0.1M的Tris中和，得到鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。
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