JP2002523746A - 分析物の電気化学的分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 電導性ポリマー膜に固定化または吸着したアダプター分子のアビジン、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ抗体（検出電極は、これらを介して試験する分析物に特異的なレセプターと結合することにより該分析物と特異的になり得る）を有する電導性ポリマー膜でコートした電導性電極を含む、電気化学的分析法に用いる検出電極。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、分析物の電気化学的検出法、および電気化学的検出法に用いる検出
電極に関する。 バイオセンサーを用いる、生物学的液体中の分析物、例えば、種々の抗原、抗
体、ＤＮＡ分子などの電気化学的分析は、機器分析の最も有望で魅力的な方法の
一つである。この分野における興味の持続と多数の刊行物は、この方法の多くの
基本的利点、すなわち、高感受性、簡単さ、および比較的簡単で費用のかからな
い装置の使用により説明づけられる。

【０００２】 分析物の存在に伴う化学信号を測定可能な電気信号に変換する、電導性ポリマ
ーフィルム、例えばポリピロールまたはポリチオフェンの使用に基づくバイオセ
ンサー用具の構築は当該分野で知られている（[1]および[2]参照）。 ＥＰ−Ａ−０１９３１５４には、電気化学的検出に用いる、ポリピロールまた
はポリチオフェンフィルムでコートした電極が記載されている。試験すべき分析
物と相補的なバイオレセプターは、重合後の電導性ポリマーフィルム表面上に吸
着する。ＷＯ８９／１１６４９には、電気化学的アッセイに用いる重合（高分子
）電極の別の製造方法が記載されている。この方法では、所望の結合特異性を有
するバイオレセプター分子は、重合中に電導性ポリマーフィルムに組み込まれる
。各該アッセイにＥＰ−Ａ−０１９３１５４およびＷＯ８９／１１６４９に記載
の方法を用いるには、試験すべき分析物と特異的に結合することができる固定化
バイオレセプターを有する種々の分析物用電極を合成する必要がある。

【０００３】 本出願人の公開された出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／００５４８には、試験する分析
物と特異的に結合する固定化バイオレセプター分子を含む電導性ポリマー層でさ
らにコートされた金属性電位差測定電極を含む電気化学的検出電極を用いる電気
化学的分析の電位差測定法が記載されている。分析物の存在は、固定化バイオレ
セプターに分析物が結合した時の検出電極表面の荷電変化により示される。分析
物検出法は、最初、固定（一定）ｐＨのワーキング緩衝溶液に浸漬した測定用具
で一緒に接続した検出電極と参照電極を含む電気化学的セルを組み立てることに
より実施される。検出電極と参照電極間の電位差のベース値を記録し、次いで、
検出電極および参照電極を、ワーキング緩衝液と同じｐＨの、分析物を含むと思
われるより高いイオン強度の溶液と接触させ、再度電位差を記録する。検出電極
および参照電極を最終的に不純物を含まないワーキング緩衝液に移し、再度電位
を記録する。分析物存在下で一定ｐＨにおける緩衝液のイオン強度の変化から生
じる検出電極と参照電極間の電気差の変化は、分析物の濃度に比例する。

【０００４】 参考文献［１３、１４、１５、１６］および［３］に示すように、バイオレセ
プターを含むポリマーフィルムを有する検出電極の、周囲溶液のイオン強度の段
階的変化に対する反応（電位変化の量および速度）は（いわゆる「イオン−ステ
ップ」法）、大部分、ポリマーフィルムの荷電により決定される。ポリマーフィ
ルムが作られている物質を除き、ポリマーフィルムの荷電は、それと結合するレ
セプター分子の荷電により決定される。特異的分析物とのアフィニティ（親和性
）反応の結果としてレセプターの荷電が変化するならば、検出電極の反応も検出
電極と被検液との接触後に行われるイオン−ステップ法の結果変化するであろう
。大多数の分析物が両向性（amphoteric）の性質を持つため、レセプターの荷電
は溶液のｐＨに依存し、したがって、該荷電はイオン−ステップ法時の溶液のｐ
Ｈを一定に維持するのに非常に重要である。

【０００５】 このように、検出電極と被検液の接触前および後に行われるイオン−ステップ
法に対する検出電極の反応の変化を測定することに基づく、先に記載の方法では
、被検液中の、検出電極と結合するレセプターに特異的な分析物の存在を検出す
ることができる。理想的な場合では、膜中のレセプターの荷電の変動、従って検
出電極反応の変化は、検出電極に結合したレセプターに特異的な分析物の、被検
液中濃度に正比例する。しかしながら、実際の条件では、同じ分析物の荷電はか
なり変動し得るため、定量的に矛盾した結果が生じる。さらに、レセプターの荷
電の変化が常にアフィニティ反応を伴うわけではない。これは、通常、小さいか
または非荷電の抗原を試験する時に生じる［１４］。 まとめると、先行技術文献に記載の、電導性ポリマー電極の使用に基づく電気
化学的検出法の欠点には、検出電極の製造法が産業化になじみにくく複雑である
こと、得られる検出電極の特性の矛盾、検出電極を性能を失わずに保存する能力
に限界があることが含まれる。さらに、電気化学的検出のための先に記載のプロ
トコール、特に、ＰＣＴ／ＧＢ９８／００５４８に記載の方法は、小さい非荷電
の分子、または等電点が検出電極表面に固定化されたレセプターの等電点に近い
分子を検出するための使用は限られている。

【０００６】 本発明は、小さい非荷電の分子を分析できることにより応用範囲が広く、上記
方法に固有の欠点をほぼ持たず、厳密な定量結果をもたらし、該電極の製造法を
産業的製造法によりなじむようにし、分析の生産性を増し、再現性を改善するこ
とにより得られる結果の信頼性を増大させる試料中の分析物の電気化学的分析法
を提供する。 すなわち、最初の局面において、本発明は、アビジン、ストレプトアビジン、
抗ＦＩＴＣ抗体、および電導性ポリマーに固定化または吸着した、少なくとも１
種類のレセプター分子と結合することができる分子からなる群から選ばれるアダ
プター分子を含む電導性ポリマーでコートされた電導性電極を含む、分析物の電
気化学的分析法に用いる検出電極を提供する。

【０００７】 検出電極を用いる電気化学的分析法に固有の重要な問題の１つは、検出電極上
に固定されたレセプターの天然の性質を一定期間にわたり保持する問題である。
この分野で比較的進歩が見られているのは、限られた数の酵素検出電極について
のみである［７］。文献［８、９、１０］で知られた精製レセプターを用いる電
気化学的検出電極の大部分については、その有効な貯蔵期限が全く記載されてい
ない。固定化レセプターの天然の性質の保持は、抗体をレセプターとして用いる
場合に特に重要であるが、これはそれらに固有の高度の構造的変動性があるため
である。 これに対して、抗体や他の生体分子は濃縮溶液の形で保存すると非常に長期に
わたってその有用な特性を保持することが知られており、したがって、実用的特
性を失わずに検出電極を長期貯蔵する問題は、電気化学的検出法の使用前または
実施中にレセプターを急速に固定化することにより克服することができよう。

【０００８】 この問題は、電導性ポリマーに固定化または吸着するいわゆるアダプター分子
を用いることにより本宣誓発明（本発明）において解決される。アダプター分子
の目的は、試験する分析物に特異的なレセプター分子を検出電極表面と結合する
ことである。以下に述べるように、アダプター分子を用いることにより、検出電
極の製造工程を一時的に分けることができる。すなわち、固定化／吸着アダプタ
ー分子を含む電極を製造し、それらを長期間貯蔵し、次いで電気化学的分析前ま
たは分析中に電極上に特異的レセプターを固定するのに便利である。適切なアダ
プター分子を選ぶことにより、全範囲の種々のレセプター分子と結合することが
できるアダプター分子を含む「普遍的」検出電極を製造することも可能である。
試験する分析物の特異性は、単に、適切な特異性のアダプター分子のレセプター
との結合により「普遍的」検出電極に付与される。したがって、もはや電気沈殿
工程中に所望の特異性のレセプターを組み込む必要はない。

【０００９】 タンパク質アビジンおよびストレプトアビジンは、アダプター分子として用い
るのに好ましい。生卵から得られたタンパク質であるアビジンは、それぞれ補助
因子ビオチン１分子と結合することができる１つの部位を有する、４つの同じペ
プチドサブユニットからなる。ビオチン（ビタミンＨ）はすべての生体中に極微
量存在する酵素の補助因子であり、主としてタンパク質やポリペプチドに結合し
てみいだされる。アビジンまたはストレプトアビジン（ある種の細菌培養、例え
ば、Streptomyces abiationから単離されたアビジン）分子との結合反応を開始
し、この反応中に実質的に解離しない（解離定数〜１０^-15Mol/l「ビオチン−ア
ビジン」複合体を形成するビオチン分子の能力はよく知られている［１１、１２
］。

【００１０】 本発明の著者が行った研究は、電導性ポリマーフィルムに固定化したアビジン
およびストレプトアビジンは長期間にわたりその天然の特性を保持し（少なくと
も１年、おそらくそれ以上）、この期間を通してビオチンコンジュゲートレセプ
ターと結合させるのに用いることができることを示した。広範囲の種々の分子に
ビオチンをコンジュゲートさせることができる技術は当該分野でよく知られてい
る。すなわち、固定化アビジンまたはストレプトアビジンを含む検出電極は、適
切なビオチン化レセプターを結合させるだけで簡単に該分析物に対して特異的に
することができる。 アビジンおよびストレプトアビジンは好ましいアダプター分子であるが、別の
アダプター分子、特に少なくとも１種類のレセプター分子と特異的に結合するこ
とができる分子を用いることも本発明の範囲内である。この別のアダプター分子
群に含まれるのはプロテインＡ、プロテインＧ、およびレクチンである。これら
の分子はすべて、少なくとも１種類のレセプター分子と結合する能力を共有し、
このことはそれらがある種のレセプター分子の各メンバーに存在する共通結合部
位モチーフと特異的に結合することができることを意味する（結合相互関係に関
する解離定数は１０^-8Mol/l以下である）。例として、プロテインＡ（Staphyloc
occus aureusから単離するか、または組換えＤＮＡ技術により得られた４２ｋＤ
のポリペプチド）は、免疫グロブリン、特に、広範囲の哺乳動物種由来のＩｇＧ
のＦｃ領域と結合し、プロテインＧ（ＩｇＧ ＦｃレセプタータイプIII、Bjorck
,L.およびKronvall,G., J.Immunol., 133, 969(1984)参照）も、広範囲の哺乳動
物種由来のＩｇＧ分子のＦｃ領域と結合する。レクチンは糖タンパク質や炭水化
物に存在してよい糖部分と結合するタンパク質である。レクチンの各タイプは、
該糖部分に対する特異性を持つため、ある範囲の糖タンパク質や正しい糖部分を
保持する複雑な炭水化物と結合することができよう。

【００１１】 さらなる態様において、抗ＦＩＴＣ抗体をアダプター分子として用いることが
できる。この態様では、分析物に対する検出電極の特異性は、適切な特異性のＦ
ＩＴＣ標識レセプターを抗ＦＩＴＣ抗体と結合させることによりもたらすことが
できる。 電導性ポリマーフィルム中／上にアダプター分子を用いることによっても、ア
ダプター分子による電導性ポリマーの遊離表面のブロッキングと結びついた、検
出電極と接触中の被検溶液成分の非特異的相互作用を減らすことにより電気化学
的分析中に得られる結果の信頼性がかなり改善される。アダプター分子の使用も
、例えば、さらなる表面ブロッキング手順の必要性を除去することにより、検出
電極の製造方法の技術的効率を増大させる。 本発明の電位差測定検出電極は、製造に費用がかからず、便宜上、１回の電気
化学的検出実験や一連の検出実験に使用して捨てることを意図した、ディスポー
ザブル形式で製造することができる。さらに本発明は、電気化学的検出に必要な
検出電極と参照電極の両方を含む電極アセンブリーを提供する。以下で述べるよ
うに、適切な参照電極には銀／塩化銀およびカロメル（塩化水銀）電極が含まれ
る。該電極アセンブリーは、検出電極と参照電極を接続するための電気的接点を
備えた、安価な物質から製造された覆いまたはホルダーを含むディスポーザブル
ユニットとして提供するのが好都合である。 本発明の検出電極は、限定されるものではないが、抗原の二重抗体サンドイッ
チアッセイ、抗体の二重抗原サンドイッチアッセイ、抗原の競合アッセイ、抗体
の競合アッセイ、ヒト抗体検出用の血清学的アッセイ（例えば、標識抗ヒト抗体
を用いるRubella IgG抗体）、およびＩｇＭアッセイ（例えば、IgM−Rubella抗
体）を含む広範囲の電気化学的分析法に用いることができる。

【００１２】 第二の局面において、本発明は、アビジン、ストレプトアビジン、および電導
性ポリマーに固定化した少なくとも１種類のレセプター分子と結合することがで
きる分子からなる群から選ばれるアダプター分子を含む電導性ポリマー層でコー
トされた電導性電極を含む、分析物の電気化学的検出法に用いる検出電極の製造
方法であって、 ａ）電導性ポリマーのモノマー単位とアダプター分子を含む電気化学的重合溶液
を調製し、 ｂ）コートする電極を該電気化学的重合溶液に浸漬し、 ｃ）該電極と電気化学的重合溶液間の周期的電位を適用して該溶液からポリマー
を電気化学的に合成することにより電極をコートする（ここで、周期的電位は少
なくとも１完全周期を適用する）工程を含む方法を提供する。 さらに本発明は、アビジン、ストレプトアビジン、および電導性ポリマーに吸
着した少なくとも１種類のレセプター分子と結合することができる分子からなる
群から選ばれるアダプター分子を含む電導性ポリマー層でコートされた電導性電
極を含む、分析物の電気化学的検出法に用いる検出電極の製造方法であって、 ａ）電導性ポリマーのモノマー単位を含む電気化学的重合溶液を調製し、 ｂ）コートする電極を該電気化学的重合溶液に浸漬し、 ｃ）該電極と電気化学的重合溶液間の周期的電位を適用して該溶液からポリマー
を電気化学的に合成することにより電極をコートし（ここで、周期的電位は少な
くとも１完全周期で適用する）、 ｄ）該アダプター分子が該電極をコーティングする電導性ポリマー上に吸着する
ようなアダプター分子を含む溶液と、該コートされた電極を接触させる工程を含
む方法を提供する。

【００１３】 本発明の方法によれば、電導性ポリマーフィルムは、モノマー溶液からの電気
化学的合成により電導性電極表面に沈殿する。電導性電極は、水性媒質中で安定
な金属または金属に準ずる電導性を有する標準的電位差測定用電極であることが
好ましい。本明細書中の実施例に示すように、電導性ポリマーフィルムの電気的
沈殿は、モノマー、極性溶媒、およびバックグラウンドの電解質を含む溶液を用
いて行われる。ピロール、チオフェン、フラン、またはアニリンが好ましいモノ
マーである。極性溶媒として用いるには脱イオン水が好ましい。 当業者によく知られているように、電導性ポリマーは、該ポリマーの構造およ
び／または電導特性を修飾するために、電気化学的合成段階で添加（dope）され
ることが多い。典型的ドーパント（dopant）アニオンは、重合工程中に組み込ま
れ、ポリマーの基本骨格（バックボーン）の正の荷電を中和する、サルフェート
（ＳＯ_４ ^２−）である。サルフェートはイオン交換により容易に放出されないの
で、ポリマー構造を維持するのを助ける。本発明において、電極の感度を増大さ
せるには、該ポリマー周囲の溶液によるイオン交換について最大能力を有するド
ーパントアニオンを用いることが好ましい。これは、電気化学的重合溶液の調整
時にバックグラウンドの電解質として、アニオンが大イオン半径を有する塩を用
いることにより達成される。アニオンが大イオン半径を有する適切な塩には、ド
デシル硫酸ナトリウムおよびデキストラン硫酸ナトリウムが含まれる。電気化学
的重合溶液中のこれら塩の濃度は試験の種類に応じて０．００５〜０．０５Ｍの
範囲内で変動する。

【００１４】 多くの論文［４、５］が報告しているように、溶液に浸漬した電導性ポリマー
についてイオン平衡が達成される速度およびイオン交換が生じる容易さは、本質
的に、電気沈殿段階で導入される抗イオンのサイズに依存し、抗イオンのイオン
半径がより大きければ、より急速なイオン交換が生じ、より急速に平衡状態に達
する。これは、溶液のイオン組成の変動に応じた「金属電極−電導性ポリマー」
の電位が変化する速度と値に直接結びついている［６］。 電導性ポリマー膜は、いずれも検出電極表面へのレセプターの結合と、緩衝溶
液組成の変動に対して検出電極を敏感にするのを助ける二重の機能を果たす。特
に、電導性ポリマーの酸化還元組成に影響を及ぼす緩衝溶液の組成変化は、検出
電極の定常状態における電位に、対応する変化を生じる。

【００１５】 アダプター分子は、アダプター分子を電気化学的重合溶液に加えることにより
電気化学的合成段階で電導性ポリマーフィルムに固定化されても、電気化学的重
合後に電導性ポリマーフィルム表面に吸着してもよい。前者の場合は、アダプタ
ー分子の溶液を電気沈殿工程の直前に電気沈殿用溶液に加えてよい。完成した溶
液の貯蔵時間が３０分以内である場合、沈殿工程は最適に行われる。特定の試験
の種類に応じて、溶液中のアダプター分子濃度は５．００〜１００．００μｇ／
ｍｌの範囲で変動してよい。アダプター分子含有溶液からの電導性ポリマーの電
気沈殿工程は本明細書中の実施例に記載している。電気沈殿工程が完結したら、
得られた検出電極を、脱イオン水および０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩溶液で連
続してリンスし、次いで、試験の種類に応じて、微生物増殖阻害剤や殺菌剤（例
えばゲンタマイシン）を含む特別な貯蔵用緩衝溶液に入れるか、室温で無塵空気
中で乾燥してよい。

【００１６】 電気沈殿工程完結後にアダプター分子が吸着されるべきである場合は、以下の
プロトコールを用いてよい（本発明はこの特定の方法の使用に何ら限定されるも
のではないことを述べておくが）。検出電極を最初脱イオン水でリンスし、新た
に調製した０．０２Ｍ炭酸緩衝溶液に入れ、これを１５−６０分間保つ。次に、
溶液を満たした容器に検出電極を浸漬するか、または検出電極表面に溶液を１滴
のせることにより、検出電極を濃度１．００〜５０．００μｇ／ｍｌのアダプタ
ー分子を含む、新たに調製した０．０２Ｍ炭酸緩衝溶液と接触させる。検出電極
を、典型的には＋４℃で１〜２４時間、アダプター分子の溶液とインキュベート
する。インキュベーション後、検出電極を脱イオン水でリンスし、０．１Ｍリン
酸緩衝生理食塩水溶液中に１〜４時間置く。試験の種類に応じて、次いで検出電
極を微生物増殖阻害剤または殺菌剤を含む特別な貯蔵緩衝液中に置くか、または
室温で無塵空気で乾燥する。

【００１７】 アダプター分子がアビジンまたはストレプトアビジンである場合は、検出電極
を製造するための上記本発明方法は、所望により、さらにビオチンと結合した特
異的レセプターが、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結
合相互作用により電極の電導性ポリマーコーティングに固定化または吸着したア
ビジンまたはストレプトアビジン分子と結合するように、該ビオチン化レセプタ
ーを含む溶液と該コートされた電極を接触させる工程を含んでいてよい。 本発明の著者および他の研究者［１２］がともに行った研究は、最適条件下でレ
セプターをビオチン化すると、ビオチン化していないものに比べて特性（アフィ
ニティ、貯蔵品質など）が変化しないことを示した。 ビオチン化として当業者に知られた方法である、ビオチンと対応するレセプタ
ーのコンジュゲーション（結合）は、知られた手順の１つ（例えば［１２］に記
載のような）を用いて行うことができる。さらに、多くの既製品の、特異性の異
なるビオチン化抗体が市販されている（例えば、抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇ
Ａビオチン標識ヤギ抗体（Calbiochem-Novabiochem, USA）。

【００１８】 ビオチン化レセプターを用いる大きな利点の１つは、検出電極と、結合したア
ビジンまたはストレプトアビジンと対応するビオチン化レセプターの間の反応を
生じさせることにより検出電極の特異性を変化させることができることである。
先に記載したように、アビジン／ストレプトアビジンが結合した検出電極は事実
上「普遍的検出電極」であり、試験する所望の分子に対する特異性は適切なビオ
チン化レセプターの結合により付与される。試験する分析物に特異的な、アビジ
ンまたはストレプトアビジンが結合した検出電極を製造するには、検出電極上に
結合したアビジンまたはストレプトアビジンとビオチン化レセプター間で反応を
行うが、このためには、溶液を満たした溶液に検出電極を浸漬するか、または検
出電極表面に溶液を滴下することにより、検出電極を室温で後者の溶液と接触さ
せる（溶液中のビオチン化レセプター濃度は一般に０．１〜１００μｇ／ｍｌで
あり、接触時間は３〜１５分間である）。 レセプター分子は別の分子（分析物）と特異的に結合することができるあらゆ
る分子であり得る。適切なレセプターの種類には、モノクローナルおよびポリク
ローナル抗体、キメラ抗体、抗原認識能を保持している抗体断片（例えば、Ｆａ
ｂおよびＦａｂ２断片）、組換えタンパク質およびその断片、合成ペプチド、抗
原、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ分子、ホルモン、ホルモンレセプター、
酵素、化合物などが含まれる。

【００１９】 上記のように、当該分野で知られた、電位差測定用検出電極を用いる電気化学
的検出法は、小さい非荷電の抗原の検出に使用するには限界がある。この問題を
克服し、厳密な定量結果を得るために、荷電標識と結合した第二レセプターまた
は競合分子を用いてよい。 したがって、さらなる局面において、本発明は、試料中の分析物の電気化学的
検出法であって、 ａ）試料中の検出すべき所望の分析物を結合することができるレセプターを固定
化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を得、 ｂ）該所望の分析物が該固定化または吸着レセプターと結合するように試料を含
む被検溶液に検出電極を浸漬し、 ｃ）固定化または吸着レセプターと結合する部位から空間的に離れた部位で該分
析物と結合することができる、荷電標識と結合した第二レセプターを含む溶液と
検出電極を接触させ、 ｄ）処理した検出電極と参照電極の両方を電解液中に浸漬したときの、それらの
間の電位差をモニターし、 ｅ）一定ｐＨにおける電解液のイオン強度の変化に伴う検出電極と参照電極間の
電位差をモニターする工程を含む方法を提供する。 上記方法のアフィニティ反応工程は、同業者によく知られた標準的サンドイッ
チ法に等しい。分析のサンドイッチ形式は、試験に用いるレセプターおよび標識
第二レセプターが抗原上の空間的に異なる種々のエピトープと結合する抗体であ
る多価抗原の検出に特に有用である。該サンドイッチ形式は、抗原が空間的に分
離した２またはそれ以上の同じエピトープを保持する場合にも用い得る。この後
者の場合、試験に用いるレセプターおよび標識第二レセプターは同じ特異性の抗
体であってよい。

【００２０】 競合アッセイ形式で電気化学的分析を行うことも本発明の範囲内である。した
がって、本発明は、試料中の分析物の電気化学的検出法であって、 ａ）レセプター試料中の検出すべき所望の分析物と結合することができるレセプ
ターを固定化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を得
、 ｂ）該所望の分析物が該固定化または吸着レセプターと結合するように試料を含
む被検溶液に検出電極を浸漬し、 ｃ）該固定化または吸着レセプターと結合することができる、荷電標識と結合し
た競合分子を含む溶液と検出電極を接触させ、 ｄ）電解液中に浸漬したときの、処理した検出電極と参照電極の間の電位差をモ
ニターし、 ｅ）一定ｐＨにおける電解液のイオン強度の変化に伴う検出電極と参照電極間の
電位差をモニターする工程を含む方法も提供する。

【００２１】 この競合電気化学的アッセイにおいて、競合分子は、標識分析物、または固定
化／吸着レセプター上の同じ分析物結合部位と結合することができる、標識され
た、分析物の構造的類似体であるかもしれない（図５Ｂおよび図７Ｂ参照）。低
分子の分析物（例えば、本明細書中の実施例に記載のジゴキシン）の検出には、
標識分析物を競合分子として用いるのが特に好ましい。あるいはまた、競合分子
は固定化／吸着レセプターの異なる部位に結合してよい。例えば、固定化レセプ
ターが抗体である場合は、抗免疫グロブリン抗体（好ましくはＦａｂ特異的）、
または適切な特異性の抗イディオタイプ抗体であるかも知れない（図５Ａおよび
図７Ａ参照）。

【００２２】 本出願の図５Ａ、５Ｂ、７Ａ、および７Ｂを参照して当業者が容易に理解する
であろうように、競合検出法は、通常、検出電極表面に過剰のレセプター部位が
あることに依存する。分析物と結合しないレセプターは競合分子と結合するのに
利用されよう。レセプター部位の総数が一定のままであるとすると、結合競合分
子の量は、存在する分析物の量と反比例するであろう。 分析物の濃度と結びついた化学的信号を測定可能な電気信号に変換するには、
第二レセプターまたは競合分子と結合する荷電標識は以下の特性を有するあらゆ
る荷電標識であり得る。（ｉ）パートｄ）の電解液のｐＨで正味の荷電を保持し
、（ii）この荷電の大きさが一定ｐＨでの電解液のイオン強度の変化に応じて変
化する。 好ましい荷電標識は、高度に荷電されており、１静電単位（ｅ）より大きいパ
ート（ｄ）の電解質のｐＨで正味の荷電を有する。荷電標識の荷電の大きさは、
工程（ｄ）および（ｅ）間のイオン強度のステップ変化が検出電極と参照電極間
の検出可能な電位差の変化を生じるように検出電極上の電導性ポリマーコーティ
ングの酸化還元組成に影響を与える。荷電標識は、レセプター／分析物／第二レ
セプター複合体（サンドイッチアッセイ）、またはレセプター／競合分子複合体
（競合アッセイ）の形成において電導性ポリマーに極めて接近するのみである。
すなわち、荷電標識を用いることにより、正しい定量結果を得ることができ、小
さな非荷電の分析物を試験する能力に関して、試験可能な分析物の範囲がかなり
広がる。

【００２３】 ラテックスミクロスフェアは、第二レセプターまたは競合分子と結合した、好
ましい荷電標識である。ラテックスミクロスフェアを用いるコンジュゲーション
は、例えば［１７］または［１８］に記載の、知られた技術の１つ用いるか、ま
たはラテックスミクロスフェアと抗体をコンジュゲーションさせるための特殊な
市販キット、例えば、「Carbodiimide Kit for Carboxylated Beads」（Polysci
ences Inc., USA）を用い、製造業者が提供するプロトコールに従って行うこと
ができよう。ある種の既製のラテックスコンジュゲートは、専門の製造業者（例
えば、Polysciences Inc., USA）から市販されている。 荷電標識を用いる代わりに、分析物濃度に関連する化学信号を測定可能な電気
信号に変換するために、酵素標識と結合した第二レセプターまたは競合分子を用
いる上記方法と同等の電気化学的検出法を実施することもできる。

【００２４】 したがって、本発明は、さらに試料中の分析物の電気化学的検出法であって、
ａ）レセプター試料中の検出すべき所望の分析物と結合することができるレセプ
ターを固定化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を得
、 ｂ）該分析物が該固定化または吸着レセプターと結合するように試料を含む被検
溶液に検出電極を浸漬し、 ｃ）固定化または吸着レセプターと結合する部位から空間的に離れた部位で該分
析物と結合することができる、酵素と結合した第二レセプターを含む溶液と検出
電極を接触させ、 ｄ）処理した検出電極と参照電極の両方を電解液中に浸漬したときの、それらの
間の電位差をモニターし、 ｅ）該酵素の基質を含む電解液に曝露した後の検出電極と参照電極間の電位差を
モニターする工程を含む方法を提供する。

【００２５】 ａ）レセプター試料中の検出すべき所望の分析物を結合することができるレセ
プターを固定化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を
得、 ｂ）該所望の分析物が該固定化または吸着レセプターに結合するように試料を含
む被検溶液に検出電極を浸漬し、 ｃ）該固定化または吸着レセプターと結合することができる、酵素と結合した競
合分子を含む溶液と検出電極を接触させ、 ｄ）処理した検出電極と参照電極の両方を電解液中に浸漬したときの、それらの
間の電位差をモニターし、 ｅ）該酵素の基質を含む電解液に曝露した後の検出電極と参照電極間の電位差を
モニターする工程を含む、対応する競合電気化学的検出法も本発明の範囲内であ
る。

【００２６】 上記方法のある態様において、第二レセプターまたは競合分子と結合した酵素
は、検出電極の電導性ポリマーコーティングの酸化還元組成に直接影響を及ぼす
基質を、電導性ポリマーコーティングの酸化還元組成に対する検出可能な効果を
持たない生成物に変換することができる。そのような酵素の例はホースラディッ
シュパーオキシダーゼである。 別の態様において、第二レセプターまたは競合分子と結合した酵素は、検出電
極の電導性ポリマーコーティングの酸化還元組成に対する検出可能な効果を持た
ない基質を、電導性ポリマーコーティングの酸化還元組成に直接または間接的に
影響を及ぼすことができる生成物に変換することができる。酵素反応の生成物が
電導性ポリマーの酸化還元組成に間接的影響を及ぼし得る１つの方法は、電解液
のｐＨを変化させることである（この態様において、電解液のｐＨは緩衝されな
い）。そのような生成物を生じる酵素の例はウレアーゼである。 さらなる態様において、第二レセプターまたは競合分子と結合した酵素は、検
出電極の電導性ポリマーコーティングの酸化還元組成に対する検出可能な効果を
持たない生成物を、第二酵素の基質である生成物に変換することができる（ここ
で、第二酵素の作用により電導性ポリマーの酸化還元組成に直接または間接的に
影響を及ぼす第二生成物が生じる）。

【００２７】 すべての態様において、コンジュゲート酵素は、レセプター／分析物／第二レ
セプター複合体（サンドイッチアッセイ）の形成、またはレセプター／競合分子
複合体（競合アッセイ）の形成により電導性ポリマーに極めて接近する。 第二レセプターまたは競合分子と酵素標識のコンジュゲーションは当該分野で
知られたあらゆる技術により行ってよい（例えば、［１９］参照）。広く利用可
能な、種々の酵素標識と種々の特異性のレセプターとのコンジュゲートの市販調
製物も使用できる。 上記電気化学的検出法はすべて、別の分子（分析物）と特異的に結合すること
ができるあらゆる種類のレセプターを用いて行うことができる。適切なレセプタ
ーには、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、抗原認識能を
保持する抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦａｂ２断片）、組換えタンパク質お
よびその断片、合成ペプチド、抗原、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＰＮＡ分子
、ホルモン、ホルモンレセプター、酵素、化合物などが含まれる。 第二レセプターまたは競合分子が荷電または酵素標識とコンジュゲートするか
どうかに関わらず、本発明の検出法すべての感度は「連続（逐次）」形式のアフ
ィニティ反応（すなわち、工程（ａ）〜（ｃ））を行うことにより達成される。
これは、試験する分析物が多価抗原である場合に特にそうである（すなわち、サ
ンドイッチアッセイ）。該連続形式では、レセプターが結合した検出電極を、最
初、分析物の存在を試験する試料を含む被検溶液と接触させる。本明細書で用い
ている用語「試料」には、その範囲内に、全血、血清、血漿、尿、リンパ液、能
脊髄液、または精液、周囲（環境）の液体、食品および飲料品産業で使用または
生産される物質、またはそれらのあらゆる希釈物もしくは抽出物が含まれる。試
料には固体物質の溶液もしくは抽出物も含まれてよい。試験溶液用に用いる容器
は、マイクロタイタープレートのウェル、微量遠心チューブ、または適切な大き
さの他のあらゆる容器であってよい。試験溶液の容量は、検出電極の幾何学的大
きさに応じて一般に５〜２００μｌであろう。検出電極と被検溶液の接触時間は
、連続的に攪拌するか攪拌せずに、典型的には１５〜４０℃で３〜３０分間であ
る。

【００２８】 被検溶液と接触後、検出電極を標識第二抗レセプターの溶液を含む溶液に移す
。用いる容器と溶液の容量は検出電極と被検溶液の接触に用いるものと同様であ
る。溶液中の標識第二レセプターまたは標識競合分子の濃度は、試験に必要な感
度に応じて典型的には１〜１００μｇ／ｍｌである。連続的に攪拌するか攪拌せ
ずに、１５〜４０℃で３〜３０分間接触させる。 「連続」形式に代わるものとして、検出電極を適切な標識第二レセプターまた
は標識競合分子を加えた被検溶液と約５〜６０分間の接触時間で接触させること
により行程（ｂ）および（ｃ）を同時に行うことにより、実質的に全試験時間を
減らし、試験手順を簡略化することができる。被検溶液に加える標識第二レセプ
ターまたは標識競合分子の濃度は、その種類、特異的特性、および試験に必要な
感度に応じて、典型的には１〜１００μｇ／ｍｌである。 得られる結果をゆがめることになる、試験する生物学的液体成分と検出電極の
間に生じうる非特異的相互作用や、標識第二レセプターまたは標識競合分子の検
出電極表面への非特異的吸着を排除するために、種々のブロッキング剤を標識第
二レセプターまたは標識競合分子の溶液に加えてよい。適切なブロッキング剤に
は、ウシ血清アルブミン（０．５〜５重量％）、希正常ヒトまたは動物血清（５
〜１０容量％）、ゼラチン（１０〜５０容量％）などが含まれる。そうすること
により検出電極のあらゆる遊離表面が同時にブロッキングされ、標識第二レセプ
ターまたは標識競合分子と検出電極の相互作用が達成される。

【００２９】 本発明の検出法のすべてにおいて、固定化／吸着アダプター分子を含む電極を
用いることができる。特に、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジ
ン、プロテインＡ／抗体、プロテインＧ／抗体、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣまたはレ
クチン／糖結合相互作用によりレセプター分子を検出電極表面に結合させてよい
。 アダプター分子を含む「普遍的」検出電極を用いることにより「ワン−ポット
」形式で検出方法を実施することができる。この態様において、アフィニティ反
応は、相互作用する分子間の接触を最大にし、感度を最大にし、試験時間を最小
にする均質な溶液中で行われる。この場合、レセプター溶液と標識第二レセプタ
ーまたは標識競合分子の溶液は、同時または連続的に、単一反応溶液中の分析物
を含む懸濁試料を含む被検溶液に加えられる。被検溶液中のレセプターおよび標
識第二レセプターまたは標識競合分子の濃度は、典型的にはそれぞれ０．１〜１
００μｇ／ｍｌおよび１−１００μｇ／ｍｌである。次に、結合反応が生じるよ
うに、被検溶液を連続的に混合するか混合せずに１５〜４０℃で５〜６０分間イ
ンキュベートする。次いで、適切なアダプター分子を含む検出電極を、被検溶液
を含む溶液に浸漬するか、または検出電極表面に被検溶液を１滴おくことにより
被検溶液と接触させる。検出電極と被検溶液の接触時間は、典型的には１５〜４
０℃で３〜３０分間である。次に、検出電極に結合した分析物の量を、第二レセ
プターまたは競合分子が荷電標識または酵素標識のいずれで標識されているかに
応じて、「イオン−ステップ」法を用いるかまたは適切な酵素基質を加えること
により測定する。

【００３０】 アフィニティ反応行程が完結したら、電気化学的測定用セルを、測定器でつな
げた検出電極および参照電極を電解質溶液（本明細書ではワーキング溶液とも呼
ぶ）と接触させることにより組み立て、測定装置を用いて一定時間の参照電極に
対する検出電極電位を記録する。市販の適切な大きさの参照電極や本発明を実施
するために設計された電極も参照電極として用いてよい。測定器は、標準的電位
差測定器またはポテンシオスタット（potentiostat）である。本発明を実施する
ために設計され、カスタムソフトウエアで制御されるＰＣ適合電子測定器も用い
ることができる。 検出電極と参照電極を接続するための電気的接点を備え、ケーブルまたは他の手
段で測定器と接続した特殊なホルダーにより検出電極および参照電極を測定器と
好都合に繋ぐことができる。測定システムの全体の大きさを小型化することがで
きる、測定器と一体になったホルダーも使用できよう。 リン酸生理食塩水、トリス−ＨＣｌ、カーボネート、ビカーボネート、アセテ
ート、ボレート（borate）などの水性緩衝溶液をワーキング溶液として用いる。
電気化学的セル中のワーキング溶液の容量は、検出電極の幾何学的大きさに応じ
て典型的には５０〜５０００μｌである。緩衝溶液の容器は、吸着特性が最小限
の物質でできた、あらゆる適切な大きさの容器、例えば標準的マイクロタイター
プレートであってよい。本発明の別の態様は、緩衝溶液をペリスタルティック（
peristaltic）ポンプや他の手段で送り込むことができる、検出電極および参照
電極の一体化ホルダーと連結して使用可能な低容量（＜１ｃｍ^３）のフロースル
ーセルを用いる変形（バリアント）である。

【００３１】 参照電極電位に対する検出電極電位を、電位差測定装置またはポテンシオスタ
ットに接続したチャートレコーダーを用いるか、またはＰＣ適合電子計測器を用
いる特別なプログラムにより一定時間記録する。後者の場合は、該プログラムで
は、予め決定した時間間隔（典型的には３〜５秒毎に合計１０〜１００秒間）で
参照電極電位に対する検出電極電位を評価し、座標「検出電極信号−時間」上に
点の形で結果を表示する。参照電極電位に対する検出電極電位の記録を記録する
ことにより、検出電極のバックグラウンド電位値Ｖ_１を測定し、検出電極のバッ
クグラウンド電位ドリフト（γ）を評価する（これは、最小二乗法を用いて得ら
れる「検出電極信号−時間」曲線の直線化により計算される）。 第二レセプターまたは競合分子を荷電標識と結合させる場合は、一定ｐＨの電
解質溶液のイオン強度を変化させることにより（いわゆる「イオン−ステップ」
法）検出電極に結合した分析物の量を評価する。 イオン−ステップ法では、検出電極および参照電極を備えたホルダーを最初の
ワーキング溶液からイオン強度が異なる同じ組成の第二ワーキング溶液に移すか
、または検出電極および参照電極を浸漬したワーキング溶液にイオン強度の異な
る（高いかまたは低い）緩衝溶液を直接加えることにより、電解質溶液のイオン
強度を変更（上方または下方に）してよい。フロースルーセルを用いる場合は、
異なるイオン強度の緩衝溶液を用いて該セルから最初のワーキング溶液を追い出
すことにより電解質溶液のイオン強度を変更することができる。

【００３２】 種々のイオン強度を有するワーキング溶液は、種々の濃度の塩、例えばＫＣｌ
、Ｎａ_２ＳＯ_４などを加えることにより達成される（それらは、溶液に加えたと
きに完全に解離し、溶液のｐＨを偏らせないことから用いられる）。ワーキング
溶液の塩濃度は０．０１〜０．１Ｍである。 第二レセプターまたは競合分子を酵素と結合する場合は、「イオン−ステップ
」法を行う必要はない。そのかわり、ワーキング溶液の組成はその酵素に適した
基質を加えることにより変更される。このために、検出電極および参照電極を備
えたホルダーを最初のワーキング溶液を含む容器からワーキング溶液および基質
を含む容器に移すか、または基質溶液を検出電極および参照電極を浸漬した最初
のワーキング溶液に直接加えることができる。フロースルーセルを用いる場合は
、基質を含むワーキング溶液を用いてセルから最初のワーキング溶液を追い出す
ことによりワーキング溶液の組成を変更することができる。

【００３３】 用いてよい基質には、ＡＢＴＳ（｛２，２’−アジノ−ビス−［３−エチルベ
ンズチアゾリン−６−スルホン酸］｝）、ＴＭＢ（３，３，５，５’−テトラエ
チルベンジジン）、ＤＡＢ（３，３’ジアミノベンジジン）（ここで、酵素標識
はパーオキシダーゼである）、尿素（ここで、酵素標識はウレアーゼである）、
ｐ−ＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）、ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルホスフェート）（ここで、酵素標識はアルカリホスファ
ターゼである）が含まれる。

【００３４】 ワーキング溶液のイオン強度の段階的変化または酵素基質の添加に応じた参照
電極電位に対する検出電極電位の変動を測定器を用いて一定時間記録する。さら
に、電位差測定装置またはポテンシオスタットに接続したチャートレコーダーを
用いるか、またはＰＣ適合電子計測器を用いる特別なプログラムにより記録を行
う。後者の場合には、該プログラムでは、予め決定した時間間隔（典型的には３
〜５秒毎）で参照電極電位に対する検出電極電位を評価し、座標「検出電極信号
−時間」上に点の形で結果を表示する。個々の試験の種類に応じて、参照電極電
位に対する検出電極電位の変動を記録するの要する時間は３０秒間から６００秒
間の間で変動する。 緩衝溶液のイオン強度が変化する場合は、参照電極電位に対する検出電極電位
の変動について得られる曲線は、通常、放物線の形を取り、電導性ポリマーフィ
ルムの総荷電（導電点）により調節される、緩衝溶液のイオン強度変化に対する
検出電極の反応を示す。

【００３５】 分析をサンドイッチアッセイとして行う場合、該ポリマーフィルムの総荷電の
変動は、試験する分析物の量に正比例する。しかしながら、分析を競合アッセイ
として行う場合、該ポリマーフィルムの総荷電の変動は、試験する分析物の量に
反比例する。 該方法のこの段階が完結したら、参照電極電位に対する検出電極電位の最終値
Ｖ_２を測定する。次に、参照電極電位に対する検出電極電位の変化について以下
の定量的特性を計算することができる。 １．参照電極電位に対する検出電極電位の変化について得られた曲線により示さ
れた面積（積分）：

【数１】 ［式中、Ｔ２−Ｔ１＝参照電極に対する電位またはバックグラウンド電位ドリフ
トを記録するための総時間、ｆ２−「検出電極電位（ミリボルト）対時間」の曲
線、t−電流記録時間、および ２．検出電極のバックグラウンドと最終電位の差（ミリボルト）： δ＝Ｖ_２−Ｖ_１ ワーキング溶液の組成またはイオン強度の変化に応じた検出電極電位変動の定
量的特性に基づいて、被検溶液中の標的分析物の定量的含有量を測定する。

【００３６】 上記のごとく得られたγ、Ｓ_２、および／またはδの値を用い、被検溶液中の
標的分析物量の測定に基づいて、ゼロラインのドリフトγを考慮する値を再計算
し、Ｓ_２ ^γおよび／またはδ^γ値を得ることができる。訂正値Ｓ_２ ^γおよびδ^γ を、「分析結果対標的分析物量」の較正曲線と比較してよい。当業者が容易にわ
かるであろうように、既知の標的分析物量を含む、一定範囲の被検溶液を用い、
上記方法と同様の方法で較正曲線を構築するためのデータを得ることができる。 さらなる局面において、本発明は、試料中の分析物の電気化学的検出法であっ
て、 （ａ）電導性ポリマーに固定化または吸着したアビジンまたはストレプトアビジ
ンを含む電導性ポリマー層でコートした電導性電極を含む検出電極を得（ここで
、該アビジンまたはストレプトアビジン分子は、ビオチン／アビジンまたはビオ
チン／ストレプトアビジン結合相互作用により、検出すべき分析物を結合するこ
とができるレセプター分子と結合する）、 （ｂ）該所望の分析物が該固定化または吸着レセプター分子と結合するように試
料を含む被検溶液と検出電極を接触させ、 （ｃ）検出電極と参照電極の両方を電解液に浸漬したときの参照電極に対する検
出電極電位をモニターし、 （ｄ）一定ｐＨでの電解液のイオン強度または組成の変化に伴う参照電極に対す
る検出電極電位差をモニターする工程を含む方法を提供する。

【００３７】 本電気化学的検出法は、標的分析物のレセプターに対する結合が、別個の荷電
または酵素標識を必要とせずに測定できるような十分大きな検出電極表面の荷電
変化を生じる場合に有用である。特に、この方法は核酸の電気化学的検出に有用
である。検出電極表面に結合した核酸プローブ（例えばオリゴヌクレオチド）に
対する標的核酸のハイブリダイゼーションは、「イオン−ステップ」法により検
出できるような十分大きな荷電変化により達成される。すなわち、荷電標識と結
合した第二レセプターまたは標的分子を用いる必要はない。特異的核酸を含むと
思われる物質（例えば生物学的液体）は、通常、検出法にかける前に増幅工程（
例えばＰＣＲ）にかけてよい。したがって、増幅法にかけた試料について特異的
核酸の電気化学的検出法を行うことも本発明の範囲内である。 さらに本発明は、以下の実施例（限定のためではない）およびそのおもな実施
段階を示す添付図を参照して理解されよう。

【００３８】 実施例で用いた試薬、物質、および装置は以下の通りであった。 試薬および物質： ピロール（＞９８％）はMerckから購入し、使用前に減圧蒸留により２回精製
し、次いで＋４℃、Ｎ_２下にて不透明容器中で貯蔵した。 以下の試薬はすべてSigma Chemical Co.(USA)から購入した： 水酸化カリウム（KOH）、ACS試薬）、水酸化ナトリウム（NaOH、ACS試薬）、ア
ジ化ナトリウム（Sigma Ultra）、硫酸セリウム(IV)（ACS試薬）、塩化カリウム
（Sigma Ultra）、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Sigma Ultra）、
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、＞９９％）、デキストラン硫酸ナトリウム（mol
.wt.〜８０００）、イソプロピルアルコール（ACS試薬）、アセトン、塩化水素
酸（ACS試薬）、塩素酸（ACS試薬）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ACS試薬
）、グリシン緩衝溶液０．２Ｍ）、「トリス緩衝生理食塩水錠」、「リン酸緩衝
生理食塩水錠」、o-フェニレンジアミン・２塩酸錠」、ウシ血清アルブミン(RIA
級、分画Ｖ)、凍結ウシ血清、ストレプトアビジン（Streptomyces abidinii由来
）、ＮＨＳ−ｄ−ビオチン、ジメチルスルホシキド（DMSO、ACS試薬）、 ビオチン−Ｘ−Ｘ−ＮＨＳ、ウシアルブミンに対するウサギポリクローナル抗体
、マウスＩｇＧに対するヤギポリクローナル抗体とウレアーゼのコンジュゲート
、ジコキシン、マウスモノクローナル抗ジコキシンクローンＤＩ−２２ビオチン
コンジュゲート、パーオキシダーゼ（１００単位／ｍｇ固体）、ディスポーザブ
ル透析バッグ（MWCO 1,000）、特記しない限り、リン酸緩衝生理食塩水溶液（Ｐ
ＢＳ）はｐＨ７．４を用いた。

【００３９】 Ｂ型肝炎表面抗原に対するマウスモノクローナル抗体（ＨＢｓＡｇ）（５．７
ｍｇ／ｍｌ、０．０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液中）
、マウスＩｇＧに対するヒツジポリクローナル抗体（１０．０ｍｇ／ｍｌ、０．
０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液中）、およびＨＢｓＡ
ｇに対するマウスモノクローナル抗体とパーオキシダーゼのコンジュゲート（２
．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液
中）は、Sorbent-Service Ltd.（Russia）から購入した。 凍結乾燥インスリン（ウシ、〜２０ＩＵ／ｍｇ）、およびインスリンに対する
モノクローナル抗体（１．２ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水溶液中）はRuss
ian Academy of Medical Sciences付属のCardiology Research Centreのメンバ
ーより寄付。 ニックトランスレーションによりビオチン化した二本鎖ＤＮＡプローブ（長さ
〜１ｋｂ）の凍結乾燥調製物［２０］、ビオチン化ＤＮＡプローブと相補的な二
本鎖ＤＮＡの凍結乾燥調製物、ビオチン化ＤＮＡプローブと相補的でない二本鎖
ＤＮＡの凍結乾燥調製物、サケ精液由来ＤＮＡの凍結乾燥調製物、およびＤＮＡ
ハイブリダイゼーション用緩衝溶液は、すべてMinistry of Health付属のScient
ific Research Institute of Biophysicsのメンバーより寄付。

【００４０】 Polybead（登録商標）Sulphate Microspheres (2.5% Solids-Latex、０．２μ
ｍ)はPolysciences Inc.から購入した。 Lavsan（登録商標）フィルム（〜５００μｍ厚）はVladimir Chemical Plant(
Russia)から購入。 真空中に分散したクロミウム標的およびフォトレジスト<<ＦＰ−３８３>>は、
NIIPIK Institute（Russia）から購入。 脱イオン水（試薬級、抵抗＞１８ＭΩ）は、Millipore Milli-RO/Milli-Q Sys
temを用いて得た。 プラチナ線、厚さ〜０．５ｍｍ。 Ｂ型肝炎表面抗原の第二英国ワーキング標準品（HbsAg濃度、０．５０ｉＵ／
ｍｌ）、North London Blood Transfusion Centre, UKより寄付。 HBsAg陽性ヒト血清試料、North London Blood Transfusion Centre, UKより寄
付。

【００４１】 装置： ＵＶＮ真空沈殿（deposition）ユニット（Russia）。 <<ＰＮＦ−６Ｔｓ>>フォトレジスト適用ユニット（Russia）。 自家製フォト−テンプレート（WO96/02001の図１、図３または図４に示す電極
デザインをもたらすフォト−テンプレートが適している）。 自家製Soxhlet装置。 ＥＵ１８乾燥加熱キャビネット（Jouan,France）。 <<ＰＩ−５０．１>>標準積分器（integrator）と２座標(twin-coordinate)レ
コーダー付きポテンシオスタット−ガルバノスタット（galbanstat）。 ２チャンネルレコーダー２２１０（LKB-Pribori, Sweden）。 標準コンビネーション電極付きチェックメートｐＨメーター(Mettler, Switze
rland)。 自家製Ａｇ／ＡｇＣｌセミミクロ参照電極；直径〜２．５ｍｍ、飽和ＫＣｌ溶
液充填。 Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極Ｎ°４７６３７０（Corning）。 増幅器とアナログ−デジタル変換器を含む、目的に合わせて設計したＰＣ適合
測定器；注文（カスタム）ソフトウエアで制御。 目的に合わせて設計した検出電極および参照電極ホルダー。

【００４２】 （実施例）実施例１． ＨＢｓＡｇ測定法：競合アッセイ；試料−希釈標本；受容体（レセプター）−
ビオチン化したモノクローナルマウス抗−ＨＢｓＡｇ；競合分子−標識化したヒ
ツジポリクローナル抗−マウスＩｇＧ；電荷標識−ラテックス。

【００４３】 １．１． 電極物質は、６０×４８ｍｍのラブサン（Ｌａｖｓａｎ）フィルムか
ら製造し、次いで熱イソプロパノール蒸気中で洗浄し、熱イソプロパノール蒸気
中で乾燥した。マグネトロン析出によって、該物質にクロム層（０.０５μｍ）
を塗布した。遠心分離によって、そのクロム層にフォトレジストを塗布し、＋８
０℃で２０分間乾燥した。パターン化した感光基板を通した紫外線を用いて、フ
ォトレジスト層を露光させた。フォトレジスト層をＫＯＨ溶液中で現像し、次い
で＋１００℃で２０分間乾燥した。硫酸第２セリウム中でエッチングすることに
よって、クロムパターンを得た。ジメチルホルムアミドを用いて、フォトレジス
トを除き、続いてイソプロパノール蒸気中ですすぎ、乾燥した。塩化金（ＩＩＩ
）溶液からガルバニ析出によって、クロムパターンに金層（０.５０μｍ）を塗
布し、続いてイソプロパノール中ですすぎ、乾燥した。

【００４４】 １．２． その結果得られた電極を、２〜５％のＫＯＨ溶液中で３０分間かけて
２回洗浄し、次いで脱イオン水ですすぎ、アセトン中で５分間、２回洗浄し、次
いで室温で２０分間、風乾した。次いで、その電極をフッ素プラスチックホルダ
ーに装着し、ソックスレット容器（Ｓｏｘｈｌｅｔ ｖｅｓｓｅｌ）中に置き、
熱イソプロピルアルコール中で０.５〜２時間洗浄した。次いで、電極を完備し
たホルダーをソックスレット容器から取りだし、電極をイソプロピルアルコール
蒸気中で乾燥した。これらの操作が完結後、その電極を封したガラス容器中に置
いた。

【００４５】 １．３． 塩化ナトリウム（８.０ｇ）、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン（１２.２ｇ）、塩化カリウム（０.２ｇ）およびアジ化ナトリウム（０.１ｇ
）を脱イオン水（１Ｌ）に溶解することによって、検出電極用の保存液を調製し
た。

【００４６】 １．４． ＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体を、以下の通りビオチン化し
た。

【００４７】 ２０トリスで緩衝化した生理食塩水の錠剤およびアジ化ナトリウム（０.１５
ｇ）を脱イオン水（１.５０Ｌ）に溶解することによって、アジ化ナトリウムを
含有する０.０１Ｍ トリスで緩衝化した生理食塩水（ｐＨ ８.０）を調製した
。

【００４８】 ＮＨＳ−ｄ−ビオチン（１.０ｍｇ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解した。

【００４９】 購入したＨＢＳＡｇのマウスモノクローナル抗体（５.７ｍｇ／ｍＬ、１７６
μＬ）を、０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（８２４μＬ）を含む
ミクロチューブに加えた。

【００５０】 その得られた溶液に、ＮＨＳ−ｄ−ビオチンのＤＭＳＯ溶液（５０μＬ）を加
えた。

【００５１】 その混合物を含むミクロチューブをサーモミキサーに入れ、絶えず混合しなが
ら、＋２２℃の温度で４時間保った。

【００５２】 次いで、その混合物を、５００倍の過剰量のアジ化ナトリウムを含有するトリ
スで緩衝化した生理食塩水（０.０１Ｍ）を用いて４℃で終夜透析した。

【００５３】 得られたビオチン化抗体の溶液を少量のアリコート（〜１０μＬ）毎に分け、
＋４℃で保存した。

【００５４】 １．５． マウスＩｇＧのヒツジポリクローナル抗体を、以下の通りラテックス
ミクロフェアと接合した。

【００５５】 ０.２Ｍ グリシン緩衝液（５００ｍＬ）を脱イオン水（５００ｍＬ）に加え
、得られた混合物に塩化ナトリウム（８.５ｇ）およびアジ化ナトリウム（０.１
ｇ）を溶解し、０.１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８.２に調節することによ
って、アジ化ナトリウムを含有するグリシンで緩衝化した生理食塩水（ｐＨ ８
.２）を調製した。

【００５６】 購入したマウスＩｇＧのヒツジポリクローナル抗体（１０ｍｇ／ｍＬ、６０μ
Ｌ）を、グリシンで緩衝化した生理食塩水（９４０μＬ）を含むミクロチューブ
に加えた（標識化する前に、ポリクローナル抗体をアフィニティー精製すること
が好ましい）。

【００５７】 ポリベッド（登録商標）スルフェートミクロフェアの懸濁液（２.５％、２０
０μＬ）を得られた溶液に加えた。

【００５８】 その混合物を含むミクロチューブをサーモミキサーに入れ、絶えず混合しなが
ら、３７±１℃の温度で３０分間保った。

【００５９】 次いで、その混合物を含むミクロチューブを室温まで冷却し、それにウシ血清
アルブミン（０.０１ｇ）を加えた。

【００６０】 得られた標識化抗体の溶液を少量（〜５μＬ）のアリコート毎に分け、＋４℃
で保存した。

【００６１】 １．６． 重合する前に、モノマー（例えば、ピロール）を標準水冷装置中で常
圧下、１３５〜１４０℃で蒸留し、封した不透明な容器中でＮ_２下、−２０℃〜
−５℃で保存した。電気化学的重合の溶液中でのモノマー濃度は、試験の種類に
応じて０.３〜１.０Ｍの範囲内で変わる。

【００６２】 本実施例において、ピロールの電気化学的重合用の溶液を、以下の通り調製し
た。

【００６３】 新たに蒸留したピロール（２.５ｍＬ）およびＳＤＳ（０.０２ｇ）を脱イオン
水（２０.０ｍＬ）に溶解した。

【００６４】 リン酸塩で緩衝化した生理食塩水の錠剤を脱イオン水（２００ｍＬ）に溶解し
、ストレプトアビジン（４.０ｍｇ）をＰＢＳ（２ｍＬ）に溶解した。

【００６５】 ピロールおよびＳＤＳの溶液に、ストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（１ｍＬ）
を加えた。

【００６６】 最終的な溶液を回転式ミキサー中に入れ、１０分間混合した。

【００６７】 １．７． 電析プロセスは、３電極の電気化学的セル（例えば、作用電極、参照
電極および補助（対）電極を含む）中で行われる。作用電極は、上記の通り製造
した金属の電位差電極であり、補助電極は金または白金のワイヤーの１片であり
、参照電極は銀／塩化銀電極である。

【００６８】 析出は、作用電極に連続して掃引電圧をかけたポテンシオスタットを用いて行
う。高分子フィルムの所望の厚さおよび性質に応じて、電位掃引下限、電位掃引
上限、電圧掃引速度および掃引の周期数は変化し、典型的にはそれぞれ、−５０
０ｍＶ〜＋８００ｍＶ、＋１０００ｍＶ〜＋２０００ｍＶ（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照
電極に対する相対値）、２５〜２００ｍＶ／秒および３〜３０である。

【００６９】 本実施例において、以下の通り、電着によってストレプトアビジンが結合した
電極上のポリピロールフィルムを得た。

【００７０】 電気化学的重合の溶液（２００μＬ）を、ミクロタイタープレートのウェルに
入れた。

【００７１】 ポテンシオスタットにつないだ電極、白金ワイヤーおよび半微量参照電極をそ
のウェルに浸した。

【００７２】 参照電極に対する電位の周期的な掃引は、掃引速度を１５０ｍｖ／分で、＋８
００〜＋１８００ｍＶの範囲とした。

【００７３】 ポリピロールフィルムの形成プロセスは、ポテンシオスタットの対応する出力
につないだ対座標チャート記録計を用いる電圧−電流曲線について、およびポテ
ンシオスタットの対応する出力につないだ積分器およびチャート記録計を用いる
電極を通過する総電気量について追跡した。析出方法全般にわたって、最初に作
用電極を通過する電気量と、次の周期のものとが１５％より多く違わないことを
確認するためにチェックを行った。

【００７４】 ポリピロールフィルムが特定の厚さに達すれば（電位掃引周期数−８；電極を
通過する総電気量−７５０ｍＣ）、そのプロセスを停止した。

【００７５】 １．８． ストレプトアビジンが結合したポリピロールフィルムでコーティング
された検出電極をウェルから取り出し、脱イオン水、続いて０.０１Ｍ リン酸
塩で緩衝化した生理食塩水（ｐＨ ７.４）ですすぎ、保存液（３００μＬ）を
入れたミクロチューブ中に置き、このものを＋４℃で保存した。

【００７６】 １．９． 検出電極の必要な電気量を得るために、工程１．７から１．８を繰り
返した。

【００７７】 １．１０． 別々のミクロチューブ中で、Ｂ型肝炎表面抗原用第２英国ワーキン
グ標準液（Second British Working Standard for Hepatitis B Surface Antige
n）の１００、５０、２５および２０μＬに、ウシ血清をそれぞれ１００、１５
０、１７５および１８０μＬを加えて、希釈倍数が２、４、８および１６で、予
め解凍したウシ血清中でＢ型肝炎表面抗原用第２英国ワーキング標準液を希釈す
ることによって、ＨＢｓＡｇ濃度が既知の試料群（２００μＬ）を製造した。純
粋なウシ血清は、ＨＢｓＡｇ含有量が０である試料を得るために使用した。

【００７８】 １．１１． ビオチン化したＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体の適当な力
価溶液（０.２ｍＬ）を、０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（１９.
８ｍＬ）に加え、回転式振とう器中で十分に撹拌し、次いでアリコート（２００
μＬ）毎にミクロチューブ中に分配した。

【００７９】 １．１２． 標識化した（ラテックス接合した）マウスＩｇＧのヒツジポリクロ
ーナル抗体の適当な力価溶液（０.１ｍＬ）を、０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化し
た生理食塩水（１９.９ｍＬ）に加え、回転式ミキサー中で十分に混合し、次い
でアリコート（２００μＬ）毎にミクロチューブ中に分配した。

【００８０】 １．１３． 作用緩衝液Ｎ°１を以下の通り調製した。

【００８１】 リン酸塩で緩衝化した生理食塩水の錠剤を、脱イオン水（２００ｍＬ）に溶解
した。

【００８２】 ウシ血清アルブミン（２ｇ）およびＫＣｌ（０.３７ｇ）を、得られた溶液に
溶解した。

【００８３】 １．１４． リン酸塩で緩衝化した生理食塩水の錠剤を脱イオン水（２００ｍＬ
）に溶解することによって、作用緩衝液Ｎ°２を調製した。

【００８４】 １．１５． ストレプトアビジンが結合したポリピロールフィルムでコーティン
グされた検出電極の適当な数を保存緩衝液から取り出し、各々を、ビオチン化し
たＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体溶液を含む１ミクロチューブ（工程１
．１１由来）中に置き、室温で１０分間インキュベートした。

【００８５】 １．１６． １．１５の完結後、ビオチン化した抗体溶液を含むミクロチューブ
から検出電極を取り出し、各々を、ＨＢｓＡｇ濃度が既知の試料を含む１ミクロ
チューブ（工程１．１０由来）中に置き；次いで、検出電極を入れたミクロチュ
ーブをサーモミキサー中に置き、絶えず撹拌しながら、３７±１℃の温度で１５
分間保った。

【００８６】 １．１７． １．１６の完結後、試料を含むミクロチューブから検出電極を取り
出し、ラテックスを接合させたマウスＩｇＧのヒツジポリクローナル抗体を含む
ミクロチューブ（工程１．１２由来）中に置き、次いで回転振とう器に置き、絶
えず撹拌しながら、室温で５分間保った。

【００８７】 １．１８． １．１７の完結後、そのミクロチューブから検出電極を取り出し、
０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水中で３〜５秒間すすぎ、各々を作
用緩衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレート中に置いた。

【００８８】 １．１９． ＰＣベースの測定装置につないだホルダーの電気接触子に、検出電
極および参照電極をつなぎ、その検出電極および参照電極が溶液に浸るように、
作用緩衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレートの上方にそのホルダ
ーを設置した。

【００８９】 １．２０． 特注のソフトウェアを始動させ、参照電極電位に対する検出電極電
位（ミリボルト単位）を記録するために、３０秒間使用した。

【００９０】 １．２１． １．２０の完結後、１，１９に記載の方法と同様にして、作用緩衝
液Ｎ°２で十分に満たしたミクロタイタープレートの上方に、そのホルダーを設
置した。

【００９１】 １．２２． 参照電極電位に対する検出電極電位（ミリボルト単位）の変化を記
録するために、特注のソフトウェアを１００秒間、使用した。

【００９２】 １．２３． 特注のソフトウェアを用いて、バックグラウンドと検出電極の最終
電位間の電位差δ（ミリボルト単位）を算出した。

【００９３】 １．２４． １，１９−１．２１に記載の操作を、工程１．１０で製造したＨＢ
ｓＡｇの濃度が既知の試料を用いて順番に繰り返した。

【００９４】 １．２５． 工程１．２４で得られた結果に基づいて、曲線「試料中のＨＢｓＡ
ｇ濃度に対するδ」（図１０）をプロットするために、外注ソフトウェアを使用
し、検出電極システムの絶対感度の閾値下限をこの曲線から決定した。

【００９５】実施例２ ＨＢｓＡｇ測定法：競合アッセイ；試料−希釈標本；受容体−ビオチン化した
モノクローナルマウス抗−ＨＢｓＡｇ；競合分子−標識化したヒツジポリクロー
ナル抗−マウスＩｇＧ；電荷標識−ラテックス。

【００９６】 ２．１． １．１−１．５に記載の方法を行った。

【００９７】 ２．２． ピロールの電気化学的重合用の溶液を、以下の通り調製した。

【００９８】 新たに蒸留したピロール（２.５ｍＬ）およびＳＤＳ（０.０５ｇ）を、脱イオ
ン水（２０.０ｍＬ）に溶解した。

【００９９】 ２．３． 以下の通り、ポリピロールフィルムを電着によって得た。

【０１００】 電気化学的重合の溶液（２００μＬ）をミクロタイタープレートのウェルに入
れた。

【０１０１】 ポテンシオスタットにつないだ電極、白金ワイヤーおよび半微量参照電極をウ
ェルに浸した。

【０１０２】 参照電極に対する電位の周期的な掃引は、掃引速度を１００ｍＶ／秒で、＋８
００〜＋２２００ｍＶの範囲をかけた。

【０１０３】 ポリピロールフィルムの製造プロセスは、ポテンシオスタットの対応する出力
につないだＸ−Ｙチャート記録計を用いる電圧−電極曲線について、およびポテ
ンシオスタットの対応する出力につないだ積分器およびチャート記録計を用いる
電極を通過する総電気量について追跡した。

【０１０４】 特定の厚さのポリピロールフィルムに達すれば（電位掃引周期数−６；電極を
通過する総電気量−７５０ｍＣ）、そのプロセスを停止した。

【０１０５】 ２．４． ポリピロールフィルムでコーティングされた検出電極をウェルから
取り出し、脱イオン水、続いて０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（
ｐＨ ７.４）ですすぎ、保存液（３００μＬ）を入れたミクロチューブ中に置
き、これを＋４℃で保存した。

【０１０６】 ２．５． 検出電極の必要な電気量を得るために、２．１〜２．４に記載の方法
を繰り返した。

【０１０７】 ２．６． リン酸塩で緩衝化した生理食塩水の錠剤を脱イオン水（２００ｍＬ）
に溶解し、得られた溶液にストレプトアビジン（１.０ｍｇ）を溶解することに
よって、ストレプトアビジン溶液を調製した。

【０１０８】 ２．７． ストレプトアビジンは、以下の通り検出電極を覆っているポリピロー
ルフィルムの表面に結合した。

【０１０９】 ストレプトアビジン溶液は、アリコート（２００μＬ）毎にミクロチューブ中
に分配した。

【０１１０】 ポリピロールフィルムでコーティングされている検出電極を保存緩衝液から取
り出し、各々を、ストレプトアビジン溶液を入れたミクロチューブ中に置き、＋
４℃で１８時間インキュベートした。

【０１１１】 ストレプトアビジン溶液を含むミクロチューブから検出電極を取り出し、０.
０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水で洗浄し、各々を保存緩衝液に入れ、
次いで＋４℃で保存した。

【０１１２】 ２．８． ＨＢｓＡｇ濃度が既知の試料群を、１．１０に記載の通り調製した。

【０１１３】 ２．９． ビオチン化したＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体の適当な力価
溶液（０.１ｍＬ）を、０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（１９.９
ｍＬ）に加え、回転振とう機中で十分に混合し、次いでアリコート（２００μＬ
）毎にミクロチューブ中に分配した。

【０１１４】 ２．１０． 標識化した（ラテックス接合した）マウスＩｇＧのヒツジポリクロ
ーナル抗体の適当な力価溶液（０.１ｍｌ）を０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した
生理食塩水（１９.９ｍＬ）に加え、回転式ミクサー中で十分に混合し、次いで
アリコート（２００μＬ）毎にミクロチューブ中に分配した。

【０１１５】 ２．１１． 作用緩衝液Ｎ°１は、１．１３に記載の通り調製した。

【０１１６】 ２．１２． 作用緩衝液Ｎ°２は、１．１４に記載の通り調製した。

【０１１７】 ２．１３． ストレプトアビジンが結合したポリピロールフィルムでコーティン
グされた検出電極を保存緩衝液から取り出し、各々を、ビオチン化したＨＢｓＡ
ｇのマウスモノクローナル抗体溶液を含むミクロチューブ（工程２．９由来）中
に置き、室温で１０分間インキュベートした。

【０１１８】 ２．１４． ２．１３の完結後、ビオチン化抗体の溶液を含むミクロチューブか
ら検出電極を取り出し、各々を、ＨＢｓＡｇ濃度が既知の試料を含む１ミクロチ
ューブ（工程２．８由来）中に置き、次いで、その検出電極を入れたミクロチュ
ーブをサーモミキサー中に置き、絶えず混合しながら、３７±１℃で１５分間保
った。

【０１１９】 ２．１５． ２．１４の完結後、試料を含むミクロチューブから検出電極を取り
出し、ラテックスを接合させたマウスＩｇＧのヒツジポリクローナル抗体溶液を
含むミクロチューブ（工程２．１０）中に置き、次いで回転式振とう機中に置き
、絶えず混合しながら、室温で５分間保った。

【０１２０】 ２．１６． ２．１５の完結後、ミクロチューブから検出電極を取り出し、０.
０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水中で３〜５秒間すすぎ、各々を作用緩
衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレート中に置いた。

【０１２１】 ２．１７． ＰＣベースの測定装置につないだホルダーの電気接触子に、検出電
極および参照電極をつなぎ、その検出電極および参照電極が溶液に浸るように、
作用緩衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレートウェルの上方にその
ホルダーを設置した。

【０１２２】 ２．１８． 特注のソフトウェアを始動させ、参照電極電位に対する検出電極電
位（ミリボルト単位）を記録するのに、３０秒間使用した。

【０１２３】 ２．１９． ２．１８の完結後、２．１７に記載と同様な方法で、作用緩衝液Ｎ
°２で十分に満たしたミクロタイターウェルプレートの上方に、そのホルダーを
設置した。

【０１２４】 ２．２０． 参照電極に対する検出電極電位の変化（ミリボルト単位）を記録す
るために、特注のソフトウェアを１００秒間使用した。

【０１２５】 ２．２１． 特注のソフトウェアを用いて、バックグラウンドと検出電極の最終
電位間の電位差（δ）（ミリボルト単位）を算出した。

【０１２６】 ２．２２． 工程２．８で製造した濃度が既知の試料を用いて、２．１７〜２．
１０に記載の操作を順番に繰り返した。

【０１２７】 ２．２３． 工程２．２２で得られた結果に基づいて、検量曲線「試料中のＨＢ
ｓＡｇ濃度に対するδ」をプロットするために、外注ソフトウェアを使用した。

【０１２８】 ２．２４． 希釈倍数が１０、１００、１０００、５０００および１００００の
試料群を製造するために、ＨＢｓＡｇ陽性血清の多数の試料（ＨＢｓＡｇ濃度が
未知のものを含む）を、予め解凍したウシ血清中で各々逐次希釈した。各希釈液
のアリコート（２００μＬ）を別々のミクロチューブに入れた。

【０１２９】 ２．２５． 各希釈液中のＨＢｓＡｇ濃度を測定するために、工程２．１３〜２
．２１に記載の方法を用い、これらの結果および工程２．２３で得られた検量曲
線を、元の（希釈していない）血清試料中でのＨＢｓＡｇ濃度を算出するのに使
用した（図１１）。

【０１３０】実施例３． 抗−アルブミン抗体測定法：競合アッセイ；試料−アルブミンに対するウサギ
ポリクローナル抗体；受容体−ビオチン化したウシ血清アルブミン；競合分子−
標識化したアルブミンのウサギポリクローナル抗体；電荷標識−ラテックス。

【０１３１】 ３．１． １．１〜１．３に記載の方法を行った。

【０１３２】 ３．２． １．４に記載の通り、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をビオチン化し
た。得られたビオチン化ＢＳＡ溶液を、少量のアリコート（〜１０μＬ）毎に分
け、＋４℃で保存した。

【０１３３】 ３．３． １．５に記載の方法に従って、ウシアルブミンのウサギポリクローナ
ル抗体をラテックスミクロフェアと接合した。得られた標識化抗体の溶液を少量
のアリコート（〜５μＬ）毎に分け、＋４℃で保存した。

【０１３４】 ３．４． ２．２．に記載の通り、ピロールの電気化学的重合用の溶液を調製し
た。

【０１３５】 ３．５． ２．３．に記載の通り、電着によってポリピロールフィルムを得た。

【０１３６】 ３．６． ポロピロールフィルム中でコーティングされた検出電極をウェルから
取り出し、脱イオン水、続いて０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（
ｐＨ ７.４）ですすぎ、保存液（３００μＬ）を入れたミクロチューブ中に置
き、これを＋４℃で保存した。

【０１３７】 ３．７． 検出電極の必要な電気量を得るために、３．１〜３．６に記載の方法
を繰り返した。

【０１３８】 ３．８． ２．６に記載の通り、ストレプトアビジン溶液を調製した。

【０１３９】 ３．９． ２．７に記載の通り、ストレプトアビジンは、検出電極を覆っている
ポリピロールフィルムの表面に結合した。

【０１４０】 ３．１０． 濃度が既知で非標識のウシアルブミンのウサギポリクローナル抗体
の試料群を、以下の通り調製した。

【０１４１】 購入したウシアルブミンのウサギポリクローナル抗体の試料を、５００倍過剰
量の０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水を用いて＋４℃で終夜透析し
た。

【０１４２】 得られた０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水中のウシアルブミンの
ウサギポリクローナル抗体の溶液を、１０，２０、５０、１００、１０００およ
び５０００の希釈倍数で０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水を用いて
逐次希釈した。

【０１４３】 各々の希釈試料のアリコート（２００μＬ）を、別々のミクルチューブに入れ
た。

【０１４４】 ３．１１． 適当に希釈したビオチン化ＢＳＡの溶液（０.８ｍＬ）を、０.０１
Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（１９.２ｍＬ）に加え、回転振とう機中
で十分に混合し、次いでアリコート（２００μＬ）毎にミクロチューブ中に分配
した。

【０１４５】 ３．１２． 標識化した（上記の通り、ラテックスで接合した）ウシアルブミン
のウサギポリクローナル抗体の適当な力価溶液（０.１ｍＬ）を、０.０１Ｍ リ
ン酸塩で緩衝化した生理食塩水（１９.９ｍＬ）に加え、回転式ミキサー中で十
分に混合し、次いでアリコート（２００μＬ）毎にミクロチューブ中に分配した
。

【０１４６】 ３．１３． 作用緩衝液Ｎ°１は、以下の通り調製した。

【０１４７】 リン酸塩で緩衝化した生理食塩水の錠剤を、脱イオン水（２００ｍＬ）に溶解
した。

【０１４８】 得られた溶液に、ＫＣｌ（０.３７ｇ）を溶解した。

【０１４９】 ３．１４． １．１４に記載の通り、作用緩衝液Ｎ°２を調製した。

【０１５０】 ３．１５． ストレプトアビジンが結合したポリピロールフィルムでコーティン
グされた検出電極を保存緩衝液から取り出し、各々を、ビオチン化ＢＳＡの溶液
を含む１ミクロチューブ（工程３．１１由来）中に置き、室温で２５分間インキ
ュベートした。

【０１５１】 ３．１６． ３．１５の完結後、ビオチン化ＢＳＡの溶液を含むミクロチューブ
から検出電極を取り出し、各々を、濃度が既知で非標識のウシアルブミンのウサ
ギポリクローナル抗体試料を含む１ミクロチューブ（工程３．１０由来）中に置
き、次いで検出電極を入れたミクロチューブをサーモミキサー中に置き、絶えず
混合しながら、３７±１℃の温度で２５分間保った。

【０１５２】 ３．１７． ３．１６の完結後、試料を含むミクロチューブから検出電極を取り
出し、このものをラテックスを接合したウシアルブミンのウサギポリクローナル
抗体溶液を含むミクロチューブ（工程３．１２由来）に移し、次いで回転振とう
機中に置き、絶えず混合しながら室温で１０分間保った。

【０１５３】 ３．１８． ３．１７の完結後、ミクロチューブから検出電極を取り出し、０.
０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水中で３〜５秒間すすぎ、各々を、作用
緩衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレート中に置いた。

【０１５４】 ３．１９． ＰＣベースの測定装置につないだホルダーの電気接触子に検出電極
および参照電極をつなぎ、その検出電極および参照電極が溶液に浸るように、参
照緩衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレートの上方にそのホルダー
を設置した。

【０１５５】 ３．２０． 特注のソフトウェアを始動させ、参照電位に対する検出電極電位（
ミリボルト単位）を記録するために、１００秒間使用した。

【０１５６】 ３．２１． ３．２０の完結後、３．１９に記載の方法と同様な方法で、作用緩
衝液Ｎ°２で十分に満たしたミクロタイタープレートの上方に、ホルダーを設置
した。

【０１５７】 ３．２２． 参照電極電位に対する検出電極電位（ミリボルト単位）の変化を記
録するために、特注のソフトウェアを２００秒間使用した。

【０１５８】 ３．２３． 特注のソフトウェアを用いて、作用電極電位に対する検出電極電位
の変化についての曲線が示す領域（積分）Ｓ_２を算出した。

【０１５９】 ３.２４． 工程３．１０で製造した濃度が既知で非標識のウシアルブミンのウ
サギポリクローナル抗体の試料を用いて、３．１９〜３．２３に記載の操作を順
番に繰り返した。

【０１６０】 ３．２５． 工程３．２４で得られた結果に基づいて、検量線「試料中の標識化
したウシアルブミンのウサギポリクローナル抗体の濃度に対するＳ_２」をプロッ
トするために、特注のソフトウェアを使用した。

【０１６１】実施例４． ＨＢｓＡｇ測定法；サンドイッチアッセイ；試料−ＨＢｓＡｇ濃度が既知であ
る試料；受容体−ビオチン化したＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体；標識
化したＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体；標識−ペルオキシダーゼ。

【０１６２】 ４．１． １．１〜１．４に記載の方法を行った。

【０１６３】 ４．２． ２．２．に記載の通り、ピロールの電気化学的重合用の溶液を調製し
た。

【０１６４】 ４．３． ２．３に記載の通り、電着によってポリピロールフィルムを得た。

【０１６５】 ４．４． ポリピロールフィルムでコーティングされた検出電極をウェルから取
り出し、脱イオン水、続いて０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（ｐ
Ｈ ７.４）ですすぎ、保存液（３００μＬ）を入れたミクロチューブ中に置き
、このものを＋４℃で保存した。

【０１６６】 ４．５． 検出電極の必要な電気量を得るために、４．１〜４．４に記載の方法
を繰り返した。

【０１６７】 ４．６． ストレプトアビジン溶液を、２．６に記載の通り調製した。

【０１６８】 ４．７． ２．７に記載の通り、ストレプトアビジンは、検出電極を覆っている
ポリピロールフィルムの表面に結合した。

【０１６９】 ４．８． ＨＢｓＡｇ濃度が既知である試料群を、１．１０に記載の通り製造し
た。

【０１７０】 ４．９． ビオチン化したＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体の適当な力価
溶液（０.２ｍＬ）を、０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（１９.８
ｍＬ）に加え、回転振とう機中で十分に混合し、次いでアリコート（２００μＬ
）毎に、ミクロチューブ中に分配した。

【０１７１】 ４．１０． 予め解凍したウシ血清（５ｍＬ）を０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化
した生理食塩水（１５ｍＬ）に加え、得られた溶液（１９.６ｍＬ）に、購入し
たペルオキシダーゼを接合したＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体の適当な
力価溶液（０.４ｍＬ）を加え、次いで回転振とう機中で十分に混合し、アリコ
ート（２００μＬ）毎にミクロチューブ中に分配した。

【０１７２】 ４．１１． リン酸塩で緩衝化した生理食塩水の錠剤を脱イオン水（２００ｍＬ
）に溶解することによって、作用緩衝液Ｎ°１を調製した。

【０１７３】 ４．１２． 作用緩衝液Ｎ°２を、以下の通り調製した。

【０１７４】 ｏ−フェニレンジアミン・二塩酸塩の錠剤および尿素過酸化水素化物／緩衝液
の錠剤を、脱イオン水（２０ｍＬ）に溶解した。

【０１７５】 得られた溶液（０.１ｍＬ）を、０.０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水
（１９.９ｍＬ）に加え、回転振とう機中で十分に混合し、次いで回転式ガラス
容器中に置き、試験開始まで＋４℃で保存した。

【０１７６】 ４．１３． ストレプトアビジンが結合したポリピロールフィルムでコーティン
グされた検出電極を保存緩衝液から取り出し、各々を、ビオチン化したＨＢｓＡ
ｇのマウスモノクローナル抗体溶液（２００μＬ）を含むミクロチューブ（工程
４．９由来）中に置き、室温で５分間インキュベートした。

【０１７７】 ４．１４． ４．１３の完結後、ビオチン化抗体の溶液を含むミクロチューブか
ら検出電極を取り出し、ＨＢｓＡｇ濃度が既知の試料を含むミクロチューブ（工
程４．８由来）中に置き、次いでその検出電極を入れたミクロチューブをサーモ
ミキサー中に置き、絶えず混合しながら、３７±１℃の温度で１０分間保った。

【０１７８】 ４．１５． ４．１４の完結後、試料を含むミクロチューブから検出電極を取り
出し、ペルオキシダーゼを接合させたＨＢｓＡｇのマウスモノクローナル抗体溶
液を含むミクロチューブ（工程４．１０由来）中に置き、次いでこれを回転振と
う機中に入れ、絶えず混合しながら、室温で５分間保った。

【０１７９】 ４．１６． ４．１５の完結後、ミクロチューブから検出電極を取り出し、０.
０１Ｍ リン酸塩で緩衝化した生理食塩水中で３〜５秒間すすぎ、各々を、作用
緩衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレート中に置いた。

【０１８０】 ４．１７． ＰＣベースの測定装置につないだホルダーの電気接触子に検出電極
および参照電極をつなぎ、その検出電極および参照電極が溶液に浸るように、作
用緩衝液Ｎ°１で十分に満たしたミクロタイタープレートの上方に、ホルダーを
設置した。

【０１８１】 ４．１８． 特注のソフトウェアを始動させ、参照電極電位に対する検出電極電
位（単位ミクロボルト）を記録するために、５０秒間使用した。

【０１８２】 ４．１９． ４．１８の完結後、４．１７に記載の方法と同様な方法で、作用緩
衝液Ｎ°２で十分に満たしたミクロタイタープレートの上方に、ホルダーを設置
した。

【０１８３】 ４．２０． 参照電極電位に対する検出電極電位（ミリボルト単位）の変化を記
録するために、特注のソフトウェアを１００秒間使用した。

【０１８４】 ４．２１． 特注のソフトウェアを用いて、バックグラウンドと検出電極の最終
電位間の電位差（δ）（ミリボルト単位）を算出した。

【０１８５】 ４．２２． 工程４．８で製造したＨＢｓＡｇ濃度が既知の試料を用いて、４．
１７〜４．２１に記載の操作を順番に繰り返した。

【０１８６】 ４．２３． 工程４．２２で得られた結果に基づいて、検量曲線「試料中のＨＢ
ｓＡｇ濃度に対するδ」をプロットするために、特注のソフトウェアを使用した
。

【０１８７】 ４．２４． ２．２４に記載の通り、希釈した血清試料群を製造した。

【０１８８】 ４．２５． ４．２４で製造した各々の希釈試料中でのＨＢｓＡｇ濃度を測定す
るために、工程４．１３〜４．２１に記載の方法を使用し、これらの結果および
工程４．２３で得られた検量曲線を、元の（希釈していない）血清試料中でのＨ
ｂｓＡｇ濃度を算出するために使用した。

【０１８９】 実施例５ ＨＢｓＡｇ測定；サンドイッチ試験；試料−既知のＨＢｓＡｇ濃度を有する試
料；受容体−ＨＢｓＡｇに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体；ＨＢｓ
Ａｇに対する標識化したマウスモノクローナル抗体；標識−パーオキシダーゼ；
”逐次試験”

【０１９０】 ５．１． １．１−１．４に記載の方法を行った。 ５．２． ２．２に記載のように、ピロールの電気化学的重合のための溶液を調
製した。 ５．３． ２．３に記載のように、ポリピロールのフイルムを電気化学的電析に
より形成した。 ５．４． ポリピロールのフイルムを被覆した検出電極をウエルから除去し、脱
イオン水、次に０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）で濯ぎ、３
００μｌの貯蔵溶液を有するマイクロチューブに入れ、＋４℃で貯蔵した。 ５．５． 必要量の検出電極を得るため、５．１−５．４に記載の方法を繰り返
した。 ５．６． ストレプトアビジンの溶液を２．６に記載のように調製した。 ５．７． ストレプトアビジンを２．６に記載のように検出電極を被覆するポリ
ピロールのフイルムの表面に結合させた。

【０１９１】 ５．８． 既知のＨＢｓＡｇ濃度を有する一連の試料を１．１０に記載のように
調製した。 ５．９． ＨＢｓＡｇに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体の溶液０．
５ｍｌを０．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶液１９．５ｍｌに添加し、ロー
タリーシェイカーで十分攪拌し、２００μｌのアリコートでマイクロチューブに
分配した。

【０１９２】 ５．１０． パーオキシダーゼで標識したＨＢｓＡｇに対するマウスモノクロー
ナル抗体の溶液１．７ｍｌを、０．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶液１８．
３ｍｌに添加し、オービタルミキサーで十分攪拌し、２００μｌのアリコートで
マイクロチューブに分配した。 ５．１１． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を４．１１に記載のように調製した。 ５．１２． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ２を４．１２に記載のように調製した。 ５．１３． 結合したストレプトアビジンを有するポリピロールのフイルムを被
覆した検出電極を貯蔵緩衝剤溶液から除去し、それぞれをＨＢｓＡｇに対するビ
オチン化マウスモノクローナル抗体（工程５．９からの）の溶液を有するマイク
ロチューブに入れ、５分間室温でインキュベートした。 ５．１４． 工程５．１３と同時に、購入した、ＨＢｓＡｇに対するパーオキシ
ダーゼで標識したマウスモノクローナル抗体の適切にタイターした（titered）
溶液を既知のＨＢｓＡｇ濃度を有する各試料（工程５．８からの）に添加し、試
料から最初に１０μｌを除去し；次にマイクロチューブ及び試料を３７±１℃で
５−１０分間サーモミキサー中に置いた。

【０１９３】 ５．１５． ５．１３−５．１４を完了したら、検出電極をビオチン化抗体の溶
液を含むマイクロチューブから除き、既知のＨＢｓＡｇ濃度を有する試料（工程
５．１４からの）を含むマイクロチューブ中に置き、次に３７±１℃で１５分間
サーモミキサー中に保ち、連続的に攪拌した。 ５．１６． ５．１６を完了したら、検出電極をマイクロチューブから取り除き
、０．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶液で３−５秒間濯ぎ、それぞれをワー
キング緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイクロタイタープレートウエルに置いた。 ５．１７． 検出電極及び参照電極をＰＣをベースにする測定装置に結合したホ
ルダーの電気接触に結合し、ホルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイ
クロタイタープレートウエル上に置き、検出電極及び参照電極が溶液中に浸るよ
うにした。

【０１９４】 ５．１８． カスタムソフトウエアを開始させ、５０秒にわたって参照電極電位
に対する検出電極電位をミリボルトで記録するのに用いた。 ５．１９． ５．１８を完了したら、５．１７に記載したのと同様の方法で、ホ
ルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ２を満たしたマイクロタイタープレートウエル上
に置いた。 ５．２０． カスタムソフトウエアを用い、２００秒にわたって参照電極電位に
対する検出電極電位のミリボルトの変化を記録した。

【０１９５】 ５．２１． カスタムソフトウエアを用い、検出電極電位変化 対 参照電極電
位の曲線により示される面積（積分）Ｓ_２を計算した。 ５．２２． ５．１７−５．２１に記載の操作を、工程５．８で調製した既知の
ＨＢｓＡｇ濃度を有する試料を用いて順に繰り返した。 ５．２３． 工程５．２２で得られた結果に基づいて、カスタムソフトウエアを
用いて、キャリブレーション曲線「Ｓ_２ 対 試料中のＨＢｓＡｇ濃度」をプロ
ットした。 ５．２４． 一連の希釈した血清試料を２．２４に記載のように調製した。 ５．２５． 工程５．１３−５．２１に記載の方法を用いて、５．２４で調製し
た希釈した各試料中のＨＢｓＡｇ濃度を測定し、これらの結果を工程５．２３で
得られたキャリブレーション（較正）曲線と共に用いて血清のもとの（希釈しな
い）試料中のＨＢｓＡｇ濃度を計算した。

【０１９６】実施例６ ＨＢｓＡｇ測定；サンドイッチ試験；試料−既知のＨＢｓＡｇ濃度を有する試
料；受容体−ＨＢｓＡｇに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体；ＨＢｓ
Ａｇに対する標識化マウスモノクローナル抗体；標識−パーオキシダーゼ；”ワ
ンポット試験”

【０１９７】 ６．１． １．１−１．４に記載の方法を行った。 ６．２． ２．２に記載のように、ピロールの電気化学的重合のための溶液を調
製した。 ６．３． ２．３に記載のように、ポリピロールのフイルムを電気化学的電析に
より形成した。 ６．４． ポリピロールのフイルムでコートした検出電極をウエルから除去し、
脱イオン水、次に０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）で濯ぎ、
３００μｌの貯蔵溶液を有するマイクロチューブに入れ、＋４℃で貯蔵した。 ６．５． 必要量の検出電極を得るため、６．１−６．４に記載の方法を繰り返
した。

【０１９８】 ６．６． ストレプトアビジンの溶液を２．６に記載のように調製した。 ６．７． ストレプトアビジンを２．７に記載のように検出電極を被覆するポリ
ピロールのフイルムの表面に結合させた。 ６．８． 既知のＨＢｓＡｇ濃度を有する一連の試料を１．１０に記載のように
調製した。 ６．９． ＨＢｓＡｇに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体の適切にタ
イターした溶液２．５ｍｌを、０．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶液１７．
５ｍｌに添加し、ロータリーシェイカーで十分攪拌し、次に２００μｌのアリコ
ートでマイクロチューブに分配した。 ６．１０． ＨＢｓＡｇに対するパーオキシダーゼで標識したマウスモノクロー
ナル抗体の溶液１．７ｍｌを０．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶液１８．３
ｍｌに添加し、ロータリーシェカーで十分攪拌し、２００μｌのアリコートでマ
イクロチューブに分配した。 ６．１１． ワーキング緩衝剤Ｎ^Ｏ１を４．１１に記載のように調製した。 ６．１２． ワーキング緩衝剤Ｎ^Ｏ２を４．１２に記載のように調製した。

【０１９９】 ６．１３． ＨＢｓＡｇに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体の溶液１
０μｌ（工程６．９からの）及びＨＢｓＡｇに対するパーオキシダーゼで標識し
たマウスモノクローナル抗体１０μｌを既知のＨＢｓＡｇ濃度の各試料に添加し
、先ずその試料から２０μｌを徐去し、；次にマイクロチューブ及び試料をサー
モミキサーに置き、３７±１℃で１０分間インキュベートし、連続的に混合した
。 ６．１４． ６．１３が完了したら、結合したストレプトアビジンを有するポリ
ピロールのフイルムを被覆した検出電極を貯蔵緩衝剤溶液から除去し、既知のＨ
ＢｓＡｇ濃度を有する試料（工程６．１３からの）を含むマイクロチューブに入
れ、次に３７ １℃で５分間サーモミキサー中に保ち、連続的に攪拌した。 ６．１５． ６．１４が完了したら、検出電極をマイクロチューブから除き、０
．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶液で３−５秒間濯ぎ、それぞれをワーキン
グ緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイクロタイタープレートウエルに置いた。

【０２００】 ６．１６． 検出電極及び参照電極をＰＣをベースにする測定装置に結合したホ
ルダーの電気接触に連結し、ホルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイ
クロタイタープレートウエル上に置き、検出電極及び参照電極が溶液中に浸るよ
うにした。 ６．１７． カスタムソフトウエアを開始させ、１００秒にわたって参照電極電
位に対する検出電極電位をミリボルトで記録するのに用いた。 ６．１８． ６．１７を完了したら、６．１６に記載したのと類似の方法で、ホ
ルダーをワーキング緩衝剤Ｎ^Ｏ２を満たしたマイクロタイタープレートウエル上
に置いた。 ６．１９． カスタムソフトウエアを用い、２００秒にわたって参照電極電位に
対する検出電極電位のミリボルトの変化を記録した。

【０２０１】 ６．２０． カスタムソフトウエアを用い、検出電極電位変化 対参照電極電位
の曲線により示される面積（積分）Ｓ_２を計算した。 ６．２１． ６．１６−６．２０に記載の操作を、工程６．８で調製した既知の
ＨＢｓＡｇ濃度を有する試料を用いて順に繰り返した。 ６．２２． ６．２１で得られた結果に基づいて、カスタムソフトウエアを用い
て、キャリブレーション曲線「Ｓ_２−試料中のＨＢｓＡｇ濃度」をプロットした
。 ６．２３． 一連の希釈した血清試料を２．２４に記載のように調製した。 ６．２４． 工程６．１３−６．２１に記載の方法を用いて、６．２３で調製し
た希釈した各試料中のＨＢｓＡｇ濃度を測定し、これらの結果を工程６．２２で
得られたキャリブレーション曲線と共に用いて血清のもとの（希釈しない）試料
中のＨＢｓＡｇ濃度を計算した。

【０２０２】実施例７ インスリン測定；競合試験；試料−既知のインスリン濃度を有する試料；受容
体−インスリンに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体；競合分子−標識
ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体；標識−ウレアーゼ”

【０２０３】 ７．１． １．１−１．３に記載の方法を行った。 ７．２． インスリンに対するマウスモノクローナル抗体のビオチン化を１．４
に記載のように行なった。インスリンに対するビオチン化マウスモノクローナル
抗体の得られた溶液を少容量のアリコート（約１０μｌ）に分け、＋４℃で貯蔵
した。 ７．３． ２．２に記載のようにして、ピロールの電気化学的重合のための溶液
を調製した。 ７．４． ２．３に記載のようにして、ポリピロールのフイルムを電気化学的電
析により形成した。

【０２０４】 ７．５． ポリピロールのフイルムでコートした検出電極をウエルから除去し、
脱イオン水、次に０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）で濯ぎ、
３００μｌの貯蔵溶液を有するマイクロチューブに入れ、＋４℃で貯蔵した。 ７．６． 必要量の検出電極を得るため、７．４−７．５に記載の方法を繰り返
した。 ７．７． ストレプトアビジンの溶液を２．６に記載のように調製した。 ７．８． ストレプトアビジンを２．７に記載のように検出電極を被覆するポリ
ピロールのフイルムの表面に結合した。

【０２０５】 ７．９． 既知のインスリン濃度を有する一連の試料を次のように調製した： １．１２ｇの塩化カリウム及び１．０ｇのウシ血清アルブミンを１００ｍｌの脱
イオン水に溶解した； １００μｇの凍結乾燥したインスリンを得られた溶液２００μｌに溶解した； 得られたインスリン溶液を、希釈倍率１０、２０、５０、１００、１０００、及
び１０,０００倍で、塩化カリウム及びウシ血清アルブミンを含む脱イオン水で
希釈した； 希釈した各試料の２００μｌアリコートを別のマイクロチューブに入れた。 ７．１０． インスリンに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体の適切に
タイターした溶液２．５ｍｌを０．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶液１９．
２ｍｌに添加し、ロータリーシェイカーで十分攪拌し、次にマイクロチューブに
２００μｌアリコートした。 ７．１１． マウスＩｇＧに対する購入したウレアーゼをコンジュゲートしたヤ
ギポリクローナル抗体０．０２ｍｌを、０．０１Ｍリン酸塩で緩衝化した食塩溶
液１９．９８ｍｌに添加し、ロータリーシェイカーで十分攪拌し、次にマイクロ
チューブに２００μｌアリコートした。

【０２０６】 ７．１２． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を、２．４４ｇの塩化カリウムを２００ｍ
ｌの脱イオン水に溶解することによって調製した。 ７．１３． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ２を、２０ｍｌのワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１中
に０．０１２ｇの尿素を溶解することによって調製した。 ７．１４． 結合したストレプトアビジンを有するポリピロールのフイルムでコ
ートした検出電極を貯蔵溶液から除去し、インスリンに対するビオチン化マウス
モノクローナル抗体の溶液（工程７．１０からの）を有するマイクロチューブに
入れ、１０分間インキュベートした。

【０２０７】 ７．１５． ７．１４が完了したら、検出電極をビオチン化抗体の溶液を有する
マイクロチューブから除去し、既知のインスリン濃度の試料（工程７．９からの
）を含むマイクロチューブ中に置き、３７±１℃で１５分間保持し、連続的に混
合した。 ７．１６． ７．１５が完了したら、検出電極を試料を含むマイクロチューブか
ら除去し、マウスＩｇＧに対するウレアーゼをコンジュゲートしたヤギポリクロ
ーナル抗体の溶液（工程７．１１からの）を含むマイクロチューブ中に置き、次
にロータリーシェーカーに置き、室温で１０分間保持し、連続的に攪拌した。 ７．１７． ７．１６が完了したら、検出電極をマイクロチューブから除去し、
塩化カリウム及びウシ血清アルブミンを有する脱イオン水で３−５秒濯ぎ、それ
ぞれをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイクロタイタープレートウエルエル
に置いた。 ７．１８． 検出電極及び参照電極をＰＣをベースにする測定装置に結合したホ
ルダーの電気接触に連結し、ホルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイ
クロタイタープレートウエル上に置き、検出電極及び参照電極が溶液中に浸るよ
うにした。

【０２０８】 ７．１９． カスタムソフトウエアを開始させ、２００秒にわたって参照電極電
位に対する検出電極電位をミリボルトで記録するのに用いた。 ７．２０． ７．１９を完了したら、７．１８に記載したのと類似の方法で、ホ
ルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ２を満たしたマイクロタイタープレートウエル上
に置いた。 ７．２１． カスタムソフトウエアを用い、４００秒にわたって参照電極電位
対 検出電極電位のミリボルトの変化を記録した。 ７．２２． カスタムソフトウエアを用い、検出電極電位変化に対する参照電極
電位の曲線により示される面積（積分）Ｓ_２を計算した。 ７．２３． ７．１８−７．２２に記載の操作を、工程７．９で調製した既知の
インスリン濃度を有する試料を用いて順に繰り返した。 ７．２４． ７．２３で得られた結果に基づいて、カスタムソフトウエアを用い
て、キャリブレーション曲線「Ｓ_２ 対 試料中のインスリン濃度」をプロット
した。

【０２０９】実施例８ 核酸ハイブリダイゼーション ８．１． １．１−１．３に記載の方法を行なった。 ８．２． ２．２に記載のようにして、ピロールの電気化学的重合用の溶液を調
製した。 ８．３． ２．３に記載のようにして、ポリピロールのフイルムを電気化学的電
析により形成した。 ８．４． ポリピロールのフイルムでコートした検出電極をウエルから除去し、
脱イオン水、次に０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）で濯ぎ、
３００μｌの貯蔵溶液を有するマイクロチューブに入れ、＋４℃で貯蔵した。

【０２１０】 ８．５． 必要量の検出電極を得るため、８．３−８．４に記載の方法を繰り返
した。 ８．６． ２００ｍｌの脱イオン水にリン酸緩衝生理食塩水錠を溶解し、得られ
た溶液にストレプトアビジンを溶解することによってストレプトアビジンの溶液
を調製した。 ８．７． ストレプトアビジンを以下のようにして検出電極を被覆するポリピロ
ールのフイルムの表面に結合させた： ストレプトアビジン溶液をマイクロチューブに２００μｌのアリコートで分配し
た； ポリピロールのフイルムで被覆した検出電極を貯蔵溶液から除去し、それぞれを
ストレプトアビジン溶液を含むマイクロチューブ中に置き、２４時間＋４℃でイ
ンキュベートした； 検出電極をストレプトアビジン溶液を含むマイクロチューブから除去し、０．０
１Ｍリン酸緩衝生理食塩水溶液、及び、０．０１％アジ化ナトリウム、及び０．
１５Ｍ塩化カリウムを含む脱イオン水で２度濯ぎ、各検出電極を貯蔵溶液中に置
き、＋４℃で貯蔵した。

【０２１１】 ８．８． ビオチン化１本鎖ＤＮＡプローブの溶液を以下のように調製した： １ｍｇのビオチン化１本鎖ＤＮＡプローブ（長さ約１ｋｂ）の凍結乾燥物を１ｍ
ｌの脱イオン水に溶解し、得られた溶液をマイクロチューブに入れた； ＤＮＡプローブ溶液を含むマイクロチューブを水浴に置き、５−８分＋１００℃
でインキュベートした； ＤＮＡプローブ溶液を含むマイクロチューブを氷を有する容器中に移し、急速に
０℃まで冷却した； ＤＮＡプローブ溶液を含むマイクロチューブを次にフリーザーに移し、−２０℃
で貯蔵した。 ８．９． ビオチン化ＤＮＡプローブに相補的な１本鎖ＤＮＡの溶液を以下のよ
うに調製した： ビオチン化ＤＮＡプローブに相補的な２本鎖ＤＮＡの凍結乾燥物１０ｍｇを脱イ
オン水１ｍｌに溶解し、得られた溶液をマイクロチューブに入れた； ＤＮＡ溶液を有するマイクロチューブを水浴中に置き、＋１００℃で５−８分イ
ンキュベートした； ＤＮＡ溶液を有するマイクロチューブを氷を含む容器に移し、０℃まで急速に冷
却した； ＤＮＡ溶液を有するマイクロチューブを次にフリーザーに移し、−２０℃で凍結
保存した。

【０２１２】 ８．１０． ビオチン化ＤＮＡプローブに非相補的な１本鎖ＤＮＡの溶液を８．
９に記載のように調製した。 ８．１１． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を、以下のように調製した： リン酸緩衝生理食塩水錠剤を２００ｍｌの脱イオン水に溶解した； ２ｇのウシ血清アルブミン、０．３７ｇの塩化カリウム、及び０．１２ｇのクエ
ン酸ナトリウムを得られた溶液に溶解した。 ８．１２． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ２を、以下のように調製した： リン酸緩衝生理食塩水錠剤を２００ｍｌの脱イオン水に溶解した； ２ｇのウシ血清アルブミン、１ｇのデキストラン硫酸ナトリウムを得られた溶液
に溶解した。 ８．１３． 結合したストレプトアビジンを有するポリピロールのフイルムで被
覆した検出電極を、０．０１％アジ化ナトリウム及び０．１５Ｍ塩化カリウムを
含む脱イオン水から除去し、前もって解凍し、室温まで暖めた１本鎖ＤＮＡプロ
ーブの溶液２０μｌを各検出電極の表面をワーキングに適用した。 ８．１４． ８．１３が完了したら、検出電極をヒュミディティチャンバーに入
れ、＋４４℃で６０分インキュベートした。

【０２１３】 ８．１５． ８．１４が完了したら、検出電極をヒュミディティチャンバーから
出し、それぞれをＤＮＡハイブリダイゼーション用の最初の緩衝剤溶液２００μ
ｌを含むマイクロチューブに入れ、＋４℃で短時間保持した。（ＤＮＡハイブリ
ダイゼーション緩衝液は当業者に公知のいずれの標準的なハイブリダイゼーショ
ン緩衝液でもよい、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) M
olecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor l
aboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 参照）

【０２１４】 ８．１６． ビオチン化ＤＮＡプローブに相補的な１本鎖ＤＮＡを含む試料を以
下のように調製した: サケの精子からの凍結乾燥したＤＮＡ１０ｍｇをＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン用の最初の緩衝剤溶液１０ｍｌに溶解した； 前もって解凍し、室温まで暖めたビオチン化ＤＮＡプローブに相補的な１本鎖Ｄ
ＮＡの溶液１０μｌを得られた溶液０．９９ｍｌに添加した； 得られた溶液をロータリーシェーカーで十分攪拌し、２００μｌのアリコートで
マイクロチューブに分配した。 ８．１７． ビオチン化ＤＮＡプローブに非相補的な１本鎖ＤＮＡを含む試料を
以下のように調製した： サケの精子からの凍結乾燥したＤＮＡ１０ｍｇをＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン用の最初の緩衝剤溶液１０ｍｌに溶解した； 前もって解凍し、室温まで暖めたビオチン化ＤＮＡプローブに非相補的な１本鎖
ＤＮＡの溶液１００μｌを得られた溶液０．９ｍｌに添加した； 得られた溶液をロータリーシェーカーで十分攪拌し、２００μｌのアリコートで
マイクロチューブに分配した。 ８．１８． 固定化ビオチン化１本鎖ＤＮＡプローブを有する検出電極の半分を
ＤＮＡハイブリダイゼーション用の最初の緩衝剤溶液を含むマイクロチューブか
ら除去し、ビオチン化ＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡを含む試料を有するマイ
クロチューブ中に置き；検出電極を含むマイクロチューブを次にサーモミキサー
に置き、連続的に攪拌しながら＋４２℃で１２０分保った。

【０２１５】 ８．１９． ８．１８が終わったら、検出電極をマイクロチューブから除去し、
ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１で３−５秒濯ぎ、それぞれをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を
満たしたマイクロタイタープレートウエルエルのウエルに置いた。 ８．２０． 検出電極及び参照電極をＰＣをベースにする測定装置に連結したホ
ルダーの電気接触に連結し、ホルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイ
クロタイタープレートウエル上に置き、検出電極及び参照電極が溶液中に浸るよ
うにした。 ８．２１． カスタムソフトウエアを開始させ、２００秒にわたって参照電極電
位に対する検出電極電位をミリボルトで記録するのに用いた。 ８．２２． ８．２１が完了したら、８．２０に記載されたのと類似の方法で、
ホルダーをワーキング緩衝剤Ｎ^Ｏ２を満たしたマイクロタイタープレートウエル
上に置いた。

【０２１６】 ８．２３． カスタムソフトウエアを用い、６００秒にわたって参照電極電位に
対する検出電極電位のミリボルトの変化を記録した。 ８．２４． カスタムソフトウエアを用い、バックグランド及び最終電位間のミ
リボルト差（δ）を計算した。 ８．２５． ８．２０−８．２４に記載の操作を、工程４．８で調製したビオチ
ン化ＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡを含む試料を用いて順に繰り返した。 ８．２６． 固定化ビオチン化１本鎖ＤＮＡプローブを有する検出電極の他の半
分をＤＮＡハイブリダイゼーション用の最初の緩衝剤溶液を含むマイクロチュー
ブから除去し、ＤＮＡプローブに非相補的なＤＮＡを含む試料を有するマイクロ
チューブ中に置き；検出電極を含むマイクロチューブを次にサーモミキサーに置
き、連続的に攪拌しながら＋４２℃で１２０分保った。 ８．２７． ８．１９−８．２５に記載の方法を、ビオチン化ＤＮＡプローブに
非相補的なＤＮＡを含む試料を用いて繰り返した。 ８．２８． ８．１９−８．２６で得られた結果に基づいて、カスタムソフトウ
エアを用い、ビオチン化ＤＮＡプローブに相補的な、及び非相補的なＤＮＡの試
料について得られたδ値の統計的な分布曲線をプロットした。

【０２１７】実施例９ ジゴキシン測定；競合的試験；試料−既知のジゴキシン濃度を有する試料；受容
体−ジゴキシンに対するビオチン化マウスモノクローナル抗体；競合分子−標識
したジゴキシン；標識−パーオキシダーゼ。

【０２１８】 ９．１． １．１−１．４に記載の方法を行なった。 ９．２． ２．２に記載のようにして、ピロールの電気化学的重合用の溶液を調
製した。 ９．３． ２．３に記載のようにして、ポリピロールのフイルムを電気化学的電
析により形成した。 ９．４． ポリピロールのフイルムでコートした検出電極をウエルから除去し、
脱イオン水、次に０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）で濯ぎ、
３００μｌの貯蔵溶液を有するマイクロチューブに入れ、＋４℃で貯蔵した。

【０２１９】 ９．５． 必要数の検出電極を得るため、９．１−９．４に記載の方法を繰り返
した。 ９．６． ２．６に記載のようにしてストレプトアビジンの溶液を調製した。 ９．７． ストレプトアビジンを２．７に記載のようにして検出電極を被覆する
ポリピロールのフイルムの表面に結合させた。 ９．８． 既知のジゴキシン濃度を有する一連の試料を以下のように調製した： ２５０ｍｌのエタノールを７５０ｍｌの脱イオン水に添加した； ２５０ｍｇのジゴキシンを得られたエタノール溶液１０００ｍｌに溶解した； リン酸緩衝生理食塩水錠剤及び１０．０ｇのウシ血清アルブミンを２００ｍｌ
の脱イオン水に溶解した； 得られたジゴキシン溶液をウシ血清アルブミンを有するＰＢＳ溶液で２５０、２
５００、２５０００、５００００、１２５０００、２５００００及び５００００
０倍の希釈倍率で順次希釈した； 希釈した試料のそれぞれの２００μｌアリコートを別々のマイクロチューブに
入れた。

【０２２０】 ９．９． ジゴキシンに対するビオチンをコンジュゲートしたマウスモノクロー
ナル抗体の溶液２０μｌを０．０１Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）１９．９
８ｍｌに添加し、ロータリーシェイカーで十分混合し、次にマイクロチューブに
２００μｌアリコートした。 ９．１０． ジゴキシンを前記したプロトコールに従ってパーオキシダーゼとコ
ンジュゲートさせた。[２１]を参照。パーオキシダーゼで標識したジゴキシンの
得られた溶液(最終濃度約０．１ｍｇ／ｍｌ)を希釈割合１０倍で０．０１Ｍリン
酸塩食塩緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、少量（１０μｌ）のアリコートに分割
し、４℃で貯蔵した。 ９．１１． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を、４．１１に記載のようにして調製した
。 ９．１２． ワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ２を、４．１２に記載のようにして調製した
。 ９．１３． 結合したストレプトアビジンを有するポリピロールのフイルムで被
覆した検出電極を貯蔵緩衝剤溶液から除去し、それぞれをジゴキシンに対するビ
オチンをコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体の溶液を含むマイクロチ
ューブ中に置き、室温で１０分間インキュベートした。

【０２２１】 ９．１４． ９．１３と同時にパーオキシダーゼで標識したジゴキシン（工程９
．１０からの）の溶液２μｌを既知ジゴキシン濃度を有する試料（工程９．８か
らの）のそれぞれに添加し、最初に試料から２μｌを除去した。 ９．１５． 工程９．１３及び９．１４が完了したら、検出電極をパーオキシダ
ーゼで標識した、及び標識しないジゴキシン（工程９．１４からの）を含む試験
管に移し；その試験管及び検出電極をサーモミキサーに置き、１０分間３７±１
℃で保持し、連続的に攪拌した。 ９．１６． 工程９．１５が完了したら、検出電極をマイクロチューブから除去
し、０．０１Ｍ ＰＢＳで３−５秒間濯ぎ、それぞれをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１
を満たしたマイクロタイタープレートウエルに置いた。

【０２２２】 ９．１７． 検出電極及び参照電極をＰＣをベースにする測定装置に結合したホ
ルダーの電気接触に連結し、ホルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ１を満たしたマイ
クロタイタープレートウエル上に置き、検出電極及び参照電極を溶液中に浸すよ
うにした。 ９．１８． カスタムソフトウエアを開始させ、３０秒にわたって参照電極電位
に対する検出電極電位をミリボルトで記録するのに用いた。 ９．１９． ９．１８を完了したら、９．１７に記載されたのと類似の方法で、
ホルダーをワーキング緩衝液Ｎ^Ｏ２を満たしたマイクロタイタープレートウエル
上に置いた。 ９．２０． カスタムソフトウエアを用い、１００秒にわたって参照電極電位に
対する検出電極電位のミリボルトの変化を記録した。 ９．２１． カスタムソフトウエアを用い、検出電極電位変化 対 参照電極電
位の曲線により示される面積（積分）Ｓ_２を計算した。 ９．２２． 工程９．８で製造した既知のジゴキシン濃度を有する試料を用いて
９．１７−９．２１に記載の操作を順に繰り返した。 ９．２３． 工程９．２２で得られた結果に基づいてカスタムソフトウエアを用
いキャリブレーション曲線「Ｓ_２ 対 試料中ののジゴキシン濃度」をプロット
した。

【０２２３】文献

【表１】

【表２】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ポリマー層に固定化したアビジンまたはストレプトアビジン分子
（３）を含む電導性ポリマー層（２）でコートした電位差測定電極（１）を含む
検出電極を模式的に示す図である。

【図１Ｂ】 ポリマー層上に吸着したアビジンまたはストレプトアビジン分子
（３）を含む電導性ポリマー層（２）でコートした電位差測定電極（１）を含む
検出電極を模式的に示す図である。

【図２Ａ】 ポリマー層に固定化したアビジンまたはストレプトアビジンと、
ビオチン（５）と結合した抗体（４）の結合反応により、検出電極を分析物（こ
の場合、抗原は中〜高分子量の物質）に特異的にする方法を示す図である。

【図２Ｂ】 ポリマー層に固定化したアビジンまたはストレプトアビジンと、
ビオチン（５）と結合した抗原（６）の結合反応により、検出電極を試験する分
析物（この場合は抗体）に特異的にする方法を示す図である。

【図２Ｃ】 ポリマー層に固定化したアビジンまたはストレプトアビジンと、
ビオチン（５）と結合したＤＮＡプローブ（７）の結合反応により、検出電極を
分析物（この場合はＤＮＡ分子）に特異的にする方法を示す図である。

【図３Ａ】 検出電極に固定化したビオチン化抗体に特異的な抗原（６）を含
む被検溶液と接触した検出電極の配置を示す図である。

【図３Ｂ】 検出電極に固定化したビオチン化抗原に特異的な抗体（４）を含
む被検溶液と接触した検出電極の配置を示す図である。

【図３Ｃ】 検出電極に固定化したビオチン化ＤＮＡプローブに特異的なＤＮ
Ａ分子（８）を含む被検溶液と接触した検出電極の配置を示す図である。

【図４Ａ】 試験する抗原に特異的な、荷電標識（１０）と結合した第二レセ
プター（９）の溶液と接触する検出電極の配置（例えば、自己抗体が荷電標識と
結合した抗アイソタイプ抗体を用いて測定される血清学的アッセイ形式）を示す
図である。

【図４Ｂ】 試験する抗原に特異的な、荷電標識（１０）と結合した第二レセ
プター（１１）の溶液と接触する検出電極の配置（サンドイッチアッセイ形式、
この場合、第二レセプターは抗アイソタイプ抗体である）を示す図である。

【図５Ａ】 ビオチン化抗体に特異的な、荷電標識（１０）と結合した競合分
子（１２）の溶液と接触した検出電極の配置（競合アッセイ形式）を示す図であ
る。

【図５Ｂ】 ビオチン化抗原に特異的な、荷電標識（１０）と結合した競合分
子（１３）の溶液と接触した検出電極の配置（競合アッセイ形式）を示す図であ
る。

【図６Ａ】 試験する抗原に特異的な、酵素（１４）と結合した第二レセプタ
ー（９）の溶液と接触した検出電極の配置（サンドイッチアッセイ形式）を示す
図である。

【図６Ｂ】 試験する抗体に特異的な、酵素（１４）と結合した第二レセプタ
ー（１１）の溶液と接触した検出電極の配置（例えば、自己抗体が酵素と結合し
た抗アイソタイプ抗体を用いて測定される血清学的アッセイ形式）を示す図であ
る。

【図７Ａ】 ビオチン化抗体に特異的な、酵素（１４）と結合した競合分子（
１２）の溶液と接触した検出電極の配置（競合アッセイ形式）を示す図である。

【図７Ｂ】 ビオチン化抗体に特異的な、酵素（１４）と結合した競合分子（
１３）の溶液と接触した検出電極の配置（競合アッセイ形式）を示す図である。

【図８Ａ】 ビオチン化レセプター溶液[図８Ａ１]、被検溶液[図８Ａ２]、お
よび標識第二レセプター溶液[図８Ａ３]と接触する検出電極の連続的配置、次い
で、参照電極電位に対する検出電極電位の測定を含む「連続」形式の電気化学的
分析工程を示す図である。

【図８Ｂ】 最初に、検出電極をビオチン化レセプター溶液と接触させ[図８
Ｂ１]、次いで検出電極を、標識第二レセプター溶液を加えた被検溶液と接触さ
せ[図８Ｂ２]、次いで参照電極電位に対する検出電極電位を測定する[図８Ｂ３]
電気化学的分析工程を示す図である。

【図８Ｃ】 ビオチン化レセプターおよび標識第二レセプターの溶液を被検溶
液に加え[図８Ｃ１]、次いで検出電極を被検溶液と接触させ[図８Ｃ２]、次いで
参照電極電位に対する検出電極電位を測定する[図８Ｃ３] 電気化学的分析工程
を示す図である。

【図９】 検出電極をいかなる分析物も含まない被検溶液とインキュベーショ
ンした後（曲線１）、および検出電極をビオチン化レセプターに特異的な分析物
を含む被検溶液とインキュベーションした後（曲線２）の、ワーキング溶液のイ
オン強度または組成の段階的変化に対する検出電極電位の変動曲線の典型的な形
を示す図である（座標「ミリボルト−時間」）。

【図１０】 血清試料中のＨＢｓＡｇ濃度対参照電極に対する測定された検出
電極のバックグラウンド電位と最終電位の差（ミリボルト）の較正曲線を示す図
である。

【図１１】 ＨＢｓＡｇ陽性血清の希釈対参照電極に対する測定された検出電
極のバックグラウンド電気と最終電位の差（ミリボルト）の較正曲線を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 イェフゲニ・ユレヴィッチ・ミラノフスキ ロシア1121108モスクワ、カスタナエフス カヤ・ストリート、フラット46、ビルディ ング48 (72)発明者 ヴラディミル・ルリコヴィッチ・チェルカ ソフ ロシア1121108モスクワ、カスタナエフス カヤ・ストリート、フラット46、ビルディ ング48 (72)発明者 ユリ・セルゲイェヴィッチ・ビリウコフ ロシア1121108モスクワ、カスタナエフス カヤ・ストリート、フラット46、ビルディ ング48 (72)発明者 オルガ・レオナルドワ カナダ、ティ３シー・オーエヌ６、アルバ ータ、カルガリー、アベニュー・サウス・ ウエスト・ナンバー401、1830−11番

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アビジン、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ抗体、および電
   導性ポリマーに固定化または吸着した少なくとも１種類のレセプター分子と特異
   的に結合することができる分子からなる群から選ばれるアダプター分子を含む電
   導性ポリマー層でコートされた電導性電極を含む、分析物（analyte）の電気化
   学的検出法に用いる検出電極。
2. 【請求項２】 電導性ポリマー層に大イオン半径のアニオンが添加されてい
   る請求項１記載の検出電極。
3. 【請求項３】 アダプター分子がアビジンまたはストレプトアビジンであり
   、該分析物と結合することができるビオチン化レセプターがビオチン／アビジン
   またはビオチン／ストレプトアビジン結合相互作用によりアダプター分子と結合
   する請求項１または２記載の検出電極。
4. 【請求項４】 アダプター分子がプロテインＡまたはプロテインＧであり、
   該分析物と結合することができる抗体がプロテインＡ／抗体またはプロテインＧ
   ／抗体結合相互作用によりアダプター分子と結合する請求項１または２記載の検
   出電極。
5. 【請求項５】 アダプター分子がレクチンであり、該分析物と結合すること
   ができるレセプターがレクチン／炭水化物結合相互作用によりアダプター分子と
   結合する請求項１または２記載の検出電極。
6. 【請求項６】 アダプター分子が抗ＦＩＴＣ抗体であり、該分析物と結合す
   ることができるレセプターがＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ結合相互作用によりアダプタ
   ー分子と結合する請求項１または２記載の検出電極。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の検出電極および参照電極を
   含む電極組み立て品（アセンブリー）。
8. 【請求項８】 アビジン、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ抗体、および電
   導性ポリマーに固定化した少なくとも１種類のレセプター分子と特異的に結合す
   ることができる分子からなる群から選ばれるアダプター分子を含む電導性ポリマ
   ー層でコートされた電導性電極を含む、分析物の電気化学的検出法に用いる検出
   電極の製造方法であって、 ａ）電導性ポリマーのモノマー単位とアダプター分子を含む電気化学的重合溶液
   を調製し、 ｂ）コートする電極を該電気化学的重合溶液に浸漬し、 ｃ）該電極と電気化学的重合溶液間の周期的電位を適用して該溶液からポリマー
   を電気化学的に合成することにより電極をコートする（ここで、周期的電位は少
   なくとも１完全周期を適用する）工程を含む方法。
9. 【請求項９】 アビジン、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ抗体、および電
   導性ポリマーに吸着した少なくとも１種類のレセプター分子と特異的に結合する
   ことができる分子からなる群から選ばれるアダプター分子を含む電導性ポリマー
   層でコートされた電導性電極を含む、分析物の電気化学的検出法に用いる検出電
   極の製造方法であって、 ａ）電導性ポリマーのモノマー単位を含む電気化学的重合溶液を調製し、 ｂ）コートする電極を該電気化学的重合溶液に浸漬し、 ｃ）該電極と電気化学的重合溶液間の周期的電位を適用して該溶液からポリマー
   を電気化学的に合成することにより電極をコートし（ここで、周期的電位は少な
   くとも１完全周期で適用する）、 ｄ）該アダプター分子が該電極をコーティングする電導性ポリマー上に吸着する
   ようなアダプター分子を含む溶液と、該コートされた電極を接触させる工程を含
   む方法。
10. 【請求項１０】 アダプター分子がアビジンまたはストレプトアビジンであ
    る請求項８または９に記載の方法であって、さらに、該ビオチン化レセプターが
    、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結合相互作用により
    電極をコーティングする電導性ポリマーに固定化または吸着したアビジンまたは
    ストレプトアビジン分子と結合するようにビオチンと結合するレセプター分子を
    含む溶液を、検出電極と接触させる工程を含む方法。
11. 【請求項１１】 レセプター分子が、細菌、植物もしくは動物細胞の断片、
    タンパク質（ハプテン）と結合した化合物、レクチン、糖タンパク質、または炭
    水化物、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、抗体擬似物、キ
    メラ抗体ウイルス溶解物、組換えタンパク質、合成ペプチド、ホルモン、ホルモ
    ンレセプター、一本鎖核酸、低分子である請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 アダプター分子がプロテインＡ、プロテインＧ、またはレ
    クチンである請求項８または９記載の方法。
13. 【請求項１３】 周期的電位がノコギリ歯の形をしている請求項８〜１２の
    いずれかに記載の方法。
14. 【請求項１４】 周期的電位が少なくとも２周期で適用される請求項８また
    は１３のいずれかに記載の方法。
15. 【請求項１５】 周期的電位が、＋２ボルトに等しいかまたはそれ以下の、
    電極に適用される最高値を有する請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 【請求項１６】 アニオンが大イオン半径を有する塩が、電気化学的重合溶
    液に添加されている請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
17. 【請求項１７】 塩がドデシル硫酸ナトリウムまたはデキストラン硫酸ナト
    リウムである請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 電導性ポリマーのモノマー単位がアニリン、チオフェン、
    フラン、またはピロールである請求項８〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 【請求項１９】 試料中の分析物の電気化学的検出法であって、 ａ）試料中の検出すべき所望の分析物を結合することができるレセプターを固定
    化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を得、 ｂ）該所望の分析物が該固定化または吸着レセプターに結合するように試料を含
    む被検溶液と検出電極を接触させ、 ｃ）固定化または吸着レセプターと結合する部位から空間的に離れた部位で該分
    析物と結合することができる、荷電標識と結合した第二レセプターを含む溶液と
    検出電極を接触させ、 ｄ）処理した検出電極と参照電極の両方を電解液中に浸漬したときの、それらの
    間の電位差をモニターし、 ｅ）一定ｐＨにおける電解液のイオン強度の変化に伴う検出電極と参照電極間の
    電位差をモニターする工程を含む方法。
20. 【請求項２０】 試料中の分析物の電気化学的検出法であって、 ａ）レセプター試料中の検出すべき所望の分析物と結合することができるレセプ
    ターを固定化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を得
    、 ｂ）該分析物が該固定化または吸着レセプターに結合するように試料を含む被検
    溶液と検出電極を接触させ、 ｃ）該固定化または吸着レセプターと結合することができる、荷電標識と結合し
    た競合分子を含む溶液と検出電極を接触させ、 ｄ）処理した検出電極と参照電極の両方を電解液中に浸漬したときの、それらの
    間の電位差をモニターし、 ｅ）一定ｐＨにおける電解液のイオン強度の変化に伴う検出電極と参照電極間の
    電位差をモニターする工程を含む方法。
21. 【請求項２１】 荷電標識が以下の特性を有する請求項１９または２０に記
    載の方法： （ｉ）パートｄ）の電解液のｐＨで正味の荷電を保持し、 （ii）この荷電の大きさが一定ｐＨでの電解液のイオン強度の変化に応じて変化
    する。
22. 【請求項２２】 荷電標識がフェロセン（ferrocene）、ラテックスミクロ
    スフェア、または金である請求項２１記載の方法。
23. 【請求項２３】 検出電極を、荷電標識と結合した第二レセプターまたは競
    合分子を添加した被検溶液と接触させることにより工程（ｂ）および（ｃ）を同
    時に行う請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 【請求項２４】 試料中の分析物の電気化学的検出法であって、 ａ）レセプター試料中の検出すべき所望の分析物と結合することができるレセプ
    ターを固定化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を得
    、 ｂ）該分析物が該固定化または吸着レセプターと結合するように試料を含む被検
    溶液と検出電極を接触させ、 ｃ）固定化または吸着レセプターと結合する部位から空間的に離れた部位で該分
    析物と結合することができる、酵素と結合した第二レセプターを含む溶液と検出
    電極を接触させ、 ｄ）処理した検出電極と参照電極の両方を電解液中に浸漬したときの、それらの
    間の電位差をモニターし、 ｅ）該酵素の基質を含む電解液に曝露した後の検出電極と参照電極間の電位差を
    モニターする工程を含む方法。
25. 【請求項２５】 試料中の分析物の電気化学的検出法であって、 ａ）レセプター試料中の検出すべき所望の分析物を結合することができるレセプ
    ターを固定化または吸着した電導性ポリマーコーティングを有する検出電極を得
    、 ｂ）該所望の分析物が該固定化または吸着レセプターに結合するように試料を含
    む被検溶液と検出電極を接触させ、 ｃ）該固定化または吸着レセプターと結合することができる、酵素と結合した競
    合分子を含む溶液と検出電極を接触させ、 ｄ）処理した検出電極と参照電極の両方を電解液中に浸漬したときの、それらの
    間の電位差をモニターし、 ｅ）該酵素の基質を含む電解液に曝露した後の検出電極と参照電極間の電位差を
    モニターする工程を含む方法。
26. 【請求項２６】 該酵素が、検出電極の電導性ポリマーコーティングの酸化
    還元組成に直接影響する基質を、該電導性ポリマーコーティングの酸化還元組成
    に対する検出可能な効果を持たない生成物に変換することができる請求項２４ま
    たは２５記載の方法。
27. 【請求項２７】 該酵素がパーオキシダーゼである請求項２６記載の方法。
28. 【請求項２８】 該酵素が、検出電極の電導性ポリマーコーティングの酸化
    還元組成に対して検出可能な効果を持たない基質を、該電導性ポリマーコーティ
    ングの酸化還元組成に直接または間接的に影響を及ぼすことができる生成物に変
    換することができる請求項２４または２５記載の方法。
29. 【請求項２９】 該電導性ポリマー膜の酸化還元組成に間接的に影響を及ぼ
    すことができる生成物がパート（ｅ）の電解液のｐＨを変化させる請求項２８記
    載の方法。
30. 【請求項３０】 該酵素がウレアーゼである請求項２９記載の方法。
31. 【請求項３１】 該酵素が、検出電極の電導性ポリマーコーティングの酸化
    還元組成に対する検出可能な効果を持たない基質を、第二酵素の基質である生成
    物に変換することができる請求項２４または２５記載の方法（ここで、第二酵素
    の作用により検出電極の電導性ポリマーコーティングの酸化還元組成に直接また
    は間接的に影響を及ぼす第二生成物が生じる）。
32. 【請求項３２】 該検出電極を、酵素標識と結合した第二レセプターまたは
    競合分子を加えた被検溶液と接触させることにより工程（ｂ）および（ｃ）が同
    時に行われる請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。
33. 【請求項３３】 検出すべき分析物と結合することができるレセプターが、
    ビオチン化されており、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジ
    ン結合相互作用により検出電極の電導性ポリマーコーティングに固定化または吸
    着したアビジンまたはストレプトアビジンと結合する、請求項１９〜３２のいず
    れかに記載の方法。
34. 【請求項３４】 検出すべき分析物と結合することができるレセプターが、
    抗体であり、プロテインＡ／抗体またはプロテインＧ／抗体結合相互作用により
    検出電極の電導性ポリマーコーティングに固定化または吸着したプロテインＡま
    たはプロテインＧと結合する、請求項１９〜３２のいずれかに記載の方法。
35. 【請求項３５】 検出すべき分析物と結合することができるレセプターが、
    糖部分を含んでおり、レクチン／糖結合相互作用により検出電極の電導性ポリマ
    ーコーティングに固定化または吸着したレクチンと結合する、請求項１９〜３２
    のいずれかに記載の方法。
36. 【請求項３６】 検出すべき分析物と結合することができるレセプターが、
    ＦＩＴＣで標識されており、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ結合相互作用により検出電極
    の電導性ポリマーコーティングに固定化または吸着した抗ＦＩＴＣ抗体と結合す
    る、請求項１９〜３２のいずれかに記載の方法。
37. 【請求項３７】 該検出電極が請求項８〜１８のいずれかに記載の方法に従
    って製造される請求項１９〜３６のいずれかに記載の方法。
38. 【請求項３８】 検出電極を、荷電標識または酵素と結合した第二レセプタ
    ーまたは競合分子およびビオチン化レセプターを加えた被検溶液と接触させるこ
    とにより検出電極とビオチン化レセプターを接触させる工程とともに、工程（ｂ
    ）および（ｃ）を同時に行う請求項３３記載の方法。
39. 【請求項３９】 該第二レセプターがポリクローナル抗体またはモノクロー
    ナル抗体である請求項１９記載の方法。
40. 【請求項４０】 生物学的液体、例えば、全血、血清、リンパ液、尿、唾液
    、脳脊髄液、および精液を被検溶液として用いる請求項１９〜３９のいずれかに
    記載の方法。
41. 【請求項４１】 試料中の分析物の電気化学的検出法であって、 （ａ）電導性ポリマーに固定化または吸着したアビジンまたはストレプトアビジ
    ン分子を含む電導性ポリマー層でコートした電導性電極を含む検出電極を得（こ
    こで、該アビジンまたはストレプトアビジン分子は、ビオチン／アビジンまたは
    ビオチン／ストレプトアビジン結合相互作用により、検出すべき分析物を結合す
    ることができるレセプター分子と結合する）、 （ｂ）該所望の分析物が該固定化または吸着レセプター分子と結合するように試
    料を含む被検溶液と検出電極を接触させ、 （ｃ）検出電極と参照電極の両方を電解液に浸漬したときの参照電極に対する検
    出電極電位をモニターし、 （ｄ）一定ｐＨでの電解液のイオン強度または組成の変化に伴う参照電極に対す
    る検出電極電位差をモニターする工程を含む方法。
42. 【請求項４２】 検出すべき分析物が核酸であり、レセプター分子がオリゴ
    ヌクレオチドである請求項４１記載の方法。