KR20030066695A - 베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화된 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 뇌 속에 있는 Aβ의 아밀로이드 퇴적물과 관련된 개선된 질환의 치료제 및 치료 방법을 제공한다. 바람직한 제제는 인간화된 항체를 포함한다.

Description

베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화된 항체{HUMANIZED ANTIBODIES THAT RECOGNIZE BETA AMYLOID PEPTIDE}

알츠하이머병(AD)은 노인성 치매를 초래하는 진행성 질환이다. 개괄적인 내용은 Selkoe의 문헌[TINS 16:403 (1993)]; Hardy 등의 WO 92/13069; Selkoe의 문헌[J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994)]; Duff 등의 문헌[Nature 373:476 (1995)]; Games 등의 문헌[Nature 373:523 (1995)]을 참조하라. 이 질환은 크게 두가지의 카테고리, 즉 고령(65세 이상)에서 발병하는 후발성 질환과 노년기 이전, 즉 35∼60세에 발병하는 조발성 질환으로 나뉜다. 두가지 유형의 질환 모두에서 병상은 동일하지만, 더 젊은 연령에서 발병이 시작된 경우에 비정상성이 더 심각하고 더 만연하는 경향이 있다. 이 질환은 뇌에 적어도 2가지 유형의 병변, 즉 신경 섬유의 얽힘(neurofibrillary tangle)과 노인성 플라크가 있는 것이 특징이다. 신경 섬유의 얽힘은 서로 둘레에 꼬여서 쌍을 이루는 2개의 필라멘트로 구성된 tau 단백질과 결합된 미소관의 세포내 퇴적물이다. 노인성 플라크(즉, 아밀로이드 플라크)는 중심에 세포외 아밀로이드 퇴적물이 있는 가로 150 ㎛ 이하의 질서가 파괴된 신경섬유망 영역으로서, 이는 뇌 조직 절편의 현미경 분석에 의해 관찰된다. 뇌 속의 아밀로이드 플라크의 축적은 다운증후군과 기타 인지 장애와도 관련이 있다.

플라크의 주 구성성분은 Aβ또는 β-아밀로이드 펩티드라 불리는 펩티드이다. Aβ펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이라 불리는 더 큰 경막 당단백질의 39-43개 아미노산으로 이루어진 4-kDa 내부 단편이다. 서로 다른 분비 효소에 의한 APP의 단백질 분해 프로세싱의 결과로 Aβ는 두가지 형태, 즉 아미노산 40개길이의 단형과 아미노산 42-43개 길이의 장형으로 주로 발견된다. APP의 소수성 경막 도메인의 일부는 Aβ의 카르복시 말단에서 관찰되며, 이는 특히 장형의 경우에는 Aβ가 플라크로 응집될 수 있도록 하는 작용을 한다. 뇌에 아밀로이드 플라크가 축적되면 결국 신경 세포의 사멸이 초래된다. 이러한 유형의 신경 퇴화와 관련된 물리적 증상이 알츠하이머병의 특징이다.

APP 단백질 내에 존재하는 몇가지의 돌연변이와 알츠하이머병의 상호연관성이 밝혀졌다. 이에 대해서는, 예컨대 Goate 등의 문헌[Nature 349:704 (1991) (발린⁷¹⁷→ 이소루신)]; Chartier Harlan 등의 문헌[Nature 353:844 (1991) (발린⁷¹⁷→글리신)]; Murrell 등의 문헌[Science 254:97 (1991) (발린⁷¹⁷→페닐알라닌)];Mullan 등의 문헌[Nature Genet. 1:345 (1992) (리신⁵⁹⁵-메티오닌⁵⁹⁶→아스파라긴⁵⁹⁵-루신⁵⁹⁶으로 변화하는 이중 돌연변이)]을 참조하라. 이러한 돌연변이는 APP에서 Aβ로의 증가된 또는 변형된 프로세싱, 특히 APP에서 증가된 양의 장형의 Aβ로의 프로세싱(즉, Aβ1-42 및 Aβ1-43)에 의해 알츠하이머병을 유발하는 것으로 생각된다. 프레세닐린 유전자인 PS1 및 PS2와 같은 다른 유전자에 발생하는 돌연변이는 APP의 프로세싱에 간접적으로 영향을 주어 장형 Aβ의 양을 증가시키는 것으로 생각된다(Hardy의 문헌[TINS 20: 154 (1997)] 참조).

마우스 모델은 알츠하이머병의 아밀로이드 플라크의 심각성을 입증하는 데 성공적으로 사용되어 왔다(Games 등의 상기 문헌, Johnson-Wood 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550 (1997)]). 특히, PDAPP 트랜스제닉 마우스(인간 APP의 돌연변이 형태를 발현하여 어린 나이에 알츠하이머병이 발병한다)에 장형 Aβ를 주사할 경우, 이 마우스는 알츠하이머병의 진행의 감소와 Aβ펩티드에 대한 항체 역가의 증가를 동시에 나타낸다(Schenk 등의 문헌[Nature 400, 173 (1999)]). 상기 관찰은 Aβ, 특히 장형 Aβ가 알츠하이머병의 원인이라는 것을 암시한다.

McMichael은 EP 526,511에서 이미 AD가 발병된 환자에게 동종 요법의 양의 Aβ(10^-2mg/일 이하)를 투여할 것을 제안한다. 혈장의 양이 약 5 리터인 보통 사람의 경우 이러한 투여량의 상한치를 투여해도 2 pg/㎖ 이하의 농도를 나타낼 것으로 예상된다. 인간 혈장 내의 정상 Aβ농도는 일반적으로 50∼200 pg/㎖이다(Seubert 등의 문헌[Nature 359:325 (1992)]). EP 526,511에서 제안된 투여량은 내생 순환 Aβ의 농도를 겨우 변화시키고, EP 526,511은 면역자극제로서 보조제(adjuvant)를 사용할 것을 권장하지 않기 때문에, 이로부터 어떠한 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 보이지 않는다.

따라서, 알츠하이머병의 치료를 위한 새로운 치료법과 제제, 특히 생리적(예컨대, 비독성) 용량으로 치료 효과를 나타낼 수 있는 치료법과 제제가 요구되는 실정이다.

발명의 개요

본 발명은 신규한 면역 제제, 특히 아밀로이드생성 질환(예컨대, 알츠하이머병)의 예방 및 치료를 위한 치료적 항체 제제를 특징으로 한다. 본 발명은 적어도 부분적으로 Aβ펩티드에 특이적으로 결합하고, 플라크 존재량을 감소시키고/시키거나 아밀로이드생성 질환과 관련된 신경돌기 영양장애를 감소시키는 데 효과적인 2종의 모노클로날 항체를 확인하고 그 특징을 규명한 것을 기초로 한다. 이러한 항체의 구조 및 기능의 분석은 다양한 인간화된 항체를 예방용 및/또는 치료용으로 디자인할 수 있게 한다. 특히, 본 발명은 이러한 항체의 가변 영역을 인간화한 것에 그 특징이 있으며, 따라서 본 발명의 항체의 인간화된 면역글로불린 또는 항체 사슬, 완전한 인간화된 면역글로불린 또는 항체, 및 기능성 면역글로불린 또는 항체 단편, 특히 항체 결합 단편을 제공한다.

본원에서는 또한 본 발명의 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역을 포함하는 폴리펩티드에 대해서도 개시하며, 상기 폴리펩티드를 암호화하기에 적합한 폴리뉴클레오티드 제제, 벡터 및 숙주에 대해서도 개시한다.

아밀로이드생성 질환 또는 장애(예컨대, 알츠하이머병)의 치료 방법에 대해서도 개시하며, 이러한 용도에 사용하기 위한 약학 조성물 및 키트에 대해서도 개시한다.

치료제로서 사용될 때, 개선된 결합 친화력 및/또는 감소된 면역원성을 나타내는 인간화된 항체를 디자인하는 데 있어서, 적절한 면역 기능에 중요한 본 발명의 모노클로날 항체 내의 잔기를 확인하고, 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 방법에 대해서도 개시한다.

관련 출원

본 출원은 발명의 명칭이 "베타-아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화된 항체"인 선행 출원인 가명세서 특허 출원 U.S. 일련 번호 60/251,892(2000년 12월 6일에 출원됨)의 이익을 주장한다. 상기 관련 출원의 전체 내용을 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용한다.

도 1은 마우스 3D6, 인간화된 3D6, Kabat ID 109230 및 생식세포계 A19 항체의 경쇄의 아미노산 서열의 정렬도를 도시한 것이다. CDR 영역은 화살표로 표시하였다. 진한 이탤릭체는 빈도가 낮은 쥐의 잔기를 나타낸다. 진한 글씨는 패킹(VH + VL) 잔기를 나타낸다. 검게 칠한 부분은 카논형(canonical)/CDR 상호작용 잔기를 나타낸다. 별표는 인간화된 3D6 제1형(3D6v1)에서 역돌연변이에 대해 선택된 잔기를 나타낸다.

도 2는 마우스 3D6, 인간화된 3D6, Kabat ID 045919 및 생식세포계 VH3-23 항체의 중쇄의 아미노산 서열의 정렬도를 도시한 것이다. 주석은 도 1에서와 동일하다.

도 3은 3D6, 키메라 3D6 및 10D5의 Aβ결합 특성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 3a는 키메라 3D6(PK1614)에 대한 Aβ의 결합 특성을 쥐 3D6에 대한 결합 특성과 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 3b는 비오틴화 3D6 대 비표지 3D6, PK1614 및10D5의 Aβ에 대한 결합에 있어서의 경쟁을 나타낸 그래프이다.

도 4는 α-탄소 골격도를 보여주는 3D6 VH 및 VL의 상동성 모델을 도시한 것이다. VH는 점선으로 표시하였고, VL은 실선으로 표시하였다. CDR 영역은 리본형으로 표시하였다.

도 5는 키메라 3D6 및 인간화된 3D6의 Aβ결합 특성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 5A는 응집된 Aβ에 대한 인간화된 3D6v1 및 키메라 3D6의 결합을 측정한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 도 5B는 응집된 Aβ에 대한 인간화된 3D6v1 및 인간화된 3D6v2의 결합을 측정한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 PDAPP 마우스의 뇌 절편에서 취한 Aβ플라크에 대한 인간화된 3D6 및 키메라 3D6의 결합을 정량한 그래프이다.

도 7은 인간화된 3D6 제1형 및 제2형, 키메라 3D6, 쥐 3D6, 및 10D5가 Aβ에 대한 결합에 대하여 쥐 3D6와 경쟁하는 능력을 테스트한 경쟁적 결합 분석의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 인간화된 3D6v2, 키메라 3D6 및 인간 IgG가 소교 세포에 의한 Aβ의 업테이크를 매개하는 능력을 테스트한 생체외 식작용 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 10D5 VL 및 3D6 VL 아미노산 서열의 정렬도를 나타낸 것이다. 진한 글씨는 10D5에 정확하게 일치하는 잔기를 나타낸다.

도 10은 10D5 VH 및 3D6 VH 아미노산 서열의 정렬도를 나타낸 것이다. 진한 글씨는 10D5에 정확하게 일치하는 잔기를 나타낸다.

본 발명은 알츠하이머병 또는 다른 아밀로이드생성 질환의 예방 또는 치료를 위한 신규한 면역 제제 및 방법을 특징으로 한다. 본 발명은, 적어도 부분적으로는, 베타 아밀로이드 단백질(Aβ)에 결합하는 데 효과적이고(예컨대, 가용성 및/또는 응집형의 Aβ에 결합하는 데 효과적이고), (예컨대, 응집형 Aβ의) 식작용을 매개하는 데 효과적이고, (예컨대, 환자의) 플라크 존재량 및/또는 신경돌기 영양장애를 감소시키는 데 효과적인 2종의 모노클로날 면역글로불린, 즉 3D6 및 10D5의 특징을 규명한 것을 기초로 한 것이다. 본 발명은 또한 상기 면역글로불린의 가변 경쇄 및 중쇄의 1차 및 2차 구조의 결정 및 구조적 특성화와 활성 및 면역원성에 중요한 잔기의 확인을 기초로 한다.

면역글로불린은 본원에서 기술한 바람직한 모노클로날 면역글로불린의 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 면역글로불린, 예컨대 치료적 면역글로불린은 인간화된 가변 경쇄 및/또는 인간화된 가변 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄는 모노클로날 면역글로불린(예컨대, 공여체 면역글로불린) 유래의 상보성 결정 영역(CDR)과 실질적으로 인간 수용체(acceptor) 면역글로불린으로부터 유래된 가변 프레임워크 영역을 포함한다. "실질적으로 인간 수용체 면역글로불린으로부터 유래된"이란 어구는 대부분 또는 주된 프레임워크 잔기가 인간 수용체 서열로부터 유래된 것이며, 하지만 인간화된 면역글로불린의 활성을 개선시키기 위해(예컨대, 공여체 면역글로불린의 활성을 더 유사하게 모방하도록 활성을 변화시키기 위해) 또는 인간화된 면역글로불린의 면역원성을 감소시키기 위해 선택된 잔기로 특정 부위에서 잔기의 치환이 허용되는 것을 말한다.

한 구체예에서, 본 발명은 3D6 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고(즉, 서열 번호 2에 개시된 경쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하거나, 또는 서열 번호 4에 개시된 중쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고), 실질적으로 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 유래된 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, 상기 프레임워크 잔기 중 1개 이상은 상응하는 쥐의 잔기로 역돌연변이되며, 이때 상기 역돌연변이는 사슬이 Aβ결합을 유도하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 3D6 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고(즉, 서열 번호 2에 개시된 경쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하거나, 또는 서열 번호 4에 개시된 중쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고), 실질적으로 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 유래된 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, 하나 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되며, 이때 프레임워크 잔기는 (a) 항원에 직접 비공유결합하는 잔기; (b) CDR에 인접한 잔기; (c) CDR-상호작용 잔기(예컨대, 상동성의 공지된 면역글로불린 사슬의 규명된 구조 상에 경쇄 또는 중쇄를 모델링함으로써 확인함); 및 (d) VL-VH 계면에 관여하는 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는중쇄를 특징으로 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 3D6 가변 영역 CDR 및 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, 하나 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되며, 이때 프레임워크 잔기는 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의해 확인되는 바와 같이 경쇄 가변 영역 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기, 예컨대 구조 모델의 표면 상에 있는, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위에 가까이 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR 잔기에서 6 Å 이내에 있는 잔기, 카논형 잔기, 버니어(vernier) 구역 잔기, 사슬간 패킹 잔기, 드문 잔기, 또는 글리코실화 부위 잔기인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 3D6 가변 영역 CDR(예컨대, 서열 번호 2에 개시된 3D6 경쇄 가변 영역 서열 유래)을 포함하고, 인간 수용체 면역글로불린 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, L1, L2, L36 및 L46(Kabat 넘버링 방식)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프레임워크 잔기가 마우스 3D6 경쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄를 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 3D6 가변 영역 CDR(예컨대, 서열 번호 4에 개시된 3D6 중쇄 가변 영역 서열 유래)을 포함하고, 인간 수용체 면역글로불린 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, H49, H93 및 H94(Kabat 넘버링 방식)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프레임워크 잔기가 마우스 3D6 경쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄를 특징으로 한다.

바람직한 경쇄는 아형 카파 II(Kabat 방식)의 카파 II 프레임워크 영역, 예컨대 수용체 면역글로불린 Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 및 Kabat ID U41645 유래의 프레임워크 영역을 포함한다. 바람직한 중쇄는 아형 III(Kabat 방식)의 프레임워크 영역, 예컨대 수용체 면역글로불린 Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 및 Kabat ID M23691 유래의 프레임워크 영역을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 10D5 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고(즉, 서열 번호 14에 개시된 경쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하거나, 또는 서열 번호 16에 개시된 중쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고), 실질적으로 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 유래된 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, 상기 프레임워크 잔기 중 1개 이상은 상응하는 쥐의 잔기로 역돌연변이되며, 이때 상기 역돌연변이는 사슬이 Aβ결합을 유도하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 10D5 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고(즉, 서열 번호 14에 개시된 경쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고/하거나, 서열 번호 16에 개시된 중쇄 가변 영역 서열 유래의 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고), 실질적으로 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열에서 유래된 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, 하나 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되며, 이때 프레임워크 잔기는 (a) 항원에 직접 비공유결합하는 잔기; (b) CDR에 인접한 잔기; (c) CDR-상호작용 잔기(예컨대, 상동성의 공지된 면역글로불린 쇄의 규명된 구조 상에 경쇄 또는 중쇄를 모델링함으로써 확인함); 및 (d) VL-VH 계면에 관여하는 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 10D5 가변 영역 CDR 및 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하되, 단, 하나 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 10D5 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되며, 이때 프레임워크 잔기는 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의해 확인되는 바와 같은 경쇄 가변 영역 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기, 예컨대 구조 모델의 표면 상에 있는 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위에 가까이 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR 잔기에서 6 Å 이내에 있는 잔기, 카논형 잔기, 버니어 구역 잔기, 사슬간 패킹 잔기, 드문 잔기, 또는 글리코실화 부위 잔기인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 특징으로 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 치환 외에도 하나 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기의 치환을 특징으로 한다. 예를 들어, 빈도가 낮은 잔기는 그 위치에서 인간 가변 사슬 서열의 경우에 일반적으로 나타나는 아미노산 잔기로치환될 수 있다. 또는, 빈도가 낮은 잔기는 상동성 생식세포계 가변 사슬 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다(예컨대, 빈도가 낮은 경쇄 프레임워크 잔기는 A1, A17, A18, A2, 또는 A19 생식세포계 면역글로불린 서열 유래의 상응하는 생식세포계 잔기로 치환될 수 있거나, 또는 빈도가 낮은 중쇄 프레임워크 잔기는 VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 또는 VH3-11 생식세포계 면역글로불린 서열 유래의 상응하는 생식세포계 잔기로 치환될 수 있다).

또 다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 경쇄 및 중쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린, 또는 상기 면역글로불린의 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 대표적인 구체예에서, 인간화된 면역글로불린은 10⁷M^-1, 10⁸M^-1, 또는 10⁹M^-1이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 결합한다(예컨대, 특이적으로 결합한다). 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 이소타입 γ1을 갖는 중쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 가용성 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 및 응집된 Aβ에 모두 결합한다(예컨대, 특이적으로 결합한다). 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)의 식작용을 매개한다(예컨대, 식작용을 유도한다). 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 피험체의 혈뇌 장벽을 관통한다. 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 피험체의 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 존재량과 신경돌기 영양장애 둘다를 감소시킨다.

다른 구체예에서, 본 발명은 3D6 가변 영역(예컨대, 서열 번호 2 또는 서열번호 4에 개시된 가변 영역 서열)을 포함하는 키메라 면역글로불린을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 8에 개시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 5에 개시된 가변 경쇄 영역을 포함하는 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 12에 개시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 11에 개시된 가변 경쇄 영역을 포함하는 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 10D5 가변 영역(예컨대, 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 개시된 가변 영역 서열)을 포함하는 키메라 면역글로불린을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 면역글로불린, 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1 유래의 불변 영역을 더 포함한다.

본원에 개시된 면역글로불린은 아밀로이드생성 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 치료 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 한 구체예에서, 이 방법은 본원에 개시된 인간화된 면역글로불린의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 아밀로이드생성 질환(예컨대, 알츠하이머병)을 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 본원에 개시된 인간화된 면역글로불린 및 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 또한, 본원에 개시된 면역글로불린 단편 또는 사슬을 제조하기 위한 분리된 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포뿐만 아니라, 상기 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 사슬을 제조하기 위한 방법을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 인간화 3D6 또는 10D5 면역글로불린을 각각 제조할 때 치환될 수 있는 3D6 또는 10D5 잔기를 확인하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 치환될 수 있는 가변 프레임워크 영역 잔기를 확인하는 방법은 규명된 상동성 면역글로불린 구조 상에 3D6 또는 10D5 가변 영역의 3차 구조를 모델링하는 단계 및 3D6 또는 10D5 면역글로불린 가변 영역의 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기에 대해 상기 모델을 분석하여 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 3D6 면역글로불린, 3D6 면역글로불린 사슬, 또는 이의 도메인의 3차원 상을 생성하는 데 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 가변 영역 서열을 사용하는 용도를 특징으로 한다. 또한, 10D5 면역글로불린, 10D5 면역글로불린 사슬, 또는 이의 도메인의 3차원 상을 생성하는 데 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 개시된 가변 영역 서열을 사용하는 용도를 특징으로 한다.

본 발명을 설명하기에 앞서, 이하에 사용되는 특정 용어들의 정의를 설명하는 것이 이해를 도울 것이다.

"면역글로불린" 또는 "항체"(본원에서 서로 같은 의미로 사용됨)란 용어는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성된 기본적인 4개 폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 항원-결합 단백질을 말한다. 이때 상기 사슬은, 예컨대 사슬간 이황화 결합에 의해 안정화되는데, 이로써 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖게 된다. 경쇄와 중쇄 모두 도메인으로 폴딩된다. "도메인"이란 용어는, 예컨대 β-플리티드 시트 및/또는 사슬간 이황화 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프를 포함하는(예컨대, 3∼4개의 펩티드 루프를 포함함) 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구형 영역을 말한다. 도메인은 또한 "불변" 도메인의 경우에는 다양한 클래스 구성원으로 이루어진 도메인 내에서 서열 변형이 상대적으로 적은 것을 토대로, "가변" 도메인의 경우에는 다양한클래스 구성원으로 이루어진 도메인 내에서 변형이 많은 것을 토대로 "불변" 또는 "가변" 도메인으로 칭해진다. 경쇄 상의 "불변" 도메인은 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인과 같은 의미로 사용된다. 중쇄 상의 "불변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인과 같은 의미로 사용된다. 경쇄 상의 "가변" 도메인은 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인과 같은 의미로 사용된다. 중쇄 상의 "가변" 영역은 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인과 같은 의미로 사용된다.

"영역"이란 항체 사슬의 일부분(part 또는 portion)을 의미하는 것으로, 본원에 정의된 불변 또는 가변 도메인뿐만 아니라 상기 도메인의 분리된 더 많은 부분들을 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 도메인 또는 영역은 본원에서 정의하는 바와 같이 "프레임워크 영역", 즉 "FR"에 산재된 "상보성 결정 영역", 즉 "CDR"을 포함한다.

면역글로불린 또는 항체는 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있다. "항원 결합 단편"이란 용어는 항원에 결합하거나 또는 완전한 항체와 항원 결합(즉, 특이적 결합)에 대해 경쟁하는(즉, 이것이 유래된 완전한 항체와 결합하는) 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 말한다. "구조(conformation)"란 용어는 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, 항체, 항체 사슬, 이의 도메인 또는 영역)의 3차 구조를 말한다. 예를 들어, "경(또는 중)쇄 구조"란 경(또는 중)쇄 가변 영역의 3차 구조를 말하고, "항체 구조" 또는 "항체 단편 구조"란 항체 또는 이의 단편의 3차구조를 말한다.

항체의 "특이적 결합"이란 항체가 항원 또는 바람직한 에피토프에 대해 감지할 수 있는 친화력을 나타내며, 바람직하게는 유의적인 교차반응성을 나타내지 않는 것을 말한다. "감지할 수 있는" 또는 바람직한 결합은 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹M^-1, 또는 10¹⁰M^-1이상의 친화력을 갖는 결합을 포함한다. 10⁷M^-1이상, 바람직하게는 10⁸M^-1이상의 친화력이 보다 바람직하다. 본원에 개시된 값들의 중간 값 역시 본 발명의 범위에 속하는 것이며, 바람직한 결합 친화력은, 예컨대 10⁶∼10¹⁰M^-1, 바람직하게는 10⁷∼10¹⁰M^-1, 보다 바람직하게는 10⁸∼10¹⁰M^-1의 친화력 범위로서 나타낼 수 있다. "유의적인 교차 반응성을 나타내지 않는" 항체는 바람직하지 않은 실체(예컨대, 바람직하지 않은 단백질성 실체)에 감지할 수 있을 정도로 결합하지 않는 것이다. 예를 들어, Aβ에 특이적으로 결합하는 항체는 Aβ에 유의적으로 결합할 것이나, 비-Aβ단백질 또는 펩티드(예컨대, 플라크에 포함된 비-Aβ단백질 또는 펩티드)와 유의적으로 반응하지 않을 것이다. 바람직한 에피토프에 대해 특이적인 항체는, 예컨대 동일한 단백질 또는 펩티드 상의 멀리 떨어져 있는 에피토프와 유의적으로 교차 반응하지 않을 것이다. 특이적 결합은 이러한 결합을 측정하기 위한 당업계에 공지된 임의의 수단에 따라서 측정할 수 있다. 바람직하게는 특이적 결합은 스캐챠드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석에 따라서 측정한다.

바람직한 단편은 DNA 기법에 의해, 또는 완전한 면역글로불린의 효소적 또는화학적 분해에 의해 제조한다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, Fv, 단일 사슬, 및 단일 사슬 항체를 포함한다. "이중 특이적(bispecific)" 또는 "이작용성" 면역글로불린 또는 항체 외에도, 면역글로불린 또는 항체는 동일한 각각의 결합 부위를 갖는 것으로 이해된다. "이중 특이적" 또는 "이작용성 항체"는 2가지의 상이한 중쇄/경쇄 사슬 쌍과 2가지의 상이한 결합 부위를 갖는 인공적인 하이브리드 항체이다. 이중 특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 이에 대해서는 Songsivilai & Lachmann의 문헌[Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)]; Kostelny 등의 문헌[J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조하라.

"인간화된 면역글로불린" 또는 "인간화 항체"란 용어는 하나 이상의 인간화된 면역글로불린 또는 항체 사슬(즉, 하나 이상의 인간화된 경쇄 또는 중쇄)을 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 말한다. "인간화된 면역글로불린 사슬" 또는 "인간화된 항체 사슬"(즉, "인간화된 면역글로불린 경쇄" 또는 "인간화된 면역글로불린 중쇄")는 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 가변 프레임워크 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역(CDR)(예컨대, 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 2개의 CDR, 보다 바람직하게는 3개의 CDR)을 포함하는 가변 영역을 갖고, 추가로 불변 영역(경쇄의 경우에는 하나 이상의 불변 영역 또는 이의 부분, 중쇄의 경우에는 바람직하게는 3개 이상의 불변 영역)을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 사슬(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)을 말한다. "인간화된 가변 영역"(예컨대, "인간화된 경쇄 가변 영역" 또는 "인간화된 중쇄 가변 영역")은 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 가변 프레임워크 영역과 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 말한다.

"실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된" 또는 "실질적으로 인간의"란 어구는 비교를 목적으로 인간 면역글로불린 또는 항체 아미노산 서열에 대해 정렬하였을 때 그 영역이 인간 프레임워크 또는 불변 영역 서열과 80-90% 이상, 바람직하게는 90-95% 이상, 보다 바람직하게는 95-99% 이상의 동일성(즉, 국부적 서열 동일성)으로 서열을 공유하여, 예컨대 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 생식세포계 치환, 역돌연변이 등이 일어날 수 있음을 의미한다. 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 생식세포계 치환, 역돌연변이 등의 도입은 종종 인간화된 항체 또는 사슬의 "최적화"로 불린다. "실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된" 또는 "실질적으로 비-인간의"란 어구는 비-인간 생물체, 예컨대 비-인간 포유동물의 서열과의 상동성이 80-95% 이상, 바람직하게는 90-95% 이상, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상인 면역글로불린 또는 항체 서열을 갖는다는 것을 의미한다.

따라서, 인간화된 면역글로불린 또는 항체, 또는 인간화된 면역글로불린 또는 항체 사슬의 모든 영역 또는 잔기는, 가능한 한 CDR을 제외하고, 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. "상응하는 영역" 또는 "상응하는 잔기"란 비교를 위해 제1 서열과 제2 서열을 최적으로 정렬하였을 때 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상의 영역 또는 잔기와 동일한(즉, 대등한) 위치를 차지하는 제2의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상의 영역 또는 잔기를 말한다.

"인간화된 면역글로불린" 또는 "인간화된 항체"는 후술하는 바와 같이 키메라 면역글로불린 또는 항체를 포함하는 것은 아니다. 인간화된 면역글로불린 또는 항체가 그 구조에 있어서 키메라일지라도(즉, 한 종류 이상의 단백질로부터 유래된 영역을 포함할지라도), 이들은 본원에서 정의하는 바와 같이 키메라 면역글로불린 또는 항체에서는 발견되지 않는 추가 특징(즉, 공여체 CDR 잔기 및 수용체 프레임워크 잔기를 포함하는 가변 영역)을 포함한다.

"유의적인 동일성"이란 용어는 디폴트 갭 가중치를 이용하는 프로그램인 GAP 또는 BESTFIT 등을 이용하여 최적으로 정렬했을 때 두개의 폴리펩티드 서열이 50-60% 이상, 바람직하게는 60-70% 이상, 보다 바람직하게는 70-80%, 보다 바람직하게는 80-90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90-95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상(예컨대, 99% 이상의 서열 동일성)의 서열 동일성으로 서열을 공유한다는 것을 의미한다. "실질적인 동일성"이란 용어는 디폴트 갭 가중치를 이용하는 프로그램인 GAP 또는 BESTFIT 등을 이용하여 최적으로 정렬했을 때 두개의 폴리펩티드 서열이 80-90% 이상, 바람직하게는 90-95%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성(예컨대, 99% 이상의 서열 동일성)으로 서열을 공유한다는 것을 의미한다. 서열 비교의 경우, 일반적으로 한 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이 서열에 대해 테스트 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때 테스트 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 서열 좌표를 지정한 후, 필요에 따라 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 그 후 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기초로 하여 기준 서열에 대한 테스트 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. "서열 동일성"과 "서열 상동성"은 같은 의미로 사용된다.

서열 비교를 위한 최적 정렬은 Smith & Waterman의 문헌[Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부적 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch의 문헌[J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman의 문헌[ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법에 의해서, 이러한 알고리즘의 전산화된 수행에 의해서(미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 Dr. 575 소재의 유전학 컴퓨터 그룹의 유전학 소프트웨어 패키지 중 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 시각적 조사에 의해서(일반적으로 Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology] 참조) 수행할 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘 중 한 예가 BLAST 알고리즘이며, 이에 대해서는 Altschul 등의 문헌[J. Mol. Biol. 215:403 (1990)]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수할 수 있다(국립보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 공개적 입수 가능). 통상적으로, 디폴트 프로그램 매개변수를 이용하여 서열 비교를 수행하지만, 통상적인 매개변수를 이용할 수도 있다. 아미노산 서열의 경우 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이(W) = 3, 기대값(E) = 10, 및 BLOSUM62 득점 행렬을 이용한다(Henikoff & Henikoff의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)] 참조).

동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해서 상이한 것이 바람직하다. 아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적 치환으로 분류하기 위해서, 아미노산을 다음과 같이 분류한다: I 그룹(소수성 측쇄), leu, met, ala, val, leu, ile; II 그룹(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; III 그룹(산성 측쇄): asp, glu; IV 그룹(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; V 그룹(사슬 배향에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 VI 그룹(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 같은 부류에 속하는 아미노산간의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 치환하는 것으로 구성된다.

바람직하게는, 인간화된 면역글로불린 또는 항체는 상응하는 비-인간 항체의 친화력의 3배, 4배 또는 5배의 범위에 속하는 친화력으로 항원에 결합한다. 예를 들어, 비-인간 항체가 10⁹M^-1의 결합 친화력을 갖는다면, 인간화된 항체는 3 x 10⁹M^-1, 4 x 10⁹M^-1또는 10⁹M^-1이상의 결합 친화력을 갖게 될 것이다. 면역글로불린 또는 항체 사슬의 결합 특성을 설명할 때, 사슬은 "항원(예컨대, Aβ) 결합을 유도하는" 능력을 기준으로 설명할 수 있다. 사슬이 완전한 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)에 특이적 결합 특성 또는 결합 친화력을 부여할 때 이 사슬은 "항원 결합을 유도한다"고 말한다. 돌연변이(예컨대, 역돌연변이)는 이 돌연변이가 없는 대등한 사슬을 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)와 비교하여 적어도 1배 이상 정도로 상기 사슬을 포함하는 완전한 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화력에 영향을 준다면(예컨대, 감소시킨다면) 항원 결합을 유도하는 중쇄 또는 경쇄의 능력에 실질적으로 영향을 준다고 말할 수 있다. 돌연변이가 이 돌연변이가 없는 대등한 사슬을 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)보다 2배, 3배 또는 4배로, 상기 사슬을 포함하는 완전한 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화력에 영향을 준다면(예컨대, 감소시킨다면) 이 돌연변이는 "항원 결합을 유도하는 사슬의 능력에 실질적으로 영향을 주지(예컨대, 감소시키지) 않는 것"이다.

"키메라 면역글로불린" 또는 항체란 용어는 그 경쇄 및 중쇄가 상이한 종에서 유래된 것인 면역글로불린 또는 항체를 말한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 분절로부터 유전공학으로 제작할 수있다.

"항원"이란 항체가 특이적으로 결합하는 실체(예컨대, 단백질성 실체 또는 펩티드)를 말한다.

"에피토프" 또는 "항원성 결정인자"란 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 말한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출시에 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리시 소실된다. 에피토프는 일반적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상의 아미노산을 독특한 공간적 구조로 포함한다. 에피토프의 공간구조를 결정하는 방법으로는, 예컨대 x-선 회절법과 2차원 핵 자기 공명법이 있다. 예컨대 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조하라.

동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역 분석법, 즉 경쟁적 결합 분석을 통해 확인할 수 있다. 경쟁적 결합은 테스트하는 면역글로불린이 공통의 항원(예컨대, Aβ)에 대해 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석을 통해 측정된다. 여러 유형의 경쟁적 결합 분석이 공지되어 있으며, 그 예로는 고체상 직접 또는 간접 방사선 면역분석법(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석법(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(Stahli 등의 문헌[Methods in Enzymology 9:242 (1983)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Kirkland 등의 문헌[J. Immunol. 137:3614 (1986)] 참조); 고체상 직접 표지 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(Harlow 및 Lane의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); I-125 표지를 이용하는 고체상 직접 표지 RIA(Morel 등의 문헌[Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung 등의 문헌[Virology 176:546 (1990)] 참조); 및 직접 표지 RIA(Moldenhauer 등의 문헌[Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)] 참조)가 있다. 일반적으로, 이러한 분석은 비표지 테스트 면역글로불린과 표지된 기준 면역글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원을 이용하는 것을 포함한다. 경쟁적 억제는 테스트 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을결정하여 측정한다. 통상 테스트 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로 경쟁 항체가 과량으로 존재할 경우, 이 항체는 공통의 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 이상 억제한다.

에피토프는 면역 세포, 예컨대 B 세포 및/또는 T 세포에 의해서도 인식된다. 에피토프의 세포 인식은 항원 의존적 증식을³H-티미딘 혼입, 사이토카인 분비, 항체 분비, 또는 항원 의존적 사멸(세포독성 T 림프구 분석)을 통해 측정하는, 시험관내 분석에 의해 측정될 수 있다.

대표적인 에피토프 또는 항원성 결정인자는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 내에서 확인할 수 있지만, 바람직하게는 APP의 Aβ펩티드 내에서 확인된다. APP의 다수의 이소타입이 존재하는데, 예컨대 APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹및 APP⁷⁷⁰이 있다. APP 내의 아미노산에는 APP⁷⁷⁰이소형의 서열에 따라 번호를 할당한다(예컨대 GenBank 등록 번호 P05067 참조, 서열 번호 38에도 개시). Aβ(본원에서는 베타 아밀로이드 펩티드 및 A-베타로도 칭함) 펩티드는 APP의 39-43개 아미노산(Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43)으로 이루어진 ∼4 kDa 내부 단편이다. 예컨대 Aβ40은 APP의 잔기 672-711로 구성되며, Aβ42는 APP의 잔기 673-713로 구성된다. 생체내(in vivo 또는 in situ)에서의 상이한 분비효소에 의한 APP의 단백질 분해 프로세싱의 결과로서 Aβ는 40개 아미노산 길이의 "단형"과 42-43개 아미노산 길이의 "장형"으로 관찰된다. 본원에서 설명하는 바람직한 에피토프 또는 항원성 결정인자는 Aβ펩티드의 N-말단 내에 위치하고, Aβ의 아미노산 1-10 내의 잔기를 포함하며, 바람직하게는 Aβ42의 잔기 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 또는 3-7를 포함한다. 또 다른 에피토프 또는 항원성 결정인자로는 Aβ의 잔기 2-4, 5, 6, 7 또는 8, Aβ의 3-5, 6, 7, 8 또는 9, 또는 Aβ42의 잔기 4-7, 8, 9 또는 10을 포함한다.

"아밀로이드생성 질환"이란 용어는 불용성 아밀로이드 섬유의 형성 또는 퇴적과 관련이 있는(또는 그것이 원인이 되는) 임의의 질환을 포함한다. 아밀로이드질환의 비제한적인 예로는 전신 아밀로이드증, 알츠하이머병, 성인 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매, 프라이언 관련 전염성 해면상 뇌질환(인간에서는 쿠루 및 크로츠펠트-야콥병으로, 양과 소에서는 각각 스크레이피와 BSE로 발병함)을 들 수 있다. 퇴적된 미소섬유의 폴리펩티드 성분의 성질에 의해 여러 종류의 아밀로이드생성 질환이 정의 또는 규명된다. 예를 들어 알츠하이머병에 걸린 대상이나 환자에서는 β-아밀로이드 단백질(예컨대, 야생형, 변종, 또는 절두형 β-아밀로이드 단백질)이 아밀로이드 퇴적의 특징적인 폴리펩티드 성분이다. 따라서, 알츠하이머병은, 예컨대 피험체나 환자의 뇌 속의 "Aβ의 퇴적을 특징으로 하는 질환" 또는 "Aβ의 퇴적과 관련이 있는 질환"의 한 예가 된다. "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ펩티드"는 본원에서 서로 같은 의미로 사용된다.

"유효량" 또는 "유효 투여량"이란 용어는 원하는 효과를 얻거나, 또는 적어도 부분적으로 원하는 효과를 얻는 데 충분한 양으로 정의된다. "치료적 유효량"이란 이미 질병을 앓고 있는 환자에서 그 질병과 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 저지시키기에 충분한 양으로서 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은감염의 심각도와 환자 자신의 면역계의 전체적인 상태에 좌우된다.

"환자"란 용어는 예방 또는 치료적 처치를 받는 인간과 기타 포유동물 피험체를 포함한다.

"가용성" 또는 "해리된" Aβ란 비응집형 또는 분해된 Aβ폴리펩티드를 말한다. "불용성" Aβ는 응집형 Aβ폴리펩티드, 예컨대 비공유 결합에 의해 함께 결합된 Aβ를 말한다. Aβ(예컨대, Aβ42)는, 적어도 부분적으로는, 펩티드의 C-말단에 소수성 잔기(APP의 경막 도메인의 일부)가 있음으로 인해 응집되는 것으로 생각된다. 가용성 Aβ를 준비하는 한 방법은 순수한 DMSO 중에서 동결건조된 펩티드를 초음파 처리에 의해 용해시키는 것이다. 이렇게 형성된 용액을 원심분리하여 임의의 불용성 미립자를 제거한다.

I. 면역제 및 치료제

본 발명의 면역제 및 치료제는 본원에서 정의되는 면역원 또는 항체, 또는 이의 기능성 단편 또는 항원 결합성 단편을 포함하거나, 또는 이것으로 구성되어 있다. 기본적인 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 두개의 동일한 폴리펩티드 사슬의 쌍으로 이루어지며, 각 쌍은 한개의 "경쇄"(약 25 kDa)와 한개의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 보유한다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식에 있어서 주된 기능을 하는 약 100∼110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단 부분은 이펙터 기능에 있어서 주된 역할을 하는 불변 영역을 한정한다.

경쇄는 카파 또는 람다로 분류되며, 길이가 약 230개 잔기이다. 중쇄는감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 또는 엡실론(ε)으로 분류되며, 길이가 약 450-600개 잔기이며, 항체의 이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 결정한다. 중쇄 및 경쇄는 도메인으로 폴딩된다. "도메인"이란 용어는 단백질, 예컨대 면역글로불린 또는 항체의 구형 영역을 말한다. 면역글로불린 또는 항체 도메인으로는, 예컨대 β-플리티드 시트와 사슬간 이황화 결합에 의해 안정화된 3개 또는 4개의 펩티드 루프를 들 수 있다. 완전한 경쇄는, 예컨대 2개의 도메인(V_L및 C_L)을 포함하고, 완전한 중쇄는, 예컨대 4개 또는 5개의 도메인(V_H, C_H1, C_H2, 및 C_H3)을 포함한다.

경쇄와 중쇄 내에서는 가변 영역과 불변 영역이 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄 역시 약 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 포함한다(개괄적 내용은 문헌[Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), Ch. 7] 참조, 본원에서 그 전문을 참고 문헌으로 인용함).

각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 완전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중 특이적 항체를 제외하고는 2개의 결합 부위는 동일하다. 사슬은 모두 3개의 고가변성 영역(상보성 결정 영역, 즉 CDR이라고도 부름)에 의해 결합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)으로 이루어진 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 자연 발생적 사슬 또는 재조합에 의해 제조된 사슬을 리더 서열과 함께 발현시키면 세포내 프로세싱 과정에서 리더 서열이 제거되어 성숙 사슬을 생성할 수 있다. 성숙 사슬은 또한 자연 발생적 리더 서열을 갖도록 재조합에 의해 제조하여, 예컨대 분비를 증강시키거나, 또는 관심있는 특정한 사슬의 프로세싱을 변화시킬 수 있다.

각 쌍의 2개의 성숙 사슬의 CDR은 특이적 에피토프에의 결합을 가능하게 하는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N-말단에서 C-말단에 이르기까지 경쇄 및 중쇄 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 당분야에서는 "FR4"를 가변 중쇄의 D/J 영역과 가변 경쇄의 J 영역으로 부르기도 한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)]에 의한 Kabat의 정의에 따라 실시한다. 또 다른 구조 정의 방법은 Chothia 등의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]; [Nature 342:878 (1989)]; 및 [J. Mol. Biol. 186:651 (1989)]에 제안되어 있다(이하, 총체적으로 Chothia 등의 문헌이라 칭함, 이 문헌들은 본원에서 그 전문을 참고 문헌으로 인용함).

A. Aβ항체

본 발명의 치료제는 Aβ또는 아밀로이드 플라크의 다른 성분에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 이러한 항체 중 일부는 Aβ의 가용성 형태에 결합하지 않고 응집형에만 특이적으로 결합한다. 일부는 응집형에 결합하지 않고 가용성 형태에만 특이적으로 결합한다. 일부는 응집형과 가용성 형태 모두에 결합한다. 이러한 항체 중 일부는 자연 발생적 단형 Aβ(즉, Aβ39, 40 또는 41)에 결합하며, 자연 발생적 장형 Aβ(즉, Aβ42및 Aβ43)에는 결합하지 않는다. 일부 항체는 Aβ의 단형에는 결합하지 않고, 장형에만 결합한다. 일부 항체는 전길이 아밀로이드 전구체 단백질에는 결합하지 않고 Aβ에만 결합한다. 치료 방법에 사용되는 항체는 완전한 불변 영역을 포함하거나, 또는 불변 영역이 Fc 수용체와 상호작용하는 데 충분한 것이 바람직하다. 인간 이소타입 IgG1은 인간 이소타입 중에서 식세포 상의 FcRI 수용체에 대해 최대의 친화력을 갖기 때문에 바람직하다. 항체의 한쪽 암(arm)은 Aβ에 대해 특이성을 갖고, 다른 쪽 암은 Fc 수용체에 대해 특이성을 갖는 이중 특이적 Fab 단편 역시 사용될 수 있다. 바람직한 항체는 약 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 또는 10¹⁰M^-1(이들 값의 중간 값의 친화력 포함) 이상의 결합 친화력으로 Aβ에 결합한다.

폴리클로날 혈청은 일반적으로 Aβ의 길이에 따른 몇가지의 에피토프에 결합하는 항체들의 혼합물을 포함한다. 그러나, 폴리클로날 혈청은 Aβ의 특정 분절, 예컨대 Aβ1-10에 특이적일 수 있다. 모노클로날 항체는 구조적 또는 비구조적 에피토프일 수 있는 Aβ내의 특정 에피토프에 결합한다. 항체의 예방 및 치료 효능은 실시예에서 설명하는 트랜스제닉 동물 모델을 이용하여 테스트할 수 있다. 바람직한 모노클로날 항체는 Aβ의 잔기 1-10 내의 에피토프(천연 Aβ의 첫번째 N 말단 잔기를 1로 표시)에 결합한다. 몇 종류의 바람직한 모노클로날 항체는 아미노산 1-5 내의 에피토프에 결합하며, 몇 종류는 5-10 내의 에피토프에 결합한다. 일부 바람직한 항체는 아미노산 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 또는 3-7 내의 에피토프에 결합한다. 일부 바람직한 항체는 Aβ의 잔기 1-3에서 시작하여 잔기 7-11로 끝나는 에피토프에 결합한다. Aβ의 잔기 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30, 또는 10-25 내의 에피토프에 결합하는 항체는 별로 바람직하지 않다. 이러한 항체들은 사용 전에 실시예에서 설명하는 마우스 모델에서 활성에 대해 스크리닝하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 잔기 10-18, 16-24, 18-21 및 33-42 내의 에피토프에 대한 특정 항체는 활성이 부족한 것으로(즉, 플라크 존재량을 감소시키는 능력 및/또는 알츠하이머병과 관련된 신경돌기 이상을 치료하는 능력이 부족한 것으로) 확인되었다. 몇가지 방법에서는, 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 여러 종류의 모노클로날 항체를 사용한다. 이러한 항체들은 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. Aβ외의 아밀로이드 성분에 대한 항체 역시 사용(예컨대, 투여 또는 동시 투여)될 수 있다. 예를 들어, 항체는 아밀로이드 관련 단백질인 시뉴클레인에 대한 것일 수 있다.

항체가 특정 잔기, 예컨대 Aβ1-5 내의 에피토프에 결합한다고 할 경우, 이는 이 항체가 특정한 잔기(즉, 한 예로서 이 경우 Aβ1-5)를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 이러한 항체는 Aβ1-5 내의 모든 잔기와 반드시 접촉할 필요는 없다. Aβ1-5 내에서의 모든 단일 아미노산 치환 또는 결실이 결합 친화력에 유의적인 영향을 주지는 않는다. 항체의 에피토프 특이성은, 예컨대 서로 다른 구성원이 Aβ의 서로 다른 부분서열을 나타내는 파지 디스플레이 라이브러리를 형성하여 측정할 수 있다. 그 후 파지 라이브러리를 테스트 대상 항체에 특이적으로 결합하는 구성원에 대해 선별한다. 서열 군을 분리한다. 일반적으로, 이러한 서열 군은 서로 다른 구성원에서 공통의 코어 서열과 다양한 길이의 측접한 서열을 포함한다. 항체에 대한 특이적 결합을 나타내는 가장 짧은 코어 서열이 항체에 의해 결합된 에피토프를 한정한다. 에피토프 특이성이 이미 결정된 항체를 사용하는 경쟁 분석을 통해 항체를 에피토프 특이성에 대해 테스트할 수도 있다. 예를 들어, Aβ에 대해 3D6 항체와 경쟁하는 항체는 3D6와 동일하거나 또는 유사한 에피토프, 즉 잔기 Aβ1-5 내의 에피토프에 결합한다. 유사하게, 10D5 항체와 경쟁하는 항체는 동일하거나 또는 유사한 에피토프, 즉 잔기 Aβ3-7 내의 에피토프에 결합한다. 에피토프 특이성에 대한 항체의 스크리닝은 치료 효능의 유용한 예측 수단이 된다. 예를 들어, Aβ의 잔기 1-7 내의 에피토프에 결합하는 것으로 확인된 항체는 본 발명의 방법에 따른 알츠하이머병의 예방 및 치료에 유효할 것으로 생각된다.

Aβ의 다른 영역에 결합하지 않고 Aβ의 바람직한 분절에 특이적으로 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 다른 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 완전한 Aβ에 폴리클로날 혈청에 비해 많은 이점을 갖는다. 첫째, 동일한 용량의 투여량에서, 바람직한 분절에 특이적으로 결합하는 항체의 투여량은 아밀로이드 플라크를 제거하는(clearing) 데 효과적인 항체를 더 많은 몰량으로 함유한다. 둘째, 바람직한 분절에 특이적으로 결합하는 항체는 완전한 APP 폴리펩티드에 대한 제거 반응은 유도하지 않으면서 아밀로이드 퇴적물에 대한 제거 반응을 유도할 수 있기 때문에 부작용 발생 위험을 감소시킨다.

1. 비-인간 항체의 생산

본 발명은 비-인간 항체, 예컨대 본 발명의 바람직한 Aβ에피토프에 대한 특이성을 보유하는 항체를 특징으로 한다. 이러한 항체들은 본 발명의 다양한 치료 조성물을 조제하는 데 사용될 수 있으며, 바람직하게는 인간화된 항체 또는 키메라 항체(아래에서 상세히 설명함)의 제조를 위한 상보성 결정 영역을 제공한다. 비-인간 모노클로날 항체, 예컨대 쥐, 기니 피그, 영장류, 토끼 또는 래트의 모노클로날 항체는, 예컨대 Aβ로 동물을 면역화하여 생산할 수 있다. Aβ또는 Aβ의 면역원성 단편을 포함하는 더 긴 폴리펩티드 또는 Aβ에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체 역시 사용할 수 있다. 이에 대해서는 Harlow & Lane의 상기 문헌을 참조할 수 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고 문헌으로 인용한다. 이러한 면역원은 천연 공급원으로부터, 펩티드 합성 또는 재조합 발현에 의해 얻을 수 있다. 선택적으로 면역원은 후술하는 바와 같이 캐리어 단백질과 융합 또는 다른 방식으로 복합체화된 상태로 투여될 수 있다. 선택적으로 면역원은 보조제와 함께 투여될 수 있다. "보조제(adjuvant)"란 항원과 함께 투여될 경우 항원에 대한 면역 반응을 증강시키며, 단독으로 투여될 경우에는 항원에 대한 면역 반응을 유발시키지 못하는 화합물을 말한다. 보조제는 림프구 보충, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 비롯한 몇가지 메카니즘에 의해 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 몇가지 종류의 보조제를 후술하는 바와 같이 사용할 수 있다. 실험 동물의 면역화에 있어서는 완전 프로인트 보조제를 투여한 후 불완전 보조제를 투여하는 것이 바람직하다.

폴리클로날 항체를 생산하는 데에는 통상적으로 토끼 또는 기니 피그를 사용한다. 예컨대 수동적 보호를 위한 폴리클로날 항체의 대표적인 제조 방법은 다음과 같이 수행할 수 있다. 125 마리의 비-트랜스제닉 마우스를 Aβ1-42 + CFA/IFA 보조제 100 ㎍로 면역화시키고, 4∼5개월 후 안락사시킨다. 면역화된 마우스로부터 혈액을 채취한다. 다른 혈액 성분들로부터 IgG를 분리한다. 친화성 크로마토그래피에 의해 면역원에 특이적인 항체를 부분적으로 정제할 수 있다. 마우스 1 마리당 평균 약 0.5∼1 mg의 면역원-특이적 항체를 얻었으며, 총량은 60∼120 mg이었다.

모노클로날 항체를 제조하는 데에는 통상 마우스를 사용한다. 모노클로날 항체는, Aβ의 단편 또는 장형을 마우스에 주사하고, 하이브리도마를 제조한 후 Aβ에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 하이브리도마를 스크리닝함으로써 단편에 대한 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 선택적으로, Aβ의 특이적 영역 또는 원하는 단편에만 결합하고 Aβ의 다른 비중첩 단편에는 결합하지 않는 항체를 스크리닝할 수 있다. 후자의 스크리닝법은 Aβ펩티드의 결실 돌연변이의 집합체에 대한 항체를 결합 능력을 측정하고, 결실 돌연변이가 항체에 결합하는지를 확인함으로써 수행할 수 있다. 결합은, 예컨대 웨스턴 블롯이나 ELISA로 평가할 수 있다. 항체에 대한 특이적 결합을 나타내는 가장 작은 단편이 항체의 에피토프를 정의한다. 대안으로, 에피토프 특이성은 경쟁 분석에 의해 측정할 수 있는데, 이 분석에서는 테스트 항체와 기준 항체가 Aβ에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 테스트 항체와 기준 항체가 경쟁할 경우, 이들은 동일한 에피토프나 충분히 가까이 있는 에피토프에 결합하여 한 항체가 다른 항체의 결합을 방해하게 된다. 이러한 항체에 대한 바람직한 이소타입은 마우스 이소타입 IgG2a 또는 다른 종에서의 대등한 이소타입이다. 마우스 이소타입 IgG2a는 인간 이소타입 IgG1의 등가물이다.

2. 키메라 항체 및 인간화된 항체

본 발명은 또한 베타 아밀로이드 펩티드에 특이적인 키메라 및/또는 인간화된 항체(즉, 키메라 및/또는 인간화된 면역글로불린)를 특징으로 한다. 키메라 및/또는 인간화된 항체는 키메라 또는 인간화된 항체의 제조를 위한 출발 물질을 제공하는 마우스 또는 기타 비-인간 항체와 동일한 또는 유사한 결합 특이성 및 친화력을 보유한다.

A. 키메라 항체의 생산

"키메라 항체"란 용어는 그 경쇄 및 중쇄 유전자가 서로 다른 종에 속하는 면역글로불린 유전자 분절로부터, 통상 유전공학에 의해 작제된 항체를 말한다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체 유래의 유전자의 가변(V) 분절을 인간 불변(C) 분절, 예컨대 IgG1 및 IgG4에 연결시킬 수 있다. 인간 이소타입 IgG1이 바람직하다. 따라서, 통상적인 키메라 항체는 마우스 항체 유래의 V 또는 항원 결합 도메인과 인간 항체 유래의 C 또는 이펙터 도메인으로 구성된 하이브리드 단백질이다.

B. 인간화된 항체의 생산

"인간화된 항체"란 용어는 실질적으로 인간 항체 사슬로부터 유래된 가변 영역 프레임워크를 포함하는 하나 이상의 사슬(수용체 면역글로불린 또는 항체로 칭함)과 실질적으로 마우스 항체로부터 유래된 하나 이상의 상보성 결정 영역(공여체 면역글로불린 또는 항체로 칭함)을 포함하는 항체를 말한다. Queen 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)], US 5,530,101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,762, Selick 등의 WO 90/07861, 및 Winter의 US 5,225,539를 참조하라. 이 문헌들은 그 전문을 본원에서 참고 문헌으로 인용한다. 존재한다면, 불변 영역(들) 역시 실질적으로 또는 전체적으로 인간 면역글로불린으로부터 유래된 것이다.

마우스 CDR을 인간 가변 도메인 프레임워크로 치환하는 것은 인간 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 유래된 마우스 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 구조를 채택한다면 그 정확한 구조적 배향을 유지하게 될 가능성이 크다. 이는 프레임워크 서열이 CDR이 유래된 마우스의 가변 프레임워크 도메인과 고도의 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터 유래된 인간 가변 도메인을 얻음으로써 이루어진다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열에서 유래된 것일 수 있다. 인간 항체 서열은 자연 발생적 인간 항체의 서열일 수 있거나, 또는 몇가지 인간 항체의 컨센서스 서열일 수 있다. Kettleborough 등의 문헌[Protein Engineering 4:773 (1991)]; Kolbinger 등의 문헌[Protein Engineering 6:971 (1993)] 및 Carter 등 WO 92/22653를 참조하라.

마우스 공여체 면역글로불린과 적절한 인간 수용체 면역글로불린의 상보성 결정 영역을 확인하고 나면, 다음 단계는, 존재한다면, 이들 성분으로부터 유래된 어느 잔기가 최종의 인간화된 항체의 특성을 최적화하도록 치환되어야 하느냐를 결정하는 것이다. 일반적으로 마우스에 인간 아미노산 잔기를 치환하는 정도는 최소로 하여야 하는데, 그 이유는 쥐의 잔기를 도입하는 것이 항체가 인간에서 인간-항-마우스-항체(HAMA) 반응을 유발할 위험을 증가시키기 때문이다. 특정 환자에서 또는 임상 시험 중에 HAMA 반응을 모니터하기 위해 면역 반응을 확인하기 위한 당업계에 공지된 방법을 수행할 수 있다. 인간화된 항체를 투여한 환자에게 상기 요법의 투여 시작시와 그 전과정에서 면역원성 평가를 실시할 수 있다. HAMA 반응은, 예컨대 표면 플라스몬 공명 기법(BIACORE) 및/또는 고체상 ELISA 분석을 비롯한 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 환자로부터 얻은 혈청 샘플 중에서 인간화된 치료제에 대한 항체를 검출함으로써 측정한다.

인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터 유래된 특정 아미노산을 CDR 구조 및/또는 항원에 대한 결합에 영향을 줄 가능성을 기초로 하여 치환 여부를 선택한다. 인간 가변 프레임워크 영역과 쥐 CDR 영역의 비천연 병치는 비천연 구조적 제약을 초래할 수 있으며, 이는 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 교정되지 않는다면, 결합 친화력을 감소시킬 수 있다.

부분적으로는 컴퓨터 모델링을 통해 치환 대상의 아미노산 잔기를 선택할 수 있다. 면역글로불린 분자의 3차원 상을 형성하기 위한 컴퓨트 하드웨어와 소프트웨어에 대해서 본원에서 설명한다. 일반적으로, 분자 모델은 면역글로불린 사슬 또는 그 도메인에 대한 규명된 구조로부터 출발하여 제작된다. 모델링할 사슬을 규명된 3차원 구조의 사슬 또는 도메인과 아미노산 서열 유사성에 대해 비교하고, 최대의 서열 유사성을 나타내는 사슬(들) 또는 도메인(들)을 분자 모델의 제작을 위한 출발 지점으로서 선택한다. 50% 이상, 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 사슬 또는 도메인을 모델링을 위해 선택한다. 규명된 출발 구조를 변형시켜서 면역글로불린 사슬 또는 도메인 내의 실제 아미노산과 출발 구조의 아미노산간의 차이가 모델링되도록 한다. 그 후 변형된 구조를 복합 면역글로불린으로 어셈블링한다. 마지막으로, 에너지를 최소화시키고, 모든 원자가 서로 적절한간격 내에 존재하는지와 결합 길이 및 각이 화학적으로 적절한 한계 내에 존재하는지를 검증함으로써 모델을 개량한다.

치환을 위한 아미노산 잔기의 선택 역시, 부분적으로는, 특정 위치의 아미노산의 특성을 조사하거나, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이 유발의 효과를 실험적으로 관찰함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 쥐의 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간의 가변 영역 프레임워크 잔기간에 아미노산이 다를 경우, 인간 프레임워크 잔기는, 그 아미노산이

(1) 항원에 직접 비공유적으로 결합하고,

(2) CDR 영역에 인접해 있고.

(3) CDR 영역과 다른 방식으로 상호작용하고(예컨대, 컴퓨터 모델링에 의해 측정시 CDR 영역에서 약 3∼6 Å 이내에 위치하고)

(4) VL-VH 계면에 관여할 것으로 당연히 예측된다면, 일반적으로 마우스 항체로부터 유래된 대등한 프레임워크 아미노산으로 치환되어야 한다.

"항원에 직접 비공유적으로 결합하는" 잔기는 확립된 화학적 힘, 예컨대 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 등에 의해 항원 상의 아미노산과 직접적으로 상호작용할 가능성이 큰, 프레임워크 영역 내 위치의 아미노산을 포함한다.

CDR 및 프레임워크 영역은 Kabat 등의 상기 문헌 또는 Chothia 등의 상기 문헌에 정의된 바와 같다. Kabat 등의 상기 문헌에 정의된 바와 같이 프레임워크 잔기가 Chothia 등의 상기 문헌에 정의된 바와 같은 구조적 루프 잔기를 구성할 경우, 마우스 항체 내에 존재하는 아미노산은 인간화된 항체로의 치환을 위해 선택될수 있다. "CDR 영역에 인접한" 잔기는 인간화된 면역글로불린 사슬의 1차 서열에서 CDR 중 하나 이상에 바로 인접한 위치의 아미노산 잔기를 포함하며, 예를 들어 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR에 바로 인접한 위치 또는 Chothia에 의해 정의된 바와 같은 CDR에 바로 인접한 위치에 있는 아미노산 잔기를 포함한다(예컨대 Chothia 및 Lesk의 문헌[JMB 196:901 (1987)] 참조). 이러한 아미노산은 특히 CDR 내의 아미노산과 상호작용할 가능성이 있으며, 수용체로부터 선택될 경우, 공여체의 CDR을 왜곡시키고 친화력을 감소시킬 가능성이 있다. 뿐만 아니라, 인접한 아미노산은 항원과 직접 상호작용할 수 있으며(Amit 등의 문헌[Science, 233:747 (1986) 참조, 본원에서 참고 문헌으로 인용함), 공여체로부터 이들 아미노산을 선택하는 것은 모든 항원 접촉이 원래의 항체에 친화력을 제공하도록 유지하기에 바람직할 수 있다.

"CDR 영역과 다른 방식으로 상호작용하는" 잔기는 2차 구조 분석에 의해 공간적 배향이 CDR 영역에 영향을 주기에 충분한 것으로 확인된 잔기들을 포함한다. 한 구체예에서, "CDR 영역과 다른 방식으로 상호작용하는" 잔기는 공여체 면역글로불린의 3차원 모델(예컨대, 컴퓨터 생성 모델)을 분석하여 확인한다. 원래의 공여체 항체에 있어서 일반적인 3차원 모델에서는 CDR 외부의 특정 아미노산은 CDR에 가까이 있고, 수소 결합, 반데르발스힘, 소수성 상호작용 등에 의해 CDR 내의 아미노산과 상호작용할 가능성이 크다는 것을 나타낸다. 그러한 아미노산 위치에서는 수용체 면역글로불린 아미노산보다는 공여체 면역글로불린 아미노산이 선택될 수 있다. 이러한 기준에 따른 아미노산은 일반적으로 CDR 내의 일부 원자에서 약 3 옴스트롱 단위(Å) 이내에 측쇄를 보유하며, 전술한 바와 같은 확립된 화학적 힘에 따라 CDR 원자와 상호작용할 수 있는 원자를 보유해야 한다.

수소 결합을 형성할 수 있는 원자의 경우, 그 핵 사이의 거리가 3 Å으로 측정되지만, 결합을 형성하지 않는 원자의 경우에는 반데르발스 표면간의 거리가 3 Å로 측정된다. 따라서, 후자의 경우, 상호작용할 수 있는 것으로 간주되는 원자에 대해서는 핵이 약 6 Å(3 Å + 반데르발스 반경의 합)내에 위치하여야 한다. 다수의 경우, 핵은 4 또는 5 또는 6 Å 떨어져 위치한다. 한 아미노산이 CDR과 상호작용할 수 있는지를 결정하는 데 있어서, 중쇄 CDR2의 마지막 8개의 아미노산은 CDR의 일부로 간주하지 않는 것이 바람직한데, 그 이유는 구조적인 측면에서 이들 8개 아미노산은 프레임워크의 일부로서 더 가깝게 작용하기 때문이다.

CDR 내의 아미노산과 상호작용할 수 있는 아미노산은 또 다른 방식으로 확인할 수 있다. 각 프레임워크 아미노산의 용매가 접근할 수 있는 표면적은 두가지 방식으로, 즉 (1) 완전한 항체에서, 그리고 (2) CDR이 제거된 항체로 구성된 가상 분자에서 계산한다. 이들 수간의 유의적인 차이가 약 10 Ų이상인 것은 용매에 대한 프레임워크 아미노산의 접근이 CDR에 의해 적어도 부분적으로 차단되며, 따라서 아미노산은 CDR과 접촉하고 있음을 나타낸다. 용매가 접근가능한 아미노산의 표면적은 당업계에 공지된 알고리즘을 이용하여 항체의 3차원 모델을 기초로 계산할 수 있다(예컨대, Connolly의 문헌[J. Appl. Cryst. 16:548 (1983)] 및 Lee 및 Richards의 문헌[J. Mol. Biol. 55:379 (1971)] 참조, 상기 두 문헌은 본원에서 참고 문헌으로 인용함). 프레임워크 아미노산은 종종 CDR과 접촉하게 되는 다른 프레임워크 아미노산의 구조에 영향을 줌으로써 CDR과 간접적으로 상호작용할 수도 있다.

프레임워크 내의 몇몇 위치에서의 아미노산은 다수의 항체의 CDR과 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다(Chothia 및 Lesk의 상기 문헌, Chothia 등의 상기 문헌, Tramontano 등의 문헌[J. Mol. Biol. 215:175 (1990)], 이들 문헌은 모두 본원에서 참고 문헌으로 인용함). 그 중에서도, 경쇄의 2, 48, 64 및 71 위치의 아미노산과 중쇄의 26-30, 71 및 94 위치(Kabat의 방식에 따라 넘버링)의 아미노산이 다수의 항체에서 CDR과 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 경쇄의 35 위치에 있는 아미노산과 중쇄의 93 및 103 위치에 있는 아미노산 역시 CDR과 상호작용할 수 있다. 상기한 모든 위치에서, 수용체 아미노산보다는 공여체 아미노산(다를 경우)이 인간화된 면역글로불린에 존재하도록 선택하는 것이 바람직하다. 반면에, CDR 영역과 상호작용할 수 있는 특정 잔기, 예컨대 경쇄의 처음 5개 아미노산은 종종 인간화된 면역글로불린의 친화력을 감소시키지 않고 수용체 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다.

"VL-VH 계면에 관여하는" 잔기 또는 "패킹 잔기"로는, 예컨대 Novotny 및 Haber의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985)] 또는 Chothia 등의 상기 문헌에 정의된 바와 같은 VL과 VH 사이의 계면에 있는 잔기를 포함한다. 일반적으로 드문 패킹 잔기는 이들이 인간 프레임워크에 존재하는 것과 다르다면, 인간화된 항체 내에 보유되어야 한다.

일반적으로, 상기 기준을 충족시키는 아미노산 중 하나 이상이 치환된다. 몇몇 구체예에서는 상기 기준을 충족시키는 모든 아미노산 또는 대부분의 아미노산을 치환한다. 경우에 따라, 특정 아미노산이 상기 기준을 충족시키는지가 다소 모호할 경우가 있으며, 이 경우에는 대안의 변형 면역글로불린을 제조하는데, 그 중 하나는 특정 치환을 갖게 하고, 다른 하나는 치환시키지 않는다. 그렇게 제조된 대안의 변형 면역글로불린을 원하는 활성에 대해 본원에서 기술한 분석법 중 임의의 것을 이용하여 테스트한 다음 바람직한 면역글로불린을 선택할 수 있다.

통상 인간화된 항체 내의 CDR 영역은 실질적으로 동일하며, 보다 일반적으로는 공여체 항체의 상응하는 CDR 영역과 동일하다. 늘 바람직한 것은 아니지만, 때때로 최종 인간화된 면역글로불린의 결합 친화력에 감지할 수 있는 영향을 주지 않고 CDR 잔기를 하나 이상의 보존적 아미노산으로 치환할 수도 있다. 보존적 치환으로는 gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr과 같은 조합이 고려된다.

또 다른 치환 대상으로는 인간 면역글로불린의 경우 그 위치에서 드문, 즉 "빈도가 낮은" 수용체 인간 프레임워크 아미노산이다. 이들 아미노산을 마우스 공여체 항체의 대등한 위치로부터의 아미노산 또는 보다 일반적인 인간 면역글로불린의 대등한 위치로부터의 아미노산으로 치환할 수 있다. 예를 들어, 수용체 면역글로불린의 인간 프레임워크 영역 내의 아미노산이 그 위치에 있어서 빈도가 낮고, 공여체 면역글로불린에서의 상응하는 아미노산이 인간 면역글로불린 서열 내의 그 위치에 대해 일반적인 경우; 또는 수용체 면역글로불린 내의 아미노산이 그 위치에 대해 빈도가 낮고, 공여체 면역글로불린 내의 상응하는 아미노산 역시 다른 인간 서열에 비해 빈도가 낮은 경우 치환이 바람직할 수 있다. 이러한 기준은 인간 프레임워크 내의 비전형적인 아미노산이 항체 구조를 파괴하지 않도록 도와준다. 또한, 인간 항체의 경우에는 일반적으로 나타나는 공여체 항체 유래의 아미노산으로 드문 인간 수용체 아미노산을 치환함으로써 인간화된 항체의 면역원성을 줄일 수 있다.

본원에서 사용되는 "빈도가 낮은(rare)"이란 용어는 대표적인 서열 샘플에서의 서열의 그 위치에서 발생하는 아미노산이 약 20% 미만, 일반적으로 약 10% 미만으로 존재하는 것을 나타내며, 본원에서 사용되는 "일반적인(common)"이란 용어는 아미노산이 대표적인 샘플에서의 서열의 약 25% 이상, 일반적으로 약 50% 이상으로 존재함을 의미한다. 예를 들어, 모든 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 각각, 서로 특별히 상동성이고, 특정한 중요 위치에서 동일한 아미노산을 보유하는 서열의 "서브그룹"으로 분류된다(Kabat 등의 상기 문헌). 인간 수용체 서열 내의 아미노산이 인간 서열 중에서 "빈도가 낮은지" 아니면 "일반적인지"를 결정할 때에는 종종 동일한 서브그룹 내의 인간 서열만을 수용체 서열로 간주하는 것이 바람직할 것이다.

또 다른 치환 대상으로는 Chothia 등의 상기 문헌에 제안된 또 다른 정의에 따라 CDR 영역의 일부로서 확인되는 수용체 인간 프레임워크 아미노산이 있다. 또 다른 치환 대상으로는 AbM 및/또는 접촉 정의에 따라 CDR 영역의 일부로서 확인되는 수용체 인간 프레임워크 아미노산이 있다. 그 중에서도, 가변 중쇄 내의 CDR1이 잔기 26-32를 포함하는 것으로 정의된다.

또 다른 치환 대상으로는 빈도가 낮은 또는 드문 공여체 프레임워크 잔기에 상응하는 수용체 프레임워크 잔기가 있다. 빈도가 낮은 또는 드문 공여체 프레임워크 잔기는 쥐의 항체의 경우 그 위치에서 빈도가 낮은 또는 드문(본원에서 정의한 바와 같은) 것이다. 쥐 항체의 경우, 서브그룹은 Kabat 방식에 따라 결정할 수 있으며, 컨센서스 서열과 상이한 잔기 위치를 확인할 수 있다. 이러한 공여체 특이적 차이는 활성을 강화시키는 쥐 서열 내의 체세포 돌연변이를 교시할 수 있다. 결합에 영향을 주는 것으로 예측되는 드문 잔기는 유지되며, 반면에 결합에 중요하지 않은 것으로 예측되는 잔기는 치환될 수 있다.

또 다른 치환 대상으로는 수용체 프레임워크 영역에서 발생하는 비-생식세포계 잔기가 있다. 예를 들어, 수용체 항체 사슬(즉, 공여체 항체 사슬과 유의적인 서열 동일성을 공유하는 인간 항체 사슬)을 생식세포계 항체 사슬(마찬가지로 공여체 사슬과 유의적인 서열 동일성을 공유함)에 정렬할 경우, 수용체 사슬 프레임워크와 생식세포계 사슬 프레임워크간에 일치하지 않는 잔기는 생식세포계 사슬로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다.

전술한 바와 같은 특정 아미노산 치환 외에도, 인간화된 면역글로불린의 프레임워크 영역은 그것이 유래된 인간 항체의 프레임워크 영역과 통상 실질적으로 동일하며, 보다 일반적으로는 동일하다. 물론, 프레임워크 영역 내의 아미노산의 다수는 항체의 특이성 또는 친화력에 거의 또는 직접 기여하지 않는다. 따라서, 프레임워크 잔기의 다수의 개별적인 보존적 치환은 최종 인간화된 면역글로불린의 특이성 또는 친화력을 감지할 수 있을 정도로 변화시키지 않고 유지될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 인간화된 면역글로불린의 가변 프레임워크 영역은 그러한 서열의 인간 가변 프레임워크 영역 서열 또는 컨센서스 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 또 다른 구체예에서, 인간 면역글로불린의 가변 프레임워크 영역은 그러한 서열의 인간화된 가변 프레임워크 영역 서열 또는 컨센서스 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유한다. 그러나 일반적으로 그러한 치환은 바람직하지 않다.

인간화된 항체는 바람직하게는 항원에 대한 특이적 결합 친화력이 10⁷, 10⁸, 10⁹또는 10¹⁰M^-1이상이다. 통상, 항원에 대한 인간화된 항체의 결합 친화력의 상한치는 공여체 면역글로불린의 친화력의 3배, 4배 또는 5배 내가 된다. 종종, 결합 친화력의 하한치 역시 공여체 면역글로불린의 친화력의 3배, 4배 또는 5배 내가 된다. 또는, 결합 친화력을 치환을 갖지 않는 인간화된 항체(예컨대, 공여체 CDR 및 수용체 FR을 갖지만 FR 치환을 갖지 않는 항체)의 것과 비교할 수 있다. 이러한 경우, 최적화된 항체(치환을 갖는)의 결합은 비치환 항체의 것보다 2배∼3배 이상, 또는 3배∼4배 이상이 되는 것이 바람직하다. 비교를 위해, 다양한 항체의 활성을, 예컨대 BIACORE(즉, 비표지된 제제를 사용하는 표면 플라스몬 공명) 또는 경쟁적 결합 분석에 의해 측정할 수 있다.

C. 인간화된 3D6 항체의 생산

본 발명의 바람직한 구체예는, 특히 본원에서 설명한 치료 및/또는 진단 방법에 사용하기 위한 Aβ의 N-말단에 대한 인간화된 항체를 특징으로 한다. 인간화된 항체의 생산을 위한 특히 바람직한 출발 물질은 3D6이다. 3D6는 Aβ의 N-말단에 대해 특이적이며, 아밀로이드 플라크의 식작용을 매개하는 것으로(예컨대, 식작용을 유도하는 것으로) 확인되었다(실시예 I-V 참조). 3D6 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 cDNA의 클로닝 및 시퀀싱에 대해서는 실시예 VI에 기술되어 있다.

공지된 인간 항체의 서열과 마우스 가변 영역의 아미노산 서열을 컴퓨터로 비교함으로써 적절한 인간 수용체 항체 서열을 확인한다. 비교는 중쇄 및 경쇄에 대해 개별적으로 수행하지만, 각각에 대한 원리는 유사하다. 특히, 프레임워크 서열이 쥐의 VL 및 VH 프레임워크 영역과 고도의 서열 동일성을 나타내는 인간 항체유래의 가변 도메인은 개개의 쥐 프레임워크 서열을 사용하여 NCBI BLAST(국립보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 공개적으로 입수 가능함)를 이용한 Kabat 데이터베이스 검색을 통해 확인하였다. 한 구체예에서, 쥐 공여체 서열과의 서열 동일성이 50% 이상인 수용체 서열을 선택한다. 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90% 이상을 공유하는 항체 서열을 선택한다.

3D6의 컴퓨터 비교에 의해 3D6 경쇄가 아형 카파 II의 인간 경쇄와 최대 서열 동일성을 나타내고, 3D6 중쇄가 아형 III의 인간 중쇄와 최대 서열 동일성을 나타냄을 알게 되었으며, 이에 대해서는 Kabat 등의 상기 문헌에 정의되어 있다. 따라서, 경쇄 및 중쇄 인간 프레임워크 영역은 이러한 아형의 인간 항체로부터, 또는 이러한 아형의 컨센서스 서열로부터 유래된 것이 바람직하다. 3D6 유래의 상응하는 영역과 최대 서열 동일성을 나타내는 바람직한 경쇄 인간 가변 영역은 Kabat ID 번호가 019230, 005131, 005058, 005057, 005059, U21040 및 U41645인 항체로부터 유래된 것이며, 19230가 보다 바람직하다. 3D6 유래의 상응하는 영역과 최대 서열 동일성을 나타내는 바람직한 중쇄 인간 가변 영역은 Kabat ID 번호가 045919, 000459, 000553, 000386 및 M23691인 항체로부터 유래된 것이며, 045919가 보다 바람직하다.

그 다음으로, 치환을 위한 잔기를 다음과 같이 선택한다. 3D6 가변 프레임워크 영역과 대등한 인간 가변 프레임워크 영역간에 1개의 아미노산이 다를 경우, 아미노산이

(1) 항원에 직접 비공유적으로 결합하고,

(2) CDR 영역에 인접해 있고, Chothia 등의 상기 문헌에 제안된 다른 정의에 따라 CDR 영역의 일부이거나, 또는 CDR 영역(예컨대, CDR 영역에서 약 3 Å내에 위치하는)(예컨대, 3D6의 L2, H49 및 H94 위치에 있는 아미노산)과 다른 방식으로 상호작용하고,

(3) VL-VH 계면에 관여(예컨대, 3D6의 L36, L46, 및 H93 위치에 있는 아미노산)할 것으로 분명히 예상된다면, 인간 프레임워크 아미노산은 일반적으로 대등한 마우스 아미노산으로 치환되어야 한다.

3D6 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 컴퓨터 모델링과 3D6 항체의 인간화에 대해서는 실시예 VII에 기술되어 있다. 간단히 설명하면, 중쇄 및 경쇄에 대해 규명된 쥐 항체 중 가장 가까운 구조를 기초로 3차원 모델을 생성하였다. 이를 위해 1CR9 로 표시한 항체(Protein Data Bank (PDB) ID: 1CR9, Kanyo 등의 문헌[J. Mol.Biol. 293:855 (1999)])를 3D6 경쇄를 모델링하기 위한 주형으로서 선택하였고, 1OPG로 표시한 항체(PDB ID: 1OPG, Kodandapani 등의 문헌[J. Biol. Chem. 270:2268 (1995)])를 중쇄를 모델링하기 위한 주형으로서 선택하였다. 바람직하지 않은 원자의 접촉을 경감시키고 정전기 및 반데르발스 상호작용을 최적화하기 위한 일련의 에너지 최소화 단계를 이용하여 이 모델을 추가로 개량하였다. 1qkz(PDB ID: 1QKZ, Derrick 등의 문헌[J. Mol. Biol. 293:81 (1999)])의 규명된 구조를 중쇄의 CDR3를 3D6로서 모델링하기 위한 주형으로 선택하였으나, 비교를 위해 정렬하였을 때 1OPG는 이 영역에서 유의적인 서열 상동성을 나타내지 않았다.

본원에 기술된 항체에 대한 3차원 구조의 정보는, 예컨대 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics's Protein Data Bank(PDB)로부터 공개적으로 입수할 수 있다. PDB는 월드 와이드 웹 인터넷을 통해 자유롭게 접근 가능하며, Berman 등의 문헌[(2000) Nucleic Acids Research, 28:235]에 설명되어 있다. 컴퓨터 모델링은 CDR-상호작용 잔기의 확인을 가능하게 한다. 3D6 구조의 컴퓨터 모델은 인간 프레임워크 구조 내에 치환된 3D6 상보성 결정 영역을 포함하는 항체의 3차원 구조를 예측하기 위하 출발점으로서 작용할 수 있다. 추가 아미노산 치환이 도입됨에 따라 구조를 나타내는 추가 모델을 작제할 수 있다.

일반적으로, 상기 기준을 충족시키는 아미노산의 1개, 대부분 또는 모두의 치환이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 인간화된 항체는 일반적으로 L1, L2, L36 및 L46 위치 중 1개, 2개 또는 3개 및 보다 일반적으로는 4개 이상에서 상응하는 3D6 잔기로 치환된 인간 경쇄 프레임워크 잔기를 포함한다. 인간화된 항체는 또한일반적으로 H49, H93 및 H94 위치 중 1개, 2개 및 종종 3개 이상의 위치에서 상응하는 3D6 잔기로 치환된 인간 중쇄 프레임워크 잔기를 포함한다. 인간화된 항체는 또한 H74, H77 및 H89 위치 중 1개, 2개 및 종종 3개 이상의 위치에서 상응하는 생식세포계 잔기로 치환된 중쇄 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다.

그러나 때로 특정 아미노산이 상기 기준을 충족시키는지가 다소 모호한 경우가 있으며, 이 경우 하나는 특정 치환을 보유하고 다른 하나는 치환을 보유하지 않는 대안의 변형 면역글로불린을 제조한다. 쥐 잔기로의 치환이 특정 위치에서 인간 면역글로불린에서 빈도가 낮은 잔기를 도입할 경우, 특정 치환이 있거나 없는 상태로 그 항체의 활성을 테스트하는 것이 바람직할 수 있다. 활성(예컨대, 친화력 및/또는 결합 특이성)이 치환이 있거나 없거나 거의 같다면, 치환이 없는 항체가 바람직할 수 있는데, 그 이유는 본원에서 설명하는 바와 같이 HAHA 반응을 유발할 가능성이 적을 것으로 예상되기 때문이다.

다른 치환 대상으로는 인간 면역글로불린의 경우 그 위치에서는 드문 수용체 인간 프레임워크 아미노산이다. 이들 아미노산을 보다 전형적인 인간 면역글로불린의 대등한 위치로부터의 아미노산으로 치환할 수 있다. 대안으로, 마우스 3D6에서의 대등한 위치로부터의 아미노산을, 이러한 아미노산이 인간 면역글로불린의 경우 대등한 위치에서 전형적인 것일 경우 인간 프레임워크 영역으로 도입할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 인간 경쇄 프레임워크 수용체 면역글로불린은 Kabat ID 번호 019230이며, 경쇄는 L7, L10, L12, L15, L17, L39, L45, L63, L78, L83, L85, L100 또는 L104 위치 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상에서 또는보다 일반적으로는 13개 이상에서 치환을 포함한다. 또 다른 구체예에서 인간 중쇄 프레임워크 수용체 면역글로불린이 Kabat ID 번호 045919인 경우, 중쇄는 H3, H5, H13, H16, H19, H40, H41, H42, H44, H72, H77, H82A, H83, H84, 또는 H108 위치 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상에서 또는 보다 일반적으로는 15개 이상에서 치환을 포함한다. 이들 위치는 보다 전형적인 아미노산 잔기를 갖는 인간 면역글로불린의 대등한 위치로부터 유래된 아미노산으로 치환된다. 치환하기에 적절한 아미노산의 예는 도 1 및 2에 도시되어 있다.

다른 치환 대상으로는 프레임워크 영역 내에 존재하는 비-생식세포계 잔기가 있다. 3D6와 공지된 생식세포계 서열의 컴퓨터 비교에 의하면 최고의 서열 동일성을 나타내는 중쇄는 생식세포계 가변 영역 서열 VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 및 VH3-11을 포함하며, VH3-23이 보다 바람직한 것으로 나타났다. Kabat ID 045919를 VH3-23으로 정렬한 결과는 잔기 H74, H77 및/또는 H89가 상응하는 생식세포계 잔기(예컨대, Kabat ID 045919와 VH3-23을 비교할 때 잔기 H74, H77 및/또는 H89)로 치환될 수 있음을 나타낸다. 마찬가지로, 3D6 경쇄에 대해 최고의 동일성을 나타내는 생식세포계 서열에는 A1, A17, A18, A2 및 A19가 포함되며, A19가 가장 바람직하다. 선택된 경쇄 수용체 프레임워크와 이들 생식세포계 서열 중 하나간에 일치하지 않는 잔기를 상응하는 생식세포계 잔기로의 치환을 위해 선택할 수 있다.

표 1은 3D6 VH 및 VL 영역의 서열 분석 결과를 요약한 것이다. 3D6 항체와 추가의 인간 항체의 컴퓨터 모델링을 위해 사용될 수 있는 추가의 마우스 및 인간 구조와, 아미노산 치환을 선택하는 데 사용될 수 있는 생식세포계 서열을 개시하였다. 빈도가 낮은 마우스 잔기들도 하기 표 1에 개시하였다. 공여체 VL 및/또는 VH 서열과 공여체 VL 및/또는 VH 서열이 속하는(Kabat에 따라) 서브그룹의 다른 구성원의 서열을 비교하여 컨센서스 서열과 다른 잔기 위치를 확인함으로써 빈도가 낮은 마우스 잔기를 확인한다. 이러한 공여체 특이적 차이는 활성을 증강시키는 체세포 돌연변이를 교시할 수 있다. 결합 부위에 가까운 드물거나 빈도가 낮은 잔기는 항원과 접촉할 가능성이 있어서, 마우스 잔기를 보유하는 것을 바람직하게 할 수 있다. 그러나, 드문 마우스 잔기가 결합에 있어서 중요하지 않을 경우, 상응하는 수용체 잔기를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 마우스 잔기는 인간화된 항체에서 면역원성의 네오에피토프를 생성할 수 있기 때문이다. 공여체 서열 내의 드문 잔기가 실제로 상응하는 수용체 서열 내의 공통의 잔기인 경우, 바람직한 잔기는 분명 수용체 잔기가 된다.

3D6 V-영역 서열의 요약
사슬	중쇄	경쇄
마우스 서브그룹(Kabat 서열 번호)	IIID (002688)	II (005840-005844 , 005851-005853 , 005857 , 005863
마우스 상동체(Kabat/Genbank)	002727/163.1'CL002711/H35-C6'CL002733/8-1-12-5-3-1(A2-1)'CL002715/ASWA2'CL020669/#14'CL	005840/1210.7005843/42.4b.12.2'CL005842/BXW-14'CL005841/42.7B3.2'CL005851/36-60CRI-
빈도가 낮은 아미노산(클래스 내에서 발생하는 빈도%)	N40 (0.233%)D42 (0.699%)	Y1(.035%)I15 (3.3%)D27 (0.867%)-CDR1I78 (0.677%)L85 (0.625%)W89 (0.815%)-CDR3K106A (0.295%)
인간 서브그룹	III (000488-000491, 000503,000624)	II (005046)
Chothia 카논형CDR 그룹화[pdb 예]	H1: 클래스 1 [2fbj]H2: 클래스 3 [1igc]	L1: 클래스 4 [1rmf]L2: 클래스 1 [1lmk]L3: 클레스 1 [1tet]
규명된 마우스 구조 중가장 유사한 것	PDB ID: 10PG Kodandapani 등의상기 문헌(72% 2 Å)	PDB ID: 1CR9; Kanyo 등의 상기문헌(94%, 2 Å)PDB ID: 1NLD; Davies 등의문헌[Acta Crystallogr. D.Biol. Crystallog. 53:186(1997)]; (98%, 2.8 Å)
규명된 인간 구조 중가장 유사한 것	1VH (68%, nmr)443560 (65%, IgG, λ골수종,1.8 Å)KOL/2FB4H (60%, 골수종, 3 Å)	1LVE (57%, LEN)1B6DA (54%, B-J 이량체, 2.8Å);1VGEL (54%, 자가항체)
생식세포계 검색(Hu)결과(상위 4개)	VH3-48 (4512283/BAA75032.1)VH3-23 (4512287/BAA75046.1)VH3-7 (4512300/BAA75056.1)VH3-21 (4512287/BAA75047.1)VH3-11 (4152300/BAA75053.1)	A1 (x63402)A17 (x63403)A18 (X63396)A2 (m31952)A19 (x63397)
* 동일한 항체 유래의 중쇄 및 경쇄(0-81, Hirabavashi 등의 문헌 [NAR 20:2601]).

본원에 언급된 Kabat ID 서열은, 예컨대 [Northwestern University Biomedical Engineering Department's Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest]로부터 공개적으로 입수할 수 있다. 본원에 기술된 항체의 3차원 구조 정보는, 예컨대 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics's Protein Data Bank(PDB)로부터 공개적으로 입수할 수 있다. PDB는 월드 와이드 웹 인터넷을 통해 자유롭게 접근 가능하며, Berman 등의 문헌[(2000) Nucleic Acids Research, p.235-242]에 설명되어 있다. 본원에 언급된 생식세포계 유전자 서열은, 예컨대 국립 생물공학 정보 센터(NCBI) 서열 데이터베이스로부터 Igh, Ig 카파 및 Ig 람다 생식세포계 V 유전자의 집합소에서 공개적으로 입수할 수 있다(국립보건원(NIH)에 있는 국립 의학 도서관(NLM)의 분과). NCBI "Ig 생식세포계 유전자" 데이터베이스의 상동성 검색은 IgG BLAST^TM에 의해 제공된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 (i) 쥐 3D6 VL CDR과 인간 수용체 프레임워크를 포함하는 가변 도메인을 포함하는 경쇄[이때, 상기 프레임워크는 상응하는 3D6 잔기로 치환된 L1, L2, L36 및 L46으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 바람직하게는 2개, 3개 또는 4개의 잔기를 보유함] 및 (ii) 3D6 VH CDR과 인간 수용체 프레임워크를 포함하는 중쇄[이때, 상기 프레임워크는 상응하는 3D6 잔기로 치환된 H49, H93 및 H94로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 바람직하게는 2개 또는 3개의 잔기를 보유함]를 포함하며, 선택적으로 H74, H77 및 H89로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 바람직하게는 2개 또는 3개의 잔기는 상응하는 인간 생식세포계 잔기로 치환된다.

보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 (i) 쥐 3D6 VL CDR과인간 수용체 프레임워크를 포함하는 가변 도메인을 포함하는 경쇄[이때, 상기 프레임워크는 tyr(Y)으로 치환된 잔기 1, val(V)으로 치환된 잔기 2, leu(L)으로 치환된 잔기 36 및/또는 arg(R)으로 치환된 잔기 46을 보유함], 및 (ii) 3D6 VH CDR과 인간 수용체 프레임워크를 포함하는 중쇄[이때, 상기 프레임워크는 ala(A)으로 치환된 잔기 49, val(V)으로 치환된 잔기 93 및/또는 arg(R)으로 치환된 잔기 94를 보유함]를 포함하며, 선택적으로 ser(S)으로 치환된 잔기 74, thr(T)으로 치환된 잔기 77 및/또는 val(V)으로 치환된 잔기 89를 보유한다.

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 본원에서 기술하는 구조적 특징을 가지며, 다음 활성 중 하나 이상(바람직하게는 2가지, 3가지 또는 4가지 또는 모두)을 보유한다: (1) 응집된 Aβ1-42에 결합하는 활성(예컨대, ELISA로 측정); (2) 플라크 내의 Aβ에 결합하는 활성(예컨대, AD 및/또는 PDAPP 플라크의 염색); (3) 키메라 3D6에 비해 2배∼3배 높은 결합 친화력으로 Aβ에 결합하는 활성(예컨대, 쥐의 CDR과 인간 수용체의 FR을 갖는 3D6); (4) Aβ의 식작용을 매개하는 활성(예컨대, 본원에서 기술한 바와 같은 생체외 식작용 분석에 의해 측정); 및 (5) 혈뇌 장벽을 관통하는 활성(예컨대, 본원에 기술하는 바와 같이 PDAPP 동물 모델 등에서 단기간 뇌 집중화를 나타냄).

또 다른 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 본원에 기술된 바와 같은 구조적 특징을 보유하며, 하기 생체내 효과 중 하나 이상을 나타내기에 충분한 방식 또는 친화력으로 Aβ에 결합한다: (1) Aβ플라크 존재량을 감소시키는 효과; (2) 플라크 형성을 예방하는 효과; (3) 가용성 Aβ의 농도를 감소시키는 효과; (4)아밀로이드생성 질환과 관련된 신경돌기의 병상을 감소시키는 효과; (5) 아밀로이드 질환과 관련된 1종 이상의 생리적 증상을 경감 또는 완화시키는 효과; 및/또는 (6) 인지 기능을 개선시키는 효과.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 인간화된 항체는 본원에서 설명한 구조적 특징을 보유하며, Aβ의 잔기 1-5 또는 3-7을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.

3. 인간 항체

Aβ에 대한 인간 항체는 후술하는 다양한 기법에 의해 제공된다. 경쟁적 결합 실험 등에 의해, 본원에서 개시한 마우스 모노클로날 중 하나와 같은 특정 마우스 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 몇몇 인간 항체를 선별한다. 인간 항체는 또한 면역원으로서 Aβ의 단편만을 사용하고/하거나 Aβ의 결실 돌연변이체의 집합소에 대한 항체를 스크리닝함으로써 특정 에피토프 특이성에 대해 스크리닝할 수도 있다. 인간 항체는 바람직하게는 인간 IgG1 이소타입 특이성을 보유한다.

a. 트리오마 방법

기본적인 방법과 이러한 방법에 사용하기 위한 대표적인 세포 융합 파트너인 SPAZ-4에 대해서는 Oestberg 등의 문헌[Hybridoma 2:361 (1983)]; Oestberg의 미국 특허 제4,634,664호; 및 Engleman 등의 미국 특허 제4,634,666호에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 각각 그 전문을 본원에서 참고 문헌으로 인용한다. 이 방법에 의해 얻어진 항체 생산 세포주를 트리오마라 부르는데, 그 이유는 이들이 3개의 세포, 즉 2명의 인간과 1 마리의 마우스로부터 유래된 것이기 때문이다. 먼저,Oestberg의 상기 문헌에 개시된 바와 같이 마우스 골수종 세포주를 인간 B-림프구와 융합하여 항체를 생산하지 않는 이종 개체의 하이브리드 세포, 예컨대 SPAZ-4 세포주를 얻는다. 그후 이종 개체의 세포를 면역화된 인간 B-림프구와 융합하여 항체 생산 트리오마 세포주를 얻는다. 트리오마는 인간 세포로부터 제조된 통상적인 하이브리도마보다 더 안정하게 항체를 생산하는 것으로 확인되었다.

인간 공여체의 혈액, 비장, 림프절 또는 골수로부터 면역화된 B-림프구를 얻는다. 특정 항원 또는 에피토프에 대한 항체가 필요하다면, 면역화를 위해 그 항원 또는 에피토프를 사용하는 것이 바람직하다. 면역화는 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 생체내 면역화의 경우, B 세포는 일반적으로 Aβ, 이의 단편, Aβ를 포함하는 더 큰 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 Aβ의 항체에 대한 항-이디오타입 항체로 면역화한 인간으로부터 분리된다. 어떤 방법에서는 최종적으로 항체 요법을 적용할 그 환자로부터 B 세포를 분리한다. 시험관내 면역화의 경우, B 림프구는 통상 10% 인간 혈장이 보강된 RPMI-1640(Engleman의 상기 문헌 참조)과 같은 배지에서 항원에 7∼14일간 노출시킨다.

면역화된 B-림프구를 공지된 방법에 의해, SPAZ-4와 같은 이종 발생 하이브리드 세포에 융합시킨다. 예를 들어, 분자량이 1000∼4000인 40∼50% 폴리에틸렌 글리콜로 약 37℃에서 약 5∼10분간 세포를 처리한다. 융합 혼합물로부터 세포를 분리하여 원하는 하이브리드에 대한 선별 배지(예컨대, HAT 또는 AH)에서 증폭시킨다. Aβ또는 그 단편에 결합하는 능력에 대해 트리오마 배양 배지를 분석함으로써 요구되는 결합 특이성을 갖는 항체 분비 클론을 확인한다. 원하는 특이성을 갖는인간 항체를 생산하는 트리오마를 한계 희석 기법으로 서브클로닝하고 배양 배지에서 시험관내에서 배양한다. 이후 얻어진 트리오마 세포주를 Aβ또는 그 단편에 결합하는 능력에 대해 테스트한다.

트리오마는 유전적으로 안정하지만, 매우 고농도로 항체를 생산하지는 못한다. 트리오마 유래의 항체 유전자를 1 이상의 발현 벡터에 클로닝하고, 그 벡터로 표준 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포주를 형질전환시킴으로써 발현 수준을 증가시킬 수 있다.

b. 트랜스제닉 비-인간 포유동물

Aβ에 대한 인간 항체는 인간 면역글로불린 로커스의 1 이상의 분절을 암호화하는 트랜스 유전자를 갖는 비-인간 트랜스제닉 포유동물로부터 생산할 수도 있다. 통상적으로, 그러한 트랜스제닉 포유동물의 내생 면역글로불린 로커스는 기능적으로 불활성 상태이다. 바람직하게는 인간 면역글로불린 로커스의 분절은 경쇄 및 중쇄 성분의 비정렬 서열을 포함한다. 내생 면역글로불린 유전자의 불활성화와 외생 면역글로불린 유전자의 도입 모두 표적화된 상동성 재조합, 또는 YAC 염색체의 도입에 의해 수행할 수 있다. 이러한 과정에 의해 얻은 트랜스제닉 포유동물은 면역글로불린 성분 서열을 기능적으로 재배열할 수 있고, 내생 면역글로불린 유전자는 발현하지 않으면서 인간 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 다양한 이소타입의 항체 집합체를 발현할 수 있다. 이러한 특성을 갖는 포유동물의 생산 및 특성에 대해서는, 예컨대 Lonberg 등의 WO93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148:1547 (1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996), Kucherlapati의 WO 91/10741 (1991)에 상세히 기재되어 있으며, 이들 문헌은 모두 본원에서 참고 문헌으로 인용한다. 트랜스제닉 마우스는 특히 안정하다. 항-Aβ항체는 Lonberg 또는 Kucherlapati의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 Aβ또는 그 단편으로 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 면역화하여 얻는다. 모노클로날 항체는 그러한 포유동물로부터 얻은 B-세포를 종래의 Kohler-Milstein 기법을 이용하여 적절한 골수종 세포주에 융합시켜서 제조한다. 인간 폴리클로날 항체는 면역원성 물질로 면역화된 인간의 혈청 형태로 얻을 수도 있다. 선택적으로, 이러한 폴리클로날 항체는 친화성 제제로서 Aβ또는 다른 아밀로이드 펩티드를 사용하는 친화성 정제에 의해 농축시킬 수 있다.

c. 파지 디스플레이법

인간 항-Aβ항체를 얻기 위한 또 다른 방법은 Huse 등의 문헌[Science 246:1275-1281 (1989)]에 개시된 일반적 프로토콜에 따라 인간 B 세포 유래의 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 트리오마 방법에 대해 기술한 바와 같이, 이러한 B 세포는 Aβ, 단편, Aβ를 포함하는 더 긴 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 항-이디오타입 항체로 면역화한 인간으로부터 얻을 수 있다. 경우에 따라 이러한 B 세포는 최종적으로 항체 치료를 받을 환자로부터 얻기도 한다. Aβ또는 그 단편에 결합하는 항체를 선별한다. 그 후 이러한 항체(또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 서열을 클로닝하여 증폭시킨다. Huse의 문헌에 기재된 프로토콜을 파지-디스플레이 기법과 병용하는 것이 더 효율적이다. 예컨대 Dower 등의 WO 91/17271, McCafferty등의 WO 92/01047, Herzig 등의 US 5,877,218, Winter 등의 US 5,871,907, Winter 등의 US 5,858,657, Holliger 등의 US 5,837,242, Johnson 등의 US 5,733,743 및 Hoogenboom 등의 US 5,565,332를 참조하라. 상기 문헌들은 모두 본원에서 참고 문헌으로 인용한다. 이들 방법에서는, 구성원이 그 외면 상에 서로 다른 항체를 디스플레이하는 파지 라이브러리를 제조한다. 항체는 일반적으로 Fv 또는 Fab 단편으로서 디스플레이된다. 원하는 특이성을 갖는 항체를 디스플레이하는 파지를 Aβ펩티드 또는 이의 단편에 대한 친화력 집중화에 의해 선별한다.

파지 디스플레이 방법의 변형법으로, 선별된 쥐 항체의 결합 특이성을 갖는 인간 항체를 생산할 수 있다. Winter의 WO 92/20791을 참조하라. 이 방법에서는 선별된 쥐 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 출발 물질로서 사용한다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역이 출발 물질로서 선택된다면, 구성원이 동일한 경쇄 가변 영역(즉, 쥐 출발 물질)과 상이한 중쇄 가변 영역을 디스플레이하는 파지 라이브러리를 작제한다. 중쇄 가변 영역은 재배열된 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 얻는다. Aβ에 대한 강력한 특이적 결합(예컨대, 10⁸M^-1이상, 바람직하게는 10⁹M^-1이상)을 나타내는 파지를 선별한다. 그 후 이러한 파지로부터 얻은 인간 중쇄 가변 영역이 후속 파지 라이브러리를 작제하기 위한 출발 물질로서 사용된다. 이 라이브러리에서 각 파지는 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 제1 디스플레이 라이브러리로부터 확인된 영역)과 상이한 경쇄 가변 영역을 디스플레이한다. 경쇄 가변 영역은 재배열된 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 얻는다. 마찬가지로 Aβ에 대한 강력한 특이적 결합을 나타내는 라이브러리를 선별한다. 이 파지는 완벽한 인간 항-Aβ항체의 가변 영역을 디스플레이한다. 이러한 항체들은 일반적으로 쥐 출발 물질과 동일하거나 유사한 에피토프 특이성을 보유한다.

4. 가변 영역의 제조

인간화된 면역글로불린의 CDR 및 프레임워크 성분을 구상적으로 선택하면, 이러한 면역글로불린을 생산하는 데 이용할 수 있는 방법은 다양하다. 암호 축퇴성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화하게 된다. 원하는 핵산 서열은 신규의 고체상 DNA 합성에 의해 또는 원하는 폴리뉴클레오티드의 미리 제조된 변형체의 PCR 돌연변이 유발법에 의해 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이 유발법이 표적 폴리펩티드 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변형체를 제조하기 위한 바람직한 방법이다. Adelman 등의 문헌[DNA 2:183 (1983)]을 참조하라. 요약하면, 원하는 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 한가닥 DNA 주형에 하이브리드화하여 표적 폴리펩티드 DNA를 변형시킨다. 하이브리드화 후, DNA 폴리머라제를 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 혼입하여 표적 폴리펩티드 DNA에서 선택된 변형을 암호화하는 제2의 상보 가닥 전체를 합성한다.

5. 불변 영역의 선택

전술한 바와 같이 제조한 항체의 가변 분절(예컨대, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역)은 통상, 일반적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 하나 이상의 부분에 연결시킨다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포로부터, 바람직하게는 불멸화된 B 세포로부터 공지된 절차에 따라 분리한다(Kabat 등의 상기 문헌 및 Liu 등의 WO 87/02671; 이들 문헌은 각각 본원에서 참고 문헌으로 인용함). 통상적으로, 항체는 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 모두 포함한다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함한다. 본원에 개시된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 모든 유형의 불변 영역과, IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 모든 유형의 이소타입을 갖는 항체를 포함한다. 불변 영역의 선택은 부분적으로, 항체 의존적 보체 및/또는 세포 매개 독성이 필요한지에 따라서 좌우된다. 예를 들어, 이소타입 IgG1 및 IgG3는 보체 활성을 보유하지만, 이소타입 IgG2 및 IgG4는 보체 활성을 보유하지 않는다. 항체(예컨대, 인간화된 항체)가 세포독성을 나타내기를 원할 경우, 불변 도메인은 일반적으로 보체 고정 불변 도메인이며, 그 클래스는 통상 IgG1이다. 이와 같은 세포 독성이 바람직하지 않을 경우, 불변 도메인은 IgG2 클래스가 될 수 있다. 이소타입의 선택은 뇌로의 항체의 통과에도 영향을 줄 수 있다. 인간 이소타입 IgG1이 바람직하다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 인간화된 항체는 1가지 이상의 클래스 또는 이소타입으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 항체는 개별 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv로서 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 포함하는 사량체의 형태로, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결되어 있는 단일 사슬 항체의 형태로 발현될 수 있다.

6. 재조합 항체의 발현

키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체는 일반적으로 재조합 발현에 의해생성된다. 경우에 따라 불변 영역에 연결된, 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 삽입한다. 경쇄 및 중쇄 사슬을 같거나 다른 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 면역글로불린 사슬을 암호화하는 DNA 분절을 발현 벡터(들) 내의 조절 서열에 작동 가능하게 연결하여 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 확실히 한다. 발현 조절 서열의 비제한적인 예로는 프로모터(예컨대, 자연적으로 관련된 또는 이종성 프로모터), 시그널 서열, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 들 수 있다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 벡터가 적절한 숙주에 도입되면, 숙주를 뉴클레오티드 서열을 고도로 발현하기에 적절한 조건하에 유지시키고, 교차 반응성 항체를 수집 및 정제한다.

이러한 발현 벡터는 일반적으로 에피좀으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합된 일부로서 숙주 유기체에서 복제할 수 있다. 통상, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 하는 선별 마커(예컨대, 암피실린 내성, 하이그로마이신 내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성)를 포함한다(예컨대 Itakura 등의 미국 특허 제4,704,362호 참조).

본 발명의 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA 서열)를 클로닝하는 데 특히 유용한 원핵 숙주는 이. 콜라이이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주로는 바실러스, 예컨대 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilus) 및 기타 엔테로박테리아, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 있다. 이들 원핵 숙주에서, 발현 벡터를 제조할 수도 있는데, 이 발현 벡터는 일반적으로 숙주 세포와 양립 가능한 조절 서열(예컨대, 복제 기점)을 포함한다. 또한, 공지된 다수의 각종 프로모터 중 몇가지, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다 유래의 프로모터 시스템을 포함할 수 있다. 프로모터는 통상, 경우에 따라 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 조절하게 되며, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보좀 결합 부위 서열 등을 보유한다.

효모와 같은 다른 미생물 역시 발현에 이용될 수 있다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 필요에 따라 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 보유하는 적절한 벡터를 갖는 바람직한 효모 숙주이다. 일반적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 기타 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터로는, 특히 알코올 탈수소효소, 이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 관여하는 효소로부터 유래된 프로모터가 있다.

본 발명의 폴리펩티드(예컨대, 면역글로불린을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편)를 발현 및 생산하는 데에는 미생물 외에도 포유동물 조직 세포 배양액이 이용될 수 있다. 이에 대해서는 Winnacker의 문헌[From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y(1987)]을 참조하라. 실제로는 진핵 세포가 바람직한데, 그 이유는 이종 단백질(예컨대, 완전한 면역글로불린)을 분비할 수 있는 다수의 적절한 숙주 세포주가 당분야에 개발되어 있기 때문이며, 여기에는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포(바람직하게는 골수종 세포주), 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마가 포함된다. 이들 세포는 인간의 것이 아닌 것이 바람직하다. 이들 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서(Queen 등의 문헌[Immunol. Rev. 89:49 (1986)] 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등에서 유래된 프로모터이다. Co 등의 문헌[J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조하라.

대안으로, 항체 암호화 서열을 트랜스제닉 동물의 게놈에 도입하기 위한 트랜스 유전자에 통합시킨 후 트랜스제닉 동물의 모유에서 발현시킬 수 있다(Deboer 등의 US 5,741,957, Rosen의 US 5,304,489, 및 Meade 등의 US 5,849,992 참조). 적절한 트랜스 유전자는 유선 특이적 유전자, 예컨대 카세인 또는 베타 락토글로불린 유래의 프로모터 및 인핸서와 작동 가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 암호화 서열을 포함한다.

관심있는 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 중쇄 및 경쇄 암호화 서열 및 발현 조절 서열)을 포함하는 벡터를 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 전달할 수 있으며, 전달 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 원핵 세포의 경우에는 염화칼슘 형질감염이 일반적으로 이용되는 반면, 다른 세포 숙주에는 인산칼슘 처리, 일렉트로포레이션, 리포펙션, 바이오리스틱스 또는 바이러스계 형질감염이 이용될 수 있다(일반적인 내용은 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989) ] 참조; 상기 문헌은 본원에서 참고 문헌으로 인용함). 포유동물 세포를 형질전환시키는 데 이용되는다른 방법으로는 폴리브렌의 사용, 원형질 융합, 리포좀의 사용, 일렉트로포레이션, 및 마이크로인젝션이 있다(Sambrook 등의 상기 문헌 참조). 트랜스제닉 동물을 생산하기 위해서는 트랜스 유전자를 수정된 난모세포에 마이크로인젝션하거나, 또는 배아 줄기 세포의 게놈으로 통합시키고 그러한 세포의 핵을 핵이 제거된 난모세포로 전달할 수 있다.

중쇄 및 경쇄가 서로 다른 발현 벡터에서 클로닝될 경우, 벡터를 동시에 트렌스펙션하여 완전한 면역글로불린의 발현 및 어셈블리를 얻는다. 일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 그 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 기타 면역글로불린 형태를 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 비롯한 당업계의 표준 절차에 따라 정제한다(Scopes의 문헌[Protein Purification(Springer-Verlag, N.Y.,(1982)] 참조). 의약용으로는 약 90∼95% 이상의 균질성을 갖는 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 98∼99% 이상의 균질성을 갖는 것이 가장 바람직하다.

7. 항체 단편

항체 단편 역시 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주한다. 한 구체예로 비-인간, 키메라 및/또는 인간 항체의 단편을 제공한다. 또 다른 구체예로 인간화된 항체의 단편을 제공한다. 일반적으로 이들 단편은 항원과의 친화력이 10⁷M^-1이상, 보다 일반적으로는 10⁸또는 10⁹M^-1인 특이적 결합을 나타낸다. 인간화된 항체 단편으로는 개별 중쇄, 경쇄, Fab, Fab', F(Fab')2, Fabc, 및 Fv를 포함한다. 단편은재조합 DNA 기법에 의해, 또는 완전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 제조한다.

8. 동물 모델에서 항체의 치료 효능 테스트하기

7∼9월령의 PDAPP 마우스 그룹의 각각의 마우스에 PBS 중의 폴리클로날 항-Aβ또는 특이적 항-Aβ모노클로날 항체 0.5 mg을 주사한다. 모든 항체 제조물은 내독소 농도가 낮게 되도록 정제한다. Aβ의 단편 또는 장형을 마우스에 주사하고, 하이브리도마를 제조하고, Aβ의 원하는 단편에 특이적으로 결합하면서 Aβ의 다른 비중첩 단편에는 결합하지 않는 항체에 대해 하이브리도마를 스크리닝함으로써 단편에 대한 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.

4개월에 걸쳐 필요할 때마다 마우스에 복강 주사하여 ELISA 역가로 측정한 순환 항체의 농도가 Aβ42 또는 다른 면역원에 대해 ELISA로 측정한 것의 1/1000 이상으로 유지되도록 한다. 역가를 모니터하고, 주사한지 6개월이 지나면 마우스를 안락사시킨다. 사후 마우스로 조직화학분석, Aβ농도 및 독성 테스트를 한다. 한 그룹당 10 마리의 마우스를 사용한다.

9. 제거(clearing) 활성에 대한 항체의 스크리닝

본 발명은 아밀로이드 퇴적물 또는 임의의 다른 항원, 또는 관련 생물학적 실체의 제거 활성이 요구되는 곳에서 이들을 제거하는 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 아밀로이드 퇴적물에 대한 활성을 스크리닝하기 위해서 알츠하이머병 환자 또는 특징적인 알츠하이머 병상을 나타내는 동물 모델의 뇌로부터 얻은 조직 샘플을 Fc 수용체(receptor)를 보유하는 식세포, 예컨대 소교 세포및 테스트 중인 항체와 시험관내의 배지에서 접촉시킨다. 식세포는 1차 세포, 또는 BV-2, C8-B4 또는 THP-1과 같은 세포주일 수 있다. 일부 방법에서는, 성분들을 현미경 슬라이드 상에서 결합하여 현미경 관찰을 용이하게 한다. 어떤 방법에서는 미량역가 디쉬의 웰에서 여러 반응을 동시에 수행한다. 이러한 방식에서는, 개별 미니 현미경 슬라이드를 별도의 웰에 마운팅하거나, 또는 Aβ의 ELISA 검출과 같은 비현미경적 검사법을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 시험관내 반응 혼합물 중의 아밀로이드 퇴적물의 양을 연속적으로 측정하는데, 측정은 반응이 진행되기 전의 기본값에서부터 시작하여 반응 중에 하나 이상의 테스트값을 측정한다. 항원은, 예컨대 Aβ또는 아밀로이드 플라크의 다른 성분에 대해 형광 표지된 항체를 사용하여 염색함으로써 검출할 수 있다. 염색에 사용된 항체는 제거 활성을 테스트하는 항체와 동일한 것일 수도 있고, 동일하지 않을 수도 있다. 아밀로이드 퇴적물의 반응 중에 일어나는 기본값에 대한 상대적인 감소는 테스트되는 항체가 제거 활성을 갖는다는 것을 암시한다. 이러한 항체는 알츠하이머병과 기타 아밀로이드생성 질환을 예방 또는 치료하는 데 유용하게 사용될 가능성이 있다.

다른 유형의 생물학적 실체를 제거하는 활성에 대해 항체를 스크리닝하기 위해 유사한 방법을 이용할 수 있다. 이 분석은 실질적으로 모든 종류의 생물학적 실체에 대한 제거 활성을 검출하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로 생물학적 실체는 인간 또는 동물의 질병에 있어서 일정 역할을 한다. 생물학적 실체는 조직 샘플이나 분리된 형태로서 제공될 수 있다. 조직 샘플로서 제공될 경우 이 조직 샘플은 조직 샘플의 성분에 접근이 용이하도록 고정시키지 않고 고정에 부수적인 성분들의구조를 교란시키지 않도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 분석에스 테스트할 수 있는 조직 샘플의 예로는 암 조직, 전암 증상의 조직, 사마귀(wart 또는 mole)와 같은 양성 종양을 포함하는 조직, 병원성 미생물에 감염된 조직, 염증성 세포로 침윤된 조직, 세포 사이에 병리적 세포간질이 있는 조직(예컨대, 섬유소 심낭염), 비정상 항원을 보유한 조직, 및 흉터 조직을 들 수 있다. 이용될 수 있는 분리된 생물학적 실체의 예로는 Aβ, 바이러스 항원 또는 바이러스, 프로테오글리칸, 다른 병원성 미생물의 항원, 종양 항원 및 점착 분자를 들 수 있다. 이러한 항원들은 천연 공급원으로부터, 재조합 발현 또는 화학적 합성 등에 의해 얻을 수 있다. 조직 샘플 또는 분리된 생물학적 실체를 Fc 수용체를 보유하는 식세포, 예컨대 단핵구 또는 소교 세포 및 테스트하려는 항체와 배지 중에서 접촉시킨다. 항체는 테스트 대상 생물학적 실체 또는 그 실체와 결합된 항원에 대한 것일 수 있다. 후자의 경우, 생물학적 실체가 항원과 함께 대상 식작용되는지를 테스트하는 것이 목적이다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 항체 및 생물학적 실체(때로는 결합된 항원과 함께)는 식세포에 첨가하기 전에 서로 접촉시킨다. 그 후, 존재한다면, 배지 중에 남아 있는 생물학적 실체 및/또는 결합된 항원의 농도를 모니터한다. 배지 중의 항원 또는 결합된 생물학적 실체의 양 또는 농도의 감소는 그 항체가 식세포와 함께 항원 및/또는 결합된 생물학적 실체에 대한 제거 반응을 한다는 것을 암시한다(실시예 IV 참조).

B. 면역제 및 치료제를 암호화하는 핵산

아밀로이드 퇴적물에 대한 면역 반응은 항체 또는 수동 면역화에 사용되는그 성분 사슬을 암호화하는 핵산을 투여하여 유도할 수도 있다. 그러한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 면역원을 암호화하는 핵산 분절은 일반적으로, 환자의 대상 표적 세포에서 DNA 분절이 발현되도록 하는 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 성분에 연결된다. 혈액 세포에서의 발현의 경우, 면역 반응을 유도하기에 바람직한 것과 같이, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자 유래의 프로모터 및 인핸서 성분 또는 CMV 주 초기(immediate early) 프로모터 및 인핸서가 발현을 유도하는 데 적합하다. 연결된 조절 성분 및 암호화 서열은 종종 벡터로 클로닝된다. 이중 사슬 항체의 투여의 경우에는 2개의 사슬을 동일한 또는 상이한 벡터에 클로닝할 수 있다.

레트로바이러스 시스템(예컨대, Lawrie 및 Tumin의 문헌[Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993)] 참조); 아데노바이러스 벡터(Bett 등의 문헌[J. Virol. 67:5911 (1993)] 참조); 아데노-관련 바이러스 벡터(예컨대, Zhou 등의 문헌[J. Exp. Med. 179:1867 (1994)] 참조), 백시니아 바이러스 및 조류 폭스 바이러스를 비롯한 폭스 계열 유래의 바이러스 벡터, 신드비스 및 셈리키 포리스트 바이러스 유래의 것과 같은 알파 바이러스 속 유래의 바이러스 벡터(예컨대, Dubensky 등의 문헌[J. Virol. 70:508 (1996)] 참조), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(Johnston 등의 US 5,643,576) 및 랍도바이러스, 예컨대 수포성구내염 바이러스(Rose의 WO 96/34625 참조) 및 파필로마바이러스(Ohe 등의 문헌[Human Gene Therapy 6:325 (1995)]; Woo 등의 WO 94/12629 및 Xiao & Brandsma의 문헌[Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)] 참조)를 비롯한 다수의 바이러스 벡터 시스템이 유용하다.

면역원을 암호화하는 DNA, 또는 이를 포함하는 벡터를 리포좀으로 패키징할 수 있다. 적절한 지질과 관련 유사체는 Eppstein 등의 미국 특허 제5,208,036호, Felgner 등의 미국 특허 제5,264,618호, Rose의 미국 특허 제5,279,833호 및 Epand 등의 미국 특허 제5,283,185호에 기재되어 있다. 벡터 및 면역원을 암호화하는 DNA는 또한 미립자 캐리어에 흡착시키거나 이와 결합시킬 수 있으며, 캐리어의 예로는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락티드 및 폴리(락티드-코-글리콜리드)가 있다. 예컨대 McGee 등의 문헌[J. Micro Encap. (1996)]을 참조하라.

유전자 요법 벡터 또는 나형(naked) 폴리뉴클레오티드(예컨대, DNA)를 개별 환자에게 투여하여, 통상적으로 전신 투여(예컨대, 정맥, 복강, 비강, 위, 피내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 도포에 의해 생체내로 전달할 수 있다(Anderson 등의 미국 특허 제5,399,346호 참조). "나형 폴리뉴클레오티드"란 용어는 콜로이드성 물질과 복합체되지 않은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 나형 폴리뉴클레오티드는 종종 플라스미드 벡터로 클로닝한다. 이러한 벡터는 부피바카인(Attardo 등의 미국 특허 제5,593,970호)과 같은 촉진제를 더 포함할 수 있다. DNA는 또한 유전자 총을 사용하여 투여할 수 있다. Xiao & Brandsma의 상기 문헌 참조. 면역원을 암호화하는 DNA를 미세 금속 비드의 표면 상에 침전시킨다. 마이크로프로젝타일을 충격파 또는 팽창 헬륨 가스로 가속시켜서, 몇개의 세포 층 깊이로 조직을 관통한다. 예를 들어, 아가세터스 인코포레이티드 미들턴 WI에서 제조한 Accel^TMGene Delivery Device가 적절하다. 대안으로, 나형 DNA는 화학적 또는기계적 자극에 의해 피부 상에 DNA를 스팟팅함으로써 간단하게 피부를 관통하여 혈류로 도입할 수 있다(Howell 등의 WO 95/05853 참조).

또 다른 변형에서, 면역원을 암호화하는 벡터를 생체외의 세포에, 예컨대 개별 환자로부터 외식한 세포(예컨대, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 유니버설 공여체 조혈 줄기 세포에 전달한 다음, 통상적으로 벡터가 혼입되어 있는 벡터를 선별한 후에 그 세포를 환자 재이식할 수 있다.

II. 예방 및 치료 방법

본 발명은 특히, 예컨대 아밀로이드생성 질환의 예방 또는 치료를 위해 환자에서 유익한 치료 반응(예컨대, Aβ의 식작용의 유도, 플라크 존재량의 감소, 플라크 형성의 억제, 신경돌기 영양장애의 감소, 인지 기능의 개선 및/또는 인지력 감퇴의 역행, 치료 또는 예방)을 유발하는 조건 하에 환자에게 Aβ내의 특이적 에피토프에 대한 치료적 면역 제제(예컨대, 인간화된 면역글로불린)를 투여함으로써, 환자의 알츠하이머병 및 기타 아밀로이드생성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아밀로이드생성 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 면역 제제(예컨대, 인간화된 면역글로불린)의 용도에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 "치료"란 용어는 질병, 질병의 증상 또는 질병에 대한 소인을 치유, 치료, 경감, 완화, 변화, 교정, 개선, 향상시키거나 그에 영향을 주기 위한 목적으로, 질병이 있거나 질병의 증상이 있거나 질병의 소인이 있는 환자에게 치료제를 도포 또는 투여하거나, 또는 그 환자로부터 얻은 분리된 조직 또는 세포주에 치료제를 도포 또는 투여하는 것으로 정의된다.

한 양태에서, 본 발명은 환자의 뇌에 있는 Aβ의 아밀로이드 퇴적물과 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 이러한 질환으로는 알츠하이머병, 다운증후군 및 인지력 손상이 있다. 후자는 아밀로이드생성 질환의 다른 특징이 있거나 없는 상태로 발병할 수 있다. 본 발명의 몇몇 방법은 아밀로이드 퇴적물의 한 성분에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 인간 환자에서 알츠하이머병을 예방 또는 치료하는 데 특히 유용하다. 대표적인 방법은 Aβ에 결합하는 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 Aβ의 잔기 1-10 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-3 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-4 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-5 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-6 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-7 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 Aβ의 잔기 3-7 내에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 Aβ의 자유 N-말단 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 Aβ의 잔기 1 및/또는 잔기 7이 아스파르트산인 Aβ의 잔기 1-10 내에 있는 에피토프에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서 본 발명은 전길이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에는 결합하지 않고 Aβ펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서 항체의 이소타입은 인간 IgG1이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 환자 내의 아밀로이드 퇴적물에 결합하여 아밀로이드 퇴적물에 대한 제거 반응을 유도하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 이러한 제거 반응은 Fc 수용체 매개 식작용에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 치료제는 통상 원하지 않는 오염물질이 없는 실질적으로 순수한 형태이다. 이는 제제가 일반적으로 약 50% w/w(중량/중량) 이상의 순도를 가질 뿐 아니라 간섭하는 단백질 및 오염물질이 실질적으로 없음을 의미한다. 때때로 제제는 약 80% w/w 이상, 보다 바람직하게는 90 또는 약 95% w/w 이상의 순도를 갖는다. 그러나, 통상적인 단백질 정제 기법을 이용하면 99% w/w 이상의 균질한 펩티드를 얻을 수 있다.

이 방법은 무증상 환자와 질환의 증상을 보이고 있는 환자 모두에 사용할 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 항체는 본원에 기술된 바와 같이 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 비-인간 항체, 또는 이들의 단편(예컨대, 항원 결합 단편)일 수 있으며, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 Aβ펩티드로 면역화된 인간으로부터 제조된 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는데, 이때 인간은 항체로 처리할 환자일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적 담체와 항체를 약학 조성물로서 투여하는 것을 특징으로 한다. 대안으로, 항체는 1 이상의 항체 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 환자에게 투여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 환자에서 발현되어 항체 사슬을 생산한다. 선택적으로 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다. 폴리뉴클레오티드는 환자에서 발현되어 중쇄 또는 경쇄를생산한다. 대표적인 구체예로서 환자의 혈액 중의 투여된 항체의 농도에 대해 환자를 모니터한다.

따라서, 본 발명은 신경병을 예방 또는 개선시키고, 일부 환자에서는 알츠하이머병과 관련된 인지력 손상을 예방 또는 개선시키기 위한 치료 방법에 대한 오랜 요구를 실현한다.

A. 치료 대상이 될 수 있는 환자

치료 대상이 될 수 있는 환자로는 질병 위험이 있으나 증상을 나타내지 않는개체뿐 아니라 현재 증상을 나타내는 환자가 포함된다. 알츠하이머병의 경우, 고령인 사람이라면 사실상 누구나 알츠하이머병의 발병 위험이 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 대상환자의 위험을 평가할 필요 없이 일반 집단에 예방적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 알츠하이머병의 공지된 유전적 위험 요인이 있는 개체에 유용하다. 이러한 개체에는 이 병에 대한 가족력이 있는 사람, 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 결정되는 위험 요인이 있는 사람이 포함된다. 알츠하이머병에 대한 위험 요인의 유전적 마커에는 APP 유전자 내의 돌연변이, 특히 각각 Hardy 및 Swedish 돌연변이라 불리는 717 위치와, 670 및 671 위치에서의 돌연변이가 포함된다(Hardy의 상기 문헌 참조). 다른 위험 요인 마커로는 프레세닐린 유전자 PS1 및 PS2 내의 돌연변이, ApoE4, AD의 가족력, 고콜레스테롤혈증 또는 아테롬성경화증이 있다. 현재 알츠하이머병이 발병된 개체는 특징적인 치매 증상과 전술한 위험 요인의 존재에 의해 식별할 수 있다. 그 밖에도, AD 환자를 확인하기 위한 다수의 진단 테스트를 이용할 수 있다. 여기에는 CSF tau 및 Aβ42 농도의 측정이 포함된다. 증가된 tau 및 감소된 Aβ42 농도는 AD 발병의 전조가 된다. 알츠하이머 발병 환자는 또한 실시예 섹션에서 기재하는 바와 같은 ADRDA 기준에 의해 진단될 수 있다.

무증상 환자의 경우 치료는 모든 연령대(예컨대, 10세, 20세, 30세)에서 시작할 수 있다. 그러나 일반적으로 환자가 40, 50, 60 또는 70세가 될 때까지 치료를 시작할 필요가 없다. 치료는 일반적으로 장기간에 걸친 다수회의 투여를 포함한다. 치료는 시간에 따른 항체 농도를 분석함으로써 모니터한다. 반응이 떨어지면 추가접종이 필요하다. 잠재적 다운증후군 환자의 경우 모체에서 또는 출생 직후에 치료제를 투여함으로써 출생전에 치료를 시작할 수 있다.

B. 치료 방법 및 투여량

예방적 용도에서는, 약학 조성물 또는 약제를 알츠하이머병에 대한 감수성이 있는 환자 또는 발병 위험이 있는 사람에게, 질병의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 질병의 진행 중에 나타나는 이의 합병증 및 중간 병리적 표현형을 비롯한 질병의 위험 요인을 제거 또는 감소시키거나, 질병의 심각도를 완화시키거나, 또는 질병의 개시를 지연시키기에 충분한 양으로 투여한다. 치료적 용도에서는, 그러한 질병이 의심되는 환자 또는 이미 그 질병에 걸린 환자에게, 질병의 진행 중에 나타나는 합병증 및 중간 병리적 표현형을 비롯한 질병의 증상을 치유하거나, 또는 적어도 부분적으로 지체시키기에 충분한 양으로 조성물 또는 약제를 투여한다.

몇몇 방법에서는, 제제의 투여는 특징적인 알츠하이머 병상을 진행시키지 않은 환자에서 근인지력 손상을 감소 또는 제거한다. 치료적 또는 예방적 치료를 달성하기에 적절한 양은 치료적 또는 예방적 유효량으로 정의된다. 예방 방법과 치료 방법 모두에서, 제제는 충분한 면역 반응이 얻어질 때까지 통상 몇개의 투여량으로 투여된다. "면역 반응" 또는 "면역학적 반응"이란 용어는 수용 피험체에서의 항원에 대한 체액(항체 매개) 및/또는 세포(항원 특이적 T 세포 또는 그 분비 생성물에 의해 매개) 반응의 진행을 포함한다. 이러한 반응은 능동 반응, 즉 면역원의 투여에 의해 유도된 반응, 또는 수동 반응, 즉 면역글로불린 또는 항체 또는 프라이밍된 T-세포의 투여에 의해 유도된 반응일 수 있다.

"면역원성 물질" 또는 "면역원"은 경우에 따라 보조제와 함께 포유동물에 투여하여 그 자체에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 통상, 면역 반응을 모니터하고 면역 반응이 감소하기 시작하면 반복 투여를 실시한다.

전술한 조건의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여된 다른 약제, 및 치료가 예방용인지 치료용인지 여부를 비롯한 다수의 상이한 요인들에 따라 달라진다. 일반적으로 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유동물을 비롯한 비-인간 포유동물도 치료할 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하도록 적정할 필요가 있다.

항체를 사용한 수동 면역화의 경우, 투여량의 범위는 숙주 체중 1 kg당 약 0.0001∼100 mg, 보다 일반적으로는 0.01∼5 mg이다. 예를 들어 투여량은 체중 1 kg당 1 mg 또는 10 mg, 또는 1∼10 mg, 바람직하게는 1 mg 이상일 수 있다. 이러한 용량을 매일, 격일로, 매주, 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라 피험체에 투여할 수 있다. 대표적인 치료법은, 예컨대 6개월 이상의 장기간에 걸쳐 다수회의 투여량으로 투여하는 방법을 포함한다. 또 다른 대표적인 치료 방법은 2주에 한번 또는 1달에 한번, 또는 3∼6개월에 한번 투여하는 것을 포함한다. 대표적인 투여량 스케쥴은 매일 1∼10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일로 30 mg/kg, 또는 매주 60 mg/kg 투여하는 방법이 있다. 어떤 방법에서는 상이한 결합 특이성을 갖는 2종 이상의 모노클로날 항체를 동시에 투여하며, 이 경우 투여된 각 항체의 투여량은 상기 범위에 속한다.

항체는 일반적으로 여러번에 걸쳐 투여한다. 1회 투여의 간격은 1주 간격, 1달 간격 또는 1년 간격일 수 있다. 간격은 또한 환자의 Aβ에 대한 항체의 혈중 농도를 측정한 결과에 따라 정기적일 수 있다. 어떤 방법에서는 투여량은 혈장 항체 농도가 1∼1000 ㎍/㎖이 되도록, 어떤 방법에서는 25∼300 ㎍/㎖이 되도록 조절한다. 대안으로 항체는 지속 방출형 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 투여 빈도가 줄어든다. 투여량과 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내며, 그 다음으로 인간화된 항체, 키메라 항체, 비-인간 항체 순이다.

투여량과 투여 빈도는 치료가 예방용이냐 치료용이냐에 따라 달라질 수 있다. 예방용인 경우, 본 발명의 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 아직 병에 걸리지 않은 환자에 투여하여 환자의 내성을 강화시킨다. 이러한 양을 "예방적 유효량"이라 정의한다. 이러한 용도에서는, 정확한 양은 역시 환자의 건강 상태 및 전신 면역 상태에 좌우되지만, 일반적으로 1회 투여량당 0.1∼25 mg, 특히 0.5∼2.5 mg이다. 비교적 낮은 투여량은 장기간에 걸쳐 비교적 뜸하게 투여한다. 일부 환자에게는 그 여생 동안 치료를 계속한다.

치료적 용도에서는, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자의 질병 증상을 부분적으로 또는 완전히 개선될 때까지 비교적 고용량(예컨대, 1회 용량당 약 1∼200 mg의 항체, 5∼25 mg의 투여량이 보다 일반적으로 사용됨)을 비교적 단기간에 투여할 필요가 종종 있다. 그 후 환자에 예방적 요법으로 투여할 수 있다.

항체를 암호화하는 핵산에 대한 용량은 환자 1인당 약 10 ng∼1 g, 100 ng∼100 mg, 1 ㎍∼10 mg, 또는 30∼300 ㎍의 DNA이다. 감염성 바이러스 벡터에 대한 용량은 1회 용량당 10∼100 이상의 비리온으로 다양하다.

치료제는 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 비경구, 국소, 정맥, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 근육내를 통해 투여할 수 있다. 면역원 물질의 가장 대표적인 투여 경로는 피하 경로이지만, 다른 경로도 동일하게 유효할 수 있다. 그 다음으로 일반적인 경로는 근육 주사이다. 이러한 주사 유형은 팔이나 다리 근육에 실시되는 것이 가장 일반적이다. 일부 방법에서는, 제제를 퇴적물이 축적되어 있는 특정 조직에 직접 주사하는데, 예컨대 두개내 주사가 있다. 근육 주사 또는 정맥 주입이 항체 투여를 위해 바람직하다. 몇몇 방법에서는 특정 치료적 항체를 두개내에 직접 주사한다. 일부 방법에서는 항체를 지속 방출형 조성물 또는 디바이스(예컨대, Medipad^TM디바이스) 형태로 투여한다.

본 발명의 제제는 선택적으로 아밀로이드생성 질환의 치료에 적어도 부분적으로 효과적인 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 아밀로이드 퇴적물이 뇌에 발생하는 알츠하이머병 및 다운증후군의 경우, 혈뇌 장벽을 관통하는 본 발명의 제제의 통과를 증가시키는 다른 제제와 함께 투여될 수도 있다.

C. 약학 조성물

본 발명의 제제는 종종 활성 치료제와 각종 다른 약학적 허용 성분들을 포함하는 약학 조성물로서 투여된다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)]을 참조하라. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식과 치료 용도에 따라 달라진다. 이 조성물은 또한 목적하는 제제에 따라 약학적으로 허용되는 비독성의 담체 또는 희석제를 포함하며, 이러한 것들은 동물 또는 인간 투여를 위한 약학 조성물을 조제하는 데 통상적으로 사용되는 비이클로서 정의된다. 희석제는 배합물의 생물학적 활성에 영향을 주지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예로는 증류수, 생리적 인산염 완충 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 행크스액이 있다. 그 밖에도, 약학 조성물 또는 제제는 담체, 보조제 또는 비독성, 비치료성, 비면역원성의 안정화제 등을 함유할 수도 있다.

약학 조성물은 또한 크기가 크고 대사가 느린 고분자, 예컨대 단백질, 다당류, 예컨대 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예컨대, 라텍스 기능성 세파로스(TM), 아가로스, 셀룰로스 등), 중합 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집체(예컨대, 오일 소적 또는 리포좀)을 함유할 수도 있다. 또한 이들 담체는면역 자극제(즉, 면역증강 보조제)로서 작용할 수 있다.

비경구 투여의 경우, 본 발명의 제제는 물, 오일, 염수, 글리세롤, 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수 있는 약학적 담체와 함께 생리적 허용 희석제 중의 성분의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 제형으로서 투여될 수 있다. 또한, 보조 성분, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 성분 등이 조성물에 포함될 수 있다. 약학 조성물의 다른 성분들에는 석유, 동물유, 식물유 또는 합성유, 예컨대 땅콩유, 대두유 및 광유가 있다. 일반적으로, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이, 특히 주사액으로 바람직한 액상 담체이다. 항체는 디포우 주사 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있으며, 이는 활성 성분의 지속 방출을 가능하게 하는 방식으로 제제화될 수 있다. 대표적인 조성물은 50 mM L-히스티딘, 150 mM NaCl로 구성된 수성 완충액(HCl을 사용하여 pH를 6.0으로 조정) 중에 제형화된 모노클로날 항체를 5 mg/㎖의 농도로 포함한다.

일반적으로 조성물은, 액체 용액 또는 현탁액 형태의 주사제로서 제조되며, 주사하기 전에 액체 비이클 중의 용액 또는 현탁액으로 만들기에 적합한 고체 형태로 제조될 수도 있다. 이 제제는 또한 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 전술한 바와 같은 면역 증강 보조 효과를 위한 공중합체와 같은 리포좀 또는 마이크로 입자 내에 유화 또는 캡슐화시킬 수 있다(Langer의 문헌[Science 249: 1527 (1990)] 및 Hanes의 문헌[Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)] 참조). 본 발명의 제제는 디포우 주사제 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있으며, 이는 활성 성분의 지속적 또는 박동성 방출을 가능하게 하는 방식으로 제조될 수 있다.

다른 투여 방식에 적합한 또 다른 제제로는 경구, 비강내, 및 폐 제제, 좌제, 및 경피 도포제가 있다. 좌제의 경우 결합제 및 담체는, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함하며, 이러한 좌제는 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2%의 활성 성분을 함유하는 혼합물로 제조될 수 있다. 경구 제제는 부형제, 예컨대 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스 및 탄산마그네슘을 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 필, 캡슐, 지속 방출형 제제 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며, 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 함유한다.

국소 도포에 의하면 경피 또는 피내 전달이 이루어질 수 있다. 국소 도포는 콜레라 독소 또는 독성이 제거된 이의 유도체 또는 서브유닛 또는 기타 유사한 박테리아 독소와 제제를 동시에 투여함으로써 촉진시킬 수 있다(Glenn 등의 문헌[Nature 391, 851 (1998)] 참조). 동시 투여는 화학적 가교에 의해 얻은 혼합물 또는 가교된 분자 형태의 성분을 사용하거나 융합 단백질 형태로 발현시켜서 수행할 수 있다.

대안으로, 경피 전달은 피부 경로를 이용하거나 트랜스페로좀을 이용하여 수행할 수 있다(Paul 등의 문헌[Eur. J. Immunol. 25:3521 (1995)]; Cevc 등의 문헌[Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15 (1998)] 참조).

III. 치료 과정의 모니터

본 발명은 알츠하이머병에 걸린 환자 또는 발병 위험이 있는 환자에서 치료 과정을 모니터하는 방법, 즉 환자에 실시된 치료 방법의 과정을 모니터하는 방법을제공한다. 이 방법은 증상이 있는 환자에 대한 치료적 처치 및 무증상 환자에 대한 예방적 처치 모두를 모니터하는 데 이용될 수 있다. 특히, 이 방법은 수동 면역화를 모니터하는 데(예컨대, 투여된 항체의 농도를 측정하는 데) 유용하다.

몇몇 방법은, 예컨대 제제를 투여하기 전에 환자의 항체 농도 또는 프로필의 기본값을 측정하여 이 값을 치료 후의 프로필 또는 농도에 대한 값과 비교하는 것을 포함한다. 농도 또는 프로필의 값의 유의적 증가(즉, 같은 샘플에서 반복 측정한 결과 실험적 오차의 통상적인 최저 한도를 초과하는 값, 이러한 측정값의 평균±1(표준 편차)로 나타냄)는 양의 치료 결과를 의미한다(즉, 제제의 투여가 원하는 반응을 나타냄). 면역 반응에 대한 값이 유의적으로 변화하지 않거나, 또는 감소하는 경우 음의 치료 결과로 표시된다.

다른 방법에서는, 농도 또는 프로필의 대조군 값(즉, 평균 및 표준 편차)을 대조군 집단에 대해 측정한다. 일반적으로, 대조군 집단의 개체는 이전의 치료를 받지 않았다. 그 후 치료제를 투여한 후 환자의 농도 또는 프로필의 측정값과 대조군 값을 비교한다. 대조군 값에 비해 유의적인 증가(예컨대, 평균에서 1 표준 편차 이상)는 양의, 즉 충분한 치료 결과를 의미한다. 유의적인 증가가 없거나 감소되는 것은 음의, 즉 불충분한 치료 결과를 의미한다. 제제의 투여는 농도가 대조군 값에 비해 증가하는 동안 대체로 지속된다. 이전과 같이, 대조군 값에 비해 평탄역에 도달하는 것은 치료제의 투여를 중단할 수 있거나 투여량 및/또는 빈도를 감소시킬 수 있다는 표시이다.

다른 방법으로, 농도 또는 프로필의 대조군 값(예컨대, 평균 및 표준 편차)은 치료제로 치료한 개체, 및 농도 또는 프로필이 치료에 반응하여 평탄역에 도달한 개체의 대조군 집단으로부터 결정한다. 환자의 농도 또는 프로필의 측정값을 대조군 값과 비교한다. 환자에서 측정된 농도가 대조군 값과 유의적인 차이를 나타내지 않는다면(예컨대, 1 표준 편차 이상) 치료를 중단할 수 있다. 환자에서의 농도가 대조군 값보다 유의적으로 낮다면 제제를 계속 투여해도 된다. 환자에서의 농도가 대조군 값보다 지속적으로 낮은 것은 치료 방법을 변화시킬 필요가 있음을 의미한다.

다른 방법으로, 현재 치료를 받고 있지는 않지만 이전에 치료를 받은 적이 있는 환자를 치료 재개가 필요한지를 결정하기 위해 항체 농도 또는 프로필에 대해 모니터한다. 이 환자에서 측정된 농도 또는 프로필을 이전 치료 과정 후에 그 환자에게서 얻은 기존의 값과 비교할 수 있다. 기존의 측정값에 비해 유의적인 감소를 보인다면(즉, 같은 샘플로 반복 측정한 결과 통상적인 오차 한계보다 크다면) 치료를 재개할 수 있음을 암시하는 것이다. 대안으로, 환자에서 측정한 값을 치료 과정을 겪은 후의 환자 집단에서 측정한 대조군 값(평균 + 표준 편차)과 비교할 수 있다. 대안으로, 환자의 측정값을 질병의 증상이 없는 상태인 예방 치료 환자의 집단, 또는 질병 특징의 개선을 보이는 치료 대상 환자의 집단에서의 대조군 값과 비교할 수 있다. 이러한 경우 모두에서, 대조군 값에 비해 유의적인 감소(즉, 1 표준 편차 이상)는 환자의 치료가 재개되어야 함을 의미하는 것이다.

분석용 조직 샘플은 통상 환자로부터 채취한 혈액, 혈장, 혈청, 점액 또는 뇌척수액이다. 이 샘플을, 예컨대 Aβ펩티드에 대한 항체의 농도 또는 프로필, 예컨대 인간화된 항체의 농도 또는 프로필에 대해 분석한다. Aβ에 특이적인 항체를 검출하는 ELISA 방법에 대해서는 실시예 부분에 기재되어 있다. 일부 방법에서는 투여된 항체의 농도 또는 프로필을, 예컨대 본원에서 기재하는 바와 같은 시험관내 식작용 분석을 통해 제거 분석(clearing assay)을 이용하여 측정한다. 이러한 방법에서는, 테스트 대상 환자로부터 얻은 조직 샘플을 아밀로이드 퇴적물(예컨대, PDAPP 마우스에서 유래된 것) 및 Fc 수용체를 보유하는 식세포와 접촉시킨다. 그 후 아밀로이드 퇴적물의 후속 제거 과정을 모니터한다. 제거 반응의 존재와 정도는 테스트 대상 환자의 조직 샘플 중의 Aβ를 제거하는 데 효과적인 항체의 존재 및 농도의 지표가 된다.

수동 면역화 후의 항체 프로필은 일반적으로 항체 농도가 즉시 최고점에 도달한 후 지수적으로 감소하는 양상을 보인다. 후속 투여가 없다면 투여된 항체의 반감기에 따라 수일∼수개월 내에 치료전의 농도로 감소한다. 예를 들어, 일부 인간 항체의 반감기는 20일 정도이다.

몇몇 방법에서는, 환자 중의 Aβ에 대한 항체의 기본값 측정은 투여 전에 이루어지며, 그 직후에 최고 항체 농도를 측정하기 위해 2차 측정이 이루어지고, 항체 농도의 감소를 모니터하기 위해 간격을 두고 1회 이상의 추가 측정을 실시한다. 항체의 농도가 기본값 또는 최고값 - 기본값의 미리 정해놓은 비율(예컨대, 50%, 25% 또는 10%)로 떨어질 경우, 추가 투여량의 항체를 투여한다. 몇몇 방법에서는, 최고 농도 또는 후속 측정 농도 - 백그라운드를 미리 측정한 기준 농도와 비교하여 다른 환자에서의 유익한 예방적 또는 치료적 처치법을 구성한다. 측정된 항체 농도가 기준 농도보다 유의적으로 낮다면(예컨대, 치료로부터 이익을 얻는 환자의 집단에서의 기준값의 평균 - 1 표준 편차보다 적다면) 추가량의 항체를 투여해야 한다는 것을 의미한다.

그 밖의 방법에는 치료 과정 전반에 걸친 모니터, 아밀로이드생성 질환(예컨대, 알츠하이머병)의 진단 또는 모니터를 위해 연구자 또는 의사가 통상적으로 의존하는 당업계에 공지된 임의의 생리적 증상(예컨대, 신체적 또는 정신적 증상) 의 관찰이 있다. 예를 들어, 인지기능 손상을 모니터할 수 있다. 후자는 알츠하이머병 및 다운증후군의 증상이나, 이들 질환 중 어느 하나의 다른 특징없이 나타날 수도 있다. 예를 들어, 인지력 손상은 치료 과정에 걸쳐 협약에 따라 간이 정신 상태 검사(Mini-Mental State Exam)에서의 환자의 점수를 결정함으로써 모니터할 수 있다.

C. 키트

본 발명은 또한 전술한 모니터 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 일반적으로 이러한 키트는 Aβ에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 제제를 포함한다. 이 키트는 또한 표지를 포함할 수 있다. Aβ에 대한 항체의 검출을 위해 표지는 일반적으로 표지된 항-이디오타입 항체의 형태로 존재한다. 항체의 검출을 위해, 제제는 고체상에 미리 결합된 상태로, 예컨대 미량역가 디쉬의 웰에 결합된 형태로 제공된다. 키트는 또한 일반적으로 키트의 사용에 관한 설명서를 제공하는 라벨링을 포함한다. 라벨링은 Aβ에 대한 항체의 농도와 측정된 표지의 농도를 서로 연관시키는 차트 또는 기타 상응하는 수단을 포함할 수 있다. 라벨링이란 용어는 제조, 운송, 판매 또는 사용시의 어느 시점에나 키트에 부착되거나 또는 다른 방식으로첨부되어 있는 임의의 문서 또는 기록재를 말한다. 예를 들어 라벨링은 광고용 소책자 및 브로셔, 포장 재료, 설명서, 오디오 또는 비디오 카세트, 컴퓨터 디스크뿐만 아니라 키트 상에 직접 인쇄된 문자를 포함한다.

본 발명은 또한 진단 키트, 예를 들어 연구, 검출 및/또는 진단 키트(예컨대 생체내 영상화를 수행하기 위한 키트)를 제공한다. 이러한 키트는 일반적으로 Aβ의 에피토프에, 바람직하게는 잔기 1-10 내의 에피토프에 결합하기 위한 항체를 포함한다. 바람직하게는 이 항체는 표지되거나, 아니면 2차 표지화 시약이 이 키트에 포함된다. 바람직하게는 키트는 목적하는 용도의 수행을 위한, 예컨대 생체내 영상화 분석의 수행을 위한 설명서로 라벨링된다. 대표적인 항체에 대해서는 본원에서 설명한다.

D. 생체내 영상화

본 발명은 환자의 아밀로이드 퇴적물을 생체내 영상화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 알츠하이머병, 또는 이 병에 대한 감수성을 진단하거나 진단을 확인하는 데 유용하다. 예를 들어 이 방법은 치매 증상을 보이는 환자에 사용될 수 있다. 환자에 비정상적인 아밀로이드 퇴적물이 존재한다면 이 환자는 알츠하이머병에 걸릴 가능성이 있다. 이 방법은 또한 무증상 환자에서 사용될 수 있다. 비정상적인 아밀로이드 퇴적물의 존재는 미래의 증상적 질환에 대한 감수성의 지표가 된다. 이 방법은 또한 이미 알츠하이머병으로 진단된 환자에서 병의 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터하는 데 유용하다.

이 방법은 Aβ에 결합하는 항체와 같은 제제를 투여한 후 이 제제가 결합된물질을 검출하는 방식으로 수행된다. 바람직한 항체는 전길이 APP 폴리펩티드에 결합하지 않으면서 환자의 Aβ퇴적물에 결합한다. 아미노산 1-10 내의 Aβ의 에피토프에 결합하는 항체가 특히 바람직하다. 몇몇 방법에서는, 항체는 Aβ의 아미노산 7-10 내의 에피토프에 결합한다. 이러한 항체는 일반적으로 실질적인 제거 반응을 유도하지 않고 결합한다. 다른 방법에서는 항체는 Aβ의 아미노산 1-7 내의 에피토프에 결합한다. 이러한 항체는 일반적으로 Aβ에 결합하여 Aβ에 대한 제거 반응을 유도한다. 그러나, 제거 반응은 Fab와 같은 전길이 불변 영역이 없는 항체 단편을 사용하여 피할 수 있다. 어떤 방법에서는 동일한 항체가 치료제와 진단제로 동시에 사용될 수 있다. 일반적으로, Aβ의 C-말단에서 잔기 10까지의 에피토프에 결합하는 항체는 잔기 1-10 내의 에피토프에 결합하는 항체와 같은 강한 시그널을 나타내지 않는데, 그 이유는 C-말단 에피토프가 아밀로이드 퇴적물에 접근할 수 없기 때문인 것으로 보인다. 따라서 이러한 항체는 덜 바람직하다.

진단 시약은 환자의 체내에 정맥 주사하거나, 또는 두개내 주사를 통해, 또는 두개골에 구멍을 뚫어 뇌에 주사하여 투여한다. 시약의 투여량은 치료 방법에 대한 것과 동일한 범위로 사용되어야 한다. 일반적으로 시약은 표지되지만, 몇몇 방법에서는 Aβ에 대한 친화력을 갖는 1차 시약에 표지하지 않고, 2차 표지화제를 사용하여 1차 시약을 결합시킨다. 표지의 선택은 검출 수단에 따라 달라진다. 예를 들어 광학적 검출에는 형광 표지가 적합하다. 상자성 표지의 사용은 수술을 이용하지 않고 X선 단층 촬영으로 검출하는 데 적합하다. 방사선 표지는 PET 또는 SPECT를 사용하여 검출할 수도 있다.

진단은 표지된 위치의 수, 크기 및/또는 강도와 상응하는 기본값을 비교하여 실시한다. 기본값은 병에 걸리지 않은 개체 집단에서의 평균값을 대표할 수 있다. 기본값은 또한 동일한 환자에서 측정된 이전 수준을 나타낼 수도 있다. 예를 들어 기본값은 치료 시작 전의 환자에서 측정하여, 그 후 측정된 값과 기본값을 비교한다. 기본값에 비해 값이 감소된 것은 치료에 대한 반응이 양성임을 의미하는 것이다.

본 발명을 하기의 비제한적인 실시예를 통해 보다 충분히 설명할 것이다.

실시예 I: 항-Aβ항체의 치료 효능: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12 및 pAb Aβ1-42

이 실시예에서는 이형접합 트랜스제닉 마우스의 뇌 속의 Aβ의 축적을 억제하는 능력에 대해 Aβ에 대한 다양한 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 테스트한다.

A. 실험 디자인

8.5∼10.5월령의 암수 이형접합 접합 PDAPP 트랜스제닉 마우스 60 마리를 찰스 리버 래버러토리로부터 입수하였다. 이 마우스를 Aβ에 대한 다양한 항체로 처리할 6개 그룹으로 나누었다. 그룹 내의 마우스는 성별, 월령, 혈통 및 공급처를 가능한 한 가깝게 일치시키도록 분배하였다. 하기 표 2는 실험 디자인을 나타낸 것이다.

상기 표 2에서 알 수 있듯이, 항체는 4가지의 쥐 Aβ-특이적 모노클로날 항체, 즉 2H3(Aβ잔기 1-12에 대한 것), 10D5(Aβ잔기 3-7에 대한 것), 266(Aβ잔기 13-28에 대한 것, 가용성 AN1792에는 결합하지만 응집된 AN1792에는 결합하지 않음), 21F12(Aβ잔기 33-42에 대한 것)를 포함한다. 제5 그룹에는 Aβ-특이적 폴리클로날 항체 분획(응집된 AN1792로 면역화하여 생성한 것)으로 처리하였다. 음성 대조군에는 항체 없이 희석제인 PBS만을 투여하였다.

B. 처리 과정의 모니터

모노클로날 항체를 약 10 mg/kg의 용량으로 주사하였다(마우스의 체중을 50 g으로 가정). 28주의 처리 기간 동안 항체 역가를 모니터하였다. 항-Aβ역가를 1000 이상으로 유지하기 위해 평균 7일에 1회씩 복강 주사하였다. mAb 266은 분석에서 캡쳐 항원으로서 사용된 응집된 AN1792에 잘 결합하지 않기 때문에 mAb 266에대해서는 낮은 역가가 측정되었지만, 이 그룹에 대해 동일한 투여량 스케쥴을 유지하였다. 모노클로날 항체 2H3를 투여한 그룹은 항체가 체내에서 급속히 제거되므로 처음 3주 내에 중단하였다.

항체 역가의 측정을 위해 각 그룹에서 무작위로 선택한 3 마리의 마우스의 부분 집단을 매 복강 주사 직전에 채혈하였으며, 총 채혈 횟수는 30회였다. 일반적인 재료 및 방법 섹션에서 상세히 설명하는 대로 Aβ1-42로 코팅한 플라스틱 멀티-웰 플레이트를 사용하여 샌드위치 ELISA를 통해 Aβ1-42-결합 항체로서 항체 역가를 측정하였다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체 10D5 및 21F12에 대한 매 채혈시의 평균 역가는 하기 표 3에 기재하였다.

폴리클로날 항체 제제의 경우 이 기간 동안의 역가의 평균값은 약 1000이었으며, 10D5 및 21F12를 처리한 동물의 경우 이 수치보다 약간 높았다.

처리는 총 196일 동안 6개월에 걸쳐 계속하였다. 마지막 투여 1주일 후 동물들을 안락사시켰다.

C. 뇌 속의 Aβ및 APP 농도

다양한 항-Aβ항체 제제로 처리한 지 약 6개월 후, 염수 관류를 하여 동물들로부터 뇌를 제거하였다. 한쪽 반구로는 면역조직화학적 분석을 준비하고, 다른 쪽 반구는 Aβ및 APP 농도의 정량에 사용하였다. 다양한 형태의 베타 아밀로이드 펩티드 및 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 농도를 측정하기 위해, 반구를 절개하고, 해마, 피질 및 소뇌 영역의 균질물을 5 M 구아니딘 중에서 준비하였다. 이것들을 연속 희석시키고, ELISA 포맷에서 알고 있는 농도의 Aβ펩티드 및 APP 기준 물질의 연속 희석액과 비교하여 아밀로이드 펩티드 또는 APP의 농도를 정량하였다.

피질 및 해마의 균질물로 ELISA에 의해 측정한 총 Aβ및 Aβ1-42의 농도 및 소뇌에서의 총 Aβ의 농도를 각각 표 4, 5 및 6에 기재하였다. PBS를 접종한 대조군의 경우 총 Aβ의 중간 농도는 피질보다 해마에서 3.6배 더 높았다(해마 조직의 중간값은 63,389 ng/g인데 비해 피질의 경우 17,818 ng/g). 대조군의 소뇌에서의 중간 농도(30.6 ng/g 조직)는 해마에서보다 2,000배 이상 더 낮았다. 이러한 농도는 같은 월령의 이형접합 PDAPP 트랜스제닉 마우스에 대해 기존에 보고된 것과 유사하다(Johnson-Wood 등의 상기 문헌).

피질의 경우, 폴리클로날 항-Aβ항체를 접종한, 한 처리 그룹은 Aβ1-42로 측정시 대조군의 것과 유의적으로 다른(p<0.05) 중간 Aβ농도를 나타내었으며, 이를 하기 표 4에 기재하였다. 이 처리 그룹의 경우 Aβ1-42의 중간 농도는 대조군에 비해 65% 감소하였다. Aβ1-42의 중간 농도 역시, mAb 10D5를 투여한 동물인 또 다른 한 처리 그룹에서 대조군에 비해 55% 감소하였다(p=0.0433).

해마에서는, 폴리클로날 항-Aβ항체의 처리와 관련된 총 Aβ의 중간 비율 감소(50%, p=0.0055)가 피질에서 관찰된 것(65%)만큼 크지 않았다(표 5). 그러나, 절대적 감소 정도는 피질에서보다 해마에서 거의 3배 더 컸으며, 해마에서의 순수한 감소는 31,683 ng/g 조직이었고, 피질에서는 11,658 ng/g 조직이었다. 총 Aβ형태보다는 아밀로이드가 더 많이 생성된 Aβ형태인 Aβ1-42의 농도로 측정하였을 때 폴리클로날 항체에 의해 얻어지는 감소가 유의적이었다(p=0.0025). mAb 10D5 및 266을 처리한 그룹 내의 중간 농도는 각각 33% 및 21% 감소하였다.

소뇌에서도 총 Aβ를 측정하였다(표 6). 폴리클로날 항-Aβ및 266 항체를 투여한 그룹은 총 Aβ의 유의적인 농도 감소를 나타내었고(각각 43% 및 46%,p=0.0033 및 p=0.0184), 10D5를 처리한 그룹은 유의적인 수준에 가까운 감소를 나타내었다(29%, p=0.0675).

항체 처리 마우스, 대조군 마우스 및 PBS 처리 마우스로부터 얻은 피질 및 소뇌에서도 ELISA에 의해 APP 농도를 측정하였다. 2종의 상이한 APP 분석을 이용하였다. APP-α/FL로 표시되는 첫번째 분석은 APP-알파(α, Aβ서열 내에서 절단된 APP의 분비형)와 APP의 전길이형(FL)을 둘다 인식하는 반면, 두번째 분석은 APP-α만을 인식한다. 처리 그룹의 일부군에 나타나는 처리에 의한 Aβ의 감소와는 달리, APP의 농도는 대조군 동물에 비해 처리된 동물 모두에서 사실상 변하지 않았다. 이러한 결과는 Aβ항체를 사용한 면역화가 APP를 고갈시키지 않고 Aβ를 고갈시킨다는 것을 암시한다.

요약하면, Aβ농도는 AN1792에 대해 생성된 폴리클로날 항체를 처리한 동물의 피질, 해마 및 소뇌에서 유의적으로 감소하였다. Aβ1-42의 아미노 말단 영역, 구체적으로 아미노산 1-16 및 13-28에 대한 모노클로날 항체 역시 더 적은 정도이지만 유의적인 처리 효과를 나타내었다.

D. 조직화학적 분석

PBS, 폴리클로날 Aβ42, 21F12, 266 및 10D5 처리 그룹의 마우스로부터 제거한 뇌의 부분군에서의 Aβ-면역반응성 플라크의 형태를 Aβ42를 사용한 표준 면역화 절차에 따라 실시한 이전 실험에서의 형태와 정성적으로 비교하였다.

폴리클로날 Aβ-42 항체로 면역화한 동물에서 아밀로이드 플라크의 정도 및 외관 모두가 크게 변화되었다. 아밀로이드 양의 감소, 붕괴된 플라크 형태 및 세포에 결합된 Aβ의 면역반응성은 표준 면역화 절차에 의해 유발된 효과를 매우 유사한 정도로 나타내었다. 이러한 관찰은 총 Aβ및 Aβ42 모두의 유의적인 감소가 폴리클로날 Aβ42 항체의 투여에 의해 이루어진다는 ELISA 결과를 지지한다.

유사한 정성적 평가에서, 10D5 그룹에서의 아밀로이드 플라크는 그 수와 외관이 모두 감소하였으며, 세포 결합형 Aβ의 면역반응성도 이를 어느 정도 입증한다. 대조군 동물에 비해, Aβ에 대한 폴리클로날 Ig 분획 및 모노클로날 항체 중 하나(10D5)는 플라크 존재량을 각각 93% 및 81% 감소시켰다(p<0.005). 21F12는 플라크 존재량에 비교적 약한 영향을 미쳤다. pAbAβ_1-42를 처리한 후의 뇌의 현미경 사진은, 대조군 동물에 비해 pAbAβ_1-42처리 그룹에서는 확산된 퇴적물과, 다수의더 큰 밀집된 형태의 플라크가 없음을 보여준다.

E. 림프구 증식성 반응

마지막 항체 투여 8일 후에 회수한 비장 세포를 이용하여 Aβ-의존적 림프구 증식을 측정하였다. 웰당 10⁵개의 새로 회수된 세포를 자극을 위한 농도 5 μM로 Aβ1-40의 존재 하에 5일간 배양하였다. 양성 대조군으로서 추가 세포를 T 세포 마이토젠인 PHA와 배양하였고, 음성 대조군으로서 펩티드를 첨가하지 않고 세포를 배양하였다.

다양한 항-Aβ항체로 수동 면역화한 노령의 PDAPP 마우스 유래의 비장 세포를 AN1792를 사용하여 시험관내에서 자극하고, 증식 및 사이토카인 반응을 측정하였다. 이 분석의 목적은 수동 면역화가 항체 제시를 촉진함으로써 AN1792에 특이적인 T 세포 반응을 프라이밍하는지를 측정하는 것이었다. 항-Aβ항체로 수동 면역화한 마우스에서는 AN1792-특이적 증식 또는 사이토카인 반응이 관찰되지 않았다.

실시예 II: 항-Aβ항체의 치료 효능: mAb 2H3, mAb 10D5, mAb 266, mAb 21F12, mAb 3D6, mAb 16C11 및 pAb Aβ1-42

두번째 실험에서는, 10D5를 사용한 처리를 반복하고, 2종의 추가적인 항-Aβ항체, 즉 모노클로날 3D6(Aβ1-5) 및 16C11(Aβ33-42)을 테스트하였다. 대조군에는 PBS 또는 비관련의 이소타입이 일치하는 항체(TM2a)를 접종하였다. 마우스는 이전 실험에 사용한 것보다 더 늙은 것이었으며(11.5∼12월령의 이형접합체), 그 외의 실험 디자인은 동일하였다. 역시 처리 6개월 후 10D5는 PBS 또는 이소타입이 일치하는 항체 대조군의 것에 비해 80% 이상 플라크 존재량을 감소시켰다(p=0.003). Aβ에 대한 다른 항체 중 하나인 3D6는 동일한 효과를 나타내었으며, 86% 감소를 유발하였다(p=0.003). 이와는 대조적으로, 펩티드 16C11에 대한 제3의 항체는 플라크 존재량에 어떠한 영향도 미치지 못했다. Aβ42 ELISA 측정에서도 유사한 결과가 얻어졌다.

이러한 결과는, T 세포 면역 부재시의 Aβ펩티드에 대한 항체 반응은 PDAPP 마우스에서 아밀로이드 퇴적물을 감소시키는 데에는 충분하지만, 모든 항-Aβ항체가 똑같이 유효한 것은 아님을 입증하는 것이다. Aβ의 아미노산 1-5 또는 3-7을 포함하는 에피토프에 대한 항체는 특히 효과적이다. 요약하면, Aβ에 대해 수동적으로 투여된 항체(즉, 수동 면역화)는 알츠하이머병의 마우스 모델에서 플라크 퇴적의 정도를 감소시킨다는 것을 알 수 있다.

실시예 III: CNS에서의 항체 결합 모니터

이 실시예에서는 별로 높지 않은 혈청 농도(25∼70 ㎍/㎖)로 유지할 때에도 항체가 β-아밀로이드 플라크에 부착하기에 충분한 농도로 CNS에 접근할 수 있음을 보여준다.

Aβ에 대한 항체가 CNS 내에서 직접적으로 작용할 수 있는지를 확인하기 우해, 실시예 II의 후반부에 염수로 관류한 마우스로부터 취한 뇌를 말초에 투여된 항체의 존재에 대해 관찰하였다. 비고정된 저온 유지 뇌 절편을 마우스 면역글로불린(염소 항-마우스 IgG-Cy3)에 대한 형광 시약에 노출시켰다. 10D5 및 3D6 그룹의 뇌에 있는 플라크는 항체에 의해 강하게 염색되었으나 16C11 그룹에서는 염색이 되지 않았다. 플라크 퇴적물의 전체적인 정도를 파악하기 위해, 각 뇌의 연속 절편을 먼저 항-Aβ항체와 면역반응시킨 다음 2차 시약과 면역반응시켰다. 말초 투여 후 10D5 및 3D6는 CNS 내의 대부분의 플라크에 도달하였다. 플라크 존재량은 16C11그룹에 비해 이들 처리 그룹에서 크게 감소하였다. CNS로의 항체 진입은 혈뇌 장벽의 비정상적인 누출에 의한 것이 아니었는데, 그 이유는 PDAPP 마우스에서 에반스 블루로 측정시 혈관 투과성이 증가하지 않았기 때문이다. 또한, 고령의 PDAPP 마우스의 뇌 실질에서의 항체의 농도는 비-트랜스제닉 마우스에서와 동일하였으며, 혈청 중 항체 농도는 0.1%로 나타났다(이소타입과 무관함).

이러한 데이터는 말초에 투여된 항체가 이들이 아밀로이드 제거를 직접적으로 촉발할 수 있는 CNS에 진입할 수 있음을 암시하는 것이다. 16C11 역시 플라크에 접근하였으나 그에 결합하지는 않는 것으로 보인다.

실시예 IV: 아밀로이드 퇴적물에 대한 항체 활성에의 생체외 스크리닝 분석

항체가 플라크 제거에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 본 발명자들은 PDAPP 마우스 또는 인간 AD 뇌의 비고정된 저온 유지 절편과 함께 1차 소교 세포를 배양하는 생체외 분석을 확립하였다. 소교 세포는 신생 DBA/2N 마우스(1∼3일)의 뇌 피질로부터 취하였다. 피질을 50 ㎍/㎖의 DNase I(시그마)을 함유하는 HBSS^--(Hanks' Balanced Salt Solution, 시그마) 중에서 물리적 힘으로 분해하였다. 분해된 세포를 100 ㎛ 세포 여과기(팰콘)로 여과하고, 1000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 펠릿을 성장 배지(고글루코스 DMEM, 10% FBS, 25 ng/㎖ rmGM-CSF)에 재현탁시키고,세포를 T-75 플라스틱 배양 플라스크 1개당 2개의 뇌가 들어가는 밀도로 깔았다. 7∼9일 후 플라스크를 오비탈 쉐이커에서 37℃에서 200 rpm으로 2시간 동안 회전시켰다. 세포 현탁액을 1000 rpm에서 원심분리하여 분석 배지에 재현탁시켰다.

PDAPP 마우스 또는 인간 AD 뇌(사후 3시간 이내)의 10 ㎛ 저온 유지 절편을 폴리-리신으로 코팅된 둥근 유리 커버슬립 위에 해동 마운팅하고, 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 깔았다. 커버슬립을 1% FBS, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 5 ng/㎖ rmGM-CSF(R&D)를 포함하는 H-SFM(하이브리도마-혈청이 없는 배지, 깁코 BRL)으로 이루어진 분석 배지로 2회 세척하였다. 대조군 또는 항-Aβ항체를 2배 농도(최종 농도 5 ㎍/㎖)로 1시간 동안 첨가하였다. 그 후 소교 세포를 분석 배지 1 ㎖당 0.8 x 10⁶개 세포의 밀도로 접종하였다. 배양물을 가습 항온기(37℃, 5% CO₂)에서 24시간 이상 동안 유지시켰다. 배양 후반부에 배양물을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.1% Triton-X100으로 투과성이 되도록 하였다. 절편을 비오틴화 3D6로 염색한 후 스트렙타비딘/Cy3 접합체(잭슨 이뮤노리서치)로 염색하였다. 핵 염색(DAPI)에 의해 외생 소교 세포를 시각화하였다. 배양물을 역형광 현미경(니콘, TE300)으로 관찰하고, SPOT 소프트웨어를 이용한 SPOT 디지털 카메라(다이애그노스틱 인스트러먼츠)로 사진을 찍었다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 배양물을 8 M 우레아에서 추출하고, 환원성 트리신 샘플 완충액에 1:1로 희석시켜서, 16% 트리신 겔(노벡스)에 로딩하였다. 임모빌론에 이전시킨 후, 블롯을 pabAβ42, 5 ㎍/㎖에 노출시키고, 이어서 HRP-접합 항-마우스 항체에 노출시킨 다음 ECL(아머샴)로 발색시켰다.

16C11(생체내에서 효능이 없는 Aβ에 대한 항체 중 하나)의 존재 하에 PDAPP 뇌 절편으로 분석을 수행할 경우 β-아밀로이드 플라크는 완전한 상태로 남아 있었고, 식작용은 관찰되지 않았다. 이와는 달리, 인접한 절편을 10D5의 존재 하에 배양할 경우, 아밀로이드 퇴적물은 거의 사라졌고, 소교 세포는 Aβ를 포함하는 식작용 소낭을 다수개 나타내었다. AD 뇌 절편을 이용한 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다. 10D5는 AD 플라크의 식작용을 유도한 반면 16C11은 효과가 없었다. 또한, 이 분석을, 마우스 또는 인간 소교 세포를 사용하고, Aβ에 대한 마우스, 토끼, 또는 영장류 항체를 사용하여 수행한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다.

하기 표 7은 몇가지의 상이한 항체 결합 특이성에 대해 Aβ결합 대 식작용을 비교한 결과를 기재한 것이다. 이로부터 아미노산 1-7 내의 에피토프에 결합하는 항체는 아밀로이드 퇴적물에 결합하여 이를 제거하는 반면, 아미노산 4-10 내의 에피토프에 결합하는 항체는 아밀로이드 퇴적물에 결합하지만 이를 제거하지 않는 것을 알 수 있다. 잔기 10의 C-말단의 에피토프에 결합하는 항체는 아밀로이드 퇴적물을 제거하지 못한다.

하기 표 8은 생체외 분석에서 식작용을 유도하는 능력과 수동 면역화 실험에서 생체내 플라크 존재량을 감소시키는 능력을 비교한, Aβ에 대한 몇가지 항체를 사용하여 얻은 결과를 나타낸다. 16C11과 21F12는 응집된 합성 Aβ펩티드에 높은 친화력으로 결합하였지만, 이들 항체는 비고정 뇌 절편에서 β-아밀로이드 플라크와 반응할 수 없었고, 생체외 분석에서 식작용을 유발시키지 못했으며, 생체내에서도 효능이 없었다. 10D5, 3D6 및 Aβ에 대한 폴리클로날 항체는 3가지 모든 측정에서 활성이 있었다. 이러한 결과는 생체내 효능이 CNS 내의 플라크의 직접적인 항체매개 제거에 의한 것이고, 생체외 분석이 생체내 효능의 예측 수단이 될 수 있음을 나타낸다.

NAC로 불리는 시뉴클레인의 단편에 대한 항체의 제거 활성을 테스트하기 위해 동일한 분석을 이용하였다. 시뉴클레인은 아밀로이드 플라크에 결합된 단백질인 것으로 확인되었다. NAC에 대한 항체를 아밀로이드 플라크를 포함하는 뇌 조직 샘플 및 소교 세포와 이전과 동일한 방식으로 접촉시켰다. 토끼 혈청을 대조군으로 사용하였다. 후속 모니터에 의하면 항체의 제거 활성의 지표가 되는 플라크의 수 및 크기의 현저한 감소가 관찰되었다.

공초점 현미경을 사용하여 Aβ가 생체외 분석 과정에서 내부화되었는지를 확인하였다. 대조군 항체의 존재 하에서는 외생 소교 세포는 조직 위의 공초점 면에 남아 있었고, Aβ를 함유하는 식작용 소낭은 없었으며, 플라크는 절편 내에 완전한 상태로 남아 있었다. 10D5의 존재 하에서는 거의 모든 플라크 물질이 외생 소교 세포 내의 소낭에 함유되어 있었다. 내부화된 펩티드의 운명을 파악하기 위해, 10D5처리 배양물을 다양한 시점에서 8 M 우레아로 추출하여 웨스턴 블롯 분석으로 관찰하였다. 1시간 경과 시점에서는 아직 식작용이 나타나지 않았으며, Aβ에 대한 폴리클로날 항체와의 반응은 강한 4 kD 밴드(Aβ펩티드에 해당함)를 나타내었다. Aβ면역반응성은 1일째 감소하였고, 3일에 이르러서는 사라졌다. 따라서, Aβ의 항체 매개 식작용은 Aβ의 분해를 유도한다.

생체외 분석에서의 식작용이 Fc에 의해 매개되는지를 확인하기 위해, 항-Aβ항체 3D6의 F(ab')2 단편을 준비하였다. F(ab')2 단편은 플라크와 반응할 수 있는 모든 능력을 유지하였지만, 이들은 소교 세포에 의한 식작용을 촉발하지는 못했다. 또한, 전체 항체를 사용한 식작용은 쥐 Fc 수용체(항-CD16/32)에 대한 시약에 의해 차단될 수 있었다. 이러한 데이터는 Aβ의 생체내 제거가 Fc 수용체 매개 식작용을 통해 일어난다는 것을 암시한다.

실시예 V: 혈뇌 장벽을 통한 항체의 통과

이 실시예에서는 정상 마우스 또는 PDAPP 마우스의 말초 조직에 정맥 주사한 후 뇌로 전달된 항체의 농도를 측정한다. 처리 후, PDAPP 또는 대조군 정상 마우스에 0.9% NaCl을 관류시켰다. 뇌 영역(해마 또는 피질)을 절개하고 급속 냉동시켰다. 0.1% 트리톤 + 프로테아제 억제제 중에서 뇌를 균질화하였다. ELISA에 의해 추출물 중의 면역글로불린을 검출하였다. F(ab)'2 염소 항-마우스 IgG를 캡쳐 시약으로서 RIA 플레이트 상에 코팅하였다. 혈청 또는 뇌 추출물을 1시간 동안 항온처리하였다. 항-마우스 IgG1-HRP 또는 IgG2a-HRP 또는 IgG2b-HRP(칼태그)로 이소타입을 검출하였다. 이소타입과 무관하게 항체는 혈중에서 관찰되는 것의 1:1000인 농도로CNS에 존재하였다. 예를 들어, 혈중 IgG1의 농도가 IgG2a의 3배일 경우, 뇌에서도 IgG2a가 3배 존재하였으며, 둘다 혈중에서 개별 농도는 0.1%였다. 이 결과는 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 마우스 모두에서 관찰되었으며, 이는 PDAPP가 특이한 누출 혈뇌 장벽을 가지고 있지 않다는 것을 암시한다.

실시예 VI: 마우스 3D6 가변 영역의 클로닝 및 시퀀싱

3D6 VH의 클로닝 및 서열 분석: 3D6의 중쇄 가변 VH 영역을 두가지의 독립적인 방법에 의해 하이브리도마 세포로부터 준비한 mRNA를 사용하여 RT-PCR로 클로닝하였다. 첫번째 방법에서는, 5' 프라이머(DNA #3818-3829)로서 번역 개시 코돈을 포함하는 VH 영역 리더 펩티드와, g2b(DNA #3832) 불변 영역 특이적 3' 프라이머에 컨센서스 프라이머를 이용하였다. PCR 증폭 생성물과 독립적으로 유래된 다수의 클론으로부터 얻은 서열은 서로 완전히 일치하였다. 3D6 VH 영역의 서열에 대한 추가 체크로서 5' RACE RT-PCR 방법 및 3' g2b 특이적 프라이머(DNA #3832)에 의해 얻은 VH 단편을 시퀀싱하여 결과를 검증하였다. 이 서열 역시 PCR 증폭 생성물과 독립적으로 분리한 다수의 클론으로부터 유래된 것이었다. 두 서열은 서로 완전히 일치하였으며(5' RACE 생성물 유래의 리더 영역에서의 V8I 치환을 제외하면), 이는 이 서열이 3D6의 VH 영역을 암호화하는 mRNA에서 유래된 것임을 나타내는 것이다. 3D6의 VH 영역의 뉴클레오티드(서열 번호 3) 및 아미노산 서열(서열 번호 4)은 각각 표 9A와 도 2에 나타내었다.

3D6 VL의 클로닝 및 서열 분석: 3D6의 경쇄 가변 VL 영역을 VH 영역에서와 유사한 방식으로 클로닝하였다. 첫번째 시도에서는 쥐의 VL 영역의 증폭을 위해 컨센서스 프라이머 세트를 다음과 같이 디자인하였다: 5' 프라이머(DNA #3806-3816)는 번역 개시 코돈을 포함하는 VL 영역에 하이브리드화하도록 디자인하였고, 3' 프라이머(DNA #3817)는 V-J 연결 영역의 하류에 있는 쥐 Ck 영역에 특이적이 되도록 디자인하였다. PCR 단편 및 이 컨센서스 경쇄 프라이머 세트를 사용하여 분리한 독립적으로 유래된 클론의 DNA 서열 분석에 의하면, 이 서열은 V-J 영역 접합부 사이에 프레임쉬프트 돌연변이를 포함하고 있기 때문에 얻어진 cDNA는 비기능적으로 재배열된 mRNA로부터 유래된 것이었다.

두번째 시도에서는, 5' RACE를 이용하여 두번째 VL 암호화 cDNA를 클로닝하였다. 이 생성물(컨센서스 11)의 DNA 서열 분석 결과는 이것이 기능이 있는 mRNA를 암호화함을 보여주었다. 따라서, 이 서열은 정확한 3D6 경쇄 mRNA를 암호화한다는 결론을 내릴 수 있다. 3D6의 VL 영역의 뉴클레오티드(서열 번호 1) 및 아미노산 서열(서열 번호 2)을 표 9B와 도 1에 각각 나타내었다.

3D6 VL cDNA의 클로닝에 사용된 프라이머는 하기 표에 제시하였다.

N-말단에서부터 C-말단에 이르기까지 경쇄 및 중쇄 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 Kabat 등의 상기 문헌의 넘버링 방식에 따라 하였다.

키메라 3D6 항체의 발현: 가변 중쇄 및 경쇄 영역이 개개의 VDH 또는 VJ 접합부 하류의 스플라이스 공여체 서열을 암호화하도록 재조작하고, 이를 중쇄의 경우에는 포유동물 발현 벡터 pCMV-hγ1로, 경쇄의 경우에는 pCMV-hγ1으로 클로닝하였다. 이들 벡터는 삽입된 가변 영역 카세트의 하류에 있는 엑손 단편으로서 인간γ1 및 Ck 불변 영역을 암호화한다. 서열 검증 후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 COS 세포에 동시 형질감염시켰다. 3종의 상이한 키메라 경쇄 클론(L3, L4 & L10)을 사용하여 2종의 상이한 중쇄 클론(H2.2 & H3.2)을 독립적으로 동시 형질감염시켜서 결과의 재현성을 확인하였다. 키메라 21.6 항체 형질감염은 벡터에 대한 양성 대조군으로서 수행하였다. 형질감염 48시간 후 컨디셔닝된 배지를 수거하여, 항체 생성에 대해서 웨스턴 블롯 분석으로, 또는 Aβ결합에 대해서 ELISA로 분석하였다.

다수의 형질감염체는 모두 중쇄 + 경쇄 조합체를 발현하였는데, 이는 웨스턴 블롯 상의 염소 항-인간 IgG(H+L) 항체에 의해 확인된다.

Aβ에 대한 3D6 및 키메라 3D6(PK1614) 항체의 직접 결합은 ELISA 분석으로 테스트하였다. 키메라 3D6는 3D6에 의해 입증된 것과 유사하게 고친화력으로 Aβ에 결합하는 것으로 확인되었다(도 3a). 또한, ELISA계 경쟁 억제 분석에 의하면 키메라 3D6 및 쥐 3D6 항체는 Aβ에 대해 비오틴화 3D6 결합과 동일하게 경쟁하였다(도 3b). 키메라 항체는 3D6 기준 샘플과는 구별되지 않는 결합 특성을 나타내었다.

뿐만 아니라, 3D6 및 PK1614 모두 Aβ플라크를 제거하는 데 효과적이었다. 생체외 분석 결과는, 항체의 농도가 증가함에 따라 쥐와 키메라 3D6 항체 모두의 경우 유사한 방식으로 Aβ의 양이 감소한다는 것을 보여준다. 따라서, 이 서열은각각 기능적 3D6 중쇄 및 경쇄를 암호화한다는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 VII: 3D6 인간화

상동성/분자 모델링: 쥐 3D6 항체 내의 주요 구조적 프레임워크를 확인하기 위해, 중쇄 및 경쇄에 대해 가장 가까운 쥐 항체를 기초로 하여 3차원 모델을 생성하였다. 이를 위해, 1CR9로 표시되는 항체를 3D6 경쇄를 모델링하기 위한 주형으로서 선택하고(PDB ID: 1CR9, Kanyo 등의 상기 문헌), 1OPG로 표시되는 항체를 중쇄를 모델링하기 위한 주형으로서 선택하였다(PDB ID: 1OPG, Kodandapani 등의 상기 문헌)(역시 표 1 참조). 이들 항체의 경쇄 및 중쇄를 이용한 3D6의 아미노산 서열 정렬 결과에 의하면, 중쇄의 CDR3을 제외하고는, 1CR9 및 1OPG 항체는 3D6와 유의적인 서열 상동성을 공유하는 것으로 나타났다. 또한, 선택된 항체의 CDR 루프는 동일한 카논형 Chothia 구조 클래스에 속하며, 3D6의 CDR 루프 역시 그러하고, 이 경우에도 중쇄의 CDR3는 제외된다. 따라서, 1CR9 및 1OPG를 3D6의 상동성 모델링을 위한 규명된 구조의 항체로서 처음에 선택하였다.

위에서 언급한 항체를 기초로 한 3D6 가변 영역의 제1 패스 상동성 모델을 Look & SegMod Modules GeneMine(v3.5) 소프트웨어 패키지를 이용하여 제작하였다. 이 소프트웨어는 몰리큘러 애플리케이션즈 그룹(캘리포니아주 팔로 알토 소재)으로부터 영구 사용권을 허가 받아 구입하였다. Michael Levitt 및 Chris Lee 박사에 의해 제작된 이 소프트웨어 패키지는, 서열 상동성을 기초로 한 공지된 구조의 주형 상에서 1차 서열을 구조적으로 모델링하는 데 이용되는 단계를 자동화함으로써 분자적 모델링 과정을 용이하게 한다. UNIX 환경 하에 실리콘 그래픽스 IRIS 워크스테이션 상에서 작업을 수행하면, 바람직하지 않은 원자적 접촉을 경감시키고 정전기 및 반데르발스 상호작용을 최적화하기 위한 일련의 에너지 최소화 단계에 의해 모델링된 구조가 자동적으로 개량된다.

Quanta(등록상표명)의 모델링 기능을 이용하여 추가로 개량된 모델을 생성하였다. 3D6의 중쇄의 CDR3를 사용하여 PDB 데이터베이스를 검색한 결과 1qkz가 최대 상동성인 것으로 확인되었고, 잔기의 확인 번호는 3D6였다. 따라서, 1qkz의 결정 구조를 주형으로서 사용하여 3D6의 중쇄의 CDR3를 모델링하였다. 3D6 모델의 α-탄소 골격도를 도 4에 도시하였다. VH 도메인은 점선으로 표시하였고, VL 도메인은 실선을 표시하였으며, CDR 루프는 리본형으로 표시하였다.

인간 수용체 항체 서열의 선택: 마우스 가변 영역의 아미노산 서열과 공지된 인간 항체의 서열을 컴퓨터로 비교하여 적절한 인간 수용체 항체를 확인하였다. 비교는 3D6 중쇄 및 경쇄에 대해 개별적으로 실시하였다. 특히, 프레임워크 서열이 쥐 VL 및 VH 프레임워크 영역과 고도의 서열 동일성을 나타내는 인간 항체 유래의 가변 도메인을 NCBI BLAST(국립보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 공개적으로 입수 가능함)를 이용하여 개개의 쥐 프레임워크 서열로 Kabat 데이터베이스를 검색하여 확인하였다.

2개의 후보 서열을 다음의 기준에 기초하여 수용체 서열로서 선택하였다: (1) 피험체 서열과의 상동성; (2) 공여체 서열과 카논형 CDR 구조를 공유하는것; 및 (3) 프레임워크 영역 내의 빈도가 낮은 어떠한 아미노산 잔기도 포함하지 않는 것. VL에 대해 선택된 수용체 서열은 Kabat ID 번호(KABID) 019230(Genbank 등록번호 S40342), VH에 대해서는 KABID 045919(Genbank 등록 번호 AF115110)이다. 인간화된 3D6 항체의 제1형은 이와 같은 선택된 항체 서열을 이용한다.

아미노산 잔기의 치환: 전술한 바와 같이, 본 발명의 인간화된 항체는 실질적으로 인간 면역글로불린(수용체 면역글로불린)으로부터 유래된 가변 프레임워크 영역과 실질적으로 3D6라 불리는 마우스 면역글로불린(공여체 면역글로불린)으로부터 유래된 상보성 결정 영역을 포함한다. 3D6의 상보성 결정 영역과 적절한 인간 수용체 면역글로불린을 확인한 후, 다음 단계는, 존재한다면, 생성된 인간화된 항체의 특성을 최적화하기 위해 이들 성분으로부터의 치환할 잔기를 결정하는 것이다. 전술한 기준을 치환을 위한 잔기를 선택하는 데 이용하였다.

도 1 및 2는 인간화된 서열의 개별 제1형, 상응하는 인간 프레임워크 수용체 서열 및 마지막으로 인간 프레임워크 수용체 서열과 최대 상동성을 나타내는 인간 생식세포계 V 영역 서열과 함께 나타낸 원래의 쥐 3D6 VL 및 VH의 정렬도를 도시한 것이다. 박스 안의 빗금친 잔기는 카논형(실선), 버니어(점선 외곽선), 패킹(진한 글씨) 및 빈도가 낮은 아미노산(진한 이탤릭체)를 나타내며 도면에 표시되어 있다. 별표는 인간 수용체 프레임워크 서열에서 쥐 잔기로 역돌연변이된 잔기를 나타내며, CDR 영역에는 위에 줄을 그어 표시했다. 인간화된 3D6 VH 및 VL의 제1형으로 도입된 변화를 요약한 것이 표 12에 제시되어 있다.

인간화된 3D6,v1의 변화 요약
변화	VL(112 잔기)	VH(119 잔기)
Hu →Mu: 프레임위크	4/112	3/119(1 카논, 1 패킹)
CDR1	6/16	3/5
CDR2	4/7	7/14
CDR3	5/8	4/10
Hu →Mu	19/112(17%)	17/119(14%)
Mu →Hu: 프레임위크	13/112	14/119
역돌연변이 주석	1. 카논형 위치인 I2V2. 패킹 잔기이고, 또한 CDR 하에 존재하는 Y36L3. 패킹 잔기이고, CDR 아래에존재하는 L46R	4. S49A 버니어/CDR 아래5. 패킹 및 버니어 구역 잔기인A93V6. 카논형 잔기인 K94R
수용체 주석	7. KABID 019230 / Genbank 등록번호 S403428. Hu κLC 서브르룹 II9. 공여체(m3D6)와 동일한 카논형 구조 그룹 유래의 CDRL1 = 클래스 4L2 = 클래스 1L3 = 클래스 110. 미지의 특이성	11. KABID 019230 / Genbank 등록번호 AF1151108. Hu κHC 서브그룹 III9. 공여체(m3D6)와 동일한 카논형 구조 그룹 유래의 CDRH1 = 클래스 1H2 = 클래스 314. 수막구균의 캡슐형 다당류를인식한다.
수용체 생식세포계	15. VH3-23	16. A3 & A19

표 13 및 14에는 각각 가변 경쇄 및 중쇄에 대한 Kabat 넘버링에 대한 약어표가 기재되어 있다.

인간화된 항체는 바람직하게는 10⁷, 10⁸, 10⁹또는 10¹⁰M^-1이상의 Aβ에 대한 특이적 결합 친화력을 나타낸다. 일반적으로 Aβ에 대한 인간화된 항체의 결합 친화력의 상한치는 3D6의 친화력의 3배, 4배 또는 5배 내에 속한다(즉, ∼10⁹M^-1). 종종 결합 친화력의 하한치는 3D6의 친화력의 3배, 4배 또는 5배의 범위에 속하기도 한다.

인간화된 3D6 VH 및 VL 제1형의 어셈블리 및 발현: 간단히 설명하면, 각 V 영역에 대해 4개의 큰 한가닥 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 또한, 특정 V 영역의 어셈블리를 더 용이하게 하기 위해 각 V 영역에 대해 4개의 짧은 PCR 프라이머를 합성하였다. 이를 위해 사용된 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 하기 표 15에 나타내었다.

PCR을 이용하여 인간화된 경쇄를 어셈블리하였다. 24개 이상의 클론의 DNA 서열 분석에 의하면 예상 서열에 대하여 산재된 점 돌연변이와 VL 영역 전반에 걸친 결실이 있는 것으로 드러났다. 서열 분석 결과는, 클론 2.3이 아미노 말단 영역에 있는 2개의 가까이 이격된 단일 뉴클레오티드 결실을 수복하기 위한 대상이 될 수 있는 것으로 나타났다. 따라서 2개의 결실된 뉴클레오티드를 도입하기 위한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 클론 pCRShum3D6v12.3 상에서 부위 특이적 돌연변이를 유발하고, DNA 서열 분석을 통해 점 돌연변이의 수복을 확인한 다음, VL 삽입체를 경쇄 발현 벡터 pCMV-cK로 클로닝하였다.

PCR계 방법을 이용한 인간화된 VH의 어셈블리에 의하면 서열의 5'쪽에 대규모의 결실이 일어난 클론이 얻어졌다. PCR 조건을 최적화하기 위한 추가의 노력으로 부분적으로 이를 달성하였다. 최적화된 PCR 조건을 통해 어셈블리된 클론은 여전히 A+B 단편의 중첩부에 대한 영역 맵핑에서 10∼20개 뉴클레오티드 결실을 지녔다. 따라서, VH 어셈블리에, DNA 폴리머라제(T4, 클레나우 및 시쿼나제) 매개로 중첩부를 연장시킨 다음, T4 DNA 리가제를 이용하여 중첩 말단을 공유 결합시키는 방법을 이용하는 다른 방법을 이용하였다. 후자의 방법을 이용한 VH 어셈블리로부터 얻어지는 클론의 부분군의 DNA 서열 분석 결과 클론 중에 산재된 점 돌연변이와 결실이 있는 것으로 나타났다. 24개 이상의 클론에 대한 분석 결과는 그 클론에 대해 설명한 것과 실질적으로 동일한 패턴을 나타내었다. VH 및 VL 클론의 제1 패스 어셈블리 후에 관찰된 유사한 결과는 DNA 서열 오차가 이 어셈블리에 이용된 긴 DNA의 합성 중에 자동 합성기 오류로부터 발생된 것임을 암시한다.

인간화된 VH 클론 2.7을 선택하여 이것이 3개 뉴클레오티드 결실의 부위 지정 돌연변이 유발에 의한 수복을 포함하는지를 관찰하였다.

실시예 XIII: 인간화된 3D6v2 항체의 특성 규명

제1형에 대해 표시된 치환 각각을 갖는 인간화된 3D6의 제2형(3D6v2)을 생성하였으며, 단, 잔기 1에서는 D -> Y 치환이었다. 이 잔기는 CDR 상호작용 잔기인 것으로 확인되었기 때문에 이 잔기에서의 치환은 제1형에서 수행하였다. 그러나, 치환은 인간 면역글로불린에 있어서는 그 위치에서 빈도가 낮은 잔기를 결실시켰다. 따라서, 치환이 없는 형태를 생성하였다. 뿐만 아니라, 중쇄 프레임워크 영역 내의 비-생식세포계 잔기를 생식세포계 잔기로 치환하였는데, 즉 H74 = S, H77 = T 및 H89 = V였다. 제2형의 경쇄 및 중쇄에 대한 Kabat 넘버링은 각각 표 13 및 14에 제시된 것과 동일하되, 단, 제2형의 경쇄의 잔기 1은 asp(D)이고, 중쇄의 잔기 74는 ser(S)이고, 중쇄의 잔기 77은 thr(T)이고, 중쇄의 잔기 89는 val(V)이다. 인간화된 3D6 제1형 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 34 및 36에 도시하였다. 인간화된 3D6 제2형 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 35 및 37에 도시하였다.

실시예 IX: 인간화된 3D6 항체의 기능 테스트

응집된 Aβ에 대한 인간화된 3D6v1의 결합: 인간화된 3D6v1의 기능 테스트는 일시적 형질감염 COS 세포로부터 얻은 컨디셔닝된 배지를 사용하여 수행하였다. 이 세포를 완전한 키메라 항체, 키메라 중쇄 + 인간화된 경쇄, 또는 키메라 중쇄 + 인간화된 중쇄의 혼합물 및 마지막으로 완전히 인간화된 항체로 형질감염시켰다. 컨디셔닝된 배지는 ELISA 분석에 의해 응집된 Aβ1-42에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 인간화된 항체는 실험적 오차 범위 내에서 우수한 활성을 보였으며, 키메라 3D6 기준 샘플과 결합 특성에서 차이를 보이지 않았다. 이 결과를 표 16에 기재하였다.

인간화된 3D6v1 항체와 및 3D6v2 항체의 결합 친화력을 비교하기 위해, 응집된 Aβ를 항원으로서 사용하여 ELISA 분석을 실시하였다. 이 결과는 3D6v1(H1L1) 및 3D6v2(H2L2) 모두 거의 동일한 Aβ결합 특성을 보유함을 보여준다(도 5).

h3D6v2의 치환 NET(rNET) 분석: rNET 에피토프 맵 분석은 에피토프 내의 개별 잔기가 항체의 전체 결합 활성에 미치는 기여도에 대한 정보를 제공한다. rNET 분석은 합성된 조직적인 단일 치환 펩티드 유사체를 이용한다. 테스트 대상 항체의 결합력은 천연(native) 펩티드(천연 항원)와 19개의 대체 "단일 치환" 펩티드에 대해 측정되며, 각 펩티드는 첫번째 위치에서 그 위치에 대한 19개의 비-천연 아미노산 중 하나로 치환된다. 그 위치에서 다양한 비-천연 잔기로 치환하는 것의 효과를 반영하는 프로필을 생성한다. 프로필은 항원성 펩티드를 따라 연속 위치에서 유사하게 생성된다. 그 후 합한 프로필, 또는 에피토프 맵(각 위치에서의 19개 모두의 비-천연 잔기로의 치환을 반영함)을 제2의 항체에 대해 유사하게 생성된 맵과 비교한다. 실질적으로 유사하거나 동일한 맵은 비교되는 항체가 동일하거나 유사한 에피토프 특이성을 갖는다는 것을 암시한다.

이 분석은 3D6 및 인간화된 3D6 제2형에 대해 실시하였다. 원형 Aβ펩티드 DAEFRHDSGY(서열 번호 33)에 대한 결합에 대해 항체를 테스트하였다. 잔기 1-8은 그 위치에 대해 19개의 비-천연 잔기 각각으로 체계적으로 치환하였다. 그에 따라 3D6 및 h3D6v2에 대한 맵을 만들었다. 그 결과는 하기 표 17에 관 형태로 제시하였다.

주목할 점은, 각 위치에서의 치환을 살펴보면 이 프로필은 3D6과 h3D6v2에 있어서 실질적으로 동일하다는 것이다(즉, 컬럼 1(3D6) 대 컬럼 2(h3D6v2)의 데이터를 비교해 보면 값이 동일한 방식으로 변동함). 이러한 데이터는 h3D6v2 rNET 에피토프 맵이 Aβ잔기 1-4 및 5-8 모두를 이용하는 m3D6와 실질적으로 동일하기 때문에 h3D6v2의 특이성이 보존된다는 것을 입증하는 것이다.

PDAPP 뇌 절편에서의 면역조직화학적 분석은 h3D6v1 항체의 특이성을 입증한다: 인간화된 3D6v1 항체는 PDAPP 마우스에서 취한 저온유지 상태로 준비된 뇌 절편 중의 Aβ를 인식하였다. 슬라이드 1개당 형광의 양(픽셀로 정량) 대 조직을 염색하기 위해 사용된 항체의 양으로 측정하였을 때 인간화된 3D6v1 및 PK1614는 모두 PDAPP 플라크에 동일한 용량 반응 방식으로 결합하였다(도 6). 이 실험에서는 동일한 항-인간 2차 항체를 사용하였다. 절편 제조, 염색 및 상 형성 절차는 앞에서 설명하였다. 동일한 실험에서, PDAPP 및 AD 뇌 절편 상에서의 h3D6v2의 상 분석은 h3D6v2가 3D6v1과 유사한 방식으로 Aβ플라크를 인식한다는 것을 보여주었다(예컨대, 항체가 많이 부착된 플라크).

h3D6의 경쟁적 결합 분석: h3D6 항체 v1 및 v2가 쥐 3D6와 경쟁하는 능력을 비오틴화 3D6 항체를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 경쟁적 결합 분석에 의하면 h3D6v1, h3D6v2 및 키메라 PK1614가 모두 Aβ에 대한 결합에 대해 m3D6와 경쟁할 수 있는 것으로 나타났다(도 7). h3D6v1 및 h3D6v2는 Aβ에 대해 3D6와 경쟁하는 능력이 동일하였다. 10D5 항체는 3D6와 상이한 결합 에피토프를 갖기 때문에 음성 대조군으로 사용하였다. BIAcore 분석 결과 역시 h3D6v1 및 h3D6v2가 Aβ에 대해 높은 친화력을 갖는 것으로 나타났다(표 18).

Kd가 0.88 nM인 3D6와 비교할 때, h3D6v1 및 h3D6v2 모두 h3D6v1 및 h3D6v2 각각에 대해 2.06 nM 및 2.24 nM로 측정하였을 때 약 2∼3배 약한 결합 친화력을 나타내었다. ELISA 경쟁적 결합 분석에 의하면 h3D6v1 및 h3D6v2의 경우 결합 친화력이 약 6배 더 낮은 것으로 나타났다. 일반적으로, 인간화된 항체는 대응하는 쥐 항체와 비교하여 결합 친화력이 약 3∼4배 더 낮았다. 따라서 h3D6v1 및 h3D6v2의 경우 약 3배(ELISA 및 BIAcore 결과의 평균)의 감소는 허용되는 범위에 속한다.

h3D6v2 항체를 이용한 생체외 분석: h3D6v2가 소교 세포를 자극하는 능력을 생체외 식작용 분석을 통해 테스트하였다(도 8). h3D6v2는 PDAPP 마우스 뇌 조직 유래의 Aβ응집체의 식작용을 유도하는 데 있어서 키메라 3D6와 동일한 효력을 나타내었다. 이 실험에서는 IgG를 음성 대조군으로 사용하였는데, 그 이유는 이것은 Aβ에 결합할 수 없어서 식작용을 유도할 수 없기 때문이다.

h3D6의 생체내 뇌에서의 위치:¹²⁵I으로 표지된 h3D6v2, m3D6 및 항체 DAE13을 별도의 실험으로 14 마리의 개개의 PDAPP 마우스에게 각각 정맥 주사하였다. 7일 후 마우스를 죽이고 후속 분석을 위해 관류시켰다. 이 동물들의 뇌 부분을 절개하여 특정 뇌 부분에서의¹²⁵I 활성을 측정하였다. 뇌에서의 방사선 표지 활성을 혈청 샘플 중의 활성과 비교하였다. 혈청과 뇌 부분에 대한 결과를 각각 하기 표 19 및 20에 기재하였다.

이 데이터는 h3D6v2가 뇌에 집중되어 있고, Aβ가 응집되는 곳으로 알려진 해마 영역에 특히 집중되어 있음을 보여준다. m3D6 및 DAE13에 대한 뇌에서의 측정값을 h3D6v2와 비교하였다. 이들 3가지 항체 모두 생체내에서의 Aβ플라크 결합에의해 입증되는 바와 같이 혈뇌 장벽을 관통할 수 있었다.

실시예 X: 마우스 10D5 가변 영역의 클로닝 및 시퀀싱

10D5 VH의 클로닝 및 서열 분석: 하이브리도마 세포 유래의 10D5의 VH 및 VL 영역을 5' RACE 절차를 이용하여 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. 추정되는 10D5 VL 도메인을 암호화하는 2개의 독립적인 cDNA 클론에서 유래된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 13) 및 추론 아미노산 서열(서열 번호 14)을 표 21과 도 9에 제시하였다. 추정되는 10D5 VH 도메인을 암호화하는 2개의 독립적인 cDNA 클론에서 유래된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 15) 및 추론 아미노산 서열(서열 번호 16)을 표 22와 도 10에 제시하였다. 10D5 VL 및 VH 서열은 이들이 개시 메티오닌에서부터 C-영역까지 연속되는 ORF를 포함하고 면역글로불린 V 영역 유전자의 특징인 보존된 잔기를 공유하는 한 기능성 V 영역에 대한 기준을 충족시킨다.

실시예 XI: 인간 피험체의 예방 및 치료

1회 용량 임상 I기 실험은 인간에서의 안전성을 확인하기 위해 수행된다. 예상 효능 수준의 약 0.01배에서 시작하여 유효 마우스 투여량의 약 10배 수준에 도달할 때까지 3 팩터(factor)씩 증가시키는 방식으로, 여러 환자에게 투여량을 증가시키면서 치료제를 투여한다.

임상 II기 실험은 치료 효능을 확인하기 위해 수행된다. 알츠하이머병 및 예상 AD(probable AD)에 대한 유관 장애 협회(ADRDA) 기준을 이용하여 정의된 초중기 알츠하이머병에 걸린 환자를 선별한다. 적절한 환자는 간이 정신 상태 검사(MMSE)에서 12∼26점을 받는 환자이다. 다른 선별 기준은 실험 기간 동안의 환자의 생존 가능성, 방해가 될 수 있는 병용 약물의 사용과 같은 복잡한 문제가 없느냐 하는 것이다. 환자 기능의 기본값 평가는 전통적인 정신측정학적 측정법, 예컨대 MMSE 및 ADAS를 이용하여 실시한다. 상기 ADAS는 알츠하이머병 환자의 상태와 기능을 평가하기 위한 종합적인 척도이다. 이러한 정신측정학적 척도는 알츠하이머병 상태의진행의 기준이 된다. 적절한 정성적인 수명 척도 역시 치료를 모니터하는 데 이용될 수 있다. 질병의 진행 정도는 MRI에 의해서도 모니터할 수 있다. 면역원 특이적 항체 및 T-세포 반응의 분석을 포함하는 환자의 혈액 프로필 역시 모니터할 수 있다.

기본값을 측정한 후 환자를 치료하기 시작한다. 이 환자들을 무작위적으로 분류하여 맹검 방식으로 치료제 또는 위약을 처리한다. 환자는 적어도 6개월마다 모니터한다. 위약 그룹에 비해 치료 그룹에서 질병의 진행 정도가 유의적으로 감소한 것에 의해 효능을 판단한다.

임상 II기의 두번째 실험은 비-알츠하이머병 환자가 초기 기억 상실(때로는 노화와 관련된 기억력 손상(AAMI) 또는 경증의 인지력 손상(MCI)이라 부르기도 함)을 예상되는 알츠하이머병(ADRDA 기준에 의해 정의된 바와 같음)으로 전환되는 것을 평가하기 위해 수행된다. 기억 상실의 초기 징후 또는 알츠하이머병 예비 증상과 관련된 기타 어려움, 알츠하이머병의 가족력, 유전적 위험 요인, 나이, 성별 및 알츠하이머병에 대한 고위험율을 예측하는 것으로 확인된 기타 특징들에 대해 기준 집단을 스크리닝함으로써 비임상 집단으로부터 알츠하이머병으로의 전환 위험이 큰 환자를 선별한다. MMSE 및 ADAS를 비롯한 적절한 측정기준과 보다 정상적인 집단을 평가하기 위해 고안된 다른 측정기준에 대한 기본값 점수를 수집한다. 이들 환자 집단을 제제를 사용한 투여 그룹에 대한 위약 비교 그룹을 포함시켜 적절한 그룹으로 나눈다. 이들 환자 집단을 약 6개월 동안 추적하여, 각 환자가 최종 시점에, 관찰 후기에 ADRDA 기준에 의해 정의되는 예상 알츠하이머병으로 전환되었는지 여부를 조사한다.

일반적 재료 및 방법

A. 폴리클로날 및 모노클로날 Aβ항체의 제조

두 그룹의 동물로부터 수집한 혈액에서 항-Aβ폴리클로날 항체를 준비하였다. 제1 그룹은 6∼8주령의 암컷 스위스 웹스터 마우스 100 마리로 구성되었다. 이들 마우스에 CFA/IFA와 혼합된 AN1792 100 ㎍을 0일, 15일 및 29일째 접종하였다. 4번째 주사는 36일째 AN1792의 용량을 반으로 하여 접종하였다. 42일에 동물들을 방혈시켜 죽이고, 혈청을 준비하여 총량이 64 ㎖이 되도록 모았다. 제2 그룹은 PDAPP 마우스와는 동종이나 인간 APP 유전자에 대해서는 비-트랜스제닉인 6∼9주령의 암컷 마우스 24 마리로 구성되었다. 이들 마우스에 CFA/IFA와 혼합된 AN1792 100 ㎍을 0일, 14일, 28일 및 56일째 접종하였다. 63일째 동물들을 방혈시켜 죽이고, 혈청을 준비하여 총량이 14 ㎖이 되도록 모았다. 두 분획의 혈청을 모았다. 50% 포화 황산암모늄으로 2회 연속 침전시켜서 항체 분획을 정제하였다. 마지막 침전물을 PBS에 대하여 투석하고 내독소에 대해 테스트하였다. 내독소 농도는 1 EU/mg 미만이었다.

복수액으로부터 항-Aβ모노클로날 항체를 준비하였다. 먼저, 빙냉 복수액에 농축 나트륨 덱스트란 설페이트를 첨가하여 최종 농도가 0.238%가 되도록 얼음 위에서 교반하여 복수액으로부터 지질을 제거하였다. 그 후 교반하면서 농축 CaCl₂를 첨가하여 최종 농도가 64 mM이 되게 하였다. 이 용액을 10,000 x g로 원심분리하고, 펠릿을 버렸다. 상청액에 동부피의 포화 황산암모늄을 적가하여 얼음 위에서 교반하였다. 이 용액을 다시 10,000 x g에서 원심분리하고 상청액을 버렸다. 펠릿을 재현탁시키고 20 mM Tris-HCl, 0.4 M NaCl, pH 7.5에 대해 투석하였다. 이 분획을 파마시아 FPLC 세파로스 Q 컬럼에 가하고, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 중의 0.4 M→0.275 M NaCl의 역 구배를 이용하여 용출시켰다.

280 nm에서의 흡광도에 의해 항체 피크를 확인하고 적절한 분획을 모았다. BCA법을 이용하여 단백질 농도를 측정하고 SDS-PAGE를 이용하여 순도를 측정함으로써 정제된 항체 제제의 특징을 분석하였다. 이 수집물 역시 내독소에 대해 테스트하였다. 내독소 농도는 1 EU/mg 미만이었으며, 100 미만의 역가에 임의로 역가 25를 할당하였다.

B. 항체 역가의 측정

마우스의 꼬리 정맥에 작은 흠집을 내어서 출혈시켜서 마이크로퓨지 튜브에 약 200 ㎕의 혈액을 모았다. 기니 피그는 먼저 뒷다리 무릎의 털을 깎고, 18 게이지 바늘을 사용하여 척골 정맥에 흠집을 낸 다음 마이크로퓨지 튜브에 혈액을 모았다. 혈액은 실온(RT)에서 1시간 동안 응고되도록 둔 다음 볼텍싱하고, 그 후 14,000 x g에서 10분간 원심분리하여 혈청으로부터 응혈을 제거하였다. 그 후 혈청을 깨끗한 마이크로퓨지 튜브에 옮겨서 적정시까지 4℃에 보관하였다.

항체 역가는 ELISA로 측정하였다. 96웰 미량역가 플레이트(코스타 EIA 플레이트)를 웰 코팅 완충액(0.1 M 인산나트륨, pH 8.5, 0.1% 나트륨 아지드) 중의 Aβ42 또는 SAPP 또는 개개의 리포트 각각에서 언급된 다른 항원 10 ㎍/㎖를 함유하는 용액 100 ㎕로 코팅한 후, 밤새 실온에 두었다. 이 웰을 흡인시키고, 표본 희석제(0.014 M 인산나트륨, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.6% 소 혈청 알부민, 0.05% 티메로살) 중의 1/100 희석율에서부터 시작하여 혈청을 웰에 첨가하였다. 3중 단계로 플레이트에서 직접 7개의 연속 샘플 희석액을 만들어서 최종 희석율이 1/218,700이 되게 하였다. 이 희석액을 코팅된 플레이트 웰에서 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후 이 플레이트를 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 4회 세척하였다. 2차 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-마우스 Ig(뵈링거 만하임에서 입수)를 표본 희석제 중의 1/3000배 희석율로 100 ㎕씩 웰에 첨가하여 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 PBS, Tween 20으로 4회 세척하였다. 색원체를 발색시키기 위해 Slow TMB(피어스 케미칼스에서 입수한 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, RT에서 15분간 항온처리하였다. 2 M H₂SO₄25 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그 후 몰리큘러 디바이스 Vmax 상에서 450∼650 nm에서 색 강도를 읽었다.

역가는 최대 OD의 1/2을 나타내는 혈청의 희석율의 역수로 정의하였다. 최대 OD는 일반적으로 처음 1/100 희석율로부터 취하되, 역가가 매우 높은 경우는 제외하였는데, 이 경우에는 최대 OD를 얻기 위해 더 높은 초기 희석율이 요구되었다. 2개의 희석율간에 50% 포인트가 감소하면, 직선으로 추정선을 그어 최종 역가를 계산하였다. 기하학적 평균 항체 역가를 계산하기 위해 100 미만의 역가에는 임의로 역가 25를 할당하였다.

C. 뇌 조직 준비

안락사시킨 후 뇌를 꺼내어 한쪽 반구로는 면역조직학적 분석을 준비하고, 다른쪽 반구로부터는 3개의 뇌 영역(해마, 피질 및 소뇌)을 절개한 다음 이를 사용하여 특이적 ELISA로 다양한 Aβ단백질 및 APP 형태의 농도를 측정하였다(Johnson-Wood 등의 상기 문헌).

ELISA 분석에 사용할 조직은 10배 부피의 빙냉 구아니딘 완충액(5.0 M 구아니딘-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에서 균질화하였다. 이 균질물을 Adams Nutator(피셔)를 사용하여 약하게 진탕시키면서 RT에서 4시간 동안 혼합한 다음, Aβ및 APP의 정량 전까지 -20℃에 보관하였다. 이전 실험 결과에 의하면 이러한 보관 조건 하에서 분석물은 안정한 상태로 유지되었으며, 마우스 한배 새끼로부터 얻은 대조군 뇌 조직의 균질물로 스파이킹하였을 때 합성 Aβ단백질(박켐)은 정량적으로 회복될 수 있다(Johnson-Wood 등의 상기 문헌).

D. Aβ농도의 측정

뇌 균질물을 빙냉 카세인 희석제(0.25% 카세인, PBS, 0.05% 나트륨 아지드, 20 ㎍/㎖ 아프로티닌, 5 mM EDTA, pH 8.0, 10 ㎍/㎖ 루펩틴)로 1:10으로 희석시킨 다음, 16,000 x g로 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 합성 Aβ단백질 표준물질(1-42 아미노산) 및 APP 표준물질은 최종 조성물에 0.5 M 구아니딘 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하도록 제조하였다. "총" Aβ샌드위치 ELISA는 캡쳐 항체로서 Aβ의 아미노산 13-28에 특이적인 모노클로날 항체 266(Seubert 등의 상기 문헌)을 사용하고, 리포터 항체로서 Aβ의 아미노산 1-5에 특이적인 비오틴화 모노클로날항체 3D6(Johnson-Wood 등의 상기 문헌)을 사용한다. 3D6 모노클로날 항체는 분비형 APP 또는 전길이 APP는 인식하지 않으며, 아미노 말단 아스파르트산을 가진 Aβ종만을 인식한다. 이 분석은 감도의 하한치가 ∼50 ng/㎖(11 nM)이며, 1 ng/㎖ 이하의 농도에서는 내생 쥐 Aβ단백질과 교차 반응성을 나타내지 않는다(Johnson-Wood 등의 상기 문헌).

Aβ1-42 특이적 샌드위치 ELISA는 캡쳐 항체로서 Aβ의 아미노산 33-42에 특이적인 mAβ21F12(Johnson-Wood 등의 상기 문헌)를 이용한다. 비오틴화된 mAβ3D6 역시 분석의 감도 하한치가 약 125 ㎍/㎖(28 μM, Johnson-Wood 등의 상기 문헌)를)인 상기 분석에서 리포터 항체로서 사용된다. AβELISA의 경우, mAβ266(10 ㎍/㎖) 또는 mAβ21F12(5 ㎍/㎖) 100 ㎕를 96웰 면역분석 플레이트(코스타)의 웰에서 RT에서 밤새 항온처리하여 코팅하였다. 흡인에 의해 이 용액을 제거하고, PBS 완충액 중의 0.25% 인간 혈청 알부민 200 ㎕를 첨가하여 RT에서 1시간 이상 동안 웰을 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, 플레이트를 사용시까지 4℃에서 건조 상태로 보관하였다. 이 플레이트는 사용 전에 세정 완충액[Tris 완충 염수(0.15 M NaCl, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.5) + 0.05% Tween 20]으로 재수화시켰다. 샘플과 표준물질을 웰당 100 ㎕씩 3중 분액으로 첨가한 후, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이 플레이트는 분석의 매 단계 사이에 세정 완충액으로 3회 이상 세척하였다. 카세인 분석 완충액(0.25% 카세인, PBS, 0.05% Tween 20, pH 7.4) 중에 0.5 ㎍/㎖로 희석시킨 비오틴화 mA 3D6를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 웰 내에서 항온처리하였다. 카세인 분석 완충액 중에 1:400으로 희석시킨 아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제접합체(Avidin-HRP, 캘리포니아주 버링엄 소재의 벡터로부터 입수)를 RT에서 1시간 동안 웰에 첨가하였다. 발색 기질인 Slow TMB-ELISA(피어스)를 첨가하여 RT에서 15분간 반응시킨 후, 2 N H₂SO₄25 ㎕를 첨가하여 효소 반응을 중단시켰다. 450 nm 및 650 nm에서의 흡광도 차이를 측정하는 몰리큘러 디바이시즈 Vmax를 사용하여 반응 생성물을 정량하였다.

E. APP 농도의 측정

2종의 상이한 APP 분석을 이용하였다. APP-α/FL로 표시되는 첫번째 분석은 APP-알파(α)와 APP의 전길이(FL) 형태 둘다를 인식한다. 두번째 분석은 APP-α에 특이적이다. APP-α/FL 분석은 Aβ의 처음 12개 아미노산을 포함하는 분비형 APP를 인식한다. 리포터 항체(2H3)는 APP⁶⁹⁵의 아미노산 612-613 사이에 존재하는 α-클립-부위에 특이적이지 않기 때문에(Esch 등의 문헌[Science 248:1122-1124 (1990)]), 이 분석 역시 전길이 APP(APP-FL)를 인식한다. APP-FL의 뇌 균질물을 고갈시키기 위해 APP-FL의 세포질 테일에 고정된 APP 항체를 사용하는 예비 실험에서는 APP-α/FL APP의 약 30∼40%가 FL임을 보여준다(도시하지 않음). APP-α/FL 및 APP-α분석 모두에 사용되는 캡쳐 항체는, APP⁶⁹⁵형태의 아미노산 444∼592에 대해 생성된 mAb 8E5이다(Games 등의 상기 문헌). APP-α/FL 분석에 사용되는 리포터 mAb는, APP⁶⁹⁵의 아미노산 597∼608에 특이적인 mAb 2H3이고(Johnson-Wood 등의 상기 문헌), APP-α분석에 사용되는 리포터 항체는 APP의 아미노산 605∼611에 대해 생성된 mAb 16H9의 비오틴화 유도체이다. APP-αFL 분석의 감도의 하한치는 약 11 ng/㎖(150 ρM)이고(Johnson-Wood 등의 상기 문헌), APP-α특이적 분석의 감도의 하한치는 22 ng/㎖(0.3 nM)이다. 두 APP 분석 모두에서, mAb 8E5를 mAb 266에 대해 전술한 바와 같이 96웰 EIA 플레이트의 웰에 코팅하였다. APP-α분석 및 APP-α/FL 분석에 대한 기준 표준물질로서 정제된 재조합의 분비형 APP-α를 사용하였다(Esch 등의 상기 문헌). 5 M 구아니딘 중의 뇌 균질물 샘플을 ELISA 표본 희석제(0.014 M 인산염 완충액, pH 7.4, 0.6% 소 혈청 알부민, 0.05% 티메로살, 0.5 M NaCl, 0.1% NP40) 중에 1:10으로 희석시켰다. 그 후 이것을 0.5 M 구아니딘을 함유하는 표본 희석제에 1:4로 희석시켰다. 그 후 희석된 균질물을 RT에서 16,000 x g로 15초간 원심분리하였다. APP 표준물질 및 샘플을 이중 분액으로 플레이트에 첨가하여 RT에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 비오틴화된 리포터 항체 2H3 또는 16H9와 샘플을 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 표본 희석제에 1:1000으로 희석시킨 스트렙타빈-알칼라인 포스파타제(뵈링거 만하임)를 RT에서 1시간 동안 웰에서 항온처리하였다. 형광 기질인 4-메틸-움벨리페릴-포스페이트를 첨가하여 RT에서 30분간 항온처리하고, 이 플레이트를 Cytofluor tm 2350 형광측정기(밀리포어) 상에서 365 nm 여기 및 450 nm 방출로 기록하였다.

F. 면역조직화학

뇌를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드에 4℃로 3일간 고정시킨 다음, 절편으로 만들 때까지 1% 파라포름알데히드, PBS 중에서 4℃에서 1∼7일간 보관하였다. RT에서 바이브라톰으로 40 미크론 두께의 두정 절편을 컷팅하여 저온 보존제(인산염 완충액 중의 30% 글리세롤, 30% 에틸렌 글리콜) 중에서 -20℃로 면역조직화학적 프로세싱을 하기 전까지 보관하였다. 각 뇌마다 각각 연속되는 240 ㎛간격으로 분리되도록 척추 해마 높이에서 6개의 절편을 만들어서 다음의 항체들 중 하나와 함께 밤새 항온처리하였다: (1) PBS 및 1% 말 혈청 중 2 ㎍/㎖의 농도로 희석시킨 비오틴화된 항-Aβ(mAb, 3D6, 인간 Aβ에 대해 특이적임); 또는 (2) PBS 및 1.0% 말 혈청 중 3 ㎍/㎖의 농도로 희석시킨, 인간 APP, 8E5에 특이적인 비오틴화된 mAb; 또는 (3) Tris-완충 염수, pH 7.4(TBS) 중의 0.25% 트리톤 X-100 및 1% 말 혈청으로 1:500으로 희석시킨 섬유성신경교세포 산성 단백질(GFAP; 시그마 케미칼 컴퍼니)에 특이적인 mAb; 또는 (4) TBS 중의 0.25% 트리톤 X-100 및 1% 토끼 혈청으로 1:100으로 희석시킨, CD11b, MAC-1 항원에 특이적인 mAb(케미콘 인터내셔널); 또는 (5) TBS 중의 0.25% 트리톤 X-100 및 1% 토끼 혈청으로 1:100으로 희석시킨, MHC II 항원에 특이적인 mAb(파밍엔); 또는 (6) PBS 중의 1% 토끼 혈청으로 1:100으로 희석시킨, CD43에 특이적인 래트 mAb(파밍엔); 또는 (7) PBS 중의 1% 토끼 혈청으로 1:100으로 희석시킨, CD45RA에 특이적인 래트 mAb(파밍엔); 또는 (8) PBS 중의 1% 토끼 혈청으로 1:100으로 희석시킨, CD45RB에 특이적인 래트 모노클로날 Aβ(파밍엔); 또는 (9) PBS 중의 1% 토끼 혈청으로 1:100으로 희석시킨, CD45에 특이적인 래트 모노클로날 Aβ(파밍엔); 또는 (10) PBS 중의 1% 토끼 혈청으로 1:100으로 희석시킨, CD3e에 특이적인 비오틴화된 폴리클로날 햄스터 Aβ(파밍엔); 또는 (11) PBS 중의 1% 토끼 혈청으로 1:200으로 희석시킨, CD3에 특이적인 래트 mAb(세로텍); 또는 (12) 1% 정상 말 혈청을 함유하는 1차 항체를 포함하지 않는PBS 용액.

상기 1, 2 및 6-12에서 열거한 항체 용액으로 반응시킬 절편은 PBS 중의 1.0% 트리톤 X-100, 0.4% 과산화수소로 RT에서 20분간 전처리하여 내생 퍼옥시다제를 블로킹시켰다. 그 후 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 그 후 3D6 또는 8E5 또는 CD3e mAb와 반응시킬 절편을 PBS 중에 1:75로 희석시킨 키트 성분 "A" 및 "B"(벡터 엘리트 스탠더드 키트, 캘리포니아주 버링검 소재의 벡터 랩스 제품)와 호스래디쉬 퍼옥시다제-아비딘-비오틴-복합체와 함께 RT에서 1시간 동안 반응시켰다. CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3에 특이적인 항체 및 1차 항체가 없는 PBS 용액과 반응시킨 절편은 각각 PBS에 1:75로 희석시킨 비오틴화 항-래트 IgG(벡터) 및 PBS에 1:75로 희석시킨 비오틴화 항-마우스 IgG(벡터)와 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후 절편들을 PBS에 1:75로 희석시킨 키트 성분 "A" 및 "B"(벡터 엘리트 스탠더드 키트, 캘리포니아주 버링검 소재의 벡터 랩스 제품)과 호스래디쉬 퍼옥시다제-아비딘-비오틴-복합체와 RT에서 1시간 동안 반응시켰다.

RT에서 0.01% 과산화수소, 0.05% 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 중에서 절편들을 발색시켰다. GFAP-, MAC-1- 및 MHC II-특이적 항체와 항온처리할 절편들은 0.6% 과산화수소로 RT에서 전처리하여 내생 퍼옥시다제를 블로킹시킨 다음, 4℃에서 1차 항체와 밤새도록 항온처리하였다. GFAP 항체와 반응시킬 절편은 TBS에 1:200으로 희석시킨 말에서 제조한 항-마우스 IgG(벡터 래보라토리즈; 벡타스타틴 엘리트 ABC 키트)와 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후 이 절편을 TBS에 1:1000으로 희석시킨 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체(벡터 래보라토리즈; 벡타스타틴 엘리트ABC 키트)와 1시간 동안 반응시켰다. MAC-1 또는 MHC II에 특이적인 모노클로날 항체를 1차 항체로서 사용하여 항온처리한 절편을 후에 TBS로 1:200으로 희석시킨 토끼에서 제조된 비오티닐화된 항-래트 IgG와 함께 RT에서 1시간 동안 반응시킨 다음, TBS로 1:1000으로 희석시킨 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체와 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후 GFAP-, MAC-1- 및 MHC-II에 특이적인 항체와 항온처리된 절편을 0.05% DAB, 0.01% 과산화수소, 0.04% 염화니켈, TBS로 RT에서 각각 4분 및 11분 동안 처리하여 시각화하였다.

면역표지된 절편을 유리 슬라이드(VWR, 수퍼프로스트 슬라이드)에 마운팅하고, 밤새 공기 건조시킨 후, 프로파(Propar)(아나텍)에 침지시키고 마운팅 매질로서 퍼마운트(Permount)(피셔)를 사용하여 커버슬립으로 덮었다.

Aβ플라크를 대비 염색하기 위해, GFAP-양성 절편의 일부를 수퍼프로스트 슬라이드 상에 마운팅하여 수성 1% 티오플라빈 S(시그마) 중에서 7분간 항온처리한 후 면역조직화학적 프로세싱을 수행하였다. 그 후 절편들을 탈수시키고 프로파에서 세척한 후 퍼마운트로 마운팅된 커버슬립으로 덮었다.

G. 상 분석

CCD 비디오 카메라를 통해 니콘 마이크로포트-FX 현미경에 연결된 비디오메트릭 150 이미지 어낼러시스 시스템(온커 인코포레이티드, 매릴랜드주 게티스버그 소재) 및 소니 트리니트론 모니터를 사용하여 면역반응성 슬라이드를 정량하였다. 절편의 상을 비디오 버퍼에 저장하고, 색 및 포화도를 기초로 역치를 결정하여 면역표지된 구조가 차지하는 총 픽셀 면적을 선택하고 계산하였다. 각 절편에 대해수작업으로 해마의 외곽을 그리고, 해마가 차지하는 총 픽셀 면적을 계산하였다. 퍼센트 아밀로이드 존재량은 (mAb 3D6와 면역반응성인 Aβ 퇴적물을 포함하는 해마 면적의 비율) x 100으로 측정하였다. 유사하게, 퍼센트 신경돌기 존재량은 (모노클로날 항체 8E5와 반응성인 영양장애 신경돌기를 포함하는 해마 면적의 비율) x 100으로 측정하였다. 심플 32 소프트웨어 애플리케이션 프로그램을 작동시키는 C-이미징 시스템(컴픽스, 인코포레이티드, 펜실베이니아주 크랜버리 타운쉽 소재)을 옵트로닉스(Optronics) 카메라를 통해 니콘 마이크로포트-FX 현미경에 연결시켜서, GFAP-양성 성상 세포와 MAC-1- 및 MHC II-양성 소교 세포가 차지하는 레트로스플레니얼 피질(retrosplenial cortex)의 비율을 정량하였다. 면역반응 절편의 상을 비디오 버퍼에 저장하고, 단색계 역치를 결정하여 면역표지된 세포가 차지하는 총 픽셀 면적을 선택하고 계산하였다. 각 절편에 대해, 수작업으로 레트로스플레니얼 피질(RSC)의 윤곽을 그리고, RSC가 차지하는 총 픽셀 면적을 계산하였다. 퍼센트 성상세포증은 (GFAP-반응성 성상 세포가 차지하는 RSC의 비율) x 100으로 정의하였다. 유사하게 퍼센트 소교세포증은 (MAC-1- 또는 MHC II-반응성 소교 세포가 차지하는 RSC의 비율) x 100으로 정의하였다. 모든 상 분석에 대해, 각각 연속되는 240 ㎛ 간격으로 분리되어 있는 척추 해마 위치에서 6개의 절편을 만들어 각 동물에 대해 정량하였다. 모든 경우에 있어서 동물들의 처리 상태는 관찰자가 모르게 하였다.

전술한 발명은 분명한 이해를 목적으로 상세히 설명하였으나, 특정 변형이 첨부되는 특허청구의 범위 내에서 실시될 수 있음은 분명하다. 본원에서 인용하는모든 공보 및 특허 문헌은 물론, 도면과 서열 목록에 개시된 텍스트는 각각이 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 그 전체를 본원에서 참고 문헌으로 포함하고 있다.

전술한 설명으로부터 본 발명이 다수의 용도를 제공한다는 것을 알 수 있다, 예를 들어, 본 발명은 아밀로이드생성 질환의 치료, 예방 또는 진단에 전술한 Aβ에 대한 항체 중 임의의 것을 사용하는 용도, 또는 아밀로이드생성 질환의 치료, 예방 또는 진단용 약제 또는 진단 조성물의 제조에 전술한 Aβ에 대한 항체 중 임의의 것을 사용하는 용도를 제공한다.

Claims (158)

1. (i) 서열 번호 2에 개시된 3D6 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄로서, 단, 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 경쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 이때 프레임워크 잔기는

   (a) 항원에 직접 비공유적으로 결합하는 하는 잔기;

   (b) CDR에 인접한 잔기;

   (c) CDR-상호작용 잔기; 및

   (d) VL-VH 계면에 관여하는 잔기

   로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
2. (i) 서열 번호 4에 개시된 3D6 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄로서, 단, 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 이때 프레임워크 잔기는

   (a) 항원에 직접 비공유적으로 결합하는 하는 잔기;

   (b) CDR에 인접한 잔기;

   (c) CDR-상호작용 잔기; 및

   (d) VL-VH 계면에 관여하는 잔기

   로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
3. 제1항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 1CR9의 규명된 구조를 기초로 하여 3D6 경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
4. 제1항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 1NLD의 규명된 구조를 기초로 하여 3D6 경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
5. 제2항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 1OPG의 규명된 구조를 기초로 하여 3D6 중쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
6. (i) 서열 번호 2에 개시된 3D6 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄로서, 단, 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 경쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 이때 프레임워크 잔기는 3D6 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의해 확인되는 바와 같이 경쇄 가변 영역의 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
7. (i) 서열 번호 4에 개시된 3D6 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄로서, 단, 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 이때 프레임워크 잔기는 3D6 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의해 확인되는 바와 같이 중쇄 가변 영역의 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
8. 제6항에 있어서, 프레임워크 잔기는 구조 모델의 표면 상에 있는, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위에 가까이 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR 잔기에서 6 Å 이내에 있는 잔기, 카논형(canonical) 잔기, 버니어(vernier) 구역 잔기, 사슬간 패킹 잔기, 빈도가 낮은 잔기, 및 글리코실화 부위 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
9. 제7항에 있어서, 프레임워크 잔기는 구조 모델의 표면 상에 있는, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위에 가까이 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR 잔기에서 6 Å 이내에 있는 잔기, 카논형 잔기, 버니어 구역 잔기, 사슬간 패킹 잔기, 빈도가 낮은 잔기, 및 글리코실화 부위잔기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
10. 제6항 또는 제8항에 있어서, 프레임워크 잔기는 1CR9의 규명된 구조를 기초로 하여 3D6 경쇄를 모델링함으로써 확인하는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
11. 제6항 또는 제8항에 있어서, 프레임워크 잔기는 1NLD의 규명된 구조를 기초로 하여 3D6 경쇄를 모델링함으로써 확인하는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
12. 제7항 또는 제9항에 있어서, 프레임워크 잔기는 1OPG의 규명된 구조를 기초로 하여 3D6 중쇄를 모델링함으로써 확인하는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
13. (i) 서열 번호 2에 개시된 3D6 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄로서, 단, L1, L2, L36 및 L46(Kabat 넘버링 방식)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 경쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
14. (i) 서열 번호 4에 개시된 3D6 중쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역, 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄로서, 단, H49, H93 및 H94(Kabat 넘버링 방식)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 3D6 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
15. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제11항 및 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 수용체 경쇄는 아형 카파 II(Kabat 방식)인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
16. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제12항 및 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 수용체 중쇄는 아형 III(Kabat 방식)인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
17. 제15항에 있어서, 인간 수용체 경쇄는 Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 및 Kabat ID U41645로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
18. 제15항에 있어서, 인간 수용체 경쇄는 Kabat ID 019230인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
19. 제16항에 있어서, 인간 수용체 중쇄는 Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 및 Kabat ID M23691로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
20. 제16항에 있어서, 인간 수용체 중쇄는 Kabat ID 045919인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
21. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제11항, 제13항, 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 인간 가변 경쇄 서열의 경우 그 위치에서 일반적으로 나타나는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
22. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제11항, 제13항, 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 생식세포계 가변 경쇄 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
23. 제22항에 있어서, 생식세포계 가변 경쇄 서열은 A1, A17, A18, A2 및 A19로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
24. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제12항, 제14항, 제16항, 제19항 및 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 인간 가변 중쇄 서열의 경우 그 위치에서 일반적으로 나타나는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
25. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제12항, 제14항, 제16항, 제19항 및 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 생식세포계 가변 중쇄 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
26. 제25항에 있어서, 생식세포계 가변 중쇄 서열은 VH3-48, VH3-23, VH3-7, VH3-21 및 VH3-11로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
27. 제25항에 있어서, 생식세포계 가변 중쇄 서열은 VH3-23인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
28. 제21항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 빈도가 낮은(rare) 프레임워크 잔기는 경쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 인간 경쇄 가변 영역 서열의 10% 미만이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로 선택되고, 일반적인(common) 잔기는 경쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 서열의 50% 이상이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
29. 제24항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 빈도가 낮은 프레임워크 잔기는 중쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 인간 중쇄 가변 영역 서열의 10% 미만이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로 선택되고, 일반적인 잔기는 중쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 서열의 50% 이상이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
30. 모노클로날 항체 3D6 경쇄 유래의 상보성 결정 영역(CDR) 및 가변 영역 프레임워크 잔기 L1, L2, L36 및 L46(Kabat 넘버링 방식)을 포함하는 경쇄로서, 이 경쇄의 나머지 부분은 인간 면역글로불린에서 유래된 것인 경쇄.
31. 모노클로날 항체 3D6 중쇄 유래의 상보성 결정 영역(CDR) 및 가변 프레임워크 잔기 H49, H93 및 H94(Kabat 넘버링 방식)을 포함하는 중쇄로서, 이 중쇄의 나머지 부분은 인간 면역글로불린에서 유래된 것인 것인 중쇄.
32. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제11항, 제13항, 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 하나의 항에 기재된 경쇄, 및 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제12항 제14항, 제16항, 제19항 및 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 중쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린, 또는 이 면역글로불린의 항원 결합 단편.
33. 제32항에 있어서, 10⁷M^-1이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
34. 제32항에 있어서, 10⁸M^-1이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
35. 제32항에 있어서, 10⁹M^-1이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
36. 제32항에 있어서, 중쇄 이소타입이 γ1인 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
37. 제32항에 있어서, 가용성 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 및 응집된 Aβ둘다에 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
38. 제37항에 있어서, 가용성 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)는 분해된 Aβ인것인 면역글로불린.
39. 제32항에 있어서, 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)의 식작용을 매개하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
40. 제32항에 있어서, 피험체의 혈뇌 장벽을 관통하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
41. 제32항에 있어서, 피험체에서 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 존재량 및 신경돌기 영양장애 둘다를 감소시키는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
42. 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린으로서,

    (a) 상기 인간화된 경쇄는 서열 번호 2로 표시되는 마우스 3D6 면역글로불린 경쇄 가변 도메인의 상응하는 상보성 결정 영역 유래의 아미노산 서열을 갖는 3가지의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 유래의 가변 영역 프레임워크를 포함하고, 단, L1, L2, L36 및 L46(Kabat 넘버링 방식)으로 이루어진 제1 그룹으로부터 선택된 1 이상의 위치는 마우스 3D6 면역글로불린 경쇄 가변 영역 프레임워크의 대등한 위치에 존재하는 동일한 아미노산가 차지하고;

    (b) 상기 인간화된 중쇄는 서열 번호 4로 표시되는 마우스 3D6 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 상응하는 상보성 결정 영역 유래의 아미노산 서열을 갖는 3가지의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크서열 유래의 가변 영역 프레임워크를 포함하고, 단, H49, H93 및 H94(Kabat 넘버링 방식)으로 이루어진 제2 그룹으로부터 선택된 1 이상의 위치는 마우스 3D6 면역글로불린 중쇄 가변 영역 프레임워크의 대등한 위치에 존재하는 동일한 아미노산 잔기가 차지하며;

    상기 인간화된 면역글로불린은 10⁷M^-1이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하고, 3D6 면역글로불린은 서열 번호 2로 표시되는 가변 도메인을 갖는 경쇄 및 서열 번호 4로 표시되는 가변 도메인을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 인간화된 면역글로불린.
43. 제42항에 있어서, 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크는 카파 경쇄 가변 영역인 것인 인간화된 면역글로불린.
44. 제42항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크는 IgG1 중쇄 가변 영역에서 유래된 것인 인간화된 면역글로불린.
45. 제42항에 있어서, 인간화된 경쇄 가변 영역 프레임워크는 Kabat ID 019230, Kabat ID 005131, Kabat ID 005058, Kabat ID 005057, Kabat ID 005059, Kabat ID U21040 및 Kabat ID U41645로 이루어진 군에서 선택되는 경쇄에서 유래되는 것인 인간화된 면역글로불린.
46. 제42항에 있어서, 인간화된 중쇄 가변 영역 프레임워크는 Kabat ID 045919, Kabat ID 000459, Kabat ID 000553, Kabat ID 000386 및 Kabat ID M23691로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄에서 유래되는 것인 인간화된 면역글로불린.
47. 제42항에 있어서, 인간화된 경쇄 가변 영역 프레임워크는 제1 그룹 유래의 위치를 제외하고는 Kabat ID 019230 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열과 동일하고, 중쇄 가변 영역 프레임워크는 제2 그룹 유래의 위치를 제외하고는 Kabat ID 045919 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열과 동일한 것인 인간화된 면역글로불린.
48. 제42항에 있어서, 인간화된 경쇄는 마우스 3D6 중쇄의 상응하는 상보성 결정 영역과 동일한 상보성 결정 영역을 포함하고, 인간화된 중쇄는 마우스 3D6 중쇄의 상응하는 상보성 결정 영역과 동일한 상보성 결정 영역을 포함하는 것인 인간화된 면역글로불린.
49. 서열 번호 2에 개시된 3D6 가변 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 인간화된 항체.
50. 서열 번호 4에 개시된 3D6 가변 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 인간화된 항체.
51. 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하고, 마우스 3D6 항체 유래의 CDR에 상응하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
52. (a) 쥐의 3D6 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 잔기 및 인간 VL 서브그룹 II 가변 도메인 프레임워크 영역(FR) 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및

    (b) 쥐의 3D6 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 잔기 및 인간 VH 서브그룹 III 가변 도메인 프레임워크 영역(FR) 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 도메인

    을 포함하는, 10⁷M^-1이상의 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 결합하는 인간화된 항체.
53. 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 3D6 면역글로불린 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 수용체 면역글로불린 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린.
54. 서열 번호 8에 개시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 5에 개시된 가변 경쇄 영역을 포함하는 면역글로불린, 또는 이의 항원 결합 단편.
55. 서열 번호 12에 개시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 11에 개시된 가변 경쇄 영역을 포함하는 면역글로불린, 또는 이의 항원 결합 단편.
56. 서열 번호 8에 개시된 가변 중쇄 영역, 서열 번호 5에 개시된 가변 경쇄 영역, 및 IgG1 유래의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린.
57. 서열 번호 12에 개시된 가변 중쇄 영역, 서열 번호 11에 개시된 가변 경쇄 영역, 및 IgG1 유래의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린.
58. 제32항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 기재된 인간화된 면역글로불린의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 아밀로이드생성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
59. 제32항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 기재된 인간화된 면역글로불린의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 알츠하이머병을 예방 또는 치료하는 방법.
60. 제59항에 있어서, 인간화된 면역글로불린의 유효량은 체중 1 kg당 1 mg인 것인 방법.
61. 제59항에 있어서, 인간화된 면역글로불린의 유효량은 체중 1 kg당 10 mg인 것인 방법.
62. 제32항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 기재된 면역글로불린과 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물.
63. 서열 번호 2의 아미노산 24-39, 서열 번호 2의 아미노산 55-61 및 서열 번호 2의 아미노산 94-102로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 2의 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
64. 서열 번호 2의 아미노산 24-39, 서열 번호 2의 아미노산 55-61 및 서열 번호 2의 아미노산 94-102를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
65. 서열 번호 4의 아미노산 31-35, 서열 번호 4의 아미노산 50-66 및 서열 번호 4의 아미노산 99-107로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 4의 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
66. 서열 번호 4의 아미노산 31-35, 서열 번호 4의 아미노산 50-66 및 서열 번호 4의 아미노산 99-107을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
67. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
68. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드,
69. 1 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체로서, 이 변이체는 10⁷M^-1이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 것인 변이체.
70. 1 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체로서, 이 변이체는 10⁷M^-1이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 것인 변이체.
71. 서열 번호 2의 아미노산 서열의 잔기 1-112를 포함하거나, 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열의 잔기 1-119를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
72. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제11항, 제13항, 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 하나의 항에 기재된 경쇄를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
73. 제2항, 제5항, 제7항, 제9항, 제12항, 제14항, 제16항, 제19항 및 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 중쇄를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
74. 제64항 내지 제71항 중 어느 하나의 항에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
75. 제32항 내지 제57항 중 어느 하나의 항에 기재된 면역글로불린을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
76. 서열 번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
77. 제72항 내지 제76항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
78. 제72항 내지 제76항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
79. 항체 또는 이의 단편이 생성되도록 하는 조건 하에 제45항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 상기 항체를 분리하는 단계를포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법.
80. 항체 또는 이의 단편이 생성되도록 하는 조건 하에 상기 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 상기 항체 또는 이의 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 2의 아미노산 24-39, 서열 번호 2의 아미노산 55-61 및 서열 번호 2의 아미노산 94-102를 포함하는 것인 방법.
81. 항체 또는 이의 단편이 생성되도록 하는 조건 하에 상기 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 4의 아미노산 31-35, 서열 번호 4의 아미노산 50-66 및 서열 번호 4의 아미노산 99-112를 포함하는 것인 방법.
82. 규명된 면역글로불린 구조를 기초로 하여 3D6 가변 영역의 3차원 구조를 모델링하는 단계 및 상기 모델을 3D6 면역글로불린 가변 영역의 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기에 대하여 분석하여 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 단계를 포함하는, 인간화된 3D6 면역글로불린 가변 프레임워크 영역에서 치환될 수 있는잔기를 확인하는 방법.
83. 3D6 면역글로불린, 3D6 면역글로불린 사슬, 또는 이의 도메인의 3차원 상을 생성하는 데 사용되는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 개시된 가변 영역 서열, 또는 이의 일부분의 용도.
84. (i) 서열 번호 14에 개시된 10D5 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄로서, 단, 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 10D5 경쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 이때 프레임워크 잔기는

    (a) 항원에 직접 비공유적으로 결합하는 하는 잔기;

    (b) CDR에 인접한 잔기;

    (c) CDR-상호작용 잔기; 및

    (d) VL-VH 계면에 관여하는 잔기

    로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
85. (i) 서열 번호 16에 개시된 10D5 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄로서, 단, 1 이상의프레임워크 잔기는 마우스 10D5 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 이때 프레임워크 잔기는

    (a) 항원에 직접 비공유적으로 결합하는 하는 잔기;

    (b) CDR에 인접한 잔기;

    (c) CDR-상호작용 잔기; 및

    (d) VL-VH 계면에 관여하는 잔기

    로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
86. 제84항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 10D5 경쇄와 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 경쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5 경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
87. 제84항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 10D5 경쇄와 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 경쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5 경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
88. 제84항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 10D5 경쇄와 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 경쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5 경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
89. 제85항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 10D5 중쇄와 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 중쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5 중쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
90. 제85항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 10D5 중쇄와 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 중쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5 중쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
91. 제85항에 있어서, CDR-상호작용 잔기는 10D5 중쇄와 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 중쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5 중쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
92. (i) 서열 번호 14에 개시된 10D5 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 서열 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄로서, 단, 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 10D5 경쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 프레임워크 잔기는 10D5 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의해 확인되는 바와 같이 경쇄 가변 영역의 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
93. (i) 서열 번호 16에 개시된 10D5 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 유래의 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR), 및 (ii) 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 유래의 가변 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄로서, 단, 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 10D5 중쇄 가변 영역 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되고, 프레임워크 잔기는 10D5 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 3차원 모델의 분석에 의해 확인되는 바와 같이 중쇄 가변 영역의 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
94. 제92항에 있어서, 프레임워크 잔기는 구조 모델의 표면 상에 있는, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위에 가까이 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR 잔기에서 6 Å 이내에 있는 잔기, 카논형 잔기, 버니어 구역 잔기, 사슬간 패킹 잔기, 빈도가 낮은 잔기, 및 글리코실화 부위 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
95. 제93항에 있어서, 프레임워크 잔기는 구조 모델의 표면 상에 있는, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위에 가까이 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR 잔기에서 6 Å 이내에 있는 잔기, 카논형 잔기, 버니어 구역 잔기, 사슬간 패킹 잔기, 드문(unusual) 잔기, 및 글리코실화 부위 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
96. 제92항 또는 제94항에 있어서, 프레임워크 잔기는 10D5 경쇄와 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 경쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
97. 제92항 또는 제94항에 있어서, 프레임워크 잔기는 10D5 경쇄와 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 경쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
98. 제92항 또는 제94항에 있어서, 프레임워크 잔기는 10D5 경쇄와 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 경쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5경쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
99. 제93항 또는 제95항에 있어서, 프레임워크 잔기는 10D5 중쇄와 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 중쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5중쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
100. 제93항 또는 제95항에 있어서, 프레임워크 잔기는 10D5 중쇄와 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 중쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5중쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
101. 제93항 또는 제95항에 있어서, 프레임워크 잔기는 10D5 중쇄와 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쥐 면역글로불린 중쇄의 규명된 구조를 기초로 하여 10D5중쇄를 모델링함으로써 확인되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
102. 제84항, 제86항 내지 제88항, 제92항, 제94항 및 제96항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 인간 가변 경쇄 서열의 경우 그 위치에서 일반적으로 존재하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
103. 제84항, 제86항 내지 제88항, 제92항, 제94항 및 제96항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 생식세포계 가변 경쇄 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
104. 제103항에 있어서, 생식세포계 가변 경쇄 서열은 가변 경쇄 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는 면역글로불린의 서열인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
105. 제103항에 있어서, 생식세포계 가변 경쇄 서열은 가변 경쇄 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 면역글로불린의 서열인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
106. 제103항에 있어서, 생식세포계 가변 경쇄 서열은 가변 경쇄 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 면역글로불린의 서열인 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
107. 제85항, 제89항 내지 제91항, 제93항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 인간 가변 중쇄 서열의 경우 그 위치에서 일반적으로 존재하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
108. 제85항, 제89항 내지 제91항, 제93항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 빈도가 낮은 인간 프레임워크 잔기는 생식세포계 가변 중쇄 서열 유래의 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
109. 제108항에 있어서, 생식세포계 가변 중쇄 서열은 서열 번호 16의 가변 중쇄 서열과 70% 이상의 동일성을 공유하는 면역글로불린의 서열인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
110. 제108항에 있어서, 생식세포계 가변 중쇄 서열은 서열 번호 16의 가변 중쇄 서열과 80% 이상의 동일성을 공유하는 면역글로불린의 서열인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
111. 제108항에 있어서, 생식세포계 가변 중쇄 서열은 서열 번호 16의 가변 중쇄 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 면역글로불린의 서열인 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
112. 제102항 내지 제106항 중 어느 하나의 항에 있어서, 빈도가 낮은 프레임워크 잔기는 경쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 인간 경쇄 가변 영역 서열의 10% 미만이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로 선택되고, 일반적인 잔기는 경쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 서열의 50% 이상이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 경쇄.
113. 제107항 내지 제111항 중 어느 하나의 항에 있어서, 빈도가 낮은 프레임워크 잔기는 중쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 인간 중쇄 가변 영역 서열의 10% 미만이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로 선택되고, 일반적인 잔기는 중쇄 가변 영역 서브그룹 중에서 서열의 50% 이상이 그 위치에서 발생하는 것을 기초로 선택되는 것인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
114. 제84항, 제86항 내지 제88항, 제92항, 제94항 및 제96항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 기재된 경쇄, 및 제85항, 제89항 내지 제91항 및 제93항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 기재된 중쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린, 또는 상기 면역글로불린의 항원 결합 단편.
115. 제114항에 있어서, 10^-7M 이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
116. 제114항에 있어서, 10^-8M 이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
117. 제114항에 있어서, 10^-9M 이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
118. 제114항에 있어서, 중쇄 이소타입이 γ1인 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
119. 제114항에 있어서, 응집된 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 결합하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
120. 제114항에 있어서, 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)의 식작용을 매개하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
121. 제114항에 있어서, 피험체의 혈뇌 차단 장벽을 관통하는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
122. 제114항에 있어서, 피험체의 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 플라크 존재량을 감소시키는 것인 면역글로불린 또는 항원 결합 단편.
123. 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린으로서,

     (a) 상기 인간화된 경쇄는 서열 번호 14로 표시되는 마우스 10D5 면역글로불린 경쇄 가변 도메인의 상응하는 상보성 결정 영역 유래의 아미노산 서열을 갖는 3가지의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 유래의 가변 영역 프레임워크를 포함하고, 단, 카논형 잔기, 버니어 잔기, 패킹 잔기 및 빈도가 낮은 잔기로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 10D5 면역글로불린 경쇄 가변 영역 프레임워크의 대등한 위치에 존재하는 동일한 아미노산 잔기가 차지하고;

     (b) 상기 인간화된 중쇄는 서열 번호 16으로 표시되는 마우스 10D5 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 상응하는 상보성 결정 영역 유래의 아미노산 서열을 갖는3가지의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 유래의 가변 영역 프레임워크를 포함하고, 단, 카논형 잔기, 버니어 잔기, 패킹 잔기 및 빈도가 낮은 잔기로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프레임워크 잔기는 마우스 10D5 면역글로불린 중쇄 가변 영역 프레임워크의 대등한 위치에 존재하는 동일한 아미노산 잔기가 차지하며;

     상기 인간화된 면역글로불린은 10^-7M 이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드("Aβ")에 특이적으로 결합하고, 10D5 면역글로불린은 서열 번호 14로 표시되는 가변 도메인을 갖는 경쇄 및 서열 번호 16으로 표시되는 가변 도메인을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 인간화된 면역글로불린.
124. 제123항에 있어서, 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크는 카파 경쇄 가변 영역에서 유래된 것인 인간화된 면역글로불린.
125. 제123항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크는 IgG1 중쇄 가변 영역에서 유래된 것인 인간화된 면역글로불린.
126. 제123항에 있어서, 경쇄 가변 영역 프레임워크는 10D5 면역글로불린의 경쇄 서열과의 서열 동일성이 70% 이상인 인간 면역글로불린 경쇄에서 유래된 것인 인간화된 면역글로불린.
127. 제123항에 있어서, 중쇄 가변 영역 프레임워크는 10D5 면역글로불린의 중쇄 서열과의 서열 동일성이 70% 이상인 인간 면역글로불린 중쇄에서 유래된 것인 인간화된 면역글로불린.
128. 제123항에 있어서, 인간화된 경쇄는 마우스 10D5 중쇄의 상응하는 상보성 결정 영역과 동일한 상보성 결정 영역을 포함하고, 인간화된 중쇄는 마우스 10D5 중쇄의 상응하는 상보성 결정 영역과 동일한 상보성 결정 영역을 포함하는 것인 인간화된 면역글로불린.
129. 서열 번호 14에 개시된 10D5 가변 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 인간화된 항체.
130. 서열 번호 16에 개시된 10D5 가변 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 인간화된 항체.
131. 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하고, 마우스 10D5 항체 유래의 CDR에 상응하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 인간화된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
132. 실질적으로 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 개시된 것과 같은 가변 영역 서열, 및 인간 면역글로불린 유래의 불변 영역 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린.
133. 제114항 내지 제131항 중 어느 하나의 항에 기재된 인간화된 면역글로불린의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 아밀로이드생성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
134. 제114항 내지 제131항 중 어느 하나의 항에 기재된 인간화된 면역글로불린의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 알츠하이머병을 예방 또는 치료하는 방법.
135. 제134항에 있어서, 인간화된 면역글로불린의 유효량은 체중 1 kg당 1 mg인 것인 방법.
136. 제134항에 있어서, 인간화된 면역글로불린의 유효량은 체중 1 kg당 10 mg인 것인 방법.
137. 제114항 내지 제131항 중 어느 하나의 항에 기재된 면역글로불린 및 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물.
138. 서열 번호 2의 아미노산 24-39, 서열 번호 2의 아미노산 55-61 및 서열 번호 2의 아미노산 94-102로 이루어진 군에서 선택되는 서열 번호 2의 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
139. 서열 번호 2의 아미노산 24-39, 서열 번호 2의 아미노산 55-61 및 서열 번호 2의 아미노산 94-102를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
140. 서열 번호 4의 아미노산 31-37, 서열 번호 4의 아미노산 52-67 및 서열 번호 4의 아미노산 100-112로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 4의 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
141. 서열 번호 4의 아미노산 31-37, 서열 번호 4의 아미노산 52-67 및 서열 번호 4의 아미노산 100-112를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
142. 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
143. 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
144. 1 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체로서, 10^-7M 이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 것인 변이체.
145. 1 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체로서, 10^-7M 이상의 결합 친화력으로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 것인 변이체.
146. 서열 번호 14의 아미노산 서열의 잔기 1-112를 포함하거나, 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 잔기 1-123을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
147. 제84항, 제86항 내지 제88항, 제92항, 제94항 및 제96항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 기재된 경쇄를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
148. 제85항, 제89항 내지 제91항, 제93항 및 제99항 내지 제101항에 기재된 중쇄를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
149. 제139항 내지 제146항 중 어느 하나의 항에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
150. 제114항 내지 제132항 중 어느 하나의 항에 기재된 면역글로불린을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
151. 서열 번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
152. 제147항 내지 제151항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
153. 제147항 내지 제151항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
154. 항체 또는 단편이 생성되도록 하는 조건 하에 제153항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법.
155. 항체 또는 이의 단편이 생성되도록 하는 조건 하에 상기 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 2의 아미노산 24-39, 서열 번호 2의 아미노산 55-61 및 서열 번호 2의 아미노산 94-102를 포함하는 것인방법.
156. 항체 또는 이의 단편이 생성되도록 하는 조건 하에 상기 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 4의 아미노산 31-37, 서열 번호 4의 아미노산 52-67 및 서열 번호 4의 아미노산 100-112를 포함하는 것인 방법.
157. 규명된 면역글로불린 구조를 기초로 하여 10D5 가변 영역의 3차원 구조를 모델링하는 단계 및 상기 모델을 10D5 면역글로불린 가변 영역의 구조 또는 기능에 영향을 줄 수 있는 잔기에 대하여 분석하여 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 단계를 포함하는, 인간화된 10D5 면역글로불린 가변 프레임워크 영역에서 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 방법.
158. 10D5 면역글로불린, 10D5 면역글로불린 사슬, 또는 이의 도메인의 3차원 상을 생성하는 데 사용되는 서열 번호 14 또는 서열 번호 16에 개시된 가변 영역 서열, 또는 이의 일부분의 용도.