JP5511144B2 - てんかんモデル非ヒト哺乳動物 - Google Patents

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Description

この発明は、てんかんモデル非ヒト哺乳動物に関するものである。更に詳細には、この発明は、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連する遺伝子と相同の遺伝子異常を有し、てんかん発作を自然発症するてんかんモデル非ヒト哺乳動物に関するものである。また、この発明は、遺伝子組換え個体の識別を容易に可能とする変異遺伝子、その構築方法ならびにその識別方法に関するものである。
てんかんは、日本国民の約２％が罹患する比較的多い神経疾患であるが、その分子生物学的成因は長い間不明であった。その原因はてんかんが多くの多彩な疾患の総称であるためである。しかしながら、最近になって、家族性てんかんを中心に少しずつその遺伝異常が分かってきた。
そのうちの常染色体優性夜間前頭葉てんかんは、家族性てんかんの１つで、夜間のてんかん発作を特徴とするが、その原因遺伝子異常としてニューロンアセチルコリン受容体のα４ならびにβ２サブユニットの遺伝子である CHRNA4 ならびに CHRNB2 の遺伝子の変異が報告されている（非特許文献１）。CHRNA4の遺伝子異常としては、S284L、S280Fならびに291-292insL の３種類が報告されている（非特許文献２、３、４、５）。またCHRNB2 の遺伝子異常としては、V287L、V287MならびにI312Mの3種類の遺伝子異常が報告されている（非特許文献６、７、８）。
てんかんの診断法や処理方法の開発ならびに発展のための手段としていわゆる「てんかんモデル動物」が使用されている。従来のてんかんモデル動物は、電気刺激やペンチレンテトラゾールなどのけいれん誘発物質を用いた「けいれんモデル動物」である。また、糖鎖抗体遺伝子を導入することによりてんかん様痙攣を起こすトランスジェニック非ヒト哺乳動物が開示されている（特許文献１）。また、体位転換に反応して強直間代痙攣またはてんかん症状を呈する、μ３Ｂ遺伝子機能を染色体上で欠損させた非ヒト動物も作出されている（特許文献２）。しかしながら、これらの従来のモデル動物は、けいれん発作のモデル動物とはなり得たが、分子生物学的にヒトてんかんの真のモデル動物とはなり得なかった。
発明者らは、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんがニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α４サブユニット (CHRNA4) 遺伝子の第284のSerがLeuに置換していることであることを見出した（非特許文献９）。
そこで、本発明者らは、ラットニューロンアセチルコリン受容体遺伝子CHRNA4の遺伝子変異を遺伝子組換えで導入した遺伝子組換えてんかんモデル動物を作出した（特許文献３）。
しかしながら、従来技術では、かかる遺伝子組換えモデル動物を作出するに当たっては、相同組換えが起こる確率が高くないので、数多くの組換え体をスクリーニングする必要があった。また、組換え体のスクリーニングにはその遺伝子の一部をシークエンスする必要があり、そのためには相当の時間と費用が掛かっていた。そこで、遺伝子をシークエンスするなしに組換え体を判別する方法が開発できれば、大幅な時間と費用の節約ができることから、かかる組換え体の判別方法の開発も要望されていた。
Hirose, S., et al., Neurology 53:1749-1753, 1999 Steinlein, O.K., et al. A missense mutation in the neuronal nicotinic acetylcholine receptor alpha 4 subunit is associated with autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Nat Genet 11, 201-203 (1995). Hirose, S., et al. A novel mutation of CHRNA4 responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology 53, 1749-1753 (1999). Steinlein, O.K., et al. Independent occurrence of the CHRNA4 Ser248Phe mutation in a Norwegian family with nocturnal frontal lobe epilepsy. Epilepsia 41, 529-535 (2000). Steinlein, O.K., et al. An insertion mutation of the CHRNA4 gene in a family with autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Hum Mol Genet 6, 943-947 (1997). De Fusco, M., et al. The nicotinic receptor b2 subunit is mutant in nocturnal frontal lobe epilepsy. Nat Genet 26, 275-276 (2000). Phillips, H.A., et al. CHRNB2 is the second acetylcholine receptor subunit associated with autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Am J Hum Genet 68, 225-231 (2001). Bertrand, D., et al. The CHRNB2 mutation I312M is associated with epilepsy and distinct memory deficits. Neurobiol Dis 20, 799-804 (2005). Hirose, S., et al. A novel mutation of CHRNA4 responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology 53, 1749-1753 (1999). 特開２００６−１４１２１７号公報 特許第３８５３１３６号公報 特開２００５−２４５３６１号公報
上記要望に応えるべく、本発明者は、鋭意研究の結果、ヒトCHRNA4またはCHRNB2の遺伝子異常に関連する遺伝子変異を非ヒト動物の相同遺伝子Chrna4またはChrnb2 のcDNAにそれぞれ変異導入し、かつ、その変異cDNAの塩基配列の１部を、その塩基配列とは異なる塩基配列を有するが、アミノ酸配列が同一になるように工夫したプローブを導入することによって作出した非ヒト哺乳動物がてんかんのモデル動物となり得ることと同時に、このようにして作出した非ヒト哺乳動物はその組換え個体の識別が容易にできるばかりではなく、組換え遺伝子から発現するmRNAをその本来の相同遺伝子のmRNAと区別して容易に検出できることを見出した。さらに、本発明者は、ヒトCHRNA4またはCHRNB2の遺伝子異常に関連する遺伝子変異を非ヒト動物の相同遺伝子Chrna4またはChrnb2 のcDNAにそれぞれ導入するに際して、変異導入部位とその変異を工夫して制限酵素切断部位を出現させるように変異を導入することにより、組換え個体の識別を容易にすることができることを見出して、この発明を完成した。
したがって、この発明は、ヒトのてんかんの遺伝子異常と同じ遺伝子異常を有するラットなどのてんかんモデル非ヒト哺乳動物であって、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α４サブユニット (CHRNA4) 遺伝子もしくはβ２サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の非ヒト哺乳動物のDNAに遺伝子異常である遺伝子変異を変異導入し、かつ、特定のプローブを導入して得られる変異遺伝子を持つてんかんモデル非ヒト哺乳動物およびその作出方法を提供することを目的としている。
また、この発明は、上記遺伝子変異をcDNAに変異導入するとともに、該cDNAの塩基配列の１部を、該塩基配列部分と塩基配列は異なるが、アミノ酸配列が同一になる上記プローブと置換した変異遺伝子とその作成方法を提供することを目的としている。
この発明の好ましい態様として、上記遺伝子変異をcDNAに変異導入して新たに制限酵素切断部位が出現している変異遺伝子ならびにその変異導入方法を提供することも目的としている。
さらに、この発明は、上記制限酵素切断部位に対する制限酵素または上記プローブを作成するときに使用した制限酵素を用いることによって、組換え体個体を容易に識別することができる組換え体の識別方法を提供することを目的とする。
これらの目的を達成するために、この発明は、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α４サブユニット (CHRNA4) 遺伝子またはβ２サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の非ヒト動物の相同遺伝子Chrna4またはChrnb2 に、遺伝子異常に関連する遺伝子変異をそれぞれ変異導入すると共に、該遺伝子の塩基配列の１部を、その塩基配列部分とは異なる塩基配列を有するが、アミノ酸配列が同じになるように工夫したプローブを導入した変異遺伝子を有するように作出したてんかんモデル非ヒト哺乳動物を提供する。
また、この発明の好ましい態様として、該変異導入により制限酵素切断部位を出現させるてんかんモデル非ヒト哺乳動物が提供される。
この発明の別の目的は、上記てんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法であって、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα４サブユニットCHRNA4またはβ２サブユニットCHRNB2の非ヒト動物の相同遺伝子Chrna4またはChrnb2 のcDNAに、遺伝子異常に関連する遺伝子変異を変異導入するとともに、該cDNAの塩基配列の１部を、その塩基配列部分とは塩基配列が異なるが、アミノ配列が同じになるプローブで置換することによって変異遺伝子を作成し、該変異遺伝子を発現ベクターに移行し、制限酵素で切断して単離した単離DNAを受精卵に注入して受精卵を得、該受精卵を受胚雌動物に移植することによって組換え体を作出することからなるてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法を提供する。
また、この発明は、遺伝子の塩基配列に１個または複数個の変異が変異導入されているとともに、該遺伝子のcDNAの塩基配列の１部が、その塩基配列部分とは塩基配列は異なるが、アミノ配列が同じになるプローブで置換されている変異遺伝子ならびにその作成方法を提供する。この発明の好ましい態様として、該変異導入にともなって制限酵素切断部位が出現している変異遺伝子およびその作成方法が提供される。
さらに、この発明は、上記てんかんモデル非ヒト哺乳動物において、上記変異遺伝子である外来遺伝子が宿主動物の本来の遺伝子との間に相同組換えの存否を、上記プローブまたは上記制限酵素部位の制限酵素を用いて識別する組換え体の識別方法を提供する。
この発明に係るてんかんモデル非ヒト哺乳動物は、外部刺激やけいれん誘発物質を用いて強制的にけいれん発作を誘導させるいわゆる「けいれんモデル動物」ではなく、てんかん発作を自然に誘発するてんかんの真のモデル動物となり得るという大きな効果を有している。
つまり、この発明のてんかんモデル非ヒト哺乳動物は、ヒトのてんかん遺伝子異常と同じ遺伝子異常を有していることから、ヒトのけいれん発作と同様のてんかん発作を自然に誘発するてんかんの真のモデル動物となり得るという大きな効果を有している。
また、この発明に係るてんかんモデル非ヒト哺乳動物においては、該変異導入により出現した制限酵素切断部位の制限酵素または変異遺伝子に導入したプローブの制限酵素を用いることにより、組換え体をシークエンスすることなしに、組換え個体の識別が容易にできるとともに、組換え遺伝子から発現するmRNAをラットなどのそれ本来のChrna4 もしくはChrnb2のmRNAと区別してPCR 法やin situ hybridization法などにより容易に検出できるという効果がある。
この発明に係るてんかんモデル非ヒト哺乳動物は、家族性てんかんの１つで、夜間のてんかん発作を特徴とするヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α４サブユニット (CHRNA4) 遺伝子もしくはβ２サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の遺伝子変異を遺伝子組換えし、該遺伝子の塩基配列の１部が、その塩基配列とは異なるが、アミノ酸配列が同一になるプローブを導入した変異遺伝子を有し、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニット CHRNA4 遺伝子もしくはβ２サブユニット CHRNB2 遺伝子の機能を欠失もしくは欠損している遺伝子組換えてんかんモデル非ヒト哺乳動物である。
ここで、用語「非ヒト哺乳動物」とは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシなどのヒト以外の哺乳動物を意味しているが、ラットが抗てんかん薬の開発に永年使用されているという観点からしてより好ましいといえる。また、本明細書においては、説明を簡潔にするために、ラットを例にして説明するが、特にラットに限定されるものではない。
現在では、一般的に、遺伝子異常を有する疾患モデル動物は当該技術分野で慣用されている組換え動物作出法で作出することができる。この発明においては、家族性てんかんの１つである夜間のてんかん発作を特徴とするヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに対するてんかんモデル動物を当該技術分野で従来から使用されている組換え動物作出法で作出することができる。
そのためには、まず、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α４サブユニット (CHRNA4) 遺伝子もしくはβ２サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の相同遺伝子がラットなどからPCRクローニングなどの常法に従って単離される。なお、ラットChrna4のcDNAの塩基配列情報は、L31620ヒトCHRNA4 cDNAの塩基配列情報のNM_000744 (NCBI)として、またラットChrnb2のcDNAの塩基配列情報はNM_019297 (NCBI)として登録されている。
ラットのニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α４サブユニット (Chrna4) 遺伝子のcDNA（野生型）の塩基配列は下記の通りである。なお、下線部分は、この発明においてプローブと置換される部分を示している。また、対応するアミノ酸配列は配列番号３０に示すとおりである。
（配列番号１）
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
ラットのニューロンニコチン性アセチルコリン受容体β２サブユニット (Chrnb2) 遺伝子のcDNA（野生型）の塩基配列は下記の通りである。なお、下線部分は、この発明においてプローブと置換される部分を示している。また、対応するアミノ酸配列は配列番号３１に示すとおりである。
（配列番号２）
ATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTGTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
このようにして得られたcDNAクローンは既知の変異導入法により変異を導入することができる。この発明に使用できる変異導入法としては、当該技術分野で従来から汎用されている部位特異的突然変異導入法などの従来法を使用するのがよい。この部位特異的突然変異導入法は、cDNAに任意の変異を部位特異的に任意の部位に導入することができる。かかるcDNAの部位に部位特異的に導入できる変異としては、特に限定されるものではなく、その変異が欠失、欠損、置換または付加などの改変であってもよい。
したがって、この発明においても、部位特異的突然変異導入法を利用して単離ラットChrna4またはChrnb2に所定の変異を導入することができ、その結果変異が導入されたラットの相同遺伝子Chrna4またはChrnb2は、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんの発作に関連する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を保持している。
なお、本明細書で使用する「相同遺伝子」またはこれに関連する用語は、遺伝学的用語ではある遺伝子の塩基配列において, 祖先を同じくすると考えられる異種の動物での遺伝子で類似の塩基配列をもち、コードされる蛋白も類似した機能を有するものをいう。
この発明において、ラットのニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット遺伝子のcDNAは次のようにして調整することができる。
具体的には、ラットのcDNAクローンをテンプレートとして既存のラットChrna4 または Chrnb2 の cDNA 配列を基に２種類のプライマー、例えば、下記塩基配列を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを設計・作成する。
ラットChrna4 の cDNA 配列を基にして作成されるフォワードプライマー（40mer）（配列番号３）とリバースプライマー（38mer）（配列番号４）は次の塩基配列を有する。
配列番号３：AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG
配列番号４：AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA
ラットChrnb2の cDNA 配列を基にして作成されるフォワードプライマー(41mer)（配列番号５）とリバースプライマー (40mer) （配列番号６）は次の塩基配列を有する。
配列番号５：AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT
配列番号６：ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA
これらのプライマーを用いてPCRを行って、得られたPCR産物を適切なベクターにサブクローニングする。得られるクローンをシークエンスし、Chrna4および Chrnb2 の cDNA の塩基配列を確認する。
つぎに、上記のようにして得られたcDNAクローンの任意の部位に変異を導入する。変異導入法としては種々の方法が知られていて、そのいずれもこの発明に適用することができる。特に、部位特異的突然変異導入法などの変異導入法を使用することによって任意の部位に任意の変異を導入することができる。
前述したように、CHRNA4 遺伝子の遺伝子異常としては、S280F、S284Lならびに、291-292insLが報告されている。また、CHRNB2 遺伝子の遺伝子変異としては、V287L、V287MおよびI312Mが報告されている。
そこで、この発明においては、上記のようにしてPCRクローニングで単離したラットChrna4（野生型）（配列番号１）およびラットChrnb2（野生型）（配列番号２）に対して、例えば、CHRNA4 遺伝子の遺伝子異常である、S280F、S284L、もしくは291-292insLまたはCHRNB2 の遺伝子変異であるV287LもしくはV287Mに相当する種特異的な相同遺伝子の変異を上記変異導入法によって変異導入することができる。
つまり、変異導入は、適切なセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、市販のキットによって所定の変異を所定の変異導入部位に変異を導入することができる。この変異導入に使用することができるセンスプライマーとアンチセンスプライマーは、一般的には20mer〜40mer、好ましくは25mer〜35merであるのがよい。この場合、制限酵素切断部位が変異導入部位に新たに出現してくるように、プライマー、変異導入部位などを工夫して変異導入を行うのがよい。
具体的には、例えば、野生型ラットChrna4にS282F（ヒトではS280F）の変異導入をするには、下記のセンスプライマー（29mer）とアンチセンスプライマー（29mer）を用いて、cDNAの塩基配列845番の C を T (c.845C>T) に、また846番の G を C (c.846G>C) に変異導入することができる。この変異導入によって、CHRNA4の p.282 番と相同のアミノ酸残基SerがPheに置換される。
使用できるセンスプライマー（配列番号７）およびアンチセンスプライマー（配列番号８）の塩基配列は次の通りである。
配列番号７: CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC
配列番号８：GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG
上記変異導入により生成された変異導入ラットcDNAの塩基配列は下記の通りである。
（配列番号９）
Figure 0005511144
同様に、野生型ラットChrna4にS286L（ヒトではS284L）の変異導入をするには、下記のセンスプライマー(29mer)とアンチセンスプライマー(29mer)を用いて、cDNAの塩基配列856番の T を C (c.856T>C) に、また857番の C を T (c.857C>T) に変異導入することができる。この変異導入によって、CHRNA4の p.286 番と相同のアミノ酸残基SerがLeuに置換される。
使用できるセンスプライマー（配列番号１０）およびアンチセンスプライマー（配列番号１１）の塩基配列は次の通りである。
配列番号１０：CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG
配列番号１１：CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。
（配列番号１２）
Figure 0005511144
同様に、野生型ラットChrna4のcDNAの塩基配列878番と879番の間にGCT (c.878-879insGCT) を挿入することによって、下記センスプライマー(30mer)とアンチセンスプライマー(30mer)を用いて、CHRNA4のp.293番（ヒトでは291番）と相同のアミノ酸残基Leuとp.294番（ヒトでは292番）と相同のアミノ酸残基Ileの間にLeuが挿入される。
使用できるセンスプライマー（配列番号１３）およびアンチセンスプライマー（配列番号１４）の塩基配列は次の通りである。
配列番号１３：GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC
配列番号１４：GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。
（配列番号１５）
Figure 0005511144
上記c.878-879insGCTの場合と同様にして、野生型ラットChrna4のcDNAの塩基配列879番と880番の間に TTA (c.879-880insTTA) を挿入することによって、CHRNA4のp.293番（ヒトでは291番）と相同のアミノ酸残基Leuとp.294番（ヒトでは292番）と相同のアミノ酸残基Ileの間にLeuが挿入される。
（配列番号１６）
Figure 0005511144
同様に、例えば、野生型ラットChrnb2にV287Lの変異導入をすることによって、ラット相同遺伝子Chrnb2のcDNAには、配列番号１６で表される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号１７で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、c.856 番目のGがCに (c.856G>C) 置換され、ヒトのニューロンアセチルコリン受容体β２サブユニットCHRNB2と相同のアミノ酸残基p.286番のValがLeuに置換される。
使用できるセンスプライマー(30mer)（配列番号１７）およびアンチセンスプライマー(30mer)（配列番号１８）の塩基配列は次の通りである。
配列番号１７：CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC
配列番号１８：GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。
（配列番号１９）
Figure 0005511144
同様にして、野生型ラットChrnb2にV287Mの変異導入をすることによって、ラット相同遺伝子Chrnb2のcDNAには、配列番号２０で表される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号２１で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、c.856 番目のGがAに (c.856G>A) 置換され、ヒトのニューロンアセチルコリン受容体β２サブユニットCHRNB2と相同のアミノ酸残基p.286番のValがMetに置換される。
使用できるセンスプライマー(30mer)（配列番号２０）およびアンチセンスプライマー(30mer)（配列番号２１）の塩基配列は次の通りである。
配列番号２０：CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC
配列番号２１：GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。
（配列番号２２）
Figure 0005511144
この発明において、上記のように変異導入する変異の種類を、その変異導入部位に位置するコドンの塩基配列に対応するように工夫することによって、その変異導入部位に新たに酵素部位を出現させることができる。
例えば、Chrna4については、879-880insTTAを変異導入することにより、制限酵素 Tru9 I (MseI) による切断部位 (T↓TAA) が出現する。また、Chrnb2については、V287LもしくはV287Mを導入することにより、制限酵素 Hinf If による切断部位 (G↓ANTG) が出現する。なお、矢印（↓）は切断箇所を示している。ただし、制限酵素の種類や切断部位などはこれらに限定されるものではなく、変異導入を変えることにより適宜選択することができる。
この発明において、上記のcDNAに所定の塩基配列からなるヌクレオチドがプローブとして導入される。導入するプローブは、元の塩基配列とは塩基配列は全くもしくはほぼ全て異なるが、元のアミノ酸配列が同一になるように工夫したヌクレオチドであって、その塩基の数は、一般的には、約３０bp〜２００bp、好ましくは約５０bp〜１５０bp、より好ましくは約６０bp〜１２０bpであるのがよい。これらヌクレオチドは、DNA合成法などの当該技術分野で慣用されている常法に従って調製することができる。
具体的には、例えば、Chrna4 遺伝子の変異導入cDNAに対しては、そのcDNAのc.104 番目から第 c.221 番目までの塩基配列と、その塩基配列は異なるが、アミノ酸配列が同一になるように、下記塩基配列 (118 bp) を有するヌクレオチドをプローブとして作成することができる。
（配列番号２３）
GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
同様にして、例えば、Chrnb2 の変異導入cDNAに対しては、そのcDNAのc.1171 番目から第 c.1232 番目までの塩基配列と、その塩基配列は異なるが、アミノ酸配列が同一になるように、下記塩基配列 (62 bp) を有するヌクレオチドをプローブとして作成することができる。
（配列番号２４）
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
次に、上記のように作成したヌクレオチドプローブをハイブリダイゼイションした後、プローブを制限酵素部位を用いて常法に従って導入する。例えば、配列番号２２で表されるプローブを上記塩基配列を有するChrna4の変異導入 cDNA の所定の部位に、pCRII-TOPO ベクター等の適当なベクターのSma IとBpu1102 I （別名Esp I または Cel II）部位に当該技術分野において慣用されているプローブ導入法によって挿入することができる。また、例えば、配列番号２２で表されるプローブを、上記塩基配列を有するChrnb2の変異導入 cDNA の所定の部位に、pCRII-TOPO ベクター等の適当なベクターの制限酵素部位の Hinc I とSma Iに当該技術分野において慣用されているプローブ導入法によって挿入することができる。各ステップでシークエンスを行い、塩基配列の確認を行った。
ラットChrana4 の変異cDNA (S282F)（なお、ヒトではS280Fである。）に配列番号２３で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (S282FPB) の塩基配列（配列番号２５）は下記の通りである。なお、c.845C>T と c.846G>Cの変異により、四角（□）で囲ったように844番目から846番目のTCG が TTC に変異され、またプローブ部分は、下線で示すように、その塩基数が118 bpで、104番目から221番目に位置している。
（配列番号２５）
Figure 0005511144
ラットChrna4 の変異cDNA (S286L)（なお、ヒトではS284Lである。）に配列番号２３で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (S284LPB) の塩基配列（配列番号２６）は下記の通りである。なお、c.856T>C と c.857C>Tの変異により、四角（□）で囲ったように856番目から858番目のTCT が CTT に変異され、またプローブ部分は、下線で示すように、塩基数が118 bpで、104番目から221番目に位置している。
（配列番号２６）
Figure 0005511144
ラットChrana4の変異cDNA (879-880insL)に配列番号２３で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (S282FPB) の塩基配列（配列番号２７）は下記の通りである。なお、c.845C>T と c.846G>Cの変異により、四角（□）で囲ったように844番目から846番目のTCG が TTC に変異され、またプローブ部分は、下線で示すように、118 bpで、104番目から221番目に位置している。ただし、ヒトではS280Fである。
（配列番号２７）
Figure 0005511144
ラットChrnb2 の変異cDNA に配列番号２４で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (V286L) の塩基配列（配列番号２８）は下記の通りである。
（配列番号２８）
Figure 0005511144
ラットChrnb2の変異cDNA に配列番号２４で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (V286M) の塩基配列（配列番号２９）は下記の通りである。
（配列番号２９）
Figure 0005511144
上記のようにして作製したラット上記変異とプローブを導入したラットChrna4またはChrb2のcDNAを用いて、この発明に係るてんかん非ヒト哺乳動物はそれ自体公知の非ヒト哺乳動物作出方法によって常法に従って作出することができる。かかる非ヒト哺乳動物の作出方法としては、目的遺伝子を動物個体に導入するトランスジェニック動物の作出方法、標的遺伝子と目的導入遺伝子とを組換えた遺伝子置換動物の作出方法、目的遺伝子を改変した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法などが挙げられる。
本明細書では、目的遺伝子である上記変異遺伝子のcDNAを、例としてラットなどの動物個体の受精卵に導入するトランスジェニック動物の作出方法を挙げて説明する。
先ず、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニット (CHRNA4) 遺伝子もしくはβ２サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の相同遺伝子に該変異を持った変異遺伝子をコードするDNAを有する発現ベクターを作製する。
つまり、非ヒト哺乳動物のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α４サブユニット (Chrna4) 遺伝子もしくはβ２サブユニット (Chrnb2) 遺伝子を含むDNAを単離し、このDNA断片に外来遺伝子などを挿入することによって発現ベクターを構築することができる。かかる外来遺伝子としては、マーカー遺伝子が好ましく、特に、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには発現ベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくこともできる。これにより、非相同組換えを起こした細胞株を排除することができる。また、発現ベクターにジフテリアトキシンＡフラグメント（DT-A）遺伝子などを結合させると、非相同的な組換えを起こした細胞株を排除することができる。発現ベクターとしては、例えば、pCI-neo、pMCIneo、pXT1、pSG5、pcDNA3.neo、pLITMUS28、pcDNAIamp、pcDNA3などが使用される。
上記ＤＮＡは、そのＤＮＡを適当なプロモーターの下流に連結した発現ベクターを導入遺伝子として非ヒト哺乳動物に導入するのが好ましい。またプロモーターとしては、上記受容体サブユニットをコードするＤＮＡを導入する非ヒト哺乳動物の細胞内で転写を開始することができるプロモーターであればいずれも用いることができ、例えば、シミアンウイルス４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、ヒトサイトメガロウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来遺伝子などのプロモーターが挙げられる。
また、この発明で使用する発現ベクターは、非ヒト動物のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニット (Chrna2) 遺伝子もしくはβ２サブユニット (Chrnb2) の変異遺伝子をコードするDNAの下流に、mRNAの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルを有していることが好ましい。ポリアデニル化シグナルとしては、例えば、上記のウィルス由来等の各遺伝子に含まれるSV40の後期遺伝子または初期遺伝子等のポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。その他、発現ベクターには、目的遺伝子をさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
この発明においては、例えば、上記変異とプローブを導入したラット変異Chrna4またはChrnb2のcDNAを発現ベクターに制限酵素部位XhoIとNotIを用いて移行させた後、制限酵素SnaBIとNaeIで切断することができる。例えば、ラット変異Chrna4のcDNAをpCI-neoベクター由来のPDGFプロモーターを持つ発現ベクターに移行する場合には、制限酵素部位X hoI とNot I を用いて移行させ、制限酵素SnaBIとNae Iで切断することができ、また、ラットChrb2のcDNAを移行する場合には、制限酵素部位Xho IとSal Iを用いて移行させ、制限酵素SnaBIとDraIIIで切断することができる。これによって、PDGFプロモーター、ラット変異Chrna4 またはChrnb2のcDNAならびにpoly A部分からなる断片をＤＮＡ構築物としてゲル切り出しにより単離・精製することができる。
この発明においては、例えば、上記のようにして単離・精製したＤＮＡ構築物などを非ヒト哺乳動物の分化全能性細胞に導入することによって非ヒト哺乳動物を作出することができる。使用できる分化全能性細胞としては、例えば、受精卵、初期胚、胚性幹細胞などが使用できる。DNA構築物を導入する受精卵は、例えば、性腺刺激ホルモン（PMS）などの排卵誘発剤を腹腔内投与し、雌動物に過剰排卵を誘発させてDNA構築物の導入可能な受精卵を回収し、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配させた偽妊娠雌動物の卵管を摘出して、顕微鏡下で採取することによって得ることができる。
次に、得られた受精卵にDNA構築物を導入する。構築物を受精卵に導入する手段としては、種々の方法が知られているが、トランスジェニック動物個体の作出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、マイクロインジェクション法が好ましい。このように変異遺伝子を注入した受精卵は、仮親の卵管に移植し、個体まで発生させ、体の一部（例えば、尾部先端等）の体細胞からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入した遺伝子の存在を確認する。このように体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作製することができる。
上記によって導入遺伝子の存在が確認された個体（ヘテロ接合体）を初代（Founder：F0）とすれば、導入遺伝子はその子（F1）の50%に伝達される。さらに、このF1個体の雌雄を交配させることにより、２倍体染色体の両方に導入遺伝子を有する個体（F2）を作出することができる。
これに対して、この発明においててんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出に用いるトランスジェニック方法は、内在性遺伝子（Chrna4遺伝子またはChrnb2遺伝子）は正常のままの状態で、新たにその染色体DNAの任意の位置に変異型Chrna4またはChrnb2をコードする変異遺伝子を導入する。このため、この発明のてんかんモデル動物では、正常なChrna4またはChrnb2と変異型Chrna4またはChrnb2とがそれぞれ共に産生されている。ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体は、イオンチャンネル（αサブユニット2個、βサブユニット3個）として機能するタンパク質であるが、このようなイオンチャンネルはいずれかのサブユニットが変異していればチャンネル機能が変更される。従って、この発明のように、正常サブユニットと変異サブユニットを同時に発現さえることがヒト型てんかん発作を呈するモデル動物として適切であると考えられる。
この発明のてんかんモデル非ヒト哺乳動物は、後記の実施例に示すように、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様に、睡眠中にてんかん発作を自然発症するという優れた特性を有している。
なお、目的遺伝子が全ての細胞の染色体上に組み込まれた個体の選択は、通常は、個体を構成する血液組織、上皮組織などの組織の一部からDNAを調製し、そのDNAをシークエンスして、その導入遺伝子が存在することをDNAレベルで確認することによって行われる。しかし、このようにDNAをシークエンスしてかかる組換え個体の選択をするには、手間も時間も、また費用も掛かる繁雑な仕事を行う必要がある。
つまり、遺伝子異常を有する疾患モデル動物を作出する場合、相同組換え体を正確に判別する必要がある。従来の疾患モデル動物の作出法では、組換え体を判別するために、その個体の遺伝子の１部をシークエンスする必要があり、かつその導入遺伝子のmRNAを発現する必要があった。しかしながら、その導入遺伝子のmRNAをRT-PCRやin situ hybridizationなどで発現させるのは容易ではない。
そこで、この発明においては、上記のように変異遺伝子を変異導入するとともに、その変異遺伝子の１部をプローブと置換することによって組換え体の識別を容易に行うことができるように工夫をしている。また、上記変異導入によって新たな制限酵素切断部位を出現させる場合にも、組換え体の識別を容易に行うことができる。なお、このアプローチは、下記に説明する具体的態様に限定的に適用されるばかりではなく、遺伝子変異や制限酵素などの種類に関係なくあらゆる変異導入に包括的に適用できるものと理解さるべきである。また、この発明においては、このcDNAクローンの部位に部位特異的に導入する変異の種類は特に限定されるものではない。
つまり、この発明では、かかる組換え個体の選択を容易に行えるように、前述したように、非ヒト動物のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα４サブユニット (Chrna4) 遺伝子もしくはβ２サブユニット (Chrnb2) 遺伝子をコードするDNAに、例えば、S280L、S284L、S291-292L、V287L、V287M などの変異を導入して新しく制限酵素切断部位を出現させている。このように新しい制限酵素切断部位を出現させることによって、組換え体の作出に際して、組換え体の識別を容易にすることができる。
この発明においては、作成した変異導入 cDNA の１部の塩基配列を、その塩基配列とは実質的には全く異なるが、アミノ酸配列が同一になる塩基配列からなるプローブで置換して元の塩基配列と同一の部位に導入しているので、その導入したプローブの制限酵素を用いることによって、組換え個体を容易に識別することができるばかりではなく、組換え遺伝子から発現する mRNA をラット本来の Chrna4 mRNA または Chrnb2 mRNA と区別して、RT-PCR や in situ hybridization などによって容易に検出することができる。
また、例えば、ニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα４サブユニットCHRNB2の相同遺伝子Chrnb2に対して変異 (c.856G>C)または(c.856G>A) 導入することによって、制限酵素切断部位Hinf Ifが出現することから、この切断部位を含む領域を制限酵素Hinf Ifを用いてPCR-RFLP（制限酵素断片長多型）法などにより判別することができる。つまり、目的とする相同組換えが起こっていない個体は、Hinf If部位を有していないことになるから、制限酵素Hinf Ifでは切断が起こらないのに対して、目的とする相同組換えが起こっている個体は、Hinf If部位を有しているから、制限酵素Hinf Ifで切断されることになる。したがって、この発明において、ニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα４サブユニットCHRNA4の相同遺伝子Chrna4またはβ４サブユニットCHRNB2の相同遺伝子Chrnb2に対して制限酵素切断部位を出現させるように変異導入することにより、組換え体を容易に識別することができる。
なお、ここで使用されるPCR-RFLP法は、それ自体周知の手法であって、この方法によって、対象となる部位をPCRにより増幅し、増幅産物を所定の制限酵素、例えば、True9IやHinf Ifなどの制限酵素で消化し、消化後のDNA断片のサイズを電気泳動等により、その制限酵素の切断部位の存否を調べることができる。
次に、この発明を実施例により更に詳細に説明するが、この発明は下記実施例によって一切限定されるものではなく、また下記実施例はこの発明を具体的に説明するためにだけ例示的に記載するものであって、この発明をいかなる意味においても限定する意図で記載するものではないと理解されるべきである。
[実施例１]
まず、Rat Brain QUICK-Clone cDNA (CLONTECH; Mountain View, CA) をテンプレートとして既存のラット Chrna4 の cDNA 配列を元に設計した２つのプライマー、つまり、フォワードプライマー (BN-Rat CHRNA4 cDNA-F)：
AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG (40mer)（配列番号３）
と、リバースプライマー (Rat CHRNA4 cDNA-BX-R)：
AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA (38mer) （配列番号４）
とによりPCRを行った。得られたPCR産物を精製し、pCRII-TOPOベクター(Invitorogen; Carlsbad , CA ) にサブクローニングした。得られたクローンをシークエンスし、Chrna4 の cDNA の塩基配列を確認した。なお、ラット塩基配列情報はアクセッション番号L31620 (NCBI) として登録されている。
得られたクローンにQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit ( STRATAGENE; La Jolla, CA ) を用いて変異の導入を行った。まず、r845T846C-sen：CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC (29mer) （配列番号７）とr845T846C-ant：GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG (29mer) （配列番号８）を用いて、cDNA 塩基配列845番のCをTに、また846番のGをCに変異させた。得られた変異cDNAの塩基配列は配列番号９に表されるとおりである。これによりヒトニューロンアセチルコリン受容体α４サブユニットと相同のアミノ酸残基p.282番のSerがPheに変異した。
このように作成した変異導入のcDNAの c.104からc.221に、この部位と同じアミノ酸配列となるが、元の塩基配列とは全く異なる下記塩基配列を有する118ｂｐのヌクレオチドからなるプローブ（配列番号２３）を作成し導入した。
（配列番号２３）GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
上記のようにしてプローブを導入した変異導入cDNAをハイブリダイゼイションの後、pCRII-TOPO ベクターに挿入中の Chrna4 の cDNA を制限酵素部位のSmaIとBpu1102Iを用いて挿入を行った。各ステップでシークエンスを行い、塩基配列の確認をおこなった。
さらに、該当変異(S286L)を有したラット Chrna4 のcDNAを、pCI-neo ベクター由来の PDGF プロモーターを持つ発現ベクターに制限酵素部位XhoIとNotIを用いて移行させたのち、制限酵素SnaBIとNaeIで切断した。PDGF プロモーターとラット Chrna4 のcDNAならびにpoly A部分を有す断端をゲル切り出しにより単離、精製した。この単離・精製したDNAを受精卵に顕微注入し、状態の良好な２００個以上の卵を受胚雌動物の卵管に移植し、自然分娩する方法によって組換え体を作出した。
[実施例２]
実施例１と同様にして、r856C857T-sen：CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG (29mer) （配列番号１０）とr856C857T-ant：CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG (29mer) （配列番号１１）を用いて、cDNA塩基配列856番のTをCに, 857番のCをTに変異させた。得られた変異cDNAの塩基配列は配列番号１２に表されるとおりである。これによりヒトニューロンアセチルコリン受容体α４サブユニットと相同のアミノ酸残基p.286番のSerがLeuに変異した。
このように作成した変異導入の cDNA の c.104からc.221に、実施例１と同様に、配列番号２３で表される118ｂｐのヌクレオチドからなるプローブを作成し導入した。
上記のようにしてプローブを導入した変異導入cDNAを使用して、実施例１と同様にして組換え体を作出した。
[実施例３]
実施例１と同様にして、センスプライマーとしてのrCHRNA-878insGCT-sen：GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC (30mer) （配列番号１３）とアンチセンスプライマーとしてのrCHRNA-878insGCT -ant：GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC (30mer) （配列番号１４）を用いて、cＤＮＡ塩基配列878番と879番目の間にGCTを挿入した。得られた変異cDNAの塩基配列は配列番号１５に表されるとおりである。これによりヒトニューロンアセチルコリン受容体α４サブユニットと相同のアミノ酸残基p.293番のLeuとp.294番のIleの間にLeuが挿入された。
このようにして作成した変異導入の cDNAを使用して、実施例１と同様にして、組換え体を作出した。
[実施例４]
PCRクローニングで単離したラットChrnb2に、変異導入法により、c.856G>Cとc.856G>Aを導入した。つまり、Rat Brain QUICK-Clone cDNA ( CLONTECH Mountain View,CA) をテンプレートとして既存のラットChrnb2のcDNA配列を元に設計した二つのプライマー（BN-Rat CHRNB2 cDNA-F：AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT ( 41mer )（配列番号５）とRat CHRNB2 cDNA-CB-R：ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA ( 40mer ) （配列番号６）とによりPCRを行った。得られたPCR産物を生成しpCRII-TOPO ベクター(Invitorogen Carlsbad , CA) にサブクローニングした。得られたクローンをシークエンスし、Chrnb2のcDNAの塩基配列を確認した。このラット塩基配列情報はアクセッション番号NM_019297 (NCBI)として登録されている。
得られたクローンにQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE、 La Jolla, CA)を用いて変異の導入を行った。まず、Rat CHRNB2 m286V/M-F：CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC (30mer)（配列番号１７）とRat CHRNB2 m286V/M-R：GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG (30mer)（配列番号１８）を用いて、cDNA塩基配列856番のGをCに変異させた。これによりヒトのニューロンアセチルコリン受容体β2サブユニットと相同のアミノ酸残基p.286番のValがLeuに変異した（βにしたのは特許庁のオンライン出願での規則によります）。
この変異導入の際に、c.856G>Cの導入により、制限酵素切断部位がHinf Ifが出現し、組換え体作出時、組換え体の識別を容易にできるよう考案した。
作成した変異導入のcDNAのc.1171からc.1232に、この部位とおなじアミノ酸配列となるが、基の塩基配列とは全く異なるプローブ（配列番号２４）を導入した。
（配列番号２４）
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
なお、この62 bpのヌクレオチドを作成し、ハイブリダイゼイションののち、pCRII-TOPOベクターに挿入中のChrnb2のcDNAを制限酵素部位のHinc IIとSma Iを用いて挿入を行った。各ステップでシークエンスを行い、塩基配列の確認をおこなった。
さらに、該当変異とプローブを有したラットChrnb2のcDNA二種類を、pCI -neo ベクター由来のPDGFプロモーターを持つ発現ベクターに制限酵素部位Xho IとSal Iを用いて移行させたのち、制限酵素SnaBIとDraIIIで切断した。PDGFプロモーターとラットChrnb2のcDNA並びにpoly A部分を有す断端をゲル切り出しにより単離、精製した。この単離したDNAを受精卵に顕微注入し、状態の良好な２００個以上の卵を受胚雌動物の卵管に移植し、自然分娩する方法によって組換え体を作出した。
[実施例５]
実施例４と同様に、Rat CHRNB2 m286V/L-F：CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC (30mer)（配列番号２０）とRat CHRNB2 m286V/L-R：GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG (30mer)（配列番号２１）を用いて、cDNA塩基配列856番のGをAに変異させた。これによりヒトのニューロンアセチルコリン受容体β2サブユニットと相同のアミノ酸残基p.286番のValがMetに変異した。このようにして得られた変異導入cDNAを用いて、実施例４と同様にして組換え体を作出した。
［実施例６］
てんかんモデルラットの脳波(electroencephalogram: EEG) 測定
8-10週齢のトランスジェニックラット（Chrnb2 V286L）に対して脳波(EEG)を測定した。ラットをnembutal（大日本住友製薬株式会社）で麻酔し、脳定位固定装置 （SR-5、成重）に固定し、電極をラットの頭蓋骨のbregma からArterial: 2.5 mm, Lateral: 1.5 mmとArterial: -2.5 mm, Lateral: 2.5 mmに、不関電極はラット鼻骨付近の骨の厚い部分に装着し、歯科用セメントで固定した。脳波測定用のテフロン (登録商標) 被覆ステンレス電極を左右大脳半球の前頭葉 (ブレグマよりA= 3. mm、L= 0.8 mm) に装着し、歯科用セメントで固定した。不関電極は、小脳部位の上部に埋め込んだ。脳波 (EEG) はVideoOption (キッセイコムテック) を用いて、数日間ラットをチャンバー内に入れて自由運動条件下で測定を行い、脳波解析はSleepSign (キッセイコムテック)を用いて行った。
脳波測定結果を図５に示す。図中、異常脳波部分を記号Ａおよび記号Ｂで示し、その記号Ａで示した異常脳波部分の拡大図を図６、また記号Ｂで示した異常脳波部分を図７に示す。この結果から、この発明に係るラットはてんかんモデルラットとして利用できることが確認された。
この発明に係るてんかんモデル非ヒト哺乳動物は、ヒトのてんかん遺伝子異常と同じ遺伝子異常を有するてんかんモデル非ヒト哺乳動物であるから、このモデル動物を使用することによりヒトのてんかん発作と同等のけいれん発作を誘発させて調べることができるので、てんかんの治療薬の研究・開発に利用することができる。
図１は、CHRNA4のSma I/Bpu1102 I 部位におけるエンザイムサイトを示す図。（Ａ）は野生型CHRNA4のエンザイムサイトを示し、（Ｂ）はプローブのエンザイムサイトを示す図。 図２は、実施例１で構築した発現ベクターを示す概略図。 図３は、SnaB I/NaeI部位におけるPDGFプロモーターとラットChrna4の構成を示す概略図。 図４は、CHRNB2のHinc II/Sma I 部位におけるエンザイムサイトを示す図。（Ａ）は野生型CHRNB2のエンザイムサイトを示し、（Ｂ）はプローブのエンザイムサイトを示す図。 図５は、実施例４で構築した発現ベクターを示す概略図。 図６は、SnaB I/Dra III部位におけるPDGFプロモーターとラットChrnb2の構成を示す概略図。 図７は、トランスジェニックラット（Chrnb2 V287L）の脳波(EEG)を測定した結果を示す図。 図８は、図６の記号Ａ部分の拡大図。 図９は、図６の記号Ｂ部分の拡大図。

Claims (2)

  1. ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のβ２サブユニットCHRNB2をコードする遺伝子Chrnb2の変異cDNAを有するてんかんモデルラットであって、該変異cDNAは、
    Chrnb2 cDNA（配列番号２）の856番G（グアニン）のC（シトシン）への置換（c.856G>C）により、CHRNB2（配列番号３１）のp.286番アミノ酸残基ValをLeuに置換させる第１の変異と、
    Chrnb2 cDNA（配列番号２）における前記変異（c.856G>C）以外の領域の塩基配列に存在する変異であって、配列番号３１のそれと同一のアミノ酸配列をコードするが配列番号２とは異なる塩基配列からなり、該変異cDNAの存在を検出するためのプローブとして機能する第２の変異、
    とを有することを特徴とするてんかんモデルラット。
  2. 請求項１に記載のてんかんモデルラットの作出方法であって、Chrnb2 cDNA（配列番号２）の856番G（グアニン）のC（シトシン）への置換（c.856G>C）により、CHRNB2（配列番号３１）のp.286番アミノ酸残基ValをLeuに置換させる第１の変異と、Chrnb2 cDNA（配列番号２）における前記変異（c.856G>C）以外の領域の塩基配列に存在する変異であって、配列番号３１のそれと同一のアミノ酸配列をコードするが配列番号２とは異なる塩基配列からなり、該変異cDNAの存在を検出するためのプローブとして機能する第２の変異とを有する変異Chrnb2 cDNAを作成すること、
    該変異Chrnb2 cDNAを発現ベクターに移行すること、
    該発現ベクターに含まれる該変異Chrnb2 cDNAを受精卵に注入して受胚雌動物に移植することによって組換えラットを作出することを特徴とするてんかんモデルラットの作出方法。
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