TWI905354B

TWI905354B - 結合至NKp46及CD123之多功能自然殺手 (NK) 細胞接合體

Info

Publication number: TWI905354B
Application number: TW110149620A
Authority: TW
Inventors: 席琳阿瑪拉; 席琳尼古拉齊; 瑪麗艾勒凱隆; 佛朗西斯杜菲; 約亨貝寧加; 歐迪斯安琪拉維羅; 羅倫高帝耶; 阿麗亞娜蒂倫斯; 班傑明羅西
Original assignee: 法商英耐特醫藥公司; 法商賽諾菲公司
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2025-11-21
Also published as: AU2021414400A1; US11692039B2; IL304124A; EP4271709A1; KR20230127306A; MX2023007901A; US20220213202A1; US20230416383A1; KR102868401B1; CO2023008958A2; JP2025063183A; AU2021414400A9; WO2022144836A1; TW202241952A; JP2024501539A; KR20250152662A; JP7623497B2; CA3206883A1

Abstract

本揭露涉及多功能結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述第一ABD與人CD123特異性結合，並且所述第二ABD與人NKp46特異性結合，並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分針對人Fc-γ受體。本揭露還涉及用於製備所述結合蛋白的方法、其組合物及其用途，包括治療或預防增殖性障礙，包括急性髓性白血病（AML）和骨髓增生異常症候群（MDS）。

Description

結合至NKp46及CD123之多功能自然殺手(NK)細胞接合體

本揭露涉及多功能結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述第一ABD特異性結合人CD123並且所述第二ABD特異性結合人NKp46，並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分針對人Fc-γ受體。

本揭露還涉及製備所述結合蛋白的方法、其組合物及其用途，其用途包括治療或預防增殖性障礙，包括急性髓性白血病（AML）和骨髓增生異常症候群（MDS）。

急性髓性白血病（AML）和骨髓增生異常症候群（MDS）是異質性選殖性腫瘤疾病，被認為是由白血病幹細胞亞群引起的，這些亞群往往對常規化療產生抗藥性，並且可能進一步導致疾病復發。

自然殺手（NK）細胞是參與非常規免疫的淋巴細胞亞群。NK細胞提供了一種有效的免疫監視機制，通過該機制可以消除不需要的細胞，例如受腫瘤或病毒感染的細胞。NK細胞的特徵和生物學特性包括表面抗原（包括CD16、CD56和/或CD57）的表現，細胞表面上α/β或γ/δ TCR複合物的不存在，通過活化特異性溶細胞酶以MHC非限制性方式結合並殺傷細胞、特別是不能表現“自身”MHC/HLA抗原的細胞的能力，殺傷表現NK活化受體的配體的腫瘤細胞或其他患病細胞的能力，以及釋放刺激免疫反應的稱為細胞因子的蛋白質分子的能力。

由於其潛在的抗腫瘤特性，人們也關注自然殺手（NK）細胞。

儘管如此，仍迫切需要用於治療或預防增殖性障礙如急性髓性白血病（AML）和骨髓增生異常症候群（MDS）的活性劑。

還需要具有治療效果的新型NK接合體。

還需要更容易製造和/或投予且沒有副作用或副作用減少的新型化合物。特別地，需要在患者中沒有細胞因子釋放症候群的風險或所述風險降低（例如，沒有IL-6相關的細胞因子釋放或所述釋放減少）的新型化合物。

在一個實施例中，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個都包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16 至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19 至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22 至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25 和 26的胺基酸序列；以及 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27 至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30 至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33 至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36 至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39 、 31 和 40的胺基酸序列；並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人Fc-γ受體。

在某些實施例中，所述結合蛋白包含形成兩個ABD的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)，如下文所定義： V _1A- C _1A- 鉸鏈 ₁- (C _H2-C _H3) _A(I) V _1B- C _1B- 鉸鏈 ₂- (C _H2-C _H3) _B- L ₁- V _2A- C _2A- 鉸鏈 ₃(II) V _2B- C _2B(III) 其中： V _1A和V _1B形成結合對V ₁（V _H1/V _L1）； V _2A和V _2B形成結合對V ₂（V _H2/V _L2）； C _1A和C _1B形成對C ₁（C _H1/C _L），並且C _2A和C _2B形成對C ₂（C _H1/C _L），其中C _H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；鉸鏈 ₁、鉸鏈 ₂和鉸鏈 ₃是相同或不同的，並且對應於免疫球蛋白鉸鏈區的全部或部分； (C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）； L ₁是胺基酸連接子。

在某些實施例中，C _1B是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（C _H1）；C _2A是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（C _H1）；C _L對應於免疫球蛋白κ輕鏈恒定結構域（C _κ）；(C _H2-C _H3) _A對應於SEQ ID NO: 69的胺基酸序列；(C _H2-C _H3) _B對應於SEQ ID NO: 70的胺基酸序列；鉸鏈 ₁對應於SEQ ID NO: 74的胺基酸序列；鉸鏈 ₂對應於SEQ ID NO: 75的胺基酸序列；鉸鏈 ₃對應於SEQ ID NO: 77的胺基酸序列；L ₁對應於SEQ ID NO: 76的胺基酸序列。

在某些實施例中，根據EU編號，所述Fc區或其變異體的殘基N297包含N-連接醣基化。

在某些實施例中，所述Fc區或其變異體的全部或部分結合人類CD16A（FcγRIII）多肽。

在某些實施例中，所述結合蛋白包含通過至少一個二硫橋連接的至少兩條多肽鏈。

在某些實施例中，所述多肽鏈(I)和(II)通過C _1A與鉸鏈 ₂之間的至少一個二硫橋連接，和/或其中所述多肽鏈(II)和(III)通過鉸鏈 ₃與C _2B之間的至少一個二硫橋連接。

在某些實施例中，V _1A是V _L1並且V _1B是V _H1。在某些實施例中，V _2A是V _H2並且V _2B是V _L2。

在某些實施例中，(a) V _H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的CDR-L3；(b) V _H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR-L3；(c) V _H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR-L3；(d) V _H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR-L3；(e) V _H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR-L3；(f) V _H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的CDR-L3；(g) V _H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR-L3；(h) V _H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR-L3；(i) V _H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR-L3；或者 (j) V _H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR-L3。

在某些實施例中，(a) V _H1和V _L1分別對應於SEQ ID NO: 41和43的胺基酸序列或分別對應於SEQ ID NO: 42和44的胺基酸序列；和/或 (b) V _H2和V _L2分別對應於SEQ ID NO: 45和53的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 46和54的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 47和55的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 48和56的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 49和57的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 50和58的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 51和59的胺基酸序列；或者分別SEQ ID NO: 52和60的胺基酸序列。

在某些實施例中， (a) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列； (b) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 46的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列； (c) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 47的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列； (d) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 48的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列； (e) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 49的胺基酸序列；VL ₂包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列； (f) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 50的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列； (g) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列； (h) V _H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列；VL ₂包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列； (i) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列；VL ₂包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列； (j) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 46的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列； (k) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 47的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列； (l) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 48的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列； (m) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 49的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列； (n) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 50的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列。 (o) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列； (p) V _H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列；V _L2包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列。

在某些實施例中，多肽(I)包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列；多肽(II)包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列；並且多肽(III)包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列。

在某些實施例中，多肽(I)由SEQ ID NO: 64的胺基酸序列組成；多肽(II)由SEQ ID NO: 65的胺基酸序列組成；並且多肽(III)由SEQ ID NO: 66的胺基酸序列組成。

在一個實施例中，本揭露涉及一種醫藥組合物，其包含上文定義的結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。

在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的核酸分子，其包含編碼上文定義的結合蛋白的核苷酸序列。

在一個實施例中，本揭露涉及一種表現載體，其包含上文定義的核酸分子。

在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的細胞，其包含上文定義的核酸分子。

在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的細胞，其包含上文定義的表現載體。在某些實施例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。

在一個實施例中，本揭露涉及一種製備上文定義的結合蛋白的方法，其包括以下步驟：(a) 將上文定義的表現載體引入宿主細胞中；(b) 在適合表現所述結合蛋白的條件下培養所述宿主細胞；以及 (c) 任選地回收表現的結合蛋白。

在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的核酸分子，其包含編碼如上文所定義的結合蛋白的核苷酸序列，並且其特徵在於其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；其中： (i) 所述第一ABD與人CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；以及 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人Fc-γ受體。

在一個實施例中，本揭露涉及一種表現載體，其包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼如上文所定義的結合蛋白的一條或多條多肽鏈的核苷酸序列。

在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的細胞，其包含如上文所定義的核酸分子。

在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的細胞，其包含如上文所定義的表現載體。

在一個實施例中，本揭露涉及一種製備所述結合蛋白的方法，其包括以下步驟： (a)在適合表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 包含 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽，和(ii) 包含 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽，和(iii) 包含 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽； (b)任選地回收表現的重組多肽。

在一個實施例中，本揭露涉及一種治療或預防血癌的方法，所述方法包括向需要所述治療或預防的受試者投予上文定義的醫藥組合物。

在一個實施例中，本揭露涉及一種治療或預防骨髓增生異常症候群（MDS）或淋巴組織增生性障礙的方法，所述方法包括向需要所述治療或預防的受試者投予上文定義的醫藥組合物。

在一個實施例中，本揭露涉及一種治療或預防急性髓性白血病（AML）的方法，所述方法包括向需要所述治療或預防的受試者投予上文定義的醫藥組合物。

在一個實施例中，本揭露涉及一種治療或預防CD64陽性和CD64陰性急性髓性白血病（AML）的方法，所述方法包括向需要所述治療或預防的受試者投予上文定義的醫藥組合物。

在一個實施例中，本揭露涉及一種治療或預防CD64陽性急性髓性白血病（AML）的方法，所述方法包括向需要所述治療或預防的受試者投予結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述第一ABD特異性結合人CD123，所述第二ABD特異性結合人NKp46，並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人Fc-γ受體。

本揭露提供多功能結合蛋白，其結合免疫NK細胞上的一種表面生物標記即NKp46和腫瘤靶細胞上的一種目的抗原即CD123，並且能夠重定向NK細胞以裂解表現CD123表面生物標記的靶細胞。本揭露的多功能結合蛋白進一步包含Fc區或其變異體的全部或部分，其結合Fc-γ受體（FcγR），特別是活化Fc-γ受體（FcγR），例如也稱為CD16a的FcγRIIIa。

本揭露的例示性多功能結合蛋白還具有包含N-連接醣基化並結合活化Fc-γ受體（FcγR）如受體CD16a的二聚Fc結構域，從而提供有利的免疫增強活性。

本發明人提供的實驗證據表明，可以通過接合NKp46、FcγR如CD16a和細胞表面生物標記CD123，在體外對AML細胞株MOLM-13和THP1以及離體對來自AML患者的原始樣品（例如，來自AML患者的外周血淋巴細胞）實現最佳NK細胞調節，特別是NK細胞活化，且具有更好的安全性概況。

重要的是，離體再現了本揭露的NKp46-CD123結合蛋白的體外細胞毒性活性，其特徵在於本文報告為“ F25”的形式並且包含保持與人CD16多肽結合的中央片段可結晶（Fc）區。

因此，本發明人提供了雙特異性NKp46/CD16-CD123結合蛋白特別是用於治療和預防AML和其他增殖性障礙的治療特性的實驗支持。

本發明人進一步提供了實驗證據表明，NKp46-CD123結合蛋白活化來自AML患者的原始樣品中的NK細胞，而不管它們的CD64表現狀態如何。

因此，通過結合細胞表面標記NKp46/CD16接合NK細胞被證實是用作藥物的穩健且可再現的策略。

I. 定義

如本文所用，“ CD123 ”標記或“ 分化群 123 ”也稱為“ 介白素 3 受體 α （ IL3RA ） ”或“ IL3R ”、“ IL3RX ”、“ IL3RY ”、“ IL3RAY ”、“ hlL-3Ra ”，並且表示異二聚細胞因子受體的介白素3特異性亞基。功能性介白素3受體是一種異二聚體，其包含特定的α鏈（IL-3A；CD123）以及與粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和介白素5（IL-5）的受體共用的IL-3受體β鏈（βθ；CD131）。CD123是一種I型整合跨膜蛋白，其推導分子量約為43kDa，其含有參與IL-3結合的細胞外結構域、跨膜結構域和約50個胺基酸的短胞質尾。所述細胞外結構域由兩個區域構成：約100個胺基酸的N末端區域，其序列展現與GM-CSF和IL-5受體α鏈的等效區域的相似性；以及靠近所述跨膜結構域的區域，其含有四個保守的半胱胺酸殘基和與此細胞因子受體家族的其他成員共有的基序。IL-3結合結構域包含由兩個IG樣折疊結構域構成的約200個胺基酸殘基的細胞因子受體基序（CRM）。CD123的細胞外結構域是高度醣基化的，具有配體結合和受體信號傳導二者都需要的N-醣基化。所述蛋白質家族聚集了三個成員：IL3RA（CD123A）、CSF2RA和IL5RA。總體結構在三個成員之間非常保守，但序列同源性極低。到目前為止已經發現了CD123的一種長300個胺基酸的亞型，但其僅在RNA水平上可在GetEntry資料庫中以登錄號ACM241 16.1訪問。包括信號肽在內的全長人CD123蛋白的參考序列可以登錄號NP_002174.1和Uniprot登錄號P26951從NCBI資料庫獲得。人CD123的細胞外結構域（ECD）由 SEQ ID NO: 86的胺基酸序列組成。CD123（介白素-3受體α鏈IL-3Ra）是在多種血液學腫瘤中過表現的腫瘤抗原。大多數AML胚細胞表現表面CD123，並且該表現並不隨AML的亞型而變化。已報導診斷時AML上的CD123的更高表現與更差預後相關。已在其他血液學惡性腫瘤中報導了CD123表現，所述血液學惡性腫瘤包括脊髓發育不良、系統性肥大細胞增多症、胚細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤（BPDCN）、ALL和多毛細胞白血病。

如本文所用，“ 自然殺手細胞”或“ NK 細胞 ”是指參與非常規免疫的淋巴細胞子群體。NK細胞可以借助某些特徵和生物學特性來鑒定，如包括CD16、CD56和/或CD57的特定表面抗原的表現，用於人NK細胞的NKp46、細胞表面上α/β或γ/δ TCR複合物的不存在，通過活化特異性細胞裂解機構結合並殺傷未能表現“自身” MHC/HLA抗原的細胞的能力，殺傷表現NK活化受體的配體的腫瘤細胞或其他患病細胞的能力，以及釋放刺激或抑制免疫反應的稱為細胞因子的蛋白質分子的能力。這些特徵和活性中的任一種可用於使用本領域熟知的方法鑒定NK細胞。NK細胞的任何子群體也將被術語NK細胞所涵蓋。在本文的背景下，“活性”NK細胞指定生物活性NK細胞，其包括具有裂解靶細胞的能力或增強其他細胞的免疫功能的NK細胞。NK細胞可以通過本領域已知的各種技術獲得，例如從血液樣品分離、細胞去除術、組織或細胞收集等。涉及NK細胞的測定的有用方案可以發現於以下文獻中：Natural Killer Cells Protocols（由Campbell KS和Colonna M編輯）. Human Press. 第219-238頁 (2000)。

如本文所用，“ NKp46 ”標記或“ 天然細胞毒性觸發受體 1 ”也稱為“ CD335 ”或“ NKp46 ”或“ NK-p46 ”或“ LY94 ”，其是指由 Ncr1基因編碼的蛋白質或多肽。全長人類NKp46蛋白的參考序列可從NCBI資料庫以登錄號NP_004820獲得。人類NKp46細胞外結構域（ECD）對應於 SEQ ID NO: 84的胺基酸序列。人類NKp46 mRNA序列描述於NCBI登錄號NM_004829中。

如本文所用，術語“ Fc-γ 受體 ”或“ FcγR ”或“ Fcγ 受體 ”可以是指活化和抑制FcγR。Fc-γ受體（FcγR）是免疫球蛋白G（IgG）Fc區的細胞受體。在結合複合的IgG後，FcγR可以調節細胞免疫效應功能，從而將適應性和先天免疫系統聯繫起來，包括ADCC介導的免疫反應。在人類中，當前報導了六種經典FcγR：一種高親和力受體（FcγRI）和五種低至中等親和力FcγR（FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB）。所有FcγR都結合IgG Fc上的相同區域，但具有不同的高（FcgRI）和低（FcgRII和FcgRIII）親和力。在功能水平上，大多數FcγR是活化受體，其可以誘導上文提及的細胞反應，包括ADCC介導的免疫反應。FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc和FcγRIIIa是特徵為細胞內免疫受體酪胺酸活化基序（ITAM）的活化受體，而FcγRIIb具有抑制基序（ITIM）且因此是抑制性的。除非另有規定，否則術語FcγR涵蓋活化受體，包括FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32a）、FcγRIIIa（CD16a）和FcγRIIIb（CD16b），並且優選地FcγRIIIa（CD16a）。

如本文所用，術語“ FcγRIIIa （ CD16a ） ”或“ FcγRIIIa ”或“ CD16a ”或“ CD16 ”或“ 分化群 16 ”可以是指在肥大細胞、巨噬細胞和自然殺手細胞上作為跨膜受體表現的50-65 kDa細胞表面分子。FcγRIIIa是一種活化受體，其在相關的FcRγ鏈中含有免疫受體酪胺酸活化基序（ITAM），ITAM是受體表現、表面組裝和信號傳導所必需的。CD16a是IgG的低親和力受體，並且是介導NK細胞的ADCC（抗體依賴性細胞介導的細胞毒性）的重要受體。高親和力受體CD16a優先發現於NK細胞和單核細胞上，並在IgG結合後誘導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。

如本文所用，術語“ FcγRII CD32 ”、“ FcγRII ”、“ FCGR2 ”或“ CD32a ”或“ CD32A ”或“ CD32 ”或“ 分化群 32 ”是屬於Ig基因超家族的表面受體糖蛋白。CD32A在所有骨髓細胞上表現，但不在淋巴細胞上表現。CD32對呈單體形式的IgG抗體的Fc區具有低親和力，但對IgG免疫複合物具有高親和力。CD32有兩個主要功能：細胞反應調節和免疫複合物的攝取。受CD32調節的細胞反應包括吞噬作用、細胞因子刺激和內吞轉運。失調的CD32與不同形式的自身免疫相關，包括系統性紅斑狼瘡。在人類中，存在三種主要的CD32亞型：CD32A、CD32B和CD32C。雖然CD32A和CD32C參與活化細胞反應，但CD32B是抑制性的並且平衡CD32A的活化特性。CD32A是CD32的活化亞型，其可以發現於多種免疫細胞上。值得注意的是，CD32A（FcγRIIA）在聚集的IgG的低親和力結合後介導粒細胞、單核細胞、B細胞、血小板和樹突細胞的效應功能。當與IgG免疫複合物結合時，胞質ITAM可以促進嗜中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬活性和細胞因子分泌。

如本文所用，術語“ hFcγRICD64 ”、“ hFcγRI ”或“ CD64 ”或“ 分化群 64 ”是僅在單核細胞和巨噬細胞上組成型表現的表面受體，但是在細胞因子刺激後在粒細胞上發生上調。

如本文所用，術語 “ 形式 5 ”或 “F5” 、 “ 形式 25” 或“ F25” 、 “ 形式 F6” 或 “ F6” 和 “ 形式 26” 或 “ F26” 是指雙特異性或多特異性抗體的特定結合蛋白構型，所述抗體特別設計為將多個抗原結合結構域工程化至單一抗體分子中。包含NKp46結合結構域和CD123結合結構域的本揭露的多功能結合蛋白是基於F25形式來製備，如圖 1和圖 2中所例示。F25和形式F26與形式F5和F6的不同之處分別在於，第二與第三多肽鏈之間的一個C _H1/C _L對被交換以形成C _L/C _H1對。F5和F6形式先前已經描述於國際專利申請WO 2017114694中，所述申請通過引用併入本文。

如本文所用，術語 “ 雙特異性結合蛋白 ”是指經由兩個不同的抗原結合結構域（ABD）特異性結合至兩個不同的抗原靶標（例如人NKp46和人CD123）的結合蛋白。

如本文所用，術語“ 特異性結合至 ”或“ 特異性結合 ”是指抗原結合結構域（ABD）以至少約1 x 10 ^-6M、1 x 10 ^-7M、1 x 10 ^-8M、1 x 10 ^-9M、1 x 10 ^-10M、1 x 10 ^-11M、1 x 10 ^-12M或更大的Kd結合含有表位的抗原（例如人NKp46和/或人CD123），和/或以比其對非特異性抗原的親和力大至少兩倍的親和力結合表位的能力。

如本文所用，術語“ 特異性結合人 NK46 多肽 ”可以是指標對包含 SEQ ID NO: 84的胺基酸序列的多肽的特異性結合。

如本文所用，術語“ 特異性結合人 CD123 多肽 ”可以是指標對包含 SEQ ID NO: 86的胺基酸序列的多肽的特異性結合。

如本文所用，術語“ 結合至人 Fc-γ 受體多肽 ”可以是指標對包含 SEQ ID NO: 87 或 SEQ ID NO: 88的胺基酸序列的多肽的結合。

用於確定特異性結合的競爭性結合測定和其他方法在下文進一步描述並且是本領域公知的。諸如“特異性結合”或“對具有特異性”的表現可以互換使用。那些術語不解釋為僅僅是指實際結合所述靶標/結合配偶體的那些抗體、多肽和/或多鏈多肽，亦指雖然以非結合形式提供但保留對所述靶標的特異性的那些。結合特異性可以通過親和常數KA（或K _A）和解離常數KD（或K _D）來定量確定。

如本文所用，術語“ 親和力 ”、濃度（EC50）或平衡解離常數（KD）意指抗體或多肽對表位的結合強度。抗體的親和力由特定類型的平衡常數（其是解離常數KD）給出，定義為 [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗體-抗原複合物的莫耳濃度，[Ab]是未結合抗體的莫耳濃度，[Ag]是未結合抗原的莫耳濃度。親和常數KA定義為1/KD。用於確定mAb的親和力的優選方法可以發現於以下文獻中：Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 冷泉港, 紐約, 1988；Coligan等人編輯, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, 紐約, (1992, 1993)；以及Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)，所述參考文獻通過引用整體併入本文。本領域熟知的用於確定mAb的親和力的一種優選和標準方法是使用表面等離子共振（SPR）篩選（如通過用BIAcore™ SPR分析裝置進行分析）。以非限制性方式，如通過SPR以及在生理條件下（例如在範圍為6至8的pH在正常緩衝液條件下）所確定小於50 nM的K _D通常可以被認為指示抗原-抗原結合結構域（ABD）相互作用的特異性。

作為說明，並且根據一些特定和例示性實施例，本文報告的結合蛋白包含： - 抗原結合結構域，其在生理條件下以小於10 nM的K _D、特別是以小於0.5 nM的K _D與人CD123特異性結合，如通過SPR所確定； - 抗原結合結構域，其在生理條件下以小於50 nM的K _D、特別是以小於20 nM的K _D與人NKp46特異性結合，如通過SPR所確定。

如本文所用，術語“ 和 / 或 ”是一個語法連詞，其被解釋為涵蓋其連接的一種或多種情形可能發生。例如，措辭“此類天然序列蛋白可以使用標準重組和/或合成方法來製備”表明，天然序列蛋白可以使用標準重組和合成方法來製備，或者天然序列蛋白可以使用標準重組方法來製備，或者天然序列蛋白可以使用合成方法來製備。

如本文所用，“ 治療 ”是指治療性用途（即，對患有給定疾病的受試者）並且意指逆轉、減輕、抑制此類障礙或病症的一種或多種症狀的進展。因此，治療不僅指導致疾病完全治癒的治療，還是指減緩疾病進展和/或延長受試者存活的治療。

如本文所用，“ 預防 ”意指預防性用途（即，對易患給定疾病的受試者），並且涵蓋對復發AML患者的治療。

如本文所用，術語多功能結合蛋白或其醫藥組合物的“ 治療有效量 ”意指抗體樣多功能結合蛋白以適用於任何醫學治療的合理的收益/風險比治療所述癌症疾病的足量。然而，應當理解，本揭露的多肽和組合物的總日用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。任何特定患者的具體治療有效劑量水平將取決於多種因素，包括所治療的障礙和所述障礙的嚴重程度；採用的具體多肽的活性；採用的具體組合物、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；採用的具體多肽的投予時間、投予途徑和排泄速率；治療的持續時間；與採用的具體多肽組合或同時使用的藥物；以及醫學領域中眾所周知的類似因素。例如，在本領域技術內眾所周知，以低於實現期望治療效果所需的那些的水平開始化合物的劑量，並逐漸增加劑量直至實現期望效果。

如本文所用，術語“ 受試者 ”或 “ 個體 ” 或“ 患者 ”可互換使用，並且可以涵蓋人或非人哺乳動物、齧齒類動物或非齧齒類動物。所述術語包括但不限於哺乳動物，例如，人（包括男人、女人和兒童）、其他靈長類動物（猴子）、豬、齧齒類動物（如小鼠和大鼠、兔子、豚鼠、倉鼠）、牛、馬、貓、狗、綿羊和山羊。

如本文所用，單數形式“ 一個 / 一種（ a ） ”、“ 一個 / 一種（ an ） ”和“ 所述 ”包括複數指示物，除非上下文明確地另外指明。例如，術語“ 醫藥上可接受的載劑”涵蓋多種醫藥上可接受的載劑，包括其混合物。

如本文所用，“ 多種 ”因此可以包括« 兩種»或« 兩種或更多種»。

如本文所用，“ 抗體 ”或“ 免疫球蛋白 ”可以是指天然或常規抗體，其中兩條重鏈通過二硫鍵彼此連接，並且每條重鏈通過二硫鍵連接至輕鏈。存在兩種類型的輕鏈，即蘭布達（λ）和卡帕（κ）。存在五種主要的重鏈類別（或同種型）決定了抗體分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每條鏈含有不同的序列結構域。輕鏈包括兩個結構域或區域，即可變結構域（V _L）和恒定結構域（C _L）。重鏈通常包括四個結構域，即可變結構域（V _H）和三個恒定結構域（C _H1、C _H2和C _H3，統稱為C _H）。具體而言，類別IgG、IgA和IgD具有三個重鏈恒定區結構域，其被命名為C _H1、C _H2和C _H3；並且IgM和IgE類別具有四個重鏈恒定區結構域，即C _H1、C _H2、C _H3和C _H4。輕鏈（VL）和重鏈（VH）二者的可變區決定了對抗原的結合識別和特異性。輕鏈（CL）和重鏈（CH）的恒定區結構域賦予重要的生物學特性，如抗體鏈締合、分泌、跨胎盤移動性、補體結合和與Fc受體（FcR）的結合。Fv片段是免疫球蛋白的抗原結合片段（Fab）的N末端部分，並且由一條輕鏈和一條重鏈的可變部分組成。

如本文所用，通常在提及“ IgG ”或“ 免疫球蛋白 G ”時，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，除非另有定義。特別地，IgG是IgG1。

如本文所用，術語“ 抗體樣”或“ 免疫球蛋白樣”多肽還可以是指非常規或合成的抗原結合多肽或結合蛋白，包括單一結構域抗體及其片段，特別是單一結構域抗體的可變重鏈，以及嵌合、人源化、雙特異性或多聚抗體。

如本文所用，術語“ 多功能結合蛋白 ”涵蓋多鏈蛋白，包括但不限於抗體樣多肽或蛋白質形式，其包含與人類CD123多肽特異性結合的至少一個第一可變區（例如第一免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和/或免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L）），以及與人NKp46多肽特異性結合的至少一個第二可變區（例如第二免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和/或免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L））。儘管不具體限於特定類型的構建體，但在整個說明書中特別考慮一個通用實施例： WO 2015197593和 WO 2017114694中報導的多肽構建體，所述申請中的每一個通過引用併入本文。特別地，多功能結合蛋白，如 WO 2015197593和 WO 2017114694中報導的那些可以涵蓋包含一條或多條多肽鏈的任何構建體。

如本文所用，如在“ 人源化抗體 ”中的術語“ 人源化 ”是指完全或部分為非人來源並且已被修飾以取代某些胺基酸（特別是在重鏈和輕鏈的框架區中）以避免或最小化在人中的免疫反應的多肽（即，抗體或抗體樣多肽）。人源化抗體的恒定結構域大部分時間是人C _H和C _L結構域。許多用於抗體序列人源化的方法是本領域已知的；參見例如，Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633的綜述。一種常用的方法是CDR移植或抗體重塑，其涉及將供體抗體（通常是小鼠抗體）的CDR序列移植到不同特異性的人抗體的框架支架中。

對於嵌合抗體，人源化通常涉及可變區序列的框架區的修飾。作為CDR的一部分的胺基酸殘基通常不會與人源化結合而改變，但是在某些情況下，可能需要改變單獨CDR胺基酸殘基，例如以去除醣基化位點、脫醯胺位點或不需要的半胱胺酸殘基。N連接醣基化是通過將寡糖鏈附接到三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr的天門冬醯胺酸殘基來進行，其中X可以是除Pro以外的任何胺基酸。N-醣基化位點的去除可以通過使Asn或Ser/Thr殘基突變為不同殘基，特別是借助保守取代來實現。天門冬醯胺酸和麩醯胺酸殘基的脫醯胺可以根據諸如pH和表面暴露等因素來進行。天門冬醯胺酸殘基特別易於脫醯胺，主要在存在於序列Asn-gly中時，並且在其他二肽序列如Asn-Ala中程度較小。當CDR序列中存在這種脫醯胺位點、特別是Asn-Gly時，因此可以期望去除所述位點，典型地通過保守取代去除所涉及殘基之一。CDR序列中用以去除所涉及殘基之一的取代也意圖被要求保護的多功能結合蛋白所涵蓋。

如本文所用，術語“ 保守胺基酸取代 ”是指其中胺基酸殘基被具有擁有類似物理化學特性的側鏈的胺基酸殘基替代的取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族是本領域已知的，並且包括具有以下側鏈的胺基酸： 鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、 酸性側鏈（例如，天門冬胺酸、麩胺酸）、 不帶電荷的極性側鏈（例如，甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、 非極性側鏈（例如，丙胺酸、擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）以及 芳香族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸）。當胺基酸屬於兩個不同類別（即，酪胺酸和苯丙胺酸）時，兩者都可以被接受。作為參考，除非另有說明，否則在整個說明書中將遵循以下分類。

保守取代	胺基酸的類型
Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp	具有非極性側鏈的胺基酸
Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly	具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸
Asp、Glu	具有酸性側鏈的胺基酸
Lys、Arg、His	具有鹼性側鏈的胺基酸
Tyr、Phe、Trp,	芳香族胺基酸

如本文所用，術語“ 結構域 ”可以是蛋白質中與特定結構或功能實體有關的任何區域，通常基於序列同源性或同一性來定義。因此，如在本揭露的上下文中使用的術語“ 區域 ”是更寬的，因為它可以包括超出相應結構域以外的另外的區域。

如本文所用，術語“ 連接子區 ”、“ 連接子肽 ”或“ 連接子多肽 ”或“ 胺基酸連接子 ”或“ 連接子 ”是指適合於將兩個多肽結構域（如兩個抗原結合結構域）共價連接在一起和/或將Fc區共價連接至一個或多個可變區（如一個或多個抗原結合結構域）的任何胺基酸序列。儘管所述術語不限於特定大小或多肽長度，但此類胺基酸連接子的長度通常小於50個胺基酸，優選地長度小於30個胺基酸，例如長度為20個或小於20個胺基酸，例如長度為15個或少於15個胺基酸。此類胺基酸連接子可以任選地包含免疫球蛋白多肽鏈的全部或部分，如免疫球蛋白鉸鏈區的全部或部分。可替代地，胺基酸連接子可以包含並非源自免疫球蛋白鉸鏈區的多肽序列，或者甚至並非源自免疫球蛋白重或輕多肽鏈的多肽序列。

如本文所用，免疫球蛋白鉸鏈區或其片段因此可以被認為是特定類型的連接子，其源自免疫球蛋白多肽鏈。

如本文所用，術語“ 鉸鏈區 ”或“ 鉸鏈 ”是指大體為彈性的區域並且由相應的重鏈多肽產生，並且其將免疫球蛋白的某些同種型、更特別地IgG、IgA或IgD同種型的Fc和Fab部分隔開。此類鉸鏈區是本領域已知的，取決於所考慮的免疫球蛋白的同種型。對於天然IgG、IgA和IgD同種型，鉸鏈區因此將C _H1結構域和C _H2結構域隔開，並且通常在木瓜蛋白酶消化時被切割。另一方面，對應於IgM和IgE重鏈中的鉸鏈的區域通常由彈性較低的另外的恒定結構域形成。此外，鉸鏈區可以包含一個或多個參與鏈間二硫鍵的半胱胺酸。當適用時，除了由C _H2結構域產生的FcγR結合位點外，鉸鏈區還可以包含一個或多個與Fcγ受體的結合位點。此外，根據所考慮的同種型，鉸鏈區可以包含一個或多個轉譯後修飾，如一個或多個醣基化殘基。因此，將容易理解，在整個說明書中體積術語“ 鉸鏈 ”時並不限於特定的鉸鏈序列組或結構上的特定位置。除非另有指示，否則仍特別考慮的鉸鏈區包含來自屬於選自以下的一種同種型的免疫球蛋白的鉸鏈的全部或部分：IgG同種型、IgA同種型和IgD同種型；特別是IgG同種型。

如本文所用，術語“ CH 結構域 ”或“ C _H 結構域 ”或“ 恒 定結構域 ”可以互換使用，並且是指任何一個或多個重鏈免疫球蛋白恒定結構域。此類C _H結構域天然折疊為免疫球蛋白樣結構域，但是它們可能以分離的形式部分無序化（例如，當與輕鏈的恒定結構域（C _L）無關時，C _H1結構域）。除非另有指示，否則所述術語因此可以是指C _H1結構域、C _H2結構域、C _H3結構域；或其任何組合。

如本文所用，術語“ CH1 結構域 ”或“ C _H1 結構域 ”或“ 恒 定結構域 1 ”可以互換使用，並且是指相應重鏈免疫球蛋白恒定結構域1。

如本文所用，術語“ CH2 結構域 ”或“ C _H2 結構域 ”或“ 恒 定結構域 2 ”可以互換使用，並且是指相應重鏈免疫球蛋白恒定結構域2。

如本文所用，術語“ CH3 結構域 ”或“ C _H3 結構域 ”或“ 恒 定結構域 3 ”可以互換使用，並且是指相應重鏈免疫球蛋白恒定結構域3。

如本文所用，如在(C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B中的術語“ C _H2-C _H3 ”因此是指包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）的多肽序列。

如本文所用，術語“ CL 結構域 ”或“ C _L 結構域 ”可以互換使用，並且是指相應輕鏈免疫球蛋白恒定結構域。除非另有指示，否則該術語可以因此涵蓋卡帕（κ或 _K）或蘭布達（λ）類免疫球蛋白輕鏈的C _L結構域，包括所有已知亞型（例如λ ₁、λ ₂、λ ₃和λ ₇）。特別地，當C _L結構域是κ類時，其在本文中也可以稱為Cκ或C _K或C _k結構域。

如本文所用，術語“ 對 C （ C _H1/C _L ） ”或“ 成對 C （ C _H1/C _L ） ”是指通過共價鍵或非共價鍵、優選地非共價鍵彼此結合的一個恒定重鏈結構域1和一個恒定輕鏈結構域（例如，卡帕（κ或 _K）或蘭布達（λ）類免疫球蛋白輕鏈）；由此形成異二聚體。除非另有規定，否則當形成所述對的恒定鏈結構域不存在於同一多肽鏈上時，該術語因此可以涵蓋所有可能的組合。優選地，相應C _H1和C _L結構域將因此被選擇為彼此互補，使得它們形成穩定的對C（C _H1/C _L）。

有利地，當結合蛋白包含多個成對C結構域，如一個“ 對 C ₁ （ C _H1/C _L ） ”和一個“ 對 C ₂ （ C _H1/C _L ） ”時，形成所述對的每個C _H1和C _L結構域將被選擇使得所述對在互補的C _H1與C _L結構域之間形成。互補的C _H1和C _L結構域的例子先前已經描述於國際專利申請 WO 2006064136或 WO 2012089814或 WO 2015197593A1中。

除非另有指示，否則術語“ 對 C ₁ （ C _H1/C _L ） ”或“ 對 C ₂ （ C _H1/C _L ） ”可以是指由相同或不同的恒定重鏈1結構域（C _H1）和相同或不同的恒定輕鏈結構域（C _L）形成的不同的恒定對結構域（C ₁和C ₂）。優選地，術語“ 對 C ₁ （ C _H1/C _L ） ”或“ 對 C2 （ C _H1/CL ） ”可以是指由相同的恒定重鏈1結構域（C _H1）和相同的恒定輕鏈結構域（C _L）形成的不同的恒定對結構域（C ₁和C ₂）。

如本文所用，術語“ Fc 區 ”或“ 片段可結晶區域 ”或者可替代地“ Fc 部分 ”涵蓋“ Fc 結構域 ”的全部或部分，其可以因此包括免疫球蛋白鉸鏈區（其天然帶有FcγR的第一結合位點）、C _H2結構域（其天然帶有FcγR的第二結合位點）和免疫球蛋白的（例如IgG、IgA或IgD免疫球蛋白的）C _H3結構域和/或（適用時）免疫球蛋白的（例如IgM和IgE的）C _H4結構域的全部或部分。優選地，Fc區包括至少C _H2結構域和C _H3結構域的全部或部分，以及任選地免疫球蛋白鉸鏈區的全部或部分。因此，所述術語可以是指包含由抗體消化得到或通過其他方式產生的非抗原結合片段的序列的分子，其呈單體形式或多聚形式，並且可以含有鉸鏈區。特別地，天然Fc的原始免疫球蛋白來源是人類來源，並且可以是任何免疫球蛋白，但是IgG1是優選的。天然Fc分子由可以通過共價（即，二硫鍵）和非共價締合連接成二聚或多聚形式的單體多肽構成。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數量範圍為1至13，根據類別（例如，IgG、IgA和IgE）或亞類（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgGA1和IgGA2）而定。天然Fc的一個例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化得到的二硫鍵鍵合的二聚體。如本文所用術語“天然Fc”泛指單體、二聚和多聚形式。在該術語下，“Fc區”可以因此包含以下或由以下組成：C _H2-C _H3（例如，(C _H2-C _H3) _A或(C _H2-C _H3) _B或其結合對，以及任選地免疫球蛋白鉸鏈區的全部或部分，其包含人類FcγR的結合位點。除非另有規定，否則術語“ Fc 區 ”可以是指天然或變異體Fc區。

如本文所用術語“ Fc 變異體 ”是指從天然Fc被修飾但仍包含受體FcRn（新生Fc受體）的結合位點的分子或序列。例示性Fc變異體及其與所述受體的相互作用是本領域已知的。因此，術語“Fc變異體”可以包括從非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以去除的區域，因為它們提供的結構特徵或生物活性是本發明的抗體樣結合蛋白不需要的。因此，術語“Fc變異體”包括缺少一個或多個天然Fc位點或殘基，或其中一個或多個Fc位點或殘基已被修飾的分子或序列，其影響或參與：(1) 二硫鍵形成，(2) 與選擇的宿主細胞的不相容性，(3) 在選擇的宿主細胞中表現時的N末端異質性，(4) 醣基化，(5) 與補體的相互作用，(6) 與補救受體外的Fc受體的結合，或者 (7) 抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。

根據本揭露的片段可結晶（Fc）區（例如，天然或變異體）保留結合人Fc-γ受體多肽（Fcγ）的能力，其通常通過抗體Fc-鉸鏈區的結合而出現在天然Fc區上。作為參考，IgG1、IgG2和IgG4的總體結構是相似的，序列同源性超過 90%，主要差異在於鉸鏈區和C _H2結構域中，它們形成了與FcγR的主要結合位點。鉸鏈區還用作Fab與Fc部分之間的彈性連接子。

進一步考慮在一個或多個部分中具有一個或多個胺基酸修飾（例如，取代、缺失、插入）的Fc區作為Fc區，所述修飾增加變異體Fc區對FcγR（包括活化和抑制FcγR）的親和力和親合力。在一些實施例中，所述一個或多個胺基酸修飾增加了Fc區對FcγRIIIA和/或FcγRIIA的親和力。在另一個實施例中，變異體Fc區以低於參考親本抗體（例如，除了Fc區中的一個或多個胺基酸修飾，具有與所述抗體相同的胺基酸序列的抗體）的Fc區的親和力進一步特異性結合FcγRIIB。因此，本文考慮的天然和變異體Fc區通常包含能夠結合人類CD16的結構域（即C _H2結構域），例如，在胺基酸殘基N297（根據EU編號）處包含N-連接醣基化的人Fc結構域。

如本文所用，術語“ Fc 勝任 (competent) ”因此是指能夠特異性結合FcγR、特別是活化FcγR、特別是選自FcγRI（CD64a）、FcγRIIa（CD32a）和FcγRIIIa（CD16a）之一、且更特別是FcγRIIIa（CD16a）的結合蛋白。

可替代地，據報導，幾種修飾直接影響與FcγR的結合，包括殘基297（根據EU編號）上的突變，或者可替代地在下鉸鏈區中的殘基234和235（根據EU編號系統）上的突變。

如本文所用，術語“ Fc 沉默 ”是指具有Fc區的結合蛋白，其中所述Fc區缺少與 FcγR的結合位點（例如，缺少具有所述結合位點的C _H2結構域和具有所述結合位點的鉸鏈區的Fc區）；特別地FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa，並且更特別地FcγRIIIa（CD16a）。

如本文所用，如在“可變結構域”中的術語“ 可變的 ”是指相關結合蛋白的某些部分，其序列在抗體之間廣泛不同，並且用於特定抗體對其特定靶標的特異性識別和結合。然而，變異性並非均勻分佈在抗體的整個可變結構域中。變異性集中在輕鏈和重鏈可變結構域二者中的稱為互補決定區（CDR；即 CDR1、CDR2和CDR3）的三個區段中，也稱為高變區。可變結構域中的更高保守度的部分稱為框架（FR）區或序列。

如本文所用，術語“ VH 結構域 ”或“ V _H 結構域 ”可以互換使用並且是指相應重鏈免疫球蛋白可變結構域。

如本文所用，術語“ VL 結構域 ”或“ V _L 結構域 ”可以互換使用並且是指相應輕鏈免疫球蛋白可變結構域。

在VH或VL結構域與第一抗原結合結構域（ABD）或與第二抗原結合結構域相關時，它們在本文中也可以分別被稱為“ V _H1 ”和“ V _L1 ”，或者“ V _H2 ”和“ V _L2 ”。

術語“ 結合對 V （ VH/VL ） ”、“ V _H/V _L 對 ”或 “ （ V _H/V _L ）對 ”或“ V _L/V _H 對 ”或 “ （ V _L/V _H ）對 ”可以互換使用。重鏈和輕鏈可變結構域可以平行配對以形成抗原結合結構域（ABD）。每個結合對包括V _H和V _L區二者。除非另有指示，否則這些術語不指定哪些免疫球蛋白可變區是V _H或V _L區以及哪些ABD將特異性結合在免疫效應細胞或靶細胞的表面上表現的蛋白質（例如，NKp46和CD123）。

如本文所用，術語“ 高變區 ”在本文中使用時是指抗體的負責抗原結合的胺基酸殘基。該術語可以用術語“ 互補決定區 ”或“ CDR ”代替。

因此，如本文所用“ 互補決定區 ”或“ CDR ”是指共同定義天然免疫球蛋白結合位點的天然Fv區的結合親和力和特異性的胺基酸序列。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個CDR，分別命名為CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3。因此，常規抗體抗原結合結構域包括六個CDR，包括來自重鏈和輕鏈可變區中的每一個的CDR組。此外，如本文所用，“ 框架區 ”（FR）是指插入在CDR之間的胺基酸序列，即免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區中在單一物種的不同免疫球蛋白之間相對保守的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有四個FR，分別命名為FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4以及FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4。因此，輕鏈可變結構域可以因此被命名為(FR-L1)-(CDR-L1)-(FR-L2)-(CDR-L2)-(FR-L3)-(CDR-L3)-(FR-L4)，並且重鏈可變結構域可以因此被命名為(FR-H1)-(CDR-H1)-(FR-H2)-(CDR-H2)-(FR-H3)-(CDR-H)-(FR4-H3)。

高變區通常包含來自“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基（例如輕鏈可變結構域中的殘基24-34（L1）、50-56（L2）和89-97（L3）以及重鏈可變結構域中的31-35（H1）、50-65（H2）和95-102（H3）；Kabat等人 1991）和/或來自“高變環”的那些殘基（例如輕鏈可變結構域中的殘基26-32（L1）、50-52（L2）和91-96（L3）以及重鏈可變結構域中的26-32（H1）、53-55（H2）和96-101（H3）；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917）。該區域中胺基酸殘基的編號是通過Kabat等人，同上中所述的方法來進行。因此，本文中諸如“Kabat位置”、“根據Kabat編號的可變結構域殘基”和“根據Kabat”的短語是指用於重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的這種編號系統。使用Kabat編號系統，肽的實際線性胺基酸序列可能含有更少的或另外的胺基酸，其對應於可變結構域的FR或CDR的縮短或插入。例如，重鏈可變結構域可以包括在CDR H2的殘基52之後的單個胺基酸插入物（根據Kabat的殘基52a）和在重鏈FR殘基82之後插入的殘基（例如，根據Kabat的殘基82a、82b和82c等）。可以通過將抗體序列同源性區域與“標準”Kabat編號的序列比對來確定給定抗體的殘基的Kabat編號。

任選地，CDR是由EU、Kabat、Chotia或IMGT編號來定義。那些分類之間的對應性是本領域中已知的，參考IMGT®或international ImMunoGeneTics information system®（CNRS和蒙貝利耶大學），並且如Lefranc（Biomolecules; 2014; 4, 1102-1139）和Dondelinger（Frontiers in Immunology; 2018; 9, 2278）中進一步詳述。

除非另有指示，否則殘基的編號將在本文中通過參考EU、Kabat、Chotia或IMGT編號約定來考慮。如果關於參考序列內高變區的確切位置發生衝突，則以Kabat編號約定為准。如果在參考序列中恒定區的確切位置發生衝突，將以歐盟編號慣例為准。

如本文所用，術語“ 細胞毒性 ”是指化合物（如根據本揭露的多功能結合蛋白）對腫瘤細胞有毒的性質。細胞毒性可由不同的作用機制來誘導，因此可以分為細胞介導的細胞毒性、細胞凋亡、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。

如本文所用，術語“ 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 ”或“ADCC”是指細胞介導的免疫防禦機制，借此免疫系統的效應細胞主動裂解靶細胞，所述靶細胞的膜表面抗原已被本揭露的特異性抗體或多功能結合蛋白結合。

如本文所用，術語“ 增殖性障礙 ”、“ 過度增殖性障礙 ”和/或“ 癌症 ”不僅是指實體瘤，如乳房、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、泌尿道、眼、肝、皮膚、頭頸部、甲狀腺、副甲狀腺的癌症及其遠端轉移，還包括血癌，包括造血和淋巴組織的腫瘤，如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病。白血病包括但不限於急性髓性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞性白血病和多毛細胞白血病。

如本文所用，“ 急性髓細胞性白血病（ AML ） ” 是一種複製性(clonal)障礙，臨床表現為異質性和未分化的髓胚細胞的增殖增加。不希望受理論束縛，白血病等級由LSC（白血病幹細胞）（AML-LSC）的小群體維持，它們具有獨特的自我更新能力，並能夠分化成白血病前驅細胞。這些前驅細胞產生大量白血病胚細胞，它們在診斷和復發時在患者中易於檢測到，最終導致死亡。與快速分裂的促選殖形成前驅細胞相比，AML-LSC一般被報導為靜止細胞。

在AML的情況下，術語“ 復發 ”可以特別定義為AML在完全緩解後復發。在這個意義上，“ 完全緩解 ”或“ CR”可以定義如下：嗜中性粒細胞的正常值（＞ 1.0*10 ⁹/L）、10 g/dl的血紅素水平和血小板計數（＞ 100*10 ⁹/L）以及與紅細胞輸注無關；胚細胞少於5%，沒有胚細胞的簇或集合，並且在骨髓檢查中不存在Auer杆(Auer rods)；以及血細胞的正常成熟（形態學；骨髓細胞分類計數像）和不存在髓外白血病。

如本文所用，“ 骨髓增生異常症候群 ”（“ MDS”），以前稱為白血病前期，是涉及骨髓類血細胞的無效產生（或發育異常）的血液病症的集合。它們代表了一系列複製性造血幹細胞障礙，其特徵是進行性骨髓衰竭和進展為急性髓性白血病（“ AML”，也稱為“ 急性髓細胞性白血病”）的風險增加。國際預後評分系統（“ IPSS”）廣泛用於根據血細胞減少的嚴重程度、骨髓成髓細胞百分比和細胞遺傳學異常來鑒定具有高風險特徵的患者。

如本文所用，“ 醫藥上可接受的載劑 ”旨在包括與藥物投予、特別是腸胃外投予相容的任何和所有載劑（如任何溶劑、分散介質、塗層、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等）。此類介質和試劑用於藥物活性物質的用途是已知的。除非任何常規介質或試劑與活性化合物不相容，否則此類介質可用於本揭露的組合物中。例如，用於腸胃外投予的製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油以及可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。以非窮舉方式，醫藥上可接受的載劑包括但不限於0.01-0.1M（例如，0.05M）磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常見的腸胃外媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發油。靜脈內媒劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑（如基於林格氏右旋糖的那些）等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。更具體地，適合於注射使用的醫藥組合物包括無菌水溶液（在水溶的情況下）或分散液，以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在此類情況下，組合物必須是無菌的並且流動性應達到存在易注射性的程度。它應該在製造和儲存條件下穩定，並且在實施例中將抵抗微生物如細菌和真菌的污染作用而保存。載劑可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物。可以例如通過使用包衣（如卵磷脂），在分散體的情況下通過維持所需粒徑，以及通過使用表面活性劑，來維持適當的流動性。防止微生物的作用可以通過各種抗細菌和抗真菌劑（例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等）來實現。在某些實施例中，組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇（如甘露糖醇、山梨糖醇）或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中包括吸收延遲劑（例如，單硬脂酸鋁和明膠）來實現。

如本文所用，且除非另有指示，否則術語“ 至少一個 / 至少一種 ”可以涵蓋“ 一個或多個 / 一種或多種 ”，或甚至“ 兩個或更多個 / 兩種或更多種 ”（或“ 多個 / 多種 ”）。例如，其可以涵蓋1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或超過100。

如本文所用，且除非另有指示，否則術語“ 小於 ... ”可以涵蓋從0到相應閾值的所有值。例如，其可以涵蓋小於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或小於100（在適用時）。

如本文所用，術語“ 細胞 ”可以涵蓋任何原核細胞或真核細胞。特別考慮的細胞類型是那些適合於重組抗體或其片段或多肽鏈的產生和/或工程化的細胞類型。以非窮舉方式，此類細胞可以選自：細菌細胞、酵胚細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞。

術語“ 宿主細胞 ”、“ 宿主細胞株 ”和“ 宿主細胞培養物 ”可互換使用並且是指已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“ 轉化體”和“ 轉化細胞”，其包括初代轉化細胞和源自其的後代，不考慮傳代次數。後代在核酸含量上可能與親本細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括如在初始轉化細胞中所篩選或選擇，具有相同功能或生物活性的突變體後代。宿主細胞是可用於產生本揭露的結合蛋白的任何類型的細胞株統。因此宿主細胞可以包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，如CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、細菌細胞、酵胚細胞、昆蟲細胞和植物細胞，僅舉幾例。

“ 分離的 ”核酸分子或多核苷酸意圖是已從其天然環境中去除的核酸分子DNA或RNA。例如，出於本揭露的目的，載體中所含的編碼多肽的重組多核苷酸被認為是分離的。分離的多核苷酸的其他例子包括維持在異源宿主細胞中的重組多核苷酸或在溶液中的（部分或基本上）純化的多核苷酸。分離的多核苷酸包括在通常含有多核苷酸分子的細胞中所含的所述多核苷酸分子，但所述多核苷酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置。分離的RNA分子包括本揭露的體內或體外RNA轉錄物，以及正股和負股形式，以及雙股形式。根據本揭露的分離的多核苷酸或核酸進一步包括合成產生的此類分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調節元件，如活化子、核糖體結合位點或轉錄終止子。

術語“ 載體 ”或“ 表現載體 ”旨在意指可以通過其將核酸、特別是DNA或RNA序列（例如，外源基因）引入宿主細胞中，以轉化宿主並促進所引入序列的表現（例如，轉錄和轉譯）的媒劑。

II. 結合蛋白

在一個實施例中，本揭露涉及一種結合蛋白，其特徵在於其包含： (i) 包含特異性結合人CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人Fc-γ受體結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，所述結合蛋白的特徵在於其包含： (i) 第一抗原結合結構域（ABD），其包含與人CD123多肽特異性結合的可變區並且包含選自 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 12的至少一個CDR，或其具有一個或多個保守取代的變異體； (ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含與人NKp46多肽特異性結合的可變區，以及 (iii) 與人Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，本揭露涉及一種結合蛋白，其特徵在於其包含： (i) 包含特異性結合人CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD）， (ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含與人NKp46多肽特異性結合的可變區並包含選自 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 40的至少一個CDR，或其具有一個或多個保守取代的變異體；以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，所述結合蛋白的特徵在於其包含： (i) 第一抗原結合結構域（ABD），其包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區並且包含選自 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 12的至少一個CDR，或其具有一個或多個保守取代的變異體；以及(ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區並包含選自 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 40的至少一個CDR，或其具有一個或多個保守取代的變異體；以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，所述結合蛋白的特徵在於其包含： (i) 第一抗原結合結構域（ABD），其包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區並且包含選自 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 12的三個CDR，或其具有一個或多個保守取代的變異體；以及(ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區並包含選自 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 40的三個CDR，或其具有一個或多個保守取代的變異體，以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，所述結合蛋白的特徵在於其包含： (i) 第一抗原結合結構域（ABD），其包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區，並且包含免疫球蛋白重鏈可變區（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（分別為 CDR-1至CDR-3），以及(ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區，並且包含免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（分別為CDR-1至CDR-3），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，所述結合蛋白的特徵在於其包含： (i) 第一抗原結合結構域（ABD），其包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區，並且包含具有三個互補決定區（至少一個選自 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 6）的免疫球蛋白重鏈可變區（V _H），和具有三個互補決定區（至少一個選自 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 12）的免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L）； (ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區，並且包含具有三個互補決定區（至少一個選自 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 26）的免疫球蛋白重鏈可變區（V _H），和具有三個互補決定區（至少一個選自 SEQ ID NO: 27至 SEQ ID NO: 40）的免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L）；以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，所述結合蛋白的特徵在於其包含： (i) 第一抗原結合結構域（ABD），其包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區，並且包含具有三個互補決定區（至少兩個選自 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 6）的免疫球蛋白重鏈可變區（V _H），和具有三個互補決定區（至少兩個選自 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 12）的免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L）； (ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區，並且包含具有三個互補決定區（至少兩個選自 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 26）的免疫球蛋白重鏈可變區（V _H），和具有三個互補決定區（至少兩個選自 SEQ ID NO: 27至 SEQ ID NO: 40）的免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L）；以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，所述結合蛋白的特徵在於其包含： (i) 第一抗原結合結構域（ABD），其包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區，並且包含具有選自 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 6的三個互補決定區的免疫球蛋白重鏈可變區（V _H），和具有選自 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 12的三個互補決定區的免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L）； (ii) 第二抗原結合結構域（ABD），其包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區，並且包含具有選自 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 26的三個互補決定區的免疫球蛋白重鏈可變區（V _H），和具有選自 SEQ ID NO: 27至 SEQ ID NO: 40的三個互補決定區的免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L）；以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，結合蛋白的特徵在於第一ABD特異性結合人類CD123並且包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H），所述免疫球蛋白重鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第一ABD特異性結合人類CD123並且包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H），所述免疫球蛋白重鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H），所述免疫球蛋白重鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 16 至 SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H），所述免疫球蛋白重鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 19 至 SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H），所述免疫球蛋白重鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 22 至 SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H），所述免疫球蛋白重鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 16 、 SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 27 至 SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 30 至 SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 33 至 SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 36 至 SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3。

根據該第一一般目的的一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於第二ABD特異性結合人類NKp46並包含免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），所述免疫球蛋白輕鏈可變結構域包含分別對應於 SEQ ID NO: 39 、 SEQ ID NO: 31 和 SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3。

根據一個實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，以及 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16 至 SEQ ID NO: 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19 至 SEQ ID NO: 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22 至 SEQ ID NO: 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26的胺基酸序列；以及 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27 至 SEQ ID NO: 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30 至 SEQ ID NO: 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33 至 SEQ ID NO: 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36 至 SEQ ID NO: 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39 、 SEQ ID NO: 31 和 SEQ ID NO: 40的胺基酸序列；並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人類Fc-γ受體。

本領域技術人員容易理解，上述結合蛋白可以由一條單一的多肽鏈組成，也可以是多聚結合蛋白，並因此包含多條（兩條或更多條）多肽鏈。

根據一些具體實施例，結合蛋白是多聚結合蛋白，並且兩個抗原結合結構域可以至少部分地由不同的多肽鏈產生。

任選地，當結合蛋白包含多條多肽鏈（例如，兩條或三條多肽鏈）時，這些多肽鏈中的一些可以共價連接。當兩條多肽鏈共價連接時，一個或多個共價連接子可以有利地選自二硫鍵或任何其他共價連接子，包括橋接一條多肽鏈與另一條的一個或多個肽鍵和/或橋接一條多肽鏈與另一條的一個或多個連接子肽。

根據一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於其包含形成兩個ABD的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)： V _1A– C _1A– L ₃– (C _H2-C _H3) _A(I) V _1B– C _1B– L ₄– (C _H2-C _H3) _B– L ₁–V _2A– C _2A– L ₂(II) V _2B- C _2B(III) 其中： V _1A和V _1B形成結合對V ₁（V _H1/V _L1）； V _2A和V _2B形成結合對V ₂（V _H2/V _L2）； C _1A和C _1B形成對C ₁（C _H1/C _L），並且C _2A和C _2B形成對C ₂（C _H1/C _L），其中C _H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域； (C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）； L ₁、L ₂、L ₃、L ₄是可選的獨立胺基酸連接子，其可以是相同或不同的。

在一些實施例中，(C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B各自包含至少一個相同的C _H2結構域，如對應於 SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的C _H2結構域。

在一些實施例中，(C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且可以包含選自 SEQ ID NO: 69 或 SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的多肽序列。

在一些實施例中，L ₁、L ₂、L ₃和L ₄中的一些可以是相同的或不同的，並且可以包含選自 SEQ ID NO: 74至 SEQ ID NO: 79的胺基酸序列的全部或部分；例如，選自 SEQ ID NO: 74至 SEQ ID NO: 79的胺基酸序列的一個或超過四個連續胺基酸。

根據一些具體實施例，L ₁、L ₂、L ₃和L ₄中的一些可以是相同或不同的，並且可以包含免疫球蛋白鉸鏈區（如選自胺基酸序列 SEQ ID NO: 74 、 SEQ ID NO: 75 、 SEQ ID NO: 77 、 SEQ ID NO: 78和/或 SEQ ID NO: 79的免疫球蛋白鉸鏈區）的全部或部分；例如免疫球蛋白鉸鏈區（如選自胺基酸序列 SEQ ID NO: 74 、 SEQ ID NO: 75 、 SEQ ID NO: 77 、 SEQ ID NO: 78和/或 SEQ ID NO: 79的免疫球蛋白鉸鏈區）的四個或超過四個連續胺基酸。

根據一些更具體的實施例，L ₂、L ₃和L ₄可以是相同或不同的，並且可以包含免疫球蛋白鉸鏈區（如選自序列 SEQ ID NO: 74 、 SEQ ID NO: 75 、 SEQ ID NO: 77 、 SEQ ID NO: 78和/或 SEQ ID NO: 79的免疫球蛋白鉸鏈區）的全部或部分；例如，免疫球蛋白鉸鏈區（如選自序列 SEQ ID NO: 74 、 SEQ ID NO: 75 、 SEQ ID NO: 77 、 SEQ ID NO: 78和/或 SEQ ID NO: 79的免疫球蛋白鉸鏈區）的四個或超過四個連續胺基酸。

根據一些更具體的實施例，L ₂、L ₃和L ₄可以是相同或不同的，並且可以包含免疫球蛋白鉸鏈區（如選自序列 SEQ ID NO: 74 、 SEQ ID NO: 75 、 SEQ ID NO: 77 、 SEQ ID NO: 78和/或 SEQ ID NO: 79的免疫球蛋白鉸鏈區）的全部或部分（例如，免疫球蛋白鉸鏈區（如選自序列 SEQ ID NO: 74 、 SEQ ID NO: 75 、 SEQ ID NO: 77 、 SEQ ID NO: 78和/或 SEQ ID NO: 79的免疫球蛋白鉸鏈區）的四個或超過四個連續胺基酸），並且L ₁可以包含對應於 SEQ ID NO: 76的胺基酸序列的連接子的全部或部分。

根據一些具體實施例，結合蛋白的特徵在於其包含形成兩個ABD的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)，如下文所定義： V _1A– C _1A– L ₃– (C _H2-C _H3) _A(I) V _1B– C _1B– L ₄– (C _H2-C _H3) _B– L ₁– V _2A– C _2A– L ₂(II) V _2B- C _2B(III) 其中： V _1A和V _1B形成與人類CD123多肽特異性結合的結合對V ₁（V _H1/V _L1）； V _2A和V _2B形成與人類NKp46多肽特異性結合的結合對V ₂（V _H2/V _L2）； C _1A和C _1B形成對C ₁（C _H1/C _L），並且C _2A和C _2B形成對C ₂（C _H1/C _L），其中C _H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域； (C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）； L ₁、L ₂、L ₃、L ₄是可選的獨立胺基酸連接子，其可以是相同或不同的。

在一個實施例中，結合蛋白的特徵在於其包含形成兩個ABD的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)，如下文所定義： V _1A- C _1A- 鉸鏈 ₁- (C _H2-C _H3) _A(I) V _1B- C _1B- 鉸鏈 ₂- (C _H2-C _H3) _B- L ₁- V _2A- C _2A- 鉸鏈 ₃(II) V _2B- C _2B(III) 其中： V _1A和V _1B形成結合對V ₁（V _H1/V _L1）； V _2A和V _2B形成結合對V ₂（V _H2/V _L2）； C _1A和C _1B形成對C ₁（C _H1/C _L），並且C _2A和C _2B形成對C ₂（C _H1/C _L），其中C _H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；鉸鏈 ₁、鉸鏈 ₂和鉸鏈 ₃是相同或不同的，並且對應於免疫球蛋白鉸鏈區的全部或部分； (C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）； L ₁是胺基酸連接子。

在一個實施例中，結合蛋白的特徵在於其包含形成兩個ABD的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)，如下文所定義： V _1A- C _1A- 鉸鏈 ₁- (C _H2-C _H3) _A(I) V _1B- C _1B- 鉸鏈 ₂- (C _H2-C _H3) _B- L ₁- V _2A- C _2A- 鉸鏈 ₃(II) V _2B- C _2B(III) 其中： V _1A和V _1B形成與人類CD123多肽特異性結合的結合對V ₁（V _H1/V _L1）； V _2A和V _2B形成與人類NKp46多肽特異性結合的結合對V ₂（V _H2/V _L2）； C _1A和C _1B形成對C ₁（C _H1/C _L），並且C _2A和C _2B形成對C ₂（C _H1/C _L），其中C _H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；鉸鏈 ₁、鉸鏈 ₂和鉸鏈 ₃是相同或不同的，並且對應於免疫球蛋白鉸鏈區的全部或部分； (C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）； L ₁是胺基酸連接子。

在結合蛋白的一些實施例中，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： C _1A包含C _L結構域； C _1B包含C _H1結構域； C _2A包含C _H1結構域； C _2B包含C _L結構域。

在結合蛋白的一些實施例中，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： C _1A包含C _H1結構域； C _1B包含C _L結構域； C _2A包含C _L結構域； C _2B包含C _H1結構域。

根據結合蛋白的那些具體實施例中的一些，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： C _1A包含C _H1結構域； C _1B包含C _L結構域； C _2A包含C _H1結構域； C _2B包含C _L結構域。

根據結合蛋白的那些具體實施例中的一些，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： C _1A包含C _L結構域； C _1B包含C _H1結構域； C _2A包含C _L結構域； C _2B包含C _H1結構域。

在一些實施例中，形成C _1A、C _1B、C _2A和C _2B的C _L和C _H1結構域可以是相同或不同的。因此，在結合蛋白的一些實施例中，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： - C _1A和C _2A是相同的並且包含C _L結構域；或者- C _1A和C _2B是相同的並且包含C _L結構域；或者- C _1B和C _2A是相同的並且包含C _L結構域；或者- C _1B和C _2B是相同的並且包含C _L結構域。

在結合蛋白的一些實施例中，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： - C _1A和C _2A是相同的並且包含C _H1結構域；或者- C _1A和C _2B是相同的並且包含C _H1結構域；或者- C _1B和C _2A是相同的並且包含C _H1結構域；或者- C _1B和C _2B是相同的並且包含C _H1結構域。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _1A是V _H並且V _1B是V _L。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _1A是V _L並且V _1B是V _H。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _2A是V _H並且V _2B是V _L。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _2A是V _L並且V _2B是V _H。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _1A是V _H並且V _1B是V _L；並且V _2A是V _H並且V _2B是V _L。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _1A是V _L並且V _1B是VH；並且V _2A是V _H並且V _2B是V _L。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _1A是V _H並且V _1B是V _L；並且V _2A是V _L並且V _2B是V _H。

在多肽鏈(I)、(II)和(III)的一些實施例中：V _1A是V _L並且V _1B是V _H；並且V _2A是V _L並且V _2B是V _H。

在結合蛋白的一些實施例中，V _1A是V _L1並且V _1B是V _H1；並且V _2A是V _H2並且V _2B是V _L2。

在結合蛋白的一些實施例中，V _1A是V _L1並且V _1B是V _H1。

在結合蛋白的一些實施例中，V _2A是V _H2並且V _2B是V _L2。

在結合蛋白的一些實施例中，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： C _1B是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（C _H1）； C _2A是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（C _H1）； C _L對應於免疫球蛋白κ輕鏈恒定結構域（C _κ）； (C _H2-C _H3) _A對應於 SEQ ID NO: 69的胺基酸序列； (C _H2-C _H3) _B對應於 SEQ ID NO: 70的胺基酸序列； L ₂或鉸鏈 ₁對應於 SEQ ID NO: 74的胺基酸序列； L ₃或鉸鏈 ₂對應於 SEQ ID NO: 75的胺基酸序列； L ₄或鉸鏈 ₃對應於 SEQ ID NO: 77的胺基酸序列； L ₁對應於 SEQ ID NO: 76的胺基酸序列。

在結合蛋白的一些實施例中，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於： C _1B是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（C _H1）； C _2A是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（C _H1）； C _L對應於免疫球蛋白κ輕鏈恒定結構域（C _κ）； (C _H2-C _H3) _A對應於 SEQ ID NO: 69的胺基酸序列； (C _H2-C _H3) _B對應於 SEQ ID NO: 70的胺基酸序列；鉸鏈 ₁對應於 SEQ ID NO: 74的胺基酸序列；鉸鏈 ₂對應於 SEQ ID NO: 75的胺基酸序列；鉸鏈 ₃對應於 SEQ ID NO: 77的胺基酸序列； L ₁對應於 SEQ ID NO: 76的胺基酸序列。

在結合蛋白的一些實施例中： (a) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO:9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的CDR-L3； (b) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR-L3； (c) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR-L3； (d) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO:9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR-L3； (e) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 39的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR-L3； (f) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO:12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的CDR-L3； (g) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR-L3； (h) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR-L3； (i) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO:12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR-L3； (j) V _H1包含含有 SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V _L1包含含有 SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V _H2包含含有 SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有 SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的CDR-H2；含有 SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的CDR-H3；V _L2包含含有 SEQ ID NO: 39的胺基酸序列的CDR-L1；含有 SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有 SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR-L3。

在結合蛋白的一些實施例中： (a) V _H1和V _L1分別對應於 SEQ ID NO: 41和 43的胺基酸序列，或者分別對應於 SEQ ID NO: 42和 44的胺基酸序列；和/或 (b) V _H2和V _L2對應於分別 SEQ ID NO: 45和 53的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 46和 54的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 47和 55的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 48和 56的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 49和 57的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 50和 58的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 51和 59的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 52和 60的胺基酸序列。

在結合蛋白的一些實施例中： (a) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 45的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 53的胺基酸序列； (b) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 46的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 54的胺基酸序列； (c) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 47的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 55的胺基酸序列； (d) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 48的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 56的胺基酸序列； (e) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 49的胺基酸序列；VL ₂包含 SEQ ID NO: 57的胺基酸序列； (f) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 50的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 58的胺基酸序列； (g) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 51的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 59的胺基酸序列； (h) V _H1包含 SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 52的胺基酸序列；VL ₂包含 SEQ ID NO: 60的胺基酸序列； (i) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 45的胺基酸序列；VL ₂包含 SEQ ID NO: 53的胺基酸序列； (j) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 46的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 54的胺基酸序列； (k) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 47的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 55的胺基酸序列； (l) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 48的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 56的胺基酸序列； (m) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 49的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 57的胺基酸序列； (n) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 50的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 58的胺基酸序列。 (o) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 51的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 59的胺基酸序列； (p) V _H1包含 SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V _L1包含 SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V _H2包含 SEQ ID NO: 52的胺基酸序列；V _L2包含 SEQ ID NO: 60的胺基酸序列。

在一些實施例中，結合蛋白包含通過至少一個二硫橋連接的至少兩條多肽鏈。

在結合蛋白的一些實施例中，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於：多肽鏈(I)與多肽鏈(II)共價連接，特別是通過一個或多個二硫鍵與多肽(II)共價連接。

根據結合蛋白的那些具體實施例中的一些，多肽鏈(I)、(II)和(III)的特徵在於：多肽鏈(II)通過一個或多個二硫鍵與多肽鏈(III)共價連接。

在一些實施例中，多肽鏈(I)和(II)通過C _1A與鉸鏈 ₂之間的至少一個二硫橋來連接和/或其中多肽鏈(II)和(III)通過鉸鏈 ₃與C _2B之間的至少一個二硫橋來連接。

在一些實施例中，結合蛋白的特徵在於，與人類Fc-γ受體多肽結合的Fc區或其變異體（例如(C _H2-C _H3) _A或(C _H2-C _H3) _B或鉸鏈 ₁– (C _H2-C _H3) _A或鉸鏈 ₂– (C _H2-C _H3) _B）包含C _H2重鏈恒定結構域，所述結構域根據EU編號在殘基N297處具有N-連接醣基化。

在一些實施例中，結合蛋白的特徵在於，根據EU編號，Fc區或其變異體的殘基N297包含N-連接醣基化。

在一些實施例中，結合蛋白的特徵在於，Fc區或其變異體的全部或部分與人類Fc-γ受體多肽結合。在一些實施例中，結合蛋白的特徵在於，Fc區或其變異體的全部或部分與人CD16A（FcγRIII）多肽結合。

在一個實施例中，結合蛋白包含： - 含有 SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的多肽，或其具有至少80%序列同一性的變異體；或者- 含有 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽，或其具有至少80%序列同一性的變異體；和 / 或- 含有 SEQ ID NO: 61或 64的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 62或 65的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 63或 66的胺基酸序列的多肽，或其具有至少80%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含： - 含有胺基酸序列 SEQ ID NO: 61的多肽、含有胺基酸序列 SEQ ID NO: 62的多肽以及含有胺基酸序列 SEQ ID NO: 63的多肽，或其具有至少80%序列同一性的變異體；或者- 含有 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽，或其具有至少80%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的多肽、含有序列 SEQ ID NO: 62的多肽以及含有 SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的多肽，或其具有至少80%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽，或其具有至少80%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的多肽，或其具有至少90%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽，或其具有至少90%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的多肽、含有 SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的多肽以及含有 SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的多肽，或其具有至少95%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽，含有 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽，以及含有 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽，或其具有至少95%序列同一性的變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的多肽(I)、含有 SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的多肽(II)以及含有 SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的多肽(III)。

在一些實施例中，結合蛋白包含： - 由 SEQ ID NO: 61的胺基酸序列組成的多肽(I)； - 由 SEQ ID NO: 62的胺基酸序列組成的多肽(II)；以及 - 由 SEQ ID NO: 63的胺基酸序列組成的多肽(III)。

在一些實施例中，結合蛋白包含：含有 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽(I)、含有 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽(II)以及含有 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽(III)。

在一些實施例中，結合蛋白包含： - 由 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列組成的多肽(I)； - 由 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列組成的多肽(II)；以及 - 由 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列組成的多肽(III)。

在那些實施例的一些變異體中，結合蛋白包含源自免疫球蛋白鏈（特別是IgG類型免疫球蛋白）的多肽序列，和/或選自 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 79中任一項的胺基酸序列，其可以因此包括具有保守取代的任何變異體序列，和/或具有與參考序列的一定程度的序列同一性百分比的任何變異體；尤其是源自免疫球蛋白鏈的參考序列。

在一些實施例中，結合蛋白包含源自IgG類型、特別是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4類型、優選地IgG1類型的免疫球蛋白鏈的多肽序列。

當本文考慮Fc和恒定區的變異體以及來自可變區的非CDR多肽序列時，它們可以由具有與參考多肽序列至少80%序列同一性的Fc和恒定區以及非CDR多肽序列組成；更特別地，具有與參考多肽序列至少90%的序列同一性；並且優選地具有與參考多肽序列至少95%的序列同一性。

可替代地，當多肽序列的變異體包括CDR多肽序列（例如，來自VH或VL結構域之一的CDR1、CDR2和CDR3）時，本文中將理解那些變異體在其CDR多肽序列上沒有修飾。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 67 至 73的胺基酸序列至少80%的序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 67 至 73的胺基酸序列至少90%的序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 67 至 73的胺基酸序列至少95%的序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 69 至 73的胺基酸序列至少80%的序列同一性的Fc區或其變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 69 至 73的胺基酸序列至少90%的序列同一性的Fc區或其變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 69 至 73的胺基酸序列至少95%的序列同一性的Fc區或其變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 69或 70的胺基酸序列具體至少80%的序列同一性的C _H2-C _H3結構域的Fc區或其變異體；或者可替代地包含具有與 SEQ ID NO: 71的胺基酸序列具有至少80%的序列同一性的C _H2結構域的Fc區或其變異體；或者可替代地包含具有與 SEQ ID NO: 72或 73的胺基酸序列具有至少80%的序列同一性的C _H3結構域的Fc區或其變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 69 或 70的胺基酸序列具有至少90%的序列同一性的C _H2-C _H3結構域的Fc區或其變異體；或者可替代地包含具有與胺基酸序列 SEQ ID NO: 71具有至少90%的序列同一性的C _H2結構域的Fc區或其變異體；或者可替代地包含具有與 SEQ ID NO: 72 或 73的胺基酸序列具有至少90%的序列同一性的C _H3結構域的Fc區或其變異體。

在一些實施例中，結合蛋白包含具有與選自 SEQ ID NO: 69 或 70的胺基酸序列具有至少95%的序列同一性的C _H2-C _H3結構域的Fc區或其變異體；或者可替代地包含具有與 SEQ ID NO: 71的胺基酸序列具有至少95%的序列同一性的C _H2結構域的Fc區或其變異體；或者可替代地包含具有與 SEQ ID NO: 72 或 73的胺基酸序列具有至少95%的序列同一性的C _H3結構域的Fc區或其變異體。

優選地，本揭露的多特異性結合蛋白是雙特異性結合蛋白。

本揭露進一步涉及一種醫藥組合物，其包含如上文所定義的結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種醫藥組合物，其包含結合蛋白和醫藥上可接受的載劑，所述結合蛋白包含： (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白片段可結晶（Fc）區或其變異體的全部或部分。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種醫藥組合物，其包含上文所定義的結合蛋白和醫藥上可接受的載劑，所述結合蛋白包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；並且 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分針對人類Fc-γ受體。

優選地，根據本揭露的結合蛋白及其醫藥組合物是無菌的並且適合腸胃外使用。

III. 醫學應用

所公開的結合蛋白及其組合物特別適合用作藥物。本文進一步公開了用於製備此類藥物的方法和用途。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含： (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白片段可結晶（Fc）區的全部或部分；所述結合蛋白用作藥物。

根據該第三一般目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含： (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白片段可結晶（Fc）區的全部或部分；所述結合蛋白用於治療或預防癌症的方法中。

根據該第三一般目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含： (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白片段可結晶（Fc）區的全部或部分；所述結合蛋白用於治療或預防血癌的方法中。

根據該第三一般目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含： (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白片段可結晶（Fc）區的全部或部分；所述結合蛋白用於治療或預防骨髓增生異常症候群（MDS）或淋巴組織增生性障礙的方法中。

根據該第三一般目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含： (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白片段可結晶（Fc）區的全部或部分；所述結合蛋白用於治療或預防急性髓性白血病（AML）的方法中。

根據該第三一般目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含： (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白片段可結晶（Fc）區的全部或部分；所述結合蛋白用於治療或預防CD64陽性和CD64陰性急性髓性白血病（AML）的方法中。

在一些實施例中，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；並且 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人類Fc-γ受體；所述結合蛋白用作藥物。

在一些實施例中，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變結構域（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；並且 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人類Fc-γ受體；所述結合蛋白用於治療或預防癌症的方法中。

根據該第三主要目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變區（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；並且 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人類Fc-γ受體；所述結合蛋白用於治療或預防血癌的方法中。

根據該第三主要目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變區（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；並且 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人Fc-γ受體；所述結合蛋白用於治療或預防骨髓增生異常症候群（MDS）或淋巴組織增生性障礙的方法中。

根據該第三主要目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變區（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於胺基酸序列 SEQ ID NO: 7至 9或分別對應於胺基酸序列 SEQ ID NO: 10至 12的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；並且 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人類Fc-γ受體；所述結合蛋白用於治療或預防急性髓性白血病（AML）的方法中。

根據該第三主要目的的一些具體實施例，本揭露涉及一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變區（V _H）和免疫球蛋白輕鏈可變區（V _L），其中每個V _H和V _L包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - V _H1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 1至 3的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 4至 6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - V _L1，其包含分別對應於 SEQ ID NO: 7至 9的胺基酸序列或分別對應於 SEQ ID NO: 10至 12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - V _H2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；並且 - V _L2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39、 31和 40的胺基酸序列；並且其中免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人類Fc-γ受體；所述結合蛋白用於治療或預防CD64陽性和CD64陰性急性髓性白血病（AML）的方法中。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白用於藥物製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白作為藥物的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防癌症的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防特徵為在表面表現CD123的腫瘤細胞的癌症的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防特徵為在表面表現CD123和CD64的腫瘤細胞的癌症的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防血癌的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防特徵為在表面表現CD123的腫瘤細胞的血癌的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防特徵為在表面表現CD123和CD64的腫瘤細胞的血癌的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防骨髓增生異常症候群（MDS）或淋巴組織增生性障礙的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防急性髓性白血病（AML）的藥物的製備中的用途。

本揭露還涉及上文提及的結合蛋白在用於治療或預防CD64陽性和CD64陰性急性髓性白血病（AML）的藥物的製備中的用途。

在一個方面，提供了一種用於治療癌症的方法，所述癌症的特徵在於在表面表現CD123和CD64的腫瘤細胞，所述方法包括向患有這種癌症的個體投予結合蛋白，所述結合蛋白包含：(i) 包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一個方面，提供了一種用於治療個體的表現CD123的腫瘤（例如血液惡性腫瘤，AML）的方法，所述個體對具有在表面表現CD64的腫瘤細胞敏感，所述方法包括向所述個體投予結合蛋白，所述結合蛋白包含：(i) 包含與人類CD123多肽特異性結合的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一個方面，提供了一種用於治療個體的血液惡性腫瘤（例如AML）的方法，所述方法包括向個體投予結合蛋白，所述結合蛋白包含：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 結合人類Fc-γ受體多肽的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在另一個方面，提供了一種治療個體的血液惡性腫瘤（例如AML）的方法，所述方法包括：(a) 評估或確定來自所述個體的惡性細胞（例如AML細胞）是否在其表面表現CD64；以及 (b) 如果確定所述個體具有在其表面（例如，以預定水平）表現CD64的惡性細胞（例如，AML細胞），則向所述個體投予結合蛋白，所述結合蛋白包含：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 結合人類Fc-γ受體多肽的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在另一個方面，提供了一種用於消耗個體中的惡性細胞和/或將NK細胞介導的細胞毒性定向至表現CD64的惡性細胞（例如，患有AML的個體）的方法，所述方法包括向具有在表面表現CD64的惡性細胞（例如AML細胞）的個體投予結合蛋白，所述結合蛋白包含：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在另一個方面，提供了一種使NK細胞消除表現CD123和CD64二者的惡性細胞的方法，所述方法包括在NK細胞存在的情況下使所述惡性細胞（例如AML細胞）與結合蛋白接觸，所述結合蛋白包含：(i) 包含與人類CD123多肽結合的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含與人類NKp46多肽結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的Fc區或其變異體的全部或部分。

評估惡性細胞（例如，AML細胞）的CD64表現，例如在其表面的表現，可以通過任何合適的方法來進行。通常，可以獲得並評估來自個體、例如來自血液樣品或合適的活組織檢查的生物樣品，並且可以使用諸如以下的測定來確定腫瘤細胞中CD64的表現：免疫組織化學（IHC）測定、螢光活化細胞分選（FACS）測定，例如定量FACS、ELISA、免疫墨點法（例如，西方墨點法、斑點墨點法或細胞內西方墨點法）以及其他免疫測定。用於此類測定的抗CD64抗體在本領域中是可獲得的。

IV. 用於製備結合蛋白的手段

本文進一步公開了用於在體外製備本揭露的結合蛋白的手段。如本文所用，“ 本揭露的結合蛋白 ”是指多功能結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述第一ABD特異性結合人類CD123並且所述第二ABD特異性結合人類NKp46，並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分針對人類Fc-γ受體。其還是指在整個揭露中描述的所述結合蛋白的所有具體實施例。

更特別地，所提供的手段可以涉及結合蛋白的製備，所述結合蛋白包含第一和第二抗原結合結構域（ABD）和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域（VH）和免疫球蛋白輕鏈可變結構域（VL），其中每個VH和VL包含三個互補決定區（CDR-1至CDR-3）；並且其中： (i) 所述第一ABD與人類CD123特異性結合並且包含： - VH1，其包含分別對應於SEQ ID NO: 1至3的胺基酸序列或分別對應於SEQ ID NO: 4至6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和 - VL1，其包含分別對應於SEQ ID NO: 7至9的胺基酸序列或分別對應於SEQ ID NO: 10至12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3； (ii) 所述第二ABD與人類NKp46特異性結合並且包含： - VH2，其包含對應於以下的CDR-H1、2和3：分別 SEQ ID NO: 13至 15的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 16至 18的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 19至 21的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 22至 24的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 16 、 25和 26的胺基酸序列；以及 - VL2，其包含對應於以下的CDR-L1、2和3：分別 SEQ ID NO: 27至 29的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 30至 32的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 33至 35的胺基酸序列；分別 SEQ ID NO: 36至 38的胺基酸序列；或者分別 SEQ ID NO: 39 、 31和 40的胺基酸序列；並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人類Fc-γ受體。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的核酸分子，其包含編碼本揭露的結合蛋白的核苷酸序列。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種表現載體，其包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼本揭露的結合蛋白的核苷酸序列。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的細胞，其包含本揭露的核酸分子。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種分離的細胞，其包含本揭露的表現載體。

根據具體實施例，所述細胞是真核細胞，特別是昆蟲細胞或哺乳動物細胞。在一個實施例中，所述細胞是哺乳動物細胞並且所述表現載體是哺乳動物表現載體。

因此，在一個實施例中，本揭露涉及一種用於製備本揭露的結合蛋白的方法，所述方法包括製備結合蛋白的步驟，所述結合蛋白包含 (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 結合人類Fc-γ受體多肽的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合表現 一種或多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述重組多肽包含(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），和 / 或(ii) 包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），和 / 或(iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分； (b)任選地回收表現的一種或多種重組多肽。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合表現 一種或多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述重組多肽包含(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），和(ii) 包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），和(iii) 與人Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分； (b)任選地回收表現的一種或多種重組多肽。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），和(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），和(iii)與人類FC-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分； (b)任選地回收表現的重組多肽。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 包含 SEQ ID NO: 61或 64的胺基酸序列的多肽，和(ii) 包含 SEQ ID NO: 62或 65的胺基酸序列的多肽，和(iii) 包含 SEQ ID NO: 63或 66的胺基酸序列的多肽； (b)任選地回收表現的重組多肽。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 包含 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽，和(ii) 包含 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽，和(iii) 包含 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽； (b)任選地回收表現的重組多肽。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合 共表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 包含 SEQ ID NO: 61或 64的胺基酸序列的多肽，和(ii) 包含 SEQ ID NO: 62或 65的胺基酸序列的多肽，和(iii) 包含 SEQ ID NO: 63或 66的胺基酸序列的多肽； (b)任選地回收共表現的重組多肽。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合 共表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含(i) 包含 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的多肽，和(ii) 包含 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的多肽，和(iii) 包含 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的多肽； (b)任選地回收表現的重組多肽。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合 表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 第一多肽鏈(I)、(ii) 第二多肽鏈(II)和 (iii) 第三多肽(III)，它們形成兩個抗原結合結構域（ABD），一個ABD特異性結合人類CD123多肽，並且另一個ABD特異性結合人類NKp46多肽；其特徵在於所述三條多肽鏈(I)、(II)和(III)由以下組成： V _1A– C _1A– L ₃– (C _H2-C _H3) _A(I) V _1B– C _1B– L ₄– (C _H2-C _H3) _B– L ₁– V _2A– C _2A– L ₂(II) V _2B- C _2B(III) 其中： V _1A和V _1B形成結合對V ₁（V _H1/V _L1）； V _2A和V _2B形成結合對V ₂（V _H2/V _L2）； C _1A和C _1B形成對C ₁（C _H1/C _L），並且C _2A和C _2B形成對C ₂（C _H1/C _L），其中C _H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域； (C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）； L ₁、L ₂、L ₃、L ₄是可選的獨立胺基酸連接子，其可以是相同或不同的； (b)任選地回收表現的多肽鏈(I)、(II)和(III)。

根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適於 共表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 第一多肽鏈(I)、(ii) 第二多肽鏈(II)和、(iii) 第三多肽(III)，它們形成兩個抗原結合結構域（ABD），一個ABD特異性結合人類CD123多肽，並且另一個ABD特異性結合人類NKp46多肽；其特徵在於所述三條多肽鏈(I)、(II)和(III)由以下組成： V _1A– C _1A– L ₃– (C _H2-C _H3) _A(I) V _1B– C _1B– L ₄– (C _H2-C _H3) _B– L ₁– V _2A– C _2A– L ₂(II) V _2B- C _2B(III) 其中： V _1A和V _1B形成結合對V ₁（V _H1/V _L1）； V _2A和V _2B形成結合對V ₂（V _H2/V _L2）； C _1A和C _1B形成對C ₁（C _H1/C _L），並且C _2A和C _2B形成對C ₂（C _H1/C _L），其中C _H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域； (C _H2-C _H3) _A和(C _H2-C _H3) _B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（C _H2）和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（C _H3）； L ₁、L ₂、L ₃、L ₄是可選的獨立胺基酸連接子，其可以是相同或不同的； (b)任選地回收 共表現的多肽鏈(I)、(II)和(III)。

因此，根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 包含 SEQ ID NO: 61或 64的胺基酸序列的第一多肽鏈(I)，(ii) 包含 SEQ ID NO: 62或 65的胺基酸序列的第二多肽鏈(II)，以及 (iii) 包含 SEQ ID NO: 63或 66的胺基酸序列的第三多肽鏈(III)； (b)任選地回收表現的多肽鏈(I)、(II)和(III)。

因此，根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)在適合 共表現多種重組多肽的條件下培養一個或多個宿主細胞，所述多種包含 (i) 包含 SEQ ID NO: 61或 64的胺基酸序列的第一多肽鏈(I)，(ii) 包含 SEQ ID NO: 62或 65的胺基酸序列的第二多肽鏈(II)，以及 (iii) 包含 SEQ ID NO: 63或 66的胺基酸序列的第三多肽鏈(III)； (b)任選地回收共表現的多肽鏈(I)、(II)和(III)。

用於製備本揭露的結合蛋白的方法，例如上文所定義的那些，可以進一步包括向一個或多個宿主細胞提供編碼所述結合蛋白的全部或一個或多個部分的核酸、特別是分離的核酸（即，重組核酸）的先前步驟。特別地，這樣的步驟可以包括用編碼所述結合蛋白的全部或一個或多個部分的核酸、特別是分離的核酸轉染所述一個或多個宿主細胞，或由其組成。

因此，根據一些具體實施例，本揭露涉及一種用於製備結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a)向一個或多個宿主細胞提供編碼所述結合蛋白的全部或一個或多個部分的核酸； (b)在適合表現 一種或多種重組多肽的條件下培養所述一個或多個宿主細胞，所述重組多肽包含 (i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），和 / 或(ii) 包含與人類NKp46多肽特異性結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），和 / 或(iii) 與人類Fc-γ受體多肽結合的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分； (c)任選地回收表現的一種或多種重組多肽。

在一個實施例中，用於製備本揭露的結合蛋白的方法包括以下步驟： (a)提供編碼第一多肽鏈(I)、第二多肽鏈(II)和第三多肽鏈(III)的一種或多種核酸； (b)用所述一種或多種核酸轉染一個或多個宿主細胞； (c)在適合表現（或共表現）所述一條或多條多肽鏈的條件下培養所述一個或多個宿主細胞；以及 (d)任選地回收表現的（或共表現的）一條或多條多肽鏈(I)、(II)和(III)。

在一個實施例中，用於製備本揭露的結合蛋白的方法包括以下步驟： (a)提供一種或多種核酸，其編碼包含 SEQ ID NO: 61或 64的胺基酸序列的第一多肽鏈(I)、包含 SEQ ID NO: 62或 65的胺基酸序列的第二多肽鏈(II)以及包含 SEQ ID NO: 63或 66的胺基酸序列的第三多肽鏈(III)； (b)用所述一種或多種核酸轉染一個或多個宿主細胞； (c)在適合表現（或共表現）所述一條或多條多肽鏈的條件下培養所述一個或多個宿主細胞；以及 (d)任選地回收表現的（或共表現的）一條或多條多肽鏈(I)、(II)和(III)。

在一些具體實施例中，製備本揭露的結合蛋白的方法包括： (a)提供編碼根據 SEQ ID NO: 61或 64的任何胺基酸序列的第一多肽鏈的第一核酸、編碼根據 SEQ ID NO: 62或 65的任何胺基酸序列的第二多肽的第二核酸以及編碼根據 SEQ ID NO: 63或 66的任何胺基酸序列的第三多肽鏈的第三核酸；以及 (b)在一個或多個宿主細胞中表現所述第一、第二和第三核酸以產生分別包含所述第一、第二和第三多肽鏈的結合蛋白； (c)任選地將產生的蛋白質載入到親和純化支持物、任選地蛋白A支持物上，並回收所述結合蛋白。

因此，本領域技術人員將容易地理解，這種製備本揭露的結合蛋白的方法可以涵蓋上文提及的多肽、多肽鏈和/或區域（例如可變區和Fc區或其變異體）的一些或全部在一個或多個宿主細胞內的產生和組裝，作為體外產生方法的一部分。

可替代地，所述方法可以涵蓋上文提及的多肽、多肽鏈和/或區域的一些或全部在一個或多個宿主細胞內的產生，及其在一個或多個宿主細胞外的組裝。因此可以同時或依次實現使所述多肽、多肽鏈和/或區域接觸的步驟。

根據一些實施例，一個或多個所述區域可以存在於一個或多個不同的多肽鏈或其片段中。

作為參考，本文在實例章節中描述的結合蛋白的“ F25 ”形式具有四個預測的鏈間二硫橋： - 一個二硫橋將多肽(I)的CL結構域內的半胱胺酸與多肽鏈(II)的鉸鏈區內的第一半胱胺酸相連接； - 兩個二硫橋將多肽鏈(I)和(II)的鉸鏈區內的兩個半胱胺酸相連接； - 一個二硫橋將多肽鏈(III)的CL結構域處的C末端半胱胺酸與多肽鏈 (II)上的C末端半胱胺酸相連接。

在一些實施例中，本揭露涉及一種用於製備本揭露的結合蛋白的方法，所述方法包括使以下接觸的步驟：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自由 SEQ ID NO: 1 至 12組成的胺基酸序列組的至少一個互補決定區（CDR），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自由 SEQ ID NO: 13 至 40組成的胺基酸序列組的至少一個互補決定區（CDR），以及 (iii) 結合人類Fc-γ受體多肽、尤其結合人CD16a Fc-γ受體多肽的Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，本揭露涉及一種用於製備本揭露的結合蛋白的方法，所述方法包括使以下接觸的步驟：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自 SEQ ID NO: 1 至 6組成的胺基酸序列組的至少一個互補決定區（CDR）和選自由 SEQ ID NO: 7 至 12組成的胺基酸序列組的至少一個互補決定區（CDR），(ii) 包含適合與人類NKp46多肽特異性結合的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自由 SEQ ID NO: 13 至 26組成的胺基酸序列組的至少一個互補決定區（CDR）和選自由 SEQ ID NO: 27 至 40組成的胺基酸序列組的至少一個互補決定區（CDR），以及 (iii) 結合人類Fc-γ受體多肽、尤其結合人類CD16a Fc-γ受體多肽的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，本揭露涉及一種用於製備本揭露的結合蛋白的方法，所述方法包括使以下接觸的步驟：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自由 SEQ ID NO: 1 至 6組成的胺基酸序列組的至少兩個互補決定區（CDR）和選自由 SEQ ID NO: 7 至 12組成的胺基酸序列組的至少兩個互補決定區（CDR），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自由 SEQ ID NO: 13 至 26組成的胺基酸序列組的至少兩個互補決定區（CDR）和選自由 SEQ ID NO: 27 至 40組成的胺基酸序列組的至少兩個互補決定區（CDR），以及 (iii) 結合人Fc-γ受體多肽、尤其結合人類CD16 Fc-γ受體多肽的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，本揭露涉及一種用於製備與本揭露相關的結合蛋白的方法，所述方法包括使以下接觸的步驟：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自由 SEQ ID NO: 1 至 6組成的胺基酸序列組的三個互補決定區（CDR）和選自由 SEQ ID NO: 7 至 12組成的胺基酸序列組的三個互補決定區（CDR），(ii) 包含特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），所述可變區包含選自由 SEQ ID NO: 13 至 26組成的胺基酸序列組的三個互補決定區（CDR）和選自由 SEQ ID NO: 27 至 40組成的胺基酸序列組的三個互補決定區（CDR），以及 (iii) 結合人類Fc-γ受體多肽，尤其結合人類CD16 Fc-γ受體多肽的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分。

在一些實施例中，本揭露涉及一種用於製備與本揭露相關的結合蛋白的方法，所述方法包括使以下接觸的步驟：(i) 包含特異性結合人類CD123多肽的可變區的第一抗原結合結構域（ABD），(ii) 包含適合特異性結合人類NKp46多肽的可變區的第二抗原結合結構域（ABD），以及 (iii) 結合人類Fc-γ受體多肽、尤其結合人類CD16 Fc-γ受體多肽的免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分；其特徵在於，使所述區域接觸的步驟包括使選自胺基酸序列 SEQ ID NO: 61至 66的多條多肽鏈接觸。

上文提及的一個或多個抗原結合結構域和免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分可以通過重組方式，在分離的細胞或細胞群中，特別是在真核細胞中，並且優選地在哺乳動物或昆蟲細胞中，在體外表現。最優選地，表現系統涉及哺乳動物細胞。

根據替代實施例，上文提及的一個或多個抗原結合結構域和Fc區或其變異體的部分可以在第一分離細胞群中表現，而上文提及的一個或多個抗原結合結構域和Fc區或其變異體的其他部分可以在第二分離細胞群中表現。

根據替代實施例，上文提及的一個或多個抗原結合結構域和免疫球蛋白Fc區或其變異體的所有部分可以在同一分離細胞群中表現，然後回收，從而在回收步驟期間或結束時使其發生接觸。

因此，用於製備結合蛋白的方法可以包括以下步驟： (a) 在分離的細胞或細胞群中，最優選在哺乳動物細胞中表現所述第一抗原結合結構域和 / 或所述第二抗原結合結構域和 / 或所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分中的至少一個； (b) 回收所述第一抗原結合結構域和/或所述第二抗原結合結構域和/或所述Fc區或其變異體的全部或部分。

根據所述優選實施例之一，本揭露涉及一種用於製備與本揭露相關的結合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 在分離的細胞或細胞群中，最優選在哺乳動物細胞中表現所述第一抗原結合結構域和 / 或所述第二抗原結合結構域和 / 或所述Fc區或其變異體的全部或部分中的至少一個； (b) 回收所述第一抗原結合結構域和/或所述第二抗原結合結構域和/或所述Fc區或其變異體的全部或部分； (c) 使所述第一抗原結合結構域和 / 或所述第二抗原結合結構域和 / 或所述Fc區或其變異體的全部或部分接觸，步驟(b)和步驟(c)是同時或依次實現。

優選地，用於製備結合蛋白的方法包括以下步驟： (a) 在分離的細胞中表現所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域和所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分； (b) 回收所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域和所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分； (c) 使所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域和所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分接觸，步驟(b)和步驟(c)是同時或依次實現。

有利地，當所述第一抗原結合結構域和所述第二抗原結合結構域和所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分是在相同的分離的細胞或細胞群和/或其相同的細胞培養物中表現時，可以在回收步驟期間使其接觸，從而製備結合蛋白。

可替代地，當所述第一抗原結合結構域和 / 或所述第二抗原結合結構域和 / 或所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分是在不同的分離細胞或細胞群中表現時，可以在回收步驟之後使其接觸。

回收步驟可以由本領域已知的任何方法組成。以非窮舉方式，帶有一個或多個抗原結合結構域和Fc區或其變異體的全部或部分的所表現多肽(例如，表現的一條或多條多肽鏈)的回收可以包括以下步驟：(b1)回收分離的細胞或其細胞培養物，(b2)任選地對分離的細胞或其細胞培養物進行離心、深度過濾、膜過濾、超濾和/或滲濾。

序列表

根據標準用法和慣例，在本文使用的蛋白質序列記法中，左手方向是胺基末端方向(“N末端”或“N-term”)，並且右手方向是羧基末端方向(“C末端”或“C-term”)。

實例

材料與方法

A.1. 通過 EXPI-293F ^TM 細胞的暫態轉染進行的 NKp46-CD123 NKCE 表現 .

將編碼本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白的每條多肽鏈的序列插入pTT-5載體中HindIII與BamHI限制性位點之間。在PEI（37ºC、5% CO2、150rpm)存在下，使用三種載體(製成無內毒素的中量製劑(midiprep))共轉染EXPI-293F細胞(Life Technologies)。使用所述細胞以1 x 106個細胞/ml的密度接種培養瓶(EXPI293培養基，Gibco)。作為參考，對於NKp46-CD123_F25結合蛋白，我們使用的DNA比率為0.1μg/ml(多肽鏈I)、0.4μg/ml(多肽鏈II)或0.8μg/ml(多肽鏈III)。添加丙戊酸(終濃度0.5mM)、葡萄糖(4g/L)和胰腖N1(0.5%)。六天后收集上清液並使其通過具有0.22μm孔的Stericup過濾器。

A.2.NKCE的純化.

在收穫後使用rProtein A Sepharose快流(GE Healthcare，參考17-1279-03)從上清液純化本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白。然後在Na₂HPO₄/KH₂PO₄ 50mM pH 6.2磷酸鹽緩衝液中透析樣品後進行陽離子交換層析(CIEX)純化。在注射至來自GE Healthcare的兩個“串聯”柱HiTrap SP-HP 1mL(參考17-1151-01)之前，在0.22μm專職上過濾樣品。起始緩衝液和溶析緩衝液分別為Na₂HPO₄/KH₂PO₄ 50mM pH 6.2和Na₂HPO₄/KH₂PO₄ 25mM pH 6.2；1M氯化鈉。在100CV上使用0%到50%的線性梯度(溶析緩衝液)進行溶析。最終在4℃在攪拌下針對PBS1X將目的峰透析過夜。

A.3.生物樣品

健康的人膚色血球層由Etablissement Français du Sang(EFS，馬賽市；AC-2019-3428)提供。通過使用Ficoll密度梯度離心從膚色血球層分離外周單個核細胞(PBMC)。通過使用來自StemCell或Miltenyi的基於珠的陰性選擇套組從PBMC純化人NK細胞。

來自患者的急性髓性白血病(AML)樣品由Institut Paoli-Calmettes(馬賽市，SA-IPH-MImAbs Contract)提供。

A.4.細胞株

表現CD123的急性髓性白血病(AML)細胞株：MOLM-13和THP-1購自ATCC。將細胞在完全RPMI培養基(含有10% FBS、2mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉和非必需胺基酸1X的RPMI-1640)中培養。在用於THP-1細胞的培養基中添加25mM HEPES。

THP-1 CD64KO和THP-1 CD32KO細胞是用CRISPR/Cas核酸內切酶產生的。將THP-1細胞在RPMI-1640(10%SVF、2mM L-Glu、1mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需胺基酸)中培養。為了產生CD64缺陷型THP-1細胞，用兩種sgRNA(CD64.1：CUUGAGGUGUCAUGCGUGGA(SEQ ID NO：80)；CD64.2：AAGCAUCGCUACACAUCAGC(SEQ ID NO：81；Synthego)以1：9的CAS9：sgRNA比率(Alt-R^TM S.p.Cas9核酸酶3NLS，Integrated DNA Technology)對2,5.106個細胞進行核轉染(Neon Transfection System，100ul尖端，1700V，20ms，1次脈衝)。通過流式細胞術監測CD64表現的缺乏，並對細胞進行分選或亞選殖。

為了產生CD32剔除(KO)THP-1細胞，用一對sgRNA(CD32A：AUGUAUGUCCCAGAAACCUG(SEQ ID NO：105)；CD32B：AAGCAUAUGACCCCAAGGCU(SEQ ID NO：106)(Integrated DNA Technologies))以1：9的CAS9：sgRNA比率(Alt-R^TM S.p.Cas9核酸酶3NLS，Integrated DNA Technology)對2.5.10⁶個細胞進行核轉染(Neon Transfection System，100μL尖端，1700V，20ms，1次脈衝)。僅對THP-1 CD32KO細胞進行細胞分選。細胞分選後，通過流式細胞術監測CD32表現的缺乏。

A.5.基於NK細胞的細胞毒性測定

向靶細胞載入⁵¹Cr(對於MOLM-13、THP-1或THP-1 CD64KO、THP-1 CD32KO細胞)或鈣黃綠素AM(Life technologies，參考：C3100MP或等效物)(對於來自患者樣品的AML胚細胞)。將測試的抗體、標記的靶細胞和來自健康供體的新鮮或靜置過夜的人NK細胞依次添加於圓底96孔板的每個孔中，以獲得10：1(E：T)比率。共培育4h後，將上清液轉移到Lumaplate中(對於⁵¹Cr)或平底培養板中(對於鈣黃綠素AM)。

對於基於⁵¹Cr的細胞毒性測定，從死靶細胞釋放的⁵¹Cr是使用TopCountNXT^TM(微孔板閃爍和發光計數器；Perkin Elmer)進行定量。放射性是通過在60s期間計數每個孔的γ發射來測量，並且這些結果表示為cpm=每分鐘計數。

對於基於鈣黃綠素的細胞毒性測定，從死靶細胞釋放的鈣黃綠素AM是通過用Luminoter(EnSpire®多模式讀板器(Perkinelmer)：在λ=495nm激發後在λ=516nm下的螢光發射)測量相對螢光單位(RFU)進行定量。

對於分析，使用下式計算特異性裂解百分比：

其中ER=實驗釋放，SR=自發釋放，並且MR=最大釋放

每種抗體的EC₅₀是通過使用Graphpad Prism軟體繪製適當的非線性回歸曲線(“log(促效劑)相對反應-可變斜率(四個參數)”模型的選擇)來確定。

對AML細胞進行表型分析

通過流式細胞術使用以下來控制源自患者血液的AML樣品上和AML細胞株上CD32、CD64和CD123的表現：抗人類CD33-BB515(BD Biosciences 564588選殖WM53)、抗人類CD45-Viogreen(Miltenyi 130-096-906選殖5B1)、抗人類CD123-AF647(BD Biosciences 563599選殖9F5)、抗人類CD32-PE(Beckman Coulter IM1935選殖2E1)、抗人類CD64-PE(Beckman Coulter IM3601U選殖22)、抗人類CD123-PE(Biolegend 306006選殖6H6)以及同源同種型對照抗體mIgG1-PE(IC-1；BD Biosciences 555749選殖MOPC-21)和mIgG2a-PE(IC-2a；Beckman Coulter A09142選殖7T4-1F5)。將靶細胞用在染色緩衝液(SB)中以1/10e稀釋的正常小鼠血清飽和，然後與偶聯至染料的抗體混合。在染色後30分鐘期間，將細胞固定在以1/10e稀釋於H2O中的BD Cellfix中，並用FACS Canto II通過流式細胞術進行分析。記錄FSC-A、FSC-H、SSC-A、SSC-H、FL2-A、FL4-A和FL7-A或FSC-A、FSC-H、SSC-A、SSC-H、FL1-A、FL2-A、FL3-A、FL5-A和FL8-A(用於源自患者血液的AML樣品)參數，並用FlowJo軟體進行分析。表型分析結果顯示於圖6A、圖6B和圖14B中。

A.6.使用AML樣品的NK細胞脫粒測定

為了如圖7中測試NK細胞活化，在圓底96孔板的每個孔中依次添加測試抗體、AML胚細胞和源自AML患者的自體NK細胞。在與本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白共培育過夜後，在每個孔中添加抗人類CD107a和CD107b抗體持續4小時。然後用以下混合物洗滌細胞並染色：活力標記、APC 偶聯的抗人類CD45、BB515偶聯的抗人類CD33、PeCy7偶聯的抗人類CD56、BV510偶聯的抗人類CD3抗體。然後將細胞洗滌、固定並通過流式細胞術進行分析。通過使用Flowjo軟體分析獲得的資料，以經由在被鑒定為活CD45⁺CD33^-CD56⁺CD3^-細胞的NK細胞上的CD107表現來分析NK細胞脫粒。

為了如圖17中測試經由NKp46-CD123_F25結合蛋白針對MOLM-13細胞的NK細胞活化和細胞因子/趨化因子產生，使用以下抗體標記進行流式細胞術分析：CD69、CD107a/b、IFNα、TNFα、MIP1β。

首先，在漸增濃度的NKp46-CD123_F25或對照(NKp46-IC_F25和無抗體)的存在下，將來自三名單獨供體的純化的初代人類NK細胞與或不與MOLM-13細胞以1：1比率(以50,000個細胞/孔接種；U形底96孔板)在37℃共培育4小時。同時，在每孔中將BD GolgiSTOP^TM以1/6000的最終稀釋度添加到實驗和對照樣品。通過使用按孔添加於50,000個靜息NK細胞上的最終125ng/mL的PMA和最終1μg/mL的IONO來進行NK細胞活化的正控制(資料未顯示)。

4小時培育後，將細胞在染色緩衝液(含有0.2% BSA、2mM EDTA和0.02%迭氮化鈉的PBS)中洗滌，並用以下細胞外抗體混合物根據製造商推薦的培育和稀釋比率進行染色：抗人類CD3-Pacific Blue、抗人類CD56-Pe-Vio770、抗人類CD69-FITC、抗人類CD107a(LAMP-1)-APC、抗人類CD107b-APC。在固定和透化步驟後，使用以下細胞內抗體混合物進行細胞內染色：抗人類IFNγ-BV605、抗人類TNFα-BUV395和抗人MIP1β-PE。為了消除聚集體，將抗體混合物在4℃以16,000g離心10min，洗滌並重懸於樣品緩衝液中。

在測量FSC-A、FSC-H、SSC-A、SSC-H、FL-1、FL-3、FL-6、FL-7、FL-9、FL-13和FL-16參數的配備有BD FACSDiva採集軟體的LSR Fortessa^TM X-20 上進行流式細胞術。所有資料均使用FlowJo軟體進行分析。

使用GraphPad prism進行NK細胞樣品的標記百分比。活化值的頂部對應於觀察到的最大活化。半最大有效濃度(EC₅₀)值是使用對應於以下等式的4參數邏輯非線性回歸模型來計算：

計算的活化底部、計算的活化頂部、斜率和95%信賴區間(CI)值是與EC₅₀使用相同的模型來計算。

針對每種活化標記(CD69、CD107a/b)、細胞因子(IFNα、TNFα)和趨化因子(MIP1β)計算這些參數。

A.7.人重組蛋白、選殖、產生和純化(SPR)

將編碼人NKp46細胞外結構域(ECD)的序列(Gln22-Asn255，NCBI參考：NM_004829.5)插入SLX192載體(Selexis)中HindIII與XbaI限制性位點之間。添加C末端6xHis標籤(SEQ ID NO：107)用於純化。使用以下引物用於對人PBMC的PCR：5' TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTCTTCCACACTCCCTGC 3'(SEQ ID NO：82)和5' CCGCCCCGACTCTAGATCAATGGTGATGGTGGTGATGATTCTGGGCAGTGTGATCCC 3'(SEQ ID NO：83)。檢查擴增子的序列。然後使用所述載體轉染CHO細胞株並選擇產生所述蛋白質的選殖。用Ni-NTA珠(Qiagen，#1018244)從培養上清液純化所述蛋白質，並進行S200尺寸排阻層析法以確保在用表面等離子共振(SPR)表徵結合動力學之前消除聚集體。重組人NKp46衍生的多肽序列在本文中報告為SEQ ID NO：84；其包括NKp46的細胞外結構域的部分。

將編碼食蟹猴NKp46的ECD的序列(Gln17-Asn254，NP_001271509.1)選殖至SLX192載體中HindIII與XbaI限制性位點之間。添加C末端Flag-M2標籤用於純化。用於擴增來自食蟹猴PBMC的預期序列的引物是：5' TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTCTTCCACACTCCGTGC 3'(SEQ ID NO：89)和5' CCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCATTCTGGGCAGTGTGGTCC 3'(SEQ ID NO：90)。序列驗證後，使用所述載體轉染CHO-K1SV細胞株並選擇產生細胞選殖。重組食蟹猴NKp46-FlagM2蛋白序列在本文中報告為SEQ ID NO：85；其包括NKp46的細胞外結構域的部分(GenBank編號：CAC41080.1)。前三批(150602CCe第1批、150618CCe第2批和150715CCe第3批)是通過M2親和層析來純化。將珠與含有重組蛋白的上清液一起培育過夜。然後用PBS1X洗滌珠，並用在PBS1X中150ng/μl的溶析肽進行溶析。然後針對PBS1X透析所述蛋白質。後續批次(161003CDe第1批和161116CDe第2批)是根據製造商的說明書(GE Healthcare，#20381，批次QB213815)通過將抗NKp46抗體HUX1-M-H46-17E1與AminoLink偶聯樹脂偶聯通過親和層析來純化。然後將珠與含有重組蛋白的上清液一起培育過夜。然後用PBS1X洗滌珠並使用甘胺酸0.1M pH2.5進行溶析。然後將蛋白質針對TBS緩衝液pH7.5進行透析並濃縮，以在Superdex 200 Increase 10/300 GL柱上進行製備型尺寸排阻層析。

進一步使用來自ACRO Biosystems的重組人CD123(目錄號ILA-H52H6)、重組人FcγRIIIA/CD16a(V176)(Biotechne，目錄號4325-FC)和重組人FcγRIIIA/CD16a(V176F)(Biotechne，目錄號8894-FC)。

A.8.用於通過表面等離子共振確定多特異性結合蛋白的抗原結合特性的分析程序.

Biacore T200儀器(Cytiva，烏普薩拉，目錄號28975001)與S系列CM5感測器晶片(Cytiva，烏普薩拉，目錄號29149603)一起使用。

對於使用NKp46和CD123的結合動力學測量，通過將100mL 10x HBS-EP+緩衝液與900mL純化水混合來製備HBS-EP+緩衝液(Cytiva，烏普薩拉，目錄號BR1006-69)。使用人類抗體捕獲套組(Cytiva，烏普薩拉，目錄號BR1008-39)實現雙特異性Ab樣品的親和捕獲。將抗Fc捕獲抗體1：20稀釋於運行緩衝液中，並使用胺偶聯套組(Cytiva)，烏普薩拉，目錄號BR-100-50)使用標準胺偶聯來偶聯至CM5晶片(Cytiva，烏普薩拉，目錄號29149603)，以產生大約8000個反應單位(RU)。將人NKp46(Innate Pharma)或人類CD123(ACRO Biosystems)在HBS-EP+測定緩衝液中的七個連續1：1稀釋液製備為1.56nmol/L、3.13nmol/L、6.25nmol/L、12.5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L的濃度。將雙特異性抗體用HBS-EP+緩衝液稀釋至0.06μg/mL的濃度，並以此濃度用於實驗中。將抗體以10μL/min的流速捕獲90sec以產生大約30RU的最大反應(Rmax)值。在兩種抗原的多循環動力學實驗中進行測量。在每個多循環實驗中，通過固定在系列S CM5感測器晶片(人類抗體捕獲套組，Cytiva，烏普薩拉，目錄號BR1008-39)上的抗人類Fc抗體來捕獲抗體。將稀釋到HBS-EP+緩衝液中的人類和食蟹猴NKp46(Innate Pharma)或人類CD123(ACRO Biosystems)以1.56nmol/L至100nmol/L的1：1稀釋系列以30μL/min的流速注射240秒，然後是1200秒的解離期。所有分析物濃度與多個緩衝液空白一起以二重複運行以進行雙重參考。用再生溶液(3mol/L MgCl₂)以30μL/min進行捕獲表面的再生持續60秒。對於所有其他抗體，使用具有質量輸送限制(mass transport limitation)的1：1結合模型，用Biacore T200評價軟體3.0版(Cytiva，烏普薩拉)評價結合動力學資料。

對於使用CD16a的結合親和力測量，通過將100mL 10x HBS-EP+緩衝液與900mL純化水混合來製備HBS-EP+緩衝液(Cytiva，烏普薩拉，目錄號BR1006-69)。使用His捕獲套組(Cytiva，烏普薩拉，目錄號28995056)實現人類CD16a蛋白的親和捕獲。將抗His捕獲抗體以1：20稀釋於運行緩衝液中，並且使用胺偶聯套組(Cytiva，烏普薩拉，目錄號BR-100-50)使用標準胺偶聯偶聯至CM5晶片(Cytiva，烏普薩拉，目錄號29149603)，以產生大約8000個反應單位(RU)。將雙特異性抗體在HBS-EP+測定緩衝液中的十個連續1：1稀釋液製備為5.8nmol/L、11.7nmol/L、23.4nmol/L、46.8nmol/L、93.75nmol/L、187.5nmol/L、375nmol/L、750nmol/L、1500nmol/L和3000nmol/L的濃度。將CD16a(V/F)蛋白用HBS-EP+緩衝液稀釋至0.1ng/mL的濃度，並以此濃度用於實驗中。將CD16a(V176)和CD16a(V176F)分別在流動池2和4上以10μL/min的流速捕獲30秒，以產生大約30RU的最大反應(Rmax)值。在多循環動力學實驗中進行測量。在每個多循環實驗中，通過固定在系列S CM5感測器晶片(人抗體捕獲套組，Cytiva，烏普薩拉，目錄號BR1008-39)上的抗His抗體來捕獲CD16a。將稀釋到HBS-EP+緩衝液中的雙特異性抗體以5.8nmol/L至3000nmol/L的1：1稀釋系列以30μL/min的流速注射120秒，然後是120秒的解離期。所有分析物濃度與多個緩衝液空白一起以二重複運行以進行雙重參考。通過再生溶液(10mmol/L甘胺酸pH 1.5)的兩次連續注射，以30μL/min進行捕獲表面的再生持續30秒。對於所測量抗體濃度使用SPR反應的穩態擬合使用Biacore T200評價軟體3.0版 (Cytiva，烏普薩拉)來評價雙特異性抗體對人CD16a的結合親和力(KD值)。

A.9.針對在SCID小鼠注射的MOLM-13人AML的抗腫瘤活性.

在移植有播散性人類MOLM-13細胞的重症聯合免疫缺陷(SCID)小鼠中評價NKp46-CD123_F25的鼠替代形式muNKp46-huCD123_F25的功效。該替代物對於靶向NKp46蛋白的臂與NKp46-CD123_F25不同(因為它靶向鼠蛋白而不是人類蛋白)，並且對於其他臂與NKp46-CD123_F25類似(人類CD123結合臂和能夠結合所有活化鼠FcγR、募集鼠效應細胞並用鼠NK細胞誘導ADCC的人IgG1勝任Fc結構域)。

將muNKp46-huCD123_F25活性與能夠結合鼠FcγR並募集鼠效應細胞的抗CD123 ADCC增強抗體(參考1)進行比較。也將muNKp46-huCD123_F25活性與結合muNKp46和鼠FcγR但不結合huCD123的的同種型對照(muNKp46-IC)進行比較。

在第0天向小鼠靜脈內接種腫瘤細胞(5x10⁶)。在腫瘤植入後第1天通過腹膜內途徑投予治療。

在第一實驗中(圖8)，在腫瘤植入後第1天在4個組中隨機化小鼠(在治療組中，n=10隻小鼠，並且在對照組中，n=20隻小鼠)。在第1天內-腸胃外(intra-parenteral)投予後以0.5、0.25和0.05mg/kg投予muNKp46-huCD123_F25。

在第二實驗中(圖18)，以0.5mg/kg投予muNKp46-IC。以5、0.5、0.25和0.05mg/kg投予muNKp46-huCD123_F25和參考1。不治療對照組。

在第三實驗中(圖19)，將小鼠隨機化為4個組(未治療對照組；未治療對照組+抗去唾液酸GM1；NKCE對照；或NKCE+抗去唾液酸GM1)。在腫瘤植入前一天(第-1天)以及腫瘤植入後第5天，實驗組接受NK細胞消耗抗體抗去唾液酸GM1。在腫瘤植入後第1天以0.5mg/kg的單一劑量腹膜內投予治療(媒劑或NKCE)。NKCE包括NKp46-CD123_F25、muNKp46-IC、同種型對照抗體結合huCD123和鼠FCγRS，但不是小鼠NKp46(IC-huCD123)。

檢查小鼠並記錄不良臨床反應。每天稱重單獨小鼠直至實驗結束(第70天)。根據預定標準，在小鼠變得垂死時將其安樂死，以避免動物痛苦。認為關鍵的與病理學相關的臨床病兆是肢體癱瘓、腹水、可觸及的內部腫瘤塊、病態或者大於或等於20%的體重減輕。

主要功效終點是以天計的中值存活時間(MST)、壽命增加百分比(%ILS)和長期存活率。

報告每隻小鼠的死亡(如果發生的話)的單獨日期。確定每組的MST，並且計算比率ILS並表示為百分比：%ILS=100x(T-C)/C

其中T=治療組的MST並且C=對照組的MST。

出於該實例的目的，當%ILS優於25%時，認為劑量是治療活性的，並且當%ILS優於50%時，認為劑量是高活性的(Johnson JI,Decker S,Zaharevitz D,Rubinstein LV,Venditti JM,Schepartz S,Kalyandrug S等人Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.Br.J.Cancer.2001年5月；84(10)：1424-31)。

長期存活率被定義為存活持續時間大於或等於對照組MST的2倍的小鼠數量除以組中小鼠的總數量，以百分比來表示。

A.10.在非人靈長類動物(NHP)中的抗腫瘤活性

合格的流式細胞術面板用於評價食蟹猴血液樣品、嗜鹼性粒細胞的表型分析和計數以及總CD123免疫細胞。所述面板由針對以下抗原的抗體構成：CD45(選殖D058-1283)、CD14(選殖REA599)、CD203c(選殖NP4D6)、CD193(選殖5E8)、IgE(選殖REA1049)、CD123(選殖CD123)、CD33(選殖AC104.3E3)以及活力標記Zombie Nir(Biolegend 423106)。將收集至3K-EDTA抗凝空氣真空採樣中的100μL全血樣品與裂解溶液(Biocytex CP025)一起培育10分鐘，然後在室溫下用DPBS(Sigma D8537)以300g離心5min。將重懸的細胞在室溫下用抗體和活力標記染色10min。進行離心的第三步驟以消除非固定抗體。將細胞重懸至250μL固定液(Biocytex CP026)中並在室溫下培育一小時。將100μL流式計數珠(Beckman A91346)添加至細胞管中，並在配備有3個雷射器和10種顏色的Gallios Beckman coulter儀器上採集。

A.11.對CD123+正常血細胞的體外作用和在人類外周血單個核細胞(PBMC)中的相關細胞因子釋放

將來自人類健康供體(N=10)的PBMC接種於96孔U形底板(超低結合Costar ref#CLS7007)中的190μL完全培養基中(500,000個細胞/孔)，並在37℃在5% CO2的存在下與CD123-NKCE、IC-NKCE對照和CD123-TCE分子的連續稀釋液一起培育20小時。通過流式細胞術分析定義為TCRαβ陰性、CD14陰性且IgE受體陽性活細胞的嗜鹼性粒細胞群，並通過中尺度發現(MSD)測定來分析上清液中釋放的細胞因子絕對濃度。

流式細胞術測定

將細胞沉澱懸浮在冷的50μL包括1μL人類FcR封閉試劑(Miltenyi Ref#130-059-901)的染色緩衝液(AutoMACS運行緩衝液Miltenyi Ref#130-091-221)中。根據供應商的建議，將PBMC子集特異性標記抗體和活力試劑的混合物添加到PBMC懸浮液中。作為螢光減一(FMO)對照，通過用其中每種標記抗體被其相應同種型對照替代的相同混合物標記PBMC來進行其他點。將具有混合抗體的細胞在4℃在暗中培育1小時。然後，將細胞懸浮液在4℃在5分鐘期間以300g離心兩次，棄去上清液並在每次離心之間添加200μL染色緩衝液。使用MACSQuant®分析儀、Miltenyi流式細胞儀分析細胞。使用VenturiOne®軟體(AppliedCytometry inc.)進行對從流式細胞儀匯出的原始資料(fcs檔)的分析。從前向散射/側向散射點圖對群體進行門控，在碘化丙啶活負門上對單細胞和其他活細胞進行門控。門是根據FMO控制設置的。

細胞因子MSD測定

根據購買者的建議，收集細胞上清液並稀釋於MSD緩衝液中。將稀釋的樣品或預稀釋的多分析物校準品樣品添加到套組中提供的預塗板中。添加與電化學發光標記(MSD SULFO-TAG)綴合的檢測抗體的溶液後，將板在室溫下培育2小時。然後，添加MSD緩衝液，其為電化學發光(ECL)創造適當的化學環境，並將板載入到MSD儀器中，在所述儀器中，向板電極施加電壓引起所捕獲的標記發光。所述儀器測量所發射光的強度並提供樣品中每種分析物的定量測量。

使用Excel軟體進行對從MSD儀器匯出的原始資料的分析。通過回擬合到用具有1/Y2加權的4參數邏輯模型建立的校準曲線，從ECL信號確定IL-6、IL-1b、IFNγ和TNFα的濃度。

A.12.在非人靈長類動物(NHP)血漿中的細胞因子釋放確定

開發並驗證了使用中尺度(MSD)促炎面板1(NHP)套組(ref.K15056D)的ECLIA(電化學發光測定)方法，以對猴K₃-EDTA血漿中的IL-2、IFN-γ、IL-6和IL-10進行定量。它是一種定量夾心酶免疫測定法，使用固定在工作電極表面的抗人類IL-2、IL-6、IL10和IFN-γ抗體以及釕抗人類IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ抗體。將50.0μL稀釋樣品分配到塗有人抗人類IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ抗體的96微孔板的孔中。在室溫下的過夜培育期和3個洗滌步驟後，添加25.0μL的sulfotag綴合的抗人類IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ抗體。在3個洗滌步驟後，添加150μL讀取緩衝液(2X)，為電化學發光創造適當的化學環境。所述儀器測量所發射光的強度，以提供樣品中分析物的定量測量。以二重複進行分析。

在非人靈長類動物中的藥代動力學和藥效學研究

用於投予的CD123-NKCE溶液是通過將儲備溶液稀釋於媒劑中來臨時製備，並在投予前和投予期間保持在室溫。為了避免吸附，使用聚丙烯、聚碳酸酯或PETG容器進行稀釋，並且在使用前用含有100ppm PS80的0.9% NaCl溶液塗布這些容器。通過用含有100ppm的PS80的0.9% NaCl溶液連續沖洗來塗布用於每次靜脈內用劑的管路(注射器/翼型針頭)。

分別地，對於以0.1mg/kg/投予用劑的雄性，將動物標識為M1和M2，對於以0.1mg/kg/投予用劑的雌性，標識為F3和F4，對於以3mg/kg/投予用劑的雄性，標識為M5和M6，並且對於以0.1mg/kg/投予用劑的雌性，標識為F7和F8。在第1、8、15和22天進行用劑。在最後一次(第4次)投予後一週(第29天)且直至4週(第50天)，評估潛在延遲發作的毒性和/或潛在毒性的可逆性。在第29天將M2、F4、M6和F8安樂死並進行屍檢。

評價每隻被治療動物的參數：

-在血液中

在測試前(劑量前)

第1天，在開始輸注後1.5、5、24、72小時

第8天，在開始輸注後24小時

第15天，在開始輸注後1.5和24小時

第22天，在開始輸注後24小時

第29天(在最後一次投予後1週；所有動物)

第50天(在最後一次投予後4週；恢復動物)。

-在骨髓中

測試前(劑量前)

第9天

第29天(在最後一次投予後1週；所有動物)

第50天(在最後一次投予後4週；恢復動物)

從肱靜脈或隱靜脈抽取血液樣品(連續採樣)至K3-EDTA聚丙烯管中。將血液樣品置於濕冰上並離心。將獲得的血漿樣品在其分析前在-80℃冷凍。使用專用的免疫測定方法在血漿中確定CD123-NKCE濃度，在所述方法中CD123-NKCE是通過生物素偶聯的CD123重組蛋白來捕獲，並通過猴吸收的alexa-山羊抗人類IgG來揭示，其定量下限(LLOQ)值為0.250ng/mL。

結果

B.1.NKp46-CD123_F25結合蛋白

F25形式或其變異體顯示於圖1和圖2中，並且包含三條多肽鏈。NKp46-CD123_F25結合蛋白包含三條多肽鏈，分別包括人CD123結合結構域和人NKp46結合結構域，包括包含多肽序列SEQ ID NO：1、2、3、7、8、9和SEQ ID NO：13、14、15、27、28、29的高變區。

每條多肽鏈(I、II和III)用在組裝前在細胞內被切割的信號(或“前導”)序列來表現。

第一多肽鏈(或“多肽鏈(I)”或“片段I”或“片段1”)從N末端至C末端包含對應於SEQ ID NO：43的胺基序列的V_L(CD123結合)結構域、源自人IgG1的天然C_K(或Cκ)結構域、修飾的人類IgG1鉸鏈區(“DKTHTCPPCP”(SEQ ID NO：74))，其中殘基D(根據EU編號的位置)連接至人C_K結構域的C末端半胱胺酸。Fc區域或其變異體進一步源自包含C_H2-C_H3結構域的天然人類IgG1抗體。在細胞外與具有天然半胱胺酸的第二多肽鏈(“鏈II”)潛在地形成二硫橋。

第二多肽鏈(“多肽鏈(II)”或“片段II”或“片段2”)從N末端至C末端包含對應於SEQ ID NO：41的胺基序列的V_H(CD123結合)結構域、源自人類IgG1的天然C_H1結構域、未修飾的人類IgG1鉸鏈區(“EPKSCDKTHTCPPCP”(SEQ ID NO：75))、和源自人類IgG1的包括C_H2-C_H3結構域的Fc區或其變異體(其中C_H3結構域的最後一個殘基被去除且由小型四胺基酸“STGS”連接子(SEQ ID NO：76)替代)、對應於SEQ ID NO：45的胺基序列的V_H(NKp46結合)結構域、與第一多肽鏈的C_H1結構域相同的第二天然C_H1結構域以及來自人類IgG1的C末端鉸鏈序列。

第三多肽鏈(“多肽鏈(III)”或“片段III”或“片段3”)包含對應於SEQ ID NO：53的胺基序列的V_L(NKp46結合)結構域和以半胱胺酸結尾的C_K結構域。

本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白的Fc部分的C _H2結構域在位置N297發生醣基化，以確保與CD16（FcγR）的結合。

總的來說，NKp46-CD123_F25結合蛋白包含四個預測的鏈間二硫橋： (i) 將第一多肽鏈的C末端C _K半胱胺酸連接至第二多肽鏈的第一鉸鏈半胱胺酸的一個二硫橋； (ii) 與第一和第二多肽鏈的鉸鏈區的兩個半胱胺酸形成的二硫橋； (iii) 將第二多肽鏈的最後一個C末端半胱胺酸連接至第二多肽鏈的C末端C _H1結構域的一個二硫橋。

章節B3至B11中顯示的與體外、離體和體內活性以及安全性概況相關的結果是用本揭露的包含多肽(I)、(II)和(III)的NKp46-CD123_F25結合蛋白來獲得；其中所述多肽(I)由 SEQ ID NO: 64的胺基酸序列組成，所述多肽(II)由 SEQ ID NO: 65的胺基酸序列組成，並且所述多肽(III)由 SEQ ID NO: 66的胺基酸序列組成。

B.3. 通過 SPR 對與人類 Fc-γ 受體結合的 NKp46-CD123_F25 結合蛋白構建體的表徵

通過SPR測試NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25），以確認其對一組人類Fcγ受體（包括CD64和CD16a受體的兩種變異體）的親和力。

Kd （ nM ）	hFcγR1 hCD64*	hFcγR3a-V hCD16a-V	hFcγR3a-F hCD16a-F
NKp46-CD123_F25	6.9	462	2606

人類CD16a-V受體或CD16a ^V是指包含CD16人類受體的片段的多肽構建體，所述片段與天然抗體的Fc區結合，介導抗體依賴性細胞毒性，並在位置158上帶有擷胺酸（V），其在文獻中也被報導為同種異型CD16a V158。

人類CD16a-F受體或CD16a ^F是指包含CD16人類受體的片段的多肽構建體，所述片段與天然抗體的Fc區結合，介導抗體依賴性細胞毒性，並在位置158上帶有苯丙胺酸（F），其在文獻中也被報導為同種異型CD16a F158。

本實驗的結論是，構成NKp46-CD123_F25的恒定區保留其對多種人類Fc-γ受體（包括人類CD16和人類CD64）的親和力。

B.4. 通過 SPR 對與 NKp46 和 CD123 結合的 NKp46-CD123_F25 結合蛋白的表徵

用NKp46的人和猴形式進行相同的實驗。結果總結在下文的兩個表中（表1和表2）。

表 1

NKp46	人（ hNKp46 ）	猴（ CynoNKp46 ）
	k _a（1/Ms）	k _d（1/S）	K _D（nM）	k _a（1/Ms）	k _d（1/S）	K _D（nM）
NKp46-CD123_F25	5.38E+04	9.43E-04	17.5	3.64E+04	2.47E-03	67.9

表 2

CD123	人（ hCD123 ）	猴（ CynoCD123 ）
	k _a（1/Ms）	k _d（1/S）	K _D（nM）	k _a（1/Ms）	k _d（1/S）	K _D（nM）
NKp46-CD123_F25	1.19E+05	2.85E-05	0.24	1.83E+05	5.29E-05	0.29

本實驗的結論是，與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）保留對NKp46和CD123靶標的親和力，這同時適用於人和猴亞型。

B.5. NKp46-CD123_F25 結合蛋白誘導 AML 細胞毒性

圖 4報告針對MOLM-13 AML細胞的體外細胞毒性（圖 4A）。針對離體患者胚細胞樣品再現與靶細胞相同的實驗（圖 4B）。評估隨實驗中測試的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）的濃度而變化的細胞毒性。

總體而言，實驗表明，NKp46-CD123_F25負責體外和離體測試樣品二者中的劑量依賴性細胞毒性。對於相似的濃度，所觀察的細胞毒性也高於用對NKp46沒有特異性的ADCC增強的抗CD123抗體（參考1）觀察到的細胞毒性。相反，僅結合NKp46的F25形式的陰性對照變異體（NKp46-IC_F25）在測試條件下顯示幾乎沒有細胞毒性。因此，所述實驗支持Fc勝任構建體（F25）中對CD123和NKp46二者的雙重結合的協同效應，從而導致針對CD123陽性腫瘤細胞的細胞毒性。

圖 5提供了基於EC ₅₀的關於MOLM-13細胞株的資料。使用NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）時觀察到體外細胞毒性的改善（轉化為EC ₅₀的降低）。相比之下，在殘基297上缺乏N-醣基化的 F6對照（NKp46-CD123_F6）提供了降低的細胞毒性，因為它通過僅接合NKp46而非CD16a來活化NK細胞。因此，此第二實驗提供了通過NKp46和CD16a NK細胞標記的結合和活化觀察到的協同效應的證據。

因此，在針對CD123陽性MOLM-13 AML細胞的人NK細胞的存在下，用 NKp46-CD123_F25以及用對NKp46沒有特異性的ADCC增強的抗CD123抗體（參考1）說明了特異性裂解。EC ₅₀值是基於細胞裂解隨結合劑濃度的變化而建立的。結果顯示於下文中。

分子	EC ₅₀ （ pM ）
	平均值 +/- sem （ 4 名供體）
NKp46-CD123_F25	80.3 ± 44.9
參考1	85.3 ± 41.3

因此，顯示NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）展現至少等於或優於ADCC增強的抗CD123抗體（參考1）的細胞毒性活性。

參考1是一種適用於AML的治療的完全人源化的單株抗體，其靶向介白素3受體的α鏈（IL3Rα；也稱為CD123），並通過自然殺手細胞針對抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）的增強活化進行了優化。

B.6. AML 上的 CD64 表現不影響 NKCE 細胞毒性活性，但是對參考 1 活性造成負面影響

為了進一步記錄和比較NKp46-CD123_F25和參考1抗體的活性，使用表現CD123的不同AML細胞株作為靶標進行細胞毒性實驗。令人驚訝的是，即使THP-1和MOLM-13細胞在細胞表面表現相當水平的CD123，但參考1抗體有效地殺傷MOLM-13細胞，但對THP-1細胞沒有活性（圖 6A-上部小圖）。與參考1抗體相反，NKp46-CD123_F25在兩種AML細胞株上表現出相當的殺傷活性（圖 6A-上部小圖）。圖 6A-下部小圖顯示，MOLM-13和THP-1細胞在細胞表面的CD32a/b和CD64 FcγR表現不同，如通過流式細胞術所分析。與THP-1細胞相比，MOLM-13細胞具有顯著更低的CD64水平以及更低的CD32a/b水平（圖 6A-下部小圖）。CD64（FcγRI）是一種在健康單核細胞和巨噬細胞上表現的人類IgG的高親和力受體，並且被發現在約三分之一的可以被認為是CD64陽性急性髓性白血病的患者的AML胚細胞上表現。為了研究CD64表現對NK細胞接合體（NKCE）的細胞毒性的作用，與人源化單株抗體參考1相比，在THP-1細胞中選擇性敲低(knock down)CD32a/b和CD64的表現。

對表現CD32a/b但不表現CD64或表現CD64但不表現CD32a/b的THP-1亞選殖進行的殺傷實驗（圖 6B）表明，THP-1上的CD64表現是負責抑制參考1的ADCC活性，因為僅在對CD64表現失活的亞選殖上恢復了這種抗體的殺傷。

因此，這些結果表明，AML細胞表面的FcγR、CD64對抗體FC的順式捕獲可能通過與與NK細胞競爭接合CD16a而干擾ADCC。

有趣的是，NKp46-CD123_F25對所有AML細胞株和所有THP-1亞選殖表現出一致的殺傷活性，從而強調，如與參考1相比，無論CD64表現狀態如何，與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白對於誘導NK細胞介導的AML胚細胞的細胞毒性更有效。

圖 14A- 圖 14B證實，參考1活性受到AML細胞上CD64表現的負面影響。

圖 14A報告來自四名代表性患者（AML#1、#2、#5和#6；N=8）的初代惡性AML胚細胞的NKp46-CD123_F25和參考1介導的細胞毒性，這些患者是使用健康供體NK細胞作為效應子離體評價的。如用MOLM-13和THP-1細胞株觀察到的，參考1抗體介導CD64陰性患者樣品（AML#1和#2；圖 14A）的殺傷，但對來自CD64陽性AML患者樣品（AML#5和#6；圖 14A）的胚細胞幾乎沒有活性。因此，AML#5- AML#6（參考1無反應者）具有比AML#1和AML#2（參考1反應者）更高的CD32和CD64染色水平（圖 14B，右側小圖，比較兩組中CD64和CD32相對於對照的峰位移）。

相比之下，靶向CD123的三功能NKp46-NKCE對CD64陽性和CD64陰性AML患者樣品都有很強的抗腫瘤作用（圖 14 ）。

圖 6 和圖 14表明，CD123-NKp46_F25對親本THP-1細胞株、THP-1亞選殖和 MOLM-13細胞同等有效，無論FcγR表現狀態如何，並且更具體地，無論靶細胞上的CD64表現如何。此外，三功能NKCE分子還展示對所有初代惡性AML細胞的殺傷活性，從而在參考1對其完全無活性的CD64陽性AML患者樣品（AML#5和6）中促進顯著抗腫瘤活性（圖 14A）。

關於使用MOLM-13細胞的實驗，三功能分子（CD123-NKp46_F25）比單獨活化NKp46（CD123-NKp46_F6）或CD16a（CD123-IC_F25）的雙特異性試劑更有效（圖 15A），證明了有效的殺傷活性（幾何平均值EC ₅₀為4.2 [95% CI：2.7、6.3] pM，平均觀察到的最大特異性裂解為71 ± 5%）和在健康NK細胞供體之間的良好一致性（圖 15B）。

B.7. NK 細胞接合體在自體原始 AML 樣品中的 NK 細胞活化

本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）誘導針對初代CD64(+)或CD64(-) AML胚細胞的NK脫粒的特性是通過測量CD107陽性NK細胞的百分比在圖 7中確立。

總體而言，所述實驗提供證據表明，本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白能夠在自體測定中活化來自AML患者的原始樣品中的NK細胞，例如，用來自同一患者的初代胚細胞和NK細胞。

這些結果在專門的自體NK細胞活化測定中得到進一步鞏固，所述測定使用另外的沒有（樣品10）和具有（樣品8和9）CD64表現的兩個AML患者樣品（圖 16A）。同樣，NKp46-CD123-NKCE介導患者NK細胞針對其自身惡性細胞的自體活化（參見CD107染色的轉變），無論胚細胞上的CD64表現狀態如何，而參考1僅對CD64陰性樣品（樣品10）有活性（圖 16B）。

因此，此實驗支持本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白關於CD64(+)和CD64(-)兩種AML細胞離體活化NK細胞的能力。

此外，在該自體測定中，本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白能夠以比在參考1存在下觀察到低得多的濃度在CD64(+)細胞的存在下接合NK細胞。

此外，還在使用六名NK健康供體的胚細胞殺傷測定中針對四個AML樣品（2個CD64(+)和2個CD64(-)）對NKp46-CD123_F25和參考1的平均EC ₅₀進行定量，並且結果再現於下文中。

	平均EC ₅₀ CD64(-)AML胚細胞 +/- SD（pM）	平均EC ₅₀ CD64(+)AML胚細胞 +/- SD（pM）
NKp46-CD123_F25	27.9 +/- 14.1	18.6 +/- 1.9
參考1	48.0 +/- 36.3	無活性

總之，這些實驗再次證明，與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白的胚細胞殺傷活性優於參考1抗體，即使對於CD64(-) AML樣品，參考1對CD64(+) AML胚細胞是無活性的。

B.8. NKp46-CD123 NK 細胞接合體誘導針對 SCID 小鼠模型中注射的 MOLM-13 人類 AML 的抗腫瘤活性

圖 8使用SCID小鼠模型報告了muNKp46-huCD123_F25結合蛋白（muNKp46-huCD123_F25）的劑量依賴性抗腫瘤活性，其在腫瘤植入後70天，以0.5 mg/kg誘導50%小鼠存活。更具體地，所治療的對照組顯示27.5天的MST和5%的長期存活者。

X軸表明腫瘤植入後的天數，所述腫瘤植入由人MOLM-13的靜脈注射組成，包括在第一天通過腹膜內（i.p.）途徑進行的單一化合物投予。Y軸表明基於治療組的10隻小鼠和對照組的20隻小鼠的存活百分比。***表明與對照組相比，p值＜ 0.001。

用0.5 mg/kg的muNKp46-huCD123_F25治療的組顯示66天的MST、140%的增加的壽命和50%的長期存活者，如與對照組相比，0.5 mg/kg的muNKp46-huCD123_F25具有統計學上顯著的活性（p ＜ 0.0001）。對於0.25 mg/kg的劑量，所述組顯示36天的MST、31%的增加的壽命和10%的長期存活者，在0.25 mg/kg的muNKp46-huCD123_F25誘導與對照組無統計學差異。對於0.05 mg/kg的劑量，所述組顯示33天的MST、20%的增加的壽命和沒有長期存活者，0.05 mg/kg的muNKp46-huCD123_F25與對照組沒有統計學差異。

與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白顯示劑量依賴性體內抗腫瘤活性，在0.5mg/kg具有穩健活性。那些結果總結在下表3中：

表 3

組	長期存活者	中值存活時間（天）	壽命的增加
F25，0.5 mg/kg	50%	66	140%
F25，0.25 mg/kg	10%	36	31%
F25，0.05 mg/kg	0%	33	20%
對照	5%	27.5	-

因此，這證實了NK細胞接合體對於動物模型中的增殖性障礙的體內治療是有效的。

此外，對於功效的進一步評價，重複上文描述的和圖 8中報告的實驗，但包括5 mg/kg muNKp46-huCD123_F25 NKCE或對照，以及投予另外的組即參考1。結果呈現於圖 18中。

與圖8研究一致，在圖 18研究中，替代muNKp46-huCD123_F25在人MOLM-13播散模型中以5、0.5、0.25和0.05 mg/kg的劑量誘導統計學上顯著的活性，對於5、0.5和0.25 mg/kg的劑量，其中與對照相比的ILS為100%且長期存活者為60%，並且對於0.05 mg/kg的劑量，ILS為30%且長期存活者為10%。

參考1在人類MOLM-13播散模型中以5 mg/kg的劑量誘導統計學顯著的活性，其中ILS為70%且長期存活者為40%。其在0.5、0.25和0.05 mg/kg的劑量下沒有活性。

在0.5和0.25 mg/kg的劑量下，muNKp46-huCD123_F25的活性在統計學上顯著高於參考1。

圖 18的表格結果總結如下：

組	長期存活者	中值存活時間（天）	壽命的增加
muNKp46-huCD123_F25，5 mg/kg	60%	＞ 70	＞ 97%
muNKp46-huCD123_F25，0.5 mg/kg	60%	＞ 70	＞ 97%
muNKp46-huCD123_F25，0.25 mg/kg	60%	＞ 70	＞ 97%
muNKp46-huCD123_F25，0.05 mg/kg	10%	46	30%
參考1，5 mg/kg	40%	60.5	70%
參考1，0.5 mg/kg	0%	32	0%
參考1，0.25 mg/kg	10%	37	4%
參考1，0.05 mg/kg	20%	40.5	14%
對照	0%	35.5	-

總之，muNKp46-huCD123_F25替代物顯示劑量依賴性活性，從0.25 mg/kg起具有穩健活性。這些資料證明了NK細胞與NKp46/FcγR共接合的益處，從而導致相對於抗CD123抗體（參考1）改進的體內功效。

B.9. NKp46-CD123 NK 細胞接合體在非人靈長類動物中誘導體內抗腫瘤活性

在對NHP進行的兩項專門的藥代動力學、藥效學和安全性研究中，進一步證實了在體外人PBMC中不存在NKCE的促炎細胞因子釋放。選擇食蟹猴作為臨床前藥代動力學、藥效學和毒理學研究的相關物種，這是基於 (1) 食蟹猴的NKp46和CD123的組織分佈與人相似（Walzer等人 PNAS; 2007; 104:3384-3398和ChiChili等人 Sci Transl Med; 2015; 7:289）和 (2) 因為構成CD123-NKCE分子的抗體和Fc片段與食蟹猴抗原和FcγR結合的親和力與人分子相似，如下表 4中所示。具體來說，CD16a（FcγRIIIA）對其158V和158F亞型的單價K _D分別為0.46 ± 0.01 µM和2.61 ± 0.09 µM，並且抗NKp46和抗CD123抗體部分與人類NKp46和人類CD123結合的單價K _D分別為16.3 ± 2.9 nM和0.40 ± 0.04 nM。

表 4

	K _D （ nM ）平均值 +/- SD （ n=3 ）
	NKp46-CD123_F25	人類 IgG1 對照
人分子
CD123	0.40 ± 0.02	NA
Nkp46	16.6 ± 1.1	NA
人類 FcRn	109 +/- 28	94 +/- 25
人類 Fcγ RI	0.2 +/- 0.0	0.2 +/- 0.0
人類 FcγRIIa	1222 +/- 99	1574 +/- 108
人類 FcγRIIb	3196 +/- 375	4232 +/- 483
人類 FcγRIIIaF	2606 +/- 91	2820 +/- 58
人類 FcγRIIIaV	462 +/- 12	575 +/- 16
人類 FcγRIIIb	6688 +/- 413	7541 +/- 838
食蟹猴分子
CD123	1.2317 ± 0.132	NA
NKp46	29.038.9 ± 1.74	NA
食蟹猴 FcRn	282 +/- 41	237 +/- 22
食蟹猴 FcγRI	12 +/- 1	18 +/- 2
食蟹猴 FcγRIIa	5177 +/- 290	6336 +/- 377
食蟹猴 FcγRIIb	1891 +/- 130	2320 +/- 165
食蟹猴 FcγRIII	466 +/- 36	580 +/- 56

表 4 中展示的結果是在 25ºC pH5.6 進行的；默認條件： 25ºC pH7.4 。 NA ：不適用。 SD ：標準差。 K _D ：解離常數。

圖 9進一步顯示了在注射與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）後長達20天，以及對於非人靈長類動物在0.5 µg/kg長達5小時，在3 μg/kg下CD123陽性嗜鹼性粒細胞的完全且持續的消耗。

因此，此結果表明，對於NK細胞接合體，先前獲得的體外、離體和體內結果，包括在SCID小鼠模型中觀察到的結果，可以外推至非人靈長類動物。

總體而言，CD123陽性免疫細胞消耗是NKp46-CD123_F25結合蛋白在非人靈長類動物中的體內活性的標誌。發現觀察到CD123陽性嗜鹼性粒細胞的快速和持續消耗，這發生在開始輸注後約1.5小時，並維持直至第7天，且細胞數量在第28天恢復到基線。

B.10. 在細胞毒性測定中對 Fc 勝任形式即分別 F5 與 25 形式的比較

圖 10A和圖 10B說明，NKp46-CD123_F25和NKp46-CD123_F5結合蛋白通過接合來自健康供體的NK細胞（D648）顯示針對MOLM-13和THP-1 AML細胞株二者相同的細胞毒性活性。

MOLM-13與THP-1細胞之間的主要差異與其CD64標記的表現水平有關。MOLM-13細胞不表現CD64(-)，而THP-1細胞表現高水平的CD64(+)。兩種細胞都表現CD32a。

因此，此實例報告了三種不同結合蛋白的特異性裂解的變化：(i) 呈 F5形式的NKp46-CD123_F5結合蛋白（NKp46-CD123_F5），(ii) 呈 F25形式的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25），以及 (iii) 僅結合CD123的形式F5的陰性同種型對照變異體（CD123-IC_F5）。

總體而言，那些結果表明，細胞毒性活性使用呈F5和F25形式的兩種Fc勝任NKp46-CD123結合蛋白得以維持。相比之下，陰性對照不產生可檢測的細胞毒性活性。

B.11. 在與 T 細胞接合體工具相比時， NKp46-CD123 NKCE 誘導的 CD123 陽性嗜鹼性粒細胞消耗與低細胞因子釋放有關

有效細胞毒性可能與患者中的毒性有關。為了研究在體外通過CD123-NKCE誘導的來自人PBMC的細胞因子釋放，作為患者中潛在細胞因子釋放症候群（CRS）的預測性測定，進行了以下實驗。

將人PBMC（ N= 10個樣品）在NKp46-CD123_F25（CD123-NKCE；0.1、1或10 µg/mL的劑量；0.68-68 nM）、僅結合NKp46的形式F25的陰性同種型對照變異體（NKp46-IC_F25；0.1、1或10 µg/mL的劑量；0.68-68 nM）的存在下，或與對CD3具有特異性且對NKp46無特異性的抗CD123 T細胞接合體抗體工具（CD123-TCE，參考1；0.1 µg/mL；1.6 nM）在濃度梯度下（10 ^-3至10 ¹μg/mL）培養20小時。

在人類PBMC中，CD123在循環嗜鹼性粒細胞和漿細胞樣樹突細胞（pDC）的子集上組成型表現。鑒於嗜鹼性粒細胞具有比pDC更高的CD123 ⁺表現，監測上述每個處理組的嗜鹼性粒細胞消耗百分比。圖 11顯示用CD123-NKCE處理人類PBMC促進CD123 ⁺嗜鹼性粒細胞的劑量依賴性部分消耗，其中值最大消耗為37% [31；50]，並且幾何平均EC ₅₀值為38 pM（95% CI [12.9；401]），用10個供體樣品中的6個來計算。相比之下，在缺乏CD123結合位點的F25結合分子（NKp46-IC_F25）的存在下，嗜鹼性粒細胞消耗沒有大量發生。從上述人類PBMC處理組收集上清液以對細胞因子釋放的量進行定量。圖 12證明，與投予與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）相關的體外IL-6和IL-1β促炎細胞因子以及TNF-α和IFN-γ細胞因子釋放顯著低於與投予低100倍的劑量（0.1 µg/ml）的已知會誘導細胞因子釋放症候群（CRS）的陽性對照參考1相關的相應IL-6釋放。

即使在42倍高的濃度下，CD123-NKCE誘導的細胞因子釋放水平遠低於CD123-TCE。

圖 11 和圖 12表明，與用CD3-CD123抗體分子處理相比，用CD123-NKCE處理PBMC促進CD123 ⁺嗜鹼性粒細胞的消耗，但誘導顯著更低水平的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ釋放。

總之，與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）已經顯示其接合初代NK細胞以靶向並殺傷與少量細胞因子釋放相關的CD123+初代正常單個核細胞的能力，並且對於AML的治療可能具有比TCE更好的收益/風險比。

無論劑量水平如何且最高3 mg/kg的高劑量，圖 13A – 圖 13F顯示，在開始注射與本揭露相關的NKp46-CD123_F25結合蛋白（NKp46-CD123_F25）後，在所有治療的動物（雄性食蟹猴）中都觀察到非常低的細胞因子釋放（IL6和IL10），沒有任何相關的臨床病兆。未檢測到IL-2和IFNγ細胞因子釋放。更特別地，在以3 mg/kg單次靜脈內注射F25構建體後，在非人靈長類動物中檢測到暫態IL6和IL10峰。這種暫態峰從1小時到5小時出現，並在1或2天內返回到基線。

此外，在最高3 mg/kg劑量，那些極低水平的IL-6和IL-10細胞因子釋放與臨床病兆無關。這表明此類NK細胞接合體在非人靈長類動物中具有良好的安全性概況。

B.12. NKp46-CD123 NK 細胞接合體在體外促進 NK 細胞活化，這與細胞因子 / 趨化因子 的產生是相稱的

對應於圖 17的流式細胞術分析表明，僅當表現CD123的靶細胞存在時，NKp46-CD123_F25結合蛋白才促進NK細胞活化。

當MOLM-13靶細胞存在時，在NKp46-CD123_F25存在下培育的初代供體NK細胞（N=3）以劑量依賴性方式展示更高的NK細胞活化標記CD107和CD69以及細胞因子TNF-α、IFN-γ和趨化因子MIP-1β的表現水平（圖 17，比較單獨的NK與NK + MOLM-13條件）。

總體而言，所述實驗提供證據表明，本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白活化並相稱地促進初代NK細胞中針對CD123+ AML細胞的細胞因子/趨化因子產生，而沒有NK細胞的脫靶活化。

B.13. NK 細胞是負責 NKp46-CD123_F25 的抗腫瘤活性的效應淋巴細胞子集

為了測試NKp46-CD123_F25的功效是否依賴於NK細胞針對在SCID小鼠模型中注射的MOLM-13人類AML的抗腫瘤活性，在B.8中概述的實驗設置期間，小鼠經歷了NK細胞消耗方案。

結果呈現於圖 18和圖 19中，並且相應的表格結果顯示於下表5中。

表 5

組	長期存活者	中值存活時間（天）	壽命的增加
muNKp46-IC	0%	31	7%
muNKp46-IC + 抗aGM1	10%	23.5	≤ 0%
IC-huCD123	20%	37	28%
IC-huCD123 + 抗aGM1	0%	25	≤ 0%
muNKp46-huCD123_F25	40%	53.5	84%
muNKp46-huCD123_F25 + 抗aGM1	0%	33	14%
對照	0%	29	-

所治療的對照組顯示29天的中值存活時間（MST），並且沒有長期存活者。

muNKp46-IC同種型對照未顯示活性，其ILS為7%並且沒有長期存活者。在用muNKp46-IC同種型對照治療的組中沒有觀察到對NK消耗的影響，壽命沒有增加且長期存活者為10%。

IC-huCD123同種型對照具有統計學上顯著的活性，其ILS為28%並且長期存活者為20%。在用IC-huCD123同種型對照治療的組中觀察到對所述消耗的統計學上顯著的影響，壽命沒有增加，並且沒有長期存活者。

muNKp46-huCD123_F25具有統計學上顯著的活性，其ILS為84%並且長期存活者為40%。在用muNKp46-huCD123_F25治療的組中觀察到對所述消耗的統計學上顯著的影響，其ILS為14%並且沒有長期存活者。

總之，NK消耗影響muNKp46-huCD123_F25的抗腫瘤活性，從而證實了NK作為效應細胞在muNKp46-huCD123_F25 NKCE體內功效中的參與。

B.14. NKp46-CD123 NK 細胞接合體在 NHP 中是安全且有效的

為了確認Nkp46-CD123細胞接合體在圖 9 和圖 13中進行的NHP研究中的安全性概況，詢問在雄性食蟹猴中以高（3 mg/kg）或低（3 µg/kg和0.5 µg/kg）劑量通過單次靜脈內注射投予的CD123-NKCE的藥代動力學和藥效學（2隻動物各自用於3 mg/kg和3 µg/kg劑量，並且1隻動物用於0.5 µg/kg劑量）。

在3 mg/kg和3 µg/kg兩個劑量下，用CD123-NKCE治療促進所有猴子血液中CD123 ⁺細胞的持續和完全消耗，持續超過10天（如圖 20A和圖 20B中針對CD123 ⁺嗜鹼性粒細胞和總CD123 ⁺細胞所例示），只有極少量（＜ 50 pg/mL）的促炎細胞因子IL-6和IL-10被釋放（圖 20C），沒有任何相關的臨床病兆。

在以最低劑量（0.5 µg/kg，資料未顯示）治療的猴子中觀察到CD123 ⁺細胞的短暫和部分消耗，但3 µg/kg被認為是該物種中的最低有效劑量。以最高劑量（3 mg/kg）治療的兩隻猴子的PK曲線被標記為抗藥物抗體（ADA）反應（資料未顯示），出現在治療後12-14天（圖 20D），並且與在以後的時間點從血液回收CD123 ⁺細胞相關。

通過一項探索性重複劑量毒性研究進一步詢問CD123-NKCE的臨床前安全性概況，在該研究中每週以3 mg/kg/投予或0.1 mg/kg/投予的劑量治療四隻猴子（2隻/性別/劑量）持續四週，所述治療是通過靜脈內輸注投予一小時（圖 21）。在所有猴子中（除了一隻猴子，即猴子M5，雄性5號；圖 21），在兩種測試劑量下，暴露於CD123-NKCE持續至少兩週，其中從第三次投予（第15天）起檢測到（資料未顯示）抗藥物抗體（ADA）的存在（表 6）。

下文表 6展示在對食蟹猴以0.1和3 mg/kg/投予每週重複1小時靜脈內輸注持續4週（在第1、8、15和22天）後的單獨CD123-NKCE血漿濃度值。

表 6

日期	採樣	血漿針對濃度（ng/mL）
0.1 mg/kg/投予	3 mg/kg/投予
M1♂	M2♂	F3♀	F4♀	M5♂	M6♂	F7♀	F8♀

1	劑量前	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	2.27	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ
1	1h	1750	1200	1550	1870	37000	68700	100000	46200 ##
1	1.5h	1100	1520	1390	1750	78600	67000	98600	48300 ##
1	5h	736	1350	986	469	64100	72200	76300	47500 ##
2	24h	160	381	250	448	221000#	30800	55200	41500 ##
4	72h	1.66	9.17	7.83	14.8	31600	31100	27500	29100 ##
8	168h/劑量前	＜LLOQ	0.484	0.698	1.18	16000	17300	20100	37800

8	1h	1340	3.32	1980	1610	92000	91900	137000	87500
8	1.5h	1250	29.6	1680	1460	89900	88400	110000	82500
8	5h	892	132	1280	1210	38600	72900	74800	88300
9	24h	239	78.2	554	512	64500	61200	46100	65200
11	72h	1.17	35.7	43.8	20.8	46300	47100	23000	30500
15	168h/劑量前	＜LLOQ	＜LLOQ	2.45	＜LLOQ	45000	51.8	＜LLOQ	＜LLOQ

15	1h	19.3	205	256	5.61	124000	21600	2310	11900
15	1.5h	5.53	105	190	3.30	75900	33600	497	9800
15	5h	＜LLOQ	22.2	157	＜LLOQ	85400	10600	246	1170
16	24h	＜LLOQ	0.333	35.1	＜LLOQ	51700	300	＜LLOQ	37.9
18	72h	US	US	US	US	US	US	US	US
22	168h/劑量前	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	9120	＜LLOQ	＜LLOQ	1.09

22	1h	0.998	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	61600	365	＜LLOQ	149
22	1.5h	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	55500	228	＜LLOQ	53.7
22	5h	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	44000	26.3	＜LLOQ	＜LLOQ
23	24h	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	26100	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ
25	72h	US	US	US	US	US	US	US	US
29	168h	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	110	＜LLOQ	＜LLOQ	0.525 #

數值捨入至三位有效數字。 LLOQ （定量下限） 0.250 ng/mL ； # 排除 TK 分析的異常值； US ：計畫外採樣； ## 在第 1 天的 1 小時輸注期間 由於技術問題作為指示而給出（即，皮下接受 50% 的劑量）

對於兩種劑量，在每次每週投予後觀察到IL-6濃度的暫態極小增加（表 7，對於0.1和3 mg/kg/投予的劑量，最大水平分別為25和160 pg/mL）。表 7展示在對食蟹猴以0.1和3 mg/kg/投予每週重複1小時靜脈內輸注CD123-NKCE持續4週（在第1、8、15和22天）後的單獨IL-6血漿濃度值。

表 7

日期	採樣時間劑量前或劑量後	血漿中的IL-6濃度（pg/mL）
0.1 mg/kg/投予	3 mg/kg/投予
M1♂	M2♂	F3♀	F4♀	M5♂	M6♂	F7♀	F8♀

1	劑量前	＜LLOQ	＜LLOQ	0.84	0.54	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	2.09
1	1h	1.52	1.92	3.12	4.65	1.49	1.61	2.63	7.99
1	1.5h	2.99	4.54	5.09	6.79	2.17	2.98	5.61	14.37
1	5h	1.83	3.00	3.17	3.55	1.57	8.92	11.41	15.86
2	24h	＜LLOQ	＜LLOQ	0.66	1.98	0.79	1.96	2.15	1.61
8	168h/劑量前	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	0.73	1.63	1.52	0.57

8	1h	1.42	2.12	5.04	2.60	1.65	2.35	2.74	4.48
8	1.5h	2.97	18.84	9.85	2.46	1.90	2.5	3.92	8.50
8	5h	2.15	18.89	7.69	1.39	1.53	38.04	2.34	2.71
9	24h	0.92	4.23	1.18	1.56	0.68	3.98	11.58	1.03
15	168h/劑量前	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	0.62	1.58

15	1h	1.20	1.98	2.93	1.63	2.17	3.14	7.67	68.51
15	1.5h	1.47	1.88	5.72	1.65	2.35	5.02	12.19	85.36
15	5h	2.33	1.33	1.57	1.33	5.53	2.01	4.09	7.11
16	24h	＜LLOQ	＜LLOQ	1.48	6.47	2.76	＜LLOQ	1.40	0.71
22	168h/劑量前	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	1.16	＜LLOQ	1.34	1.11

22	1h	2.22	2.79	1.35	4.07	3.12	123.36	27.39	150.97
22	1.5h	3.54	3.52	2.23	5.08	2.83	121.88	51.43	159.71
22	5h	2.68	4.42	2.89	22.72	2.56	4.07	6.35	22.23
23	24h	＜LLOQ	1.53	＜LLOQ	0.81	4.52	＜LLOQ	1.10	1.29
29	168h	0.79	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	＜LLOQ	0.74	＜LLOQ	0.69

LLOQ （定量下限）： 0.53 pg/mL

特別地，在以高劑量（3mg/kg/投予）治療的猴子M5中未觀察到顯著的IL-6釋放，其在整個研究中未展現ADA反應並且暴露於CD123-NKCE（圖 21A 和圖 21B），而在這隻猴子的血液和骨髓二者中都觀察到CD123 ⁺細胞消耗的強PD效應（表 8和圖 21C）。

表 8展示在對食蟹猴以0.1和3 mg/kg/投予每週重複1小時靜脈內輸注CD123-NKCE持續4週後，血液和骨髓中嗜鹼性粒細胞和總CD123陽性細胞的單獨絕對計數。

日期	採樣時間	0.1 mg/kg/投予	3 mg/kg/投予
M1♂	M2♂	F3♀	F4♀	M5♂	M6♂	F7♀	F8♀

血液中CD123陽性嗜鹼性粒細胞的絕對計數（細胞/µL）
劑量前	1.16	2.79	8.60	2.25	5.65	11.6	15.1	＜DL
1	1.5h	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
1	5h	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
2		＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
4		＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
9		＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
15	1.5h	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
16		1.90	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	1.87	＜DL
23		1.56	＜DL	＜DL	7.61	＜DL	10.4	34.7	9.58
29		11.8	3.30	＜DL	34.5	＜DL	24.9	62.3	17.0
50		4.19	nd	6.30	nd	13.1	nd	12.9	nd
		血液中總CD123陽性細胞的絕對計數（細胞/µL）
	劑量前	6.26	6.32	21.9	4.02	9.72	22.8	19.3	1.59
1	1.5h	5.90	1.83	3.01	3.74	1.50	＜DL	1.18	1.24
1	5h	4.06	1.40	＜DL	1.90	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
2		3.79	2.00	＜DL	2.47	＜DL	2.08	2.30	1.48
4		10.3	1.95	2.47	2.43	1.54	1.32	1.84	2.80
9		1.44	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
15	1.5h	5.77	2.16	2.40	3.25	1.15	8.14	12.9	12.3
16		17.7	3.77	2.97	6.42	1.43	7.16	10.2	8.91
23		18.5	8.33	9.52	12.2	1.28	58.5	49.7	32.4
29		33.9	18.2	29.5	47.0	4.15	82.9	72.1	38.1
50		8.81	nd	14.5	nd	16.8	nd	17.3	nd
		骨髓中CD123陽性嗜鹼性粒細胞的絕對計數（細胞/µL）
	劑量前	439	11.5	30.2	30.0	21.4	14.7	155	21.3
9		＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
29		74.5	25.6	50.2	89.2	＜DL	50.0	235.6	131
50		54.0	nd	185	nd	29.6	nd	43.9	nd
		骨髓中總CD123陽性細胞的絕對計數（細胞/µL）
	劑量前	914	19.8	45.9	51.1	61.6	28.9	218	41.6
9		5.85	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL	＜DL
29		140	49.6	192	142	68.4	98.1	311	200.8
50		112	nd	402	nd	50.9	nd	71.6	nd

DL （檢測限）： 1.15 個細胞 /µL （血液）或 2.10 個細胞 /µL （骨髓）； nd ：未完成

在所有其他動物中，在第一次投予後1.5小時和第3次投予後長達24小時在血液中觀察到CD123表現細胞的持續消耗，並且在第22至29天觀察到反彈（高於基線）（表 8）。此外，對於兩種劑量，所有治療的猴子在第9天（在第二次投予後24小時）都表現出骨髓中CD123陽性細胞的完全消耗（表 8；對於大多數動物，第9天的值低於檢測限），且CD123陽性群體在第29天（最後一次投予後一週）恢復。

無論劑量如何，均未觀察到可能可歸因於使用CD123-NKCE治療的臨床病兆、體重或體溫變化以及對心電圖的影響。也未觀察到對血液學、凝血、臨床化學或泌尿參數的化合物相關的不良影響。對採樣組織的顯微鏡檢查沒有揭示器官靶向的證據，並且所記錄的所有觀察結果都被認為位於變異的背景範圍內，並且與CD123-NKCE的投予無關。

總的來說，這些結果因此構成CD123-NKCE在體內的功效的原理證明，沒有毒性徵兆。

B.15. 使用健康供體 NK 細胞的 NKp46-CD123 NK 細胞接合體腫瘤細胞殺傷

在使用取自2名不同健康供體（HD）的NK細胞的體外腫瘤細胞殺傷測定中測試NKp46-CD123_F25及其同種型對照IC-CD123_F6。

NK細胞純化和AML細胞株

通過Ficoll密度梯度離心從匿名健康供體（HD）分離人外周血單個核細胞（PBMC）。用MACSxpress®全血NK細胞分離套組（Miltenyi Biotec）從這些PBMC純化NK細胞。使NK細胞在補充有10% SVF（BioWest）和1% L-麩醯胺酸（Gibco）的RPMI1640（Gibco）中靜置過夜。

基於其CD123表現選擇THP1細胞（CD123+. CD64+）用於此研究。在實驗前，用Incucyte® Nuclight Green慢病毒（Sartorius）感染THP1細胞以表現綠色螢光蛋白（GFP）。

在NKp46-CD123_F25存在下隨時間的NK功能測定

在NKp46-CD123_F25或其同種型對照IC-CD123_F6以0.1、1、10和100 ng/mL存在下在37ºC培育NK細胞和THP1 GFP靶細胞。效應子:靶細胞的比率為1:1。使用的培養基與NK細胞培養相同。使用Incucyte活細胞分析系統（EssenBioscience）在74h內通過螢光成像監測靶細胞。使用IncucyteS3軟體（2020B版）對活靶細胞的數量進行定量。

結論

如圖 22中所示，在1 : 1的效應子:靶細胞比率，不同濃度（1、10和100 ng/mL）的NKp46-CD123_F25隨時間增強HD NK細胞針對THP1 GFP AML細胞的細胞毒性活性。

如果沒有另外說明，根據標準用法和約定，本揭露的結合蛋白在左側以胺基末端方向（“N末端”或“N-term”）定向，並且在右側以羧基末端方向（“C末端”或“C-term”）定向。

圖 1.F25形式的三維示意圖，它是一種雙特異性F5形式的變異體，包括一個人類NKp46結合位點和一個人類CD123結合位點。在圖1中，多肽的C末端位於左側，並且N末端位於右側。

圖 2A- 圖 2D分別顯示F25、F5、F26和F6形式的二維示意圖，包括每條多肽鏈的相關結構域。在圖2A至圖2D中，多肽的C末端位於左側，並且N末端位於右側。人NKp46結合結構域由左側的VH/VL對形成。人CD123結合結構域由右側的VH/VL對形成。

圖 2A顯示了F25形式的二維示意圖。該表示代表要求保護的“ NKp46-CD123_F25”結合蛋白。

圖 2B顯示了F5形式的二維示意圖。在與 F25相比時， F5的不同之處在於，NKp46結合結構域的C _L和C _H對與包含C _H1結構域和V _L結構域的第三多肽鏈交換。

圖 2C顯示了F26形式的二維示意圖。該F26與圖2A的F25的不同之處在於，它在每個C _H2結構域上都包括Fc沉默N297S突變。

圖 2D顯示了F6形式的二維示意圖。該F6與圖2B的F5的不同之處在於，它在每個C _H2結構域上都包含Fc沉默N297S突變。

圖 2E顯示了F25形式的變異體的二維詳細表示。該F25形式表示對應於圖2A中的表示。

圖 3顯示了所提出的在表現CD123的腫瘤細胞（即AML細胞株；即MOLM-13）和表現NKp46和Fcγ受體（CD16a）的NK細胞的聯合結合後，NK細胞接合體（NKCE）用於殺傷的作用機制。轉載並改編自 Gauthier, L. 等人（“Multifunctional natural killer cell engagers targeting NKp46 trigger protective tumor immunity”. Cell 177, 1701-1713 (2019)）。

圖 4A- 圖 4B報告本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白分別針對AML細胞株（MOLM-13）或初代AML胚細胞的體外細胞毒性。圖 4A顯示了本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白和僅結合NKp46的形式F25的陰性同種型對照變異體（NKp46-IC_F25）針對AML細胞株（MOLM-13）的體外細胞毒性。圖 4B使用離體患者樣品再現了相同實驗，其中針對初代AML胚細胞來評估NKp46-CD123_F25、NKp46-IC_F25、對NKp46沒有特異性的抗CD123 ADCC增強抗體（參考1）以及ADCC活性增加且對 NKp46和CD123二者沒有特異性的陰性同種型對照Fc優化抗體（IC-hIgG1-ADCC-enh）。

圖 5提供本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白和NKp46-CD123_F6結合蛋白的使用新鮮健康供體NK細胞針對MOLM-13 AML細胞株的體外細胞毒性資料（EC ₅₀資料），所述NKp46-CD123_F25結合蛋白能夠通過以其Fc勝任(competent)形式接合NKp46和CD16a二者來活化人NK細胞，從而誘導ADCC活性（F25），所述NKp46-CD123_F6結合蛋白通過以其Fc沉默形式僅接合NKp46而非CD16a來活化人NK細胞，從而誘導降低的ADCC活性（F6）。

圖 6A- 圖 6B上部小圖報告了本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白、對NKp46無結合的抗CD123 ADCC增強抗體（參考1）和ADCC活性增加且對NKp46和CD123二者無特異性的陰性同種型對照Fc優化抗體（IC_hIgG1-ADCC-enh）針對不同AML細胞株的體外細胞毒性。測試的AML細胞株是：THP-1，一種表現CD64(+)和CD32(+)的細胞株（圖 6A）；MOLM-13，一種不表現CD64(-)但表現CD32(+)的細胞株（圖 6A）；THP-1 CD64KO，一種剔除CD64(-)但表現CD32(+)的細胞株（圖 6B）；以及THP-1 CD32KO，一種表現CD64(+)且剔除CD32(-)的細胞株（圖 6B ）。圖 6A 和圖 6B下部小圖通過流式細胞術分析報告了惡性AML細胞株和亞選殖的表型以及CD123、CD64、CD32a/b的表現。還顯示了用小鼠-IgG2a（IC_小鼠IgG2a）和小鼠-IgG1（IC_小鼠IgG1）同種型對照對AML細胞的背景染色。

圖 7A - 圖 7B報告了通過針對來自兩個不同供體的初代AML胚細胞的CD107a陽性NK細胞的百分比測量的NK脫粒的離體誘導。來自供體#1的初代AML胚細胞是CD64(+) （圖 7A ），並且來自供體#2的初代AML胚細胞是CD64(-) （圖 7B ）。測試的結合蛋白是本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白、對NKp46沒有特異性的抗CD123 ADCC增強抗體（參考1）、不結合CD123但結合NKp46和CD16a的形式F25的陰性同種型對照變異體（NKp46-IC_F25）以及ADCC活性增加且對NKp46和CD123二者無特異性的陰性同種型對照Fc優化抗體（IC_hIgG1-ADCC-enh）。

圖 8報告了在重症聯合免疫缺陷小鼠（SCID）小鼠模型中，muNKp46-huCD123_F25結合蛋白（攜帶抗鼠NKp46和抗人類CD123結合結構域並且也稱為moNKp46-huCD123）針對MOLM-13人細胞的劑量依賴性抗腫瘤活性。

圖 9A - 圖 9C報告了在非人靈長類動物（M1、M2、M3、M4和M6）中以3000 µg/kg或3 mg/kg（圖 9A）、以3 µg/kg（圖 9B）以及以0.5 µg/kg（圖 9C）投予本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白後，長達28天的CD123陽性嗜鹼性粒細胞消耗。

圖 10A - 圖 10B報告了在NK細胞健康供體樣品（D648）的存在下，兩種NKp46-CD123 NKCE Fc勝任結合蛋白（本揭露的NKp46-CD123_F25和NKp46-CD123_F5）以及結合CD123和CD16a但不結合NKp46的形式F5的對照變異體（CD123-IC_F5）針對兩種AML細胞株MOLM-13（圖 10A）和THP-1（圖 10B）的體外細胞毒性。

圖 11左側小圖報告了通過用NKp46-CD123_F25（CD123-NKCE；劑量範圍0.001至10 µg/mL）、NKCE同種型對照NKp46-IC_F25（IC-NKCE；不結合CD123但結合NKp46和CD16a）（劑量範圍0.001至10 µg/mL）或CD3-CD123雙特異性T細胞接合體（CD123-TCE工具；0.001至0.1 µg/mL）處理在體外誘導的健康供體PBMC中（ N= 10）的CD123陽性嗜鹼性粒細胞消耗。中間小圖報告了在測試的最高劑量（10 µg/mL，68 nM）下的NKp46-CD123_F25最大消耗活性。右側小圖報告了根據六名健康供體的PBMC的NKp46-CD123_F25劑量反應計算的CD123陽性嗜鹼性粒細胞消耗的EC ₅₀（pM）。

圖 12展示在用劑量為0.1、1和10 µg/mL的NKp46-CD123_F25、NKCE同種型對照NKp46-IC_F25（不結合CD123但結合NKp46和CD16a）或劑量為0.1 µg/mL的共靶向CD123和CD3結合位點的雙特異性T細胞接合體工具（TCE工具）處理後，健康供體PBMC（ N= 10）的IL-1β、TNF-α、IFN-γ（在圖上寫作INFg）和IL-6細胞因子體外釋放。

圖 13A - 圖 13F顯示了對於6隻雄性食蟹猴（M1至M6），與3000 µg/kg（圖 13A 和圖 13B）、3 µg/kg（圖 13C 和圖 13D）、0.5 µg/kg（圖 13E）和＜ 0.5 µg/kg（圖 13F）的NKp46-CD123_F25結合蛋白濃度相關聯的單獨IL-6和IL-10血漿濃度與時間曲線。

圖 14A展示如與對NKp46無特異性的抗CD123 ADCC增強抗體（參考1）和ADCC活性增加且對NKp46和CD123二者無特異性的陰性同種型對照Fc優化抗體（IC-hIgG1-ADCC-enh）相比，本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白針對表現（#AML5、#AML6）或不表現（#AML1、#AML2）CD64的來自患者的AML胚細胞的細胞毒性。來自AML患者的惡性細胞用作靶標，並且純化的健康供體NK細胞用作效應子。顯示了測試的所有健康供體NK細胞的結果。

圖 14B報告了來自圖14A中使用的患者的惡性AML細胞的表型，其通過流式細胞術分析顯示了CD33、CD123、CD32a/b和CD64的表現。

圖 15A是靶向腫瘤細胞上的CD123並且不接合NK細胞（IC-CD123_F6）或者僅通過CD16a接合NK細胞（IC-CD123_F25）或者僅通過NKp46接合NK細胞（NKp46-CD123_F6）或者共接合NKp46+CD16（NKp46-CD123_F25）的NKCE的細胞毒性的比較。MOLM-13細胞用作靶細胞，並且純化的靜息健康供體NK細胞用作效應子。顯示了兩個NK供體。

圖 15B報告了與不結合CD123的陰性同種型對照NKCE分子（NKp46-IC_F25）相比，本揭露的NKp46-CD123_F25結合蛋白針對AML細胞株MOLM-13的細胞毒性。顯示了五名健康NK細胞供體的結果。

圖 16A是來自AML患者（AML #8-#10）的NK細胞和惡性細胞的流式細胞術分析。上部小圖展示AML胚細胞上CD123的表現（對CD33陽性群體進行門控）；中間小圖展示CD123陽性AML胚細胞上CD64的表現（CD64染色呈黑色且同種型對照呈灰色）；並且下部小圖展示NK AML樣品NK細胞上NKp46和CD16a的表現。

圖 16B是在對在其胚細胞(blast)的細胞表面處表現CD64（AML #8和#9）和不表現CD64（AML #10）的來自AML患者樣品的PBMC用NKp46-CD123_F25（CD123-NKCE）、對NKp46無特異性的抗CD123 ADCC增強抗體（圖中的參考1或CD123-IgG1+）、不結合CD123但結合NKp46和CD16a的對照同種型NKp46-IC_F25（600和120 ng/mL）（IC-NKCE）以及IgG1同種型對照（600 ng/ml）（IC-IgG1+）處理過夜後，對NK細胞的CD107a/b表現的分析。

圖 17顯示在使用與或不與MOLM-13細胞共培養的NK細胞（NK + MOLM-13相對於僅NK）的實驗環境中，與包括僅接合NKp46和CD16的結合蛋白（NKp46-IC_F25）的對照相比，用漸增濃度的NKp46-CD123_F25處理的NK細胞的標記表現（CD107、CD69、TNF-α、IFN-γ和MIP-1β）表現的百分比。顯示了三個NK細胞供體的結果。

圖 18顯示了在SCID小鼠中，替代muNKp46-huCD123_F25雙特異性抗體（也稱為moNKp46-huCD123）針對播散性人類AML即MOLM-13的活性。在第0天以單次投予靜脈內注射MOLM-13細胞。在腫瘤植入後第1天通過腹膜內途徑投予治療。以0.5 mg/kg投予結合muNKp46和鼠FcγR但不結合huCD123的同種型對照抗體（muNKp46-IC）。以5、0.5、0.25和0.05 mg/kg投予muNKp46-huCD123_F25和參考1。不治療對照組。圖表表示通過muNKp46-huCD123_F25雙特異性抗體、參考1和對照以 5、0.5、0.25和0.05 mg/kg治療的動物的Kaplan-Meier曲線。***：與對照組相比，p ＜ 0.001；**：與對照組相比，p ＜ 0.01；*：與對照組相比，p ＜ 0.05；###：與參考1相比，p ＜ 0.001；#：與參考1相比，p＜ 0.05。n = 5至10隻小鼠/組。

圖 19評估在帶有播散性人MOLM-13腫瘤細胞的SCID小鼠中，NK消耗對替代muNKp46-huCD123_F25雙特異性抗體的體內功效的影響。通過在腫瘤細胞植入前一天和在植入後第5天，抗去唾液酸GM1血清的2次腹膜內投予來誘導NK消耗。在第0天以單次投予靜脈內注射MOLM-13細胞。在腫瘤植入後第1天腹膜內投予治療。另評估對照組，包括結合muNKp46和鼠FcγR但不結合huCD123的同種型對照抗體（muNKp46-IC）以及結合huCD123和鼠FcγR但不結合鼠NKp46的第二同種型對照抗體（IC-huCD123）。圖表表示通過muNKp46-huCD123_F25雙特異性抗體和對照（muNKp46-IC、IC-huCD123）以0.5、0.25和0.05 mg/kg治療的動物的Kaplan-Meier曲線。n = 10隻小鼠/組。***：與對照組相比，p ＜ 0.001；**：與對照組相比，p ＜ 0.01；###：與相同治療 + NK消耗相比，p ＜ 0.001；#：與相同治療 + NK消耗相比，p ＜ 0.05。

圖 20A描繪了CD123陽性嗜鹼性粒細胞從作為單一1小時靜脈內輸注以3 μg/ kg低劑量治療的猴子M3和M4血液的消耗。在用劑前（劑量前）和在開始輸注後24小時收集血樣，並通過流式細胞術進行分析。CD123陽性嗜鹼性粒細胞顯示在門中。

圖 20B展示在作為單一1小時靜脈內輸注以3 mg/kg治療的猴子M1（橙色）和M2（紫色）中以及作為單一1小時靜脈內輸注以3 µg/kg治療的猴子M3（紅色）和M4（藍色）中，在研究時循環CD123陽性嗜鹼性粒細胞（空心符號）和總CD123陽性白細胞（實心符號）的數量。

圖 20C報告了在作為單一1小時靜脈內輸注以分別為3 mg/kg和3 µg/kg的高劑量和低劑量治療的食蟹猴中的細胞因子產生。顯示在用劑前（0）以及在開始治療後1.5、5和24小時的血漿IL-6和IL-10濃度。

圖 20D報告了在開始1小時輸注後1.5、5、24、48、72、168、240、336、504和672小時（即，0.04、0.06、0.21、1、2、3、7、10、14、21和28天）監測的用3 mg/kg和3 µg/kg的高劑量和低劑量治療的食蟹猴的血漿NKp46-CD123_F25（CD123-NKCE）濃度。定量下限（LLOQ；0.25 ng/mL）由水平虛線指示。

圖 21A顯示在每週以3 mg/kg/投予的劑量治療持續四週（在第1天、第8天、第15天和第22天）的雄性猴子M5中，NKp46-CD123_F25（CD123-NKCE）分子的毒物代謝動力學（TK）。在第1天、第8天、第15天用劑前（劑量前）和開始1小時輸注後1、1.5、5、24和/或72小時，以及在第22天用劑前和開始1小時輸注的最後四分之一後1、1.5、5、24和168小時，確定血漿CD123-NKCE濃度。在圖中未報告低於定量下限（LLOQ：0.25 ng/mL）的值。輸注日由豎直虛線指示。

圖 21B是在每週用3 mg/kg/投予的高劑量治療持續四週的猴子M5中，對介白素-6產生的分析。在第1天、第8天、第15天用劑前和開始一小時輸注後1、1.5、5和24小時，以及在第22天用劑前和開始一小時輸注的最後四分之一後1、1.5、5、24和168小時，監測血漿IL-6濃度。

圖 21C對於以3 mg/kg/週的劑量治療的猴子M5，依據研究中的時間點，對血液（左側小圖）或骨髓（右側小圖）中的循環CD123陽性嗜鹼性粒細胞（空心符號）和總CD123陽性白細胞（實心符號）的數量進行定量。

圖 22以圖表描繪了在使用來自2個健康供體（HD）的人外周血單個核細胞（PBMC）的測定中的THP1細胞毒性活性。在0.1、1、10和100 ng/mL的NKp46-CD123_F25或其同種型對照IC-CD123_F6的存在下培育NK細胞和THP1 GFP靶細胞，所述同種型對照以其Fc沉默形式接合CD123並誘導降低的ADCC活性（F6）。

Claims

一種結合蛋白，其包含第一和第二抗原結合結構域(ABD)以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)，其中每個VH和VL包含三個互補決定區(CDR-1至CDR-3)；並且其中：(i) 所述第一ABD與人CD123特異性結合並且包含：- VH1，其包含分別包含SEQ ID NO: 1至3的胺基酸序列或分別包含SEQ ID NO: 4至6的胺基酸序列的CDR-H1、H2和H3，和- VL1，其包含分別包含SEQ ID NO: 7至9的胺基酸序列或分別包含SEQ ID NO: 10至12的胺基酸序列的CDR-L1、L2和L3；(ii) 所述第二ABD與人NKp46特異性結合並且包含：- VH2，其包含含有以下的CDR-H1、2和3：分別SEQ ID NO: 13至15的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 16至18的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 19至21的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 22至24的胺基酸序列；或者分別SEQ ID NO: 16、25和26的胺基酸序列；以及- VL2，其包含含有以下的CDR-L1、2和3：分別SEQ ID NO: 27至29的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 30至32的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 33至35的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 36至38的胺基酸序列；或者分別SEQ ID NO: 39、31和40的胺基酸序列；並且其中所述免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分結合人Fc-γ受體。
如請求項1所述的結合蛋白，其包含形成兩個ABD的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)，如下文所定義：輕鏈可變結構域1A(V_1A) – 輕鏈恒定結構域1A(C_1A) - 鉸鏈₁(C_H2-C_H3)_A(I)重鏈可變結構域1B(V_1B) – 重鏈恒定結構域1B(C_1B) - 鉸鏈₂- (C_H2-C_H3)_B- L₁- 重鏈可變結構域2A(V_2A) - 重鏈恒定結構域2A(C_2A) - 鉸鏈₃(II)輕鏈可變結構域2B(V_2B) - 輕鏈恒定結構域2B(C_2B) (III)其中：V_1A和V_1B形成結合對V₁(V_H1/V_L1)；V_2A和V_2B形成結合對V₂(V_H2/V_L2)；C_1A和C_1B形成對C₁(C_H1/C_L)，並且C_2A和C_2B形成對C₂(C_H1/C_L)，其中C_H1是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1並且C_L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；鉸鏈₁、鉸鏈₂和鉸鏈₃是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白鉸鏈區的全部或部分；(C_H2-C_H3)_A和(C_H2-C_H3)_B是相同或不同的，並且包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域2(C_H2)和免疫球蛋白重鏈恒定結構域3(C_H3)；L₁是胺基酸連接子。
如請求項2所述的結合蛋白，其中：C_1B是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1(C_H1)；C_2A是免疫球蛋白重鏈恒定結構域1(C_H1)；C_L包含免疫球蛋白κ輕鏈恒定結構域(C_κ)；(C_H2-C_H3)_A包含SEQ ID NO: 69的胺基酸序列；(C_H2-C_H3)_B包含SEQ ID NO: 70的胺基酸序列；鉸鏈₁包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列；鉸鏈₂包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列；鉸鏈₃包含SEQ ID NO: 77的胺基酸序列；L₁包含SEQ ID NO: 76的胺基酸序列。
如請求項2所述的結合蛋白，其包含通過至少一個二硫橋連接的至少兩條多肽鏈。
如請求項4所述的結合蛋白，其中所述多肽鏈(I)和(II)通過C_1A與鉸鏈₂之間的至少一個二硫橋來連接，和/或其中所述多肽鏈(II)和(III)通過鉸鏈₃與C_2B之間的至少一個二硫橋來連接。
如請求項2所述的結合蛋白，其中V_1A是V_L1，並且V_1B是V_H1。
如請求項2所述的結合蛋白，其中V_2A是V_H2，並且V_2B是V_L2。
如請求項2所述的結合蛋白，其中：- 多肽(I)由SEQ ID NO: 64的胺基酸序列組成；- 多肽(II)由SEQ ID NO: 65的胺基酸序列組成；及- 多肽(III)由SEQ ID NO: 66的胺基酸序列組成。
如請求項1所述的結合蛋白，其中根據EU編號，所述Fc區或其變異體的殘基N297包含N-連接醣基化，其中所述Fc區或其變異體係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同種型之人類Fc區或其變異體。
如請求項1所述的結合蛋白，其中所述Fc區或其變異體的全部或部分結合人類CD16A(FcγRIII)多肽。
如請求項1所述的結合蛋白，其中：(a) V_H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO:9的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的CDR-L3；(b) V_H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR-L3；(c) V_H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR-L3；(d) V_H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO:9的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR-L3；(e) V_H1包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR-L3；(f) V_H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO:12的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的CDR-L3；(g) V_H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的CDR-L3；(h) V_H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 19的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR-L3；(i) V_H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO:12的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 22的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR-L3；或者(j) V_H1包含含有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的CDR-H3；V_L1包含含有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的CDR-L3；V_H2包含含有SEQ ID NO: 16的胺基酸序列的CDR-H1；含有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的CDR-H2；含有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的CDR-H3；V_L2包含含有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列的CDR-L1；含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的CDR-L2；含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項1所述的結合蛋白，其中：(a) V_H1和V_L1分別包含SEQ ID NO: 41和43的胺基酸序列，或者分別包含SEQ ID NO: 42和44的胺基酸序列；和/或(b) V_H2和V_L2對應於包含分別SEQ ID NO: 45和53的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 46和54的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 47和55的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 48和56的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 49和57的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 50和58的胺基酸序列；分別SEQ ID NO: 51和59的胺基酸序列；或者分別SEQ ID NO: 52和60的胺基酸序列。
如請求項12所述的結合蛋白，其中：(a) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列；(b) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 46的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列；(c) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 47的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列；(d) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 48的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列；(e) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 49的胺基酸序列；VL₂包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列；(f) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 50的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列；(g) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列；(h) V_H1包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列；VL₂包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列；(i) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列；VL₂包含SEQ ID NO: 53的胺基酸序列；(j) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 46的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列；k) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 47的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列；(l) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 48的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列；(m) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 49的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列；(n) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 50的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列；(o) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列；(p) V_H1包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列；V_L1包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列；V_H2包含SEQ ID NO: 52的胺基酸序列；V_L2包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1所述的結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。
一種結合蛋白，其包括第一及第二抗原結合結構域(ABD)以及免疫球蛋白Fc區或其變異體的全部或部分，其中所述ABD中的每一個包含免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)，其中每個VH和VL包含三個互補決定區(CDR-1至CDR-3)；並且其中：(i) 所述第一ABD與人CD123特異性結合並且包含含有SEQ ID NO: 41胺基酸序列之V_H1以及含有SEQ ID NO: 43胺基酸序列之V_L1；以及(ii) 所述第二ABD與人NKp46特異性結合並且包含含有SEQ ID NO: 45胺基酸序列之V_H ₂以及含有SEQ ID NO: 53胺基酸序列之V_L ₂。
如請求項15所述的結合蛋白，其中根據EU編號，所述Fc區或其變異體的殘基N297包含N-連接醣基化，其中所述Fc區或其變異體係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同種型之人類Fc區或其變異體。
如請求項15所述的結合蛋白，其中所述Fc區或其變異體的全部或部分結合人類CD16A(FcγRIII)多肽。
一種醫藥組合物，其包含如請求項15所述的結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。
一種結合蛋白，其包含形成第一和第二抗原結合結構域(ABD)的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)，其中：多肽(I)由SEQ ID NO: 64的胺基酸序列組成；多肽(II)由SEQ ID NO: 65的胺基酸序列組成；及多肽(III)由SEQ ID NO: 66的胺基酸序列組成。
一種醫藥組合物，其包含如請求項19所述的結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。
一種結合蛋白，其包含形成第一和第二抗原結合結構域(ABD)的三條多肽鏈(I)、(II)和(III)，其中：多肽(I)包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列；多肽(II)包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列；及多肽(III)包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列。
一種醫藥組合物，其包含如請求項21所述的結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。