TWI573802B - 變異之活動素受體多肽及其用途 - Google Patents

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Description

變異之活動素受體多肽及其用途
本發明之技術領域是關於轉形生長因子-β(TGF-β)家族成員及可溶性TGF-β受體(soluble TGF-β receptors)，以及調節TGF-β家族成員活性以治療各種失調之方法。
已知TGF-β蛋白與各種疾病狀態有關，以及對抗這些蛋白質可用於作為該疾病狀態之治療性處理。尤其是同時對抗數種TGF-β蛋白對某些疾病的治療特別有效。
也稱為肌肉生長抑制素(myostatin)之生長/分化因子8(GDF-8)是TGF-β家族成員，大部分表現於發育中及成人骨骼肌組織之細胞。肌肉生長抑制素在負調控骨骼肌的生長似乎扮演必要角色(McPherron et al.,Nature(London)387,83-90(1997))。已顯示對抗肌肉生長抑制素會增加動物的淨肌肉量(lean muscle mass)(McFerron et al.,supra,Zimmers et al.,Science 296：1486(2002))。
交叉結合研究已確定肌肉生長抑制素在活體外能結合第II型活動素受體(activin type II receptor)ActRIIA及ActRIIB(Lee et al.,PNAS USA 98：9306-11(2001))。也有證據指出GDF-11結合至ActRIIA及ActRIIB二者(Oh et al.,Genes Dev 16：2749-54(2002))。
蛋白質療法的製品可因表現及蛋白質純化期間蛋白質凝集而惡 化。尤其在細胞培養狀況下，大量蛋白質堆積可造成細胞內凝集，以及分泌可使蛋白質暴露到額外因子而促進進一步的凝集(Cromwell,M.E.M.et al.,The AAPS Journal 8：E572-E579,2006.)。
雖然已試圖緩和造成凝集的因子，但仍持續有需要設計蛋白質以減少形成凝集物的傾向。本發明達到改善結合至肌肉生長抑制素、活動素(activin)、GDF-11之蛋白質治療物溶解性之需求以治療某些疾病狀態。
發明概述
本發明提供一種含有變異之人類活動素受體IIB(稱為vActRIIB或vActRIIB5)多肽之經單離蛋白質。在一具體例中，該蛋白質含有具SEQ ID NO：2或18胺基酸序列之多肽，其中位置E28或R40，或位置28及40二者之胺基酸經另一非天然胺基酸取代，且其中該多肽能結合肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11。在一具體例中，該蛋白質含有具SEQ ID NO：2或18胺基酸序列之多肽，其中位置E28或R40，或E28及R40二者之胺基酸經非天然胺基酸取代，以及其中該18胺基酸訊息肽被移除，以及其中該多肽能結合肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11。在一具體例中，該蛋白質含有具SEQ ID NO：2或18胺基酸序列之多肽，其中位置E28或R40，或E28及R40二者之胺基酸經另一胺基酸取代，以及其中N-末端18胺基酸訊息序列及成熟序列的N-末端四個胺基酸或N-末端六個胺基酸被移除，以及其中該多肽能結合肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11。在一具體例中，位置E28的取代是選自由W、Y及A所組成之群組。在另一具體例中，位置E28的取代是選自由A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y所組成之胺基酸群組。在另一具體例中，位置R40的取代是選自由G、Q、M、H、K及N所組成之胺基酸群組。在另一具體例中，位置E28的取代是選自由 A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y所組成之胺基酸群組以及位置R40的取代是選自由A、G、Q、M、H、K及N所組成之胺基酸群組。在另一具體例中，該蛋白質進一步含有異質蛋白質。在一具體例中，該異質蛋白質是Fc功能部位(domain)。
在一具體例中，該該蛋白質含有多肽具有提及於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97之胺基酸序列。
在另一具體例中，該蛋白質含有多肽係經由具有提及於SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96之序列或其互補體之多核苷酸所編碼。
在另一觀點，本發明提供一種經單離之核酸分子含有編碼vActRIIB或vActRIIB5多肽之多核苷酸。在一具體例中，該核酸分子含有多核苷酸具有提及於SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96之核酸序列或其互補體。
在另一具體例中，該核酸分子含有多核苷酸可編碼提及於由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97所組群組之胺基酸序列所組成之多肽。在另一具體例中，該核酸分子進一步含有轉錄或轉譯調節序列。在另一觀點，提供一種含有vActRIIB核酸分子之重組載體。在另一觀點，提供含有該重組載體之宿主細胞，以及提供製造vActRIIB多肽之方法。
本發明進一步提供一種包含至少一本發明vActRIIB多肽之組成物。在一具體例中，該組成物為一種包含vActRIIB多肽混合醫藥可接受載劑之醫藥組成物。
在另一觀點，本發明提供一種於罹患肌肉清瘦疾病(muscle wasting disease)之患者治療或預防此等失調之方法，其係經由投與包含vActRIIB多肽之治療性組成物至患者。肌肉清瘦疾病包括或起因於下列病症，但不限於：癌症惡病質，肌肉萎縮症，肌萎縮性脊髓側索硬化，阻塞性肺部疾病，慢性心衰竭，化療惡病質，HIV/AIDS，腎衰竭，尿毒症，類風濕性關節炎，老年人肌力流失，器官萎縮，腕道症候群，雄性素剝奪(androgen deprivation)，以及因不活性(例如長期臥床，脊髓鍵肌損傷，中風，骨折，老化)造成之肌肉清瘦。肌肉清瘦亦可起因於情況如太空飛行之失重，胰島素抗性，燒傷引起之肌肉清瘦，雄性素剝奪(androgen deprivation)，及其他失調。在另一觀點，本發明提供一種治療與活動素A表現有關之疾病之方法。在一具體例中，該疾病為癌症。在另一觀點，本發明提供一種治療代謝失調之方法，包括對有此治療需要之患者投與治療性組成物，其中該代謝失調為選自骨質流失，糖尿病，肥胖，葡萄糖耐受不良，高血糖症，雄性素剝奪(androgen deprivation)，以及代謝症候群。在另一觀點，本發明提供一種基因治療之方法，包括對有其需要之患者投與編碼本發明vActRIIB多肽之載體，其中該載體能於患者表現vActRIIB多肽。
第1圖顯示野生型可溶性ActRIIB-huIgG1Fc之胺基酸序列(SEQ ID NO：98)。訊息肽序列為粗體，接著為成熟的ActRIIB細胞外功能部位，以及包括部分樞紐區域之人類IgG1 Fc為斜體。人類IgG1 Fc含有樞紐區域。胺基酸E28及R40劃底線。連接子序列GGGGS(SEQ ID NO：75)為斜體及劃底線。
第2圖顯示可溶性ActRIIB5-huIgG1Fc的胺基酸序列(SEQ ID NO：99)。訊息肽序列為粗體，接著為成熟的ActRIIB5可溶性功能部位，以及包括部分樞紐區域之人類IgG1 Fc為斜體。E28及R40劃底線。連接子序列(GGGGS)(SEQ ID NO：75)為斜體及劃底線。
第3圖顯示在抑制素-踢除小鼠中可溶性vActRIIB-Fc E28W治療對睪丸(第3A圖)及卵巢(第3B圖)質量的影響。
第4圖顯示在抑制素-踢除小鼠中可溶性vActRIIB-Fc E28W治療對雄性(第4A圖)及雌性(第4B圖)抑制素-踢除小鼠存活率之影響。
第5圖顯示在具有結腸26腫瘤之小鼠中可溶性vActRIIB-Fc E28W治療對體重的影響。
第6圖顯示在具有結腸26腫瘤之小鼠中可溶性vActRIIB-Fc E28W治療對存活之影響。
變異之人類活動素IIB受體(vActRIIB)多肽已被揭示。這些多肽的特性為其結合三種TGF-β蛋白之至少一種、肌肉生長抑制素(GDF-8)、活動素A及GDF-11並抑制這些蛋白質活性之能力。相較於未展現文中所揭示修飾之受體，這些可溶性受體也展現改善的溶解性及穩定性。該修飾由與登錄號碼NP_001097(SEQ ID NO：47)之野生型ActRIIB，ActRIIB(SEQ ID NO：18)或ActRIIB5(SEQ ID NO：2)之細胞外功能部位有關以及十分相關之ActRIIB分子之位置28、40或28及40二者的胺基酸取代所組成。
文中使用之用詞“TGF-β家族成員”或“TGF-β蛋白”是指轉形生長因子家族之結構有關的生長因子，包括活動素以及生長及分化因子(GDF)蛋白(Kingsley et al.Genes Dev.8：133-146(1994),McPherron et al.Growth factors and cytokines in health and disease,Vol.1B,D. LeRoith and C.Bondy.ed.,JAI Press Inc.,Greenwich,Conn,USA：pp 357-393).GDF-8,also referred to as myostatin,is a negative regulator of skeletal muscle tissue(McPherron et al.PNAS USA 94：12457-12461(1997))。GDF-8也稱為肌肉生長抑制素，是骨骼肌組織的負調節劑(McPherron et al.PNAS USA 94：12457-12461(1997))。
肌肉生長抑制素以約375個胺基酸長度之不活性蛋白質複合體合成，具有GenBank登錄號碼：AAB86694(SEQ ID NO：49)，人類。該前驅蛋白的活化是經由蛋白水解切割四鹼性處理位置以產生N-末端不活性前功能部位(prodomain)，以及約109胺基酸C-末端蛋白質，其二聚體化為約25kDa之同二聚體。此同二聚體是成熟、具生物活性之蛋白質(Zimmers et al.,Science 296,1486(2002))。
文中使用之用詞“前功能部位(prodomain)”或“前肽”是指不活性N-末端蛋白質，其經切割釋出活性C-末端蛋白質。文中使用之用詞“肌肉生長抑制素”或“成熟的肌肉生長抑制素”是指成熟、具生物活性之C-末端多肽於單體、二聚體或或其他形式，以及具生物活性之片段或有關之多肽，包括對等基因變異體，接合變異體(splice variants)，以及融合肽及多肽。已報告成熟的肌肉生長抑制素於許多物種間，包括人類、小鼠、雞、豬、火雞及大鼠，具有100%序列相同性(Lee et al.,PNAS 98,9306(2001))。
文中使用之GDF-11是指BMP(骨形態發生蛋白，bone morphogenic protein)，具有Swissprot登錄號碼O95390(SEQ ID NO：50)，以及該蛋白質之變異體及物種同種物。GDF-11在胺基酸等級具有約90%相同性於肌肉生長抑制素。GDF-11涉及中軸骨骼之前/後模式的調節(McPherron et al,Nature Genet.22(93)：260-264(1999)；Gamer et al,Dev.Biol.208(1),222-232(1999))，但出生後功能未知。
活動素A是多肽鏈βA的同二聚體。文中使用之用詞“活動素A”是 指具有GenBank登錄號碼：NM_002192(SEQ ID NO：48)之活動素蛋白質，以及該蛋白質之變異體及物種同種物。
活動素受體
文中使用之用詞第II型活動素B受體(ActRIIB)是指具有登錄號碼NP_001097(SEQ ID NO：47)之活動素受體。用詞可溶性ActRIIB包含ActRIIB(SEQ ID NO：18)、ActRIIB5(SEQ ID NO：2)之細胞外功能部位，及這些序列中位置64之精胺酸經丙胺酸取代。也包含用詞可溶性ActRIIB，其為實質類似於SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：2之可溶性受體，而仍保留這些受體的活性，如下所述。
變異之可溶性ActRIIB多肽
本發明提供經單離之蛋白質，其含有可溶性變異之ActIIB受體多肽(文中稱為vActRIIB多肽)。文中使用之用詞“經單離”是指一蛋白質或多肽分子從內生性物質純化至某種程度。這些多肽的特徵為具有結合及抑制活動素A、肌肉生長抑制素或GDF-11任一之活性的能力。在某些具體例中，相較於野生型，該多肽對於活動素A、肌肉生長抑制素或GDF-11之結合親和力已有改善。
在一具體例中，該經單離蛋白質含有vActRIIB多肽，具有提及於SEQ ID NO：2或18之胺基酸序列，以及這些序列的成熟版本(SEQ ID NO：2的胺基酸19至160，以及SEQ ID NO：18的胺基酸19至134)，或這些的已截頭成熟版本(SEQ ID NO：2的胺基酸23至160，以及SEQ ID NO：2的胺基酸25至160；以及SEQ ID NO：18的胺基酸23至134，SEQ ID NO：18的胺基酸25至134)，其中位置28及40之一或兩胺基酸經非野生型胺基酸取代而仍保留SEQ ID NO：2或18的多肽活性，即結合至活動素A、肌肉生長抑制素或GDF-11的能力。文中使用之用詞成熟的vActRIIB多肽是指具有已移除N-末端18胺基酸訊息序列之多肽。文中使用之用詞已截頭成熟的vActRIIB多肽是指具有已移除N-末 端18胺基酸訊息序列及另外成熟多肽之N-末端4個胺基酸或N-末端6個胺基酸的多肽。文中使用之用詞位置28及位置40是指關於全長SEQ ID NO：2或18之胺基酸位置，亦即E28及R40。因此，雖然經純化vActRIIB成熟的多肽可具有取代在位置10及/或位置22、以及已截頭的成熟多肽可具有取代在位置6及/或位置18以及取代在位置4及/或位置16於有關的成熟或已截頭的成熟序列，但這些變異體與全長SEQ ID NO：2及18有關，亦即胺基酸取代在位置E28及/或R40。此等成熟具體例或N-末端已截頭具體例將例示如下。
在一具體例中，位置E28的取代是選自由W、Y及A所組群組。在一具體例中，位置28的取代是W。在另一具體例中，位置28的取代是選自由A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y所組成之胺基酸群組。在另一具體例中，位置40的取代是選自由G、Q、M、H、K及N所組成之胺基酸群組。在另一具體例中，位置28的取代是選自由A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y所組成之胺基酸群組以及位置40的取代是選自由A、G、Q、M、H、K及N所組成之胺基酸群組。在一具體例中，該蛋白質含有多肽具有選自由SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97所組群組之胺基酸序列。在另一具體例中，該蛋白質含有多肽係經由具有提及於SEQ ID NO：3,5,7,9,11,13,15,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,92,94,96之序列或其互補體之多核苷酸所編碼。
在一具體例中，從vActRIIB多肽移除訊息序列而留下成熟的可溶性變異之受體。各種訊息肽能用於本發明可溶性受體之製備。該訊息肽能具有示於第1或2(分別為SEQ ID NO：73及74)之序列，以及可用於表現vActRIIB或vActRIIB5多肽之其他訊息肽。
在另一具體例中，vActRIIB多肽具有實質類似於SEQ ID NO：2及18之序列。文中使用之用詞“實質類似”是指多肽具有至少約80%相同性、至少約85%相同性、至少約90%相同性、至少約95%相同性、至少約98%相同性、或至少約99%相同性於提及於SEQ ID NO：2及18之胺基酸序列，以及其中位置28及/或40之一或兩胺基酸經非野生型胺基酸取代，其中該多肽仍保留SEQ ID NO：2及18之多肽活性，及結合並抑制肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11的能力。此外，用詞vActRIIB多肽包含SEQ ID NO：2或18的片段，例如能結合並抑制肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11之N及C末端截頭。
文中使用之用詞vActRIIB及vActRIIB5多肽的“衍生物”是指附加至少一額外的化學部分(chemical moiety)或至少一額外多肽以形成共價或聚集共軛物，例如糖基基團、脂質、乙醯基基團、或C-末端或N-末端融合多肽、共軛於PEG分子、及更充分說明於下之其他修飾。變異之ActRIIB受體多肽(vActRIIB)也能包括額外的修飾及衍生物，包括因表現於各種細胞類型(例如哺乳動物細胞，大腸桿菌(E.coli)，酵母菌及其他重組宿主細胞)之過程所引起之對C及N末端的修飾。進一步所包括者為vActRIIB多肽片段及含有提及於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97多肽序列之不活性N-糖化作用位置、不活性蛋白酶處理位置或保守胺基酸取代之多肽。
文中使用之用詞“vActRIIB或vActRIIB5多肽活性”或“可溶性ActRIIB或ActRIIB5多肽之生物活性”是指vActRIIB及vActRIIB5多肽(包括但不限為以下實施例舉例說明者)之一種或以上活體外(in vitro)或活體內(in vivo)活性。vActRIIB多肽的活性包括但不限為結合肌肉生長抑制素或活動素A或GDF-11之能力，以及降低或中和肌肉生長抑 制素或活動素A或GDF-11活性之能力。文中使用之用詞“能結合”肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11是指由技藝已知方法測量之結合，例如以下實施例2敘述之Biacore法。另實施例2中，基於pMARE C2C12細胞之分析測量活動素A中和活性、肌肉生長抑制素中和活性以及GDF-11中和活性。活體內活性包括但不限為如下說明之動物模式以及技藝已知之增加體重，增加淨肌肉量，增加骨骼肌質量，減少脂肪質量。生物活性進一步包括降低或預防特定種類腫瘤造成之惡病質，預防特定種類腫瘤的生長，以及增加特定動物模式的存活。vActRIIB多肽活性的進一步討論提供於下。
本發明之多肽進一步含有異質多肽(heterologous polypeptides)直接或透過連接子(linker)序列附著於vActRIIB多肽以形成融合蛋白。文中使用之用詞“融合蛋白”是指經由重組DNA技術一蛋白質具有異質多肽附著。異質多肽包括但不限為Fc多肽，His標籤，以及白胺酸拉鍊(leucine zipper)功能部位以促進變異之ActRIIB多肽的寡聚合化及穩定化，例如敘述於WO 00/29581，其併入本文作為參考。在一具體例中，該異質多肽是Fc多肽或功能部位。在一具體例中，該Fc功能部位是選自人類IgG1，IgG2，以及IgG4 Fc功能部位。其提供於SEQ ID NO：80、82及84。該vActRIIB能進一步含有IgG1、IgG2或IgG4之全部或部分樞紐序列(hinge sequence)，分別鄰接於其IgG Fc區域。對於IgG1、IgG2及IgG4之完整樞紐序列分別提供於SEQ ID NO：76、77及78。
VActRIIB能選擇性進一步含有“連接子(linker)”序列。連接子主要作為一多肽與第二異質多肽或其他型融合之間或兩種或以上變異之ActRIIB多肽之間的連接體(spacers)。在一具體例中，連接子是由以胜肽鍵連接在一起之胺基酸所組成，以從1至20個胺基酸經胜肽鍵連接為佳，其中胺基酸是選自20個天然之存在之胺基酸。這些胺基酸的 一個或以上可經糖化，如熟悉該項技藝者所瞭解。在一具體例中，1至20個胺基酸是選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸及離胺酸。較佳為連接子大部分由無空間阻礙的胺基酸所組成，例如甘胺酸及丙胺酸。連接子的範例為聚甘胺酸(特別是(Gly)5、(Gly)8、聚(Gly-Ala)及聚丙胺酸。連接子之一適合範例如下實施例所示，其為(Gly)4Ser(SEQ ID NO：75)。在另一具體例中，vActRIIB能含有樞紐連接子，是提供用於鄰接樞紐區域之連接子序列，如SEQ ID NO：79舉例說明。
連接子亦為非肽連接子。舉例而言，能使用烷基連接子例如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s=2-20。這些烷基連接子可進一步經任何無空間阻礙基取代，例如低級烷基(例如C1-C6)低級醯基、鹵素(例如Cl，Br)、CN、NH2、苯基等等可進一步經任何無空間阻礙基取代。
在一具體例中，vActRIIB多肽能直接或透過連接子或透過樞紐連接子附著於Fc多肽。vActRIIB包括但不限為vActRIIB-IgG1Fc，E28A(SEQ ID NO：60)；vActRIIB-IgG1Fc，E28W(SEQ ID NO：62)；vActRIIB-IgG1Fc，E28Y(SEQ ID NO：64)；vActRIIB-IgG Fc，R40G(SEQ ID NO：66)；vActRIIB5-IgG1Fc，E28A(SEQ ID NO：70)；以及vActRIIB5-IgG1Fc，E28W(SEQ ID NO：72)，如表1及2所示並敘述於文中實施例。相較於野生型，vActRIIB-IgG1Fc之E28W及E28Y變異體以約高於4倍的親和力結合至活動素A。測量結合親和力之方法敘述於下實施例1。進一步的具體例包括vActRIIB-IgG2 Fc，E28W(SEQ ID NO：91)；vActRIIB-IgG2 Fc，E28Y(SEQ ID NO：93)及vActRIIB-IgG2 Fc(SEQ ID NO：95)。已證明相較於野生型ActRIIB-IgG2 IgG2，該變異體產生較少的凝集，如下舉例證明。
揭示於文中之vActRIIB多肽亦能附著於非多肽分子以賦予所欲特性，例如對ActRIIB多肽降低降解及/或增加半衰期、降低毒性、降低 免疫原性及/或增加生物活性。分子的範例包括但不限為線型聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚離胺酸、葡聚糖；脂質；膽固醇基(例如類固醇)；碳水化合物或寡醣分子。
在另一觀點，本發明提供經單離核酸分子，含有編碼本發明vActRIIB多肽之多核苷酸。文中使用之用詞“經單離”是指從內生性物質純化至某種程度的核酸分子。在一具體例中，本發明之核酸分子含有編碼SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97多肽之多核苷酸。由於已知遺傳密碼的退化性，其中超過1個以上的密碼子能編碼同一胺基酸，示於SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、92、94及96或SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、92、94及96的互補股DNA序列能有所變化，並仍編碼具有SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97胺基酸序列之多肽。此等變異之DNA序列能發生自製造期間發生的無聲突變(silent mutations)，或能為這些序列的蓄意突變產物。
在另一具體例中，本發明之核酸分子含有多核苷酸，具有提及於SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、92、94及96或SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、 45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、92、94及96之互補股之多核苷酸序列。在另一具體例中，本發明提供核酸分子能在嚴格或中度嚴格條件下與SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、92、94及96之編碼多肽區域雜化，其中所編碼之多肽含有提及於SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97之胺基酸序列，且其中所編碼之多肽維持vActRIIB多肽的活性。
本發明之核酸分子包括單股及雙股型式DNA，及其RNA互補體。DNA包括，例如cDNA、基因體DNA、合成之DNA、經由PCR增幅之DNA、及其組合。基因體DNA可經由常見技術單離，例如經由使用SEQ ID NO：1或17之DNA或其適當的片段作為探針。編碼ActRIIB多肽之基因體DNA是得自可獲自數物種之基因體資料庫。合成之DNA可獲自重疊之寡核苷酸片段的化學合成，隨後裝配該片段以重組部分或全部的編碼區域及兩側序列(flanking sequences)。RNA可獲自直接高水平合成mRNA之原核表現載體，例如使用T7啟動子之載體以及RNA聚合酶。cDNA是獲自單離自表現ActRIIB之各種組織的mRNA所製備之資料庫。本發明之DNA分子包括全長基因及其多核苷酸及片段。全長基因亦可包括編碼N-末端訊息序列之序列。
本發明之另一觀點也提供包含核酸序列之表現載體，以及提供以此載體轉形之宿主細胞與vActRIIB多肽之製造方法。用詞“表現載體”是指從多核苷酸序列表現多肽用之質體、噬菌體、病毒或載體。用於表現vActRIIB多肽之載體包含載體增殖及表現所選殖插入物所需之最小序列。表現載體含有轉錄單元，包括配件(1)在基因表現具有 調節角色之遺傳因子或因子，例如啟動子或增強子、(2)將編碼vActRIIB多肽之序列轉錄為mRNA並轉譯為蛋白質、以及(3)適當的轉錄開始及終止序列。這些序列可進一步包括篩選記號。適於宿主細胞表現之載體是易於取得且使用標準重組DNA技術將核酸分子插入載體。此等載體能包括用於特定組織作用之啟動子，以及用於目標人類或動物細胞表現vActRIIB之病毒性載體。適於表現vActRIIB之表現載體的一些範例，包括但不限為包含vActRIIB多核苷酸之pDSRa(敘述於WO 90/14363，併入文中作為參考)及其衍生物，以及包含vActRIIB多核苷酸之pDC323或pDC324載體(敘述於Bianchi et al,Biotech and Bioengineering,Vol 84(4)：439-444(2003))，以及技藝已知或以下敘述之其他適合載體也提供於本發明。
本申請案進一步提供製造vActRIIB多肽之方法。許多其他表現/宿主系統可被利用。這些系統包括但不限為微生物，例如經以重組細菌-噬菌體、質體或黏接質體DNA表現載體轉形之細菌；經酵母菌表現載體轉形之酵母菌；經病毒表現載體(例如竿狀病毒(baculovirus))感染之昆蟲細胞系統；經病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)、菸草嵌紋病毒(TMV))轉形或經細菌表現載體(例如Ti或pBR322質體)轉形之植物細胞系統；或動物細胞系統。可用於重組蛋白製造之哺乳動物細胞，包括但不限為VERO細胞，HeLa細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，COS細胞(例如COS-7)，W138，BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562及293細胞。當轉譯後修飾，例如糖化及多肽處理對活性是重要時，以哺乳動物宿主細胞為佳。哺乳動物表現使能產生可分泌或可溶多肽，而可從生長培養基中回收。
使用適宜的宿主-載體系統，經由在使能製造之條件下培養經含有本發明核酸分子表現載體轉形之宿主細胞能重組地製造vActRIIB多 肽。轉形之細胞能用於長期、高產量多肽製造。一旦此等細胞經含有可篩選記號及所欲表現匣之載體轉形，該細胞在換到篩選用培養基之前在富含某種成分的培養基(enriched media)能生長1-2天。可篩選記號是設計為能生長及回收成功表現導入序列之細胞者。已穩定轉形細胞之抗性團塊，使用適於該細胞系使用之組織培養技術能純化之。重組蛋白質表現之概要見於Methods of Enzymology,v.185,Goeddell,D.V.,ed.,Academic Press(1990)。
在某些情形，例如使用原核系統表現，該表現之本發明多肽可能需要“再摺疊”及氧化為適當的三級結構及生物活性所需產生之二硫鍵。使用許多技藝已知步驟能達到再摺疊。此等方法包括，例如曝露可溶多肽在促溶劑(chaotropic agent)存在下至pH，通常7以上。促溶劑之選擇類似用於包函體溶解之選擇，然而促溶劑通常以低濃度使用。促溶劑範例為胍及尿素。在大部情形，再摺疊/氧化溶液亦含有特定比例之還原劑加上其氧化型以產生特殊的氧化還原勢(redox potential)，其能使二硫鍵移動以發生半胱胺酸橋的形成。一些常用的氧化還原對，包括半胱胺酸/胱胺(cystamine)，穀胱甘肽/二硫雙GSH，氯化銅，二硫蘇糖醇DTT/二硫環己烷DTT，以及2-硫氫乙醇(bME)/二硫-bME。在許多情形，可使用助溶劑增加再摺疊的效率。常用助溶劑包括甘油，各種分子量之聚乙二醇，以及精胺酸。
活動素受體IIB(ActRIIB)結合至配體(ligand)而活化肌肉降解作用系列。阻斷配體：活動素A、肌肉生長抑制素及GDF-11之vActRIIB受體多肽具有對抗涉及肌肉萎縮之疾病治療的潛能以及某些癌症治療，如下實施例所示。然而，表現這些多肽時可能產生凝集。此凝集包括表現期間形成結構寡聚物以及在表現期間及多肽純化後產生非結構凝集。
結構分析、分子模擬及質譜分析方法之組合已指出經由非糖化 ActRIIB分子間之靜電及氫鍵交互作用輔助，透過分子間雙硫鍵形成可於ActRIIB產生多聚合作用。顯著的氫鍵存在於兩ActRIIB分子界面；例如一ActRIIB的E28側鏈與另一ActRIIB的R40側鏈之間。關鍵的靜電交互作用存在於一ActRIIB的E28與另一ActRIIB的R40之間。
這些靜電交互作用可顯著促成暫時性ActRIIB二聚體族群的增加，造成促進ActRIIB單元間之非共價及/或共價鍵形成。殘基28及40間之交互作用是這些交互作用中最關鍵者，因為這兩殘基涉及雙氫鍵以及強烈靜電交互作用。殘基28及40涉及ActRIIB：ActRIIB交互作用且未涉及ActRIIB：活動素A(及其他配體)交互作用。因此，根據本發明殘基28及40是可經取代以改善受體分子的溶解性。因此，E28及R40分別經全部其他可能的天然胺基酸取代、表現並經由如下所示Biacore測試。
結果顯示相較於野生型，E28W及E28Y Fc變異體以高於約四倍的親和力結合至活動素A，如下實施例2之表2所示。Biacore決定之結合示於以下實施例2之表1A及1B。
依據常見技術，多肽能於溶液中或在固體撐體上合成。各種自動合成儀為市售商品並能根據已知規則使用。例如參閱Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2d.Ed.,Pierce Chemical Co.(1984)；Tam et al.,J Am Chem Soc,105：6442,(1983)；Merrifield,Science 232：341-347(1986)；Barany and Merrifield,The Peptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York,1-284；Barany et al.,Int J Pep Protein Res,30：705-739(1987)。
純化本發明多肽是必須的。蛋白質純化技術已被熟悉該項技藝者所熟知。這些技術包括一階段之蛋白質及非蛋白質部分劃的粗製分劃作用。已從其他蛋白質分離胜肽、多肽，因此此等有興趣之胜肽或多肽之進一步純化能使用色層分析及電泳技術達到部分或完全純化 (或純化至均質性)。特別適用於本發明多肽製備之分析方法為離子交換色層分析法，排除色層分析法，聚丙烯醯胺膠體電泳，等電聚焦(isoelectric focusing)。純化胜肽之特效法為快速蛋白質液相色層分析法(FPLC)或甚至高效能液相色層分析法(HPLC)。
文中使用之用詞“經單離多肽”或“純化之多肽”意指可單離自其他成分之組成物，其中該多肽經純化至相對於其天然可得狀態之任何程度。因此純化之多肽亦指沒有於其可天然存在之環境中的多肽。一般而言，“經純化”將指已接受分劃作用移除各種其他成分之多肽組成物，且其組成物實質保留其表現之生物活性。此處使用之用詞“實質經純化”將指一胜肽或多肽組成物中，該多肽或肽形成組成物之主要成分，例如構成組成物約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、或約90%或以上之蛋白質。
定量多肽純化程度之各種方法，根據本發明揭示將被熟悉該項技藝者所知。這些包括，例如決定活性分劃的專一結合活性，或經由SDS/PAGE分析評價分劃中胜肽或多肽含量。評價多肽分劃純度之較佳方法是相較於最初萃取物之結合活性，計算分劃的結合活性，並因此計算純化程度，文中由“-倍純化數”評價。當然，用於代表結合活性量之實際單位將視所選擇採用純化之特殊分析技術而異，且不論多肽或肽是否展現可偵測之結合活性。
適用於純化之各種技術已被熟悉該項技藝者所熟知。這些包括，例如以硫酸銨、PEG、抗體(免翼沉澱)等等沉澱或經由熱變性，隨後離心；色層分析步驟，例如親和力色層分析(例如蛋白質-A-Sepharose)，離子交換，凝膠過濾，逆相，羥基磷灰石及親和力色層分析；等電聚焦；膠體電泳；以及這些技術的組合。如技藝通知，咸信各種純化步驟的進行順序是可改變的，或某些步驟可省略，並仍為製備實質經純化多肽之適宜方法。
抗體
本發明進一步包括結合變異之ActRIIB多肽的抗體，包括專一結合本發明vActRIIB多肽者。文中使用之用詞“專一結合”是指對vActRIIB多肽具有結合親和力(Ka)為106M-1或更高之抗體。文中使用之用詞“抗體”是指完整的抗體，包括多株抗體(參閱，例如抗體：A Laboratory Manual,Harlow and Lane(eds),Cold Spring Harbor Press,(1988))，以及單株抗體(參閱，例如美國專利第RE 32,011，4,902,614，4,543,439及4,411,993號，以及Monoclonal Antibodies：A New Dimension in Biological Analysis,Plenum Press,Kennett,McKearn and Bechtol(eds.)(1980))。文中使用之用詞“抗體”亦指抗體之片段，例如F(ab)，F(ab’)，F(ab’)2，Fv，Fc及單鏈抗體，由重組DNA技術或完整抗體的酵素或化學切割來製造。用詞“抗體”亦指雙專一性(bispecific)或雙功能(bifunctional)抗體，其為具有兩不同重鏈/輕鏈對及兩不同結合位置之人造混成抗體。雙專一性抗體可由各種方法製造，包括融合瘤之融合或Fab’片段的連接。(參閱Songsivilai et al,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990),Kostelny et al.,J.Immunol.148：1547-1553(1992))。
文中使用之用詞“抗體”亦指嵌合型抗體，亦即具有人類恆定抗體免疫球蛋白功能部位偶合一個或以上非人類可變抗體免疫球蛋白功能部位或其片段之抗體(參閱，例如美國專利第5,595,898號及美國專利第5,693,493號)。抗體亦指“人類化”抗體(參閱，例如美國專利第4,816,567號及WO 94/10332)，最小抗體(minibodies)(WO 94/09817)，最大抗體(maxibodies)，以及由基因轉殖動物製造之抗體，其中含有一部分製造人類抗體的基因，但缺乏內生性抗體製造的基因轉殖動物能製造人類抗體(參閱，例如Mendez et al.,Nature Genetics 15：146-156(1997)以及美國專利第6,300,129號)。用詞“抗體”也包括多聚體抗體或 更複雜的蛋白質，例如雜二聚體抗體以及抗遺傳屬性抗體(anti-idiotypic antibody)。“抗體”也包括抗遺傳屬性抗體。例如能使用對抗v ActRIIB之抗體在活體外及活體內鑑定及定量vActRIIB。
也包括者為來自任何哺乳動物之多株抗體，例如小鼠及大鼠抗體以及兔子抗體，能專一結合文中所述包括SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95及97之vActRIIB多肽。
發現此等抗體可用於作為研究工具以及偵測及分析文中所揭示多肽用之定量分析。此等抗體是使用以上所述及習知方法製造。
醫藥組成物
也提供包含vActRIIB蛋白質及本發明多肽之醫藥組成物。此等組成物含有治療或預防有效量之多肽混合醫藥可接受物質以及生理可接受調配物物質。該醫藥組成物可包含修飾、維持或保存用調配物物質，例如組成物之pH、滲透壓、黏性、清澈性、顏色、等滲壓、味道、無菌、穩定性、溶解或釋放率、吸收或穿透。適合的調配物物質包括但不限為胺基酸(例如甘胺酸，麩醯胺酸，天冬醯胺酸，精胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(例如抗壞血酸，亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(例如硼酸鹽，重碳酸鹽，Tris-HCl，檸檬酸鹽，磷酸鹽，其他有機酸類)；增量劑(例如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(例如咖啡因，聚乙烯基咯酮，β-環狀糊精或羥丙基-β-環狀糊精)；填充劑；單醣類；雙醣類及其他碳水化合物類(例如葡萄糖，甘露糖或糊精)；蛋白質(例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(例如聚乙烯基咯酮)；低分子量多肽；形成鹽反離子(例如鈉)；防腐劑(例如殺藻胺(benzalkonium chloride)，苯甲酸，水楊酸，硫柳汞， 苯乙醇，甲基對苯甲酸，丙基對苯甲酸，氯己啶(chlorhexidine)，山梨酸或過氧化氫)；溶劑(例如甘油，聚丙二醇或聚乙二醇)；糖醇類(例如甘露醇或山梨醣醇)；懸浮劑；界面活性劑或潤濕劑(例如普朗尼克類(pluronics)，PEG，山梨糖醇酯類，聚山梨醇酯類例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，Triton，胺基丁三醇(tromethamine)，卵磷脂，膽固醇，太羅西旁(tyloxapal))；穩定性增強劑(蔗糖或山梨醣醇)；滲漲度增強劑(例如鹼金屬鹵化物(較佳為氯化鈉或氯化鉀，甘露醇山梨醣醇)；傳送運劑(delivery vehicle)；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。(Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990)。
最佳醫藥組成物將由熟悉該項技藝者決定，依據例如所欲的投與路徑，傳送格式，以及所欲劑量。參閱，例如上述之Remington’s Pharmaceutical Sciences。此等組成物可影響物理狀態，穩定性，活體內釋放率，以及多肽在活體內的清除率。舉例而言，適合的組成物可為注射用水，非經腸投與用生理食鹽液。
醫藥組成物之主要運劑或載劑本質上可為水性或非水性。舉例而言，適合的運劑或載劑可為注射用水，生理食鹽液或人造腦脊髓液，可補充以非經腸投與之組成物常用的其他物質。中性緩衝鹽液或混與血清白蛋白之鹽液為進一步的範例運劑。其他的範例醫藥組成物鹽液含有約pH 7.0-8.5之Tris緩衝劑，或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩衝劑，其可進一步包括山梨醣醇或其適合的取代物。在本發明一具體例中，組成物可製備用以保存，其係經由將所選具有所欲純度之組成物混合選擇性調配物劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，如上)為凍乾塊或水溶液形式。再者，使用適當賦形劑例如蔗糖治療性組成物可調配為凍乾物。
該調配物能以各種方法傳送，例如經由吸入治療、口服、或經 由注射。當考慮非經腸投與時，用於本發明之治療性組成物可為含有所欲多肽於醫藥可接受運劑之無致熱原(pyrogen)、非經腸可接受水溶液形式。特別適用於非經腸注射之運劑為無菌蒸餾水，其中多肽經調配為無菌、等滲壓液、適於保存。又另一製備物能包含所欲分子與一試劑之調配物，該試劑例如可注射微球、生物可腐蝕顆粒、聚合性化合物(聚乳酸、聚羥基乙酸)、珠或微脂粒，其提供用於控制或持續釋放可透過積存注射(depot injection)傳送之產物。亦可使用透明質酸，且此可於循環期間具有促進持續性之效果。導入所欲分子之其他適合的方法，包括可植入藥運送裝置。
在另一觀點，適於注射投與之醫藥調配物可調配為水溶液，較佳為生理相容之緩衝劑，例如Hanks氏溶液，Ringer氏溶液，或生理緩衝鹽液。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏性之物質，例如羧甲基纖維素鈉，山梨醣醇或葡聚糖。此外，活性化合物之懸浮液可製備為適當的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或運劑包括脂肪油類(例如芝麻油)，或合成之脂肪酸酯類(例如油酸乙酯，三酸甘油酯類或微脂粒)。亦可使用非脂質多價陽離子胺基聚合物於運送。可選擇地，懸浮液亦可包含適當穩定劑或增加化合物溶解度的試劑，並使能製備高濃縮溶液。在另一具體例中，醫藥組成物可調配為吸入用。吸入液亦可與推進劑調配用於氣溶膠運送。又於另一具體例中，溶液可成為霧狀。肺的投與進一步敘述於PCT申請案號PCT/US94/001875，其敘述經化學修飾蛋白質之肺運送。
也考慮某些調配物可口服投與。在本發明一具體例中，以此方式投與之分子能與或不與習慣用於化合固體劑型(例如錠劑及膠囊)之載劑調配。舉例而言，膠囊可設計以釋放調配物的活性部分在胃腸道之點為生物利用率是最大化且前全身性降解是最小化。能包括額外試劑來促進治療性分子的吸收。亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、 植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩散劑及結合劑。口服投與用醫藥組成物亦能使用醫藥可接受載劑及技藝熟知適合口服投與之劑量來調配之。此等載劑能使醫藥組成物調配為錠劑，藥丸，糖衣藥丸，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿狀物，懸浮液等等以給病患攝取。
口服用之醫藥製備物之獲得能透過組合活性化合物與固體賦形劑，以及處理所得細粒混合物(可於磨碎後)以得到錠劑或糖衣藥丸核心。視需要可添加適當的輔助劑。適宜的賦形劑包括碳水化合物或蛋白質填充劑，例如糖類，包括乳糖，蔗糖，甘露醇及山梨醣醇；來自玉米，小麥，米，馬鈴薯或其他植物之澱粉；纖維素，例如甲基纖維素，羥丙基甲基-纖維素，或羧甲基纖維素鈉；樹膠類，包括阿拉伯膠及特拉加康斯樹膠(tragacanth)；以及蛋白質，例如明膠及膠原蛋白。視需要可添加崩散劑或助溶劑，例如交叉連接之聚乙烯吡咯酮，瓊脂，以及藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。
糖衣藥丸核心可與適當的塗覆，例如濃縮糖液結合使用，其亦可包含阿拉伯膠，滑石，聚乙烯基咯酮，高分子凝膠(carbopol gel)，聚乙二醇及/或二氧化鈦，亮漆液，以及適宜的有機溶劑或溶劑混合物。可添加染料或顏料至錠劑或糖衣藥丸塗覆以辨別產物或描繪活性化合物的定量性，亦即劑量。
可用於口服之醫藥製備物也包括由明膠組成之推進式膠囊，以及由明膠及塗覆(例如甘油或山梨醣醇)組成之軟、封口膠囊。推進式膠囊可含有活性成分混與填充劑或結合劑(例如乳糖或澱粉)、潤滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)、以及選擇性穩定劑。於軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮於適當液體，例如含或不含穩定劑脂肪油類、液體或液體聚乙二醇。
額外的醫藥組成物對熟悉該項技藝者應是顯見的，包括調配物為多肽於持續型或調控型運送調配物。調配各種其他持續型或調控型 運送工具，例如微脂粒載劑，生物可腐蝕微顆粒或多孔珠及積存注射之技術也為熟悉該項技藝者所知。參閱例如PCT/US93/00829，其敘述運送醫藥組成物用多孔聚合性微顆粒之控制釋放。持續釋放型製備物之其他實例包括成形物品形式例如膜或微膠囊之半滲透型聚合物基質。持續釋放之基質可包括聚酯類，水膠類(hydrogels)，聚乳酸酯(U.S.3,773,919，EP 058481)，L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸之共聚合(Sidman et al.,1983,Biopolymers 22：547-556)，聚(2-羥基乙基-甲丙烯酸)(Langer et al.,1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277 and Langer,1982,Chem.Tech.12：98-105)，乙烯-醋酸乙烯(Langer et al.,1981，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。持續釋放型組成物亦可包括微脂粒，能以數種技藝已知方法之任一製備。參閱例如Eppstein et al.,PNAS(USA),82：3688(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。
用於活體內投與之醫藥組成物通常必需為無菌。此可透過無菌過濾膜過濾來達成。當組成物為凍乾時，使用此方法之滅菌作用可於凍乾及復原之前或之後進行。非經腸投與用之組成物可以凍乾形式或溶液保存。此外，非經腸組成物通常置入具有無菌取用接口的容器中，例如靜脈液袋或具有皮下注射針可穿刺塞子的小瓶。
一旦醫藥組成物經調配，其可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或經脫水或凍乾粉末保存於無菌小瓶內。此等調配物可為立即使用之形式或投與前復原之形式(例如凍乾)保存。
於專一具體例中，本發明提供製造單劑投與單位用之套組。該套組可各含有具有乾燥蛋白質之第一容器以及具有水溶液調配物之第二容器。本發明之範圍也包括含有單一及多室預填充注射器(例如液體注射器及凍乾注射器)之套組。
欲使用之醫藥組成物的治療有效量將隨，例如治療背景及目標而異。熟悉該項技藝者應知治療用適當劑量水平，在某種程度上將依 據運送的分子、使用多肽之徵兆、投與路徑及病患大小(體重，體表面或器官大小)及健康狀況(年齡及健康概況)而異。因此，臨床醫生可定量劑量及修改投與路徑以得到最佳治療效果。典型劑量可為從約0.1mg/kg至最高約100mg/kg或以上之範圍，視以上提及之因子而異。多肽組成物可注射或靜脈內投與為佳。長期作用之醫藥組成物可每3至4天、每週或美兩週投與，視特殊調配物之半衰期及清空率而異。給藥頻率將視多肽於所用調配物之藥物動力學參數而異。通常投與組成物直到劑量達到所欲效果。因此組成物可為以單劑或多劑(以相同或不同濃度/劑量)投與一段時間，或持續灌注投與。適當劑量之進一步精確改變可例行進行。適當劑量之確定可利用適當劑量-反應數據。
醫藥組成物之投與路徑是依據已知方法，例如口服，透過靜脈內、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內、病灶內、骨隨內、囊內、腦室內、經真皮、皮下或腹膜內路徑注射；以及鼻內、腸道、局部、舌下、尿到、陰道內或直腸工具，經由持續釋放系統或經由植入裝置。視需要，組成物可經由快速注射(bolus injection)或連續式輸注或經由植入裝置投與。此外，組成物也可透過已吸附於其上或填裝入所欲分子之植入膜、藥棉或另一適當材料來局部投與。當使用植入裝置時，該裝置可植入任何適合的組織或器官，以及所欲分子的運輸可透過擴散、定時釋放藥丸或持續投與。
於某些情形，本發明之vActRIIB多肽能經由植入特定細胞(其通常已經過加工)來運送，使用方法例如那些文中所述者，以表現及分泌該多肽。此等細胞可為動物或人類細胞，以及可為自體移植的、異體移植的、異種移植的。另外，細胞亦可為不死的。為減少免疫反應的機會，細胞可裝入膠囊內避免周圍組織的滲透。裝入膠囊的物質典型是生物可相容性，半滲透性聚合封入物或膜，能使多肽產物釋放但 防止因病患免疫系統或來自組織周遭其他有害因子之細胞破壞。
也展望活體內之ActRIIB基因治療，其中直接導入編碼vActRIIB或vActRIIB衍生物之核酸分子於患者。舉例而言，編碼vActRIIB之核酸序列是經由局部注射含或不含適當運送載體(例如腺相關病毒載體)之核酸構築體導入目標細胞。其他病毒載體，包括但不限為反轉錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒及乳突瘤病毒載體。病毒載體的身體轉移可經由活體內局部注射所欲核酸構築體或包含所欲核酸序列之其他適宜運送載體、微脂粒仲介之轉移、直接注射(裸DNA)或微顆粒砲擊(基因槍)達成。
vActRIIB組成物之使用
本發明提供在活體內及活體外降低或中和肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11的量或活性之方法及醫藥組成物，其係經由該多肽與vActRIIB多肽接觸。vActRIIB多肽對肌肉生長抑制素、活動素A及GDF-11具有高親和力，並能降低及抑制至少一肌肉生長抑制素、活動素A及GDF-11的生物活性。此證明於以下實施例。
在另一觀點，本發明提供方法及試劑用於有其需要之患者治療與肌肉生長抑制素有關及/或活動素A有關之失調，其係對患者投與有效劑量之vActRIIB組成物。文中使用之用詞“患者”是指任何動物，例如包括人之哺乳動物。
本發明之組成物用於增加體重百分比之淨肌肉量以減少體重百分比之脂肪量。
可經由vActRIIB組成物治療之失調，包括但不限為各種形式的肌肉萎縮以及代謝失調，例如糖尿病及有關之失調，以及骨退化性疾病，例如骨質疏鬆。已證實vActRIIB組成物在提及於下實施例3之各種疾病模式中能有效治療肌肉萎縮失調。此證實在抑制素-α踢除小鼠(inhibin-αknockout mice)之肌肉清瘦的治療，結腸-26癌症惡病質模式 之肌肉清瘦的治療，後肢懸浮液模式中肌肉萎縮的預防，顯示增加淨肌肉量之OXV雌性的治療，減少脂肪量及增加骨質礦物質含量。
肌肉清瘦失調也包括萎縮症如裘馨氏肌肉萎縮症(Duchenne’s muscular dystrophy)，進行式肌肉萎縮症，貝克氏肌肉萎縮症(Becker’s type muscular dystrophy)，代熱林-蘭杜氏肌肉萎縮症(Dejerine-Landouzy muscular dystrophy)，俄伯氏肌肉萎縮症(Erb’s muscular dystrophy)，以及嬰兒神經軸肌肉萎縮症。由慢性疾病或失調例如肌萎縮性脊髓側索硬化，阻塞性肺部疾病，癌症，AIDS，腎衰竭，器官萎縮，雄性素剝奪(androgen deprivation)及類風濕性關節炎引起之額外的肌肉萎縮症，。
肌肉生長抑制素及/或活動素的過度表現可促成惡病質，一種嚴重的肌肉及脂肪消耗症候群。在兩模式中有效治療惡病質示於下列實施例3。惡病質也因類風濕性關節炎，糖尿病腎病變，腎衰竭，化療以及其他原因引起。在另一實施例，發現呈現AIDS有關肌肉清瘦之人的肌肉生長抑制素免疫反應性蛋白質之血清及肌肉內濃度是增加的但對無脂肪重是相反的(Gonzalez-Cadavid et al.,PNAS USA 95：14938-14943(1998))。也顯示肌肉生長抑制素水平在燒傷者中因肌肉分解作用，因此是增加的(Lang et al,FASEB J 15,1807-1809(2001))。其他情形導致之肌肉清瘦可由殘疾，例如限制活動於輪椅、中風引起之長期臥床、患病、脊髓鍵肌損傷、骨折或創傷、以及微重力環境(太空飛行)之肌肉萎縮造成的不活動所引起。舉例而言，已發現長期臥床後血漿肌肉生長抑制素免疫反應性蛋白質是增加的(Zachwieja et al.J Gravit Physiol.6(2)：11(1999)。也發現太空梭飛行期間，相較於未暴露在微重力環境的大鼠肌肉，暴露於微重力環境之大鼠的肌肉呈現增加的肌肉生長抑制素量(Lalani et al.,J.Endocrin 167(3)：417-28(2000))。
此外，年齡有關之脂肪對肌肉比例增加以及年齡有關之肌肉萎縮似乎與肌肉生長抑制素有關。例如平均的血清肌肉生長抑制素-免疫反應性蛋白質在年輕族群(19-35歲)、中年(36-75歲)、及老年(76-92歲)男性及女性是隨年齡增加，然而平均肌肉量及無脂肪重在這些族群是隨年齡下降(Yarasheski et al.J Nutr Aging 6(5)：343-8(2002))。此外，現今已發現肌肉生長抑制素在心肌以低水平表現，以及梗塞後在心肌細胞的表現上調(Sharma et al.,J Cell Physiol.180(1)：1-9(1999))。因此，降低心肌的肌肉生長抑制素程度可增進梗塞後心肌的復原。
肌肉生長抑制素也顯現對代謝失調有影響，包括第2型糖尿病，非胰島素依賴型糖尿病，高血糖症及肥胖。舉例而言，已顯示缺乏肌肉生長抑制素能改善兩小鼠模式的肥胖及糖尿病表現型(Yen et al.FASEB J.8：479(1994)。在美國專利申請第11/590,962號及美專利申請公開第2007/0117130號中已證實AAV-ActRIIB5載體增加動物之肌肉對脂肪比例，特別是肥胖動物模式。本案揭示之vActRIIB多肽，例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95適於此等用途。因此，經由投與本發明組成物減少脂肪組成物將可改善動物的糖尿病，肥胖及高血糖狀態。此外，含有vActRIIB多肽之組成物可在肥胖個體中減少食物吸收，如同美國專利申請第11/590,962號及美專利申請公開第2007/0117130號中對於ActRIIB5多肽之證實。
投與本發明之ActRIIB多肽可改善骨頭強度及降低骨質疏鬆及其他退化性骨疾病。此已於下述之OVX小鼠模式中證實。亦已發現，例如肌肉生長抑制素缺乏小鼠顯現小鼠肱骨之礦物質含量及密度增加以及增加小樑骨及皮質骨在肌肉附著區域的礦物質含量，以及增加肌肉 量(Hamrick et al.Calcif Tissue Int 71(1)：63-8(2002))。此外，本發明之vActRIIB組成物能用於治療雄性素剝奪(androgen deprivation)，例如用於前列腺癌治療之雄性素剝奪(androgen deprivation)療法的影響。
本發明也提供在食用動物增加肌肉量之方法及組成物，經由對該動物投與有效量之vActRIIB蛋白質。由於成熟的C-末端肌肉生長抑制素多肽在全部測試物種中是相同的，預期vActRIIB多肽在任何農業重要物種，包括牛、雞、火雞及豬應能有效增加肌肉量及降低脂肪。
本發明之vActRIIB多肽及組成物也對抗活動素A的活性。已知活動素A表現於特定種類的癌症，特別是性腺瘤例如卵巢癌，以及造成嚴重的惡病質。(Ciprano et al.Endocrinol 141(7)：2319-27(2000),Shou et al.,Endocrinol 138(11)：5000-5(1997)；Coerver et al,Mol Endocrinol 10(5)：534-43(1996)；Ito et al.British J Cancer 82(8)：1415-20(2000),Lambert-Messerlian,et al,Gynecologic Oncology 74：93-7(1999)。以下實施例3中，已證實本發明之vActRIIB多肽有效於治療嚴重的惡病質，減小腫瘤尺寸以及在抑制素-α踢除小鼠模式及結腸-26癌症惡病質小鼠模式中延長存活。因此，本發明揭示之組成物能用於治療有關活動素A過度表現以及肌肉生長抑制素表現之狀況，例如特定癌症之惡病質以及治療特定性腺類腫瘤。
本發明揭示之組成物可單獨使用或組合其他治療劑使用增強他們的治療效果或減少潛在副作用。這些特性包括增加活性，增加溶解度，降低降解，增加半衰期，降低毒性，以及降低免疫原性。如此本發明揭示之組成物可用於長期的治療療程。此外，本發明化合物之親水性及疏水性特性具有極佳平衡，藉此增強他們在活體外且尤其是活體內使用的效用。詳言之，所揭示之化合物在水溶液培養基中具有適宜程度的溶解性，使能於體內吸收及具生物可利用率，另也具有某程 度溶解性於脂質中，使該化合物穿越細胞膜至推定的作用位置，例如一特別的肌肉量。
此外，本發明之vActRIIB多肽可用在許多分析中偵測及定量肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11。一般而言，本發明之ActRIIB多肽可用於各種分析中作為捕捉劑以結合及固定肌肉生長抑制素、活動素A或GDF-11，類似以下所述者，例如Asai,ed.,Methods in Cell Biology,37,Antibodies in Cell Biology,Academic Press,Inc.,New York(1993)。該多肽可以一些方法標記或可與第三個分子(例如經標記以使肌肉生長抑制素能被偵測及定量之抗體)反應。舉例而言，多肽或第三個分子能經可偵測部分修飾，可偵測部分例如生物素，然後其能結合第四個分子例如酵素標記之卵白素(streptavidin)或其他蛋白質。(Akerstrom,J Immunol 135：2589(1985)；Chaubert,Mod Pathol 10：585(1997))。
本發明已有說明，而提供下列實施例作為舉例說明且不因此有所限制。
實施例1
vActRIIB多肽之表現及純化
使用下列方法表現及純化變異之ActRIIB多肽。
從來自人類睪丸cDNA資料庫單離人類第II型活動素B受體之cDNA(Clontech,Inc.)並如美國專利申請第11/590,962號及美專利申請公開第2007/0117130號所述選殖。
胺基酸取代之測定
組合結構分析、分子模擬及質譜分析之方法顯示凝集(寡聚合化)可形成於ActRIIB，其係透過由無糖化ActRIIB分子間靜電及氫結合交互作用引起形成之分子間二硫鍵。經測定殘基28、38、40、42及48涉及ActRIIB：ActRIIB交互作用但未涉及ActRIIB與其配體之交互作 用。
最初，ActRIIB-Fc之E28及R40在各位置經A取代。N42是ActRIIB中兩N-連接受糖化作用位置之一，其被突變為T以研究刪除ActRIIB：ActRIIB交互作用界面之糖化作用位置將如何影響蛋白質的生物物理性質。光散射及質譜分析確認，相較於野生型蛋白質，完全糖化vActRIIB-IgG1Fc(E28A)及vActRIIB-IgG1Fc(R40A)之分劃有顯著增加。相較於野生型，在37℃培育E28A及R40A vActRIIB-IgG1Fc六天造成些微或無凝集。製作位置28及40之胺基酸取代以減輕或防止凝集(凝集可發生於野生型ActRIIB(SEQ ID NO：2及18)的表現或純化期間)。此凝集已鑑定是表現期間形成之結構性寡聚物以及表現期間及蛋白質純化後產生之非結構性凝集。
製造及純化過程中不同階段的凝集，可使用尺寸排除色層分析法根據以下步驟測定。
有兩可能的N-連接受糖化作用位置在ActRIIB部分以及一N-連接受糖化作用位置在Fc部分。表現於CHO細胞之vActRIIB-Fc是完全及部分糖化形式之混合物。由於ActRIIB-Fc是同二聚體蛋白質，因此預期總共六個位置具有糖化的可能。然而分析顯示有產生糖化不足形式。於此形式只有兩Fc節段被糖化。這些形式被稱為“完全糖化”及“次糖化”。次糖化形式隨時間改變為由四聚體及六聚體組成之寡聚物形式，然而完全糖化形式不會經歷寡聚合化。此樣式於剛純化vActRIIB-Fc偵測到。然而，於變異體vActRIIB-Fc、E28A及vActRIIB-Fc、R40A，全部蛋白質形式仍未改變。
有觀察到次糖化物種進行寡聚合化，構築之代用次糖化變異體中N42被突變為T以杜絕糖化專有在ActRIIB兩可能糖化作用位置之一。於vActRIIB-Fc、N42T，發展為關鍵殘基(E28及R40)之寡聚物峰仍未改變。因此，確立殘基E28及R40於ActRIIB及ActRIIB5中對分子 凝集之重要性。
使用下列示範方法製造本申請案變異之ActRIIB多肽(vActRIIB及vActRIIB5)。文中提供一示範方法。使用含有突變結果E28W之引子利用PCR重疊延伸編碼，透過樞紐連接子序列(編碼SEQ ID NO：79之核苷酸)將vActRIIB、E28W之多核苷酸(SEQ ID NO：23)融合到編碼人類IgG1 Fc功能部位之多核苷酸(SEQ ID NO：82)。該多核苷酸序列全長為SEQ ID NO：61。將雙股DNA片段次選殖於pTT5(Biotechnology Research Institute,National Research Council Canada(NRCC),6100 Avenue Royalmount,Montréal(Québec)Canada H4P 2R2)、pDSR(敘述於WO/9014363)及/或pDSRα之衍生物。在另一具體例中，編碼vActRIIB多肽之多核苷酸是附著於多核苷酸樞紐連接子GGGGS(SEQ ID NO：75)或其多聚體、及/或樞紐連接子(SEQ ID NO：79)。
如下進行設計之vActRIIB-Fc及vActRIIB5-Fc的短暫表現。
以上兩分子之不同設計版短暫表現於適應無血清懸浮液之293-6E細胞(National Research Council of Canada,Ottawa,Canada)，保持於補充250μg/ml健太黴素(geneticin)(Invitrogen)及0.1% Pluronic F68(Invitrogen)之FreeStyleTM培養基(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。轉染作用依照1L培養進行。簡言之，細胞接種體在4L大型搖動培養燒瓶(Corning,Inc.)中生長至1.1×106細胞/ml。將搖動燒瓶培養置於37℃及5% CO2之溼潤化培育器中，保持在Innova 2150搖動器平台(News Brunswick Scientific,Edison,NJ)上、65 RPM。轉染時，將293-6E細胞稀釋至1.0×106細胞/ml。
在100ml FreeStyle培養基中形成轉染複合體。首先添加1mg質體DNA至該培養基，隨後添加3ml的FuGene HD轉染試劑(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)。在室溫培育轉染複合體約15分 鐘，然後添加到搖動燒瓶的細胞。轉染後24小時，添加20%(w/v)的腖TN1(OrganoTechnie S.A.,TeknieScience,QC,Canada)至最終濃度為0.5%(w/v)。進行轉染/表現4-7天，之後經由在4℃以4,000 RPM離心60分鐘收取條件培養基。
如下進行穩定的轉染及表現。vActRIIB-huIgG2-Fc細胞系是使用標準電穿孔步驟，經由表現質體pDC323-VH3-vActRIIB(E28W)-Fc2及pDC324-VH3-ActR2B(E28W)-Fc2轉染穩定的CHO宿主細胞所產生(根據Bianchi et al.Biotech and Bioengineering,Vol.84(4)：439-444(2003))。以表現質體轉染宿主細胞系後，將細胞於無血清、不含GHT之篩擇用培養基生長2-3週以篩選質體應回收細胞。篩選細胞直到他們的生存力達>85%。然後在含有150nM甲氨蝶呤(Methotrexate)之培養基培養此經轉染細胞。
細胞系選殖
根據下列步驟將篩選之細胞製作一細胞庫。選殖步驟確保所產生的選殖族群及細胞庫能在商品製造上可再現實施。播種穩定轉染之細胞增幅群於96-井平板，並於小規模研究中評估候選選殖株的生長及生產力成果。從所選之選殖株製備約60小瓶的預主細胞庫(PMCB；Pre-master cell banks)。測試全部PMCB之無菌、黴漿菌及病毒。從PMCB製備主細胞庫。
使用典型饋料批次製程將vActRIIB-Fc表現細胞系大規模化。將細胞接種到Wave生物反應器(Wave Biotech LLC)。以藥丸饋料餵食培養3次。第10天收取10L，剩餘在第11天收取；兩收取物皆進行深度過濾，隨後無菌過濾。條件培養基透過10英吋0.45/0.2微米/濾器過濾，隨後透過6英吋0.2微米/濾器過濾。
蛋白質純化
使用5 ft2 10K膜正切流動濾器(Pall)濃縮約5L之含有ActRIIB5- Fc(IgG1及IgG2二者)、ActRIIB5-Fc(IgG1及IgG2二者)及這些變異體的條件培養基。將濃縮之物質施用於5mL蛋白質A高效管柱(GE Healthcare)，該管柱已經由PBS(不含氯化鎂或氯化鈣之杜氏(Dulbecco’s))平衡過。以平衡緩衝液清洗管柱直到在280nm(OD280)的吸收少於0.1後，以0.1M甘胺酸-HCl、pH 2.7溶析結合之蛋白質，並立即以1M Tris-HCl、pH 8.5中和。將中和之溶析液濃縮至體積1ml並施用於320ml Sephacryl-200管柱(GE Healthcare)，該管柱已於PBS(不含氯化鎂或氯化鈣之杜氏(Dulbecco’s))平衡過。進行4-20% SDS PAGE凝膠(Invitrogen)以決定匯集哪一分劃。如下所示測試這些可溶性受體的活性以及凝集程度。
選擇性地，該多肽能使用例如Shp-Sepharose管柱進一步純化。使用OD280測定濃度。
實施例2
活體外活性分析
以磷酸鹽緩衝液(PBS：2.67mM氯化鉀，138mM氯化鈉，1.47mM磷酸二氫鉀，8.1mM磷酸氫二鈉，pH 7.4)稀釋如上所述純化之vActRIIB多肽樣品至0.2mg/ml，在37℃培育6天，然後施用到MALDI-MS(介質輔助雷射脫附/離子化質譜分析)、SEC及/或SEC-LS分析。蛋白質A純化步驟後，使用SEC或SEC-LS測定野生型及變異之多肽的凝集，使用下述MALDI-MS步驟確認分子的分子量。
尺寸排除色層分析法(SEC)：在具一前一後兩管柱之Agilent 1100 HPLC系統(TOSOHAAS G3000swxl,7.8 x 300mm)進行實驗。使用2xPBS作為移動相，以0.5ml/分鐘。
尺寸排除色層分析法-光散射(SEC-LS)：在具有Superdex-200凝膠過濾管柱之Agilent 1100 HPLC系統(Amersham Pharmacia,Waukesha,WI)進行實驗。然後將樣品通過Wyatt miniDawn LS雷射光 散射偵測儀及Wyatt Optilab DSP折射儀(Wyatt Technology Co.,Santa Barbara,CA)測定分子量。使用PBS作為移動相，以0.4ml/分鐘。
介質輔助雷射脫附/離子化質譜分析：樣品與芥子酸(sinapinic acid)混合(1：1)，並施用到MALDI-MS(Applied Biosystem Voyager System 2009)。使用此步驟檢查分子的分子量。
定性BIAcore ® 分析：分別以其他天然胺基酸取代E28及R40於如上所述含IgG1 Fc之融合體中。這些所製造含或不含連接子者如下表所示。來自條件培養基之每一vActRIIB-IgG1Fc樣品被塗覆在CM5表面的山羊抗-人類IgG1 Fc抗體(Jackson Immuno Research,cat# 109-005-098,lot 63550)捕捉。使用BIACore2000(BIACore Life Sciences,Piscataway,New Jersey)注射20nM的活動素A於被捕捉樣品。所得感應曲線圖對捕捉之vActRIIB-IgG1Fc變異體RL(500 RU)標準化。以示於表2之樣品作圖經標準化之結合反應(RU)。也使用如上所述獲自哺乳動物細胞表現之條件培養基，經由Biacore測量測定對活動素之相對結合親和力。使用活動素A(20nM)捕捉條件培養基中的可溶性受體，以及標準化所測量之SPR訊號。+++++：>60，++++：40-60，+++：20-40，++：10-20，+：5-10，-：<5之標準化SPR。
表1A及表1B概述相對結合數據之結果。相較於野生型，尤其是E28W(SEQ ID NO：62)、E28Y(SEQ ID NO：64)及R40G(SEQ ID NO：66)ActRIIB-IgG1Fc以較高或保留之親和力結合至活動素A。
基於C2C12細胞之活性分析：如上所述產生vActRIIB5-IgG1Fc及vActRIIB-IgG1Fc變異體。使用如下所述基於細胞之活性分析測試這些變異體抑制活動素A結合至活動素IIB受體的能力。
以pMARE-luc構築體轉染C2C12肌胚細胞(ATCC NO：CRL-1772)產生肌肉生長抑制素/活動素/GDF-11-反應報告子細胞系。pMARE-luc構築體是經由選殖代表肌肉生長抑制素/活動素反應元件(Dennler et al.EMBO 17：3091-3100(1998))之12個重複CAGA序列到pLuc-MCS報告子載體(Stratagene cat # 219087)之TATA盒子上游所製作的。C2C12細胞天然表現活動素受體IIB於其細胞表面。當肌肉生長抑制素/活動素A/GDF-11結合該細胞受體時，Smad路徑被活化以及磷酸化Smad結合至該反應元件(Macias-Silva et al.Cell 87：1215(1996))，造成蟲螢光素酶基因的表現。然後使用市售蟲螢光素酶報告子分析套組(cat # E4550,Promega,Madison,WI)，根據廠商操作手冊測量蟲螢光素酶活性。使用已以pMARE-luc(C2C12/pMARE)轉染之C2C12細胞的穩定系，根據下列步驟測量活性。將報告子細胞置於96井培養。使用稀釋之如上所述野生型及變異之ActRIIB-IgG1 Fc融合構築體與濃度固定在4nM活動素進行篩選。活動素A與數種濃度之受體預培育。經由測定所處理培養中蟲螢光素酶活性來測量活動素活性。測定每一多肽之IC50值。這些結果示於表2。採用相同步驟對如上所述製造之ActRIIB-huIgG2 Fc融合體測定肌肉生長抑制素。使用經純化之野生型及變異體蛋白質A測定肌肉生長抑制素的IC50。該多肽與4nM肌肉生長抑制素預培育。此外，使用上述步驟測定凝集程度。這些值示於以下表3。
從列於表1A之ActRIIB5-IgG1 Fc變異體組中，進一步純化5個ActRIIB-IgG1 Fc變異體(野生型及4個經設計突變株)及3個ActRIIB5-IgG1 Fc變異體(野生型及2個經設計突變株)，並經由SPR(表面電漿共振)以20nM活動素A(或4nM肌肉生長抑制素)以及基於細胞之肌肉生長抑制素結合分析法來分析。表2顯示對活動素A及肌肉生長抑制素所篩選之ActRIIB/5-IgG1 Fc變異體的SPR結合親和力及IC50值。使用純化之ActRIIB/5-Fc多肽經由Biacore測量相對之結合親和力。使用活動素A(20nM)捕捉樣品中的可溶性受體，以及標準化所測量之SPR訊號。IC50值是獲自如上所述基於細胞之肌肉生長抑制素之抑制分析。全部結果的標準誤差少於10%。
表2之變異體的胺基酸序列示於序列表。這些代表成熟的ActRIIB多肽透過連接子/融合附著於IgG1 Fc。vActRIIB-Fc、E28W(SEQ ID NO：62)。ActRIIB-Fc之E28W及E28Y變異體比野生型以高於約四倍的親和力結合至活動素A。在細胞-系活動素結合分析中測試這些變異體。vActRIIB-IgG1Fc(E28W)阻斷活動素之IC50值為2.07nM以及vActRIIB-IgG1Fc(E28Y)之IC50值為2.1nM，如表2所 示。vActRIIB-IgG1Fc之E28W及E28Y變異體是穩定的且一旦純化則不凝集。也以受體及Fc間之連接子序列評價本發明之vActRIIB-Fc變異體。為研究連接子所扮演的角色，將兩連接子Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：75)及2 x(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)(SEQ ID NO：75)插入野生型、E28A及R40A ActRIIB-Fc變異體的人類ActRIIB及人類Fc功能部位之間。評價併入這些連接子的功效，且結果包括於表1中。
也在基於肌肉生長抑制素阻斷細胞之分析中檢驗額外的變異體之IC50。這些變異體是成熟的已截頭ActRIIB多肽起點，其中成熟者之18胺基酸訊息序列以及前6個胺基酸被切開。這些序列示於表3。表3顯示蛋白質A純化後之蛋白質的凝集%，以及有關肌肉生長抑制素之IC50值。能見到相較於野生型，變異體可溶性受體的凝集%是減少的。
表4確認對應於序列表SEQ ID NO：1-99之序列。
實施例3
使用vActRIIB之活體內治療
使用成熟的已截頭vActRIIB-IgG2 Fc成熟的已截頭(E28W)(SEQ ID NO：91)進行下列所有的動物研究，使用量及步驟敘述於下。
抑制素-α缺乏小鼠之肌肉清瘦治療
抑制素-α是天然存在的活動素A抑制劑。缺乏抑制素-α之小鼠顯示顯著提升之活動素A水平於循環及罹患與自發性形成腫瘤(例如卵巢、睪丸癌症及腎上腺癌症)有關的致命性消耗症狀者(Matzuk et al., PNAS 91(19)：8817-21(1994),Cipriano et al.Endocrinology 121(7)：2319-27(2000),Matzuk et al.,Nature 360(6402)：313-9(1992))。對於下列實驗，從Charles River Laboratories取得抑制素-α踢除小鼠(C57BL/6J)。在抑制素-踢除小鼠檢驗vActRIIB-IgG2 Fc E28W(SEQ ID NO：91)(以下文中稱為E28W)對體重及肌肉量的作用。在8週齡雄抑制素-踢除小鼠進行14天單劑注射研究。在8週齡，相較於同齡野生型同窩出生之對照組小鼠，該雄抑制素-α踢除小鼠已減重超過25%體重。在第0天，對5隻踢除小鼠給予單劑皮下注射E28W(30mg/kg)，而5隻踢除小鼠皮下投與等體積PBS(運劑)。作為基線對照，在第0天，5隻年齡相當之野生型小鼠以單劑皮下注射運劑投與。在第0天、第7天及第14天對小鼠稱重。第14天結束時，犧牲全部小鼠，以及透過驗屍分析他們的精肉屍重及小腿肌肉量。經歷14天研究期，處以運劑之踢除小鼠的平均體重下降約1.1g，即從第0天22.5g至第14天21.4g。相較之下，處以E28W之踢除小鼠的平均體重顯示引人注目的增加11g，從第0天22.1g至第14天33.1g。最終驗屍分析呈現可溶性受體E28W實際上使抑制素-α踢除小鼠的精肉屍重及小腿肌肉量加兩倍，如下所示。處以E28W之踢除小鼠的平均精肉屍重約14.9g，相較於處以運劑之踢除小鼠之約8.0g，以及處以運劑之野生型對照組小鼠之約12.1g。處以E28W之踢除小鼠的平均小腿肌肉重(兩腿)為約426mg，相較於處以運劑之踢除小鼠之約定209mg，以及處以運劑之野生型對照組小鼠之約324mg。這些結果證明E28W變異體對體重流失及肌肉清瘦之疾病狀態的治療有效，並概述於下表中。
*：P<0.05對 野生型+運劑；#：P<0.05對 踢除+運劑
分別於雄性及雌性抑制素-踢除小鼠檢驗投與E28W變異體對睪丸及卵巢腫瘤形成速率之效果。於此研究中，11隻抑制素-踢除小鼠，包括8週齡雄性(n=5)及9週齡雌性(n=6)，處以單劑皮下注射可溶性受體E28W(30mg/kg)，而另11隻抑制素-踢除小鼠，包括年齡相當之(n=5)及雌性(n=6)接受單劑注射等體積PBS(運劑)。此外，11隻野生型同窩出生之對照組小鼠，包括年齡相當之(n=5)及雌性(n=6)投與單劑注射運劑。處理兩週後，犧牲小鼠並進行驗屍檢驗視覺可識別之睪丸及卵巢腫瘤的形成速率。觀察到11隻處以運劑之踢除小鼠中有10隻進展為可識別的腫瘤。詳言之，5隻雄性中有5隻以及6隻雌性中有5隻分別檢驗發現睪丸及卵巢腫瘤形成。見到這些腫瘤的大小為2-3倍大於對應之野生型對照組小鼠的正常睪丸或卵巢。此示於第3圖。只有10%(11隻有1隻)處以E28W之抑制素-α踢除小鼠顯示可見的腫瘤形成。詳言之，6隻處以E28W之踢除小鼠中有1隻進展為可識別的卵巢腫瘤；反之，相較於同齡的野生型對照組，6隻未處理之雌性踢除小鼠中有5隻有些微或沒改變卵巢大小或粗略的形態。相較於同齡的野生型對照組，5隻處以E28W之雄性踢除小鼠中有5隻顯示沒有可見的腫瘤以及些微或未改變睪丸大小或粗略的形態。這些結果證明於抑制素-踢除小鼠投與可溶性受體E28W可有效降低睪丸及卵巢腫瘤的形成，因此提議可溶性受體療法於癌症治療的臨床用途。
在雄性抑制素-踢除小鼠檢驗變異之受體於治療厭食症的效果。在此研究中，相較於同齡野生型小鼠(n=10)，抑制素-踢除小鼠(n=5)的食物消耗顯著降低。觀察到在檢驗的3週期期間，處以可溶性受體之抑制素-踢除小鼠的食物吸收顯著的增加。處以可溶性受體之踢除小鼠的平均每週食物吸收增加到稍微高於同齡野生型對照組小鼠的水準，以及比處以運劑之踢除小鼠的平均每週食物吸收大於約50%。如此，數據顯示在抑制素-α踢除小鼠中，可溶性受體治療高度 有效於改善厭食症。
分別在雄性及雌性抑制素-α踢除小鼠，檢驗可溶性受體治療對存活的效果。關於雄性，對25隻約50天齡的抑制素-α踢除小鼠投與vActRIIB-IgG2 FcE28W(SEQ ID NO：91)(10mg/kg/wk,SC)，而26隻同齡抑制素-α踢除小鼠接受運劑(PBS)。19隻同齡野生型雄性小鼠接受運劑以及使用作為基線對照組。處以運劑之踢除小鼠在研究的第15天開始垂死(大約65日齡)。實驗的第34天以前(大約84日齡)，50%處以運劑之踢除小鼠已死亡；以及第78天以前(大約128日齡)，100%此等小鼠皆死亡。相較之下，25隻處以可溶性受體E28W的踢除小鼠，或19隻處以運劑之野生型對照組小鼠沒有任一在研究的第78天以前死亡(大約128日齡)。在處以E28W之踢除小鼠中，25隻中有1隻在研究的第78天死亡(大約128日齡)以及25隻中有24隻在第100天後存活(大約150日齡)。在100天的研究期期間，沒有任一處以運劑之野生型小鼠死亡。在雌性抑制素-α踢除小鼠也得到類似的存活結果。22隻約50日齡的雌性抑制素-α踢除小鼠處以可溶性受體E28W(10mg/kg/wk,SC)，而23隻同齡雌性抑制素-α踢除小鼠處以PBS(運劑)。在這期間，17隻野生型雌性對照組小鼠處以運劑。處以運劑之雌性踢除小鼠在研究第40天開始垂死(大約90日齡)。在實驗的第58天以前(大約108日齡)，50%處以運劑之雌性踢除小鼠已死亡，以及在研究的第86天以前(約136日齡)，100%此等小鼠皆死亡。相較之下，只有約5%(22隻有1隻)處以E28W之雌性踢除小鼠已死亡，然而研究第120天後(約170日齡)約90%(22隻有20隻)存活。在120天的研究期期間，沒有任一處以運劑之野生型小鼠死亡。因此，數據顯示可溶性受體治療有效於引人注目地延長雄性及雌性抑制素-α踢除小鼠的存活。雄性及雌性踢除小鼠之存活曲線概要圖提供於第4圖。
具有結腸-26腫瘤小鼠之肌肉清瘦治療
具有結腸-26腫瘤小鼠是在研究癌症惡病質中，被廣泛使用之前臨床動物模式(Fujita et al.,Int J Cancer 68(5)：637-43(1996),Kwak et al.,Cancer Research 64(22)：8193-8(2004))。在具有腫瘤小鼠中研究可溶性受體E28W對體重改變、肌肉量及存活率的效果。以每隻小鼠0.5 x 106細胞，皮下植入結腸-26(C-26)腫瘤細胞於40隻10週齡雄性CDF1小鼠。在第0天進行腫瘤植入。腫瘤植入後第5天開始，20隻C-26小鼠每週處以皮下注射10mg/kg的vActRIIB IgG2 Fc E28W變異體(SEQ ID NO：91)，而20隻C-26小鼠處以運劑(PBS)。在此同時，10隻年齡及體重相當的正常小鼠僅處以運劑(PBS)。每週測定體重及食物吸收3次。具有腫瘤的小鼠每天視察存活情形兩次。使用雙角規形夾(Ultra-Cal IV IP65 electronic caliper,Fred V Fowler Co.Boston MA)連接個人電腦測量腫瘤大小，以及自動記錄所測值於微軟Excel數據資料工作單中。如第5圖所示，腫瘤植入兩週後，具有C-26腫瘤的小鼠進展為嚴重的惡病質並顯著損失體重。可溶性E28W受體處理，在具有腫瘤的小鼠可有效減輕體重流失。處以可溶性E28W受體之具有腫瘤小鼠的平均體重顯著高於處以運劑之具有腫瘤的小鼠(p<0.001，從腫瘤接種後第7天至第33天。未配對T test，Graph pad Software Inc.San Diego CA)。
處以可溶性E28W受體與處以運劑組之間的腫瘤大小沒有差異，此表示該治療對C-26腫瘤生長無作用。最終驗屍分析顯示處以可溶性E28W受體之具C-26腫瘤小鼠的平均精肉屍量及小腿肌肉重顯著高於處以運劑之具腫瘤小鼠(p<0.001對於精肉屍及小腿肌肉)。可溶性E28W受體對具C-26腫瘤之小鼠存活的效果示於第6圖。處以運劑之小鼠在腫瘤植入後約第14天開始垂死。腫瘤植入後第35天，20隻處以運劑之具C-26腫瘤小鼠全部死亡；然而20隻處以E28W之具C-26腫瘤小鼠中有17隻仍存活。因此，可溶性受體E28W治療使具C-26腫瘤小 鼠的存活顯著延長(p<0.0001，chi-square測試)。因此，E28W變異體可溶性受體不僅能有效維持體重及肌肉量，且能延長具C-26腫瘤小鼠的存活。
後肢懸掛小鼠之治療
使用後肢懸掛小鼠模式檢驗vActRIIB-IgG2 Fc E28W(SEQ ID NO：91)對不用狀態之肌肉量之效果。後肢懸掛步驟實質相同如先前Carlson CJ等人發表(Carlson CJ,Booth FW and Gordon SE：Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.277：R601-RR606,1999)。使用9週齡雌C57BL/6小鼠進行研究。將共60隻小鼠如下分為3組：1.處以運劑(PBS)之未懸掛基線對照組(20隻小鼠)，2.處以運劑之後肢懸掛組(20隻小鼠)，以及3.處以vActRIIB-IgG2 Fc、E28W之後肢懸掛小鼠組(20隻小鼠)。詳言之，在後肢懸掛開始之時，分別單劑皮下(SC)注射30mg/kg的vActRIIB-IgG2 Fc E28W或運劑至如上所述組別。每週縱向地測量體重變化2-3次。在下列4不同時間點：第1天、第3天、第7天及第14天，從每組犧牲5隻小鼠。透過驗屍測定小腿肌肉重。
如下表所示，後肢懸掛導致體重顯著流失多達10%。經由ANOVA測量分析，處以vActRIIB-IgG2 Fc E28W之後肢懸掛小鼠導致顯著體重增加至高於處以運劑之後肢懸掛組或未懸掛基線對照組之水平。在兩週研究期間，分別相較於處以運劑之懸浮液組下降0.2%以及未懸掛基線對照組體重增加4.8%，處以vActRIIB-IgG2 Fc E28W(SEQ ID NO：91)組的平均體重增加12.6%。時程驗屍結果顯示後肢肌肉量變化類似體重變化。處以vActRIIB-IgG2 Fc(E28W)之小鼠完全緩和肌肉流失。因此，此實驗結果顯示E28W於不用有關之肌肉萎縮是有效的。
OVX小鼠之治療
已切除卵巢之雌C57Bl6小鼠(OVX)被視為雌性性腺功能低下症及骨質疏鬆之模式。24隻雌性C57Bl6小鼠在3個月之年齡時切除卵巢並使之恢復3個月。在6個月之年齡時，經由NMR及骨質(PIXImus-GE LUNAR Corporation)測量24隻OVX小鼠以及24隻年齡相當之虛擬手術對照組C57Bl6小鼠之體重、肌肉及脂肪量的縱向變化歷經3個月治療期間。在期間終了時犧牲動物，並在最終驗屍期間收取骨組織然後接受Faxitron X-射現及microCT(Faxitron X-ray Corporation及GE Medical系統)分析。其證明E28W變異體受體(SEQ ID NO：91)在增加體重上有效，特別是淨骨骼肌量以及骨質量，但確減少小鼠的脂肪含量至未切除卵巢之小鼠所見水平。詳言之，經歷12週期間，相較於處以E28W之虛擬手術小鼠從20g增加至27.5g，相較於幾乎沒增加淨肌肉量之OVX加運劑或虛擬手術加運劑(約19g於OVX加運劑以及約20g於野生型加運劑)，處以E28W之OVX小鼠的淨肌肉量從20g增加至27.0g。於同一研究中，在12週研究結束前，相較於虛擬手術動物，處以E28W之OVX小鼠顯現降低的脂肪量，從每隻動物平均8g至每隻動物平均約4g。相較之下，處以運劑之OVX小鼠在研究的任何時間沒有流失脂肪量。最終，相較於處以運劑之OVX小鼠，處以E28W之OVX小鼠的骨質是增加的。最終驗屍期間回收解剖骨頭的股骨/脛骨BMC(骨質礦物質含量)之分析，是經由pQCT分析(Peripheral Quantitative Computed Tomography)測定。在12週研究結束時，處以 E28W之OVX小鼠增加BMC約0.045g/cm至約0.055g/cm，此與處以運劑之虛擬手術動物的最終BMC相當的。在12週研究結束時，處以運劑之OVX小鼠顯示約0.045g/cm相同的BMC。在12週研究結束時，處以E28W之野生型小鼠顯示BMC從約0.054g/cm增加至約0.065g/cm。這些研究證明E28W變異體能有效作為老化之脆弱、骨質疏鬆及肥胖的可能治療。
本發明不被限於文中所述特定具體例之範圍內，具體例是用於本發明各個方面的單一舉例說明，且功能相當之方法及成分是落在本發明之範圍內。的確，除文中所示及所述那些以外，本發明之各種修飾對熟悉該項技藝者從前面說明及伴隨之圖式應是顯而易見的。此等修飾應落於本發明主張之申請專利範圍內。
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<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
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<221> 變異體
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<221> 變異體
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<220>
<221> CDS
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<220>
<221> CDS
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<221> 變異體
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<211> 480
<212> DNA
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<220>
<221> 變異體
<222> (82)...(84)
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<220>
<221> 變異體
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<220>
<221> CDS
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<220>
<221> 變異體
<222> 28
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<220>
<221> 變異體
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<220>
<221> 變異體
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<220>
<221> CDS
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<220>
<221> 變異體
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<221> CDS
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<220>
<221> 變異體
<222> 84
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<220>
<221> 變異體
<222> 120
<223> n=a,c,t，或g
<220>
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<210> 22
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<221> CDS
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<221> CDS
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> 變異體
<222> 28
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<220>
<221> 變異體
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<210> 31
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<221> 變異體
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<221> 變異體
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<210> 33
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<220>
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<221> CDS
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<220>
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<220>
<221> CDS
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<221> 變異體
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<220>
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<221> CDS
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<220>
<221> 變異體
<222> 28
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<220>
<221> 變異體
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<221> 變異體
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<222> 28
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<220>
<221> 變異體
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<223> Xaa=任何胺基酸
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<210> 55
<211> 402
<212> DNA
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<220>
<221> 變異體
<222> 40
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<221> 變異體
<222> 64
<223> Xaa=Ala或Arg
<400> 98
<210> 99
<211> 392
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 變異體
<222> 64
<223> Xaa=Ala或Arg
<400> 99

Claims (26)

  1. 一種同二聚體，其含有包含變異之活動素IIB受體多肽(vActRIIB)之經單離蛋白質，其中該多肽係選自由下列組成之群：(a)具有SEQ ID NO：18所示多肽序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代係以選自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y之任一者取代E；(b)具有SEQ ID NO：18所示19至134胺基酸之多肽序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代係以選自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y之任一者取代E；(c)具有SEQ ID NO：18所示23至134胺基酸之多肽序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代係以選自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y之任一者取代E；(d)具有SEQ ID NO：18所示25至134胺基酸之多肽序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代係以選自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y之任一者取代E；及(e)與(a)至(d)中任一者具有至少90%相同性之多肽，其中該位置28之取代係以選自A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W及Y之任一者取代E，且其中該多肽能結合肌肉生長素、活動素A或GDF-11。
  2. 如請求項1之同二聚體，其中該位置28之取代，係以選自A、W或Y取代E。
  3. 如請求項1之同二聚體，其中該多肽與以下多肽具有至少90%之相同性：具有SEQ ID NO：18所示25至134胺基酸之胺基酸序列之 多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代係以W取代E。
  4. 如請求項3之同二聚體，其中該多肽與以下多肽具有至少95%之相同性：具有SEQ ID NO：18所示25至134胺基酸之胺基酸序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代係以W取代E。
  5. 如請求項4之同二聚體，其中該多肽與以下多肽具有至少99%之相同性：具有SEQ ID NO：18所示25至134胺基酸之胺基酸序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代係以W取代E。
  6. 如請求項1之同二聚體，其中該多肽融合至至少一異質多肽。
  7. 如請求項6之同二聚體，其中該異質多肽為人類抗體Fc功能部位。
  8. 如請求項7之同二聚體，其中該多肽係經由連接子融合至至少一異質多肽。
  9. 如請求項8之同二聚體，其中該連接子包含SEQ ID NO：79所示胺基酸序列，且該異質多肽包含SEQ ID NO：80所示胺基酸序列。
  10. 如請求項1之同二聚體，其中該多肽與以下多肽具有至少95%之相同性：具有SEQ ID NO：18所示25至134胺基酸之胺基酸序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代為以W取代E；且其中該經分離之蛋白質包含經由連接子融合至一異質多肽之多肽，其中該連接子包含SEQ ID NO：79所示胺基酸序列，且其中該異質多肽包含SEQ ID NO：80所示胺基酸序列。
  11. 如請求項1之同二聚體，其中該多肽與以下多肽具有至少99%之相同性：具有SEQ ID NO：18所示25至134胺基酸之胺基酸序列之多肽，但其位置28具單一胺基酸取代，其中該取代為以W取代 E；且其中該經分離之蛋白質係由經由連接子融合至一異質多肽之多肽所組成，其中該連接子包含SEQ ID NO：79所示胺基酸序列，且其中該異質多肽包含SEQ ID NO：80所示胺基酸序列。
  12. 一種醫藥組合物，其含有有效量之如請求項1至11中任一項之同二聚體及醫藥上可接受載劑。
  13. 一種經單離之核酸分子，其包含編碼如請求項1至11中任一項之同二聚體之多核苷酸。
  14. 一種重組表現載體，其包含如請求項13之核酸分子。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項14之載體。
  16. 一種製備如請求項1至11中任一項之同二聚體之方法，其包括培養如請求項15之宿主細胞以表現該二聚體。
  17. 一種如請求項1至11中任一項之同二聚體之用途，其係用於製備在有此治療需要之患者抑制肌肉生長素用之藥劑。
  18. 一種如請求項1至11中任一項之同二聚體之用途，其係用於製備在有此治療需要之患者增加淨肌肉量或增加淨肌肉量對脂肪之比例用之藥劑。
  19. 一種如請求項1至11中任一項之同二聚體之用途，其係用於製備在有此治療需要之患者治療肌肉清瘦疾病或失調用之藥劑。
  20. 如請求項19之同二聚體之用途，其中該肌肉清瘦疾病或失調是選自由以下組成之群之病症或由其所致：肌肉萎縮症、肌萎縮性脊髓側索硬化、阻塞性肺部疾病、慢性心衰竭、癌症惡病質、AIDS、起因於腎衰竭之惡病質、尿毒症、起因於類風濕性關節炎之惡病質、老年人肌力流失、器官萎縮、腕道症候群、雄性素剝奪(androgen deprivation)、起因於燒傷之惡病質、糖尿病腎病變、以及由於長期臥床、脊髓鍵肌損傷、中風、骨折、老化或暴露在微重力造成之肌肉清瘦。
  21. 一種如請求項1至11中任一項之同二聚體之用途，其係用於製備在有此治療需要之患者治療代謝失調用之藥劑。
  22. 如請求項21之用途，其中該代謝失調係選自糖尿病、肥胖、高血糖症及骨質流失。
  23. 一種如請求項1至11中任一項之同二聚體之用途，其係用於製備在有此治療需要之患者治療活動素過度表現之疾病用之藥劑。
  24. 如請求項23之用途，其中該疾病是癌症。
  25. 如請求項24之用途，其中該癌症是卵巢癌。
  26. 一種如請求項14之載體之用途，其係用於製備在有此治療需要之患者治療肌肉清瘦失調或代謝失調用之藥劑，其中該載體能於患者體中主導vActRIIB多肽表現。
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