CN120988137A - 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体 - Google Patents

抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体

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Abstract

本发明涉及抗CD3抗体、抗CD123抗体和与CD3和/或CD123特异性结合的双特异性抗体，具体涉及与CD3特异性结合并与至少另一种抗原例如CD123特异性结合的抗体样结合蛋白。本发明还涉及与CD123特异性结合并与至少另一种抗原特异性结合的抗体样结合蛋白。本发明进一步涉及抗CD3抗体和抗CD123抗体。本发明还涉及包含本发明抗体样结合蛋白、抗CD3抗体或抗CD123抗体的药物组合物和其治疗癌症的用途。本发明进一步涉及包含编码所述抗体样结合蛋白、抗CD3或抗CD123抗体的序列的分离的核酸、载体和宿主细胞和所述抗CD123抗体作为诊断工具的用途。

Description

抗CD3抗体、抗CD123抗体和与CD3和/或CD123特异性结合的双 特异性抗体
本申请是申请日为2016年01月22日、申请号为202111365671.4、发明名称为“抗CD3抗体、抗CD123抗体和与CD3和/或CD123特异性结合的双特异性抗体”的分案申请的再分案申请(原申请号为201680017477.8)。
技术领域
本发明涉及与CD3特异性结合并与至少另一种抗原例如CD123特异性结合的抗体样结合蛋白。本发明进一步涉及抗CD3抗体和抗CD123抗体。本发明还涉及与CD123特异性结合并与至少另一种抗原特异性结合的抗体样结合蛋白。本发明还涉及包含本发明抗体样结合蛋白、抗CD3抗体或抗CD123抗体的药物组合物和其治疗癌症的用途。本发明进一步涉及包含编码所述抗体样结合蛋白序列、抗CD3或抗CD123抗体的分离的核酸、载体和宿主细胞和所述抗CD123抗体作为诊断工具的用途。
背景技术
第一代双特异性抗体开发已逾20年。自那时起多项临床研究已测试了双特异性抗体工程化以靶向癌细胞表面抗原。这类抗癌症融合蛋白包含两个或多个在靶向的癌细胞附近定位的免疫效应细胞以获得抗癌活性的功能性结构域。
随着双特异性抗体技术的开发，称为双特异性T-细胞衔接器(BiTE)的另一组融合蛋白仅通过使用柔性接头连接两抗体单链可变区(scFv)(不包括Fc氨基酸区段)生成，一个scFv结合靶向的细胞且另一个结合T细胞表面的CD3。一种具有CD19xCD3双特异性结合活性的BiTE，blinatumomab，在针对具有B-系急性淋巴细胞中微小残留病变的患者的II期临床试验中展示了有前景的结果。
CD123(白细胞介素-3受体α链IL-3Rα)是在多种血液系统肿瘤中过表达的肿瘤抗原。大量AML母细胞表达表面CD123且该表达不随AML的亚型而变化。诊断时CD123在AML上的较高表达已报导与较差预后相关。已报导CD123在白血病干细胞(LSC)上表达。越来越多的证据表明AML从一直以来显示为静息的且对DNA损伤化疗相对有抗性的白血病干细胞发生。
与造血干细胞(HSC)相比LSC上增加的CD123表达因此提供用于靶向的治疗机会。
针对CD123产生的单克隆抗体(MAb)7G3先前已显示抑制白血病细胞系和原代细胞两者IL-3介导的增殖和活化(美国专利号6,177,078)。然而，靶向CD123是否可功能性损坏AML-LSC尚不清楚。
CD123xCD3抗体样结合蛋白的使用导致肿瘤细胞杀伤，如本文由发明人所示。
已提出产生具有CD123xCD3双特异性结合活性的的双特异性抗体样结合蛋白的构思以并描述于国际专利申请WO2013/173820中。
此外，来自MacroGenics的基于CD123 x CD3双亲和性再靶向(DART)双特异性抗体的分子已在2014进入I期临床试验。
然而，如由发明人所示，该来自MacroGenics的基于CD123xCD3双亲和性再靶向(DART)双特异性抗体的分子，例如，在靶细胞不存在时具有82％的表达CD4+的T-细胞活化和83％的表达CD8+的T-细胞活化。T-细胞不合适的活化可导致严重的副作用，如细胞因子释放综合征。细胞因子释放综合征指通过活化的T细胞产生与在严重感染中发现相似并通过低血压、发热和僵直表征的全身性炎性响应的细胞因子的释放。已报导由于细胞因子释放综合征导致的死亡例如对于OKT3。
因此，尽管双特异性抗体技术的这些进展，对于其他癌症疗法特别是有效直接或间接靶向并杀伤癌细胞的那些疗法存在需求。
发明人已成功生成、筛选并选择对于人和食蟹猴(Macaca fascicularis)CD3蛋白都展示高亲和力的特异性大鼠抗CD3抗体。
发明人开发了对抗原CD3和至少一种其他靶抗原具有生物和免疫特异性的抗体样结合蛋白。在一个实例中，为证明这些抗CD3抗体在双特异性抗体样结合蛋白生成中的用途，发明人生成了抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白并证明了其治疗用途。那些双特异性抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白具有低T-细胞活化，如对单独的抗CD3抗体所观察。然而，一旦CD12表达的靶细胞如THP-1细胞存在，所述双特异性抗CD3/抗CD123抗体样结合蛋白展示高T-细胞活化。相应地，上文定义的本发明的抗CD3抗体对于本发明抗体样结合蛋白的制备特别有效。
发明内容
具体地，本发明涉及如下各项：
1.一种与人CD3ε蛋白细胞外结构域结合的分离抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其含有由序列GFX1X2X3X4AW(SEQ ID NO:331)组成的CDR1-H，其中X1是T或S，X2是F或V，X3是S或T且X4是N、K、L或Y，或其任何组合；和
由序列IKX1X2X3NX4YX5T(SEQ ID NO:332)组成的CDR2-H，其中X1是A或D，X2是K或R，X3是S或A，X4是N或S且X5是A或E，或其任何组合；和
由序列TWRHYYSSHTMDA(SEQ ID NO:69)或RALTYYGYKRDAMDG(SEQ ID NO:129)或RX1X2X3YX4X5X6X7X8X9X10X11DX12(SEQ ID NO:333)组成的CDR3-H，其中X1是Y、G或A，X2是V、T或L，X3是H、N、Y或Q，X4是G、R或A，X5是F或V或无氨基酸，X6是R或无氨基酸，X7是F、S或I或无氨基酸，X8是F、L、N、M、Y、S、A或G，X9是Y、A、K、S、N、T、F或L，X10是A、P、G或T，X11是M、L、F或S且X12是A、V或Y，或其任何组合，和
轻链可变结构域，其含有由序列QX1LX2HX3NGX4TY(SEQ ID NO:334)组成的CDR1-L，其中X1是R或S，X2是V或E，X3是N、D或T且X4是N或Y，或其任何组合；和
由序列‘KVS’组成的CDR2-L；和
由序列GQGX1X2YPFT(SEQ ID NO:335)组成的CDR3-L，其中X1是T、A或S且X2是H、E或Q，或其任何组合；或
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:30或与SEQ ID NO:30的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:31或与SEQ ID NO:31的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:32或与SEQ ID NO:32的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:34或与SEQ ID NO:34的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RDD’或与序列‘RDD’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:35或与SEQ ID NO:35通过氨基酸取代不同的序列的CDR3-L；或
b)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:50或与SEQ ID NO:50的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:51或与SEQ ID NO:51的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:52或与SEQ ID NO:52的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:54或与SEQ ID NO:54的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；‘NAN’或与序列‘NAN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:55或与SEQ ID NO:55的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
c)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:90或与SEQ ID NO:90的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:91或与SEQ ID NO:91的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:32或与SEQ ID NO:32的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:93或与SEQ ID NO:93的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘GAS’或与‘GAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:94或与SEQ ID NO:94的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
d)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:96或与SEQ ID NO:96的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:97或与SEQ ID NO:97的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:98与SEQ ID NO:98的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100或与SEQ ID NO:100的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘NTN’或与序列‘NTN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:101或与SEQ ID NO:101的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
e)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:103或与SEQ ID NO:103的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:104或与SEQ ID NO:104的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:105或与SEQ ID NO:105的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与序列‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
f)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:116或与SEQ ID NO:116的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:117或与SEQ ID NO:117的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:118或与SEQ ID NO:118的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100或与SEQ ID NO:100的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘VTN’或与序列‘VTN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:120或与SEQ ID NO:120的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
g)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:122或与SEQ ID NO:122的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:123或与SEQ ID NO:123的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:124或与SEQ ID NO:124的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:126或与SEQ ID NO:126的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RDD’或与序列‘RDD’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:127或与SEQ ID NO:127的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L。
2.根据项1所述的分离抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:6的CDR1-H，序列SEQ ID NO:7的CDR2-H，序列SEQ ID NO:8的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:142的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
b)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:14的CDR2-H，序列SEQ ID NO:15的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:184的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
c)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:20的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:22的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
d)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:24的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:25的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:27的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
e)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:30的CDR1-H，序列SEQ ID NO:31的CDR2-H，序列SEQ ID NO:32的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:34的CDR1-L，序列‘RDD’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:35的CDR3-L；或
f)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:38的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
g)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:41的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
h)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:44的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
i)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:47的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
j)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:50的CDR1-H，序列SEQ ID NO:51的CDR2-H，序列SEQ ID NO:52的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:54的CDR1-L，序列‘NAN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:55的CDR3-L；或
k)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:57的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:58的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
l)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:61的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
m)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:64的CDR1-H，序列SEQ ID NO:65的CDR2-H，序列SEQ ID NO:47的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:67的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
n)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:69的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:71的CDR3-L；或
o)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:84的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
p)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:75的CDR1-H，序列SEQ ID NO:76的CDR2-H，序列SEQ ID NO:77的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
q)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:80的CDR1-H，序列SEQ ID NO:76的CDR2-H，序列SEQ ID NO:81的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
r)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:84的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
s)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:47的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:88的CDR3-L；或
t)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:90的CDR1-H，序列SEQ ID NO:91的CDR2-H，序列SEQ ID NO:32的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:93的CDR1-L，序列‘GAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:94的CDR3-L；或
u)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:96的CDR1-H，序列SEQ ID NO:97的CDR2-H，序列SEQ ID NO:98的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100的CDR1-L，序列‘NTN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:101的CDR3-L；或
v)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:103的CDR1-H，序列SEQ ID NO:104的CDR2-H，序列SEQ ID NO:105的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
w)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:80的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:108的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
x)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:111的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:113的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:114的CDR3-L；或
y)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:116的CDR1-H，序列SEQ ID NO:117的CDR2-H，序列SEQ ID NO:118的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100的CDR1-L，序列‘VTN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:120的CDR3-L；或
z)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:122的CDR1-H，序列SEQ ID NO:123的CDR2-H，序列SEQ ID NO:124的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:126的CDR1-L，序列‘RDD’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:127的CDR3-L；或
aa)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:129的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
bb)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:103的CDR1-H，序列SEQ ID NO:104的CDR2-H，序列SEQ ID NO:105的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:133的CDR1-L，序列‘LVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:134的CDR3-L。
3.一种与人CD3ε特异性结合的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽具有通过式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽具有通过式[II]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对，且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含如项1所限定的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
4.根据项3所述的抗体样结合蛋白，其中式[II]所述多肽进一步包含Fc结构域。
5.根据项3或4所述的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中一条多肽链具体通过式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且一条多肽链具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白是免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式III的多肽形成交叉轻链-重链对，且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含如项1所限定的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
6.根据项4或5所述的抗体样结合蛋白，其中所述式[I]的多肽进一步包含Fc结构域(Fc2)。
7.根据项4-6中任一项所述的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中一条多肽链具有通过式[IV]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]
且一条多肽链具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
Fc2是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头；
其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉轻链。
8.根据项4或5所述的抗体样结合蛋白，其包含含有Fc结构域(Fc3)的第三多肽链。
9.根据项4、5和8中任一项所述的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的三条多肽链，其中：
第一多肽具有通过式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
第二多肽具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
第三多肽Fc3，其是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
其中
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3,和L4是氨基酸接头；
且其中式[I]的多肽和式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对，
其中式[III]的多肽与第三多肽通过其Fc结构域异二聚化；且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含如项1所限定的重链可变结构域和轻链可变结构域。
10.根据项3-9中任一项所述的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结合蛋白与至少另一靶抗原结合。
11.根据项10所述的抗体样结合蛋白，其中所述至少另一抗原靶是CD123。
12.根据项11所述的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结合蛋白包含：
a)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:9或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:5或与其至少85％相同的序列组成，或
b)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:21或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:18或与其至少85％相同的序列组成，或
c)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:16或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:12或与其至少85％相同的序列组成，或
d)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域，其由氨基酸序列SEQ ID NO:26或与其至少85％相同的序列组成(VD1)，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:23或与其至少85％相同的序列组成，或
e)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:143或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:138或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，或
f)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:158或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:171或与其至少85％相同的序列组成，
g)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:230或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:158或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:171或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:226或与其至少85％相同的序列组成，
h)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:385或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:141或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:138或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:383或与其至少85％相同的序列组成。
13.根据项3所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[I]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2和序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388组成，或
由与SEQ ID NO:388至少85％相同的序列组成，其中VD1的序列SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR，和VD2的序列SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变，和
b)根据式[II]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0氨基酸、序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0氨基酸和序列SEQ ID NO:313的CH1的氨基酸序列SEQ ID NO:390组成，或
与SEQ ID NO:390至少85％相同的序列组成，其中VD4的序列SEQ ID NO:381、SEQID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR和VD3的序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；
且其中所述式[I]的多肽和所述式[II]的多肽形成交叉轻链-重链对。
14.根据项6或7所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[IV]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2、序列SEQ ID NO:310的CL、包含0氨基酸的L5和序列SEQ ID NO:392的Fc2的氨基酸序列SEQ ID NO:391组成，或
与SEQ ID NO:391至少85％相同的序列组成，其中VD1的序列SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR和VD2的序列SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变；和
b)根据式[III]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0氨基酸、序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0氨基酸和序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:394的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:393组成，或
与SEQ ID NO:393至少85％相同的序列组成，其中VD4的序列SEQ ID NO:381、SEQID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和VD3的序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；
且其中所述式[IV]的多肽和所述式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对。
15.根据项8或9所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[I]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2、和序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388组成，或
与SEQ ID NO:388至少85％相同的序列组成，其中VD1的SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR和VD2的序列SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变；和
b)根据式[III]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0氨基酸、序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0氨基酸和序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:396的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:395组成，或
与SEQ ID NO:395至少85％相同的序列组成，其中VD4的序列SEQ IDNO:381、SEQ IDNO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和VD3的序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；和
c)一条多肽Fc3，其由序列SEQ ID NO:397或与其至少85％相同的序列组成，其中所述Fc3或与其至少85％相同的序列与根据式[III]的多肽的Fc区异二聚化；且
其中所述式[I]的多肽和所述式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对。
16.根据项8或9所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[I]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2和序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388组成，或
与SEQ ID NO:388至少85％相同的序列，其中VD1的序列SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR，和VD2序列SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变；和
b)根据式[III]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0氨基酸、序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0氨基酸和序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:400的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:399组成，或
与SEQ ID NO:399至少85％相同的序列，其中VD4的序列SEQ ID NO:381、SEQ IDNO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和VD3序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；和
c)一条多肽Fc3，其由序列SEQ ID NO:398或与其至少85％相同的序列组成，其中所述Fc3或与其至少85％相同的序列与根据式[III]的多肽的Fc区异二聚化；且
其中所述式[I]的多肽和所述式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对。
17.一种与人CD123蛋白细胞外结构域结合的分离抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:227或与SEQ ID NO:227的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:353或SEQ ID NO:279，或与SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:353或SEQ ID NO:279的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:229或与SEQ ID NO:229的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:231或与SEQ ID NO:231的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RDD’或与‘RDD’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:232或与SEQ ID NO:232的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
b)重链可变结构域，其含有由序列X1YTFTDX2I(SEQ ID NO:336)组成的CDR1-H，其中X1是G或A且X2是H、Y或N，或其任何组合；和
由序列INPYSX1GX2(SEQ ID NO:337)组成的CDR2-H，其中X1是G或D且X2是T或A，或其任何组合；和
由序列ALNYGSYYAMDA(SEQ ID NO 201)组成的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有由序列X1DIX2X3N(SEQ ID NO:338)组成的CDR1-L，其中X1是E或K，X2是F、H或Y且X3是N或S，或其任何组合；和
由序列‘DAN’或‘DAS’组成的CDR2-L；和
由序列X1QYNX2YPYT(SEQ ID NO:339)组成的CDR3-L，其中X1是H或Q且X2是I、K或N，或其任何组合；或
c)重链可变结构域，其包含由序列GFSLTSYX1(SEQ ID NO:340)组成的CDR1-H，其中X1是H或S；和
由序列MWX1DGDT(SEQ ID NO:341)组成的CDR2-H，其中X1是S或N；和
由序列ARGX1X2X3X4X5X6X7X8X9FX10Y(SEQ ID NO:342)组成的CDR3-H，其中X1是D、Y或H，X2是Y或R，X3是S或T，X4是S或P，X5是Y或无氨基酸，X6是L、I或无氨基酸，X7是Y或无氨基酸，X8是L或无氨基酸，X9是W或无氨基酸，X10是A或D，或其任何组合，和
轻链可变结构域，其包含由序列QSFLSSGDX1X2NY(SEQ ID NO:343)组成的CDR1-L，其中X1是E或G且X2是R或K，或其任何组合；和
由序列‘WAS’组成的CDR2-L；和
由序列QQYYDTPLT(SEQ ID NO:253)组成的CDR3-L，或
d)重链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:206或与SEQ ID NO:206的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:207或与SEQ ID NO:207的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:208或与SEQ ID NO:208的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:210或与SEQ ID NO:210的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘ETS’或与‘ETS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:211或与SEQ ID NO:211的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
e)重链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:213或与SEQ ID NO:213的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:214或与SEQ ID NO:214的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:215或与SEQ ID NO:215的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:217或与SEQ ID NO:217的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘NTN’或与‘NTN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:218或与SEQ ID NO:218的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
f)重链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:220或与SEQ ID NO:220的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:221或与SEQ ID NO:221的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:222或与SEQ ID NO:222的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:224或与SEQ ID NO:224的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RVS’或与‘RVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:225或与SEQ ID NO:225的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
g)重链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:234或与SEQ ID NO:234的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:235或与SEQ ID NO:235的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:236或与SEQ ID NO:236的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:238或与SEQ ID NO:238的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘GAS’或与‘GAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:239或与SEQ ID NO:239的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
h)重链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:241或与SEQ ID NO:241的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:242或与SEQ ID NO:242的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:243或与SEQ ID NO:243的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:245或与SEQ ID NO:245的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘YAS’或与‘YAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:246或与SEQ ID NO:246的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L。
18.一种与人CD123特异性结合的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽具有通过式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽具有通过式[II]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述第一和所述第二多肽形成交叉轻链-重链对；且
其中所述VD1和VD4或VD2和VD3包含如项17所限定的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
19.一种药物组合物，其包含根据项3-16或18中任一项所述的抗体样结合蛋白或根据项17的抗CD123抗体或根据项1或2的抗CD3抗体和药物上可接受的载剂。
20.根据项3-16或18中任一项所述的抗体样结合蛋白或根据项17的抗CD123抗体或根据项1或2的抗CD3抗体或根据权利要19的药物组合物作为药物的用途。
21.根据项3-16或18中任一项所述的抗体样结合蛋白，或根据项17的抗CD123抗体或其药物组合物用于治疗癌症的用途。
22.根据项1或2所述的抗CD3抗体或其药物组合物用于预防或治疗病理性免疫应答中的用途。
23.用于根据项21所述的用途的抗体样结合蛋白、抗体或药物组合物，其中所述癌症是血液癌症。
24.一种治疗或预防疾病或病症的方法，其包括：将治疗上有效的量的根据项3-16或18任一项的抗体样结合蛋白，或根据项17的抗CD123抗体，或根据项1或2的抗CD3抗体或根据项19的药物组合物施用至有需要的受试者。
25.一种分离的核酸，其包含编码根据项3-16或18中任一项所述的抗体样结合蛋白，或根据项17所述的抗CD123抗体，或根据项1或2所述的抗CD3抗体的序列。
26.一种宿主细胞，其已由根据项25所述的核酸转化。
27.一种试剂盒，其包含至少一种根据项1、2或17中任一项所述的抗体、至少一种根据项3-16中任一项所述的抗体样结合蛋白。
28.根据项17所述的抗体用于在受试者的生物样品中离体或体内检测CD123表达的用途。
29.根据项28所述的抗体的用途，其中所述抗体用可检测的分子或物质标记。
30.根据项28-29中任一项所述的抗体的用途，其中所述用途是用于诊断受试者中癌症的存在、确定具有癌症的患者对靶向CD123的治疗剂的易感性，或抗CD123癌症疗法后监测抗CD123癌症疗法或检测癌症复发的有效性。
31.根据项30所述的抗体的用途，其中所述抗CD123癌症疗法使用根据项3-16或18中任一项的所述抗体样结合蛋白或根据项17所述的抗CD123抗体。
附图说明
图1:称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“3H6-D2”抗CD3抗体VH区的序列比对。
图2:称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“3H6-D2”抗CD3抗体的VL区的序列比对。
图3:称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的VH和VL区的序列比对。
图4:称为“6C10-C4”、9B8-G6”、“9D7-C8”抗CD123抗体的VH和VL区的序列比对。
图5和图7:人T细胞中存在的完整人CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在全部机体中在所有所测试剂量都抑制Molm13肿瘤生长。
图6和图8:人T细胞中存在的完整人CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在长骨中在所有所测试剂量都与肿瘤消退相关。
图9和图11:人T细胞中存在的完整人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”IV抑制肿瘤生长。
图10和图12:人T细胞中存在的完整人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”IV在长骨中与肿瘤消退相关。
图13和图15:人T细胞中存在的完整人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”CIP以0.13nmol/Kg/天或更高的剂量抑制全机体肿瘤生长。
图14和图16:人T细胞中存在的完整人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”CIP在长骨中以0.13nmol/Kg/天或更高的剂量抑制肿瘤生长。
图17:CODV-Ig、CODV-Fab-TL和CODV-Fab-OL的结构图示(还展示了LALA突变(当使用IgG1的Fc骨架时)和Knob-into-Hole突变)。
具体实施方式
定义
贯穿本发明，术语“和/或”是语法上的结合进而应理解为其连接的涵盖一种或多种情况可发生。例如，词语"这种天然序列蛋白可使用标准重组和/或合成方法制备"这一表述表明天然的序列蛋白可使用标准重组和合成方法制备或天然序列蛋白可使用标准重组方法或天然序列蛋白可使用合成方法制备。
此外，贯穿本发明，术语“包含”应理解为涵盖全部具体提及的特征以及任选的、额外的、未描述的一些。如本文使用，术语“包含”的使用还公开给出其中除具体提及的特征而无其他特征的实施方案(即“由…组成”)。此外，不定冠词"一个"或"一种"不排除复数。某些措施记载在相互不同的从属权利要求中这一事实并不表明不能有利地使用这些措施的组合。
术语"基因"意为编码或对应包含一个或多个蛋白或酶的特定氨基酸序列的DNA序列，且可包含或不包含调节性DNA序列如启动子序列(其例如确定在何种条件下基因表达)。一些并非为结构基因的基因，可从DNA转录成RNA，但不翻译成氨基酸序列。其他基因可作为结构基因的调节子或作为DNA转录的调节子发挥功能。具体地，术语基因可以表示编码蛋白的基因组序列，即包含调节子、启动子、内含子和外显子序列的序列。
“与参照序列至少85％相同”的序列是在其全长上与参照序列的全长具有85％或更多，具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在本发明的上下文中，“同一性的百分数”使用全域双序列比对(即将两序列在其全长上比较)计算。用于比对两或多序列同一性的方法为本领域熟知。当考虑其全长时，例如可使用应用Needleman-Wunsch全域比对算法的《needle》程序(Needleman和Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)已发现两序列的最佳排列(包括缺口)。Needle程序例如可在ebi.ac.uk全球网站上获得。依据本发明两多肽间同一性的百分数使用具有“缺口开放”参数等于10.0、“缺口延伸(Gap Extend)”参数等于0.5和Blosum62矩阵的EMBOSS:needle(global)程序计算。
由与参照序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同”的氨基酸序列组成的蛋白与参照序列相比可包含突变如缺失、插入和/或取代。在取代的情况中，由与参照序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的蛋白可对应源自不同于参照序列的物种的同源序列。
“氨基酸取代”可以是保守或非保守的。优选地，取代为保守取代，其中一个氨基酸由具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。所述取代优选对应如下表所示的保守取代。
保守取代 氨基酸类型
Ala、Val、Leu、lle、Met、Pro、Phe、Trp 具有脂肪族疏水性侧链的氨基酸
Ser、Tyr、Asn、Gln、Cys 具有不带电荷但极性侧链的氨基酸
Asp、Glu 具有酸性侧链的氨基酸
Lys、Arg、His 具有碱性侧链的氨基酸
Gly 中性侧链
“抗体”也称为“免疫球蛋白“其可以是天然或常规的抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接且每条重链与轻链通过二硫键连接。存在两种类型的轻链，、λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分别称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链V区的CDR集合。
在本发明的上下文中，抗体或免疫球蛋白是IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文使用的"人框架区"是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
在本发明的上下文中，免疫球蛋白轻链或重链中CDR/FR的限定基于IMGT的定义确定(Lefranc等Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1):55-77；www.imgt.org)。
如本实验的术语“抗体”指代常规抗体及其片段以及单结构域抗体及其片段，具体地单结构域抗体的可变重链和嵌合、人源化、双特异性或多重特异性抗体。
如本文使用的抗体或免疫球蛋白还包括近来更多描述且其互补决定区是单结构域多肽部分的“单结构域抗体”。单结构域抗体的实例包括重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、源自常规四链抗体的单结构域抗体、工程化单结构域抗体。单结构域抗体可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、羊、兔、牛。单结构域抗体可以是天然存在的已知为缺乏轻链的重链抗体的单结构域抗体。具体地，骆驼科(Camelidae)物种例如骆驼、单峰骆驼(dromedary)、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)和原驼(guanaco)产生天然缺乏轻链的重链抗体。骆驼的重链抗体也缺乏CH1结构域。
这些缺乏轻链的单结构域抗体的可变重链在本领域中已知为“VHH”或“纳米抗 体”。与常规VH结构域相似的是VHH包含四个FR和三个CDR。纳米抗体比常规抗体具有优势：其比IgG分子小约十倍，且作为结果恰当折叠的功能性纳米抗体可通过体外表达产生并获得高产量。此外，纳米抗体非常稳定，且能抵抗蛋白酶的作用。Harmsen和De Haard HJ(Appl.Microbiol.Biotechnol.2007Nov；77(1)：13-22)已对纳米抗体的性质和产生进行了综述。
如本文使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指针对特定抗原的具有单一氨基酸组成的抗体分子，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。单克隆抗体可由B细胞或杂交瘤的单一克隆产生，但还可为重组的，即通过蛋白工程产生。
术语“嵌合抗体”指其最广泛意义上含有来自一种抗体的一个或多个区和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区的工程化抗体。具体而言，嵌合抗体包含衍生自非人动物的抗体的VH结构域和VL结构域，其与另一抗体(具体而言人抗体)的CH结构域和CL结构域联合。作为非人动物，可使用任何动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔等等。嵌合抗体还可指对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。
术语“人源化抗体”指起初完全或部分为非人来源，且已经修饰以置换某些氨基酸(具体而言重链和轻链的框架区中的氨基酸)以避免或最小化人中的免疫反应的抗体。人源化抗体的恒定结构域大多数为人CH和CL结构域。
多种用于抗体序列人源化的方法为本领域已知；参见例如Almagro和Fransson(2008)Front Biosci.13：1619-1633。一种常用方法是CDR移植或抗体重塑，其牵涉将供体抗体、通常为小鼠抗体的CDR序列移植入具有不同特异性的人抗体的框架支架中。由于CDR移植可降低CDR移植的非人抗体的结合特异性和亲和性，且因此降低生物活性，所以可在CDR移植抗体的所选位置引入回复突变进而保留亲代抗体的结合特异性和亲和性。可使用可在文献和抗体数据库中获得的信息实施用于可能的恢复突变的位点识别。用于回复突变的候选者的氨基酸残基通常是位于抗体分子的表面的那些，而包埋或具有低表面暴露度的残基通常将不发生变化。CDR移植和回复突变的替代性人源化技术是表面重修，其中保留非人来源的非表面暴露残基，而将表面残基改变为人残基。另一可替代的技术称为“引导选择”(Jespers et al,(1994)Biotechnology 12,899)且可用于从鼠类或大鼠抗体衍生保留亲代抗体表位和结合特征的全人抗体。人源化的另一方法称为4D人源化。4D人源化方案描述于专利申请US20110027266 A1(WO2009032661A1)且例证于下列4D人源化的应用以人源化大鼠抗体可变轻链(VL)和可变重链(VH)结构域。在一个实例中，大鼠抗体同源模型用典型的MOE软件(v.2011.10-Chemical Computing Group,Quebec,Canada)使用PDB结构(Berman等,Nucleic Acids Research,2000,28:235-242)作为模板完成且随后使用MOE中实施的标准步骤最小化能量。随后在大鼠抗体上的3D同源模型(用MOE软件完成)上实施分子动态(MD)模拟并与例如源自由LGCR/SDI设计的7种代表性轻链(vk1、vk2、vk3、vk4、vλ1、vλ2、vλ3)和7种代表性重链(vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)且在MOE内可获得的49种人模型进行了比较。例如，选择了疏水性、静电组分和CDR外的序列同一性都最佳的链对的一个模型(Vkx-Vhx)用于“4D人源化”。对于大鼠抗体可变结构域和所选模型间的配对缔合，通常基于相应同源模型的α碳的最佳3D叠加比对序列。随后考虑并突变不想要的基序。最后，获得的人源化序列针对序列相似性进行使用例如IEDB数据库(http://www.immuneepitope.org；版本2012/01/30本地可获得)比对以确保无序列包含任何列举的已知B-或T-细胞表位。
对于嵌合抗体，人源化通常涉及可变区序列框架区的修饰。
CDR部分的氨基酸残基通常在人源化方面将不改变，尽管在一些情况中，想要改变个体CDR氨基酸残基，例如以去除糖基化位点、脱酰胺位点和不想要的半胱氨酸残基。N-连接的糖基化通过三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中寡糖链附着至天冬氨酸残基发生，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸。N-糖基化位点的去除可通过突变Asn或Ser/Thr残基至不同残基实现，具体地通过保守取代的方式。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的去酰胺可取决于因素如pH和表面暴露的发生。天冬酰胺残基通常对去酰胺易感，首要是当存在于序列Asn-Gly中时，且在其他二肽序列如Asn-Ala中程度较少。当该去酰胺位点特别是Asn-Gly存在于CDR序列中，因此可预期通常通过保守取代去除所述位点以去除牵涉的残基之一。CDR序列中的取代以去除牵涉的残基之一也意在涵盖于本发明中。
(常规)抗体的“片段”包含完整抗体的一部分，具体而言完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括由抗体片段形成的Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、(dsFv)2、scFv、sC(Fv)2、双抗体、双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段还可为单一结构域抗体，例如重链抗体或VHH。
术语“Fab”表示具有约50,000分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中，H链的N末端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
术语“F(ab’)2”是指具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，在通过用一种蛋白酶即胃蛋白酶处理IgG所获得的片段中，其稍大于经由铰链区域的二硫键结合的Fab。
术语“Fab'”指具有约50,000分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过剪切F(ab')2铰链区的二硫键获得。
单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其通常由包括通过肽编码接头连接的编码VH和VL的基因的基因融合表达。本发明的人scFv片段包括具体而言通过使用基因重组技术来保持适当构象的CDR。二价和多价抗体片段可自发地通过单价scFv缔合来形成，或可通过肽接头偶联单价scFv来生成，例如二价sC(Fv)2。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异源二聚体。“(dsFv)2”指两个通过肽接头偶联的dsFv。
术语“双特异性抗体”或“BsAb”一般指将两个抗体的抗原结合位点结合于单一分子内的抗体。因此，BsAb能够同时结合两种不同抗原。已经使用基因工程以越来越高的频率设计、修饰并产生具有一组预期的结合性质和效应功能的抗体或抗体衍生物，例如如EP 2050 764 A1中所述。
术语“多特异性抗体”指将两种或更多种抗体的抗原结合位点结合于单一分子内的抗体。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
术语“杂交瘤”指一种细胞，其通过将由用抗原免疫非人哺乳动物制备的B细胞与衍生自小鼠等等的产生具有抗原特异性的预期单克隆抗体的骨髓瘤细胞进行细胞融合来获得。
当指代多肽(即本发明的抗体)或核苷酸序列时，“纯化”和“分离”意为指示的分子在基本上不存在相同类型的其他生物大分子的情况下存在。具体而言，如本文使用的术语“纯化”意为存在至少75％、85％、95％或98％重量的相同类型的生物大分子。编码特定多肽的“分离”核酸分子指实质上不含其他不编码主题多肽的核酸分子的核酸分子；然而，该分子可包含一些不会不利地影响组合物基本特性的其他碱基或部分。
如本文使用的术语"抗原"或"靶抗原"指能够由抗体或抗体样结合蛋白所结合的分子或分子的部分。该术语进一步指能够用于动物以产生能够与该抗原的表位结合的抗体的分子或分子的部分。靶抗原可具有一个或多个表位。对于每种由抗体或由抗体样结合蛋白识别的靶抗原，抗体样结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。
“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。亲和力可以例如由半数最大有效浓度(EC50)或平衡解离常数(KD)表述。
“半数最大有效浓度”还称为“EC50 ”，指特定暴露时间后在基线和最大值间诱导一半响应的药物、抗体或或毒物的浓度。EC50和亲和力呈负相关，EC50值越低，抗体的亲和力越高。
“KD ”是平衡解离常数，是抗体和其抗原间koff/kon的比率。KD和亲和力呈负相关。KD值涉及抗体浓度且KD值越低，抗体的亲和力越高。亲和力可通过多种已知的方法实验性评估，如用表面等离子体共振测量缔合和解离速率或在免疫化学试验(ELISA、FACS)中测量EC50。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种生化试验，其使用固相酶免疫试验以检测物质的存在，通常是在液体样品或湿性样品中的抗原。来自样品的抗原附着至表面。随后，将另一特异性抗体应用至表面进而其可与抗原结合。该抗体连接至酶，其在最终步骤中，添加包含酶的底物的物质。后续反应产生可检测的信号，最常用的是底物中的颜色改变。荧光活化的细胞分选(FACS)提供用于将生物细胞的非均匀混合物分选入两个或多个容器的方法，一个细胞一次，基于每个细胞的特定光散射和荧光特性。在这些试验中，EC50是通过ELISA(酶联免疫吸附试验)暴露至定义的抗原浓度或通过FACS(荧光活化细胞分选)的表达所述抗原的细胞上一些特定时间后诱导基线和最大值间一半响应的抗体浓度。表面等离子体共振是无标记的方法，其中可溶相(“分析物”)中分子的结合直接测量成在感应器表面上固定的“配体”分子。在感应装置中，配体的结合通过称为表面等离子体的光学现象监测。具体地，当“分析物”分子从“配体”分子解离时，观察到SPR信号(共振单元中表达，RU)的减少。缔合('开速率'，ka)和解离速率('关速率'，kd)从缔合和解离过程中获得的信号取得，且由此计算平衡解离常数('结合常数'，KD)和尤其计算。共振单元(RU)中给出的信号取决于分析物中存在的配体大小，然而在实验条件相同的情况中，即配体是在相同条件的相同分子，获得的RU可表示亲和力，其中RU中获得的信号越高，结合越高。
当对于两种抗原EC50在相似范围时，与抗原1(Ag1)结合的单克隆抗体与抗原2(Ag2)“交叉反应”。在本申请中，用相同方法针对两种抗原测量亲和力，当Ag2的亲和力比Ag1的亲和力的比率等于或小于10(具体地5、2、1或0.5)时，与Ag1结合的单克隆抗体与Ag2交叉反应。
当针对两抗原的亲和力非常不同时，与Ag1结合的单克隆抗体与Ag2“不显著交叉 反应”。如果结合响应过低，针对Ag2的亲和力可能不可测量。在本发明中，在相同的实验设置和相同抗体浓度中，如果单克隆抗体对Ag2的结合响应小于相同单克隆抗体对Ag1的结合响应的5％时，则与Ag1结合的单克隆抗体与Ag2不显著交叉反应。实践中，使用的抗体浓度可以是EC50或用Ag1获得达到饱和平台所需的浓度。
如本文使用的“特异性”指代抗体从高度相关、高度同源的肽序列辨析其结合(“表位”)的靶肽序列的能力。
当其不与Ag2显著交叉反应时，单克隆抗体与Ag1“特异性结合”。
“结构域”可以是蛋白的任何区，一般基于序列同源性限定且通常涉及特定结构或功能实体。
"重组"分子是通过重组方式制备、表达、生成或分离的那些分子。
如本文使用的“受试者”指代哺乳动物，如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。具体地，根据本发明的受试者是人。
抗CD3抗体
“CD3”指代作为多分子T-细胞受体复合物的部分表达在T-细胞上且由至少由三条不同的链CD3ε、CD3δ和CD3γ组成的抗原。CD3δ和CD3γ具有低序列同一性和/或与人CD3ε的相似性(相似性和同一性小于20％)。CD3ε和CDR3δ可共同形成复合物，在本文称为“CD3ε/δ-复合物”。CD3ε还与CDR3γ形成的复合物，其称为“CD3ε/γ-复合物”。T-细胞上的CD3簇(例如通过固定的抗CD3-抗体)导致T-细胞受体参与相似的T-细胞活化但不依赖于其克隆典型特异性。“CD3ε”包含三个结构域，细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域。
大多现有技术的抗CD3抗体识别CD3ε-链。这些现有技术的抗CD3-抗体之一是OKT3。现有技术已列举采用抗体分子的T细胞活化，例如通过采用抗体分子OKT3。抗CD3抗体及其变体已描述于现有技术(US 4,361,549；US 4,361,549；US 5,885,573；US 5,929,212和WO 98/52975或US 5,955,358)。OKT3已进一步在临床移植中用作强效免疫抑制剂以治疗同种异体移植排斥(Thistlethwaite 1984,Transplantation 38,695-701；Woodle 1991,Transplantation51,1207-1212；Choi 2001,Eur.J.Immunol.31(1),94-106)。
该疗法的主要缺点是T细胞活化由于T细胞和具有FcγR的细胞间的交联和人抗小鼠抗体(HAMA)响应显现细胞因子释放。数篇出版物已描述改变如OKT3的人源化减少这些副作用：US 5,929,212；US 5,885,573和其他。另一方面，OKT3或其他抗CD3-抗体可用作免疫增强剂以刺激T细胞活化和增殖(US 6,406,696 Bluestone；US 6,143,297 Bluestone；US6,113,901Bluestone；Yannelly 1990,J.Immunol.Meth.1,91-100)。抗CD3-抗体还已描述作为与抗CD28-抗体的组合使用以诱导T细胞增殖(US 6,352,694)。OKT3已进一步通过其自身或作为双特异性抗体的组分使用以靶向细胞毒性T细胞至肿瘤细胞或病毒感染的细胞(Nitta 1990,Lancet 335,368-376；Sanna 1995,Bio/Technology 13,1221-1224；WO 99/54440)。
到目前为止现有的使用抗体作为作用剂用于招募T-细胞的方式已经受限于数项发现。首先，具有与T-细胞高亲和力的天然或工程化抗体经常不活化与之结合的T-细胞。第二，具有与T-细胞低亲和力的天然或工程化抗体经常无法有效地触发T-细胞介导的细胞裂解能力。
包括信号肽的全长人CD3ε蛋白的参照可从Uniprot数据库登录号P07766下获得且在本文包括在SEQ ID NO:1(2014年12月12日可获得)下。
包括信号肽的全长食蟹猴CD3ε蛋白的参照序列可从Uniprot数据库登录号Q95LI5下获得且本文包括在SEQ ID NO:2(2014年12月12日可获得)下。
由发明人从基因组DNA克隆的序列成熟人CD3εHis-标签Fc-融合蛋白的序列公开于SEQ ID NO:3。所述成熟的人CD3εHis-标签Fc-融合蛋白包含全长人CD3ε蛋白的氨基酸23至126且因此包含人CD3ε的细胞外结构域。
通过发明从基因组DNA克隆的成熟的食蟹猴CD3εFc-融合蛋白序列在SEQ ID NO:4下公开。所述成熟的食蟹猴CD3εFc-融合蛋白包含全长食蟹猴CD3ε蛋白的氨基酸23-117且因此包含人或食蟹猴CD3ε的细胞外结构域，与野生型序列的氨基酸位置57相比在氨基酸位置35处含有一个丙氨酸至缬氨酸的交换。
人和食蟹猴CD3ε的结构域组织安排如下(基于Uniprot P07766序列(人)和Uniprot Q95LI5序列(食蟹猴))：
CD3ε结构域 SEQ ID NO:1上的位置(人) SEQ ID NO:2上的位置(食蟹猴)
细胞外 23-126 22-117
跨膜结构域 127-152 118-138
细胞质 153-207 139-198
相应地，人CD3ε的细胞外结构域由SEQ ID NO:1的位置23-126处的氨基酸组成且食蟹猴CD3ε的细胞外结构域由SEQ ID NO:2位置22-117处的氨基酸组成。
发明人成功生成、筛选并选择了特异性小鼠和大鼠抗CD3抗体。这些抗CD3抗体展示对于人和食蟹猴CD3蛋白的高亲和力，但是在靶细胞不存在时具有低T-细胞活化。
本发明确定了这种单克隆抗体的可变重链和轻链的序列，其称为抗CD3抗体“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“12D2-E5”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“18H11-F10”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“3G5-E10”、“9D7-F3”、“8C2-F7”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“6C9-C9”、“3E8-G1”、“3H6-D2”和“8H2”。
称为“20G6-F3”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:5，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:6的CDR1-H、序列SEQ ID NO:7的CDR2-H和序列SEQ ID NO:8的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:9，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“4B4-D7”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:12,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:14的CDR2-H和序列SEQ ID NO:15的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:16，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:17的CDR1-L、序列‘KVS’组的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“4E7-C9”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:18，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ IDNO:19的CDR2-H和序列SEQ ID NO:20的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:21，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:22的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“18F5-H10”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:23，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:24的CDR1-H、序列SEQ ID NO:19的CDR2-H和序列SEQ ID NO:25的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:26，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:27的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L。
称为“12D2-E5”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:29，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:30的CDR1-H、序列SEQ ID NO:31的CDR2-H和序列SEQ ID NO:32的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:33，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ IDNO:34的CDR1-L、序列‘RDD’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:35的CDR3-L。
称为“11D7-C3”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:36,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ IDNO:38的CDR3-H。
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:39，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L。
称为“11H3-E5”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:40,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ ID NO:41的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:42，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:17的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“13H2-C2”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:43,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ ID NO:44的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:45，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“13C1-F6”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:46，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ IDNO:47的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:48，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“18H11-F10”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:49,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:50的CDR1-H、序列SEQ ID NO:51的CDR2-H和序列SEQ ID NO:52的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:53，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:54的CDR1-L、序列‘NAN’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:55的CDR3-L。
称为“1E6-C9”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:56，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:57的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ IDNO:58的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:59,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L。
称为“10F4-C10”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:60，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ ID NO:61的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:62，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“10E6-G6”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:63，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:64的CDR1-H、序列SEQ ID NO:65的CDR2-H和序列SEQ IDNO:47的CDR3-L，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:66，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:67的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L。
称为“18G9-H11”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:68，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ IDNO:69的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:70，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:71的CDR3-L。
称为“11F3-B9”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:72,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ ID NO:84的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:73,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:17的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“12G3-E8”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:74,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:75的CDR1-H、序列SEQ ID NO:76的CDR2-H和序列SEQ IDNO:77的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:78，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“5B1-G2”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:79，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:80的CDR1-H、序列SEQ ID NO:76的CDR2-H和序列SEQ IDNO:81的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:82，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“16F8-A7”的抗CD3抗体包含:
-重链可变结构域，其含有序列 (SEQ ID NO:83，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ ID NO:84的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:85，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“11F9-F8”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:46，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ IDNO:47的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:87，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:88的CDR3-L。
称为“3G5-E10”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:89,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:90的CDR1-H、序列SEQ ID NO:91的CDR2-H和序列SEQ ID NO:32的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:92，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ IDNO:93的CDR1-L、序列‘GAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:94的CDR3-L。
称为“9D7-F3”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:95,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:96的CDR1-H、序列SEQ ID NO:97的CDR2-H和序列SEQ ID NO:98的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:99,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:100的CDR1-L、序列‘NTN’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:101的CDR3-L。
称为“8C2-F7”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:102,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:103的CDR1-H、序列SEQ ID NO:104的CDR2-H和序列SEQ ID NO:105的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:106，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“20E5-F10”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:107，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:80的CDR1-H、序列SEQ ID NO:19的CDR2-H和序列SEQID NO:108的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:109，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“20B5-F10”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:110，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:37的CDR2-H和序列SEQ IDNO:111的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:112，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:113的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:114的CDR3-L。
称为“6C9-C9”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:115，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:116的CDR1-H、序列SEQ ID NO:117的CDR2-H和序列SEQ IDNO:118的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:119，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:100的CDR1-L、序列‘VTN’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:120的CDR3-L。
称为“3E8-G1”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:121，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:122的CDR1-H、序列SEQ ID NO:123的CDR2-H和序列SEQ ID NO:124的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成 (SEQ ID NO:125，其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQID NO:126的CDR1-L、序列‘RDD’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:127的CDR3-L。
称为“3H6-D2”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:128,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:19的CDR2-H和序列SEQ ID NO:129的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:130,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L、序列‘KVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L。
称为“8H2”的抗CD3抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:131,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:103的CDR1-H、序列SEQ ID NO:104的CDR2-H和序列SEQ ID NO:105的CDR3-H，和
-轻链可变结构域，其由下列序列组成
(SEQ ID NO:132,其中CDR以粗体和下划线显示)，含有序列SEQ ID NO:133的CDR1-L、序列‘LVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:134的CDR3-L。
在一实施方案中，本发明的抗CD3抗体与人CD3结合。在另一个实施方案中，本发明的抗CD3抗体还与食蟹猴CD3结合。具体地，本发明的抗CD3抗体与人CD3或人和食蟹猴CD3两者的细胞外结构域结合。更具体地，所述抗体与CD3ε结合。更具体地，所述抗CD3抗体与人和食蟹猴CD3ε的细胞外结构域结合。当在复合物的形式如CD3ε/δ复合物中存在或作为单蛋白存在时，无论是在分离形式中表达还是存在于可溶性细胞外结构域或全长膜锚定的CD3ε中在例如存在于T-细胞中，所述抗CD3抗体与CD3ε结合。
根据本发明的抗CD3抗体特异性针对表面人CD3蛋白或人和食蟹猴CD3蛋白两者，特别是CD3ε。
在一实施方案中，根据本发明的抗CD3抗体对于食蟹猴CD3的亲和力比对人CD3的亲和力的比率(KD(食蟹猴)/KD(人))≤10，具体地≤6、≤5、≤4、≤3，例如≤2、≤1或≤0.5。这种根据本发明的多肽可用于在猴中实施的毒性研究，猴中观察到的毒性概貌与在人中预期潜在的副作用相关。
具体地，本发明的抗CD3抗体不与CD3γ和/或CD3δ蛋白结合或不与CD3γ和/或CD3δ蛋白显著交叉反应。
具体地，所述抗体不与人和食蟹猴CD3γ和/或CD3δ蛋白结合，或不与人和食蟹猴CD3γ和/或CD3δ蛋白显著交叉反应。
全长人CD3δ蛋白序列可在Uniprot数据库登录号P04234下获得(SEQ ID NO:86，2014年12月14日可获得)。人CD3δ的细胞外结构域由SEQ ID NO:86位置22-105处的氨基酸组成。
全长人CD3γ蛋白的序列可在Uniprot数据库登录号P09693下获得(SEQ ID NO:185，2014年12月14日可获得)。人CD3γ的细胞外结构域由SEQ ID NO:185位置23-116处的氨基酸组成。
此外，根据本发明的抗CD3抗体对于人CD3或食蟹猴CD3或两者的亲和力(KD)≤90nM、≤50nM或≤30nM，例如≤20nM、≤10nM、≤8nM、≤6nM、≤4nM或≤2nM，例如具有0.1nM-10nM的亲和力，具体地0.1nM-8nM或0.1nM-4nM的亲和力。
用使用来自人和食蟹猴的可溶性重组CD3ε/δ复合物作为捕获抗原的表面等离子体共振确定对于人CD3或对于食蟹猴CD3的亲和力的KD值。
在一个实例中，抗CD3抗体的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR)使用例如Biacore3000仪器(GE Healthcare)测量。试验缓冲剂为例如HBS-EP(BR-1001-88,GEHealthcare)。可使用实例中所述的Fc-融合蛋白形式的包含信号肽的抗原，例如人CD3ε和人CD3δ亚单元细胞外结构域构建体。可替换地，可使用实施例中所述的Fc-融合蛋白形式的包含信号肽的食蟹猴CD3ε和食蟹猴CD3δ亚单元细胞外结构域构建体作为抗原。人或食蟹猴CD3ε/δ-Fc融合蛋白的捕获使用例如人抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)实现。例如，捕获的抗体可与CM5芯片(BR-1001-88,GE Healthcare)使用距离来说胺偶联试剂盒(BR-100-50,GE Healthcare)偶联至例如大约12.000RU。CD3ε/δ-Fc融合蛋白以10μl/min捕获至大约70RU以获得30RU的Rmax值。对于抗CD3抗体的结合动力学可以例如30μl/min分别测量缔合和解离阶段240s和600s。例如，可使用在试验缓冲剂中的3-400nM的抗CD3抗体二倍稀释液。捕获表面的生成可实施例如3M MgCl2溶液以30μl/min注射1min。对于数据分析可使用例如BIA评估软件v.4.1(GE Healthcare)。数据可使用具有质量转移的1:1Langmuir模型全域拟合。
在一实施方案中，本发明的抗CD3抗体还具有通过对人T-细胞的FACS分析确定的表观EC50，其≤60nM，举例来说≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM或≤15nM。通常，表观EC50在1-60nM的范围，特别是1-30nM，例如1-20nM。
在一个实施方案中，在靶细胞不存在时本发明的抗CD3抗体具有少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％，例如少于0.5％的T-细胞活化。
术语"T-细胞的活化"在本文指触发涉及细胞毒性颗粒融合、瞬间细胞因子释放和增殖的CD3信号。靶细胞存在时，本发明的抗体样结合蛋白和抗CD3抗体靶向CD3ε并活化T-细胞；该活性也称为“T-细胞衔接效应”。T-细胞衔接效应诱导靶细胞中的细胞毒性。
如本领域的技术人员已知，T-细胞的活化诱导表面标记物如CD69和CD25的表达。T-细胞的活化可因此通过检测和测量CD4+/CD25+、CD4+/CD69+、CD8+/CD25+或CD8+/CD69+T细胞测量。测量T-细胞活化的方法为本领域的技术人员已知。
测量T-细胞活化的方法还公开在实施例(实施例3.3)部分中。相应地，在本发明的上下文中，T-细胞活化作为总细胞数中表达CD69的细胞的百分比％测量，或作为总细胞数中表达CD4和CD69的细胞的百分数％测量，或作为总细胞数中表达CD8和CD69的细胞的百分数％测量。
本发明上下文中的的抗CD3抗体的“低T-细胞活化”指靶细胞不存在时少于10％、少于8％、少于6％、少于4％、少于2％、少于1％，例如少于0.5％的T-细胞活化。
实施了“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“12D2-E5”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“18H11-F10”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“3G5-E10”、“9D7-F3”、“8C2-F7”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“6C9-C9”、“3E8-G1”、“3H6-D2”和“8H2”抗CD3抗体VH和VL区的序列比对。CDR-H和CDR-L序列的比较倾向于表明结构上“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”和“3H6-D2”密切相关，所述抗体可能与相同表位结合。所述相关抗体的CDR-H和CDR-L序列的比较分别在图1和2中给出。识别了在抗体间严格保守的且认作对特异性至关重要的CDR位置，而其他位置可支持取代。
相应地，根据本发明的抗体包含：
-重链可变结构域，其含有序列GFX1X2X3X4AW(SEQ ID NO:331)组成的CDR1-H，其中X1是T或S，X2是F或V，X3是S或T且X4是N、K、L或Y，或其任何组合，和
序列IKX1X2X3NX4YX5T(SEQ ID NO:332)组成的CDR2-H，其中X1是A或D，X2是K或R，X3是S或A，X4是N或S且X5是A或E，或其任何组合；和
序列TWRHYYSSHTMDA(SEQ ID NO:69)或RALTYYGYKRDAMDG(SEQ ID NO:129)或RX1X2X3YX4X5X6X7X8X9X10X11DX12(SEQ ID NO:333)组成的CDR3-H，其中X1是Y，G或A，X2 V，T或L，X3是H、N、Y或Q，X4是G、R或A，X5是F或V或无氨基酸，X6是R或无氨基酸，X7是F、S或I或无氨基酸，X8是F、L、N、M、Y、S、A或G，X9是Y、A、K、S、N、T、F或L，X10是A、P、G或T，X11是M、L、F或S且X12是A、V或Y，或其任何组合，和
-轻链可变结构域，其含有序列QX1LX2HX3NGX4TY(SEQ ID NO:334)组成的CDR1-L，其中X1是R或S，X2是V或E，X3是N、D或T且X4是N或Y，或其任何组合；和
序列‘KVS’组成的CDR2-L；和
序列GQGX1X2YPFT(SEQ ID NO:335)组成的CDR3-L，其中X1是T、A或S且X2是H、E或Q，或其任何组合。
根据实施方案，根据本发明的抗CD3抗体包含上文列举的28种称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“12D2-E5”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“18H11-F10”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“3G5-E10”、“9D7-F3”、“8C2-F7”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“6C9-C9”、“3E8-G1”、“3H6-D2”和“8H2”抗CD3抗体之一的重链和/或轻链的CDR序列。
因此，本发明涉及抗CD3抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:142或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:142的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
b)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:14的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:184或与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:184的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
c)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:20或与SEQ ID NO:20的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:22或与SEQ ID NO:22的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
d)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:24或与SEQ ID NO:24的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:27或与SEQ ID NO:27的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
e)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:30或与SEQ ID NO:30的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:31或与SEQ ID NO:31的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:32或与SEQ ID NO:32的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:34或与SEQ ID NO:34的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RDD’或与‘RDD’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:35或与SEQ ID NO:35的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
f)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:38或与SEQ ID NO:38的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
g)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:41或与SEQ ID NO:41的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:17的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
h)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:44或与SEQ ID NO:44的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
i)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:47或与SEQ ID NO:47的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
j)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:50或与SEQ ID NO:50的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:51或与SEQ ID NO:51的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:52或与SEQ ID NO:52的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:54或与SEQ ID NO:54的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘NAN’或与‘NAN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:55或与SEQ ID NO:55的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
k)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:57或与SEQ ID NO:57的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:58或与SEQ ID NO:58的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
l)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:61或与SEQ ID NO:61的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
m)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:64或与SEQ ID NO:64的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:65或与SEQ ID NO:65的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:47或与SEQ ID NO:47的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:67或与SEQ ID NO:67的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
n)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:69或与SEQ ID NO:69的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:71或与SEQ ID NO:71的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
o)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:84或与SEQ ID NO:84的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:17的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
p)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:75或与SEQ ID NO:75的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:76或与SEQ ID NO:76的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:77或与SEQ ID NO:77的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
q)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:80或与SEQ ID NO:80的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:76或与SEQ ID NO:76的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:81或与SEQ ID NO:81的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
r)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:84或与SEQ ID NO:84的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
s)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:47或与SEQ ID NO:47的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:88或与SEQ ID NO:88的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
t)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:90或与SEQ ID NO:90的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:91或与SEQ ID NO:91的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:32或与SEQ ID NO:32的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:93或与SEQ ID NO:93的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘GAS’或与‘GAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:94或与SEQ ID NO:94的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
u)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:96或与SEQ ID NO:96的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:97或与SEQ ID NO:97的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:98或与SEQ ID NO:98的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100或与SEQ ID NO:100的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘NTN’或与‘NTN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:101或与SEQ ID NO:101的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
v)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:103或与SEQ ID NO:103的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:104或与SEQ ID NO:104的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:105或与SEQ ID NO:105的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
w)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:80或与SEQ ID NO:80的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:108或与SEQ ID NO:108的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
x)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:37或与SEQ ID NO:37的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:111或与SEQ ID NO:111的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:113或与SEQ ID NO:113的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:114或与SEQ ID NO:114的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
y)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:116或与SEQ ID NO:116的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:117或与SEQ ID NO:117的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:118或与SEQ ID NO:118的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100或与SEQ ID NO:100的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘VTN’或与‘VTN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:120或与SEQ ID NO:120的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
z)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:122或与SEQ ID NO:122的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:123或与SEQ ID NO:123的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:124或与SEQ ID NO:124的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:126或与SEQ ID NO:126的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RDD’或与‘RDD’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:127或与SEQ ID NO:127的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
aa)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:129或与SEQ ID NO:129的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘KVS’或与‘KVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
bb)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:103或与SEQ ID NO:103的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:104或与SEQ ID NO:104的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:105或与SEQ ID NO:105的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:133或与SEQ ID NO:133的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘LVS’或与‘LVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:134或与SEQ ID NO:134的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L。
一个或多个上述CDR序列中的一个或多个单个氨基酸可通过取代特别是通过保守取代改变。这种改变在抗体的人源化方面意在例如去除糖基化位点或去酰胺位点。
基于“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”和“3H6-D2”的VH和VL区的序列比对，鉴别出氨基酸取代。因此，在一个实施方案中，在下列位置进行氨基酸取代：
-在CDR1-H中位置3-6的一处或多处，例如在序列GFTFSNAW(SEQ ID NO:13)CDR1-H的位置3、5或6或例如在序列GFTFSNAW(SEQ ID NO:13)CDR1-H的位置4和5；和/或
-在CDR2-H中位置3-5、7和9的一处或多处，例如在序列IKAKSNNYAT(SEQ ID NO:37)CDR2-H的位置3、4、5、7或9或例如序列IKAKSNNYAT(SEQ ID NO:37)CDR2-H的位置3和5或3和7；和/或
-在CDR3-H中位置2-4、7-10和12的一处或多处，例如序列RGVYYALSPFDY(SEQ IDNO:8)CDR3-H的位置2、3、4、6、7、8、9和10或位置2、4、6、8、10和12或序列RGVYYALSPFDY(SEQID NO:8)CDR3-H的位置2、3、7和8或序列RGLYYGLSPSDY(SEQ ID NO:38)CDR3-H的位置7和8或序列RGLYYGLSPSDY(SEQ ID NO:38)CDR3-H的位置2、3、4、6、7、8、9和10；和/或
-在CDR1-L中位置2、4、6和9的一处或多处，例如序列QSLVHDNGNTY(SEQ ID NO:17)或QSLVHTNGNTY(SEQ ID NO:27)CDR1-L的位置6或序列QSLVHNNGNTY(SEQ ID NO:10)或QRLVHNNGNTY(SEQ ID NO:113)CDR1-L的位置2或序列QSLVHNNGNTY(SEQ ID NO:10)CDR1-L的位置4、6和9；和/或
-在CDR3-L中位置4和5的一处或多处，例如序列GQGSQYPFT(SEQ ID NO:71)或GQGTQYPFT(SEQ ID NO:11)CDR3-L的位置4，或序列GQGAHYPFT(SEQ ID NO:88)CDR3-L的位置4和5或序列GQGTHYPFT(SEQ ID NO:28)或GQGTEYPFT(SEQ ID NO:114)CDR3-L的位置5。
根据本发明的抗CD3抗体具体是常规抗体，特别是常规单克隆抗体或抗体片段、双特异性或多重特异性抗体。
根据本发明的抗CD3抗体具体包含IgG或其片段或由IgG或其片段组成。
根据另一实施方案，本发明涉及抗CD3抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:6的CDR1-H，序列SEQ ID NO:7的CDR2-H，序列SEQ ID NO:8的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:142的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
b)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:14的CDR2-H，序列SEQ ID NO:15的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:184的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
c)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:20的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:22的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
d)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:24的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:25的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:27的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
e)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:30的CDR1-H，序列SEQ ID NO:31的CDR2-H，序列SEQ ID NO:32的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:34的CDR1-L，序列‘RDD’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:35的CDR3-L；或
f)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:38的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
g)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:41的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
h)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:44的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
i)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:47的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
j)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:50的CDR1-H，序列SEQ ID NO:51的CDR2-H，序列SEQ ID NO:52的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:54的CDR1-L，序列‘NAN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:55的CDR3-L；或
k)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:57的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:58的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
l)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:61的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
m)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:64的CDR1-H，序列SEQ ID NO:65的CDR2-H，序列SEQ ID NO:47的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:67的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L；或
n)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:69的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:71的CDR3-L；或
o)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:84的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
p)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:75的CDR1-H，序列SEQ ID NO:76的CDR2-H，序列SEQ ID NO:77的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
q)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:80的CDR1-H，序列SEQ ID NO:76的CDR2-H，序列SEQ ID NO:81的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
r)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:84的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其包含序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
s)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:47的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:88的CDR3-L；或
t)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:90的CDR1-H，序列SEQ ID NO:91的CDR2-H，序列SEQ ID NO:32的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:93的CDR1-L，序列‘GAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:94的CDR3-L；或
u)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:96的CDR1-H，序列SEQ ID NO:97的CDR2-H，序列SEQ ID NO:98的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100的CDR1-L，序列‘NTN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:101的CDR3-L；或
v)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:103的CDR1-H，序列SEQ ID NO:104的CDR2-H，序列SEQ ID NO:105的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
w)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:80的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:108的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
x)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:37的CDR2-H，序列SEQ ID NO:111的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:113的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:114的CDR3-L；或
y)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:116的CDR1-H，序列SEQ ID NO:117的CDR2-H，序列SEQ ID NO:118的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:100的CDR1-L，序列‘VTN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:120的CDR3-L；或
z)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:122的CDR1-H，序列SEQ ID NO:123的CDR2-H，序列SEQ ID NO:124的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:126的CDR1-L，序列‘RDD’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:127的CDR3-L；或
aa)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H，序列SEQ ID NO:19的CDR2-H，序列SEQ ID NO:129的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10的CDR1-L，序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
bb)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:103的CDR1-H，序列SEQ ID NO:104的CDR2-H，序列SEQ ID NO:105的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:133的CDR1-L，序列‘LVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:134的CDR3-L。
本发明还提供抗CD3抗体，其至少包含上文列举的称为抗CD3抗体之一的重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
因此，本发明具体涉及抗CD3抗体，其包含：
a)序列SEQ ID NO:5或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:9或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
b)序列SEQ ID NO:12或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:16或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
c)序列SEQ ID NO:18或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:21或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
d)序列SEQ ID NO:23或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:26或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
e)序列SEQ ID NO:29或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:33或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
f)序列SEQ ID NO:36或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:39或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
g)序列SEQ ID NO:40或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:42或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
h)序列SEQ ID NO:43或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:45或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
i)序列SEQ ID NO:46或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:48或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
j)序列SEQ ID NO:49或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:53或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
k)序列SEQ ID NO:56或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:59或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
l)序列SEQ ID NO:60或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:62或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
m)序列SEQ ID NO:63或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:66或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
n)序列SEQ ID NO:68或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:70或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
o)序列SEQ ID NO:72或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:73或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
p)序列SEQ ID NO:74或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:78或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
q)序列SEQ ID NO:79或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:82或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
r)含有序列SEQ ID NO:83或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:85或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
s)序列SEQ ID NO:46或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:87或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
t)序列SEQ ID NO:89或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:92或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
u)序列SEQ ID NO:95或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:99或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
v)序列SEQ ID NO:102或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:106或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
w)序列SEQ ID NO:107或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:109或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
x)序列SEQ ID NO:110或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:112或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
y)序列SEQ ID NO:115或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:119或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
z)序列SEQ ID NO:121或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:125或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
aa)序列SEQ ID NO:128或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:130或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
bb)序列SEQ ID NO:131或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:132或其至少85％相同的序列的轻链可变结构域。
例如，重链或轻链可变结构域的序列酌情可与参照序列SEQ ID NO:5、9、12、16、18、21、23、26、29、33、36、39、40、42、43、45、46、48、49、53、56、59、60、62、63、66、68、70、72、73、74、78、79、82、83、85、87、89、92、95、99、102、106、107、109、110、112、115、119、121、125、128、130、131、132区别在于一个或多个氨基酸取代，特别是一个或多个保守氨基酸取代和/或用典型残基的取代。具体地，重链或轻链可变结构域的序列与参照序列SEQ ID NO:5、9、12、16、18、21、23、26、29、33、36、39、40、42、43、45、46、48、49、53、56、59、60、62、63、66、68、70、72、73、74、78、79、82、83、85、87、89、92、95、99、102、106、107、109、110、112、115、119、121、125、128、130、131、132区别仅在于保守氨基酸取代。
与序列SEQ ID NO:5、9、12、16、18、21、23、26、29、33、36、39、40、42、43、45、46、48、49、53、56、59、60、62、63、66、68、70、72、73、74、78、79、82、83、85、87、89、92、95、99、102、106、107、109、110、112、115、119、121、125、128、130、131、132相比的序列改变具体将基本上在一个或多个框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H中。
然而，一个或多个CDR中的氨基酸取代也有可能。具体地，轻链可变结构域的序列可与序列SEQ ID NO:9区别仅在于SEQ ID NO:9位置28处的S至R的取代(CDR1-L中)不同，和/或至少至少通过在SEQ ID NO:9位置30处的V至E的取代(CDR1-L中)，和/或至少通过在SEQ ID NO:9位置33处的N至D或T的取代(CDR1-L中)不同，和/或至少通过在SEQ ID NO:9位置35处的N至Y的取代(CDR1-L中)不同，和/或轻链可变结构域序列可与序列SEQ ID NO:9至少通过在SEQ ID NO:9位置97处的T至S或A的取代(CDR3-L中)不同，和/或至少通过在SEQID NO:9位置98处的Q至H或E的取代(CDR3-L中)不同，和/或重链可变结构域可与序列SEQID NO:9至少通过在SEQ ID NO:5位置28处的T至N或S的取代(CDR1-H中)不同，和/或至少通过在SEQ ID NO:5位置29处的F至V的取代(CDR1-H中)不同，或至少通过在SEQ ID NO:5位置30处的T至N或Y的取代(CDR1-H中)不同，或至少通过在SEQ ID NO:5位置31处的K至L或Y的取代(CDR1-H中)不同，和/或重链可变结构域可与序列SEQ ID NO:5至少通过在SEQ ID NO:5位置53处的D至A的取代(CDR2-H中)不同，或至少通过在SEQ ID NO:5位置54处的K至R的取代(CDR2-H中)不同，或至少通过在SEQ ID NO:5位置55处的S至A的取代(CDR2-H中)不同，或至少通过在SEQ ID NO:5位置57处的S至N的取代(CDR2-H中)不同，或至少通过在SEQ IDNO:5位置59处的A至E的取代(CDR2-H中)不同，和/或重链可变结构域可与序列SEQ ID NO:5至少通过在SEQ ID NO:5位置100处的G至A的取代(CDR3-H中)不同，和/或至少通过在SEQID NO:5位置101处的T至V的取代(CDR3-H中)不同，至少通过在SEQ ID NO:5位置102处的Q至Y的取代(CDR3-H中)不同。
在一个实施方案中，本发明的抗CD3抗体及其片段分别为大鼠抗体和大鼠抗体片段。
本发明的一方面，本发明的抗CD3抗体还可为嵌合抗体且具体地是大鼠/人抗体，例如包含大鼠重链和轻链可变结构域和来自人的CH结构域和CL结构域的抗体。
在本发明的另一方面，抗CD3抗体还可为人源化抗体或例如通过CDR-移植或通过4D方法获得的人源化抗体片段(US20110027266)。
相应地，在一个实施方案中，本发明的抗CD3抗体是人源化抗体，包含：
a)重链可变结构域，其含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:
135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:
144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:
152、SEQ ID NO:153，和
轻链可变结构域，其含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQID NO:151、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157，或
b)重链可变结构域，其含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:
171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:
175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:
179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183，和
轻链可变结构域，其含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:158、SEQID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ IDNO:165、SEQ ID NO:166、SEQID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQID NO:182。
根据另一实施方案，本发明的抗CD3抗体是人源化抗体，包含
a)序列SEQ ID NO:138的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:
143的轻链可变结构域；或
b)序列SEQ ID NO:171的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:
158的轻链可变结构域；或
c)序列SEQ ID NO:176的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:
164的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，根据本发明的抗CD3抗体包含上文列举的称为抗CD3抗体重链的三个CDR序列或可变结构域，或重链和轻链的六个CDR序列或可变结构域。
本发明还参照上文定义的人源化抗CD3抗体片段。在一个实施方案中，上文所述的人源化抗CD3抗体是嵌合抗体。
根据本发明的抗CD3抗体还可为单结构域抗体或其片段。具体地，单结构域抗体片段可由包含上文所述的抗体之一的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的可变重链(VHH)组成。抗CD3抗体还可为重链抗体，即缺乏轻链的抗体，其可包含或不包含CH1结构域。
单结构域抗体或其片段还可以包含骆驼单结构域抗体的框架区和任选地骆驼单结构域抗体的恒定结构域。
根据本发明的抗CD3抗体还可为选自下组的抗体片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sC(Fv)2和双抗体，特别是人源化抗体片段。
相应地，本发明的抗CD3抗体是Fab，其包含或由下列组成：
a)重链氨基酸序列SEQ ID NO:186和/或轻链氨基酸序列SEQ ID NO:187；或
b)重链氨基酸序列SEQ ID NO:188和/或轻链氨基酸序列SEQ ID NO:189；或
c)重链氨基酸序列SEQ ID NO:190和/或轻链氨基酸序列SEQ ID NO:191；或
d)重链氨基酸序列SEQ ID NO:192和/或轻链氨基酸序列SEQ ID NO:193。
在一实施方案中，CD3-抗体是由本发明的抗CD3抗体至少一个抗体片段或至少一个可变结构域形成的双特异性或多重特异性抗体。多重特异性抗体是多价蛋白复合物，如例如EP 2 050 764 A1或US2005/0003403 A1中所述。
根据本发明的双特异性或多重特异性CD3-抗体可具有针对(a)由上述抗CD3抗体之一靶向的人或人和食蟹猴CD3细胞外结构域和(b)至少一种其他抗原具有特异性。
在一个实施方案中，其他抗原是CD123且相应地获得的双特异性抗体是CD3/CD123双特异性抗体。常规的双特异性抗体可通过本领域已知的技术产生。
根据本发明的抗体和抗CD3抗体片段可用于以分离(例如纯化)形式或包含于载体中，如膜或脂质媒介物(例如脂质体)。
在另一实施方案中，本发明的抗CD3抗体用于制备本发明的在“抗体样结合蛋白”部分进一步定义的抗体样结合蛋白。
上述实施方案的任何组合构成本发明的部分。
抗CD123抗体
“CD123”(分化簇123)也称为“白细胞介素3受体,α(IL3RA)”或“IL3R”、“IL3RX”、“IL3RY”、“IL3RAY”、“hIL-3Ra”且指代异二聚化细胞因子受体的白细胞介素3特异性亚单元。功能性白细胞介素3受体是包含特异性α链(IL-3A；CD123)和与针对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素5(IL-5)的受体共享的IL-3受体β链(β0；CD 131)的异二聚体。CD123是具有约43kDa的推导分子量的I型整体跨膜蛋白，其包含参与IL-3结合的细胞外结构域，跨膜结构域和约50个氨基酸的短胞质尾。细胞外结构域由两个区构成：约100氨基酸的N-末端区，该序列展示与GM-CSF和IL-5受体α-链的等同区的相似性；和该细胞因子受体家族其他成员常见的包含四个保守半胱氨酸残基和WSXWS基序的跨膜结构域的近端区。IL-3结合结构域包含两个Ig-样折叠结构域组成的约200个氨基酸残基细胞因子受体基序(CRM)。CD123的细胞外结构域高度糖基化，具有配体结合和受体信号都需要的N-糖基化。蛋白家族汇集三个成员：IL3RA(CD123A)、CSF2RA和IL5RA。整体结构在三成员间非常保守但序列同源性非常低。目前已发现了一种300氨基酸长的同型CD123，但仅在RNA水平，其可在Getentry数据库登录号ACM24116.1下获得。
美国专利号6,177,078公开了抗IL-3受体α链(IL-3Rα，CD123)单克隆抗体7G3和7G3结合IL-3Rα的N-末端结构域特别是氨基酸残基19-49的能力。美国专利号6,733,743公开了通过将细胞与抗体和细胞毒性剂(选自化疗剂、毒素或α-发射放射性同位素)的组合物接触，其中该组合物选择性地以有效导致细胞死亡的量与CD123结合，以损伤表达CD123但不显著表达CD131的血液癌症前体细胞。然而，靶向CD123是否功能性损伤AML-LSC尚不清楚。
包括信号肽的全长人CD123蛋白的参照序列可从NCBI数据库在登录号NP_002174.1下和在Uniprot登录号P26951下获得，且在本文公开于SEQ ID NO:194下(2014年12月14日可获得)。包括信号肽的全长食蟹猴CD123蛋白的参照序列可从GenBank数据库在登录号EHH61867.1下和Uniprot登录号G8F3K3下获得，且在本文公开于SEQ ID NO:195下(2014年12月14日可获得)。
由发明人从基因组DNA克隆的成熟人CD123 Strep-II标签Fc-融合蛋白序列公开于SEQ ID NO:196下。所述成熟人CD123Fc-融合蛋白包含全长人CD123蛋白氨基酸19-305且因此包含人CD123的细胞外结构域。
由发明人从基因组DNA克隆的成熟食蟹猴CD123 Strep-II标签Fc-融合蛋白的序列公开于SEQ ID NO:197下。所述成熟食蟹猴CD123 Fc-融合蛋白包含全长食蟹猴CD123蛋白氨基酸19-305且因此包含食蟹猴CD123的细胞外结构域。
人和食蟹猴CD123的结构域组织安排如下(人CD123序列可基于可在NCBI数据库在登录号NP_002174.1下获得的人序列(SEQ ID NO:194)，以及基于可在数据库登录号G8F3K3下获得的食蟹猴CD123序列获得，SEQ ID NO:195)：
人CD123结构域 SEQ ID NO:194上的位置(人) SEQ ID NO:195上的位置(食蟹猴)
细胞外 19-305 19-305
跨膜结构域 306-325 306-325
细胞质 326-378 326-378
相应地，人CD123的细胞外结构域由SEQ ID NO:194位置19-305处的氨基酸组成。
CD123(白细胞介素-3受体α链IL-3Rα)是肿瘤抗原在多种血液肿瘤中过表达。大量的AML原始细胞主要表达表面CD123且该表达不随AML亚型变化。诊断时CD123在AML上的较高表达已报导与较差预后相关。CD123表达已在其他血液恶性肿瘤包括骨髓增生异常、全身性肥大细胞增多症、急浆样树突状细胞肿瘤(BPDCN)、ALL和毛细胞白血病中报导。
CD123表达在AML白血病干细胞上且越来越多的证据表明AML从这些LSC产生，其显示静息且对DNA损伤化疗相对抵抗。假设LSC的持久巩固了初始缓解后的复发，因此将根除LSC认为是治愈所必需，且是重要的治疗目标。
“白血病干细胞(LSC)”是具有与正常干细胞相关的特性(即自我更新的性质和发育成多系的能力)的癌细胞。已提出此类细胞存留于血液癌症如AML中作为特殊群体。存在于AML中的LCS也称为“AML-LCS”。
“急性骨髓性白血病(AML)”是由于异种和未分化的髓性原始细胞增殖的增加而在临床呈现的克隆性病症。白血病等级通过具有特殊自我更新能力的LSC(AML-LCS)的小群体维持，且能够分化成白血病原始细胞。这些原始细胞在诊断和复发时生成在患者中易于检测的大数目的白血病原始细胞，最终导致死亡。AML-LSC通常报导为静息细胞，与快速分裂克隆形成型祖细胞不同。AML-LSC的性质给予靶向增殖细胞不那么有效的常规化疗剂，潜在说明了AML患者进入完全缓解但几乎总是复发的高比例，4年以上具有<30％的成人生存率。此外，诊断时微小残留病的发生和较差的生存率已归因于AML患者中的高LSC频率。因此，当务之急是开发以特异性消除LSC的新疗法的AML(和相似的上述血液癌症病况)的长期管理。
已报导CD123在AML原始细胞和CD34+/CD38 AML-LSC上相对正常血细胞过表达。
CD123因此提供用于癌症治疗的重要治疗靶标，特别是用于具有不良预后的患者的癌症治疗。
发明人已成功生成、筛选和选择了针对人和食蟹猴CD123蛋白都显示高亲和力的特异性小鼠和大鼠抗CD123抗体，且其不与人CSF2RA和IL5RA蛋白和食蟹猴CD3蛋白显著交叉反应。
发明人确定了这种称为“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”和“9F6-G3”的抗CD123抗体的单克隆抗体可变重链和轻链的序列。
称为“3E3-D3”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:226，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQID NO:227的CDR1-H、序列SEQ ID NO:228的CDR2-H和序列SEQ ID NO:229的CDR3-H，或
重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:277，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQID NO:227的CDR1-H、序列SEQ ID NO:353的CDR2-H和序列SEQ ID NO:229的CDR3-H，或
重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:278，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQID NO:227的CDR1-H、序列SEQ ID NO:279的CDR2-H和序列SEQ ID NO:229的CDR3-H，和轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:230，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:231的CDR1-L、序列‘RDD’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:232的CDR3-L。
称为“1E1-G5”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:198，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:199的CDR1-H、序列SEQ ID NO:200的CDR2-H和序列SEQ ID NO:201的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:202，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:203的CDR1-L、序列‘DAN’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:204的CDR3-L。
称为“2B8-F3”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:205，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:206的CDR1-H、序列SEQ ID NO:207的CDR2-H和序列SEQ ID NO:208的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:209，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:210的CDR1-L、序列‘ETS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:211的CDR3-L。
称为“2F8-D6”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:212，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:213的CDR1-H、序列SEQ ID NO:214的CDR2-H和序列SEQ ID NO:215的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:216，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:217的CDR1-L、序列‘NTN’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:218的CDR3-L。
称为“3B10-E6”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:219，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:220的CDR1-H、序列SEQ ID NO:221的CDR2-H和序列SEQ ID NO:222的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:223，其中CDR以粗体显示)，其含有序列SEQ ID NO:224的CDR1-L、序列‘RVS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:225的CDR3-L。
称为“5A5-B4”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:233，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:234的CDR1-H、序列SEQ ID NO:235的CDR2-H和序列SEQ ID NO:236的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:237，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:238的CDR1-L、序列‘GAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:239的CDR3-L。
称为“6B10-E4”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:240，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQID NO:241的CDR1-H、序列SEQ ID NO:242的CDR2-H和序列SEQ ID NO:243的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:244，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:245的CDR1-L、序列‘YAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:246的CDR3-L。
称为“6C10-C4”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:247，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQID NO:248的CDR1-H、序列SEQ ID NO:249的CDR2-H和序列SEQ ID NO:250的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:251，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:252的CDR1-L、序列‘WAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253的CDR3-L。
称为“6D6-B8”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:254，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:255的CDR1-H、序列SEQ ID NO:200的CDR2-H和序列SEQ ID NO:201的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:256，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:257的CDR1-L、序列‘DAN’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:258的CDR3-L。
称为“8B11-B7”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成：
(SEQ ID NO:259，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:199的CDR1-H、序列SEQ ID NO:260的CDR2-H和序列SEQ ID NO:201的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:261，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:262的CDR1-L、序列‘DAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:263的CDR3-L。
称为“9B8-G6”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:264，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:265的CDR1-H、序列SEQ ID NO:266的CDR2-H和序列SEQ ID NO:267的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:251，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:252的CDR1-L、序列‘WAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253的CDR3-L。
称为“9D7-C8”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:268，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:265的CDR1-H、序列SEQ ID NO:266的CDR2-H和序列SEQ ID NO:269的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:270，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:271的CDR1-L、序列‘WAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253的CDR3-L。
称为“9F6-G3”的抗CD123抗体包含：
-重链可变结构域，其由下列序列组成： (SEQ ID NO:272，其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQID NO:273的CDR1-H、序列SEQ ID NO:274的CDR2-H和序列SEQ ID NO:201的CDR3-H和
-轻链可变结构域其由下列序列组成： (SEQ ID NO:275,其中CDR以粗体显示)，含有序列SEQ ID NO:276的CDR1-L、序列‘DAS’组成的CDR2-L和序列SEQ ID NO:258的CDR3-L。
本发明的一方面，抗CD123抗体与人CD123结合。在另一个实施方案中，抗CD123抗体进一步与食蟹猴CD123结合。具体地，本发明的抗CD123抗体与人CD123或人和食蟹猴CD123两者的细胞外结构域结合。更具体地，抗CD123抗体与CD123的远端部分结合，例如与氨基酸序列SEQ ID NO:194的人CD123的位置19-49处的氨基酸结合。无论在分离形式表达还是存在于CD123表达细胞如AML细胞或CD123转染细胞中的可溶性细胞外结构域或全长膜锚定的CD123中，抗CD123抗体都与CD123结合。根据本发明的抗CD123抗体对在其表面表达人和食蟹猴CD123蛋白的细胞例如表达CD123的癌细胞具有特异性。
根据本发明的抗CD123抗体对于食蟹猴CD123的亲和力比对人CD123的亲和力的比率(KD(食蟹猴)/KD(人))≤10，具体地≤6、≤5、≤4、≤3，例如≤2、≤1或≤0.5。因此根据本发明的多肽可用于在猴中实施的毒性研究，猴中观察到的毒性概貌与在人中预期潜在的副作用相关。
具体地，本发明的抗CD123抗体不与CSF2RA和IL5RA蛋白结合或不与CSF2RA和IL5RA蛋白显著交叉反应。
具体地，所述抗体不与人和食蟹猴的上述CSF2RA和IL5RA蛋白结合，或不与人和食蟹猴的CSF2RA和IL5RA蛋白显著交叉反应。
此外，根据本发明的抗CD123抗体对于人CD123或食蟹猴CD123或对于两者的亲和力(KD)≤50nM、≤40nM、≤30nM例如≤20nM、≤15nM、≤10nM、≤8nM、≤6nM、≤4nM、≤2nM、≤1nM或≤0.5nM，例如有0.1nM-20nM的亲和力，例如0.1nM-10nM的亲和力，具体地0.1nM-2nM或0.1nM-1nM的亲和力。
在一个实例中，用使用来自人和食蟹猴的重组CD123蛋白(例如用人和食蟹猴CD123-Fc融合蛋白)作为捕获抗原的表面等离子体共振定确定对于人CD3或对于食蟹猴CD3的亲和力的KD值。
抗原可用于例如对应野生型蛋白(SEQ ID NO:194(人)，SEQ ID NO:195(食蟹猴))位置M1-R305的氨基酸序列的包含信号肽的人或食蟹猴CD123细胞外结构域。获得的用于人或食蟹猴CD123成熟蛋白的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:197。Biacore测量为本领域已知。在给出的实例中，Biacore测量可如上文“抗CD3抗体”部分所述实施。
本发明的抗CD123抗体还由FACS分析确定表观亲和力常数(表观KD)，(所述分析对于例如具有通过适应在杂交瘤上清中纯化的抗CD123抗体对CD123表达细胞如CD123转染的HEK293细胞进行)，其≤20nM，例如≤15nM、≤10nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM或≤1nM。通常，表观KD在0.1-20nM范围，具体地0.1-10nM，例如0.1-5nM。
对称为“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体的VH和VL区序列进行比对。CDR-H和CDR-L序列比较倾向于表明结构上一方面“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”和“9F6-G3”抗CD123抗体和另一方面“6C10-C4”、9B8-G6”、“9D7-C8”抗CD123抗体密切相关，所述抗体与相同表位适当结合。称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”和“9F6-G3”抗CD123抗体和“6C10-C4”、9B8-G6”、“9D7-C8”抗CD123抗体的比对分别示于图3和图4。CDR-H和CDR-L序列的比较进一步识别了在两组抗体间严格保守的CDR位置且其因此被认为对于特异性至关重要，而其他位置可支持取代。
相应地，根据本发明的抗体包含：
a)重链可变结构域，其含有序列X1YTFTDX2I(SEQ ID NO:336)组成的CDR1-H，其中X1是G或A且X2是H、Y或N，或其任何组合；和
序列INPYSX1GX2(SEQ ID NO:337)组成的CDR2-H，其中X1是G或D且X2是T或A，或其任何组合；和
序列ALNYGSYYAMDA(SEQ ID NO 201)组成的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列X1DIX2X3N(SEQ ID NO:338)组成的CDR1-L，其中X1是E或K，X2是F、H或Y且X3是N或S，或其任何组合；和
序列‘DAN’或‘DAS’组成的CDR2-L；和
序列X1QYNX2YPYT(SEQ ID NO:339)组成的CDR3-L，其中X1是H或Q且X2是I、K或N，或其任何组合；或
b)重链可变结构域，其含有序列GFSLTSYX1(SEQ ID NO:340)组成的CDR1-H，其中X1是H或S；和
序列MWX1DGDT(SEQ ID NO:341)组成的CDR2-H，其中X1是S或N；和
序列ARGX1X2X3X4X5X6X7X8X9FX10Y(SEQ ID NO:342)组成的CDR3-H，其中X1是D、Y或H，X2是Y或R，X3是S或T，X4是S或P，X5是Y或无氨基酸，X6是L、I或无氨基酸，X7是Y或无氨基酸，X8是L或无氨基酸，X9是W或无氨基酸，X10是A或D，或其任何组合，和
轻链可变结构域，其含有序列QSFLSSGDX1X2NY(SEQ ID NO:343)组成的CDR1-L，其中X1是E或G且X2是R或K，或其任何组合；和
序列‘WAS’组成的CDR2-L；和
序列QQYYDTPLT(SEQ ID NO:253)组成的CDR3-L。
根据实施方案，根据本发明的抗CD123抗体包含上文列举的13种称为“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”和“9F6-G3”抗CD123抗体之一的重链和/或轻链CDR序列。
因此，本发明涉及抗CD123抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:227或与SEQ ID NO:227的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:353或SEQ ID NO:279或与SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:353或SEQ ID NO:279的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:229或与SEQ ID NO:229的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:231或与SEQ ID NO:231的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RDD’或与‘RDD’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:232或与SEQ ID NO:232的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
b)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:199或与SEQ ID NO:199的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:200或与SEQ ID NO:200的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:201或与SEQ ID NO:201的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:203或与SEQ ID NO:203的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘DAN’或与‘DAN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:204或与SEQ ID NO:204的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
c)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:206或与SEQ ID NO:206的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:207或与SEQ ID NO:207的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:208或与SEQ ID NO:208的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:210或与SEQ ID NO:210的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘ETS’或与‘ETS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:211或与SEQ ID NO:211的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
d)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:213或与SEQ ID NO:213的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:214或与SEQ ID NO:214的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:215或与SEQ ID NO:215的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:217或与SEQ ID NO:217的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘NTN’或与‘NTN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:218或与SEQ ID NO:218的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
e)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:220或与SEQ ID NO:220的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:221或与SEQ ID NO:221的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:222或与SEQ ID NO:222的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H of；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:224或与SEQ ID NO:224的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘RVS’或与‘RVS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:225或与SEQ ID NO:225的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
f)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:234或与SEQ ID NO:234的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:235或与SEQ ID NO:235的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:236或与SEQ ID NO:236的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:238或与SEQ ID NO:238的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘GAS’或与‘GAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:239或与SEQ ID NO:239的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
g)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:241或与SEQ ID NO:241的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:242或与SEQ ID NO:242的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:243或与SEQ ID NO:243的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:245或与SEQ ID NO:245的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘YAS’或与‘YAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:246或与SEQ ID NO:246的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
h)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:248或与SEQ ID NO:248的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:249或与SEQ ID NO:249的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:250或与SEQ ID NO:250的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:252或与SEQ ID NO:252的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘WAS’或与‘WAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253或与SEQ ID NO:253的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
i)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:255或与SEQ ID NO:255的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:200或与SEQ ID NO:200的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:201或与SEQ ID NO:201的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:257或与SEQ ID NO:257的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘DAN’或与‘DAN’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:258或与SEQ ID NO:258的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
j)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:199或与SEQ ID NO:199的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:260或与SEQ ID NO:260的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:201或与SEQ ID NO:201的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:262或与SEQ ID NO:262的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘DAS’或与‘DAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:263或与SEQ ID NO:263的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
k)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:265或与SEQ ID NO:265的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:266或与SEQ ID NO:266的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:267或与SEQ ID NO:267的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:252或与SEQ ID NO:252的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘WAS’或与‘WAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253或与SEQ ID NO:253的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
l)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:265或与SEQ ID NO:265的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:266或与SEQ ID NO:266的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:269或与SEQ ID NO:269的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:271或与SEQ ID NO:271的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘WAS’或与‘WAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253或与SEQ ID NO:253的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L；或
m)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:273或与SEQ ID NO:273的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-H；序列SEQ ID NO:274或与SEQ ID NO:274的区别在于一个或多个氨基酸取代的序列的CDR2-H；序列SEQ ID NO:201或与SEQ ID NO:201的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:276或与SEQ ID NO:276的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR1-L；序列‘DAS’或与‘DAS’的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR2-L和序列SEQ ID NO:258或与SEQ ID NO:258的区别在于一个氨基酸取代的序列的CDR3-L。
在一种或多种上述的CDR序列中，一个或多个个体氨基酸可通过取代特别是通过保守取代改变。这种改变在抗体人源化方面可意在例如去除糖基化位点或去酰胺位点。
基于“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体VH和VL区序列的比对识别了不同的氨基酸取代。因此在一个实施方案中，可进行下列氨基酸取代：
-在CDR1-H位置1和7的一处或多处，例如在CDR1-H序列GYTFTDHI(SEQ ID NO:199)或GYTFTDYI(SEQ ID NO:273)的位置7，例如在序列AYTFTDNI(SEQ ID NO:255)CDR1-H的位置1和5；和/或
-在CDR2-H位置6和8的一处或多处，例如在CDR2-H序列INPYSGGT(SEQ ID NO:200)或INPYSDGT(SEQ ID NO:274)或INPYSGGA(SEQ ID NO:260)的位置6和/或8；和/或
-在CDR1-L位置1、4和5的一处或多处，例如在CDR1-L序列KDIYSN(SEQ ID NO:262)或EDIFNN(SEQ ID NO:257)的位置1或1、4和5；和/或
-在CDR2-L的序列‘DAN’或‘DAS’的位置3处；和/或
-在CDR3-位置1和5的一处或多处，例如在CDR3-L序列HQYNIYPYT(SEQ ID NO:258)或QQYNKYPYT(SEQ ID NO:204)或HQYNNYPYT(SEQ ID NO:263)的位置1和/或5。
在另一实施方案中，进行下列氨基酸取代：
-在CDR1-H中的位置8处，例如在CDR1-H序列GFSLTSYH(SEQ ID NO:265)或GFSLTSYS(SEQ ID NO:248)的位置8；和/或
-在CDR2-H中的位置3处，例如在CDR2-H序列MWSDGD(SEQ ID NO:265)或MWNDGD(SEQ ID NO:248)的位置3；和/或
-在CDR3-H中的位置4和9处，例如在CDR3-H序列ARGDYSSYIYLWFAY(SEQ ID NO:267)或ARGYYSSYLYLWFAY(SEQ ID NO:269)的位置4和9；和/或
-在CDR1-L中位置9和10的一处或多处，例如在CDR1-L序列QSFLSSGDERNY(SEQ IDNO:252)或QSFLSSGDGKNY(SEQ ID NO:271)的位置9和10。
根据实施方案，所述抗体包含：
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:227的CDR1-H、序列SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:279的CDR2-H、序列SEQ ID NO:229的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:231的CDR1-L、序列‘RDD’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:232的CDR3-L；或
n)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:199的CDR1-H、序列SEQ ID NO:200的CDR2-H、序列SEQ ID NO:201的CDR3-H；和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:203的CDR1-L、序列‘DAN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:204的CDR3-L；或
o)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:206的CDR1-H、序列SEQ ID NO:207的CDR2-H、序列SEQ ID NO:208的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:210的CDR1-L、序列‘ETS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:211的CDR3-L；或
p)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:213的CDR1-H、序列SEQ ID NO:214的CDR2-H、序列SEQ ID NO:215的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:217的CDR1-L、序列‘NTN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:218的CDR3-L；或
q)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:220的CDR1-H、序列SEQ ID NO:221的CDR2-H、序列SEQ ID NO:222的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:224的CDR1-L、序列‘RVS’生的CDR2-L和序列SEQ ID NO:225的CDR3-L；或
r)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:234的CDR1-H、序列SEQ ID NO:235的CDR2-H、序列SEQ ID NO:236的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:238的CDR1-L，序列‘GAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:239的CDR3-L；或
s)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:241的CDR1-H、序列SEQ ID NO:242的CDR2-H、序列SEQ ID NO:243的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:245的CDR1-L、序列‘YAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:246的CDR3-L；或
t)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:248的CDR1-H、序列SEQ ID NO:249的CDR2-H、序列SEQ ID NO:250的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:252的CDR1-L、序列‘WAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253的CDR3-L；或
u)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:255的CDR1-H、序列SEQ ID NO:200的CDR2-H、序列SEQ ID NO:201的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:257的CDR1-L、序列‘DAN’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:258的CDR3-L；或
v)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:199的CDR1-H、序列SEQ ID NO:260的CDR2-H、序列SEQ ID NO:201的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:262的CDR1-L、序列‘DAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:263的CDR3-L；或
w)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:265的CDR1-H、序列SEQ ID NO:266的CDR2-H、序列SEQ ID NO:267的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:252的CDR1-L、序列‘WAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253的CDR3-L；或
x)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:265的CDR1-H、序列SEQ ID NO:266的CDR2-H、序列SEQ ID NO:269的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:271的CDR1-L、序列‘WAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:253的CDR3-L；或
y)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:273的CDR1-H、序列SEQ ID NO:274的CDR2-H、序列SEQ ID NO:201的CDR3-H，和
轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:276的CDR1-L、序列‘DAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:258的CDR3-L。
根据本发明的抗CD123抗体具体是常规抗体，特别是常规单克隆抗体或抗体片段、双特异性或多重特异性抗体。
根据本发明的抗CD123抗体具体包含IgG或其片段或由IgG或其片段组成。
本发明还提供如上文定义的抗CD123抗体，其至少包含上文列举的称为抗CD123抗体之一的重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
因此，本发明具体涉及抗CD123抗体，其包含：
a)序列SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:277或SEQ ID NO:278或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:230或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
b)序列SEQ ID NO:198或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:202或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
c)序列SEQ ID NO:205或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:209或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
d)序列SEQ ID NO:212或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:216或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
e)序列SEQ ID NO:219或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:223或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
f)序列SEQ ID NO:233或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:237或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
g)序列SEQ ID NO:240或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:244或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
h)序列SEQ ID NO:247或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:251或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
i)序列SEQ ID NO:254或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:256或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
j)序列SEQ ID NO:259或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:261或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
k)序列SEQ ID NO:264或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:251或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
l)序列SEQ ID NO:268或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:270或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
m)序列SEQ ID NO:272或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:275或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域。
例如，重链或轻链可变结构域的序列酌情可与参照序列SEQ ID NO:226、277、278、230、198、202、205、209、212、216、219、223、233、237、240、244、247、251、254、256、259、261、264、251、268、270、272或275区别在于一个或多个氨基酸取代，具体地在于一个或多个保守氨基酸取代和/或用典型残基的取代。具体地，重链或轻链可变结构域的序列可与参照序列SEQ ID NO:226、277、278、230、198、202、205、209、212、216、219、223、233、237、240、244、247、251、254、256、259、261、264、251、268、270、272或275区别仅在于保守氨基酸取代。
与序列SEQ ID NO:226、277、278、230、198、202、205、209、212、216、219、223、233、237、240、244、247、251、254、256、259、261、264、251、268、270、272或275相比的序列改变具体基本上在一个或多个以下框架区中存在：FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
在一个实施方案中，本发明的抗CD123抗体及其片段分别是大鼠抗体和大鼠抗体的片段。
本发明的抗CD123抗体还可为嵌合抗体，且具体是大鼠/人抗体，例如包含大鼠重链和轻链可变结构域和来自人抗体的CH结构域和CL结构域的抗体。这种抗体的片段可以是多肽。抗CD123抗体还可为人源化抗体或通过CDR-移植或通过4D方法获得的人源化抗体的片段(US20110027266)。
相应地，在一个实施方案中，本发明的抗CD123抗体是人源化的抗体，其包含：
a)重链可变结构域，其含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:
280、SEQ ID NO:281、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:
284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:
288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:301和SEQ IDNO:302；和
b)轻链可变结构域，其含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:
292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:
296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:
300、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304和SEQ ID NO:305。
在一个实施方案中，根据本发明的抗CD123抗体包含上文列举的称为抗CD123抗体之一的重链三个CDR序列或可变结构域，或重链和轻链的六个CDR序列或可变结构域。
本发明进一步涉及如上文列举的人源化抗CD123抗体的片段。在一个实施方案中，上文所述的人源化抗CD123抗体是嵌合抗体。
根据本发明的抗CD123抗体还可为单结构域抗体或其片段。具体地，单结构域抗体片段可由包含上文所述的抗体之一的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的可变重链(VHH)组成。抗CD3抗体还可为重链抗体，即缺乏轻链的抗体，其可包含或不包含CH1结构域。
单结构域抗体或其片段还可以包含骆驼单结构域抗体的框架区和任选地骆驼单结构域抗体的恒定结构域。
根据本发明的抗CD123抗体还可为选自下组的抗体片段：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sC(Fv)2和双抗体，特别是人源化抗体片段。
CD123-抗体还可为由本发明的抗CD123抗体的至少一个抗体片段或至少一个可变结构域形成的双特异性或多重特异性抗体。多重特异性抗体和多价蛋白复合物如例如EP 2050 764 A1或US2005/0003403 A1所述。
根据本发明的双特异性或多重特异性CD123-抗体可具有针对(a)由上述抗CD123抗体之一靶向的人或人和食蟹猴CD123细胞外结构域和(b)至少一种其他抗原具有特异性。
在具体的实施方案中，其他抗原是CD3且相应地获得的双特异性抗体是CD3/CD123双特异性抗体。常规的双特异性抗体可通过本领域已知的技术产生。
根据本发明的抗体和其片段可用于分离(例如纯化)形式或包含于载体中，如膜或脂质媒介物(例如脂质体)。
在另一实施方案中，本发明的抗CD123抗体用于制备本发明的在”抗体样结合蛋白”部分进一步定义的抗体样结合蛋白的用途。
上述实施方案的任何组合构成本发明的部分。
抗体样结合蛋白
发明人已生成数种抗体样结合蛋白，称为“7G3x20G6”、“7G3x4E7”、“7G3x4B4”、“7G3x18F5”、“hz20G6x7G3”、“7G3xhz4B4”、“hz4B4x3E3”、“hz20G6x7G3-TL4”和“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白，其中术语“hz”指代人源化抗体。这些抗体样结合蛋白具有CODV设计，特别是CODV-Fab或CODV-Ig设计。
本发明上下文中的“CODV形式”指双特异性抗体或多重特异性抗体的交叉双可变(CODV)配置。CODV形式允许可变结构域折叠保留和最终亲和力的互换性。
CODV形式之前已在国际专利申请WO2012/135345中描述。相应地，在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白如之前国际专利申请WO2012/135345(其通过提述并入本文)中所述处于CODV形式。
在一个实施方案中，本发明参照CODV-Fab形式的抗体样结合蛋白。相应地，在一个实施方案中，本发明参照包含形成两抗原结合位点的两条多肽链的抗体样结合蛋白，其中第一多肽具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽具有通过式[II]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对，且
其中VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且如果VD1和VD2为轻链可变结构域，则VD3和VD4均为重链可变结构域，或如果VD1和VD2是重链可变结构域，则VD3和VD4均为轻链可变结构域。
在CODV-Fab中添加Fc结构域至抗体样结合蛋白进一步稳定抗体样结合蛋白。更准确地，添加Fc结构域至CODV-Fab中的式(II)抗体样结合蛋白的多肽增加抗体样结合蛋白的半衰期且因此改进抗体样结合蛋白的药物动力学概貌。添加一个Fc区至CODV-Fab导致包含Fc结构域的多肽二聚化且获得的抗体样结合蛋白是CODV-Ig形式的抗体样结合蛋白。本发明因此进一步参照CODV-Ig形式的抗体样结合蛋白。
因此，本发明进一步参照包含形成四抗原结合位点的四条多肽链的抗体样结合蛋白，其中两条多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且两条多肽链具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白中的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式III的多肽形成交叉轻链-重链对，且
其中VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且如果VD1和VD2是轻链可变结构域，则VD3和VD4均为重链可变结构域，或如果VD1和VD2是重链可变结构域，则VD3和VD4均为轻链可变结构域。
在所述CODV-Ig形式中，两条具有由式[III]所示的结构的多肽链通过其Fc结构域二聚化。
在另一个实施方案中，将第一Fc结构域添加至式[II]抗体样结合蛋白CODV-Fab多肽，并将第二Fc结构域(称为Fc2)添加至式[I]抗体样结合蛋白CODV-Fab多肽。此外，在相同的实施方案中，接头L5出现在式[I]多肽链CL和Fc2结构域间获得式[IV]多肽链。
相应地，本发明进一步参照包含形成两抗原结合位点的两条多肽链的抗体样结合蛋白，其中一条多肽链具有由式[IV]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]
且一条多肽链具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
Fc2是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头；且
其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对；且
其中VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且如果VD1和VD2是轻链可变结构域，则VD3和VD4均为重链可变结构域，或如果VD1和VD2是重链可变结构域，则VD3和VD4均为轻链可变结构域。
该CODV形式中，其中由式[III]和[IV]所示的多肽链通过其分别的Fc2和Fc区二聚化，本文中称为CODV-Fab-TL。
在CODV-Fab的另一实施方案中，将第一Fc结构域添加至由式[II]所示的多肽链(获得式[III])，且抗体样结合蛋白包含含有第二Fc结构域或由其组成的多肽链(称为Fc3)。
本发明进一步涉及抗体样结合蛋白，其包含形成两抗原结合位点的三条多肽链，其中
第一多肽具有通过式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
第二多肽具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
第三多肽Fc3是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域(也称为Fc残端)；
其中
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3,和L4是氨基酸接头；
且其中式[I]的多肽和式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对，且
其中VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且如果VD1和VD2是轻链可变结构域，则VD3和VD4均为重链可变结构域，或如果VD1和VD2是重链可变结构域，则VD3和VD4均为轻链可变结构域；
且其中式[III]的多肽与第三多肽通过其Fc结构域异二聚化。
相应地，在所述实施方案中，所谓的“Fc残端(Fc stump)”(Fc3)与根据式III的多肽Fc区异二聚化。该CODV形式本文称为CODV-Fab-OL。该构建体避免CODV-Fab形成聚集体。
在CODV-Fab-OL的一个实施方案中，Fc和Fc3都是免疫球蛋白变体，其中CH3结构域已修饰：根据特别是描述于专利US5731168和US8216805(其以提述并入本文)中称为“Knob-into-Hole”的技术，Fc和Fc3各已在CH3-CH3界面基因工程化以促进异多聚体形成。
相应地，在一实施方案中，Fc和Fc3之一的CH3结构域包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，而其他Fc和Fc3的CH3结构域包含突变S354C和T366W(氨基酸位置由参照IgG1序列表示)。
合适的Fc和Fc3对的实例包括SEQ ID NO:396(Fc)和SEQ ID NO:397(Fc3)对和SEQID NO:394(Fc)和SEQ ID NO:398(Fc3)对。
在本发明的一个实施方案中，第一免疫球蛋白或第二免疫球蛋白是如上文《抗CD3抗体》部分定义的一种抗CD3抗体。
在本发明的另一实施方案中，第一免疫球蛋白或第二免疫球蛋白是如上文《抗CD123抗体》部分定义的一种抗CD123抗体。
根据本发明的实施方案，式I或式[IV]多肽的VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且II或III多肽的VD3和VD4均为重链或均为轻链可变结构域。该可交换性也称为"交换能力"且因此确定本发明抗体样结合蛋白的交叉双可变(CODV)配置。
根据上文定义，VD1和VD4是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域，且是VD2和VD3第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域，VD1和VD4以及VD2和VD3因此考虑为关联结构域。
相应地，术语“交叉”指式[I]或式[IV]多肽的VD1或VD2对应其式[II]或式[III]多肽的关联可变结构域VD4或VD3的交换比对。
在一个具体的实施方案中，VD1和VD2是轻链可变结构域且VD3和VD4是重链可变结构域。
本发明的抗体样结合蛋白可使用获得自或源自任何人或非人抗体的结构域或序列，例如人、大鼠或人源化抗体。
在一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG免疫球蛋白。
相应地，在一个实施方案中，CL是IgG免疫球蛋白的轻链恒定结构域。在另一个实施方案中，CH1是IgG免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域。
在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白可以使用本文所述的抗CD3抗体和抗CD123抗体的结构域或序列制备。
如本文使用的术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头由0氨基酸组成意为不存在接头。在序列水平，接头分别在可变结构域间或可变和恒定结构域间过渡处插入。由于已熟知免疫球蛋白结构域的大致大小，因此可识别结构域间的过渡。如通过实验数据所证或如通过建模或二级结构预测所假设，可通过定位不形成第二结构组成(如β-片层或α-螺旋)的肽段来确定结构域过渡的精确位置。本发明上下文所述的接头是接头L1、L2、L3、L4和L5。L1位于N-末端VD1结构域和VD2结构域间；L2位于VD2和C-末端CL结构域间。接头L3和L4位于如根据抗体样-蛋白式II或III所定义的多肽上。更精确地，L3位于N-末端VD3和VD4结构域间且L4位于VD4和C-末端CH1-Fc结构域间。L5位于CL和N-末端Fc2间。接头L1、L2、L3、L4和L5是独立的，但在一些实施方案中，其具有相同的序列和/或长度。
在本发明的一些抗体样结合蛋白中，L3的长度是L1长度的至少两倍。在本发明的其他抗体样结合蛋白中，L4的长度是L2长度的至少两倍。在本发明的一些抗体样结合蛋白中，L1的长度是L3长度的至少两倍。在本发明的其他抗体样结合蛋白中，L2的长度是L4长度的至少两倍。
在一个实施方案中，接头L1、L2、L3和L4包含0-20个氨基酸。在一个实施方案中，L5包含0-10个氨基酸。
在本发明的一些抗体样结合蛋白中，L1是3-12氨基酸残基长，L2是3-1氨基酸残基长，L3是1-8氨基酸残基长，且L4是1-3氨基酸残基长。在其他抗体样结合蛋白中，L1是5-10氨基酸残基长，L2是5-8氨基酸残基长，L3是1-5氨基酸残基长，且L4是1-2氨基酸残基长。在优选的抗体样结合蛋白中，L1是7氨基酸残基长，L2是5氨基酸残基长，L3是1氨基酸残基长，且L4是2氨基酸残基长。
在本发明的一些抗体样结合蛋白中，L1是1-3氨基酸残基长，L2是1-4氨基酸残基长，L3是2-15氨基酸残基长，且L4是2-15氨基酸残基长。在其他抗体样结合蛋白中，L1是1-2氨基酸残基长，L2是1-2氨基酸残基长，L3是4-12氨基酸残基长，且L4是2-12氨基酸残基长。在优选的抗体样结合蛋白中，L1是1氨基酸残基长，L2是2氨基酸残基长，L3是7氨基酸残基长，且L4是5氨基酸残基长。
在本发明的一些抗体样结合蛋白中，L1、L3或L4可等于0。然而，在其中L3或L4等于0的抗体样结合蛋白中，可变区和恒定区或在其他链上的双可变结构域间的相应过渡接头不能为0。在一些实施方案中，L1等于0且L3是2个或多个氨基酸残基，L3等于0且L1等于1个或更多氨基酸残基，或L4等于0且L2是3个或多个氨基酸残基。
在本发明的一些抗体样结合蛋白中，选自下组的接头至少之一包含至少一个半胱氨酸残基：L2、L3和L4。
合适的接头实例包括单甘氨酸、苏氨酸或丝氨酸残基；二肽如二甘氨酸肽、组氨酸-苏氨酸肽或甘氨酸-丝氨酸二肽；具有三个甘氨酸的三肽、三肽Thr-His-Thr、三肽Gly-Gly-Ser；具有四个甘氨酸残基的肽；具有五个甘氨酸残基的肽；具有六个甘氨酸残基的肽；具有七个甘氨酸残基的肽；具有八个甘氨酸残基的肽。可使用其他氨基酸残基的组合如肽Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:354)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:344)、肽Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:355)、肽Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:356)、肽Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:357)、肽Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:358)，和肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:345)。其他合适的接头包括单Ser和Val残基；二肽Arg-Thr、Gin-Pro、Ser-Ser、Thr-Lys和Ser-Leu；Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO:359)；Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQ IDNO:360)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQ ID NO:361)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO:362)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO:363)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro(SEQ ID NO:364)；Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO:365)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser(SEQ IDNO:366)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO:367)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO:368)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO:369)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO:370)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ IDNO:371)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ ID NO:372)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:373)；Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:374)；Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:346)、Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO:347)、Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ IDNO:348)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:349)、Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO:350)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:307)、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:309)、His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO:351)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:389)。上文列举的实例并非意在以任何方式限制本发明的保护范围，且包含选自下组的随机所选的氨基酸的接头已表明适于本发明的抗体样结合蛋白：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸。
接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸对于具有最大柔性的接头最佳。如果需要更加刚性和延伸的接头，则甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的一些组合有效。根据预期性质任何氨基酸残基与其他氨基酸残基组合以按需要构建较大肽接头时均可认作是接头。
在一个实施方案中，接头L1是序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:307)，接头L2是序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:309)，接头L3是序列‘S’且接头L4是序列‘RT’。
在另一个实施方案中，L1、L2、L3和L4接头序列选自下组：苏氨酸；二肽如组氨酸-苏氨酸肽；三肽Thr-His-Thr、Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO:359)；Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQID NO:360)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQ ID NO:361)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO:362)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO:363)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro(SEQ ID NO:364)；Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO:365)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser(SEQ IDNO:366)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO:367)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO:368)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO:369)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO:370)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ IDNO:371)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ ID NO:372)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gl y(SEQ ID NO:373)和Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:374)。在一个实施方案中，接头L5的序列选自下组：单丝氨酸残基；二肽如甘氨酸-丝氨酸二肽；和三肽Gly-Gly-Ser、肽Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:354)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:344)、肽Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:355)、肽Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:356)、肽Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:357)、肽Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:358)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQID NO:345)和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:389)。
本文使用的术语"Fc结构域"涵盖天然Fc和Fc变体和如上文定义的序列。当与Fc变体和天然Fc分子一起时，术语"Fc结构域"包括单体或多聚体形式的分子，无论从完整抗体消化还是由其他方式产生。
本文使用的术语"天然Fc"指包含由抗体消化或由其他方式产生的非抗原结合片段序列的分子，无论是单体或多聚体形式，并可包含铰链区。天然Fc的最初免疫球蛋白来源具体地是人来源且可以是任何免疫球蛋白，尽管优选是IgG1和IgG2。天然Fc分子由可通过共价(即二硫键)和非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽构成。天然Fc分子单体亚单元间的分子间二硫键的数目取决于种类(例如IgG、IgA和IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)可以是1-4。天然Fc的一个实例是IgG的木瓜蛋白酶消化获得的二硫键二聚体。本文使用的术语"天然Fc"是单聚体、二聚体和多聚体形式的统称。
本文使用的术语"Fc变体"指从天然Fc修饰但仍包含针对救助受体FcRn(新生Fc受体)的结合位点的分子或序列。典型的Fc变体和其与救助受体的相互作用为本领域已知。因此，术语"Fc变体"可包含从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然的Fc包含由于提供非对于本发明的抗体样结合蛋白所需的结构特征和生物活性因此可去除的区。因此，术语"Fc变体"包含缺少一个或多个天然Fc位点或残基或其中一个或多个Fc位点或残基已修饰的分子或序列，所述修饰影响或参与：(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞的不相容性，(3)在所选宿主细胞中表达时N-末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与Fc受体而非救助受体的结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，当抗体样结合蛋白包含两个Fc结构域时，即在CODV-Ig(Fc和Fc2)、CODV-Fab-TL(两Fc结构域)和CODV-Fab-OL(Fc和Fc3)中，两Fc结构域为相同的免疫球蛋白同型或同型亚类。相应地，在一些实施方案中，CODV-Ig的Fc和Fc2或CODV-Fab-TL的两Fc结构域，或CODV-Fab-OL的Fc和Fc3都是IgG1亚类，或IgG2亚类，或IgG3亚类，或IgG4亚类。
如本文所述的全部抗体样结合蛋白不具有效应器功能。这意味着当抗体样结合蛋白包含一个或多个IgG1亚类的Fc结构域时(即式[III]中的Fc、式[IV]中的Fc2和/或Fc3)，所述IgG1骨架的一个或多个Fc结构域包含废除Fc效应器功能的双突变L234A和L235A(称为“LALA突变”)。Fc双突变L234A和L235A不结合FcγR或C1q，且IgG1亚类Fc结构域的ADCC和CDC功能都被废除(Hezareh,M.等,J Virol.2001Dec；75(24):12161–12168)。
在一个实例中，Fc区包含氨基酸序列SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:394或SEQ IDNO:396。在一个实施方案中，FC2区包含CH3结构域中的H435R和Y436F这两处氨基酸交换，如Jendeberg,L.等(1997,J.Immunological Meth.201:25-34)中所述。相应地，在一个实施方案中，FC2区包含氨基酸序列SEQ ID NO:327。在另一个实施方案中，FC2区包含氨基酸序列SEQ ID NO:392。
称为CODV-Fab“7G3x20G6”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:306,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:9的VD1、序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:308的VD2、序列SEQ ID NO:309的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-根据式II的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:311,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:312‘RT’的VD3、氨基酸序列‘S’的L3、序列SEQ ID NO:5的VD4、氨基酸序列的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
称为CODV-Fab“7G3x4E7”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:314,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:21的VD1、序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:308的VD2、序列SEQ ID NO:309的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-根据式II的一条多肽，氨基酸序列为：
(SEQ IDNO:315,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:312的VD3、氨基酸序列‘S’的L3、序列SEQ ID NO:18的VD4、氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
称为CODV-Fab“7G3x4B4”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:316,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:16的VD1、序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:308的VD2、序列SEQ ID NO:309的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-根据式II的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:317,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:312的VD3、氨基酸序列‘S’的L3，序列SEQ ID NO:12的VD4，氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
称为CODV-Fab“7G3x18F5”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:318,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:26的VD1、序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:308的VD2、序列SEQ ID NO:309的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-根据式II的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:319,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:312的VD3，氨基酸序列‘S’的L3，序列SEQ ID NO:23的VD4，氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
称为CODV-Fab“hz20G6x7G3”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:320,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:308的VD1，序列SEQ ID NO:307的L1，序列SEQ ID NO:143的VD2，序列SEQ ID NO:309的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-根据式II的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:321,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:138的VD3、氨基酸序列‘S’的L3、序列SEQ ID NO:312的VD4、氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
称为CODV-Fab“7G3xhz4B4”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ IDNO:322,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:158的VD1、序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:308的VD2、序列SEQ ID NO:309的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-根据式II的一条多肽，氨基酸序列为：
(SEQ IDNO:323,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:312的VD3、氨基酸序列‘S’的L3、序列SEQ ID NO:171的VD4、氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
称为CODV-Fab“hz4B4x3E3”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ ID NO:324,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:230的VD1、序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:158的VD2、序列SEQ ID NO:309的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-根据式II的一条多肽，氨基酸序列为： (SEQ ID NO:325,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:171的VD3、氨基酸序列‘S’的L3、序列SEQ ID NO:226的VD4、氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
称为CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”的抗体样结合蛋白包含：
-一条根据式[I]的多肽，其基本由下列氨基酸序列组成：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGSGSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:388,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2和序列SEQ ID NO:310的CL，和
-一条根据式[II]的多肽，其基本由下列氨基酸序列组成：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGD IIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO:390)，其含有序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0氨基酸，序列SEQ ID NO:383的VD4(斜体和下划线)，L4是0氨基酸和序列SEQ ID NO:313的CH1。
在一个实例中，称为CODV-Fab“7G3x20G6”、“7G3x4E7”、“7G3x4B4”、“7G3x18F5”、“hz20G6x7G3”、“7G3xhz4B4”、“hz4B4x3E3”和“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽进一步包含对应使用的铰链序列和His标签的序列EPKSCDKTHTHHHHHH(SEQ ID NO:352)，例如用于纯化。
称为CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4”(也称为CODV-Fab-TL4“hz20G6x7G3”)的抗体样结合蛋白包含：
-一条根据式[IV]的多肽，其基本由下列氨基酸序列组成：DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKGQPKAAPDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEIKTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNRFTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:326,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ IDNO:308的VD1、序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:143的VD2、序列SEQ ID NO:309的L2、序列SEQ ID NO:310的CL和序列SEQ ID NO:327的Fc2(下划线)，和
-一条根据式[III]的多肽，其基本由下列氨基酸序列组成：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:328,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ IDNO:138的VD3、氨基酸序列‘S’的L3、序列SEQ ID NO:312的VD4、氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:329的CH1和序列SEQ ID NO:330的Fc。
在上述CODV-Fab-TL4“hz20G6x7G3”抗体样结合蛋白中，序列SEQ ID NO:330的Fc和序列SEQ ID NO:327的Fc2来自IgG4骨架。所述抗体样结合蛋白为CODV-Fab-TL形式且包含一条式III的多肽和一条式IV的多肽或由其组成。
称为CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”的抗体样结合蛋白包含：
-一条根据式IV的多肽基本由下列氨基酸序列组成：
(SEQ ID NO:391,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2、序列SEQ IDNO:310的CL、包含0氨基酸的L5和序列SEQ ID NO:392的Fc2(下划线)；和
-根据式III的一条多肽，其氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:393)，其含有序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0氨基酸、序列SEQ IDNO:383的VD4(斜体)，L4是0氨基酸、序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:394的Fc(下划线)。
在CODV-Fab-TL1“hz20G6x7G3”的抗体样结合蛋白中，序列SEQ ID NO:394的Fc和序列SEQ ID NO:392的Fc2来自IgG1骨架。所述抗体样结合蛋白是CODV-Fab-TL形式。其包含或由式IV的一条多肽和式III的一条多肽组成。
称为CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，其氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:388,接头以粗体和下划线表示)，其含有序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2和序列SEQ IDNO:310的CL；和
-根据式III的一条多肽，其氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:395)，其含有序列SEQ ID NO:138的VD3，0氨基酸的L3、序列SEQ IDNO:383的VD4(斜体和下划线)，0氨基酸的L4，序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:396的Fc(下划线)；
且其中称为CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”的抗体样结合蛋白进一步包含Fc残端(Fc3)，其氨基酸序列为： (SEQ ID NO:397)，且其与根据式III的多肽的Fc区异二聚化。
所述抗体样结合蛋白为CODV-Fab-OL形式，即其包含或由一条式I的多肽、一条式III的多肽和一条Fc残端或由上述组成。其Fc和Fc3序列已根据“Knob-into-Hole”技术工程化并进一步包含双突变L234A和L235A。
序列SEQ ID NO:396的Fc序列已设计在位置200-221(上文粗体)包含RF残基，替代本来在Fc区的这些位置存在的HY残基。HY>RF突变(即CH3结构域中的H435R和Y436F由Jendeberg,L.等1997,J.Immunological Meth.,201:25-34进行了描述)就纯化目的是具有优势的，这是由于其废除与蛋白A的结合。在CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”的情况中，序列SEQ ID NO:397的Fc残端在位置217-218包含HY残基(上文粗体)。
称为CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”的抗体样结合蛋白包含：
-根据式I的一条多肽，其氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:388)，其包含序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2和序列SEQ ID NO:310的CL；
-根据式III的一条多肽，其氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:399)，其包含序列SEQ ID NO:138的VD3，0氨基酸的L3，序列SEQ IDNO:383的VD4(斜体和下划线)，0氨基酸的L4，序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:400的Fc(下划线)；
-且其中称为CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”的抗体样结合蛋白进一步包含Fc残端(Fc3)，其氨基酸序列为：
(SEQ ID NO:398)，其与根据式III的多肽的Fc区异二聚化。
序列SEQ ID NO:400的Fc在位置220-221包含HY残基(上文粗体)而序列SEQ IDNO:398的Fc残端在位置217-218包含RF残基(上文粗体)。
所述抗体样结合蛋白为CODV-Fab-OL形式，即其包含或由一条式I的多肽、一条式III的多肽和一条Fc残端或由上述组成。其Fc和Fc3序列已根据“Knob-into-Hole”技术工程化并进一步包含双突变L234A和L235A。
在一个实施方案中，第一免疫球蛋白或第二免疫球蛋白选自下组的一种抗CD123抗体：称为“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”和“9F6-G3”抗CD123抗体，或其人源化形式，或下文所述的抗CD123抗体“7G3”，例如抗CD123抗体“3E3-D3”或“7G3”，或其人源化形式。
在一个实施方案中，第一免疫球蛋白或第二免疫球蛋白是选自下组的一种抗CD3抗体：称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“12D2-E5”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“18H11-F10”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“3G5-E10”、“9D7-F3”、“8C2-F7”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“6C9-C9”、“3E8-G1”、“3H6-D2”和“8H2”抗CD3抗体，或其人源化形式，例如称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”和“hz20G6”抗CD3抗体，例如称为“20G6-F3”、“4B4-D7”抗CD3抗体。
相应地，VD1和VD4或VD2和VD3是抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含：
a)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:6的CDR1-H、序列SEQ ID NO:7的CDR2-H、序列SEQ ID NO:8的CDR3-H，和轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:142的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
b)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:14的CDR2-H、序列SEQ ID NO:15的CDR3-H，和轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:17或SEQID NO:184的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
c)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:19的CDR2-H、序列SEQ ID NO:20的CDR3-H，和轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:22的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L；或
d)重链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:24的CDR1-H、序列SEQ ID NO:19的CDR2-H、序列SEQ ID NO:25的CDR3-H，和轻链可变结构域，其含有序列SEQ ID NO:27的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:28的CDR3-L，且
其中如果VD4是轻链的可变结构域，则VD1是如上文定义的重链的可变结构域，或如果VD4是重链的可变结构域，则VD1是如上文定义的轻链的可变结构域，或
如果VD3是轻链的可变结构域，则VD2是如上文定义的重链的可变结构域，或如果VD3是重链的可变结构域，则VD3是如上文定义的轻链的可变结构域。
在另一个实施方案中，VD1和VD4或VD2和VD3是抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体是人源化抗体且包含：
a)序列SEQ ID NO:13或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:143或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
b)序列SEQ ID NO:171或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:158或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
c)序列SEQ ID NO:176或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:164或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
其中如果VD4是轻链的可变结构域，则VD1是如上文定义的重链的可变结构域，或如果VD4是重链的可变结构域，则VD1是如上文定义的轻链的可变结构域，或
如果VD3是轻链的可变结构域，则VD2是如上文定义的重链的可变结构域，或如果VD3是重链的可变结构域，则VD3是如上文定义的轻链的可变结构域。
在与SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:158、SEQ IDNO:176或SEQ ID NO:164至少85％相同的所述序列中，6个CDR序列与参照序列SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:176或SEQ ID NO:164中存在的6个CDR相比无变化。
在一实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白与人CD3结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白进一步与食蟹猴CD3结合。具体地，本发明的抗体样结合蛋白与人CD3或人和食蟹猴CD3两者的细胞外结构域结合。更具体地，抗体与CD3ε结合。更具体地，抗体样结合蛋白与人或人和食蟹猴CD3ε细胞外结构域结合。当以复合物的形式如CD3ε/δ复合物存在或作为单蛋白存在时，无论在分离的形式中表达还是存在于例如T细胞中的可溶性细胞外结构域或全长膜锚定的CD3ε，抗体样结合蛋白均与CD3ε结合。根据本发明的抗体样结合蛋白特异性针对表面人CD3蛋白或人和食蟹猴CD3蛋白两者，特别是CD3ε。
根据本发明的抗体样结合对于食蟹猴CD3的亲和力比对人CD3的亲和力的比率(KD(食蟹猴)/KD(人))≤10，具体地≤6、≤5、≤4、≤3、≤2、≤1或≤0.5。因此，这种根据本发明的多肽可用于在猴中实施的毒性研究，猴中观察到的毒性概貌与在人中预期潜在的副作用相关。
此外，根据本发明的抗体样结合蛋白对于人CD3或食蟹猴CD3或两者亲和力(KD)≤50nM、≤40n或≤30nM，例如≤20nM，例如0.1nM-30nM的亲和力，具体地0.4nM-20nM或0.4nM-15nM的亲和力。
在一个实施方案中，不存在靶细胞时本发明的抗体样结合蛋白具有小于20％、小于18％、小于16％、小于14％、小于12％、小于10％的更低的T-细胞活化。
在一个实施方案中，靶细胞存在时本发明的抗体样结合蛋白具有高于55％、高于60％、高于62％、高于64％、高于66％、高于68％、高于70％更高的T-细胞活化。
“低T-细胞活化”在本发明抗体样结合蛋白的上下文中指小于20％、小于18％、小于16％、小于14％、小于12％、小于10％的T-细胞活化。
本文的“靶细胞”指表达第二抗原的细胞，在本文靶细胞的一个实例中指表达CD123的细胞如THP-1细胞。
本文的“高T-细胞活化”指高于50％、高于55％、高于60％、高于62％、高于64％、高于66％、高于68％、高于70％的T-细胞活化。
在另一个实施方案中，本发明涉及对至少一种其他靶抗原具有生物和免疫特异性的抗体样结合蛋白。
因此，本发明的一方面，本发明的抗体样结合蛋白进一步与至少一种其他靶抗原结合。相应地，在一个实施方案中，本发明的抗体样结合蛋白是双特异性的且能够结合两种不同的抗原靶标或表位。
相应地，在一个实施方案中，如果第二免疫球蛋白是一种如上文《抗CD123抗体》部分所定义的CD123抗体，则第一免疫球蛋白是针对至少一种其他靶标的免疫球蛋白，或如果第一免疫球蛋白是一种如上文《抗CD123抗体》部分所定义的CD123抗体，则第二免疫球蛋白是针对至少一种其他靶标的免疫球蛋白。
在另一实施方案中，如果第二免疫球蛋白是一种如上文《抗CD3抗体》部分所定义的CD3抗体，则第一免疫球蛋白是针对至少一种其他靶标的免疫球蛋白，或如果第一免疫球蛋白是一种如上文《抗CD3抗体》部分所定义的CD3抗体，则第二免疫球蛋白是针对至少一种其他靶标的免疫球蛋白。
本发明的抗体样结合蛋白具有T-细胞衔接效应。该T-细胞衔接效应在靶细胞中诱导细胞毒性。在一个实施方案中，靶细胞是表达CD123的细胞，如表达CD123的癌细胞，例如THP-1或TF-1。
相应地，在一个实施方案中，根据本发明的抗体样结合蛋白可结合能够衔接原代T-细胞并能够体外裂解细胞，其中(EC50)≤40pM、≤35pM，例如≤30pM。
“细胞毒性”在本文指化合物如本发明的抗体样结合蛋白或抗CD123抗体对于细胞有毒的性质。细胞毒性可通过不同反应机制诱导且可因此分为细胞介导毒性、细胞凋亡、抗体依赖性细胞介导的毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
“抗体依赖性细胞介导的毒性”或“ADCC”指细胞介导的免疫抵御机制由此免疫系统的效应器细胞活跃地裂解其膜表面抗原已由特异性抗体结合的靶细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”在本发明的上下文中指在补体系统蛋白存在下裂解靶细胞。
“细胞介导的细胞毒性”指靶细胞通过效应器淋巴细胞如细胞毒性T淋巴细胞或天然杀伤细胞进行细胞裂解，且因此可分为T-细胞介导的细胞毒性和NK细胞毒性。
在一个实施方案中，本文的细胞毒性指细胞介导的细胞毒性例如T-细胞介导的细胞毒性。
此外，在一个实施方案中，细胞介导的细胞毒性指通过T细胞的细胞介导的细胞毒性。
相应地，本发明的抗体样结合蛋白在通过T细胞介导的靶细胞中通过诱导细胞介导的细胞毒性。
测量细胞毒性的方法为本领域的技术人员已知且包括使用51铬(Cr)释放试验，靶细胞的活/死细胞染色包括碘化丙锭、7-AAD和其他本领域的技术人员已知的染料、通过流式细胞术或ELISA检测由T细胞释放的裂解分子的包括颗粒酶和穿透细胞膜蛋白质、从损伤细胞释放如培养基的乳酸脱氢酶(LDH)作为对于细胞的细胞毒性和细胞裂解的检测、CD107a的细胞表面运动检测、凋亡靶细胞的Annexin V(钙依赖性磷脂结合蛋白)染色和例如激活Caspase-3的(CASP3)检测。此外，本领域的技术人员可在基于所选测试和基于实验设置区分不同的细胞毒性机制。
在一个实例中，细胞介导的细胞毒性可例如如上文所述使用CFSE以标记靶细胞和7-AAD以标记死亡细胞测量，例如在实施例3.2中。
在另一个实施方案中，抗体样结合蛋白能够与CD3和至少一种其他抗原靶标结合，例如CD123。
在一个实施方案中，抗体样结合蛋白能够抑制该其他抗原靶标的功能，例如CD123。
本发明的一方面，抗体样结合蛋白与人CD123结合。在另一个实施方案中，抗体样结合蛋白还与食蟹猴CD123结合。具体地，本发明的抗体样结合蛋白与人CD123或人和食蟹猴CD123两者的细胞外结构域结合。更具体地，抗体样结合蛋白CD123的远端部分结合，例如，与始于氨基酸序列SEQ ID NO:104的人CD123的位置19-49的氨基酸结合。无论在分离形式中或存在于CD123表达细胞如AML细胞或CD123转染细胞中存在的可溶性细胞外结构域或全长膜锚定的CD123中，抗体样结合蛋白都与CD123结合。根据本发明的抗体样结合蛋白对在其表面表达人和食蟹猴CD123蛋白的细胞具有特异性，例如表达CD123的癌细胞。
相应地，根据本发明的抗体样结合蛋白对于人CD123或食蟹猴CD123或两者的亲和力(KD)≤20nM、≤15nM或≤10nM，例如≤5nM，例如亲和力为0.01nM-5nM，更具体地0.1nM-5nM。
相应地，在一个实施方案中，第一免疫球蛋白是一种选自下组的抗CD3抗体：称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“12D2-E5”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“18H11-F10”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“3G5-E10”、“9D7-F3”、“8C2-F7”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“6C9-C9”、“3E8-G1”、“3H6-D2”和“8H2”抗CD3抗体，或其人源化形式，例如，称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“hz4B4”和“hz20G6”的抗CD3抗体，且第二免疫球蛋白是选自下组的一种抗CD123抗体:称为“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”和“9F6-G3”抗CD123抗体。
相应地，在另一个实施方案中，第二免疫球蛋白是一种选自下组的抗CD3抗体：称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“12D2-E5”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“18H11-F10”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“3G5-E10”、“9D7-F3”、“8C2-F7”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“6C9-C9”、“3E8-G1”、“3H6-D2”和“8H2”抗CD3抗体，或其人源化形式，例如称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“hz4B4”和“hz20G6”的抗CD3抗体，且第一免疫球蛋白是一种选自下组的抗CD123抗体：称为“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”和“9F6-G3”的抗CD123抗体。
相应地，在一个实施方案中，VD1和VD4或VD2和VD3包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其分别通过如上文所述的13种称为“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”和“9F6-G3”的抗CD123抗体之一的三个CDR序列或通过重链和轻链可变结构域序列限定，
其中如果VD2和VD3都包含如上文定义的一种抗CD3抗体重链和轻链可变结构域序列的三个CDR序列，则VD1和VD4都包含如上文定义的一种抗CD123抗体重链和轻链可变结构域序列的三个CDR序列，或
其中如果VD1和VD4都包含如上文定义的一种抗CD3抗体重链和轻链可变结构域序列的CDR序列，则VD2和VD3都包含如上文定义的一种抗CD123抗体重链和轻链可变结构域序列的三个CDR。
相应地，在一个实施方案中VD1和VD4为抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含含有序列SEQ ID NO:6的CDR1-H、序列SEQ ID NO:7的CDR2-H、序列SEQID NO:8的CDR3-H的重链可变结构域和含有序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:142的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L的轻链可变结构域且VD2和VD3是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
相应地，在另一实施方案中，VD2和VD3是抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含含有序列SEQ ID NO:6的CDR1-H、序列SEQ ID NO:7的CDR2-H、序列SEQID NO:8的CDR3-H的重链可变结构域和含有序列SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:142的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L的轻链可变结构域，且VD1和VD4是选自下组的CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
相应地，在另一实施方案中，VD1和VD4是抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:14的CDR2-H、序列SEQ ID NO:15的CDR3-H的重链可变结构域和含有序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:184的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L的轻链可变结构域，且VD2和VD3是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
相应地，在另一实施方案中，VD1和VD4为抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含含有序列SEQ ID NO:13的CDR1-H、序列SEQ ID NO:14的CDR2-H、序列SEQ ID NO:15的CDR3-H的重链可变结构域和含有序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:184的CDR1-L、序列‘KVS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:11的CDR3-L轻链可变结构域，且VD2和VD3是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
在另一实施方案中，VD1和VD4是人源化抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含序列SEQ ID NO:138的可变重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:143的轻链可变结构域，且VD2和VD3是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
在另一实施方案中，VD2和VD3是人源化抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含序列SEQ ID NO:138重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:143的轻链可变结构域，且VD1和VD4是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
在另一实施方案中，VD1和VD4是人源化抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含序列SEQ ID NO:171重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:158的轻链可变结构域，且VD2和VD3是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
在另一实施方案中，VD2和VD3是人源化抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含序列SEQ ID NO:171的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:158的轻链可变结构域，且VD1和VD4是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
在另一实施方案中，VD1和VD4是人源化抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含序列SEQ ID NO:176的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:164的轻链可变结构域，且VD2和VD3是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
在另一实施方案中，VD2和VD3是人源化抗CD3抗体重链或轻链的可变结构域，其中所述抗CD3抗体包含序列SEQ ID NO:176的重链可变结构域和/或序列SEQ ID NO:164的轻链可变结构域，且VD1和VD4是选自下组的抗CD123抗体重链或轻链的可变结构域：“3E3-D3”、“1E1-G5”、“2B8-F3”、“2F8-D6”、“3B10-E6”、“5A5-B4”、“6B10-E4”、“6C10-C4”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9B8-G6”、“9D7-C8”、“9F6-G3”抗CD123抗体，如上文在“抗CD123抗体”部分所述，
其中如果VD3和VD4均为重链可变结构域，则VD1和VD2均为轻链可变结构域，或如果VD3和VD4均为轻链可变结构域，则VD1和VD2均为重链可变结构域。
根据本发明的另一方面，第一或第二免疫球蛋白是抗CD123抗体7G3。因此，在一个实施方案中，VD1和VD4或VD2和VD3包含如通过如本文下文定义的抗体7G3重链和轻链可变结构域序列CDR序列所定义重链可变结构域和轻链可变结构域。在一个实施方案中，VD1和VD4或VD2和VD3包含如专利申请WO2013/173820(其通过提述并入本文)中所述的抗体7G3的重链可变结构域和轻链可变结构域。
相应地，如本文使用的称为“7G3”的抗CD123抗体包含：
-下列序列组成的重链可变结构域： (SEQ ID NO:312,其中CDR以粗体显示)，其含有序列SEQ ID NO:375的CDR1-H、序列SEQ ID NO:376的CDR2-H和序列SEQ ID NO:377的CDR3-H且
-下列序列组成的轻链可变结构域： (SEQ ID NO:308,其中CDR以粗体显示)，其含有序列SEQ ID NO:378的CDR1-L、序列‘WAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:379的CDR3-L。
在本发明的另一方面中，抗体7G3还可为人源化抗体或人源化抗体的片段。相应地，在一个实施方案中，本发明的抗体7G3是人源化抗体，其包含：
-下列序列组成的重链可变结构域： (SEQ ID NO:380,其中CDR以粗体显示)，其含有序列SEQ ID NO:381的CDR1-H、序列SEQ ID NO:377的CDR2-H和序列SEQ ID NO:382的CDR3-H，或
下列序列组成的重链可变结构域： (SEQ ID NO:383,其中CDR以粗体显示)，其含有序列SEQ ID NO:381的CDR1-H、序列SEQ ID NO:384的CDR2-H和序列SEQ ID NO:382的CDR3-H，或
-下列序列组成的轻链可变结构域： (SEQ ID NO:385,其中CDR以粗体显示)，其含有序列SEQ ID NO:378的CDR1-L、序列‘WAS’的CDR2-L和序列SEQ ID NO:379的CDR3-L。
在一个实施方案中，与人CD3ε和人CD123特异性结合的抗体样结合蛋白包含：
a)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:9或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:5或与其至少85％相同的序列组成，或
b)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:21或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:18或与其至少85％相同的序列组成，或
c)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:16或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:12或与其至少85％相同的序列组成，或
d)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:26或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:23或与其至少85％相同的序列组成，或
e)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:143或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:138或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，或
f)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:158或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:171或与其至少85％相同的序列组成，
g)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:230或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:158或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:171或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:226或与其至少85％相同的序列组成，
h)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:385或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:141或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:138或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:383或与其至少85％相同的序列组成。
在上文所述的与参照序列至少85％相同的序列(例如与SEQ ID NO:383或SEQ IDNO:385至少85％相同的序列)中，与本发明参照序列中的6个CDR相比，6个CDR的序列未改变。
在一个实施方案中，根据a)-g)任一项定义的抗体结合蛋白进一步包含下列接头：序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:309的L2、氨基酸序列‘S’的L3、氨基酸序列‘RT’的L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
在一个实施方案中，根据a)-g)任一项定义的抗体结合蛋白进一步包含序列SEQID NO:327的Fc2。
在一个实施方案中，根据h)定义的抗体结合蛋白进一步包含下列接头：序列SEQID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:389的L2、由0氨基酸组成的L3和L4和序列SEQ ID NO:313的CH1。
在一个实施方案中，根据h)定义的抗体结合蛋白进一步包含序列SEQ ID NO:392的Fc2。
在一个实施方案中，根据a)-h)任一项定义的抗体结合蛋白的L5包含0氨基酸。
在另一实施方案中，根据a)-g)任一项定义的抗体结合蛋白进一步包含下列接头：序列SEQ ID NO:307的L1、序列SEQ ID NO:309的L2、氨基酸序列‘S’的L3、氨基酸序列‘RT’的L4、序列SEQ ID NO:329的CH1和序列SEQ ID NO:330的Fc。
在另一个实施方案中，根据h)定义的抗体结合蛋白进一步包含下列接头：序列SEQID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:389的L2、由0氨基酸组成的L3和L4、序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:394的Fc。
在另一个实施方案中，根据h)定义的抗体结合蛋白进一步包含序列SEQ ID NO:397或SEQ ID NO:398或与SEQ ID NO:397或SEQ ID NO:398至少的85％相同的序列的Fc残端。
在一实施方案中，与人CD3ε和人CD123特异性结合的抗体结合蛋白包含或基本上由下列组成：
a)根据式[I]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2和序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388组成，或
与SEQ ID NO:388至少85％相同的序列，其中hz7G3轻链可变结构域(SEQ ID NO:385的VD1的序列)中SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR，和hz20G6轻链可变结构域(SEQ ID NO:141的VD2的序列)中SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变，和
b)根据式[II]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:138的VD3(L3是0氨基酸)、序列SEQ ID NO:383的VD4(L4是0氨基酸)和序列SEQ ID NO:313的CH1的氨基酸序列SEQ ID NO:390组成，或
与SEQ ID NO:390至少85％相同的序列，其中hz7G3重链可变结构域(SEQ ID NO:383的VD4的序列)中SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR和hz20G6重链可变结构域(SEQ ID NO:138的VD3的序列)中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；
且其中所述式[I]的多肽和所述式[II]的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一实施方案中，与人CD3ε和人CD123特异性结合的抗体结合蛋白包含或基本上由下列组成：
a)根据式[IV]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2、序列SEQ ID NO:310的CL、包含0氨基酸的L5和序列SEQ ID NO:392的Fc2的氨基酸序列SEQ ID NO:391组成，或
与SEQ ID NO:391至少85％相同的序列，其中hz7G3轻链可变结构域(SEQ ID NO:385的VD1的序列)中SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR和hz20G6轻链可变结构域(SEQ ID NO:141的VD2的序列)中SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变；和
b)根据式[III]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:138的VD3(L3是0氨基酸)、序列SEQ ID NO:383的VD4(L4是0氨基酸)和序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:394的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:393组成，或
与SEQ ID NO:393至少85％相同的序列，其中hz7G3重链可变结构域(SEQ ID NO:383的VD4的序列)中SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和hz20G6重链可变结构域(SEQ ID NO:138的VD3的序列)中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；
且其中所述式[IV]的多肽和所述式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对。
在所述抗体样结合蛋白中，由式[III]和[IV]所示的多肽链通过其分别的Fc2和Fc区二聚化。
在一实施方案中，与人CD3ε和人CD123特异性结合的抗体结合蛋白包含或基本上由下列组成：
a)根据式[I]的一条多肽，其由含有序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2、和序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388组成，或
与SEQ ID NO:388至少85％相同的序列，其中hz7G3轻链可变结构域(SEQ ID NO:385的VD1的序列)中SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR和hz20G6轻链可变结构域(SEQ ID NO:141的VD2的序列)中SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变；和
b)根据式[III]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:138的VD3(L3是0氨基酸)、序列SEQ ID NO:383的VD4(L4是0氨基酸)和序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:396的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:395组成，或
与SEQ ID NO:395至少85％相同的序列，其中hz7G3重链可变结构域(SEQ ID NO:383的VD4的序列)中SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和hz20G6重链可变结构域(SEQ ID NO:138的VD3的序列)中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；和
c)一条Fc残端(多肽Fc3)，其为序列SEQ ID NO:397或与其至少85％相同的序列，其中所述残端Fc3或与其至少85％相同的序列与根据式[III]的多肽的Fc区异二聚化；且
其中所述式[I]的多肽和所述式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对。
在一实施方案中，与人CD3ε和人CD123特异性结合的抗体结合蛋白包含或基本上由下列组成：
a)根据式[I]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:385的VD1、序列SEQ ID NO:389的L1、序列SEQ ID NO:141的VD2、序列SEQ ID NO:389的L2和序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388组成，或
与SEQ ID NO:388至少85％相同的序列，其中hz7G3轻链可变结构域(SEQ ID NO:385的VD1的序列)中SEQ ID NO:378、‘WAS’和SEQ ID NO:379的3个CDR，和hz20G6轻链可变结构域(SEQ ID NO:141的VD2的序列)中SEQ ID NO:142、‘KVS’和SEQ ID NO:11的3个CDR未改变；和
b)根据式[III]的一条多肽，其由包含序列SEQ ID NO:138的VD3(L3是0氨基酸)、序列SEQ ID NO:383的VD4(L4是0氨基酸)和序列SEQ ID NO:313的CH1和序列SEQ ID NO:400的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:399组成，或
与SEQ ID NO:399至少85％相同的序列，其中hz7G3重链可变结构域(SEQ ID NO:383的VD4的序列)中SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和hz20G6重链可变结构域(SEQ ID NO:138的VD3的序列)中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；和
c)一条Fc残端(多肽Fc3)，其为序列SEQ ID NO:398或与其至少85％相同的序列，其中所述残端Fc3或与其至少85％相同的序列与根据式[III]的多肽的Fc区异二聚化；且
其中所述式[I]的多肽和所述式[III]的多肽形成交叉轻链-重链对。
免疫偶联物
在一个实施方案中，本发明的抗CD123抗体与生长抑制剂、细胞毒性剂或前体药物激活酶偶联或连接。具体地，本发明的抗CD123抗体对于靶向所述生长抑制剂、细胞毒性剂或前体药物至在表面表达或过表达CD123的癌细胞确实有效。
核酸、载体和重组宿主细胞
本发明的另一目的涉及包含或由编码如上文定义的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白的序列组成的核酸序列。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可包括与任何合适的载体中，如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。
术语"载体"、"克隆载体"和"表达载体"意为通过其DNA或RNA序列(例如外源基因)可转入宿主细胞进而转化宿主并促进导入的基因表达(例如转录和翻译)的媒介物。
因此，本发明的另一目的涉及包含本发明核酸的载体。
这种载体可包含调节组成，如启动子、增强子、终止子等，以在施用至受试者时引起或指导所述多肽的表达。在表达载体中使用的用于动物细胞的启动子和增强子的实例包括SV40早期启动子和增强子(Mizukami T.等1987)、LTR启动子莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney mouse leukemia virus)(Kuwana Y等1987)的增强子、启动子(Mason JO等1985)和免疫球蛋白H链增强子(Gillies SD等1983)等。
可使用任何用于动物细胞的表达载体，只要编码人抗体C区的基因可以插入和表达。合适的载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等1990)、pAGE103(Mizukami T等1987)、pHSG274(Brady G等1984)、pKCR(O'Hare K等1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等1990)等。质粒的其他实例包括包含复制起点的质粒，或整合质粒，如pUC、pcDNA、pBR等。
病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这种重组病毒可通过本领域已知的技术产生，如通过转染包装细胞或通过使用复制质粒或病毒的瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷性重组病毒的详细方案可例如在WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中发现。
本发明的另一目的涉及已通过根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的细胞。
术语"转化"意为将"外源"(即外来的)基因、DNA或RNA序列导入宿主细胞，进而宿主细胞将表达导入的基因或序列以产生预期物质，通常是由导入的基因或序列编码的蛋白或酶。接收和表达导入的DNA或RNA的宿主细胞已"转化"。
本发明的核酸可用于在合适的表达系统产生本发明的重组抗体。术语"表达系统"意为在合适的条件下的宿主细胞和相容载体，例如由外源DNA编码的蛋白通过载体携载并导入宿主细胞表达。
通用的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，和哺乳动物宿主细胞和载体。其他宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体的实例包括大肠杆菌(E.coli)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)或酿酒酵母(Saccharomyces yeasts)、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或建立的哺乳动物细胞培养(例如从淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(此后称为"DHFR基因")缺陷的CHO细胞、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，此后称为"YB2/0细胞")等。优选为YB2/0细胞，由于当在该细胞中表达时，嵌合或人源化抗体的ADCC活性增强。
具体地，对于人源化抗体或抗体样结合蛋白的表达，表达载体可以是其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于分开的载体上的类型或其中两基因存在于相同载体上的类型(串联型)。考虑到人源化抗体和抗体样结合蛋白表达载体构建的难易程度、导入动物细胞的难易程度和抗体H和L链在动物细胞中的表达水平间的平衡，优选串联型人源化抗体表达载体(Shitara K等J Immunol Methods.1994Jan.3；167(1-2):271-8)。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18等。
本发明还涉及表达根据本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白的重组宿主细胞的产生方法，所述方法包括或由下列步骤组成：(i)将如上文所述的重组核酸或载体体外或离体导入感受态宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞并(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。
这些重组宿主细胞可用于产生本发明的抗CD3抗体、至少一种抗CD123抗体或至少一种抗体样结合蛋白。
产生本发明的抗体和抗体样结合蛋白的方法
本发明的一个实施方案提供制备包含形成两抗原结合位点的两条多肽链的抗体样结合蛋白的方法，其中第一多肽具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽具有通过式[II]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述第一和第二多肽形成交叉轻链-重链对，且
其中VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且如果VD1和VD2为轻链可变结构域，则VD3和VD4均为重链可变结构域，或如果VD1和VD2是重链可变结构域，则VD3和VD4均为轻链可变结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供用于制备包含形成四抗原结合位点的四条多肽链的抗体样结合蛋白的方法，其中两条多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且一条多肽链具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
且其中所述式I的多肽和式III的多肽形成交叉轻链-重链对，且
其中VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且如果VD1和VD2是轻链可变结构域，则VD3和VD4均为重链可变结构域，或如果VD1和VD2是重链可变结构域，则VD3和VD4均为轻链可变结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供用于制备包含形成四抗原结合位点的四条多肽链的抗体样结合蛋白的方法，其中两条多肽链具有由式[IV]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]
且两条多肽链具有通过式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
Fc2是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头；且
其中式IV的多肽和式III的多肽形成交叉轻链-重链对；且
其中VD1和VD2均为轻链可变结构域或均为重链可变结构域，且如果VD1和VD2是轻链可变结构域，则VD3和VD4均为重链可变结构域，或如果VD1和VD2是重链可变结构域，则VD3和VD4均为轻链可变结构域。
在本发明的一个实施方案中，第一免疫球蛋白或第二免疫球蛋白是一种如上文《抗CD3抗体》部分定义的抗CD3抗体。
在本发明的另一实施方案中，第一免疫球蛋白或第二免疫球蛋白是一种如上文“抗CD123抗体”部分定义的抗CD123抗体。
本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体和/或抗体样结合蛋白可通过任何本领域已知的技术产生，如但不限于单独的任何化学、生物、基因或酶技术或其组合。
获知预期序列的氨基酸序列，本领域的技术人员可以很容易地通过标准用于产生多肽的技术产生所述抗体或免疫球蛋白链。例如，其可使用已知的固相方法合成、具体地使用市场有售的肽合成设备(如由Applied Biosystems,Foster City,California制造的)并依照生产商的说明书合成。可替换地，本发明的抗体、免疫球蛋白链和抗体样结合蛋白可通过本领域熟知的重组DNA技术合成。例如，这些片段作为DNA表达产物如下获得：将编码预期(多)肽的DNA序列并入表达载体并将这种载体导入合适的将表达预期多肽的真核或原核宿主后，随后使用已知技术从其分离所述片段。
具体地，本发明进一步涉及产生本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体和/或抗体样结合蛋白的方法，该方法包括或由下列步骤组成：(i)培养根据本发明的转化的宿主细胞；(ii)表达所述抗体或多肽；和(iii)回收表达的抗体或多肽。
本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体和/或抗体样结合蛋白通过常规的免疫球蛋白纯化步骤例如A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基适当分离。
在具体的实施方案中，本发明的人源化嵌合抗CD3抗体和/或抗CD123抗体可通过下列方式产生：获得编码之前所述的人源化VL和VH结构域的核酸序列，通过将其插入用于具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的动物细胞的表达载体构建人嵌合抗体表达载体，并通过将表达载体导入动物细胞表达编码序列。类似于此，人源化抗体样结合蛋白可通过使用两种人源化抗体的重链和轻链的第一人源化免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域(VD1)、第二人源化免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域(VD2)、所述第二人源化免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域(VD4)和所述第一人源化免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域获得。
作为本发明的人嵌合抗体的CH结构域或抗体样结合蛋白的CH结构域，其可以是属于人免疫球蛋白重链的任何区，但这些IgG类型是合适的且也可使用属于IgG类型的亚类的任何一种如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。此外，作为本发明的人嵌合抗体的CL或抗体样结合蛋白的CL，其可以是属于人免疫球蛋白轻链的任何区，且可使用κ类或λ类的那些。
用于产生人源化或嵌合抗体的方法涉及本领域熟知的常规重组DNA和基因转入技术(参见Morrison SL.等(1984)and patent documents US5,202,238；和US5,204,244)。
基于常规重组DNA和基因转染技术的用于产生人源化抗体的方法为本领域熟知(参见例如Riechmann L.等1988；Neuberger MS.等1985)。抗体可使用多种本领域已知的技术人源化包括例如在专利申请WO2009/032661中公开的技术、CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、饰面或表面置换(EP592,106；EP 519,596；Padlan EA(1991)；Studnicka GM等(1994)；Roguska MA.等(1994))和链替换(美国专利号5,565,332)。用于制备这种抗体的一般重组DNA技术也已知(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。
本发明的Fab可通过用蛋白酶如木瓜蛋白酶处理与CD3或CD123特异性反应的抗体获得。此外，Fab可通过将编码抗体的两条Fab链的DNA序列插入用于原核表达或用于真核表达的载体，并将所述载体导入原核或真核(酌情)细胞以表达Fab产生。
本发明的F(ab')2可用蛋白酶木瓜蛋白酶处理与CD3或CD123特异性反应的抗体获得。此外，F(ab')2可通过经由硫醚键或二硫键结合下文所述的Fab'。
本发明的Fab'可用还原剂如二硫苏糖醇处理与CD3或CD123特异性反应的F(ab')2获得。此外，Fab'可通过将编码抗体Fab'链的DNA序列插入用于原核表达或用于真核表达的载体，并将所述载体导入原核或真核(酌情)细胞以表达Fab产生。
本发明的scFv可通过采用如前文所述的CDR或VH和VL结构域的序列，构建编码scFv片段的DNA，将DNA插入原核表达或真核表达的载体，且随后将表达载体导入原核或真核细胞(酌情)以表达Fab产生。为生成人源化scFv片段，可使用称为CDR移植的已知技术，其涉及选择根据本发明的互补决定区(CDR)，并将其移植至已知三维结构的人scFv片段框架上(参见例如W098/45322；WO 87/02671；US5,859,205；US5,585,089；US4,816,567；EP0173494)。
本发明对抗体的修饰
预期对如本文所述的抗体或抗体样结合蛋白进行氨基酸序列修饰。例如，期望改进抗体或抗体样结合蛋白的结合亲和力和/或其他生物学性质。例如，已知当人源化抗体通过仅将源自非人动物的抗体VH和VL中的CDR移植至人抗体VH和VL的FR中产生，与原始源自非人的动物抗体相比抗原结合活性可减少。考虑非人抗体VH和VL中的数种氨基酸残基不仅在CDR中还在FR中，也可直接或间接与抗原结合活性相关。因此用源自人抗体VH和VL的FR的不同氨基酸残基的这些氨基酸残基取代将减少结合活性。为解决该问题，在移植了非人CDR的人抗体中，需做出在人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中识别与抗体结合直接相关的氨基酸残基，或与维持抗体三维结构且与跟抗原的结合直接相关的CDR相互作用的氨基酸残基。减少的抗原结合活性通过用源自非人动物的最初抗体的氨基酸残基取代识别的氨基酸增加。本发明的抗体样结合蛋白可包含人源化抗体的可变区，且因此在本文提及的考虑同样可应用至本发明的抗体样结合蛋白。
修饰和改变可发生在本发明的抗体结构以及在编码它们的DNA序列中，并仍得到具有预期特性的功能性抗体、抗体样结合蛋白或多肽。
在产生这些多肽的氨基酸序列中的改变时，可考虑氨基酸的亲水性指数。赋予相互作用的生物功能的亲水性氨基酸指数对蛋白的重要性一般为本领域所理解。已接受氨基酸的相对亲水特征对有助于所产生的蛋白的二级结构，其随后限定蛋白与其他分子的相互作用，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。已确定于其亲水性和电荷特性确定每种氨基酸的亲水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本发明的另一目的还涵盖本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白的多肽的功能性保守变体。
例如，一些氨基酸可由其他蛋白结构中的氨基酸取代而不丧失活性。由于蛋白的相互作用能力和性质限定其生物功能活性，一些氨基酸取代可在蛋白序列中发生，且当然可在其DNA编码序列中发生，而仍然获得具有相似性质的蛋白。因此预期多种改变可在本发明的抗体序列中发生，或在对应的编码所述多肽的DNA序列中发生，而不丧失其生物活性。
本领域已知一些氨基酸可通过其他具有相似亲水性指数或分数的氨基酸取代且仍产生具有相似生物活性的蛋白，即仍获得生物功能性等同的蛋白。可能使用已建立的技术如丙氨酸扫描方式以在本发明的抗体或多多肽中鉴别可取代而不显著丧失与抗原的结合的全部氨基酸。由于这些残基不参与抗原结合或维持抗体的结构，它们可以具有中性的性质。一个或多个这种中性位置可通过丙氨酸通过另一氨基酸取代而不改变本发明的抗体或多肽的主要特性。
如上所述，氨基酸一般因此基于其氨基酸侧链取代基的相似性例如其亲水性、疏水性、电荷、大小等而发生取代。考虑上述特征的典型取代为本领域的技术人员已知且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
还可预期对应抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白的效应器功能进行修饰，例如从而增强或减少抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体的Fc区引进一个或多个氨基酸取代实现，在本发明抗体样结合蛋白的上下文中，此处也称为Fc-变体。可替换地或附加地，半胱氨酸残基可引进Fc区，由此允许在该区形成链内二硫键。生产的同二聚化抗体可具有改进的或减少的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Caron PC.等1992；和Shopes B.1992)。
另一类型本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白氨基酸修饰可用于改变抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白的最初糖基化类型，即通过删除一个或多个在抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白中发现的糖部分和/或添加一个或多个未在抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白中存在的糖基化位点。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸的存在(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)生成潜在的糖基化位点。糖基化位点对于抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白抗CD3的添加或删除可通过改变氨基酸序列方便地完成，由此其包含一个或多个上述的三肽序列(对于N-连接糖基化位点)。
另一类型的修饰涉及去除在计算机中或实验中识别的潜在导致抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白制剂产生降解产物或异质性的序列。举例来说，天冬酰胺和谷氨酰胺的去酰胺化可取决于因素如pH和表面暴露而发生。天冬酰胺残基对去酰胺化特别易感，特别是当存在于序列Asn-Gly中，且在其他二肽中如Asn-Ala程度较少。当该去酰胺化位点特别是Asn-Gly存在于本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白或多肽时，因此可预期去除该位点，通常通过保守取代，以去除残留的残基之一。序列中的这种去除一个或多个残留残基的取代也意在涵盖于本发明中。
共价修饰的另一类型涉及将糖苷与抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白化学或酶学偶联。这些操作对于在不需要在具有N-或O-连接糖基化的宿主细胞中产生抗CD3抗体、抗CD123抗体和抗体样结合蛋白中存在优势。依赖于使用的偶联模式，糖可与以下附着：(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基如半胱氨酸中的游离巯基，(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸中的游离羟基，(e)芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法例如描述于WO87/05330。
存在于抗CD3抗体,抗CD123抗体或抗体样结合蛋白的任何糖部分的去除可化学或酶学实现。化学去糖基化需要抗CD3抗体，抗CD123抗体或抗体样结合蛋白暴露至化合物三氟甲磺酸或等同化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖)以外的大多数或全部糖的裂解，而保持抗体完整。化学去糖基化由Sojahr H.等(1987)和by Edge,AS.等(1981)描述。抗体上糖部分的酶学裂解可通过使用如Thotakura,NR.等(1987)所述的多种内切和外切糖苷酶实现。
抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白另一类型的共价修饰包含将抗体以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述的方式连接至多种非蛋白多聚物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
药物组合物
本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体和/或抗体样结合蛋白可与药物上可接受的赋形剂和任选的缓释基质如可生物降解的聚合物组合以形成治疗组合物。
因此，本发明的另一目的涉及包含本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白和药物上可接受的载剂的药物组合物。
本发明还涉及根据本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白用作药物的用途。本发明还涉及本发明的药物组合物用作药物的用途。
本文使用的术语"药物组合物"或"治疗组合物"指当适当施用至患者时能诱导预期治疗效果的化合物或组合物。
这样的治疗或药物组合物可包含治疗上有效的量的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白或其药物偶联物，和与所选用于施用模式稳定性的药物上或生理上可接受的配制剂的混合物。
"药物上"或"药物上可接受的"指酌情使用至哺乳动物特别是人时不产生副作用、过敏或其他不良反应的整体和组合物。药物上可接受的载剂或赋形剂指任何类型的非毒性固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂辅料。
本文使用的“药物上可接受的载剂”包括任何和全部生理上兼容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂等。合适的载剂、溶剂和/或赋形剂的实例包括水、氨基酸、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或多种，以及其组合。在许多情况中，优选组合物中包括等渗剂，如糖、多元醇或氯化钠且制剂还可包含抗氧化剂如色胺类和稳定剂如吐温20。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病况、疾病的严重性、患者的年龄、重量和性别等。
本发明的药物组合物可配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内施用等。
具体地，药物组合物包含媒介物、其对于能够注射的制剂是药物上可接受的。这些可具体为等渗、无菌的盐水溶液(单钠或二钠磷酸盐、钠、钾、钙或镁盐酸盐等或这些盐的组合物)，或根据情况为干燥的特别是冷冻干燥的组合物，其在添加无菌水或生理盐水时可构成可注射溶液。
用于施用的剂量可作为相关疾病的多种参数的函数，且特别是作为施用模式或预期治疗持续时间的函数。
为制备药物组合物，可将有效量的本发明的抗体或免疫偶联物溶解或分散于药物上可接受的载剂或水介质中。
适于可注射用途的药物形式包括无菌溶液或分散剂；制剂包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；和用于可注射溶液或分散剂的临时制备的无菌粉末。在所有情况中，所述形式必需为无菌且必需为易于注射的一定程度的液体。其在制造和保存条件下必需稳定且必需可预防微生物，如细菌和真菌的污染作用。
作为游离碱或药物上可接受的盐的活性化合物的溶液可与表面活性剂如羟丙基纤维素在水中适当制备。分散剂还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备。在正常的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以预防微生物生长。
本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合可配制成中性或盐形式的组合物。药物上可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白的游离氨基酸基团形成)且其用无机酸如例如盐酸或磷酸或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。用游离羧基基团形成的盐还可源自无机碱如例如钠，钾、铵、钙或铁的氢氧化物和有机碱如异丙胺、三甲胺、甘氨酸、组氨酸、普鲁卡因等。
载剂还可为溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和植物油。通过例如包衣如卵磷脂的使用、在分散剂的情况中通过维持所需颗粒尺寸和通过使用表面活性剂保持适当的流动性。微生物作用的预防可通过多种抗菌可抗真菌剂带来，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况中，优选包括等渗剂例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶带来。
无菌溶液优选通过在具有多种其他上文列举的成分的合适的溶剂中以所需的量并入活性化合物制备，按需要随后可过滤灭菌。一般而言，分散剂可通过将多种无菌活性成分并入包含基础分散介质和需要的上文列举的其他成分的无菌媒介物制备。在用于制备可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是从之前的其无菌过滤溶液获得活性成分及其他预期成分粉末的真空干燥和冷冻干燥技术。
还预期制备用于直接注射的更浓或高度浓缩的溶液，其中预想将DMSO用作溶剂以导致快速穿透，递送高浓度活性剂至小肿瘤区域。
配制后，溶液将以与剂量配制相容和治疗上有效的量的方式施用。制剂可以多种剂型施用，如上文所述的可注射溶液的类型，但也可采用药物释放胶囊等。
对于液体溶液中的肠胃外施用，例如，必要时所述溶液应适当缓冲且液体溶剂用足够的盐或葡萄糖首先赋予等渗。这些特定的水溶液特别适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，在本公开的启示下可采用的无菌水介质为本领域的技术人员已知。例如，可将一剂量溶于1ml的等渗NaCl溶液并添加至1000ml皮下输液或在选定输液位点注射(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版,1035-1038和1570-1580页)。剂量上的一些变化取决于治疗的患者的病况可按需要发生。在任何事件中，负责施用的人将确定用于个体受试者的合适剂量。
在一个实施方案中，本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白在合适的治疗混合物中配制以使每剂量包含约0.01-100毫克等。
除配制用于肠胃外施用的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白如静脉或肌肉注射，其他治疗上可接受的形式包括例如片剂或其他用于口服施用的固体；时间释放胶囊；和任何其他现在使用的形式。
在一些实施方案中，预期使用脂质体和/或纳米颗粒用于将多肽如抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白导入宿主细胞。脂质体和/或纳米颗粒的配制和使用为本领域的技术人员已知。
纳米胶囊一般可以稳定和可重复的方式包裹化合物。为避免由于细胞内多聚物过载引起的副作用，一般使用可在体内降解的聚合物设计这种超细颗粒(尺寸约0.1μm)。预期满足需要的生物可降解聚氰基丙烯酸酯纳米颗粒可在本发明中使用，且这种颗粒可很容易地制备。
可从分散于水介质且同时形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成脂质体。MLV的直径一般为25nm-4μm。Sonication of MLV的超声形成直径为的小单层囊泡(SUV)，其在中心包含水溶液。脂质体的物理特性依赖于pH、离子强度和二价氧离子的存在。
一旦配制了药物组合物，其可作为溶液、悬液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末在无菌小瓶中保存。这种制剂可以即用形式或以需要在施用前重构的形式(例如冻干形式)保存。
治疗方法和用途
发明人已展示本发明的数种双特异性化合物，如“hz20G6x7G3”,“7G3xhz4B4”,“hz4B4x3E3”和“hz20G6x7G3–TL4”对CD123阳性肿瘤细胞系模型的T-细胞介导的细胞毒性。此外，发明人还证明了数种本发明的双特异性化合物在靶细胞存在下激活T细胞导致肿瘤细胞的细胞毒性的能力。发明人还进一步证明了靶细胞不存在下无T-细胞活化中的T细胞低活化。
已知治疗性抗CD123单克隆抗体可导致具有由抗体特异性识别的抗原的消耗。该消耗可通过至少三种机制介导。抗体介导的细胞的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和通过经由抗体靶向的抗原赋予的信号的肿瘤生长的直接抗肿瘤抑制。在一个实施方案中，本发明的抗CD123抗体通过抗体介导细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导表达CD123的细胞的细胞毒性。
"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"指补体存在下的靶细胞裂解。经典补体通路的活化通过补体系统的第一组成与结合关联抗原的抗体的结合而启动。为评估补体活化，实施CDC试验例如Gazzano-Santoro等(1997)中所述。
"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"或"ADCC"指其中分泌的抗体结合至存在于一些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)表面的Fc受体(FcR)使这些细胞毒性效应器特异性结合带有抗原的靶细胞且随后杀伤靶细胞的细胞毒性形式。为评估感兴趣的分子的ADCC活性，可实施体外ADCC试验，如美国专利号5,500,362或5,821,337所述。
如上文“抗CD3抗体”部分所述，本发明的抗CD3抗体具有低T-细胞活化，其因此在受试者中具有用作免疫抑制剂的治疗潜力。
此外，如上文定义的抗体样结合蛋白目的在于通过靶向T-细胞至肿瘤细胞增强患者对肿瘤的免疫应答。在一个实施方案中，如上文定义的抗体样结合蛋白在T-细胞表面靶向T-细胞受体(TCR)的CD3ε亚单位，而其他臂靶向表达CD123的癌细胞，其中T-细胞和肿瘤细胞通过双特异性构建体的共同参与导致细胞裂解合酶的形成，其诱导细胞活化并导致肿瘤细胞杀伤。肿瘤细胞杀伤可通过至少两种机制介导：穿孔蛋白/颗粒酶杀伤和FasL/Fas杀伤，例如穿孔蛋白/颗粒酶杀伤。
因此，在一个实施方案中，本发明提供治疗或预防疾病并病症的方法，其包括将本发明的治疗上有效的量的抗CD3抗体、抗CD123抗体、抗体样结合蛋白或如上文“药物组合物”定义的药物组合物施用至有需要的受试者。
本发明进一步涉及本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体、抗体样结合蛋白或药物组合物用于制备治疗或预防受试者中疾病或病症的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及抗CD3抗体、抗CD123抗体、抗体样结合蛋白或药物组合物用于治疗或预防受试者中疾病或病症的用途。
术语“受试者”或“个体”可交换使用且可例如为人或非人哺乳动物。例如，受试者是蝙蝠；鼬；兔；猫科动物(猫)；犬科动物(狗)；灵长类动物(猴)，马类(马)；人包括男人、女人和儿童。在一个实施方案中，"受试者"指人。
在本发明的上下文中，术语"治疗"或"疗法"指治疗用途(即对具有给定疾病的受试者)且意为逆转、减轻、抑制一种或多种这些病症或病况的进展。因此，治疗不仅指导致疾病完全治愈的治疗，还指减缓疾病进展和/或延长受试者生存率的治疗。
“预防”意为预防性使用(即对给定疾病易于发展的受试者的作用)。
在一个实施方案中，"疾病"或"病症"是将从用本发明的抗CD123抗体或抗体样结合蛋白的治疗获益的任何状况。在一个实施方案中，其包括长期或急性病症或疾病，其包括使受试者易感于相关病症的病理状况。术语“需要治疗”指具有病症以及病症将发展的受试者。
在一个实施方案中，"疾病"或"病症"是将从用本发明的抗CD3抗体治疗获益的任何病况。因此，在一个实施方案中，其包括特征在于病理性免疫应答的疾病或病症。
"病理性免疫应答"在本发明的上下文中意为炎性免疫应答。
在一个实施方案中，特征在于病理性免疫应答的疾病是自身免疫学疾病、移植相关疾病或炎性相关疾病。
自身免疫性疾病为例如克罗恩氏病(Crohn's disease)，溃疡性结肠炎和1型糖尿病或移植相关疾病，如移植物抗宿主病(GVHD)。
因此，在一个实施方案中，受试者已诊断患有特征在于病理性免疫应答的疾病或病症。
在一个实施方案中，受试者已诊断患有自身免疫性疾病。
在另一个实施方案中，所述病症指癌症。
在另一个实施方案中，癌症涉及血液癌症，特别是与CD123表达相关的血液癌症。
在一个实施方案中，由癌细胞表达的CD123可以很容易地例如通过使用根据本发明的抗CD123抗体如在“诊断用途”部分所述进行试验。
“与CD123表达相关血液癌症”包括白血病(如急性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、毛细胞白血病和骨髓增生异常综合征)和恶性淋巴增殖病况，母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)，系统性肥大细胞增多症，包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)，伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)和小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤)。
如上文“抗CD123抗体”部分所述LSC表达CD123。
因此，在相关实施方案中，癌症指与白血病干细胞相关的血液癌症。
依照本发明待治疗的与白血病干细胞(LSC)相关的血液癌症病况包括白血病(如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病和骨髓增生异常综合征)和恶性淋巴增殖病况、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)、系统性肥大细胞增多症包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)，伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)和小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤)。
本发明的一方面，血液癌症是急性骨髓性白血病(AML)。
在一个实施方案中，受试者已诊断患有AML。
在另一个实施方案中，受试者已用化疗治疗直至完全缓解但复发。
“复发”定义为完全缓解后AML的重新出现。
“完全缓解”或“CR”定义如下：中性粒细胞为正常值(>1.0*109/L)，10g/dL的血红蛋白水平，和血小板计数(>100*109/L)且不依赖红细胞输血；少于5％的原始细胞，无原始细胞簇或聚集，和对骨髓的检查无Auer小体存在；和血细胞的正常成熟(形态学；脊髓X线造影摄片)且不存在髓外白血病。
在一个实施方案中，本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白单独使用或与任何合适的生长抑制剂组合使用。
本发明多肽的"治疗上有效的量"意为以合理的收益/风险比率应用至任何医学治疗足以治疗所述癌症疾病的多肽的量。然而，可以理解的是本发明多肽和组合物的每日总用量将由主治医师在安全医学判断范围内决定。用于任何特定患者的特定的治疗上有效的量将取决于多种因素，包括待治疗的病症和病症的严重性；采用的特定多肽的活性；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、基本健康、性别和饮食；施用时间；施用途径和采用的多肽的排泄率；治疗持续时间；与采用的多肽组合或同时使用的药物等医学领域已知的因素。例如，本领域的技术人员已知化合物的初始剂量低于实现预期治疗效果所需的剂量且逐渐增加剂量直至达到预期效果。
在一个实施方案中，用本发明的抗CD3抗体、抗CD123抗体或抗体样结合蛋白或根据本发明的免疫偶联物治疗的效力在体内可以很容易地试验，例如在癌症小鼠模型中，例如通过测量例如治疗和对照组间肿瘤体积的变化。
诊断用途
已报导CD123在多种血液肿瘤表面过表达。
因此，CD123构成癌症标记物且因此具有用于预测抗癌疗法或检测疾病复发的潜力。
在一实施方案中，本发明的抗CD123抗体用作上下文中靶向表达CD123肿瘤的疗法的试验组成，进而确定患者对治疗剂的易感性，监测抗癌疗法的有效性或检测治疗后疾病复发。具体地，本发明相同的抗CD123抗体既可作为治疗剂的组成也可作为诊断试验的组成。
因此，本发明的另一目的涉及根据本发明的抗CD123抗体用于在受试者体内检测抗CD123抗体表达的用途，或用于在受试者的生物样品中离体检测CD123抗体表达的用途。在一个实施方案中，所述检测具体目的为：
a)诊断受试者中癌症的存在，或
b)确定具有癌症的患者对靶向CD123特别是根据本发明的抗CD123抗体或抗体样结合蛋白治疗剂的易感性，或
c)通过检测肿瘤细胞上表面蛋白CD123的表达监测抗CD123癌症疗法的有效性或检测抗CD123癌症疗法后癌症的复发。
在一实施方案中，抗体目的用于体外或离体用途。例如，在从受试者获得的生物样品中使用本发明的抗CD123抗体体外或离体检测CD123。根据本发明的用途还可为体内用途。例如，将根据本发明的抗CD123抗体或抗体样结合蛋白施用至受试者并检测和/或量化抗体细胞复合物，由此所述复合物的检测对癌症有指示作用。
本发明进一步涉及体外或离体检测受试者中癌症的存在，其包括或由下列步骤组成：
(a)将受试者的生物样品与根据本发明的抗CD123抗体接触，特别是在使抗体与生物样品足以形成复合物的条件中；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体的水平，
(c)通过比较抗体和对照的结合水平来检测癌症的存在，抗体结合水平高于对照则对癌症具有指示性。
本发明还涉及确定具有癌症的患者对靶向CD123的治疗剂特别是根据本发明的抗CD123抗体或抗体样结合蛋白的易感性的体外或离体方法，该方法包括或由下列步骤组成：
(a)将具有癌症的患者的生物样品与根据本发明的抗CD123抗体接触，特别是在使抗体与生物样品足以形成复合物的条件中；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体的水平，
(c)将测得的抗体与所述生物样品的结合水平与抗体与对照的结合水平进行比较。
其中与对照相比，与所述生物样品结合的抗体水平更高表明患者对靶向至少CD123的治疗剂易感。
在上述方法中，所述对照可以是相同类型的正常、非癌症生物样品或在相同类型的正常生物样品中确定的代表性抗体结合水平的参照值。
在一实施方案中，本发明的抗CD123抗体对诊断与CD123表达相关的血液癌症的有效，包括白血病(如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、毛细胞白血病和骨髓增生异常综合征)和恶性淋巴增殖病况、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)、系统性肥大细胞增多症包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤、非霍金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)，伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)和小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤)。
本发明进一步涉及体外或离体监测抗CD123癌症疗法有效性的方法，其包括或由下列步骤组成：
(a)将经历抗CD123癌症疗法的受试者的生物样品与根据本发明的抗CD123抗体接触，特别是在使抗体与生物样品足以形成复合物的条件中；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体的水平，
(c)将所测得的抗体的结合水平与抗体与对照的结合水平进行比较；
其中与对照相比与所述生物样品结合的抗体水平减少指示所述抗CD123癌症疗法的有效性。
在所述方法中，与对照相比与所述生物样品结合的抗体水平的增加指示所述抗CD123癌症疗法无效。
所述对照具体是与用于分析的生物样品相同的生物样品类型，但其在之前抗CD123癌症疗法的过程中及时从受试者获得。
本发明进一步涉及体外或离体检测抗CD123癌症疗法后癌症复发的方法，其包括或由下列步骤组成：
(a)将具有完全抗CD123癌症疗法的受试者的生物样品与根据本发明的抗CD123抗体接触，特别是在使抗体与生物样品足以形成复合物的条件中；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体的水平，
(c)将所测得的抗体的结合水平与抗体与对照的结合水平进行比较；
其中与对照相比与所述生物样品结合的抗体水平的增加指示抗CD123癌症疗法后癌症的复发。
所述对照具体是与用于分析的生物样品相同的生物样品类型，但其之前从抗CD123癌症疗法完成时或之后及时从受试者获得。
所述抗CD123癌症疗法具体是使用抗CD123抗体或抗体样结合蛋白或根据本发明的免疫偶联物的疗法。所述抗CD123癌症疗法靶向表达CD123的癌症，具体为与CD123表达相关的血液癌症，包括白血病(如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、毛细胞白血病和骨髓增生异常综合征)和恶性淋巴增殖病况、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)、系统性肥大细胞增多症包括淋巴瘤(如多发性骨髓瘤、非霍金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)，伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)和小细胞和大细胞滤泡性淋巴瘤)。
在一实施方案中，本发明的抗CD123用可检测的分子或物质如荧光分子或任何已知提供(直接或间接)信号的其他标记物进行标记。
对于根据本发明的抗CD123抗体，本文使用的术语"标记"意在涵盖通过偶联(即物理连接)可检测物质直接标记抗CD123抗体，如将放射剂或荧光基团(如异硫氰酸萤光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))偶联至多肽，以及通过用可检测物质间接标记多肽。
在另一个实施方案中，本发明的抗CD123抗体用放射性分子通过本领域已知的方法标记。例如放射性分子包括但不限于用于闪烁照相研究的放射性原子如I123、I124、In111、Re186、Re188、Tc99。例如，本发明的多肽可用用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记如碘-123、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁进行标记。
"生物样品"涵盖从受试者获得的多种样品类型且可在诊断或检测中使用。生物样品包括但不限于血液和其他生物来源的液体样品、固体组织样品如活检样品或组织培养或源自它们的细胞，和其子代。因此，生物样品涵盖临床样品、培养基中的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品，特别是肿瘤样品。
本发明还涉及体内检测受试者中癌症存在的方法，其包括或由下列步骤组成：
a)将可检测标记的根据本发明的抗体施用至患者；
b)在患者中通过成像检测所述可检测标记的抗体的定位。
在一个实施方案中，本发明的抗体对于癌症分期(例如放射成像中)有效。其可单独或与其他癌症标记物组合使用。
本文使用的术语"检测"或“检测了”包括具有或无对照参照的定性和/或定量检测(测量水平)。
在本发明的上下文中，本文使用的“诊断”意为目的在于从收集的多项数据中识别影响患者的病理从而确定医疗病况的性质。
在所述方法中，癌症是如上文所述的表达CD123的癌症。
试剂盒
最后，本发明还提供包含本发明的至少一种抗CD3抗体、至少一种抗CD123抗体或至少一种抗体样结合蛋白的试剂盒。已发现包含本发明的抗CD123或抗CD3抗体的试剂盒可用于检测表面蛋白CD123或CD3中或治疗或诊断试验中。本发明的试剂盒可包含多肽或抗CD3抗体、与固体支持物偶联的至少一种抗体或至少一种抗体样结合蛋白，例如组织培养平板或珠(例如琼脂糖珠)。包含在体外检测和量化表面蛋白CD123或CD3的抗体的试剂盒可在例如ELISA或蛋白免疫印迹中提供。在一个实施方案中，所述抗体对于检测有效且提供标记物如荧光或放射标记。
在一个实施方案中，本发明涵盖用于产生单剂量施用单位的试剂盒。每个试剂盒可包含具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。还包括在本发明保护范围之内的是包含单或多室预填充注射器的试剂盒(例如液体注射器和lyosyringes)。
贯穿本申请，术语“包含”应理解为涵盖全部具体提及的特征以及任选地、额外的未描述的那些。本文使用的术语“包含了”也公开其中除具体提及的特征未给出其他特征的实施方案(即“由…组成”)。此外不定冠词"一个"或"一种"不排除复数。某些记载在相互不同的从属权利要求中的措施这一起码事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。
本发明现将更详细地参照下文附图和实施例描述。全部本文记载的文献和专利文件在此处以提述并入。由于本发明在前文说明书中已详细阐述并说明，因此实施例应理解为阐述性或示例性而非限制性的。
序列简述
SEQ ID NO:1展示包含信号肽的全长人CD3ε蛋白的氨基酸序列，可从Uniprot数据库在登录号P07766下获得。
SEQ ID NO:2展示包含信号肽的全长食蟹猴CD3ε蛋白的氨基酸序列，可从Uniprot数据库在登录号Q95LI5下获得。
SEQ ID NO:3展示包含全长野生型人CD3ε蛋白氨基酸23-126的成熟人CD3εHis-标签Fc-融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4展示包含与野生型序列的氨基酸位置57相比含有在氨基酸位置35包含一个Ala至Val交换的全长野生型食蟹猴CD3ε蛋白(SEQ IDNO:2)的氨基酸23-117的成熟食蟹猴CD3εFc-融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5展示称为“20G6-F3”抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6、7和8展示称为“20G6-F3”抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9展示称为“20G6-F3”抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10展示称为“20G6-F3”、“11D7-C3”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9、“10F4-C10”、“18G9-H11”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“8C2-F7”、“20E5-F10”和“3H6-D2”抗体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11展示称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“10F4-C10”、“4E7-C9”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“20E5-F10”和“3H6-D2”抗体的CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12展示称为“4B4-D7”抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13展示称为“4B4-D7”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“10F4-C10”、“18G9-H11”、“4E7-C9”、“11F3-B9”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20B5-F10”和“3H6-D2”抗体的CDR1-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14和15展示称为“4B4-D7”抗体的CDR2-H和CDR3-H氨基酸序列。
SEQ ID NO:16展示称为“4B4-D7”抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17展示称为“4B4-D7”、“11H3-E5”和“11F3-B9”抗体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18展示称为“4E7-C9”抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19展示称为“4E7-C9”、“18F5-H10”、“20E5-F10”和“3H6-D2”抗体的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20展示称为“4E7-C9”抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21展示称为“4E7-C9”抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22展示称为“4E7-C9”抗体的CDR1-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23展示称为“18F5-H10”抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24展示称为“18F5-H10”抗体的CDR1-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25展示称为“18F5-H10”抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26展示称为“18F5-H10”抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27展示称为“18F5-H10”抗CD3抗体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28展示称为“18F5-H10”、“11D7-C3”、“1E6-C9”和“10E6-G6”抗CD3抗体的CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29展示称为“12D2-E5”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30和31展示称为“12D2-E5”抗CD3抗体的CDR1-H和CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32展示称为“12D2-E5”和“3G5-E10”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33展示称为“12D2-E5”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34和35展示称为“12D2-E5”抗CD3抗体的CDR1-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36展示称为“11D7-C3”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37展示称为“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“16F8-A7”、“11F9-F8”和“20B5-F10”抗CD3抗体的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38展示称为“11D7-C3”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39展示称为“11D7-C3”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40展示称为“11H3-E5”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41展示称为“11H3-E5”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42展示称为“11H3-E5”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43展示称为“13H2-C2”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44展示称为“13H2-C2”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45展示称为“13H2-C2”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46展示称为“13C1-F6”和“11F9-F8”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47展示称为“13C1-F6”、“10E6-G6”和“11F9-F8”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48展示称为“13H2-C2”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49展示称为“18H11-F10”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50、51和52展示称为“18H11-F10”抗CD3抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53展示称为“18H11-F10”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54和55展示称为“18H11-F10”抗CD3抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56展示称为“1E6-C9”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57和58展示称为“1E6-C9”抗CD3抗体的CDR1-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:59展示称为“1E6-C9”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:60展示称为“10F4-C10”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61展示称为“10F4-C10”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:62展示称为“10F4-C10”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63展示称为“10E6-G6”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:64和65展示称为“10E6-G6”抗CD3抗体的CDR1-H和CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:66展示称为“10E6-G6”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:67展示称为“10E6-G6”抗CD3抗体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:68展示称为“18G9-H11”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:69展示称为“18G9-H11”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:70展示称为“18G9-H11”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71展示称为“18G9-H11”抗CD3抗体的CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:72展示称为“11F3-B9”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:73展示称为“11F3-B9”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:74展示称为“12G3-E8”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75、76和77展示称为“12G3-E8”抗CD3抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78展示称为“12G3-E8”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:79展示称为“5B1-G2”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:80和81展示的CDR1-H和CDR3-H的氨基酸序列称为“5B1-G2”抗CD3抗体。
SEQ ID NO:82展示称为“5B1-G2”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:83展示称为“16F8-A7”抗CD3抗体的重链可变结构域的部分的氨基酸序列。
SEQ ID NO:84展示称为“16F8-A7”和“11F3-B9”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85展示称为“16F8-A7”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86展示包含信号肽的全长人CD3δ蛋白的氨基酸序列，可从Uniprot数据库登录号P04234下获得。
SEQ ID NO:87展示称为“11F9-F8”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:88展示称为“11F9-F8”抗CD3抗体的CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89展示称为“3G5-E10”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:90和91展示称为“3G5-E10”抗CD3抗体的CDR1-H和CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:92展示称为“3G5-E10”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:93和94展示称为“3G5-E10”抗CD3抗体的CDR1-L和CDR3-L的序列。
SEQ ID NO:95展示称为“9D7-F3”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:96、97和98展示称为“9D7-F3”抗CD3抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:99展示称为“9D7-F3”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:100和101展示称为"9D7-F3"和"6C9-C9"抗CD3抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:102展示称为“8C2-F7”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:103、104和105展示称为“8C2-F7”抗CD3抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:106展示称为“8C2-F7”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:107展示称为“20E5-F10”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:108展示称为“20E5-F10”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109展示称为“20E5-F10”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:110展示称为“20B5-F10”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:111展示称为“20B5-F10”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:112展示称为“20B5-F10”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:113和114展示称为“20B5-F10”抗CD3抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:115展示称为“6C9-C9”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:116、117和118展示称为“6C9-C9”抗CD3抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:119展示称为“6C9-C9”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:120展示称为“6C9-C9”抗CD3抗体的CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:121展示称为“3E8-G1”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:122、123和124展示称为“3E8-G1”抗CD3抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:125展示称为“3E8-G1”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:126和127展示称为“3E8-G1”抗CD3抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:128展示称为“3H6-D2”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:129展示称为“3H6-D2”抗CD3抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:130展示称为“3H6-D2”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:131展示称为“8H2”抗CD3抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:132展示称为“8H2”抗CD3抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:133和134展示称为“8H2”抗CD3抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:135展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH1a。
SEQ ID NO:136展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH1b。
SEQ ID NO:137展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH1c。
SEQ ID NO:138展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH1d。
SEQ ID NO:139展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1a。
SEQ ID NO:140展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1b。
SEQ ID NO:141展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1c。
SEQ ID NO:142展示人源化“20G6”抗CD3抗体VL1c变体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:143展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1d。
SEQ ID NO:144展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH2a。
SEQ ID NO:145展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH2b。
SEQ ID NO:146展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH2c。
SEQ ID NO:147展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH2d。
SEQ ID NO:148展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2a。
SEQ ID NO:149展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2b。
SEQ ID NO:150展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2c。
SEQ ID NO:151展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2d。
SEQ ID NO:152展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH3a。
SEQ ID NO:153展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH3b。
SEQ ID NO:154展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL3a。
SEQ ID NO:155展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL3b。
SEQ ID NO:156展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL3c。
SEQ ID NO:157展示人源化“20G6”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL3d。
SEQ ID NO:158展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1A。
SEQ ID NO:159展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1B。
SEQ ID NO:160展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2A。
SEQ ID NO:161展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2B。
SEQ ID NO:162展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1Cmodif1。
SEQ ID NO:163展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1Cmodif2。
SEQ ID NO:164展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1Cmodif3。
SEQ ID NO:165展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1Amodif1。
SEQ ID NO:166展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1Amodif2。
SEQ ID NO:167展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL1Amodif3。
SEQ ID NO:168展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2C。
SEQ ID NO:169展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2D。
SEQ ID NO:170展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列VL2F。
SEQ ID NO:171展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH1A。
SEQ ID NO:172展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH1B。
SEQ ID NO:173展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH2A。
SEQ ID NO:174展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH2B。
SEQ ID NO:175展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH6Bmodif1。
SEQ ID NO:176展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH6Bmodif2。
SEQ ID NO:177展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH6Amodif1。
SEQ ID NO:178展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH6Amodif2。
SEQ ID NO:179展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH6Amodif3。
SEQ ID NO:180展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH6C。
SEQ ID NO:181展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列VH6D。
SEQ ID NO:182展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL变体氨基酸序列D7-VK3mut。
SEQ ID NO:183展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VH变体氨基酸序列D7-VH1mut。
SEQ ID NO:184展示人源化“4B4”抗CD3抗体的VL1B、VL2B、VL1Cmodif3和VL2F变体的CDR1-L氨基酸序列。
SEQ ID NO:185展示包含信号肽的全长人CD3γ蛋白的氨基酸序列，可从Uniprot数据库登录号P09693下获得。
SEQ ID NO:186展示称为“20G6-F3”抗CD3抗体的Fab重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:187展示称为“20G6-F3”抗CD3抗体的Fab轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:188展示称为“4E7-C9”抗CD3抗体的Fab重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:189展示称为“4E7-C9”抗CD3抗体的Fab轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:190展示称为“4B4-D7”抗CD3抗体的Fab重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:191展示称为“4B4-D7”抗CD3抗体的Fab轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:192展示称为“18F5-H10”抗CD3抗体的Fab重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:193展示称为“18F5-H10”抗CD3抗体的Fab轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:194展示包含信号肽的全长人CD123蛋白的氨基酸序列可从NCBI数据库NP_002174.1下和从Uniprot数据库P26951下获得。
SEQ ID NO:195展示包含信号肽的全长食蟹猴CD123蛋白的氨基酸序列，可从GenBank数据库EHH61867.1下和Uniprot数据库G8F3K3下获得。
SEQ ID NO:196展示包含全长人CD123蛋白(SEQ ID NO:194)氨基酸22 -305的成熟人CD123 Strep-II标签Fc-融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:197展示包含全长食蟹猴CD123蛋白(SEQ ID NO:195)氨基酸22-305的成熟食蟹猴CD123 Strep-II标签Fc-融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:198展示称为“1E1-G5”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:199展示称为“1E1-G5”和“8B11-B7”抗CD123抗体的CDR1-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:200展示称为“1E1-G5”和“6D6-B8”抗CD123抗体的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:201展示称为“1E1-G5”,“6D6-B8”,“8B11-B7”和“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:202展示称为“1E1-G5”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:203和204展示称为“1E1-G5”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:205展示称为“2B8-F3”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:206、207和208展示称为“2B8-F3”抗CD123抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:209展示称为“2B8-F3”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:210和211展示称为“2B8-F3”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:212展示称为“2F8-D6”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:213、214和215展示称为“2F8-D6”抗CD123抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:216展示称为“2F8-D6”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:217和218展示称为“2F8-D6”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:219展示称为“3B10-E6”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:220、221和222展示称为“3B10-E6”抗CD123抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:223展示称为“3B10-E6”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:224和225展示称为“3B10-E6”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:226展示称为“3E3-D3”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:227、228和229展示称为“3E3-D3”抗CD123抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:230展示称为“3E3-D3”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:231和232展示称为“3E3-D3”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:233展示称为“5A5-B4”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:234、235和236展示称为“5A5-B4”抗CD123抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:237展示称为“5A5-B4”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:238和239展示称为“5A5-B4”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:240展示称为“6B10-E4”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:241、242和243展示称为“6B10-E4”抗CD123抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:244展示称为“6B10-E4”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:245和246展示称为“6B10-E4”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:247展示称为“6C10-C4”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:248、249和250展示称为“6C10-C4”抗CD123抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:251展示称为“6C10-C4”和“9B8-G6”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:252展示称为“6C10-C4”和“9B8-G6”抗CD123抗体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:253展示称为“6C10-C4”、“9B8-G6”和“9D7-G3”抗CD123抗体的CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:254展示称为“6D6-B8”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:255展示称为“6D6-B8”抗CD123抗体的CDR1-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:256展示称为“6D6-B8”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:257和258展示称为“6D6-B8”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:259展示称为“8B11-B7”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:260展示称为“8B11-B7”抗CD123抗体的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:261展示称为“8B11-B7”抗CD123抗体的轻链可变结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:262和263展示称为“8B11-B7”抗CD123抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:264展示称为“9B8-G6”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:265和266展示称为“9B8-G6”和“9D7-C8”抗CD123抗体的CDR1-H和CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:267展示称为“9B8-G6”抗CD123抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:268展示称为“9D7-C8”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:269展示称为“9D7-C8”抗CD123抗体的CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:270展示称为“9D7-C8”抗CD123抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:271展示称为“9D7-C8”抗CD123抗体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:272展示称为“9F6-G3”抗CD123抗体的重链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:273和274展示称为“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR1-H和CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:275展示称为“9F6-G3”抗CD123抗体的轻链可变结构域氨基酸序列。
SEQ ID NO:276展示称为“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:277展示“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH_G45A。
SEQ ID NO:278展示“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VHmDG。
SEQ ID NO:279展示“3E3”抗CD123抗体变体VHmDG的CDR2-H和人源化“3E3”抗CD123抗体VH1Fm2DG变体的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:280展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1A。
SEQ ID NO:281展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1B。
SEQ ID NO:282展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1C。
SEQ ID NO:283展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1D。
SEQ ID NO:284展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1E。
SEQ ID NO:285展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1F。
SEQ ID NO:286展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1G。
SEQ ID NO:287展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1Fm1。
SEQ ID NO:288展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1Fm2。
SEQ ID NO:289展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1Fm2DG。
SEQ ID NO:290展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1Dm1。
SEQ ID NO:291展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH1Em1。
SEQ ID NO:292展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1A。
SEQ ID NO:293展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1B。
SEQ ID NO:294展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1C。
SEQ ID NO:295展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1D。
SEQ ID NO:296展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1E。
SEQ ID NO:297展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1F。
SEQ ID NO:298展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1G。
SEQ ID NO:299展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1Fm1。
SEQ ID NO:300展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL1Fm2。
SEQ ID NO:301展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH2A。
SEQ ID NO:302展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VH变体氨基酸序列VH3A。
SEQ ID NO:303展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL2A。
SEQ ID NO:304展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL2Am1。
SEQ ID NO:305展示人源化“3E3”抗CD123抗体的VL变体氨基酸序列VL2Am2。
SEQ ID NO:306展示称为CODV-Fab“7G3x20G6”抗体样结合蛋白的多肽根据式I的氨基酸序列。
SEQ ID NO:307展示称为CODV-Fab“7G3x20G6”、“7G3x4E7”、“7G3x4B4”、“7G3x18F5”、“hz20G6x7G3”、“7G3xhz4B4”、“hz4B4x3E3”和CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4”抗体样结合蛋白的接头L1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:308展示称为CODV-Fab“7G3x20G6“、“7G3x4E7“、“7G3x4B4“、“7G3x18F5“、“hz20G6x7G3“、“7G3xhz4B4“和CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4“抗体样结合蛋白的代表VD1或VD2结构域的7G3的可变轻链结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:309展示称为CODV-Fab“7G3x20G6“、“7G3x4E7“、“7G3x4B4“、“7G3x18F5“、“hz20G6x7G3“、“7G3xhz4B4“、“hz4B4x3E3“和CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4“抗体样结合蛋白的接头L2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:310展示称为CODV-Fab“7G3x20G6“、“7G3x4E7“、“7G3x4B4“、“7G3x18F5“、“hz20G6x7G3“、“7G3xhz4B4“和“hz4B4x3E3“抗体样结合蛋白的CL氨基酸序列。
SEQ ID NO:311展示称为CODV-Fab“7G3x20G6”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:312展示称为CODV-Fab“7G3x20G6“、“7G3x4E7“、“7G3x4B4“、“7G3x18F5“、“hz20G6x7G3“、“7G3xhz4B4“和CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4“抗体样结合蛋白的本文代表VH1或VH2结构域的7G3的可变重链结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:313展示称为CODV-Fab“7G3x20G6“、“7G3x4E7“、“7G3x4B4“、“7G3x18F5“、“hz20G6x7G3“、“7G3xhz4B4“、“hz4B4x3E3“抗体样结合蛋白的CH1氨基酸序列。
SEQ ID NO:314展示称为CODV-Fab“7G3 x 4E7”抗体样结合蛋白的根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:315展示称为CODV-Fab“7G3x4E7”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:316展示称为CODV-Fab“7G3x4B4”抗体样结合蛋白的根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:317展示称为CODV-Fab“7G3x4B4”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:318展示称为CODV-Fab“7G3x18F5”抗体样结合蛋白的根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:319展示称为CODV-Fab“7G3x18F5”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:320展示称为CODV-Fab“hz20G6x7G3”抗体样结合蛋白的多肽根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:321展示称为CODV-Fab“hz20G6x7G3”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:322展示称为CODV-Fab 7G3xhz4B4”抗体样结合蛋白的根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:323展示称为CODV-Fab“7G3xhz4B4”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:324展示称为CODV-Fab“hz4B4x3E3”抗体样结合蛋白的根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:325展示称为CODV-Fab“hz4B4x3E3”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:326展示称为CODV-Fab“hz20G6x7G3 TL4”抗体样结合蛋白的根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:327展示称为CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4“抗体样结合蛋白的Fc2氨基酸序列。
SEQ ID NO:328展示称为CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4”抗体样结合蛋白的根据式III的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:329展示称为CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4“抗体样结合蛋白的CH1氨基酸序列。
SEQ ID NO:330展示称为CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4“抗体样结合蛋白的Fc氨基酸序列。
SEQ ID NO:331展示基于序列比对的称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“3H6-D2”抗CD3抗体的CDR1-H共有序列。
SEQ ID NO:332展示基于序列比对的称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“3H6-D2”抗CD3抗体的CDR2-H共有序列。
SEQ ID NO:333展示基于序列比对的称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“3H6-D2”抗CD3抗体的CDR3-H共有序列。
SEQ ID NO:334展示基于序列比对的称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“3H6-D2”抗CD3抗体的CDR1-L共有序列。
SEQ ID NO:335展示基于序列比对的称为“20G6-F3”、“4B4-D7”、“4E7-C9”、“18F5-H10”、“11D7-C3”、“11H3-E5”、“13H2-C2”、“13C1-F6”、“1E6-C9”、“10F4-C10”、“10E6-G6”、“18G9-H11”、“11F3-B9”、“12G3-E8”、“5B1-G2”、“16F8-A7”、“11F9-F8”、“20E5-F10”、“20B5-F10”、“3H6-D2”抗CD3抗体的CDR3-L共有序列。
SEQ ID NO:336展示基于序列比对的称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR1-H共有序列。
SEQ ID NO:337展示基于序列比对的称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR2-H共有序列。
SEQ ID NO:338展示基于序列比对的称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR1-L共有序列。
SEQ ID NO:339展示基于序列比对的称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR3-L共有序列。
SEQ ID NO:340展示基于序列比对的称为“6C10-C4”、9B8-G6”、“9D7-C8”抗CD123抗体的CDR1-H共有序列。
SEQ ID NO:341展示基于序列比对的称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR2-H共有序列。
SEQ ID NO:342展示基于序列比对的称为“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR3-H共有序列。
SEQ ID NO:343展示基于序列比对的“1E1-G5”、“6D6-B8”、“8B11-B7”、“9F6-G3”抗CD123抗体的CDR1-L共有序列。
SEQ ID NO:344展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)。
SEQ ID NO:345展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)。
SEQ ID NO:346展示接头序列的氨基酸序列(Thr-Val-Ala-Ala-Pro)。
SEQ ID NO:347展示接头序列的氨基酸序列(Gln-Pro-Lys-Ala-Ala)。
SEQ ID NO:348展示接头序列的氨基酸序列(Gln-Arg-Ile-Glu-Gly)。
SEQ ID NO:349展示接头序列的氨基酸序列(Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser)。
SEQ ID NO:350展示接头序列的氨基酸序列(Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser)。
SEQ ID NO:351展示接头序列的氨基酸序列(His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys)。
SEQ ID NO:352展示接头的氨基酸序列和His-tag序列，其被添加至称为CODV-Fab“7G3x20G6”、“7G3x4E7”、“7G3x4B4”、“7G3x18F5”、“hz20G6x7G3”、“7G3xhz4B4”和“hz4B4x3E3”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽C-末端的氨基酸序列，对应于用于纯化实例的对应铰链序列和His-标签。
SEQ ID NO:353展示称为“3E3”抗CD123抗体的变体的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:354展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)。
SEQ ID NO:355展示接头序列的氨基酸序列(Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)。
SEQ ID NO:356展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)。
SEQ ID NO:357展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)。
SEQ ID NO:358展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)。
SEQ ID NO:359展示接头序列的氨基酸序列(Lys-Thr-His-Thr)。
SEQ ID NO:360展示接头序列的氨基酸序列(Lys-Thr-His-Thr-Ser)。
SEQ ID NO:361展示接头序列的氨基酸序列(Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser)。
SEQ ID NO:362展示接头序列的氨基酸序列(Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro)。
SEQ ID NO:363展示接头序列的氨基酸序列(Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro)。
SEQ ID NO:364展示接头序列的氨基酸序列(Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro)。
SEQ ID NO:365展示接头序列的氨基酸序列(Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser)。
SEQ ID NO:366展示接头序列的氨基酸序列(Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser)。
SEQ ID NO:367展示接头序列的氨基酸序列(Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)
SEQ ID NO:368展示接头序列的氨基酸序列(Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)
SEQ ID NO:369展示接头序列的氨基酸序列(Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly)。
SEQ ID NO:370展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly)。
SEQ ID NO:371展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)。
SEQ ID NO:372展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)
SEQ ID NO:373展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)。
SEQ ID NO:374展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)
SEQ ID NO:375、376和377展示称为“7G3”抗体的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:378和379展示称为“7G3”抗体的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:380展示称为人源化“7G3”抗体的重链可变结构域变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:381和382展示称为人源化“7G3”抗体的CDR1-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:383展示称为人源化“7G3”抗体的重链可变结构域另一变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:384展示称为人源化“7G3”抗体之一的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:385展示称为人源化“7G3”抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:386展示如WO2015026892所示的氨基酸序列SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:387展示如WO2015026892所示的氨基酸序列SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:388展示称为CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”、CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”和CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的根据式I的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:389展示接头序列的氨基酸序列(Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly)。
SEQ ID NO:390展示称为CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:391展示称为CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的根据式IV的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:392展示称为CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的Fc2区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:393展示称为CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的根据式III的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:394展示称为CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”的Fc区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:395展示称为CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:396展示称为CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的Fc区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:397展示称为CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的Fc残端(Fc3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:398展示称为CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的Fc残端(Fc3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:399展示称为CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的根据式II的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:400展示称为CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”抗体样结合蛋白的Fc残端(Fc3)的氨基酸序列。
实施例
实施例1:抗体生成
1.1hCD3ε/δ-hFc融合表达质粒(CD3ed-Fc)的构建
使用包含cDNA的质粒作为模板，如此处下文详述，在阅读框中用携带8x His或Strep-II标签以用于任选串联纯化的包含人免疫球蛋白IgG铰链区、CH2和CH3的重链恒定结构域生成人和食蟹猴CD3ε和CDδ融合蛋白。
使用人DNA基因组作为模板，扩增包含信号肽序列的人CD3ε和人CDδ亚单位细胞外结构域。获得的扩增裂解和纯化的PCR产物通过连接PCR组合，并通过InFusion方法使用NheI和HindIII位点连接入哺乳动物表达载体pXL。将每个亚单位克隆至质粒上。获得的成熟人CD3εHis-标签Fc-融合蛋白序列在本文公开于SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:3的氨基酸1-104对应野生型全长人CD3ε(本文公开于SEQ ID NO:1下，可从Uniprot数据库在登录号P07766下获得)蛋白氨基酸23-126且因此对应于人CD3ε细胞外结构域。
使用食蟹猴基因组DNA作为模板，扩增了包含信号肽的食蟹猴CD3ε和CD3δ细胞外结构域。获得的扩增裂解和纯化的PCR产物通过连接PCR组合并通过InFusion方法使用NheI和HindIII位点连接入哺乳动物表达载体pXL。将每个亚单位克隆至质粒上。获得的成熟食蟹猴CD3εFc-融合蛋白序列公开于SEQ ID NO:4下。SEQ ID NO:3的氨基酸1-95对应全长食蟹猴CD3ε蛋白氨基酸23-117且因此包含野生型全长食蟹猴CD3ε的细胞外结构域(本文公开于SEQ ID NO:2下，可从Uniprot数据库登录号Q95LI5下获得)。克隆的融合蛋白与野生型序列氨基酸位置57相比进一步在氨基酸位置35包含一个丙氨酸至缬氨酸的交换。
1.2人和食蟹猴CD3ed-Fc的表达和纯化
生长在无F17血清的悬浮培养基(Life)中的自由式HEK293细胞用表达质粒瞬时转染。使用Cellfectin转染试剂(Life)实施代表CD3ε和CD3δ细胞外结构域(ECD)亚单位的两种质粒的共转染。在37℃培养细胞7天。包含重组蛋白的培养基上清通过离心收获并通过过滤(0.22μm)澄清。
对于纯化，在蛋白A基质(GE)上捕获Fc-融合蛋白变体并通过pH转移洗脱。通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex 200(GE)和最终超滤浓缩步骤精制蛋白后，将蛋白用于进一步试验。
在蛋白A上捕获后将人异二聚体额外应用至His-Trap管柱(GE)并除盐。将洗脱的蛋白应用至Strepavidin管柱(GE)并在通过使用Superdex 200(GE)的SEC最终精制前用D-脱硫生物素洗脱。该策略用于从同型二聚体分离异二聚体。
1.3人/食蟹猴交叉反应抗CD3抗体的生成
将人和食蟹猴CD3ε和CD3δcDNA分别克隆入Aldevron专有免疫载体(pB8和VV8)并用于大鼠的基因免疫。免疫组MR12-266(“CD3-食蟹猴”)的大鼠最初用人CD3ε和CD3δcDNA免疫，随后进一步用人和食蟹猴CD3ε和CD3δcDNA的混合物两次免疫。4次基因应用(IS24d-4)后，在免疫步骤的24天取免疫血清。稀释在PBS1％ BSA中的血清，在共转染实验中通过流式细胞术使用用靶cDNA瞬时转染的哺乳动物细胞对该测试血清进行测试以获得人和食蟹猴CD3ε和CD3δTCR复合物。此外，将免疫血清在下列细胞系上测试：Jurkat E6-1(表达人TCR)、Jurkat-RT-T3.5(TCR阴性)和食蟹猴HSC-F(表达食蟹猴TCR)；未获得对于食蟹猴TCR阴性的细胞系。将10μg/ml的山羊抗大鼠IgG R-藻红蛋白偶联物(Southern Biotech,#3030-09)用作第二抗体。
当与用不相关的cDNA转染的细胞比较时，可在免疫的动物中检测到特别针对用CD3ε和CD3δcDNA的组合转染的细胞的免疫血清的特异反应性。当与TCR-阴性细胞系(RT-T3.5)相比时，其对于对TCR阳性的Jurkat细胞系(E6-1)相同检测有效，在食蟹猴HSC-F细胞系上检测到明显较少但仍显著的信号(参见表1)。
免疫组MR12-265(“CD3-hum”)的大鼠与克隆入相应表达载体的人CD3ε和CD3δcDNA共免疫。4次基因应用(IS24d-4)后，在免疫步骤的24天取免疫血清。稀释在PBS1％ BSA中的血清，在共转染实验中通过流式细胞术使用用靶cDNA瞬时转染的哺乳动物细胞测试对该测试血清进行以获得人和食蟹猴CD3ε和CD3δTCR复合物。将10μg/ml的山羊抗大鼠IgG R-藻红蛋白偶联物(Southern Biotech,#3030-09)用作第二抗体。此外，在下列细胞系测试了免疫血清：Jurkat E6-1(表达人TCR)、Jurkat-RT-T3.5(TCR阴性)和食蟹猴HSC-F(表达食蟹猴TCR)；未获得对于食蟹猴TCR阴性的细胞系。将10μg/ml的山羊抗大鼠IgG R-藻红蛋白偶联物(Southern Biotech,#3030-09)用作第二抗体。
当与用不相关的cDNA转染的细胞比较时，可在免疫的动物中检测到特别针对用CD3ε和CD3δcDNA的组合转染的细胞的免疫血清的特异反应性。当与TCR-阴性细胞系(RT-T3.5)相比时，其对于对TCR阳性的Jurkat细胞系(E6-1)的检测的情况也同样有效，但在食蟹猴HSC-F细胞系上检测到明显较少的信号(然而在阳性大鼠中仍显著)(参见表2)。
处死具有阳性血清的大鼠并将B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。获得的杂交瘤在用人或食蟹猴CD3ε和CD3δ表达质粒转染的HEK293细胞上、在Jurkat E6.1(CD3+)和JurkatT3.5(CD3-)上通过流式细胞术筛选。通过表面等离子体共振将杂交瘤克隆的上清液用于评估通过固定分析物为25nM的针对人和食蟹猴CD3ε/δ复合物的单点动力学(数据示于表3)。
表3:通过流式细胞术和Biacore分析的不同杂交瘤克隆上清液的特异反应性检测。对不同细胞系的上清进行了测试(Jurkat E6-1、Jurkat-RT-T3.5和食蟹猴HSC-F)。分别针对来自人和食蟹猴的CD3e/d实施了Biacore分析。
扩大阳性克隆并通过RT-PCR分离可变重链和轻链的相应cDNA。将VH和VL序列克隆入与人CH1、IGHG1-骨架或κ链融合的表达载体进而表达Fab-片段以及完整的IgG。
1.4IgG和Fab-片段的表达
编码IgG的重链和轻链和Fab-片段的表达质粒在大肠杆菌NEB 10-β(DH10B衍生物)中繁殖。从大肠杆菌使用QIAGEN Plasmid Plus Kit(目录号:12991)制备用于转染的质粒。
生长在自由式培养基(Freestyle Medium)(Invitrogen)的HEK 293-FS细胞用所示的编码重链和轻链的LC和HC质粒使用293fectin(Invitrogen)转染试剂如制造商所述转染。细胞在37℃、8％ CO2的Kuhner ISF1-X震动温育器中以110rpm培养。培养7天后，将细胞通过离心去除，添加10％Vol/Vol的1M Tris HCl pH 8,0并经由0,2μM瓶顶过滤器过滤上清以去除颗粒CODV-IgG1构建体。通过在蛋白A管柱(HiTrap蛋白AHP管柱，GE Life Sciences)上的亲和层析纯化。从管柱用0,1M柠檬酸,pH 3.0洗脱后，使用配制于PBS的HiPrep26/10除盐管柱(Gibco 14190-136)对CODV-IgG1构建体除盐。
通过HisTrap高性能管柱(GE Healthcare,Cat.No.:17-5248-02)纯化双特异性CODV-Fab构建体。从管柱(洗脱缓冲液：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱后，收集包含组分的蛋白并使用使用配制于PBS的HiPrep 26/10除盐管柱(Gibco 14190-136)除盐。
为从聚集物分离单体，使用HiLoad Superdex 200 26/60 320ml管柱(GEHealthcare目录号:29-9893-36)在PBS(Gibco 14190-136)中对于两种构建体CODV-IgG和CODV-Fab片段实施了高分辨率分馏步骤。收集单体组分并使用Vivaspin 20离心管柱(VS2002 Sartorius Stedim biotech)浓缩至1mg/ml且使用0.22μm膜(SyringeFilters SLGV033RS)过滤。
蛋白浓度通过测量在280nm的吸光度确定。每批次通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下分析以确定每种单体亚单位的纯度和分子量。
1.5抗CD3抗体亲和力的评估
1.5.1人和食蟹猴CD3ε/δ两者亲和力的评估
结合抗CD3的Fab或CODV-Fab的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR)使用Biacore3000仪器(GE Healthcare)测量。试验缓冲液为HBS-EP(BR-1001-88，GEHealthcare)。CD3ε/δ-Fc融合蛋白的捕获使用人抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)实现。使用胺偶联试剂盒(BR-100-50,GE Healthcare)将捕获抗体与CM5芯片(BR-1001-88,GEHealthcare)偶联至约12.000RU。以10μl/min捕获CD3εδ-Fc融合蛋白至约70RU以获得30RU的值。与抗CD3Fab或CODV-Fab的结合动力学以30μl/min在缔合和解离阶段分别测量240秒和600秒。使用在试验缓冲液中3-400nM的Fab的两倍稀释液。全部Fab浓度一式两份地进行。与两份空白缓冲液进行双重比较。捕获表面的再生用3M MgCl2溶液以30μl/min用1分钟注射实施。使用BIA评估软件v.4.1(GE Healthcare)用于数据分析。数据使用1:1具有质量转移的Langmuir模型整体拟合。
抗CD3 IgG和CODV-Fc蛋白结合亲和力的测量，除捕获抗体外，类似与对于Fab和CODV-Fab的结合试验实施。在这种情况中，将His捕获试剂盒(28-9950-56,GE Healthcare)用于经由His-标签捕获人CD3-Fc蛋白。对于与食蟹猴CD3-Fc的结合试验，将Strep-MAB经典抗体(2-1507-001,IBA)用作捕获抗体。在这种情况中，再生溶液为10mM甘氨酸缓冲液pH2.0。
表4:通过Biacore测量的所选CD3抗体针对人和食蟹猴CD3ε/δ复合物的亲和力。
SP-34用作IgG
1.5.2通过流式细胞术测定抗CD3抗体与表达在HEK293F细胞表面的huCD3ε、huCD3δ和huCD3ε/δ的结合
为分析抗体与表达在细胞表面的人CD3ε和人CD3δ的结合，用两种抗体单独或共转染来转染HEK293细胞，并通过流式细胞术测量信号。对于转染步骤根据制造商的说明使用FuGENE HD转染试剂(Promega,#E2311)。
HEK293F细胞以6E6细胞每管接种于具有过滤器(Greiner bio-one)的50mlCellstar Cellreactor管中的自由式(Freestyle)293培养基(Gibco)。根据FuGENE方案完成转染。复合物的制备在无酚红的OptiMEM(Gibco)中以3:1的比例完成(使用3.0:1的HD:DNA的比率用于在T-25烧瓶中的8,000μl培养基生长的293F细胞的转染的方案，http://www.promega.com/techserv/tools/FugeneHdTool/default.aspx)。
细胞在37℃和5％ CO2的振动器上温育。转染细胞在1-3天收获且抗体的结合通过流式细胞术分析。
用于染色的抗体以1μg接种于96-孔U-底悬液培养板(Greiner bio-one)中具有50μl的FBS的每孔。收获的转染细胞在具有FBS的染色缓冲液中重悬并以50μl每孔添加至抗体。将细胞在4℃暗处温育30分钟并洗涤两次。0.5μg第二抗体山羊F(ab')2抗人IgG-FITC(Beckman Coulter,#732598)或山羊F(ab')2抗人κ-PE(Southern Biotech,#206209)分别在每孔中与0.5μg7-AAD每孔的组合，加入100μl具有FBS的染色缓冲液。细胞在4℃暗处温育15min并洗涤两次。对于测量，将细胞在200μl具有FBS的染色缓冲液中重悬。分别使用MACSQuant(Miltenyi Biotec)或LSRII(BD)流式细胞术测量细胞。使用FlowJo软件(TreeStar,Inc.)实施进一步的数据分析。读取对于抗体染色阳性的7-AAD阴性单细胞的百分数(数据示于表5)。
1.5.3通过SPR的抗CD3 Fab与huCD3ε/δ和huCD3ε/γ的结合
通过SPR使用用HBS-EP缓冲液运行的BIAcore300仪器测试结合。以10μl/min经由Fc-标签通过固定在CM5感应芯片上的抗人Fc捕获抗体MAB1302(Millipore)捕获重组huCD3蛋白(ε/δ(PB01226),ε/γ(PB01225))。将抗CD3 Fab以100nM用240秒和300秒的缔合和解离时间用作分析物。每次循环后，通过10mM甘氨酸缓冲液pH2.5的2分钟脉冲再生表面。
当仅huCD3δ表达在HEK293F细胞表面时，通过流式细胞术不能检测到信号。相反，几乎所有的抗体可与用仅huCD3ε转染或huCD3ε与huCD3δ共转染的细胞结合，表明huCD3ε作为表位是必需的。在Biacore试验中，与huCD3ε的结合表明与是否使用δ或γ链用于重组蛋白无关，表明huCD3ε作为抗原是足够的。当合作链存在时，抗体12D2例外地仅与huCD3ε结合。g或d链共表达对于展示该抗体表位蛋白的构象结构可能存在间接效应。对于公开的抗体OKT3已展示了相同效应。描述了该抗体与huCD3ε与huCD3δ或γ分别缔合后形成的构象表位相互作用(Salmeron等,1991,The Journal of Immunology)。还展示了其仅与huCD3ε亚单位结合(Kjer-Nielsen等,2004,PNAS)。由于12D2和OKT3相似的行为，与huCD3ε的相互作用对于12D2是可以设想的。总之，huCD3ε看起来是所有分析的抗体的抗原结构域(数据示于表5)。
表5：通过流式细胞术和Biacore测量的所选CD3抗体针对huCD3δ、huCD3ε、huCD3ε/δ和huCD3ε/γ复合物的亲和力。
n.b.＝无结合(huCD3e+huCD3d的结合<20％)
1.6CD3 Fab与人T细胞的结合
CD3-Fab的结合能力通过流式细胞术确定。将原代人T细胞用作靶细胞。因此，从用EDTA治疗的健康捐赠者200ml外周血通过Ficoll密度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。15ml Histopaque(Sigma-Aldrich)预先装载至50ml Leucosep-管(Greiner bio-one)上。血液用autoMACS清洗缓冲液+1％ BSA(Miltenyi Biotec)稀释并装载于共10只制备的管的膜上。1000xg无制动离心管10min。收集PBMC并用autoMACS清洗缓冲液+1％ BSA洗涤三次。最后，在autoMACS运行缓冲液(Miltenyi Biotec)中重悬PBMC用于通过autoMACSpro技术根据制造商的说明使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离T淋巴细胞。分离的T细胞的纯度通过MACSQuant流式细胞术使用人7色免疫表型试剂盒(Miltenyi Biotec)分析。分离的T细胞在具有FBS的染色缓冲液(BD Pharmingen)中重悬并将100μl每孔中的1E5细胞接种于96-孔U-底悬浮培养平板(Greiner bio-one)中。Fab抗体在PBS(Invitrogen)中1:3系列稀释并将每种以30000ng/ml终浓度添加5μl至细胞。试验在4℃温育45分钟。细胞用具有FBS的染色缓冲液洗涤两次且将1μg第二抗体山羊F(ab')2抗人κ-FITC(Beckman Coulter,#732621)每孔添加至每孔的100μl染色缓冲液中。试验在4℃温育20分钟并在此后洗涤两次。细胞在具有FBS的150μl染色缓冲液中重悬并使用MACSQuant(Miltenyi Biotec)或LSRII(BD)流式细胞术测量。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)实施进一步的数据分析。读取对于抗体结合阳性的细胞百分数。仅用第二抗体处理而无一抗的细胞用于设置入口。EC50曲线通过XLfit(Algorithm 205)计算，EC50值以斜率拐点计算(数据示于表6)。
表6：通过流式细胞术测量的CD3 Fab与人T细胞的亲和力。给出的是从曲线计算的平均EC50。
1.7CD3 Fab的安全性
1.7.1通过CD25+和CD69+在人T细胞上的表达测量CD3 Fab的安全性
CD3 Fab抗体对T细胞活化状态的作用，作为安全性的读数，通过基于流式细胞术的活化标记物CD25和CD69在原代人T细胞表面上的表达检测分析而读出。
分离的原代人T淋巴细胞在RPMI+GlutaMAX I(Gibco)+10％ FCS(Invitrogen)中重悬并将2.5E5细胞接以100μl每孔接种于96-孔U-底悬浮培养平板(Greiner bio-one)中。
将5μl Fab CD3抗体以30 000ng/ml的终浓度添加至细胞。试验在37℃的5％ CO2中温育20h。
温育时间后，离心细胞并在100μl具有FBS的染色缓冲液(BD Pharmingen)中用下列标记的抗体于4℃染色15分钟：CD25-V450、CD69-APC。
染色后洗涤细胞两次，在150μl具有FBS的染色缓冲液中重悬，并使用LSRII(BD)流式细胞术测量5000细胞。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)实施进一步的数据分析。读取CD25阳性和CD69阳性的T细胞百分数(表7)。
表7:通过人T细胞上CD25+和CD69+的表达测量的CD3 Fab安全性
1.7.2通过CD4+/CD69+、CD4+/CD25+、CD8+/CD69+和CD8+/CD25+在人T细胞上的表达测量CD3 Fab安全性
CD3 Fab抗体对T细胞活化状态的作用，作为安全性的读数，通过基于流式细胞术的活化标记物CD25和CD69在原代人T细胞表面上的表达检测分析。仅测试T淋巴细胞且在孔中填充了50μl RPMI+GlutaMAX I(Gibco)+10％ FCS，或将靶细胞(即THP-1细胞系)以2.5E4细胞每孔添加至50μl RPMI+GlutaMAX I+10％ FCS中。双特异性抗体在PBS(Invitrogen)中1:3系列稀释并将每种以30 000ng/ml的最终最大浓度添加5μl至细胞。在37℃5％ CO2中温育试验20h。温育时间后，离心细胞并在100μl具有FBS的染色缓冲液(BD Pharmingen)中用下列标记的抗体于4℃染色15分钟：CD4-PE、CD8-APC-Cy7、CD25-APC、CD69-PE-Cy7。作为Fluorescence Minus One(FMO)对照，如上文所述染色激活的T细胞，但在一个管中通过其同型(Isotype APC-IG1k)替代CD25并在第二管中通过其同型(Isotype PE-Cy7-IG1k)替代CD69。染色后将细胞洗涤两次，在150μl具有FBS的染色缓冲液中重悬，并使用LSRII(BD)流式细胞术测量5000细胞。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)实施进一步的数据分析。读取CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD8+CD25+和CD8+CD69+的T细胞的百分数。根据FMO对照设置入口(参照表8)。
表8：通过人T细胞上CD4+/CD69+、CD4+/CD25+、CD8+/CD69+和CD8+/CD25+的表达测 量的CD3 Fab的安全性
实施例2:CD123序列
2.1CD123(IL3RA)-hFc融合表达质粒(CD123-Fc)的构建
使用包含cDNA的质粒作为模板，将人和食蟹猴CD123融合蛋白在具有包括GS-接头(猕猴蛋白中使用)、铰链区、额外携带Strep-II标签(仅人蛋白版本)的人免疫球蛋白IgG的CH2和CH3结构域的阅读框中生成。
使用人基因组DNA作为模板，扩增包含信号肽的人CD123(IL3RA)细胞外结构域。获得的扩增裂解和纯化的PCR产物通过连接PCR组合并通过InFusion方法使用NheI和HindIII位点连接入哺乳动物表达载体pXL。获得的成熟人CD123 Strep-II标签Fc-融合蛋白的序列公开于SEQ ID NO:196。氨基酸1-284对应全长野生型人CD123蛋白(本文公开于SEQ ID NO:194，可从NCBI数据库登录号NP_002174.1获得)氨基酸22-305，且因此对应人CD123细胞外结构域。
为克隆食蟹猴CD123，从食蟹猴种群血液中制备cDNA。使用该分离的cDNA作为模板，扩增包含信号肽的猕猴CD123(IL3ra)细胞外结构域。获得的扩增裂解和纯化的PCR产物通过连接PCR组合并通过InFusion方法使用NheI和HindIII位点连接入哺乳动物表达载体pXL。获得的成熟人CD123Strep-II标签Fc-融合蛋白序列公开于SEQ ID NO:197。氨基酸1-284对应全长野生型食蟹猴CD123蛋白(本文公开于SEQ ID NO:195，可从NCBI数据库登录号NP_002174.1下获得)的氨基酸22-305，且因此对应人CD123细胞外结构域。
2.2人和食蟹猴CD123-Fc的表达和纯化
生长在无F17血清的悬浮培养基(Life)中的自由式HEK293细胞用表达质粒瞬时转染。使用Cellfectin转染试剂(Life)实施转染。在37℃培养细胞7天。包含重组蛋白的培养基上清通过离心收获并通过过滤(0.22μm)澄清。
对于纯化，在蛋白A基质(GE)上捕获Fc-融合蛋白变体并通过pH转移洗脱。通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex 200(GE)和最终超滤浓缩步骤精制蛋白后，将蛋白用于进一步试验。
2.3来自杂交瘤的人和食蟹猴CD123大鼠IgG两者亲和力的评估
用杂交瘤上清使用Proteon XPR36(Biorad)以一次性动力学的方式实施了针对与人CD123的结合亲和力和与食蟹猴CD123的交叉反应的抗CD123大鼠IgG的筛选。使用山羊抗大鼠IgG(112-005-071,Jackson Immuno Research)建立捕获试验。以垂直方向使用胺偶联试剂盒(176-2410,Biorad)将捕获的抗体包被在GLC芯片上(176-5011,Biorad)至约8000RU。垂直方向大鼠IgG至约200RU的捕获导致CD123-Fc Rmax值对于多至100RU。与人和食蟹猴CD123-Fc融合蛋白的结合动力学，在水平方向以100μl/min对于缔合和解离分别测量120秒和600秒。将CD123-Fc蛋白用于6nM-100nM的二倍稀释液。将PBSET缓冲液(176-2730,Biorad)用作试验缓冲液。再生通过以30μl/min注射10mM甘氨酸缓冲液(pH 1.5)18秒实现。使用ProteonManager软件v3.0实施数据处理和分析。用1:1Langmuir模型完成传感图拟合。基于亲和性KD<1的人CD123和与食蟹猴的交叉反应性选择克隆。
Fab和CODV-Fab
抗CD123结合Fab或CODV-Fab的结合亲和力使用Biacore3000仪器(GEHealthcare)测量。试验缓冲液为HBS-EP(BR-1001-88,GE Healthcare)。CD123-Fc融合蛋白的捕获使用人抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)实现。捕获的抗体与CM5芯片(BR-1001-88,GE Healthcare)使用胺偶联试剂盒(BR-100-50,GE Healthcare)偶联至约12.000RU。CD123-Fc融合蛋白以10μl/min捕获至约70RU以获得30RU的Rmax值。与抗CD123 Fab或CODV-Fab的结合动力学以30μl/min对于缔合和解离阶段分别测量240秒和600秒。使用试验缓冲液中3-200nM的Fab二倍稀释液。全部Fab浓度与用于双重空白的两份缓冲空白共同运行两次。捕获表面的再生以30μl/min用3M MgCl2溶液注射1分钟实施。使用BIAevaluation软件v.4.1(GE Healthcare)用于数据分析。数据使用具有质量转移的1:1Langmuir模型整体拟合。
IgG和CODV-Fc蛋白
抗CD123 IgG和CODV-Fc蛋白结合亲和力的测量，除捕获抗体外，与用于Fab和CODV-Fab的结合试验相似实施。在该情况中，使用Strep-MAB经典抗体(2-1507-001,IBA)经由其StrepII-标签捕获人CD123-Fc。此处再生溶液为10mM甘氨酸缓冲液pH2.0。
2.4人和食蟹猴交叉反应的抗CD123抗体的生成
将人和食蟹猴CD123 cDNA分别克隆入Aldevron专有免疫载体(pB8和VV8)。免疫组MR13-296的三只大鼠用免疫载体IL3RA-hum.-ECD(aa19-305)进行免疫。4次基因应用(IS24d-4)后，在免疫步骤的24天取免疫血清。稀释在PBS 3％ FBS中的血清通过流式细胞术使用用人和食蟹猴IL3RA cDNA变体IL3RA-hum.ECD和IL3RA-hum.D3瞬时转染的哺乳动物细胞测试。
当与用不相关的cDNA转染的细胞相比时，可在全部免疫的动物中检测到免疫血清针对用pB1-IL3RA-hum.ECD以及用IL3RA-食蟹猴(pFF1262)转染的细胞和THP-1细胞的特定反应性。
处死具有阳性血清的大鼠并将B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。获得的杂交瘤通过在用人或食蟹猴CD123表达质粒转染的HEK293细胞上、不同表达CD123的细胞系上筛选(数据示于表10)。
将靶细胞以5E4细胞接种于96-孔U-底悬浮培养平板中(每孔50μl具有FBS的染色缓冲液(BD Pharmingen))。将杂交瘤上清在PBS(Invitrogen)中1:3系列稀释并将50μl每种以1μg/ml的最终最大浓度添加至细胞。将试验在4℃温育45min。
用具有FBS的染色缓冲液洗涤细胞两次并将1μg第二抗体山羊抗大鼠IgG(H+L)-Alexa Fluor 488(Invitrogen-Life Technologies,#MH10520)添加至每孔100μl具有FBS的染色缓冲液中。将试验在4℃温育15分钟且之后洗涤两次。
将细胞在每孔200μl具有FBS的染色缓冲液中重悬并使用MACSQuant(MiltenyiBiotec)或LSRII(BD)流式细胞术测量。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)实施进一步的数据分析。读取对于抗体结合阳性的细胞百分数。将仅用二抗而无一抗处理的细胞用于设置入口。曲线通过XLfit(Algorithm 205)计算。
与检测不到信号的未转染的HEK293细胞相比，克隆与CD123的特异性结合可展示在转染的HEK293表面上(数据未展示)。抗体的结合是浓度依赖的，具有0.4-17.7ng/ml的EC50值(表9)。
表9：通过流式细胞术检测的杂交瘤上清中大鼠IgG克隆的特异性CD123结合。使用CD123转染的HEK293作为靶细胞和山羊抗-大鼠IgG(H+L)-Alexa Fluor 488作为二抗测量抗体的浓度依赖性结合。给出的是曲线计算的EC50值。
抗体 EC50[ng/ml]
BFX-1A6 6.4
BFX-1E1 2.2
BFX-2B8 5.5
BFX-2F4 4.5
BFX-2F8 3.4
BFX-2H7 17.7
BFX-3B10 2.0
BFX-3E3 2.0
BFX-5A5 10.1
BFX-6B10 5.0
BFX-6C10 6.1
BFX-6D6 0.9
BFX-8B11 0.4
BFX-9B8 1.2
BFX-9D7 0.9
BFX-9F6 1.3
BFX-9H2 14.9
2.5抗CD123大鼠抗体序列的人源化
大鼠抗体的人源化通过CDR-移植或通过4D方法(US20110027266)实施。对于大鼠-抗CD3抗体3E3，识别的最接近的家鼠种系序列的重链可变区为IGHV2S48*01和IGHJ3*01且轻链可变区为IGKJ3*01。计算的大鼠生殖性指数(germinality index)(仅框架序列)对于VH为94.51％且对于VL为98.9％。
检查了潜在的暴露问题残基且修饰了CDRH2中的一个残基是修饰的。
使用移植方法，基于识别的最接近的人种系序列生成了多种人源化变体：对于VH的IGHV4-59*05和IGHJ4*01(框架上的生殖性指数：75.82％)；和对于VL的IGLV6-57*01和IGLJ3*01(框架上的生殖性指数：72.22％)。
除CDR移植外，使用4D人源化方案(US20110027266)以人源化大鼠抗CD123 3E3可变轻链(VL)和重链(VH)结构域。分子动力学(MD)模拟在大鼠抗CD123 3E3的最小化的3D同源模型(用MOE完成；使用的PDB：1FLR)上实施并与通过LGCR/SDI设计的且可从MOE获得的源自7条代表性轻链(vk1、vk2、vk3、vk4、λ1、λ2、λ3)和7条代表性重链(vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)的49种人模型进行了比较。
选择了两种模型用于“4D人源化”：具有最佳疏水和静电组成的Vl3-vh4和VL3-VH2和CDR外的序列标识。对于大鼠抗CD123 3E3可变结构域和两种所选模型间的配对缔合，基于相应同源模型的α碳的最佳3D叠加比对序列。
实施例3:双特异性CODV-Fab形式的抗体
3.1双特异性CODV-Fab形式的所选CD3序列与抗CD123 mAb 7G3组合的克隆以研究其T-细胞衔接活性
选择的CD3抗体序列如I2C、mAb2(Macrogenics)和称为“20G6-F3”、“4E7-C9”、“4B4-D7”和“18F5-H10”的序列作为单特异性抗CD3 Fab表达，所述选择的序列还作为双特异性CD3xCD123 CODV-Fab使用单克隆抗体7G3序列表达，获得CODV-Fab构建体“I2Cx7G3”和称为“7G3x20G6”、“7G3x4E7”、“7G3x4B4”和“7G3x18F5”，如本文“抗体样结合蛋白”部分进一步所述。将纯化的蛋白用于Biacore试验以比较针对CD3ε/δ复合物的亲和力(数据示于表11)。当将CD3序列导入双特异性CODV-Fab形式时，通过Biacore分析未检测到亲和力的变化。
表11:Fab-片段和CODV-Fab间针对来自任何食蟹猴的CD3ε/δ复合物的亲和力的比较
3.2针对CD123和CD3的双特异性CODV-Fab介导强效重定向T-细胞杀伤
这种双特异性CODV-Fab具有定位T-细胞(通过结合这种T-细胞至CD3-结合CODV-Fab的CD3-结合部分)至肿瘤细胞的位置(通过结合这种癌细胞至CODV-Fab的CD123部分)的能力。定位的T-细胞随后可在本文中称为"重定向"杀伤的步骤中介导肿瘤的杀伤。构建特异性针对CD123和CD3的双特异性CODV-Fab其具有单克隆抗体7G3的抗CD123可变结构域和实施例1中生成的所选CD3抗体的抗CD3可变结构域。
因此，Ficoll密度离心通过从200ml用EDTA治疗的健康捐赠者外周血分离外周血单核细胞(PBMC)。15ml Histopaque(Sigma-Aldrich)预先装载至50ml Leucosep-管(Greiner bio-one)上。血液用autoMACS清洗缓冲液+1％BSA(Miltenyi Biotec)稀释并装载于共10只制备的管的膜上。1000xg无制动离心管10min。收集PBMC并用autoMACS清洗缓冲液+1％ BSA洗涤三次。最后，在autoMACS运行缓冲液(Miltenyi Biotec)中重悬PBMC用于通过autoMACSpro技术根据制造商的说明使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离T淋巴细胞。分离的T细胞的纯度通过MACSQuant流式细胞术使用人7色免疫表型试剂盒(Miltenyi Biotec)分析。
基于细胞毒性试验通过流式细胞术分析双特异性抗体的T细胞衔接效应。用1μM在1ml RPMI+GlutaMAX I(Gibco)(对于每1E7个细胞)中的CFSE在37℃染色靶细胞(即THP-1细胞系)15分钟。之后，洗涤细胞两次并在RPMI+GlutaMAX I+10％ FCS(Invitrogen)中重悬。将2.5E4靶细胞接种于96-孔U-底悬浮培养平板(Greiner bio-one)每孔50μl的培养基中。
分离的原代人T淋巴细胞在RPMI+GlutaMAX I+10％ FCS中重悬并以所述的效应器对靶标的比率添加至50μl每孔的靶细胞(一般效应器:靶标＝10:1)中。
将双特异性抗体在PBS(Invitrogen)中1:3系列稀释并将每种以3 000ng/ml的最终最大浓度添加5μl至细胞。试验在37℃5％ CO2中温育20h。
为检测死亡的细胞，将全部细胞用7-AAD染色。因此，将具有FBS的染色缓冲液(BDPharmingen)中稀释的5μg/ml 7-AAD添加至每孔并在4℃暗处温育15min。分别使用MACSQuant(Miltenyi Biotec)或LSRII(BD)流式细胞术测量细胞。使用FlowJo软件(TreeStar,Inc.)实施进一步的数据分析。读取CFSE和7-AAD双重阳性细胞的百分数。
例如在表20-22中展示的这些研究结果证明CD123xCD3 CODV-Fab介导肿瘤细胞重定向杀伤的能力。
3.3重定向T-细胞杀伤的安全性评估
双特异性抗体对T细胞活化状态的作用作为安全性的读数，通过基于流式细胞术的原代人T细胞表面上表达的活化标记物CD25和CD69的表达的检测分析来读取。
分离的原代人T淋巴细胞在RPMI+GlutaMAX I(Gibco)+10％ FCS(Invitrogen)中重悬并将2.5E5细胞接种于96-孔U-底悬浮培养平板(Greiner bio-one)的50μl每孔。
仅对T细胞进行测试并用50μl RPMI+GlutaMAX I+10％ FCS填充孔，或以2.5E4细胞每孔在50μl RPMI+GlutaMAX I+10％ FCS中添加靶细胞(即THP-1细胞系)。
双特异性抗体在PBS(Invitrogen)中1:3系列稀释并将每种以30 000ng/ml的最终最大浓度添加5μl至细胞。
温育时间后，离心细胞并用下列标记抗体在每孔100μl具有FBS的染色缓冲液(BDPharmingen)中于4℃染色15min：CD4-PE、CD8-APC-Cy7、CD25-APC、CD69-PE-Cy7。
作为Fluorescence Minus One(FMO)如前所述染色对照活化的T细胞，但在一个管中CD25由其同型(同型APC-IG1k)替代且在第二管中CD69由其同型(同型PE-Cy7-IG1k)替代。
染色后洗涤细胞两次，在150μl具有FBS的染色缓冲液中重悬，并使用LSRII(BD)流式细胞术测量5000细胞。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)实施进一步的数据分析。读取CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD8+CD25+和CD8+CD69+T细胞的百分数。根据FMO对照设置入口(参见表12)。
表12：在细胞毒性试验中测量的CD123 x CD3 CODV-Fab的活性和通过CD69的表达测量的安全性
3.4抗CD3大鼠抗体序列和双特异性抗体的人源化
通过CDR-移植或通过4D方法(US20110027266)实施大鼠抗体人源化。
对于大鼠-抗CD3抗体“20G6”，识别的最接近的家鼠种系为IGHV6S17*01和IGHJ2*01(对于重链可变区，且对于轻链可变区为IGKV1S21*01和IGKJ4*01)。计算的大鼠生殖性指数(仅框架序列)对于VH为97,80％对于VL为95,5％。
使用移植方法的多种人源化变体基于下列生成：
1)在识别的最接近的人种系序列上，IGHV3-30-01_IGHJ4-01对于VH具有77％的框架上的生殖性指数；IGK2D-29-02_IGKJ4-01对于VL具有80％的框架上的生殖性指数)，或
2)或基于识别的具有较低PI的最接近的种系序列，IGVH3-48*02-IGHJ4-01对于VH具有75％的框架上的生殖性指数；IGKV2-28*01-IGKJ4-01对于VL具有77,5％的框架上的生殖性指数，或
3)由更遥远的人种系序列(改变种系分支)(VH的IGVH1-46*01-IGHJ4*01对于具有框架上56％的生殖性指数；IGKV4*01-IGKJ4*01对于VL具有框架上67,5％的生殖性指数)组成。
随后将人源化序列导入称为CODV-Fab“7G3 x 20G6”与来自上文所述的抗体7G3的抗CD123序列的组合的CODV-Fab形式。将纯化的CD123 x CD3CODV-Fab用于Biacore试验以评估CD3ε/δ的亲和力(参见表13)。
表13：抗CD3抗体20G6所选的人源化变体与重组CD3ε/δ复合物的亲和力。
对于大鼠-抗CD3抗体4B4-D7，识别的最接近的家鼠种系序列对于重链可变区为IGHV6S17*01(93％的同一性)和IGHJ2*01(87.5％的同一性)且对于轻链可变区为IGKV1S21*01(93％的同一性)和IGKJ4*01(100％的同一性)。
计算的识别的家鼠V-序列与人种系(仅框架序列)的同一性百分数对于VH为79％且对于VL为77.53％。
通过用额外序列工程化移植，试验最接近的人种系序列(IGHV3-30*01_IGHJ6*02；IGKV2-30*02/IGKV2D-39*02_IGKJ2*01)生成VH和VL的多种人源化变体对。计算的对于人源化V-序列的人生殖性(仅4IMGT框架序列)列于表14。
表14：通过称为“B4-D7”的抗体的移植获得的人源化V-序列的人生殖性百分数。仅基于4IMGT框架序列计算百分数。
除CDR移植，如美国专利申请US20110027266中所述的4D人源方案可用于人源化大鼠抗CD3 4B4-D7可变轻链(VL)和重链(VH)结构域。分分子动力学(MD)模拟在大鼠抗CD34B4-D7的最小化的3D同源模型(用MOE完成；使用的PDB：1FLR)上实施并与通过LGCR/SDI设计的且可从MOE获得的源自7条代表性轻链(vk1、vk2、vk3、vk4、λ1、λ2、λ3)和7条代表性重链(vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)的49种人模型进行了比较。
选择了两种模型用于“4D人源化”。具有最高4D相似性的vk1-vh6，具有疏水和静电组成。具有CDR外最高序列同一性的vk2-vh3。对于大鼠抗CD34B4-D7可变结构域和两种所选模型间的配对缔合，基于相应同源模型的α碳的最佳3D叠加比对序列。进一步优化了多种其他VH和VL的人源化变体对。
计算的对于人源化V-序列的人生殖性的百分数(仅4IMGT框架序列)列于表15。
表15：称为“B4-D7”的抗体的4D人源化获得的人源化V-序列的生殖性百分数。仅基于4IMGT框架序列计算百分数。
4D“4B4—D7”变体 ％人生殖性指数
VL1A 75
VL1B 75
VL2A 83
VL2B 83
VH1A 80
VH1B 80
VH2A 80
VH2B 84.5
人源化序列作为Fab-片段表达和纯化且随后通过Biacore试验评估CD3ε/δ的亲和力(数据示于表16)。
表16：抗CD3抗体4B4-D7所选的人源化变体与重组CD3ε/δ复合物的亲和力
3.5CODV人-Fab CD123 x CD3与THP-1和TF-1细胞的结合
将所选的CD123抗体的序列克隆入CODV-Fab形式与CD3结合序列的组合，并表达和纯化蛋白。
其与天然表达CD123的细胞的结合能力通过流式细胞术确定。将THP-1细胞系或TF-1细胞系用作靶细胞。
将靶细胞用FcR-Blocker(Sigma)封闭。因此，将靶细胞在具有FBS的染色缓冲液(BD Pharmingen)中重悬并用100μl封闭试剂每ml在4℃封闭1h。使用具有FBS的染色缓冲液填充细胞并将50μl每孔的1E5细胞接种于96-孔U-底悬浮培养平板(Greiner bio-one)中。
将3μg抗体添加入每孔50μl具有FBS的染色缓冲液中。将该试验在4℃温育30min。
用具有FBS的染色缓冲液洗涤细胞两次并将1μg第二抗体山羊F(ab')2抗人κ-FITC(Beckman Coulter,#732621)每孔添加入每孔具有FBS的染色缓冲液。将试验在4℃温育20min并随后洗涤两次。
将细胞在每孔150μl具有FBS的染色缓冲液中重悬并使用MACSQuant(MiltenyiBiotec)或LSRII(BD)流式细胞术测量。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)实施进一步的数据分析。读取对于抗体结合的阳性细胞的百分数。仅用第二抗体而无一抗处理的细胞用于设置入口。
CD123xCD3 CODV-Fab与CD123的结合示于具有下列两种表达CD123的不同细胞系：在与CD131共表达的TF-1细胞系上或在缺乏CD131表达的THP-1细胞表面上。例示性展示了五种与靶细胞结合的不同克隆。将CD19xCD3 CODV-Fab用作阴性对照(特异性对照)和参照CD123xCD3CODV-Fab作为阳性对照(表17)。
表17：克隆入CODV-Fab骨架的靶向CD123的序列与CD3结合序列的组合与THP-1和TF-1细胞系的特异性结合。使用表达CD123的THP-1和TF-1作为靶细胞检测抗体的结合。添加3μg抗体并通过第二山羊抗人κ-FITC抗体检测。展示的是抗体阳性靶细胞的百分数。
3.6通过CODV-Fab CD123 x CD3介导的对THP-1细胞的细胞毒性作用
通过流式细胞术基于细胞毒性试验分析由新生成的CD123序列和相同的CD3结合序列组成的双特异性抗体的T-细胞衔接效应。效应器细胞是从健康捐赠者的全血分离的原代T细胞。将THP-1细胞用作表达CD123的靶细胞。
从用EDTA治疗的健康捐赠者200ml外周血通过Ficoll密度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。15ml Histopaque(Sigma-Aldrich)预先装载至50ml Leucosep-管(Greinerbio-one)上。血液用autoMACS清洗缓冲液+1％ BSA(Miltenyi Biotec)稀释并装载于共10只制备的管的膜上。1000xg无制动离心管10min。收集PBMC并用autoMACS清洗缓冲液+1％BSA洗涤三次。最后，在autoMACS运行缓冲液(Miltenyi Biotec)中重悬PBMC用于通过autoMACSpro技术根据制造商的说明使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离T淋巴细胞。分离的T细胞的纯度通过MACSQuant流式细胞术使用人7色免疫表型试剂盒(Miltenyi Biotec)分析。
在37℃用1μM CFSE在1ml RPMI+GlutaMAX I+10％ FCS(Invitrogen)中染色靶细胞(即THP-1细胞系)。将2.5E4靶细胞接种于96-孔U-底悬浮培养平板(Greiner bio-one)中每孔50μl的培养基中。
将分离的原代人T淋巴细胞在RPMI+GlutaMAX I+10％ FCS中重悬并以所示效应器对靶标的比率添加在每孔50μl的靶细胞中(一般效应器:靶标＝10:1)。
将双特异性抗体在PBS(Invitrogen)中以1:3系列稀释并将5μl每种以3000ng/ml的最终最大浓度添加至细胞。将试验在37℃ 5％ CO2中温育20h。
为检测死亡的细胞，将全部细胞用7-AAD染色。因此，将具有FBS的染色缓冲液(BDPharmingen)中稀释的5μg/ml 7-AAD添加至每孔并在4℃暗处温育15min。分别使用MACSQuant(Miltenyi Biotec)或LSRII(BD)流式细胞术测量细胞。使用FlowJo软件(TreeStar,Inc.)实施进一步的数据分析。读取CFSE和7-AAD双重阳性细胞的百分数。曲线由XLfit(Algorithm 205)计算。
如在表18中所例示，双特异性抗体能够衔接原代T细胞并在体外裂解THP-1靶细胞。死亡的靶细胞中抗体浓度依赖的增加可在20h共温育后检测。对于此处展示的抗体，计算的EC50值为12.2-429.3ng/ml。
表18：基于流式细胞术的细胞毒性试验检测的双特异性CODV-Fab CD123 x CD3的T-细胞衔接效应。给出了从曲线计算的平均EC50值
CD123克隆3E3以CODV-Fab形式与抗CD3抗体4B4的人源化变体组合。分析了其T-细胞衔接效应和其体外活化T细胞的能力。
如上文所述实施细胞毒性试验。由这些构建体介导的原代T细胞对THP-1靶细胞的裂解效应示例性地通过CODV-Fab hz4B4(4D_A)x3E3示于表20。可用从七位不同的健康捐赠者分离的T细胞的浓度依赖效应很可靠地诱导细胞毒性活性(表19)。
表19：基于流式细胞术的细胞毒性试验中检测的双特异性CODV-Fab hz4B4(4D_A)x 3E3的T-细胞衔接效应。给出从曲线计算的平均EC50值。
3.7CD123xCD3 CODV-Fab或DART的T-细胞活化效应
双特异性抗体对T细胞的活化状态的效果，作为安全性的读数通过如上文所述的基于流式细胞术的原代人T细胞表面的活化标记物CD25和CD69的表达检测来读取。比较包括了描述于WO2015026892的包含序列SEQ ID NO:386(其在WO2015026892以SEQ ID NO:1展示)的第一多肽链和序列SEQ ID NO:387(其在WO2015026892以SEQ ID NO:3展示)的第二多肽链的通过二硫键彼此共价结合的DART形式的单链CD123 x CD3双特异性双抗体(本文称为“MGD006”)。
当CODV-Fab仅与分离的T细胞温育时，未在CD4阳性和CD8阳性的T细胞表面检测到晚期活化标记物CD25的表达上的显著增加(数据未展示)。相同地，在两种T-细胞亚群上不存在早期活化标记物CD69表达水平的浓度依赖性增加(表20)。因此，将构建体评估为非活性的(NA)。相反，当添加THP-1靶细胞时，可测量两种标记物表达水平上的巨大增加(CD25数据未展示，CD69数据在表21)。
表20：通过基于流式细胞术的试验中检测的CD69表达水平检测的双特异性CD123x CD3 CODV-Fab或DART对T细胞活化状态的影响。给出的是仅使用T细胞的试验中100nM抗体浓度和最小效果-浓度的活化CD8和CD4 T细胞的平均百分数。
表20中展示的结果表明单链抗体(DART)在测试条件下无靶细胞时引起明显更多的T-细胞活化。
表21：通过基于流式细胞术的试验中CD69表达水平检测的双特异性CODV-Fabhz4B4(4D_A)x 3E3对T细胞活化状态的影响。展示了在最大抗体浓度(Cmax)和在细胞毒性试验中EC50的抗体浓度时活化的CD8和CD4 T细胞的平均百分数。用THP-1靶细胞和T细胞的共温育实施试验。
表22：通过基于流式细胞术的试验中CD69的表达水平检测包含CODV分子和单链Dart的双特异性完整人源化7G3对T细胞活化状态的影响。展示了细胞毒性试验中活化的CD8和CD4 T细胞代表性测试的EC50值。用THP-1靶细胞和T细胞的共温育实施试验。
为评估具有人源化CD3部分的新型CD123抗体的细胞毒性效果，生成包含不同Fv组合的CODV-Fab“hz20G6x7G3”、“7G3xhz4B4”、“hz4B4x3E3”。还生产一种包含Fc的变体，CODV-Fab“hz20G6x7G3-TL4”在轻链具有Fc标记以形成具有相应重链的Fc异二聚体(TL4变体)。双特异性构建体对CD3ε/δ-复合物和CD123的亲和力通过Biacore测量。此外，如上文所述实施了细胞毒性试验并测量了CD4+活化和CD8+活化。
表23：双特异性CD123 x CD3 CODV-分子的亲和力和活性
还评估了CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”、CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”,CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”和单链Dart MGD006的细胞毒性效应。每种双特异性构建体与CD3ε/δ-复合物和CD123的亲和力通过Biacore测量。此外，如上文所述实施了细胞毒性试验并测量了CD4+活化和CD8+活化。
表24：双特异性CD123 x CD3 CODV-分子和DART(MGD006)的亲和力和活性
为评估在靶细胞存在(想要的)和不存在(不想要的)时分子触发T-细胞活化的潜力，实施了新的试验。将NFAT-RE-luc2 Jurkat细胞(Promega#CS176403细胞)与新鲜分离的人T-细胞以效应器靶标1:1的比率在386孔平板中具有2g/L(11mM)葡萄糖、具有GlutaMAX、具有25mM HEPES的RPMI中于37℃5％ CO2温育。5小时后，停止温育并使用Bio-Glo萤光素酶分析系统，Promega#G7940在发光HTS微板读数器中测量发光。
表25：如Jurkat-NFAT-Luc-报告细胞系中测量的通过CD123 x CD3CODV-分子和MGD006诱导的活化的T细胞活化
示于表25的结果表明全部抗体都诱导报告细胞活化，其中EC50值在靶细胞存在时在nM以下。对于T-细胞衔接方式，T-细胞活化应受限于靶细胞的存在。由于靶细胞不存在时无明显的发光信号，这一点对于CODV分子可见。相反地，单链DART分子在靶细胞不存在时诱导更高的报告细胞系活化。这些结果与用原代T-细胞获得的结果吻合。
3.8CD123xCD3双特异性CODV-Fab-TL1和CD123xCD3双特异性CODV-Fab的体内抗肿瘤活性
材料和方法
从全血分离人PBMC和T细胞
用Ficoll梯度离心，从人健康捐赠者的全血分离PBMC。将全血在无菌的磷酸缓冲盐水(PBS)中1:1稀释。随后，将35mL两体积的稀释血液置于存在15mL Ficoll-Paque的两只50mL Falcon管中。将管在200g室温无制动离心40分钟。回收棕黄包衣层并置于具有45mL无菌PBS的六只50mL Falcon管中并以100g室温无制动在10分钟的过程中离心三次(每次离心之间，弃上清并添加45mL PBS)。最后离心后，将两沉淀共同放入50mL Falcon管中由PBS完成的50mL的最终体积。总可变PBMC数目通过Vicell技术定义。随后在来自MyltenyiBiotech(130-091-221)的Automacs运行缓冲液中回收沉淀并从PBMC根据制造商的说明使用来自Miltenyi Biotech(130-091-156)和Automacs的阴性选择试剂盒分离T细胞。回收纯化的T细胞并以2.5x10E+6细胞/mL的浓度置于Xvivo-15 5％HIS+peni-strepto1X培养基的培养中。
人T细胞扩增
活化人富集的T细胞种群并在14天过程中使用来自Miltenyi Biotech(130-091-441)的T细胞活化/扩大试剂盒扩大。
用于体内施用的人T细胞的制备
400g离心细胞和细胞培养基10分钟。以2x10E+7细胞/ml的浓度在PBS中回收沉淀。根据生产商的说明使用来自Myltenyi Biotech(130-092-168)的MACsiMAG的分隔器实施从扩增的T细胞对活化的珠的去除。富集的T细胞种群通过Vicell计数进行计数并在50mLFalcon管中的25mL无菌PBS中回收。室温10分钟的过程中在400g的离心步骤后，在等体积的无菌PBS中回收细胞沉淀以获得5x10E+7细胞/mL的最终浓度。
肿瘤模型
从微生物和细胞培养收集Leibniz-institut DSMZ-German(DSMZ Braunshweig,Germany)获得表达CD123的Molm-13人急性髓性白血病细胞。细胞在RPMI1640 Glutamax培养基(用20％胎牛血清完成)中培养(37℃，5％CO2，95％湿度)生长。用通过非复制型慢病毒携带的萤光素萤光素酶载体(SV40-PGL4-Puro–即由连接至萤光素酶2的Simian Virus 40启动子和嘌呤霉素抗性盒序列组成的萤光素酶载体)感染Molm-13细胞。
在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ NSG小鼠中静脉注射(IV)Molm13-luc+肿瘤细胞(在200μl PBS悬液中的10E+6细胞每动物)。24小时后，在0.2mL体积的无菌PBS下腹腔注射(IP)10E+7人T-细胞至相同小鼠。
在肿瘤植入后三天使用具有Living Image 3.2采集软件(Perkin-Elmer,Waltham,M,USA)的IVIS100成像仪(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)实施基线生物发光成像。成像前15分钟用120mg/kgPBS中的甲壳虫萤光素钾盐(批次316019,Promega,Lyon,France)IP注射动物。成像前5分钟用(120mg/kg；6mg/kg IM,5ml/kg)麻醉小鼠。
通过静脉途径(IV)或连续腹腔内灌注(CIP)在肿瘤植入后第4天对建立的已在骨中可检测的肿瘤初始CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”、CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”、CD123xCD3双特异性DART竞争剂(单链抗体DART形式MGD006或接近的类似物，本文称为“DART-tool”)或PBS治疗，如在表26(CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”)、表27(CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”IV)和表28(CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”CIP)所示。
表26:CD123xCD3双特异性CODV-Fab-TL1静脉注射(IV)的评估研究设计
表27:CD123xCD3双特异性CODV-Fab静脉注射(IV)的评估研究设计
表28:CD123xCD3双特异性CODV-Fab连续腹腔内灌注(CIP)评估研究设计
数据收集和效力标准
从第三天至试验结束监测动物体重进而跟踪治疗影响。将在连续3天内出现20％体重丧失或15％体重丧失或更多药物相关死亡的剂量认作过度毒性剂量。动物体重包括肿瘤重量。
肿瘤负荷随后是非侵入性生物发光成像(BLI)。在植入后第三天治疗开始的24小时前实施基线BLI。基于全身生物发光信号将动物分配于不同组。在全身和后腿长骨中通过在肿瘤植入后第7、10和14天BLI信号测量追踪肿瘤生长。长骨信号通过分区测量且可由附近的局部区域的信号影响(例如在后期时间点软组织中的残留信号)。将治疗组与具有Molm13-luc+浸染的肿瘤和人T细胞的对照动物进行了比较。
主要效力终点是治疗组和对照组从基线改变的肿瘤信号的比率(dT/dC)、部分肿瘤消退的数目(PR)和完全肿瘤消退的数目(CR)。
对于每治疗组的每只动物准时监测基于生物发光曲线的肿瘤生长(以Phot/秒表述)并以中值曲线±MAD表示，都针对全身和骨区段信号。对于每对照(C)和治疗(T)动物每天通过从在具体观察日的肿瘤信号减去在第一治疗日(分期日)的肿瘤信号计算生物发光信号的改变。对于治疗组计算中值T且对于对照组计算中值C。
随后计算T/C比率并以百分数表示：
dT/dC＝[(观察天的中值T-第3天中值T)/(观察天的中值C-第3天中值C)]x 100
当在试验末期(14天)的dT/dC低于42％时将剂量认为治疗上有活性，且当dT/dC低于10％认作非常有活性。
肿瘤消退的百分数定义为治疗组中在具体的观察日与治疗第一日的信号相比肿瘤信号减少的百分数。在具体时间点且对于每只动物，％消退计算为：
假设由于萤光素动力学和可能错过的IP注射的信号变异风险，对于动物仅当在至少两连续时间点观察到时将信号消退认作真的肿瘤消退。
部分消退(PR)：如果对于两次连续时间点肿瘤信号减少低于初始治疗信号，保持高于基线信号的50％，则将消退定义为部分。
完全消退(CR)：如果对于两次连续时间点肿瘤信号减少至治疗初始的50％以下，则将消退定义为完全。
统计学分析
IV途径的化合物的评估
用按天的重复测量进行双向方差分析随后使用用于多重配对比较的Bonferroni-Holm调整将每治疗组的个体生物发光信号与其他组进行了比较：p>0.05:NS，0.05>p>0.01:*，p<0.01:**。对于全身生物发光信号和长骨生物发光信号都实施了统计学分析。
CIP途径的化合物评估
CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”CIP途径的评估导致两独立研究的数据聚集(第一项研究设计高剂量化合物，第二项研究用于低剂量，两项研究都包含媒介物对照组和CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”1.3nmol/kg IV Qd阳性对照组)。通过相同实验相同天媒介物组生物发光信号的方式标准化数据后，实施了每只小鼠每天的生物发光信号的统计学分析(集合的媒介物对照n＝19；收集的阳性对照n＝20)。用按天的重复测量进行双向方差分析随后使用用于多重配对比较的Bonferroni-Holm调整将治疗的每组个体的标准化生物发光信号与其他组进行了比较：p>0.05:NS，0.05>p>0.01:*，p<0.01:**。对于全身生物发光信号和长骨生物发光信号都实施了统计学分析。
结果
CD123xCD3双特异性CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”IV
人T细胞存在的完整的人CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在全部测试剂量抑制Molm13肿瘤生长(1.3、0.13和0.013nmol/Kg Q3d)，在全血中分别具有20％、14％和38％的dT/dC(图5和7)且在全部测试剂量与长骨中的肿瘤消退相关，分别具有4/7CR、6/8CR和2/6CR(图6和8)。
在全身和长骨中以0.13nmol/kg Q3d获得完整的人CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”最大响应。在该剂量，活性与DART 1.3nmol/kg IV Qd(全身dT/dC 29％，具有1/7CR和长骨中1/7PR)无统计学差异，且与CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”1.3nmol/kg IV Qd(全身dT/dC23％，1/8CR且长骨中的肿瘤消退1/8PR)等同。数据通过末端组织病理学分析确认(未显示)。
在全身和长骨间观察到的差异与IV注射后连续的外髓质肿瘤传播的卵巢和腹部脂肪中残留肿瘤生长相关。
CD123xCD3双特异性CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”IV
人T细胞存在的完整的人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”IV在所有所测试剂量(1.3和0.13nmol/Kg Qd4-13)均抑制肿瘤生长，分别具有14％和39％的dT/dC(图9和11)，与1.3nmol/kg时长骨中具有5/8CR的肿瘤消退相关(图10和12)。
DART 1.3nmol/kg IV Qd4-13抑制肿瘤生长，具有全身dT/dC 29％和长骨中3/8CR肿瘤消退，与CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”1.3nmol/Kg IV无显著性差异。尽管长骨中1/7PR肿瘤消退，但DART在0.13nmol/Kg IV Qd4-13(dT/dC62％)无抑制全身肿瘤信号的活性。在研究末期使用相同剂量的完整的人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”未观察到显著差异。当以1.3nmol/kg iv QD4-13的相同剂量给药时，在完整人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”和部分人源化CODV-Fab hz20G6x7G3化合物间未看到统计学差异：在该剂量CODV-Fab hz20G6x7G3抑制全身肿瘤生长，具有34％的dT/dC，与长骨中的肿瘤消退相关(1/8CR和1/8PR)。
在全身和长骨间观察到的差异与IV注射后连续的外髓质肿瘤传播的卵巢和腹部脂肪中残留肿瘤生长相关。
CD123xCD3双特异性CODV-Fab CIP
人T细胞存在的完整的人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”CIP以3.9、1.3和0.13nmol/Kg/天CIP4-14抑制全身肿瘤生长且在0.013nmol/kg/天无活性，在全身分别具有2％、3％、21％和57％的dT/dC(图13和15)。在3.9、1.3和0.13nmol/kg时其分别与长骨中的肿瘤消退和5/9CR 3/9PR、6/10CR 1/10PR和7/8CR相关(图14和16)。
DART 3.9,1.3和0.13nmol/kg/天CIP4-14但非0.013nmol/kg/天抑制全身肿瘤生长，分别具有21％、5％、21％和46％的dT/dC(图13)，在长骨中以3.9、1.3和0.13nmol/kg诱导肿瘤消退，分别具有3/9CR 3/9PR；8/9CR和4/8CR 2/8PR(图14)。
完整的人CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”1.3nmol/kg IV Qd4-13在全身抑制肿瘤生长，具有4％和5％的dT/dC(分别在第一和第二项研究中)，与长骨中的肿瘤消退相关(在第一和第二项研究中分别8/10CR 1/10PR vs 8/10CR)。
本发明进一步涉及如下各项：
1.一种与人CD3ε蛋白的细胞外结构域特异性结合的分离抗体，其包含：
a)序列SEQ ID NO:5或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:9或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
b)序列SEQ ID NO:12或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:16或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
c)序列SEQ ID NO:18或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:21或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
d)序列SEQ ID NO:23或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:26或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
e)序列SEQ ID NO:29或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:33或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
f)序列SEQ ID NO:36或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:39或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
g)序列SEQ ID NO:40或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:42或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
h)序列SEQ ID NO:43或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:45或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
i)序列SEQ ID NO:46或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:48或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
j)序列SEQ ID NO:49或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:53或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
k)序列SEQ ID NO:56或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:59或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
l)序列SEQ ID NO:60或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:62或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
m)序列SEQ ID NO:63或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:66或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
n)序列SEQ ID NO:68或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:70或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
o)序列SEQ ID NO:72或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:73或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
p)序列SEQ ID NO:74或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:78或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
q)序列SEQ ID NO:79或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:82或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
r)序列SEQ ID NO:83或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:85或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
s)序列SEQ ID NO:46或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:87或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
t)序列SEQ ID NO:89或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:92或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
u)序列SEQ ID NO:95或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:99或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
v)序列SEQ ID NO:102或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:106或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
w)序列SEQ ID NO:107或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:109或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
x)序列SEQ ID NO:110或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:112或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
y)序列SEQ ID NO:115或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:119或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
z)序列SEQ ID NO:121或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:125或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
aa)序列SEQ ID NO:128或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:130或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
bb)序列SEQ ID NO:131或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ ID NO:132或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
cc)包含选自下组氨基酸序列的重链可变结构域：SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQID NO:147、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153，和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变结构域：SEQ ID NO:139、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ IDNO:151、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157，或
dd)包含选自下组氨基酸序列的重链可变结构域：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183，和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变结构域：SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ IDNO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:182。
2.一种与人CD3ε特异性结合的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽链具有由式[II]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的CH1重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式[I]的多肽链和式[II]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对；且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据项1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
3.根据项2所述的抗体样结合蛋白，其中所述式[II]的多肽链进一步包含Fc结构域。
4.根据项2或3所述的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条抗原多肽链，其中第一多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽链具有由式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白中的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式[I]的多肽链和式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对，且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据项1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
5.根据项3或4所述的抗体样结合蛋白，其中所述式[I]的多肽链进一步包含Fc结构域(Fc2)。
6.根据项3至5中任一项所述的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽链具有由式[IV]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]
且第二多肽链具有由式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
Fc2是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头；
其中所述式[IV]的多肽链和式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对，且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据项1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
7.根据项3或4所述的抗体样结合蛋白，其包含含有Fc结构域(Fc3)的第三多肽链。
8.根据项3、4和7中任一项所述的抗体样结合蛋白，
其包含形成两个抗原结合位点的三条多肽链，其中第一多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
第二多肽链具有由式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
且第三多肽Fc3，其是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
其中
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3,和L4是氨基酸接头；
其中所述式[I]的多肽链和式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对；
其中式[III]的多肽链与第三多肽通过其Fc结构域异二聚化；且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据项1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
9.根据项2至8中任一项所述的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结合蛋白与至少另一靶抗原特异性结合。
10.根据项9所述的抗体样结合蛋白，其中所述至少另一抗原靶是CD123。
11.根据项10所述的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结合蛋白包含：
a)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:9或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:5或与其至少85％相同的序列组成，或
b)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:21或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:18或与其至少85％相同的序列组成，或
c)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:16或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:12或与其至少85％相同的序列组成，或
d)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域，其由氨基酸序列SEQ ID NO:26或与其至少85％相同的序列组成(VD1)，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:23或与其至少85％相同的序列组成，或
e)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:143或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:138或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，或
f)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:158或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:308或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:312或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:171或与其至少85％相同的序列组成，或
g)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:230或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:158或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:171或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:226或与其至少85％相同的序列组成，或
h)第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:385或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VD2)，其由氨基酸序列SEQID NO:141或与其至少85％相同的序列组成，第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VD3)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:138或与其至少85％相同的序列组成，和第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VD4)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:383或与其至少85％相同的序列组成。
12.根据项2所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[I]的一条多肽链，其由如下组成：含有氨基酸序列SEQ ID NO:385的VD1、氨基酸序列SEQ ID NO:389的L1、氨基酸序列SEQ ID NO:141的VD2、氨基酸序列SEQ ID NO:389的L2和氨基酸序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388，或
与氨基酸序列SEQ ID NO:388至少85％相同的氨基酸序列；和
b)根据式[II]的一条多肽链，其由如下组成：含有氨基酸序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0个氨基酸、氨基酸序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0个氨基酸、和氨基酸序列SEQ IDNO:313的CH1的氨基酸序列SEQ ID NO:390，或
与SEQ ID NO:390至少85％相同的氨基酸序列，其中VD4的氨基酸序列SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和VD3的氨基酸序列SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；而且
其中所述式[I]的多肽链和所述式[II]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对。
13.根据项5或6所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[IV]的一条多肽链，其由如下组成：包含氨基酸序列SEQ ID NO:385的VD1、氨基酸序列SEQ ID NO:389的L1、氨基酸序列SEQ ID NO:141的VD2、氨基酸序列SEQ IDNO:389的L2、氨基酸序列SEQ ID NO:310的CL、L5是0个氨基酸、和氨基酸序列SEQ ID NO:392的Fc2的氨基酸序列SEQ ID NO:391，或
与氨基酸序列SEQ ID NO:391至少85％相同的氨基酸序列；和
b)根据式[III]的一条多肽链，其由如下组成：含有氨基酸序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0个氨基酸、氨基酸序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0个氨基酸、和氨基酸序列SEQ IDNO:313的CH1和氨基酸序列SEQ ID NO:394的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:393，或
与SEQ ID NO:393至少85％相同的氨基酸序列，其中VD4的氨基酸序列SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和VD3的氨基酸序列SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；而且
其中所述式[IV]的多肽链和所述式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对。
14.根据项7或8所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[I]的一条多肽链，其由如下组成：含有氨基酸序列SEQ ID NO:385的VD1、氨基酸序列SEQ ID NO:389的L1、氨基酸序列SEQ ID NO:141的VD2、氨基酸序列SEQ ID NO:389的L2、和氨基酸序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388，或
与氨基酸序列SEQ ID NO:388至少85％相同的氨基酸序列；和
b)根据式[III]的一条多肽链，其由如下组成：包含氨基酸序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0个氨基酸、氨基酸序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0个氨基酸、氨基酸序列SEQ IDNO:313的CH1、和序列SEQ ID NO:396的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:395，或
与SEQ ID NO:395至少85％相同的氨基酸序列，其中VD4的氨基酸序列SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和VD3的氨基酸序列SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；和
c)一条多肽Fc3，其由氨基酸序列SEQ ID NO:397或与其至少85％相同的氨基酸序列组成，其中所述Fc3或与其至少85％相同的氨基酸序列与根据式[III]的多肽链的Fc区异二聚化；而且
其中所述式[I]的多肽链和所述式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对。
15.根据项7或8所述的抗体样结合分子，其包含：
a)根据式[I]的一条多肽链，其由如下组成：包含氨基酸序列SEQ ID NO:385的VD1、氨基酸序列SEQ ID NO:389的L1、氨基酸序列SEQ ID NO:141的VD2、氨基酸序列SEQ ID NO:389的L2和氨基酸序列SEQ ID NO:310的CL的氨基酸序列SEQ ID NO:388，或
与氨基酸序列SEQ ID NO:388至少85％相同的氨基酸序列；和
b)根据式[III]的一条多肽链，其由如下组成：包含氨基酸序列SEQ ID NO:138的VD3、L3是0个氨基酸、氨基酸序列SEQ ID NO:383的VD4、L4是0个氨基酸、氨基酸序列SEQ IDNO:313的CH1、和氨基酸序列SEQ ID NO:400的Fc的氨基酸序列SEQ ID NO:399，或
与SEQ ID NO:399至少85％相同的氨基酸序列，其中VD4的氨基酸序列SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:384和SEQ ID NO:382的3个CDR，和VD3的氨基酸序列SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8的3个CDR未改变；和
c)一条多肽Fc3，其由氨基酸序列SEQ ID NO:398或与其至少85％相同的氨基酸序列组成，其中所述Fc3或与其至少85％相同的氨基酸序列与根据式[III]的多肽链的Fc区异二聚化；而且
其中所述式[I]的多肽链和所述式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对。
16.一种药物组合物，其包含根据项2至15中任一项所述的抗体样结合蛋白或根据项1所述的抗体，以及药物上可接受的载剂。
17.根据项2至15中任一项所述的抗体样结合蛋白或根据项1所述的抗体或根据项16所述的药物组合物作为药物的用途。
18.根据项2至15中任一项所述的抗体样结合蛋白或包含根据项2至15中任一项所述的抗体样结合蛋白的药物组合物作为用于治疗癌症的药物的用途。
19.根据项1所述的抗体或包含根据项1所述的抗体的药物组合物作为用于预防或治疗病理性免疫应答的药物的用途。
20.根据项18所述的用途，其中所述癌症是血液癌症。
21.根据项2至15中任一项所述的抗体样结合蛋白或根据项1所述的抗体或根据项16所述的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
22.一种分离的核酸，其包含编码根据项2至15中任一项所述的抗体样结合蛋白或根据项1所述的抗体的核苷酸序列。
23.一种分离的宿主细胞，其已被根据项22所述的核酸分子转化。
24.一种试剂盒，其包含至少一种根据项1所述的抗体或至少一种根据项2至15中任一项所述的抗体样结合蛋白。

Claims (10)

1.一种与人CD3ε蛋白的细胞外结构域特异性结合的分离抗体，其包含：
a)序列SEQ ID NO:5或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQ IDNO:9或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
b)序列SEQ ID NO:12或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:16或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
c)序列SEQ ID NO:18或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:21或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
d)序列SEQ ID NO:23或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:26或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
e)序列SEQ ID NO:29或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:33或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
f)序列SEQ ID NO:36或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:39或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
g)序列SEQ ID NO:40或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:42或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
h)序列SEQ ID NO:43或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:45或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
i)序列SEQ ID NO:46或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:48或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
j)序列SEQ ID NO:49或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:53或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
k)序列SEQ ID NO:56或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:59或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
l)序列SEQ ID NO:60或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:62或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
m)序列SEQ ID NO:63或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:66或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
n)序列SEQ ID NO:68或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:70或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
o)序列SEQ ID NO:72或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:73或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
p)序列SEQ ID NO:74或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:78或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
q)序列SEQ ID NO:79或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:82或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
r)序列SEQ ID NO:83或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:85或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
s)序列SEQ ID NO:46或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:87或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
t)序列SEQ ID NO:89或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:92或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
u)序列SEQ ID NO:95或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:99或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
v)序列SEQ ID NO:102或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:106或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
w)序列SEQ ID NO:107或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:109或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
x)序列SEQ ID NO:110或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:112或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
y)序列SEQ ID NO:115或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:119或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
z)序列SEQ ID NO:121或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:125或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
aa)序列SEQ ID NO:128或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:130或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
bb)序列SEQ ID NO:131或与其至少85％相同的序列的重链可变结构域，和/或序列SEQID NO:132或与其至少85％相同的序列的轻链可变结构域；或
cc)包含选自下组氨基酸序列的重链可变结构域：SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153，和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变结构域：SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157，或
dd)包含选自下组氨基酸序列的重链可变结构域：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183，和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变结构域：SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQID NO:182。
2.一种与人CD3ε特异性结合的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽链具有由式[II]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1[II]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的CH1重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式[I]的多肽链和式[II]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对；且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据权利要求1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
3.根据权利要求2所述的抗体样结合蛋白，其中所述式[II]的多肽链进一步包含Fc结构域。
4.根据权利要求2或3所述的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条抗原多肽链，其中第一多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
且第二多肽链具有由式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白中的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中所述式[I]的多肽链和式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对，且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据权利要求1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
5.根据权利要求3或4所述的抗体样结合蛋白，其中所述式[I]的多肽链进一步包含Fc结构域(Fc2)。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的抗体样结合蛋白，其包含形成两个抗原结合位点的两条多肽链，其中第一多肽链具有由式[IV]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2[IV]
且第二多肽链具有由式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
其中：
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
Fc2是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头；
其中所述式[IV]的多肽链和式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对，且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据权利要求1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
7.根据权利要求3或4所述的抗体样结合蛋白，其包含含有Fc结构域(Fc3)的第三多肽链。
8.根据权利要求3、4和7中任一项所述的抗体样结合蛋白，
其包含形成两个抗原结合位点的三条多肽链，其中第一多肽链具有由式[I]所示的结构：
VD1-L1-VD2-L2-CL[I]
第二多肽链具有由式[III]所示的结构：
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc[III]
且第三多肽Fc3，其是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
其中
VD1是第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD2是第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD3是所述第二免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
VD4是所述第一免疫球蛋白的重链或轻链可变结构域；
CL是免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白的C H1重链恒定结构域；
Fc是免疫球蛋白的免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；
L1、L2、L3,和L4是氨基酸接头；
其中所述式[I]的多肽链和式[III]的多肽链结合以形成交叉轻链-重链对；
其中式[III]的多肽链与第三多肽通过其Fc结构域异二聚化；且
其中所述VD1和VD4，或VD2和VD3包含根据权利要求1所述的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结合蛋白与至少另一靶抗原特异性结合。
10.根据权利要求9所述的抗体样结合蛋白，其中所述至少另一抗原靶是CD123。
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