JPH05501612A - 胎児ｄｎａ単離および検出のための非侵入性方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 胎児ＤＮＡ単離および検出のための非侵入性方法ここに記述する研究は、Ｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　ＨｅａｌｔｈおよびＣｈｉｌｄｒｅ ｎ’　ｓ　［Ｉｏｓｐｆｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒによって支持さ れた。

背景 種々の胎児細胞型（血小板、栄養芽層、赤血球および白血球）は、胎盤を横切り 、そして母親の血液内に転移するように循環する（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ。

Ｊ９、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｇｅｎｅｔ、、１２：２３０−２４２　（１９７５）； 　Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｇ、　ｆ、他、Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃ 、、７８：９６０−９７３　（１９５９））、母親の血液中に存在している母親 細胞から胎児細胞を分離する試みに関する数多くの報告が成されているが、その 結果として、胎児のＤＮＡを含んでいることを示さす細胞を単離する点では、い かなる報告も成功していない。母親細胞から胎児細胞を区別することは、いくつ かの理由のため成功しなかった。その理由のいくつかには次のものが含まれる： 母親の血液サンプル中に存在している胎児細胞の数が少ないこと、そして形態学 上の差が小さいこと（例えば、形態学単独で母親細胞から区別することができる ただ１つの胎児細胞は、栄養芽層である）。

胎児が元となる細胞に関して、妊娠した女性の末梢血液をスクリーニングするこ とを、他の研究書違が報告している。胎児の同定は、単一細胞発生マーカー、即 ちＹ染色体の存在に依存していた。１４週という早い懐妊状態の母親の循環系中 に、推定のｒＸＹＪ核型を有するリンパ球が見いだされた（Ｗａｌｋｎｏｗｓｋ ａ、　Ｊ、他、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、１１１９−１１２２　（１９７９））。

フロー血球計算法が利用できるようになったことから、フロー血球計算器を用い ることで胎児細胞が得られるのではないか、そして出生前遺伝診断のために上記 細胞が利用できるのではないか、と多くの人が考えるようになった。しかしなが ら、この方式で種類分けされた細胞は、細胞表面抗原の分析、形態学、または細 胞発生判断基準を基にして、胎児を元とするものであるとされたが、これらの細 胞が胎児ＤＮＡを含んでいることは立証されなかった。妊娠中の母親の血液から 胎児ＤＮＡを得るための方法は、もしそれによって、非侵入性技術による出生前 診断を行うことが可能になるならば、特に価値あることである。

発明の開示 本発明は、妊娠した女性の血液中に存在している胎児ＤＮＡを母親のＤＮＡから 分離もしくは単離するインビトロ方法、並びに非侵入性出生前診断または分析方 法として有効な、胎児ＤＮＡ存在の検出および／または胎児ＤＮＡ中の選択胎児 ＤＮＡの定量、に関するインビトロ方法である。

本方法において、胎児の被形した成細胞には結合するが母親の細胞には結合しな い検出可能材料によって、母親の血液サンプルから胎児の核形成細胞を単離した 後、これをその母親サンプルから分離し、その結果として該サンプルからの該胎 児核形成細胞の分離をもたらす。この胎児の核形成細胞は、いかなる未分化の造 血細胞であってもよく、詳細には、胎児の核形成赤血球である。単離に関する本 方法の１つの具体例において、胎児の核形成細胞上に存在している抗原に特異的 であるが、母親細胞上に存在している抗原には特異的でないところの、少なくと も１つの検出可能標識モノクローナル抗体を、母親の血液サンプルと混合し、そ して胎児の核形成細胞と結合させた後、これを該母親サンプルから分離する。二 者択一的に、母親細胞上に存在している抗原に特異的であるが、胎児の核形成細 胞上に存在している抗原には特異的でないところの、少な（とも１つの検出可能 標識モノクローナル抗体を用いる。更に一層の具体例において、２つの種類のモ ノクローナル抗体を用いる。

検出可能標識が蛍光分子である場合、フロー血球計算法により分離を行い、ここ では、蛍光標識した分子を未標識の分子から分離する。これにより、母親細胞か らの、胎児の核形成細胞、例えば胎児の核形成赤血球の分離、従って母親ＤＮＡ からの胎児ＤＮＡの分離が生じる。この分離が生じたことは、公知の技術、例え ば胎児ヘモグロビンの顕微鏡法もしくは検出などによって確認できる。

胎児ＤＮＡ中の選択ＤＮＡ配列もしくは配列類（遺伝子（類）もしくは遺伝子部 分（類））の存在を測定（検出および／または定量）するための本発明方法の１ つの具体例において、この単離した胎児核形成細胞、例えば胎児核形成赤血球、 を処理することで、そこに存在しているＤＮＡを増幅可能にする。胎児核形成細 胞から得られるＤＮＡ　（胎児ＤＮＡ）の増幅は、公知の増幅技術、例えばポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行う。増幅させた胎児核形成細胞ＤＮＡを 次に、大きさを基準にして分離しく例えばゲル電気泳動法により）、そして選択 した標識プローブ、例えば選択ＤＮＡ配列に相補性を示す標識ＤＮＡ　（例えば 、異常遺伝子もしくは遺伝子部分に相補性を示すか、或はＹに特異的なりＮＡ） に接触させる。胎児ＤＮＡに標識プローブをハイブリッド形成させた後の標識プ ローブの検出により、該胎児ＤＮＡ中の興味の持たれている配列の検出が得られ る。このハイブリッド形成させた標識プローブの定量により、該胎児ＤＮＡの定 量が得られる。

選択したＤＮＡ配列（または配列類）が存在していることを測定する本方法の２ 番目の具体例において、上述した如く単離した細胞を、固体状支持体（例えばス ライド）上に選別した後、インサイチュ−のハイブリッド形成を用いて染色体の 異常をスクリーニングする。この具体例において、選択した核酸プローブ、例え ば先天性異常に関係した染色体ＤＮＡのための標識ＤＮＡプローブと、該胎児Ｄ ＮＡとを、相補配列のハイブリッド形成が生じるに適当な条件下で混合する。ハ イブリッド形成後の標識プローブの検出および／または定量により、このプロー ブがハイブリッド形成した該胎児ＤＮＡの検出および／または定量が得られる。

選択した胎児ＤＮＡの存在を検出する本方法は、出生前の評価もしくは診断目的 、例えば胎児の性の決定、染色体異常の検査、並びに人の病気に関連した異常遺 伝子の存在に関する測定など、に有効である。

胎児の核形成赤血球を単離するための本発明の方法に関する特別な利点は、母親 を元とする細胞から上記細胞が確実に単離できることである。

更に、上記細胞は核形成されているため、従ってこれらは胎児遺伝子の充分な補 体を含んでいるため、本方法は、完全な胎児ＤＮＡの利用を可能にする。選択さ れた胎児ＤＮＡ配列を検出および／または定量する本方法は、胎児細胞を単離す る本方法に関連した利点のためばかりでなく、これは懐妊の初期に適用できる非 侵入性技術であることのため、特に価値あるものである。

図の簡単な説明 図１は、母親の細胞から胎児核形成細胞を単離し、そしてこの胎児細胞内のＤＮ Ａを、特別な胎児ＤＮＡ配列が存在していることに関して評価する、本発明の方 法に関する図式的表示である。

図２は、２２２ｂｐ配列に関して増幅させた希釈男性ＤＮＡのオートラジオグラ フである。レーン１：試薬対照、レーン２：φＸ１７４分子量標準、レーン３　 ：　１１００ｎ、レーン４：１０ｎｇ、レーン５：１ｎｇ。

レーン６　：　２００ｐｃｇ、レーン７：１０ｐｃｇ、レーン８：１ｐｃｇ０図 ３は、増幅させた患者ＤＮＡの複合オートラジオグラフである。レーン１　：　 １０ｎｇ正常男性、レーン２　：　１０ｎｇ正常女性、レーン３：試薬対照、レ ーン４：φｘ１７４、レーン５：患者１から選別した細胞（男性胎児）、レーン ６：患者２から選別した細胞（男性胎児）、レーン７：患者３から選別した細胞 （女性胎児）、レーン８：患者６から選別した細胞（女性胎児）、レーン９：患 者７から選別した細胞（男性胎児）、レーン１０：患者８から選別した細胞（男 性胎児）、レーン１１：患者９から選別した細胞（女性胎児）、レーン１２：レ ーン８で出生前に細胞を選別した女乳児から得たへその緒血液。

図４は、男児妊娠女性における種々の懐妊点でのＹ染色体ＤＮＡ配列の検出を示 す図である。

図５は、男性細胞を加えた、妊娠していない女性から得たサンプル中に、単核細 胞が存在しているか否かを測定するためにＦＩＴＣ抗トラシトランスフェリンレ セプタたとき得られた、一連のヒストグラム（Ａ−Ｆ）である。

図６は、妊娠していない女性から得たサンプルに１０”−１０’個の男性細胞を 加えたときのＴｆＲ”ｍ泡中、並びに妊娠していない女性から得たサンプルに１ ０’−１，０’個の男性細胞を加えたときのＴｆＲ−細胞中、で検出した、増幅 させた男性ＤＮＡの複合オートラジオグラフである。

図７は、男性細胞を加えた、妊娠していない女性から得たサンプル中に、単核細 胞が存在しているか否かを測定するために抗ｔｌＰｃＡ−１抗体を用いたとき得 られた、一連のヒストグラム（Ａ−Ｈ）である。

図８は、胎児の核形成赤血球にＹ染色体用ｐＤＰ９７プローブをインサイチュ− でハイブリッド形成させたときの陽性結果に帰すべき蛍光細胞を説明する写真で ある。

発明の詳細な記述 本発明は、妊娠した女性の細胞から、妊娠した女性の血液（母親の血液サンプル ）中に存在している胎児の核形成した細胞を分離もしくは単離し、そして母親の ＤＮＡから胎児ＤＮＡを分離もしくは単離するインビトロ方法に関する。本発明 は更に、該母親血液サンプルから単離した胎児ＤＮＡ中の選択胎児ＤＮＡを出生 前検出および／または定量するためのインビトロ方法に関する。本方法は、胎児 ＤＮＡ、例えば懐妊中の評価が望まれている病気もしくは状態に関連したＤＮＡ 、を検出および／または定量するための非侵入性方法を提供するものである。本 発明はまた、胎児の性を決定するための非侵入性手段を提供するものである。

以下は、本主題方法の基礎となる記述であり、そしてこれらは、妊娠した女性の 血液中に存在している核形成した胎児細胞を母親の細胞から単離し、続いて、胎 児ＤＮＡを母親ＤＮＡから分離する本方法、並びに胎児細胞中に選択ＤＮＡが存 在しているか否かを出生前に決定（存在の有り無しもしくは定量）する本方法に 関する。

胎児遺伝子の可能源としての核形成赤血球妊娠した女性の血液中に存在している 胎児核形成細胞は胎児遺伝子の源となることをここに見い出した。即ち、胎児の 核形成した赤血球（胎児ＮＲＢＣとも呼ぶ）が母親の血液から単離もしくは分離 でき、そしてこの単離した胎児細胞中に存在しているＤＮＡを用いて胎児の特性 （例えば性、染色体異常の有り無し）を評価することができることが示された。

下記の理論的解釈を基とする選別に関して、胎児核形成赤血球を選択した。

１、　与えられたいかなる胎児から母親への（ｆｅｔｏ■ａｔｅｒｎａｌ）出血 に関して、いかに少な（とも、胎児リンパ球に対する胎児赤血球の比率は、胎児 全血中と同じままであるべきである。従って、分析で利用できる白血球の１．０ ００倍から成る赤血球が存在しているものとする。

２、　正常な妊娠女性は、通常、循環しているＮＲＢＣを有していない。従って 、起源に関して、単離されたＮＲＢＣは先天的に胎児のものである可能性が高い こと。

３、　妊婦の大部分は血液型適合性を示す、即ちこれは、「血液浸透した（ｔｒ ａｎｓｆｕｓｅｄ）　Ｊ　ＮＲＢＣは、恐らくは、その母親にとって耐えられる ものであり、そして彼女の循環系中に存在していることを意味している。

４、これらは核形成したものであるため、このＮＲＢＣは、胎児遺伝子の全補体 を含んでいる。

胎児細胞選別に応用した分子生物学における発展分子生物学における最近の発展 は、胎児細胞同定の可能性に対して巨大な衝撃を与えた。この目的のため、例え ばインサイチュ−の蛍光ハイブリッド形成が使用できる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）　（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、他、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂ。

Ｓ）’Ｉｌｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、、５１：２６３−２７２　（１９８ ６））の開発は、単一細胞でＤＮ八へ析を行うことができる能力を有することか ら（Ｌｉ、　Ｈ，他、Ｎａｔｕｒｅ、３５５：４１４−４１７　（１９８８）　 ；　Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ、＾」、他、Ｌａｎｃｅｔ　１：３４７−７４９　（１ ９８９））、母親の血液中に存在している胎児細胞が少ないことに関連した技術 的な問題を無くさせた。これにより、単一細胞からでもＤＮＡ診断が可能になる 。

以下に記述するように、妊娠した女性から得た血液中に胎児核形成赤血球が存在 していることを示し、従って、有効で信頼性のある可能な胎児ＤＮＡ給源として 母親の血液を用いることができることを示し、そして表面の抗原性特徴を基準に して母親細胞から胎児核形成細胞を区別し、このように、２つの細胞型を互いに 分離することを可能にし、モして鐵た、この分離した胎児核形成細胞中に存在し ている胎児ＤＮＡを分析しそして特徴づけした。

母親血液中の胎児遺伝子配列の検出 母親の血液供給源から胎児核形成細胞を単離する本方法を開発するための第一段 階の１つは、妊婦から得た血緯中に存在している母親細胞から胎児細胞を同定お よび分離することを可能にするモノクローナル抗体の同定であった。これは、実 施例中に詳述するようにして行った。結果として、母親の白血球を認識するモノ クローナル抗体、並びに胎児細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体が、母 親細胞と胎児細胞とを分離するに有効であることが見いだされた。下記は、母親 の血液サンプル中に存在している母親細胞から胎児核形成細胞を分離するに有効 であることが見いだされたモノクローナル抗体に関する簡単な記述である。しか しながら、表面抗原性の相違を基準にして胎児細胞と母親細胞とを区別する他の モノクローナル抗体もまた本方法で使用できる。本方法では、胎児核形成細胞上 に存在している表面抗原、母親細胞上に存在している表面抗原、に対して特異的 である（或は認識する）が、両方に対しては特異的でないところの、少なくとも １種の抗体を用いる必要がある。即ち、本方法は、母親細胞から胎児核形成細胞 を区別する１種以上の抗体を用いて行われる。本方法は、胎児核形成細胞を富裕 化する（濃度を上昇させる）ように処理もしくは加工した全血液もしくは血液を 用いて実施できる。

母親細胞から胎児核形成赤血球を区別するモノクローナル抗体に関する選択およ び成功した使用を以下に記述する。しかしながら、他の胎児核形成細胞型（また は型類）を選択することが可能なモノクローナル抗体も、同様にして同定でき、 そして母親細胞から胎児核形成細胞を分離する（従って、母親のＤＮＡから胎児 ＤＮＡ源を分離する）本方法で使用できる、と理解すべきである。

最初の研究は、単核細胞層中の不純物である母親白血球を取り除き、そしてこの 分離を実施するに有効なモノクローナル抗体を同定し、その結果として、胎児核 形成細胞が豊富な母親サンプルを作り出すことであった。

Ｈｌｅ−１（Ｂｅｃｔｏｎ−ＤＬｃｋｉｎｓｏｎモノクローナルセンター、Ｍｏ ｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ。

Ｃ＾、カタログ番号７４６３）は、直接フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ ＩＴＣ）接合体として入手できるモノクローナル抗体である。これは、成熟した ヒト白血球上、並びに非常に未成熟な赤血球前駆体上、に存在しているが、成熟 した核形成赤血球上には存在していないところの、抗原を認識する（Ｌｏｋｅｎ 、　ＩＩ、Ｅ、他、Ｂｌｏｏｄ、　６９：２５５−２６３　（１９８７）、従っ て、母親の白血球は認識されそして結合するが、胎児核形成赤血球は認識されず そして結合しない、その結果、この２つを分離することが可能である。実施例１ 中に詳述するように、単核細胞層中から母親白血球を除去するために、該標識抗 体を用いた。

また記述（実施例１）するように、同じ目的で（即ち血液サンプルから母親細胞 を除去するため）、モノクローナル抗体の組み合わせを用いた。記述するように 、密度勾配遠心分離で得られる単核細胞層から母親細胞を除去する目的で、抗単 核細胞抗体（Ｍ３）および抗リンパ球抗体（Ｌｉ）を用いた。

胎児核形成細胞は認識するが母親細胞は認識しないモノクローナル抗体もまた同 定した。実施例１に詳述するように、トランスフェリンレセプタを認識するモノ クローナル抗体を同定した。赤芽球は、ＢＦＵ−Ｅ段階から核駆逐（Ｌｏｋｅｎ 、　Ｍ、Ｅ、他、Ｂｌｏｏｄ、６９：２５５−２６３　（１９８７）まで、それ らの細胞表面上でトランスフェリンレセプタ（Ｌｏｋｅｎ、　Ｍ、Ｆ、、他、Ｂ ｌｏｏｄ、６９：２５５−２６３　（１９８７）抗原を発現することが示された 。このトランスフェリンレセプタもまた、活性化したリンパ球（Ｔｒｏｗｂｒｉ ｄｇｅ、　１．Ｓ、および菖。

Ｂ、　０ｓａｒｙＳＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 ７８：３０３９−３０４３　（１９８１））　、特定の腫瘍細胞（Ｇｒｅａｖｅ ｓ、　Ｍ、他、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｉｍｓｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、、３：２８３− ３００　（１９８１））　、および栄養芽層細胞（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ、　Ｇ」 、Ｐ、他、Ｂｌｏｏｄ、　５５：２４０−２４２　（１９８０））の上にも存在 している。従って、上記抗体は、胎児核形成細胞に特異的であるか、或はそれを 認識する（結合する）が、母親白血球にはしない。実施例１に記述するように、 トランスフェリンレセプタ（ＴｆＲ）に対する市販のフルオレセイン連結モノク ローナル抗体を用いて、母親細胞から胎児核形成赤血球を分離した。この抗体は 胎児核形成赤血球に特異的ではないが、これを用いることで容易に、フロー選別 したサンプル中でそれらを富裕化させることができた。血液サンプル中に存在し ている胎児核形成細胞と母親細胞との間を区別できる他のモノクローナル抗体も また使用できる。このような抗体には、市販のモノクローナル抗体、並びに公知 の技術を用いて製造できる抗体が含まれる。

上述した抗体を用いた、母親細胞サンプルからの胎児核形成細胞の分離は、全血 もしくは全血の両分（即ち、全血を処理もしくは加工することで、存在している 胎児核形成細胞の割合を上昇させたもの、即ち富裕化母親サンプルと呼ばれるも のから得られる両分）を用いて行うことができる。この富裕化母親サンプルは、 例えば二段階方法で製造される。

この母親サンプルに対して、最初に、大きさを基とした分離、例えばＦｉｃａｌ ｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を行う。これによって、血小板が入ってい る上澄み層、単核細胞層、そして核形成していない赤血球および顆粒球を含んで いる凝集したベレット、が生じる。この単核層を他の層から分離することで、胎 児核形成細胞が豊富な母親サンプルが得られる。

この母親サンプルに対して、これが母親の全血もしくは富裕化母親サンプルであ ろうとも、上述した抗体を用い、胎児核形成細胞と母親細胞との間の表面抗原性 差異を基準にした分離を行う。胎児核形成細胞か或は母親細胞のどちらかに対し て特異的であるが、両者には特異的でない、従ってこの２種類の細胞を分離する ことを可能にする、少なくとも１種のモノクローナル抗体に、この母親サンプル を接触させる。２種以上のモノクローナル抗体から成る１組（これらの各々は胎 児もしくは母親細胞のどちらかに特異的であるが、両方には特異的でない）と、 上記母親細胞とを混合する。単一のモノクローナル抗体を用いたとき可能なより も勝って、この２種類の細胞に関する分離を増強し得るモノクローナル抗体の組 み合わせ（例えば、抗ＴｆＲ抗体と前記Ｈ１ｅ−Ｌとの組み合わせ）が設計でき る。この胎児細胞の分離は、公知の技術、例えばフロー血球計算法、免疫原性ビ ードの使用、および細胞選別などを用いて実施できる。一般に、これらのモノク ローナル抗体は検出可能標識を有する（例えば放射能材料、蛍光団など）。

胎児細胞を単離しそして胎児ＤＮＡを検出する本発明の方法に関する１つの具体 例を、図１に図式的に示す。公知技術を用いて、母親血液サンプル（典型的には ２０ｍＬ）を得る。大きさを基準にしてこのサンプルを成分層に分離し、核形成 細胞が豊富な母親細胞（或は富裕化母親サンプル）として表す単核細胞層を取り 出して、更に一層の処理を行う。

この富裕化母親サンプルを、上述した如き少な（とも１種のモノクローナル抗体 と接触させ、そしてこの得られる胎児核形成細胞／抗体の複合体を公知方法（例 えばフロー血球計算法、免疫磁性ビード、および細胞選別）で分離する。この得 られる複合体から胎児ＤＮＡを粗抽出しく例えば熱により）、その結果として、 核酸プローブとのハイブリッド形成で利用できるようにする。選択したＤＮＡ配 列もしくはＤＮＡ配列類に関して、胎児ＤＮＡを公知技術で分析する。分析に先 立って、必要ならば公知方法（例えばＰＣＲ）を用いて、胎児ＤＮＡを増幅させ る。

増幅を実施する場合、適当数のサイクル（例えば約２５〜６０サイクル）から成 る変性およびアニーリングで、この選別したサンプルを増幅させる。対照サンプ ルには、誤った陽性を示す増幅を監視するため、ＤＮＡを添加していない試験管 が含まれる。ＰＣＲ条件の適当な修飾形を用いて、２個以上の独立した胎児遺伝 子を同時に増幅させることができる。「マルチプレックス」増幅として知られて いるこの技術は、ＤＭＤ（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ、　Ｊ、Ｓ、他、Ｐｒｅｎａ ｔ、　Ｄｉａｇｏｎｏｓｉｓ、　９：３４９−３５５　（１９８９））　（７） 診断で、６つの組から成るプライマーと一緒に用いられた。増幅を行う場合、こ の得られる増幅産生物は、増幅させたところの、興味の持たれている胎児ＤＮＡ 　（即ち、存在を検出および／または定量すべきＤＮＡ）および他のＤＮＡ配列 を含んでいる混合物である。増幅させた興味の持たれている胎児ＤＮＡと他のＤ ＮＡ配列とを、公知の技術で分離する。

増幅させたＤＮＡに対して行う次の分析は、下記の公知技術を用いて行う：制限 エンドヌクレアーゼを用いた消化、臭化エチジウム染色したアガロースゲルの紫 外線光可視化、ＤＮＡ配列決定、または対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチ ドプローブを用いたハイブリッド形成（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，Ｋ、他、Ａｍ、　Ｊ 、■ｕｔ　Ｇｅｎｅｔ、、４３　（Ｓｕｐｐｌ）：Ａ３５　（１９８ｇ））、上 記分析法により、その増幅させた「母親の」および「胎児の」サンプル間に多型 性差異が存在しているか否かを測定する。１つの具体例において、大きさを基準 にしてこの増幅混合物を分離した後、この得られる大きさで分離した胎児ＤＮＡ と、適当な選択ＤＮＡプローブもしくはプローブ類（興味の持たれている胎児Ｄ ＮＡに対して充分な相補性を示すＤＮＡ、即ちこれは、使用条件下で、興味の持 たれている胎児ＤＮＡにハイブリッド形成する）とを接触させる。一般に、これ らのＤＮＡプローブには標識を付ける（例えば、放射能材料、蛍光団、または他 の検出可能材料を用いて）。この大きさで分離した胎児ＤＮＡと該選択ＤＮＡプ ローブとを、相補的ＤＮＡ配列のハイブリッド形成が生じる適当な条件下で充分 な時間維持することにより、胎児ＤＮＡ／ＤＮＡプローブ複合体を生じさせた後 、公知方法を用いてこれらの複合体の検出を行う。例えばこのプローブが標識さ れている場合、胎児ＤＮＡ／標識ＤＮＡプローブの複合体を検出および／または 定量する（例えば、オートラジオグラフィー、蛍光標識の検出などによって）。

標識した複合体の量（従って胎児ＤＮＡの量）は、標準曲線（即ち、検出する標 識の量と与えられた読みとの間の、予め決められた関係）と比較することによっ て検出できる。

本方法を用いて、妊婦の末梢血液から得られた核形成赤血球中のＹ特異的ＤＮＡ を同定した。これを実施例３に記述する。簡単に言えば、１９人の妊婦から得た 血液サンプルから、フロー選別により、候補となる胎児細胞を単離した。これら の細胞中のＤＮＡを、これらの細胞が胎児から派生したものであることの証拠と して、Ｙ染色体の短いアーム上に存在している２２２個の塩基対（ｂｐ）から成 る配列に関して増幅させた。この増幅させたＤＮＡを、標準化したＤＮＡ濃度と 比較し、そして２０ｍＬの母親サンプル中、０．１〜ｌｏｇの胎児ＤＮＡを得た 。７／１９の場合、増幅ＤＮＡの２２２ｂｐ帯が検出され、これは単離した細胞 中に男性ＤＮＡが存在していることと一致し、これらの６／７は、核型羊膜細胞 により男児妊娠であると確認した。女胎児の場合、出産時のへその緒血液から調 製したＤＮＡも、Ｙ染色体の存在を示していた。２２２ｂｐ帯が存在していない １０／１２の場合、胎児は女児であった。

従って、男児妊娠の７５％中で成功裏にＹ染色体配列が検出され、従って、初め て、母親の血液から胎児遺伝子配列を単離することは可能であることが示された 。

実施例６に記述するように、懐妊の種々の地点の妊婦から選別した細胞中に、男 性（Ｙに特異的な）ＤＮＡが検出された。簡単に言えば、懐妊１１〜１６週の婿 入から得た静脈血液サンプルから、単核細胞層を単離した。Ｆｉｃｏｌｌ／１ｌ ｙｐａｑｕｅ密度遠心分離に続き、蛍光マーカーまたは化合物（フルオレセイン 、フィコエリトリン）に連結したモノクローナル抗体（抗−ＴｆＲ，抗Ｌｅｕ４ および抗ＬｅｕＭ３）と−緒に培養し、そして二重色分析、および蛍光活性化細 胞選別装置を用いたフロー選別を行うことで、分離を行つた。赤色蛍光を示さず 緑色蛍光を示す（Ｔ　ｆ　Ｒ陽性、Ｌｅｕ４陰性、ＬｅｕＭ３陰性）細胞は胎児 核形成細胞であり、そしてこれらを、このサンプルの残りの部分から分離した。

これらの細胞を溶解させた後、ＤＮＡを増幅させ、モしてＹ染色体の３９７ｂｐ 配列の存在に関して試験した。

実施例６で示された結果は、この操作により、５ｐｇの如き少ない量でも、男性 ＤＮＡ中に存在している３９７ｂｐ配列は検出可能である、ことを示している。

更に、これらの結果は、図４に示すように、懐妊令と男性ＤＮＡ検出とが関連し ていることを示唆している。このデータは、母親循環系への胎児核形成赤血球の 転移に関する生物学的「ウィンドー」が存在していることを示唆している。

本方法をまた、母親ＤＮＡから女胎児ＤＮＡを区別するために用いた。

実施例７中に詳述するようにして、父親多型性の増幅を用いて、この２つの種類 の女性ＤＮＡを区別した。簡単に言えば、単純妊娠の婦人から静脈血液サンプル を採取した。Ｆｉｃｏｌｌ／ｌ１ｙｐａｑｕｅ密度遠心分離に続き、蛍光マーカ ー（フルオレセイン、フィコエリトリン）に連結したモノクローナル抗体（抗− ＴｆＲ，抗Ｌｅｕ４および抗ＬｅｕＭ３）と−緒に培養し、そして二重色分析、 および蛍光活性化細胞選別装置を用いたフロー選別を行うことで、胎児核形成細 胞の分離を行った。赤色蛍光を示さず（Ｌｅｕ４、ＬｅｕＭ３陰性）、緑色蛍光 を示す（Ｔ　ｆ　Ｒ陽性）ことによって同定した胎児核形成細胞を集め、そして これらを溶解させた。

これらの細胞から得られるＤＮＡを増幅させ、そして母親のＤＮＡから女胎児Ｄ ＮＡを区別することを可能にする染色体１７の高度字型性領域の父方配列に関し て試験した。

これらの結果は、父親からのＤＮＡ配列が胎児の常染色体中で同定できることを 示していた。その結果、本発明の方法を用いて、母親の血液から、女胎児核形成 細胞、並びに男胎児核形成細胞を分離することができる。従って、本方法は、他 の方法、例えば羊水せん刺で現在用いられているところの、ＤＮＡを基とする診 断方法の全てで使用できる。

妊婦の末梢血液から得られる核形成赤血球中のＹ特異的ＤＮＡを同定することが できる本発明の方法に関する更に一層の支持が、再構築実験によって得られてい る。実施例８に記述するように、妊娠していない女性から得た血液に男性へその 緒血液を添加することで、母親血液中の胎１　児細胞の存在を模擬した。簡単に 言えば、健康で妊娠していない婦人から静脈血液サンプルを採取した後、Ｆｉｃ ｏｌｌ／１ｌｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によって単核細胞層を単離した。妊娠し ていない蝿大の血液の単核細胞層に、男乳児のへその緒から得た単核細胞（１０ ２〜１０＠個の範囲から成る細胞）を加えた。このへその緒血液は、核形成した 赤血球を高い割合で含んでいる。これらの実験から得られた結果は、種々の懐妊 段階の妊婦から得たものと本質的に同様であった。Ｙ染色体からの増幅配列は、 男性ＤＮＡの存在に一致しており、そしてこれらは、１０２個の男性細胞を女性 細胞に加えたとき検出された。

上述しそして実施例中に示した研究結果は、母親の血液から核形成胎児細胞が単 離され、この胎児細胞からゲノム状のＤＮＡが抽出され、そしてこれらは、胎児 が元となるものとして同定され、ＰＣＲを用いて胎児遺伝子が増幅され、そして この胎児ＤＮＡ中で選択ＤＮＡ配列が同定された、ことを示している。これらは 、母親の血液から単離した細胞中で胎児ＤＮＡが初めて検出されたことを示して いる。

胎児核形成細胞を単離しそして胎児ＤＮＡの特性記述を行うための本方法の使用 このように、母親の血液サンプル中に存在している胎児核形成細胞から胎児ＤＮ Ａが得られることが示された。図１中に示す胎児ＤＮＡを検出および／または定 量するための方法は、出生前評価を行うための道具（例えば、染色体異常を評価 するための手段、病気に関連したＤＮＡが存在しているか否かを決定するための 手段、或はＹ特異的ＤＮＡを検出するための手段）として有効である。この方法 は、非侵入性でありそしてほんの少量のみの血液で充分なため特に有益である。

ここに記述するようにして単離するか、或は母親の血液サンプルから胎児核形成 細胞を分離することができる他の手段によって単離したところの、胎児の核形成 赤血球中の胎児ＤＮＡ配列を、診断もしくは他の目的にとって興味の持たれてい るＤＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列ｍｌ（遺伝子（順）もしくは遺伝子部分（類） ）が存在しているか否かに関して分析もしくは評価する。ここでは、胎児細胞中 に存在しているＤＮＡ配列（類）もしくは遺伝子（類）／遺伝子部分（類）を、 興味の持たれている胎児ＤＮＡと呼ぶ。例えば、存在の有無を測定しそしてその 量も測定するために選択したＤＮＡは、のう飽性繊維症の如き病気に関する遺伝 子であり、ここでは、原因となる遺伝子もしくは遺伝子部分をクローン化した後 、配列決定するか、二者択一的に、それをＸもしくはＹに特異的なりＮＡ用プロ ーブとする。他の遺伝子もしくは遺伝子部分を検出するため、適当な修飾（例え ば適当なりＮＡプローブ、時間、温度）を行った上で、また同様な操作が使用で きる。

診断に関連して、例えばのう胞繊維症を引き起こすことが知られている遺伝子を 検出するために用いたように、本方法は下記の如（実施される。最初に、母親の 血液サンプル（典型的に２０ｍＬ）を採取した後、核形成していない赤血球を除 去しそして単核細胞層を得る目的で、比重を基準にして成分層に分離する（例え ば、Ｆｉｃｏｌｌ−取ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により）。これにより、胎児 核形成赤血球が豊富な母親血液サンプルが得られる。この単核細胞層を、少なく とも１種の適当なモノクローナル抗体（例えば、このサンプルから分離すべき種 類の胎児核形成細胞に特異的な抗体）で染色する。例えば、胎児核形成細胞に特 異的なモノクローナル抗体、例えば上述した抗ＴｆＲ抗体が使用できる。一般に 、使用するモノクローナル抗体は検出可能標識を有する。二者択一的に、選択し た標識モノクローナル抗体の組み合わせ、例えば胎児核形成細胞に特異的なモノ クローナル抗体（例えば抗ＴｆＲ抗体）と、母親の白血球に特異的なモノクロー ナル抗体（ＨＬｅ−１もしくはＬ４およびＭ３）との組み合わせ（各々を異なる 蛍光化合物で標識する）を用いることで、本質的に全ての母親細胞を除去するこ とができる。その後、公知の方法、例えばフロー血球計算法を用いて、標識した 細胞を互いに分離する。特異的な細胞へのモノクローナル抗体の結合が生じる結 果、標識モノクローナル抗体−細胞の複合体が生じる。例えば、抗ＴｆＲ抗体と ＨＬｅ−１とを使用した場合、胎児核形成赤血球は抗ＴｆＲ抗体と結合して、胎 児核形成赤血球／抗ＴｆＲ抗体の複合体を生じ、そして母親の白血球はＨＬｅ− １抗体と結合して、母親白血球／ＨＬｅ−１抗体の複合体を生じる。これらの胎 児核形成赤血球／抗ＴｆＲ抗体の複合体を、例えばフロー血球計算方法を用いて 、母親細胞／ＨＬｅ−１抗体の複合体から分離する。これらの胎児細胞を溶解さ せて、粗抽出した胎児ＤＮＡを生じさせ、続いて例えばＰＣＲを用いて、これを 増幅させる。その結果、増幅した胎児ＤＮＡが得られ、これを次に、大きさを基 準にして分離する。

大きさで分離した胎児ＤＮＡを、標識ＤＮＡプローブと接触させる（即ち、のう 飽性繊維症に関する出生前検出では、のう飽性繊維症に関連した遺伝子に相補的 な標識ＤＮＡプローブ）。この胎児ＤＮＡが、興味の持たれているＤＮＡを含ん でいる場合（この場合、のう飽性繊維症に関連した遺伝子）、興味の持たれてい る胎児ＤＮＡ／標識プローブの複合体が生じる。

次に、オートラジオグラフィーの如き公知技術を用いて、興味の持たれている胎 児ＤＮＡ／標識プローブの複合体を検出する。簡単に、興味の持たれている標識 胎児ＤＮＡ存在の有無を検出するか、或は興味の持たれている胎児ＤＮＡの存在 量が測定できる。どちらの場合も、この結果は、母親の血液サンプルから得た胎 児ＤＮＡに関する、選択したＤＮＡの評価である。のう胞性繊維症以外の病気も しくは状態に関連している胎児ＤＮＡが存在しているか否かも、本方法により検 出および／または定量できる。どちらの場合も、興味の持たれている配列を決定 するために適当なプローブを用いる。例えば、プローブＳ　ｔ　１４　（Ｏｂｅ ｒｌｅ、　Ｉ。

他、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、３１２：６８２−６８６　（１９８ ５））　、４９　ａ　（Ｇｕｅｒｉｎ、　Ｐ。

他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｓ　Ｒｅｓ、、１６：７７５９　（１９８８）、Ｋ Ｍ−１９（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ、　Ｐ。

他、Ｐｒｅｎａｔ、　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、　９：３４９−３５５　（１９８９ ））　、または筋ジストロフィー　（ＤＶＤ）遺伝子に関する欠失し易いエキソ ン（Ｃｈａａ＋ｂｅｒｌａｉｎ、　Ｊ、Ｓ。

他、ＮｕｃＬｅｉｃ　Ａｃ１５　Ｒｅｓ、、１６：１１１４１−１１１５６　（ １９８８））から得られる配列がプローブとして用いられる。５ｔ１４は、母親 ＤＮＡから女性ＤＮＡを区別するに潜在的な有効性を有するＸ染色体の長アーム から単離したところの、高多型性を示す配列である。この遺伝地図は、Ｆａｃｔ ｏｒ　ＶＩＩＩ：Ｃに関する遺伝子の近くであり、従って、血友病Ａの出生前診 断にも利用できる。該ＤＭＤ遺伝子中の、最も通常欠失し易い６個のエキソンに 隣接している配列に相当するプライマー（これは、ＰＣＲによってＤＭＤを診断 する目的で成功裏に用いられた）もまた使用できる（Ｃｈａｉｂｅｒｌａｉｎ、 　Ｊ、Ｓ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｓ　Ｒｅｓ、、１６：１１１４１−１１ １５６　（１９８８））　、本方法で診断できる他の状態には、β−サラセミア （Ｃａｉ、　Ｓ−Ｐ、他、Ｂｌｏｏｄ、　７３：３７２−３７４　（１９８９） ；　Ｃａｉ、　Ｓ−Ｐ、他、＾ｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、４５：１ １２−１１４　（１９８９）；　５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、他、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ 、　Ｊ、　ｌｅｄ、、３１９：５３７−５４１　（１９８８）、鎌状赤血球貧血 （Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，に、他、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、３１９： ５３７−５４１　（１９８８））、７エールケトン尿症（ＤｉＬｅｌｌａ、＾、 Ｇ、他、Ｌａｎｃｅｔ、　１：４９７−４９９　（１９８ｇ）およびゴーシェ病 （Ｔｈｅｏｐｈｉｌｕｓ、　Ｂ、池、八ｍ、　１．　Ｈｕ＋ｓ、　Ｇｅｎｅｔ、 、４５　：２１２−２１５（１９８９）が含まれる。各々の状態を評価するため の本方法における使用で適当なプローブ（またはプローブ類）が利用できる。

前述した如きフロー血球計算法以外の手段によっても、母親細胞から胎児細胞を 分離することが可能であり、そしてこの方法で得た胎児核形成赤血球ＤＮＡを分 析することも可能である。上記分離操作は、フロー血球計算法と一緒か、或はそ れと独立して使用されてもよい。フロー血球計算器は入手しづらく高価であり、 この技術に関する可能な用途は限定されているため、上記が有利である。従って 、胎児細胞の分離に関する他の方法も使用できる。使用する分離方法により、望 まれない細胞を除去（「負の選択」）するか、或は量は少ないが望まれている細 胞を単離（「正の選択」）する。

例えば、免疫磁性ビードによるか、或は細胞選別による分離を用いる。

この具体例において、前述したように、単核細胞層を単離する。次に、この層と 、磁性コア（例えばｒＤｙｎａｂｅａｄｓＪ　）を含んでいる抗体がコートされ たポリマー粒子とを混合する。これらの免疫磁性ビードは、種々の抗体がコート されたものとして入手可能である。例えば、白血球抗原に対する抗体およびマウ ス免疫グロブリンに対する抗体がコートされている免疫磁性ビード（これらを次 に、ヒトトランスフェリンレセプタに対するマウスモノクローナル抗体に連結さ せることができる）が使用できる。混合した後、磁性粒子濃縮装置を用いて、ロ ゼツト細胞を単離する。１つの具体例において、２組の抗体コートした免疫磁性 ビードを連続して用いる。最初に、母親の白血球を除去した後、残存するＴｆＲ 陽性細胞を集める。本方法の次の段階（増幅、分離、適当なりＮＡプローブもし くはプローブセットとの接触）は、フロー血球計算法によって分離した細胞に関 して記述したのと同様である。

１１ｕｅｌｌｅｒ他（Ｌａｎｃｅｔ、　３３６：１９７−２００　（１９９０） は、磁性ビードを用いて、妊婦の血液中に存在している胎盤派生栄養芽層細胞を 単離する方法を記述している。この方法は、１ｍＬのモノクローナル抗体ハイブ リドーマ培養上澄み液と、マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント）　（Ｄｙｎａｂｅ ａｄｓ　Ｍ−４５０、Ｄｙｎａｌ　ＡＳ、　０ｓｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙ）に対す るヒツジ抗体で予めコートした２ｘｌＯ’個の磁性ビードと、を混合した後、こ れらを室温で一晩培養することを伴っていた。このコートしたビードを４℃で保 存した後、リチウムヘパリン（１０１Ｕ／ｍＬ）が入っている氷冷ＲＰＩＩＩ　 １６４０培地中で３回洗浄した。妊婦から得た血液を、全血１ｍＬ当たりｌ０Ｉ Ｕのリチウムが入っている試験管中に集めた後、リチウムが入っている［？ＰＭ Ｉで１：１０に希釈し、そして該抗体をコートしたビードと一緒に４℃で一晩培 養した。この所望細胞を、該ビード上の抗体に結合させ、そしてコバルト−サマ リウムマグネットを用いてこれらのビードを集める。この場合、該抗体は栄養芽 層抗原に対して特異的であったが、例えば、胎児核形成赤血球上に存在している が、母親細胞上には存在していない細胞表面抗原に対する抗体を用いた同様の技 術も利用できる。この特別な技術の利点は、単核細胞の単離をもたらす初期段階 が無いことである。更に、これらの磁性ビードは、正の選択（胎児細胞）および 負の選択（母親細胞）の両方で使用できる。

単離に関する代替方法は、Ｒ，Ｊ、　Ｂｅｒｅｎｓｏｎ他（Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　９１：１１−１０　（１９８６））が記述した 方法の修飾形であり、ここでは、蛋白室アビジンとビタミンビオチンとの間の高 親和力を利用して、間接的免疫吸着操作を作り出した。この技術では、臭化シア ンで活性化したセファロース６ＭＢビードにアビジンを結合させた後、達成用緩 衝液（０，５ＭのＮａＣ１中０．１ＭのＮ　ａ　ＨＣＯｓ、ｐＨ８，３）および 洗浄用緩衝液（０，５ＭのＮａＣ１中０．ＩＭの酢酸ナトリウム、ｐｉ−Ｉ４． ５）を用いて交互に洗浄し、そして４℃で保存した。この血液細胞を、１）ネズ ミモノクローナル抗体、モして２）ビオチニル化ヤギ抗マウス免疫グロブリンと 一緒に培養した。３ｍＬカラムのゲルをＰｈａｒ■ａｃｉａ　Ｋ　１９／１５カ ラムに充填した。この処理した細胞を、ウシの血清アルブミンが２％入っている 燐酸塩緩衝食塩水で該カラムに通した。接着した細胞を機械的撹拌によって取り 外した。使用した抗体が、胎児細胞の表面抗原もしくは母親細胞表面抗原を認識 するが、両方は認識しない場合、上記技術が胎児細胞分能に適用できる。ビード に抗体を結合させるための方法ｌ二関する変法が存在しており、それらの例には 、Ｔｈｏ−ａＳおよび共同研究者（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｔ、Ｅ、他、Ｊ、　ｏｆ　 Ｉ＋＊１ｕｎｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１２０：２２１−１３１　（１９８９） ）そしてｄｅＫｒｅｔｓｅｒおよび共同研究者（ｄｅ［ｒｅイーｓｅｒ、　Ｔ、 Ａ、他、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１６：３１７−３２５　（１９８９ ））が記述した方法が含まれる。この抗体結合カラムの使用では、全血から単核 細胞画分を予め単離する必要が無い。

胎児細胞を母親の血液から一麿単離した後、所望に応じて、それらを培養するこ とで診断に利用できる細胞数を上昇させてもよい。Ｅ、　Ｆｉｂａｅｈ他、（Ｂ ｌｏｏｄ、　７３：１００−１０３　（１９８９））は、ヒト造血始原細胞の増 殖を支持する方法を記述している。この段階的方法は、１）ヒト膀胱癌細胞から 得た条件付は培地存在下で初期培養し、２）非接着細胞を収穫することで白血球 を除去した後、モノクローナル抗体で溶解し、モして３）組換え型エリトロポイ エチンを補った培地中で細胞を再び培養する、ことを伴う。

母親細胞から胎児核形成細胞を分離するための別の方法も使用できるが、但し、 胎児細胞と母親細胞との差を区別することができ、そして片方からもう一方を単 離することができることを条件とする。

母親の血液サンプル中の、興味の持たれている胎児ＤＮＡ、例えば病気もしくは 他の状態に関連した染色体異常、を単離および検出する本方法を実施するために 用いるキットを作り出すことができる。これには、例えば必要とされる試薬を入 れるための容器、そして試薬類および任意の他のサンプル成分から胎児核形成細 胞／特異的抗体の複合体を分離するために用いるか或は特異的抗体と複合した母 親細胞を除去するために用いる固体状支持体、が含まれる。例えば、ＰＣＲで胎 児ＤＮＡを増幅した後、興味の持たれている胎児ＤＮＡを検出するために用いる キット中の試薬類には、１）胎児核形成細胞の表面抗原特性に特異的であるが、 母親白血球の表面抗原特性には特異的でない、少なくとも１種の抗体、モしてＰ ＣＲで胎児ＤＮＡを増幅するときに用いる選択ＤＮＡプライマー、並びに検出す べき胎児ＤＮＡ　（興味の持たれている胎児ＤＮＡ）に相補性を示す少な（とも １種のＤＮＡプローブ、が含まれる。このキットには、上述したように、生じた 複合体を他のサンプル成分から分離するときに用いる固体状支持体も備わってい る。上記固体状支持体は、例えばガラス製スライド、ニトロセルロースフィルタ ー、または免疫磁性ビードであってもよ（、そしてそこに、胎児核形成細胞／特 異的抗体複合体中に存在している抗体に選択性を示す抗体を固定させてもよい。

いかなる方法でも範囲を限定することを意図したものではない下記の実施例によ り本発明の説明をここに行う。

実施例１　胎児核形成赤血球（ＮＲＢＣ）を単離および選別するための抗体選択 ヒト白血球抗原（ＨＬｅ−１）を用いた母親血液からの母親白血球の除去 胎児ＮＲＢＣ単難技単信技術ず最初に、母親血液中に存在している巨大な数の、 核形成していない赤血球を除去するためのＦｉｃｏｌｌ−取ｐａｑｕｅ密度勾配 遠心分離で開始した。末梢血液を遠心分離することで、血小板が入っている上澄 み液層、単核細胞層、および核形成していない赤血球および顆粒球から成る凝集 したペレット、に分離した。この単核細胞層は、リンパ球、単核細胞、恐らくは 栄養芽層、そしてその増大した太きさおよび密度からＮＲＢＣおよびいくつかの 網状赤血球、から成っていた。

Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離でも、該母親サンプル中に存在している 胎児ＮＲＢＣの割合を初期富裕化することができることが示されたが、この単離 した細胞集団の純度を改良するため、フロー血球計算法および細胞選別法を用い た。

フロー血球計算分析のため、６３人の妊婦、１５人の妊娠していない成人、およ び３９個のへその緒中の、末梢血液サンプルから得た単核細胞層を、ＦＴＴＣ− ＨＬｅ−１で染色した。胎児全血の代替物としてへその緒サンプルを用いた。こ れらの３つのグループ各々に関する低角光散乱（おおよそ細胞の大きさ）に対す る蛍光を示す代表的ヒストグラムが得られた。

白血球、赤血球および血小板、に相当するヒストグラムビークが同定された。９ 人の妊婦、７人の妊娠していない成人および１２個のへその緒サンプルに関して 、ｆｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅ＠ｓａ染色後の詳染色機鏡のために、蛍光（ＨＬｅ−１ 陽性）および非蛍光（ＨＬｅ−１陰性）細胞集団を選別した。サンプル源に関係 な（、ＨＬｅ−１陽性集団は常に白血球から成っていたが、ＨＬｅ−１陰性集団 は異なっていた。

へその緒の血液中、ＨＬｅ−１陰性細胞は、核形成されていない赤血球と核形成 されている赤血球、並びに時として血小板であった。妊婦においては、血小板、 核形成していない赤血球、そして非常にまれであるがＮＲＢＣが存在していた。

妊娠していない成人の場合、血小板と砕片のみが見られた。従って、細胞選別パ ラメーターを確立するための参考として、高含有量のＮＲＢＣが入っているへそ の緒血液用いた。顕微鏡により、抗体−抗原結合の特異性が確認され、そして選 別したＨＬｅ−１陰性細胞は白血球で比較的汚染されていないことが確認された 。４０人の妊婦に対して上記選別パラメーターを利用することで、潜在する胎児 ＮＲＢＣを単離した。

トランスフェリンレセプタ（Ｎｅｖｍａｎ、　Ｒ，他、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１：３９７−３９９　（１９８２））は、細胞の鉄輸送で 重要な表面糖蛋白質である。このＴｆＲは、活性化されたリンパ球（Ｔｒｏｖｂ ｒｉｄｇｅ、　１．Ｓ、他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８：３０３９−３０４３　（１９８１）） 　、特定の腫瘍細胞（Ｇｒｅａｖｅｓ。

１他、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｉｎ＋ｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、、３：２８３−３００　 （１９８１））　、および栄養芽層細胞（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ、　Ｇ、ＬＰ、他 、Ｂｌｏｏｄ、　５５：２４０−２４２　（１９８０））上に存在している。赤 芽球は、ＢＦＵ−Ｅ段階から核駆逐までそれらの細胞表面上でＴｆＲを発現する （Ｌｏｋｅｎ、　Ｍ、Ｒ，他、Ｂｌｏｏｄ、　６９：２５５−２６３　（１９８ ７））。

従って、ＴｆＲは、母親血液中で見いだされる胎児ＮＲＢＣ富裕化のための優れ た「候補抗原」である。ＴｆＲに対するモノクローナル抗体は、フルオレセイン 接合体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号７５１３）およびフィ コエリトリン（ＰＲ）接合体（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｌｏｋｅｎ博士、Ｂｅｃｔｏｎ −Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ提供）として両方が入手できる。ＴｆＲ分析および顕微鏡 分析のため、６人の妊娠、４人の妊娠していない成人、そして３個の新生児へそ の緒中の、末梢血液サンプルから単核細胞層を単離した。これらの３つのグルー プから、光散乱に対する蛍光の代表的ヒストグラムを得た。

へその緒サンプルは、大きさが様々な蛍光を示す大きな集団（ＴｆＲ陽性細胞） を有していたが、妊娠していない成人および妊娠した成人は、個別のグループと して束になった蛍光細胞を少量のみ有していた。更に、妊娠していない（平均＝ ０．３２）サンプル試験に対する妊婦（平均＝０．８３）中のＴｆＲ陽性細胞の パーセントに関して、若干の差が存在していた。

形態学に関してはｆｒｉｇｈｔ−ＧＬｅ■Ｓａ染色を用い、そして胎児ヘモグロ ビン検出に関してはＫｌｅｉｈａｕｅｒ−Ｂｅｔｋｅ技術（Ｋｌｅｉｈａｕｅｒ 、　Ｅ、他、Ｋ１１ｎ　ｆｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、、３５：６３７−６３８　（１ ９５７））を用いて、上記ＴｆＲ陽性細胞に関する顕微鏡試験を行った。へその 緒のサンプルに関しては、胎児ヘモグロビンおよび時には白血球が含まれている 、多数の核形成および非核形成赤血球が可視的に同定された。妊婦に関しては、 主流となる細胞型は、胎児ヘモグロビンを含んでいる核形成および非核形成赤血 球であったが、白血球も時には観察された。逆に、妊娠していない対照区から得 られたサンプルはほとんど排他的にリンパ球および単核細胞から成っていた。

栄養芽層細胞はＴｆＲを発現するため、妊婦からの選別集団中にはそれらは存在 していないと仮定され、そして全く検出されなかった。

二重抗体分析 抗体の組み合わせを用いることで、両方の抗体は、存在しているＮＲＢＣの集団 を富裕化させるが、選別したサンプル中の他の細胞型を完全には排除しないため 、胎児ＮＲＢＣの純粋な集団が単離された。ＰＥ接合ＴｆＲおよびＦＩＴＣ接合 ＨＬｅ−１を用いて、予備二重抗体試験を行った。ＮＲＢＣはＴｆＲ陽性でＨＬ ｅ−１陰性であるが、一方、母親の白血球はＨＬｅ−１陽性である。これらの実 験はうまく働き、そして母親白血球の分離を生じさせた。

従って、上述した研究は、妊婦から得た末梢血液中のＮＲＢＣを富裕化および選 別するためのフロー血球計算法パラメーターを定義付けした。

更に、顕微鏡試験により、妊婦の静脈血管サンプルから得られた単核細胞集団に 関して、妊娠していない成人に対する形態学的差が存在していることが分かった 。

実施例２　母親血液から選別したＨＬｅ−１陰性細胞におけるＤＮＡ／＼イブリ ッド形成試験 実施例１中に記述したようにして選別した細胞に関する胎児起源を確認する目的 で、Ｙ染色体プローブを用いた、何故ならばこれは、問題無くその起源を胎児と するＹ染色体であるからである。出生前に実施したオートラジオグラフィーで検 出したときの母親血液中のＹ染色体ＤＮＡの存在が、引き続く男乳児出生に対し て相互関係を有しているか否か、を試験するための評価法を設計した。

ＤＮＡ単離 へその緒血液および妊婦から得たＨＬｅ−１陰性細胞を試験管中に選別した。通 常のＤＮＡ単離方法並びにより未完成な方法の修飾形（Ｌａｕ。

Ｙ−Ｆ、他、Ｌａｎｃｅｔ、１：１４−１６　（１９８４）：　ＭｃＣａｂｅ、 　Ｅ、Ｒ，Ｂ、他、ｆｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔ、、７５：２１３−２１６　（１９８ ７））の使用を試みたが、サザンプロット上のＹ染色体派生帯の検出は成功しな かった。存在している細胞の数が少ないことから全てが制限された。

実施例３　フィルター上に堆積した細胞に対する直接ハイブリッド形成りＮＡ単 離に関連した技術的問題を回避する目的で、ニトロセルロースフィルター上にフ ロー選別した細胞に対して直接ＤＮＡハイブリッド形成を行う方法が開発された （Ｂｉａｎｃｈｉ、　Ｄ、Ｗ、他、Ｃｙｔｏｓ＋ｅｔｒｙ、　８：１９７−２０ ２　（１９８７））。対照実験において、５０個という少ない数の選別したへそ の緒血液白血球または５．０００個のＨＬｅ−１陰性細胞（核形成および非核形 成細胞の混合物）から、新生児の性を決定した。

次に、懐妊８．５および３８週目の婦人４０人中の末梢血液サンプルから選別し たＨＬｅ−１陰性細胞中でのＹ染色体配列の検出に対して、この方法論を適用し た。結果は下記の通りであった：Ｙ染色体プローブ使用　出産した　出産した　 追跡損失ドツトプロット　男乳児　女乳児 ハイブリッド形成 このプローブを用いたハイブリッド形成は男児妊娠に関しては予測できないと結 論付けられた。ＤＮＡハイブリッド形成が生じたフィルター上に胎児ＤＮＡが存 在している可能性はあるが、しかしこのＤＮＡはＹプローブに非特異的に結合し た。従って、男児ＤＮＡに関して「陽性」として解釈されたフィルターは、実際 上、胎児から母親への出血に対して「陽性」であった。

実施例４　選別した胎児細胞中の遺伝子配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）の使用 数の少ない標的遺伝子配列を１０６個から成るコピーを構築させる能力を有する ＰＣＲを用いて、選別した胎児細胞中の遺伝子配列を増幅させた。胎児細胞選別 後期待される少量のＤＮＡ　（おおよそｌｐｇ〜１０１００ｎに対して与えられ る最適のＰＣＲ条件を決定した。新しい情報が入手できるよ）になったことから 、実験条件を修飾した。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメ ント（Ｋｏｇａｎ、　Ｓ、Ｃ，他、Ｎｅ曹Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３ １７：９９０　（１９８７））の代わりにＴａｑポリメラーゼを用いた、と言う のは、それはＤＮＡ複製において増大した特異性を示するからである。

最初に、Ｙ染色体の長アーム、即ちプローブＹ４３１−Ｈｉｎｆａ　（Ｋｉｒｂ ｙ　Ｓａ＋ｉｔｈ博士、Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　ＭＤ提供）、およびＹ染色体の短アーム、即ちプローブ Ｙ４１１　（Ｕｌｒｉｃｈ　ｌｌｕｌｌｅｒ博士、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’　ｓ（ｓ ［１ｏｓｐｉｔａｌ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ提供）から得られる繰り返し配列 に関する試験を行った。繰り返し配列を選択した理由は、それらは、量の少ない 男胎児細胞から、より強い増幅シグナルを作り出すからである。Ｙ４１１は、Ｙ １５６　（ｌｌｕｌｌｅｒ、　Ｕ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 、１４：１３２５−１３２９　（１９８６））と同じであり、１０〜６０回の繰 り返しであり、モしてサザンプロットで完全Ｙ特異的である。配列Ｙ４３１は、 女性に関して常染色体相同性を示しているため、性決定のみにその利用性が限定 される。

ＰＣＲ標準化 母親血液中で検出可能なりＮＡの最小量を明白にする目的で、一連の標準化実験 を行つた。男性および女性個人から得たＤＮＡを１０倍希釈で調製しく１　ｐｇ 〜１ｍｃｇ）　、そしてＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｓｅｒのＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙ ｃｌｅｒを用いたＧｅｎｅ！ｐキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ カタログ番号Ｎ８０１−００５５）中、標準試薬を用いて増幅させた。プローブ Ｙ４１１内に在る２２２個の塩基対（ｂ　ｐ）から成る配列を増幅させるように 、プライマー４１１−Ｏｌおよび４１１−０３を設計した。増幅サイクルの数を １８〜３０回の間で変化させた。増幅させたＤＮＡサンプルを、アガロースゲル 上で電気泳動にかけ、ナイロンフィルターに転移させた後、″！ｐ標識Ｙ４１１ プローブにハイブリッド形成させた。ｉｏｐｇという少ない量の男性ＤＮＡを含 んでいるレーン中にオートラジオグラフ上のＹ特異的帯を検出することは明らか に可能であるが、女性のレーンまたはＤＮＡを添加していない対照レーン中に増 幅させたＤＮＡが存在していることから、これらの結果はしばしば曖昧であった 。「誤った陽性を示す増幅」の現象は、現在普遍的に認識されている（Ｌｏ、　 Ｙ−Ｍ、Ｄ、他、Ｌａｎｃｅｔ、　２：６９７　（１９８８）：　Ｋｗｏｋ。

Ｓ、他、Ｎａｔｕｒｅ、　３３９：２３７−２３８　（１９８９））。

「誤った陽性を示す」増幅の削除 胎児細胞選別中には限定された量の出発材料しか存在していないため、どの胎児 が実際にＹ染色体ＤＮＡを有しているかを決定するためには、背景の増幅を削除 するための努力が必要であった。従って、男性ＤＮＡのコロイド性汚染を防止す るための方策を取った。全てのＰＣＲを無菌条件下で行い、手袋を着用し、そし て必ずピペットを交換した。全ての試薬は無菌様式で調製し、そしてＰＣＲに先 立って、この標的配列内に消化部位を有する制限エンドヌクレアーゼと一緒に一 晩培養した。これらを注意することにより、ＤＮＡを除く全ての試薬に対して対 照反応を行うことによって監視したとき、誤った陽性を示す増幅は、有意に減少 しそして実質的に無くなった。

母親血液中のＮＲＢＣから得た胎児遺伝子配列の成功単離および増幅ＤＮＡ汚染 源を除去しそしてｔｏｐｇという少ない量の男性ＤＮＡ　（１細胞＝７ｐｇのＤ ＮＡ）でも、ＰＣＲ増幅後に検出できることを決定した後、懐妊１２．５〜１７ 週の婦人１９人の末梢血液から得た候補胎児細胞を選別した。ＴｆＲに対するモ ノクローナル抗体を用いて、予想されるＮＲＢＣを同定した。これらの細胞が、 男児妊娠における胎児から派生したものであることの証拠としての、プローブＹ ４１１中の２２２ｂｐ配列に関して、上記選別した細胞中のＤＮＡを増幅させた 。７／１９の場合、増幅させたＤＮＡの２２２ｔｌ帯がオートラジオグラフ上で 検出され、これは、単離した細胞中に男性ＤＮＡが存在していることと一致して おり、そしてこれらの６／７は、核型羊膜細胞によって、男児妊娠として確認さ れた。−人の女胎児の場合、懐妊３２週目で繰り返した試験および出産時のへそ の緒血液もまた、Ｙ染色体配列の存在を示していた。この結果は、低レベルの性 染色体モザイク化か、ＸＸ／ＸＹＸ／Ｘ化（Ｆａｒｂｅｒ、　Ｃ，Ｍ、他、Ｈｕ ｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、８２：１９７−１９８　（１９８９））か、或はＸ染色体 もしくは常染色体上の単一コピー中にＹ４１１配列が存在していること、によっ て説明できるであろう。２２２ｂｐが存在していない１０／１２の場合、胎児は 女児であった。従って、Ｙ染色体配列の検出は、男児妊娠の６／８もしくは７５ ％の割合で成功である。男性ＤＮＡが検出できなかった２つの妊娠において、胎 児から母親への血液型に不適合性が有った。二者択一的に、胎児から母親への出 血が無かったか、或は存在しているＮＲＢＣの数がＤＮＡ検出の感度限界以下で あった可能性がある。

用いた条件では、最小でｉｏｏｐｇの胎児ＤＮＡか、或は１５個の胎児細胞相当 量を検出することが可能であった。感度限界は、ＰＣＲで用いたサイクル数を増 やすことによって改良できる。この試験で初めて、母親血液から単離した細胞中 で胎児ＤＮＡが検出されることが示された。

誤った陽性を示す増幅を更に減少させ、そしてアガロースゲルを用いて単一細胞 レベルでの胎児ＤＮＡの検出を可能にする目的で、Ｙ染色体の長アーム、即ちｐ Ｙ４９ａ　（Ｇｕｅｒｉｎ、　Ｐ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 、１６　：　７７５９（１９８８））　、に特異的な配列の単一コピーから誘導 したプライマーを用いてＰＣＲを実施する。６０サイクルから成るＰＣＲを用い た予備実験で、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上でＹ染色体ＤＮＡが見 られる。この際だった感度を、ここに、選別した胎児細胞から得たＤＮＡに応用 する。

実施例５　胎児から母親への出血量、形態学および普遍性の測定ａ、一般的方策 妊婦から得た血液からの胎児核形成細胞の単離に本方法が利用できるため、全て の妊娠に関して、母親の血液中で胎児細胞を見付けることができるか否かを測定 することも可能である。妊娠の進行に伴い、母親の血液中に循環している胎児細 胞の数および種類に対する情報を得ることができるデータベースを作成する。前 記試験を基にして、懐妊令に応じて正常な範囲の値が存在していることが予想さ れ、そして、妊娠の可能性を指示するものとしての、これらの値に対する偏差を 試験する。特に、母親循環系中の胎児血液の大部分は、胎盤異常、堕胎の危険性 、および子宮内成長遅延に関連付けられ得る。

一般的には、いずれかの侵入性操作を行うに先立って、妊婦から母親静脈血液サ ンプルを採取する。一般的には、１回２０ｍＬから成る静脈血液サンプルを得る 。患者のサブグループにおいて、存在している胎児細胞の数の変化を追跡するた め、４週毎に血液サンプルを採取する許可をめる。血液をＥＤＴＡ中に採取し、 ハンクス液（ＨＢＳＳ）で１＝１希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅカラム （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に置いた後、室温で４０分間１４００ｒｐｍで高速回 転した。単核細胞層を単離し、ＨＢＳＳで２回洗浄した後、蛍光モノクローナル 抗体で染色した。例えば、これは、蛍光イソチオシアネート連結抗トランスフェ リンレセプタ（ＴｆＲ）とフィコエリトリン連結抗単核細胞抗体（Ｍ３、Ｂｅｃ ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号７４９７）と抗リンパ球抗体（Ｌ４、 Ｂｅｅｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号７３４７）とから成る組み合わ せであってもよい。この染色は、２％の胎児ウシ血清および０．１％のアジ化ナ トリウムが入っている燐酸緩衝水溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中、氷上で生じる。フロー 血球計算法に先立って、これらの細胞をＰＢＳ中で洗浄する。Ｃｏｎ５ｏｒｔ　 ４０プログラムが備わっているＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳ− ＩＶを用いて分析および選別を行う。分析した細胞の相対的大きさおよび蛍光（ ２色で）に対してデータを取る。緑色の波長で蛍光を発しくＴ　ｆ　Ｒ陽性）そ して赤色波長で蛍光を発しない（Ｌ４およびＭ３陰性）細胞は、予測される胎児 ＮＲＢＣを含んでいる。

該単核細胞層中の上記細胞のパーセントを記録し、そしてこれらを懐妊令の関数 として分析する。これらの細胞を、顕微鏡法およびＰＣＲ増幅のため選別する。

更に、緑色波長で蛍光を発しない（ＴｆＲ陰性）で赤色波長で蛍光を発する（Ｌ ４および／またはＭ３陽性）細胞を、予測される母親の白血球集団および母親の ＤＮＡ多型性源として選別する。

母親血液中の核形成胎児細胞を試験することの追加的利点は、存在している胎児 ＤＮＡの量を推定することで、正常および異常妊娠における胎児から母親への出 血度合を決定することである。妊娠に関する試験において、平均でｌｎｇから成 る量の胎児ＤＮＡ（１５０個のＮＲＢＣに相当している）が存在していた。１６ 週目の、胎児血液１リツトル当たりのＮＲＢＣの数に関する公開された値（３， ６ｘｌＯリ　（Ｍｉｌｌａｒ、　Ｄ。

Ｓ、他、Ｐｒｅｎａｔ、　Ｄｆａｇｎｏｓｉｓ、　５：３６７−３７３　（１９ ８５）　；　（Ｆｏｒｅｓｔｉｅｒ、　Ｆ、他、Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、、 ２０：３４２−３４６　（１，９８６））を用いそして簡単な計算を行ったとこ ろ、これらの計算結果は、胎児血液の２〜２０ｔｔＬが母親循環系中に出血して いることと一致していた。１６週における胎児胎盤の出血量、即ち約２０ｍＬと 比較したとき、この量は極めて少ない量である。妊娠初期における胎児から母親 への血液浸透に関する標準データを作り上げるだめには、これらの結果を根拠の 有るものにしそして拡張させることが重要である。予測された結果からの逸脱と 妊娠合併症とを相互に関連付けることも同様に重要である。

実施例６　異なる懐妊時点の妊婦から選別した細胞中の男性ＤＮＡ検出懐妊の異 なる時点で、侵入性診断操作に先立って、単純妊娠の健康な婦人から静脈血液サ ンプル（２０ｍＬ）をＥＤＴＡ中に採取した。Ｆｉｃ。

１１／Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によって単核細胞層を単離した後、モノクロ ーナル抗体フルオレセイン（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）連結抗ＴｆＲ、フィコエリトリン（ ＰＥ）連結抗Ｌｅｕ４およびＰＥ連結抗Ｌ　ｅ　ｕ　Ｍ３　（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ ｉｃｋｉｎｓｏｎ　）と−緒に培養した。蛍光活性化細胞選別装置を用いて、２ 重色分析およびフロー選別を行った。

緑色蛍光を示すが赤色蛍光を示さない（ＴｆＲ陽性、Ｌｅｕ４陰性、ＬｅｕＭ３ 陰性）細胞を、無菌ミクロ試験管中に採取した後、−２０℃で凍結した。ポリメ ラーゼ連鎖反応増幅に先立って、沸騰させることによってこれらの細胞を溶解し た。実施例４に記述した標準試薬を用いて、標準条件下でポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）を行った。Ｙ染色体から得た材料を増幅させるために用いたプライマ ーにより、３９７個の塩基対（ｂ　ｐ）から成る配列が明らかになる。ＰＣＲ後 、３２ｐ標識プローブを用い、通常のサザンプロットで患者のサンプルを分析し た。臭化エチジウムでアガロースゲルを染色し、３９７ｂｐ帯（これは、試薬対 照が誤った陽性を示す増幅を示さない時のみ有意であると見なす）の存在に関し てオートラジオグラフを検査した。

上述した反応条件下、５ｐｇの男性ＤＮＡが存在している場合、３９７ｂｐから 成る男性に特異的な帯を検出することが可能であった。これはおおよそ、１つの 細胞中に存在しているＤＮＡ量であった。この反応混合物に過剰の女性ＤＮＡ　 （５００ｎｇ）を加えた場合、この男性に特異的な帯は一定してｉｏｏｐｇで検 出可能であった。

図４は、男胎児を身ごもっている１２人の婦人から得たサンプルの合計を示して いる。これらのサンプルは、妊娠の異なる時点で採取し、そして婦人１人に対し て２回採取した。このデータは、懐妊令と男性ＤＮＡ検出との間に関係が存在し ていることを示している。これは、胎児核形成赤血球が母親の循環系中に転移し ていることに対する可能な生物学的「ウィンドー」になることを意味している。

実施例７　父親の多型性の増幅による女胎児ＤＮＡの検出単純妊娠している健康 な婦人から静脈血液サンプル（２０ｍＬ）をＥＤＴＡ中に採取した。Ｆｉｃｏｌ ｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によって単核細胞層を単離した後、モノクロー ナル抗体フルオレセイン（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）連結抗ＴｆＲ，フィコエリトリン（Ｐ Ｅ）連結抗Ｌｅｕ４およびＰＥ連結抗Ｌｅ　ｕ　Ｍ３　（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ）と−緒に培養した。蛍光活性化細胞選別装置を用いて、２重色分 析およびフロー選別を行った。

緑色蛍光を示すが赤色蛍光を示さない（ＴｆＲ陽性、Ｌｅｕ４陰性、ＬｅｕＭ３ 陰性）細胞を、無菌ミクロ試験管中に採取した後、−２０℃で凍結した。更に、 赤色蛍光を示すが緑色色量光を示さない（ＴｆＲ陰性、Ｌｅｕ４陽性、ＬｅｕＭ ３陽性）細胞を、同様な様式で採取した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅 に先立つて、沸騰させることによってこれらの細胞を溶解した。１ｍＭのＭｇＣ ｌ２が入っている緩衝液を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲで用いたプライマーは 、染色体１７の高度に多型性を示す領域を増幅させる。増幅させたＤＮＡ配列は 、親から子に直接伝達された遺伝子のブロックに相当している。これらの配列に 関する個々の変化度合が高い結果として、両親と同一のＤＮＡパターンが現れる のは一般的でない。従って、これらの選別した胎児細胞中の父親配列の遺伝を示 すことは可能である。これらの配列は染色体１７から来るものであるため、これ らは胎児の性とは独立しており、そしてこれを、母親ＤＮＡから女胎児ＤＮＡを 区別するために使用できる可能性がある。臭化エチジウム染色したアガロースゲ ルを用いた電気泳動によって、増幅させたＤＮＡを分離した。このＤＮＡをナイ ロンフィルターに転移させた後、３２ｐ標識配列を用いて試験した。次に、母親 ＤＮＡ１父親ＤＮＡ、ＴｆＲ＋細胞、およびＴｆＲ−細胞を比較した。

１０人の妊婦中５人で、選別した候補胎児細胞集団中に父親の配列が存在してい ることを示すことができた。他の５人の婦人に関しては、母親ＤＮＡと、その候 補胎児細胞から得られたＤＮＡと、の間にいかなる差異も見いだされなかった。

実施例８　妊娠していない女性の血液、および母親の血液中の胎児細胞の存在を 模擬するために添加した男児へその緒血液、を用いた再構築実験 妊娠していない健康な婦人から静脈血液サンプル（２０ｍＬ）をＥＤＴＡ中に採 取した。正常な新生児から得たへその緒血液サンプル（１０ｍＬ）をＥＤＴＡ中 に採取した。Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離により単核細胞層を単 離した。血球計数器を用いて細胞数を数えた。一定分量から成る細胞に下記を含 有させた＝１）女性細胞単独；２）１０”個の男児へその緒血液細胞を添加した 女性細胞；３）１０”個の男児へその緒血液細胞を添加した女性細胞；４）１０ ’個の男児へその緒血液細胞を添加した女性細胞＋５）１０’個の男児へその緒 血液細胞を添加した女性細胞；６）１０’個の男児へその緒血液細胞を添加した 女性細胞ニア）男児へその緒血液細胞単独。その後、個々の一定分量を、試験す べき個々のモノクローナル抗体と一緒に培養した。フロー血球計算法を用いた分 析および選別を行った。各々の一定分量に対して、二変量のヒストグラムが得ら れ、そして抗体陽性および抗体陰性細胞に対するゲーティング（ｇａｔｉｎｇ） パラメーターを確立した。この選別した細胞を無菌ミクロ試験管中に集めた後、 −２０℃で凍結した。Ｙ染色体に対してユニークな３９７ｂｐ配列を検出するプ ライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。

オートラジオグラフ中の３９７ｂｐ帯の存在を用いて、選別したサンプル中の男 児へその緒血液細胞の存在を確認した。

図５は、ＦＩＴＣ抗トラシトランスフェリンレセプタたとき得られるヒストグラ ムを示している。妊娠していない女性においては、単核細胞の０゜１％がその抗 体と反応する。男児へその血液においては、単核細胞の２４．９％がその抗体と 反応する。妊娠していない女性細胞にへその緒細胞を次々添加するにつれて、そ の抗体と反応する細胞のパーセントが増大することが分かる。

図６は、１０２〜１０６個の男性細胞を添加したとき、ＴｆＲ’細胞中に男性Ｄ ＮＡが検出されることを示している。１０ｓ〜１０８個の男性細胞を添加したと き、ＴｆＲ−細胞中に男性ＤＮＡが検出される。これは、ＴｆＲ−集団中に男性 白血球が存在していることから生じる。

図７は、抗ＨＰＣＡ−１抗体を用いたとき得られるヒストグラムを示している。

妊娠していない女性の場合、単核細胞の０．　９％が抗体と反応する。へその緒 血液の場合、明確に区別できる細胞集団が見られるが、そのパーセントは１．１ ％のみである。従って、ヒストグラム上では、妊娠していない女性細胞にへその 緒血液細胞を添加したことを、トランスフェリンレセプタ抗体を用いたときと同 様には、明確な確認を行うことはできない。添加するへその緒血液細胞の量を増 大するにつれて、集められるＨＰＣＡ”細胞の数が増大した。

１０８〜１０’個の男性細胞を女性細胞に添加したとき、アガロースゲルにおい て、ＤＮＡに一致している３９７ｂｐ帯がＨＰＣＡ”細胞中に検出された。１０ ６個の男性細胞を女性細胞に添加したときのＨＰＣＡ細胞に関して、アガロース ゲル中で男性ＤＮＡが検出された。

本発明の診断上の有用性を示す目的で、ノイズ比に対する良好なシグナル、およ び蛍光シグナルに関する良好な空間的分解能、の両方を与えるところの、染色体 に特異的なプローブから成るＤＮＡプローブセットを構築した。従って、生児出 生異数性としてしばしば見られる５個の染色体、即ち染色体１３．１８．２１、 ＸおよびＹ、のための特異的プローブを開発した。染色体１のためのプローブを 対照として用いた。これらのプローブ構築における一般的な方策は、多数の遺伝 的および物理的方法により所望遺伝子領域に位置している出発クローンを同定し た後、そのクローンを用いて、一致するコスミド「コンチＩ（ｃｏｎｔｉｇ）　 Ｊを同定し、これを次にハイブリッド形成プローブとして用いた。

全ゲノム状ヒトＤＮＡを包含させることによって、高コピー数繰り返し配列のハ イブリッド形成を抑制し、そして中期拡散に対してハイブリッド形成することに よって、染色体の特異性を確認した。これらのプローブは、容易に区別できそし て数を数えることができる界面細胞中に、鋭角で小斑点の有る蛍光シグナルを与 えた。この試験で用いたＹプローブは、ｐＤＰ９７、即ち反復クローン（ｐＵＣ −１３のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化したコスミドＹ９７から得られる５、 ３ｋｂのＥｅｏＲＩ　Ｙフラグメント）であった。全てのプローブをビオチン標 識し、抑制条件下でハイブリッド形成した後、接合させたストレプトアビジン− ＦＩＴＣ（これは、ＦＩＴＣ画像中に単一「ドツト」として示す）によって特異 的ハイブリッド形成を検出した。図８に説明するように、胎児核形成赤血球中の Ｙ染色体に関して、ｐＤＰ９７プローブのインサイチュ−ハイブリッド形成によ ってＹ染色体を検出した。従って、母親血液から単離した胎児細胞に対して、染 色体異常に関する出生前診断を行うことができた。

標識した複合体を検出 ＦＩＧ、３ ・ ・　・　・　・　・　・　・ 懐妊齢（週） ＦＩＧ、５Ａ 圓妊娠していない Ｆ　Ｉ　Ｇ、　５　Ｂ 調＋１ｅｅ男性細胞 ＦＩＧ、５Ｃ 訓トを綿実性細胞 ＦＩＧ、５Ｄ 加◆１ｍ男性細胞 ＦＩＧ、５Ｅ （１■２彊珀男性細胞 ＦＩＧ、５Ｆ 謝１．ｅｅｅ、例時男性細胞 ＦＩＧ、７Ａ 男性へその緒血液、正の対照 男性へその緒血液、負の対照 ＩＧ７Ｃ 妊娠していない女性 ＦＩ　Ｇ、７Ｄ ｗ１■男性細胞 ＦＩＧ、７Ｅ ）ｋ＋＋１ｅｅｅ男性細胞 ＦＩＧ、７Ｆ ＩＩ＆＃＋１９．刺珍男性細胞 ＆ｌ＋ｌｅｅ、４！ｍ男性細胞 ＦＩＧ、７８ ＆ｌ＋１．瞑珀漕帥男性細胞 国際調査報告 １ｍｅｎｕｌ１ｍｖｌ＾−＋　ｃＩＩｎ−ｕ−ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０６６２３ 国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．胎児核形成細胞上に存在しており、血液中に在る他の細胞上に存在している が、それらの両者上には存在していないところの、抗原を基にして、血液中に存 在している他の細胞から、血液のサンプル中に存在している胎児核形成細胞を分 離することから成る、妊婦から得た血液サンプル中に存在している胎児核形成細 胞を分離する方法。
2. ２．該胎児核形成細胞が胎児核形成赤血球である請求の範囲１の方法。
3. ３．胎児核形成赤血球の特性または胎児核形成赤血球以外の細胞の特性を示すが 、両者の特性は示さないところの、免疫原性特徴を基にして、血液中に存在して いる胎児核形成赤血球を選別することから成る、妊婦の血液中に存在している胎 児核形成赤血球のインビトロ分離方法。
4. ４．胎児核形成細胞上に存在している抗原に抗体を結合させるに適当な条件下で 、胎児核形成細胞上に存在しているが母親の細胞上には存在していない抗原に特 異的な少なくとも１種の抗体に全血サンプルを接触させ、それによって、抗体− 胎児核形成細胞の複合体を生じさせた後、該サンプルから抗体−胎児核形成細胞 複合体を分離する、ことから成る、妊婦から得た全血サンプル中に存在している 胎児核形成細胞を分離する方法。
5. ５．ａ）血液サンプルと、１）胎児核形成赤血球上に存在している抗原には特異 的であるが母親の白血球には特異的でない第一モノクローナル抗体、そして２） 母親白血球上に存在しているが胎児核形成赤血球上には存在していない抗原に特 異的な第二モノクローナル抗体とを、特異的抗原にモノクローナル抗体が結合す るに適当な条件下で接触させ、それによって、胎児核形成赤血球／第一モノクロ ーナル抗体複合体および母親白血球／第二モノクローナル抗体複合体を生じさせ 、そしてｂ）母親白血球／第二モノクローナル抗体複合体から胎児核形成赤血球 ／第一モノクローナル抗体複合体を分離する、段階から成る、母親の血液サンプ ル中に存在している胎児核形成赤血球を分離する方法。
6. ６．該第一モノクローナル抗体および該第二モノクローナル抗体を、各々異なる 蛍光材料で蛍光標識した後、段階（ｂ）の分離をフロー血球計算法で行う請求の 範囲５の方法。
7. ７．ａ）母親のサンプルと、胎児核形成赤血球に対して選択性を示す少なくとも １種の検出可能モノクローナル抗体とを、形成可能モノクローナル抗体が胎児核 形成赤血球に結合するに適当な条件下で混合することで、結合した検出可能モノ クローナル抗体を生じさせ、そしてｂ）結合した検出可能モノクローナル抗体を 該サンプルから分離する、 段階から成る、妊婦から得た血液サンプル中に存在している胎児核形成赤血球を 分離する方法。
8. ８．ａ）段階（ａ）で、該母親サンプルと、少なくとも２種の検出可能モノクロ ーナル抗体（ここで、上記検出可能モノクローナル抗体の１番目は、成熟したヒ ト白血球上に存在している抗原そして非常に未成熟な赤血球前駆体上に存在して いる抗原に対して選択性を示すが、成熟した核形成赤血球には特異性を示さず； 上記検出可能モノクローナル抗体の２番目は、胎児核形成赤血球上に存在してい る抗原に対して選択性を示し；上記検出可能モノクローナル抗体の２番目は、胎 児核形成赤血球の表面上に存在している抗原に対して選択性を示すが、成熟した ヒト白血球上に存在している抗原または非常に未成熱な赤血球上に存在している 抗原には選択性を示さず；そしてこの２つの検出可能モノクローナル抗体は個々 に検出可能である）とを混合することで、１番目の結合した検出可能モノクロー ナル抗体と２番目の結合した検出可能モノクローナル抗体を生じさせ、そして ｂ）段階（ｂ）で、核１番目の結合した検出可能モノクローナル抗体と該２番目 の結合した検出可能モノクローナル抗体とを互いに分離させる、 ことを更に含む請求の範囲７の方法。
9. ９．上記検出可能モノクローナル抗体の１番目が、Ｈｌｅ−１、Ｌ４およびＭ３ Ｈｌｅ−１から成る群から選択され、そして上記検出可能モノクローナル抗体の ２番目が抗ＴｆＲ抗体である請求の範囲８の方法。
10. １０．ａ）妊婦から得た血液サンプルを成分層に分離し、上記成分層には単核細 胞層が含まれており、そしてｂ）胎児核形成細胞上に存在しており、単核細胞層 中に在る他の細胞上に存在しているが、両者上には存在していないところの、抗 原を基にして、該単核細胞層中に存在している胎児核形成細胞を、該単核細胞層 中に存在している他の細胞から分離する、段階から成る、妊婦の血液中に存在し ている胎児核形成細胞を分離する方法。
11. １１．段階（ａ）で、該妊婦から得た血液サンプルを、密度勾配遠心分離で、成 分層に分離し、そしてこの胎児核形成細胞が胎児核形成赤血球である請求の範囲 １０の方法。
12. １２．妊婦から得た末梢血液サンプル中に存在している胎児核形成赤血球の集団 を富裕化することで、胎児核形成赤血球が豊富な母親サンプルを生じさせた後、 胎児核形成赤血球の特性または核形成赤血球以外の細胞の特性を示すが、両者の 特性を示さないところの、免疫原性特徴を基にして、胎児核形成赤血球が豊富な 該母親サンプル中に存在している胎児核形成赤血球を選別する、ことから成る、 妊婦の血液中に存在している胎児核形成赤血球を分離する方法。
13. １３．密度勾配遠心分離によって該サンプルを成分層に分離した後、単核細胞層 を取り出すことによって、該末梢血液サンプル中に存在している胎児核形成赤血 球の集団を富裕化する請求の範囲１２の方法。
14. １４．ａ）母親の血液サンプルを成分層に分離し、上記成分層には単核細胞層が 含まれており、 ｂ）段階（ａ）で製造した成分層から該単核細胞層を分離し、ｃ）該単核細胞層 と、１）胎児核形成赤血球上に存在している抗原には特異的であるが母親の白血 球には特異的でない第一モノクローナル抗体、そして２）母親白血球上に存在し ているが胎児核形成赤血球上には存在していない抗原に特異的な第二モノクロー ナル抗体とを、特異的抗原にモノクローナル抗体が結合するに適当な条件下で接 触させ、それによって、胎児核形成赤血球／第一モノクローナル抗体複合体およ び母親白血球／第二モノクローナル抗体複合体を生じさせ、そしてｄ）母親白血 球／第二モノクローナル抗体複合体から胎児核形成赤血球／第一モノクローナル 抗体複合体を分離する、段階から成る、母親の血液サンプル中に存在している胎 児核形成赤血球を分離する方法。
15. １５．該第一モノクローナル抗体および該第二モノクローナル抗体を、各々異な る蛍光材料で蛍光標識した後、段階（ｄ）の分離をフロー血球計算法で行う請求 の範囲１４の方法。
16. １６．ａ）最初に、大きさおよび密度を基にして、サンプル中に存在している核 形成赤血球から、核形成していない赤血球を分離することによって、血液サンプ ル中に存在している胎児核形成赤血球の集団を富裕化することで、富裕化母親サ ンプルを生じさせ、ｂ）更に、この富裕化母親サンプルと、胎児核形成赤血球に 対して選択性を示す少なくとも１種の検出可能モノクローナル抗体とを、検出可 能モノクローナル抗体と胎児核形成赤血球とが結合するに適当な条件下で、混合 することによって、該富裕化母親サンプル中に存在している胎児核形成赤血球の 割合を増すことで、結合した検出可能モノクローナル抗体を生じさせ、そして ｃ）結合した検出可能モノクローナル抗体を該サンプルから分離する、 段階から成る、妊婦から得た血液サンプル中に存在している胎児核形成赤血球を 分離する方法。
17. １７．ａ）段階（ｂ）で、該富裕化母親サンプルと、少なくとも２種の検出可能 モノクローナル抗体（ここで、上記検出可能モノクローナル抗体の１番目は、成 熟したヒト白血球上に存在している抗原そして非常に未成熟な赤血球前駆体上に 存在している抗原に対して選択性を示すが、成熟した核形成赤血球には選択性を 示さず；上記検出可能モノクローナル抗体の２番自は、胎児核形成赤血球表面上 に存在している抗原に対して選択性を示すが、成熟したヒト白血球上に存在して いる抗原または非常に未成熟な赤血球上に存在している抗原に対しては選択性を 示さず；そしてこの２つの検出可能モノクローナル抗体は個々に検出可能である ）とを混合することで、１番目の結合した検出可能モノクローナル抗体と２番目 の結合した検出可能モノクローナル抗体を生じさせ、そして ｂ）段階（ｃ）で、該１番自の結合した検出可能モノクローナル抗体と該２番目 の結合した検出可能モノクローナル抗体とを互いに分離させる、 ことを更に含む請求の範囲１６の方法。
18. １８．上記検出可能モノクローナル抗体の１番目が、Ｈｌｅ−１、Ｌ４およびＭ ３Ｈｌｅ−１から成る群から選択され、そして上記検出可能モノクローナル抗体 の２番目が抗ＴｆＲ抗体である請求の範囲１７の方法。
19. １９．ａ）サンプルから得た末梢血液のサンプル中に存在している胎児核形成細 胞を分離することで、分離した胎児核形成細胞を生じさせ、ｂ）分離した胎児核 形成細胞を処理することで、上記細胞中に存在しているＤＮＡを、相補的ヌクレ オチド配列を用いたハイブリッド形成で利用できるようにし、 ｃ）該段階（ｂ）の生成物と、選択したＤＮＡプローブ（これは、興味の持たれ ている胎児ＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列である）とを、相補的ＤＮ Ａ配列のハイブリッド形成が生じるに適当な条件下で接触させ、そして ｄ）該段階（ｂ）の生成物と、該選択ＤＮＡプローブとの間のハイブリッド形成 を検出する（ハイブリッド形成が生じることは、該胎児ＤＮＡ中に興味の持たれ ている胎児ＤＮＡが存在していることを指示している）、 段階から成る、妊婦から得た血液サンプル中の胎児ＤＮＡの中に在る興味の持た れている胎児ＤＮＡの存在を検出する方法。
20. ２０．ａ）サンプルから得た末梢血液のサンプル中に存在している胎児核形成赤 血球を分離し、 ｂ）分離した胎児核形成赤血球中に存在しているＤＮＡを増幅させることで、増 幅させた胎児ＤＮＡを生じさせ、ｃ）増幅させた胎児ＤＮＡを処理することで、 これを、相補的なヌクレオチド配列を用いたハイブリッド形成で利用できるよう にし、ｄ）段階（ｃ）の生成物と、ＤＮＡプローブ（これは、興味の持たれてい る胎児ＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列である）とを混合し、そして ｅ）該段階（ｃ）の生成物と、該ＤＮＡプローブとの間のハイブリッド形成を検 出する（ハイブリッド形成が生じることは、該胎児ＤＮＡ中に興味の持たれてい る胎児ＤＮＡが存在していることを指示している）、 段階から成る、妊婦から得た末梢血液サンプル中の胎児ＤＮＡの中に在る興味の 持たれている胎児ＤＮＡの存在を検出する方法。
21. ２１．ａ）胎児核形成細胞の表面抗原特性には選択性を示すが、母親白血球の表 面抗原特性には選択性を示さない、少なくとも１種の抗体、ｂ）選択したＤＮＡ プライマー、およびｃ）興味の持たれている胎児ＤＮＡに相補的な少なくとも１ 種のＤＮＡプローブ、 から成る、母親血液サンプル中の興味の持たれている胎児ＤＮＡを検出するため のキット。
22. ２２．ａ）胎児核形成細胞の表面抗原特性には選択性を示すが、母親白血球の表 面抗原特性には選択性を示さない、少なくとも１種の抗体、ｂ）（ａ）の抗体に 対して選択性を示す抗体をその上に固定化した固体状支持体、 ｃ）選択したＤＮＡプライマー、およびｄ）その選択したＤＮＡに相補的な少な くとも１種のＤＮＡプローブ、 から成る、母親血液サンプル中の興味の持たれている胎児ＤＮＡを検出するため のキット。
23. ２３．該固体状支持体が磁性ビードであり、そして更に磁石が備わっている請求 の範囲２２のキット。
24. ２４．ａ）胎児核形成細胞の表面抗原特性には選択性を示すが、母親細胞の表面 抗原特性には選択性を示さない、少なくとも１種の抗体、および ｂ）（ａ）の抗体に対して選択性を示す抗体をその上に固定化した固体状支持体 、 から成る、妊婦から得た血液サンプル中に存在している胎児核形成細胞を分離す るためのキット。