KR20030032922A - 세포의 동시 자극 및 농축 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 세포를 자극하는 방법, 및 보다 특히 세포의 자극 및/또는 증식을 최대화시키는, 세포를 농축시키고 자극하는 방법에 관한 것이다. 다양한 양태에 있어서, 세포를 증강된 증식, 세포 시그널 전달 및/또는 세포 표면부 응집을 야기하는 표면으로 자극하고 농축시킨다. 특정 국면에 있어서, 세포 집단을 세포 표면부를 연결하는 1종 이상의 제제가 부착되어 있는 표면과 접촉시키고, 세포 농축 및 세포 표면부 연결을 탁월하게 구동시키는 힘을 적용시켜, 세포 자극, 세포 표면부 응집 및/또는 수용체 시그널링 증강을 유도함으로써, 동시 농축 및 표면부 연결에 의해 T-세포와 같은 세포의 집단을 자극하는 방법을 제공한다. 또한, 진단, 약물 발견, 및 암, 바이러스 감염 및 면역 관련된 장애를 포함한 각종 징후의 치료에서 사용하기 위해 T-세포를 포함한 표현형적으로 적합화된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 의해 제조된 특이적 표현형 특성을 갖는 세포의 조성물을 또한 제공한다.

Description

세포의 동시 자극 및 농축{Simultaneous stimulation and concentration of cells}
다수의 세포가 세포 표면 막에서 발견되는 지질 래프트(raft)에 매봉되어 있는 수용체를 통해 활성화되거나 조절된다[참조: K. Simons and D. Toomre, Nature Rev. 1:31, 2000]. 지질 래프트는 리간드 결합에 의해 활성화된 개별적 수용체에 대한 농축 플랫폼을 형성한다. 지질 래프트는 알레르기 면역 반응 동안의 면역글로불린 E 시그널링, 신경계의 발생 및 유지에 중요한 아교 세포-유도된 향신경성 인자 시그널링, 다수의 시그널 전달 과정에 주요한 Ras 시그널링, 및 T-세포 항원 수용체(TCR) 시그널링을 포함한, 세포의 시그널링 과정에 관여한다.
T-세포 항원 수용체(TCR)는 CD3 복합체와 결합하고 항원 제시 세포(APC) 상에서 주조직 적합 복합체(MHC: major histocompatibility complex) I형 및 II형 단백질에 의해 제시되는 펩타이드에 결합하는 멀티서브유니트 면역 인식 수용체이다. APC 상에서의 TCR의 항원성 펩타이드에의 결합은 T-세포와 APC 사이에서의 접촉점에서의 면역학적 시냅스에서 발생하는 T-세포 활성화의 중심적 이벤트이다. 또한, 데이터는 지질 래프트의 클러스터링이 면역학적 시냅스의 형성에 필수적임을 제시한다[참조: Krawczyk et al., Immunity 13(4):463-73, 2000].
T-세포 활성화를 지지하기 위해, T 림프구는 전형적으로 제2의 공자극 시그널을 필요로 한다. 공자극은 전형적으로는 클론 증식을 유도하는 충분한 사이토킨 수준을 생성시키기 위해 T 헬퍼 세포에 전형적으로 필수적이다[참조: Bretscher, Immunol. Today 13:74, 1992; June et al., Immunol. Today 15:321, 1994]. 주요 공자극 시그널은 활성화된 항원 제시 세포(APC) 상의 B7 계열 리간드의 일원(CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2))이 T-세포 상에서 CD28에 결합하는 경우에 발생한다.
T-세포의 특정 서브세트의 증식을 자극하는 방법은 면역요법에서 유용한 각종 T-세포 조성물을 생성시키는 가능성을 갖는다. 성공적인 면역요법은 효율적인 자극에 의한 T-세포의 반응성 및 양을 증가시킴으로써 촉진시킬 수 있다.
사람 T-세포를 증식시키는데 이용가능한 다양한 기술은 본질적으로 보조 세포 및/또는 외인성 성장 인자, 예를 들어, 인터류킨-2(IL-2)의 사용에 의존하였다. IL-2를 항-CD3 항체와 함께 사용하여, T-세포의 CD8+아집단을 탁월하게 증식시키는T-세포 증식을 자극하였다. 둘 다의 APC 시그널은 최적의 T-세포 활성화 증식, 및 재주입시 T-세포의 장기간 생존에 필요한 것으로 고려된다. 보조 세포로서의 MHC-매칭된 APC에 대한 요건은 APC가 비교적 짧게 생존하기 때문에 장기간 배양 시스템에 대한 중요한 문제점을 나타낸다. 따라서, 장기간 배양 시스템에 있어서, APC는 공급원으로부터 연속적으로 획득되어야 하고 보충되어야 한다. 보조 세포의 보충 공급에 대한 필요성은 보조 세포에 침범되어 있는 면역결핍증의 치료에 문제점을 갖는다. 또한, 바이러스 감염을 치료할 경우에, 보조 세포가 바이러스를 보유하고 있으면, 세포는 장기간 배양 동안 전체 T-세포 집단을 오염시킬 수 있다.
외인선 성장 인자 또는 보조 세포의 부재하에, 공자극 시그널은, 예를 들어, T-세포를 고체상 표면, 비드에 부착되어 있는 CD3 리간드 및 CD28 리간드에 노출시킴으로써 T-세포 집단에 전달할 수 있다.[참조: C. June, et al., 미국 특허 제5,858,358호; C. June et al., WO 99/953823]. 이들 방법은 치료학적으로 유용한 T-세포 집단을 획득할 수 있는 반면, T-세포 제조의 증가된 강건함 및 용이성은 여전히 이상적인 상태는 아니다.
또한, 당해 분야에서 현재 이용가능한 방법은 T-세포의 단기간 증식 또는 보다 강건한 T-세포 집단 및 이의 보다 유리한 결과 및/또는 특유한 T-세포 아부류/표현형의 증식을 획득하는데 중점을 두지 않았다. 더우기, 증식된 T-세포의 적용가능성은 단지 수가지 질환 상태에만 제한되었다. 최대 생체내 효능을 위해, 이론적으로는 생체외 또는 생체내-생성된, 활성화 T-세포 집단은 암, 감염성 질환 또는 기타 질환 상태에 대한 면역 반응을 최대한으로 제어할 수 있는 상태로 존재하여야만 한다. 본 발명은 표면 수용체 및 다른 증식 방법보다 건강하고 천연적인 것으로 보이는 사이토킨 생산 특성을 갖는 보다 고도로 활성화되고 보다 순수한 T-세포의 증가된 수를 생성시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 T-세포 집단을 포함한 임의의 표적 세포의 표현형적으로 적합화된 세포 집단의 조성물 및 이를 제조하고, 다른 관련된 이점을 제공하기 위한 파라미터를 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로는 세포를 자극하는 방법을 제공하고, 보다 특히, 세포를 농축시키고 자극하여, 상기 세포의 자극을 최대화시키는 신규한 방법을 제공한다. 한 국면에 있어서, 본 발명은 적어도 일부가 T-세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을 T-세포의 적어도 일부의 세포 표면부를 연결하고 T-세포의 적어도 일부 또는 이의 아집단을 자극하는 1종 이상의 제제가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계 및 T-세포 농축 및 T-세포 표면부 연결을 탁월하게 구동시키는 힘을 적용시켜, T-세포 자극을 유도하는 단계를 포함하여, 동시 T-세포 농축 및 세포 표면부 연결에 의해 T-세포 집단을 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 표면에 T-세포의 제1 세포 표면부를 연결하는 제1 제제가 부착되어 있고, 동일한 표면 또는 제2의 표면에 당해 T-세포의 제2 표면부를 연결하는 제2 제제가 부착되어 있으며, 여기서 제1 및 제2 제제에 의한 연결은 당해 T-세포의 증식을 유도한다. 관련된 양태에 있어서, 표면은 생체적합성,천연 또는 합성일 수 있으며, 중합체를 포함하거나, 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 폴리사카라이드, 글리코사미노글리칸 또는 세포외 매트릭스 조성물을 포함할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 폴리사카라이드는 키토산, 알기네이트, 덱스트란, 히알루론산 및 셀룰로스로부터 선택되고, 중합체는 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리에테르, 다가무수물, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리비닐아세테이트, 블럭 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 폴리우레탄으로부터 선택된다. 또 다른 양태에 있어서, 중합체는 락트산 또는 공중합체를 포함할 수 있다. 한편 또 다른 양태에 있어서, 중합체는 공중합체일 수 있다. 이러한 공중합체는 각종 공지된 공중합체일 수 있고, 락트산 및/또는 글리콜산(PLGA)을 포함할 수 있다.
생체적합성 표면과 관련하여, 이러한 표면은 생체분해성거나 비-생체분해성일 수 있다. 관련된 양태에 있어서, 비제한적으로, 비-생체분해성 표면은 폴리(디메틸실록산) 및/또는 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)를 포함할 수 있다. 또한, 생체적합성 표면은 비제한적으로 콜라겐, 금속, 하이드록시아파타이트, 유리, 알루미네이트, 바이오세라믹재, 히알루론산 중합체, 알기네이트, 아크릴산 에스테르 중합체, 락트산 중합체, 글리콜산 중합체, 락트산/글리콜산 중합체, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드 및/또는 세포외 매트릭스 조성물을 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 양태에 있어서, 생체적합성 표면을 이식형 장치와 결합시킨다. 이식형 장치는 사용하기에 바람직한 임의의 장치일 수 있고, 스텐트, 카테터, 섬유, 중공 섬유, 패취 또는 봉합사를 포함할 수 있다. 관련된 양태에 있어서, 표면은 유리, 실리카, 실리콘, 콜라겐, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔, PTFE, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론 또는 폴리아크릴아미드일 수 있다. 또 다른 추가의 양태는 표면이 지질, 플레이트, 백, 로드, 펠렛, 섬유 또는 메쉬를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 양태는 표면이 입자이고, 추가로 여기서 입자가 비드, 미세구체, 나노입자 또는 콜로이드 입자를 포함하는 경우를 포함한다. 입자 및 비드 크기를 또한 선택할 수 있으며, 비드의 직경이 약 5나노미터 내지 약 500마이크론인 경우를 포함하여 각종 크기를 가질 수 있다.
다른 양태에 있어서, 당해 방법에서 사용되는 제제는 단백질 리간드, 천연 리간드 또는 합성 리간드로부터 독립적으로 선택할 수 있다. 또한, 당해 제제는 항체, 항체 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 가용성 수용체, 스테로이드, 호르몬, 미토겐, 항원, 초항원, 성장 인자, 사이토킨, 렉틴, 바이러스 단백질, 유착 분자 또는 케모킨을 포함할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 1종 이상의 제제는 항체 또는 항체 단편이다. 한편 또 다른 양태에 있어서, 제1 제제는 항체 또는 이의 단편이고, 제2 제제는 항체 또는 이의 단편이다. 제1 및 제2 제제가 동일하거나 상이한 항체일 수 있음은 물론이다.
선택된 양태에 있어서, 제1 제제는 항-CD3 항체, 항-CD2 항체, 또는 항-CD3 또는 항-CD2 항체의 항체 단편이다. 추가로 선택된 양태는 제2 제제가 항-CD28 항체 또는 이의 항체 단편인 경우를 포함한다. 추가의 양태는 제2 항체가, 예를 들어, B7-1 또는 B7-2와 같은 CD28에 대한 천연 리간드를 포함하는 경우를 포함한다. 또한, 다른 자극제를 사용할 수 있다.
특정 양태에 있어서, 세포를 구동시키기 위해 사용되는 힘은 유사하게 작용하는 각종 힘을 포함할 수 있고, 중력보다 큰 힘, 유압력, 막통과압에 의해 발생된 여과력, 원심력 또는 자기력을 포함할 수 있다. 자기력을 사용할 경우에, 특정 양태는 자성체 표면에서 약 200가우스 내지 약 12,000가우스 범위의 자기장을 갖는 자성체에 의해 발생된 자기력을 사용한다.
또 다른 양태는 표면이 상자성 입자의 표면인 경우를 포함한다. 한편, 상자성 입자의 표면을 포함하는 표면을 사용하는 양태에 있어서, 표면에의 제제 부착은 공유, 비공유, 정전기, 분자간 유착 또는 소수성일 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 연결되어 있는 T-세포를 연결되어 있지 않는 T-세포로부터 분리한다. 한편, 다른 양태에 있어서, T-세포는 면역 반응 기능장애를 경감시킨다.
상기 양태와 조합할 수 있는 다른 국면은, 예를 들어, T-세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을 세포 표면부에 특이적인 1종 이상의 리간드가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계, T-세포 및 표면의 농축을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계 및 당해 세포를 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하여, 동시 세포 표면부 연결 및 T-세포 응집에 의해 T-세포를 자극하는 방법을 포함한다. 관련된 양태에 있어서, 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간은 1분 내지 10일 및 이들 사이의 모든 정수값의 범위일 수 있다. 특정 양태에 있어서, 시간 범위는 약 1일 내지 약 8일일 수 있고, 한편 또 다른 양태에 있어서, 시간 범위는 약 3일 내지 약 5일 또는 약 1일 내지 약 5일일수 있다. 관련된 양태에 있어서, 배양 온도는 약 2 내지 약 38℃의 범위일 수 있다.
모든 언급된 방법과 함께 사용할 수 있는 추가의 양태는 표면이 유리, 실리카, 실리콘, 콜라겐, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔, PTFE, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론, 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드, 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 경우를 포함한다. 추가로, 양태는 상기한 임의의 단계 전에 또는 동시에 표면을 사용하여 농축시킨 T-세포를 비농축된 세포로부터 분리함을 포함한다.
다른 국면에 있어서, T-세포 활성화를 유도하는 T-세포 표면부에 특이적인 리간드가 부착되어 있는 상자성 입자를 동물에게 제공하는 단계 및 자기장을 동물의 별개의 부위에 적용시켜, 별개의 부위에서 당해 입자에 결합되어 있는 T-세포의 국재화 및 활성화를 유도하는 단계를 포함하여, 생체내 T-세포 활성화를 유도하는 방법을 제공한다.
적어도 일부가 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을 당해 표적 세포의 적어도 일부의 세포 표면부를 연결하고 표적 세포의 적어도 일부를 자극하는 1종 이상의 제제가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계 및 표적 세포 농축 및 표적 세포 표면부 연결을 탁월하게 구동시키는 힘을 적용시켜, 표적 세포 자극을 유도하는 단계를 포함하여, 동시 표적 세포 농축 및 표적 세포 표면부 연결에 의해 표적 세포 집단을 자극하는 방법을 포함하는 추가의 국면을 제공한다.
특정 양태에 있어서, 본원에 기술된 방법은 표적 세포의 제1 세포 표면부를연결하는 제1 제제가 부착되어 있는 표면 및 당해 표적 세포의 제2 표면부를 연결하는 제2 제제가 부착되어 있는 동일한 표면 또는 제2의 표면을 사용하고, 여기서, 제1 및 제2 제제에 의한 연결은 표적 세포내에서의 시그널 전달을 유도한다.
상기한 바와 같이, 표면은 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 폴리사카라이드, 글리코사미노글리칸 및/또는 세포외 매트릭스 조성물을 포함한 각종 성분을 포함한다. 특정 양태에서 사용되는 특정의 폴리사카라이드는 키토산, 알기네이트, 덱스트란, 히알루론산 및/또는 셀룰로스를 포함할 수 있다. 또한, 위에서 기술하고 모든 방법에 적용가능한 바와 같은 중합체는 폴리에스테르, 폴리에테르, 다가무수물, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리비닐아세테이트, 블럭 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 및/또는 폴리우레탄, 및 이의 혼합물로부터 선택할 수 있다.
다른 국면에 있어서, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을 세포 표면부에 특이적인 1종 이상의 리간드가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계, 표적 세포의 농축 및 당해 표면에서의 당해 세포의 농축을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계 및 당해 세포를 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하여, 세포 표면부 연결 및 표적 세포 농축에 의해 표적 세포를 농축하는 방법을 제공한다.
관련 양태에 있어서, 표적 세포는 T-세포, B-세포 또는 간세포일 수 있다.
다른 국면은 표적 세포 자극을 유도하는 표적 세포 표면부에 특이적인 리간드가 부착되어 있는 상자성 입자를 동물에게 제공하는 단계 및 자기장을 동물의 별개의 부위에 적용시켜, 별개의 부위에서 당해 입자에 결합되어 있는 표적 세포의 국재화 및 자극을 유도하는 단계를 포함하여, 생체내 표적 세포 자극을 유도하는 방법을 제공한다.
세포 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을 당해 세포 집단의 적어도 일부에 존재하는 세포 표면 수용체에 특이적인 1종 이상의 리간드가 부착되어 있는 고체 표면과 접촉시키는 단계 및 세포 농축 및 세포 표면 수용체 연결을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계를 포함하여, 수용체 보유 세포내에서 수용체 분극화를 유도하는 방법을 포함하는 또 다른 국면을 제공한다.
다른 국면은 표적 세포 표면 분자를 갖는 세포 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을 1종 이상의 표적 세포 표면 분자에 대한 리간드가 부착되어 있는 고체 표면과 접촉시키는 단계 및 표적화 세포 표면 분자의 응집을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계를 포함하여, 세포 표면 분자의 응집을 유도하는 방법을 포함한다.
특정 양태에 있어서, 세포 집단은 림프구를 포함한다.
또 다른 특정 양태에 있어서, 수용체 또는 세포 표면부 결합은 세포 이벤트의 하향 조절 또는 억제를 유도한다. 관련된 양태는 수용체 결합이, 예를 들어, 수용체 매개된 시그널 전달을 포함할 수 있는 세포 이벤트의 상향 조절 또는 활성화를 유도하는 경우를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 세포 표면부의 농축 또는 배향을 구동시키는 힘의 사용을 고려한다.
본 발명의 또 다른 추가의 양태는 표현형적으로 적합화된 표적 세포 집단및/또는 T-세포 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 상기 세포를 세포 표면부의 연결에 의해 활성화시키는 방법을 제공한다. T-세포를, 활성화 시그널을 제공하는 제1 제제 및 공자극 시그널을 당해 T-세포에 제공하는 제2 제제가 고정화되어 있는 고체 표면과 약 2시간 내지 약 9일의 시간 동안 접촉시킴을 포함하여, T-세포 집단의 증식을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 국면은 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하면 명백해질 것이다.
본 발명은 일반적으로는 세포를 자극하는 방법, 및 보다 특히 세포를 농축시키고 자극하여, 상기 세포의 자극을 최대화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특이적 표현형 특성을 갖는 자극된 T-세포를 포함한 세포의 조성물에 관한 것이다.
도 1은 (XCELLERATE II™) 자기 농축 및 자극의 존재하에 또는 (XCELLERATE I™) 자기 농축 및 자극의 부재하에 약 0.5 x 109개 T-세포로 개시하여 8일째에 측정한 활성화되고 증식된 T-세포의 전체 수를 비교한 플롯이다.
도 2는 (XCELLERATE II™) 자기 농축 및 자극의 존재하에 또는 (XCELLERATE I™) 자기 농축 및 자극의 부재하에 8일째에 측정한 활성화되고 증식된 T-세포의 증식 배수를 비교한 플롯이다.
도 3은 자기 농축 및 자극 (XCELLERATE II™) 후 또는 자기 농축 및 자극 (XCELLERATE I™)의 부재하에 8일 동안 미리 배양한 T-세포의 재자극을 비교하여, CD154 발현의 유세포 측정 분석을 나타낸 플롯이다.
도 4는 자기 농축 및 자극 (XCELLERATE II™)를 자기 농축 및 자극(XCELLERATE I™)의 부재하에 활성화된 세포와 비교하여, 배양한지 3일 후의 CD154 발현의 유세포 측정 분석을 나타낸 플롯이다.
도 5A 및 5B는 XCELLERATE I™ PBMC(5A) 또는 동결 및 해동시킨 PBMC(5B)를 사용하여, XCELLERTATE I™ 공정을 개시한 T-세포 활성 및 증식을 도시하는 플롯이다.
도 6A 및 6B는 XCELLERTATE I 또는 II™ 공정 동안 1개의 공여체 샘플(PC071)내에서의 T-세포의 활성화 이후 CD25 발현의 경시적 분석을 도시하는 플롯이다. 재자극을 8일째 마크에서 수행하여, 생체내 활성화를 자극한다. 도 6A는 CD4+세포 상에서의 CD25 발현을 도시하는 한편, 도 6B는 CD8+세포 상에서의 CD25 발현을 도시한다.
도 7A 및 7B는 XCELLERTATE I 또는 II™ 공정 동안 1개의 공여체 샘플(PC071)내에서의 T-세포의 활성화 이후 CD154 발현의 경시적 분석을 도시하는 플롯이다. 재자극을 8일째 마크에서 수행하여, 생체내 활성화를 자극한다. 도 7A는 CD4+세포 상에서의 CD154 발현을 도시하는 한편, 도 7B는 CD8+세포 상에서의 CD154 발현을 도시한다.
도 8A 및 도 8B는 실시예 IX에 제시되어 있는 방법을 이용하여 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용한 자극 후의 사람 말초혈 T-세포의 증식을 도시하는 플롯이다.
도 9는 +/- 10u/ml 재조합 사람 IL-2 및 +/- 단핵구 결핍하에 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용한 자극 후의 사람 말초혈 T-세포의 증식을 예시하는 플롯이다. 모든 세포를 박스터 라이프셀 플라스크(Baxter Lifecell Flask)(300ml)내에서 배양한다. 스케일 업은 박스터 라이프셀 3L들이 플라스크까지 증식되는 300ml 플라스크 배양물(IL-2 부재/단핵구 결핍)을 의미한다.
도 10은 경시적 정방향 스캐터 유세포 측정 프로파일에 의해 측정된 바와 같은 세포 크기의 동역학적 분석을 도시하는 플롯이다.
도 11A 및 도 11B는 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용한 최초 자극 후의 경시적 CD25 발현을 나타내는 플롯이다. 도 11A는 CD4+세포 상에서의 CD25의 발현 프로파일을 도시하는 한편, 도 11B는 CD8+세포 상에서의 CD25의 발현 프로파일을 도시한다.
도 12는 1차 및 2차 자극 후의 경시적 정방향 스캐터 유세포 측정 프로파일에 의해 측정된 바와 같은 세포 크기의 변화를 도시하는 플롯이다.
도 13A 및 13B는 1차 및 2차 자극 후의 경시적 CD25 발현을 나타내는 플롯이다. 도 13A는 CD4+세포 상에서의 CD25의 발현 프로파일을 도시하는 한편, 도 13B는 CD8+세포 상에서의 CD25의 발현 프로파일을 도시한다.
도 14A 및 도 14B는 2차 자극 후의 CD154 발현을 나타내는 유세포 측정 데이터 플롯이고, 여기서, 1차 및 2차 자극원은 상이하다. 도 14A는 CD4+세포 상에서의 CD154의 발현 프로파일을 도시하는 한편, 도 14B는 CD8+세포 상에서의 CD154의 발현 프로파일을 도시한다.
도 15는 2차 자극 후에 샘풀내에서 증식된 모든 T-세포 상에서의 CD137 발현을 나타내는 유세포 측정 데이터 플롯이다.
도 16A 및 16B는 2차 자극 후의 CD54 발현을 나타내는 유세포 측정 데이터 플롯이고, 여기서, 1차 및 2차 자극원은 상이하다. 도 16A는 CD4+세포 상에서의 CD54의 발현 프로파일을 도시하는 한편, 도 16B는 CD8+세포 상에서의 CD54의 발현 프로파일을 도시한다.
도 17A 내지 17D는 B-세포 만성 림프구성 백혈병을 앓고 있는 환자로부터 수득된 T-세포의 항-CD3 및 항-CD28 커플링된 비드에 의한 2차 자극 후의 CD154 및 CD137 발현뿐만 아니라, 세포 표현형을 나타내는 유세포 측정 데이터 플롯이다. 도 17A 및 17B는 항-CD3 및 항-CD28 커플링된 비드를 사용한 자극 후 13일째(17A) 및 항-CD3 및 항-CD28 커플링된 비드를 사용한 1차 자극 후 18일째 및 2차 자극 후 7일째(17B) 샘플내에 존재하는 CD4+및 CD8+세포를 도시한다. 도 17C 및 17D는 B-세포 만성 림프구성 백혈병을 앓고 있는 환자로부터 수득된 세포의 2차 자극 후의 CD154 및 CD137 발현을 나타내는 유세포 측정 데이터 플롯이다.
도 18A 내지 18C는 정상 공여체로부터의 T-세포의 1차 및 2차 자극 후의 IL-2(18A), 인터페론 감마(IFN-)(18B) 및 IL-4(18C)의 경시적 발현을 나타내는 플롯이다.
도 19A 및 19B는 항-CD3 및 항-CD28 커플링된 비드를 사용한 자극 후의 CD62L의 경시적 발현을 나타내는 플롯이다.
도 20은 항-CD3 및 항-CD28 커플링된 비드를 사용한 자극 후의 CD4 또는 CD8 세포의 백분율을 도시하는 플롯이다.
도 21A 및 도 21B는 실시예 IX에서의 방법을 이용하여 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용한 자극 후의 CD25 및 CD154 발현의 각각의 평균 형광 강도의 함수로서의 유세포 측정 데이터를 나타내는 플롯이다.
도 22A 및 22B는 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드 자극 전에 CD4 및 CD8 아집단(22A) 또는 CD4-강화 집단(22B) 둘 다를 갖는 세포내에서의 CD154 염색 대 대조 염색(예를 들어, 배경)의 유세포 측정 분석치를 나타내는 플롯이다.
도 23A 및 23B는 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용한 말초혈 림프구의 자극 후에 배지 중의 TNF-(23A) 및 IFN-(23B)의 ELISA 분석치를 나타내는 플롯이다.
도 24A 및 24B는 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용한 말초혈 림프구의 자극 후에 배지 중의 IL-4(24A) 및 IL-2(23B)의 ELISA 분석치를 나타내는 플롯이다.
도 25는 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용하고 정방향 스캐터 분석을 이용한 말초혈 림프구의 자극 후 T-세포 크기에서의 증가를 나타내는 플롯이다.
도 26A 내지 26L은 CD62L 발현(평균 형광 강도, MFI)(26A),CD49d(MFI)(26B), CD25(MFI)(26C), CD69(MFI)(26D), CD154(MFI)(26E), 정방향 광 스캐터(크기)(26F), 생존율(생 게이트 %)(26G)의 유세포 측정 데이터를 나타내는 막대 그래프이고, 모든 이후 자극은 항-CD3 및 항-CD28 공고정화된 비드를 사용하고 재자극은 8일째에 동일한 비드를 사용한다. 도 26H 내지 26L은 2시간 및 18시간째 각각의 자극 후 CD62L, CD69, CD49d, CD154 및 CD25를 도시한다.
본 발명을 설명하기 전에, 이후에 사용될 수 있는 특정 용어의 정의를 설명하는 것이 이의 이해에 도움이 될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생체적합성"은 생세포에 탁월하게 무독성인 특성을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "자극"은 세포 표면부의 연결에 의해 유도된 1차 반응을 의미한다. 예를 들어, 수용체의 범주에 있어서, 이러한 자극은 수용체의 연결 및 후속적인 시그널 전달 이벤트를 함의한다. T-세포의 자극과 관련하여, 당해 자극은 TCR/CD3 복합체의 결합과 같이, 특정 양태에 있어서 시그널 전달 이벤트를 후속적으로 유도하는 T-세포 표면부의 연결을 의미한다. 또한, 자극 이벤트는 세포를 활성화하고 분자 발현 또는 분비를 상향 조절 또는 하향 조절, 예를 들어, TGF-β를 하향 조절할 수 있다. 이와 같이, 직접 시그널 전달 이벤트의 부재하에서도 세포 표면부의 연결은 세포골격 구조의 재조직 또는 세포 표면부의 융합을 야기할 수 있으며, 이들 각각은 후속적인 세포 반응을 증강시키거나, 완화시키거나 변경시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성화"는 현저한 형태학적 변화를 유도하기에 충분한 세포 표면부 연결 이후의 세포 상태를 의미한다. T-세포의 범주내에서, 당해 활성화는 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T-세포의 상태를 의미한다. T-세포의 활성화는 또한 사이토킨 생성 및 조절 또는 세포융해성 이펙터 기능의 수행을 유도할 수 있다. 다른 세포의 범주내에서, 당해 용어는 특유한 물리화학적 과정의 상향 또는 하향 조절을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "힘"은 세포 표면부에 결합하는 제제를 사용하여 세포 농축 및 세포의 농축을 유도하도록 자극하기 위해 세포에 적용하는 인공 또는 외부 힘을 의미한다. 예를 들어, 용어 "힘"은 세포 농축 및/또는 세포 표면부 연결을 유도하는 중력보다 큰 임의의 힘(즉, 중력에 부가한 힘 및 단지 중력만이 아닌 힘)을 포함한다. 이러한 힘은 여과력, 유압력, 전기력, 음파력, 원심력 또는 자기력과 같은 막통과압을 포함한다. 이상적으로는, 사용되는 힘은 세포 표면부를 연결하는 제제와 함께 관심의 대상인 표적 세포의 농축을 구동시킨다. 다양한 범주에 있어서, 힘을 펄스, 즉, 적용시키고 재적용시킬 수 있다(예를 들어, 자기력을 턴 오프 및 턴 온하여, 상자성 입자와 함께 세포 집단을 펄스시킬 수 있다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동시"는 본질적으로 세포 표면부 결합제가 부착되어 있는 표면에서 세포를 농축시킬 때 서로 및 표면, 예를 들어, 리간드(즉, 제제)와 함께 세포의 농축을 야기하는 현상을 의미한다. 그러나, 용어 "동시"의사용은 농축 및 이후의 리간드 결합이 농축 표면에서 동시에 발생하기 때문에 세포 표면부 결합제가 부착되어 있는 표면과 표적 세포의 예비 결합을 배제하지 않는다. 예를 들어, T-세포 활성화의 범주내에서, T-세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착되어 있는 상자성 비드와 같은 표면에 노출시키고, 후속적으로 자기장에 의해 농축시킬 수 있다. 따라서, 이러한 범주내에서 세포 및 비드가 예비 접촉 및 연결을 갖는 반면, 그럼에도 불구하고 세포의 농축 동안 추가의 연결은 발생한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 세포"는 세포 표면부 연결에 의해 자극하고자 하는 임의의 세포를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 영장류화(예를 들어, 사람화), 마우스, 마우스-사람, 마우스-영장류 및 키메라 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 다를 포함하고; 완전 분자, 이의 단편(예를 들어, scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' 및 F(ab)'2단편), 또는 완전 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체일 수 있고; 천연적으로 발생할 수 있거나, 예를 들어, 면역화, 합성 또는 유전자 조작에 의해 생성될 수 있고; 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 단편"은 항원에 결합되고, 특정 양태에 있어서, 예를 들어, 갈락토스 잔기의 혼입에 의해 제거 및 흡수를 용이하게 하는 구조 특정을 나타내도록 유도체화될 수 있는 항체로부터 유도되거나 이와 관련된 단편을 의미한다. 이는, 예를 들어, F(ab), F(av)'2, scFv, 경쇄 가변 영역(VL), 중쇄 가변 영역(VH) 및 이의 배합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하고, 완전 분자, 이의 단편, 또는 완전 분자 및/또는 이의 단편의 다량체 또는 응집체일 수 있고, 천연적으로 발생하거나, 예를 들어, 합성(화학적 및/또는 효소적 합성을 포함) 또는 유전자 조작에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제제", "리간드" 또는 "세포 표면부에 결합하는 제제"는 세포의 한정된 집단에 결합하는 분자를 의미한다. 당해 제제는 임의의 세포 표면부, 예를 들어, 수용체, 항원 결정체, 또는 표적 세포 집단 상에 존재하는 다른 결합 부위에 결합할 수 있다. 당해 제제는 단백질, 펩타이드, 항체 및 이의 항체 단편, 융합 단백질, 합성 분자, 유기 분자(예를 들어, 소형 분자) 등일 수 있다. 명세서 및 T-세포 자극의 범주내에서, 항체는 상기 제제의 표준예로서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포 표면부에 결합하는 제제" 및 "세포 표면부"는 리간드/항-리간드 쌍의 범주내에서 사용한다. 따라서, 이들 분자는 일반적으로 비교적 높은 친화성의 특이적 결합을 나타내는 분자의 상보성/항-상보성 세트로서 고려하여야만 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "공자극 시그널"은 1차 시그널, 예를 들어, TCR/CD3 연결과 함께 T-세포 증식을 유도하는 시그널을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "리간드/항-리간드 쌍"은 일반적으로 비교적 높은 친화성의 특이적 결합을 나타내는 분자의 상보성/항-상보성 세트를 의미한다. 예시적인 리간드/항-리간드 쌍은 효소/저해제, 합텐/항체, 렉틴/탄수화물, 리간드/수용체, 비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 본 발명의 명세서 범주내에서, 수용체 및 다른 세포 표면부는 항-리간드인 한편, 이와 반응성인 제제(예를 들어, 항체 및 항체 단편)는 리간드가 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 "분리"는 한 성분을 또 다른 성분으로부터 (예를 들어, 여과 또는 자기 인력에 의해) 실질적으로 정제하는 임의의 수단을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "휴지 상태"는 세포가 활성적으로 증식하지 않는 세포 상태를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "표면"은 제제가 부착될 수 있는 임의의 표면을 의미하고, 비제한적으로, 금속, 유리, 플라스틱, 공중합체, 콜로이드, 지질, 세포 표면 등을 포함한다. 본질적으로, 당해 표면은 결합되거나 부착되어 있는 제제를 보유할 수 있는 있는 표면이다.
본 발명의 한 국면은 세포의 농축 및 세포 표면부의 연결을 유도하는 힘의 조합이 이들 세포의 자극에서 현저한 증강을 야기한다는 경이적인 발견에 관한 것이다. 본원에 제시된 표준예에서는, T-세포를 사용한다. 그러나, 당업자라면 본 발명이 세포 표면부 연결 또는 응집이 목적되거나 이러한 결합이 후속적인 세포 시그널링 이벤트(예를 들어, 수용체)를 유도하는 임의의 세포 유형에의 광범위한 적용성을 갖는 것으로 용이하게 추론할 수 있다. 이론에 구속되지 않길 바라면서, 본 발명은 지질 래프팅 및/또는 수용체 분극화를 포함한 현상을 이용함으로써 작용할 수 있다. 이러한 현상은 이들이 세포의 하나 또는 심지어 수개의 부위에서 수용체의 국재화(즉, 분극화)로 인해 세포 표면부를 포함한 지질 래프트의 응집 또는 증강된 시그널 전달에 의한 시그널 전달의 개시/증강의 계기가 된다는 점에서 유사하다. 이와 같이, 당해 세포 표면부 연결이 예상외로 T-세포에서의 강건한 세포 활성화 및 증식을 유도할 뿐만 아니라, 또한 다수의 세포 유형의 시그널 전달 이벤트를 확대하기 위해 적용시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 생체내의 특유한 위치에서 시그널 전달 이벤트를 유도하는 이식형 장치와 함께 이용하고, 환자내에의 후속적인 주입을 생체외에서 자극하기 위해 사용하고, 시그널 전달 시그널을 증폭시키고, 이에 의해 당해 전달 이벤트(예를 들어, 정신분열증, 수면장애, 다른 신경학적 징후에 관련된 G-커플링된 단백질 수용체; 알레르기 반응에 관련된 비만 세포 및 호염구 상의 Fc 단편 수용체)를 작동시키는 약물을 선별하는데 원조함으로써 세포내 시그널 전달 이벤트의 연구를 실질적으로 증진시키기 위해 사용할 수 있다. 따라서, T-세포의 범주내에서, 본 발명은 다양한 예상외의 이점을 제공하는데, 먼저 이는 "비피복된" 입자를 사용하여 별개의 단핵구-결핍 단계에 대한 필요성을 제거하고, 활성화 과정 동안 보다 낮은 세포 이동 및 보다 소량의 시약, T-세포 활성화의 증가된 수준을 요구함으로써 T-세포의 증식을 간소화하고, 세포의 프로세싱에 수반되는 시간 및 노동력을 감소시키고, 제조 비용을 감소시키고, 환자 프로세싱 및 주입 스케쥴링의 유연성을 증가시킨다.
본 발명의 추가의 국면에 있어서, 제1 및 제2 표면 또는 그 이상의 표면을 이에 결합되어 있는 리간드/제제의 존재 또는 부재하에 사용할 수 있다. 당해 양태에 있어서, 다양한 표면은 표적 세포의 세포 표면부를 결합하기 위해 부착되어 있는 동일하거나 상이한 제제를 가질 수 있다. 예를 들어, 상자성 비드는 이에 표적 세포 상의 수용체에 대한 항체가 부착될 수 있고, 당해 비드는 표적 세포를 함유하는 세포 집단과 혼합할 수 있다. 또한, 세포 집단을 동일하거나 상이한 세포 표면부 결합제가 부착되어 있는 제2 또는 그 이상의 비드와 혼합할 수 있다. 힘이 농축을 유도할 경우에, 비드 및 세포는 보다 작은 용적으로 되어, 시그널링을 증폭시킨다. 또 다른 예에서, 부착되어 있는 탄수화물 또는 다른 비-수용체 세포 표면부에 특이적인 제제를 보유한 상자성 비드를 표적 세포를 함유하는 세포 집단과 혼합할 수 있다. 다음, 자기장을 사용하여, 수용체 연결 제제가 부착되어 있는 또 다른 표면에 세포가 부착되어 있는 비드를 인취한다. 따라서, 시그널 전달 유도제는 제2 표면 상에 존재한다. 또 다른 예에 있어서, 표적 세포의 세포 표면부에 결합하는 제제를 그 자체에 리간드가 부착되어 있는 메쉬 또는 필터내에 보유되기에 충분히 큰 입자에 부착시킬 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 세포 집단내의 세포의 표면부를 동시에 농축시키고 연결함으로써 세포 집단을 자극하는 방법을 제공한다. 세포 집단의 세포 표면부에 결합하는 제제(예를 들어, 리간드)와의 접촉은 세포 집단을 자극할 수 있다. 리간드는 용액 중에 존재할 수 있으나, 또한 표면에 부착될 수 있다. 세포 표면부, 예를 들어, 수용체의 연결은 일반적으로는 특유한 시그널링 경로를 유도할 수 있다. 최근의 연구는 발생하는 시그널링을 위해, 필수 수용체를 함유하는 지질 래프트의 결정적인 농축물은 응집되어야만 하는 것으로 제시한다. 예로써, 래프트 응집은 특유한 세포 표면부에 대한 리간드를 상자성 입자에 부착시키고, 리간드-보유 입자를 세포에 노출시키고, 자기장과 같은 힘을 적용시킨 직후 또는 이와 동시에 연결된 잔기(예를 들어, 수용체)를 분극화시키고, 세포를 소용적으로 농축시킴으로써 생체내 또는 시험관내에서 촉진시킬 수 있다. 자기력의 적용은 세포를 농축시킬 뿐만 아니라, 세포 표면부를 연결하는 제제가 부착되어 있는 표면을 사용하여 세포를 농축시키고, 이에 의해 세포를 리간드와 보다 더 접촉시켜, 촉진되고 보다 강력한 활성화를 유발시킨다. 본 발명의 다수의 적용은, 예를 들어, 세포가 적은 수 및/또는 기능장애 수용체를 가질 경우에 가능하며, 당해 방법은 지질 래프트 중의 상기 수용체를 충분하게 농축시켜, 상기 결점을 극복하고, 적합한 시그널링 활성을 가능하게 할 수 있다. 상기 세포 표면 레퍼토리 억제의 일례는 항-CD3 및 항-CD28 항체와 같은 제제를 사용한 세포 표면부 자극 이전에 수개의 정상 세포 표면 마커, 예를 들어, CD3/TCR 복합체가 현저하게 낮은 특정한 유형의 백혈병을 앓고 있는 환자에서이다. 항-CD3 및 항-CD28 항체와 같은 제제를 사용하여 세포 집단을 자극함으로써, 상기 세포의 세포 표면 마커를 정상으로 보이는 수준으로 복귀시키고, 상기와 같이 환자에게 재발될 경우에 암 치료법에 대한 보다 강건한 산물을 제공할 수 있다. 본 발명의 또 다른 적용에 있어서, 세포는 수용체 분극화를 유도하고, 이에 의해 수용체 시그널링 이벤트를 최대화함을 포함하여, 효과적으로 농축시키고 활성화시킬 수 있다. 이러한 적용은 수용체에서 지시된 선별 검정법에서의 사용을 포함한 용도 또는 종양 세포에서의 Fas 또는 기타 분자를 연결함으로써 아폽프토시스를 유도하는 것과 같이 세포의 표면 상의 세포 래프트를 수집함으로써 활성화를 유도하는 광범위한 용도를 갖는다.
이러한 선별 검정법의 일례에 있어서, G-커플링된 단백질 수용체 보유 세포를 사용하여, 이들을 힘 유도된 농축을 가능하게 하는 표면에 결합되어 있는 제제와 접촉시킬 수 있다. 따라서, 수용체로서 래프트는 시그널 전달 이벤트와 함께 증폭될 것이다. 이는 전형적인 실험에서 매우 낮은 수준인 시그널 전달 이벤트의 연구 및 따라서 이러한 시그널 전달 이벤트를 저해하거나 다소 변형시키는 약물 화합물을 선별하는데 있어서 중요할 수 있다.
A. 세포 집단의 자극
본 발명의 방법은 리간드 및 세포 부분에 결합하는 제제의 유입 및 세포 이벤트의 유도에 의한 표적 세포의 자극에 관한 것이다. 리간드 또는 제제의 세포에의 결합은 시그널링 경로를 유도하여, 따라서 세포내에서 특유한 표현형 또는 생물학적 변화를 활성화시킬 수 있다. 세포의 활성화는 정상 세포 기능을 증강시키거나, 비정상 세포에서의 정상 세포 기능을 개시할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 리간드 또는 세포 표면부를 연결하는 제제를 사용한 세포의 농축에 의한 자극을 제공한다. 세포의 자극은 증강될 수 있고, 특유한 세포 이벤트는 제2 세포 표면부를 연결하는 제2 제제 또는 리간드를 유입함으로써 자극할 수 있다. 당해 방법은 세포 표면부의 연결이 시그널링 이벤트를 유도하는 임의의 세포에 적용시킬 수 있다. 본 발명은 자극된 세포를 선택하거나 배양하는 수단을 추가로 제공한다. 기술된 표준예는 T-세포의 자극이나, 당해 분야의 통상의 숙련가라면 당해 방법을 다른 세포 유형에 적용시킬 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 예로써, 자극하여 선택할 수 있는 세포 유형은 섬유아 세포, 신경모세포, 조혈 간세포 및 조혈 전구세포(CD34+세포), 중간엽 간세포, 수지상 세포, 세포융해성 T-세포(CD8+세포), 다른 백혈구 집단, 만능 간세포, 다능성 세포, 소도 세포 등을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 방식으로부터 생성된 세포 집단뿐만 아니라, 특이적 표현형 특성을 갖는 T-세포를 포함한 독특한 표현형 특성을 갖는 세포 집단을 제공한다.
상기한 바와 같이, 다양한 세포 유형을 본 발명의 범주내에서 이용할 수 있다. 예를 들어, B 세포, T-세포, NK 세포, 다른 혈액 세포, 신경 세포, 선상(내분비) 세포, 골 형성 세포(파골세포), 생식 세포(예를 들어, 난모세포), 내피 세포 라이닝 재생 기관 및 기타와 같은 세포 유형을 사용할 수 있다. 세포 표면부-리간드 쌍은 (비배제적으로) T-세포 항원 수용체(TCR) 및 항-CD3 mAb, TCR 및 주조직 적합 복합체(MHC)+항원, TCR 및 초항원(예를 들어, 스타필로코쿠스 장독소 B(SEB), 독소 쇽 증후군 독소(TSST) 등), B 세포 항원 수용체(BCR) 및 항-Ig, BCR 및 LPS, BCR 및 특이적 항원(일가 또는 다가), NK 수용체 및 항-NK 수용체 항체, FAS(CD95) 수용체 및 FAS 리간드, FAS 수용체 및 항-FAS 항체, CD54 및 항-CD54 항체, CD2 및 항-CD2 항체, CD2 및 LFA03(림프구 기능 관련된 항원-3), 사이토킨 수용체 및 이의 각각의 사이토킨, 사이토킨 수용체 및 항-사이토킨 수용체 항체, TNF-R(종양 괴사 인자-수용체) 계열 일원 및 이들에 대해 생성된 항체, TNF-R 계열 일원 및 이들의 각각의 리간드, 유착/회귀 수용체 및 이들의 리간드, 유착/회귀 수용체 및 이들에 대한 항체, 난모세포 또는 수정된 난모세포 수용체 및 이들에 대한 항체, 자궁의 자궁내막 라이닝 상의 수용체 및 이들의 리간드, 호르몬 수용체 및 이들의 각각의호르몬, 호르몬 수용체 및 이들에 대해 생성된 항체 및 기타를 포함할 수 있다.
리간드에 의한 수용체의 결합의 특성은 수용체의 다량체화 또는 수용체의 응집/배향을 야기할 수 있어, 세포 반응의 시그널링을 촉진시키거나, 향상시키거나, 또는 달리 특유의 이점, 예를 들어, 세포 분열, 사이토킨 분비, 세포 이동, 증가된 세포-세포 상호작용 등을 제공하도록 변형시킨다.
상기 세포 표면부의 다량체화, 응집 또는 조절된 재배향이 실용적으로 유리할 수 있도록 하는 방법의 2가지 예를 아래에 제시한다.
한 예에서는, 항원 및 항원 제시 세포에 의한 정상 T-세포 활성화는 통상적으로, 예를 들어, TCR 래프트, 세포골격 재조직, "활성화" 시그널의 분극화 및 세포 분열을 야기한다. 본원에 기술된 바와 같은 "정상" 생체내 T-세포 활성화의 부재하의 인공 접근법을 이용하여, 특히 TCR 및 CD28의 촉진되고, 제어되고, 공간적으로 배향된 연결을 통해 상기한 기능을 촉진시키거나, 개선시키거나, 또는 달리 이에 영향을 미친다. 이점은 치료학적 적용에 대해 보다 많은 수의 주입가능한 세포 및 보다 강건한 세포를 생성시키는 시험관내의 개선된 세포 증식일 수 있다. 다른 이점은 세포 표면 상의 정상 TCR 밀도보다 낮은 밀도와 같은 결함을 갖는 세포에 대한 개선된 수용체 "응집"일 수 있다. 유사하게는, 종양 부위에서의 종양-특이적 T-세포와 같은 특이적 T-세포 집단이 활성화할 필요가 있는 시험관내 적용이 유리할 수 있다. 개선된 수용체 응집 및 배향은 다른 방법으로 기능적으로 허용가능한 T-세포에 대해 수득하기에 어려운 활성화 시그널을 제공한다. 또한, 이러한 활성화는 항원 특이적 T-세포의 범주내에서 사용할 수 있다. 이와 관련하여,종양으로부터의 T-세포를 분리하고 증식시켜, 환자에 주입할 수 있다. 유사하게는, 생체내 또는 시험관내에서 항원에 노출된 T-세포는 본 방식에 의해 증식시킬 수 있다.
또 다른 예에서는, 세포 사멸의 개선된 유도는 FAS 경로를 통해 발생한다. FAS의 다량체화를 촉진시키거나, 표적 세포 표면 상에서 "활성화" FAS를 공간적으로 배향하거나, 다른 방법으로 달성할 수 없는 누적 FAS 연결을 촉진시키는 능력은 특히 암, 자가면역 반응 또는 이식편 대 숙주 질환을 치료하는데 유의한 생체내 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포는 낮은 수준의 FAS를 생체내에서 발현시킬 수 있고, 숙주는 낮은 수준의 FAS-L을 (억제 사이토킨 등으로 인해) 종양 부위에서 발현시킬 수 있다. 이들 낮은 수준으로 인해, 적합한 FAS 시그널을 종양 생존 및 증식을 가능하게 하도록 생성시킬 수 없다. 상기 FAS/FAS-리간드 결핍을 극복하는 한가지 가능한 방법은 상자성 입자에 결합되어 있는 FAS에 대한 일가 또는 다가 리간드(FAS-L, 항체 등)를 갖는 종양/종양 부위를 표적화할 수 있는 것이다. 종양 부위(예를 들어, 흑색종, 카포시 육종, 편평 세포 경부 암종 등)에서 본 방법을 이용한 강한 자기장의 적용은 수용체 활성화 및/또는 T-세포 활성화 및 증식에 적합화된, 종양 세포 상의 입자 결합된 FAS로서 종양 부위에서의 상자성 입자의 공간 배향을 위해 제공할 수 있다. 시그널 분극화에 의해 수반되는 증가된 FAS 응집은 종양 세포에서의 세포 사멸을 즉시 유도하는 적합한 시그널을 제공할 것이다.
본 발명의 한 특유한 양태에 있어서, T-세포 집단은 T-세포의 표면을 동시에농축하고 연결함으로써 자극할 수 있다. 본 발명의 한 국면에 있어서, CD3 및 CD28에 대한 항체를 표면 상에 공고정화시킬 수 있다. 이러한 고정화에 바람직한 표면은 입자, 및 특정 국면에 있어서, 상자성 비드와 같은 비드를 포함한다. 본 발명의 또 다른 국면에 있어서, TCR/CD3 복합체에 결합하고 1차 자극 시그널을 개시하는 임의의 리간드를 표면 상에 고정화된 1차 활성화 제제로서 사용할 수 있다. CD28에 결합하고, CD28 리간드 시그널 전달 경로를 개시하여, CD3 리간드를 사용한 세포의 공자극을 유발하고, T-세포 집단의 활성화를 증강시키는 임의의 리간드는 CD28 리간드이고, 따라서, 본 발명의 범주내에서 자극제이다. 본 발명의 추가의 국면에 있어서, 힘을 T-세포 및 항-CD3 및 항-CD28-피복된 표면의 혼합물에 적용시켜, T-세포를 농축시키고, 이에 의해 T-세포 표면 연결을 최대화시킨다. 한 특유한 양태에 있어서, 농축력은 항-CD3 및 항-CD28 피복된 표면이 상자성 비드인 경우에 적용된 자기력이지만, 세포 및 리간드를 함께 농축된 형식으로 만드는 다른 방법을 당해 분야에서 이용할 수 있다. T-세포 집단을 자극하는 상기 방법은 T-세포의 의외로 보다 높은 활성화 및/또는 증식을 유도하는 유의한 비드-세포 및/또는 세포-세포 접촉을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 활성화 T-세포가 질환을 앓고 있는 피검체로부터 먼저 분리할 경우에 T-세포의 프로파일과 비교하여 보다 더 정상인 표현형 및 보다 덜 가변성인 최종 산물을 지시하는 세포 표면 마커를 발현시키는 세포 표면 마커 프로파일을 변형시킨다.
1. 1차 시그널
생체외 T-세포 자극을 초래하는 생화학 이벤트를 아래에 간략하게 기재한다. TCR/CD3 복합체 및 항원 제시 세포 상에서 MHC I형 또는 II형 분자와 접합하여 제시된 항원 사이의 상호작용은 항원-특이적 T-세포 활성화로 칭해지는 일련의 생화학적 이벤트를 개시한다. 따라서, T-세포의 활성화는 T-세포 TCR/CD3 복합체를 자극하거나, CD2 표면 단백질을 자극함으로써 달성할 수 있다. 항-CD3 모노클로날 항체를 사용하여, TCR/CD3 복합체를 통해 T-세포 집단을 활성화시킬 수 있다. 다수의 항-사람 CD3 모노클로날 항체를 상업적으로 구입가능하고, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 구입된 하이브리도마 세포로부터 제조된 OKT3, 및 모노클로날 항체 G19-4가 예시적이다. 유사하게는, 항-CD2 항체의 자극 형태는 공지되어 있고, 입수가능하다. 항-CD2 항체를 사용하여 CD2를 통한 자극은 전형적으로는 2종 이상의 상이한 항-CD2 항체의 배합물을 사용하여 달성한다. 기술된 항-CD2 항체의 자극 배합물은 다음과 같다: T11.1 또는 T11.2 항체와 T11.3 항체와의 배합물[참조: Meuer et al., Cell 36:897-906, 1984] 및 9-1 항체와 9.6 항체와의 배합물(T11.1과 동일한 에피토프를 인식함)[참조: Yang et al., J. Immunol. 137:1097-1100, 1986]. 임의의 상기한 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 항체를 또한 사용할 수 있다. 부가의 항체 또는 항체의 배합물은 표준 기술에 의해 제조하고 동정할 수 있다.
1차 활성화 시그널은 또한 다른 메카니즘을 통해 T-세포에 전달할 수 있다. 예를 들어, 사용할 수 있는 배합물은 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제, 예를 들어, 포르볼 에스테르(예를 들어, 포르볼 미리스테이트 아세테이트), 및 칼슘 이오노포어(예를 들어, 세포질 칼슘 농축을 일으키는 이오노마이신) 등을 포함한다. 이러한 제제의 사용은 TCR/CD3 복합체를 우회하나, 자극 세포를 T-세포에 전달한다. 1차 시그널로서 작용하는 다른 제제는 천연 및 합성 리간드를 포함할 수 있다. 천연 리간드는 제시된 펩타이드의 존재 또는 부재하의 MHC를 포함할 수 있다. 다른 리간드는 펩타이드, 폴리펩타이드, 성장 인자, 사이토킨, 케모킨, 글리코펩타이드, 가용성 수용체, 스테로이드, 호르몬, 미토겐, 예를 들어, PHA 또는 다른 초항원을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 범주내에서, 농축 및 자극의 사용은 T-세포의 증식을 유도하는데 2차 시그널을 필요로 하지 않는 상기 고 수용체 분극화를 야기할 수 있다.
다른 양태에 있어서, 임의의 종류의 시그널 전달 이벤트는 현재 발명을 이용함으로써 확대하거나 분석할 수 있다. 예를 들어, G 단백질-커플링된 수용체는 본 발명의 농축 방법을 이용하여 자극하고 측정할 수 있다.
2. 2차 시그널
TCR/CD3 복합체 또는 CD2 분자의 자극이 T-세포내에서의 1차 활성화 시그널의 전달에 필요한 것으로 보이는 반면, 보조 또는 공자극 분자로 칭해지는 T-세포의 표면 상의 다수의 분자는 휴지 T-세포의 아세포 변형으로의 전이 및 후속적인 증식 및 분화를 조절하는데 관련된다. 따라서, 1차 활성화 시그널 이외에, T-세포 반응의 유도는 제2의 공자극 시그널을 필요로 한다. 특정의 상기 공자극 또는 보조 분자인 CD28은 TCR 복합체에 의해 자극된 임의의 것과 구별되는 시그널 전달 경로를 개시하거나 조절하는 것으로 고려된다.
따라서, 외인성 성장 인자 또는 보조 세포의 부재하에 T-세포 집단의 활성화 및 증식을 증강시키기 위해, T-세포의 표면 상의 보조 분자, 예를 들어, CD28을 보조 분자에 결합하는 리간드를 사용하여 자극한다. 한 양태에 있어서, 보조 분자 CD28의 자극 및 T-세포 활성화는 T-세포 집단을 CD3에 결합하는 리간드 및 CD28에 결합하는 리간드가 부착되어 있는 표면과 접촉시킴으로써 동시에 발생한다. 예를 들어, 항-CD3 항체를 사용한 T-세포의 활성화 및 CD28 보조 분자의 자극은 CD4+T-세포의 선택적 증식을 발생시킨다.
따라서, 당해 분야의 통상의 숙련가는 CD28 분자를 가교 결합시킬 수 있는 항-CD28 항체 또는 이의 단편을 포함한 임의의 제제 또는 CD28에 대한 천연 리간드를 사용하여 T-세포를 자극할 수 있다. 본 발명의 범주내에서 유용한 예시적인 항-CD28 항체 또는 이의 단편은 모노클로날 항체 9.3(IgG2a)(Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ), 모노클로날 항체 KOLT-2(IgG1), 15E8(IgG1), 248.23.2(IgM) 및 EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)을 포함한다. 예시적인 천연 리간드는 단백질의 B7 계열, 예를 들어, B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)[참조: Freedman et al., J. Immunol. 137:3260-3267, 1987; Freeman et al., J. Immunol. 143:2714-2722, 1989; Freeman et al., J. Exp. Med. 174:625-631, 1991, Freeman et al., Science 262:909-911, 1993; Azuma et al., Nature 366:76-79, 1993; Freeman et al., J. Exp. Med. 178:2185-2192, 1993]를 포함한다. 또한, 천연이거나 화학적 또는 재조합 기술에의해 합성된 경우에 천연 리간드의 결합 상동체를 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 2차 시그널로서 작용하는 다른 제제는 천연 및 합성 리간드를 포함할 수 있다. 당해 제제는 다른 항체 또는 이의 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 성장 인자, 사이토킨, 케모킨, 글리코펩타이드, 가용성 수용체, 스테로이드, 호르몬, 미토겐, 예를 들어, PHA 또는 다른 초항원을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 추가의 양태에 있어서, T-세포 집단의 활성화는 다른 T-세포 구성 막 단백질의 공자극에 의해 증강시킬 수 있다. 예를 들어, T-세포 인테그린 LFA-1의 이의 천연 리간드, ICAM-1에의 결합은 세포의 활성화를 증강시킬 수 있다. T-세포에 대한 공자극제로서 또 다른 세포 표면 분자는 T-세포 상에서 베리-레이트-항원-4(VLA-4: very-late-antigen-4)에 결합하는 VCAM-1(CD106)이다.
당업자라면 T-세포 이외의 세포가 세포 표면부를 연결하고 표면부의 응집을 유도하는 제제의 결합에 의해 자극하여, 따라서 시그널링 경로의 활성화를 유발시킬 수 있음은 인지할 것이다. 다른 세포 표면부는 GPI-고정된 엽산 수용체(CD59), 사람 IgE 수용체(FcεRi 수용체), BCR, EGF 수용체, 인슐린 수용체, 에프린 B1 수용체, 뉴로트로핀, 아교 세포 유도된 신경영양 인자(GNDF), 헤지호그 및 다른 콜레스테롤-연결되고 팔미토일화된 단백질, H-Ras, 인테그린, 내피 산화질소 합성효소(eNOS), FAS, TNF 수용체 계열의 일원, GPI-고정된 단백질, 이중 아실화 단백질, 예를 들어, Src-계열 키나제, 이종삼량체 G 단백질의 알파-서브유니트 및 세포골격 단백질을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
B. T-세포 집단의 증식
본 발명의 한 국면에 있어서, 생체외 T-세포 증식은 T-세포의 분리 및 후속적인 자극에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 있어서, T-세포는 단일 제제에 의해 자극할 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, T-세포는 1차 시그널을 유도하는 제1 제제 및 공자극 시그널인 제제인 2종의 제제를 사용하여 자극한다. 단일 시그널을 자극하거나 1차 시그널을 자극하는데 유용한 리간드 및 제2 시그널을 자극하는 보조 분자는 세포의 표면에 부착되어 있거나 상기한 바와 같이 표면에 고정화되어 있는 가용성 형태로 사용할 수 있다. 표면에 부착되어 있는 리간드 또는 제제는 "대용" 항원 제시 세포(APC)로서 작용한다. 바람직한 양태에 있어서, 1차 및 2차 제제 둘 다를 표면 상에 공고정화시킨다. 한 양태에 있어서, 1차 활성화 시그널을 제공하는 분자, 예를 들어, CD3 리간드 및 공자극 분자, 예를 들어, CD28 리간드를 동일한 표면, 예를 들어, 입자에 커플링시킨다. 또한, 상기한 바와 같이, 1종, 2종 또는 그 이상의 자극 분자를 동일하거나 상이한 표면 상에서 사용할 수 있다.
증식 이전에, T-세포의 공급원을 피검체로부터 획득한다. 용어 "피검체"는 면역 반응을 유도할 수 있는 생유기체(예를 들어, 포유동물)를 포함하고자 한다. 피검체의 예는 사람, 개, 고양이, 마우스, 랫트 및 이들의 형질전환 종을 포함한다. T-세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직 및 종양을 포함한 다수의 공급원으로부터 획득한다. 바람직하게는, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 획득할 수 있다. 성분채집산물은 전형적으로는 T-세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 한 양태에 있어서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여, 혈장 분획을 제거하고, 후속적인 프로세싱 단계에 적합한 완충액 또는 배지에 세포를 유입할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 있어서, 세포를 인산염 완충염수(PBS)로 세척한다. 또 다른 양태에 있어서, 세척액은 칼슘이 결핍되어 있고, 마그네슘이 결핍되어 있거나 모두 이가 양이온이 아닐 경우에 다수가 결핍되어 있을 수 있다. 한편, 놀랍게도, 칼슘의 부재하에서의 최초 활성화는 확대된 활성화를 유도한다. 당해 분야의 통상의 숙련가라면 세척 단계가 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 제조업자의 지침사항에 따라 반자동 "유동" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 이용함으로써 달성할 수 있음은 용이하게 인지할 것이다. 세척 후, 세포를 각종 생체적합성 완충액, 예를 들어, Ca-비함유, Mg-비함유 PBS에 재현탁시킬 수 있다. 달리, 성분채집술 샘플 중 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 직접적으로 배양 배지에 재현탁시킬 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 적혈구를 융해시키고, 단핵구를 고갈시킴으로써 T-세포를 말초혈 림프구로부터 분리한다. T-세포의 특이적 아집단, 예를 들어, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+및 CD45RO+T-세포를 포지티브 또는 네가티브 선택 기술에 의해 추가로 분리할 수 있다. 예를 들어, 네가티브 선택에 의한 T-세포 집단의 농축을 네가티브하게 선택된 세포에 특이적인 표면 마커에 대해 생성된 항체의 배합물을 사용하여 달성할 수 있다. 바람직한 방법은 네가티브하게 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 생성된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 네가티브 자기 면역부착 또는 유세포 분석에 의한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 네가티브 선택에 의해 CD4+세포에 대해 농축시키기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로는 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
상기한 단핵구 결핍과 관련하여, 단핵구 집단(즉, CD14+세포)을 제거를 촉진시키기 위해 항-CD14 피복된 비드 또는 칼럼 또는 상기 세포의 탐식 활성의 활용을 포함한 각종 방식에 의해 생체외 증식 이전에 혈액 제제로부터 결핍시킬 수 있다. 따라서, 한 양태에 있어서, 본 발명은 탐식 단핵구에 의해 탐식되기에 충분한 크기의 상자성 입자를 사용한다. 특정 양태에 있어서, 상자성 입자는 상업적으로 구입가능한 비드, 예를 들어, 상품명 Dynabeads™하에 Dynal AS에 의해 제조된 비드이다. 이와 관려하여 예시적인 Dynabeads™는 M-280, M450 및 M-500이다. 한 국면에 있어서, 다른 비특이적 세포는 상자성 입자를 "무관한" 단백질(예를 들어, 혈청 단백질 또는 항체)로 피복함으로써 제거한다. 무관한 단백질 및 항체는 증식시킬 T-세포를 특이적으로 표적화하지 않는 상기 단백질 및 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 양태에 있어서, 무관한 비드는 양 항-마우스 항체, 염소 항-마우스 항체 및 사람 혈청 알부민으로 피복된 비드를 포함한다.
간략하게, 단핵구의 이러한 결핍은 피콜화 전혈 또는 성분채집된 말초혈을 1종 이상의 다양한 무관하거나 비-항체 커플링된 상자성 입자(약 비드 1바이알 또는 4x109비드 내지 세포의 1배취(전형적으로 약 5x108내지 약 2x1010개 세포))와 함께 약 30분 내지 2시간 동안 22 내지 37℃에서 예비배양하고, 이후 상자성 입자가 부착되어 있거나 이를 탐식하는 세포를 자기 제거함으로써 수행한다. 이러한 분리는 당해 분야에서 이용가능한 표준 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 각종 방식(예를 들어, DYNALRMagnetic Particle Concetrator (DYNAL MPCR))을 포함한 임의의 자기 분리 방식을 이용할 수 있다. 필수 결핍의 확실성은 상기 결핍 전후에 CD14 포지티브 세포의 유세포 분석을 포함한 당해 분야의 통상의 숙련가에게 공지된 각종 방식에 의해 모니터링할 수 있다.
자극하기 위한 T-세포를 제조하는 또 다른 방법은 세척 단계 후에 세포를 동결시키는 것이며, 당해 방법은 단핵구-제거 단계를 필요로 하지 않는다. 이론에 구속되지 않길 바라면서, 동결 및 후속적 해동 단계는 과립구를 제거함으로써 세포 집단 중에 보다 균일한 산물 및 어느 정도까지는 단핵구를 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 동결액에 현탁시킬 수 있다. 다수의 동결액 및 파라미터가 당해 분야에 공지되어 있고, 본 범주에서 유용할 수 있는 한편, 특정 방법은 20% DMSO 및 8% 사람 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용함을 포함하고, 다음, 세포를 분당 1℃의 비율로 -80℃까지 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 기상에서 저장한다.
세포 집단을 본원에 기술한 바와 같이, 예를 들어, 표면 상에 고정화된 항-CD3 항체 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브라이오스타틴)와의 접촉에 의해 자극할 수 있다. T-세포의 표면 상의 보조 분자의 공자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드를 사용한다. 예를 들어, CD4+세포 집단을 T-세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. 유사하게는, CD8+T-세포의 증식을 자극하기 위해, 당해 분야에 통상적으로 공지된 다른 방법[참조: Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999]을 사용할 수 있는 바와 같이 항-CD3 항체 및 모노클로날 항체 ES5.2D8(ATCC)을 사용할 수 있다.
T-세포에 대한 1차 자극 시그널 및 공자극 시그널을 상이한 프로토콜에 의해 제공할 수 있다. 예를 들어, 각각의 시그널을 제공하는 제제는 용액 중에 존재할 수 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링될 경우에, 당해 제제는 동일한 표면에 (즉, "시스" 구조로) 또는 별개의 표면에 (즉, "트랜스" 구조로) 커플링될 수 있다. 달리, 특정의 제제는 표면 및 용액 중의 다른 제제에 커플링될 수 있다. 한 양태에 있어서, 공자극 시그널을 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되어 있고, 1차 활성화 시그널을 제공하는 제제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링되어 있다. 바람직한 양태에 있어서, 2종의 제제가 동일한 비드 상에, 즉, "시스"로 또는 별개의 비드에, 즉, "트랜스"로 비드에 고정화되어 있다. 예로써, 1차 활성화 시그널을 제공하는 제제는 항-CD3 항체이고, 공자극 시그널을 제공하는 제제는 항-CD28 항체이고, 양쪽 제제는 동등한 분자량으로 동일한 비드에 공고정화되어 있다. 한 양태에 있어서, CD4+T-세포 증식 및 T-세포 증식을 위해 비드에 결합되어 있는 각각의 항체의 1:1 비율을 사용한다. 그러나, 1:500 내지 500:1의 입자 대 세포의 비 및 이들 사이의 임의의 정수값을 사용하여, T-세포 또는 다른 표적 세포를 자극할 수 있다. 당해 분야의 통상의 숙련가라면 입자 대 세포의 비가 표적 세포에 대한 입자 크기에 의존할 수 있음은 용이하게 인지할 수 있다. 예를 들어, 소형 크기의 비드는 단지 소수의 세포를 결합시킬 수 있는 반면, 보다 큰 비드는 보다 다수의 세포를 결합시킬 수 있다. 특정의 양태에 있어서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 범위 및 이들 사이의 임의의 정수값이고, 추가의 양태에 있어서, 당해 비는 1:9 내지 9:1 및 이들 사이의 임의의 정수값을 포함하고, 이들 비를 사용하여 T-세포를 자극할 수 있다. T-세포 자극을 유발하는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 비드 대 T-세포의 비는 상기한 바와 같이 변화할 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:4, 1:3, 1:2, 2:1, 3:1, 4:1 내지 6:1 이상을 포함하고, 한 바람직한 비는 T-세포당 2:1 이상의 비드이다.
특정 방식을 이용하여, T-세포를 약 12 내지 약 14일의 기간 후에 자극물로부터 분리함으로써 최초 활성화 및 자극 후의 T-세포 집단의 장기간 자극을 유지시키는 것이 유리할 수 있다. T-세포 증식 속도를, 예를 들어, 코울터 카운터(Coulter Counter)를 이용하여 T-세포의 크기를 조사하거나 용적을 측정함으로써 정기적으로(예를 들어, 매일) 모니터링한다. 이와 관련하여, 휴지 T-세포의 평균 직경은 약 6.8마이크론이고, 개시 활성화 및 자극시, 자극 리간드의 존재하에 T-세포 평균 직경은 4일째에 12마이크론을 초과하여 증가할 것이고, 약 6일째에 감소하기 시작한다. 평균 T-세포 직경이 약 8마이크론으로 감소할 때, T-세포를 재활성화시키고 재자극하여, T-세포의 추가의 증식을 유도할 수 있다. 달리, T-세포의 증식 속도 및 T-세포 재자극에 대한 시간을 활성화 T-세포 상에서 유도된 세포 표면 분자, 예를 들어, B7-1 또는 B7-2의 존재에 대해 평가함으로써 모니터링할 수 있다.
CD4+및/또는 CD8+T-세포 집단의 장기간 자극을 유도하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 또는 모노클로날 항체 ES5.2D8과 같은 자극제를 사용하여 T-세포를 수회 재활성화시키고 재자극하여, 최초 T-세포 집단의 약 10배 내지 약 1,000배수로 증가된 CD4+또는 CD8+세포 집단을 생성시키는 것이 필요할 수 있다. 본 방식을 이용하여, 약 100배 내지 약 100,000배의 T-세포수를 달성하는 것이 가능하다. 더우기, 실시예 XII에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 증식된 T-세포는 고수준의 사이토킨(예를 들어, IL-2, IFN-γ, IL-4, GM-CSF 및 TNF-α)을 배양 상등액으로 분비한다. 예를 들어, IL-2를 이용한 자극과 비교할 경우, 항-CD3 및 항-CD28 공자극의 이용에 의해 증식된 CD4+T-세포는 고수준의 GM-CSF 및 TNF-α를 배양 배지로 분비한다. 이들 사이토킨은 배양 상등액으로부터 정제할 수 있거나, 상등액을 배양액 중에 세포를 유지시키기 위해 직접적으로 사용할 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 방법에 의해 증식된 T-세포를 배양 상등액 및 사이토킨과 함께 생체내 세포 증식을 지지하기 위해 투여할 수 있다.
한 양태에 있어서, T-세포 자극을 비드(3x28 비드) 상에 공고정화된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여 세포를 휴지 상태(낮은 수준으로 증식 또는 전혀 증식하지 않음)로 복귀하기에 충분한 시간 동안(최초 자극 후 약 8 내지 14일) 수행한다. 다음, 자극 시그널을 세포로부터 제거하고, 세포를 세척하고, 환자에게 역주입한다. 자극 단계의 말기에서 실시예에 의해 명백한 바와 같이 세포를 항원에 반응하는 능력 및 기억-유사 표현형을 명시하는 이들 세포의 능력에 의해 입증된 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 "초-유도성"으로 만든다. 따라서, 외인성으로 또는 주입 후 생체내 항원에 의해 재자극시, 활성화 T-세포는 특이한 표현형 특성, 예를 들어, 지속된 CD154 발현, 증가된 사이토킨 생산 등을 특징으로 하는 강건한 반응을 나타낸다.
본 발명의 추가의 양태에 있어서, T-세포와 같은 세포를 제제-피복된 비드와 결합하고, 비드 및 세포를 후속적으로 분리한 다음, 세포를 배양한다. 또 다른 양태에 있어서, 배양 전에, 제제-피복된 비드 및 세포를 분리하지 않지만, 함께 배양한다. 추가의 양태에 있어서, 비드 및 세포를 힘의 적용에 의해 먼저 농축시키고, 이에 의해 세포 표면부를 연결하고, 이에 의해 세포 자극을 유발한다.
예로써, T-세포를 표적 세포 집단인 경우에, 항-CD3 및 항-CD28이 부착되어 있는 상자성 비드(CD3xCD28 비드)를 제조된 T-세포와 접촉시킴으로써 세포 표면부를 연결할 수 있다. 한 양태에 있어서, 세포(예를 들어, mL당 T-세포 104내지 109개) 및 비드(예를 들어, 1.5x109CD3xCD28 상자성 비드)를 완충액, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 이가 양이온 부재) 중에서 결합시킨다. 한편, 당해 분야의 통상의 숙련가라면 임의의 세포 농축을 이용할 수 있음을 용이하게 인지할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플 중에 매우 희박할 수 있고, 샘플 중 단지 0.01%를 차지할 수 있고, 전체 샘플(즉, 100%)은 관심의 대상인 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포수는 본 발명의 범주내에 있다.
세포를 현탁시키는 완충액은 특유한 세포 유형에 적합한 임의의 것일 수 있다. 특정의 세포 유형을 사용할 경우에, 완충액은 다른 성분, 예를 들어, 프로세싱 동안 세포 통합성을 유지시키는데 필요한 1 내지 5% 혈청을 함유할 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 세포 및 비드를 세포 배양 배지에서 결합시킬 수 있다. 세포 및 비드를, 예를 들어, 회전, 교반 또는 임의의 혼합 수단에 의해 1분 내지 수시간 범위의 시간 동안 혼합할 수 있다. 다음, 비드 및 세포의 컨테이너를 힘에 의해, 예를 들어, 자기장내에 유입함으로서 농축시킨다. 배지 및 비결합 세포를 제거하고, 비드에 부착되어 있는 세포를, 연동 펌프에 의해 펌핑함으로써 세척한 다음, 세포 배양에 적합한 배지에 재현탁시킨다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 혼합물을 수시간(약 3시간) 내지 14일 동안 또는 이들 사이의 임의의 매시간의 정수값 동안 배양할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 있어서, 비드 및 T-세포를 약 8일 동안 함께 배양한다. 또 다른 양태에 있어서, 비드 및 T-세포를 2 내지 3일 동안 함께 배양한다. T-세포 배양에 적합한 조건은 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 사람 혈청) 또는 인터류킨-2(IL-2)를 포함한, 증식 및 생육에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적합한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지(Minimal Essential Media) 또는 RPMI 배지 1640, 또는 X-vivo 15(BioWhittaker))를 포함한다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신을 단지 실험 배양에만 포함시키고, 피검체에 주입할 세포의 배양물에는 포함시키지 않는다. 표적 세포를, 증식을 지지하기에 필요한 조건, 예를 들어, 적합한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2)하에 유지시킨다.
농축력으로서 자기장을 사용할 경우에, 세포 배양 전에 세포에 적용시킬 자기장 세기는 자성체 표면 상에서 200가우스 내지 12,000가우스 범위내일 수 있다. 자성체의 형태 및 크기는 혼합 또는 세포 배양 용기의 크기 및 형태, 또는 세포와 세포의 접촉 및 세포의 농축을 촉진시키거나 증가시키는 임의의 다른 파라미터에 적합화시킬 수 있다. 자기력은 버퍼 또는 스페이서로서 작용하는 물질을 자성체와 세포와의 혼합물 중에 함유되어 있는 상자성 비드 사이에 물질을 위치시킴으로써 확산시킬 수 있다. 강한 자기력은 일반적으로는 표면에서 7500가우스 이상으로 고려되는 반면, 약한 자기력은 표면에서 2000 내지 2500가우스 범위내인 것으로 고려된다. 상자성 입자 상에 자성체에 의해 적용되는 대략의 자기력은 상자성 비드의 용적 및 다음의 수학식에 따르는 자기장 세기에 따라 달라진다:
F mag = (ν)(ψ)(B)(dB/dx)
여기서,F mag 는 자기력이고,ν는 상자성 비드의 용적이고,ψ는 상자성 비드의 자기화율(제조업체에 의해 제공된 값)이고,B는 자기장 세기이고,(dB/dx)는 자기장 세기 구배이다. 당업자라면 수학식의 우측의 인자를 획득하거나 측정하여, 적용된 자기력을 계산할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 방법에 의해 자극된 세포를 시그널 전달, 발현 세포 표면 마커 및/또는 증식의 유도에 의해 제시된 바와 같이 활성화시킨다. T-세포에 적합한 특정의 마커는 중요한 면역조절 분자인 CD154이며, 당해 CD154의 발현은 면역 반응을 증폭시키는데 극히 유리하다. CD154는 다수의 B 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 몇몇 내피 세포 상에서 발현된 CD40 분자와 상호작용한다. 따라서, CD154의 예상외의 경이적인 증가는 아마도 보다 효과적인 T-세포 조성물을 유도할 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 CD3+세포의 자극은 자극 후 1, 2, 3 또는 4일째에 CD154 발현과 같은 특정의 세포 표면 마커의 수준이 1.1 내지 20배 증가하여 발현하는 T-세포를 제공한다(실시예 5, 표 2 및 도 4 참조). 또 다른 세포 표면 마커, CD25의 발현은 또한 배양 이전의 세포 또는 다른 방법에 의해 자극된 세포보다 농축 및 자극 후의 T-세포 상에서 보다 높다(표 2 참조).
당업자라면 세포 표면부 연결에 의해 자극할 수 있는 임의의 표적 세포를 제제-피복된 표면, 예를 들어, 비드와 결힙시킬 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 제제-피복된 표면, 예를 들어, 비드를 배양 전에, 배양 동안 임의의 시점에서 또는 배양 종료시에 세포로부터 분리할 수 있다. 또한, 표적 세포에 연결되어 있는 제제-피복된 표면을 배양 전에 비결합 세포로부터 분리할 수 있고, 다른 세포를 또한 배양물내에 잔류시킬 수 있다. 한 양태에 있어서, 배양 전에, 제제-피복된 비드 및 표적 세포는 분리하지 않고, 함께 배양한다. 추가의 양태에 있어서, 비드 및 표적 세포를 세포 표면부 연결을 힘의 적용에 의해 먼저 농축시키고, 이에 의해 자극 및 후속적인 활성화를 유도한다.
또한, 표적 세포, 예를 들어, 1차 및 2차 자극 분자로 피복된 표면에 결합되어 있는 T-세포 분획의 농축을 증가시키는 다른 수단을 본 발명에 의해 고려한다. 자기력의 적용 이외에, 중력보다 큰 다른 힘을 적용시킬 수 있으며, 이러한 힘은, 예를 들어, 원심력, 막통과압 및 유압력 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 농축은 또한 여과에 의해 달성할 수 있다.
당업자라면 제제-피복된 비드 및 자극할 세포 사이의 접촉을 다른 힘을 사용한 농축에 의해 증가시킬 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 세포 표면부 결합 리간드를 사용하여 세포를 농축시키는 임의의 수단은 농축이 중력을 초과하는 수단 또는 확산으로 세포와 제제를 함께 모으는 한 충분할 것이다.
다양한 양태에 있어서, 제제-피복된 표면이 입자, 예를 들어, 세포와 혼합되고 자기장내에 소용적으로 농축된 비드이므로, 모든 입자 및 세포에 결합되어 있는 입자를 한정되고 농축된 면적으로 인취할 수 있음을 이해하여야만 한다. 특정 양태에 있어서, 제제-피복된 표면을 표적 세포에 노출시키는 30초 내지 4시간 이내에 힘에 의해 함께 인취하여야 한다. 다른 양태에 있어서, 당해 시간은 1분 내지 2시간, 또는 이들 사이의 모든 정수 범위일 수 있다. 1종 이상의 세포 표면 리간드가부착되어 있는 표면과 혼합되어 있는 수용체 보유 세포를 갖는 세포 집단에의 힘의 적용은 세포 표면 분자를 응집시키는 세포 수용체 분극화를 유도할 수 있다. 세포 표면 분극화를 유도하는 이러한 수단은 지질 래프트를 포함하는 세포 표면 분자를 응집시킴으로써 세포 내에서의 시그널링을 증폭시킬 수 있다. 이러한 응집은 세포 이벤트의 하향 조절 또는 억제를 야기할 수 있는 시그널 경로를 유도할 수 있다. 달리, 세포 표면 분자의 응집은 세포 이벤트의 상향 조절 또는 활성화를 야기할 수 있다.
세포 이벤트는, 예를 들어, 아폽프토시스 경로를 포함한 특유한 경로를 유도 또는 억제하거나, 단백질의 포스포릴화를 유도하거나, 증식 시그널을 자극 또는 억제하는 수용체-매개된 시그널 전달을 포함할 수 있다. 한 양태에 있어서, 세포는 림프구, 특히 T-세포일 수 있고, 세포 표면 리간드는 표면, 예를 들어, 입자에 부착되어 있는 항-CD3 항체일 수 있다. 입자는 상자성 비드일 수 있고, 적용된 힘은 자기력일 수 있다. 림프구와 상자성 비드의 항-CD3-피복된 표면과의 혼합물에의 자기력의 적용은 T-세포의 CD3 수용체가 외부힘의 부재하에 발생할 수 있는 것보다 신속하게 분극하도록 할 수 있다. T-세포를 자극하는 이러한 방법은 T-세포 면역 반응 경로의 보다 신속한 활성화 및 세포의 증식을 촉진시킨다.
또 다른 양태에 있어서, 항-CD3/항-CD28(즉, CD3xCD28)-피복된 비드와 같은 자극제에의 노출 시간은 목적하는 T-세포 표현형을 수득하도록 변경하거나 적합화시킬 수 있다. CD8+세포독성 또는 억제제 T-세포(Tc)와 대조적으로 헬퍼T-세포(TH), 전형적으로는 CD4+의 보다 큰 집단을 요구할 수 있는데, 이는 TH세포의 증식이 전체적인 면역 반응성을 개선시키거나 회복시킬 수 있기 때문이다. 다수의 특이적 면역 반응이 표적 세포를 직접적으로 융해시키거나 사멸시키는 CD8+항원-특이적 T-세포에 의해 매개되는 반면, 대부분의 면역 반응은, 예를 들어, GM-CSF, CD40L 및 IL-2와 같은 중요한 면역-조절 분자를 발현시키는 CD4+T-세포의 원조를 필요로 한다. CD4-매개된 원조가 바람직한 경우에 본원에 기술된 방법을 유지시키거나 증강시킬 경우, CD4:CD8 비가 유의하게 유리할 수 있다. CD4+T-세포의 증가된 수는 표적 세포 가시율(개선된 APC 기능)을 잠재적으로 개선시키는, 환자에 도입된 세포-발현된 CD40L의 양을 증가시킨다. 유사한 효과는 탁월하게 CD4+T-세포에 의해 발현되는 GM-CSF 또는 IL-2를 발현시키는 주입된 세포의 수를 증가시킴으로써 나타낼 수 있다. 달리, CD4-원조가 보다 덜 필요하고, CD8+T-세포의 증가된 수가 바람직한 상황에서, 본원에 기술된 XCELLERATE 접근법은 또한, 예를 들어, 자극 및/또는 배양 전에 CD8+세포에 대한 예비 선택에 의해 이용할 수 있다. 이러환 상황은 IFN-의 증가된 수준 또는 표적 세포의 증가된 세포 융해가 바람직한 경우에 존재할 수 있다.
상이한 T-세포 집단의 분리를 실시하기 위해, 농축력에 대한 노출 시간을 변경하거나 펄스시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 힘이 자성체인 경우에, 자성체 또는 자기장 세기에 대한 노출을 변경할 수 있고/있거나, 증식 시간을 관심의 대상인 특이적 표현형을 수득하도록 변경할 수 있다. 각종 표현형 마커 발현은 경시적으로 변화하고, 따라서, 특정한 시점을 선택하여, T-세포의 특이적 집단을 수득할 수 있다. 따라서, 자극할 세포 유형에 따라서, 자극 및/또는 증식 시간은 4주 이하, 2주 이하, 10일 이하 또는 8일 이하일 수 있다(4주 이하는 4주에 이르는 범위부터 1일(24시간)까지의 범위의 모든 시간을 포함한다). 특정 양태에 있어서, 자극 및 증식을 6일 이하, 4일 이하, 2일 이하 동안, 및 다른 양태에 있어서, 24시간 이하만큼 적은 시간 동안, 및 바람직하게는 4 내지 6시간 이하 동안 수행할 수 있다(이들 범위는 이들 사이의 임의의 정수값을 포함한다). T-세포의 자극을 보다 짧은 시간 동안 수행할 경우에, T-세포 집단은 현저한 수로 증가할 수는 없으나, 당해 집단은 생체내에서 지속적으로 증식할 수 있고, 천연 이펙터 T-세포 풀과 보다 근접하게 유사한 보다 강건하고 왕성한 활성화 T-세포를 제공할 것이다. T-세포 원조의 이용가능성이 종종 단백질 항원에 대한 항체 반응에서 제한 인자이므로, T-세포의 CD4+농축 집단을 선택적으로 증식시키거나 피검체에 선택적으로 주입하는 능력이 극히 유리하다. 이러한 농축된 집단의 추가의 이점은 B-림프구에 의해 제시된 항원을 인식하는 활성화 헬퍼 T-세포가 2종의 자극물, 물리적 접촉 및 사이토킨 생산을 전달하여, B 세포의 증식 및 분화를 유발한다는 점에서 용이하게 알 수 있다.
변경된 자극 시간에 노출된 T-세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초혈 단핵 세포 산물은 세포독성 또는 억제제 T-세포 집단(Tc, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T-세포 집단(TH, CD8+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체의 자극에 의한 T-세포의 생체외 증식은 약 8 내지 9일째 이전에 TH세포로 우세하게 이루어진 T-세포 집단을 생성시키는 한편, 약 8 내지 9일째 이후에는 점점 더 많은 TC세포 집단을 포함하는 T-세포 집단을 생성시킨다. 따라서, 치료 목적에 따라, 피검체에 TH세포를 우세하게 포함하는 T-세포 집단을 주입하는 것은 유리할 수 있다. 유사하게는, TC세포의 항원-특이적 서브세트를 분리하였을 경우에, 이들 서브세트를 보다 높은 정도로 증식시키는 것이 유리할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 이외에, 다른 표현형 마커는 대부분에서 세포 증식 과정의 경과 동안에 현저하지만 재현가능하게 변화한다. 이와 같이, 이러한 재현성은 활성화 T-세포 산물을 특수한 목적에 적합화하는 능력을 가능하게 한다.
한 예에서, 시간에 따라 재현가능하게 변화하는 중요한 표현형 마커 중에는 고친화성 IL-2 수용체(CD25), CD40 리간드(CD154) 및 CD45RO(TCR과의 우선적 결합에 의해 항원 결합에 대한 TCR의 감수성을 증가시킬 수 있는 분자)가 있다. 당해 분야의 통상의 숙련가라면 상기 분자가 각종 이유로 중요하다는 것을 용이하게 인지한다. 예를 들어, CD25는 신속한 T-세포 분열을 가능하게 하는 자가분비 루프의 중요한 부분을 구성한다. CD154는 항원-제시 수지상 세포의 성숙을 자극하고, 항체 생산에 대해 B-세포를 활성화시키고, TH세포 증식을 조절하고, TC세포 분화를증진시키고, TH세포 및 항원 제시 세포 둘 다의 사이토킨 분비를 조절하고, CD80, CD86 및 CD154를 포함한 공자극 리간드의 발현을 자극하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 제시되어 있다.
사이토킨 생산은 생체외 증식 과정의 처음 몇일 이내에 절정을 이룬다. 따라서, 사이토킨이 면역 반응 조절뿐만 아니라 T-세포 활성화 및 기능을 조절하는데 중요한 것으로 공지되어 있기 때문에, 이러한 사이토킨은 부가의 항원 챌린지와 접촉시 재활성화를 겪을 수 있는 치료학적 T-세포 산물의 발생에서 아마도 중요할 것이다. 이와 관련하여 중요한 사이토킨은 IL-2, IL-4, TNF- 및 IFN-을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이와 같이, 상기 세포를 증식하고 피검체에 주입한지 처음 몇일 동안 T-세포 집단을 획득함으로써, 생체내에서의 T-세포의 추가의 활성화 및 증식이 발생하는 치료학적 이점이 발생할 수 있다.
위에서 논의한 사이토킨 및 마커 이외에, T-세포 활성화의 조정 및 면역 반응 조절에 중요한 것으로 공지된 부착 분자의 발현은 또한 생체외 증식 과정의 경과에 걸쳐 현저하지만 재현가능하게 변화한다. 예를 들어, CD62L은 T-세포의 림프양 조직에의 회귀 및 T-세포의 염증 부위에의 트래픽킹(trafficking)에 중요하다. 질환 및 상해의 특정 환경하에, 이들 부위에서의 활성화 T-세포의 존재는 불리할 수 있다. CD62L의 하향 조절이 활성화 후에 조속히 발생하기 때문에, T-세포는 보다 짧은 시간 동안 증식될 수 있다. 반대로, 배양에서의 보다 긴 시간은 CD62L의 보다 높은 수준 및 다른 바람직한 조건하에 이들 부위에 대해 활성화 T-세포를 표적화하는 보다 고도의 능력을 갖는 T-세포 집단을 발생시킬 수 있다. 발현이 경시적으로 변화하는 폴리펩타이드의 또 다른 예는 CD49d이고, 혈액으로부터 조직으로 림프구를 트래픽킹하는데 관련되는 유착 분자는 염증 부위에서 공간을 잡는다. CD49d 리간드의 CD49d에의 결합은 또한 T-세포가 VCAM-1 또는 피브로넥틴 리간드에 의한 결합을 통해 활성화 및 증식에 대한 공자극 시그널을 수신할 수 있도록 한다. 염증 부위에의 회귀뿐만 아니라, T-세포-APC 및 T-세포-T-세포 상호작용에 관련된 유착 분자 CD54의 발현은 또한 증식 과정에 결쳐서 변화한다. 따라서, T-세포는 관심의 대상인 마커 프로파일과 부합하는 선택된 시간 동안 자극할 수 있고, 후속적으로 수집하여 주입할 수 있다. 이와 같이, T-세포 집단은 치료할 징후에 최대의 치료학적 이점을 제공하는 것으로 고려되는 마커를 발현시키도록 적합화시킬 수 있다.
다양한 양태에 있어서, 당해 분야의 통상의 숙련가라면 세포로부터의 자극 시그널의 제거가 사용되는 표면의 유형에 의존한다는 것을 이해한다. 예를 들어, 상자성 비드를 사용할 경우에, 자기 분리는 실행가능한 옵션이다. 분리 기술은 상자성 비드 제조업체의 지침사항(예를 들어, DYNAL Inc., Oslo, Norway)에 의해 상세하게 기술되어 있다. 또한, 표면이 세포로부터 분리하기에 충분히 큰 비드인 경우에, 여과법을 사용할 수 있다. 또한, 20마이크론 및 80마이크론 주입 필터(Baxter)를 포함한 각종 주입 필터가 상업적으로 구입가능하다. 따라서, 비드가 필터의 메쉬 크기보다 크다면, 이러한 여과법은 고도로 유효하다. 관련된 양태에 있어서, 비드를 필터로 통과시키지만, 세포는 잔류할 수 있으므로, 분리가능하다.
본원에 기술된 방법에서 사용되는 항체가 공개 공급원, 예를 들어, ATCC로부터 용이하게 입수할 수 있더라도, T-세포 보조 분자 및 CD3 복합체에 대한 항체는 표준 기술에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항체를 생성시키는 방식은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 본원에 보다 상세하게 논의된다.
C. 표면 상에의 리간드 고정화
위에서 지시한 바와 같이, 본 발명의 방법은 바람직하게는 표면에 결합된 리간드를 사용한다. 표면은 리간드가 결합되어 있거나 통합되어 있을 수 있고, 생체적합성이고, 즉 자극할 표적 세포에 대해 실질적으로 무독성인 임의의 표면일 수 있다. 생체적합성 표면은 생체분해성 또는 비-생체분해성일 수 있다. 표면은 천연 또는 합성일 수 있고, 합성 표면은 중합체일 수 있다. 표면은 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 폴리사카라이드, 글리코사미노글리칸 또는 세포외 매트릭스 조성물을 포함할 수 있다. 폴리사카라이드는, 예를 들어, 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 히알루론산 또는 알기네이트를 포함할 수 있다. 다른 중합체는 폴리에스테르, 폴리에테르, 다가무수물, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리비닐아세테이트, 블럭 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 폴리우레탄을 포함할 수 있다. 중합체는 락트산 또는 공중합체일 수 있다. 공중합체는 락트산 및 글리콜산(PLGA)을 포함할 수 있다. 비-생체분해성 표면은 중합체, 예를 들어, 폴리(디메틸실록산) 및 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)를 포함할 수 있다. 생체적합성 표면은, 예를 들어, 유리(예를 들어, 생체유리), 콜라겐, 금속, 하이드록시아파타이트, 알루미네이트, 바이오세라믹재, 히알루론산 중합체, 알기네이트, 아크릴산 에스테르 중합체, 락트산 중합체, 글리콜산 중합체, 락트산/글리콜산 중합체, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드 또는 세포외 매트릭스 조성물을 포함한다. 표면을 포함한 다른 중합체는 유리, 실리카, 실리콘, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔, 콜라겐, 아크롤레인, 폴리아크릴아미드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론, 또는 다수의 플라스틱 또는 합성 유기 중합체 등을 포함할 수 있다. 표면은 생물학적 구조, 예를 들어, 리포좀을 포함할 수 있다. 표면은 지질, 플레이트, 백, 펠렛, 섬유, 메쉬 또는 입자 형태일 수 있다. 입자는 콜로이드 입자, 미세구체, 나노입자, 비드 등을 포함할 수 있다. 다양한 양태에 있어서, 상업적으로 구입가능한 표면, 비드 또는 다른 입자(예를 들어, Miltenyi Particles, Miltenyi Biotec, Germay; Sepharose beads, Pharmacia Fine Chemicals, Sweden; DYNABEADS™, Dynal Inc., New York; PURABEADS™, Prometic Biosciences)가 유용하다.
비드를 사용할 경우에, 비드는 표적 세포 자극을 야기하는 임의의 크기일 수 있다. 한 양태에 있어서, 비드의 크기는 바람직하게는 약 5나노미터 내지 약 500㎛이다. 따라서, 비드 크기의 선택은 비드가 작용하는 특유한 용도에 따라 달라진다. 예를 들어, 비드를 단핵구 결핍에 사용할 경우에, 소형 크기를 선택하여, 단핵구 섭취를 촉진시키나(예를 들어, 직경 또는 2.8 내지 4.5㎛ 또는 탐식될 수 있는 임의의 크기); 여과에 의한 비드의 분리가 바람직한 경우에, 50㎛ 이상의 비드 크기가 전형적으로 사용된다. 또한, 상자성 비드를 사용할 경우에, 비드의 크기는 전형적으로는 약 2.8 내지 약 500㎛ 및 보다 바람직하게는 약 2.8 내지 약 50㎛ 범위이다. 마지막으로, 약 10nm만큼 소형일 수 있는 상자성 나노입자를 사용하도록 선택할 수 있다. 따라서, 상기한 논의로부터 용이하게 알 수 있는 바와 같이, 실질적으로 어떠한 입자 크기도 사용할 수 있다.
제제는 당해 분야에서 공지되어 있으며, 이용가능한 각종 방법에 의해 표면에 부착시키거나 커플링시키거나 이에 통합시킬 수 있다. 제제는 천연 리간드, 단백질 리간드 또는 합성 리간드일 수 있다. 부착은 공유 또는 비공유, 정전기 또는 소수성일 수 있고, 예를 들어, 화학적, 기계적, 효소적 또는 다른 방법을 포함하는 각종 부착 수단에 의해 달성할 수 있으며, 이에 의해, 리간드는 세포를 자극할 수 있다. 예를 들어, 리간드에 대한 항체를 먼저 표면에 부착할 수 있거나, 아비딘 또는 스트렙타비딘을 비오티닐화 리간드에의 결합을 위해 표면에 부착할 수 있다. 리간드에 대한 항체를 항-개별특이형 항체를 통해 표면에 부착시킬 수 있다. 또 다른 예는 단백질 A 또는 단백질 G, 또는 항체에 결합하는 표면에 부착되어 있는 다른 비특이적 항체 결합 분자를 사용함을 포함한다. 달리, 리간드를 화학적 수단, 예를 들어, 상업적으로 구입가능한 가교 결합제(Pierce, Rockford, IL)를 사용하는 표면에의 가교 결합 또는 다른 수단에 의해 표면에 부착할 수 있다. 특정 양태에 있어서, 리간드를 표면에 공유적으로 결합시킨다. 또한, 한 양태에 있어서, 상업적으로 구입가능한 토실-활성화 DYNABEADS™ 또는 에폭시-표면 반응성 그룹을갖는 DYNABEADS™를 제조업체의 지침사항에 따라 관심의 대상인 폴리펩타이드 리간드와 함께 배양한다. 간략하게, 이러한 조건은 전형적으로는 pH 4 내지 pH 9.5의 인산염 완충액 중에서 4 내지 37℃의 온도에서 배양함을 포함한다.
한 국면에 있어서, 특정의 리간드와 같은 제제는 단일 기원 또는 다중 기원일 수 있고, 항체 또는 이의 단편일 수 있는 한편, 또 다른 국면에 있어서, T-세포를 사용할 경우에, 공자극 리간드는 B7 분자(예를 들어, B7-1, B7-2)이다. 이들 리간드를 위에서 논의한 상이한 부착 수단 중 하나에 의해 표면에 커플링시킨다. 표면에 커플링된 B7 분자를 공자극 분자를 발현시키는 세포로부터 분리하거나, 표준 DNA 기술 및 본원에 기술된 공자극 분자(들)의 생산 및 분리를 가능하게 하는 발현 시스템을 이용하여 수득할 수 있다. 세포의 표면에 커플링될 경우에 T-세포에서 공자극 시그널을 유도하는 능력을 보유하는 B7 분자의 단편, 돌연변이체 또는 변형체를 또한 사용할 수 있다. 또한, 당해 분야의 통상의 숙련가라면 T-세포의 서브세트의 활성화 및 증식의 유도에 유용한 임의의 리간드를 또한 비드 또는 배양 용기 표면 또는 임의의 표면 상에 고정화시킬 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 리간드의 표면에의 공유 결합이 하나의 바람직한 방식인 한편, 2차 모노클로날 항체에 의한 흡착 또는 포획을 또한 사용할 수 있다. 표면에 부착된 특유한 리간드의 양은 표면이 비드의 표면인 경우에 유세포 측정(FACS) 분석에 의해 용이하게 측정할 수 있거나, 표면이 예를 들어, 조직 배양 디쉬, 메쉬, 섬유, 백인 경우에 효소-결합 면역흡착 검정법(ELISA)에 의해 측정할 수 있다.
특정의 양태에 있어서, B7 분자의 자극 형태 또는 항-CD28 항체 또는 이의단편을 TCR/CD3 복합체를 자극하는 제제, 예를 들어, 항-CD3 항체와 동일한 고체 상 표면에 부착시킨다. 항-CD3 항체 이외에, 항원 시그널과 유사한 수용체에 결합하는 다른 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 비드 또는 다른 표면을 항-CD2 항체 및 B7 분자 및 특히 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 배합물로 피복시킬 수 있다.
D. 제제
본 발명에 의해 고려되는 제제는 단백질 리간드, 천연 리간드 및 합성 리간드를 포함한다. 세포 표면부에 결합할 수 있고, 특정 조건하에 시그널링을 유도하는 연결 및 응집을 야기하는 제제는 렉틴(예를 들어, PHA, 렌즈콩 렉틴, 콘카나발린 A), 항체, 항체 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 수용체, B 수용체 및 T-세포 수용체 리간드, 세포외 매트릭스 성분, 스테로이드, 호르몬(예를 들어, 성장 호르몬, 코르티코스테로이드, 프로스타글란딘, 테트라-요오도 티로닌), 세균 구성성분(예를 들어, 리포폴리사카라이드), 미토겐, 항원, 초항원 및 이들의 유도체, 성장 인자, 사이토킨, 바이러스 단백질(예를 들어, HIV gp-120), 유착 분자(예를 들어, L-렉틴, LFA-3, CD54, LFA-1), 케모킨 및 소형 분자를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 제제는 천연 공급원, 예를 들어, 세포, 혈액 산물 및 조직으로부터 분리할 수 있거나, 시험관내 증식된 세포로부터 분리하거나, 재조합적으로 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 한 국면에 있어서, T-세포를 자극하는 것이 요망될 경우에, 유용한 제제는 CD3/TCR 복합체, CD2, 및/또는 CD28을 결합할 수 있고, 각각의 활성화 또는 증식을 개시할 수 있는 리간드를 포함한다. 따라서, 용어 리간드는 세포 표면 단백질에 대한 "천연" 리간드, 예를 들어, CD28에 대한 B7 분자뿐만 아니라, 세포 표면 단백질에 대해 생성된 항체와 같은 인공 리간드인 단백질을 포함한다. 이러한 항체 및 이의 단편은 통상의 기술, 예를 들어, 하이브리도마 방법 및 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술에 따라 제조할 수 있다. 유용한 항체 및 단편은 사람을 포함한 임의의 종으로부터 유도할 수 있거나, 1종 이상의 종으로부터의 서열을 사용하는 키메라 단백질로서 형성시킬 수 있다.
당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여, 항체, 폴리클로날 항혈청, 또는 리간드에 특이적인 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 항체는 또한 유전자 조작된 면역글로불린(Ig) 또는 바람직한 특성을 가지도록 디자인된 Ig 단편으로서 제조할 수 있다. 예를 들어, 비제한적인 예시로써, 항체는 제1 포유류 종으로부터의 하나 이상의 가변(V) 영역 도메인 및 제2 별개의 포유류 종으로부터의 하나 이상의 불변 영역 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질인 재조합 IgG를 포함할 수 있다. 가장 통상적으로는, 키메라 항체는 마우스 가변 영역 서열 및 사람 불변 영역 서열을 보유한다. 이러한 마우스/사람 키메라 면역글로불린은 사람-유도된 V 영역 프레임워크 영역 및 사람-유도된 불변 영역으로 마우스 항체로부터 유도된 항체에 결합 특이성을 부여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 이식함으로써 "사람화"시킬 수 있다. 이들 분자의 단편은 단백질분해성 분해에 의해 또는 임의로 단백질분해성 분해, 및 이어서 디설파이드 결합의 온화한 감소 및 알킬화에 의해, 또는 재조합 유전자 조작 기술에 의해 생성시킬 수 있다.
항체는 이들이 약 104M-1이상, 바람직하게는 약 105M-1이상, 보다 바람직하게는 약 106M-1이상, 보다 더 바람직하게는 약 107M-1이상의 친화성 상수, Ka를 갖는 리간드에 특이적으로 결합할 경우에 "면역특이적"인 것으로 정의한다. 결합 파트너 또는 항체의 친화성은 통상의 기술, 예를 들어, 문헌[참조: Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51:660, 1949]에 기재된 기술을 사용하거나, 표면 플라즈몬 공명(BIAcore, Biosensor, Piscataway, NY)[참조예: Wolff et al., Cancer Res., 53:2560-2565, 1993]에 의해 용이하게 측정할 수 있다.
항체는 일반적으로는 당해 분야의 통상의 숙련가에게 공지된 각종 기술 중 하나에 의해 제조할 수 있다[참조예: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory]. 특정의 이러한 기술에 있어서는, 동물을 폴리클로날 항혈청을 생성시키는 항원으로서 리간드를 사용하여 면역화시킨다. 적합한 동물은 토끼, 양, 염소, 돼지, 소를 포함하고, 보다 소형인 포유류 종, 예를 들어, 마우스 랫트 및 햄스터를 포함할 수 있다.
면역원은 리간드를 발현시키는 세포, 정제되거나 부분적으로 정제된 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편, 또는 리간드 펩타이드로 구성될 수 있다. 리간드 펩타이드는 단백질분해성 분해에 의해 생성시킬 수 있거나, 화학적으로 합성할 수 있다. 아마도 숙주 동물에서 항원 반응을 생성시킬 것 같은 아미노산 서열을 결정하기 위해 당업자에게 공지된 방법에 따라 리간드의 1차, 2차 또는3차 구조를 분석함으로써 면역화에 대한 펩타이드를 선택할 수 있다[참조예: Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207, 1991; Berzoksky, Science 229:932-40, 1985].
면역원의 제조법은 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편, 또는 다른 면역원성 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 소 혈청 알부민에 대한 펩타이드의 공유 커플링을 포함할 수 있다[참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory]. 일반적으로는, 제1 주사 후에, 동물 종에 바람직한 스케쥴에 따라 1회 이상의 부스터 면역화를 동물에게 제공한다. 면역 반응을 동물로부터 주기적으로 채혈하고, 혈청을 분리하고, 면역검정법, 예를 들어, 아우치터로니(Ouchterlony) 검정법으로 혈청을 분석하여, 특이적 항체 역가를 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 항체 역가가 확립되면, 동물로부터 주기적으로 채혈하여, 폴리클로날 항혈청을 집적할 수 있다. 다음, 리간드 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체를, 예를 들어, 단백질 A를 사용하거나 적합한 고체 지지체에 커플링되어 있는 리간드 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 항혈청으로부터 정제할 수 있다.
리간드 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변형체에 결합하는 모노클로날 항체는, 예를 들어, 코흘러 및 밀슈타인의 기술[참조: Nature, 256:495-497, 1975; Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976] 또는 이의 개선책을 이용하여 제조할 수 있다. 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 대한 바람직한 특이성을 갖는항체를 생성시키는 불멸성 진핵 세포주인 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 동물-예를 들어, 랫트, 햄스터, 또는 바람직하게는 마우스-를 상기한 바와 같이 제조된 리간드 면역원으로 면역화시킨다. 림프양 세포, 가장 통상적으로는, 면역화 동물로부터 수득된 비장 세포를 약물-감작화 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화 동물과 동계인 것을 사용한 융합에 의해 불멸화시킬 수 있다. 비장 세포 및 골수종 세포를 막 융합-촉진제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 비이온성 세제와 수분 동안 결합시킨 다음, 하이브리도마 세포의 증식은 지지하나, 골수종 세포의 증식은 지지하지 않는 선택 배지 상에서 낮은 밀도로 플레이팅시킬 수 있다. 바람직한 선택 배지는 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)이다. 충분한 시간, 통상적으로는 약 1 내지 2주 후에, 세포의 콜로니를 관찰한다. 단일 클로니를 분리하고, 세포에 의해 생산된 항체를 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에의 결합 활성에 대해 시험할 수 있다. 리간드 항원에 대한 높은 친화성 및 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마가 바람직하다. 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 본 발명에 의해 고려된다.
모노클로날 항체를 하이브리도마 배양물의 상등액으로부터 분리할 수 있다. 마우스 모노클로날 항체를 생산하는 대체법은 하이브리도마 세포를 동계 마우스의 복강내로 주사하는 것이다. 마우스는 모노클로날 항체를 함유하는 복수액을 생산한다. 오염물을 통상의 기술, 예를 들어, 크로마토그래피, 겔 여과법, 침전법 또는 추출법에 의해 항체로부터 제거할 수 있다.
사람 모노클로날 항체를 다수의 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 당해 방법은 사람 말초혈 세포의 엡슈타인 바르 바이러스(EBV) 형질전환[참조: 미국 특허 제4,464,456호), 사람 B 세포의 시험관내 면역화[참조예: Boernet et al., J. Immunol. 147:86-95, 1991], 사람 면역글로불린 유전자를 보유하는 면역화된 형질전환 마우스로부터의 비장 세포의 융합물 및 효모 인공 염색체(YAC)에 의해 삽입된 면역글로불린 유전자를 보유하는 면역화된 형질전환 마우스로부터의 비장 세포의 융합물[참조예: 미국 특허 제5,877,397호; Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58, 1997; Jakobovits et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35, 1995], 또는 사람 면역글로불린 V 영역 파아지 라이브러리로부터의 분리물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용하기 위한 키메라 항체 및 사람화 항체를 생성시킬 수 있다. 키메라 항체는 제1 포유류 종으로부터 유래된 하나 이상의 불변 영역 도메인 및 제2 별개의 포유류 종으로부터 유래된 하나 이상의 가변 영역 도메인을 갖는다[참조예: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-55, 1984]. 보다 통상적으로는, 키메라 항체를 비사람 모노클로날 항체로부터 유래된 하나 이상의 가변 영역 도메인, 예를 들어, 마우스, 랫트 또는 햄스터 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 하나 이상의 사람 불변 영역을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터내에 클로닝시킴으로써 작제할 수 있다[참조예: Shin et al., Methods Enzymol. 178:459-76, 1989; Walls et al., Nucleic Acids Res. 21:2921-29, 1993]. 선택된 사람 불변 영역은 특유한 항체에 바람직한이펙터 기능에 따라 달라질 수 있다. 키메라 항체를 생성시키기 위해 당해 분야에 공지된 또 다른 방법은 상동성 재조합[참조: 미국 특허 제5,482,856호]이다. 바람직하게는, 벡터는 키메라 항체의 안정한 발현을 위해 진핵 세포내로 형질감염시킬 것이다.
비사람/사람 키메라 항체를 또한 유전자 조작하여, "사람화" 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 항체는 비사람 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래된 다수의 CDR, 하나 이상의 사람 가변 프레임워크 영역 및 하나 이상의 사람 면역글로불린 불변 영역을 보유한다. 사람화는 비사람 모노클로날 항체 또는 키메라 항체와 비교할 경우에 감소된 결합 친화성을 갖는 항체를 생산할 수 있다. 따라서, 당업자는 사람화 항체를 디자인하기 위한 1종 이상의 방책을 사용한다.
특정한 양태에 있어서, 항체의 항원-결합 단편의 사용이 바람직할 수 있다. 이러한 단편은 각각 파파인 또는 펩신을 사용한 단백질분해성 분해에 의해 제조할 수 있는 Fab 단편 또는 F(ab')2를 포함한다. 항원 결합 단편은, 예를 들어, 고정화 단백질 A 또는 고정화 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 Fc 단편으로부터 분리할 수 있다. Fab 단편을 생성시키는 대체법은 F(ab')2단편의 온화한 감소, 및 이어서 알킬화를 포함한다[참조예: Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston].
상기한 Ig 분자 중 하나의 비사람, 사람 또는 사람화 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 단일쇄 Fv(sFv) 단편(단일쇄 항체)으로서 작제할 수 있다[참조예: Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988]. 다기능 융합 단백질을 sFv를 프레임내에서 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 다양한 이펙터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 연결함으로써 생성시킬 수 있다. 이들 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, EP-B1-0318554, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제5,091,513호 및 미국 특허 제5,476,786호에 개시되어 있다.
리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하는 추가의 방법은 파아지 디스플레이에 의한 것이다[참조예: Winter et al., Annul. Rev. Immunol. 12:433-55, 1994; Burton et al., Adv. Immunol. 57:191-280, 1994]. 사람 또는 마우스 면역글로불린 가변 영역 유전자 조합 라이브러리를 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 Ig 단편(Fab, Fv, sFv 또는 이의 다량체)을 선택하도록 선별할 수 있는 파아지 벡터내에서 생성시킬 수 있다[참조예: 미국 특허 제5,223,409호; Huse et al., Science 246:1275-81, 1989; Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66, 1991; Hoogenboom et al., J. Molec. Biol. 227:381-388, 1992; Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52, 1997, 및 본원에 인용된 참고문헌].
세포 집단
위에서 논의한 바와 같이, 본 발명은 연결을 원하는 세포 표면부를 갖는 임의의 세포 유형에 광범위한 적용성을 갖는다. 이와 관련하여, 다수의 세포 시그널링 이벤트를 본 발명의 방법에 의해 증강시킬 수 있다. 이러한 방식을 생체외 셋팅으로 치료학적으로 이용하여, 환자에 주입하기 위한 세포를 활성화시키고 자극할 수 있거나, 생체내에서 사용하여, 표적 세포 집단 상에서 세포 시그널링 이벤트를 유도할 수 있다. 그러나, 또한 상기한 바와 같이, 본원제 제공된 표준예는 T-세포에 관한 것이지만, 어떠한 방법으로든 이에 한정되지 않는다.
T-세포와 관련하여, 본원에 기술된 다양한 증식 방식으로부터 유래된 T-세포 집단은 사용된 조건하에 따라 달라지는 각종 특이적 표현성 특성을 가질 수 있다. 이러한 표현형 특성은 CD25, CD154, IFN- 및 GM-CSF의 증강된 발현뿐만 아니라, CD137, CD134, CD62L 및 CD49d의 변경된 발현을 포함한다. 이들 성분의 발현을 차별적으로 조절하는 능력은 매우 중요할 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포, 단핵구 및 심지어 백혈병성 B 세포 또는 림프종) 상에서 발현된 CD40 분자와의 접촉을 통한 "적합화된 T-세포" 상에서의 CD154의 표면 발현의 보다 높은 수준은 항원 제시 및 면역 기능을 증강시킬 것이다. 이러한 방책은 통상적으로 항체 또는 재조합 CD40L을 통한 CD40을 연결하는 다양한 일단에 의해 이용되고 있다. 본원에 기술된 접근법은 이러한 동일한 시그널을 보다 물리학적 방식으로, 예를 들어, T-세포에 의해 전달되도록 할 수 있다. T-세포 활성화(XCELLERATE) 고정을 적합화함으로써 IFN-분비를 증가시킬 수 있는 능력은 항-종양 및 항-바이러스 반응에 중요한 TH1-유형 면역 반응의 생성을 촉진시키는데 도움을 줄 수 있다. CD154와 같이, GM-CSF의 증가된 발현은 특히 APC 전구체의 보다 기능적으로 유능한 APC, 예를 들어, 수지상 세포로의 성숙을 촉진시키는데 대한 이의 능력을 통해 APC 기능을 증강시키는데 작용할 수 있다. CD137 및 CD134의 발현의 변경은 아폽프토시스 시그널을 저해하거나 이에 감수성일 수 있는 T-세포의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 유착/회귀 수용체, 예를 들어, CD62L 및/또는 CD49d의 발현을 조절함으로써 림프양 기관, 감염 부위 또는 종양 부위에 회귀하는 주입된 T-세포의 능력을 측정할 수 있다.
본 발명의 추가의 국면은 증식 이전에 CD8+또는 CD4+세포가 결핍되어 있는 T-세포 집단 또는 조성물을 제공한다. 한 양태에 있어서, CD8+세포를 CD8+마커에 대해 생성된 항체에 의해 결핍시킨다. 당해 분야의 통상의 숙련가라면 CD8+또는 CD4+세포의 샘플을 결핍시키거나 반대로 CD8+또는 CD4+세포 함유율을 강화시키기 위한 각종 특유한 방식을 용이하게 동정할 수 있을 것이다. CD4+세포를 강화시키는 것과 관련하여, 본 발명의 한 국면은 TC(CD8+) 세포가 결핍되어 있는 경우에 T-세포 집단의 자극시 극히 강건한 CD154 발현 프로파일의 동정에 중점을 둔다. 위에서 지시한 바와 같이, CD154는 발현이 면역 반응을 증폭시키는데 극히 유리한 중요한 면역조절 분자이다. 따라서, CD154 발현에서의 증가는 아마도 보다 유효한 T-세포 조성물을 유도할 것이다.
본 발명의 T-세포 집단의 표현형 특성을 당업자에 의해 공지된 표준 유세포측정 방법 및 ELISA 방법을 포함한 각종 방법에 의해 모니터링할 수 있다.
당해 분야의 통상의 숙련가라면 본원에 기술된 세포 자극 방식을 각종 환경(즉, 컨테이너)내에서 수행할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들어, 이러한 컨테이너는 배양 플라스크, 배양 백, 또는 바람직하게는 멸균 환경내에서 세포를 보유할 수 있는 임의의 컨테이너일 수 있다. 본 발명의 한 양태에 있어서, 생물반응기가 또한 유용하다. 예를 들어, 수개의 제조업체는 현재 세포를 증식시키는데 사용할 수 있고, 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있는 장치를 제조한다[참조예: Celdyne Corp., Houston, TX; Unisyn Technologies, Hopkinton, MA; Synthecon, Inc. Houston, TX; Aastrom Biosciences, Inc. Ann Arbor, MI; Wave Biotech LLC, Bedminster, NJ]. 또한, 이러한 생물반응기를 포함하는 특허는 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제6,096,532호, 제5,985,653호, 제5,888,807호 및 제5,190,878호를 포함한다.
사용 방법
상기한 방법 이외에, 본원에 기술된 방법에 의해 자극되고/되거나 활성화된 세포를 각종 범주내에서 사용할 수 있다. T-세포의 표준예와 관련하여, 본원에 기술된 방식을 이용하여, 감염 질환, 암의 치료 및 면역요법에서 사용하기 위해 CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+또는 CD45RO+T-세포 집단을 선택적으로 증식시킬 수 있다. 결과로서, 항원 반응성과 관련하여 폴리클로날이지만, CD4+또는 CD8+과 관련하여서는 실질적으로 상동성인 표현형적으로 특유한 T-세포 집단을 제조할 수 있다. 또한, 당해 방법은 T-세포 집단을 개체의 전체 CD4+또는 CD8+T-세포 집단(개체에서의 림프구 집단은 약 1011개이다)을 재구성하기에 충분한 수로 증식가능하게 한다. 생성된 T-세포 집단을 또한 유전적으로 형질도입하여 면역요법에 사용할 수 있거나, 감염제의 시험관내 분석 방법에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 종양-침습 림프구의 집단을 암에 걸린 개체로부터 분리하고, T-세포를 자극하여, 충분한 수로 증식시킬 수 있다. 생성된 T-세포 집단을 유전적으로 형질도입하여, 종양 괴사 인자(TNF) 또는 다른 단백질을 발현시켜, 개체에 제공할 수 있다.
본 발명의 CD4+T-세포 집단에 대한 특유한 용도는 개체에서의 HIV 감염의 치료이다. HIV로의 장기간 감염은 궁극적으로 CD4+T 림프구의 수에서 현저한 감소를 유발한다. 이러한 감소는 따라서 면역결핍의 중증 상태를 유발하고, 생명 위협 기회 감염의 어레이에 감수성인 환자로 만든다. CD4+T-세포의 수를 정상 수준으로 보충하는 것은 면역 기능을 유의한 정도로 회복시킬 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 CD4+T-세포를 HIV 감염 환자에서 이들 집단을 재구성하기에 충분한 수로 선택적으로 증식시키는 수단을 제공한다. 이는 또한 장기간 자극 동안 T-세포를 감염시키는 것을 방지하는데 필요하거나, 이는 T-세포를 영구적으로 HIV 감염에 내성이도록 만드는데 바람직할 수 있다. T-세포를 HIV 감염에 내성이도록 만들 수 있거나 감염된 개체에 T-세포를 복원시키기 전에 바이러스를 생산할 수 없도록 만들 수 있는 다수의 기술이 존재한다. 예를 들어, 1종 이상의 항-레트로바이러스 제제(예를 들어, 역전사효소 및/또는 바이러스 조직의 다른 성분을 표적화하는 약물, 참조예: Chow et al., Nature 361:650-653, 1993)를 HIV 복제 또는 바이러스 생산을 저해하기 위해 증식시키기 전에 CD4+T-세포와 함께 배양할 수 있다.
수가지 방법을 이용하여, HIV 감염 또는 복제를 저해하는 분자를 생산하도록 T-세포를 유전적으로 형질도입할 수 있다. 예를 들어, 다양한 양태에 있어서, T-세포를 형질우성 저해제, "분자 유인제", 안티센스 분자 또는 독소를 생산하도록 유전적으로 형질도입할 수 있다. 이러한 방식은 본원에 전체 내용이 참고로 인용되어 있는 미국 특허원 제08/253,751호, 제08/253,964호 및 PCT 공개공보 제WO 95/33823호에 보다 상세하게 기술되어 있다.
항원 특이적 T-세포 집단을 자극하고 증식하는 방법은 T-세포의 피검체에의 투여시 면역 반응을 상향 조절하는 것(예를 들어, 반응을 유도하거나 존재하는 반응을 증강시키는 것)이 바람직한 경우의 치료 상황에서 유용하다. 예를 들어, 당해 방법을 이용하여, 종양-관련된 항원에 대한 T-세포 반응을 증강시킬 수 있다. 피검체로부터의 종양 세포는 전형적으로는 종양-관련된 항원을 발현시키지만, T-세포에서 공자극 시그널을 자극할 수 없을 수 있다(예를 들어, 이들은 공자극 분자의 발현이 결핍되어 있기 때문이다). 따라서, 종양 세포를 피검체로부터의 T-세포와시험관내에서 접촉시키고, 항원 특이적 T-세포를 본 발명에 따라 증식시키고, T-세포를 피검체에 복귀시킨다.
따라서, 한 양태에 있어서, 비-호지킨 림프종(NHL) 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병(B-CLL)과 같은 악성 종양을 치료할 수 있다. 증식된 T-세포를 사용하는 초기 연구는 NHL에서 시험된 한편[참조: Liebowitz et al., Curr. Opin. Onc. 10:533-541, 1998], 본 발명의 T-세포 집단은 (아마도 CD28 시그널의 자극에 의해 공급된) 증가된 주입물 및 반응성을 제공함으로써 면역요법의 성공율을 현저하게 증대시킬 수 있는 특유한 표현형 특성을 제공한다. 그러나, B-CLL을 앓는 환자는 높은 일반적인 T-세포 면역억제에 의해 수반되는 말초혈에서의 백혈병성 세포 부하를 갖는 낮은 상대적 T-세포수를 포함한 특수한 어려움을 제공한다. 본 발명의 T-세포 집단은 특히 간세포(CD34+) 이식 요법과 병용할 경우에 상기 질환을 치료하는데 현저하게 개선된 효능을 제공할 수 있다. 따라서, 항-CD3 x 항-CD28 공고정화된 비드를 사용하여 T-세포 기능 및 항-CLL T-세포 활성을 증가시키는 것이 유리할 것이다.
예를 들어, B-CLL 환자의 T-세포 상에서의 CD40에 대한 리간드인 CD154의 부족한 발현이 질환의 주요한 면역학적 결함으로서 인용된다고 가정할 때, 재주입시 CD154 발현의 지속된 높은 수준을 제공할 수 있는 본 발명의 T-세포 집단은 이의 치료에서 도움이 될 수 있다. 조사원들은 CLL에서 CD154를 발현시키는 환자의 T-세포의 능력이 결핍되어 있을 뿐만 아니라, CD80 및 CD86을 발현시키는 백혈병성B-세포의 능력이 결핍되어 있는 것으로 보고한다. CLL에서 백혈병성 B-세포가 CD28에 대한 리간드를 적합하게 발현시키지 못하는 것은 종양-반응성 T-세포를 충분히 활성화시키지 못할 수 있으며, 따라서, 내성의 T-세포의 명백한 상태를 기초로 하는 메카니즘을 나타낼 수 있다. CD40이 가용성 항-CD40 항체를 통해 또는 CD154-형질도입된 백혈병성 B-세포를 통해 CLL B 세포 상에서 관여한다는 연구로 CD80 및 CD86 발현에서의 결함을 보정하는 것으로 보이고, MHC 표면 발현을 상향 조절한다[참조: Kato et al., J. Clin. Invest. 101:1133-1141, 1998; Ranheim and Kipps, J. Exp. Med. 177:924-935, 1993]. 이러한 방식으로 처리된 세포는 특이적 T-세포 항-종양 반응을 자극할 수 있다.
본 발명의 T-세포의 표면 상에서의 CD154의 증강된 발현으로 인해, 이러한 T-세포는 자가 B-CLL 세포와 상호작용할 수 있는 것으로 예상되고, 따라서 MHC, CD80 및 CD86의 발현을 구동시킴으로써 종양의 면역원성을 증가시킬 수 있을 것이다. 또한, 이는 강한 항-종양 반응을 유도하여야만 한다. 또한, 당해 분야의 통상의 숙련가라면 본 발명의 생체외에서 증식된 T-세포를 사용한 환자의 치료는 화학요법과 같은 종래의 암 요법과 병용할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 이와 관련하여, 예를 들어, 환자를 플루다라빈 또는 캠패스와 같은 제제의 이용, 이어서 본 발명의 T-세포 집단의 주입 또는 둘 다에 의해 치료할 수 있다.
달리, T-세포를 본원에 기술된 바와 같이 자극하고 증식시켜, 병원성 제제, 예를 들어, 바이러스(예를 들어, 사람 면역결핍증 바이러스), 박테리아, 기생충 및 진균류에 대한 반응성을 유도하거나 증강시킬 수 있다.
본 발명은 또한 T-세포의 혼합된 집단으로부터의 T-세포의 특이적 아집단을 선택적으로 증식시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 CD4+및 CD8+이중 포지티브 T-세포의 보다 더 높은 비를 갖는 T-세포의 특이적으로 강화된 집단을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 CD4+T-세포로부터의 TH1세포 집단을 선택적으로 증식시키는 방법을 제공한다. 당해 방법에 있어서, CD4+T-세포를 항-CD28 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체 9.3을 사용하여 공자극하여, IFN-γ를 포함한 TH1-특이적 사이토킨의 분비를 유도하고, 이에 따라 TH2세포에 대해 보다 TH1세포를 강화시킨다.
활성화 T-세포의 표현형 특성이 발현 과정 동안 경시적으로 변화한다는 관찰은 T-세포가 수시간내에 활성화되는 것으로 입증된 사실과 조합되었다[참조: Iezzi et al., Immunity 8:89-95, 1998]. 따라서, 본원에 기술된 방식과 함께, 이는 단시간내에 T-세포 집단의 적합화된 서브세트를 증식시키는 능력을 제공한다. 한 양태에 있어서, 이러한 기술을 신장 투석법의 이용과 유사하게 피검체의 침대에서, 외래 환자 양상으로, 또는 피검체의 가정에서 사용할 수 있다. 예를 들어, T-세포를 활성화 시그널(예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체 등)과 접촉시켜 배양하여 연속 유동으로 즉시 또는 수시간의 증식 기간 후에 환자에게 환류시키는 방법 또는 장치이다. 한 국면에 있어서, 이러한 증식 기술은 필터 부품을 갖는 분리된 챔버를 사용할 수 있어, 3x28 비드 또는 유사하게 피복된 미세입자를 혈액/농축된 세포의 연속 유출물과 혼합한다. 또 다른 양태에 있어서, 장치내에 있는 고체 표면을 항체 또는 다른 성분으로 직접적으로(공유적으로) 또는 간접적으로(예를 들어, 스트렙타비딘/비오틴 등) 피복하거나 접합시켜, T-세포 활성화 및 증식을 자극할 수 있다. 예를 들어, 혈액/세포 수집 장치 및/또는 2종 이상의 고정화 항체(예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28) 또는 세포를 피검체에 복귀시키기 전에 T-세포 활성화에 필요한 수용체를 자극하는 다른 성분을 함유한 일회용 장치를 통한 환자로부터의 연속 유체 경로를 이용할 수 있다(플라스틱 표면 분리가능한 미세입자 상에 고정화됨). 이러한 시스템은 현존하는 제조업체 일회용 세트에 도킹된 무균 일회용 세트를 갖는 백혈구성분채집 기구를 포함할 수 있거나, 제조업체의 일회용 세트에 대한 개작물일 수 있다(예를 들어, 항체/활성 성분이 고정화되고/함유되어 있는 표면 플랫폼은 성분채집 동안 말초혈 단핵 세포의 채집을 위한 백/컨테이너내에 있다). 또한, 고체 표면/표면 플랫폼은 장치 챔버 중 하나에 삽입되어 있거나 일회용 부품 중 하나내에 물질적으로 존재하는 제거 삽입물의 일부일 수 있다. 위에서 논의한 연속 유동 국면의 또 다른 양태에 있어서, 당해 시스템은 세포를 혈액 수집 장치내의 챔버 또는 환자에로의 유동 경로를 갖는 일련의 배양 챔버 기구를 이용하여 실온에서 또는 생리적 온도에서 활성화 성분과 접촉시킴을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 혈액을 (예를 들어, 플라스틱 표면 또는 분리가능한 미세입자 상에 고정화된) 2종 이상의 고정화 항체(예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28) 또는 피검체에게 세포를 투여하기 전에 T-세포 활성화에 필요로 하는 수용체를 자극하는다른 성분을 함유하는 환자로부터 직접적으로 독립형 일회용 장치에 인취한다. 한 양태에 있어서, 일회용 장치는 시린지로의 코우밍(couming)/도킹(docking)에 적합한 특유한 관재 접속부를 갖는 컨테이너(예를 들어, 플라스틱 백 또는 플라스크)를 포함할 수 있다. 이러한 장치는 T-세포 활성화 성분(예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체)의 고정화를 위한 고체 표면을 함유할 것이고; 이들은 컨테이너 자체 또는 삽입물의 표면일 수 있거나, 평면, 에칭된 평면, 불규칙 표면, 다공성 패드, 섬유, 임상적으로 허용가능/안전한 페로-유체, 비드 등일 수 있다. 또한, 독립형 장치를 사용할 경우에, 피검체를 장치에 접속해 둘 수 있거나, 장치를 환자로부터 분리할 수 있다. 또한, 당해 장치를 실온에서 사용하거나, 휴대용 배양기를 사용하여 생리적 온도에서 배양할 수 있다.
혈액 및 혈액 산물을 수집하여 프로세싱하는 장치 및 방법은 익히 공지되어 있기 때문에, 당업자라면 본원에 제공된 기술이 제공될 경우에 상기한 요구를 실행하는 각종 자이를 용이하게 디자인하거나 현존 장치를 변형시킬 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 이러한 장치 및 방법은 본원에 기술된 특정 양태에 의해 한정되지는 않지만, 무균 상태를 유지할 수 있고, 혈액을 보체 활성화가 감소된 유체 형태로 유지하고, T-세포 활성화에 필요한 성분(예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체 또는 이에 대한 리간드)이 고정화되거나 피검체에게 투여하기 전에 혈액 또는 혈액 산물로부터 분리될 수 있는 장치 및 방식을 포함할 것이다. 또한, 당해 분야의 통상의 숙련가라면 각종 혈액 산물을 본원에 기술된 장치 및 방법과 함께 이용할 수 있음을 용이하게 인지할 수 있다. 예를 들어, 당해 방법 및 장치를 이용하여, 해동시 및 피검체 투여 전에 냉동보존된 전혈, 말초혈 단핵 세포, 다른 냉동보존된 혈액-유래된 세포 또는 냉동보존된 T-세포주로부터의 T-세포의 신속한 활성화를 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 당해 방법 및 장치를 이용하여, 피검체에의 투여 전에 미리 생체외 증식된 T-세포 산물의 활성을 증강시킬 수 있다. 마지막으로, 당업자라면 상기한 방법 및 장치를 피검체 및 공여체와 동시에 자가 또는 동종이형 세포 요법에 이용할 수 있다.
본 발명의 방법을 또한 항원의 반응성을 증강시키고 생체내 효과를 증강시키는 백신과 함께 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 증식된 T-세포가 생체내에서 비교적 긴 반감기를 갖는 것으로 가정하면, 이들 세포는 관심의 대상인 목적하는 핵산 서열을 보유하고, 암, 질환 또는 감염 부위에 잠재적으로 회구함으로써 유전자 요법에 대해 완전한 비히클로서 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 증식된 세포를 백신, 1종 이상의 사이토킨, 1종 이상의 치료학적 항체 등과 함께 환자에게 전달할 수 있다. 실질적으로, 보다 강건한 T-세포 집단에 의해 이익을 획득할 수 있는 임의의 치료법은 본원에 기술된 사용 방법의 범주내에 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 T-세포 집단과 같은 표적 세포 집단을 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 성분, 예를 들어, IL-2 또는 다른 사이토킨 또는 세포 집단과 함께 약제학적 조성물로서 투여할 수 있다. 간략하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기술된 표적 세포 집단을 1종 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예를 들어, 중성 완충염수, 인산염 완충염수 등; 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 글리신; 항산화제; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA 또는 글루타치온; 애쥬번트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥 투여용으로 제형화한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료할(또는 예방할) 질환에 적합한 방식으로 투여할 수 있다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적합한 투여량은 임상 시용에 의해 결정할 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 전체 내용이 본원에 참고로 인용되어 있다. 또한, 본원에서 사용된 모든 수치 범위는 범위내의 모든 정수값을 명시적으로 포함하고, 범위내의 특정 수치의 선택은 특정한 용도에 따라 달라지는 것으로 고려된다. 또한, 다음 실시예는 예시로서 제공하는 것이지, 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 I
T-세포 자극
본원에 기술된 특정 실험에 있어서는, XCELLERATE I™로 명명되는 공정을 이용한다. 간략하게, 당해 공정에 있어서, XCELLERATED T-세포를 말초혈 단핵 세포(PBMC) 성분채집 산물로부터 제조한다. 임상적 부위에서 환자로부터 수집한 후, PBMC 성분채집물을 세척한 다음, "비피복된" DYNABEADSRM-450 에폭시 T와 함께 배양한다. 이 시간 동안, 단핵구와 같은 탐식 세포는 비드를 섭취한다. 배양 후, 비드를 비드에 부착되어 있는 임의의 단핵구/탐식 세포를 제거하기 위해 세포 및 비드를 MaxSep 마그네틱 분리기 상에서 프로세싱한다. 이러한 단핵구-결핍 단계 후에, 총 5x108개 CD3+T-세포를 함유하는 용적을 취하여, 1.5x109개 DYNABEADSRM-450 CD3/CD28 T와 셋팅하여, XCELLERATE™ 공정(약 3:1 비드 대 T-세포)을 개시한다. 다음, 세포와 DYNABEADSRM-450 CD3/CD28 T의 혼합물을 37℃, 5% CO2에서 약 8일 동안 배양하여, 제1 주입용 XCELLERATED T-세포를 생성시킨다. 잔류하는 단핵구-결핍된 PBMC를 제2 또는 추가의 세포 산물 증식(약 21일 이후)까지 냉동보존하고, 이 증식 시점에서 이들을 해동하고, 세척한 다음, 총 5x108개 CD3+T-세포를 함유하는 용적을 취하여, 1.5x109개 DYNABEADSRM-450 CD3/CD28 T와 셋팅하여, 제2 주입용 XCELLERATE 공정을 개시한다. 37℃, 5% CO2에서의 약 8일 동안의 배양 기간 동안, CD3+T-세포는 활성화하고 증식한다. 항-CD3 mAb(OKT3)를 Ortho Biotech.(Raritan, NJ)로부터 구입하고, 항-CD28 mAb(9.3)를 Bristol-MyersSquibb(Stamford, Conn.)로부터 구입한다.
XCELLERATE II™로 명명되는 변형된 공정과 함께, 별개의 단핵구 결핍 단계를 이용하지 않는 소정의 변형 상태로 상기한 공정을 이용하고, 특정 공정에 있어서는 세포를 비드와의 최초 접촉 전에 동결시키고, 추가의 농축 및 자극을 수행한다(도 5A 및 도 5B 참조). 당해 공정의 한 변형에 있어서, T-세포를 공여체 또는 환자의 순환 혈액으로부터 성분채집술에 의해 획득한다. 성분채집 산물의 성분은 전형적으로는 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 세포(백혈구), 적혈구 및 혈소판을 포함한다. 전형적인 성분채집 산물은 1-2x1010개 유핵 세포를 함유한다. 세포를 칼륨-비함유, 마그네슘-비함유 인산염 완충염수로 세척하여, 혈장 단백질 및 혈소판을 제거한다. 세포를 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, PBS로 대체함으로써 세척 단계를 수행한다. 당해 공정은 반자동 "유동" 원심분리기(COBE 2991 Systems, Baxter)를 이용하여 수행한다. 세포를 프로세싱할 때에 이는 폐쇄 시스템에서 보유한다.
(활성화 세포에 대해 강화된) 단핵구를 포함한 비결합 세포를 결핍시킨 다음, 연속적으로 자극함으로써 세포를 추가로 프로세싱할 수 있다. 달리, 세척한 세포를 동결시키고, 저장하고, 이후에 프로세싱할 수 있으며, 이는 과립구를 결핍시킬 뿐만 아니라, 증식의 강건도를 증가시키는 것으로 본원에 입증되어 있다. 한 예에서, 세포를 동결시키기 위해, 세포의 35ml 현탁액을 250ml 크리오사이트(Cryocyte) 동결 백내에 동결액 35ml와 함께 유입한다. 세포 현탁액35ml는 전형적으로는 PBS 중에 3.5x109내지 5.0x109개 세포를 함유한다. 동일한 용적의 동결액(PBS 중의 20% DMSO 및 8% 사람 혈청 알부민)을 첨가한다. 세포의 최종 농도는 50x106개 세포/ml이다. 크리오사이트 백은 30 내지 70ml 범위의 용적을 수용할 수 있으며, 세포 농도는 10 내지 200x106개 세포/ml 범위일 수 있다. 크리오사이트 백이 세포 및 동결액으로 충전되면, 백을 속도 제어 냉동기내에 유입하고, 세포를 1℃/분으로 -80℃로 동결시킨다. 다음, 동결된 세포를 필요할 때까지 액체 질소 저장 시스템내에 유입한다.
세포를 액체 질소 저장 시스템으로부터 제거하여, 37℃에서 해동시킨다. 다음, DMSO를 제거하기 위해, 해동된 세포를 COBE 2991 시스템 상에서 칼슘-비함유, 마그네슘-비함유 PBS로 세척한다. 다음, 세척한 세포를 80마이크론 메쉬 필터로 통과시킨다.
해동된 세포, 즉, 약 0.5x109개 CD3+세포를 칼슘-비함유, 마그네슘-비함유 PBS 100ml를 함유하는 플라스틱 1L들이 라이프셀 백에 유입한다. 상기 PBS는 1% 내지 5% 사람 혈청을 함유한다. 1.5x109개 CD3xCD28 비드(Dynabeads M-450)를 또한 세포(3:1 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T:CD3+T-세포)와 함께 백에 유입한다. 비드와 세포를 실온에서 1RPM(엔드-오버-엔드 회전)으로 약 30분 동안 혼합한다. 비드 및 세포를 함유하는 백을 MaxSep 마그네틱 분리기(Nexell Therapeutics, Irvine,CAb). 백과 MaxSep 사이에, 플라스틱 스페이서(약 6mm 두께)를 위치시킨다. (자기 세기를 증가시키기 위해, 스페이서를 제거한다.) 비드 및 비드에 부착되어 있는 임의의 세포를 자성체 상에 유지시키는 한편, PBS 및 비결합 세포를 펌핑에 의해 제거한다.
CD3xCD28 비드 및 비드에 결합되어 있는 농축된 세포를 세포 배양 배지(X-Vivo 15(BioWhittaker)를 함유하는 1리터; 약 100,000I.U. IL-2의 존재 또는 부재하에 50ml 열 불활성화 풀링된 사람 혈청, 20ml 1M Hepes, 10ml 200mM L-글루타민 함유)로 세정하여, 3L 라이프셀 배양 백내로 유입한다. CD3xCD28 비드 및 포지티브하게 선택된 세포를 라이프셀 백으로 이송시킨 후, 백이 1000ml를 포함할 때까지 배양 배지를 첨가한다. 세포를 함유하는 백을 배양기(37℃ 및 5% CO2)내에 유입하고, 세포를 증식시킨다.
세포를 3일째 및 5일째에 각각 1 내지 4회 분할한다. 세포를 배양물 중에서 3일 및 8일 후에 수거함으로써 T-세포 활성화 및 증식을 측정한다. 세포 크기, 세포 표면 마커 발현의 수준, 특히 배양 3일째에 CD25 및 CD154의 발현을 측정함으로써 T-세포의 활성화를 평가한다. 8일째에 세포를 MaxSep 자성체 상에서 중력하에 유동(약 150ml/분)시켜, 자기 입자를 제거한 다음, 상기한 COBE 장치를 이용하여 세포를 세척하고 농축시키고, 정맥내 투여에 적합한 평형화 전해질 용액, 예를 들어, Plasma-Lyte AR(Baxter-Healthcare)에 재현탁시킨다.
명세서에 기술된 바와 같이, XCELLERATE I™은 자극 및 농축을 수행하지 않으며, 단핵구 결핍을 자극 전에 수행하는 것을 제외하고는 상기한 바와 유사한 조건을 의미한다.
XCELLERATE I™ 및 II™ 양쪽 공정을 수행하고, T-세포 증식을 배양한지 8일 후에 측정한다. 증식된 T-세포의 수율은 CD3+세포를 세포 배양 전에 농축시킨 경우보다 더 높다(표 1 참조). 또한, 세포 집단은 CD3+세포를 90% 이상 포함한다.
8일째의 T-세포 증식 수율
실험 CD3+비농축(XCELLERATE ITM) CD3+농축(XCELLERATE IITM)
NDa079 33 x 109 36 x 109
NDa081 38 x 109 42 x 109
NDa082 28 x 109 38 x 109
평균 33 ±5 x 109 39 ±3 x 109
이와 관련하여 추가의 실험을 수행하고, 증식된 세포의 총수뿐만 아니라, CD3+농축 부재하에 자극된 세포의 9개 배취 및 CD3+세포 존재하에 자극된 세포의 5개 배취의 증식 배수를 제시한다(도 1 및 2 참조).
배양 전 자기력의 적용에 의한 세포의 농축은 효과적으로 CD3+세포의 순도를 증가시킬 뿐만 아니라, CD154 수준을 증가시킨다(표 2, 도 3 및 4는 CD154 수준을 그래프로 도시한다). 또한, T-세포 집단을 상이한 세기에 노출시키는 경우의 T-세포 증식의 비교는 보다 강한 자성체에의 노출이 CD3+세포의 보다 높은 수율을발생시킴을 제시한다(표 2).
약한 자성체 및 강한 자성체를 사용한 농축 후에 T-세포 증식 및 세포 표면 마커의 비교
실험 자성체 일수 CD3% 크기 CD25 CD154 CD3#
(FSC) (MFI) (MFI) x 109
NDa087
선택 전 0 47% 318 8 4 0.5
선택 후 약함 0 56% 0.37
선택 후 강함 0 61% 0.35
비선택 부재 3 533 758 19
선택 후 약함 3 90% 570 846 41
선택 후 강함 3 92% 558 1006 45
배양 후 부재
배양 후 약함 8 92% 412 110 9 17.7
강함 8 93% 413 89 7 37.8
NDa089
선택 전 0 44% 312 6 4 0.5
선택 후 약함 0 46% 0.39
선택 후 강함 0 55% 0.3
선택 후 약함 3 83% 589 685 67
선택 후 강함 3 83% 600 720 115
배양 후 약함 8 89% 409 58 18 25.3
강함 8 87% 371 65 13 42.1
약한 자성체 및 강한 자성체를 사용한 농축 후에 T-세포 증식 및 세포 표면 마커의 비교
실험 자성체 0일째CD25 3일째CD25 0일째CD154 3일째CD154 8일째CD3 세포수
(MFI) (MFI) (MFI) (MFI) x 109
NDa087
비선택 부재 8 758 4 19 31
선택 약함 8 846 4 41 18
선택 강함 8 1006 4 45 38
NDa089
비선택 부재 6 309 4 12 26
선택 약함 6 685 4 67 25
선택 강함 6 720 4 115 42
XCELLERATE I™의 공정을 XCELLERATE II™의 공정과 비교하는 5회의 추가의 실험을 수행한다. 2가지 공정에 따라 활성화되고 배양-증식된 세포의 경우, 배양 3일째 및 8일째의 세포 활성화 마커(세포 크기, CD25 발현 및 CD154 발현)를 아래 표 3 및 도 6 및 7에 제시한다.
3일째의 세포 활성화 마커
실험 번호(공여체) 공정 세포 크기(FSC) CD25(MFI) CD154(MFI)
0일째 3일째 0일째 3일째 0일째 3일째
NDa104(PC071) XCELLERATE I 282 526 7 625 5 50
XCELLERATE II 315 531 7 750 5 162
NDa107(PC074) XCELLERATE I 243 578 5 287 4 23
XCELLERATE II 272 587 6 311 5 120
NDa110(PC076) XCELLERATE I 262 588 6 497 4 59
XCELLERATE II 284 615 6 580 5 197
NDa113(PC060) XCELLERATE I 271 662 5 726 4 54
XCELLERATE II 291 660 6 741 5 177
NDa115(PC073) XCELLERATE I 253 560 6 202 6 25
XCELLERATE II 252 582 6 448 6 83
평균 ±표준편차 XCELLERATE I 262±15 583±50 6±1 467±221 5±1 42±17
XCELLERATE II 283±23 595±47 6±1 566±189 5±1 148±17
표 3에서 모든 배양은 동결/해동된 세포를 사용하여 개시한다.
표 3 및 도 6 및 7에서의 데이터는 XCELLERATE II™ 공정이 3일째의 세포 크기 및 CD25 발현 활성화 마커가 평균하여 유사하나, 전형적으로 자극 이후 보다 높고 지속적으로 높아지는 세포를 발생시킴을 제시한다. 그러나, XCELLERATE II™ 공정으로부터의 T-세포에 대한 3일째의 CD154 활성화 마커는 XCELLERATE I™ 공정으로부터의 T-세포의 것보다 매우 높다. 또한, 위에서 입증되는 바와 같이, XCELLERATE II™ 공정은 다른 방법보다 공여체마다 일관적으로 보다 높은 CD25 및 CD154 수준을 발생시킨다.
XCELLERATE II™ 공정의 3일째의 CD154 발현은 XCELLERATE I™ 공정에 대한 것보다 실제로 매우 높다. 이러한 관찰은 T-세포가 XCELLERATE I™ 공정에서보다 XCELLERATE II™ 공정 동안 활성화의 보다 높은 상태로 존재함을 제시한다. 이는생체내 투여할 경우에 보다 유효한 산물로 전환할 수 있음을 예시한다.
CD3+세포 순도, CD4 세포/CD8 세포 비율 및 배양 3일째의 세포 생존율을 또한 5종의 환자 샘플에 대해 측정한다. 유세포 측정법 또는 트리판 블루 염색법(Trypan blue staining)에 의해 측정한 바와 같은, XCELLERATE I™ 공정 및 XCELLERATE II™ 공정에 적용시켜 사용된 세포의 표현형 및 생존율을 아래 표 4에 제시한다.
NDa # 0일째 CD3+세포 순도(%)* 0일째세포생존율(%) 0일째 CD4:CD8 비율ψ 0일째 CD3+세포 순도(%)* 3일째세포생존율(%) 3일째CD4:CD8비율
103XCELLERATE I 70 92 1.91 79 82 1.3
103XCELLERATE II 85 99 2.3 91 95 2.4
104XCELLERATE I 67 95 3.2 84 78 2.7
104XCELLERATE II 110 99 3.7 93 87 2.9
107XCELLERATE I 69 99 2.3 85 82 2.3
107XCELLERATE II 119 99 2.7 95 92 2.8
110XCELLERATE I 63 99 2.9 91 82 2.6
110XCELLERATE II 83 99 3.9 93 92 4.5
115XCELLERATE I 60 99 1.9 92 91 2.7
115XCELLERATE II 72 99 2.2 96 94 2.8
*= XCELLERATE I 공정에서의 단핵구-결핍 후 또는 XCELLERATE II 공정에서의 자기 농축 후 0일째의 CD3+T-세포의 순도ψ= XCELLERATE I 공정에서의 단핵구-결핍 후 또는 XCELLERATE II 공정에서의 자기 농축 후 0일째의 CD4+:CD8+T-세포의 비율
실시예 II
CD3+T-세포 강화, 단핵구-결핍 및 과립구-결핍의 효능
본 연구를 위해, 싸이트 테라피스 디벨롭먼트(Xcyte Therapies Development) 실험실에서 인수하자마자, 신입 PBMC 성분채집 산물을 세척하고, 분할하고, 다음 단계를 수행한다:
1. XCELLERATE I 공정을 위해, 단핵구-결핍 단계를 수행하고, CD14+단핵구-결핍된 PBMC를 냉동보존하고, LN2냉동기(실시예 I에 제시한 바와 같음)의 기상에서 저장한다. XCELLERATE I 공정을 셋업하는 날에, CD14+단핵구-결핍된 PBMC를 해동하고, XCELLERATE 공정을 실시예 I에 상술한 바와 같은 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T를 사용하여 개시한다. 이러한 최초 단계에서 N = 5 공여체에 대한 CD3+T-세포 강화, 단핵구-결핍 및 과립구-결핍의 평균 세포 조성물 및 평균 효능을 표 5.1에 제시하고, 각각의 개체 공여체를 표 5.2에 제시한다.
2. XCELLERATE II 공정을 위해, PBMC 성분채집 산물 세포를 냉동보존하고, LN2냉동기의 기상에서 저장한다. XCELLERATE II 공정을 셋업하는 날에, 냉동보존된 PBMC 성분채집 산물 세포를 해동하고, CD3+T-세포를 자기적으로 농축시키고, XCELLERATE II 공정을 실시예 I에 상술한 바와 같은 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T를사용하여 개시한다. 이러한 최초 단계에서 N = 5 공여체에 대한 CD3+T-세포 강화, 단핵구-결핍 및 과립구-결핍의 평균 세포 조성물 및 평균 효능을 표 5.1에 제시하고, 각각의 개체 공여체를 표 5.2에 제시한다.
표 5.1 및 5.2에서 제시되는 바와 같이, XCELLERATE II 공정 구성에서의 해동된 PBMC 성분채집 산물로부터의 직접적인 CD3+T-세포의 자기 농축에 이은 PBMC 성분채집 산물의 동결/해동의 조합은 CD14+단핵구 및 과립구의 효율적인 제거를 야기한다. XCELLERATE II 공정에서의 CD14+단핵구 및 과립구 제거의 효능은 부가의 "비피복된" DUNABEADS M-450 T 시약을 사용하는 별개의 결핍 단계에 대한 필요성을 배제하여, 일관적으로 보다 높은 CD4/CD8 비율을 유도하는 이점을 갖는 XCELLERATE I 공정의 효능만큼 우수하다.
XCELLERATE I 공정 및 XCELLERATE II 공정 구성의 최초 단계에서의 CD3+T-세포 강화, CD14+단핵구-결핍 및 과립구-결핍의 평균(N=5) 효능
세포 제제 평균 ±표준편차 세포 조성(%)
CD3+ CD14+ 과립구 CD4/CD8*
신입 PBMC성분채집 산물 49 ±6 16 ±3 8 ±7 2.2 ±0.3
XCELLERATE I
단핵구-결핍된 PBMC 51 ±6 5.5 ±3 5.7 ±5 2.4 ±0.6
동결/해동된 단핵구-결핍된 PBMC 64 ±4 6 ±3 0.4 ±0.5 2.4 ±0.6
XCELLERATE II
동결-해동된 PBMC성분채집 산물 56 ±5 11 ±2 0.4 ±0.5 2.4 ±0.8
CD3+자기 농축 후 92 ±22 2.4 ±3.7 0 ±0 2.86 ±0.86
세포 조성은 표준 프로토콜에 따라 유세포 측정법에 의해 측정한다.
XCELLERATE I 공정 및 XCELLERATE II 공정 구성의 최초 단계에서의 CD3+T-세포 강화, CD14+단핵구-결핍 및 과립구-결핍의 효능 비교
실험 번호(공여체) 세포 제제 세포 조성(%)
CD3+ CD14+ 과립구 CD4/CD8*
NDa104(PC071) 신입 PBMC 성분채집 산물 43% 11% 14% 2.2
XCELLERATE I
단핵구-결핍된 PBMC 54% 5% 12.5% 3.2
동결/해동된 단핵구-결핍된 PBMC 67% 4% 0% 3.2
XCELLERATE II
동결-해동된 PBMC 성분채집 산물 64% 7% 0% 3.1
CD3+자기 농축 후 110% 1% 0% 3.7
NDa107(PC074) 신입 PBMC 성분채집 산물 51% 16% 1% 2.1
XCELLERATE I
단핵구-결핍된 PBMC 64% 5% 1% 2.3
동결/해동된 단핵구-결핍된 PBMC 69% 3% 0% 2.3
XCELLERATE II
동결-해동된 PBMC 성분채집 산물 55% 11% 0% 2.0
CD3+자기 농축 후 120% 0% 0% 2.7
NDa110(PC076) 신입 PBMC 성분채집 산물 44% 18% 15% 2.5
XCELLERATE I
단핵구-결핍된 PBMC 63% 3.5% 10% 2.9
동결/해동된 단핵구-결핍된 PBMC 63% 7% 0% 2.9
XCELLERATE II
동결-해동된 PBMC 성분채집 산물 55% 13% 0% 3.2
CD3+자기 농축 후 83% 1% 0% 3.8
NDa113(PC060) 신입 PBMC 성분채집 산물 47% 17% 6% 2.3
XCELLERATE I
단핵구-결핍된 PBMC 61% 4% 3% 1.8
동결/해동된 단핵구-결핍된 PBMC 63% 4% 1% 1.8
XCELLERATE II
동결-해동된 PBMC 성분채집 산물 51% 13% 1% 1.5
CD3+자기 농축 후 76% 1% 0% 1.9
NDa115(PC073) 신입 PBMC 성분채집 산물 59% 17% 2% 1.7
XCELLERATE I
단핵구-결핍된 PBMC 60% 10% 2% 1.8
동결/해동된 PBMC 성분채집 산물 60% 11% 1% 1.9
XCELLERATE II
동결-해동된 PBMC 성분채집 산물 53% 12% 1% 2.0
CD3+자기 농축 후 72% 9% 0% 2.2
세포 조성은 표준 프로토콜에 따라 유세포 측정법에 의해 측정한다.
CD14+단핵구-결핍 단계 및 관련된 시약의 제거에 의한 공정의 간소화 및 능률화 이외에, XCELLERATE II™ 공정에서의 자기 농축 단계는 또한 T-세포 활성화의 개시때 CD3+T-세포의 보다 높은 순도 및 CD3+CD4+: CD3+CD8+T-세포의 보다 높은 비를 제공한다(표 5.1 및 표 5.2 참조).
XCELLERATE I™ 공정 및 XCELLERATE II™ 공정의 8일째의 활성화된 CD3+T-세포 예비수거물의 수율, 순도, 생존율 및 조성을 또한 비교한다.
표 5.3에 제시된 바와 같이, 8일째 수거 이전의 CD3+T-세포의 평균 수율, 순도 및 생존율은 전형적으로는 XCELLERATE I™ 공정과 비교하여 XCELLERATE II™ 공정의 경우에 개선된다.
XCELLERATE I 공정 및 XCELLERATE II 공정의 8일째 CD3+T-세포 예비수거물의 수율, 순도, 생존율 및 조성
실험 번호(공여체) XCELLERATE공정 구성 예비수거 CD3+T-세포 산물 특성
CD3+T-세포수 CD3+T-세포 순도(%) 생존율(%) CD4/CD8 비율*
NDa104(PC071) XCELLERATE I 65 x 109 95 97 1.2
XCELLERATE II 50 x 109 97 97 1.7
NDa107(PC074) XCELLERATE I 57 x 109 98 98 0.8
XCELLERATE II 52 x 109 98 98 1.5
NDa110(PC076) XCELLERATE I 41 x 109 96 96 1.6
XCELLERATE II 41 x 109 99 99 2.4
NDa113(PC060) XCELLERATE I 41 x 109 96 96 1.3
XCELLERATE II 43 x 109 98 98 2.0
NDa115(PC073) XCELLERATE I 31 x 109 96 96 1.3
XCELLERATE II 48 x 109 97 97 1.4
평균 ±표준편차 XCELLERATE I 47 ±14 96 ±2 97 ±1 1.2 ±0.3
XCELLERATE II 45 ±6 98 ±1 98 ±1 1.8 ±0.4
*= CD3+CD4+: CD3+CD8+T-세포의 비율
또한, 표 5.3에 제시된 바와 같이, XCELLERATE II™ 공정은 공정 동안 내내 CD3+CD4+: CD3+CD8+T-세포의 보다 높은 비율을 유지시킨다. 이는 자기 농축 단계 동안 CD3+CD4+세포의 우선적 농축을 원인으로 할 수 있다(표 5.1 및 5.2).
"신입(incoming)"은 새로운, 세척된 신입 성분채집 세포를 의미한다. XCELLERATE I™ 공정에 대해 표 5.2에 기재된 출발 세포는 세척하고, 단핵구 결핍시키고/시키거나, 동결/해동시킨 성분채집 세포이다. XCELLERATE II™ 공정에 대해 표 5.2에 기재된 출발 세포는 세척하고, 동결/해동시킨 성분채집 세포이다.
*= CD3+CD4+: CD3+CD8+T-세포의 비율
표 5.3은 XCELLERATE II™ 공정이 XCELLERATE I™ 공정으로부터의 세포 산물보다 (CD3+세포 %를 기준으로) 순수한 세포 산물을 생성시킨다는 것을 제시한다. 즉, XCELLERATE II™ 공정으로부터의 산물 세포는 96%±1%의 평균(±표준 편차) CD3+세포 순도를 갖는 한편, XCELLERATE I™ 공정으로부터의 세포는 93%±2%의 평균 순도를 갖는다.
또한, 표 5.3에 제시된 바와 같이, XCELLERATE II™ 공정은 CD4/CD8 세포의 보다 높은 비율을 유지시킨다. 신입 세포는 2.2의 CD4/CD8 세포비를 가지고, XCELLERATE II™ 공정으로부터의 산물 세포는 1.8의 CD4/CD8 세포비를 갖는 한편, XCELLERATE I™ 공정으로부터의 산물 세포는 1.2의 CD4/CD8 세포비를 갖는다.
표 5.3의 데이터는 또한 XCELLERATE II™ 공정이 98%의 평균 생존율을 갖는 산물 세포를 생성시키는 한편, XCELLERATE I™ 공정이 97%의 평균 생존율을 갖는 산물 세포를 생성시킴을 제시한다.
실시예 III
단핵구 결핍
단핵구(CD14+탐식 세포)를 각종 "무관한" (즉, 비-항체 피복되거나 비-표적 항체 피복된) Dynal 비드를 사용한 자기 결핍에 의한 T-세포 제제로부터 제거한다.피콜에서의 분리 후 전혈 또는 성분채집된 말초혈을 Dynal 양 항-마우스 M-450 비드, Dyanl 사람 혈청 알부민-피복된 비드(M-450) 또는 Dynal 에폭시(M-450) 비드와 함께 대략 2:1 비드 대 세포 비율로 예비배양함으로써 결핍을 수행한다. 세포 및 비드를 22 내지 37℃에서 1 내지 2시간의 기간 동안 배양한 다음, 비드에 부착되어 있거나 비드를 탐식한 세포를 자기 제거한다. 잔류하는 세포를 비조작된 세포와 함께 배양물에 유입한다. 당해 세포를 결핍 전후에 세포 표현형에 대한 유세포 측정법에 의해 특성화시킨다.
실시예 IV
유세포 측정법 셋팅
Becton Dickinson FACSCALIBUR 세포측정기를 수집되고 제시된 모든 데이터에 대해 사용한다. 3색 분석법을 수행할 수 있는 유세포 측정기는 동일한 데이터를 획득하는 숙련된 조작자에 의해 사용될 수 있다. 예를 들어, FACSCAN, Vantage Cell Sorter 또는 다른 BD 제품이 유사한 데이터를 수집하도록 작동할 것이다. 또한, Coulter 제품, 예를 들어, Coulter Epic Sorter가 마찬가지로 작동한다.
아래에 제시된 기구 셋팅을 본 연구에서 수행된 바와 같은 데이터를 수집하기 위한 기구 배치에 대한 일반적 가이드라인으로서 사용할 수 있다. 이들 셋팅을 본원에 제공된 실시예에 대해 사용하지만; 이들 셋팅은 보상 및 검출기 전압을 적합하게 조정하기 위해 숙련된 기구 취급자에 의해 변형할 수 있고 변형하여야만 한다. 또한, 상이한 형광 태그를 갖는 상이한 검출 항체의 사용은 다른 채널로의 최소 "블리딩-오버(bleeding-over)"을 갖는 최적 시그널 분리(전압)을 제공하기 위해 임의의 특유한 기구에 대한 유일한 조정(예를 들어, 보상)을 필요로 한다. 보상 제어, 아이소타입 제어를 사용하는데 있어 정통하고 T-세포 생리의 전반적인 이해를 갖는 숙련된 유동 조작자는 아래에 제시된 모든 데이터를 재현할 수 있다.
또한, 다양한 셋팅, 특히 전압 셋팅은 기구 레이저의 효능에 따라 달라질 수 있음을 주목하여야 한다. 예를 들어, 보다 오래된 레이저는 보다 새로운 레이저에 비하여 시그널을 생성시키기 위해 보다 높은 전압을 필요로 할 수 있다. 그러나, 보다 높은 전압 또는 보다 낮은 전압을 사용하든지 수득된 데이터는 생물학에서 유사한 패턴을 반영하여야 한다.
FACSCALIBUR™(Becton Dickinson) 상에서 사용된 셋팅:
검출기/암페어:
파라미터 검출기 전압 암페어/게인(gain) 모드
P1 FSC EOO 1.30 Lin
P2 SSC 370 1.00 Lin
P3 FL1 610 1.00 Log
P4 FL2 550 1.00 Log
P5 FL3 520 1.00 Log
파라미터 전압이 일반적으로는 일정하더라도, 최대 시그널 분리를 달성하기 위해 P3, P4 및 P5를 경미하게 상향 또는 하향 조절할 수 있는 한편, 로그 모드로 시그널 강도에서의 처음 10개(0-10)내에서 또는 근처에서 네가티브 대조 시그널 값을 유지시킬 수 있다.
역치:
1차 파라미터: FSC(정방향 스캐터)
값: 52
2차 파라미터: 부재
보상:
FL1-4.0% FL2
FL2-21.4% FL1
FL2-2.6% FL3
FL3-15.2% FL2
제공된 셋팅은 아래에 제시된 데이터의 대부분을 수집하기 위해 사용되는 셋팅과 흡사하나, 당해 셋팅은 변경할 수 있으며, 자극된 T-세포 상에서 대략적으로 동등한 데이터를 발생시켜야만 한다. 위에서 기재된 전압에서의 보상에 대해 일반적으로 허용되는 범위는 아래에 제시한 바와 같다:
FL1-FL2 0.4-4%
FL2-FL1 18-27%
FL2-FL3 2-8%
FL3-FL2 10-16%
특유한 보상 또는 전압치의 측정은 다음 목표로 숙련된 유세포 측정기 조작자에 의해 수행되어야 한다:
1) 전압: 포지티브와 네가티브 시그널(예를 들어, 표면 항원 마커 네가티브 대 저수준 표면 항원 대 고수준 표면 항원) 사이의 시그널 분리의 최대화.
2) 보상: 보상 제어의 사용에 의한 채널간 간섭(블리딩-오버)의 최소화.
전압 셋팅이 변화함에 따라, 보상 셋팅도 변화한다.
실시예 V
세포 증식 및 생존율 검정
세포 증식 및 생존율을 표준 트리판 블루 염색법 및 혈구측정기를 이용한 세포 카운팅에 의해 측정한다. 도 5A 및 5B 참조.
실시예 VI
활성화 마커 검정
CD154는 일시적 방식으로 활성화 T-세포 상에서 발현되며, APC 상에서의 CD40을 통한 T-세포 상호작용에서의 중대한 인자인 것으로 제시되었다. 이들 2종 수용체의 상호 작용을 차단함으로써 면역 반응을 효과적으로 변형시킬 수 있고, 심지어 중지시킬 수 있다. CD3xCD28 상자성 비드를 사용한 농축에 의해 자극된 T-세포의 분획을 3, 5 및 5일째에 세포 배양물로부터 제거하고, CD154 발현의 수준에 대해 분석한다. CD154 발현의 수준을 단핵구가 결핍되었지만 CD3xCD28 상자성 비드와 함께 배양되지 않은 T-세포(즉, T-세포는 배양 개시 시점에서 자기적으로 농축되지 않음)와 비교한다. 항-CD3 및 항-CD28 비드를 사용한 자기 농축에 의해 자극된 T-세포의 현저한 활성화는 배양 개시 시점에서 유사하게 자극되지 않은 세포와 비교하여 배양 3일째의 CD154 발현의 수준이 3배 증가된 것으로 나타난다(도 4 및 7 참조). 유사한 방식으로 측정된 CD25 수준(도 6)은 보다 높은 활성화로의 추세를 나타낸다.
일반적으로는, 마커 발현을 여러 시간에 걸쳐 모니터링한다. 이와 관련하여, 세포를 항-사람 CD4(Immunotech, Fullerton, CA), FITC 커플링된 항-사람 CD11a(Pharmingen), FITC 커플링된 항-사람 CD26(Pharmingen), FITC 커플링된 항-사람 CD49d(Pharmingen), FITC 커플링된 항-사람 CD54(Pharmingen 및 Becton Dickinson), FITC 커플링된 항-사람 CD95(Pharmingen), FITC 커플링된 항-사람 CD134(Pharmingen), FITC 커플링된 항-사람 CD25 Ab(Becton Dickinson, Fullerton, CA), FITC 커플링된 항-사람 CD69 Ab(Becton Dickinson), FITC 또는 PE 커플링된 항-사람 CD154 Ab(Becton Dickinson), 또는 FITC 또는 PE 커플링된 IgG1 아이소타입 대조 Ab로 표지시킨다. 2x105개 세포를 각각의 항체 2㎕를 사용하여 최종 용적 30㎕로 4℃에서 20분 동안 표지시키고, 세척하고, 1% 파르포름알데히드(Sigma, St. Louis, MO)에 재현탁시킨다.
세포 표면 마커 분자 발현 수준의 비교를 각종 방법에 의해 수행할 수 있으며, 따라서 절대값은 상이할 수 있다. 그러나, 2가지 값을 비교할 경우에, 상대적 배수값을 용이하게 계산할 수 있다. 예를 들어, 상이한 "활성화" 방법에 의해 생성된 T-세포 상에서의 CD154 발현 수준을 유세포 측정 방법에 의해 비교적 정확하게 측정할 수 있다. 항-CD154-PE 접합체(Becton Dickinson, 카탈로그 제340477호)와 같은 시약을 사용하여, 휴지 또는 활성화 상태의 T-세포를 염색하여, 상기 마커에 대한 발현 수준을 평가할 수 있다(또는 숙련된 유세포 측정기 조작자에게 익히 공지된 방법에 의해). T-세포, 즉 CD4+및 CD8+상에서의 증가된 발현을 제공하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술된 바와 같이 배양 개시 시점에서 T-세포를 동시에 자극하고 농축함으로써, 발현 수준을 유세포 측정법(BD FACSCalibur 및 상기한 항체)을 이용한 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같은 수준에서 약 20% 내지 100%를 초과하는 증가로 표준 3x28 활성화에 의해 수득된 값 이상으로 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 비자극된 CD4+T-세포는 CD154에 대해 네가티브할 것이고, 따라서 1 내지 10의 MFI 값을 수득할 것이다. XCELLERATE I™에 의해 활성화시키면, 활성화 후 3일째, CD4+T-세포 상에서의 CD154에 대한 MFI 값은 20 내지 40 범위내일 것인 한편, XCELLERATE II™ 공정은 60 내지 200의 CD154 MFI 값을 수득할 것이다. 이들은 T-세포 상에서 발현된 CD154 분자의 수로 환산한 절대값은 아니지만, 증가된 발현의 상대적 수준을 측정하기에는 충분하다. 따라서, 이는 활성화 후 1 내지 4일째 사이에 CD154 수준에서 약 1.1 내지 20배 증가가 XCELLERATE I™ 공정에 비하여 XCELLERATE II™ 공정을 이용할 경우에 나타날 수 있음을 증명할 수 있다.
실시예 VII
사이토킨 검정
세포를 상기한 바와 같이 제조한다. 여러 시간에 대해 자극된 세포로부터의 상등액을 제조업체의 지침사항(Biosource International, Sunnyvale, CA)에 따라 IL-2, IL-4, INF-감마 또는 TNF-α ELISA에 적용시킨다.
대체 검정법에 있어서는, 유세포 측정법을 이용하여 CD4 T-세포의 세포내 염색에 의해 IL-2를 측정한다. IL-2 또는 IFN-γ의 세포내 표지화를 위해, 세포를 먼저 1㎍/ml Monensin(Calbiochem)과 함께 검정 전에 4시간 동안 배양한다. 후속적으로, 세포를 제조업체에 의해 기술된 바와 같이 PE-커플링된 항-사람 IL-2 Ab 및 FIFC 커플링된 항-사람 IFN-γ 또는 상응하는 대조 Ab로 표지된 벡턴 딕킨슨 세포내 염색-키트를 이용하여 상기한 바와 같이 표면 단백질에 대해 염색하고, 고정시키고, 삼출시킨다. 데이터 획득 및 유세포 측정 분석을 제조업체의 프로토콜(Becton Dickinson)에 따라 Cellquest 소프트웨어를 이용하는 Becton Dickinson FACSCalibur 유세포 측정기 상에서 수행한다.
IFN-감마 농도는 XCELLERATE I™ 공정과 대조하여 XCELLERATE II™ 방식을 이용할 경우에 3일째에 약 2, 3, 4배 및 특정 경우에는 5배 더 높다(데이터 제시하지 않음). 또한, TNF-알파 수준은 또한 XCELLERATE I™과 비교하여 자극 후 5일째까지 현저하게 더(1.5 내지 3배 이상) 높다.
실시예 VIII
재자극 후 표현형 세포 분석
재자극 분석을 위해, 약 5x106개 세포를 종료일에 배양물로부터 취한다. 수가지 예에 있어서, 종료일은 배양 8일째이다. 세포를 6웰 플레이트 중 하나의 웰에서 상기한 바와 같이 IL-2의 존재 또는 부재하에 혈청을 함유하는 X-vivo 15 배지 5mL에 유입한다. 약 5x106개 Dynabeds M-450 CD3/CD28 T 비드를 세포를 함유하는 웰에 비드화시키고, 세포 및 비드를 37℃, 5% CO2배양기내에 유입한다. 2일 후에, 샘플을 제거하고, 생존율에 대해 시험하고, FACS에 의해 분석하여, 세포 크기, 및 세포 마커 및/또는 사이토킨 발현 수준, 예를 들어, CD25 발현 수준, CD154 발현 수준을 측정한다. 표 6은 XCELLERATE I™ 및 XCELLERATE II™ 공정에 적용한 5명의 환자 샘플에 대한 하기 결과를 제시한다.
XCELLERATE I™ 및 XCELLERATE II™ 공정을 이용하여 생성된 XCELLERATE T-세포에 대한 재자극 검정의 결과
실험 번호(공여체) 공정 구성 세포 크기(FSC) CD25(MFI) CD154(MFI)
T=0 T=48시간 T=0 T=48시간 T=0 T=48시간
NDa104(PC071) XCELLERATE I 393 607 104 478 6 37
XCELLERATE II 404 659 115 544 12 70
NDa107(PC074) XCELLERATE I 386 596 59 585 6 121
XCELLERATE II 380 607 62 721 10 109
NDa110(PC076) XCELLERATE I 425 501 111 600 10 39
XCELLERATE II 390 445 97 434 15 36
NDa113(PC060) XCELLERATE I 399 630 66 659 8 32
XCELLERATE II 41 633 113 816 12 145
NDa115(PC073) XCELLERATE I 433 514 105 247 13 10
XCELLERATE II 408 569 81 369 20 36
평균 ±표준편차(n=5) XCELLERATE I 407 ±21 470 ±58 89 ±24 514 ±163 9 ±3 48 ±43
XCELLERATE II 399 ±13 583 ±84 94 ±22 577 ±189 14 ±4 79 ±48
실시예 IX
대체 세포 수집 및 배양 프로토콜 XCELLERATE™
사람 혈액으로부터 분리된 세포를 용도에 따라 20U/ml IL-2(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)가 보충되거나 보충되지 않고 5% 사람 혈청(Biowhittaker), 2mM 글루타민(Life Technologies, Rockville, MD) 및 20mMHEPES(Life Technology)가 보충된 X-vivo 배지(Biowhittaker Inc., Walkersville, MD)에서 증식시킨다. Jurkat E6-1 세포(ATCC, Manassas, VA)를 10% FBS(Biowhittaker), 2mM 글루타민(Life Technologies), 2mM 페니실린(Life Technologies) 및 2mM 스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 RPMI 1640(Life Technologies)에서 증식시킨다.
건강한 사람 지원자 공여체로부터의 연막을 구입한다(American Red Cross, Portland, OR). 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 제조업체의 지침사항에 따라 림프구 분리 배지(Lymphocyte Separation Media; ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA)를 사용하여 획득한다.
말초혈 림프구(PBL)를 배양 플라스크내에서 비피복된 Dynabeads(Dynal, Oslo, Norway)와 함께 108개 세포/ml, 2개 비드/세포로 37℃에서 2시간 동안 배양함으로써 PBMC 분획으로부터 수득한다. 단핵구 및 대식세포를 배양 플라스크에의 유착에 의해 제거할 수 있다. 달리, 이들은 상자성 비드를 탐식한 다음, 이들 세포를 제조업체의 지침사항(Dynal)에 따라 자기 세포 분리에 의해 결핍시킴으로써 제거할 수 있다. CD4+세포를 CD8(클론 G10-1), CD20(클론 IF5), CD14(클론 F13) 및 CD16(Coulter)에 대한 모노클로날 항체 10㎍/ml와 함께 108개 세포/ml로 4℃에서 20분 동안 배양함으로써 PBL 분획으로부터 정제한다. 세척 후, 세포를 양 항-마우스 Ig-커플링된 Dynabeads로 처리(108개 세포/ml, 6개 비드/세포, 4℃에서 20분 동안)한 다음, 자기 세포 분리에 의해 2회 결핍시킨다. CD4+세포의 순도는 유세포 측정법에 의해 측정한 바 통상적으로 91 내지 95%이다.
수지상 세포를 먼저 PBMC를 배양 플라스크(Costar)에 108개 세포/ml로 37℃에서 2시간 동안(Dynabeads 부재) 유착시킴으로써 생성시킨다. 광범위한 세척 후, 유착 세포를 500U/ml GM-CSF(Boehringer Mannheim) 및 12.5U/ml IL-4(Boehringer Mannheim)를 함유하는 배지에서 7일 동안 배양한다. 생성된 세포 집단은 약하게 유착되어 있고, 수지상 세포의 표면 마커 특성을 발현한다(예를 들어, HLA-DR. CD86, CD83, CD11c를 발현하고, CD4의 발현은 결핍된다). (모든 항체의 구입원: Becton Dickinson, San Jose, CA).
다른 기술은 조직 배양 플레이트 및/또는 조직 배양 플라스크(Baxter 백), 또는 RPMI, X-vivo 15로 구성될 수 있는 배지, 또는 특정의 다른 T-세포 배양 배지 중의 다른 통상의 배양 용기내에서 배양된 T-세포를 함유하는 사람 말초혈 림프구를 사용할 수 있다. T-세포의 활성화 및 증식에 필요로 하지 않더라도, 글루타민 및 HEPES를 배양 배지에 첨가한다. 소 태아 혈청(최종 10%), 사람 A/B 혈청(5%) 또는 자가 사람 혈청(5%)을 배양 배지에 첨가한다. 혈청의 백분율은 T-세포 생리 또는 배양 성과에 크게 영향을 미치지 않으면서 변화시킬 수 있다. 특정 예에서, 재조합 사람 IL-2를 배양 배지에 첨가한다. 특정 예에서, 탐식 CD14+세포 및 다른 탐식 세포를 하기한 바와 같은 자기 결핍에 의해 제거한다. 표면에 항-CD3 및 항-CD28가 공고정화되어 있는 비드(3x28 비드)를 3:1 비드:세포 비율로 첨가한다. 배양을 37℃ 및 5-7% CO2에서 유지시킨다. 세포를 14일간에 걸쳐 수개의 시점에서 제거하여, 각종 표면 항원의 유세포 측정 분석에 의해 세포 밀도(세포수), 세포 크기 및 세포 표면 표현형을 측정한다. 또한, 상응액을 배양물로부터 수집하여, 비제한적으로 IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α를 포함한 사이토킨 분비 프로파일을 측정한다. 활성화 세포가 증식하고 분열할 때, 배양물은 0.2-2x106개 CD3+T-세포/ml로 유지시킨다. T-세포 밀도가 대략 2x106개/ml를 초과할 경우에, 배양물을 분할하고, 새로운 배지를 공급하여, 0.2-1.4x106개/ml 범위의 세포 밀도를 제공한다. 최초 자극 후 대략 2시간 내지 약 14일째에, 활성화 T-세포가 보다 휴지상(예를 들어, CD25 수준이 감소하고, 정방향 스캐터에 의해 측정된 바와 같은 세포 크기가 감소하고, 세포 분열 속도가 감소할 수 있음)으로 도입된 것으로 보이는 경우에, 세포를 피검체에 주입하거나 다음 자극물 중 하나로 재자극한다:
1) 자극물 부재
2) 파이토헤마글루티닌(PHA) 2㎍/ml
3) 1:1 비드/세포 비율의 (3x28 비드)
또한, 세포를 세포 표현형 및 활성화/기능적 상태에 대해 경시적으로 분석한다. 상등액을 다시 분비된 사이토킨 분석을 위해 수집한다.
세포를 3가지 상이한 방식: 1) 제조업체의 지침사항(Dynal)에 따르는 항-CD3(OKT-3) 및 항-CD28(9.3) 항체에 공유적으로 커플링되어 있는 Dynabeads(M-450)(3x28 비드), 3개 비드/세포, 2) 이오노마이신(Calbiochem, La Jolla, CA)(100ng/ml) 및 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)(Calbiochem)(10ng/ml), 3) 동종이형 수지상 세포(25,000개 수지상 세포/200,000개 CD4 세포)에 의해 자극한다. 모든 세포를 106개 세포/ml의 농도에서 자극한다. 증식 검정법을 96웰 평저 플레이트에서 4회 수행한다. 세포를 최종 용적 200㎕로 106개 세포/ml에서 자극한다. 증식을 3일째(자극 방법 1 및 2) 또는 6일째(자극 방법 3)에 MTT 검정법(MTT 검정 키트, Chemicon International Inc., Temecula, CA)에 의해 측정하고, 결과를 4회의 평균치로서 제시한다. PBL 배양물 또는 또는 정제된 CD4+세포 배양물을 3x28 비드, 이오노마이신/PMA 또는 동종이형 수지상 세포로 자극한다.
도 8A 및 8B에 의해 제시된 바와 같이, 세포수(Coulter 카운터)는 PHA, 양 항-마우스(SAM)를 통해 비드에 부착되어 있는 3x28 비드(항-CD3 및 항-CD28가 공고정화되어 있는 비드), 비드에 공유적으로 부착되어 있는 항체 또는 플레이트에 단독으로 또는 이중으로 고정화되어 있는 항체를 보유하는 3x28 비드로의 자극 후에 현저하게 증가한다. 도 9는 또한 +/- 단핵구 결핍 및 +/- IL-2 20단위하에 비드에 공유적으로 고정화된 항-CD3 및 항-CD28로의 자극 후에 세포 수가 증가함을 제시한다.
실시예 X
자기 결핍에 의한 단핵구 결핍
단핵구(CD14+탐식 세포)를 각종 "무관한" (즉, 비-항체 피복되거나 비-표적 세포 피복된) Dynal 비드를 사용한 자기 결핍에 의해 T-세포 제제로부터 제거한다. 피콜화 전혈 또는 성분채집된 말초혈을 Dynal 양 항-마우스 M-450 비드, Dyanl 사람 혈청 알부민-피복된 비드(M-450) 또는 Dynal 에폭시(M-450) 비드와 함께 대략 2:1 비드 대 세포 비율로 22 내지 37℃에서 1 내지 2시간 동안 예비배양한 다음, 비드 또는 탐식된 비드에 부착되어 있는 세포의 자기 제거에 의해 결핍을 수행한다. 잔류하는 세포를 비조작된 세포와 함께 배양물에 유입한다. 당해 세포를 결핍 전후에 세포 표현형에 대한 유세포 측정법에 의해 특성화시킨다. 도 9는 단핵구의 부재하에서의 증가된 증식을 도시한다.
실시예 XI
활성화 전 및 활성화 후 동역학적 경시적 연구
전혈 또는 성분채집된 말초혈로부터 수득된 사람 T-세포를 각종 조건하에 배양하는 일련의 실험을 수행한다. 이들 조건은:
1) 자극 부재
2) 2㎍/ml의 파이토헤마글루티닌(PHA)로의 자극
3) 3:1 또는 1:1 비드:T-세포 비율로 3x28 Dynabeads(항-CD3 및 항-CD28 비드가 접합되어 있는 비드)로의 자극
4) 10U/ml(5ng/ml)로 외인적으로 첨가된 재조합 사람 IL-2의 존재 또는 부재하에서의 자극 또는 배양
5) 단핵구(CD14+탐식 세포)의 존재하에서의 배양 또는 각종 "무관한" Dynabeads를 사용한 자기 결핍에 의한 상기한 세포의 제거 후의 배양을 포함한다. 결핍을 실시예 2에 예시한 바와 같이 수행한다.
다음 세포 표면 마커: CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD25, CD45RA, CD45RO, CD54, CD62L, CDw137(41BB) 및 CD154를 유세포 측정법에 의해 분석한다. 또한, 세포 크기를 유세포 측정법을 통한 정방향 스캐터 프로파일에 의해 측정한 바와 같이 조사한다.
CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD45RA 및 CD45RO와 같은 마커를 사용하여, T, B 및 단핵구 계통 및 아집단을 결정하는 한편, 정방향 스캐터, CD25, CD62L, CD54, CD137 및 CD154를 사용하여, 세포의 활성화 상태 및 기능적 특성을 결정한다.
T-세포를 함유하는 사람 말초혈 림프구를 실시예 IX에 기술된 바와 같이 제조한다. 세포를 세포 표현형 및 활성화/기능적0 상태에 대해 경시적으로 분석한다. 상등액을 다시 분비된 사이토킨 분석을 위해 수집한다. 도 8 및 9는 +/- 10u/ml의 재조합 사람 IL-2 및 +/- 단핵구 결핍하에서의 3x28 비드를 사용한 활성화 이후의 전반적인 사람 T-세포의 증식 특성을 도시한다. 모든 세포를 박스터 라이프 라이프셀 플라스크(300ml)내에서 배양한다. "스케일 업"으로 명시된 한 플롯은 박스터 라이프셀 3리터들이 플라스크까지 증식되는 300ml 플라스크 배양물(IL-2 부재/단핵구 결핍)을 의미한다. 그래프는 다양한 조건하에서의 사람 T-세포의 약 2-4 대수 증식을 도시한다.
도 10은 경시적 정방향 스캐터 유세포 측정 프로파일에 의해 측정된 바와 같은 세포 크기의 동역학적 분석을 도시한다. T-세포는 활성화 직후 크기가 증가하고, 후속적으로 크기가 감소하여, 14일째 이들은 보다 고도의 휴지 상태를 제시하는 가장 작은 정방향 스캐터 프로파일을 나타낸다.
도 11은 3x28 비드 자극 후의 경시적 IL-2 수용체(CD25) 발현을 도시한다. CD4+및 CD8+T-세포 둘 다는 수용체 수준에서 초기 증가를 나타낸다. 14일째에, CD25 발현 수준은 대부분의 T-세포 상에서 크게 감소하며, 이는 보다 고도의 휴지 상태임을 지시한다.
3x28-자극된 T-세포가 보다 고도의 휴지 상태(낮은 CD25, 낮은 정방향 스캐터)로 될 경우에, 이들을 아래에 제시한 바와 같이 재자극한다:
1) 자극 부재
2) PHA 2ug/ml
3) 1개 비드/CD3+T-세포로 3x28(Xcellerate) 비드 자극.
다음, 세포 크기(정방향 스캐터), 표면 표현형, 활성화 마커 발현 및 사이토킨 분비의 동역학적 분석을 수행한다. 도 12는 1차 및 2차 자극 후의 정방향 스캐터(세포 크기) 동역학을 도시한다. 도 13은 1차 및 2차 자극 후의 CD25(IL-2 수용체) 발현 동역학을 도시한다. 도 16은 CD4+T-세포(A) 및 CD8+T-세포(B) 상에서의 2차 자극 후의 CD54(I-CAM) 발현을 도시하며, 여기서 1차 자극은 PHA 또는 CD3xCD28 비드이고, 재자극은 부재, PHA 또는 CD3xCD28 비드이다. CD4 및 CD8 포지티브 세포 사이를 도식하는 마커를 또한 사용하여, 3x28 항체 비드 활성화 동안 이들의 상대적 비율을 측정한다(도 19 및 22).
실시예 XII
공자극된 T-세포의 사이토킨 발현 패턴의 분석
IL-2, IFN-γ, TNF- 및 IL-4를 포함한 각종 사이토킨은 T-세포 유지, 증식 및 분화에 관련되기 때문에, 이들의 역할을 광범위하게 연구되었다. 특히, IL-2가 T-세포 유지 및 증식을 지지하는 것으로 제시되어 있다. IFN-γ는 T-세포를 TH1-유형 반응으로 분화하도록 구동시키는데 관련되는 한편, IL-4는 T-세포를 TH2-유형 반응에 대해 구동시키는데 관련된다. PHA 또는 CD3xCD28 비드에 의해 활성화된 1차 사람 T-세포에서의 사이토킨 방출 수준을 1차 자극에 대한 반응 및 2차 자극에 대한 반응의 동역학적 연구를 포함하여 실시예 IX에서와 같이 T-세포를 자극함으로써 분석한다. 도 18A-C 및 도 23-24에 제시된 데이터는 CD3xCD28 비드 자극의 독특한 특성을 입증한다. 최초 자극 후 2일째 및 4일째 사이에(1일째는 평가하지 않음), IL-2와 IFN-γ 둘 다에서 극히 높은 수준이 관찰된다. 절대 분비된 IL-2 수준에서의 거의 5배 증가가 PHA로 자극된 세포에 대해 관찰된 수준과 비교하여 3x28 비드-자극된 T-세포에 대해 관찰된다. 또한, IFN-γ 수준에서의 약 7배 증가가 이들의 PHA 대응물과 비교하여 3x28 자극된 T-세포에서 관찰된다. IL-4의 경우에, 1차 자극에 대한 증가는 현저하지 않다. 세포가 1차 자극 후에 정지 상태(상기한 3종의 사이토킨을 더 이상 분열하거나 분비하지 않음)로 된 후에, 이들을 CD3xCD28 비드, PHA로 재자극하거나, 자극하지 않은 상태로 두는 것이 흥미롭고, 아마 매우 중요하다. CD3xCD28 비드를 통한 최초 활성화/증식 시그널을 수신한 T-세포는 1차 자극 후에 관찰된 것보다 매우 높은 수준의 IFN-γ를 분비한다. 대조적으로, PHA로 최초에 자극된 세포는 이들의 3x28 대응물에 대해 관찰되는 것보다 훨씬 낮은 수준의 IFN-γ를 분비한다. 유사한 차이는 IL-4 수준에 대해서도 관찰된다.
이들 데이터는 CD3xCD28 비드를 통해 매개된 활성화/증식 후에 수득된 세포가 증식의 다른 수단, 예를 들어, PHA로부터 수득된 것과는 기능적으로 상이하다는 것을 제시한다. 생성된 세포를 TH1-유형 프로파일(IFN-γ)의 가능한 선호도를 갖는 TH1및 TH2사이토킨의 매우 높은 수준을 촉진하는 변형된 사이토킨 분비 반응을 갖는 것으로 보인다. 배양물에서의 고수준의 사이토킨의 분비는 항-종양 및 항-바이러스 반응에 유리한 T-세포의 TH1분화 경로로의 구동을 포함하고, 또한 생성된 T-세포의 기본적 기능성을 변형함으로써(예를 들어, 활성화 역치를 낮추고 프로그래밍된 세포 사멸 경로를 저해함) 다수의 효과를 가질 수 있다.
실시예 XIII
공자극된 T-세포의 CD54 발현의 분석
도 16은 CD4+T-세포(A) 및 CD8+T-세포(B) 상에서의 2차 자극 후의 CD54(I-CAM) 발현을 도시하며, 여기서 1차 자극은 PHA 또는 CD3xCD28 비드이고, 재자극은 부재, PHA 또는 CD3xCD28 비드이다.
실시예 XIV
단기간 활성화 마커 검정
마커 발현을 실시예 IX에 기재한 바와 같은 T-세포의 자극 후에 여러 시간에 걸쳐 모니터링한다. 이와 관련하여, 세포를 항-사람 CD4(Immunotech, Fullerton, CA), FITC-커플링된 항-사람 CD11a(Pharmingen), FITC-커플링된 항-사람 CD26(Pharmingen), FITC-커플링된 항-사람 CD49d(Pharmingen), FITC-커플링된 항-사람 CD54(Pharmingen 및 Becton Dickinson), FITC-커플링된 항-사람 CD95(Pharmingen), FITC-커플링된 항-사람 CD134(Pharmingen), FITC-커플링된 항-사람 CD25 Ab(Becton Dickinson, Fullerton, CA), FITC-커플링된 항-사람 CD69 Ab(Becton Dickinson), FITC- 또는 PE-커플링된 항-사람 CD154 Ab(Becton Dickinson), 또는 FITC-또는 PE-커플링된 IgG1 아이소타입 대조 Ab로 표지시킨다. 2x105개 세포를 각각의 항체 2㎕를 사용하여 최종 용적 30㎕로 4℃에서 20분 동안 표지시키고, 세척하고, 1% 파르포름알데히드(Sigma, St. Louis, MO)에 재현탁시킨다. 도 21-22 및 26A-26L을 참조하며, 이들 도면에는 CD4+및 CD8+세포 사이에서뿐만 아니라 활성화 시간에 대하여 유이한 차이를 나타내는 것으로 도시된다.
상기한 바로부터, 본 발명의 구체적 양태가 예시의 목적으로 본원에 기술되어 있더라도, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양하게 변형할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의한 것을 제외하고는 한정되지 않는다. 위에서 언급한 모든 참고문헌, 특허, 특허원 등은 이들 전체 내용이 본원에 인용되어 있다. 또한, 본원에 인용된 모든 수치 범위는 이들 범위내의 모든 정수값을 명시적으로 포함한다.

Claims (171)

  1. (a) 적어도 일부가 T-세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계,
    (b) 당해 세포 집단을 T-세포의 적어도 일부의 세포 표면부를 연결하고 T-세포의 적어도 일부를 자극하는 1종 이상의 제제가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계 및
    (c) T-세포 농축 및 T-세포 표면부 연결을 탁월하게 구동시키는 힘을 적용시켜, T-세포 자극을 유도하는 단계를 포함하는,
    동시 T-세포 농축 및 세포 표면부 연결에 의해 T-세포 집단을 자극하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표면에 부착되어 T-세포의 제1 세포 표면부를 연결하는 제1 제제 및 동일한 표면 또는 제2의 표면에 부착되어 T-세포의 제2 표면부를 연결하는 제2 제제에 의한 연결이 T-세포의 증식을 유도하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 표면이 생체적합성인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 표면이 천연 또는 합성인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 표면이 중합체를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 표면이 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 폴리사카라이드, 글리코사미노글리칸 및 세포외 매트릭스 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 폴리사카라이드가 키토산, 알기네이트, 덱스트란, 히알루론산 및 셀룰로스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 중합체가 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리에테르, 다가무수물, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리비닐아세테이트, 블럭 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 및 폴리우레탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 중합체가 락트산을 포함하는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 중합체가 공중합체인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 공중합체가 락트산 및 글리콜산(PLGA)을 포함하는 방법.
  12. 제3항에 있어서, 생체적합성 표면이 생체분해성인 방법.
  13. 제3항에 있어서, 생체적합성 표면이 비-생체분해성인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 비-생체분해성 물질이 폴리(디메틸실록산) 및 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는 방법.
  15. 제3항에 있어서, 생체적합성 표면이 콜라겐, 금속, 하이드록시아파타이트, 유리, 알루미네이트, 바이오세라믹재, 히알루론산 중합체, 알기네이트, 아크릴산 에스테르 중합체, 락트산 중합체, 글리콜산 중합체, 락트산/글리콜산 중합체, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드 및 세포외 매트릭스 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제3항에 있어서, 생체적합성 표면이 이식형 장치와 결합되어 있는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 장치가 스텐트, 카테터, 섬유, 중공 섬유, 패취 및 봉합사로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  18. 제4항에 있어서, 표면이 유리, 실리카, 실리콘, 콜라겐, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔, PTFE, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론 및 폴리아크릴아미드로이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. 제4항에 있어서, 표면이 지질, 플레이트, 디쉬, 백, 로드, 펠렛, 섬유 및 메쉬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  20. 제4항에 있어서, 표면이 입자인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 입자가 비드, 미세구체, 나노입자 및 콜로이드 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 비드의 직경이 약 5나노미터 내지 약 500마이크론인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 제제가 단백질 리간드, 천연 리간드 및 합성 리간드로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제제가 항체, 항체 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 수용체, 스테로이드, 호르몬, 미토겐(mitogen), 항원, 초항원, 성장 인자, 사이토킨, 렉틴, 바이러스 단백질, 유착 분자 및 케모킨으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 1종 이상의 제제가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 제1 제제가 항체 및 이의 단편이고, 제2 제제가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 제1 제제 및 제2 제제가 상이한 항체인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 제1 제제가 항-CD3 항체, 항-CD2 항체, 또는 항-CD3 항체 또는 항-CD2 항체의 항체 단편인 방법.
  29. 제24항 또는 제27항에 있어서, 제2 제제가 항-CD28 항체 또는 이의 항체 단편인 방법.
  30. 제24항 또는 제27항에 있어서, 제2 제제가 CD28에 대한 천연 리간드인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 천연 리간드가 B7-1 또는 B7-2를 포함하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 힘이 중력보다 큰 힘, 유압력, 막통과압에 의해 발생된 여과력, 원심력 및 자기력으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 자기력이 자성체 표면에서 약 200가우스 내지 약 12,000가우스 범위의 자기장을 갖는 자성체에 의해 발생되는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 표면이 상자성 입자의 표면인 방법.
  35. 제1항에 있어서, 표면에의 제제의 부착이 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성인 방법.
  36. 제1항에 있어서, 연결되어 있는 T-세포를 연결되어 있지 않은 T-세포로부터 분리하는 방법.
  37. 제1항에 있어서, T-세포가 면역 반응 기능장애를 경감시키는 방법.
  38. (a) T-세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계,
    (b) 당해 세포 집단을 세포 표면부에 특이적인 1종 이상의 리간드가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계,
    (c) T-세포 및 표면의 농축을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계 및
    (d) 당해 세포를 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하여,
    동시 세포 표면부 연결 및 T-세포 응집에 의해 T-세포를 자극하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간이 1분 내지 8일인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간이 1일 내지 5일인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 표면이 생체적합성인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 표면이 천연 또는 합성인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 표면이 유리, 실리카, 실리콘, 콜라겐, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔, PTFE, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론, 덱스트란 및 폴리아크릴아미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  44. 제38항에 있어서, 표면이 플레이트, 디쉬, 백, 로드, 펠렛, 섬유 및 메쉬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  45. 제38항에 있어서, 표면이 입자인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 입자가 비드, 미세구체, 나노입자 및 콜로이드 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 비드의 직경이 약 5나노미터 내지 약 500마이크론인 방법.
  48. 제38항에 있어서, 리간드가 단백질, 천연 리간드 및 합성 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  49. 제38항에 있어서, 리간드가 항체, 항체 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 가용성 수용체, 스테로이드, 호르몬, 미토겐, 항원, 리간드, 초항원, 성장 인자, 사이토킨, 렉틴 및 케모킨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 1종 이상의 리간드가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 2종 이상의 리간드가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 2종 이상의 리간드가 존재하고, 상이한 항체 또는 이의 단편인 방법.
  53. 제49항에 있어서, 1종 이상의 리간드가 항-CD3 항체, 항-CD2 항체, 또는 항-CD3 항체 또는 항-CD2 항체의 항체 단편인 방법.
  54. 제49항 또는 제53항에 있어서, 1종 이상의 리간드가 항-CD28 항체 또는 이의 항체 단편인 방법.
  55. 제49항 또는 제53항에 있어서, 1종 이상의 리간드가 CD28에 대한 천연 리간드인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 천연 리간드가 B7-1 또는 B7-2를 포함하는 방법.
  57. 제38항에 있어서, 힘이 중력보다 큰 힘, 유압력, 막통과압에 의해 발생된 여과력, 원심력 및 자기력으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 자기력이 자성체 표면에서 약 200가우스 내지 약 12,000가우스 범위의 자기장을 갖는 자성체에 의해 발생되는 방법.
  59. 제38항에 있어서, 표면이 상자성 입자의 표면인 방법.
  60. 제38항에 있어서, 표면에의 리간드 부착이 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성인 방법.
  61. 제38항에 있어서, 단계(d) 전에 또는 이와 동시에, 표면을 사용하여 농축시킨 T-세포를 비-농축된 세포로부터 분리함을 추가로 포함하는 방법.
  62. T-세포 활성화를 유도하는 T-세포 표면부에 특이적인 리간드가 부착되어 있는 상자성 입자를 동물에게 제공하고, 자기장을 동물의 별개의 부위에 적용시키고, 이에 의해 별개의 부위에서 당해 입자에 결합되어 있는 T-세포의 국재화 및 활성화를 유도함을 포함하여, 생체내 T-세포 활성화를 유도하기에 적합한 방법.
  63. (a) 적어도 일부가 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계,
    (b) 당해 세포 집단을 표적 세포의 적어도 일부의 세포 표면부를 연결하고 표적 세포의 적어도 일부를 자극하는 1종 이상의 제제가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계 및
    (c) 표적 세포 농축 및 표적 세포 표면부 연결을 탁월하게 구동시키는 힘을 적용시켜, 표적 세포 자극을 유도하는 단계를 포함하여,
    동시 표적 세포 농축 및 표적 세포 표면부 연결에 의해 표적 세포 집단을 자극하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 표면에 부착되어 표적 세포의 제1 세포 표면부를 연결하는 제1 제제 및 동일한 표면 또는 제2의 표면에 부착되어 표적 세포의 제2 표면부를연결하는 제2 제제에 의한 연결이 표적 세포내에서의 시그널 전달을 유도하는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 표면이 생체적합성인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 표면이 천연 또는 합성인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 표면이 중합체를 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 표면이 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 폴리사카라이드, 글리코사미노글리칸 및 세포외 매트릭스 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 폴리사카라이드가 키토산, 알기네이트, 덱스트란, 히알루론산 및 셀룰로스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  70. 제67항에 있어서, 중합체가 폴리에스테르, 폴리에테르, 다가무수물, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리비닐아세테이트, 블럭 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 및 폴리우레탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 중합체가 락트산을 포함하는 방법.
  72. 제67항에 있어서, 중합체가 공중합체인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 공중합체가 락트산 및 글리콜산(PLGA)을 포함하는 방법.
  74. 제65항에 있어서, 생체적합성 표면이 생체분해성인 방법.
  75. 제65항에 있어서, 생체적합성 표면이 비-생체분해성인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 비-생체분해성 물질이 폴리(디메틸실록산) 및 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는 방법.
  77. 제65항에 있어서, 생체적합성 표면이 콜라겐, 금속, 하이드록시아파타이트, 생체유리, 알루미네이트, 바이오세라믹재, 히알루론산 중합체, 알기네이트, 아크릴산 에스테르 중합체, 락트산 중합체, 글리콜산 중합체, 락트산/글리콜산 중합체, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드 및 세포외 매트릭스 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  78. 제65항에 있어서, 생체적합성 표면이 이식형 장치와 결합되어 있는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 장치가 스텐트, 카테터, 섬유, 중공 섬유, 패취 및 봉합사로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  80. 제66항에 있어서, 표면이 유리, 실리카, 실리콘, 콜라겐, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔, PTFE, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론 및 폴리아크릴아미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  81. 제66항에 있어서, 표면이 지질, 플레이트, 디쉬, 백, 로드, 펠렛, 섬유 및 메쉬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  82. 제66항에 있어서, 표면이 입자인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 입자가 비드, 미세구체, 나노입자 및 콜로이드 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 비드의 직경이 약 5나노미터 내지 약 500마이크론인 방법.
  85. 제63항에 있어서, 제제가 단백질 리간드, 천연 리간드 및 합성 리간드로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 제제가 항체, 항체 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 수용체, 스테로이드, 호르몬, 미토겐, 항원, 초항원, 성장 인자, 사이토킨, 렉틴, 바이러스 단백질, 유착 분자 및 케모킨으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 1종 이상의 제제가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  88. 제86항에 있어서, 제1 제제가 항체 및 이의 단편이고, 제2 제제가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  89. 제86항에 있어서, 제1 제제 및 제2 제제가 상이한 항체 또는 이의 단편인 방법.
  90. 제63항에 있어서, 힘이 중력보다 큰 힘, 유압력, 막통과압에 의해 발생된 여과력, 원심력 및 자기력으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  91. 제32항에 있어서, 자기력이 자성체 표면에서 약 200가우스 내지 약 12,000가우스 범위의 자기장을 갖는 자성체에 의해 발생되는 방법.
  92. 제63항에 있어서, 표면이 상자성 입자의 표면인 방법.
  93. 제63항에 있어서, 표면에의 제제의 부착이 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성인 방법.
  94. (a) 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계,
    (b) 당해 세포 집단을 세포 표면부에 특이적인 1종 이상의 리간드가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계,
    (c) 표적 세포의 농축 및 당해 표면에서의 당해 세포의 농축을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계 및
    (d) 당해 세포를 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하여,
    세포 표면부 연결 및 표적 세포 농축에 의해 표적 세포를 자극하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간이 약 1분 내지 약 30일인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 목적하는 자극을 달성하기에 충분한 시간이 약 1일 내지약 5일인 방법.
  97. 제94항에 있어서, 표면이 생체적합성인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 표면이 천연 또는 합성인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 표면이 유리, 실리카, 실리콘, 콜라겐, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔, PTFE, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론, 덱스트란 및 폴리아크릴아미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  100. 제94항에 있어서, 표면이 플레이트, 백, 디쉬, 로드, 펠렛, 섬유 및 메쉬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  101. 제94항에 있어서, 표면이 입자인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 입자가 비드, 미세구체, 나노입자 및 콜로이드 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 비드의 직경이 약 5나노미터 내지 약 500마이크론인 방법.
  104. 제94항에 있어서, 리간드가 단백질, 천연 리간드 및 합성 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  105. 제94항에 있어서, 리간드가 항체, 항체 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 수용체, 스테로이드, 호르몬, 미토겐, 항원, 리간드, 초항원, 성장 인자, 사이토킨, 렉틴 및 케모킨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 1종 이상의 리간드가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  107. 제105항에 있어서, 2종 이상의 리간드가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  108. 제105항에 있어서, 2종 이상의 리간드가 존재하고, 상이한 항체 또는 이의 단편인 방법.
  109. 제63항 또는 제94항에 있어서, 표적 세포가 T-세포, B-세포 및 간세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  110. 제94항에 있어서, 힘이 중력보다 큰 힘, 유압력, 막통과압에 의해 발생된 여과력, 원심력 및 자기력으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 자기력이 자성체 표면에서 약 200가우스 내지 약 12,000가우스 범위의 자기장을 갖는 자성체에 의해 발생되는 방법.
  112. 제94항에 있어서, 표면이 상자성 입자의 표면인 방법.
  113. 제94항에 있어서, 표면에의 리간드 부착이 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성인 방법.
  114. 제94항에 있어서, 단계(d) 전에 또는 이와 동시에, 농축시킨 표적 세포를 비-농축된 세포로부터 분리함을 추가로 포함하는 방법.
  115. 표적 세포 자극을 유도하는 표적 세포 표면부에 특이적인 리간드가 부착되어 있는 상자성 입자를 동물에게 제공하고, 자기장을 동물의 별개의 부위에 적용시키고, 이에 의해 별개의 부위에서 당해 입자에 결합되어 있는 표적 세포의 국재화 및 자극을 유도함을 포함하여, 생체내 표적 세포 자극을 유도하는 방법.
  116. (a) 세포 집단을 제공하는 단계,
    (b) 당해 세포 집단을 당해 세포 집단의 적어도 일부에 존재하는 세포 표면 수용체에 특이적인 1종 이상의 리간드가 부착되어 있는 고체 표면과 접촉시키는 단계 및
    (c) 세포 농축 및 세포 표면 수용체 연결을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계를 포함하여,
    수용체 보유 세포내에서 수용체 분극화를 유도하는 방법.
  117. (a) 표적 세포 표면 분자를 갖는 세포 집단을 제공하는 단계,
    (b) 당해 세포 집단을 1종 이상의 표적 세포 표면 분자에 대한 리간드가 부착되어 있는 고체 표면과 접촉시키는 단계 및
    (c) 표적화 세포 표면 분자의 응집을 구동시키는 힘을 적용시키는 단계를 포함하여,
    세포 표면 분자의 응집을 유도하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 세포 집단이 림프구를 포함하는 방법.
  119. 제116항 또는 제117항에 있어서, 고체 표면이 플레이트, 백, 디쉬, 로드, 펠렛, 섬유, 미세구체 및 비드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  120. 제116항 또는 제117항에 있어서, 리간드가 항체, 천연 리간드 및 합성 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 리간드가 항체, 펩타이드, 폴리펩타이드, 성장 인자, 사이토킨 또는 케모킨을 포함하는 방법.
  122. 제116항 또는 제117항에 있어서, 힘이 중력보다 큰 힘, 유압력, 막통과압에 의해 발생된 여과력, 원심력 및 자기력으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 자기력이 자성체 표면에서 약 200가우스 내지 약 12,000가우스 범위의 자기장을 갖는 자성체에 의해 발생되는 방법.
  124. 제116항 또는 제117항에 있어서, 고체 표면이 상자성인 방법.
  125. 제116항 또는 제117항에 있어서, 수용체 결합이 세포 이벤트의 하향 조절 또는 억제를 유도하는 방법.
  126. 제116항 또는 제117항에 있어서, 수용체 결합이 세포 이벤트의 상향 조절 또는 활성화를 유도하는 방법.
  127. 제116항에 있어서, 세포 이벤트가 수용체 매개된 시그널 전달인 방법.
  128. 제94항에 있어서, 힘이 세포 표면부의 농축 또는 배향을 구동시키는 방법.
  129. T-세포를 활성화 시그널을 제공하는 제1 제제 및 공자극 시그널을 당해 T-세포에 제공하는 제2 제제가 고정화되어 있는 고체 표면과 약 2시간 내지 약 9일의 시간 동안 접촉시킴을 포함하여, T-세포 집단의 증식을 유도하는 방법.
  130. 제129항에 있어서, 접촉 시간이 약 2시간 내지 약 48시간인 방법.
  131. 제130항에 있어서, 접촉 시간이 약 2시간 내지 약 12시간인 방법.
  132. 제129항에 있어서, 접촉 시간이 약 2일 내지 약 8일인 방법.
  133. 제129항에 있어서, 접촉 시간이 약 3일 내지 약 6일인 방법.
  134. 제129항에 있어서, 제1 제제 및 제2 제제가 동일한 고체 표면에 고정화되어 있는 방법.
  135. 제134항에 있어서, 고체 표면이 평면, 불규칙 표면 및 구면으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  136. 제129항에 있어서, 고체 표면이 비드인 방법.
  137. 제135항에 있어서, 불규칙 표면이 플라스틱 표면인 방법.
  138. 제129항에 있어서, 제1 제제가 CD3에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 제2 제제가 CD28에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 방법.
  139. 제129항 내지 제138항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 제조된 T-세포 집단.
  140. 제139항에 따르는 T-세포 집단 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  141. a. T-세포를 직경이 약 20마이크론 내지 약 1밀리미터인 비드에 고정화되어 있는 제1 제제와 접촉시킴으로써 T-세포 집단을 활성화시키는 단계 및
    b. T-세포의 표면 상의 보조 분자를 비드에 고정화되어 있으며 보조 분자에 결합하는 제2 제제로 자극하여, T-세포의 증식을 유도하는 단계를 포함하여,
    T-세포 집단의 증식을 유도하는 방법.
  142. 제141항에 있어서, 비드의 입자가 약 80마이크론 내지 약 500마이크론인 방법.
  143. 제142항에 있어서, 비드의 입자가 약 100마이크론 내지 약 400마이크론인 방법.
  144. 제143항에 있어서, 비드의 입자가 약 250마이크론 내지 약 300마이크론인 방법.
  145. 제141항 내지 제144항 중의 어느 한 항에 있어서, 비드가 상자성 비드인 방법.
  146. 제141항에 있어서, 제1 제제가 항-CD3 항체를 포함하고, 제2 제제가 항-CD28 항체를 포함하는 방법.
  147. 제146항에 있어서, T-세포 집단이 헬퍼 T-세포를 포함하는 방법.
  148. 제141항 내지 제144항 중의 어느 한 항에 있어서, 비드를 여과에 의해 T-세포로부터 분리함을 추가로 포함하는 방법.
  149. 제148항에 있어서, 제1 제제가 항-CD3 항체를 포함하고, 제2 제제가 항-CD28 항체를 포함하는 방법.
  150. 제149항에 있어서, T-세포 집단이 헬퍼 T-세포를 포함하는 방법.
  151. 세포의 1종 이상의 서브세트가, CD154 수준이 자극 후 약 1일 내지 약 4일 사이에 최대인 표현형을 갖는 활성화 T-세포 집단.
  152. CD4+T-세포를 약 60% 이상 포함하는 활성화 T-세포 집단.
  153. CD4+T-세포를 약 70% 이상 포함하는 활성화 T-세포 집단.
  154. 항-CD3 및 항-CD28 항체 또는 이의 단편과 약 2시간 내지 약 9일 동안 접촉시킴으로써 증식하도록 미리 자극되어 있는 활성화 T-세포 집단.
  155. 제154항에 있어서, 접촉 기간이 약 4시간 내지 약 8일인 집단.
  156. 제154항에 있어서, 접촉 기간이 약 4시간 내지 약 8일인 집단.
  157. T-세포를, 고정화되어 있는, 활성화 시그널을 제공하는 제1 제제 및 공자극 시그널을 T-세포에 제공하는 제2 제제와 약 2시간 내지 약 9일의 기간 동안 접촉시킴으로써 증식하도록 미리 유도되어 있는 활성화 T-세포 집단.
  158. 제157항에 있어서, T-세포가 1차 및 2차 시그널 활성화 후 약 2일 내지 약 7일 사이에 최대 인터류킨-4 수준을 생성시키는 집단.
  159. 제157항에 있어서, T-세포가 1차 및 2차 시그널 활성화 후 약 2일 내지 약 7일 사이에 최대 인터류킨-2 수준을 생성시키는 집단.
  160. 제157항에 있어서, T-세포가 1차 및 2차 시그널 활성화 후 약 2일 내지 약 7일 사이에 최대 종양 괴사 인자-알파 또는 인터페론-감마 수준을 생성시키는 집단.
  161. 제151항 내지 제160항 중의 어느 한 항에 따르는 T-세포 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  162. T-세포 및 단핵구를 포함하는 현탁액을 직경이 약 2.8㎛ 내지 약 10㎛인 상자성 비드와 접촉시키고, 후속적으로 단핵구를 자기 인력에 의해 현탁액으로부터 분리함을 포함하여, T-세포 및 단핵구를 포함하는 현탁액으로부터 단핵구를 결핍시키는 방법.
  163. 제162항에 있어서, 현탁액이 전혈 세포 현탁액인 방법.
  164. 제162항 또는 제163항에 있어서, 비드에 1종 이상의 항체가 부착되어 있는 방법.
  165. 제164항에 있어서, 항체가 비특이적 항체인 방법.
  166. 제161항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 종양을 치료하는 방법.
  167. 제166항에 있어서, 투여 전에 환자에서 내인성 림프구를 결핍시키는 방법.
  168. 제166항에 있어서, T-세포가 활성화 전의 환자로부터 유래되는 방법.
  169. 제166항에 있어서, T-세포 집단에서 단핵구가 결핍되어 있는 방법.
  170. T-세포 자극 후에 1일 내지 4일 사이에 유세포 측정법에 의해 측정된 CD154 발현 수준이 동시 농축 및 자극의 부재하에 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극된 T-세포보다 10% 이상 더 높은 수준인 자극된 T-세포 집단.
  171. T-세포 자극 후에 1일 내지 4일 사이에 유세포 측정법에 의해 측정된 CD25발현 수준이 동시 농축 및 자극의 부재하에 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극된 T-세포보다 10% 이상 더 높은 수준인 자극된 T-세포 집단.
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