ES2679282T3 - Porcinos transgénicos que carecen de cadena ligera de inmunoglobulina endógena - Google Patents

Abstract

Un animal porcino transgénico que carece de expresión de al menos un alelo del gen de inmunoglobulina de cadena ligera kappa endógena porcina, en el que el al menos un alelo del gen de la cadena ligera kappa porcina se inactiva mediante un evento de orientación genética, en el que el evento de selección genética comprende la interrupción de la región constante kappa.

Description

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DESCRIPCION

Porcinos transgénicos que carecen de cadena ligera de inmunoglobulina endógena CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención proporciona animales porcinos, tejidos y órganos, así como células y líneas celulares derivadas de dichos animales, tejidos y órganos, que carecen de expresión de inmunoglobulina endógena funcional. La presente invención también proporciona animales, tejidos y órganos porcinos, así como células y líneas celulares derivadas de dichos animales, tejidos y órganos, que expresan inmunoglobulina xenógena, tal como humana. También se describen ungulados, tales como secuencias de ADN genómico porcino de inmunoglobulinas porcinas de cadena pesada y ligera. Dichos animales, tejidos, órganos y células se pueden utilizar en investigación y terapia médica. Además, se describen métodos para preparar dichos animales, órganos, tejidos y células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Un antígeno es un agente o sustancia que puede ser reconocida por el cuerpo como "extraños". A menudo, es solo un grupo químico relativamente pequeño de una sustancia extraña más grande que actúa como antígeno, por ejemplo, un componente de la pared celular de una bacteria. La mayoría de los antígenos son proteínas, aunque los carbohidratos pueden actuar como antígenos débiles. Las bacterias, los virus y otros microorganismos comúnmente contienen muchos antígenos, como el polen, los ácaros del polvo, los mohos, los alimentos y otras sustancias. El cuerpo reacciona a los antígenos produciendo anticuerpos. Los anticuerpos (también llamados inmunoglobulinas (Igs)) son proteínas que son fabricadas por células del sistema inmune que se unen a un antígeno o proteína extraña. Los anticuerpos circulan en el suero de la sangre para detectar antígenos extraños y constituyen la parte de la globulina gamma de las proteínas sanguíneas. Estos anticuerpos interactúan químicamente con el antígeno de una manera muy específica, como dos piezas de un rompecabezas, formando un complejo antígeno/anticuerpo o complejo inmune. Esta unión neutraliza o provoca la destrucción del antígeno.

[0003] Cuando un vertebrado primero se encuentra con un antígeno, exhibe una respuesta inmune humoral primaria. Si el animal encuentra el mismo antígeno después de unos días, la respuesta inmune es más rápida y tiene una mayor magnitud. El encuentro inicial hace que los clones específicos de células inmunes (células B) proliferen y se diferencien. Los linfocitos de progenie incluyen no solo células efectoras (células productoras de anticuerpos) sino también clones de células de memoria, que retienen la capacidad de producir células efectoras y de memoria después de la estimulación por el antígeno original. Las células efectoras viven solo unos pocos días. Las células de memoria viven durante toda la vida y pueden reactivarse mediante una segunda estimulación con el mismo antígeno. Por lo tanto, cuando se encuentra un antígeno por segunda vez, sus células de memoria producen rápidamente células efectoras que producen rápidamente cantidades masivas de anticuerpos.

[0004] Mediante la explotación de la capacidad única de los anticuerpos para interactuar con los antígenos de una manera altamente específica, los anticuerpos se han desarrollado como moléculas que pueden ser fabricadas y utilizadas tanto para aplicaciones diagnósticas como terapéuticas. Debido a su capacidad única de unirse a epítopos antigénicos, se pueden usar anticuerpos policlonales y monoclonales para identificar moléculas que portan ese epítopo o se pueden dirigir, por sí mismos o junto con otro resto, a un sitio específico para diagnóstico o terapia. Se pueden generar anticuerpos policlonales y monoclonales contra prácticamente cualquier patógeno o objetivo biológico. El término anticuerpo policlonal se refiere a sueros inmunes que generalmente contienen anticuerpos específicos de patógenos de diversos isotipos y especificidades. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales consisten en un único tipo de inmunoglobulina, que representa un isotipo con una especificidad.

[0005] En 1890, Shibasaburo Kitazato y Emil Behring llevaron a cabo el experimento fundamental que demostró que la inmunidad puede transmitirse de un animal a otro mediante la transferencia del suero de un animal inmune a un animal no inmune. Este experimento histórico sentó las bases para la introducción de la inmunización pasiva en la práctica clínica. Sin embargo, la terapia sérica a gran escala se abandonó en gran medida en la década de 1940 debido a la toxicidad asociada con la administración de sueros heterólogos y la introducción de una quimioterapia antimicrobiana eficaz. Actualmente, dicha terapia con anticuerpos policlonales está indicada para tratar enfermedades infecciosas en relativamente pocas situaciones, como terapia de reemplazo en pacientes con deficiencia de inmunoglobulina, profilaxis posterior a la exposición contra varios virus (p. ej., rabia, sarampión, hepatitis A y B, varicela) y neutralización de toxinas (difteria, tétanos y botulismo). A pesar del uso limitado de la terapia sérica, en los Estados Unidos, se requieren más de 16 toneladas métricas de anticuerpos humanos cada año para la terapia con anticuerpos intravenosos. Existen niveles de uso comparables en las economías de la mayoría de los países altamente industrializados, y se puede esperar que la demanda crezca rápidamente en los países en desarrollo. Actualmente, el anticuerpo humano para la inmunización pasiva se obtiene a partir del suero agrupado de los donantes. Por lo tanto, existe una limitación inherente en la cantidad de anticuerpo humano disponible para terapias terapéuticas y profilácticas.

[0006] El uso de anticuerpos para la inmunización pasiva contra agentes de guerra biológica representa una

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estrategia de defensa muy prometedora. La última línea de defensa contra tales agentes es el sistema inmune del individuo expuesto. Las actuales estrategias de defensa contra las armas biológicas incluyen medidas tales como una mayor vigilancia epidemiológica, la vacunación y el uso de agentes antimicrobianos. Dado que la amenaza potencial de guerra biológica y bioterrorismo es inversamente proporcional al número de personas inmunes en la población diana, los agentes biológicos son armas potenciales solo contra poblaciones con una proporción sustancial de personas susceptibles.

[0007] La vacunación puede reducir la susceptibilidad de una población frente a amenazas específicas, siempre que exista una vacuna segura que pueda inducir una respuesta protectora. Desafortunadamente, inducir una respuesta protectora mediante la vacunación puede tomar más tiempo que el tiempo transcurrido entre la exposición y el inicio de la enfermedad. Además, muchas vacunas requieren dosis múltiples para lograr una respuesta inmune protectora, lo que limitaría su utilidad en una emergencia para proporcionar una profilaxis rápida después de un ataque. Además, no todos los beneficiarios de la vacuna brindan una respuesta de protección, incluso después de recibir el cronograma de vacunación recomendado.

[0008] Los fármacos pueden proporcionar protección cuando se administran después de la exposición a ciertos agentes, pero ninguno está disponible contra muchos agentes potenciales de la guerra biológica. Actualmente, no hay medicamentos de molécula pequeña disponibles que eviten la enfermedad después de la exposición a toxinas preformadas. La única intervención actualmente disponible que podría proporcionar un estado de inmunidad inmediata es la inmunización pasiva con anticuerpos protectores (Arturo Casadevall "Passive Antibody Administration (Immediate Immunity) as a Specific Defense Against Biological Weapons" from Emerging Infectious Diseases, publicado el 12/09/2002).

[0009] Además de proporcionar inmunidad protectora, terapias basadas en anticuerpos de módem constituyen una opción potencialmente útil contra las bacterias patógenas recién emergentes, hongos, virus y parásitos (A. Casadevall y M.D. Scharff, Clinical Infectious Diseases 1995; 150). Terapias de pacientes con tumores malignos y cáncer (C. Botti y col., Leukemia 1997; Suppl 2: S55-59; B. Bodey, S.E. Siegel, y H.E. Kaiser, Anticancer Res 1996; 16 (2): 661), terapia de rechazo resistente a esteroides de órganos trasplantados así como de enfermedades autoinmunes también se puede lograr mediante el uso de preparaciones monoclonales o policlonalerales (N. Bonnefoy-Berard y J.P.Revillard, J Heart Lung Transplant 1996; 15 (5): 435-442; C. Colby, y col. Ann Pharmacother 1996; 30 (10): 1164-1174; M.J. Dugan, y col., Ann Hematol 1997; 75 (1- 2): 41 2; W. Cendrowski, Boll Ist Sieroter Milan 1997; 58 (4): 339 - 343; L.K. Kastrukoff, y col. Can J Neurol Sci 1978; 5 (2): 175178; J.E. Walker y col., J. Neurol Sci 1976; 29 (2-4): 303309).

[0010] Los recientes avances en la tecnología de producción de anticuerpos proporcionan los medios para generar reactivos de anticuerpos humanos, evitando al mismo tiempo las toxicidades asociadas con la terapia de suero humano. Las ventajas de las terapias basadas en anticuerpos incluyen la versatilidad, la baja toxicidad, la especificidad del patógeno, la mejora de la función inmune y la farmacocinética favorable.

[0011] El uso clínico de anticuerpos terapéuticos monoclonales ha surgido recientemente. Los anticuerpos monoclonales ahora han sido aprobados como terapias en trasplantes, cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares e inflamación. En muchos más, anticuerpos monoclonales se encuentran en ensayos clínicos de última etapa para tratar una amplia gama de indicaciones de enfermedades. Como resultado, los anticuerpos monoclonales representan una de las clases más grandes de drogas actualmente en desarrollo.

[0012] A pesar de la reciente popularidad de anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos, existen algunos obstáculos para su uso. Por ejemplo, muchas aplicaciones terapéuticas para anticuerpos monoclonales requieren administraciones repetidas, especialmente para enfermedades crónicas tales como autoinmunidad o cáncer. Debido a que los ratones son convenientes para la inmunización y reconocen la mayoría de los antígenos humanos como extraños, los anticuerpos monoclonales contra dianas humanas con potencial terapéutico han sido típicamente de origen murino. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales murinos tienen desventajas inherentes como agentes terapéuticos humanos. Por ejemplo, requieren una dosificación más frecuente para mantener un nivel terapéutico de anticuerpos monoclonales debido a una semivida circulante más corta en humanos que los anticuerpos humanos. Más críticamente, la administración repetida de inmunoglobulina murina crea la posibilidad de que el sistema inmunitario humano reconozca la proteína del ratón como extraña, generando una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón, que puede causar una reacción alérgica grave. Esta posibilidad de eficacia y seguridad reducidas ha llevado al desarrollo de una serie de tecnologías para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales murinos.

[0013] Los anticuerpos policlonales son altamente potentes contra múltiples dianas antigénicas. Tienen la capacidad única de atacar y matar a una pluralidad de "objetivos en evolución" vinculados con enfermedades complejas. Además, de todas las clases de fármacos, los policlonales tienen la mayor probabilidad de mantener la actividad en caso de mutación de antígeno. Además, aunque los monoclonales tienen una actividad terapéutica limitada contra los agentes infecciosos, los policlonales pueden neutralizar las toxinas y dirigir las respuestas inmunitarias para eliminar los patógenos, así como los agentes de guerra biológica.

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[0014] El desarrollo de plataformas de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales para satisfacer la demanda futura de la capacidad de producción representa un área prometedora de que está siendo objeto de muchas investigaciones. Una estrategia especialmente prometedora es la introducción de genes de inmunoglobulina humana en ratones o animales domésticos grandes. Una extensión de esta tecnología incluiría la inactivación de sus genes de inmunoglobulinas endógenas. Los animales grandes, como las ovejas, los cerdos y el ganado, se utilizan actualmente en la producción de productos derivados del plasma, como suero hiperinmune y factores de coagulación, para uso humano. Esto apoyaría el uso de anticuerpos policlonales humanos de tales especies sobre la base de seguridad y ética. Cada una de estas especies produce naturalmente cantidades considerables de anticuerpos tanto en suero como en leche.

Disposición de genes que codifican inmunoglobulinas

[0015] Las moléculas de anticuerpo se ensamblan a partir de combinaciones de elementos génicos variables, y las posibilidades resultantes de combinar los muchos elementos génicos variables en la línea germinal permiten al huésped sintetizar anticuerpos para un número extraordinariamente grande de antígenos. Cada molécula de anticuerpo consta de dos clases de cadenas polipeptídicas, cadenas ligeras (L) (que pueden ser tanto cadenas L kappa (k) como cadenas L lambda (A)) y cadenas pesadas (H). Las cadenas pesadas y ligeras se unen para definir una región de unión para el epítopo. Una sola molécula de anticuerpo tiene dos copias idénticas de la cadena L y dos de la cadena H. Cada una de las cadenas está compuesta por una región variable (V) y una región constante (C). La región variable constituye el sitio de unión a antígeno de la molécula. Para lograr un reconocimiento de antígeno diverso, el ADN que codifica la región variable se somete a una reorganización genética. La secuencia de aminoácidos de la región constante es específica para un isotipo particular del anticuerpo, así como también el huésped que produce el anticuerpo y, por lo tanto, no se somete a una reorganización.

[0016] El mecanismo de reordenamiento de ADN es similar para la región variable de loci tanto de cadena pesada y de cadena ligera, aunque sólo se necesita un evento de unión para generar un gen de la cadena ligera mientras que dos son necesarias para generar un gen completo de cadena pesada. El modo más común de reordenamiento implica el bucle y la eliminación del ADN entre dos segmentos de genes. Esto ocurre cuando las secuencias de codificación de los dos segmentos de genes están en la misma orientación en el ADN. Un segundo modo de recombinación puede ocurrir entre dos segmentos de genes que tienen orientaciones transcripcionales opuestas. Este modo de recombinación es menos común, aunque tales reordenamientos pueden representar hasta la mitad de todas las uniones Vk a Jk; la orientación transcripcional de la mitad de los segmentos del gen Vk humano es opuesta a la de los segmentos del gen Jk.

[0017] La secuencia de ADN que codifica una región completa V es generada por la recombinación somática de los segmentos génicos separados. La región V, o dominio V, de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina está codificada por más de un segmento génico. Para la cadena ligera, el dominio V está codificado por dos segmentos de ADN separados. El primer segmento codifica los primeros 95-101 aminoácidos de la cadena ligera y se denomina segmento del gen V porque codifica la mayor parte del dominio V. El segundo segmento codifica el resto del dominio V (hasta 13 aminoácidos) y se denomina segmento de unión o gen J. La unión de un segmento génico V y J crea un exón continuo que codifica toda la región V de la cadena ligera. Para formar un ARN mensajero de cadena ligera de inmunoglobulina completo, el exón de la región V se une a la secuencia de la región C por corte y empalme de ARN después de la transcripción.

[0018] Una región V de cadena pesada se codifica en los segmentos de tres genes. Además de los segmentos génicos V y J (denominados Vh y Jh para distinguirlos de la cadena ligera Vl y Jl, hay un tercer segmento genético denominado segmento de diversidad o gen Dh, que se encuentra entre los segmentos del gen Vh y Jh. El proceso de recombinación que genera una región V de cadena pesada completa se produce en dos etapas separadas. En la primera, un segmento del gen Dh se une a un segmento del gen Jh; a continuación, un segmento de gen Vh reorganiza a DJh para hacer una region exón Vh completa. Al igual que con los genes de la cadena ligera, el empalme de ARN une la secuencia de la región V ensamblada al gen de la región C vecina.

[0019] La diversificación del repertorio de anticuerpos se produce en dos etapas: principalmente por reordenamiento ("recombinación V(D)J") de segmentos de genes Ig V, D y J en células B precursoras residentes en la médula ósea, y luego por la mutación somática y la recombinación de cambio de clase de estos genes de Ig reorganizados cuando se activan las células B maduras. La mutación somática de inmunoglobulina y el cambio de clase son fundamentales para la maduración de la respuesta inmune y la generación de una respuesta de "memoria".

[0020] Los loci genómicos de anticuerpos son muy grandes y que están situados en diferentes cromosomas. Los segmentos del gen de la inmunoglobulina están organizados en tres grupos o loci genéticos: los loci k, Ay de cadena pesada. Cada uno está organizado de forma ligeramente diferente. Por ejemplo, en humanos, los genes de inmunoglobulina se organizan de la siguiente manera. El locus de cadena ligera A se encuentra en el cromosoma 22 y un grupo de segmentos del gen Va está seguido por cuatro conjuntos de segmentos del gen Ja unidos cada uno a un único gen Ca. El locus de la cadena ligera k está en el cromosoma 2 y el grupo de segmentos de genes Vk es seguido por un grupo de segmentos de gen J kappa, y luego por un solo gen Ck. La organización del locus de cadena pesada, en el cromosoma 14, se asemeja a la del locus k, con grupos separados de segmentos de genes

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Vh, Dh y Jh y de genes Ch. El locus de la cadena pesada difiere de una manera importante: en lugar de una sola región C, contiene una serie de regiones C dispuestas una detrás de la otra, cada una de las cuales corresponde a un isotipo diferente. Hay cinco isotipos de cadena pesada de inmunoglobulina: IgM, IgG, IgA, IgE e IgD. En general, una célula expresa solo una a la vez, comenzando con IgM. La expresión de otros isotipos, como IgG, puede ocurrir a través del cambio de isotipo.

[0021] La unión de varios genes V, D y J es un evento completamente al azar que resulta en aproximadamente 50.000 diferentes combinaciones posibles para VDJ(H) y aproximadamente 1.000 para VJ(L). El apareamiento aleatorio posterior de las cadenas H y L lleva el número total de especificidades de anticuerpos a aproximadamente 107 posibilidades. La diversidad se incrementa aún más por la unión imprecisa de diferentes segmentos genéticos. Los reordenamientos ocurren en ambas hebras de ADN, pero solo se transcribe una hebra (debido a la exclusión alélica). Solo se produce una reorganización en la vida de una célula B debido a deleciones irreversibles en el ADN. Consecuentemente, cada célula B madura mantiene una especificidad inmunológica y se mantiene en la progenie o clon. Esto constituye la base molecular de la selección clonal; es decir, cada determinante antigénico desencadena la respuesta del clon preexistente de los linfocitos B que llevan la molécula receptora específica. El repertorio primario de las células B, que se establece mediante la recombinación V(D)J, está controlado principalmente por dos genes estrechamente unidos, el gen activador de la recombinación (RAG)-1 y RAG-2.

[0022] En la última década, ha sido revelada una considerable diversidad entre los vertebrados, tanto en la diversidad de genes Ig como en el desarrollo de repertorio de anticuerpos. Los roedores y humanos tienen cinco clases de cadenas pesadas, IgM, IgD, IgG, IgE e IgA, y cada una tiene cuatro subclases de IgG y una o dos subclases de IgA, mientras que los conejos tienen un solo gen de cadena pesada IgG pero 13 genes para diferentes subclases de IgA (Burnett, R.C. y col., EMBO J 8: 4047; Honjo, en Honjo, T, Alt. F.W. T.H. eds, Immunoglobulin Genes p. 123 Academic Press, Nueva York). Los cerdos tienen al menos seis subclases de IgG (Kacskovics, I et al. 1994 J Immunol 153: 3565), pero no IgD (Butler et al., 1996 Inter. Immunol 8: 1897 - 1904). Un gen que codifica IgD solo se ha descrito en roedores y primates. La diversidad en el mecanismo del desarrollo del repertorio se ejemplifica al contrastar el patrón observado en roedores y primates con el reportado para pollos, conejos, cerdos y bovidos domesticados. Mientras que el primer grupo tiene una gran cantidad de genes VH que pertenecen a siete a 10 familias (Rathbun, G. In Hongo, T. Alt. F.W. y Rabbitts, T.H., eds, Inmunoglobulin Genes, p.63, Academic press Nueva York), los genes VH de cada miembro de este último grupo pertenecen a una familia de un solo gen VH (Sun, J. et al 1994 J. Immunol 1553:. 56.118; Dufour, V et al.1996, J Immunol 156:. 2163). Con la excepción del conejo, esta familia está compuesta de menos de 25 genes. Considerando que los roedores y primates pueden utilizar cuatro a seis segmentos JH, sólo un único JH está disponible para el desarrollo de repertorio en el pollo (Reynaud et al 1989 Adv Immunol 57: 353). Del mismo modo, Butler et al. (1996 Inter Immunol 8: 1897-1904) planteó la hipótesis de que los cerdos puede ser similar a la de pollo en tener sólo un único gen Jh. Estas especies generalmente tienen menos genes V, D y J; en el cerdo y la vaca existe una única familia de genes VH, que consta de menos de 20 segmentos génicos (Butler et al., Advances in Swine in Biomedical Research, eds: Tumbleson y Schook, 1996; Sinclair y col., J. Immunol. 159: 3883)., 1997). Junto con un menor número de segmentos de genes J y D, esto da como resultado una diversidad significativamente menor generada por la reorganización genética. Sin embargo, parece que hay un mayor número de genes de cadena ligera en estas especies. De manera similar a los humanos y los ratones, estas especies expresan una única cadena ligera k pero múltiples genes de cadena ligera A. Sin embargo, estos no parecen afectar la diversidad restringida que se logra mediante la reorganización.

[0023] Desde combinatoria unión de más de 100 Vh, 20-30 Dh de cuatro a seis segmentos génicos Jh y es un importante mecanismo de generación del repertorio de anticuerpos en seres humanos, las especies con menos segmentos Vh, Dh o Jh deben generar un repertorio más pequeño o usar mecanismos alternativos para el desarrollo del repertorio. Los rumiantes, cerdos, conejos y pollos utilizan varios mecanismos para generar diversidad de anticuerpos. En estas especies parece haber un importante desarrollo del repertorio secundario, que ocurre en tejidos linfoides altamente especializados, tales como parches ileales de Peyer (Binns y License, Adv. Exp. Med. Biol. 186: 661, 1985). El desarrollo del repertorio secundario ocurre en estas especies por un proceso de mutación somática que es un proceso aleatorio y no completamente entendido. El mecanismo para la diversificación de este repertorio parece ser la mutación moldeada, o la conversión génica (Sun y col., J. Immunol., 153: 5618, 1994) y la hipermutación somática.

[0024] La conversión génica es importante para la diversificación de anticuerpos en algunos vertebrados superiores, tales como pollos, conejos y vacas. En los ratones, sin embargo, los eventos de conversión parecen ser poco frecuentes entre los genes de anticuerpos endógenos. La conversión génica es un mecanismo diversificador distintivo caracterizado por transferencias de secuencias homólogas desde un segmento del gen V del anticuerpo donante a un segmento del gen V receptor. Si los segmentos donante y aceptor tienen numerosas diferencias de secuencia, entonces la conversión génica puede introducir un conjunto de cambios de secuencia en una región V por un solo evento. Dependiendo de la especie, los eventos de conversión génica pueden ocurrir antes y/o después de la exposición al antígeno durante la diferenciación de las células B (Tsai y col., International Immunology, Vol. 14, No. 1, 55-64, enero de 2002).

[0025] La hipermutación somática logra diversificación de genes de anticuerpos en todas las especies vertebradas superiores. Se tipifica por la introducción de mutaciones puntuales únicas en segmentos de anticuerpo V(D)J. En

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general, parece que la hipermutación se activa en las células B mediante estimulación antigénica.

Producción de animales con sistemas inmunes humanizados

[0026] A fin de reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos generados en ratones para la terapéutica humana, se han hecho diversos intentos para reemplazar las secuencias de proteínas murinas con secuencias de proteínas humanas en un proceso ahora conocido como humanización. Se han construido ratones transgénicos que tienen sus propios genes de inmunoglobulina funcionalmente reemplazados con genes de inmunoglobulina humana para que produzcan anticuerpos humanos tras la inmunización. La eliminación de la producción de anticuerpos de ratón se logra mediante la inactivación de los genes de Ig de ratón en células madre embrionarias (ES) mediante el uso de tecnología orientada a genes para eliminar secuencias que actúan en cis cruciales implicadas en el proceso de reordenamiento genético Ig de ratón y expresión. El desarrollo de células B en estos ratones mutantes podría ser restaurado por la introducción de CAL del tamaño de megabases que contienen un transgen minilocus de cadena L de configuración de línea germinal humana H y k. La expresión del anticuerpo completamente humano en estos ratones transgénicos fue predominante, a un nivel de varios 100 pg/l de sangre. Este nivel de expresión es varios cientos de veces mayor que el detectado en ratones de tipo salvaje que expresan el gen Ig humano, lo que indica la importancia de inactivar los genes Ig de ratón endógenos para mejorar la producción de anticuerpos humanos por ratones.

[0027] Los primeros intentos de humanización utilizan técnicas de biología molecular para construir anticuerpos recombinantes. Por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de ratón específico para un hapteno se injertaron en un armazón de anticuerpo humano, efectuando un reemplazo de CDR. El nuevo anticuerpo retuvo la especificidad de unión transmitida por las secuencias de CDR (P.T. Jones y col., Nature 321: 522 - 525 (1986)). El siguiente nivel de humanización implicaba combinar una región VH de ratón completa con una región constante humana tal como gammai (S.L. Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, págs. 6851-6855 (1984)). Sin embargo, estos anticuerpos quiméricos, que aún contienen más de 30% de secuencias xenogénicas, a veces son solo marginalmente menos inmunogénicos que los anticuerpos totalmente xenogénicos (M. Bruggemann y col., J. Exp. Med., 170, págs. 2153-2157). (1989)).

[0028] Posteriormente, los intentos se llevaron a cabo para introducir genes de inmunoglobulina humana en el ratón, creando con ello ratones transgénicos capaces de responder a antígenos con anticuerpos que tienen secuencias humanas (Bruggemann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. eE.UU. 86: 6709-6713 (1989)). Debido al gran tamaño de los loci genómicos de inmunoglobulina humana, se pensó que estos intentos estaban limitados por la cantidad de ADN, que podría mantenerse de forma estable mediante los vehículos de clonación disponibles. Como resultado, muchos investigadores se concentraron en producir mini loci que contienen números limitados de genes de la región V y que tienen distancias espaciales alteradas entre genes en comparación con la configuración natural o de línea germinal (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.569.825). Estos estudios indicaron que era posible producir anticuerpos de secuencia humana en ratones, pero quedaron serios obstáculos para obtener suficiente diversidad de especificidades de unión y funciones efectoras (isotipos) de estos animales transgénicos para satisfacer la creciente demanda de agentes terapéuticos de anticuerpos.

[0029] Con el fin de proporcionar diversidad adicional, el trabajo se ha realizado para agregar fragmentos grandes de la línea germinal del locus de Ig humana en los mamíferos transgénicos. Por ejemplo, la mayoría de los genes V, D y J de la región humana dispuestos con el mismo espaciado encontrado en la línea germinal no reordenada del genoma humano y las regiones constantes Cp y C8 humanas se introdujeron en ratones usando vectores de clonación de cromosoma artificial de levadura (CAL) (véase, por ejemplo, WO 94/02602). Un fragmento de ADN de 22 kb que comprende secuencias que codifican una región constante gamma-2 humana y las secuencias aguas arriba requeridas para la recombinación de cambio de clase se añadieron posteriormente al transgén anterior. Además, una porción de un locus kappa humana que comprende genes de la región Vk, Jk y Ck, también dispuesto con sustancialmente la misma separación que se encuentra en la línea germinal no reordenada del genoma humano, se introdujo en ratones usando YACS. La dirección del gen se usó para inactivar los loci del gen de la inmunoglobulina de cadena ligera IgH y kappa murina y tales cepas inactivadas se criaron con las cepas transgénicas anteriores para generar una línea de ratones que tienen las regiones constantes humanas V, D, J, Cp, CS, Cg2 así como los genes de la región Vk, Jk y Ck humanas en un fondo de inmunoglobulina murina inactivada (véase, por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO 94/02602 a Kucherlapati et al.; véase también Mendez et al., Nature Genetics 15: 146 - 156 (1997)).

[0030] Cromosomas artificiales de levadura como vectores de clonación en combinación con la orientación de genes de loci endógenos y cría de cepas de ratones transgénicos proporcionaron una solución para el problema de la diversidad de anticuerpos. Se obtuvieron varias ventajas con este enfoque. Una ventaja era que los YACs se pueden usar para transferir cientos de kilobases de ADN a una célula huésped. Por lo tanto, el uso de vehículos de clonación CAL permite la inclusión de porciones sustanciales de las regiones de cadena pesada y ligera de Ig humana en un ratón transgénico acercándose así al nivel de diversidad potencial disponible en el ser humano. Otra ventaja de este enfoque es que se ha demostrado que la gran cantidad de genes V restaura el desarrollo completo de células B en ratones deficientes en la producción de inmunoglobulinas murinas. Esto asegura que estos ratones reconstituidos están provistos de las células necesarias para montar una respuesta robusta de anticuerpos humanos

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a cualquier inmunógeno dado. (Véase, por ejemplo, WO 94/02602, L. Green y A. Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483495 (1998)). Una ventaja adicional es que las secuencias pueden eliminarse o insertarse en el CAL utilizando recombinación homóloga de alta frecuencia en levadura. Esto proporciona una ingeniería fácil de los transgenes CAL.

[0031] Además, Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) describen la generación de CAL que contienen fragmentos de configuración de línea germinal de 245 kb Y190 kb del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de la región central variable y constante. El trabajo de Green et al. recientemente se extendió a la introducción de más de aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de CAL de configuración de línea germinal del tamaño de megabases de loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa, respectivamente, para producir ratones XenoMouse™. Véase, por ejemplo, Mendez et al. Nature Genetics 15: 146 - 156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Medicina. 188: 483-495 (1998), Patente Europea N° EP 0 463 151 B1, Publicaciones PCT Núms. WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 98/24893.

[0032] Existen varias estrategias para la generación de mamíferos que producen anticuerpos humanos. En particular, existe el enfoque de "minilocus" tipificado por el trabajo de GenPharm International, Inc. y el Medical Research Council, CAL, la introducción de fragmentos grandes y sustancialmente de línea germinal de los loci de Ig tipificados por el trabajo de Abgenix, Inc. (anteriormente Cell Genesys). La introducción de loci completos o sustancialmente completos a través del uso de la fusión de microcélulas como se tipifica en el trabajo de Kirin Beer Kabushiki Kaisha.

[0033] En el enfoque minilocus, un locus de Ig exógeno es imitado por medio de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o más genes Vh, uno o más genes Dh, uno o más genes Jh, una región constante mu, y una segunda región constante (como una región constante gamma) se forman en una construcción para la inserción en un animal. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, 5.643.763; Patente Europea N° 0 546 073; Publicaciones PCT Nos WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884; Taylor et al. Nucleic Acids Research 20: 6287 - 6295 (1992), Chen et al. International Immunology 5: 647 - 656 (1993), Tuaillon et al. J. Immunol. 154: 6453 - 6465 (1995), Choi et al. Nature Genetics 4: 117 - 123 (1993), Lonberg et al. Nature 368: 856 - 859 (1994), Taylor et al. International Immunology 6: 579 - 591 (1994), Tuaillon et al. J. Immunol. 154: 6453 - 6465 (1995), y Fishwild et al. Nature Biotech. 14: 845 - 851 (1996).

[0034] En el enfoque de fusión de microcélulas, porciones o cromosomas humanos enteros se puede introducir en ratones (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea N° EP 0 843 961 A1). Los ratones generados usando este enfoque y que contienen el locus de la cadena pesada de Ig humana generalmente poseen más de una, y potencialmente todos los genes de región constante humana. Tales ratones producirán, por lo tanto, anticuerpos que se unen a antígenos particulares que tienen varias regiones constantes diferentes.

[0035] Mientras que los ratones siguen siendo el animal más desarrollado para la expresión de inmunoglobulinas humanas en humanos, los avances tecnológicos recientes han permitido el progreso para aplicar estas técnicas a otros animales, como las vacas. El enfoque general en ratones ha sido modificar genéticamente las células madre embrionarias de ratones para eliminar las inmunoglobulinas murinas y luego insertar los CAL que contienen inmunoglobulinas humanas en las células ES. Sin embargo, las células ES no están disponibles para las vacas u otros animales grandes como las ovejas y los cerdos. Por lo tanto, tuvieron que ocurrir varios desarrollos fundamentales incluso antes de que existiera la posibilidad de generar grandes animales con genes de inmunoglobulina noqueados y que expresan anticuerpos humanos. La alternativa a la manipulación de células ES para crear animales genéticamente modificados es la clonación utilizando células somáticas que han sido genéticamente modificadas. La clonación utilizando células somáticas genéticamente modificadas para la transferencia nuclear se ha logrado recientemente.

[0036] Desde el anuncio del nacimiento de Dolly (una oveja clonada) de una célula somática adulta en 1997 (Wilmut, I., et al (1997) Nature 385: 810-813), ungulados, incluyendo ganado vacuno (Cibelli, J et al 1998 Science 280: 1266 - 1258; Kubota, C. y col., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci 97: 990 - 995), cabras (Baguisi, A. y col., (1999) Nat. Biotechnology 17: 456 - 461), y los cerdos (Polejaeva, I.A., y col., 2000 Nature 407: 86 - 90, Betthauser, J. y col., 2000 Nat. Biotechnology 18: 1055 - 1059) han sido clonados.

[0037] El siguiente avance tecnológico fue el desarrollo de la técnica para modificar genéticamente las células antes de la transferencia nuclear para producir animales transgénicos. La publicación PCT n° WO 00/51424 de PPL Therapeutics describe la modificación genética diana de las células somáticas para la transferencia nuclear.

[0038] Posteriormente a estos acontecimientos fundamentales, se ha informado de knockouts de alelos individuales y dobles de los genes y el nacimiento de animales vivos con estas modificaciones. Entre 2002 y 2004, tres grupos independientes, Immerge Biotherapeutics, Inc. en colaboración con la Universidad de Missouri (Lai y otros (Science (2002) 295: 1089-1092) y Kolber-Simonds y otros (PNAS. (2004) 101 (19): 7335-40)), Alexion Pharmaceuticals

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(Ramsoondar y otros (Biol Reprod (2003) 69: 437-445) y Revivicor, Inc. (Dai y otros (Nature Biotechnology (2002) 20: 251- 255) & Phelps et al. (Science (2003) Jan 17; 299 (5605): 411-4)) produjeron cerdos que carecían de un alelo o ambos alelos del gen alfa-1,3-GT mediante transferencia nuclear desde células somáticas con deleciones genéticas dirigidas. En 2003, Sedai y otros (Transplantation (2003) 76: 900-902) informaron de la alteración selectiva de un alelo del gen alfa-1,3-GT en el ganado, seguido de la transferencia nuclear exitosa del núcleo de la célula genéticamente modificada y la producción de fetos transgénicos.

[0039] Por lo tanto, la viabilidad de eliminar genes de inmunoglobulina en animales grandes y la inserción de loci de inmunoglobulina humana en sus células recién ahora está empezando a ser explorado. Sin embargo, debido a la complejidad y las diferencias de especie de los genes de inmunoglobulina, las secuencias genómicas y la disposición de Ig kappa, lambda y cadenas pesadas siguen siendo poco conocidas en la mayoría de las especies. Por ejemplo, en cerdos, la secuencia y organización genómica parcial solo se ha descrito para la constante de cadena pesada alfa, constante de cadena pesada mu y constante de cadena pesada delta (Brown and Butler Mol Immunol. 1994 Jun; 31 (8): 633-42, Butler y col. Vet Immunol. Immunopathol. 1994 Oct; 43 (1- 3): 5 - 12, y Zhao y col. J. Immunol., 3 de agosto de 2003; 171 (3): 1312 - 8).

[0040] En las vacas, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina ha sido mapeado (Zhao et al 2003 J. Biol Chem 278: 35024-32) y la secuencia de ADNc para el gen kappa bovino es conocido (Véase, por ejemplo, Publicación de Patente de EE.UU. N° 2003/0037347). Además, se han secuenciado aproximadamente 4,6 kb del locus de la cadena pesada mu bovina y se han creado terneros transgénicos con expresión disminuida de inmunoglobulinas de cadena pesada mediante la ruptura de uno o ambos alelos de la cadena pesada mu bovina. Además, se ha introducido en las vacas (vacas TC) un vector de cromosoma artificial (CAM) de mamífero que contiene todas las secuencias no ordenadas de la cadena H humana de Ig y la cadena L K con la tecnología de transferencia cromosómica mediada por microcélulas y transferencia nuclear de células de fibroblastos fetales bovinos (véase, por ejemplo, Kuroiwa y col., 2002 Nature Biotechnology 20: 889, Kuroiwa y col., 2004 Nat Genet. Jun 6 Epub, Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos 2003/0037347, 2003/0056237, 2004/0068760 y Publicación PCT n° WO 02/07648).

[0041] Aunque se ha hecho un progreso significativo en la producción de bovino que expresan inmunoglobulina humana, poco se ha logrado en otros animales grandes, tales como ovejas, cabras y cerdos. Aunque la información de secuencia de cADN para genes de inmunoglobulinas de ovejas, cabras y cerdos está fácilmente disponible en Genbank, la naturaleza única de los loci de inmunoglobulinas, que experimentan reordenamientos masivos, crea la necesidad de caracterizar más allá de secuencias que se sabe están presentes en mARN (o cADNs). Ya que los loci de inmunoglobulina son modulares y las regiones de codificación son redundantes, la eliminación de una región de codificación conocida no asegura la función alterada del locus. Por ejemplo, si se eliminase la región de codificación de una región variable de cadena pesada, la función del locus no se alteraría significativamente debido a que cientos de otros genes variables de función permanecen en el locus. Por lo tanto, primero se debe caracterizar el lugar para identificar un potencial "talón de Aquiles".

[0042] El documento WO 03/047336 describe ratones transgénicos que son homocigotos para un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina endógena inactivada.

[0043] A pesar de algunos avances en la expresión de anticuerpos humanos en el ganado, mayores desafíos permanecen para la inactivación de los genes de Ig bovina endógenos, aumentando los niveles de expresión de los anticuerpos humanos y la creación de la expresión del anticuerpo humano en otros animales grandes, tales como los porcinos, para los que la secuencia y disposición de genes de inmunoglobulinas son en gran parte desconocidos.

[0044] Por lo tanto, un objeto de la presente descripción consiste en proporcionar la disposición de secuencia del gen de inmunoglobulina de línea germinal ungulada.

[0045] Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar nuevas secuencias genómicas de inmunoglobulina ungulada.

[0046] Un objeto adicional de la presente descripción consiste en proporcionar células, tejidos y animales que carecen de expresión de al menos un alelo de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera.

[0047] Otro objeto de la presente descripción consiste en proporcionar ungulados que expresan inmunoglobulinas humanas.

[0048] Un objeto adicional de la presente descripción consiste en proporcionar métodos para generar células, tejidos y animales que carece de al menos un alelo de nuevas secuencias génicas de inmunoglobulina ungulada y/o expresa inmunoglobulinas humanas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0049] La invención en su sentido más amplio se define como en las reivindicaciones independientes. La invención

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proporciona un animal porcino transgénico que carece de expresión de al menos un alelo del gen de inmunoglobulina de cadena ligera kappa endógena porcina, en donde el al menos un alelo del gen de la cadena ligera kappa porcina se inactiva mediante un evento de dirección genética, donde el evento de selección genética comprende interrupción de la región constante kappa.

[0050] La invención también proporciona un método para producir el porcino transgénico de la invención, que comprende (i) una etapa de interrupción de genes a través de (a) sustitución, deleción o inserción técnicas y/o (b) la recombinación homóloga; y/o (ii) una etapa de clonación usando un núcleo donante de una célula en la que ha sido inactivado al menos un alelo del gen de inmunoglobulina.

[0051] La invención también proporciona una célula, tejido u órgano derivado de un animal porcino de la invención, en donde el tejido de la célula u órgano carece de expresión de al menos un alelo del gen de inmunoglobulina de cadena ligera kappa endógena porcina, en donde el al menos un alelo del gen de la cadena ligera kappa porcina se inactiva a través de un evento de dirección genética, en donde el evento de dirección genética comprende la interrupción de la región constante kappa.

SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

[0052] En la presente memoria se describe por primera vez la disposición de la secuencia del gen de la línea germinal de inmunoglobulina del ungulado, así como las nuevas secuencias genómicas. Además, se describen células, tejidos y animales ungulados novedosos que carecen de expresión de al menos un alelo de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera. En base a este descubrimiento, se pueden producir ungulados que carecen completamente de expresión de al menos un alelo de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera. Además, estos ungulados se pueden modificar adicionalmente para expresar loci xenogenéticos, tales como loci de inmunoglobulina humana o fragmentos de los mismos.

[0053] Aquí se describe un ungulado transgénico que carece de cualquier expresión de inmunoglobulinas endógenas funcionales. El ungulado puede carecer de cualquier expresión de inmunoglobulinas endógenas de cadena pesada y/o ligera.

[0054] La inmunoglobulina de cadena ligera puede ser una inmunoglobulina kappa y/o lambda. Los ungulados transgénicos se describen que carecen de expresión de al menos un alelo de una inmunoglobulina endógena en donde la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en cadena pesada, cadena ligera kappa y cadena ligera lambda o cualquier combinación de las mismas. La expresión de inmunoglobulinas endógenas funcionales se puede lograr mediante selección genética de los loci de inmunoglobulina endógena para prevenir la expresión de la inmunoglobulina endógena. El objetivo genético se puede lograr a través de la recombinación homóloga. El ungulado transgénico se puede producir mediante transferencia nuclear.

[0055] El ungulado transgénico que carece de cualquier expresión de inmunoglobulinas endógenas funcionales se puede modificar adicionalmente genéticamente para expresar loci de inmunoglobulina xenógena. Se describen animales porcinos que contienen un locus de inmunoglobulina xenogénica. El locus de inmunoglobulina xenógena puede ser una inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera o fragmento de la misma. El locus de inmunoglobulina xenógena puede ser un locus de cadena kappa o un fragmento del mismo y/o un locus de cadena lambda o un fragmento del mismo. Un cromosoma artificial (CA) puede contener el locus de inmunoglobulina xenógena. Entonces CA puede ser una levadura CA o una CA de mamífero. El locus xenógeno puede ser un locus de inmunoglobulina humana o un fragmento del mismo. El locus de inmunoglobulina humana puede ser el cromosoma 14 humano, el cromosoma 2 humano y el cromosoma 22 humano o fragmentos de los mismos. El locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier fragmento de un locus de inmunoglobulina humana que pueda experimentar una reorganización. El locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier fragmento de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana que puede experimentar reordenamiento. El locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier locus de inmunoglobulina humana o fragmento del mismo que pueda producir un anticuerpo tras la exposición a un antígeno. En particular, la inmunoglobulina humana exógena puede expresarse en células B para producir inmunoglobulina xenógena en respuesta a la exposición a uno o más antígenos.

[0056] En un aspecto de la presente invención, se proporcionan animales porcinos transgénicos que expresan una inmunoglobulina xenógena o fragmento del mismo, en donde la inmunoglobulina se puede expresar a partir de un locus de inmunoglobulina que se integra dentro de un cromosoma ungulado endógeno. En una realización, se proporcionan las células derivadas de animales porcinos transgénicos. En una realización, el locus de inmunoglobulina xenógena puede ser heredado por la descendencia. En otra realización, el locus de inmunoglobulina xenógena puede ser heredado a través de la línea germinal masculina por descendencia. En todavía otras realizaciones, un cromosoma artificial (CA) puede contener el locus de inmunoglobulina xenógena. En una realización, el CA puede ser un CA de mamífero. En una realización adicional, el locus xenógeno puede ser un locus de inmunoglobulina humana o un fragmento del mismo que puede experimentar una reordenación. En una realización, el locus de inmunoglobulina humana puede ser el cromosoma 14 humano, el cromosoma 2 humano y el cromosoma 22 humano o fragmentos de los mismos. El locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier

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fragmento de una inmunoglobulina humana que pueda experimentar una reorganización. En una realización, el locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier fragmento de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana que puede experimentar reordenamiento. El locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier locus de inmunoglobulina humana o fragmento del mismo que pueda producir un anticuerpo tras la exposición a un antígeno. En una realización particular, la inmunoglobulina humana exógena se puede expresar en células B para producir inmunoglobulina xenógena en respuesta a la exposición a uno o más antígenos.

[0057] Secuencias genómicas novedosas que codifican el locus de cadena pesada de inmunoglobulina ungulada se dan a conocer en el presente documento. Se describe una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una cadena pesada porcina que incluye al menos una región variable, dos regiones de diversidad, al menos cuatro regiones de unión y al menos una región constante, tal como la región constante mu, por ejemplo, como se representa en Seq ID N° 29. Se describe una secuencia de nucleótidos aislada que incluye al menos cuatro regiones de unión y al menos una región constante, tal como la región constante mu, de la secuencia genómica de la cadena pesada porcina, por ejemplo, como se representa en la Seq ID N° 4. Se describe la secuencia de nucleótidos que incluye la secuencia flanqueante 5' de la primera región de unión de la secuencia genómica de la cadena pesada porcina, por ejemplo, como se representa en la Seq ID N° 1. Además, se describe una secuencia de nucleótidos que incluye la secuencia flanqueante 3' uniendo la región de la secuencia genómica de la cadena pesada porcina, por ejemplo, como se representa en la región 3' de la Seq ID N° 4. Las secuencias de nucleótidos aisladas como se representa en las Seq ID N° 1, 4 o 29 son divulgadas aquí. Se describen también secuencias de ácido nucleico al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% homólogas a las Seq ID Nos 1, 4 o 29. Además, se describen secuencias de nucleótidos que contienen al menos 10, 15, 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de Seq ID Nos 1, 4 o 29. La secuencia de nucleótidos puede contener al menos 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de Seq ID N° 4 o los residuos 1-9.070 de Seq ID N° 29.

La secuencia de nucleótidos puede contener los residuos 9.070-11039 de la Seq ID N° 29. También se describen secuencias de nucleótidos que se hibridan, opcionalmente en condiciones restrictivas, con las Seq ID Nos 1, 4 o 29, así como con los nucleótidos homólogos de las mismas.

[0058] También se describen secuencias genómicas novedosas que codifican el locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina ungulada. Aquí se describe la primera secuencia genómica informada de regiones de cadena ligera kappa de ungulados. Se describe la secuencia de ácido nucleico que codifica el locus de la cadena ligera kappa porcina. La secuencia de ácido nucleico puede contener al menos una región de unión, una región constante y/o una región potenciadora del locus de la cadena ligera kappa. La secuencia de nucleótidos puede incluir al menos cinco regiones de unión, una región constante y una región potenciadora, por ejemplo, como se representa en la Seq ID N° 30. En la presente se describe una secuencia de nucleótidos aislada que contiene al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o cinco regiones de unión y una secuencia flanqueante 3' a la región de unión de la cadena ligera kappa genómica porcina, por ejemplo, como se representa en la Seq ID N° 12. Una secuencia de nucleótidos aislada de la cadena ligera kappa genómica porcina contiene una secuencia flanqueante 5' en la primera región de unión, por ejemplo, como se representa en la Seq ID N° 25. En la presente se describe una secuencia de nucleótidos aislada que contiene la secuencia flanqueante 3' de la región constante y, opcionalmente, la porción 5' de la región potenciadora, de la cadena ligera kappa genómica porcina, por ejemplo, como se representa en las Seq. ID. Nos 15, 16 y/o 19.

[0059] Las secuencias aisladas de nucleótidos representadas en Seq ID Nos 30, 12, 25, 15, 16 o 19 también se describen en este documento. Las secuencias de ácido nucleico al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% homólogas a las Seq ID Nos 30, 12, 25, 15, 16 o 19 también se describen en el presente documento. Además, las secuencias de nucleótidos que contienen al menos 10, 15, 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de Seq ID Nos 30, 12, 25, 15, 16 o 19 se describen en este documento. En la presente memoria se describen adicionalmente secuencias de nucleótidos que se hibridan, opcionalmente en condiciones restrictivas, con las Seq ID Nos 30, A2, 25, 15, 16 o 19, así como con los nucleótidos homólogos a las mismas.

[0060] Las secuencias genómicas novedosas que codifican el locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina ungulada se dan a conocer en el presente documento. Aquí se divulga la primera secuencia genómica informada de regiones de cadena ligera lambda de ungulados. Los nucleótidos de cadena ligera lambda porcina incluyen un concatámero de unidades J a C. En la presente se describe una secuencia de nucleótidos lambda porcina aislada, tal como la representada en la Seq BD N° 28. Se describe aquí una secuencia de nucleótidos que incluye la secuencia flanqueante 5' de la primera región lambda J/C de la secuencia genómica de la cadena ligera lambda porcina, por ejemplo, como se representa por la Seq ID N° 32. La secuencia de nucleótidos se describe en la presente memoria que incluye la secuencia flanqueante 3' a la región de agrupamiento J/C de la secuencia genómica de la cadena ligera lambda porcina, por ejemplo, aproximadamente 200 pares de bases de lambda J/C, tal como la representada por la Seq ID N° 33. Alternativamente, se describe aquí la secuencia de nucleótidos que incluye una secuencia flanqueante en 3' a la región de agrupamiento J/C de la secuencia genómica de la cadena ligera lambda porcina, por ejemplo, representada por Seq ID N° 34, 35, 36, 37, 38 y/o 39. Se describen en la presente memoria secuencias de ácido nucleico que codifican locus de cadena ligera lambda bovina, que puede incluir al menos un par de región constante de región de unión y/o al menos una región variable, por ejemplo, representada por Seq ID N° 31. Las secuencias de nucleótido aisladas descritas en las Seq. ID. Nos. 28, 31, 32, 33,

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34, 35, 36, 37, 38 o 39 se describen en el presente documento. Secuencias de ácido nucleico al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% homólogas a las Seq. ID. Nos. 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39 también se describen en el presente documento. Además, las secuencias de nucleótidos que contienen al menos 10, 15, 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de Seq ID Nos 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39 se describen en este documento. También se describen en la presente memoria secuencias de nucleótidos que se hibridizan, opcionalmente en condiciones rigurosas, a las Seq ID Nos 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39, así como a los nucleótidos homólogos a las mismas.

[0061] Las construcciones de vectores dirigidos al ácido nucleico también se describen en este documento. Los vectores de direccionamiento pueden diseñarse para llevar a cabo la recombinación homóloga en las células. Estos vectores de direccionamiento pueden transformarse en células de mamífero para dirigirse a la cadena pesada de ungulados, a la cadena ligera kappa o a los genes de la cadena ligera lambda mediante recombinación homóloga. Los vectores de direccionamiento pueden contener un brazo de recombinación 3' y un brazo de recombinación 5' (es decir, secuencia flanqueante) que es homóloga a la secuencia genómica de cadena pesada de ungulado, cadena ligera kappa o secuencia genómica de cadena ligera lambda, por ejemplo, secuencia representada por Seq ID Nos. 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 o 31, como se describió anteriormente. La secuencia de ADN homóloga puede incluir al menos 15 pb, 20 pb, 25 pb, 50 pb, 100 pb, 500 pb, lkbp, 2 kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp o 50 kbp de secuencia homóloga a la secuencia genómica. Los brazos de recombinación 3' y 5' pueden diseñarse de modo que flanqueen los extremos 3' y 5' de al menos una variable funcional, unión, diversidad y/o región constante de la secuencia genómica. La selección de una región funcional puede volverla inactiva, lo que da como resultado la incapacidad de la célula para producir moléculas de inmunoglobulina funcionales. La secuencia de ADN homóloga puede incluir una o más secuencias de intrón y/o exón. Además de las secuencias de ácido nucleico, el vector de expresión puede contener secuencias marcadoras seleccionables, tales como, por ejemplo, secuencias de genes mejorados de Proteína Fluorescente Verde (eGFP), secuencias de iniciación y/o secuencias potenciadoras, poli A de cola, y/o secuencias de ácido nucleico que proporcionan la expresión de la construcción en células hospedadoras procariotas y/o eucariotas. El marcador seleccionable puede localizarse entre la secuencia del brazo de recombinación 5' y 3'.

[0062] El vector de direccionamiento puede contener brazos 5' y 3' de recombinación que contienen una secuencia homóloga a la 3' y 5' que flanquean la secuencia de la región J6 del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina porcina. Ya que la región J6 es la única región de unión funcional del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina porcina, esto evitará la expresión de una inmunoglobulina de cadena pesada porcina funcional. El vector de direccionamiento puede contener un brazo de recombinación 5' que contiene una secuencia homóloga a la secuencia genómica 5' de la región J6, que incluye J1-4, y un brazo de recombinación 3' que contiene una secuencia homóloga a la secuencia genómica 3' de la región J6, incluyendo la región constante mu (una "construcción dirigida a J6"), véase, por ejemplo, la Figura 1. Además, esta construcción dirigida a J6 también puede contener un gen marcador seleccionable que se localiza entre los brazos de recombinación 5' y 3', véase por ejemplo, Seq ID N° 5 y Figura 1. El vector de direccionamiento puede contener un brazo de recombinación 5' que contiene una secuencia homóloga a la secuencia genómica 5' de la región de diversidad, y un brazo de recombinación 3' que contiene una secuencia homóloga a la secuencia genómica 3' de la región de diversidad del locus de la cadena pesada porcina. El vector de direccionamiento puede contener un brazo de recombinación 5' que contiene secuencia homóloga a la secuencia genómica 5' de la región constante mu y un brazo de recombinación 3' que contiene secuencia homóloga a la secuencia genómica 3' de la región constante mu del locus de la cadena pesada porcina. El vector de direccionamiento puede contener brazos de recombinación 5' y 3' que contienen la secuencia homóloga a las secuencias flanqueantes 3' y 5' de la región constante del locus de cadena pesada de inmunoglobulina porcina. Dado que los presentes inventores descubrieron que solo hay una región constante del locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina porcina, esto evitará la expresión de una inmunoglobulina de cadena ligera kappa porcina funcional. El vector de direccionamiento puede contener un brazo de recombinación 5' que contiene una secuencia homóloga a la secuencia genómica 5' de la región constante, que incluye opcionalmente la región de unión, y un brazo de recombinación 3' que contiene una secuencia homóloga a la secuencia genómica 3' de la región constante, incluyendo opcionalmente al menos parte de la región potenciadora (una "construcción de dirección constante Kappa"), véase, por ejemplo, la Figura 2. Además, esta construcción de dirección constante kappa también puede contener un gen marcador seleccionable que se encuentra entre los brazos de recombinación 5' y 3', véase por ejemplo, Seq ID N° 20 y Figura 2. El vector de dirección puede contener un brazo de recombinación 5' que contiene una secuencia homóloga a la secuencia genómica 5' de la región de unión, y un brazo de recombinación 3' que contiene una secuencia homóloga a secuencia genómica 3' de la región de unión del locus de la cadena ligera kappa porcina.

[0063] Los cebadores se describen en la presente memoria para generar secuencias 3' y 5' de un vector de direccionamiento. Los cebadores de oligonucleótidos pueden ser capaces de hibridarse a la secuencia genómica de inmunoglobulina porcina, tal como Seq ID Nos. 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 o 31, como se describió anteriormente. Los cebadores pueden hibridarse bajo condiciones rigurosas con las Seq ID Nos. 1,4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 o 31, como se describió anteriormente. Aquí se describen sondas oligonucleotídicas capaces de hibridar con secuencias de cadena pesada porcina, cadena ligera kappa o cadena ligera lambda porcina, tales como Seq ID Nos. 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 o 31, como se describió anteriormente. Los cebadores o sondas de polinucleótidos pueden tener al menos 14 bases, 20 bases, 30 bases o 50 bases que se hibridan con un

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polinucleótido descrito en este documento. La sonda o cebador puede tener al menos 14 nucleótidos de longitud, y puede tener al menos 15,20,25,28 o 30 nucleótidos de longitud.

[0064] Los cebadores se describen en la presente memoria para amplificar un fragmento de cadena pesada de Ig de porcino que incluye la región de unión funcional (la región j6). El fragmento amplificado de la cadena pesada puede representarse mediante la Seq ID N° 4 y los cebadores utilizados para amplificar este fragmento pueden ser complementarios a una parte de la región J, tal como, pero sin limitarse a la Seq ID N° 2, para producir el brazo de recombinación 5' y complementario a una porción de la región constante mu de cadena pesada de Ig, tal como, pero sin limitarse a Seq ID N° 3, para producir el brazo de recombinación 3'. Las regiones de la cadena pesada de Ig porcina (tal como, pero sin limitarse a la Seq ID N° 4) se pueden subclonar y ensamblar en un vector de direccionamiento.

[0065] Los cebadores se describen en la presente memoria para amplificar un fragmento de cadena ligera kappa de Ig de porcino que incluye la región constante. Los cebadores se describen en la presente memoria para amplificar un fragmento de cadena ligera kappa Ig de porcino que incluye la región J. Los cebadores utilizados para amplificar este fragmento pueden ser complementarios a una porción de la región J, tal como, pero sin limitarse a la Seq ID N° 21 o 10, para producir el brazo de recombinación 5' y complementario a la secuencia genómica 3' de la región constante, tal como, pero sin limitación, Seq ID N° 14, 24 o 18, para producir el brazo de recombinación 3'. Las regiones de la cadena pesada de Ig de porcino (tal como, pero sin limitarse a la Seq ID N° 20) se pueden subclonar y ensamblar en un vector de direccionamiento.

[0066] Se describen células unguladas que carecen de expresión de al menos un alelo de una región funcional de una cadena pesada de ungulado, cadena ligera kappa y/o locus de cadena ligera lambda producida de acuerdo con el proceso, secuencias y/o constructos descritos en este documento. Estas células pueden obtenerse como resultado de la recombinación homóloga. Particularmente, al desactivar al menos un alelo de un gen de cadena pesada de ungulados, cadena ligera kappa o cadena ligera lambda, pueden producirse células que tienen una capacidad reducida para la expresión de anticuerpos de ungulados. Las células de mamífero que carecen de expresión de ambos alelos de un gen de cadena pesada de ungulado, cadena ligera kappa y/o cadena ligera lambda pueden producirse de acuerdo con el proceso, secuencias y/o constructos descritos en este documento. Se describen animales porcinos en la presente memoria en los que al menos un alelo de un gen de cadena pesada del ungulado, cadena ligera kappa y/o cadena ligera lambda se inactiva mediante un evento de direccionamiento genético producido de acuerdo con el proceso, secuencias y/o constructos descritos aquí. En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan animales porcinos en los que ambos alelos de un gen de cadena pesada de ungulado, cadena ligera kappa y/o cadena ligera lambda se inactivan a través de un evento de dirección genética. El gen puede ser dirigido a través de recombinación homóloga. El gen puede ser alterado, es decir, una porción del código genético puede alterarse, afectando de este modo la transcripción y/o traducción de ese segmento del gen. Por ejemplo, la interrupción de un gen puede ocurrir a través de técnicas de sustitución, eliminación ("knock-out") o inserción ("knock-in"). Se pueden insertar genes adicionales para una proteína deseada o secuencia reguladora que modulan la transcripción de una secuencia existente. Para lograr múltiples modificaciones genéticas de genes de inmunoglobulina ungulada, las células pueden modificarse secuencialmente para contener múltiples modificaciones genéticas. Los animales se pueden criar juntos para producir animales que contienen múltiples modificaciones genéticas de genes de inmunoglobulina. Como ejemplo ilustrativo, los animales que carecen de expresión de al menos un alelo de un gen de cadena pesada de ungulados pueden modificarse genéticamente o criarse adicionalmente con animales que carecen de expresión de al menos un alelo de un gen de cadena ligera kappa.

[0067] Los alelos de genes de cadena pesada ungulados, cadena ligera kappa o cadena ligera lambda se pueden volver inactivos de acuerdo con el proceso, las secuencias y/o construcciones descritas en este documento, de manera que las inmunoglobulinas de ungulados funcionales ya no pueden ser producidas. El gen de inmunoglobulina diana puede transcribirse en ARN, pero no traducirse en proteína. El gen de inmunoglobulina diana puede transcribirse en una forma truncada inactiva. Tal ARN truncado puede no traducirse o traducirse en una proteína no funcional. El gen de inmunoglobulina diana puede inactivarse de tal forma que no se produzca la transcripción del gen. El gen de inmunoglobulina diana se puede transcribir y luego traducir a una proteína no funcional.

[0068] Células unguladas, como porcina o bovina, que carecen de expresión de un alelo, opcionalmente ambos alelos de un gen de cadena pesada de ungulados, cadena ligera kappa y/o cadena ligera lambda se pueden utilizar como células donantes para la transferencia nuclear en células receptoras para producir animales transgénicos clonados. Alternativamente, pueden crearse genomas de cadenas ligeras de ungulados, cadena pesada kappa, cadena ligera lambda y/o células madre embrionarias, que luego se usan para producir descendencia. La descendencia que carece de expresión de un único alelo de un gen de cadena pesada de ungulados, cadena ligera kappa y/o cadena ligera lambda producido de acuerdo con el proceso, secuencias y/o constructos descritos aquí pueden reproducirse para producir aún más descendencia que carezca de funcionalidad en ambos alelos a través de herencia de tipo mendeliano.

[0069] Se describe un método en el presente documento para interrumpir la expresión de un gen de inmunoglobulina de ungulados por (i) el análisis de la configuración de línea germinal del locus genómico de cadena

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pesada de ungulados, cadena ligera kappa o la cadena ligera lambda; (ii) determinar la ubicación de las secuencias de nucleótidos que flanquean el extremo 5' y el extremo 3' de al menos una región funcional del locus; y (iii) transfectar una construcción de direccionamiento que contiene la secuencia flanqueante en una célula en la que, tras la recombinación homóloga exitosa, al menos una región funcional del locus de inmunoglobulina se rompe reduciendo o evitando la expresión del gen de inmunoglobulina. La configuración de la línea germinal del locus de la cadena pesada porcina se describe en este documento. El locus de cadena pesada porcina contiene al menos cuatro regiones variables, dos regiones de diversidad, seis regiones de unión y cinco regiones constantes, por ejemplo, como se ilustra en la Figura 1. Solo una de las seis regiones de unión, J6, puede ser funcional. La configuración de la línea germinal del locus de la cadena ligera kappa porcina se describe aquí. El locus de cadena ligera kappa porcina contiene al menos seis regiones variables, seis regiones de unión, una región constante y una región potenciadora, por ejemplo, como se ilustra en la Figura 2. La configuración de línea germinal del locus de cadena ligera lambda porcina se describe aquí.

[0070] En este documento se describen ungulados y células de ungulados que carecen de al menos un alelo de una región funcional de un locus de cadena ligera de cadena pesada y/o lambda de unguladoa, producido de acuerdo con los procesos, secuencias y/o construcciones descritas en este documento, que se modifican adicionalmente para expresar al menos parte de un locus de anticuerpo humano (es decir, inmunoglobulina (Ig)). Se describen aquí animales porcinos que expresan inmunoglobulina xenógena. Este locus humano puede sufrir una reorganización y expresar una población diversa de moléculas de anticuerpos humanos en el ungulado. Estos ungulados transgénicos clonados proporcionan un suministro reponible, teóricamente infinito de anticuerpos humanos (tales como anticuerpos policlonales), que pueden usarse con fines terapéuticos, de diagnóstico, de purificación y otros fines clínicamente relevantes. Los cromosomas artificiales (CA), tales como levaduras o cromosomas artificiales de mamíferos (YACS o MACS) pueden usarse para permitir la expresión de genes de inmunoglobulina humana en células y animales ungulados. Todos o parte de los genes de inmunoglobulina humana, como el gen de la cadena pesada de Ig (cromosoma humano 414), el gen de la cadena Ig kappa (cromosoma humano n° 2) y/o el gen de la cadena Ig lambda (cromosoma n° 22) pueden insertarse en el cromosoma, que luego pueden insertarse en células de ungulados. Los ungulados y las células de ungulados se describen en el presente documento que contienen parte o la totalidad de al menos un locus de gen de anticuerpo humano, que se somete a transposición y expresa una población diversa de moléculas de anticuerpo humano.

[0071] Los métodos para producir anticuerpos xenógenos se describen en la presente memoria, en donde el método puede incluir: (a) administrar uno o más antígenos de interés para un ungulado cuyas células comprenden uno o más cromosomas artificiales y carecen de cualquier expresión de inmunoglobulina endógena funcional, cada cromosoma artificial que comprende uno o más locus de inmunoglobulina xenógena que se somete a transposición, dando como resultado la producción de anticuerpos xenógenos contra el uno o más antígenos; y/o (b) recuperar los anticuerpos xenógenos del ungulado. El locus de inmunoglobulina puede sufrir reordenamiento en una célula B.

[0072] Un ungulado, tal como un cerdo o una vaca, se puede preparar por un método descrito en este documento. Estos ungulados transgénicos clonados (por ejemplo, animales porcinos y bovinos) proporcionan un suministro reponible, teóricamente infinito de anticuerpos policlonales humanos, que pueden usarse como terapéuticos, diagnósticos y con fines de purificación. Por ejemplo, los animales transgénicos producidos de acuerdo con el proceso, las secuencias y/o constructos descritos en este documento que producen anticuerpos humanos policlonales en la corriente sanguínea se pueden usar para producir una matriz de diferentes anticuerpos que son específicos para un antígeno deseado. La disponibilidad de grandes cantidades de anticuerpos policlonales también puede usarse para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades infecciosas, la vacunación contra agentes de guerra biológica, la modulación del sistema inmune, la eliminación de células humanas no deseadas tales como células cancerosas y la modulación de moléculas humanas específicas.

[0073] Los animales o células que carecen de expresión de inmunoglobulina funcional, producida de acuerdo con el proceso, secuencias y/o constructos descritos en la presente memoria, pueden contener modificaciones genéticas adicionales para eliminar la expresión de xenoantígenos. Dichos animales pueden modificarse para eliminar la expresión de al menos un alelo del gen de alfa-1,3-galactosiltransferasa, el gen de la hidroxilasa CMP-Neu5Ac (véase, por ejemplo, el documento USSN 10/863,116), el gen de la sintasa iGb3 (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 60/517.524) y/o el gen de la Forssman sintasa (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 60/568.922). Los animales descritos en la presente memoria también pueden contener modificaciones genéticas para expresar fucosiltransferasa y/o sialiltransferasa. Para lograr estas modificaciones genéticas adicionales, las células pueden modificarse para contener múltiples modificaciones genéticas. Los animales se pueden criar juntos para lograr múltiples modificaciones genéticas. Los animales, tales como cerdos, que carecen de expresión de inmunoglobulina funcional, producidos de acuerdo con el proceso, secuencias y/o constructos descritos en este documento, pueden criarse con animales, tales como cerdos, que carecen de expresión de alfa-1,3-galactosiltransferasa (por ejemplo, como se describe en el documento WO 04/028243).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

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Figura 1 ilustra el diseño de un vector de direccionamiento que interrumpe la expresión de la región de unión del gen de inmunoglobulina de cadena pesada porcina.

Figura 2 ilustra el diseño de un vector de direccionamiento que interrumpe la expresión de la región constante del gen de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa porcina.

Figura 3 ilustra la organización genómica del locus de inmunoglobulina lambda porcina, que incluye un concatámero de secuencias JC así como regiones flanqueantes que incluyen la región variable 5' a la región JC. Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC1 y BAC2) representan fragmentos del genoma de la inmunoglobulina porcina que se pueden obtener de las bibliotecas de CAB.

Figura 4 representa el diseño de un vector de direccionamiento que interrumpe la expresión de la región de agrupación Jc del gen de inmunoglobulina de cadena ligera lambda porcina. "SM" representa un gen marcador seleccionable, que puede usarse en el vector de direccionamiento.

Figura 5 ilustra una estrategia de direccionamiento para insertar una diana de recombinasa de sitio específico o reconocimiento del sitio en la región 5' de la región del grupo JC del locus de inmunoglobulina lambda porcina. "SM" representa un gen marcador seleccionable, que puede usarse en el vector de direccionamiento. "SSRRS" representa un sitio específico de recombinasa o sitio de reconocimiento.

Figura 6 ilustra una estrategia de direccionamiento para insertar una diana de recombinasa de sitio específico o sitio de reconocimiento en la región 3' de la región del grupo JC del locus de inmunoglobulina lambda porcina. "SM" representa un gen marcador seleccionable, que puede usarse en el vector de direccionamiento. "SSRRS" representa un sitio específico de recombinasa o sitio de reconocimiento.

Figura 7 ilustra la transferencia mediada por la recombinasa específica del sitio de un CAL en un genoma del hospedador. "SSRRS" representa un sitio específico de recombinasa o sitio de reconocimiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0075] Se describen en la presente memoria por primera vez la disposición de la secuencia del gen de la línea germinal de inmunoglobulina del ungulado, así como las secuencias genómicas novedosass de la misma. Además, en este documento se describen células, tejidos y animales ungulados novedosos que carecen de expresión de al menos un alelo de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera. En base a este descubrimiento, se pueden producir ungulados que carecen completamente de expresión de al menos un alelo de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera. Además, estos ungulados se pueden modificar adicionalmente para expresar loci xenogenéticos, tales como loci de inmunoglobulina humana o fragmentos de los mismos.

[0076] En este documento se describe un ungulado transgénico que carece de cualquier expresión de inmunoglobulinas endógenas funcionales. El ungulado puede carecer de cualquier expresión de inmunoglobulinas endógenas de cadena pesada y/o ligera. La inmunoglobulina de cadena ligera puede ser una inmunoglobulina kappa y/o lambda. Los ungulados transgénicos descritos aquí carecen de expresión de al menos un alelo de una inmunoglobulina endógena en donde la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en cadena pesada, cadena ligera kappa y cadena ligera lambda o cualquier combinación de las mismas. La expresión de inmunoglobulinas endógenas funcionales se puede lograr mediante selección genética de los loci de inmunoglobulina endógena para prevenir la expresión de la inmunoglobulina endógena. El objetivo genético se puede lograr mediante recombinación homóloga. El ungulado transgénico se puede producir mediante transferencia nuclear.

[0077] El ungulado transgénico que carece de cualquier expresión de inmunoglobulinas endógenas funcionales se puede modificar adicionalmente genéticamente para expresar una inmunoglobulina xenógena. Se describen aquí animales porcinos que contienen un locus de inmunoglobulina xenógena. En una realización, el locus de inmunoglobulina xenógena puede ser una inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera o fragmento de la misma. En otra realización, el locus de inmunoglobulina xenógena puede ser un locus de cadena kappa o un fragmento del mismo y/o un locus de cadena lambda o un fragmento del mismo. En todavía otras realizaciones, un cromosoma artificial (CA) puede contener el locus de inmunoglobulina xenógena. En una realización, el CA puede ser un CA de levadura o un CA de mamífero. En una realización adicional, el locus xenógeno puede ser un locus de inmunoglobulina humana o un fragmento del mismo. En una realización, el locus de inmunoglobulina humana puede ser el cromosoma 14 humano, el cromosoma 2 humano y el cromosoma 22 humano o fragmentos de los mismos. En otra realización, el locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier fragmento de un locus de inmunoglobulina humana que pueda experimentar reordenamiento. En una realización adicional, el locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier fragmento de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana que puede experimentar reordenamiento. En otra realización más, el locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier locus de inmunoglobulina humana o fragmento de la misma que pueda producir un anticuerpo tras la exposición a un antígeno. En una realización

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particular, la inmunoglobulina humana exógena se puede expresar en células B para producir inmunoglobulina xenógena en respuesta a la exposición a uno o más antígenos.

[0078] En un aspecto de la presente invención, se proporcionan animales porcinos transgénicos que expresan una inmunoglobulina xenógena o fragmento de la misma, en donde la inmunoglobulina se puede expresar a partir de un locus de inmunoglobulina que se integra dentro de un cromosoma ungulado endógeno. En una realización, se proporcionan células derivadas de los animales transgénicos. En una realización, el locus de inmunoglobulina xenógena puede ser heredado por la descendencia. En otra realización, el locus de inmunoglobulina xenógena puede ser heredado a través de la línea germinal masculina por descendencia. En todavía otras realizaciones, un cromosoma artificial (CA) puede contener el locus de inmunoglobulina xenógena. En una realización, el CA puede ser un CA de levadura o un CA de mamífero. En una realización adicional, el locus xenógeno puede ser un locus de inmunoglobulina humana o un fragmento del mismo que puede experimentar una reordenación. En una realización, el locus de inmunoglobulina humana puede ser el cromosoma 14 humano, el cromosoma 2 humano y el cromosoma 22 humano o fragmentos de los mismos. El locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier fragmento de un locus de inmunoglobulina humana que pueda experimentar reordenamiento. En una realización adicional, el locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier fragmento de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana que puede experimentar reordenamiento. El locus de inmunoglobulina humana puede incluir cualquier locus de inmunoglobulina humana o fragmento del mismo que pueda producir un anticuerpo tras la exposición a un antígeno. En una realización particular, la inmunoglobulina humana exógena se puede expresar en células B para producir inmunoglobulina xenógena en respuesta a la exposición a uno o más antígenos.

Definiciones

[0079] Los términos "tecnología de ADN recombinante", "de clonación de ADN", "Molecular Cloning", o "clonación de genes" se refieren al proceso de transferencia de una secuencia de ADN a una célula u organismo. La transferencia de un fragmento de ADN puede ser de un organismo a un elemento genético autorreplicante (p. ej., plásmido bacteriano) que permite que una copia de cualquier parte específica de una secuencia de aDn (o ARN) se seleccione entre muchos otros y se produzca en una cantidad ilimitada. Los plásmidos y otros tipos de vectores de clonación, como los cromosomas artificiales, se pueden usar para copiar genes y otras piezas de cromosomas para generar suficiente material idéntico para su posterior estudio. Además de los plásmidos bacterianos, que pueden transportar hasta 20 kb de ADN extraño, otros vectores de clonación incluyen virus, cósmidos y cromosomas artificiales (p. ej., bacterias, cromosomas artificiales (CAB) o cromosomas artificiales de levadura (CAL)). Cuando el fragmento de ADN cromosómico se une finalmente con su vector de clonación en el laboratorio, se denomina "molécula de ADN recombinante". Poco después de que el plásmido recombinante se introduzca en células huésped adecuadas, el segmento recién insertado se reproducirá junto con el ADN de la célula huésped.

[0080] Los "cosmidos" son vectores de clonación construidos artificialmente que llevan hasta 45 kb de ADN extraño. Se pueden envasar en partículas de fago lambda para infección en células de E. coli.

[0081] Tal como se utiliza aquí, el término "mamífero" ("mamífero genéticamente modificado (o alterado)") se entiende que incluye cualquier mamífero no humano, incluyendo, pero no limitado a cerdos, ovejas, cabras, ganado vacuno (bovino), ciervos, mulas, caballos, monos, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollos, reptiles, peces e insectos. En una realización de la invención, se proporcionan cerdos genéticamente alterados y métodos de producción de los mismos.

[0082] El término "ungulado" se refiere a mamíferos ungulados. Los artiodáctilos son ungulados de dedos pares (de pezuña hendida), incluidos antílopes, camellos, vacas, ciervos, cabras, cerdos y ovejas. Los perisodáctilos son dedos del pie impares, que incluyen caballos, cebras, rinocerontes y tapires. El término ungulado tal como se usa en el presente documento se refiere a un animal ungulado adulto, embrionario o fetal.

[0083] Como se usa en el presente documento, los términos "porcino", "animal porcino", "cerdo" y "puerco" son términos genéricos que se refieren al mismo tipo de animal independientemente del género, tamaño, o raza.

[0084] Una "secuencia de ADN homóloga o ADN homólogo" es una secuencia de ADN que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ADN de referencia. Una secuencia homóloga hibrida en condiciones estrictas con la secuencia diana, las condiciones de hibridación rigurosas incluyen aquellas que permitirán que ocurra la hibridación si hay al menos 85, al menos un 95% o un 98% de identidad entre las secuencias.

[0085] Una "secuencia de ADN isogénica o sustancialmente isogénica" es una secuencia de ADN que es idéntica a o casi idéntica a una secuencia de ADN de referencia. El término "sustancialmente isogénico" se refiere a ADN que es al menos aproximadamente 97-99% idéntico a la secuencia de ADN de referencia, o al menos aproximadamente 99,5-99,9% idéntico a la secuencia de ADN de referencia, y en ciertos usos 100% idéntico a la referencia Secuencia de ADN.

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[0086] "Recombinación homóloga" se refiere al proceso de recombinación de ADN basado en homología de secuencia.

[0087] "Orientación génica" se refiere a la recombinación homóloga entre dos secuencias de ADN, una de las cuales se encuentra en un cromosoma y la otra no.

[0088] "No homólogo o integración aleatoria" se refiere a cualquier proceso por el que se integra el ADN en el genoma que no implica la recombinación homóloga.

[0089] Un "gen marcador seleccionable" es un gen, cuya expresión permite que se identifiquen las células que contienen el gen. Un marcador seleccionable puede ser uno que permita que una célula prolifere en un medio que previene o ralentiza el crecimiento de las células sin el gen. Los ejemplos incluyen genes de resistencia a antibióticos y genes que permiten que un organismo crezca en un metabolito seleccionado. Alternativamente, el gen puede facilitar el cribado visual de los transformantes confiriendo a las células un fenotipo que se identifica fácilmente. Tal fenotipo identificable puede ser, por ejemplo, la producción de luminiscencia o la producción de un compuesto coloreado, o la producción de un cambio detectable en el medio que rodea la célula.

[0090] El término "contiguo" se usa aquí en su significado estándar, es decir, sin interrupción, o ininterrumpido.

[0091] "Condiciones rigurosas" se refiere a condiciones que (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, 0,015 M de NaCl/0,0015 M de citrato de sodio/0,1% de SDS a 50°C, o (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como, por ejemplo, formamida. Un experto en la técnica puede determinar y variar las condiciones de rigurosidad apropiadamente para obtener una señal de hibridación clara y detectable. Por ejemplo, la rigurosidad generalmente se puede reducir aumentando el contenido de sal presente durante la hibridación y el lavado, reduciendo la temperatura, o una combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989).

I. Genes de inmunoglobulina

[0092] En este documento se describe un ungulado transgénico que carece de cualquier expresión de

inmunoglobulinas endógenas funcionales. El ungulado puede carecer de cualquier expresión de inmunoglobulinas endógenas de cadena pesada y/o ligera. La inmunoglobulina de cadena ligera puede ser una inmunoglobulina kappa y/o lambda. Los ungulados transgénicos se describen aquí que carecen de expresión de al menos un alelo de una inmunoglobulina endógena en donde la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en cadena pesada, cadena ligera kappa y cadena ligera lambda o cualquier combinación de las mismas. La expresión de

inmunoglobulinas endógenas funcionales se puede lograr mediante selección genética del locus de inmunoglobulina endógena para prevenir la expresión de la inmunoglobulina endógena. El objetivo genético se puede lograr a través de la recombinación homóloga. El ungulado transgénico se puede producir mediante transferencia nuclear.

[0093] Se describe aquí un método para interrumpir la expresión de un gen de inmunoglobulina de ungulado

mediante (i) análisis de la configuración de la línea germinal de la cadena pesada del ungulado, la cadena ligera kappa o el locus genómico de la cadena ligera lambda; (ii) determinar la ubicación de las secuencias de nucleótidos que flanquean el extremo 5' y el extremo 3' de al menos una región funcional del locus; y (iii) transfectar una

construcción de direccionamiento que contiene la secuencia flanqueante en una célula en la que, tras una

recombinación homóloga exitosa, al menos una región funcional del locus de inmunoglobulina se rompe, reduciendo o previniendo la expresión del gen de inmunoglobulina.

[0094] La configuración de línea germinal del porcino locus de cadena pesada puede ser como se describe aquí. El locus de cadena pesada porcina contiene al menos cuatro regiones variables, dos regiones de diversidad, seis regiones de unión y cinco regiones constantes, por ejemplo, como se ilustra en la Figura 1. Solo una de las seis regiones de unión, J6, puede ser funcional.

[0095] La configuración de línea germinal del porcino locus de cadena ligera kappa pueden ser como se describe aquí. El locus de la cadena ligera kappa porcina contiene al menos seis regiones variables, seis regiones de unión, una región constante y una región potenciadora, por ejemplo, como se ilustra en la Figura 2.

[0096] La configuración de línea germinal del porcino locus de cadena ligera lambda puede ser como se describe aquí.

[0097] Las secuencias aisladas de nucleótidos representadas en Seq ID Nos 1-39 se dan a conocer en el presente documento. Secuencias de ácido nucleico al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% homólogos a una cualquiera de las Seq ID Nos 1-39 también se describen en la presente memoria. Además, las secuencias de nucleótidos que contienen al menos 10, 15, 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de una cualquiera de las Seq ID Nos 1-39 se describen en este documento. Se describen adicionalmente secuencias de nucleótidos que se hibridan, opcionalmente en condiciones rigurosas, con las Seq. ID. Nos. 1-39, así como con los nucleótidos homólogos a las

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mismas.

[0098] La homología o identidad a nivel de secuencia de nucleótidos o aminoácidos se puede determinar mediante el análisis BLAST (herramienta de búsqueda de alineación local básica) usando el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (véase, por ejemplo, Altschul, SF y col. (1 997) Nucleic Acids Res 25: 3389 - 3402 y Karlin et al, (1 900) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87, 2264- 2226) que se adaptan para la búsqueda de similitud de secuencia. El enfoque utilizado por el programa BLAST primero consiste en considerar segmentos similares, con y sin espacios, entre una secuencia de consulta y una secuencia de base de datos, luego evaluar la significación estadística de todas las coincidencias identificadas y finalmente resumir solo aquellas coincidencias que satisfacen un umbral de significación preseleccionado. Véase, por ejemplo, Altschul et al., (1994) (Nature Genetics 6, 119-129). Los parámetros de búsqueda para histograma, descripciones, alineaciones, espectativa (es decir, el umbral de significancia estadística para reportar coincidencias con las secuencias de la base de datos), corte, matriz y filtro (baja complejidad) están en la configuración predeterminada. La matriz de puntuación predeterminada utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., (1 992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 10915-10919), que se recomienda para secuencias de consulta sobre 85 de longitud (bases de nucleótidos o aminoácidos).

Cadena pesada porcina

[0099] Secuencias genómicas novedosas que codifican el locus de cadena pesada de inmunoglobulina ungulada se dan a conocer en el presente documento. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una cadena pesada porcina se describe en la presente que incluye al menos una región variable, dos regiones de diversidad, al menos cuatro regiones de unión y al menos una región constante, tal como la región constante mu, por ejemplo, como se representa en Seq ID N° 29. También se describe aquí una secuencia de nucleótidos aislada que incluye al menos cuatro regiones de unión y al menos una región constante, tal como la región constante mu, de la secuencia genómica de la cadena pesada porcina, por ejemplo, como se representa en la Seq. ID. 4. Se describe aquí la secuencia de nucleótidos que incluye la secuencia flanqueante 5' de la primera región de unión de la secuencia genómica de la cadena pesada porcina, por ejemplo, como se representa en la Seq ID N° 1. Además, la secuencia de nucleótidos se describe aquí que incluye la secuencia flanqueante 3' de la primera región de unión de la secuencia genómica de la cadena pesada porcina, por ejemplo, como se representa en la región 3' de la Seq ID N° 4. Secuencias de nucleótidos aisladas representadas en las Seq ID Nos 1,4 o 29 se describen en este documento. Las secuencias de ácido nucleico al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% homólogas a las Seq ID Nos 1, 4 o 29 también se describen en este documento. Se describen adicionalmente en el presente documento secuencias de nucleótidos que se hibridizan, opcionalmente en condiciones restrictivas, con las Seq ID Nos 1, 4 o 29, así como con los nucleótidos homólogos de las mismas.

[0100] Además, las secuencias de nucleótidos que contienen al menos 10, 15, 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de Seq ID Nos 1,4 o 29 se describen en la presente memoria. La secuencia de nucleótidos puede contener al menos 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de Seq ID N° 4 o residuos 1-9,070 de Seq iD N° 29. Secuencias de nucleótidos que contienen al menos 50, 100, 1.000, 2.500, 4.000, 4.500, 5.000, 7.000, 8.000, 8.500, 9.000, 10.000 o 15.000 nucleótidos contiguos de Seq ID N° 29 se describen en este documento. La secuencia de nucleótidos puede contener residuos 9.070-11039 de Seq ID N° 29.

[0101] Las secuencias de nucleótidos aisladas como se representan en las Seq ID Nos 1, 4 o 29 se describen en este documento. Las secuencias de ácidos nucleicos que son al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% homólogas a las Seq ID Nos 1, 4 o 29 también se describen en este documento. Además, las secuencias de nucleótidos que contienen al menos 10,

[0102] 15, 17, 20, 25 o 30 nucleótidos contiguos de Seq ID Nos 1, 4 o 29 se describen en este documento. Se describen adicionalmente secuencias de nucleótidos que se hibridan, opcionalmente en condiciones restrictivas, con las Seq ID Nos 1,4 o 29, así como con los nucleótidos homólogos a las mismas.

[0103] Se describe aquí una secuencia de nucleótidos aislada que codifica la cadena pesada porcina que incluye al menos una región variable, dos regiones de diversidad, al menos cuatro regiones de unión y al menos una región constante, tal como la región constante mu, por ejemplo, como se representa en la Seq ID N° 29. En Seq ID N° 29, la región de diversidad de la cadena pesada está representada, por ejemplo, por los residuos 1089-1099 (D(pseudo)), la región de unión de la cadena pesada está representada, por ejemplo, por los restos 1887-3352 (por ejemplo: J(psuedo): 1887-1931, J(psuedo): 2364-2411, J(psuedo): 2756-2804, J(funcional J): 3296-3352), las señales de recombinación están representadas, por ejemplo, por los residuos 3001-3261 (Nonamer), 3292-3298 (Heptamer), la región constante está representada por los siguientes residuos: 3353-9070 (intrón mu de J a C), 5522-8700 (región de cambio), 9071-9388 (exón 1 de Mu), 9389-9699 (intrón A de mu), 9470-9802 (exón 2 de Mu), 9830-10069 (intrón B de Mu), 10070-10387 (exón 3 de Mu), 10388-10517 (intrón C de Mu), 10815-11052 (exón 4 de Mu), 11034-11039 (señal de Poli(A)).

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Seq ID N°29

tctagaagacgctggagagaggccagacttcctcggaacagctcaaagag

ctctgtcaaagccagatcccatcacacgtgggcaccaataggccatgcca

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aaaccgtgcaggcagccctcagcaittcaaggattgtagcagcggccaac

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Claims (18)

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   1. Un animal porcino transgénico que carece de expresión de al menos un alelo del gen de inmunoglobulina de cadena ligera kappa endógena porcina, en el que el al menos un alelo del gen de la cadena ligera kappa porcina se inactiva mediante un evento de orientación genética, en el que el evento de selección genética comprende la interrupción de la región constante kappa
2. 2. Un animal porcino según la reivindicación 1, en el que el porcino carece adicionalmente de expresión de al menos un alelo del gen de inmunoglobulina de cadena pesada porcina, en el que el al menos un alelo del gen de cadena pesada porcina se inactiva mediante un evento de dirección genética.
3. 3. Un animal porcino según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el porcino carece adicionalmente de expresión de al menos un alelo del gen de la cadena ligera lambda porcina, en el que el al menos un alelo del gen de la cadena lambda porcina se inactiva mediante un evento de orientación genética, y donde el porcino comprende un locus de inmunoglobulina xenógena.
4. 4. Un método para producir la porcina transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende (i) una etapa de interrupción génica a través de (a) técnicas de sustitución, deleción o inserción y/o (b) recombinación homóloga; y/o (ii) una etapa de clonación usando un núcleo donante de una célula en la que al menos un alelo del gen de inmunoglobulina ha sido inactivado.
5. 5. Un animal porcino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que (i) los genes se rompen mediante (a) técnicas de sustitución, deleción o inserción y/o (b) recombinación homóloga; o (ii) el animal se produce mediante clonación usando un núcleo donante de una célula en la que al menos un alelo del gen de la inmunoglobulina ha sido inactivado.
6. 6. Un animal porcino según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende un locus de inmunoglobulina xenógena.
7. 7. El animal porcino de la reivindicación 6, en el que el locus de inmunoglobulina xenógena es un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o un fragmento del mismo que puede sufrir reordenamiento o un locus de inmunoglobulina de cadena ligera o un fragmento del mismo que puede sufrir reordenamiento.
8. 8. Un animal porcino de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 7 que expresa una inmunoglobulina xenógena, en el que la inmunoglobulina se expresa a partir de un locus de inmunoglobulina xenógena o un fragmento del mismo que puede sufrir una reordenación que está integrada dentro de un cromosoma porcino endógeno.
9. 9. El animal porcino de una cualquiera de las reivindicaciones 6 - 8, en el que el locus de inmunoglobulina xenógena es un locus de cadena kappa o lambda o un fragmento del mismo que puede experimentar una reorganización; y/o en el que el locus xenógeno es un locus de inmunoglobulina humana o un fragmento del mismo que puede sufrir una reordenación.
10. 10. El animal porcino de la reivindicación 6, la reivindicación 7 o la reivindicación 9, en el que un cromosoma artificial contiene el locus de inmunoglobulina xenógena.
11. 11. El animal porcino de la reivindicación 10, en el que el cromosoma artificial comprende un cromosoma artificial citoplasmático, en el que opcionalmente el cromosoma artificial de mamífero comprende uno o más cromosomas 14 humanos, cromosoma 2 humano y cromosoma 22 humano o fragmentos de los mismos; o b) el cromosoma artificial comprende un cromosoma artificial de levadura.
12. 12. El animal porcino de la reivindicación 8, en el que a) el locus de inmunoglobulina xenógena es heredado por la descendencia; o b) el locus de inmunoglobulina xenógena es heredado por la descendencia a través de la línea germinal masculina; o c) el animal se produce por transferencia nuclear; y/o d) la inmunoglobulina xenógena se expresa en células B en respuesta a la exposición a uno o más antígenos.
13. 13. Una célula, tejido u órgano derivado del animal porcino de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tejido u órgano celular carece de expresión de al menos un alelo del gen de inmunoglobulina de cadena ligera kappa endógena porcina, en el que al menos un alelo de gen de la cadena ligera kappa porcina se inactiva a través de un evento de dirección genética, en el que el evento de dirección genética comprende la interrupción de la región constante kappa.
14. 14. La célula de la reivindicación 13, en la que a) la célula es una célula somática, reproductiva o germinal; o b) la célula es una célula B o una celula de fibroblastos.
15. 15. El animal porcinode la reivindicación 10, en el que el cromosoma artificial comprende uno o más loci de

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    inmunoglobulina xenogena que se reordenan y pueden producir una inmunoglobulina xenógena en respuesta a la exposición a uno o más antígenos.
16. 16. El animal porcino de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 a 12 o 15, que comprende adicionalmente una modificación genética adicional para eliminar la expresión de un xenoantígeno, en donde opcionalmente el animal carece de expresión de al menos un alelo del gen de alfa-1,3 -galactosiltransferasa.

    de cadera

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    Región J

    Til!

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    ID10

    1011 1013

    1^17 IDIJ^ 1011

    S«qfu 12

    AnplimaroCiE

    S»q'D25

    Seqlü 1S

    Archivo anotado

    Archivo anotado

    Targeina

    Vector g

    StqlD 20

    Marcador

    se eccionaole

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    imagen13

    ACQ02060 (no anotado)

    NG_000002 (anotado)

    Perspectiva gráfica de la secuencia humana AC002060 y NG_000002 con contigs porcinos lambeta que flanquean el cluster JC.

    Escala aproximada: un bloque es aproximadamente 1 kb

    Base n* en AC0Q2060

17. 20.000

    30.000 40.000 50.000 60.000 70,000 80,000 90,000 100,000 110,000 120,000

    Base n"

    en NG_0C00€2

18. 830.000

    840,000 850,000 860,000 870,000 880,000 890,000 900,000

    Secuencia aguas arriba

    Secuencia aguas abajo

    Regiones desconocidas

    Cluster J~C eliminado

    MU i

    V2 1

    V3 2

    imagen14

    imagen15

    QQ

    £ü ÍD

    imagen16