FI120045B - Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit - Google Patents

Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit Download PDF

Info

Publication number
FI120045B
FI120045B FI20051318A FI20051318A FI120045B FI 120045 B FI120045 B FI 120045B FI 20051318 A FI20051318 A FI 20051318A FI 20051318 A FI20051318 A FI 20051318A FI 120045 B FI120045 B FI 120045B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dsm
acremonium
enzymes
thermophilum
enzyme
Prior art date
Application number
FI20051318A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20051318A0 (fi
FI20051318L (fi
Inventor
Liisa Viikari
Matti Siika-Aho
Jari Vehmaanperae
Jarno Kallio
Marika Alapuranen
Terhi Puranen
Satu Hooman
Sanni Voutilainen
Teemu Halonen
Original Assignee
Roal Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38188306&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI120045(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Roal Oy filed Critical Roal Oy
Priority to FI20051318A priority Critical patent/FI120045B/fi
Publication of FI20051318A0 publication Critical patent/FI20051318A0/fi
Priority to RU2008123954/10A priority patent/RU2458128C2/ru
Priority to EP12151850.0A priority patent/EP2453013B1/en
Priority to CN2006800528641A priority patent/CN101384713B/zh
Priority to ES06830936.8T priority patent/ES2501944T3/es
Priority to DK12151850.0T priority patent/DK2453013T3/en
Priority to EP10191152.7A priority patent/EP2319920B1/en
Priority to PCT/FI2006/050558 priority patent/WO2007071818A1/en
Priority to EP06830936.8A priority patent/EP1963498B1/en
Priority to EP12151852.6A priority patent/EP2453014B1/en
Priority to ES12151852.6T priority patent/ES2582078T3/es
Priority to AU2006326963A priority patent/AU2006326963B2/en
Priority to CA2833029A priority patent/CA2833029C/en
Priority to ES12151850.0T priority patent/ES2582320T3/es
Priority to AP2008004509A priority patent/AP2924A/xx
Priority to ES10191152.7T priority patent/ES2527681T3/es
Priority to DK12151852.6T priority patent/DK2453014T3/en
Priority to CA2632502A priority patent/CA2632502C/en
Priority to BRPI0620287A priority patent/BRPI0620287B1/pt
Priority to CN201110021502.9A priority patent/CN102174492B/zh
Priority to ARP060105762A priority patent/AR058721A1/es
Priority to TW095148542A priority patent/TWI391489B/zh
Publication of FI20051318L publication Critical patent/FI20051318L/fi
Priority to ZA200804976A priority patent/ZA200804976B/xx
Priority to US12/141,976 priority patent/US20090042266A1/en
Publication of FI120045B publication Critical patent/FI120045B/fi
Application granted granted Critical
Priority to US12/917,603 priority patent/US8409836B2/en
Priority to US13/774,465 priority patent/US9758777B2/en
Priority to US14/045,236 priority patent/US9593324B2/en
Priority to US15/690,513 priority patent/US20180044656A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Selluloosamaterfaalm käsittely Ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee sokerihydrqlysaattien tuotantoa seilu-5 loosamateriaalista. Tarkemmin keksintö koskee käymisessä käytettävien sokerien tuotantoa lignoselluioosamateriaatista entsymaattiselia muuntamisella.
Käymisessä käytettävät sokerit ovat käyttökelpoisia esimerkiksi bioetanoiin tuotannossa tai muihin tarkoituksiin. Erityisesti keksintö kohdistetaan seliuloo-samateriaalin käsittelymenetelmään seiiöbiohydrolaasilla, endogiukanaasiila, iö betagiukosidaasilia ja valinnaisesti ksyianaasiila ja entsyymivalmisteisiin ja niiden käyttöihin.
Keksinnön tausta
Sokerihydrolysaatteja voidaan käyttää useiden eri hienokemikaalien tai biopolymeerien, kuten orgaanisten happojen, esimerkiksi maitohapon, tai 15 etanolin tai muiden alkoholien, esimerkiksi ri-butanöiiri, 1,3-propaanidiolin, tai polyhydroksiatkaanoaattien (PHA:t) mikrobituotantoon. Sokerihydrolysaatit voivat myös palvella raakamateriaaiina muissa kuin mikrobiprasesseissa, esimerkiksi korkean arvon sokeroiden rikastuksessa, eristyksessä ja puhdistuksessa tai erilaisissa polyrnerointiprosesseissa. Yksi sokerihydrolysaättien pääkäytöis-20 tä on biopolttoaineiden tuotannossa. Bioetanoiin ja/tai muiden kemikaalien tuotanto voi tapahtua integroidussa prosessissa biojalostamossa {Wyman 2001).
Fossiilisten polttoaineiden rajoitetut lähteet ja niistä vapautuneet lisääntyvät GOs-määrät, jotka aiheuttavat kasvihuoneilmiötä, ovat synnyttäneet | tarpeen käyttää biomassaa uusiutuvana ja puhtaana energianlähteenä. Yksi j
25 iupaava vaihtoehtoinen tekniikka on biopolttoaineiden t.s. etanolin tuotanto sei- I
iuloosamateriaaieista. Kuljetussektorilla biopolttoaineet ovat toistaiseksi ainoa vaihtoehto, joka voisi vähentää C02-päästöjä merkittävästi. Etanolia voidaan käyttää nykyisissä kulkuneuvoissa ja jakeiusysteemeissä ja siten se ei vaadi kalliita investointeja infrastruktuuriin. Uusiutuvista lignoseiiuloosaraakamateri-30 saleista peräisin olevia sokereita voidaan myös käyttää raakamateriaaieina useille eri kemialllsilie tuotteille, jotka voivat korvata öljypohjaisia kemikaaleja.
Suurin osa hiilihydraateista kasveissa on lignoseiluioosan muodossa, joka oleellisesti koostuu selluloosasta, hemisellulposasta, pektiinistä ja ligniinistä. j
Lignoseifuioosasta-etanoiiksi-prosessissa iigniseliuioosamateriaali esikäsitei- | as. lään ensin joko kemiallisesta tai fysikaalisesti seliuloosafraktion tekemiseksi j | 2 alttiimmaksi hydroiyysille. Seliuioosafraktio hydrolysoidaan sitten sokereiden aikaansaamiseksi, jotka voidaan käyttää hiivan avulla etanoliksi. Ligniini saadaan pääsivutuotteena, jota voidaan käyttää kiinteänä polttoaineena.
Bioetanolin tuotantokustannukset ovat korkeat ja energiatuotanto on 5 matala ja taloudellisemman prosessin tekemiseksi tehdään jatkuvaa tutkimusta. Entsymaattista hydrolyysiä pidetään lupaavimpana tekniikkana selluloosa-biomassan muuntamiseksi käymisessä käytettäviksi sokereiksi. Kuitenkin entsymaattista hydrolyysiä käytetään vain rajoitetussa määrin teoiiisessa mittakaavassa ja erityisesti, kun käytetään voimakkaasti iignifoitua materiaalia, kulo ten puuta täi maaviljelysjätettä, tekniikka ei ole tyydyttävä. Entsymaattisen vaiheen kustannus on yksi prosessin taloudellisista päätekijöistä. Ön tehty yrityksiä parantaa selluloosamateriaalin entsymaattisen hydrolyysin tehokkuutta (Badger 2002).
US-patentti 2002/019 2774 A1 kuvaa jatkuvaa prosessia kiinteän 15 iignoselluloosabiomassan muuntamiseksi palaviksi poittoainetuotteiksi. Esikäsittelyn märkähapetuksella tai höyryräjähdyksellä jälkeen biomassa erotetaan osittain selluloosaksi, hemiseiluloosaksi ja ligniiniksi ja sitten altistetaan osittaiselle hydroiyysille käyttäen yhtä tai useampia hiilihydraasientsyymejä (EC 3.2).
Celluclast™, Novo Nordisk Ä/S:n kaupallinen tuote, joka sisältää sellulaasi- ja 20 ksylaaniaktiivisuuksiä, annetaan esimerkkinä.
US-pateritti 2004/000 5674 AI kuvaa uusia entsyymiseoksia, joita voidaan käyttää suoraan iignoselluloosasubstraatiile, jolloin esikäsitieiyproses- I
sien aikana muodostuneet myrkylliset jätetuotteet voidaan välttää ja energiaa j voidaan säästää. Synergistinen entsyymiseos sisältää sellulaasia ja apuent- j 25 syymejä, kuten sellulaasia, ksylaania, ligninaasia, amylaasia, proteaasia, lipi- | daasia tai giukoronidaasia tai niiden mitä tahansa yhdistelmää, Seiluiaasin aja- | teilaan sisältävän endogiukanaasia (EG), betaglukosidaasia (BG) ja seliobio- | hydrolaasia (CBH), Esimerkit havainnoiiistavat Trichoderman ksylaani- ja sellu- j laasivalmisteiden seoksen käytön. j 30 Kurabi ym. (2005) ovat tutkineet höyryräjäytetyn ja etanoiiorgano- solv-esikäsiteliyn Pouglas-kuusen entsymaattista hydrolyysiä uusilla ja kaupallisilla sienisellujaasellla. He testasivat kaksi kaupallista Trichoderma reesein seliulaasivaimistetta ja kaksi uutta Trichoderma sp.:n ja Peniciiiium sp.:n mu- j tanttikannoiilä tuotettua valmistetta. Trichoderma sp.:n valmiste osoitti merkit- j
35 tävästi parempaa suorituskykyä kuin muut valmisteet. Paremman suoritusky- I
vyn uskottiin ainakin osittain johtuvan merkittävästi korkeammasta betagiu- ] il i 3 kosidaasiaktiivisuudesta, joka lievittää seflobiohydrolaasin ja endogiukanaasin tuoteinhibitiota.
US-patentti 2004/005 3373 A1 koskee selluloosan muuttamismene-telmää glukoosiksi käsittelemällä esikäsiteltyä iignoseiluioosasubstraattia ent-5 syymiseokseila, joka käsittää seliufaasia ja modifioitua seliobiohydrolaasia I (CBHi). CBKI on modifioitu inaktivoimaila sen selluloosaan sitova domeeni (CBD). CBH1;n modifikaation edut ovat esimerkiksi parempi talteenotto ja korkeampi hydrolyysinopeus korkeammalla substraattipitoisuudelia. Sefiuiaasi valitaan ryhmästä, joka koostuu EG:sta, CBH-sta ja BG:sta. CBHi saadaan edui-10 lisesti Trichodermasta.
US-patentti 2005/016 4355 A1 kuvaa ligndselluloosamateriaalin ha-jotusmeneteimaä yhdellä tai useammilla sellulölyyttiSillä entsyymeillä vähintään yhden surfaktantin ollessa läsnä. Usäentsyymejä, kuten herniseilulaaseja, es-teraasia, peroksidaasia, proteaasia, lakkaasia tai niiden seosta, voidaan myös 15 käyttää. Surfaktantin läsnäolo lisää iägnoseiluioösamateriaaiän hajotusta verrattuna surfaktantin poissaoloon. Seliuidlyyttiset entsyymit voivat ofla mitä tahansa entsyymejä, jotka osallistuvat tignoselluloosan hajotukseen, mukaan lukien C8H:n, EG;n ja BG:ri. j
On valtava määrä julkaisuja, jotka esittävät erilaisia sellulaaseja ja \ 20 hemiseliulaasejä. |
Sellobiohydrolaaseja (CBH:t) esitetään esimerkiksi julkaisussa | WO 03/000 941, joka koskee erilaisista sienistä saatuja CBHi-entsyymejä.
Entsyymien fysiologisia ominaisuuksia ei anneta eikä myöskään niiden käytön j
mitään esimerkkejä. Julkaisu Hong ym. (2003b) luonnehtii hiivassa tuotettua 25 Thermoascus aurantiacuksen CBHlia, Entsyymin sovelluksia ei kuvata. Juikai- I
su Tuohy ym. (2002) kuvaa seflobiohydrolaasien kolme muotoa Talaromyces j emersoniMa. j celS-perheen endoglukanaaseja (EG;t perhe 5) kuvataan esimerkiksi julkaisussa WO 03/062 409, joka koskee koostumuksia, jotka käsittävät vä-30 hintään kahta termisesti stabiilia entsyymiä, käytettäviksi rehusövelluksissa.
Julkaisu Hong ym. (2003a) kuvaa termisesti stabiilin endo-β-1,4-giukanaasin T, j aurantiacuksesta tuotantoa hiivassa. Sovelluksia ei selitetä. Julkaisu j WO 01/70 998 koskee β-glukanaaseja Talaromycesistä. He kuvaavat myös β-giukanaaseja Taloromyces emersonUsta. Elintarvike-, rehu-, virvoitusjuoma-, j 35 pano- ja pesuainesoveiluksia käsitellään. Lignoseliuloosan hydrolyysiä ei mai- j \ nita. Julkaisy WÖ 98/06 858 kuvaa beta-1,4-endoglukanaaseja Aspergillus ai- \ | \ \ i 4 getistä ja käsittelee entsyymin rehu- ja elintarvikesovelluksfa. Julkaisu Wö 97/13 853 kuvaa menetelmiä entsyymejä koodittavien DNA-fragmenttien seulontaan CDNA-kirjastoista. cDNA-kirjasto on hiiva- tai sieniperäinen, edullisesti Aspergilluksesta. Entsyymi on edullisesti sellulaasi. Julkaisu Van Pete-s gem yrn, (2002) kuvaa cel5-perheen endogiukanaasin Thermoascus auran-f/acuksesta 3D-rakenteen. Julkaisu Parry yrn. (2002) kuvaa ce!5-perheen en-dqglukanaasin Thermoascus aurantiacuksesta toimintamuodon.
cel7-perheen endoglukanaaseja (EG:t perhe 7) esitetään esimerkiksi US-patentissa 5 912 157, joka koskee Myceloiphthoran endoglukanaasia ja to sen homologeja ja sen sovelluksia pesuaineissa, tekstiileissä ja kuitumassas-$a. US-patentti 6 071 735 kuvaa sellulaaseja, jotka osoittavat korkeaa endo-glukanaasiaktiivisuutta emäksisissä olosuhteissa. Käyttöjä pesuaineina, massa- ja paperi- ja tekstiilisovelluksissa käsitellään. Bioetanolia ei mainita. US-patentti 5 763 254 esittää entsyymejä, jotka hajottavat selluiosaa/hemisellu-15 toosaa ja joilla on konservoituneita aminohappoja CBD:ssa.
cel45-perheen endoglukanaaseja (EG;t perhe 45) kuvataan esimerkiksi US-patentissa 6 001 639, joka koskee entsyymejä, joilla on endoglu-kanaasiaktiivisuutta ja joilla on kaksi konservoitunutta aminohapposekvenssiä. Käyttöjä tekstiili-, pesuaine- ja massa- ja paperisovellukslssa käsitellään yiei-20 sesti ja lignoseiluloosamateriaalin käsitteleminen mainitaan, mutta esimerkkejä ei anneta. Julkaisu WÖ 2004/053 039 kohdistetaan endoglukanaasien pesu-ainesovelluksiin. US-patentti 5 958 082 esittää endogiukanaasin, erityisesti Thielavia terrestrisistä, käytön tekstiilisoveliuksessa. Julkaisu EP 0 495 258 koskee pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät Humicolan seliuiaasia. US-25 patentti 5 948 672 kuvaa selluiaasivalmistetta, joka sisältää endogiukanaasia, erityisesti HumicolasXa, ja sen käyttöä tekstiili- ja kuitumassasoveliuksissa. Lignoseiluloosan hydroiyysiä ei mainita.
Pieni määrä beiaglukosidaasia (BG) lisää biomassan hydroiyysiä glukoosiksi hydrolysoimalla sellobiohydrolaaseilla tuotettua sellobioosia. Sello-30 bioosin muuntaminen glukoosiksi on yleensä eniten nopeutta rajoittava vaihe. Betagiukosidaaseja esitetään esimerkiksi US-patentissa 2005/0 214 920, joka koskee BG:a Aspergillus fumigatuksesia. Entsyymi on tuotettu Aspergillus ory-zaessa ja Trichoderma reeseissä. Entsyymin käyttöä biomassan hajotuksessa tai pesuainesovelluksissa käsitellään yleisesti, mutta esimerkkejä ei esitetä. 35 Julkaisu WO 02/095 014 kuvaa Aspergillus oryzaen entsyymin, jolla on sello-biaasiaktiivisuutta. Käyttö etanolin tuotannossa biomassasta käsitellään ylei- 5 sesti, mutta esimerkkejä ei esitetä. Julkaisu WQ 2005/074 656 esittää polypep-tidejä, joilla on sellulojyysiä lisäävää aktiivisuutta ja jotka ovat peräisin esimerkiksi T. aurantiacuksesta; A. fumigatuksesia; T. terretrisistä ja T, aurantiacuk-sesta. Julkaisu WO 02/26 979 esittää kasvimateriaalin entsyyrnaattisen pro-5 sessoinnin. US-patentti 6 022 725 kuvaa Triehoderma reesein betaglukosi-daasigeenin kloonausta ja vahvistamista ja US-patentti 6 103 464 kuvaa menetelmää betaglukosldaasia koodittavan DNA:n detektioon filamenttihomeesta. Sovellusesimerkkejä ei anneta.
Ksyianaaseja kuvataan esimerkiksi julkaisussa FR2 786 784, joka 10 koskee kuumuusstabiilia ksylaania, joka on käyttökelpoinen eläinrehun käsittelemisessä ja leivänvalmistuksessa. Entsyymi on peräisin termofiilisestä sienestä, erityisesti Thermoascus-suvusta.
US-patentti 6 197 564 kuvaa entsyymejä, joilla on ksylanaasiaktiivi-suutta ja saadaan Aspergillus aculeatuksesta. Niiden sovellus leipomisessa 15 esitetään esimerkkinä. Julkaisu WO 02/24 926 koskee Talaromycesm ksyla-naaseja. Rehu- ja ieivontaesimerkkejä annetaan. Julkaisu WO 01/42 433 esittää termisesti stabiilin ksyianaasin Talaromyces emersoniista käytettäväksi elintarvike- ja rehusoveliuksissa.
Parhaiten tutkitut ja laajimmin sovelletut sieniaikuperän seiiulolyytti-20 set entsyymit ovat peräisin Trichoderma reese/stä (Hypperea jecorinan ana- \ morfi). Näin ollen myös eniten kaupallisesti saatavilla olevat slenisellulaasit j ovat peräisin Trichoderma reese/stä. Kuitenkaan suurinta osaa vähemmän j tunnetuista sienistä peräisin olevista sellulaaseista ei ole käytetty käytännölli- \ sesti tärkeissä prosesseissa, kuten selluloosamateriaalin, mukaan lukien ligno- j 25 selluloosan, hajotuksessa.
On jatkuva tarve uusille selluloosasubstraattien, erityisesti lignosel-luloosasubstraattien, hajotusmenetelmille ja uusille entsyymeille ja entsyymi- j seoksille, jotka lisäävät hajotuksen tehokkuutta. On myös tarve prosesseille ja j entsyymeille, jotka toimivat korkeissa lämpötiloissa siten mahdollistaen bio- \ 30 massan korkean koostumuksen käytön ja johtaen korkeisiin sokeri- ja etanoli- j pitoisuuksiin. Tämä lähestymistapa voi johtaa merkittävään säästöön energi- j i assa ja investointikustannuksissa. Korkeammat lämpötilat myös vähentävät kontaminaatioriskiä hydroiyysin aikana. Esillä oleva keksintö pyrkii kohtaamaan ainakin osan näistä tarpeista.
i 6
Keksinnön lyhyt kuvaus
Nyt on yllättäen havaittu, että sellu Myyttiset entsyymit ja erityisesti Thermoascus auranf/acuksesta, Acremonium thermophilumlsta tai Chaetomi-um thermophilumlsia saatavissa olevat sellobiohydrolaasit ovat erityisen käyt-5 tökeippisia seiluloosamateriaalin hydroiysoimisessa. Sellobiohydrolaasien lisäksi näillä sienillä on myös endoglukanaaseja, betagiukosidaaseja ja ksy-lanaaseja, jotka ovat erittäin sopivia seiiuioosamateriaaiin hajotukseen. Entsyymit ovat kineettisesti erittäin tehokkaita ieveäliä iämpötiiaväliliä ja vaikka niillä on korkea aktiivisuus korkeissa lämpötiloissa, ne ovat myös erittäin telo hokkaita hydrolyysin perusiämpotiloissa. Tämä tekee ne äärimmäisen hyvin sopiviksi vaihtelevien selluloosasubstraattien hydrolyyslprosesseihin, jotka suoritetaan sekä tavanomaisissa lämpötiloissa että korotetuissa lämpötiloissa.
Esillä oleva keksintö koskee seiluloosamateriaalin käsittelymenetelmiä seilobiohydrolaasilla, endoglukanaasilfa ja betaglukosidaasilfa, jolloin 15 mainittu sellöbiohydrolaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 28 kanssa.
Keksintö edelleen koskee entsyymivalmistetta, joka käsittää seiio-biohydrolaasia, endogiukänaasia ja betaglukosidaasia, jossa mainittu sellobio-hydrolaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys 20 sekvenssin nro 28 kanssa.
Keksintö koskee edelleen mainitun entsyymivalmisteen käyttöä sei-, luloosamateriaaiin hajottamiseksi sekä menetelmän käyttöä prosessissa eta- j nolin valmistamiseksi selluloosarnateriaaiista. |
Lisäksi tässä kuvataan poiypeptidiä, joka käsittää selluIoiyyttistä ak- j 25 tiviisuutta omaavan fragmentin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu: j a) polypeptidistä, joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vä- j hintaan 66 % identtisyys sekvenssin nro 4 kanssa, 79 % identtisyys sekvens- j sin nro 6 kanssa, 78 % identtisyys sekvenssin nro 12 kanssa, 68 % identtisyys j sekvenssin nro 14 kanssa, 72 % identtisyys sekvenssin nro 16 kanssa, 68 % \ 30 identtisyys sekvenssin nro 20 kanssa, 74 % identtisyys sekvenssin nro 22 tai ) 24 kanssa tai 78 % identtisyys sekvenssin nro 26 kanssa; b) kohdan a) variantista, joka käsittää fragmentin, jolla on seliulolyyt-tistä aktiivisuutta; ja g) kohdan a) tai b) fragmentista, jolla on seiluloiyyttistä aktiivisuutta. \ 35 Edelleen kuvataan polynukleotidi, joka valitaan ryhmästä, joka koos- j
tuu: I
j ] | s 7 a) sekvenssin.3,. 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 tai 25 nukleotidisekvens-sista tai patenttivaatimuksen 35 mukaista poiypeptidiä koodittavasta sekvenssistä; b) kohdan a) komplementaarisesta juosteesta 5 c) kohdan a) tai b) vähintään 20 nukleotidiä käsittävästä fragmentis ta; ja d) sekvenssistä, joka on degeneroitu geneettisen koodin suhteen missä tahansa kohdassa a), b) tai c) määriteilyssä sekvenssissä.
Lisäksi esitetään vektori, joka käsittää mainitun polynukieotidjn helo teroiogisena sekvenssinä, ja isäntäsolua, joka käsittää mainitun vektorin. Es-cheria coll·kannat, joilla' on taiietusnumerot DSM 18728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 tai DSM 17667, sisällytetään myös keksintöön.
Muita kuvauksen kohteita ovat entsyymivalmisteet, jotka käsittävät 15 vähintään yhtä uusista poiypeptideistä, ja mainitun poiypeptidin käyttö polttoaine-, tekstiili-, pesuaine-, massa-ja paperi-, elintarvike-, rehu-ja virvoltusjuorna-teoilisuudessa.
Edelleen esitetään menetelmä poiypeptidin valmistamiseksi, joka käsittää poiypeptidin seliuioiyyttistä aktiivisuutta omaavan fragmentin, joka vaii-20 taan ryhmästä, joka koostuu: j a) polypeptidistä, joka käsittää aminohapposekvenssin, jolta' on vä- j hintään 66 % identtisyys sekvenssin nro 4 kanssa, 79 % identtisyys sekvens- j sin nro 6 kanssa, 78 % identtisyys sekvenssin nro 12 kanssa, 68 % identtisyys Ϊ sekvenssin nro 14 kanssa, 72 % identtisyys sekvenssin nro 16 kanssa, 68 % \ 25 identtisyys sekvenssin nro 20 kanssa, 74 % identtisyys sekvenssin nro 22 tai j 24 kanssa tai 78 % identtisyys sekvenssin nro 26 kanssa; j b) kohdan a) variantista, joka käsittää fragmentin, jolla on seilulolyyt- i tistä aktiivisuutta; ja j c) kohdan a) tai b) fragmentista, jolla on seliuioiyyttistä aktiivisuutta, 30 jossa menetelmässä transformoidaan isäntäsoiu mainittua poiypeptidiä koodattavalla vektorilla ja viljellään mainittua isäntää olosuhteissa, jotka j mahdollistavat poiypeptidin ilmentämisen ja valinnaisesti otetaan tuotettu poly- j peptidi talteen ja puhdistetaan se.
Keksinnön spesifisiä suoritusmuotoja esitetään riippuvissa patehtti-35 vaatimuksissa.
| 8
Esillä olevan keksinnön muut kohteet, yksityiskohdat ja edut tulevat ilmeisiksi seuraavista piirustuksista, yksityiskohtaisesta kuvauksesta ja esimerkeistä.
Piirustusten lyhyt kuvaus 5 Kuva 1. Seiiulaasi- ja betagiukosidaasiaktiivisuuksien lämpötilariip puvuudet testattujen kuuden sieni kannan supernatanteissa. inkubaatioaika kokeessa oli 60 min mainitussa lämpötilassa, kokeen pH oli 5,0 (MUL-aktiMsuus) tai 4,8 (CMCaäsi tai BGU). 60 °C:ssa saatu aktiivisuus asetetaan 100 %:n suhteelliseksi aktiivisuudeksi. A) Thermoaseus aurantiacus ALK04239, B) Thereto moascus aurantiacus ALK04242, C) Acremonium thermophilum ALK04245, D) Taiaromyces thermophilus ALKÖ4246, E) Chaetomium thermophilum AL-K04261, F) Chaetomium thermophiium ALK04265.
Kuva 2. Kaaviokuva ekspressiokaseteista, joita käytettiin Tricho-derma reesei -protoplasiien transformaatiossa rekombinanttisieniproteiinin 15 tuottamiseksi. Rekombinanttigeenit olivat T reesei cbhl {cel7A) -promoottorin {cbhl prom) kontrollin alaisia ja transkription terminaatio varmistettiin käyttäen T reesein cbhl -terminaatiosekvenssiä (cbhl term). amdS~geen\ (amdS) sisällytettiin transformaatiomarkkerina.
Kuva 3. A) GBH/Cel7~rekombinanttiproteiinivalmisteiden Thermoas-20 cus aurantiacus ALK04242:sta, Chaetomium thermophilum ALK04265:stä ja Acremonium thermophilum ALK04245:sta pH-optimi määritettynä 4-metyyli-umbelliferyyli-p-D-iaktosidilia (MUL) 50°C:ssa, 10 min. Tulokset annetaan kolmen erillisen mittauksen keskiarvona (±SD). B) CBH/Cel7-rekombinanttiprote-iinivalmisteideh Thermoaseus aurantiacus ALK04242:sta, Chaetomium ther-25 mophiium ALK04265:stä ja Acremonium thermophilum ALK04245:sta terminen stabiilius määritettynä 4-metyyliumbeliiferyyli-h-D-iaktosidilla (MUL) optimi-pH:ssa 60 min ajan. Tulokset annetaan kolmen erillisen mittauksen keskiarvona (±SD). Molemmat reaktiot sisälsivät BSA:a (100 pg/ml) stabilointiaineena.
Kuva 4. Kiteisen selluloosan (Avicel) hydrolyysi puhdistetuilla re-30 kombinanttisellGbiohydraiaaseilla 45 °C:ssa. Substraattipitoisuus 1 % (pamo/ti-iavuus), pH 5,0, entsyymipitoisuus 1,4 μΜ. A) GBD:n sisältävät sellobiohyd-roiaasit, B) seiiobiohydrölaasit (ydin) ilman CBD:a,
Kuva 5. Kiteisen selluloosan (Avicel) hydrolyysi puhdistetuilla re-kombinanteilla sellobiohydrolaaseilia 70 °C:ssa. Substraattipitoisuus 1 % (palas no/tilavuus), pH 5,0, entsyymipitoisuus 1,4 μΜ. A) CBD:n sisältävät sellobio-hydroiaasit, B) seilobiohydroiaasit (ydin) ilman CBD:a.
9
Kuva 6. Heterologisesti tuotetun Acremoniumm EG_40/Cel45A:n, EG_40Jike/Ge!45B:n ja Thermoascuksen EG_28/Cel5A:n aktiivisuuden pH-riippuvuus määritettiin CMC-substraatilla 10 minuutin reaktiossa 50 °C:ssa, B) Acremoniumm E<3_40/Ce!45A:n, EG_40Jike/Cel45B:n ja Thermoascuksen 5 EG_28/'Cel5A:n lämpötiiaoptimä määritettiin pH:ssa 5,5, 4,8 ja 6,0 mainitussa järjestyksessä. CMC-:a substraattina sisältävä reaktio suoritettiin 60 minuutin ajan, paitsi EG_28/Gei5A:lle 10 minuutin ajan. BSA {100 pg/ml) lisättiin stabilointiaineena.
Kuva 7. A) Heierölogisesti tuotetun Acremoniumin BG_101/Cel3A:n, 10 Ghaetomiumln BG__76/Cei3A:n ja Thermoascuksen BG_81/Cei3A:n aktiivisuuden pH-riippuvuus määritettiin 4-nitrofenyy!i-p-D-glukopyranosidisubstraatilla 10 minuutin reaktiossa 50 °C:ssa. B) Acremoniumm 0G_1O1/Cel3A:n, Chae-tomiumm pG_76/Ce!3A:n ja Thermoascuksen 0G„81/Cei3A:n lämpötiiaoptimi määritettiin pH:ssa 4,5, 5,5 ja 4,5 mainitussa järjestyksessä, 4-nitrofenyyli-0-D~ 15 giukopyranpsidia substraattina sisältävä reaktio suoritettiin 60 minuutin ajan, BSA (100 gg/ml) lisättiin stabilointiaineena*
Kuva 8. A) Heterologisesti tuotetun Thermoascuksen XYN_30/Xyn10A-ksylanaasiaktiivisuuden pH-riippuvuus määriteltiin koivun ksylaanisubstraatilia 10 minuutin reaktiossa 50°C:ssa. B) XYN_30/Xyn10A:n 20 lämpötiiaoptimi määritettiin pH:ssa 5,3 60 minuutin reaktiossa, BSA
(100 jig/ml) lisättiin stabilointiaineena. j
Kuva 9. Pestyn höyry räjäytetyn kuusikuidun (10 mg/ml) hydroiyysi \ termpfiiiisten entsyymien seoksella (SEOS 1) ja T reesein entsyymeillä 55 ja j 60 °C:ssa. Entsyymiannos annetaan yksikkönä FPU/g substraatin kuiva- j 25 ainetta, FPU analysoitu 50 0C:ssa, pH 5. Hydroiyysiä suoritettiin 72 tunnin ajan | pHissa 5 sekoittaen. Tulokset annetaan kolmen erillisen mittauksen keskiarvo- | na (±SD). j ί
Kuva 10. Höyryräjäytetyn maissinkoijuujätteen (10 mg/ml) hydroiyy- j
si termofiilisten entsyymien seoksella (SEOS 2) ja T. reesein entsyymeillä 45, I
30 55 ja 57,5 °C;ssa. Entsyymiannos oli "SEOKSELLE 2" 5 FPU/g substraatin | kuiva-ainetta ja 7. reesein entsyymeille 5 FPU/g Gelluclast-kuiva-ainetta täy- j riennettynä 100 nkat/g kuiva-ainetta Novozym 188:11a (suodatinpaperiaktiivi-suus analysoitiin 50 °C:ssa, pH 5). Hydroiyysiä suoritettiin 72 tunnin ajan | pH:ssa 5 sekoittaen, Tulokset annetaan kolmen erillisen mittauksen keskiarvo- j 35 na (±SD). Substraatti sisälsi liukoisia pelkistäviä sokereita (noin 0,7 mg/ml). :j 10 Tämä taustasokeripitöisuus vähennettiin hydrolyysin aikana muodostuneista pelkistävistä sokereista.
Kuva 11. Höyryräjäytetyn maissinkorjuujätteen (10 mg/mi) hydroiyy-si termofiilisten entsyymien seoksella, joka sisältää uutta termofiillstä ksy-5 lanaasia Thermoascus aurantiacuksesia(SEQS 3), ja T. teesein entsyymeillä 45, 55 ja 60 °C:ssa. Entsyymiannos oli ’’SEOKSELLE 3" 5 FPU/g substraatin kuiva-ainetta ja T. teesein entsyymeille 5 FPU/g Geiiuciast-kuiva-ainetta täydennettynä 100 nkat/g kuiva-ainetta Novozym 188:iia {suodatinpaperiaktiivi-suus analysoitiin 50 °C:ssa, pH 5). Hydrolyysiä suoritettiin 72 tunnin ajan 10 pH:ssa 5 sekoittaen. Tulokset annetaan kolmen erillisen mittauksen keskiarvona (±SD). Substraatti sisälsi liukoisia pelkistäviä sokereita (noin 0,7 mg/mf).
Tämä taustasokeripitöisuus vähennettiin hydrolyysin aikana muodostuneista pelkistävistä sokereista.
Kuva 12. Höyryräjäytetyn kuusikuidun (10 mg/mi) hydroiyysi termo-15 fiilisten entsyymien seoksella, joka sisältää uutta termofiiiistä ksylanaasia XYN 3Q/XyntGA Thermoascus aurantiacuksesta (SEOS 3), ja T. reese/n entsyymeillä 45, 55 ja 60 °C:ssa. Entsyymiannos ’’SEOKSELLE 3” oli 5 FPU/g substraatin kuiva-ainetta ja T. reese/n entsyymeille 5 FPU/g Ceiiuclast-kuiva-ainet-ta täydennettynä 100 nkat/g kuiva-ainetta Novozym 188:11a (suodatinpaperiak-20 tiivisuus analysoitiin 50 °C:ssa, pH 5). Hydrolyysiä suoritettiin 72 tunnin ajan pH:ssa 5 sekoittaen. Tulokset annetaan kolmen erillisen mittauksen keskiarvona (±SD). j
Kuva 13. Glukoosin vaikutus erilaisien β-giukosidaasivalmisteiden I
aktiivisuuteen. Peruskoe käyttäen p-nitrofenyyll· β-D-glukopyranosidia sub-25 straattina suoritettiin glukoosin ollessa läsnä koeseoksessa. Aktiivisuus esitetään prosentteina ilman glukoosia saadusta aktiivisuudesta, |
Kuva 14. Entsyymiseoksien FPU-aktiivisuudet lämpötiloissa 50-70 °0 j
esitettynä prosentteina aktiivisuudesta perusolosuhteissa (50 °C, 1 h). J
Kuva 15. Kahden erilaisen käsittelemätöntä Nutriosea (NO) tai \ 30 BG__81/Cet3A:ita esikäsiteltyä Nutriosea (NBG81) hiilen lähteenä sisältävässä \ liuoksessa kasvatetun T. ree.se/--.kannan suhteellinen sellulaasiaktiivisuus. \ | 11
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Selluloosa on korkeampien kasvien päärakennekomponentti, Se varustaa kasvisolut korkealla vetolujuudella auttaen niitä vastustamaan mekaanista kuormitusta ja osmoottista painetta. Selluloosa on p~1,4~glukaani, joka 5 muodostuu glukoosien suorista ketjuista, joita yhdistävät β-1,4-giykosidisidok-set. Seiiobioosi on selluloosan pienin toistuva yksikkö. Solu seinämissä selluloosa pakataan eri tavoin suunnattuihin levyihin, jotka upotetaan hemlseiiuioo-san ja ligniinin matriisiin. Hemiseiiuloosa on hiiiihydraattipolymeerien heterogeeninen ryhmä, joka sisältää pääosin erilaisia glukaaneja, ksylaaneja ja man-10 naaneja. Hemiselluioosa koostuu β-1,4-liiteftyjen osien lineaarisesta' rungosta substituoituna lyhyillä sivuketjuilla,.. jotka yleensä sisältävät asetyyiiä, glukoro-nyyiiä, arabinosyyliä ja gaiaktosyyliä. Hemisellulöosa voi olla kemiallisesti ris-tisidottu ligniiniin. Ligniini on erilaisten substituoitujen p-hydroksifenyylipropaa-niyksikköjen, jotka antavat voimaa soluseinämälle kestää mekaanista kuormi-15 tusta, monimutkainen silloitettu polymeeri ja se myös suojaa selluloosaa ent-symaattiselta hydroiyysiltä.
Lignoseliuloosa on selluloosan ja hern (selluloosan ja fenolipropa-h o I ly kslkköj e n polymeerien ja ligniinin yhdistelmä. Se on fysikaalrsestt kovaa, tiheää ja saavuttamatonta ja yleisin biokemiallinen materiaali biosfäärissä. Lig-20 noselluloosaa sisältäviä materiaaleja ovat esimerkiksi; jalopuu- ja havupuulas-tut, puumassa, sahanpuru ja metsätalous- ja puuteoliisuusjäte; maatalouden biomassa, kuten viljan olki, sokerijuurikasmassa, maissinkorjuujäte ja -tähkät, sokeriruokojäte, -varret, -lehdet, -palot, -kuoret yms.; jätetuotteet, kuten kiinteä yhdyskuntajäte, sanomalehdet ja toimistopaperijäte, esimerkiksi viljan myilyji-25 te; erityisenergiasadot (esimerkiksi paju, poppeli, lännenhirssi (switchgrass) tai ruokohelpi yms.). Edulliset esimerkit ovat maissinkörjuujäte, lännenhirssi (switchgrass), viljan olki, sokeriruokojäte ja puuperäiset materiaalit.
’’Sellufoosamateriaair, kuten tässä käytetään, koskee mitä tahansa materiaalia, joka käsittää selluloosaa, hemiseliuloosaa ja/tai lignoselluioosaa 30 merkittävänä ainesosana. ttJgnoselluloQsarnateriaair tarkoittaa mitä tahansa materiaalia, joka käsittää iignoselluloösaa. Tällaisia materiaaleja ovat esimerkiksi kasvimateriaalit, kuten puu, mukaan lukien havupuu ja jalopuu, ruohosa-dot, maatalouden jäännökset, massa- ja paperijäännökset, jätepaperi, elintarvike-ja rehuteollisuuden jätteet jne. Tekstiilikuidut, kuten puuvilla, puuvillasta 35 peräisin olevan kuidut, pellava, hamppu, juutti ja keinotekoiset selluloosa- 12 kuidut, kuten modaalikuidut, viskoosi, lyocefl, ovat selluloosa-aineiden eri- koisesimerkkejä.
Selluioosamateriaaiia hajotetaan luonnossa useiden erilaisten organismien, mukaan lukien bakteerien ja sienien, toimesta. Selluloosa hajotetaan 5 tyypillisesti erilaisilla seliuiaaseilla, jotka toimivat peräkkäin tai samanaikaisesti.
Selluloosan biologinen muuntaminen glukoosiksi vaatii yleisesti kolmea tyyppiä hydrolyyttisiä entsyymejä: (1) Endoglukanaaseja, jotka katkaisevat sisäisiä be-ia~1,4-giukosidisidoksia; (2) Eksoseilobiohydrolaaseja, jotka katkaisevat disak-kandisellobiopsia selluloosapolymeeriketjun päästä; (3) Beta-1,4-giukosidaa-10 seja, jotka hydrolysoivat sellobioosia ja muita lyhyitä seilo-oiigosakkarideja glukoosiksi. Toisin sanoen sellulaasien kolme pääryhmää ovat seliobiohydrolaasit (CBH), endoglukanaasit (EG) ja betaglukosidaasit (BG).
Monimutkaisempien selluloosaa sisältävien substraattien hajotus vaatii laajan sarjan erilaisia entsyymejä. Esimerkiksi (ignoselluioosaa hajote-15 taan hemiseiiulaasien, kuten ksylaanien ja mannaanien, toimesta. Hemiseliu-laasi on entsyymi, joka hydrolysoi hemiseiluloosaa.
"Seiluloiyyttiset entsyymit” ovat entsyymejä, joilla on "seflulolyyttistä aktiivisuutta”, mikä tarkoittaa, että ne kykenevät hydrolysoimaan seliuioo-saasubstraatteja tai niiden johdannaisia pienemmiksi sokereiksi. Seiluloiyyttiset 20 entsyymit siten sisältävät sekä seflulaaseja että hemiseliulaaseja. Selfulaasit, | kuten tässä käytetään, sisältävät sellobiohydrolaasia, endoglukanaasia ja be- j taglukosidaasia. j T. reeseiM on hyvin tunnettu ja tehokas seilulaasisysieemi, joka si- j sältää kaksi GBH;a, kaksi pää- ja useita vähäisempiä EG:eja ja BGieja. T. ree- j 25 sein GBHI (Cel7A) katkaisee sokeria seiiuioosaketjun pelkistävistä päästä, sillä on C-terminaaiinen selluloosaa sitova domeeni (CBD) ja se voi muodostaa jopa 60 % eritetystä kokonaisproteiinista. T, reesein GBHIi (GelöA) katkaisee sokeria seiiuioosaketjun pelkistämättömästä päästä, sillä on N-terminaaiinen j
selluloosaa: sitova domeeni ja se voi muodostaa jopa 20 % eritetystä koko- I
30 naisproteiinista. Endoglukanaasellla EGI (Cei7B) ja EGV (Cel45A) on CBD C- terminuksessaan, EGIklla (CelSA) on N-terminaalinen CBD ja EGIIhlla | (CeJ12A) ei ole lainkaan selluloosaa sitovaa domeenia. GBHI, C8HII, EGI ja j EGII ovat niin kutsuttuja. Trichoderman ’’pääseilulaaseja", jotka käsittävät yh- j dessä 80-90 % eritetyistä kokonaisproteiineista. On alan ammattimiehelle tun- j 35 nettua, että entsyymi voi olla aktiivinen useille substraateille ja enisymaattiset j aktiivisuudet voidaan mitata käyttäen erilaisia substraatteja, menetelmiä ja olo- \ \ Λ 13 suhteita. Erilaisten seliulolyyttisten aktiivisuuksien tunnistaminen käsitellään esimerkiksi julkaisussa van Tilbeurgh ym. 1988.
Katalyyttisen domeenin/ytimen, joka ilmentää sellulolyyttistä aktiivisuutta, lisäksi seliulolyyttiset entsyymit voivat käsittää yhden tai useampia sel-5 luloosaa sitovia domeeneja (CBD:t), joita kutsutaan myös hiilihydraattia sitoviksi domeeneiksi/moduleiksi (QBD/CBM), jotka voivat sijaita katalyyttisen do-meenin joko N- tai C-terminuksessa. CBD:eilia on hiilihydraattia sitovaa aktiivisuutta ja ne välittävät sellulaasin sitoutumisen käteiseen selluloosaan, mutta niillä on vähän tai ei lainkaan vaikutusta entsyymin hydrotyyttiseen sellu-10 laasiaktiivisuuteen liukoisille substraateille. Nämä kaksi domeenia tyypillisesti yhdistyvät joustavan ja erittäin giykösyloidun liitosaiueen kautta.
’'Sellobiohydroläasr tai ”CBH”, kuten tässä käytetään, viittaa entsyymeihin, jotka pilkkovat selluloosaa glukoosiketjun päästä ja tuottavat pääosin sellobioosia. Niitä kutsutaan myös 1,4-beta-D-glukaanisellobiohydFOlaa-15 seiksi tai selluioosa~1,4-betaSeliobiosidaaseiksi. Ne hydrolysoivat 1,4-beta-D-glukosidisidoksia mainittuja sidoksia sisältävän polymeerin, kuten selluloosan, pelkistävistä tai pelkistämättömistä päistä, jolloin sellobioosia vapautuu. Kaksi erilaisia CBH:a on eristetty Trichoderma reese/stä, CBHI ja GBHIL Niillä on moduleista koottu rakenne, joka koostuu katalyyttisestä domeenista liitettynä 20 selluloosaa sitovaan domeeniin (CBD). Luonnossa on myös sellobiohydro- j laaseja, joilta puuttuu CBD, j "Endoglukanaasf tai ”EG” viittaa entsyymeihin, jotka katkaisevat \ seiluloosaketjun sisäisiä glykosidisidoksia. Ne luokitellaan EC 3.2.1.4.:ksi. Ne | ovat 1,4-beta-D-glukaani-4-g!ukanohydrolaaseja ja katalysoivat 1,4-beta-D-gly- j 25 kosidisrdosten endohydrolyysiä glukoosipolymeerissä, kuten selluloosassa ja j sen johdannaisissa. Joillakin luonnostaan esiintyvillä endoglukanaaseilla on j selluloosaa sitova domeeni, kun toisilla taas ei ole. Joillakin endoglukanaaseil- \ la on myös ksylanaasiaktiivisuutta (Bailey ym. 1993). \ "Betaglukosidaasi” tai "BG” tai ”βΘ" viittaa entsyymeihin, jotka hajot-30 tavat pieniä liukoisia oligosakkarideja, mukaan lukien sellobioosia glukoosiksi. 1
Ne luokitellaan EC 3.2,1.21 :ksL Ne ovat beta-D-glukosidiglukohydrolaaseja, | jotka tyypillisesti katalysoivat terminaalisten pelkistämättömien beta-D-glukoo- ] siosien hydrolyysiä. Nämä entsyymit tunnistavat glukoosin oligosakkarideja. j
Tyypillisiä substraatteja ovat seilöbioosi ja seliötrioosi. Seilobioosi on sellobio- l 35 hydrolaasien inhibiittori, minkä vuoksi seilobioosln hajotus on tärkeää sellobio-hydrolaasien lopputuoteinhibition voittamiseksi.
J
14
Ksylanaasit ovat entsyymejä, jotka kykenevät tunnistamaan ja hydrolysoimaan hemiseiiuiöosäa. Ne sisältävät sekä eksohydrolyyttisiä että endo-hydroiyyttisiä entsyymejä. Tyypillisesti: niillä on errdo-1,4-betaksylanaasi- (EC 3.2.1.8) tai beta-D-ksylosidaasiaktiivisuutta (EC3.2.1.37), joka katkaisee hemi-5 selluloosaa ksyloosiksi. "Ksylanaasi” täi "Xyn” esillä olevan keksinnön yhteydessä viittaa erityisesti EC 3.2.1.8:ksi luokiteltuun entsyymiin, joka hydrolysoi lignoseflujoosasubstraatin ksyloosipolymeerejä tai puhdistettua ksylaania.
Tämän lisäksi sellulaasit voidaan luokitella erilaisiin glykosyylihydro-iaasiperheisiin niiden primäärisen sekvenssin mukaisesti tuettuna joidenkin 10 perheen jäsenten kolmiulotteisen rakenteen analyysillä (Henrissat 1991, Hen-rissat ja Bairoch 1993, 1996). Jotkut glykosyylihydrolaasit ovat monitoimient-syymejä, jotka sisältävät katalyyttisiä domeeneja, jotka kuuluvat erilaisiin gly-kosyyiihydroiaasiperheisiin. Perhe 3 koostuu betaglukosidaaseista (EC 3.2.1.21), kuten tässä kuvatuista Ta BG_81 :stä, Ai BG_101:stä ja Ct 15 BG_76:sta. Perhe 5 (aiemmin tunnettu celA:na) koostuu pääosin endoglu-kanaaseista (EC 3.2.1.4), kuten tässä kuvatusta Ta EG_28:sta. Perhe 7 (aiemmin: sellulaasiperhe oelC) sisältää endoglukanaaseja (EC 3.2.1.4) ja sello-biohydrofaaseja (EC 3.2.1.91), kuten tässä kuvattuja Ct EG:54:ä, Ta CBH.a, At CSH_A:ta, At CBH_C:tä ja Ct CBH:a. Perhe 10 (aiemmin celF) koostuu pää-20 osin ksyianaaseista (EC 3.2.18), kuten tässä kuvatuista Ta XYN_30:stä ja At XYN_60:stä. Perhe 45 (aiemmin CeiK) sisältää endoglukanaaseja (EC j 3.2,1.4), kuten tässä kuvattuja At EG_40:ä ja At EG_40Jike:ä.
Seiluioosamateriaaiin hydroiysoinnissa käyttökelpoisia seiluloiyytti- j siä entsyymejä on saatavissa Thermoascus aurantiacuksesXa, Acremonium \
25 thermophilumista tai Chaetomium thermophilumista. "Saatavissa jostakin” tar- I
koittaa, että ne voidaan saada mainituista lajeista, mutta se ei sulje pois mah- j dollisuutta saada ne muista lähteistä. Toisin sanoen ne voivat olla lähtöisin j mistä tahansa organismeista, mukaan lukien kasveista. Edullisesti ne ovat läh- \ toisin mikro-organismeista, esim. bakteereista tai sienistä. Bakteerit voivat olla j 30 esimerkiksi suvusta, joka valitaan Bacfifuksesta, Azospirillumistä ja Streptomy-cesistä. Edullisemmin entsyymi on lähtöisin sienistä (mukaan iukien filametti-homeesta ja hiivoista), esimerkiksi suvusta, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu Thermoascuksesta, AcremoniurrMa, Chaetomiumista, Achaetomiumistä,
Thieiaviasta, Aspergilluksesia, Botrytisista, Chrysosporiumista, Collybiasta, I
35 Famesista, Fusariumista, Humicolasta, Hypocreasta, Lentinuksesta, Melano- j carpuksesta, Myceliophthorasta, Myriococcumlsta, Neurosporasta, PenicilUu- | ] j 1 15 mistä, Phanerochaetesta, Ph le h iästä, Pleurotuksesta, Podosporasta, Polypo-ruksesia, Rhizoctoniasia, ScytalidiumisXa, Pycnoporuksesia, Trameteslsta ja Trichodermasta,
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti entsyymit ovat saa-5 tavissa numerolta CBS 116239 talletetusta Thermoascus aurantiacus -kannasta ALK04242, numerolla CBS 116240 talletetusta Acremonium thermophi-(um -kannasta ALK04245 tai numerolla CBS 730.95 tailetetusta Chaetornium thermophilum -kannasta ALKÖ4265,
Sellobiohydrolaasi edullisesti käsittää aminohapposekvenssin, jolla 10 on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 2, 4, 6 tai 8 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa.
Sellobio- Geeni Saatavissa CBD nukleiini- aminohappo- hydrolaasi happo- sekvenssi sekvenssi nro __________ nro
Ta CBH Ta ce/7A T. aurantiacus - 1__2_
At CBH_A At ce/7B A thermophilum__3_ 4
At CBH_C At cef7A A, thermophilum +5 6
Ct CBH Ct cei7A C. thermophilum + 7 8 Näillä CBH:eilla on edullinen selluloosainhibitiovakio verrattuna 15 Trichoderma reesein CBH:n vastaavaan ja ne osoittavat parantuneita hydro- iyysituloksia, kun testataan erilaisia seliuloosasubstraatteja. Sekvenssit nro 2 ja 4 eivät käsitä CBD:a. Erityisesti lisääntyneitä hydrölyysituloksia voidaan saada, kun selluloosaa sitova domeeni (CBD} liitetään CBH:iin, jolla ei ole omaa CBD:a. CBD voidaan saada esimerkiksi Trichoderma- tai Chaetomium-20 lajeista ja se edullisesti liitetään CBH;iin liitoksen kautta. Tuloksena oleva fuu-sioproteiini, joka sisältää CBH-ydinalueen liitettynä CBD:iin liitoksen kautta, voi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 28 tai 30 kanssa. Polynukleotidit, jotka käsittävät sekvenssin nro 27 tai 29, koodittavattällaisia fuusioproteiineja.
16
Endogiukanaasi voi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 10, 12, 14 tai 16 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa. Näillä endoglukanaaseilla on hyvä terminen stabiilius.
5____^_____
Endo- Geeni Saatavissa CBD nukieiini- amino- glukanaasi happo- happo- sekvenssi sekvenssi _____nro__nro_
Ta EG_28__Ta ce/5A 7~. aurantiacus - _9__10
At EG_40_ At ce/45A A. thermophilum + 11 12
At EGm40_Jike Atee/45B A. thermophilum - 13 14
Ct EG_54__Ct ce!7B C. thermophilum + _1_5_ 16
Betagtukosidaasi voi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 22, 24 tai 26 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa. Näillä betagiukosidaaseilla on hyvä vastustusky-10 ky glukoosMnhibitiota vastaan, mikä on edullista lopputuoteinhibiton välttämiseksi selluloosamateriaaiin entsymaattisen hydrolyysin aikana. Betaglu-kosidaaseja voidaan myös käyttää soforoosin, T. reesein viljelyssä käytetyn seliuiaasin ilmentymistä indusoivan aineen, valmistamisessa.
Betaglukosidaasi Geeni Saatavissa nukieiini- amino happo- happo-sekvenssi sekvenssi ____nro__nro_ j
Ta BG_8t__Ta ce/3A T, aurantiacus 21 22_ I
AtBG__101___At ce/3A A. thermophilum 23__24__ j
Ct BG_76__Ct ce/3A C. thermophilum 25__26_ I
15
Ksyianaasi voi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään •80 % identtisyys sekvenssin nro 18 tai 20 tai sen entsymaattisesti aktiivisen j fragmentin kanssa. j | 17
Ksylanaasi Geeni Saatavissa CBD nukleiini- amino happo- happo-sekvenssi sekvenssi ________nro__nro_
XynJBO__Ta xyn1 OA T. aurantiacus + 17 18
XynjSO At xynIQA A. thermophilum__19__20
Termiilä "identtisyys" tässä tarkoitetaan globaalia identtisyyttä kahden aminohapposekvenssin välillä verrattuna toisiinsa ensimmäisestä vastaavan geenin koodittamasta aminohaposta viimeiseen aminohappoon saakka.
5 Täyspitkien sekvenssien identtisyys mitataan käyttämällä Needleman-Wunschin globaalia linjausohjeirnaa EMBOSS-ohjeimapaketissa {European Molecular Biology Open Software Suite; Rice ym. 2000), versio 3.0,0, seuraa-villa parametreillä: EMBLOSUM62, gap penalty 10.0, extend penalty 0.5. Algoritmi kuvataan julkaisussa Needleman ja Wunsch (1970). Alan ammattimies on to tietoinen siitä tosiasiasta, että Needleman-Wunschin algoritmia käyttäen saadut tulokset ovat vertailukelpoisia vain, kun linjataan sekvenssin vastaavia do-meeneja. Näin ollen esim. sellulaasisekvenssien, jotka sisältävät CBD:n tai signaaiisekvenssejä, vertailua sekvenssien kanssa, joista nämä elementit puuttuvat, ei voida tehdä.
15 Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti käytetään sellulolyyt- tistä polypeptidiä, joi la on vähintään 80, 85, 90, 95 tai 99 % identtisyys sekvenssin nro 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 tai 26 tai vähintään sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa.
Termillä "entsymaattisesti aktiivinen fragmentti” tarkoitetaan määri-20 tellyri sekvenssin mitä tahansa fragmenttia, jolla on sellu!olyyttists aktiivisuutta. Toisin sanoen entsymaattisesti aktiivinen fragmentti voi olla määritellyn sekvenssin kypsä proteiiniosa tai se voi olla kypsän proteiiniosan pelkkä fragmentti edellyttäen, että sillä edelleen on sellobiohydroiaasi-, endogiukanaasi-, beta-glukosidaasi- tai ksylanaasiaktiivisuutta.
25 Selluloiyyttiset entsyymit ovat edullisesti rekombinanttientsyymejä, joita voidaan tuottaa yleisesti tunnetulla, tavalla, Entsyymigeenin käsittävä po~ lynukleotidifragmentiä eristetään, geeni insertoidaan voimakkaan promoottorin alaisena ekspressiovektoriin, vektori siirretään sopiviin isäntäsoluihin ja Isän-täsoluja yiijeliään entsyymin tuotantoa yllyttävissä olosuhteissa. Proteiinituo-30 tantömenetelmät rekombinanttitekniikaila erilaisissa isäntäsysteemeissä ovat 18 alalia hyvin tunnettuja (Sambrook ym., 1989; Coen, 2000; Geiiissen, 2005).
Edullisesti entsyymit tuotetaan solun ulkoisina entsyymeinä, jotka eritetään kasvuiiuokseen, josta ne voidaan helposti ottaa taiteen. Tuotantoisännan käytetty kasvijliuos voidaan käyttää sellaisenaan tai isäntäsolut voidaan poistaa 5 siitä ja/tai se voidaan väkevöidä, suodattaa tai fraktioida. Se voidaan myös kuivata.
Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti heterologinen poly-nukleotidi käsittää samanlaisen geenin kuin, mitä on mikro-organismissa, jolla on taiietusnumero DMS 16723, DMS 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 10 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM
16725, DSM 17325 tai DSM 17667.
Tuotantoisäntä voi olla mikä tahansa organismi, joka kykenee ilmentämään selluiolyyttistä entsyymiä. Edullisesti isäntä on mikrobisolu, edullisemmin sieni. Edullisimmin isäntä on fiiamenttihome, Eduiiinen rekombinantti-15 isäntä modifioidaan ilmentämään ja erittämään seilulolyyttisiä entsyymejä päätoimintonaan tai yhtenä päätoiminnoistaan. Tämä voidaan tehdä poistamaila homologiset eritetyt päägeenit, esimerkiksi Trichoderman neljä pääseliulaasia ja kohdistamalla heteroiogisef geenit fokukseen, joka on modifioitu varmistamaan korkeat ekspressio- ja tuotantotasot. Edullisia isäntiä seilufoiyyttisten 20 entsyymien tuottamiseksi ovat etenkin kannat Trichoderma- tai Aspergilius-suvuista.
Keksinnön mukaisen seilutoosamateriaalin hydrolyysiin tarvittavat entsyymit voidaan lisätä entsymaattisesti tehokkaana määränä joko samanaikaisesti, esimerkiksi entsyymiseoksen muodossa, tai peräkkäin tai samanäi-25 jkai.sen sokeroitumisen ja käymisen (SSF) osana. Seliobiohydrolaasien mitä tahansa yhdistelmää, joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 2, 4, 6, tai 8 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa, voidaan käyttää yhdessä minkä tahansa endogfukärtaasien ja betagiukosidaasien yhdistelmän kanssa. Jos seiluioosamatefiaali käsittää 30 hemiseiiuloosan, herniseliulaaseja, edullisesti ksylanaaseja, käytetään lisäksi hajotukseen. Endoglukanaasit, betaglukosidaasit ja ksylanaasit voidaan vaiita | tässä kuvatuista, mutta eivät rajoitu niihin. Ne voivat esimerkiksi ofia kaupalfi- j sesti saatavilla olevia entsyymivaimisteita. Seilulaasien ja valinnaisten hemisel- j lulaasien lisäksi yhtä tai useampia muita entsyymejä voidaan käyttää, esimer- ) 35 kiksi proteaaseja, amylaaseja, lakkaaseja, lipaaseja, pektinaaseja, esteraasejä j ] j 19 ja/tai peroksidaaseja. Toinen entsyyrnikäsittely voidaan suorittaa ennen sellu-laasikäsitteiyä, sen aikana tai sen jälkeen.
Termi ’’entsyymivaimiste” merkitsee koostumusta, joka käsittää vähintään yhden toivotuista entsyymeistä. Valmiste voi sisältää entsyymejä vä~ 5 hifitään. osittain puhdistetussa ja eristetyssä muodossa. Se voi jopa oleellisesti koostua toivotusta· entsyymistä tai entsyymeistä. Vaihtoehtoisesti valmiste voi ol la käytetty kasvu liuos· tai suodos, joka sisältää yhtä tai useampia seiiu lolyytti-siä entsyymejä. Bellulolyyttisen aktiivisuuden lisäksi valmiste voi sisältää lisäaineita, kuten välittäjäaineita, stabilointiaineita, puskureita, säilöntäaineita, sur-10 faktantteja ja/täi käsvujiuoksen ainesosia. Edullisia lisäaineita ovat sellaiset, joita tavallisesti käytetään erityisiin sovelluksiin· tarkoitetuissa entsyymivaimis-teissa. Entsyymivaimiste voi olla nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
.Edullisesti entsyymivaimiste on käytetty kasvuiiuos. " Käytetty kasvuiiuos" viittaa isännän kasvuliuokseen, joka käsittää tuotetut entsyymit. Edullisesti isän-15 täsolut erotetaan mainitusta liuoksesta tuotannon jälkeen.
Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti entsyymivaimiste käsittää CBH:n, EG:n ja BG:n seoksen valinnaisesti yhdessä ksylanaasin ja/tai muiden entsyymien kanssa. CBH käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 2, 4, 6 tai 8 tai sen entsymaattisesti j 20 aktiivisen fragmentin kanssa ja se voidaan saada Thermoascus aurantiacuk- |
sesta , Acremonium thermophiiumista tai Ghaeiomium tbermophilarn\sta, kun I
taas EG, BG ja ksylanaasi voivat otia mitä tahansa alkuperää, mukaan lukien j mainitut organismit. Muita entsyymejä, joita voi otia läsnä valmisteessa, ovat esimerkiksi protesasit, amylaasit, iakkaasit, iipaasit, pektinaasit esteraasit ja/tai j
25 peroksidaasit. I
Erilaisia entsyymiseoksia ja -yhdistelmiä voidaan käyttää erilaisiin j prosessiolosuhteisiin sovittamiseksi. Esimerkiksi jos hajotusprosessi tullaan \ suorittamaan korkeassa lämpötilassa, valitaan termisesti stabiileja entsyymejä. i
Perheen 7 C8H:n yhdistelmällä perheen 45 endoglukanaasin kanssa, valin- j 30 naisesti yhdessä perheen 3 BG:n ja/tai perheen 10 ksylanaasin kanssa, ofi | erinomainen hydrolyysisuorituskyky sekä 45 öC:ssa että korotetuissa lämpötP !
loissa. I
Trichoderma Teesein selluloiyyttisiä entsyymejä käytetään tavan- j omaisesti lämpötiiaväliilä noin 40-50 °C hydrofyysissä ja 30-40 °C SSF:ssä. | 35 Thermoascus aurantiacuksesta, Acremonium thermophiiumista tai Chaetom/- | um thermophiiumista saatavat CBH, EG, BG ja Xyn ovat tehokkaita myös j l 20 näissä lämpötiloissa, mutta lisäksi suurin osa niistä toimii myös äärimmäisen hyvin lämpötiloissa 50 °C:n ja 75 °C:n välillä tai jopa 80 0C:seen ja 85 °G:seen saakka, kuten 55 °C:n ja 70 °C:n välillä, esimerkiksi 60 °C:n ja 65 °C:n välillä. Lyhyille inkubaatioajoiiie entsyymiseokset ovat toimivia jopa 85 °C:seen saak-5 ka, täydelliseen hydrolyysiin käytetään normaalisti matalampia lämpötiloja.
Selluloosamateriaalin käsittelymenetelmä CBH:lia, EG:lla, BG:lla ja Xymlla on erityisen sopiva käymisessä käytettävien sokereiden tuottamiseksi lignoselluloosamateriaalista. Käymisessä käytettävät sokerit voidaan sitten käyttää hiivalla alkoholiksi ja käyttää polttoaineena. Näitä voidaan myös käyttää 10 välituotteina tai raakamateriaaieina erilaisten kemikaalien ja rakennelohkojen tuotantoon kemianteollisuuden prosesseihin, esimerkiksi niin kutsutussa bioja-lostamossa. Lignoselluloosamateriaall voidaan esikäsiteilä ennen entsymaattista hydrolyysiä seiiuloosasubstraattien kuiturakenteen häiritsemiseksi ja sellu-loosafraktion tekemiseksi alttiimmaksi seilulolyyttisille entsyymeille. Nykyiset 15 esikäsittelyt sisältävät mekaanisia, kemiallisia tai termisiä prosesseja ja niiden yhdistelmiä. Materiaalia voidaan esimerkiksi esikäsiteilä höyryräjäytykseflä tai happohydrolyysillä.
Useita uusia sellulolyyttisiä polypeptidejä löydettiin Thermoascus aurantiacuksesta, Acremonium thermophilumista ja Chaetomium thermophilu-20 /riista. Uudet polypeptidit voivat käsittää sellolyyttistä aktiivisuutta omaavan fragmentin,, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu poiypeptidistä, joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 66 %, edullisesti 70% tai 75%, identtisyys sekvenssin nro 4 kanssa, 79 % identtisyys sekvenssin nro 6 kanssa, 78 % identtisyys sekvenssin nro 12 kanssa, 68 %, edullisesti 70 % tai 25 75 %, identtisyys sekvenssin nro 14 kanssa, 72 %, edullisesti 75 %, identtisyys sekvenssin nro 16, 68 %, edullisesti 70 % tai 75 %, identtisyys sekvenssin nro 20 kanssa, 74 % identtisyys sekvenssin nro 22 tai 24 kanssa tai 78 % identtisyys sekvenssin nro 26 kanssa.
Uudet polypeptidit voivat olla myös mainittujen polypeptidien vaso hantteja. "Variantti" voi olla poiypeptidi, joka esiintyy luonnostaan esimerkiksi alleelisena varianttina samassa kannassa, lajissa tai suvussa tai se voi olla kehitetty mutageneesiilä. Se voi käsittää aminohapposubstituutioita, -deiee-tioita tai -insertioita, mutta se edelleen toimii olennaisesti samalla tavoin kuin yllä määritellyt entsyymit t.s. se käsittää sellulolyyttistä aktiivisuutta omaavan 35 fragmentin.
21
Seliulolyyttiset polypeptidit tuotetaan yleensä solussa kypsymättö-minä polypeptldeinä, jotka käsittävät signaalisekvenssjn, joka pilkotaan pois proteiinin erityksen aikana. Ne voivat myös olla edelleen prosessoituja erityksen aikana sekä N-terminaalisesta ja/tai C-terminaalisesta päästä kypsän, ent-5 symaattisesti aktiivisen proteiinin aikaansaamiseksi. Poiypeptidi, "joka käsittää selluiofyyttisiä aktiivisuutta omaavan fragmentin”, siten tarkoittaa, että poiypeptidi voi olla joko kypsymättömässä tai kypsässä muodossa, edullisesti se on kypsässä muodossa t.s. prosessointi on tapahtunut.
Uudet polypeptidit voivat edelleen oiia yllä mainittu "polypeptidien tai 10 varianttien fragmentti”. Fragmentti voi olla. yllä mainittujen proteiinien kypsässä muodossa tai se voi olia ainoastaan kypsän proteiinin entsymaattisesti aktiivinen osa. Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti polypeptidiliä on aminohapposekvenssi, jolla on vähintään 80, 85, 90, 95 tai 99 % identtisyys sekvenssin nro 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 tai 26 tai sen sellulolyyttisesti aktiivisen 15 fragmentin kanssa. Se voi olla sen variantti tai sen fragmentti, jolla on seliobio-hydrolaasi-, endoglukanaasi-, ksylanaasi- tai betaglukosidaasiaktiivisuutta. Keksinnön toisen suoritusmuodon mukaisesti poiypeptidi koostuu olleellisesti sekvenssin nro 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 tai 26 sekvenssin seilulolyyttisesti aktiivisesta fragmentista:.
20 Uudet polypeptidit voivat käsittää sekvenssin nro 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21,23 tai 25 nukteotidisekvenssin tai sekvenssin, joka koodittaa yllä määritellyn mukaista uutta polypeptjdiä, mukaan lukien sen komplementaariset juos-teet. Kuten tässä käytetään, polynukieotidi viittaa sekä RNA:han että DNA:han ja se voi olla yksijuosteinen tai kaksijuosteinen. Polynukieotidi voi myös olla 25 mainittujen polynukieötidien fragmentti, joka käsittää vähintään 20 nukleotidiä, esimerkiksi vähintään 25, 30 tai 40 nukleotidiä. Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti se on vähintäin 100, 200 tai 300 nukleotidiä pitkä. Edelleen polynukieotidi voi olla degeneroitu geneettisen koodin suhteen missä tahansa yiiä määritellyssä sekvenssissä. Tämä tarkoittaa, että eri kodonit voivat koodit-30 taa samaa aminohappoa.
Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti polynukieotidi on ’’sisällytetty” sekvenssiin nro 3, 5, 11, 13,15, 19, 21, 23 tai 25, mikä tarkoittaa, että sekvenssillä on vähintään osa mainitusta sekvenssistä. Keksinnön toisen suoritusmuodon mukaisesti polynukieotidi käsittää samanlaisen geenin kuin, 35 mitä on mikro-organismissa, joita on talietusnurnero DSM 16728, DSM 16729, 22 DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16726, DSM 17325 tai DSM 17667.
Uudet proteiinit/polypeptidit voidaan valmistaa, kuten yilä kuvataan. Uudet polypeptidit voidaan insertoida vektoriin, joka kykenee ilmentämään he-5 terologisen sekvenssin koodittamaa polypeptidiä, ja vektori voidaan insertoida isäntäsoluun, joka kykenee ilmentämään mainittua poiypeptidiä. isäntäsoiu on edullisesti Trichoderma- tai Aspergillus-suvusta.
Heteroioginen geeni, joka koodittaa uusia pölypeptidejä, on tuotu plasmidissa Escherichia co/Z-kantaan, jolla on tailetusnumero DSM 16728, 10 DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM16726, DSM 16725, DSM 17325 tai DSM 17667.
Uudet entsyymit voivat olla entsyymivalmisteen ainesosia. Entsyy-mivalmiste voi käsittää yhtä tai useampia uusia pölypeptidejä ja se voi olla esimerkiksi käytetyn kasvuiiuoksen, jauheen, rakeiden tai nesteen muodossa. 15 Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti se käsittää seliobiohydrolaasi-, endogiukanaasi-, betaglukosidaasi- ja valinnaisesti ksylanaasiaktiivisuutta ja/tai muita entsyymiaktiivisuuksia. Se voi edelleen käsittää mitä tahansa tavanomaisia lisäaineita.
Uusia entsyymejä voidaan käyttää missä tahansa prosessissa, jo-20 hon liittyy selulolyyttisiä entsyymejä, kuten polttoaine-, tekstiili-, pesuaine-* massa- ja paperi-, elintarvike-, rehu- tai virvoitusjuomateöllisuudessa ja erityisesti seiluloosamateriaalin hydrolysoimisessa etanolia käsittävän biopolttoaineen tuotantoon. Massa- ja paperiteollisuudessa niitä voidaan käyttää sellu-loosakuidun modifioimiseksi esimerkiksi kraftmassan, mekaanisen massan tai 25 kierrätyspä pe rin käsittelemisessä.
Keksintö havainnollistetaan seuraavilia rajoittamattomilla esimerkeillä. Pitäisi" pila. kpitienkin -ymrji#rrei.tfcäivlfcö* että yllä olevassa kuvauksessa ja esimerkeissä annetut suoritusmuodot ovat vain havainnollistaviin tarkoituksiin ja että erilaiset muutokset ja modifikaatiot ovat mahdollisia keksinnön suoja-alan 30 sisällä.
Esimerkit
Esimerkki 1. Sellu lolyyttistä aktiivisuutta ilmentävien kantojen seulonta ja niiden viljely puhdistukseen
Noin 25 sienikantaa Roal Oy:n viijelmäkokelmasta testattiin sellulo-35 lyyttisen aktiivisuuden, mukaan lukien betaglukosidaasien, suhteen. Alustavan 23 seulonnan jälkeen kuusi kantaa· valittiin jatkotutkimuksiin. Nämä olivat Ther-moascus aurantiacus ALK04239 ja ALK04242, Acremonfum thermophilum ALK04245, Talaromyces thermophiius ALK04246 ja Chaetomium thermophl· ium ALK04261 ja ALK04265.
5 Kantoja ALK04239, ALKÖ4242 ja ALK04246 viljeltiin ravistelupul- ioissa 42 °C:ssa 7 vuorokauden ajan liuoksessa 3 χ B, joka sisältää g/iitra:
Solka Floc -selluloosa 13, tislausjätevilja 18, kaurasta eristetty ksylaani 9,
Ca-CÖ3 2, soijarouhe 4,5, (NH4)HPÖ4 4,5, vehnäleseet 3,0, KH2PO4 1,5,
MgSCU’HaG 1,5, Nad 0,5, KNO3 0,9, sirkkapapuhaitsi 9,0, hivenaineliuos #1 10 0,5, hivenaineliuos #2 0,5, Struktoi-vaahdonestoaine (Stow, OH, USA) 0,5 ml; pH säädettiin 6,5:ksi. Hivenaineliuoksessa #1 on g/litra: MriSQ* 1,6,
ZnS04*7H20 3,45, ja CoCI2*6H20 2,0; hivenaineliuoksessa #2 on g/lätra: Fe-S04"7H2Ö 5,0 ja kaksi tippaa väkevää H2SO4.
Kantaa ALKÖ4261 viljeltiin ravistelupulloissa liuoksessa 1 x B, jolla 15 on kolmasosa kutakin 3 x B -liuoksen ainesosista (yllä) paitsi, sama pitoisuudet GaCOsta, NaGka ja hivenaineita. Kantaa viljeltiin 45 0C:ssa 7 vuorokauden ajan.
Kantaa ALK04265 viljeltiin ravistelupulloissa seuraavassa liuoksessa, g/l: Solka Floc -selluloosa 40, Pharmamedia™ (Traders Protein, Memphis, 20 TN, USA) 10, maissijaahe 5, {NH4)2SC>4 5 ja KH2PO4 15; pH säädettiin 6,5:ksi.
Kantaa viljeltiin 45 °C:ssa 7 vuorokauden ajan.
Viljelyn jälkeen solut ja muut kiintoaineet kerättiin sentrifugaatiolla alas ja supematantti otettiin talteen. Ravistelupuiloviljelyihin, proteaasi-inhibiittoreita PMSF (fenyylimetyyii-suifonyyiifluoridi) ja pepstatiini Aita lisättiin 25 1 mM:een ja 10 pg/ml:aan saakka mainitussa järjestyksessä. Jos ei käytetty heti, valmisteet varastoitiin näytteinä -20 °C:ssa.
Entsyymien termisen aktiivisuuden arviointiin kokeet suoritettiin ra-vistelupuiioviijelmävalmisteissa 50 °C:ssa, 60 °C:ssa, 65 °G:ssa, 70 °C:ssa ja 75 °C:ssa 1 tunnin ajan, 100 pg:n naudan seerumin albumiinia (BSA)/ml olles-30 sa läsnä stabilointiaineena. Alustavat kokeet suoritettiin 50 °C:ssa ja 65 °C:ssa kahdessa eri pH-arvossa (4,8/5,0 tai 6,0) sen selvittämiseksi, kumpi pH oli sopivampi termisen aktiivisuuden kokeeseen. ]
Kaikki ravistelupullosupernatantit analysoitiin seuraavien aktiivisuuk- j sien suhteen: j 35 Sellobiohydrolaasin ! kaltainen aktiivisuus ('CBHi’) ja endogfukanaa- j
sin f kaltainen aktiivisuus (ΈΘΓ): I
24 Nämä mitattiin 50 mM Na-asetaattipuskurissa 0,5 mi MUL:n (4-metyyliumbelfiferyyii-beta-D-la ktosid i) ollessa substraattina. Glukoosia (100 mM) lisättiin inhiboimaan mikä tahansa häiritsevä betaglukosidaasiaktivisuus. Vapautunut 4-metyy!iumbelllferyyii mitattiin 370 nm:ssä. ’CBH!’- ja ΈΘΓ-aktiivi-5 suudet erotettiin mittaamalla aktiivisuus sellobioosin (5 mM) ollessa läsnä ja poissa. Aktiivisuus, joka ei inhiboidu seliobioosilla, edustaa ΈΘ Γ-aktiivisuutta ja jäljellä oleva MUL-aktiivisuusedustaa ’CBHI-aktiivisuutta (van Tilbeurgh ym. 1988). Koe suoritettiin pH:ssa 5,0 tai 6,0 (katso alla).
Endoglukanaasiaktiivisuus (CMCaasi): 10 Tämä analysoitiin 2% (paino/tijavuus) karboksimetyyliselluioosan (CMC) ollessa substraattina 50 mM sitraattipuskurissa oleellisesti kuten kuvataan julkaisuissa Bailey ja Nevalainen 1981; Haakana ym. 2004. Pelkistäviä .Sokereita mitattiin DNS-reagenssilia. Koe suoritettiin pH:ssa 4,8 tai 6,0 (katso alla), 15 Betaglukosidaasiaktiivisuus (8GU): Tämä analysoitiin 4-nitrofenyyli-p-D-glukopyranosidiiia (1 mM) 50 mM sitraattipuskurissa kuten kuvataan julkaisussa Bailey ja Nevalainen 1981. Vapautunut 4~nitrofenoli mitattiin 400 nm:ssä. Koe suoritettiin pHrssa 4,8 tai 6,0 (katso alla).
20 Entsyymien suhteelliset aktiivisuudet esitetään kuvassa 1. Suhteel liset aktiivisuudet esitettiin määräämällä aktiivisuus 60 °C:ssa 100 %:ksi (kuva 1). Kaikki kannat tuottivat entsyymejä, joilla oli korkea aktiivisuus korkeissa lämpötiloissa (65-75 °C).
Pföteiinipuhdistukseen ALK04242 kasvatettiin myös 2-litran biore-25 aktorissa (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Saksa) seuraavassa liuoksessa, g/litra: Soika Floc -selluloosa 40, soijarouhe 10, NH4NO3 5, KH2PQ4 5, MgSÖ4*7H2Ö 0,5, CaCi2*2H20 0,05, hivenainelluos #1 0.,5, hivenaineliuos #2 0,5. Ilmastus oli 1 vvm, vaahdonestokontrolli Struktolilla®, sekoitus 2ÖÖ-800 rpm ja lämpötila 47°C:ssa. Kaksi erää ajettiin, toinen pH:ssa 4,7 ± 0,2 30 (NH3/H2SO4) ja toinen pH:n 4,5 aloitus-pH:ssa. Viljelyaika oli 7 vuorokautta.
Viljelyn jälkeen solut ja muut kiintoaineet poistettiin sentrifugaatioila.
Kanta ALK04245 kasvatettiin 2-litran bioreaktorissa (Braun Biostat® B, Braun, Melsungen, Saksa) seuraavassa liuoksessa, g/litra: Soika Fioc—-selluloosa 40, maissijauhe 15, tislausjätevilja 5, kaurasta eristetty ksylaanj 3, 35 (NH4)2S04 5 ja KH2PO4 5. pH-väli oli 5,2 ± 0,2 (NH3/H2S04), ilmastus 1 vvm, sekoitus 300-600 rpm, vaahdonestokontrolli Struktolilla ja lämpötila 42 °C. Vil- 25 jelyaika oli 4 vuorokautta. Viljelyn jälkeen solut ja muut kiintoaineet poistettiin sentrifugoinniiia.
Entsyymjpuhdistukseen ALK04261 kasvatettiin 10-litran bioreakto-rtssa (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Saksa) seuraavassa liuoksessa, 5 g/iitra: Selkä Floc -selluloosa 30, tislausjätevilja 10, kaurasta eristetty ksyiaani 5, CaC03 2, soijarouhe 10, vehnäleseet 3,0, (NH4)2S04 5, KH2PO4 5, MgS04*7H20 0,5, NaCI 0,5, KNO3 0,3, hivenalneiiuos #1 0,5 ja hivenaineliuos #2 0,5. pH-väli oli 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), ilmastus 1 vvm, sekoitus 200-600 rpm, vaahdonestökontrolii Struktolilla ja lämpötila 42 °C. Viljejyaika oli 5 vuoro-10 kautta. Toinen erä kasvatettiin samanlaisissa olosuhteissa paitsi, että Soika Floc lisättiin 40 g/l saakka ja jätevilja 15 g/! saakka, Supernatantit otettiin talteen sentrifugaatiolia ja suodatuksella Seitz-K 150 ja EK-suodattimien (Pali SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Saksa) läpi. Jälkimmäinen supematantti väkevoitiin noin kymmenkertaiseksi käyttäen Pellicon mini -uitra-15 suodatussysteemiä (suodatin NMWL 10 kDa; Miliipore, Billerioa, MA, IISA).
Entsyymipuhdistukseen ALK04265 kasvatettiin myös 10-jitran bio-reaktorissa (Braun Biostat® ED, Braun, Melsungen, Saksa) samassa liuoksessa kuiri yllä paitsi,että K^Pdpa lisättiin 2,5 g/l saakka. pH-väli oli 5,3 ± 0,3 (NHa/HaPO-i), ilmastus 0,6 vvm, sekoitus 500 rpm, vaähdonestoköntroili Struk-20 tolilla ja lämpötila 43 °C. Viljelyaika oli 7 vuorokautta. Supernatantit otettiin talteen sentrifugaatiolia ja suodatuksella Seitz-K 150 ja EK-suodattimien (Pali SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Saksa) läpi. Jälkimmäinen supematantti väkevoitiin noin 20-kertaiseksi käyttäen Pellicon mini -ultrasuo-datussysteemiä (suodatin NMWL 10 kDa; Miliipore, Billerica, MA, USA).
25 Esimerkki 2. Seiiobiohydrolaasien puhdistus ja karakterisointi Acre-monium th&rmophikim ALKÖ4245:siä ja Chaetomium thermophilum ALKQ4265:stä Äcremonium thermophilum ALKCM245 ja Chaetomium thermophilum ALK04265 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Päiseilobiohydro-30 iaasit puhdistettiin käyttäen p-aminobentsyy!i-1-tio-p-se!lobiosidi-pohjaista affi-niteettipyivästä, joka valmistettiin, kuten kuvataan julkaisussa Tomme ym-, 1998.
Vifjelysupernatantit puskuroitiin ensin 50 m.M natriurnasetaattipusku-riin pH 5,0, joka sisälsi 1 mM Ö-glukonoiaktonia ja 0,1 M glukoosia ligandihyd-35 rolyysin viivästämiseksi β-giukosidaasien ollessa läsnä. Seliobiohydroiaaseja eluoltiin 0,1 M laktoosilla ja lopuksi puhdistettiin geelisuodatuskromatografiaila 26 käyttäen Superdex 200 HR 10/30 -pylväitä AKTA-systeemissä (Amersham Pharmacia Biotech). Geeiisuodatuksessa käytetty puskuri oli 50 mM natrium-fosfaatti pH 7,0, joka sisälsi 0,15 M natrium kloridia .
Puhdistetut seiiobiohydroiaasit analysoitiin SDS-poiyakryyliamidi-5 geeiielektroforeesiila ja molempien proteiinien molekyytipainon määritettiin ole-van likimäärin 70 kDa arvioituna moiekyylipainostandardien perusteeiia (Matalan molekyylipatnon kalibraatiopakkaus, Amersham Biosciences). Puhdistetut Acremonium- ja Chaetomium-seiiobiohydroiaasit nimettiin At Cei7A:ksi ja Ct Cel7A:ksi mainitussa järjestyksessä noudattaen kaaviota julkaisussa Henrissat 10 ym. (1998) (Henrissat, 1991; Henrissat ja Bairoch, 1993),
Valmisteiden spesifinen aktiivisuus määritettiin käyttäen 4-metyyli-u m bel I iferyy 1 ί-β-la ktosid ia (MUL), 4-m ety yl i u m be! I iferyy li- β-D-seliobioosia
(MUG2) tai 4-metyyliumbeiliferyyii- β-D-sellotriosidia (MUG3) substraattina (van Tiibeurgh ym., 1988) 0,05 M natriumsitraattipuskurissa pH 5 50 °C:ssa 10 15 minuutin ajan. Endoglukanaasi- ja ksyianaasiakiiivisuudet määritettiin perus-menettelyiliä (IUPAC:n mukaisesti 1987) käyttäen karboksimetyyiiseiluiöosaa (CMC) ja koivun giukoronoksyiaania (Bailey ym., 1992) substraattina. Spesifinen aktiivisuus Avicelia kohtaan laskettiin 24 tunnin reaktiossa 50 °C:ssa, pH
5,0, 1 % substraatilla ja 0,25 μΜ entsyymiannokselia, muodostuneiden pelkis-20 tavien sokerien perusteeiia. Puhdistettujen entsyymivalmisteiden proteiinipitoisuus mitattiin julkaisun Lowry ym., 1951 mukaisesti. Hydrolyysin lopputuotteiden karakterisoimiseksi 24 tunnin hydrolyysikokeessa vapautuneet liukoiset sokerit, kuten yllä kuvataan, analysoitiin HPLCrlla (Dionex). Trichoderma ree- j sein puhdistettua sellobiohydrolaasia I (CBHI/Cel7A) käytettiin referenssinä.
25 Puhdistettujen entsyymien ja Trichoderma reesein CBHI/Cel7A:n spesifiset aktiivisuudet esitetään taulukossa 1. Puhdistetuilla At Cei7A- ja Ct Cel7A-sellobiohydrolaaseilia oli korkeammat spesifiset aktiivisuudet pieniä syn- | teettisää substraatteja kohtaan verrattuna T. reesein CBHi-Cel7A:han. Spesifinen aktiivisuus Avicelia kohtaan oli selvästi korkeampi tässä esitetyillä entsyy- j
30 meillä. Puhdistettujen entsyymivalmisteiden matalat aktiivisuudet ksylaania ja I
CMC:a kohtaan voivat johtua joko proteiinien itsensä ominaisuuksista tai vä- j hintään osittain jäljellä olevista kontaminöivien entsyymien pienistä määristä, j
Selluloosahydroiyysin päälopputuote kaikilla puhdistetuilla entsyymeittä oli sei- j
iohiöosi, joka on tyypillistä seliobiohydroiaaseiiie. I
27
Taulukko 1. Puhdistettujen sellobiohydrolaasieri ja T. reese/n refererss-sientsyymien spesifiset aktiivisuudet (nkat/mg) (50 °C, pH 5,0, 24 h) Substraatti A. thermophHum C, thermophHum T, reese/n
ALK04245:n ALK04265:n Cel7A
_ Cel7A_Cei7A__
Ksylaani__11,3_ 6,7__13__ CMC__; 26,2 5,5__1,0__ MUG2___9i2__16,9_ 4,3 MUG3__13__ 1,5__0,9 MUL_ 21,5___510__21,9
Avicei__18__14__0,6_
Puhdistettujen seflobiohydrolaasien terminen stabiilius määritettiin 5 erilaisissa lämpötiloissa. Reaktio suoritettiin 0,1 % BSA:n ollessa läsnä pH:ssa 5,0 60 minuutin ajan käyttäen 4-meiyyiiumbeinferyyii“6-D-iaktosidla substraattina. C. thermophHum ALK04265:n CBH/Ce!7A ja A. thermophtlum ALK04245:n CBYH/Cei7A olivat stabiileja 65 °C:seen ja 60 °C:seen saakka mainitussa järjestyksessä. T. reesein referenssientsyymi {CBH!/Cel7A) säilytti 10 100 % aktiivisuudestaan 55 °G:seen saakka.
Esimerkki 3. Endoglukanaasin puhdistus ja karakterisointi Acremonium thermophHum ALK04245:stä
Acremonium thermophHum ALKG4245 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Viljeiysupernatanttia inkuboitiin 70 °C:ssa 24 tunnin ajan, jonka 15 jälkeen se väkevöiiiin uitrasuodatukselia. Puhdas endoglukanaasi saatiin peräkkäisellä puhdistuksella hydrofobisen vuorovaikutuksen ja kationinvaihto-kromatografialla ja seuraavalla geelisuodatukseila. Puhdistuksen aikana kerättyjen fraktioiden endoglukanaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen karboksime-tyyliseiluloosaa (CMC) substraattina (IUPAC:n menettely 1987). Proteiinipitoi-20 suus mitattiin BioRadin Assay -pakkauksella (Bio-Rad Laboratories) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.
Väkevöity viljelysupernatantti pantiin HiPrep 16/10 Butyl FF hydrofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mi kafium-fosfaattipuskurilla, pH 6,0, joka sisälsi 1 M (ISIHydaSO^ Sitoutuneet proteiinit 25 eiuoitiin lineaanselia gradientiiia yläpuskurista 5 mi kaliumfosfaattiin, pH 6,0.
28
Fraktiot kerättiin ja endoglukanaasiaktiivisuus määritettiin, kuten yllä kuvataan. Endogiukanaasiaktiivisuus eluoitui 120-15 mS:n/em leveällä johtokykyalueella.
Yhdistetyt fraktiot pantiin HiTrap SP XL -kationin vaihtopylvääseen, joka oli tasapainotettu 8 mM natriumasetaatilla, pH 4,5. Sitoutuneet proteiinit s eluoitiln lineaarisella gradientiila 0-0,25 M NaCI:a tasapainötuspuskurissa. En-doglukanaasiaktiivisuutta sisältävä proteiini eluoitui 3-7 mS:n/cm johtokyky-alueella. Kationinvaihtokrornaiografia toistettiin ja proteiinieluaatti väkevöitiin pakastekuivaukseila.
Liuotettu näyte ladattiin Superdex 75 HR10/30 -geelisuodatuspyi-to väälle, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumfosfaattipuskurilia, pH 7,0, joka sisälsi 0,15 M NaCI:a. Pääproteiinifraktio eluoitui pylväästä 13,3 mi n retentiotiia-vuudella. Proteiinieluaatti oli puhdas SDS-pöiyakryyliamidigeeiielektroforeesiiia pääteltynä ja mofekyylipainon arvioitiin olevan 40 kDa. Puhdistetun proteiinin spesifisen aktiivisuuden, joka nimettiin At EG_40:ksi, 50°C:ssa määritettiin 15 olevan 450 nkat/mg (lUPACm menettely 1987, käyttäen CMC;aa substraattina).
Puhdistetun endogiukanaasin terminen stabiilius määritettiin erilaisissa lämpötiloissa. Reaktio suoritettiin 0,1 mg/ml BSA:a ollessa läsnä pH:ssa 5,0 60 minuutin ajan käyttäen karboksimetyyliselluloosaa substraattina. A. 20 thermophilumm EG_40/Gel45A oli stabiili 80 °C:seen saakka. T. reesem refe-renssientsyymit EG! (Gel7B) ja EGII (Cel5A) säilyttivät 100% aktiivisuudestaan 60 °C:seen ja 65 °C:seen saakka mainitussa järjestyksessä.
Esimerkki 4. Endogiukanaasin puhdistus Chaetomium thermophilum ALK04261 :stä 25 Chaetomium thermophilum ALK04261 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Puhdas endoglukanaasi saatiin peräkkäisellä puhdistuksella hydrofobisen vuorovaikutuksen ja kationinvaihtokromatografialla ja seuraavalla geelisuodatuksella. Puhdistuksen aikana kerättyjen fraktioiden endogiukanaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen karboksimetyyliseliuioosaa (CMC) substraat-30 tina (IUPAC:n menettely 1987),
Ammoniumsulfaattia lisättiin viljeiysupernatanttiin, jotta saavutettiin sama johtokyky kuin 20 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,0, joka sisälsi 1 M .(NHikSO*. Näyte pantiin HiPrep 16/10 Phenyl FF hydrofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM kaliumfosfaattipuskurilfa, pH 35 6,0, joka sisälsi 1 M (NH^SÖ^ Eluutio suoritettiin 20-0 mM· kaliumfosfaatin, pH 6,0, iineaarisella gradientilia ja seuraavaksi 5 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,0, 29 ja vedellä. Sitoutuneet proteiinit 0-6 M urean lineaarisena gradientiila.
Fraktiot kerättiin ja endoglukanaasiaktiivisuus analysoitiin, kuten yllä kuvataan. Endoglukanaasiaktiivisuutta sisältävä proteiini eiuoitiin ureagradientin alussa.
Fraktiot yhdistettiin, tasapainotettiin 16 mM Tris-HCI:ija, pH 7,5, 5 (! = 1,4 mS/cm) 10DG-pyiväällä (Bio-Rad) ja pantiin HiTrap DEAE FF -anio- ninvaihtopylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM Tris~HCI:lia, pH 7,5. Sitoutuneet proteiinit eiuoitiin lineaarisella gradientiila 0-1 M NaCI:a tasapainotus-puskurissa. Fraktiot kerättiin ja analysoitiin endogiukanaasiaktiivisuuden suhteen, kuten yllä kuvataan. Proteiini eiuoitiin välillä 10-20 mS/cm.
10 Näyte tasapainotettiin 15 mM natriumasetaatiila, pH 4,5 1öDG-pyl- väällä {Bio-Rad} ja pantiin HiTrap SP XL -kationinvaihtopyivääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumasetaatilla, pH 4,5. Proteiinit eiuoitiin lineaarisella gradientiila 0-0,4 M natriumasetaattia, pH 4,5. Endoglukanaasiaktiivisuus eiuoitiin välillä 1—10 mS/cm, Keritty näyte pakastekuivattiin.
15 Näyte liuotettiin veteen ja pantiin Superdex 75 HR1 6/30 -geelisuo- datuspyiväälle, joka Oli tasapainotettu 20 mM natriumfosfaatilla, pH 6,0, joka sisälsi 0,15 M NaC!:a. Fraktiot kerättiin ja ne, jotka sisälsivät endoglukanaasiaktiivisuutta, yhdistettiin. Proteiinieiuaatti oli puhdas SDS-polyakryyll· amidigeeiielektroforeesilla pääteltynä ja molekyylipainon arvioitiin molekyyii-20 painostandardien (esivärjätyt SDS-PAGE-standardlt, Broad Range, Bio-Rad) perusteella olevan 54 kDa. Puhdistetun proteiinin, joka nimettiin Ct EG_54:ksi, pl:n määritettiin PhastSystemillä (Pharmacia) olevan hoin 5,5.
Esimerkki 5. Endoglukanaasin puhdistus Thermoascus aurantiacus AL-K04242:sta 25 Thermoascus aurantiacus ALK04242 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Puhdas endoglukanaasi saatiin peräkkäisellä puhdistuksella hydrofobisen vuorovaikutuksen ja anioninvaihtokromatografialia ja seuraavalla geefisuodatukselia. Puhdistuksen aikana kerättyjen fraktioiden endoglukanaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen karboksimetyytiselluloosaa (CMC) substraat-30 tina (lUPAC:n menettely 1987). Proteiinipitoisuus mitattiin BioRadin Assay -pakkauksella (Bio-Rad Laboratories) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.
Viljelysupernatantti pantiin HiPrep 16/10 Butyl hydrofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM kaiiumfosfaattipuskuril-36 la, pH 6,0, joka sisälsi 0,7 M (NH^SOif, Sitoutuneet proteiinit eiuoitiin 0,2 M
30 (NH^SCMIa (1=39 mS/cm). Endoglukanaasiakiiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin ultrasuodatukseila.
Näytteestä poistettiin suolat 1öDG-pylväissä (Bio-Rad) ja se pantiin HiTrap DEAE FF -anioninvaihtopyivääseen, joka oli tasapainotettu 15 mM Tris-5 HCSiila, pH 7,0. Sitoutuneet proteiinit eiuoitiin lineaarisena gradientiila 0-4 M NaCi:a tasapainotuspuskurissa. Endoglukanaasiaktiivisuutta sisältävä proteiini eiuoitiin 15-21 mS:n/cm johtokykyalueella. Kerätyt fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin kuten yllä.
Näyte pantiin Sephacryf S-100 HR 26/60 -geelisuodatuspyivääseen, io joka oli tasapainotettu 50 mM natriumasetaattipuskurilla, pH 5,0, joka sisälsi 0,05 M NaCI. Endoglukanaasiaktiivisuutta sisältävä proteiinifraktio eiuoitiin pylväästä retentiotilavuudella, joka vastaa 16 kDa:n molekyylipainoa. Kerätyt fraktiot yhdistettiin, väkevöitiin ja geeiisuodatus toistettiin. Proteiinieluaatti oli puhdas SDS-polyakryyliamidfgeeiielektrQforeesilla pääteltynä ja moiekyylipainon 15 arvioitiin olevan 28 kDa. Puhdistetun proteiinin, joka nimettiin Ta EG_28:ksi, pl:n määritettiin lEF-geelillä (PhastSystem, Pharmacia) olevan noin 3,5. Ta EG_28:n spesifisen aktiivisuuden 50 °C;ssa määritettiin olevan 4290 nkat/mg (IUPAC:n menettely 1987, käyttäen CMC:a substraattina).
Esimerkki 6* β-giukosidaasin puhdistus Ja karakterisointi Acremonium 20 tbermophitum ALKÖ4245:stä |
Acremonium ihermophiium ALKQ4245 kasvatettiin, kuten kuvataan j esimerkissä 1. Puhdas β-giukösidaasi saatiin peräkkäisellä puhdistuksella \ hydrofobisen vuorovaikutuksen ja anioninvaihtokromatografialla ja seu.raav.alla | geelisuodatuksella. Puhdistuksen aikana kerättyjen fraktioiden β-glukosidaasi- j 25 aktiivisuus määritettiin käyttäen 4-nitrofenyyii-p-D-glukopyranosidia substraät- j
tina (Bailey ja Linko, 1990). Proteiinipitoisuus mitattiin BioRadin Assay -pakkauksella (Bio-Rad Laboratories) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina. I
Viljelysupematantti pantiin HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF hyd- { 30 rofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM kalium-fosfaattina, pH 6,0, joka sisälsi 1 M Sitoutuneet proteiinit eiuoitiin lineaarisella gradientiila tasapainoiuspuskurista 5 mM kaliumfosfaattiin | 137-16 mS;n/cm johtokykyaiueella. Kerätyt fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin { ultrasuodatukseila. j 35 Näytteestä poistettiin sUoiat 10DG-pyiväissä (Bio-Rad) ja se pantiin |
HiTrap DEAE FF -anioninvaihtopyivääseen, joka oli tasapainotettu 10 mM ka- j j | 31 liumfosfaatilia, pH 7,0. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin lineaarisella gradientiila tasapainotuspuskurista samaan puskuriin, joka sisälsi 0,25 M NaCl, 1,5-12 mS:n/cm johtokykyalueelja. Anioninvaihtokromatografia toistettiin kuten yllä paitsi, että 4 mM kajiumfosfaattipuskuria, pH 7,2, käytettiin. Proteiinit eluoitiin S 6-9 mS:n/cm johtokykyalueella. β-glukosidaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot kerättiin, yhdistettiin ja väkevöitiin.
Aktiivinen materiaali anioninvaihtokromatografiasta pantiin Sephao ryi S-300 HR 26/60 -pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumfosfaa-tilla, pH 6,5, joka sisälsi 0,15 M NaCl. β-glukosidaasiaktiivisuutta sisältävä pro-10 teiini eluoitiin retentiotilavuudella, joka vastaa 243 kDa:n moiekyylipainoa. Proteiini oli puhdas SDS-polyakryyiiamidigeelieiektroforeesilla pääteltynä ja mole-kyyiipainon arvioitiin olevan 101 kDa. Puhdistetun proteiinin, joka nimettiin At pG_101:ksi, pl:n määritettiin lEF-geeltllä (PhastSystem, Pharmacia) olevan alueella 5,6-4,9. At βΘ_101:η spesifisen aktiivisuuden 50°C:ssa määritettiin 15 olevan 1100 nkat/mg (käyttäen 4-nitrofenyyii-^-D-glukopyranosidia substraattina, Bailey ja Linko, 1990).
Puhdistetun β-glukosidaasin terminen stabiilius määritettiin erilaisissa lämpötiloissa. Reaktio suoritettiin 0,1 mg/m! BSA ollessa läsnä pHissa 5,0 60 minuutin ajan käyttäen 4-n!tmfenyyfi-p-D-glukopyranQsidia substraatti-20 nä. A. thermophilumm pG_101 oli stabiili 70 °C:seen saakka. Aspergilluksen referenssientsyymi (Novozym 188) säilytti 1ÖÖ % aktiivisuudestaan 60 °C:seen saakka.
Esimerkki 7, β-glukosidaasin puhdistus Chaetomium thermophilum ALK04261:stä 25 Chaetomium thermophilum ALK04261 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Puhdas β-glukosidaasi saatiin peräkkäisellä puhdistuksella hydrofobisen vuorovaikutuksen, anionin ja kationinvaihtokromatografialia ja | seuraavalla geeiisuodatuksella. Puhdistuksen aikana kerättyjen fraktioiden β-glukosidaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen 4-nitrofenyyli-p-D-g!ukopyrano-30 sidia substraattina (Bailey ja Linko, 1990).
Viljelysupematantti pantiin Hi Prep 16/10 Phenyl Sepharose FF hydrofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM kaliumfosfaatilla, pH 6,0, joka sisälsi 0,8 M (MH^SC^. Eluutio suoritettiin lineaarisella gradientiila tasapainotuspuskurista 3 mM kaliumfosfaattiin, pH 6,0, jota seurasi 35 eluutio vedeltä ja 6 M urealla. Ensimmäiset fraktiot, joilla oli β-glukosidaasi-aktiivisuutta, eluoitiin 80-30 mS:n/cm johtokykyalueella. Toinen β-glukosidaa- 32 siaktiivisuus eiuoitiin 6 M iirealla. Ureaila eiuoidut aktiiviset fraktiot pantiin yhteen ja niistä poistettiin suolat iÖpG-pyiväissä (Bio-Rad), jotka oli tasapainotettu 10 mM Tris-HCklta, pH 7,0.
Suolojen poiston jälkeen näyte pantiin HiTrap DEAE FF anionin-5 vaihtopytvääseen, joka oli tasapainotettu 15 mM Tris-HCI:ila, pH 7,0. Proteiini ei sitoutunut pylvääseen vaan eluoitui näytteen syötön aikana. Tästä läpivir-tausfraktiosta poistettiin suolat lODG-pyiviissä, jotka oli tasapainotettu 7 mM Na-asetaatiiia, pH 4,5, Näyte anioninvaihtokromatograftasta pantiin HiTrap SP FF -katio-io ninvaihtopylvääseen, joka oii tasapainotettu 10 mM natriumasetaatilla, pH 4,5. Sitoutuneet proteiinit eiuoitiin lineaariseiia gradientiiia 10 mM-400 mM natri-umasetaattia, pH 4,5. Fraktiot, joilia oli β-glukosidaasiaktiivlsuutta ja jotka eluoitui vat 6,5-12 mS:n/cm jöHtokykyalueelia, kerättiin, niistä poistettin suolat 10DG-pylväissä (Bio-Rad), jotka oli tasapainotettu 7 mM natriumasetaatilia, pH 15 4,5, ja pakastekuivattiin.
Pakastekuivattu näyte laimennettiin 100 pl:aan vettä ja pantiin Su-perdex 75 HF10/3Ö -geelisuodatuspylväälle, joka oii tasapainotettu 20 m M nat-riumfosfaatitia, pH 4,5, joka sisälsi 0,15 M NaGI. β-glukosidaasiaktiivisuus eiuoitiin 13,64 ml:n retentiotilavuudelia. Kerätyt fraktiot yhdistettiin, pakasteku ivat-20 tiin ja .liuotettiin' veteen. Proteiini oli puhdas SDS-polyakryyliamidigeelieiek-troforeesiiia pääteltynä ja rrtolekyyiipainon arvioitiin olevan 76 kDa, Proteiini nimettiin Ct pG_76:ksi.
Esimerkki 8. β-glukosidaasin puhdistus ja karakterisointi Thermoascus aurantiacus ALK04242:sta 25 Thermoascus aurantiacus ALK04242 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Puhdas β-glukosidaasi saatiin peräkkäisellä puhdistuksena hydrofobisen vuorovaikutuksen anionin- ja kationinvalhtokromatografialia ja seuraavalia geelisuodatuksella. Puhdistuksen aikana kerättyjen fraktioiden β-glukosidaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen 4-nitrofenyyii-p-D-glukopyrano-30 sidia substraattina (Bailey ja Linko, 1990). Proteiinipitoisuus mitattiin BioRadin Assay -pakkauksena (Bio-Rad Laboratories) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.
Viijelysupernatantti pantiin HiPrep 16/10 Phenyf Sepharose FF hydrofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oii tasapainotettu 20 mM kaiium-35 fosfaattina, pH 6,0, joka sisälsi 0,7 M (NH/^SCX). Sitoutuneet proteiinit eiuoitiin lineaarisella gradientiiia 0,2 M (NH4)2S04.‘Sta 5 mM kaliumfosfaattiin, pH 6,0.
33 p-glukosidaasiaktiivisuus eluoitui gradientin aikana 28,0-1,1 mS:n/cm johtoky-kyalueeila. Fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin uitrasuodatukseiia.
Näytteestä poistettiin suolat 1OD0-py!väissä (Bio-Rad) ja se pantiin HiTrap DEAE FF -anioninvaihtopylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 rnM Tris-5 HCIviia, pH 7,0. Entsyymi eluoitiin lineaarisella gradientiila 0-0,2 M NaC!:a ta-sapainotuspuskurissa ja viivytetyltä eluutioila 20 mM Tris-HC!:lla, joka sisälsi 0,4 M NaCi. Noin 10-30 mS:n/cm johtokykyalueella eiuoituva näyte väkevöitiin uitrasuodatukseiia ja siitä poistettiin suolat 1Ö DO - pylväällä (Bio-Rad), Näyte pantiin HiTrap SP XL -kationinvaihtopylvääseen, joka oli ta-10 sapainotettu 9 mM natnumasetaatiiia, pH 4,5* Entsyymi eluoitiin lineaarisella gradientiila 10 mM-400 mM NaAc ja viivytetyllä eluutioila käyttäen 400 mM NaAc, pH 4,5. Proteiinit, joilla oli p-giukosidaasiaktiivisuutta, eluoitiin leveästi lineaarisen gradientin aikana 5,0-11,3 rrtS:n/cm johtokykyaiueelia.
Aktiivinen materiaali kationinvaihtokromatpgrafiasta pantiin Sephac-15 ryi S-300 HR 26/60 -pylvääseen, joka oii tasapainotettu 20 mM natriumfosfaa-tiila, pH 7,0, joka sisälsi 0,15 M NaGI. Proteiini, joila oli β-giukosidaasiaktii-visuutta, eluoitiin retentiotiiavuudeila, joka vastaa 294 kDa:n molekyyiäpainoa.
Kerätyt fraktiot yhdistettiin, pakastekuivattiin ja liuotettiin veteen. Proteiini oii puhdas SDS-poiyakryyiiamidigeeiieiektroforeesiila pääteltynä ja molekyylipaP 20 non arvioitiin olevan 81 kDa, mikä edustaa todennäköisimmin proteiinin mo-nomeeristä muotoa. Isoeiektrinen fokusointi (IEF) suoritettiin käyttäen 3-9 pl:n geeliä. Hopeavärjäyksen jälkeen leveä alue pi:n 5,85 yläpuolella värjäytyi pidä 4,55. vastaavan kapean raidan lisäksi* Puhdistetun proteiinin, joka nimettiin Ta pG_81 :ksi, spesifisen aktiivisuuden 50 °G:ssa määritettiin olevan 600 nkat/mg 25 käyttäen 4-nitrofenyyli-p-D“g!ukopyranosidia substraattina (Bailey ja Linko, 1990).
Puhdistetun β-giukosidaasin terminen stabiilius määritettiin erilaisissa lämpötiloissa. Reaktio suoritettiin: 0,1 mg/mi BSA:a ollessa läsnä pH:ssa 5,0 60 minuutin ajan käyttäen 4~nitrofenyy!H3--D-g!ukopyranosidia substraatti-30 na. T. aurahtiacuksen pG_81 oli stabiili 75 °C:seen saakka. Aspergilluksen re-ferenssientsyymi (Novozym 188} säilytti 100% aktiivisuudestaan 60 °G:seen saakka.
Esimerkki 9* Ksylanaasin puhdistus Acremonium thermophiium AL-K04245:stä 35 Acremonium thermophiium ALK04245 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Viijelysupernaianttia inkuboitiin 70 °G:.ssa 24 tunnin ajan, jonka j 34 jälkeen se väkevöitiin ultrasuodatukseila.: Puhdas ksylanaasi saatiin peräkkäisenä puhdistuksella hydrofobisen vuorovaikutuksen ja kationinvaihtokromato·* gfafialia ja seuraavglla geelisuodatukselia. Ksyianaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen koivun ksylaania substraattina (IUPAC:n menettely 1987), Proteiini 5 analysoitiin BioRad Protein Assay -pakkauksella (Bio-Rad Laboratories) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.
Väkevöity viljelysupernataniti pantiin HiPrep 16/10 Butyl FF hydrofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM kalium-fosfaattipuskurilla, pH 6,0, joka sisälsi 1 M .(NH^zSCV Sitoutuneet proteiinit 10 eluoitiin lineaarisella gradientiiia yiäpuskunsta 5 mM kaliumfosfaattiin, pH 6,0. Proteiinifraktio eiutoitiin leveällä 120-15 mS:n/cm johtokykyalueella.
Näyte hydrofobisen vuorovaikutuksen pylväästä pantiin HiTrap SP XL -kationinvajhtDpyivääseen, joka oli tasapainotettu 8 mM natriumasetaatiiia, pH 4,5. Proteiini ei sitoutunut tähän pylvääseen vaan eluoitiin läpivirtauksessa 15 näytteen syötön aikana. Tämä eluaatti väkevöitiin ultrasuodatukseila. Hydrofobinen kromatografia toistettiin, kuten yllä kuvataan. Sitoutumattomat proteiinit kerättiin ja pakastekuivattiin.
Liuotettu näyte ladattiin Superdex 75 HR10/30 -geelisuodatus-pyiväälle, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH 7,0, joka 20 sisälsi 0,15 M NaCL Proteiini, joka eluoitui pylväästä 11,2 mi:n retentiotilavuu- j della, oli puhdas SDS-polyakryyliamidigeeiieiektroforeesilia pääteltynä. Puhdis- ] tetun proteiinin molekyyiipainon arvioitiin molekyyiipainosiandardien perusteel- | la (esivärjätyt SDS-PAGE-standardit, Broad Range, Bio-Rad) olevan 60 kDa. |
Proteiinin, joka nimettiin At XYN_60:ksi, spesifisen aktiivisuuden 50 °C:ssa | 25 määritettiin olevan 1800 nkat/mg (IUPAC:n menettely 1987, käyttäen koivun j ksyiaania substraattina). Suhteellinen aktiivisuus lisääntyi noin 1,2-kertaiseksi j 60 °C:ssa ja 1,65-kertaiseksi 70 °ö:ssa (10 min, pH 5,0) verrattuna 50 °C:seen. \
Spesifinen aktiivisuus MUG2:a (4-metyy!iumbeiiiferyyii- β-D-seliobiosidi), MUL:a (4-metyyiiumbelIiferyyIΐ-β-laktosidi) ja MUG3:a (4-metyyliurnbelliferyyli-30 β-D-seliotriosidi) kohtaan oli 54, 33 ja 78 nkat/mg (50 °C pH 5,0 10 min) mainitussa järjestyksessä. Tämä on yhtäpitävää sen tosiasian kanssa, että perheen 10 ksylanaasft osoittavat myös aktiivisuutta aryyfiglukopyranoosideja kohtaan (Bieiy ym. 1997).
i 35
Esimerkki 1ö. Ksylanaasin puhdistus Thermoascus aurantiacus ALK04242:sta
Thermoascus aurantiacus ALKÖ4242 kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Puhdas ksylanaasi saatiin peräkkäisenä puhdistuksella hydro-5 fobisen vuorovaikutuksen, anionin- ja kationinvaihtokromatograflalla ja seuraa-vaiia geelisuodatukseila. Ksylanaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen koivun ksylaania substraattina (IUPAC:n menettely 1987). Proteiini analysoitiin Bio-Rad Protein Assay -pakkauksella (Bio-Rad Laboratories) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.
10 Viljelysupernatantti pantiin HiPrep 16/10 Pheny! Sepharose FF hyd rofobisen vuorovaikutuksen pylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM kaiium-fosfaatipuskurilla, pH 6,0, joka sisälsi 0,7 M {NH4)2SC>4. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin kaksivaiheisella eluutiokäytännöllä. Eluutio suoritettiin tiputtamalla suolapitoisuus ensin 0,2 M (NH4)2S04:tin ja sen jälkeen käytettiin lineaarista 15 gradienttia 20 mM kaliumfosfaatista, pH 6,0, joka sisälsi 0,2 M {N^kSQ^ 5 mM kaliumfosfaattiin, pH 6,0. Proteiini eluoitiin 0,2 M (N^^SC^Ila (! = 39 mS/orn).
Näytteestä poistettiin suolat lODG-pyiväissä (Bio-Rad) ja se pantiin HiTrap DEAE FF -anioninvaihtopylvääseen, joka oli tasapainotettu 15 mM Tris-HChlla, pH 7,0. Proteiini ei sitoutunut anioninvaihtopylvääseen vaan eluoitui 20 läpivirtauksessa. Näytteen johtokyky säädettiin vastaamaan 20 mM natrium-asetaatin, pH 4,5, johtokykyä lisäämällä vettä ja pH säädettiin 4,5:ksi väkevöinnin uitrasuodatuksella aikana.
Näyte pantiin HiTrap SP XL -kationinvaihtopylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumasetaatiiia, pH 4,5. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin 25 lineaarisella gradientilia iasapainotuspuskurista samaan puskuriin, joka sisälsi 1 M NaCI. Entsyymi eluoitiin 1-7 mS:n/cm johtokykyalueella. Näyte pakaste-kuivattiin ja sen jälkeen liuotettiin veteen,
Pakastekuivattu näyte liuotettiin veteen ja pantiin Saperdex 75 HR 10/30 -geelisuodatuspyiväälle, joka oli tasapainotettu 20 mM nairiumfosfaatil-30 ia, pH 7,0, joka sisälsi 0,15 M NaCI. Proteiini eluoitiin pylväästä retentiotilavuu-delia, joka vastaa 26 kDa:n moiekyyiipainoa. Proteiini ofi puhdas SDS-poiy-akryyiiamidigeelieiektroforeesilla pääteltynä. Puhtaan proteiinin molekyylipaino öii 30 kDa arvioituna molekyylipainostandardien (esivärjätyt SDS-PAGE-stan-dardit, Broad Range, Bio-Rad) perusteeiia. Puhdistetun proteiinin, joka nimet-35 tiin Ta XYN_30:ksi, pi:n määritettiin PhastSystemillä (PharmaGia) olevan noin 6,8. Ta XYN_30:n spesifisen aktiivisuuden 50 °C:ssa määritettiin olevan 36 4800 nkat/mg (lUPACm menettely 1987, käyttäen koivun ksyiaania substraattina).
Esimerkki 11. Sisäinen aminohapposekvensointi
Sisäiset peptidit sekvensoitiin sähkösuihkelonisaatiolia yhdistettynä 5 tandem-massaspektrometriin (ESi-MS/MS) käyttäen Q-TOF1 -instrumenttia (Micromass). Proteiini aikyioitiin ensin ja digestoitlin tryptisiksi peptideiksi. Syntyneistä peptideistä poistettiin suolat ja ne osittain erotettiin nanonestekroma-tografialia (käänteisfaasi) ennen panemista Q-TOF1-instrumenttiin, Chaetorni-um thermophifumm ja Acremonium thermophiiumm seiiobiohydrolaasien sisai-10 set peptidisekvenssit osoitetaan taulukossa 2. Chaetomiumm CBH:n peptidit saatiin sen jälkeen, kun vastaava cM-geeni oli kloonattu. Acremoniumm CBHista määritettyjä peptidejä ei käytetty hyväksi vastaavan geenin kloonauksessa.
Taulukko 2. Chaetomium thermophilum ALK04265:n GBH:sta (1„C-4_C) 15 ja Acremonium thermophilum ALK04245:n CBH:sta (1_A-4_A) määritetyt sisäiset peptidisekvenssit
Peptidi____Sekvenssi__
Peptidi 1_C__τ p s τ M D a n a g f g r___
Peptidi 2_C_v A f s n t d d f m r_
Peptidi 3„C__f s n τ p p f n r k___
Peptidi 4_C__P g H 3 l/i t q e y c d a q/k k
Peptidi 1_A__v τ q f i/l t g______
Peptidi 2_A_ M G d τ s F y G p g_
Peptidi 3_A___c D P D G G D F N____
Peptidi 4_A_ s G N s L/I T T D F_____] lii - ieusiiniUa ja isoletsiinilla on: sama molekyyiipaino ja niitä ei voida erottaa ESI-MS/MS-anai.yysissä.
Q/K = glutamiihin ja; lysiinin moiekyylipaino eroaa vain 0,036 Da ja niitä ei voida erottaa ESf-20 MS/MS-analyysfssä
Puhdistettujen Acremonium ihermophiium ALKÖ4245;n, Chaetomium thermophilum ALK04261:n ja Thermoäscus aurantiacus ALK04242:n en-dogiukanaasien, β-glukosidaasien ja ksyfanaasien sisäiset peptidisekvenssit 25 listataan taulukossa 3, taulukossa 4 ja taulukossa 5.
37
Taulukko 3. Acremonium thermophUum ALK04245:n EG_40-, Chaetami-um thermophUum ALK04261:n EG__54“ ja Thermoascus aurantiacus AL-KD4242 EG_28-endog|ukanaaseista määritetyt sisäiset peptidisekvensslt Proteiini Peptidi Sekvenssi^__
AtEG_40 Peptidi t q s c s s F p a p l k p g c q w r_ __Peptidi 2 y a l t f m s g p v a g k _ __Peptidi 3 y Q c P s e l t s r_ __Peptidi 4 n q p v f s c s adm q r__ ___Peptidi 5 ¥ w d c c k p s c g w p g k_ __Peptidi 6 p τ f t____
Ct EG_54 Peptidi 1 s P E P E v τ Y y v_ __Peptidi 2 yylldqteqy_ __Peptjdi 3 r y c a c m d l w e a m s r _ __Peptidi 4 p g n t p e v h p q/k_ _ Peptidi 5 s I/L A p h p c n q/k_ ___Peptidi 6 q q y e m f r _ ___ Peptidi f alnddfcr_ __Peptidi 8_w Q N p p p r__|
Ta EG„28; Peptidi 1 I/L· τ S a t q w l R_ I
_Peptidi 2 g c ä i/l s a t e v s a t i/l g q e r [ _ Peptidi 3 p f m m e r__ __Peptidi 4 j Q Y A v v D P H n y g r_ (a i/L = leusiinlfia ja isoleisiinilla on samä: mofekyylipaino ja niitä ei voida erottaa ES1-MS/MS-5: analyysissä. Q/K =: glutamiirtin ja lysiinin molekyylipaino eroaa vain 0,036 Da ja niitä ei voida erottaa ESi^MS/MS-anaiyysissä. f :;ä 38
Taulukko 4. Acremonium thermophilum ALK04245:n βΟ__101«, Chaeto-mium thermophilum ALK04261;n pG_76- ja Thermoascus aurantiacus ALK04242 βΘ_81 -betagf ukosidaaseista määritetyt sisäiset peptidise- kvenssit
Proteiini___Peptidi_ Sekvenssi^__
At βΘ_101__Peptidi 1 s P F τ w G P τ R__ _Peptidi 2 v v y g d d a g m p g_ __Peptidi 3 afvsqltl le k_ __Peptidi 4 G τ d v e/i y t p n n k_ _ Peptidi 5 q P n p a g p n a g v l/.i r
Ct βΘ_76__Peptidi 1 E G l f 1 D Y r___ __Peptidi 2 p G Q s g τ a τ f r__ __Peptidi 3 etmssnvddr_ ___Peptidi 4 i a l ¥ g s a a v y _ _ Peptidi 5 m w l g e n d r_ ___Peptidi 6 y p q l c l qdgplgir __Peptidi 7 elngqnsgypsi_
Ta β6_81___Peptidi 1 T p f t w g r _ ___Peptidi 2 l c l q d s l p g V R__
__Peptidi 3 G V D V Q L g p V A G V A P R
____Peptidi 4 V N L τ L E _ __Peptidi 5 f τ g v f g e d v v g___ ___Peptidi 6 n d l p l t g y e k_ 5 (a l/L = leusiiniila ja isoieisilnilia on sama moiekyyiäpaino ja niitä ei voida erottaa j ESi-MS/MS-analyysissä j ϊ i il 39
Taulukko 5. Acremonium thermophilum ALK04245:n XYN_60- ja Thermo-ascus aurantiacus ALK04242:n XYN__30“ksy!anaaseista määritetyt sisäiset peptidfsekvenssit
Proteiini Peptidi Sekvenssi__
At XYN_6Ö Peptidi 1 y n d Y m l e Y m q k__ __Peptidi 2 F G Q V T P E 33_____ __ Peptidi S V D <3 D A T Ύ M 5 Y V N N K_ _Peptidi 4 k p a w τ 5 y s s v l a a k_ ____ Peptidi 5 s q g b i v f :r a k__
TaXYN_30 Peptidi 1 v Y F G v A T D Q N R__ j __Peptidi 2 M A a I I Q A P F g q v t f b m s m k _ Peptidi 3 G H T L V W H s q l F s W V s S I T d k ___Peptidi 4 N H I T T L M T R ______ __Peptidi 5 awdvvneafn e d g s l r__ ___Peptidi 6 L Y I N D Y N L D S A S Y P K_
Peptidi 7 a s t t p l i. f d £5 n f m p k p a y n a _______I V Q P L Q Q___
Peptidi 8 qtvflnvigedyipiafqtä ___R__ 5 Esimerkki 12. Genomisen kirjaston konstruktio Thermoascus auran-tiacuksette, Chaetomium thermophitumille ja Acremonium thermophifu-milie
Cheatomium thermophilum ALK04265:n ja Acremonium thermphi-lum ALK04245:n genominen kirjasto tehtiin Lambda DASH®ll-vektoriin (Stra- | 10 tagene, USA) toimittajan ohjeiden mukaisesti. Raederin ja Brodan (1985) me- | netelmällä eristetyt kromosomaatiset DNA:t digestoitiin osittain Sau3A:lia. Di- \ gestordut DNA:t fraktioitiin koon mukaan ja valitun kokoiset (~ 5-23 kb) frag- j mentit defosforyioitiin ja iigoitiin BamHhilä digestoituihin lambda-vektorikäsi- ] varsiin. Ligaatiöseokset pakattiin käyttäen Gigapack III Gold -pakkausuutteita \ 15 vaimistaian ohjeiden mukaisesti (Stratagene, USA). Chaetomium thermo- j
phiiumin ja Acremonium thermophilumln genomisten kirjastojen tiitterit olivat I
3.6 x 106 pfu/ml ja 3,7 x 105 pfu/ml ja vahvistettujen kirjastojen olivat 6,5 x 101Q j pfu/ml ja 4,2 x 10a pfu/ml mainitussa järjestyksessä. j l 40
Lambda FIX® ll/Xho I Partial Fill-In -vektoripakkausta (Stratagene, USA) käytettiin Thermoascus aurantiacus ALK04242:n ja Chaetomium ther-mophUum ALK04261:n genomisten kirjastojen konstruktiossa toimittajan ohjeiden mukaisesti, Raederin ja Brodan (1985) menetelmällä eristetyt kro-5 mosomaaliset DNA:t digestoltiin osittain Sau3A:!ia. Digestoidut DNA:t fraktioitiin koon mukaan ja valitun kokoiset (~ 6-23 kb) fragmentit täytettiin ja ligoitiin Xho\:\\ä digestoituihin Lambda FIX il -vektorikäsivarsiin. Ligaatioseokset pakattiin käyttäen Gigapack lii Gold -pakkausuutteita valmistajan ohjeiden mukaisesti (Stratagene, USA). Thermoascus aurantiacus ALK04242:n ja Chaetomi-10 um thermophilum ALK04261:n genomisten kirjastojen tiitterit olivat 0,2 x 106 pfu/ml ja 0,3 x 106 pfu/mi ja vahvistettujen kirjastojen olivat 1,8 x 109 ja 3,8 x 10'9 pfu/ml mainitussa järjestyksessä.
Esimerkki 13. Sellobiohydrolaasigeenien (cbh/cel7) kloonaus Thermoas-cus aurantiacuksesta, Chaetomium thermophilumista ja Acremonium 15 thermophilumista
Molekyylibiologian perusmenetelmiä käytettiin DNA:n (plasmidit, DNA-fragmentit) eristämisessä ja entsyymikäsittelyissä, E. colin transformaatioissa jne. Käytetyt perusmenetelmät kuvataan molekyylibiologian peruskäsikirjoissa, esim. Sambrook, ym. (1989) ja Sambrook ja Russell (2001).
20 Koettimet genomisten kirjastojen seulontaan, jotka konstruoitiin esimerkissä 12 kuvatulia tavalla, vahvistettiin PCR:lfa käyttäen Thermoascus aurantiacus ALK04242:n, Chaetomium thermophifum ALK04265:n ja Acremonium thermophilum ALK04245;n genomisiä DNA:ita templaatteina reaktioissa. Useita PCR-reaktioissa testattuja alukkeita suunniteltiin julkaistun nuk-25 leotidisekvenssin mukaisesti (WO 03/000 941, Hong ym., 2003b), PCR-reak- j tioseokset sisälsivät 50 mM Tris-HCI, pH 9,0, 15 m M {NH^SCX, 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCi2, 0,2 mM dNTF:ejä, 0,5 μΜ kutakin aiuketta ja 1 yksikön Dynazyme EXT DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja “ 0,5-1 pg gerto-mista DNA:ta. PCR-reaktion olosuhteet olivat seuraavat: 5 minuutin alkudena-30 turaatio 95 °C:ssa, jota seurasi 30 1 minuutin sykliä 95 °C:ssa, joko 1 minuutin aiukkeiden kiinnittymisvaihe 62 °C:ssa (±8 °C:n gradientti) Thermoascus AL-K04242- ja Chaetomium ALK04265-iernpiaateilie tai 1 minuutin aiukkeiden kiinnittymisvaihe 58 °C:ssa (±6 °C:n gradientti) Acremonium ALK04245-tem-plaatiile, 2 min aiukkeiden pidentymisvaihe 72 0C:ssa ja lopullinen pidentymis-35 vaihe 72 °C:ssa 10 minuutin ajan.
41
Odotetun kokoisia (laskettu julkaistuista cb/?-sekvensseistä) DNA-tuotteita saatiin kaikista käytetyistä genomisista templaateista. Odotetun kokoiset DNA-frägmentit eristettiin spesifisimmistä PCR-reaktioista ja ne kloonattiin pCR® Biunt-TOPO® -vektoriin (invitrogen, USA). Insertit karakterisoitiin sek-5 vensoinniila ja suorittamalla Southern-blottaushybridisaaiioita useilla restriktio-entsyymeillä digestoiduille genomisille DNA:ille. PGR-fragmentit, jotka valittiin käytettäviksi koettimina Thermoascus aurantiacuksen, Chaetomium thermophi-lum\n ja Acremonium fhermophjlumm genomisten kirjastojen seulontaan, esitetään taulukossa 6.
10 Taulukko 6. PCR-reaktioissa käytetyt alukkeet ja cbh/ceFT«geenien seulontaan Thermoascus aurantiacuksen, Chaetomium thermophilumm ja Acremonium thermophiiumxn genomisista kirjastoista valitut koettimet Genominen templaatti-DNA ja koetinfragmentin sisältävän plasm idin nimi osoitetaan.
Geeni Forward-aluke Reverse-aluke Tempiaatti- Frag- Plasmidi DNA mentti ;___________(kb)__
Ta cbh TCEL11 TCELT2 Thermoascus 0,8 kb pALK1633 ___atgcgaactggcgttgggtcc gaatttggagctagtgicgacg ALKQ4242 __
Gt cbh TGEL7 TGEL8 Chaetomium 0,8 kb pALkl632 j _ cgatgccaaciggcgctggac ittcttggtggtgtogacggtc ALK04265 j
At cbh TCEL13 TCEL4 Acremonium 0,7 kb pALK1634 __agctcgaccaactgctacacg accgtgaacttcttgctggtg ALKQ4245___ 15 Päätellyillä aminohapposekvensseillä kaikista näistä koetiimista oli homqlogiaa useiden julkaistujen glykosidihydrolaasiperheen 7 (Henrissat, 1991; Henrissat ja Bairoch, 1993) GBH-sekvenssien kanssa (BLAST-ohjelma, versio 2.2.9 NGBkila, National Center for Biotechnology Information; Altschul |
20 ym., 1990). I
Insertit taulukossa 6 listatuista plasmideista leimattiin digoksigeniinil- | la toimittajan ohjeiden mukaisesti (Roche, Saksa) ja vahvistetut genomiset kir- | jastot (2 x 105-3 x 10® plakkia) seulottiin leimatuilla koetinfragrnenteiila. Hybri- ] disaatiolämpötila suodattimille Oli 68 °C ja suodattimia pestiin 2x5 minuuttia | 25 huoneenlämmössä käyttäen 2 x SSC-0,1 % SDS ja seuraavaksi 2 x 15 mi- ] nuuttia 68 pC:ssa käyttäen 0,1 x SSC-0,1 % SDS käytettyjen homologisten j | 42 koettimlen kanssa. Useita positiivisia plakkeja saatiin kustakin hybridisaatiosta. Äcremonium ALK04245:n genomisten kirjastojen seulonnassa joitakin positiivisia plakkeja hybridisoitui voimakkaasti kyseiseen koettimeen, mutta lisäksi oli paljon plakkeja, jotka hybndisoiiuivat heikommin koettimiin. Tämä ehdotti, että 5 toinen sellobiohydrafaasigeeni / muita seiiobiohydroiaasigeenejä saattoi olla läsnä genomissa aiheuttaen ristiinreaktiota. Neljistä viiteen voimakkaasti hyd-ridisoitunutta plakkia puhdistettiin Thermoascus ALK04242;n ja Chaetömium ALK04265:n genomisen kirjaston seulonnoista. Acrerriohium thermophilum ALK04245:n ollessa kyseessä neljä kuudesta puhdistetusta plakista hydro-10 dosoitui heikosti käytetyllä koettimelia. Faagi-D.NÄ:t eristettiin ja karakterisoitiin Southern-blottaushybridisaatioilia. Valitut koettimeen hybridisöituneet restrik-tiogragmentit subkloonattiin pBluescript li KS+ -vektoriin ja kloonien asiaankuuluvat alueet sekvensöitiin.
Yhteensä neljä cbh/ceI7-geeniä kloonattiin; yksi Thermoascus au-15 rantiacus ALKQ4242:sta, yksi Chaetömium thermophilum ALK04265;stä ja kaksi Äcremonium thermophilum ALK04245:stä (työn aikaisessa vaiheessa näillä oli koodit At_cbh_C ja At_cbh_A ja ne nimettiin sitten At ce!7A:ksi ja At ce/7B:ksi mainitussa järjestyksessä). Taulukko 7 tekee yhteenvedon geenien seulontaan käytettyjen koettimien tiedoista, faagiklooneista, joista geenit eris-20 tettiin, valituista täyspitkät geenit promoottori- ja terminaattorialueineen sisältävistä restriktiofragmenteista, pfasmidien nimistä ja DSM-taiietusnumeroista näitä plasm ideja sisältäville E coii-kannoille.
Taulukko 7. cbh/cef7-geenien kloonaukseen käytetyt koettimet, valitut faagikloonit ja subkloonit, plasmidinimero ja vastaavan E. co// -kannan 25 talletuksen numero
Geeni Seulonnassa Faagi- pBluescript H:een Piäsmidin E. Colin käytetty koe- klooni subkioonattu numero talietus- _ tin_ fragmentti__numero
Ta ceflA pALK1633 F12 3,2 kb Xba\__pALK1635 DSM 16723
Ct ce/7A pALK1632 F36 2,3 kb Pvu\ - HindlU pALKi 642 DSM 16727
At celJB pALK1634 F6__3,1 kb EcoRl__pALK1646 DSM 16728
Mcel7A I pAlK1634 , F2 3,4 kb Xho\_ pALK1861 DSM 16729 43
Asiaankuuluvat tiedot geeneistä ja päätellyt proteiinisekvenssit (sekvenssi nrot 1-8} vedetään yhteen taulukossa 8 ja taulukossa 9 mainitussa järjestyksessä.
Puhdistettujen GBH-proteiinien Chaeiomium thermophiium AL-5 K04265:stä ja Acremonium thermophiium ALKÖ4245:stä (taulukko 2) pepti- disekvenssit löydettiin Ct celJA- ja At ce/7A~geenit sisältävien kloonien päätellyistä aminohapposekvensseistä. Siten voitiin päätellä, että puhdistettuja CBH/cel7-proteiineja Ghaetomium thermophilumlsta ja Acremonium ther-mophilum\sia koodittavat geenit kloonattiin.
10 Taulukko 8. Yhteenveto Thermoascus auraniiacus ALKO 4242:sta, Ghaetomium thermophiium ALK04265:stä ja Acremonium thermophiium AL-KÖ4245:stä eristetyistä cbh/cel7-geeneistä cbh- Pituus Koodaus- intronien intronien pi- Sekvenssi geeni intronien aiue (fap)<b lukumäärä tuus (bp) nro kanssa _Jbp£_________
Ta cell A 1439 1371__1__65__1___
Ctce/7A 1663__1596_____64__7_
At ce!7B 1722 1377 3__134, 122, 87 3_
At cei?A 1853 1569 4 88, 53,54,86 5 (a STOP-kpdoni mukaan lukien (b STOP-kpdonia lukuun ottamatta., 15 44
Taulukko 9. cbh/ceH“geenisekvensseistä Thermoascus aurantiacus AL-K04242:sta, Chaetomium thermophiium ALK4265:stä ja Acremonium thermophiium ALK04245:sta pääteltyjen aminohapposekvenssien yhteenveto. ss» signaafisekvenssi CBH- Amino ss C-ter- Ennustet- Ennus- Otaksutut Sek- proteiini happojen NN/HMM:n minaa- tu MW tettupl N-giyko- venssi iuku- pituus*3 Unen (Da, ss:ä (ss:ä lu- sylaatio- nro määrä CBD|b lukuunot- kuutiotta-- kohdat<d tamatta}<c matta)
Ta CqI7A 457 17/17 E] 46873 4,44 2 2
Ci Ce!7A 532 18/18 KYLLÄ, 54564 5,Ö5 3 8 ___T497-L532________
At Cei7B 459__21/21__E!___47073 4,83__Z__4__
At Cel7A; 523 17/17 KYLLÄ, 53696 4,67 4 6 I_____Q488-L523 ___j_ S (a Ennuste signaalisekvenssille tehtiin käyttäen SignaiP V3.0 -ohjelmaa: (Nielsen ym., 1907; Bendtsen ym„ 2004); NN-arvo saatiin käyttäen neuraaiiverkkoja ja HMM-arvo käyttäen kätkettyjä Markov-m alleja.
(b Selluloosaa sitova domeeni (CBD), C-terminaailsen CBD-alueen aminohapot ilmaistaan (Ml (Met #1) mukaan lukien numeroinnissa) 10 (c Ennustettua signaafisekvenssiä lukuun ottamatta. Ennuste tehtiin käyttäen Compute p!/MW-työkaiua ExPaSy-palveiimella (Gasteiger ym., 2003).
(d Sekvenssien N-X-S/T lukumäärä,
Thermoascus auranfiacuksen CeJ7A:n ja Acremonium thermophilu-15 min Ce!7A:n (ydin, mutta ei CBD:a) päätellyt aminohapposekvenssit olivat ho-moiogisimpia toistensa kanssa (analysoitu Needleman-Wunschin globaalilla linjauksella, EMBOSS 3.0.0 Needle, Matrix EBLOSUM62:n kanssa, gap penalty 10.0 ja extend penalty 0.5; Needfeman ja Wunsch, 1970). Lisäksi päätellyllä Acremonium thermophilum'm Cel7A:ila oli matalampi identtisyys päätellyn 20 Chaetomium thermophilumm Gei7A:n kanssa. Acremonium thermophiium\n Cel7B oli erilaisin keksinnön mukaisista CBH/Cel7-sekvensseistä.
45 Päätellyllä Chaetomiumin Gel7A-sekvenssillä oli korkeimmat identtisyydet (analysoitu Needieman-Wunschin globaalilla linjauksella, EMBOSS Needle, katso yllä) julkaisussa WO 03/000 941 kuvattujen Chaetomium ther-mophilumin, Scytalidium thermophiiumin ja Thielavia australiensisin CBHirien 5 polypeptidien kanssa. Samalla tavoin päätelty Thermoascus aurantiacuksen Cel7A-sekvenssi oli erittäin identtinen julkaistunThermoascus aurantiacuksen julkaistun CBHl:n kanssa (WO 03/000 941, Hong ym., 2003b). Acremonium thermophiiumin Cel7B:lfä oli merkittävästi matalammat identtisyydet aiemmin julkaistuihin sekvensseihin sen ollessa läheisempää sukua CBHi-polypepiidin 10 Oryza sativasta kanssa. Päätellyn Acremonium thermophiiumin Cel7A:n sekvenssin korkeimmat homologiat olivat Exidia gladulosan ja Acremonium thermophiiumin CBHi-poiynukleotidien kanssa (WO 03/000941). Linjaus ilmaisee, että kloonatut Thermoascus aurantiacus ALK04242-, Chaetomium thermophilum ÄLK04265- ja Acremonium thermophilum ALK04245-sekvenssit kooditta-15 vat CBH-proteiineja, joilla on korkea homologia glykosidihydrolaasiperheen 7 polypeptidien kanssa, siksi nämä nimettiin CeI7A:ksl tai Cel7B:ksi (Henrissä! ym., 1998), cbh/ceU-geenlen Thermoascus aurantiacus ALK04242:sta, Chaetomium thermophilum ALK04265:stä ja Acremonium thermophilum ALK04245 20 Thielaviaste pääteltyjen aminohapposekvenssien vertailu toisiinsa ja edelleen tietokannoista löydettyihin sekvensseihin osoitetaan taulukossa 10.
46
Taulukko 10. Korkeimman homologian sekvenssit cbh/ceH-geenien Thermoascus aurantiacus ALK04242:sta, Chaetomium thermophilum ALK04265:sta ja Äcremonium thermophilum ALK04245:stä pääteltyjen aminohapposekvenssien kanssa. Linjaus tehtiin käyttäen IMeedleman-5 Wunschin globaalia linjausta (EBLOSUIW62, gap penalty 10.0, extend penalty 0.5). ^ilmaisee yhdestä tässä työssä kloonatusta seilobiohydro-laasigeenistä peräisin olevan aminohapposekvenssin. ’Ydin5 ilmaisee linjauksen ilman CBD:a.
Organismi, entsyymi ja talietusnumero__Identtisyys (%) * Thermoascus aurantiacus Cel7A 100,0
Thermoascus aurantiacus, AY840982 99,6
Thermoascus aurantiacus, AX657575 99,1
Thermoascus aurantiacus, AF421954 97,8
Talaromyces emersonii, AY081766 79,5
Chaetomicfium pingtunglum, AX657623 76,4
TnchQphaea saccata, AX657607 73,4 * Acr&monium thermophilum Cel7A (ydin) 70,6
Emericella niduians, AF420020 (ydin) 70,4 *Chaetomium thermophilum Cel7Ä (ydin)__66,4______ ^Chaetomium thermophilum Cel7A 100,0
Chaetomium thermophilum, AY861347 91,9
Chaetomium thermophilum, AX657571 91,7
Scytgliudium thermophilum, AX657627 74,7
Thieiavia australiensis, AX657577 74,6 Äcremonium thermophilum, AX657569 72,3
Exidia giandulosa, AX657613 68,0 * Äcremonium thermophilum Cei7A 66,9 * Thermoascus aurantiacus Cell A (ydin) 66,4
Exidia giandulosa, AX657615 60,8
Chaetomidium pingtungium, AX657623 60,7 * Äcremonium thermophilum Cei7B (ydin) 60,2_ * Äcremonium thermophiium Cel7B 100,0
Oryza sativa, AKI 08948 66,1
Exidia giandulosa, AX657615 65,0 Äcremonium thermophilum, AX657569 (ydin) 64,8 47
Thermoascus aurantiacus, AX657575 64,.8 * A cremonium thermophiiurn. Cell A 64.6 * Thermoascus aurantiacus Cell A 64,4
Trichophaea saccata, AX657607 63,6 * Chaetomium thermophiiurn Cel7A (ydin) 60,2__ * Acremonium thermophiiurn Cel7A 100,0
Exidia glandubsa, AX657613 77,.9
Exidia giandulosa, AX657615 77,9
Acremonium thermophiiurn, AX657569 77,5
Thieiavia australiensis, AX657577 71,0 * Thermoascus aurantiacus Cel7A (ydin) 70,6
Scytaliudium thermophiiurn, AX657627 67,5
Chaetomium thermophiiurn, AX657571 67,5
Chaetomidium pingtungium, AX657623 67,3 * Chaetomium thermophiiurn, Cell A 66,9 * Acremonium thermophiiurn Cei7B (ydin) 64,6_
Esimerkki 14, CBH/Ce!7-rekombmanttiprotennien tuotanto Tnchoderma reeseissä
Ekspressiopfasmidit konstruoitiin CBH/Cel7~rekombinanttiproteiinien 5 tuotantoon Thermoascus aurantiacuksesta (Ta Cei7A), Chaetomium ther- mophilumMa (Ct Cel7A) ja Acremonium thermophilumlsia (At Cel7A, At j
CelJB; työn aikaisessa vaiheessa näillä proteiineilla oli väliaikaiset koodit At i CBH_G ja At GBH_A mainitussa järjestyksessä). Konstruoidut ekspressio-plasmidit listataan taulukossa 11. cö/?/cei7-rekombinanttigeenit, mukaan lukien 10 niiden omat signaaiisekvenssft, sulautettiin tarkalleen T reesein cbh1~pm- | oottoriin (cel7A) PCR:lla. Transkription terminaatio varmistettiin T. reesein ! ce/7A-terminaattoriila ja Ä nidulansin amafS-markkerigeeniä käytettiin trans-formanttien valikointiin, kuten kuvataan julkaisussa Paloheimo ym. (2003). Lineaariset ekspressiokasetit (kuva 2) eristettiin vektorirungosta EcoRI-digestion 15 jälkeen ja transformoitiin T. reesein A96- ja A98-protoplasteihin (molemmilta j kannoilta on neljää pääseliulaasia: CBHI/Cel7A, CBH!i/Ce[6A, EGl/Gel7B ja | EGIi/Ce!5A koodittavat geenit poistettu). Transformaatiot suoritettiin kuten jul- | kaisussa Penttilä ym. (1987) niiden modifikaatioiden kanssa, jotka kuvataan julkaisussa Karhunen ym. (1993). valikoiden asetamidiila ainoana typen läh- 48 teenä. Transformantit puhdistettiin valintamaljöilia yksittäisten konidioiden kautta, ennen kuin ne Idätettiin PD:ila.
Taulukko 11. Thermoascus aurantiaeus ALK04242:n (Ta Cel7A), Cäae-tomium thermophUum ALK04265:n (Ct Cel7A) ja Acremonium thermophl· 5 lum ALK04245:n (At Cei7A, At Cel7B) CBH/Cel7-proteiinien tuotantoon Trichoderma reeseissä konstruoidut ekspressiokasetit. Ekspressiokaset-tien kokonaisrakenne oli kuvassa 2 kuvatun kaltainen. Kloonatut cJb/i/ce/7-geenit sulautettiin tarkalleen T. reesein cbh1/cel7A-promootto-iin.
CBH/Cel7 Ekspressio- Ekspressio- ce/7A- terminaattoriib __plasmidi kasetin koko(3__
Ta Cel7A__pALK185.1 9,0 kb__245 bp (Xbs\)_
Ct Cei7A__pALK1857 9,2 kb__240 bp (HindUl)_
At CeiTB__pALK1860 9,4 kb____361 bp (EcoRi)_
At Cel7A_ PALK1865__9,5jb__ 427 bp (EcoRV)_ 10 <s Ekspressiökasetti T. reese/-transformaatioon eristettiin vektorirungosia käyttämällä EcoRI-digestiota.
(b Nukleotidien lukumäärä genomisesta cöft1/ce/7A-terminaattorialueesta STOP-kodonin jälkeen. Restrikiiokohta 3'-päässä, jota käytetään genomisen geenlfragmentin leikkaamisessa pois, sisällytetään suluissa.
15
Transformanttien CBH/Gel7-tuotanto analysoitiin ravistelijoissa kasvatettavien pulloviijeimien (50 ml) viijeiysupernatanteista. Transformantteja kasvatettiin 7 päivin ajan 28 C:ssa kompleksisessa laktoosipohjaisessa sellu-iaasin ilmentymistä indusoivassa liuoksessa (Joutsjoki ym. 1993), joka oli pus-20 kuroitu 5 KHaPÖ4-:l!a.. Sellobiohydrolaasiaktiivisuus analysoitiin käyttäen 4-metyyliumbelliferyyli-p-D-iaktosidisubstraattia (MUL) julkaisun van Tiibeurgh ym. (1988) mukaisesti. Valittujen transformanttien genotyypit varmennettiin käyttämällä Southern-blottauksia, joihin useita genomisia digesteji sisällytettiin ja vastaavaa ©kspressiokasetija käytettiin koettimena. Ta Cel7A-, Ct Cel7A-, At 25 Cel7A- ja At Cel7B-proteiinien heteroioginen ilmentyminen analysoitiin SDS-PAGEIIa ja sen jälkeisellä Coomassie-värjäyksellä. Havainto, ettei seilöbiöhyd-folaasiaktiivisuutta tai heterologista pfoteiinituotantoa SDS-PAGEssa voitu de-tektoida At Cel7B~transformanteii!e, jotka sisälsivät integroidun ekspressio- 49 kasetin, ehdottaa, että At Cel7B:tä tuotetaan alle detektiotasojen Trichoder-massa käyttäen kuvattua koemallia.
CBH/Cei7~rekombinanttientsyymivafmisteet karakterisoitiin pH-opti-min ja termisen stabiiliuden suhteen. CBH/Cei7-rekombinanttiproteiinien ITier-5 moascus aurantiacuksesta, Chaetomium thermophilumlsta ja Acremonium thermophiiumistä pH-optimi määritettiin universaalissa MGlIvaine-puskurissa pH-väliliä 3,0--8,0 käyttäen 4-metyy! iu m beli iferyyii-p-D-la ktosid ia (MOL) substraattina (Kuva 3A). pH-optimi Ct Cel7A- ja At Cel7A-entsyymiile on 5,5:ssä, jonka yläpuolella aktiivisuus alkaa asteittain tippua. Rekombinantin Ta Cel7A-10 raakamuodon pH-optimi on 5,Q:ssä (Kuva 3A). Gei7-rekombinanttientsyymien terminen stabiilius määritettiin mittaamalla MUL-aktiivisuus universaalissa Mcllvaine-puskurissa optimi-pH:ssa 1 tunnin reaktioajalla. Kuten tuloksesta osoitetaan Ta Cel7A ja Ct Cel7A säilyttivät enemmän kuin 60 % aktiivisuudestaan 70 °C:ssa, kun taas At Cel7A osoitti selvästi vähempää stabiiliutta korke-15 ämmissä lämpötiloissa (=65 °C) (Kuva 3B).
Valittuja CBH/Cel7-transformanttejä viljeltiin laboratoriobioreakto-reissa 28 °C:ssa yllä ilmaistussa liuoksessa 3-4 päivän ajan pH-kontrollilfa 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) materiaalin saamiseksi sovellustesteihin. Supernatantit otettiin taiteen sentrifugoinnilfa ja suodatuksella Seitz-K 150 ja EK-suodattimien 20 läpi (Pali SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Saksa).
Esimerkki 15, Thermoascus aurantiacus Cel7A~CBD«rekombinanttifuusio-proteiinien tuotanto Γ. reese/ssä
Thermoascus aurantiacuksen cel7A (AF478686, Hong ym., 2003b; sekvenssi nro 1) sulautettiin Tnchoderma teesein CBHI/Cel7A:n (AR088330, 25 SriSodsuk ym. 1993) (= Tr CBD) liitokseen ja CBDriin, jota seurasi fuusioprote-Unin (sekvenssi nro 28, joka vastaa nukleiinihappösekvenssiä nro 27) tuontan-to T. reese/ssä, kuten kuvattiin julkaisussa FI20 055 205/US 11/119 526; arkistoitu 29. huhtikuuta 2005, Lisäksi Thermoascus aurantiacuksen Cei7A sulautettiin Chaetomium thermophiiumm Ce!7A:n {sekvenssi nro 7) (Ct CBD) iiitok-30 seen ja CBD.iin. Tätä tarkoitusta varten Chaetomium thermöphitumm Cel7A:n liitoksen ja CBD:n koodaussekvenssi syntetisoitiin PCR:lia käyttäen se uraa via aiukkeita: 5?-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTC- GACCGTCCCTGGCCTTGAC-3’(forward-a!uke) 35 ja 50 5’-TATATGGGG CCGGAAGCTTT ACGAT CAAG TTACTCCAGCAAAT C AGG G-AACIG-3’ (reverse-aluke).
PCR-reaktioseos sisälsi 1 x DyNAzyme1MEXT-reaktiopuskuria (Finnzymes, Suomi), 15 mM Mg2\ 0,2 mM dls3TP:eja, 2 μΜ kutakin ai u kettä, 5 0,6 yksikköä DyNazyme™EXT-DNA-polymeraasia {Finnzymes, Suomi) ja iiki- määrin 75 ng/30 μ| tempiaatti-DNA:ta, joka sisälsi täyspitkän ce/7A-geenin Chaetomium ihermophiiumlsia. PCR-reaktion olosuhteet olivat seuraavat; 2 minuutin alkudenaturaatio 98 °C:ssa, jota seurasi 30 30 sekunnin sykliä 98°C:ssa, 30 sekunnin alukkeiden kiinnittymisvaihe 68 °C:ssa (±4 gradientti), 10 30 sekunnin alukkeiden pidentymisvaihe 72 °G:ssa ja lopullinen pidentymisval·-he 72°C:ssa 10 minuutin ajan. Spesifinen DNA-fragmentti PCR-reaktiossa saatiin alukkeiden kiinnittymisiämpötilavälillä 64-68,5 °C. Chaetomium ther-mophUumin syntetisoitu CBD-fragmentti iigoitiän Thermoascus aurantiacuksen ce/7A-geenin jälkeen, mikä johti GPiGST:n liitoskohtaan domeenien välissä.
15 PCR-vahvistetiu fragmentti piasmidissa varmennettiin sekvensoinnilla (sek-vensi nro 29). Konstruoitu ce/7A-fuusiogeeni sulautettiin tarkalleen T. reesein chh1 -promoottoriin (ce/7A). Transkription terminaatio varmistettiin T. reesein ce/7A-terminaattorilia ja A. nidufansin amdS-markkerigeeniä käytettiin transformanttien valikointiin, kuten kuvataan julkaisussa Paloheimo ym. (2003).
20 Lineaarinen ekspressiokasett! eristettiin vektorirungosta A/oii-diges- tion jälkeen ja transformoitiin T. reesein A96-protopiasteihin. Transformaatiot suoritettiin kuten julkaisussa Penttilä ym. (1987) niiden modifikaatioiden kanssa, jotka kuvataan julkaisussa Karhunen ym. (1993), valikoiden asetamidilla ainoana typen lähteenä. Transform a ntit puhdistettiin valintamaljoilia yksittäis- j 25 ten konidioiden kautta, ennen kuin ne idätettiin PD:lla,
Transformanttien Thermoascus aurantiacuksen Cel7A+CBD-tuo-tanto (sekvenssit nro 28 ja 30) anaiysoitiin ravisteiijoissa kasvatettavien puiio-viljeimien (50 mi) viljeiysupernatanteista. Transformantteja kasvatettiin 7 päivän ajan 28 °C;ssa kompleksisessa selluiaasin ilmentymistä indusoivassa liu-30 oksessa (Joutsjoki ym, 1993), joka oii puskuroitu 5 % KH2PO4.Ha pH:ssa 5,5. Sellobiohydrolaasiaktiivisuus analysoitiin käyttäen 4-metyyliumbeiiiferyyli-p-D-laktosidisubstraattia (MUL) julkaisun van Tiibeurgh ym. (1988) mukaisesti- Valittujen transformanttien genotyypit varmennettiin käyttämällä Southern-blot-tauksia, joihin useita genomisia digestejä sisällytettiin ja ekspressiokasettia 35 käytettiin koettimena, SDS-PAGE-anaiyysit osoittivat, että Thermoascus au- $ 51 rantiacuksen Ce!7A+CBD-entsyymit tuotettiin stabiileina fuusioproteiineina Γ. reaseissä.
Ta Cel7A + Tr CBD -fuusioproteiinia (sekvenssi nro 28) tuottavia valittuja transformantteja viljeltiin myös 2-iitran bioreaktorissa 28 °C:ssa yllä ii-s imaistussa liuoksessa 3-4 päivän ajan pH-kontroliilia 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4} materiaalin saamiseksi sovellustesteihin. Supematantit otettiin talteen sentrifu-goinnilla ja suodatuksella Seitz-K 150 ja EK-suodattimien läpi (Pall Seitz-Schenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Saksa),
Esimerkki 16. Puhdistettujen rekombmanttisellobiohydroiaasien ftfiicha-10 elis-Menien-ja selfobioosi-inhibitiovakioiden vertailu
Michaelis-Menten- ja sellobioosi-inhibitiovakiot määritettiin heteroio-gisesti T. reese/ssä tuotetuista seilobiohydrolaaseista (esimerkki 14 ja 15). Entsyymit puhdistettiin, kuten kuvataan esimerkissä 2. Puhdistettujen entsyymien proteiinipitoisuudet mitattiin niiden absorptiolla 280 nimissä käyttäen teo-15 reettista molaarista ekstinktiokerrointa, joka laskettiin aminohapposekvensseistä (Gill ja von Hippel, 1989).
Kineettiset vakiot (Km- ja kcat-arvot) ja sellobioosi-inhibitiovakiö (Ki) Tr CBHl/Cel7A:i!e, Ta CBH/Cel7A:ile, At CBH/Cel7A:lle ja Ct GBH/Ce!7A:ile mitattiin käyttäen CNPLac:a (2-kloori-4-nitrofenyylΐ-β-D-laktosidi) substraattina 20' ympäristön lämpötilassa (22 °C) 50 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH 5,7. ln-hibitiovakiön (Ki) määrittämiseksi käytettiin kahdeksan erilaista substraattipitoi-suutta (31-4000 μΜ) viiden inhibiittonpitoisuuden välin ollessa läsnä (0-100 μΜ tai 0-400 μΜ), jotka luokitteievt Ki-arvon samaan joukkoon. Kaikki kokeet suoritettiin mikrotiittenlevyiliä ja kokonaisreaktiotitavuus oli 200 μΙ. Alkunopeudet kus-25 sakin tapauksessa mitattiin jatkuvalla kioon-nitrofenolaattianionin (CNF, 2-kloo-ri-4~niirofenolaatti) vapautumisen seurannalla mittauksien 405 nmissä avulla käyttäen Varioscan-mikrotiitterilevylukijaa (Thermolabsystems). Tulokset laskettiin GNP-standardikäyrästä (0—1ÖO μΜ). Käytetyt entsyymipitoisuudet olivat: Tr CBHI/Ce!7A 2,46 μΜ, Ta CBH/Cel7A 1,58 μΜ, Ct C8H/Cef7A 0,79 μΜ ja At 30 CBH/Ce!7A 3 μΜ. Km- ja kcat-vakiot laskettiin Michaelis-Mentenin yhtälön sovituksella käyttäen Drigin-ohjelmaa. Linevveaver-Burk-kuvaajia, uusiokuvaajia {LWP~käyrä verratuna [Glc2;seiiobioosiir(j) ja Hanes-kuvaajla käytettiin kilpailevan ja sekoitetun tyypin inhibition erottamiseksi ja inhlbltiovakiolden (Ki) määrittämiseksi, 35 Tulokset kineettisistä mittauksista osoitetaan taulukossa 12 ja taulu kossa 13. Kuten voidaan nähdä, Ct CBH/Ce!7A:lia oli seivästi korkeampi reak- 52 tiofrekvenssi (kcat) CNPLac:ila ja myös spesifisyysvakio (kcat/Km) oli korkeampi verrattuna T. reesein CBHi/Gei7A:han. Sellpbiopsi (G!c2) on kilpaileva inhibiittori kaikille mitatuille sellulaaseille ja Tr CBHI/Cel7Ä:lla (käytetty kontrollina) oli voimakkain inhibltio (t.s. matalin Ki-arvo) sellobioosilla. At 5 CBH/Cel7A:ila oli yli 7-kertaa korkeampi inhibitiovakio verrattuna Tr CBHI/Cel7A:n vakioon. Nämä tulokset ilmaisevat, että kaikki kolme uutta seilo-biohydrolaasia voisivat toimia paremmin selluloosan hydrolyysissä johtuen vähentyneestä sellobioosi-inhibitiosta verrattuna Triehoderma reesein Cel7A~ sellobiohydrolaasiin I.
10 Taulukko 12. Neljän GH-perheen 7 seliobiohydrolaasien sellobioosi-inhibitiovakioiden vertailu, mitattuna CNPLacdla 50 mlVI natriumfosfaatti-puskurissa pH 5,7 22 °C:ssa
Entsyymi___Ki (μΜ)__Inhibitiotyyppi_
Ct Cei7A_ 39__kilpaileva_ T a Gel7A__107_ kilpaileva_
At Cei7A___141__kilpaileva_
Tr Gei7Ä__19__kilpaiieva_
Tauiukko 13. Chaetomium thermophilumm selfobiohydrolaasin GeI7A 15 Michaefis-Mentenin kineettisten vakioiden vertailu T. reesein CBHI/Cei7A:han, mitattuna CNPLacdia 50 mM nairiumfosfaattipuskurissa pH 5,7 22 °C;ssa
Entsyymi kcat (min1) Km (μΜ) kcat/Km (min1 M‘%)
CtCel7A 18,8_____1960 9,5 103_
Tr Cel7A 2,6 ~ 520 5,0103
Esimerkki 17, Kiteisen selluloosan (Avice!) hydrolyysi rekombinanttisei» 20 lobiohydrolaaseilla
Puhdistetut rekombinanttisellobiohydrolaasit Ct Ce!7A, Ta Ce!7A, Ta Cel7A + Tr CBD, Ta Cel7A + Ct CBD, At Cel7A sekä Ct Ce!7A:n ydinversio (katso alla) testattiin samoina määrinä kiteisen selluloosan hydrolyysissä kahdessa lämpötilassa, 45 °C ja 70 °C; puhdistettua T. reesein Tr Cel7A;ta ja sen 25 ydinversiota (katso alla) käytettiin vertailussa. Kiteisen selluloosan (Ph 101, Avicei; Fiuka, Bucsh, Sveitsi) hydrolyysikoe suoritettiin 1,5 m!:n putkimättakaa- 53 vassa 50 mM natriumasetaattia, pH 5,0. Avicelia ravisteltiin 45 °C:ssa tai 70-C ' ssa entsyymiiiuoksen kanssa (1,4 μΜ) ja reaktioseoksen lopullinen tilavuus oli 325 μ!. Hydrolyysiä seurattiin 24 tuntiin saakka ottaen näytteitä kuudessa eri aikapisteessä ja pysäyttämällä reaktio lisäämällä 163 μΐ pysäytys-5 reagenssia, joka sisälsi 9 tilavuutta 94 % etanolia ja 1 tilavuuden 1 M glysiiniä (pH 11). Liuos suodatettiin Miilex GV13 0,22 μτη -suodatusyksikön läpi (Milli-pore, Billerica, MA, USA). Liukoisten pelkistävien sokereiden muodostuminen supernatantissa määritettiin para-hydröksibentsoehappohydratsidimeneieirnäl-lä (RA-HBAH) (Lever, 1972) käyttäen sellobioosistandardikäyrää (50-1600 μΜ 10 seliobioosia}. Tuoreeltaan tehty 0,1 M PAHBAH (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, USA) 0,5 M NaOH-liuoksessa (100 μ!) lisättiin 150 pbaan suodatettua näytettä ja keitettiin 10 minuutin ajan, jonka jälkeen liuos jäähdytettiin jäillä. Näytteiden absorbanssi 405 nm:ssä mitattiin.
Seliobiohydrolaasien ydinversiot, joilla oli CBD alkuperäisessä muo-15 dossaan, saatiin seuraavasti: Ct Cel7A ja Tr Cei7A altistettiin proteolyyttiseiie digestioile selluloosaa sitovan domeenin poistamiseksi. Alkuperäisten seiio-biohydroiaasien papaiinidigestio (Papaijaiateksi, 14 U/mg, Sigma) suoritettiin 37 °C:ssa 24 tunnin ajan reaktioseoksessa, joka koostui 10 mM L-kysteiinistä ja 2 mM EDTA:sta 50 mM natriumasetaattipuskurissa (pH 5,0), papalinin lisä-20 ykseliä (kaksi papaiinipitoisuutta testattiin: yhden viidesosan ja yhden kymmenesosan määrä papaiinia Cel7A:n kokonaismäärästä reaktioseoksessa). Tuloksena oleva ydinproteiini puhdistettiin DEAE Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) -anioninvaihtopyiviailä, kuten yllä kuvataan. Tuote analysoitiin SDS-PAGE:lla.
25 Hydrolyysin tulokset 45 °C:ssa ja 70 °C:ssa osoitetaan kuvassa 4 ja kuvassa 5 mainitussa järjestyksessä. Tulokset osoittavat selvästi, että kaikki sellobiphydrolaasit osoittavat nopeampaa ja täydellisempää: hydrolyysiä molemmissa lämpötiloissa verrattuna tunnetun tekniikan mukaiseen selloöiohyd-rolaasiin T, teesein Cel7A. 70 °C:ssa termisesti stabiilit seilobiohydrolaasit 30 Thermoascus aurantiacus ALK04242;sta ja Chaetomium thermophilum ÄL-KÖ4265:stä olivat parempia verrattuna T. reese/n Ce!7A:han myös tapauksessa, jossa Th&rmoascuksen CelTA-ydln liitetään T, reese/n Cel7A:n CBD:iin (Ta Cel7A + Tr CBD), Oli yilättävää, että tässä työssä eristetyt ja kloonatut sello-biohydroiaasit ovat parempia, kun niillä on CBD, nopeudessa ja tuotteen muo-35 dostumisessa kiteisen selluloosan hydrolyysissä myös 45 DC:n tavanomaisessa hydrolyysilämpötilassa, kun verrataan tunnetun tekniikan mukaiseen sello- 54 hiöhydroiäasiin T. reesein Cei7A (CBHI) samassa entsyymipitoisuudessa. Tulokset ovat myös yhtäpitäviä niiden entsyymivalrnisteiden (At Cei7A ja Ct Cel7A) kanssa, jotka puhdistettiin alkuperäisistä isännistä ja testattiin Avicei-hydrolyysissä (50 °C, 24 h) (Esimerkki 2, Taulukko 1).
5 Esimerkki 18, Acremonium tbermophilum ALXÖ4245:n, Chaetomium thermophilum ALK04261:n ja Thermoascus aurantiacus ALK04242:n endoglukanaasigeenien kloonaus
Molekyyiibioiogian perusmenetelmiä käytettiin, kuten kuvataan esimerkissä 13. Acnemoniumm, Chaetomiumm ja Thermoascuksen genomisten 10 kirjastojen konstruktio on kuvattu esimerkissä 12.
Puhdistetuista Acremoniumm ja Chaetomiumm endoglukanaaseista peräisin oieviiia peptideillä oli homoiogiaa useiden glykosyylihydrolaasiperheen 45 endogiukanaasien kanssa, kuten Metanocarpus albomycesm Cel45A-endogtukanaasin (AJ515703) ja Humicola insolensln endoglukanaasin 15 (A35275) kanssa mainitussa järjestyksessä. Thermoascuksen endoglukanaa- sista peräisin oieviiia peptideillä oli lähes 100 %:n identtisyys julkaistun Thermoascus aurantiacukseo ΕΘ1 -endoglukanaasin sekvenssin (AF487830) kanssa. Koettimen vahvistamiseksi Acremoniumm ja Chaetomiumm genomisten kirjastojen seulontaan degeneroidut aiukkeet suunniteltiin peptidisekvenssien pe-•20 rusteeila. Peptidien järjestys proteiinisekvenssissä ja vastaava alukkeiden j sense- tai anti-sense-iuonne pääteltiin vertailusta homologisten julkaistujen j endogiukanaasien kanssa. Alukesekvenssit ja vastaavat peptidit listataan tau- j lukossa 14. Thermoascuksen peptidien lähes 100 % identtisyydestä julkaistu- j jen sekvenssien kanssa johtuen endoglukanaasigeeni vahvistettiin P.CR:lla j 25 suoraan genomisesta DIMA;sta. | \ 55
Taulukko 14. Oligonukleotidit, jotka syntetisoitiin ja käytettiin PCR-alukkeina koettimen vahvistamiseksi Acremonium thermophilumm ce/45A- (EG_40) ja Chaetomium thermophilum'm ce/7B-geenin (EGJS4) seulontaan vastaavista genomisista kirjastoista Proteiini Peptidi Aiukkeen Aiukkeen sekvenssi^ ______sijainti^3 _
AtEG^40 Peptidi 5 1-6_ TAYTGGGAYTGYTGYAärCC
__WFQNADN(C__R^a-i^cisrGORTTYTGRÄaccA_
Ct EG_54 Peptidi 7 3-7_ gcaagcttcgrcaraärtcrtcrtt (d ___ Peptidi 2 5-9_ggaattcgaycaracngarcarta (e
5 {a Alukesekvenssin suunnitteluun käytetyn peptidin aminohapot {h N = A, C, G tai T; R = A tai G, Y = C tai T
(c Peptidi, joka ei oie peräisin puhdistetusta Acremonium\u EG_4D-proteiinista, mutta on lähtöisin EG_40:n kanssa homologisesta M. albomycesin Cel45A-sekvenssistä (AJ515703).
(d Modiii-restriktiokohta lisättiin oligpnukleotidin 5’-päähän 10 (e EcoRf-restriktiokohta lisättiin oiigonukieotidin 5'-päähän
Acremonium thermophilumm ce/45A-geeni!ie spesifinen koetin ge-nomisen kirjaston seulontaan vahvistettiin forward- (TAYTGGGAYTGYTGY-AARGG) ja reverseaiukkeilia (RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA) käyttäen ge-15 nomista DNA:ta templaattina. PCR-reaktiöseökset.sisälsivät 50 mM Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM (NH^SO*, 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgC!2, 0,1 mM dNTPiejä, 0,5 pg kutakin aluketta, 1 yksikön Dynazyme EXT DNA-polyme-raasia (Finnzymes, Suomi) ja iikimäärin 0,5 pg Acremonium genomista DNA:ta. PCR-reaktioiden olosuhteet diivat seuraavat: 5 minuutin alkudenatu-20 raatio 95 °C:ssa, jota seurasi 30 1 minuutin sykliä 95 °G:ssa, 1 minuutin aiukkeiden kiinnittymisvaihe 5Q~60GC;ssa, 2 min aiukkeiden pidentymisvaihe 72 0C:ssa ja lopullinen pidentymisvaihe 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. Chaetomium thermophilumm ce/ZB-geenille (koödittaä Ct EG_54:ä) spesifisen koettimen vahvistamiseksi käytettiin forward-aiuketia (GGAATTCGAYCARÄCNGAR-25 CARTA) ja reverse-alukeita (G C AAG CTT CG RC ARAA RTC RT GRTT). PCR-reaktioseokset sisälsivät 10 mM Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM KCl, 0,1 % Triton X-100, 1,5 rh M MgCia, 0,2 mM dNTPiejä, 250 pmoi kutakin aluketta, 2 yksikköä Dynazyme II DNA-pofymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja Iikimäärin 2 pg Qhae-tomiumm genomista DNA:ta. PCR-reaktion olosuhteet olivat yllä kuvatun kai-30 täiset paitsi, että aiukkeiden kiinnittyminen suoritettiin 45-50 °C:ssa.
56
Kaksi PCR-tuotetta saatiin Acremoniumm PCR-reaktiosta. Noin 0,6 kb;n ja 0,8 kb:n DNA-fragmentit eristettiin agaroosigeeliltä ja kloonattiin pCR4-TOPO® TA "-vektoriin (invitrogen, USA), mikä johti plasmideihin pALKI 710 ja PALK1711 mainitussa järjestyksessä. DNA-tuotteet karakterisoitiin sekven-5 soinnilla ja suOnttamalia Southern-btottaushyhndisaatioita useilla restriktioent-syymeiiiä digestoidulle genomiselle Acremoniumm DNA:i!e. Kahdella fragmentilla ankarissa pesuolosuihteissa saadut hybridisaatiokuviot ehdottavat, että kaksi otaksuttua endoglukanaasigeeniä voitiin seuloa Acremoniumm genomi-sesta kirjastosta. Molempien PCR-tuotteiden päätellyillä aminohapposekvens-10 selliä oli homologiaa useiden julkaistujen glykosyylihydrolaasiperheen 45 en-doglukanaasisekvenssien kanssa (BLAST-ohjelma, National Center for Biotechnology information; Altschul ym. 1990).
Yksi odotetun kokoinen PCR-tuöte (arvioitu homologisesta Humico-ta insolensm endoglukanaasisekvenssistä, Ä35275) saatiin Chaeiomiumin 15 PCR-reaktiosta. Tämä noin 0,7 kb:n DNÄ-fragmentti kloonattiin pCR4-TGPÖ® TA-vektoriin (invitrogen, USA), mikä johti piasmidiin pALK2Ö05 ja analysoitiin, kuten yllä kuvataan. PCR-tuotteen päätellyllä aminohapposekvenssillä oli homologiaa useiden julkaistujen glykosyylihydrolaasiperheen 7 seilulaasisek-venssien kanssa (BLAST-ohjelma, versio 2.2.9 NCBLilä, National Center for 20 Biotechnology Information; Altschul ym. 1990).
Insertit piasmideista pÄLK1710, pALK1711 ja pALK2005 eristettiin restriktioehtsyymidigestiolia ja leimattiin digoksigeniinillä toimittajan ohjeiden mukaisesti (Roche, Saksa). Noin 1-2 x 105 plakkia vahvistetusta Acremoniumm ja Chaeiomiumin genomisesta kirjastosta seulomiin. Hybridisaatio-25 lämpötila oli 68 °C ja suodattimia pestiin 2x5 minuuttia huoneenlämmössä käyttäen 2 x SSC-0,1 % SDS ja seuraavaksi 2 x 15 minuuttia 68 °C:ssa käyttäen 0,1 x SSC-0,1 % SDS. Useita positiivisia plakkeja saatiin, joista 5-6 voimakkaasti hybridisoituvaa plakkia puhdistettiin kustakin seulonnasta. Faagi-DNA:t eristettiin ja analysoitiin Söuthern-blottaushybndisaatioilla. Koettimeen 30 hybridisoituneet restriktiofragmentit subkloonattiin pBluescript II KS+ -vektoriin (Stratagene, USA) ja asiaankuuluvat osat sekvensoitiin. Kaikissa tapauksissa subkloonattu faagifragmentti sisältää täyspitkän mielenkiinnon kohteena olevan geenin. Taulukko 15 tekee yhteenvedon endoglukanaasigeenten seulontaan käytettyjen koettimien tiedoista, faagiklöoneista, joista geenit eristettiin, 35 valituista täyspitkät geenit promoottori- ja terminaattorialueineen sisältävistä restriktiofragmenteista, subkloonatun faagifragmentin sisältävien plasmidien 57 nimistä ja talietusnumeroista Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zelikuituren GmbH-viljelmäkokoelrnassa (DSMj näitä plasmideja sisältäville E co//-kannoille.
Taulukko 15. Endoglukanaasigeenien kloonaukseen käytetyt koettimet, 6 valitut faagikloonit ja subkloonit, piasmidinimi ja vastaavan E. co// -kannan talietusnumero
Geeni Gonominen Seulonnassa Faagi- Subkioonattu Plasmidi E. colin kirjasto käytetty klooni fragmentti talletus- ________ koetin___ numero
At ce/45A A. thermophilum pAI K1710 P24 5,5 kb S/nal pALK1908 DSM 17324 ALKQ4245_____ at ce/45b A. thermophilum pALK1711 p41 6,0 kb Xho\ pALK1904 DS M17323 _ ALKQ4245_______
CtceffB C. thermophilum pALK2005 P55 5,1 kb BamH\ pALK2010 DS M17729 _ ALKQ4261_________
Thermoascus aurantiacuksen ce/45A-geeni (kpodittaa EG_28:a) (sekvessl nro 9) vahvistettiin suoraan eristetystä genomisesia DNAista PCR-10 reaktiolla. Forward- {ATTAACGGCGGACTGCGCATCATGAAGGTCGGCTCT-CTCGTGCTC) ja reverse-alukkeet (AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCAT-ATT), joita käytettiin vahvistamiseen, suunniteltiin julkaistun T. aurantiacuksen eg1 -geenin (AF487830) perusteella. PCR-reaktioseokset sisälsivät 1 x Phusi-on HF -puskuria, 0,3 m M' dNTP;ejä, 0,5 μΜ kutakin aluketta, 2 yksikköä Phu-15 sionTM DNA-poiymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja likimäärin 0,25 pg Thermo-ascuksen genomista DNAita. PCR-reaktion olosuhteet olivat seuraavat: 5 minuutin aikudenaturaatio 95 0C:ssa, jota seurasi 25 30 sekunnin sykliä 95 °C:ssa, 30 sekunnin alukkeiden kiinnittymisvaihe 57-67 °C:ssa, 2,5 min alukkeiden pidentymisvaihe 72 °C:ssa ja lopullinen pidentymisvaihe 72 °C;ssa 20 5 minuutin ajan. Vahvistettu 1,3 kb:n tuote, joka sisäisi tarkan geenin (START- kodonista STÖF-kodoniin), kloonattiin Sacll-Psii-fragmenttina pBluescript 11 KS+ -vektoriin. Kaksi riippumatonta kioonia sekvensoitiin ja toinen klooni valikoitiin ja nimettiin pALK1926:ksi. E, coii -kannan, joka sisältää pALK1926:n, talietusnumero Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zelikuituren 25 GmbH —viljelmäkokoelmassa on DSM 17326.
58
Geenien asiaankuuluvat tiedot ja päätellyt proteimisekvenssit (sekvenssi nro 9-16) vedetään yhteen taulukossa 16 ja taulukossa 17 mainitussa järjestyksessä, Puhdistetun Acremoniumm EG_40- (geeni At ce/45A), Chea~ iomiurrm EG_54- (geeni Ct ce/7B) ja Thermoascuksm EG_28-endogiuka-5 naasien (geeni Ta ce/5A) peptidisekvenssit löydettiin kloonattujen geenien päätellyistä aminohapposekvensseistä, mikä varmentaa, että tarkpituksenmu-kaiset geenit kloonattiin.
Taulukko 16, Acremonium ihermophilumista, Chaetomium thermophilu-mistä ja Thermoascus a uran t/acukses ta eristettyjen endoglukanaasigee-10 nien yhteenveto
Endogluka- Pituus Koodaus- Intronien intronien Sekvenssi naasi- intronien alue (bp)<b lukumäärä pituus nro geeni kanssa (bp) __J>pf___________
At Ce/45A 1076 891__2__59, 123 11
At ce/45B 1013 753___2__155, 102 13___
Ct Caff’S 1278__1275__-___ 15
Tace/SA 1317 1005 5 55, 60, 59, 9 j _J__ 74,61__|
(a STGP-kodoni mukaan lukien. I
(b STOP-kqdonia lukuun ottamatta. \ \ \ \ :¾ ί \ j
-I
59
Taulukko 17. Acremonium thermophUumin, Chaetomium thermophifumin ja Thermoascus aurantiacuksen pääteltyjen endoglukanaaslsekvenssien yhteenveto, ss, signaalisekvenssi
Endo- Amino- ss CBD|b Ennus- Ennus- Otak- Sek- giukanaasi- happojen NN/HWIM:n tettu Mw te'ttu pi sutut N- venssi proteiini luku- pituus<a {Da, ss:ä (ss:ä lu- glyko- nro määrä lukuun- kuun- sylaa- notta- otta- tiokoh- matta)te matta) dat,d
At EG_40 297 21721 Kyllä, 28625 4,79 2 12 _______K265-L29? _____
At EG_40Jjke 251_ 20/20__Ei__23972 6,11__2__14
Ct EG_54__425__17/17__Ei.__45358 5,44 1__16
Ta EG_28__335 30(e__B_ 33712 4,30__i__10 (a Signaalisekvenssin ennuste tehtiin käyttäen SignalP V3,0 -ohjelmaa (Nielsen ym., 1997; S Bendtsen ym., 2004); MN-arvo saatiin käyttäen neuraaliverkkoja ja H M M-arvo käyttäen kätkettyjä Markov-mallejä.
(b Selluloosaa sitovan domeenin (GBD) läsnäolo proteiinmissa, C-ierminaalisen CBD:n aminohapot ilmaistaan (numerointi tayspitkän polypeptidin: mukaisesti) (c Ennustettua: signaafisekvenssiä lukuun ottamatta. Ennuste tehtiin käyttäen Compute pl/MW-10 työkalua ExPASy-palvelimelia (Gasteiger ym., 2003).
(d Otaksutut N-glykosyiaatiokohdat N-X-S/T ennustettiin käyttäen NetNGlyc 1,0 -ohjelmaa (Gupta ym,, 2004) (e julkaisun Hong ym., 2.003a mukaisesti 15 Acremoniumin EG_4Q- (At Cel45A) ja EG_40_iike~ (At Gel45B),
Chaetomiumin EG_54- (Gt Cel7B) ja Thenrioascuksen EG_28-endogluka-naasien (Ta Cel5A) päätellyillä pröteiinisekvensseillä oli homologiaa gtykosyy-lihydrolaasiperheen 45 (Acmmonium), perheen 7 (Chaetomium) ja perheen 5 (Thermoascus) seilulaasien kanssa siten tunnistaen eristetyt geenit näiden 20 geeniperheiden jäseniksi. Acmmonium in endogiukanaasien EG_40/Ce!45A ja EG_40_tike/Cel45B lähimmät homologit ovat Thielavia terrestrism (CQ827970, 77,3 % identtisyys) ja Myceliophthora thermophilan (ARÖ943Q5, 66,9 % identtisyys) endoglukanaasit mainitussa järjestyksessä (taulukko 18). Kahdella eristetyllä Apremontum-perheen 45 endoglukanaasilla on vain 53,7 %:n identtisyys 60 toistensa kanssa. Näistä entsyymeistä vain EG„40/Cei45A sisältää selluloosaa sitovan domeenin (CSD).
Lähin homologi Chaetomium'm EG_54/Cel7B-endoglukanaasin ennustetulle proteiinisekvensille löydetään Melanöcarpus albomycesm ce!7A-5 selfuiaasisekvenssistä {AJ5157Q4). identtisyys näiden kahden priteiinisekvens» sin välillä pn 70,6 %.
Eristetyn Thermoascus aurantiacuksen endoglukanaasin proteiini-sekvenssi on täysin identtinen julkaistun V aurantiacuksen EGI:n (AF487830, taulukko 18) sekvenssin kanssa. Lähin homologi löydettiin Täfaromyces emer-10 soniln β-giukanaasisekvenssisiä (AX254752, 71,1 % identtisyys).
Taulukko 18. Pääteltyjen Acremonium thermophiiumin EG_40-, EG_40_lfke/Cel45B-, Chaetomium thermophiiumin EG_54/CeI7B- ja Thermoascus aurantiacuksen EG_2S/Gel5A-endoglukanaasien vertailu homologisten vastinesdensa kanssa. Linjaus suoritettiin käyttäen EM-15 BOSS-ohjelmapaketin Needie-ohjeimaa. ilmaisee tässä työssä kloonatun geenin köodittaman endoglukanaasin.
Organismi, entsyymi ja talletus numero__identtisyys (%)
Acremonium thermophiium EG_40 100,0
Thielavia terrestris EG45, CQ827970 77,3
Meiahöcarpus aibomyees Ce\45A, AJ515703 75,3
Neurospora erässär hypoteettinen XM_324477 68,9
Humicoia grisea var thermoidea, EGL3, AB0031Ö7 67,5
Humicoia insolens EG5, A23635 67,3
Myceliophthora thermophila perhe 45, ARQ943Q5 57,9 * Acremonium thermophiium EG_4QJike__53,7_
Acremonium thermophiium EG_4Ö_Jike 100,0
Myceliophthora thermophila perhe 45, ARQ94305 66,9
Magnaporthe grisea 70-15 hypoteettinen X.M_363402 61,9
Thielavia terrestris EG45, CG827970 * Acremonium thermophiium EG_40 56,8
Meiahöcarpus aibomyees Cel45A, AJ515703 53,7 _________52^___
Chaetomium thermophiium EGJ54 100,0
Melanöcarpus aibomyees Gel7A, AJ515704 70,6
Humicoia grisea var thermoidea, EGI, D63516 68,8 j 61
Humicola insolens EGI, ÄR012244 67,7
Myceliophthora thermophila EGi, AR071934 61,7
Fusarium oxysporumvar lycopercisi EG I, AF29210 53,5
Fusarium oxysporum EGI, ARÖ12243__52,6__
Thermoascus aurantiacus EGJ28 100,0
Thermoascus aurantiacus EG, AX812161 100,0
Thermoascus aurantiacus EGi, ÄY055121 99,4
Talaromyces emersonii β-glukanaasi, AX254752 71,1
Taiaromyces emersonii EG, ÄF440003 70,4
Aspergillus niger EG, A69663 70,1
Aspergillus niger EG, A62441 69,9
Aspergillus niger EG, AF331518 69,6
Aspergillus aculeatus EGV, AF054512 _ 68,5
Esimerkki 19. Rekombinanttiendoglukanaasien tuotanto Trichoderma reese/ssä
Ekspressioplasmidit konstruoitiin Acremonium'm EG_40/Cel45A-, 5 EG40_iike/Gel45B ja Thermoascuksen EG_28/Ce[5-rekombinantiiproteiin!en tuotantoon, kuten kuvataan esimerkissä 14. Lineaariset ekspressiokasetit (taulukko 19) eristettiin vektorirungosta restriktioentsyymidigestioiia, transformoitiin T. reesein A96:een ja transformantit puhdistettiin, kuten kuvataan esimerkissä 14.
! 62
Taulukko 19. Äcremonium thermophitumin EG_40/Cei45A-, EG_40_Iike/Cef45B» Ja Thermoascus auraniiacuksm EG_28/Ce!5A-endo-glukanaasien tuotantoon Trichoderma reeseissä konstruoidut ekspres-siokasetit. Ekspressiokasettieri kaäviomainen rakenne kuvataan kuvassa 5 2.
En dog Su kanaasi Ekspressio- Ekspresslo- Beteroioginen __piasmidi__kasetin koko{a terminaattoritb
At EG_40_ pALKi920 10,9 kb ΛΜ 156 bp {HindiW}
At EG„40Jike pALK1921__8,6 kb EcoRl 282 bp (Sspl)
Ta EG_28 pALK1930 8,6 kb Not\ ei - Ekspressiokasetti T. reese/'-transformaatioon eristettiin vektorimngosta EeoRi- ja Not\- dlgestioila.
(ö Nukleotidien lukumäärä kloonatun geenin, joka sisällytetään ekspressiokasettiin, STOP-kodonin jälkeen Ilmaistaan. Restriktiokohia geenin 3-päässä, jota käytettiin ekspressiokasetin 10 konstruktiossa, ilmaistaan suluissa.
Transformanttien endogiukanaasituotanto analysoitiin ravisteiijoissa kasvatettavien pulioviijelmien (50 ml) viljeiysupernatanteista. Transformantteja kasvatettiin 7 päivän ajan kuten esimerkissä 14 ja rekombinanttiproteiinin entis syymiaktiivisuus mitattiin viljeiysupernatanteista pelkistävien sokerien vapautumisena karboksimetyyliselluioosasta (2% (paino/tiiavuus) CMC) 50 °C:ssa 50 tn M: sitraattipuskurissa pH 4,8 oleellisesti' kuten kuvataan julkaisuissa Bailey ja Nevalainen 1981; Haakana ym, 2004. Rekombinanttiproteiinien tuotanto de-te kto it iin m yös vi Ijeiysu pernatanteista S DS-pol ya kryyl ia m id igeeiielektrofo ree-20 silla. Acremoniumm EG_40-spesiflset polyklonaallset vasta-aineet tuotettiin kaneissa (Helsingin yliopisto, Suomi). EG_40:n ilmentyminen todennettiin VVestern-biottausanaiyysiila anti-EG_4Ö-vasta~aineilla käyttäen ProtoBlot Western biot AP -systeemiä (Promega). Valittujen transformanttien genotyypit analysoitiin Southern-blottauksefla käyttäen ekspressiokasettia koettimena.
25 Heteroiogisesti tuotettujen endoglukanaasien pH-optimi määritettiin universaalissa Mcllvainen puskurissa pH-välilia 4,0-8,0 käyttäen karboksime-tyyliselluloosaa substraattina. Kuten osoitetaan kuvassa 6A levein pH-väli (4,5-6,0) on Acremoniumm EG_40/Cel45A~proteiinin, optimin ollessa pH 5,5. pH-optimit muille heteroiogisesti tuotetuille endogtukanaaseille ovat pH 5,0-5,5 30 ja 6,0 Acremoniumm EG_40_like/Cel45B:lie ja Thermoascuksen EG_28/Cel5A:lle mainitussa järjestyksessä. Optimilämpöfila näiden endoglu- 63 kanaasien entsyymiaktiivisuudelle määritettiin lämpötilaväiillä 50-85 °C kuten yllä kuvataan. Korkeimman entsyymien aktiivisuuden määritettiin olevan 75 °C:ssa, 60 °C:ssä ja 75 °C:ssa Acremoniumin EG_40/Cel45A:iie, EG_40Jike/Cel45B:ile ja Thermoascukeen EG_28/Cel5A:iie mainitussa järjes-5 tyksessä (Kuva 6B).
Valittuja transformantteja viljeltiin, kuten kuvataan esimerkissä 14, 2-litran bioreaktorissa neljän päivän ajan (28 °C, pH 4,2), materiaalin saamiseksi soveilustesteihin.
Esimerkki 20. Acremonium fhermophilum ALK04245:n, Chaetomium 10 thermophilum ALK04261 :n ja Thermoascus aurantiacus ALK04242:n be-taglukosädaasigeenien kloonaus
Molekyylibiologian perusmenetelmiä käytettiin, kuten kuvataan esimerkissä 13. Acremoniumin, Chaetomiumin ja Thermpascuksen genomisten kirjastojen konstruktio on kuvattu esimerkissä 12.
15 Puhdistetuista Acremoniumm, Chaetomiumin ja Thermoascuksen β- giukosidaaseista peräisin olevilla peptideillä oli homologiaa useiden glykosyyli-hydrolaasiperheen 3 β-glukosidaasien kanssa, kuten Acremonium cellulolyth cuksen (BD168028), Trichoderma viriden (AY368687) ja Talaromyces emer-soniin β-glukosidaasien (AY072918) kanssa mainitussa järjestyksessä. Koet-20 timen vahvistamiseksi Acremoniumm, Chaetomiumin ja Thermoasacuksen genomisten kirjastojen seulontaan degeneroidut aiukkeet suunniteltiin peptidise-kvenssien perusteella. Peptidien järjestys pröteiinisekvenssissä ja vastaava aiukkeiden sense- tai anti-sense-luonne pääteltiin vertailusta Homologisten julkaistujen β-glukosidaasien kanssa. Aiukesekvenssit ja vastaavat peptidit iista-25 taan taulukossa 20.
64
Taulukko 20. Oiigonukleotidit, jotka syntetisoitiin ja joita käytettiin PGR-alukkeina koettimen vahvistamiseksi Acremonium thermophiiumm ce/3A- (pG_101), Chaetomium thermophiiumm ce/3A- (pG_76) ja Thermo-ascus aurantiacuksen ce/3A-geenin (βΟ__81) seulontaan vastaavista ge-5 nomisistä kirjastoista.
Proteiini Peptidi Älukkeen AlukesekvenssJtb ___sijainti^__
AtpG_101 EKVNLT(C___GäRAARGTNääyctnac_ ___Peptidi 4 6—11__yttkccrttrttsggrgtrta_
Ctp<3„76 Peptidi 6 4-9_tntgyctncargaygg_ __Peptidi 1 3-8_tgraartgscgrtartcratr&äsag
Ta pG_ei Peptidi 3 1-5_aarggygtsgaygtscar_ ;___Peptidi 1 2-7__YTTRCCCCASGTRAASGG_ (a Aiukesekvenssin suunnitteluun käytetyn peptidin: aminohapot (b Degeneraation vähentämiseksi jotkin kodonit valittiin sienen mieltymyksen mukaisesti. N=A,
G, G tai T; R = A tai G; S = C tai G; Y = C taiT
(c Peptidi, joka ei ole peräisin puhdistetusta Acremoniumin 0G_101-proteiinista vaan on lähtoi-10 sin pG_101:n kanssa homologisesta Ä. cellulolyticuksen β-giukosidaasisekvenssistä (BD168028)
Koettimet konstruoitujen genomisten kirjastojen seulontaan vahvistettiin listatuilla alukeyhdistelmillä (taulukko 20} käyttäen Acremoniumin, Chae-15 tomiumln tai Thermoascuksen genomista DNA:ta tempiaattina. PCR-reaktioseokset sisälsivät 50 mM Tris-HGI, pH 9,0, 15 mM (NH^SO,*, 0,1 %
Triton X-100, 1,5 mM MgCi2, 0,1-0,2 mM dNTP:ejä, 0,25 μΜ kutakin aluketta, 1 yksikön Dynazyme EXT DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja likimäärin 0,5 pg genomista DNAita. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat seuraavat: 5 mi-20 nautin alkudenaturaatio 95 °C:ssa, jota seurasi 30 1 minuutin sykliä 95 °C:ssa,
1 minuutin aiukkeiden kiinnittymisvaihe 40 °C:ssa (Acremonium'm DNA tempiaattina), 50 °C:ssa (Chaetomiumm DNA tempiaattina) tai 63 °C:ssa (Thermo-asct/ksen DNA tempiaattina}, 2-3 min aiukkeiden pidentymisvaihe 72 °G:ssa ja lopullinen pidentymisvaihe 72 °G:ssa 5—10 minuutin ajan. I
25 Odotetun kokoisia (arvioitu homologisista β-glukosidaasisekvens- ] seistä BD168028, AY072918 ja AY368687) spesifisiä PCR-tuotteita eristettiin \ agaroosigeeliltä. Noin 1,8 kb:n (Acremonium), 1,5 kb:n (Chaetomium) ja 1,52 j kb:n (Thermoascus) DNA-fragrnentit kloonattiin pCR-TOPO® TA -vektoriin (In- | 5 j 65 vitrogen, USA), mikä johti plasrnideihin pALKT924, pALK1935 ja pALK1713 mainitussa järjestyksessä. DNA-tuotteet karakterisoitiin sekvensoinnilla ja suo-rittamaiia Shouthem-blottaushybridisaatioita useilta restriktioentsyymeillä di-gestoidulle genomiselle DNA:lie. Hyfaridisaatiökuviot ankarissa pesuotosuh-5 teissä ehdottavat, että yksi otaksuttu β-glukosidaasigeeni voitiin eristää Acre-moniumln, Chaetomiumm ja Thermoascuksen genomisesta kirjastosta. Kalkkien kolmen PCR-tuotteen päätellyillä aminohapposekvensseillä on homologiaa useiden julkaistujen glykosyyiihydrölaäsiperheen 3 β-giukosidasisekvenssien kanssa (BLAST-ohjelma, National Center for Biotechnology Information; Aitio schul ym., 1990).
Insertit plasmideista pALK1713, pALK1924 ja pALK1935 eristettiin restriktioentsyymidigestiolla ja leimattiin digoksigeniiniiia toimittajan ohjeiden mukaisesti ('Roche, Saksa). Noin 1-2 x TO5 plakkia vahvistetusta Acremo-n/umin, Ch&etdmiumin tai Thermoascuksen genomisesta kirjastosta seulottiin, 15 kuten kuvataan esimerkissä 18. Useita positiivisia plakkeja saatiin, joista 5-6 voimakkaasti hybridisoituvaa plakkia puhdistettiin kustakin seulonnasta. Faagi-DNA:t eristettiin ja analysoitiin Söuthern-biottaushybridisaatiolla. Koettimeen hybridisoituneet restriktiofragmentit subkloonattiin pBluescript li KS+ -vektoriin (Stratagene, USA) ja asiaankuuluvat osat sekvensoitiin. Kaikissa tapauksissa 20 subkloonattu faagifragmentti sisältää täyspitkän mielenkiinnon kohteena olevan geenin. Taulukko 21 tekee yhteenvedon β-glukosidaasigeenien seulontaan käytettyjen koettimien tiedoista, faagiklooneista, joista geenit eristettiin, valituista täyspitkät geenit promoottori- ja terminastiorialueineen sisäftävistä restriktiofragmenteista, subkloonatun faagifragmentin sisältävien plasmidien 25 nimistä ja talletusnumeroista Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-viSjelmäkokoeimassa (DSM) näitä plasmideja sisältäville E. co//-kannoiile.
66
Taulukko 21. β-glukosidaasigeenin kloonaukseen käytetyt koetti met, valitut fäagiklooni ja subklooni, pfasmidinimi ja vastaavan E. coii -kannan talietusnumero
Geeni Genominen Seulonnassa Faagi- Subkioonattu Plasmidi E. cotin kirjasto käytetty klooni fragmentti talletus- koetin numero
AtceOA A. thermophilum pAl.K1924 P44 6,0 kb Hinditi pALK1925 DSM 17325 __ALKQ4245 _______
Cl ce/3A C. thermophilain pALK1935 P51 7,0 kb Xba\ pALK2001 DSM 17667 __ALKÖ4261 ______
Ta ce/3A Zaurantiacus pALK1713 P21 5,3 kb BamHl pALK1723 DSM 16725 ___ ALK04242______j 5 Asiaankuuluvat tiedot geeneistä ja päätellyt proteiinisekvenssit {sekvenssi nrot 21-26) vedetään yhteen taulukossa 22 ja taulukossa 23 mainitussa järjestyksessä-
Puhdistettujen Acremoniumm βΘ_101- (At Cel3A), Chaetomiumin βΘ_76- (Ct Cel3A) ja T/jem?oasci/ksen pG_81-proteiinien (Ta Cel3A) pepti-10 disekvenssit löydettiin vastaavista kloonattujen geenien päätellyistä aminohapposekvensseistä varmentaen, että tarkoituksenmukaiset geenit kloonattiin.
Taulukko 22. Yhteenveto Acremonium thermophilumista, Chaetomium ihermphilum&ta ja Thermoascus aurantiacuksesta eristetyistä β-glukosl· daasigeeneistä.
β-gluko- Pituus Koodaus- Intronien Intronien Sek-
Sidaasi- intronien alue (fap)(b luku- pituus (bp) venssi geeni kanssa määrä nro ._ (bpf__________ AT ce/3A 2821__2583__3_ 92, 74, 69_ 23 __
Ct-ce/3A 2257 2202 1.__52 _ 26;_
Ta Ce/3A 3084 2529 J___134, 67, 56, 64, 59, 110, 62 _21_ 15 (a STOP-kodoni mukaan lukien {b STQP-kodonia lukuun ottamatta.
$ 67
Taulukko 23. Yhteenveto päätellyistä Acremonium thermphitumm, Chae-tommm thermophilumm ja Thermoascus aurantiacuksen β-glukosidaasi-sekvensseisiä. ss, signaalisekvenssi.
-..........-......—— --- β-glukp- Amino ss CBD1 Ennus- Ennus- Otaksutut Sek- sidaasi- happojen NN/HMM:n lettu MW tettu pl N-giyko- venssi proteiini luku- pituus*® {Da, ss:ä (ss:ä iu- syiaatio- nro määrä lukuunot- kuunotta- kohdat*0 lamatta)*® matta)
Atp(3JD1 361 19/18: Ei 91 434 5,46 8 24
Ct pG_76 734__20/20__Ei 76 457 6,3 __2__26
Ta pG_81 843 19/19 Ei 89 924 __4,95 _&__22 (a Stgnaalisekvenssin ennuste tehtiin käyttäen SignalP V3,Ö -ohjelmaa (Nielsen ym.r 1997; 5 Bendtsen yrn., 2004); NN-arvp saatiin käyttäen neuraaliverkkoja ja HMM-aryo käyttäen kitket* tyjä Markav-rnaltejä.
(b Selluloosaa sitovan domeenin läsnäolo proteiinissa (c Ennustettua signaalisekvenssiä lukuun ottamatta. Ennuste tehtiin käyttäen Compute pl/MW-työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteigerym., 2003).
10 (d Otaksutut N-glykosylaatiokohdat N-X-S/T ennustettiin käyttäen NetNGIyc 1,0 -ohjelmaa (Gupta yrn., 2004).
Acremoniumm pG_101/Ce(3A, Chaetomiumm pG_76/Cei3A ja Ther-moascuksen pG_81 /Cel3A-p~glukosidaasien päätellyillä proteiinisekvensseiilä 15 on homologiaa glykosyylihydrolaasiperheen 3 entsyymien kanssa siten tunnistaen, että eristetyt geenit kuuluvat tähän geeniperheeseen. Acremoniumm, Chaetömiumm ja Thermoascuksen β-glukosidaasien lähimmät vastineet ovat Magnaporthe grisean (p-glukosidaasi, AY849670), Neurospora crassan (hypoteettinen, XM_324308) ja Talaromyces emersonim (p-glukosidaasi, AY072918) 20 vastaavat mainitussa järjestyksessä (taulukko 24). Löydetty korkein sekvenssien identtisyys (73,2%) oii C. thermophilumm pG__76/Cei3A:n ja N. crassan hypoteettisen proteiinin identtisyys ilmaisten, että uudet entsyymigeenit kloonattiin.
: 68
Taulukko 24. Pääteltyjen Acremonium thermophilumm βΘ_101 /CelSA-. Chaetomium thermophilumm βΘ_78 /CelSA- ja Thermoascus auran-tiacuksen β6_81 /Cel3A-8~gfukosidaasien vertailu homologisten väsyneidensä kanssa. Linjaus suoritettiin käyttäen EMBOSS-ohjeimapaketin 5 Needle-ohjeimaa. ilmaisee tässä työssä kloonatulla geenillä kooditetun β-glukosidaasin.
Organismi, entsyymi ja tailetusnumero _ Identtisyys (%) * Acremonium thermophiium ββ_101 100,0
Magnaporthe grisea p-giukosidaasi, AY849670 73,1
Neurospora orassa hypoteettinen, XM__330871 71,1
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374 65,2 * Thermoascus aurantiacus BG_81 62,2
Aspergillus aculeaius β-giukosidaasi, D64088 59,5
Talaromyces emersonii p-giukosidaasi, A YO72918 58,9
Aspergillus oryzae, AX616738 58,2
Acremonium cellulolyticus β-glukosidaasi, BD168028 57,2 * Chaetomium thermophiium βΘ_76___40,9_
Chaetomium thermophiium pG„76 100,0
Neurospora erässä hypoteettinen, XM__3243Q8 76,9
Magnaporthe grisea hypoteettinen, XMJ364573 70,2
Trichoderma viridae BGi, AY368687 65,8
Acremonium cellulolyticus β-glukösidaasi, BD168028 41,2 * Acremonium thermophiium βΘ._101 40,9
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374 40,0 * Thermoascus aurantiacus βΟ„81__39,9 _ * Thermoascus aurantiacus βΘ 81 100,0
Talaromyces emersonii β-glukosidaasi, AY072918 73,2
Aspergillus oryzae, AX616738 69,5
Aspergillus aculeatus β-glukosidaasi, D64088 68,0
Acremonium cellulolyticus β-glukosidaasf, BD168028 65,7 * Acremonium thermophiium βΘ_101 62,2
Trichoderma reesei Gel3B, AY281374 57,9 * Chaetomium thermophiium βΘ_76___39,9_ 69
Esimerkki 21. Rekombinanttibetaglukosidaasien tuotanto Trichoderma reese/ssä
Ekspressioplasmidit konstruoitiin Acremoniumin pG_101 /Cel3A-, Chaetomiumm pG_76/Cef3A- ja Thermoascuksen pG_81 /CelSA-rekombi-5 nanttiproteiinien tuotantoon, kuten kuvataan esimerkissä 14. Lineaariset eks-pressiokasetit (taulukko 25) eristettiin vektorirungosta restriktioentsyymidiges-tiolla, transformoitiin T. reesein A96:een tai A33:een (molemmilta kannoilta on neljää pääseiiuiaasia: CBH!/Cei7A, CBHIi/Cel6A, EGi/Ce!7B ja EGIi/Cel5A koodittavat geenit poistettu) ja transformantit puhdistettiin, kuten kuvataan io esimerkissä 14.
Taulukko 25, Acremomum thermophUumin βθ_101 /Ce!3A-, Chaetomium thermophUumin pG_76 /Cel3A- ja Thermoascus aurantiacuksen pG_81 /Cel3A-p-glukosidaasien tuotantoon Trichoderma reeseissä konstruoidut ekspresstokaseiit. Ekspressiokasetiien kaaviomainen rakenne kuvataan 15 kuvassa 2.
β-glukosidaasi Ekspressio- Ekspressio» Heterologinen __plasmtdi__kasetin koko(a terminaattori(b
At pGjlQI ; PALK1933 10,5kbA/ofl 300 bp {Hind\\\}
Ct pG_76 pALK2ö04 10,1 kb EcoRl 528 bp (Xba\)
Ta pG_81 pALKt 914 10,9 kb EcoRl 452 bp (Apo\) |a Ekspressiokasetti T. reesei -transformaatioon eristettiin vektorirungosta EcoRl- tai Not\-digesfioiia.
<b Nukleotidien lukumäärä kloonatun geenin, joka sisällytetään ekspressiokasettiin, STOP-kodonin jälkeen ilmaistaan. Restrjktiokohta geenin 3’-päässä, jota käytettiin ekspressiokasetin 20 konstruktiossa ilmaistaan suluissa.
Transformanttien betagiukosidaasituotaniö analysoitiin ravisteiijois-sa kasvatettavien pufloviljeimien (50 ml) viljeiysupernatanteista. Transformant-teja kasvatettiin kuten esimerkissä 14 ja rekombinanttiproteiinin entsyymiaktii-25 visuus mitattiin viljelysupernatantista käyttäen 4-nitrofenyyii-p-D-glukopyrano-sidisubstraattia, kuten kuvataan julkaisussa Bailey ja Nevalainen 1981. Re-kombinanttiproteiinien tuotanto detektoitiin myös viljeiysupernatanteista SDS-poiyakryynamidigeelielektroforeesiila. Lisäksi Thermoascuksen βΘ__81 :n ilmentyminen .todennettiin VVestern-blottausanäiyysiilä anti-pG_81-vasta-aineilla, ku- 70 ten kuvataan esimerkissä 19. Valittujen transfprmanttien genotyypit analysoitiin Southern-blottauksilla käyttäen ekspressiokasettia koettimena.
Heterologisesti tuotettujen p-glukosidaasieh pH-optimi määritettiin universaalissa· Mcllvainen puskurissa pH-välilla 3,0-8,0 käyttäen 4-nitrofenyyii-5 β-D-giukopyranosidia substraattina. pH-optimit Acremoniumm pG_101:!le, C/iaetom/umin pG_76:lie ja Thermoascuksen pG_81:lie ovat pH:t 4,5, 5,5 ja 4,5 mainitussa järjestyksessä (Kuva 7A). Optimiiämpötiia näiden p-gSukosi-daasien entsymaattiseiie aktiivisuudelle määritettiin lämpötilaväliflä 50-85 °C, kuten yllä kuvataan. Entsyymien korkeimman aktiivisuuden määritettiin dievan 10 70 °C:ssa, 05 °C:ssa ja 75 °C:ssa Acremoniumln pG_101/Cei3A:ller Chaeto- miu min pG_76/Cel3A:äie ja Thermoascuksen pG_81/Cel3A:l!e mainitussa järjestyksessä (Kuva 7B).
Valittuja transformantteja viljeltiin, kuten kuvataan esimerkissä 14, 2-litran bioreaktorissa neljän päivän ajan (28 °G, pH 4,2) materiaalin saarni-15 seksi sovellustesteihih.
Esimerkki 22. Acremonium thermophilum ALK04245:n ja Thermoascus auraniiacus ALKG4242:n Rsylariaasigeemen kloonaus
Molekyylibiologian perusmenetelmiä käytettiin, kuten kuvataan esimerkissä 13. Acremoniumin genomisen kirjaston konstruktio on kuvattu esi-20 merkissä 12.
Puhdistetuista Acremoniurnm ksylanaasista peräisin olevilla peptideillä oli homologiaa glykosyyiihydrolaasiperheen 10 ksylanaasien kanssa, kuten Humicolä grisean XYNlin (AB001030). Kaikki Thermoascuksen ksy-ianaaseista peräisin olevat peptidit olivat täysin identtisiä julkaistun Thermoas-25 cus aurantiacuksen XYNA-sekvenssin (AJ132635) kanssa siten tunnistaen puhdistetun proteiinin samaksi entsyymiksi. Tämän johdosta Thermoascuksen ksyianaasigeeni vahvistettiin PCRilia genomisesta DNA:sta.
Koettimen vahvistamiseksi Acremoniumm ksyianaasigeenin seulontaan genomisesta kirjastosta degeneroidut alukkeet suunniteltiin peptidise-30 kvenssien perusteella (esimerkki 11, taulukko 5). Peptidien järjestys prote-iimsekyenssissä ja vastaava alukkeiden sense- tai anti-sense-luonne pääteltiin vertailusta homologisen Humicolä grisean XYNI-sekvenssin (AB00103Ö) kanssa. Sense-alukesekvenssi (GAYGGYGAYGCSACYTAYATG) perustuu peptidiin 3 (aminohapot 2-8) ja anti-sense-aluke (YTTYTGRTCRTAYTC- j 35 SAGRTTRTA) peptidiin 1 (aminohapot 4-11). j 71
Odotetun kokoinen (arvioitu homologisesta Humicola insolensm XYNi-sekvenssistä AB001030) PCR-iuote saatiin reaktiosta. Tämä noin 0,7 kb:n DNA-fragmentti kloonattiin pCR-TÖPO® TA -vektoriin (invitrogen, USA), mikä johti piasmidiin pALK1714 ja karakterisoitiin sekvensoinnilla. PCR-tuotteen 5 päätellyllä aminohapposekvenssinä on homologiaa useiden julkaistujen glyko-syyiihydroiaasiperheen 10 ksyianaasisekvenssäen kanssa (BLAST-öhjeima, National Center for Biotechnology Information; Altschu! ym., 1990).
Insertit plasmidista pALK1714 eristettiin restriktioentsyymidigesiiojla ja leimattiin digoksigeniinilla toimittajan ohjeiden mukaisesti (Roche, Saksa). io Noin 1-2 x 105 plakkia vahvistetusta Acremoniumm genomisesta kirjastosta seulottiin, kuten kuvataan esimerkissä 18. Useita positiivisia plakkeja saatiin, joista 5 voimakkaasti hybridisoituvaa plakkia puhdistettiin. Faagi-DNA'.t eristettiin ja analysoitiin Southern-blottaushybridisaatiolia. Koeitimeen hybridrsoitunut 3,0 kb:n Xbai-restriktiofragmentti subkioonattiin pBluescript 11 KS+ -vektoriin 15 (Stratagene, USA), mikä johti piasmidiin pALK1725. pÄLK1725:n asiaarikuulu-vai osat sekvensoitiin ja niiden havaittiin sisältävän täyspitkän Acremonium themophilumin xynlOA-geenin (sekvenssi nro 19). pALK1725 sisältävän E. goU -kannan tailetusnumero Deutsche Sarnmlung von Mikroorganismen und ZeilkuSturen GmbH-viijelmäkokoetmassa ori. DS.M1.6726.
20 Thermoascus aurantiacuksen xynlOA-geeni (sekvessi nro 17) vah vistettiin suoraan eristetystä genomisesta DNA:sta PCR-reaktiolla. Forward-{TTÄTACGGCGGGAAGCCATGGTTCGACCAACGATCCTAC) ja reverse-aiukkeet (TTATAGGATCCACCGGTCTÄTACTGÄCTGCTGCAGGTCCTG), joita käytettiin geenin vahvistamisessa, suunniteltiin julkaistun T. aurantiacuksen 25 xynA-geenin (AJ132635) perusteella. PCR-reaktioseokset sisälsivät 50 mM Tris-HGi, pH 9,0, 15 mM (NH4}2SÖ4, 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCI2, 0,3 mM dNTP:ejä, 1 μΜ kutakin aluketta, 1 yksikön Dynazyme EXT DNA-polymeraasia (Rnnzymes, Suomi) ja iikimäärin 0,5 pg Thermoascuksen ge-nomista DNA:ta, PCR-reaktion olosuhteet oi ivat seuraavat: 5 minuutin alku-30 denaturaatio 95 °C:ssa, jota seurasi 30 1 minuutin sykliä 95 °C:ssa, 1 minuutin alukkeiden kiinnittymisvaihe 60-66 °C:ssa, 3 minuutin alukkeiden pidentyrnis-vaihe 72 °C:ssa ja lopullinen pidentymisvalhe 72 0C:ssa 10 minuutin ajan, Vahvistettu 1,9 kb;n tuote, joka sisälsi tarkan geenin (START-kodonista STOP-kodpniin), kloonattiin Säcli-BamHi-fragmenttina pBluescript II KS+ -vektoriin. 35 Kolme riippumatonta kloonia sekvensoitiin ja yksi klooni valikoitiin ja nimettiin pALK1715:ksi. pALK1715:n sisältävän E coli -kannan talietusnumero Deut- 72 sche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -viljelmä-kokoelmassa on DSM 16724,
Asiaankuuluvat tiedot geeneistä ja päätellyt protelinisekvenssit (sekvenssi nrot 17-20) vedetään yhteen taulukossa 26 ja taulukossa 27 rnaini-5 tussa järjestyksessä.
Puhdistettujen Acremoniumm XYN_60 ja Thermoascuksen XYN_30-proteiinien peptidisekvenssit löydettiin vastaavista kloonattujen geenien (At xynlOA ja Ta xyrtiOA mainitussa järjestyksessä) päätellyistä aminohapposekvensseistä varmentaen, että tärkoituksenmukaiset geenit· kloonattiin.
10 Taulukko 26, Yhteenveto Acremoniutn thermophifumista ja Thermoascus aurantiacuksesta eristetyistä ksylanaasSgeeneJstä Ksylanaasi- Pituus Koodaus- Intronien intronien Sek- geeni intronien alue (bp)(b lukumäärä pituus (bp) venssi kanssa nro _ibp)(!_____i:__
Atxy/riOA 1471__1248 2__135, 85____19
TaxynlOA 1913 987 10 73, 74, 68, 103, 17 69, 65, 93, 66, ____ 100, 212___ (a STOP-kodoni mukaan lukien (b STOP-kodonia lukuun ottamatta.
73
Taulukko 27. Yhteenveto päätellyistä Äcremonium thermphilumm jja Thermoascus aurantiacuksen ksylanaasisekvensseistä. ss, signaalisek-venssi.
Ksyia- Amino- ss CBD*b Ennus- Ennus- Otak- Sek- naasi- happojen NN/HMM:r» tettu MW tettu pi sutut N- venssi proteiini iuku- pituus*® {Da, ss:ä {ss:ä )u giyko- nro määrä lukuun- kuun- sylaa otta- otta- tio- matta)(c matta) kohdat^
At XYN...60 416 19/19 Kyllä, 42 533 6,32 1 -2 20 ___W365-L416_____
Ta XYN_30 329_ 26(e__El__32 901 5,81 0__18 (a Signaalisekvenssin ennuste tehtiin käyttäen SignalP V3:0 -ohjelmaa (Nielsen ym., 1997; 5 Bendtsen ym., 2004); NN-arvo saatiin käyttäen neuraaliverkkoja ja HMM-arvo käyttäen kätkettyjä Marköv-malleja.
(b Hiilihydraattia sitovan domeenin (CBD) läsnäolo, C-terminaalisen CBD:n aminohapot ilmaistaan (numerointi tiyspitkän polypeptidin mukaisesti) (c Ennustettua: signaaiisekvenssiä lukuun ottamatta. Ennuste tehtiin käyttäen Compute pf/MW-10 työkalua ExPASy-paivelimeila (Gasteiger ym., 2003).
(d Otaksutut N-glykosyiaatiokohdat N-X-S/T ennustettiin käyttäen NetNGiyc 1,0 -ohjelmaa (Gupta ym., 2004).
(e Julkaisun; Lo Leggiö ym., 1999 mukaisesti 15 Acremoniumm ja Thermoascuksen ksylanaasien päätellyillä prote- iinisekvensseiM on homologiaa giykosyyiihydrolaasiperheen 10 useiden entsyymien kanssa, mikä tunnistaa vastaavat geenit perheen 10 ksyianaasien jäseniksi, Lähin Acremoniumm XYN_6ö/XynT0A:iie löydetty vastine on Humicoia grisean XYLI (ABÖ01030), joka osoittaa 67,1 %:n identtisyyttä XYNJ30:n 20 kanssa (taulukko 28). Eristetyn Thermoascus aurantiacuksen XYN_30/Xyn1 OA~ksylanaasin ennustettu proteiinisekvenssi on täysin identtinen julkaistun T. aurantiacuksen XYNA (P23360, taulukko 28) sekvenssin kanssa. Lähin homologia löydettiin Aspergillus nigehn ksylanaasisekvenssistä (A62445, 69,7 % identtisyys).
74
Taulukko 28. Pääteltyjen Acremonium thermophilumin XYN_60/Xyn10A-ja Thermoascus aurantiacuksen XYN_30/Xyn1OA-ksylanaasien vertailu homologisten vastineidensa kanssa. Linjaus suoritettiin käyttäen EM-BOSS-ohjeimapaketin Needle-ohjelmaa. ilmaisee tässä työssä kloonatul· 5 la geenillä koödifetun ksylanaasin.
Organismi, entsyymi ja taUetusnumero__identtisyys (%) * Thermoascus aurantiacus XYN_30 100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, P23360 100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, AF127529 99,4
Aspergillus niger ksylanaasi, A62445 69,7
Aspergillus aculeatus ksylanaasi, ARI 37844 69,9
Aspergillus terreus perheen 10 ksylanaasi, DQ087436 65,0
Aspergillus sojae, XynXI AB040414 63,8
Penicillium chrysogenum ksylanaasi, AY583585__62,5___ * Acremonium ihermophilum XYNJSÖ 100,0
Humicola grisea XYL !, AB001030 67,1
Magnaporthe grisea 70-15, hypoteettinen, XM_364947 63,8
Aspergillus acuieatus ksylanaasi, ARI 49839 53,7
Talaromyces emersonii ksylanaasi, AX4Ö3831 51,8
Gibherella zeae ksylanaasi, AY575962 51,4
Magnaporthe grisea XYL5, AY144348 48,5
Talaromyces emersonii, AX172287___46,9 _ ?
Esimerkki 23. Rekombinanttiksylanaasien tuotanto Trichoderma reese/s-sä
Ekspressiopiasmidit konstruoitiin Acremoniumin XYN_60/Xyn10A~ I
10 ja Thermoascuksen XYN_30/Xyn10A-rekombinanttiproteiinien tuotantoon, kuten kuvataan esimerkissä 14. Lineaariset ekspressiokasetit (taulukko 29) eristettiin vektorirungosta restriktiöenisyymidigestiolia, transformoitiin T. reesein A96:een ja transförmantit puhdistettiin, kuten kuvataan esimerkissä 14. j 75
Taulukko 29. Acremonium thermophilumin XYN_60/Xyn 10A- ja Thermo-ascus aurantiacuksen XYN_3G/Xyn1 OA-ksylanaas ien tuotantoon Tricho-derma reeseissä konstruoidut ekspressiokasetit. Ekspressiokasettien kaaviomainen rakenne kuvataan kuvassa 2.
Ksylanaasi E ks pressi o- Ekspressio- Heterologinen __piasmidi__kasetin koko(a terminaattori(b
At XYN_60 pALK1912 9,0 kb__150 bp (BamH\)
Ta XYN_3Q pALK1913 9,3 kb ei yhtään 5 (a Ekspressiokasetti T. reesei -transformaatioon eristettiin vektorirungosta EcoRI-digestioifa.
(b Nukleotidien lukumäärä kloonatun geenin, joka sisällytetään ekspressiokasettiin, STOP-kodonin jälkeen ilmaistaan. Restriktiokohta geenin 3'-päissät jota käytettiin ekspressiokasetin konstruktiossa, ilmaistaan suluissa.
1Ö Transformanttien ksylanaasituotanto analysoitiin ravistelijoissa kas vatettavien pulioviljelmien (50 ml) viijeiysupematanteista. Transformantteja kasvatettiin kuten esimerkissä 14 ja rekomblnantin proteiinin entsyymiaktiivisuus mitattiin viljeiysupernatantlsia pelkistävien sokerien vapautumisena koivun ksylaanista (1 paino/tiiavuus-%) 50 0C:ssa 50 rnM sitraattipuskurissa pH 15 5,3, kuten kuvataan julkaisussa Bailey ja Poutanen 1989. Rekombinanttiprote- iinin tuotanto analysoitiin myös viljelysupernatanteista SDS-polyakryyliarnidi-geelieiektroforeesilla. Lisäksi molempien ksylanaasien ilmentyminen määritettiin Western-biottausanalyysiiia anti-XYN_3Q- tai anti-XYN_60-vasta-ainei!ia, kuten kuvataan esimerkissä 19, Valittujen transformanttien genotyypit analy-20 soitiin Southern-blotiauksilla käyttäen ekspressiokasettia koettimena.
Thermoascukseh XYN_30/Xyn10A tuotettiin T. reeseissä ja hetero-logisesti tuotetun proteiinin pH-optimi määritettiin universaalissa Mciivainen puskurissa pH-väiillä 3,0-8,0 käyttäen koivun ksyiaania substraattina (Kuva 8A). Optimaalisen pH:n määritettiin olevan 4,5. Lämpötilaoptimin XYN_30:n 25 entsymaattiseile aktiivisuudelle määritettiin olevan 75 °C (Kuva 8B).
Valittuja transformantteja vifjeltiin* kuten kuvataan esimerkissä 14, 2-iitran bioreakforissa neljän päivän ajan (28 °G, pH 4,2) materiaalin saamiseksi soveliustesteihin.
76
Esimerkki 24. Rekombinanttisellobiohydroiaasien suorituskyky hydro-iyystssä
Puhdistettujen rekombinanttiseliobiohydrolaasien suorituskyky arvioitiin hydroiyysitutkimuksissa puhdistetuifla T. reesein entsyymeinä. Hydroiyysi 5 suoritettiin puhdistettujen entsyymien kontrolloiduilla seoksilla useille esikäsitel-lyiiie substraateille. 7 reesein viijelysuodokset, jotka sisälsivät erilaisia kloonattuja CBH/Ge|7-entsyymejä, saatiin, kuten kuvataan esimerkeissä 14 ja 15, ja CBH-enisyymit puhdistettiin afiiniteettikromatografiaila, kuten kuvataan esimerkissä 2. Lisäksi puhtaita 7 reesein seliuiaaseja (puhdistettu, kuten kuya-10 taan julkaisussa Suurnäkki ym., 2000) käytettiin entsyymiseoksissa. Kokeessa käytetyt seiiobiohydrolaasit olivat:
Thermoascus aurantiacus ALK04242:n CBH (Ta CelTAJ Thermoascus aurantiacus ALK04242:n CBH (Ta Cei7A), johon oil geneettisesti liitetty Trichoderma reesein CBD (Ta Ce!7A + Tr CBD) 15 Thermoascus aurantiacus ALK04242:n CBH (Ta Cel7A), johon oli geneettisesti liitetty Chaetomium thermophilumm CBD (Ta Cel7A + Ct CBD) Acremönium thermophilum ALK04245:n CBH (At Cel7A) Chaetomium thermophifum ALK04265:n CBH (Ct Cel7A) 20 Kutakin testattavaa CBH/Cei7:ää (annos 14,5 rng/g substraatin kuivamateriaalia) käytettiin joko yhdessä T reesein EGil/Cel5A:n (3,6 mg/g) kanssa tai seoksen kanssa, joka sisälsi T. reesein EGI/CeJ7B:tä (1,8 mg/g), EGIi/Gel5A:ta (1,8 mg/g), ksyianaasi pi 9:äi (Tenkanen ym. 1992) (5000 nkat/g) ja asetyyiiksylaanjesteraasia (AXE) (Sundberg ja Poutanen, 1991) (250 nkat/g). 25 Kaikkia seoksia täydennettiin lisäksi β-giukosidaasiila kaupallisesta entsyyml-vaimisteesta Noyozym 188 (176 nkat/g dejonisoitua vettä). Kolmea putkea, jotka sisälsivät entsyymiseoksen ja 10 mg (kuivamateriaalia)/mi substraattia suspendoftuna 0,05 M natriumasetaattiin, inkuboitiin sekoittaen magneetti-sekoituksella 45 °C:ssa 48 tunnin ajan. Referenssinäytteet inaktivoitujen ent-30 syymien ja vastaavien substraattien kanssa valmistettiin myös. Hydralyysituot-teiden vapautuminen mitattiin pelkistävinä sokereina DNS-menetelmäliä käyttäen glukoosia standardina (taulukko 30).
Seuraavia substraatteja käytettiin kokeessa:
Kiteinen selluloosa (Avicef) 77
Pesty höyryltä esikäsitelty kuusikuitu {kyllästäminen 3 paino/paino-% S02:!la 20 minuutin ajan, jota seurasi esikäsittely höyryllä 215 pC:ssa 5 minuutin ajan), kuiva-aines 25,9 % (SPRUCE),
Pesty märkähapetettu maissinkorjuujätekuitu (W0GS) 5 Pesty höyryllä esikäsitelty pajukuitu (esikäsittely 14 minuutin ajan 210 °C:ssa), kuiva-aines 23,0 % (WILLOW)
Taulukko 30. Hydroiyysituptteet CBH-entsyymeillä (45 ®C pH 5,0). Reaktiotuotteet 48 tunnin hydrolyysin jälkeen pelkistävinä sokereina (mg/ml), niitattu glukoosi standardina. Lyhenteet: CBH = sellobiohydrolaasi; EGi = to T. reese/n endoglukanaasi I (CelTBJ, EGII = T. reese/n endoglukanaasi li (CelSA); bG = β-giukosidaasi (Novozym f88:sta); XYL = T. reese/n ksy-lanaasi pi 9 (XYN li), AXE = T, reese/n aselyyliksylaaniesteraasi; nd ~ ei tehty.__
Entsyymit_________Substraatit___
CBH Lisäentsyymit Avicel SPRUCE WOGS WILLOW
Ta Cel7A 'EGII, bG 2,0 2,0 2,8 2,0
Ta Cel7A + Tr CBD EGi!, bG 5,8 4,0 4,4 4,0
Ta: Cel7Ä + CtCBD EGII, bG 4,9 3.7 4,6 3,7
At Cel7A EGII, bG 5,3 3,3 4,5 3,3
GtCe]7A EGII, bG 6,0 2,6 3,4 2,6 T. reese/n Ce!7A_ EGII, bG__4,7 2,9__2$__2^9_
Ta Cei7Ä EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 4,3 2,8
Ta Cel7A + Tr CBD EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 7,2 5,9
Ta Ce!7A + Ct CBD EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 7,2 5,6
At CelTA EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 6,4 5,4
Ct Cel7Ä EGO, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 5,6 4,0 T. reesein Cel7A EGII, EGI, XYL, AXE, bG nd nd 6,0 4,1_ 15 Taulukossa 30 erilaisia seliobiohydrolaaseja on verrattu samojen proteiiniannosten perusteella hydrolyysissä. Tulokset osoittavat, että seliuioo-sasubstraateilla (Avicel ja kuusikuitu) Thermoascus aurantiacuksen Cei7A, johon on geneettisesti liitetty CBD, osoitti selvästi korkeampaa hydrolyysiä kuin T. reese/n GBHl/Cel7A. Ilman OBD:a T. aurantiacuksen Cel7A oli tehottomam-20 pi näillä substraateilla. Acremonium thermophilumin ja Ghaetomium thermophi-lumirt sellobiohydrolaasien suorituskyky oli parempi kuin T. reese/n 78 CBHl/Ce(7A:n suorituskyky useilla substraateilla; etenkin C. thermophilumm Ce!7A osoitti korkeaa tehokkuutta puhtaalla selluloosalla (Avicel).
Substraattien, jotka sisältävät huomattavia määriä hemioseiluioosaa (paju ja maissinkorjuujäte) tapauksessa GBH/Ce!7-entsyymit selvästi tarvitsivat 5 lisäksi sekä hemiseliulaaseja että endoglukanaaseja suoriutuakseen tehokkaasti. Jos lisähemiseliulaaseja ei ollut läsnä,. T. aurantiacuksen Cel7A, johon on geneettisesti liitetty GBD, osoitti jälleen selvästi korkeinta hydrolyysiä. Tärkeimpien hemiseiluloosaa hajottavien entsyymien (ksylanaasi, asetyyliksy-iaaniesteraasi ja EGI) kanssa T. aurantiacuksen Cel7A, johon on geneettisesti io liitetty GBD, suoriutui jälleen korkeimmalla tehokkuudeiia. A thermophilumm Ce(7A oli tehokkaampi kuin T. reese/n entsyymi ja G. thermophilumm Cel7A tuotti hydrolyysituotteita samalla tasolta kuin T. reese/n CBHI/Cei7A. T. reese/n selluloosaa sitova domeeni näytti antavan hieman paremman tehokkuuden kuin C. thermophHumin CBD T. aurantiacuksen Cel7A:n hydrolyyttisessä suori-15 tuskyvyssä, vaikkakin ero oli melko pieni.
Voidaan päätellä, että kun CBHI/Ce!7A korvattiin Trichoderman entsyymien seoksessa tässä tuotetuilla sellobiohydrolaaseilla, hydroiyysitehok-kuUS tällä koejärjestelyllä pääteltynä oli selvästi parantunut T. aurantiacuksen Ce!7A;n tapauksessa, johon on geneettisesti liitetty GBD, ja parantunut myös 2D A. thermophiiumm Cel7A:n ja C. thermöphiiumm Cei7A:n tapauksessa. Ottaen l huomioon myös paremmat tässä tuotettujen seilobiohydrolaasien lämpötila- j
stabiiliudet tulokset ilmaisevat, että sellulaasientsyymiseosten suorituskykyä I
korkeammissa lämpötiloissa kuin 45 °C voidaan selvästi parantaa käyttämällä l tässä tuotettuja seliobiohydrolaaseja. | 25 Esimerkki 25. Rekombinanttisellobiohydrolaasieri suorituskyky hydro- | lyysissä j
Endoglukanaaseja sisältäviä valmisteita verrattiin hydroiyysitutkf- j mukeissa sekoitettuna puhdistettujen CBH/Cef7~ ja GBH/Cei6-entsyymien j kanssa useille esikäsitelyiile substraateille. T. reesein viljelysuodokset, jotka j 30 sisälsivät erilaisia kloonattuja endoglukanaasientsyymejä, saatiin, kuten kuvataan esimerkeissä 19. Entsyymit rikastettin poistamalla termisesti labiileja pro- j teiineja seoksista kuumakäsittelyilä (60 °C, 2 h, pH 5) ja supernatantit käytettiin j
hydroiyysitutkimuksiin. Lisäksi puhtaita T. reesein seiluiaaseja (puhdistettu, ku- I
ten kuvataan julkaisussa Suurnäkki ym., 2000) käytettiin entsyymiseoksissa. j 35 Kokeessa käytetyt endoglukanaasit olivat: | j | 79
Acremonium thermophifum ALK04245:n endoglukanaasi
At EG_40/CeS45A (ALK04245 EG_40)
Acremonium thermaphiium ALK04245:n endoglukanaasi
At EG_4QJike/Ce!45B (ALK04245 EG_40Jike) 5 Thermoascus aurantiacus ALK04242;n endoglukanaasi
Ta EG_28/Ce!5A (ALK04242 EG_28)
Seuraavia substraatteja käytettiin kokeessa:
Pesty höyryllä eslkisiteity kuusikuitu (kyllästäminen 3 paino/paino-% 10 SGzilia 20 minuutin ajan, jota seurasi esikäsittely höyryllä 215 °C:ssa 5 minuutin ajan), kuiva-aines 25,9 % (SPRUCE).
Höyryräjäytetty maissinkoruujätekuitu (esi-käsitelty höyryllä 210 °C:ssa 5 minuutin ajan), kuiva-aines 31,0 % (SECS)
Tutkittavia endoglukanaaseja (annos 840 nkat/g kuiva-ainesta, pe-15 ruskien edoglukanaasin aktiivisuuteen HEC:ä kohtaan IUPAC:n mukaisesti 1987) käytettiin joko T. reesein sellobiohydrolaasien kanssa (GBH!/Cei7A, 8,1 mg/g kuiva-ainesta ja CBHII/Cel6A, 2,0 mg/g kuiva-ainesta) tai Thermoascus auran-tiacuksen Gei7A:n kanssa (10,1 mg/g kuiva-ainesta), johon oli geneettisesti liitetty T. reesein CBD. Puhdistetut (Suurnäkki ym„ 2000) T reesein EGI 20 (Cei7B) ja EG1I (Ce!5A) sisällytettiin myös kokeisiin vertailun vuoksi. Kaikkia seoksia täydennettiin lisäksi β-glukosidaasilia Novözym 188:sia (β-giukosi-daasin kokonaisannoksen 560 nkat/g kuiva-ainesia tekemiseksi, suhteellisen korkeaa annosta käytettiin kompensoimaan erilaisten EG-valmisteiden tausta-aktiivisuuksien eroja). Kolmea putkea inkuboitiin sekoittaen 45 °C:ssa 48 tun-25 nin ajan ja referehssinäytteitä inaktivoitujen entsyymien ja vastaavien substraattien kanssa valmistettiin. Nydrolyysituotteiden vapautuminen mitattiin pelkistävinä sokereina DNS-meneteimällä käyttäen glukoosia standardina (taulukko 31).
80
Taulukko 30. Hydroiyysituotteet erilaisilla endoglukanaasivaimisteilla, kun käytetään yhdessä T. teesein seflobjohydrolaasien tai T. aurantiacuksen Cei7A:n, jolla on T, reesein CBD, kanssa. Reaktiotuotteet 48 tunnin hydrolyysin jälkeen (48 °C, pH .5,0) pelkistävinä sokereina (mg/ml), 5 mitattu glukoosi standardina. Lyhenteet: CBHI = T. reesein sellobiohyd-rolaasi I (Cel7A); CBHll ~ T. reesein sellobiohydrolaasi li (Cel6A); EGl = T. reesein endogiukanaasi 1 (Ce!7B), EGif - T. reesein endoglukanaasi 11 (Cel5A); bG = β-glukosidaasi (Novozym 188:sta); nd. » ei tehty.
Entsyymit__Substraatit_
Endogiukanaasi CBH/CelT__SPRUCE SECS
ei lisättyä EG:a T. reesein CBHi ja CBHll 2,4 3,2 EGi T. reesein CBHI ja CBHI! 3,5 4,6 EGIi T, reesein CBHI ja CBHll 3,8 3,5
At EG_40 T. reesein CBHI ja CBHll 4,9 4,3
At EG_40!ike T. reesein CBHI ja CBHll 4,5 4,8
Ta EG.,28___T. reesein CBHI ja CBHll__3$_ 3,9 ei lisättyä EG:a T. aurantiacuksen Cel7A + Tr CBD 1,8 2,1 EGl T. aurantiacuksen Cel7A + Tr CBD nd. 4,2 EGII T. aurantiacuksen Ce!7A + Tr CBD 3,2 nd.
At EG_40 T. aurantiacuksen Cel7A + Tr CBD 4,8 4,0
Ta EG_28 T. aurantiacuksen Cel7A + Tr CBD 1,5 nd.
10 Taulukossa 31 erilaisia endogiukanaaseja on verrattu samojen ak- tiivisuusannosten perusteella hydrolyysissä. Tämä voi suosia entsyymejä, joilla on matala spesifinen aktiivisuus kokeessa käytettyä substraattia (hydroksyy-lietyyliseliuloosa) kohtaan ja aliarvioida sellaisten entsyymien tehokkuutta, joilla on korkea spesifinen aktiivisuus hydroksletyyliseiluloosaa kohtaan. Joka ta- 15 pauksessa tulokset osoittavat, että Acrernonium thermcphilumm endogiu-kanaasit suoriutuvat erittäin hyvin hydrolyysissä, kun vaikuttavat yhdessä molempien seoksessa käytettyjen seilobiohydrolaasien kanssa. A. fbermopbifu-min endoglukanaaseilia on samanlainen suorituskyky kuin T. reesein EGI/Gei7B:|lä, joka on erittäin tehokas entsyymi hemiselluloosaa sisältävälle 20 maissinkorjuujätesubstraatille johtuen sen voimakkaasta ksylanaasisivuaktiivl· suudesta. T aurantiacuksen endogiukanaasi Ce!5A (ALK04242 EG_28J osoitti matalampaa hydroiyysiä kuin T. reesein entsyymit.
81
Voidaan päätellä, että kun endoglukanaasit A. thermophilumista suoriutuvat vastaavalla tai lisääntyneellä tehokkuudella, kun verrataan vastaaviin Trichoderman entsyymeihin hydrolyyslssä tällä koejärjestelyllä pääteltynä.
Ottaen huomioon myös tässä kuvattujen endoglukanaasien lämpötiiastabiiiiu-s den tulokset ilmaisevat, että sellulaasientsyymiseosien suorituskykyä korkeammissa lämpötiloissa kuin 45 °C voidaan parantaa käyttämällä tässä kuvattuja endoglukanaaseja.
Esimerkki 26. Höyryllä esikäsitellyn kuusen hydroiyysi korkeissa lämpötiloissa 10 Pestyä höyryräjäytettyä kuusikuitua (kyllästäminen 3 painD/paino-% SOz:lla 20 minuutin ajan, jota seurasi esikäsittely höyryllä 215 °G:ssa 5 minuutin ajan), jolla oli 25,9 %:n kuiva-aines, suspendoitiin 5 ml:aan 0,05 M natrium-asetaattipuskuria 10 mg/ml koostumuksessa. Tämä substraatti hydrolysoitiin käyttäen erilaisia entsyymiseoksia koeputkissa magneettisekoituksella vesi-15 hauteessa, joka oli säädetty eri lämpötiloihin, 72 tunnin ajan. Kullekin näyte-kohdalle kolme koeputkea otettiin pois hydroiyysistä, keitettiin 10 minuutin ajan entsyymihydroiyysin lopettamiseksi, sentrifugoitiin ja supernatantti analysoitiin reaktiotuotteiden hydroiyysistä suhteen. Myös nollanäytteitä, jotka sisälsivät pelkkää substraattia (vain puskuri lisättiin entsyymien sijaan), inkuboitiin vas-20 taavissa olosuhteissa.
Termofiilisten selluiaasien seos vaimistettin käyttäen seuraavia ainesosia: Törmofiilinen GBH/Cei7-vaimiste, joka sisältää Thermoascus auran-tiacus ALK04242:n Cei7A:n, johon on geneettisesti liitetty T. reesein 25 GBHI/Gel7A:n CBD. Proteiinivalmiste tuotettiin kuten kuvataan esimerkissä 15 ja puhdistettiin esimerkin: 2 mukaisesti, mikä johti puhdistettuun Ta Cel7A + Tr CBD -valmisteeseen, jonka proteiinipitoisuus on 5,6 mg/ml.
Termofiilinen endogiukanaasivalmiste, joka sisältää Acremonium thermophilum ALK04245:n endogiukanaasia At EG_40/Cei45A. Proteiini tuo-30 tettiin T. reeseissä, kuten kuvataan esimerkissä 19. Termofiilisten ainesosien rikastamiseksi käytettyä kasvuliuosta kuumakäsiteitiin (60 °C 2 tunnin ajan).
Saatu valmiste sisälsi proteiinia 4,9 mg/ml ja endogiukanaasiaktiMsuus (iU-PAC:n mukaisesti 1987) 422 nkat/mf.
Termöfiiiinen β-glukosidaasivalmiste, joka valmistettiin kuten kuva-35 taan esimerkissä 21 ja joka sisältää Thermoascus aurantiacus ALK04242:n β-giukpsidaasia Ta pG_81/Cel3A. Termofiilisten ainesosien rikastamiseksi bio- i 82 reaktorin liemi kuumakäsiteltiin (65 °C 2 tunnin ajan). Saatu valmiste sisälsi 4,3 mg/ml proteiinia ja 6270 nkat:n/m! p-glukosidaasiaktiivisuuden (julkaisun Bailey ja Linko, 1990, mukaisesti).
Nämä entsyymivaimisteet yhdistettiin seuraavasti (10 mi seosta 5 kohti): CBH/Cel7-vaimiste 4,51 ml, endogiukanaasivalmiste 5,19 ml ja β-giuko-Sidaasivalmiste 0,29 ml. Tätä seosta käytettiin termofiiiisten entsyymien "SEOKSENA 1".
Vertailuna ja referenssinä tunnetun tekniikan mukaisia kaupallisia Trichoderma rees&In entsyymejä konstruoitiin yhdistämällä (10 ml.:aa kohti): to 8,05 mi Celiuelast 1,5 L FG (Novozymes A/S:stä) ja 1,95 ml Novozym 188 (Novozymes Ä/S:stä). Tämä nimettiin “T. REESEIM ENTSYYMEIKSi”,
Entsyymejä annosteltiin seosten FPU-aktiivisuuden perusteella: ’’SEOS 1” käyttäen 5,5 FPU:n annosta 1 grammaa kuiva-ainesta kohti kuu-sisubstraatissa ja "T. REESEIH ENTSYYMEJÄ” käyttäen 5,8 FPU 1 grammaa 15 kuiva-ainesta kohti kuusisubstraatissa.
Näytteet otettiin hydrolyysistä 24, 48ja 72 tunnin jälkeen ja käsiteltiin, kuten kuvataan yllä. Hydrolyysituotteet määritettiin käyttäen koetta pelkistäville sokereille (Bernfeld, 1955) käyttäen glukoosia standardina. Hydroiyysi-tuotteiden määrä pelkistävinä sokereina esitetään kuvassa 9.
20 Tulokset osoittavat seivästi tässä kuvattujen entsyymien parempaa j suorituskykyä verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin Trichoderman entsyy- j meihin 55 °C:ssa ja 60 °C:ssa kuusisubstraatiila. HPLG-analyysin perusteeiia sokerien maksimisaanto substraatista olisi 5,67 mg 10 mg kuivakuusisubst- i raattia kohti. Entsyymin suhteellisen matalan annoksen vuoksi lopullinen soke- j 25 risaanto oli seivästi matalampi. Termisesti stabiileille entsyymeille sokerisaanto j pelkistävän sokerikokeen perusteella oli 66 % ja 57 % teoreettisesta 55 0C:ssa ja 60 °C:ssa mainitussa järjestyksessä. Tunnetun tekniikan mukaisille Tricho- 1 dermau entsyymeille se oli vain 31 % ja 11 % 55 °C:ssa ja 60 °C:ssa mainitus- \ sa jäijestyksessä, j 30 Esimerkki 27. Höyryllä esikäsiteliyn maissinkorjuujätteen hydrolyysl korkeissa lämpötiloissa j Höyryräjäytettyä maissinköijuujätekuitua (käsittely 195 °C:ssa. 5 mi- j nuutin ajan), jolla oli 45,3 %:n kuiva-aines, suspendoitiin 5 m!:aan 0,05 M nai- | riumasetaattlpuskuria 10 mg/ml;ssa koostumuksessa. Käsittelyt ja mittaukset j 35 suoritettiin, kuten kuvataan esimerkissä 26. | j 83 Tässä kuvattujen termofiiiisten sellulaasien seos konstruoitiin käyttäen seuraayia ainesosia:
Termofiilinen CBH-valmiste, joka sisältää Thermoascus aurantiäcus ALK04242:n Cel7A:n, johon on geneettisesti liitetty T. teesein CBHi/Cel7A;n 5 GBD (Ta Ce!7A + TrCBD, esimerkki 15), Valmisteen proteiinipitoisuus oli 31 mg/mi,
Termofiilinen endoglukanaasivaimiste, joka sisältää Acremonium thermophilum ALKQ4245:n endoglukanäasia At EG_40/Cel45A saatiin kuten kuvataan esimerkissä 19. Väkevöity entsyymivaimiste sisälsi 2057 nkat/mi:n endogiukanaasiaktiivisuuden (IUPAC:n mukaisesti 1987). to Termofiilinen β-glukosidaasivalmiste, joka sisältää Thermoascus au-· rantiacus ALK04242:n β-glukosldaasiä Ta pG_81/Ce!3A saatiin, kuten kuvataan esimerkissä 21, joka sisältää 11500 nkat/mi:n β-giukosidaasiaktiivisuuden (julkaisun Bailey ja Linko, 1990).
Termofiiinen ksylanaasituote, joka sisältää AM24-ksyianaasia, joka 15 on lähtöisin Nonornuraea ffexudsa DSM43186:sta. Tuote valmistettiin käyttäen rekombinantiia Trichod&rma reese/'-kantaa, joka oli transformoitu ekspres-siokasetilia pALK1502, kuten kuvataan julkaisussa WO 2005/100 557. Kiinteä tuote iiuotettiin veteen 10-prosenttisen liuoksen tekemiseksi ja entsyymivaimiste, joiia oli 208 000 nkat:o/ml ksylanaasiaktiivisuus (analysoitu julkaisun Baiiey 20 ym., 1992 mukaisesti), saatiin.
Nämä entsyymiyalmisteet yhdistettiin seuraavasti (10 ml seosta kohti): GBH/Cel7-valmiste 7,79 ml, endoglukanaasivaimiste 0,96 ml ja β-gluko-sidaasivalmiste 1,14 ml ja ksyianaasivalmiste 0,31 ml. Tätä seosta käytettiin termofiiiisten entsyymien "SEOKSENA 2".
25 Vertailuna ja referenssinä tunnetun tekniikan mukaisia kaupallisia
Trichoderma reesein entsyymejä konstruoitiin yhdistämällä (10 ml:aa kohti): 8,05 ml Celluclast 1,5 L FG (Novozymes A/S:stä) ja 1,95 ml Novozym 188 (Novozymes A/S:stä). Tämä nimettiin "T. REESEIN ENTSYYMEIKSI”.
Näytteet otettiin hydroiyysistä 24, 48 ja 72 tunnin jälkeen ja käsitei-30 tiin, kuten yllä kuvataan. Hydroiyysituotteet määritettiin käyttäen koetta pelkistäville sokereille (Bernfeid, 1955) käyttäen glukoosia standardina. Tulokset substraattinollanäytteistä vähennettiin näytteistä, joissa oli entsyymejä, ja hyd-roiyysituotteiden pitoisuus pelkistävinä sokereina esitetään kuvassa 10.
Tulokset osoittavat selvästi tässä kuvattujen entsyymien parempaa 35 suorituskykyä verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin Trichoderman entsyymeihin, 45 °C:ssa termofiiiisten entsyymien seos osoitti tehokkaampaa hydro- l 84 lyysiä verrattuna T. reesein entsyymeihin: Hydrolyysi oli nopeampi ja korkeampia sokerisaantoja saatiin myös. HPLC-anaiyysin perusteella sokereiden mak-simisaanto (mukaan lukien vapaat liukoiset sokerit pesemättömässä substraatissa, jota käytettiin) substraatista olisi 5,73 mg 10 mg kuivaa substraattia kohti.
5 Siten hydrolyysi SEOKSEN 2 entsyymeillä oli lähes täydellinen 48 tunnin sisällä. 55 °G:ssa ja 57,5 QC:ssa tässä kuvatut termofiiliset entsyymit osoittivat myös selvästi parempaa suorituskykyä hydrolyysissä verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin Trichodermä-entsyymeihin.
Esimerkki 28. Esikäsitellyn maissinkorjuujätteen hydrolyysi korkeissa 10 lämpötiloissa käyttäen termisesti stabiileja ksyianaaseja sisältävää seosta
Esimerkissä 27 selitetty menettely toistettiin paitsi, että ksyianaasi-tuote XT Q2026A3 korvattiin termofiilisellä ksylanaasivaimisteelia, joka sisälsi F, reese/ssä tuotetun Thermoasms aurantiacus ALKÖ4242:n ksyianaasin Ta 15 XYN_30/Xyn10A. Esimerkissä 23 kuvatulia tavalla tuotettu bioreaktorin liemi sisälsi 132 000 nkat:n /mi ksylanaasiaktiivisuuden (analysoitu julkaisun Bailey ym., 1992 mukaisesti).
Nämä entsyymivaimisteet yhdistettiin seuraavasti (10 mi seosta kohti): CBH/Cel7-valmiste 7,64 ml, endoglukanaasivalmiste 0,96 ml, β-glukosi-20 daasivalmiste 1,15 ml ja ksylanaasivalmiste 0,25 ml. Tätä seosta käytettiin termofiilisien entsyymien ’’SEOKSENA 3".
Vertailuna ja referenssinä tunnetun tekniikan mukaisia kaupallisia Trichoderma reesein entsyymejä konstruoitiin yhdistämällä (10 rhkaa kohti): 8,05 mi Celluclast 1,5 L FG (Novozymes A/S:stä) ja 1,95 ml Novozyrn 188 25 (Novozymes A/S:stä). Tämä nimettiin ” T. REESEIN ENTSYYMeiKSr.
Näytteet otettiin hydrqlyysistä 24, 48 ja 72 tunnin jälkeen ja käsiteltiin, kuten kuvataan yllä. Hydrolyysituotteet määritettiin käyttäen koetta pelkistäville sokereille (Bernfeld, 1955) käyttäen glukoosia standardina. Tulokset substraattinollanäytteistä vähennettiin näytteistä, joissa oli entsyymejä, ja hyd-30 roiyysituotteiden pitoisuus pelkistävinä sokereina esitetään kuvassa 11.
Tulokset osoittavat selvästi tässä kuvattujen entsyymien seoksen parempaa suorituskykyä verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin Trichoderma-entsyymeihin. 45 °C:ssa termofiilisten entsyymien seos osoitti tehokkaampaa hydrolyysiä verrattuna T. reesein entsyymeihin. 55 °G:ssa ja 60 °C:ssa tässä 35 kuvatut termofiiliset entsyymit osoittivat seivästi parempaa suorituskykyä hydrolyysissä verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin Trichoderma~entsyymeihin.
85
Uuden entsyymiseoksen suorituskyky 60 °C:ssa oii samaiia tasolla kuin tunnetun tekniikan mukaisten entsyymien suorituskyky 45 °C:ssa.
Esimerkki 29. Esikäsiteiiyn kuusen hydroiyysi korkeissa lämpötiloissa käyttäen termisesti stabiilia ksyianaasia sisältävää seosta 5 Esimerkissä 28 kuvatun mukainen menettely toistettiin pestyllä höy- ryräjäytetyllä kuusikuiduiia (kyliästäminen 3 paino/paino-% S02:lia 20 minuutin ajan, jota seurasi esikäsittely höyryllä 215°C:ssa 5 minuutin ajan, 25,9 %:n kuiva-aines) substraattina käyttäen hydrolyysiiampötifoja 45 °C, 55 °C ja 60 °C. Näytteet otettiin hydrolyysistä 24, 48 ja 72 tunnin jälkeen ja käsiteltiin, kuten 1:0 kuvataan yllä. Hydrolyysituotteet määritettiin käyttäen koetta pelkistäville sokereille (Bemfeld, 1955) käyttäen glukoosia standardina. Tulokset suhstraattinoi-laniytteistä vähennettiin näytteistä, joissa oli entsyymejä, ja hydroiyysituottei-denpitoisuus pelkistävinä sokereina esitetään kuvassa 12.
Tulokset osoittavat seivästi tässä kuvattujen entsyymien seoksen 15 parempaa suorituskykyä verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin Trrchoderma-entsyymeihin kaikissa tutkituissa lämpötiloissa. 45 °C:ssa termofiilisten entsyymien seos osoitti tehokkaampaa hydroiyysiä venattuna T. reesein entsyymeihin, ilmeisesti johtuen paremmasta stabiiliudesta pitkäaikaisessa hydrolyy-sissä. 55 °C:ssa tässä kuvattujen entsyymien seoksen tehokkuus oli edelleen 20 samalla tasolla kuin 45 °C:ssa, kun taas tunnetun tekniikan mukainen seos oli tehoton käytetyn substraatin kanssa tässä lämpötilassa. 60 °C:ssa tässä kuvatut termofiiiiset entsyymit osoittivat vähentynyttä hydroiyysiä, vaikka hydroiyysi oli lähes samaiia tasolla kuin tunnetun tekniikan mukaisien entsyymien suorituskyky 45 °C:ssa.
25 Esimerkki 30. β-glukosidaasien Acremomum thermophiium ALK04245:stä, Chaetomium thermphiium ALK04261:stä ja Thermoascus aurantiacus ALK04242:sta glukoosi-inhibition arviointi
Acremonium thermophiium ALK04245-, Chaetomium thermphiium ALKQ4261- ja Thermoascus aurantiacus ALK04242 -kannoilla tuotetut viije-30 iysuodokset kuvataan esimerkissä 1. Näiden valmisteiden β-glukosidaasiaktii-visuudet (mitattu julkaisun Bailey ja Linko, 1990 mukaisesti) olivat 21,4 nkat/mi, 5,6 nkat/ml ja 18,6 nkat/mi mainitussa järjestyksessä. Vertailun vuoksi kaupalliset entsyymit Ceifuciast 1,5L (β-giukosidaasi 534 nkat/ml) ja Novozym 188 (β-glukosidaasi 5840 nkat/ml) myös sisällytettiin kokeeseen.
86
Erilaisten β-giukosidaasien herkkyyden glukoosi-inhibltiota kohtaan arvioimiseksi perusaktiivisuuskoemenetteiy suoritettiin erilaisten glukoosipitoi-suuksien ollessa läsnä. Substraattiliuokset (p-nitrofenyyli-p-D-glukopyranosidi) β-glukosidaasiaktiivisuuskokeeseen täydennettiin glukoosilla niin, että glu-5 koosipitoisuus koeseoksessa säädettiin arvoihin 0-0,5 M. Tätä glukoosHisäys-tä iukuun ottamatta koe suoritettiin käyttäen perusmeneftelyä (Bailey ja linko, 1990). Aktiivisuudet vaibielevien giukoosipitoisuuksien ollessa läsnä prosentteina aktiivisuudesta ilman glukoosia esitetään kuvassa 13.
Tulokset osoittavat, että glukoosi-inhibitio vaikutti vähemmän β-glu-10 kosidaaseihin C. thermophilumlsia ja. T. aumntiacuksesta kuin kaupallisissa, entsyymeissä läsnä oleviin β-glukosidaaseihin: Aspergillus-peräinen β-glukosi-daasi Novozym 188:ssa tai Trichoderma- perä i n en β-giukosidaasi Celluclast 1,5 L;ssä. A. thermophilumm entsyymi osoitti Celiuclastin T. reesetn entsyymiä vastaavaa käytöstä. Erityisesti korkea glukppsipitoisuus vaikutti selvästi vä-15 hemmän C. thermophilumin entsyymiin. Siten nämä tulokset ilmaisevat, että ottaen huomioon g I u koosi-i h h i bition uusien β-giukQsidaasien käyttö, erityisesti kannoista Acremonium thermophifum ALK04242 ja Chaetomium ihermophi-lum ÄLK04261, antaisi selvän edun hydrolyysissä teollisissa olosuhteissa korkean glukoqsipitoisuuden kanssa.
20 Esimerkki 31, Entsyymiseosfen suodatinpaperiaktiivisuus korkeissa lämpötiloissa
Entsyyrnivalmisteiden suodätinpaperiaktiMsuus mitattiin IUPAC:n (1987) menetelmän mukaisesti, kuten kuvataan menettelyssä paitsi, että eni-syymireaktio suoritettiin lämpötiloissa 50-70 °C. Laskettu FPU-aktiivisuus pe-25 rustuu entsyymin määrään, joka vaaditaan hydrolysoimaan 4 % suodatinpape-nsubstraatista 1 tunnissa koeolosuhteissa. FPU-aktiivisuuden ajatellaan edustavan entsyymivalmisteen totaalista kokonaisseilulaasiaktiivisuutta.
Entsyymiseokset olivat esimerkissä 27 kuvatulla tavalla valmistettu SEOS 2, esimerkissä 28 kuvatulla tavalla valmistettu SEOS 3 ja SEOS 4. 30 SEOS 4 valmistettiin yhdistämällä esimerkissä 27 kuvatut entsyymivalmisteet seuraavasti (10 ml seosta kohti): CBH/Ce!7-valmlste 7,84 mi, endoglu-kanaasivalmiste 0,99 ml ja β-glukosidaasivaimiste 1,17 mi.
Referenssinä käytetyt entsyymiseokset, jotka edustavat tunnetun tekniikan mukaisia seoksia, olivat: esimerkissä 26 kuvatulia valmistuksella ”T, 35 REESEIN ENTSYYMIT" valmistettu ”T. REESEiN ENTSYYMIT A".
87 Ί~. REESEI ENTSYYMIT ET konstruoitiin yhdistämällä (10 mi kohti) 8,05 mi Econase CE:tä (kaupailinen T. reesein seiiulaasivaimiste AB Enzymes Oydtä, Rajamäki, Suomi) ja 1,95 mi Novozym 188:a (Novozymes A/S:!tä).
Entsyymivalmisteille erilaisissa lämpötiloissa mitatut FPU-aktiivi-5 soudat esitetään kuvassa 14 prosentteina perusolosuhteissa (iUPAC, 1987) esiintyvästä aktiivisuudesta (50 o0:ssa).
Tulokset osoittavat selvästi, että keksinnön seokset osoittavat korkeampaa kokonaisseliuiaasiaktiivisuutta korotetuissa (60-70 °C) lämpötiloissa verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin seoksiin, jotka perustuvat entsyymei-10 hin Trichodermasta ja Aspergilluksesta.
Esimerkki 32. Uusien betaglukosidaasien käyttö soforoosin valmistuksessa
Korkean pitoisuuden tärkkeiyshydroiysaattiseosta (Nutriose 74/968,
Roquette) käsiteltiin esimerkissä 21 kuvatulla tavaiia tuotetulla Thermoascus 15 aurantiacuksen β_81 /Cel3A-rikastetul!a entsyymivaimisteelia sokeriseoksen tuottamiseksi, joka sisältää olennaisia määriä seitulaasia indusoivaa ainetta (soföroqsi) glukoosirepression voittamiseksi.
Ta pG_81/Cel3A-rikastettu entsyymivalmiste lisättiin 70 % (pai-no/paino) Nutriose-liuokseen 1 g:n kokonaisproteiinia /litra ioppupitolsuuteen, 20 Seosastiaa inkuboitiin vesihauteessa 65 °C:ssa 3 päivän ajan jatkuvasti sekoittaen ja käytettiin hiililähteenä ravistelupuiloliuoksessa kahdelta eriiaisefle Triehoderma-kamaWe (A47 ja Rut~C30). Entsyymikäsittelyn vaikutus mitattiin 7 päivän aikana ravistelupulioviljelmässä muodostuneena endoglukanaasiaktiivi-suutena. Referenssiviljelmät suoritettiin samoissa olosuhteissa käsittelemättä-25 mällä Nutriosefla hiiiilähteena. Enemmän kuin kaksinkertainen lisäys aktivii-suuksissa saatiin Ta pG_81/Cei3A:ila esikäsiteliyilä Nutriose-liuokseila suoritetuissa ravistelupulioviijeimissä testatuilla kannoilla. Tulokset osoitetaan kuvassa 15.
i 88
Lista talletetuista organismeista
Karita Plasmidi Talletus- Talletus» Talletus» sisälsi viran- päivämäärä numero ___omainen___
Acremoriium - CBS(1) 20. syyskuuta 2004 CBS 116240 thermaphiium ALKQ4245__________
Tbermoascua - CBS(1) 20. syyskuuta 2004 CBS 116239 aurantiacus ALK04242_____
Chaetomium - CBS{2i 8. marraskuuta 1995 CBS 730.95w ihermopMum ALK04265 _.____
Escheria coli pALK1635 PSMZ(3) 16. syyskuuta 2004 PSM16723
Eschetfa coli pALK1642 DSMZ 16, syyskuuta 2004 DSM16727
Escharia colt pALK1646 DSMZ 16, syyskuuta 2004 DSM 16728
Escheria coll pALK1861 DSMZ 16. syyskuuta 2004 DSM 16729
Escharia coli pALK1715 DSMZ___16. syyskuuta 2004 DSM 16724
Escharia coli pALK1723 DSMZ 16. syyskuuta 2004 DSM 16725
Escheria coli pALK1725 DSMZ 16. syyskuuta 2004 DSM 16726
Escheria coli pALK1904 DSMZ__13. toukokuuta 2005 DSM 17323
Escheria coli pALK1908 DSMZ 13. toukokuuta 2005 DSM 17324
Escheria coli pALK1925 DSMZ 13. toukokuuta 2005 DSM 17325
Escheria coli pALK1926 DSMZ 13. toukokuuta 2005 DSM 17326
Escheria coti pALK200t DSMZ 18 Jokakuuta 2005 DSM 17667
Escheria coli pALK20lO DSMZ 18, marraskuuta 2005 DSM 17729 l1)the Centrafbureau Voor Schimmelcuitures at Uppsala/aan 8, 3584 CT, Utrecht, Alankomaat (2) the Centralbureau Voor Schimmelcuitures at Oosterstraat 1,3742 SK BAARN, Alankomaat <3) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuliuren GmbH (DSMZ), Mascheroder 5 Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Saksa <4· [Nykyisen talletuskauden päättymisen jälkeen näytteet Juliaan varastoimaan sopimusten alaisina niin, että kanta on saatavilla patentin voimassaoloajan yli.] 89
Viitteet
Aitschul S., Gish W„ Miller W., Myers E. W. ja Lipman O. J. (1990)
Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
5 Badger, P.C. (2002) Ethanol from cellulose: a general review. Kir jassa: Trends in new crops and new uses. J. Janick ja A Whipkey (toim.), ASHS Press, Alexandria, VA, USA, s. 17-21.
Bailey M. J. ja K. M. H. Nevalainen (1981) Induction, isolation and testing of stable Triehoderma reesei mutants with improved production of solu-10 bilizing celluiase. Enz Microbiol Technol. 3: 153-157.
Bailey, M.J., Biely, P. ja Poutanen, K. (1992) Interlaboratory testing for assay of xyianase activity. J Biotechnol. 23:257-270.
Bailey, M. J. ja Linko, M. (1990) Production of β-galactosidase by Aspergillus oryzae in submerged bioreactor cultivation. J. Biotechnol. 16:57-15 66.
Bailey M. J. ja Poutanen K. (1989) Production of xylanases by strains of Aspergillus. Appi. Microbiol. Biotechnol. 30:5-10.
Bailey M., Siika-aho M., Vaikeajärvi A ja Penttilä M. (1993) Hydrolytic properties of two ceiluiases of TriGhoderma reesei expressed in yeast.
20 Biotehnol. Appi. Biochem 17: 65-76
Bendtsen J.D., Nielsen K, von Heijne G. ja Brunak S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340: 783-795.
Bernfeld, B. (1955) Amylases, a and β, Kirjassa: Methods in Enzy-rnology, osa 1, Toim. Colowick, S.P. ja Kaplan, N.O. Academic Press, New 25 York, s. 149-158.
Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfet O. (1997) Endo-beta-1,4-xyianase families: differences in catalytic properties. Journal of Biotechnology 57: 151-166.
Coen, Q.M. (2001) The polymerase chain reaction. Kirjassa: 30 Ausubel, F.M., Brent, R, Kingston, RE., More, D.D., Seidman, J.G., Smith, K. ja Struhl, K. (toim.) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons.
Inc., Hoboken, USA.
Gasteiger, E., Gattiker A, Hoogland C., IvanyiAppel R. D. ja Bai-roch A (2003) ExPASy: the proteiomics server for in-depth protein knowledge 35 and analysis. Nucleic Acids Res. 31:3784-3788.
i 90
Gellissen, G. (toim.) (2005) Production of recombinant proteins. Novel microbial and eukaryotic expression systems, Wiley-VCH Veriag Gmbh&Co. Weinheim, Saksa,
Gil!, S.C, ja von Hippei, P.H. (1989) Calculation of protein extinction 5 coefficients from amino acid sequence data· Anal. Biochem. 182: 319-326.
Gupta, R., E. Jung ja S. Brunak. (2004) Prediction of N-gtyco-sylation sites in human proteins, valmisteilla, www.cbs.dtu.dklservices/NetNGIvc/ Haakana H., Miettinen-Oinonen A., Joutsjoki V., Mäntylä A., Suominen P, ja Vehmaanperä J. (2004) Cloning of cellulase genes from Meianocar-10 pus albomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enz, Microbiol. Technol. 34: 159-167.
Henrissat B. (1991) A classification of glycosy! hydroiases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J, 280: 309-316.
Henrissat B. ja Bairoch A, (1993) New families in the classification 15 of glycosy! hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788.
Henrissat B. ja Bairoch A. (1996) Updating the sequence-based classification of giycosyl hydroiases. Biochem. J. 316: 695-696.
Henrissat B., Teeri T. T. ja Warren R. A. J. (1998) A scheme for 20 designating enzymes that hydrolyse the polysaccharides In the cell wall of plants. FEBS Letters 425: 352-354.
Hong J., H. Tamaki, K. Yamamoto, ja Kumagai H. (2003a) Cloning of a gene encoding a thermo-stabile ehdo-β-Ι ,4-glueanase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast. Biotech. Letters 25:657-661.
25 Hong J., Tamaki H., Yamamoto K. ja Kumagai H. (2003b) Cloning of a gene encoding thermostable ceilobiohydroiase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast. Appi. Microbiol. Biotechnoi. 63: 42-50.
IUPAC (Internationa! Union of Pure and Applied Chemistry) (1987) Measurement of celiuiase activities. Pure and Appi. Chem, 59: 257-268.
30 Joutsjoki, V. V., Torkkeii T. K. ja Nevalainen K. M. H. (1993) Trans formation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae giucoamyiase P (gamp) gene: production of a heterologous giucoamyiase by Trichoderma reeseL Gurr. Genet. 24: 223-228.
Karhunen T., Mäntylä A., Nevalainen K. M. H. ja Suominen P. L. 35 (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I.
Endogiucanase I overproduction. Moi, Gen. Genet. 241: 515-522.
91
Kurabi A., Berlin A, Gilkes N., Kilburn D.f Markov A., Skomarovsky A., Gusakov A., Okunev 0,, Sinitsyn A., Gregg D. Xie D. ja Saddler J. (2005) Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolv-pretreated Dougias-Fir by novel and commercial fungal ceilulases. Appi. Biochem and 5 B iotech n. Osat 121— 24: 219-229.
Lever, M. (1972) A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem., 47: 276-279.
Lo Leggio, L., Kaiogiannis S„ Bhat M.K., ja Pickersgill R.W. (1999) High resolution structure and sequence of the T. aurantiacus xylanase 1-: irnpli-10 cations for evolution of thermostability in family 10 xylanases and enzymes with (beta) alpha-barrel architecture. Proteins 36(3): 295-306.
Lowry, 0., Rosenbrough, N., Farr, A. ja Randall, R. (1951) Protein measuremen with the Folin phenol reagent. J. Biol. Gherri. 193: 265-275.
Needleman S. ja Wunsch G. (1970) A general method applicable to 15 the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48, 443-453.
Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. ja von Heijne G. (1997) Identification of prokaryotic and eykaryotie signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1-6.
20 Paloheimo M., Mäntylä A., Kallio J., ja Suominen P. (2003) High- yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma mesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appi. Env. Microbiol. 69: 7073-7082.
Parry N., Beever D., Owen E., Nerinckx W. Ciaeyssens M, Van 25 Beeumen J. ja Bhat M. (2002) Biochemical characterization and mode of action of a thermostable endoglucanase purified from Thermoascus aurantiacus, Arch, of Biochem. and Btophys. 404: 243-253.
Penttilä M., Nevalainen H., Rättö M., Salminen E. ja Knowies J. (1987) A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus 30 Trichoderma reesei. Gene 61:155-164.
Raeder U. ja Broda P. (1985) Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appi, MicrobioL 1:17-20.
Rice P, Longdeo I ja Bleasby A. (2000). EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16:276-277.
35 Sambrook J., Fritsch E. F. ja Maniatis T. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
92
Sambrook J, ja Russell D. W. (2001) Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US,
Srisodsuk M, Reinikainen I, Penttilä M ja Teeri T. (1993) Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I In its in-5 teraction with crystalline cellulose. J. Biol. Chem. Oct 5;268(28): 20756-61.
Sundberg, M., ja Poutanen, K. (1991) Purification and properties of two acetylxylan esterases of Trichoderma reesei. Biotechno!. Appi. Biochem. 13:1-11.
Suurnäkki, A., Tenkanen M., Siika-aho, M., Niku-Paavola, M.-L., Vii-10 kari, L. ja Buchert, J. .(2000) Trichoderma reesei cellulases and their core domains in the hydrolysis and modification of chemical pulp. Cellulose 7: 189-209.
Tenkanen, M., Puls, J. ja Poutanen, K (1992) Two major xylanases of Trichoderma reesei. Enzyme Microbiol. Technol. 14: 566-574.
15 Tomme, P. McRae, S., Wood, T. ja Ciaeyssens, M. (1988) Chroma tographic separation of cellulolytic enzymes. Methods in Enzymol. 160: 187-192.
Tuohy M,, Walsh J., Murray P., Ciaeyssens M., Cuffe M., Savage A. ja Coughan M. (2002) Kinetic parameters and mode of action of ceilobiohy-20 droiases produced by Taiaromyces emersonii. Biochem. Biophys. Acta 1596: 366-380 (abstrakti).
Van Petegem ym. (2002) Atomic resolution structure of major en-doglucanase from Thermoascus aurantiacus, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 296, s. 161-166.
25 Van Tilbeurgh, H., Loonties, F., de Bruyne, C. ja Ciaeyssens, M.
(1988) Fluorogenic and chromogenic giycosides as substrates and ligands of earbohydrases. Methods Enzymol, 160: 45-59.
Wyman, C.E. (2001) Twenty years of trials, tribulations, and research progress in bioethanoi technology. Applied Biochemistry and Biotech-30 oology 91-93: 5-21.

Claims (24)

1. Menetelmä selluioosarnateriaalin käsittelemiseksi seilobiohydro-laasilla, endoglukanaasiila ja betaglukosidaasiila, tunnettu siitä, että sello- 6 biohydrolaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 28 kanssa,
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endoglukanaasi käsittää aminohapposekvenssin, joita on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 10, 12, 14 tai 16 tai sen entsymaattisesti aktiivisen 10 fragmentin kanssa.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tu n n e 11 u siitä, että endoglukanaasi on saatavissa Thermoascus aurantiacuksesta, Acremoni-um ihermophilumista tai Ghaetomium thermophilumista.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että endoglukanaasi on saatavissa Thermoascus aurantiacus CBS 116239:stä, Acremonium thermophilum CBS 116240:sta tai Ghaetomium thermophilum CBS 730.95:stä.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että betaglukosidaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % 20 identtisyys sekvenssin nro 22, 24 tai 26 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että betaglukosidaasi on saatavissa Thermoascus aurantiacuksesta, Acremonium thermophiiumista tai Ghaetomium ihermophilumista, edullisesti Ther- 25 moascus aurantiacus CBS i16239:stä, Acremonium thermophilum CBS 116240:sta tai Chaetomiurh thermophilum CBS 730.95:stä.
7. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selluloosamateriaali on iignoseliuloosarnateriaa-lia. 30
8, Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että käsitellään lignoselluloosamateriaalia vähintään yhdellä lisäentsyymillä, edullisesti ksylanaasilia, joka edullisesti käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 18 tai 20 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa, i
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylanaasi on saatavissa Thermoascus aurantiacuksesta tai Acremonium thermophifumista, edullisesti Thermoascus aurantiacus CBS i1623S:stä tai Acremonium thermophilum CBS 116240:sta.
10. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että entsyymit lisätään sellutoosamateriaaliin joko samanaikaisesti tai peräkkäin.
11. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin yhtä entsyymeistä koodittaa samanlainen ίο geeni kuin mitä on mikro-organismissa, jolta on tafletusnumero DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 tai DSM 17667.
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selluloosamatenaaif valitaan ryhmästä, joka koostuu maissinkorjuujättees- 15 tä, iännenhirssistä (switchgrass), viljan oljesta, sokeriruokojätteestä ja puusta peräisin olevista materiaaleista.
13. Entsyymivalmiste, joka käsittää seliobiohydroiaasia, endoglo-kanaasia ja betaglukosidaasia, t u n net t u siitä, että sellobiohydrolaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 20 28 kanssa.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen entsyymivaimiste, tunnet-t u siitä, että endoglukanaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 10,12,14 tai 16 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa,
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen entsyymivalmiste, tunnet- t u siitä, että endoglukanaasi on saatavissa Thermoascus aurantiacuksesta, Acremonium thermophifumista tai Chaetomium thermophilumista, edullisesti Thermoascus aurantiacus CBS 116239:stät Acremonium thermophilum CBS 11624Ö:sta tai Chaetomium thermophiium CBS 730.95:stä.
16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen entsyymivalmiste, tunnet- t u siitä, että betaglukosidaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 22, 24 tai 26 tai sen entsymaattisesti ak- | tiivisen fragmentin kanssa. I
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen entsyymivaimiste, t u n net - 35. u siitä, että betaglukosidaasi on saatavissa Thermoascus aurantiacuksesta, Acremonium thermophilumista tai Chaetomium ihermophiiumista, edullisesti Thermoascus aurantiacus CBS 116239:sta, Acremonium thermophilum CBS 116240;sta tai Chaetomium thermophilum CBS 730.95:stä.
18. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13 -17 mukainen entsyymi-vaimiste, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden iisäentsyymin, 5 edullisesti ksylanaasin, joka edullisesti käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 80 % identtisyys sekvenssin nro 18 tai 20 tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin kanssa.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen entsyymivalmiste, tunnet -t u siitä, että ksylanaasi on saatavissa Thermoascus aurantiacuksesta tai Agio remonium thermophilumista, edullisesti Thermoascus aurantiacus CBS 116239:stä tai Acremonium thermophilum CBS 11624Ö:sta.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-19 mukainen entsyymi-valmiste, tunnettu siitä, että ainakin yhtä entsyymeistä koodittaa samanlainen geeni kuin mitä on mikro-organismissa, jolla on talletusnumero DSM 15 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 tai DSM 17667.
21. Patenttivaatimuksen 13 mukainen entsyymivalmiste, tunnet-t u siitä, että se on käytetyn kasvuiiuoksen, jauheen, granuloiden tai nesteen muodossa.
22. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 13 - 21 mukaisen entsyy- mivalmisteen käyttö selluloosamateriaalien hajotukseen.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen käyttö, t u n n ett u siitä, että selluloosamateriaaii valitaan ryhmästä, joka koostuu maissinkorjuujätteestä, lännenhirssistä (switchgrass), viljan oljesta, sokeriruokojätteestä ja puusta pe- 25 räisin olevista materiaaleista.
24. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukaisen menetelmän käyttö etanolin valmistusprosessissa seliuloosamateriaalista.
FI20051318A 2005-12-22 2005-12-22 Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit FI120045B (fi)

Priority Applications (28)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20051318A FI120045B (fi) 2005-12-22 2005-12-22 Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
CN201110021502.9A CN102174492B (zh) 2005-12-22 2006-12-15 纤维素材料的处理和用于其中的酶
ES12151850.0T ES2582320T3 (es) 2005-12-22 2006-12-15 Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
DK12151852.6T DK2453014T3 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulose materials and enzymes useful therefor
CN2006800528641A CN101384713B (zh) 2005-12-22 2006-12-15 纤维素材料的处理和用于其中的酶
ES06830936.8T ES2501944T3 (es) 2005-12-22 2006-12-15 Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
DK12151850.0T DK2453013T3 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulose materials and enzymes useful therefor
EP10191152.7A EP2319920B1 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
PCT/FI2006/050558 WO2007071818A1 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
EP06830936.8A EP1963498B1 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
EP12151852.6A EP2453014B1 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
ES12151852.6T ES2582078T3 (es) 2005-12-22 2006-12-15 Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
AU2006326963A AU2006326963B2 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
CA2833029A CA2833029C (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
RU2008123954/10A RU2458128C2 (ru) 2005-12-22 2006-12-15 Способ обработки целлюлозного материала и используемые в нем ферменты
AP2008004509A AP2924A (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
ES10191152.7T ES2527681T3 (es) 2005-12-22 2006-12-15 Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
EP12151850.0A EP2453013B1 (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
CA2632502A CA2632502C (en) 2005-12-22 2006-12-15 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
BRPI0620287A BRPI0620287B1 (pt) 2005-12-22 2006-12-15 método para tratar material celulósico com celobioidrolase, endoglicanase e betaglicosidase, uso do mesmo, preparação de enzima, uso da mesma, vetor, célula hospedeira de fungo e cepa de escherichia coli, bem como método de preparação de um polipeptídeo e uso do mesmo
ARP060105762A AR058721A1 (es) 2005-12-22 2006-12-21 Triamiento de material celulosico y enzimas utiles en el mismo
TW095148542A TWI391489B (zh) 2005-12-22 2006-12-22 處理纖維素材料之方法及用於彼之酶類
ZA200804976A ZA200804976B (en) 2005-12-22 2008-06-06 Treatment of cellulosic material and enzymes useful there-in
US12/141,976 US20090042266A1 (en) 2005-12-22 2008-06-19 Treatment of cellulosic material and enzymes useful thererin
US12/917,603 US8409836B2 (en) 2005-12-22 2010-11-02 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
US13/774,465 US9758777B2 (en) 2005-12-22 2013-02-22 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
US14/045,236 US9593324B2 (en) 2005-12-22 2013-10-03 Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
US15/690,513 US20180044656A1 (en) 2005-12-22 2017-08-30 Treatment of Cellulosic Material and Enzymes Useful Therein

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75325805P 2005-12-22 2005-12-22
FI20051318A FI120045B (fi) 2005-12-22 2005-12-22 Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
FI20051318 2005-12-22
US75325805 2005-12-22

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20051318A0 FI20051318A0 (fi) 2005-12-22
FI20051318L FI20051318L (fi) 2006-12-28
FI120045B true FI120045B (fi) 2009-06-15

Family

ID=38188306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20051318A FI120045B (fi) 2005-12-22 2005-12-22 Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit

Country Status (14)

Country Link
US (5) US20090042266A1 (fi)
EP (4) EP2453014B1 (fi)
CN (2) CN102174492B (fi)
AP (1) AP2924A (fi)
AR (1) AR058721A1 (fi)
AU (1) AU2006326963B2 (fi)
BR (1) BRPI0620287B1 (fi)
CA (2) CA2833029C (fi)
DK (2) DK2453013T3 (fi)
ES (4) ES2501944T3 (fi)
FI (1) FI120045B (fi)
RU (1) RU2458128C2 (fi)
TW (1) TWI391489B (fi)
WO (1) WO2007071818A1 (fi)

Families Citing this family (206)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA95795C2 (ru) * 2006-01-27 2011-09-12 Юниверсити Оф Массачусетс Способ изготовления продукта из биомассы и установка по производству топлива из биомассы
EA201600301A1 (ru) 2006-10-26 2016-12-30 Ксилеко, Инк. Переработка биомассы
DE102006062045A1 (de) 2006-12-29 2008-07-03 Ab Enzymes Gmbh Verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Pflanzensamen
WO2008115596A2 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Danisco Us, Inc., Genencor Division Over expression of foldases and chaperones improves protein production
US7923236B2 (en) * 2007-08-02 2011-04-12 Dyadic International (Usa), Inc. Fungal enzymes
CN101932704A (zh) 2007-12-05 2010-12-29 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP2235173A2 (en) 2007-12-19 2010-10-06 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20110020884A1 (en) * 2008-02-27 2011-01-27 William Greg Latouf Method for the conversion of plant materials into fuels and chemicals by sequential action of two microorganisms
EP2260099A1 (en) * 2008-03-06 2010-12-15 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
US20090286294A1 (en) * 2008-04-04 2009-11-19 University Of Massachusetts Methods and Compositions for Improving the Production of Fuels in Microorganisms
US8212087B2 (en) 2008-04-30 2012-07-03 Xyleco, Inc. Processing biomass
US8236535B2 (en) 2008-04-30 2012-08-07 Xyleco, Inc. Processing biomass
BRPI0911588B1 (pt) 2008-04-30 2018-07-17 Xyleco Inc método de preparo de um material de ração
US20100105114A1 (en) * 2008-06-11 2010-04-29 University Of Massachusetts Methods and Compositions for Regulating Sporulation
EP2306964A1 (en) * 2008-07-03 2011-04-13 Novozymes A/S A personal wash bar
WO2010059424A2 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Novozymes, Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
EP2373788A1 (en) 2008-12-04 2011-10-12 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
FR2939446B1 (fr) 2008-12-05 2011-04-22 Valagro Carbone Renouvelable Utilisation de coton recycle pour produire de l'ethanol, et procede de production.
AP3994A (en) 2008-12-19 2017-01-11 Xyleco Inc Processing biomass
US8426158B2 (en) 2008-12-19 2013-04-23 Novozymes, Inc. Methods for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material in the presence of a peroxidase
CN102325889A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 增加纤维素材料水解的方法
CN102325879A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 在纤维二糖脱氢酶存在下增加纤维素材料水解的方法
US8338121B2 (en) 2008-12-19 2012-12-25 Novozymes, Inc. Methods for determining cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
TWI384073B (zh) * 2008-12-24 2013-02-01 Taiwan Textile Res Inst 以含纖維素的纖維製品為原料生產生質酒精的方法
FI122029B (fi) 2008-12-30 2011-07-29 Ab Enzymes Oy Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
EP2391715A1 (en) 2009-01-28 2011-12-07 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
US8629324B2 (en) 2009-01-30 2014-01-14 Novozymes, Inc. Polypeptides having expansin activity and polynucleotides encoding same
US20100086981A1 (en) * 2009-06-29 2010-04-08 Qteros, Inc. Compositions and methods for improved saccharification of biomass
JP2012519500A (ja) * 2009-03-09 2012-08-30 クテロス， インコーポレイテッド クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種からの発酵最終産物の生産
CA2752007A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novozymes A/S Polypeptides having acetyl xylan esterase activity and polynucleotides encoding same
BRPI1011597B1 (pt) 2009-05-29 2019-08-20 Novozymes, Inc. Métodos para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico, e, composição de enzima
WO2010141325A1 (en) 2009-06-02 2010-12-09 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2011005867A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity activity and polynucleotides encoding same
US20110039319A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Theodora Retsina Enzyme recycle from hydrolysis of lignocellulosic material
WO2011022644A2 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 Auburn University Fermentation and chemical treatment of pulp and paper mill sludge
WO2011035027A2 (en) 2009-09-17 2011-03-24 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2478095A1 (en) 2009-09-18 2012-07-25 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
DK2480660T5 (da) 2009-09-23 2020-11-09 Danisco Us Inc Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf
DK2483403T3 (en) 2009-09-29 2018-02-12 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
MX2012003473A (es) 2009-09-29 2012-05-22 Novozymes Inc Polipeptidos que tienen actividad celulitica mejorada y polinucleotidos que codifican para los mismos.
EP2483402A1 (en) 2009-09-30 2012-08-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2011041504A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novozymes, Inc. Polypeptides derived from thermoascus crustaceus having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2486139B1 (en) * 2009-10-08 2020-09-16 DSM IP Assets B.V. Process for the preparation of a fermentation prodcut from lignocellulose containing material
WO2011050037A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2011059740A1 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US9267125B2 (en) 2009-11-06 2016-02-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN104694517B (zh) 2009-11-06 2019-06-28 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN102947442B (zh) * 2009-11-06 2016-03-09 诺维信股份有限公司 用于糖化纤维素材料的组合物
RU2012126131A (ru) 2009-11-25 2013-12-27 Кодексис, Инк. РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАРИАНТЫ β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ ДЛЯ ПРОДУКЦИИ РАСТВОРИМЫХ САХАРОВ ИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ
WO2011066187A1 (en) * 2009-11-25 2011-06-03 Codexis, Inc. Recombinant thermoascus aurantiacus beta-glucosidase variants for production of fermentable sugars from cellulosic biomass
WO2011069106A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Georgia Tech Research Corporation Improved methods of treating a biomass for enzymatic hydrolysis
WO2011081658A2 (en) * 2009-12-15 2011-07-07 Qteros, Inc. Methods and compositions for producing chemical products from c. phytofermentants
WO2011080155A2 (en) * 2009-12-21 2011-07-07 Novozymes A/S Method for producing fermentation products from lignocellulose-containing material
AU2010333801B2 (en) 2009-12-23 2015-12-17 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
FI122937B (fi) * 2009-12-30 2012-09-14 Roal Oy Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
DK2529013T3 (en) * 2010-01-28 2016-09-12 Academia Sinica Novel beta-glucosidase and uses thereof
PL2357227T3 (pl) 2010-02-11 2015-12-31 Sued Chemie Ip Gmbh & Co Kg Zoptymalizowane enzymy celulazy
GB2478791A (en) * 2010-03-19 2011-09-21 Qteros Inc Ethanol production by genetically-modified bacteria
CN102918151B (zh) 2010-03-31 2015-09-09 诺维信股份有限公司 纤维二糖水解酶变体及编码其的多核苷酸
EP2402454A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-04 Süd-Chemie AG Cellobiose production from biomass
EP2588604B1 (en) 2010-06-30 2016-06-29 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
US9394555B2 (en) 2010-08-12 2016-07-19 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a dioxy compound and uses thereof
US20130212746A1 (en) 2010-08-30 2013-08-15 Novoyzmes A/S Polypeptides Having Hemicellulolytic Activity And Polynucleotides Encoding Same
US9303074B2 (en) 2010-08-30 2016-04-05 Novoyzmes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US9187742B2 (en) 2010-08-30 2015-11-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8629325B2 (en) 2010-08-30 2014-01-14 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030844A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US8624082B2 (en) 2010-08-30 2014-01-07 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
MX2013003237A (es) 2010-09-30 2013-05-30 Novozymes Inc Variantes de polipeptidos que tienen actividad potenciadora celulolitica y polinucleotidos que codifican a los mismos.
DK2622068T3 (en) 2010-09-30 2016-10-17 Novozymes Inc Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
DK3023492T3 (en) 2010-10-01 2018-03-05 Novozymes Inc Beta-glucosidase variants and polynucleotides encoding them
WO2012058293A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Novozymes North America, Inc. Methods of saccharifying sugarcane trash
ES2541492T3 (es) 2010-11-02 2015-07-21 Novozymes, Inc. Métodos para pretratar material celulósico con polipéptido GH61
US9212354B2 (en) 2010-11-04 2015-12-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activitiy and polynucleotides encoding same
BR112013009026A2 (pt) 2010-11-12 2016-07-12 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína, e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e método para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, molécula de rna inibidora de filamento duplo, polinucleotídeo isolado, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de célula
DK2640833T3 (en) 2010-11-18 2016-11-28 Novozymes Inc Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
EP2649188A1 (en) 2010-12-06 2013-10-16 Novozymes North America, Inc. Methods of hydrolyzing oligomers in hemicellulosic liquor
US9353363B2 (en) 2011-01-26 2016-05-31 Novozymes A/S Glycoside hydrolases from thermophilic fungi
WO2012103322A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
CN103517986B (zh) 2011-01-26 2016-12-07 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸
WO2012103350A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK2668266T3 (en) 2011-01-26 2018-03-26 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH CELLOBIO HYDROASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
US9434972B2 (en) 2011-01-31 2016-09-06 Novozymes North America, Inc. Processes for enzymatic refining of pretreated cellulosic material for saccharification
CN103384678B (zh) 2011-02-23 2017-01-18 诺维信股份有限公司 具有纤维素水解增强活性的多肽及其编码多核苷酸
US9150842B2 (en) 2011-03-09 2015-10-06 Novozymes A/S Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
US9409958B2 (en) 2011-03-10 2016-08-09 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
JP6290626B2 (ja) * 2011-03-17 2018-03-14 ダニスコ・ユーエス・インク 糖化プロセスにおける粘度を低下させる方法
WO2012130120A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Novozymes A/S Method for degrading or converting cellulosic material
WO2012135659A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes A/S Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
EP2691519A1 (en) * 2011-03-31 2014-02-05 Novozymes, Inc. Cellulose binding domain variants and polynucleotides encoding same
CN103649308A (zh) 2011-04-28 2014-03-19 诺维信股份有限公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US9624518B2 (en) 2011-04-29 2017-04-18 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US8993286B2 (en) 2011-05-19 2015-03-31 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins
WO2012159007A1 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins
EP2734633B1 (en) 2011-07-22 2019-05-01 Novozymes North America, Inc. Processes for pretreating cellulosic material and improving hydrolysis thereof
DK3382016T3 (da) 2011-08-04 2019-11-18 Novozymes Inc Polypeptider med xylanaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
BR112014002405A2 (pt) 2011-08-04 2017-04-04 Novozymes As polopeptídeo e polinucleotídeo isolados, composição, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, métodos para produzir um polipeptídeo e uma proteína, e, processos para degradar um material celulóssico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico
EP2748321A2 (en) 2011-08-24 2014-07-02 Novozymes, Inc. Methods for obtaining positive transformants of a filamentous fungal host cell
US9493790B2 (en) 2011-08-24 2016-11-15 Novozymes, Inc. Methods for producing multiple recombinant polypeptides in a filamentous fungal host cell
US9670510B2 (en) 2011-09-13 2017-06-06 Novozymes A/S Methods of hydrolyzing and fermenting cellulosic material
WO2013043910A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN108373498A (zh) * 2011-09-23 2018-08-07 诺维信公司 纤维素分解酶组合物及其用途
BR112014007651A2 (pt) 2011-09-30 2017-04-11 Novozymes Inc polipeptídeo quimérico isolado, polinucleotídeo isolado, métodos para produzir um polipeptídeo quimérico e um produto de fermentação, para degradar ou converter um material celulósico, e para fermentar um material celulósico, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, e, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células
US10704034B2 (en) 2011-10-28 2020-07-07 Novozymes Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP2771353A4 (en) * 2011-10-28 2015-07-29 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES THAT CODE
CN104039817A (zh) * 2011-10-28 2014-09-10 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
DK2773656T3 (da) 2011-10-31 2019-09-09 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem
CA2856083A1 (en) * 2011-11-15 2013-05-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN104350148A (zh) * 2011-11-15 2015-02-11 诺维信股份有限公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP3409769A1 (en) 2011-11-18 2018-12-05 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
DK3219794T3 (da) 2011-11-21 2019-12-16 Novozymes Inc GH61-polypeptidvarianter og polynukleotider, som koder for dem
WO2013075644A1 (en) 2011-11-22 2013-05-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
BR112014012417A2 (pt) 2011-12-01 2017-06-06 Novozymes Inc polipeptídeo e polinucleotídeo isolados, célula hospedeira recombinante, métodos para a produção de um polipeptídeo, de um mutante de uma célula de origem, e de uma proteína, e para a inibição da expressão de um polipeptídeo, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, molécula de rna, processos para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, para produzir um produto de fermentação, e de fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células
EP3272862A1 (en) 2011-12-16 2018-01-24 Novozymes, Inc. Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same
BR112014014697A2 (pt) 2011-12-19 2020-10-27 Novozymes, Inc. polipeptídeo isolado, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo e uma proteína, para gerar oxigênio molecular, e para remover peróxido de hidrogênio do tecido, processos para degradar ou converter um material celulósico, e para produzir um produto de fermentação, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células
US20140342038A1 (en) 2011-12-19 2014-11-20 Novozymes A/S Processes and Compositions For Increasing The Digestibility of Cellulosic Materials
BR112014015228B1 (pt) 2011-12-20 2022-07-05 Novozymes, Inc. Variante de celobiohidrolase genitora, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto de fermentação, e de fermentação de um material celulósico, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura celular, e, célula hospedeira microbiana transgênica
EP2794899A1 (en) 2011-12-21 2014-10-29 Novozymes, Inc. Methods for determining the degradation of a biomass material
BR112014015242B1 (pt) 2011-12-22 2023-01-31 Novozymes, Inc Polipeptídeo híbrido isolado, polinucleotídeo isolado,célula hospedeira, método de produção de um polipeptídeo híbrido, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto de fermentação, de fermentação de um material celulósico, formulação ou composição de cultura de células microbianas de caldo completo, e,célula hospedeira microbiana transgênica
CN102618602B (zh) * 2012-03-30 2013-05-15 吴允山 甘薯渣酶法水解糖工艺
EP2841569A2 (en) 2012-04-23 2015-03-04 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-glucuronidase activity and polynucleotides encoding same
US9394556B2 (en) 2012-04-23 2016-07-19 Novozymes A/S Polypeptides having glucuronyl esterase activity and polynucleotides encoding same
CA2868308A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Novozymes, Inc. Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same
US8975058B2 (en) 2012-05-24 2015-03-10 Roal Oy Endoglucanases for treatment of cellulosic material
FI124476B (fi) * 2012-05-24 2014-09-15 Roal Oy Paranneltuja endoglukanaaseja selluloosapitoisen materiaalin käsittelyyn
FI124477B (fi) 2012-06-07 2014-09-15 Roal Oy Uusia proteiineja selluloosamateriaalin käsittelyyn
US9458440B2 (en) 2012-06-07 2016-10-04 Roal Oy Proteins for the treatment of cellulosic material
AU2012387042A1 (en) * 2012-08-03 2015-02-19 Dupont Nutrition Biosciences Aps Enzymes
CN104685052A (zh) 2012-09-19 2015-06-03 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料的降解或转化的方法
US10035996B2 (en) 2012-10-08 2018-07-31 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20150275194A1 (en) 2012-10-24 2015-10-01 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
US9434929B2 (en) 2012-10-26 2016-09-06 Roal Oy Esterases useful in the treatment of cellulosic and lignocellulosic material
CA2888753A1 (en) * 2012-10-31 2014-05-08 Danisco Us Inc. Beta-glucosidase from magnaporthe grisea
WO2014093835A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20150337280A1 (en) 2012-12-19 2015-11-26 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN103013959A (zh) * 2013-01-17 2013-04-03 青岛农业大学 一种用于降解纤维素的混合酶
US8753860B1 (en) * 2013-02-12 2014-06-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN110628749A (zh) 2013-03-08 2019-12-31 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
US9617574B2 (en) 2013-03-15 2017-04-11 Auburn University Efficient process for producing saccharides and ethanol from a biomass feedstock
FI126698B (fi) * 2013-12-18 2017-04-13 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Menetelmä fibrilloidun selluloosamateriaalin valmistamiseksi
MY176473A (en) 2013-12-27 2020-08-11 Toray Industries Method of producing sugar liquid
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
US10370408B2 (en) * 2014-06-25 2019-08-06 Jhl Biotech, Inc. Method for purification of a DNase or RNase protein from a sample
JP2017524363A (ja) * 2014-08-08 2017-08-31 ザイレコ，インコーポレイテッド アグリコシル化された酵素およびその使用
EP3594335B1 (en) 2014-09-05 2024-05-01 Novozymes A/S Carbohydrate binding module variants and polynucleotides encoding same
FI127093B (fi) 2014-10-27 2017-11-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäisiä endoglukanaasivariantteja, niiden tuottaminen ja käyttö
EP3221460A1 (en) * 2014-11-20 2017-09-27 Full Cycle Bioplastics Inc. Producing polyhydroxyalkanoate copolymers from organic waste products
WO2016120298A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3250698B1 (en) 2015-01-28 2019-11-27 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP4001419A1 (en) 2015-01-28 2022-05-25 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
DK3739045T3 (da) 2015-02-24 2024-10-21 Novozymes As Cellobiohydrolasevarianter og polynukleotider, som koder for dem
EP3067428A1 (en) 2015-03-12 2016-09-14 BETA RENEWABLES S.p.A. A process for producing a hydrolyzed mixture from a pre-treated ligno-cellulosic slurry comprising a slurry liquid and slurry solids
WO2016145527A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Iogen Corporation Process comprising acid pretreatment and enzymatic hydrolysis
WO2016145529A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Iogen Corporation Process for treating lignocellulosic feedstock comprising wet oxidation
BR112017017892A2 (pt) 2015-03-16 2018-04-10 Iogen Corp processo para produzir etanol.
WO2016169892A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016169893A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Whole fermentation broth
WO2016207144A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN105058546B (zh) * 2015-08-06 2018-05-08 浙江品创知识产权服务有限公司 一种酶处理环保松木板
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
US10662455B2 (en) 2015-12-18 2020-05-26 Iogen Corporation Sulfur dioxide and/or sulfurous acid pretreatment
US20190029272A1 (en) * 2016-02-10 2019-01-31 Novozymes A/S Preparation of a Baked Product Comprising Fibers Treated by a Cellulase
WO2017136915A1 (en) 2016-02-10 2017-08-17 Iogen Corporation Pretreatment of lignocellulosic biomass with sulfur dioxide and/or sulfurous acid
WO2017211957A1 (en) 2016-06-09 2017-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Seed train for large scale enzyme production
WO2018019948A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof
AT519059B1 (de) * 2016-09-02 2018-07-15 Andritz Ag Maschf Verfahren zur Abtrennung von Hemizellulosen aus Biomasse-Aufschlussprozesswasser oder verbrauchten Laugen
MY198644A (en) 2016-11-24 2023-09-13 Dsm Ip Assets Bv Enzyme composition
MY206033A (en) 2016-11-24 2024-11-26 Dsm Ip Assets Bv Enzyme composition
WO2018185071A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN108866025B (zh) * 2017-05-10 2021-04-13 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种纤维素酶制剂及其应用
WO2019072732A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Dsm Ip Assets B.V. PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC MATERIAL AND FERMENTATION OF SUGARS
MX2020004287A (es) 2017-10-27 2020-07-29 Xyleco Inc Procesamiento de biomasa.
WO2019086370A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN111278986A (zh) 2017-10-30 2020-06-12 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
CA3078822A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Iogen Corporation Low temperature sulfur dioxide pretreatment
CA3078833A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Iogen Corporation Low temperature pretreatment with sulfur dioxide
EP3530743A1 (en) 2018-02-21 2019-08-28 Cambridge Glycoscience Ltd Method of production
BR112020018791A2 (pt) 2018-03-28 2020-10-13 Dsm Ip Assets B.V. composição de enzima
WO2019185681A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
US11312977B2 (en) 2018-04-06 2022-04-26 Iogen Corporation Pretreatment with lignosulfonic acid
US10940094B2 (en) 2018-04-27 2021-03-09 Pilleve, Inc. Pill dispensing assembly
MY202507A (en) 2018-05-17 2024-05-01 Dsm Ip Assets Bv Process for producing a polypeptide
FI3802843T3 (fi) 2018-05-30 2023-05-08 Versalis Spa Menetelmä lignoselluloosamateriaalin entsymaattista hydrolyysiä ja sokerien käymistä varten
CN108841810B (zh) * 2018-07-21 2021-08-27 湖北大学 一种多功能纤维素酶基因及其应用
CA3109239A1 (en) 2018-08-15 2020-02-20 Cambridge Glycoscience Ltd Novel compositions, their use, and methods for their formation
CN108976302B (zh) * 2018-08-17 2021-04-13 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 用于催化木质纤维素糖化的纤维小体酶制剂
WO2020058249A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058248A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058253A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
CN112912511A (zh) 2018-10-24 2021-06-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于碳水化合物材料酶促水解和糖发酵的方法
RU2696074C1 (ru) * 2018-11-16 2019-07-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи Штамм мицелиального гриба trichoderma reesei - продуцент комплекса эндоглюканазы, ксиланазы и пектиназ для получения белковых добавок на основе зернового и зернобобового сырья для применения в кормопроизводстве
EP3938525A1 (en) 2019-03-12 2022-01-19 DSM IP Assets B.V. Process for producing a fermentation broth
CA3142488A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 Danisco Us Inc Methods for improving the amino acid content of animal feed products
EP4013240A1 (en) 2019-08-16 2022-06-22 Cambridge Glycoscience Ltd Methods of treating biomass to produce oligosaccharides and related compositions
WO2021048164A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2021066695A1 (en) * 2019-10-04 2021-04-08 Sharetex Ab Process for manufacturing organic chemicals and/or distillate hydrocarbon fuels from waste textiles
EP4072318A2 (en) 2019-12-12 2022-10-19 Cambridge Glycoscience Ltd Low sugar multiphase foodstuffs
WO2022013148A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of biogas
BR112023020370A2 (pt) 2021-04-06 2023-11-21 Dsm Ip Assets Bv Composição de enzimas
EP4320258A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
CN117178059A (zh) 2021-04-06 2023-12-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶组合物
CN116670296A (zh) 2021-04-08 2023-08-29 维尔萨利斯股份公司 用于制备糖产品和发酵产品的方法
TWI796066B (zh) * 2021-12-27 2023-03-11 行政院原子能委員會核能研究所 廢紙容器處理方法及使用廢紙容器水解液生產聚羥基烷酸酯的方法
CN119630280A (zh) 2022-05-14 2025-03-14 诺维信公司 用于预防、处理、抑制和/或消除植物病原性侵染和感染的组合物和方法
CN121472198B (zh) * 2026-01-12 2026-03-20 上海康地恩生物科技有限公司 一种高比活纤维素酶突变体及其应用

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4966850A (en) * 1987-01-21 1990-10-30 Forintek Canada Corp. Production of thermostable xylanase and cellulase
CA2082279C (en) 1990-05-09 2007-09-04 Grethe Rasmussen Cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
US5997913A (en) 1990-12-10 1999-12-07 Genencor International, Inc. Method enhancing flavor and aroma in foods by overexpression of β-glucosidase
WO1992010581A1 (en) 1990-12-10 1992-06-25 Genencor International, Inc. IMPROVED SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF THE β-GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESEI
DE69133035T2 (de) 1991-01-16 2003-02-13 The Procter & Gamble Company, Cincinnati Kompakte Waschmittelzusammensetzungen mit hochaktiven Cellulasen
AU679211B2 (en) 1993-03-10 1997-06-26 Novozymes A/S Enzymes with xylanase activity from aspergillus aculeatus
US6117664A (en) 1994-03-03 2000-09-12 Novo Nordisk A/S Alkaline cellulases
JP3107977B2 (ja) * 1994-08-29 2000-11-13 明治製菓株式会社 新規セルラーゼおよびその遺伝子
DE69535733T2 (de) 1994-10-06 2009-04-23 Novozymes A/S Ein enzympräparat mit endoglucanase aktivität
EP0815209B2 (en) * 1995-03-17 2015-02-25 Novozymes A/S Novel endoglucanases
JPH10510720A (ja) 1995-10-13 1998-10-20 ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ タンパク質検出法
US6723549B2 (en) * 1995-10-17 2004-04-20 Ab Enzymes Oy Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
GB9617184D0 (en) 1996-08-15 1996-09-25 Danisco Enzyme
BR9711479B1 (pt) * 1996-09-17 2009-08-11 variante de celulase tendo uma resistência aumentada a tensìdeo de ánion.
US5811381A (en) * 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
EP0843041A1 (en) 1996-11-13 1998-05-20 Novo Nordisk A/S Garments with considerable variation in abrasion level and process for its production using cellulolytic enzymes
FR2786784B1 (fr) 1998-12-04 2003-01-24 Lesaffre & Cie FRAGMENT D'ADN CODANT POUR LA XYLANASE THERMOSTABLE XynA DE THERMOASCUS
EP1142992A4 (en) * 1998-12-24 2003-05-14 Takara Bio Inc POLYPEPTIDES
GB9928968D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Danisco Enzyme
US6555350B2 (en) 2000-02-17 2003-04-29 Forskningscenter Riso Method for processing lignocellulosic material
WO2001070998A1 (en) 2000-03-20 2001-09-27 Dsm N.V. Talaromyces emersonii beta-glucanases
ES2394481T3 (es) 2000-09-21 2013-02-01 Basf Se Xilanasa de talaromyces
ES2266265T3 (es) 2000-09-25 2007-03-01 Iogen Energy Corporation Metodo para la produccion de glucosa con una mezcla de celulosa que comprende una celulosa modificada.
AU2001292292A1 (en) 2000-09-29 2002-04-08 Meiji Seika Kaisha Ltd. Novel enzyme having beta-glucosidase activity and use thereof
TWI301412B (en) * 2001-04-09 2008-10-01 Lonza Ag Pharmaceutical composition and injection solution for improving the well-being of poultry
JP2004527261A (ja) 2001-05-18 2004-09-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ セロビアーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
ES2533923T3 (es) * 2001-06-26 2015-04-16 Novozymes A/S Polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa I y polinucleótidos que codifican los mismos
US6982159B2 (en) * 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
WO2003062409A2 (en) 2002-01-25 2003-07-31 Dsm Ip Assets B.V. Thermostable enzyme compositions
ATE481496T1 (de) 2002-03-15 2010-10-15 Iogen Energy Corp Verfahren zur herstellung von glukose durch verwendung von endoglucanase-core-protein zur verbesserten rückgewinnung und wiederverwendung des enzyms
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
WO2004016760A2 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 Genencor International, Inc. Novel variant hyprocrea jecorina cbh1 cellulases
US20060035800A1 (en) 2002-12-11 2006-02-16 Novozymes A/S Detergent composition
EP1578964B2 (en) * 2002-12-20 2013-09-04 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase ii activity and polynucleotides encoding same
CN101374948B (zh) * 2003-04-01 2012-04-11 金克克国际有限公司 灰腐质霉cbh1.1变体
ES2437198T3 (es) * 2003-10-28 2014-01-09 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos
CN1934249B (zh) 2004-01-16 2012-11-14 诺维信股份有限公司 降解木质素纤维素材料的方法
WO2005074656A2 (en) 2004-02-06 2005-08-18 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8097445B2 (en) * 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
EP1737951B1 (en) 2004-04-16 2010-05-26 AB Enzymes Oy Method and dna constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi
FI118012B (fi) 2004-06-04 2007-05-31 Valtion Teknillinen Menetelmä etanolin valmistamiseksi
US7741093B2 (en) * 2005-04-29 2010-06-22 Ab Enzymes Oy Cellulases and their uses
BRPI0609906A8 (pt) * 2005-04-29 2017-11-21 Ab Enzymes Oy proteína de fusão de celulase, seu processo de produção e composição detergente contendo a mesma, vetor de expressão, célula hospedeira, preparação de enzima, processos para desbotamento e para bioacabamento e métodos de tratamento de fibra celulósica contendo material têxtil, para tratar fibra ou polpa derivada de madeira e para melhorar a qualidade de ração animal
FI118979B (fi) 2005-04-29 2008-05-30 Metso Automation Oy Menetelmä sakeuden mittaamiseksi, katkojarakenne ja sakeusmittari
US7256032B2 (en) 2005-12-22 2007-08-14 Ab Enzymes Oy Enzymes
TWI771890B (zh) 2013-03-14 2022-07-21 美商安美基公司 用於增加重組蛋白質之甘露糖含量之方法

Also Published As

Publication number Publication date
RU2458128C2 (ru) 2012-08-10
ES2501944T9 (es) 2014-10-22
DK2453013T3 (en) 2016-07-25
ES2527681T3 (es) 2015-01-28
AU2006326963A1 (en) 2007-06-28
EP2453014A1 (en) 2012-05-16
CA2632502A1 (en) 2007-06-28
WO2007071818A1 (en) 2007-06-28
TWI391489B (zh) 2013-04-01
US9758777B2 (en) 2017-09-12
ES2501944T3 (es) 2014-10-02
EP2453013A1 (en) 2012-05-16
CA2833029C (en) 2018-03-27
AP2924A (en) 2014-05-31
DK2453014T3 (en) 2016-08-01
US20140322762A1 (en) 2014-10-30
BRPI0620287B1 (pt) 2018-12-18
EP2453014B1 (en) 2016-06-08
EP1963498A4 (en) 2010-01-06
CN101384713A (zh) 2009-03-11
CN101384713B (zh) 2013-03-20
AR058721A1 (es) 2008-02-20
TW200801195A (en) 2008-01-01
EP1963498B1 (en) 2014-08-13
CN102174492A (zh) 2011-09-07
EP2453013A9 (en) 2012-11-28
FI20051318A0 (fi) 2005-12-22
ES2582320T3 (es) 2016-09-12
BRPI0620287A2 (pt) 2011-11-08
CA2632502C (en) 2016-07-19
EP2319920A1 (en) 2011-05-11
US20180044656A1 (en) 2018-02-15
US20110045544A1 (en) 2011-02-24
AU2006326963B2 (en) 2012-03-29
EP2319920B1 (en) 2014-12-03
ES2582078T3 (es) 2016-09-09
FI20051318L (fi) 2006-12-28
US8409836B2 (en) 2013-04-02
CN102174492B (zh) 2014-01-01
US20090042266A1 (en) 2009-02-12
RU2008123954A (ru) 2010-01-27
US9593324B2 (en) 2017-03-14
AP2008004509A0 (en) 2008-06-30
US20130224801A1 (en) 2013-08-29
CA2833029A1 (en) 2007-06-28
EP1963498A1 (en) 2008-09-03
EP2453013B1 (en) 2016-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120045B (fi) Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
FI122937B (fi) Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
CA2994320C (en) Treatment of cellulosic material and enzymes useful therein
Class et al. Patent application title: Treatment of Cellulosic Material and Enzymes Useful Therein Inventors: Jari Vehmaanperä (Klaukkala, FI) Jari Vehmaanperä (Klaukkala, FI) Marika Alapuranen (Rajamaki, FI) Terhi Puranen (Nurmijarvi, FI) Terhi Puranen (Nurmijarvi, FI) Matti Siika-Aho (Helsinki, FI) Jarno Kallio (Jarvenpaa, FI) Jarno Kallio (Jarvenpaa, FI) Satu Hooman (Espoo, FI) Sanni Voutilainen (Lohja, FI) Teemu Halonen (Espoo, FI) Liisa Viikari (Helsinki, FI) Assignees: Roal OY

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120045

Country of ref document: FI

TC Name/ company changed in patent

Owner name: AB ENZYMES FINLAND OY, FI