DE69723369T2

DE69723369T2 - Mikrobieller Stamm, Verfahren zum biologischen Abbau von organischen Verbindungen und Verfahren zur Engiftung der Umwelt damit

Info

Publication number: DE69723369T2
Application number: DE69723369T
Authority: DE
Inventors: Chieko Ohta-ku Mihara; Tetsuya Ohta-ku Yano; Shinya Ohta-ku Kozaki; Takeshi Ohta-ku Imamura
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2017-08-01
Also published as: JP3347596B2; US5962305A; EP0822253A3; DE69723369D1; EP0822253B1; EP0822253A2; JPH1042863A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf einen neuartigen mikrobiellen Stamm und ein Verfahren zum biologischen Abbau von chlorierten organischen Verbindungen, wie etwa Trichlorethylen (TCE) und Dichlorethylen (DCE) durch seine Verwendung. Sie bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Umweltsanierung durch Behandlung eines wässrigen Mediums, wie etwa Abwasser und wässrige Abfalllösungen, die chlorierte organische Verbindungen enthalten. Ein derartiges Verfahren ist verwendbar zur Wiederherstellung des Bodens und der Luft (gasförmige Phase der Umwelt) von Verunreinigungen, insbesondere wenn die Luft mit chlorierten organischen Verbindungen verunreinigt ist.
Verwandter Stand der Technik
In den letzten Jahren war die Umweltverschmutzung durch schwer abbaubare chlorierte organische Verbindung, die schädlich für Lebewesen sind, in Hauptumweltproblem. Insbesondere wird angenommen, dass der Boden von industriellen Gebieten, verbunden mit Papierherstellung, Zellstoffindustrie und Feinmaschinenbau in einem großen Umfang durch chlorierte organische Verbindungen, einschließlich chlorierter aliphatischer Kohlenwasserstoffverbindungen, wie etwa Tetrachlorethylen (PCE), Trichlorethylen (TCE) und Dichlorethylen (DCE) verunreinigt wurden, und diese Annahme wurde durch eine Anzahl von Berichten über die Umwelt von Industriegebieten überall auf der Welt bestätigt. Die in den Boden abgegebenen, chlorierten organischen Verbindungen werden dann im Grundwasser gelöst und breiten sich in umgebende Bereiche aus, um sie zu verunreinigen. Die meisten dieser Verbindungen stehen unter starkem Verdacht krebserregend zu sein und stellen ein soziales Hauptproblem dar, insbesondere da viele Leute auf Grundwasser zur Wasserversorgung angewiesen sind, und diese Verbindungen in der Umwelt sehr stabil sind.
Unter diesen Umständen ist es vom Umweltschutzstandpunkt lebenswichtig, die verunreinigten wässrigen Medien, wie etwa Grundwasser, Boden und die umgebende gasförmige Phase durch Entfernung und Abbau der darin enthaltenen chlorierten organischen Verbindungen zu behandeln, und tatsächlich wurden Fortschritte gemacht, um für derartige Behandlungsvorgänge notwendige Technologien zu entwickeln.
Während bekannte Technologien zum Umweltschutz Adsorption unter Verwendung von Aktivkohle und Abbau durch Hitze oder Licht einschließen, sind sie mit Blick auf Kosten und Durchführbarkeit nicht notwendigerweise praktikabel und brauchbar.
Inzwischen wurden Mikroorganismen beschrieben, die chlorierte organische Verbindungen, wie etwa TCE abbauen, die normalerweise stabil in der Umwelt sind, und eine Anzahl von Untersuchungen wurden begonnen, um sie in praktischen Anwendungen zu nutzen. Einige der Vorteile der Verwendung von Mikroorganismen für biologische Abbauverfahren sind, das chlorierte organische Verbindungen harmlos durch geeignete Auswahl von einem oder mehreren spezifischen Mikroorganismen und ihrer Verwendung zum biologischen Abbau reduziert werden können, dass grundsätzlich keine Chemikalien für den biologischen Abbau erforderlich sind, um das Kosten für Instandhaltung und Laborarbeit bei biologischen Abbauverfahren vermindert werden können. Jedoch gibt es eine begrenzte Anzahl von Berichten über isolierte Mikroorganismen mit der Fähigkeit chlorierte organische Verbindungen abzubauen. Bekannte mikrobielle Stämme, die für den biologischen Abbau von TCE verwendet werden können, enthalten Welchia alkenophila Sero 5 (USP 4877736, ATCC 53570), Welchia alkenophila Sero 33 (USP 4877736, ATCC 53571), Methylocystis sp. Stamm M (Agric Biol. Chem., 53, 2903 (1989), Biosci. Biotech. Biochem., 56, 486 (1992), ibid 56, 736 (1992)), Methylosinus trichosporium 0B3b (Am. Chem. Soc. Natl. Meet. Dev. Environ. Microbiol., 29, 365 (1989), Appl. Environ. Microbiol., 55, 3155 (1989), Appl. Biochem. Biotechnol., 28, 877 (1991), S.U. S.4 Z17 2-92274, S.U. S.4 Z.17 3-292970), Methylomonas sp. NM2 (Appl. Environ. Microbiol., 57, 236 (1991)), Alcaligenes denitrificans ssp. Xylosoxidans JE75 (Arch. Microbiol., 154, 410 (1990)), Alcaligenes eutrohpus JMP134 (Appl. Environ. Microbiol., 56, 1179 (1990)), Alcaligenes eutrophus FERM-13761 Open Nr. 7-123978, Pseudomonas aeruginosa JII04 S.U. 7-236895), Mycobacterium vaccae JOB5 (J. Gen. Microbiol., 82, 163 (1974), Appl. Environ. Microbiol., 55, 2960, (1989), ATCC 29678), Pseudomonas putida BH (J. of Japan Sewage Work Assoc. (Gesuido Kyokai-shi), 24, 27 (1987), Pseudomonas sp. Stamm G4 (Appl. Environ. Microbiol., 52, 383, (1986), ibid 53, 949 (1987), ibid 54, 951 (1989), ibid 56, 279 (1990), ibid 57, 193 (1991), USP 4925802, ATCC 53617, dieser Stamm wurde zunächst als Pseudomonas cepacia klassifiziert, aber später zu Pseudomonas sp. geändert, Pseudomonas mendocina KR-1 (Bio/Technol., 7, 282 (1989), Pseudomonas putida F1 (Appl. Environ. Microbiol., 54, 1703 (1988), ibid 54, 2578 (1988)), Pseudomonas fluorescens PFL12 (Appl. Environ. Microbiol., 54, 2578 (1988)), Pseudomonas putida KWI-9 Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 6-70753, Pseudomonas cepacia KK01 S.O. 6-22769. Nitrosomonas europaea (Appl. Environ. Microbiol., 56, 1169 (1990) und Lactobacillus vaginalis sp. Nov (Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 368 (1989), ATCC 49540).
Ein Problem der praktischen Anwendung dieser abbauenden Bakterien zur Sanierung der Umwelt ist, dass sie Chemikalien, wie etwa aromatische Verbindungen oder Methan als eine Induktionssubstanz (einen Induktor) benötigen.
Obwohl aromatische Verbindungen, wie etwa Phenol und Toluol hervorragend als Abbauinduktoren dienen, sind sie toxisch und sollten nicht in die Umwelt abgegeben werden. Obwohl Methan ebenfalls als ein Abbauinduktor verwendbar ist, ist es leicht entflammbar und daher ist es schwierig und sehr gefährlich Methan in die Umwelt auf eine kontrollierte Art und Weise abzugeben.
Nelson et al. entwickelten ein Verfahren unter Verwendung von Tryptophan, einer Aminosäure, als ein Abbauinduktor zum biologischen Abbau chlorierter organischer Verbindungen (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 4-502277). Obwohl dieses Verfahren die Toxizität und Gefahr des Induktors selbst in einem gewissen Maße vermeiden kann, ist Tryptophan eine sehr teure Verbindung und die Kompliziertheit des kontrollierten Einbringens einer spezifischen Substanz in die Umwelt ist weiterhin nicht gelöst. Zusätzlich ist die Zugabe einer übermäßigen Kohlenstoff- und Stickstoffquelle in die Umwelt ebenfalls vom Standpunkt der Eutrophierung nicht bevorzugt. Überdies, da derartige TCE-abbauende Enzyme induzierbare Enzyme sind, hält die einmal induzierte enzymatische Aktivität nur für wenige Stunden bis einen Tag an, erfordert danach eine weitere Induktion und es gibt ein Problem, dass der Abbau von TCE kompetitiv durch die Anwesenheit des Induktionsmittels gehemmt wird.
Gegenwärtig wurden Fortschritte gemacht, ein Plasmid mit einem DNA Fragment einzubringen, welches für eine Oxygenase oder eine Hydroxylase als ein TCE-abbauendes Enzym in einem Wirtsbakterium kodiert, um die TCE-abbauende Aktivität unter Verwendung eines harmlosen Induktors zu exprimieren, oder sie in der Abwesenheit irgendeines Induktors konstitutiv zu exprimieren. Mikrobielle Stämme mit einem derartigen DNA-Fragment enthalten Pseudomonas mendocina KR-1 S.O. 2-503866), Pseudomonas putida KWI-9 (S.O. 6-105691) und Pseudomonas putida BH (Zusammenfassung der "Third Conference for the Studies on the Contamination of Underground Water and Soil and Preventive Measures" (1994)).
Jedoch haben diese rekombinanter Stämme verschiedene unterschiedliche Probleme, einschließlich der Verwendung des sehr teuren IPTG (Isopropylthiogalactopyranosid) und einer unzureichenden Stabilität des Plasmids in Wirtsmikroorganismus. Zusätzlich unterliegt das Freisetzen rekombinanter Mikroorganismen in die Umwelt genauen Bestimmungen unter Berücksichtigung der öffentlichen Akzeptanz.
Shields et al. erzielten einen mutierten Stamm von Pseudomonas sp. Stamm G4, der TCE in der Abwesenheit eines Induktors (Phenol oder Toluol) unter Verwendung eines Transposons abbauen kann (Appl. Environ. Microbiol., 58, 3977 (1992), PCT Application, International Patentveröffentlichung WO 92/19738).
Jedoch ist dieser mutierte Stamm von G4 beim TCE-Abbau nicht befriedigend aktiv und hat ein Problem der Instabilität aufgrund des Transposons. Zusätzlich, da das Transposon selbst ein Antibiotikaresistenzgen enthält, wie etwa Kanamycinresistenz, gibt es eine mögliche Gefahr der horizontalen Übertragung auf andere Mikroorganismen, falls der mutierte Stamm in die Umwelt beigesetzt wird.
Hinsichtlich der vorher dargestellten Probleme und anderer Probleme führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Serie von Mutationsexperimenten am J1-Stamm (FERM BP-5102) mittels Nitrosoguanidin durch, und waren erfolgreich durch Erhalt eines neuen Stamms JM1 (FERM BP-5352), der in der Lage ist flüchtige chlorierte organische Verbindungen und aromatische Verbindungen abzubauen ohne eines Induktors zu bedürfen, wie in der Japanischen Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr. 8-294387 offenbart.
Spezifischer wurde der Stamm JM1 (FERM BP-5352) durch Mutagenese des Stamms J1 (FERM BP-5201; National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology) unter Verwendung einer Chemikalie, Nitrosoguanidin, ohne genetische Manipulation erhalten. Der Stamm JM1 erfordert keine Verwendung eines Induktors, wie etwa Phenol, Toluol oder Cresol für den Abbau flüchtiger chlorierter organischer Verbindungen einschließlich TCE.
Als ein Mikroorganismus, welcher chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen, wie etwa TCE, ohne einen Induktor abbauen kann, wurde Burkholderia (Pseudomonas) Cepacia PR1301 (hiernach einfach als PR1301 bezeichnet) in Environmental Science & Technology, Band 30, Nr. 6, S. 2045–2052 berichtet.
Vom Standpunkt der Behandlung von TCE-haltigen Abfalllösungen und Boden, ist es erforderlich, dass der zu verwendende Mikroorganismus nicht nur eine TCE-Abbaufähigkeit hat, sondern ebenfalls die Fähigkeit in der armen Umwelt einer Abfalllösung oder eines Bodens zu wachsen und seine Abbaufähigkeit zu erhalten.
In der natürlichen Bodenumwelt, ungleich Kultursystemen in Laboratorien, ist die Optimierung des Wachstums und der Abbauaktivität eines Mikroorganismus, der chlorierte organische Verbindungen abbauen kann, aufgrund verschiedener Faktoren, wie etwa Temperatur, Feuchtigkeitsgehalt, pH, Sauerstoffgehalt und andere Parameter des Bodens ziemlich schwierig, so dass nach wie vor eine Anzahl von zu lösenden Problemen vorhanden ist, um erfolgreich Boden von Kontamination mittels Mikroorganismen, die Verunreinigungen abbauen können, wieder herzustellen.
Von diesen Parametern, ist die Temperatur sehr wichtig, da sie direkt das Wachstum und die Abbauaktivität des in den Boden eingebrachten Mikroorganismus beeinflusst. Die Bodentemperatur in der Temperaturzone, in der sich Japan befindet, wird im Wesentlichen konstant bei etwa 15°C gehalten, was signifikant niedriger als 25°C ist, der optimalen Temperatur für das Wachstum und die Abbauaktivität des Stamms JM1. Während der Stamm JM1 bei etwa 15°C in praktischen Anwendungen ausreichend wachsen und seine biologische Abbauaktivität exprimieren kann, kann die Bodentemperatur nahe der Oberfläche im Winter in Japan signifikant unter dieses Niveau fallen, wo die Umgebungstemperatur sehr wohl unterhalb null fallen kann. In kälteren Regionen, wie etwa "Cryic" und "Frigid", wie durch die Bodentaxonomie der Abteilung für Landwirtschaft der U.S. Regierung definiert, ist die durchschnittliche jährliche Bodentemperatur zwischen 0 und 8°C und zwischen 8 und 15°C im Mittel.
Daher gibt es einen Bedarf für eine Technologie um vollständig die hervorragenden Eigenschaften des Stamms JM1 für den Abbau aromatischer Verbindungen und/oder chlorierter organischer Verbindungen ohne Verwendung eines Induktors bei einer Temperatur typischerweise zwischen 4 und 15°C zu nutzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist einen neuen mikrobiellen Stamm zur Verfügung zu stellen, der Verunreinigungen ohne einen Induktor in einer Niedertemperaturzone bemerkenswert abbaut, und ein Verfahren des Abbaus von Verunreinigungen durch seine Verwendung, als auch ein Verfahren zur Umweltsanierung durch seine Verwendung.
Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung wird ein neuartiger Stamm JMC1 (FERM BP-5960), der konstitutiv eine Oxygenase exprimiert zur Verfügung gestellt, welcher ein vom Stamm JM1 (FERM BP-5352) abgeleiteter, mutierter Stamm ist.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zum biologischen Abbau einer aromatischen Verbindung oder einer chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindung durch Einsatz eines neuartigen Stamms JMC1 (FERM BP-5960), der konstitutiv Oxygenase exprimiert, zur Verfügung gestellt, welcher ein von JM1 (FERM BP-5352) mutierter Stamm ist. Gemäß diesem Verfahren werden aromatische Verbindungen und chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen wirkungsvoll bei einer Temperatur nicht höher als 15°C abgebaut.
Gemäß eines noch weiteren Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Umweltsanierung zur Verfügung gestellt, mit einem Schritt des biologischen Abbaus von Verunreinigungen in der Umwelt durch Einsatz eines neuartigen Stamms JMC1 (FERM BP-5960), der konstitutiv Oxygenase exprimiert, welcher ein mutierter Stamm von JM1 (FERM BP-5352) ist. Dieses Verfahren kann wirkungsvoll die aromatischen Verbindungen und chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen enthaltende Umwelt bei einer Temperatur von nicht höher als 15°C sanieren.
In einer Reihe von Experimenten, isolierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen mutierten Stamm JMC1 des Ausgangsstamms JM1 (FERM BP-5352) welcher onstitutiv Oxygenase exprimiert, durch Verbringen des Ausgangsstamms in eine kühle Umwelt von 4°C in der anfänglichen Wachstumsphase. Sie fanden, dass dieser mutierte Stamm JM1 konstitutiv Oxygenase exprimiert, folglich kann er aromatische Verbindungen und chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe ohne die Anwesenheit eines Induktors in einer Umwelt mit niedriger Temperatur abbauen. Daher haben die Erfinder ein Verfahren zum Abbau aromatischer Verbindungen und chlorierter aliphatischer Kohlenwasserstoffverbindungen oder ein Verfahren zur Sanierung der durch diese Chemikalien verschmutzen Umwelt unter Verwendung dieses mutierten Stamms JMC1 gefunden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE durch den Stamm JMC1 zeigt.
Die 2 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von DCE durch den Stamm von JMC1 zeigt.
Die 3 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von aromatischen Verbindungen durch den Stamm JMC1 zeigt.
Die 4 ist eine grafische Darstellung, um den Stamm JM1 mit dem Stamm JMC1 im Wachstum und dem TCE-Abbau zu vergleichen.
Die 5 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE im Boden durch den Stamm JM1 und den Stamm JMC1 zeigt.
Die 6 ist eine grafische Darstellung, die ebenfalls den Abbau von TCE im Boden durch den Stamm JM1 und den Stamm JMC1 zeigt.
Die 7 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE im Boden durch den Stamm JMC1 zeigt.
Die 8 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE im Boden durch den Stamm JMC1 zeigt.
Die 9 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von Phenol im Boden durch den Stamm JMC1 zeigt.
Die 10 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE in einer gasförmigen Phase durch den Stamm JMC1 zeigt.
Die 11 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von Toluol in einer gasförmigen Phase durch den Stamm JMC1 zeigt.
Die 12 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE in einer gasförmigen Phase bei Belüftung eines den Stamm JMC1 enthaltenden Bodes zeigt.
Die 13 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE in einer gasförmigen Phase bei kontinuierlicher Belüftung der Flüssigkultur des Stammes JMC1 zeigt.
Die 14 ist eine grafische Darstellung, die den Abbau von TCE in einer gasförmigen Phase bei kontinuierlicher Belüftung des den Stamm JMC1 enthaltenen Bodens zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Zunächst werden die mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms JM1 (FERM BP-5352), von welchem der erfindungsgemäße mutierte Stamm abgeleitet ist, im Folgenden aufgelistet.
Gram-Färbung und Morphologie: Gram-negativ, Stäbchen Wachstum in verschiedenen Kulturmedien:
BHIA: gut
MacConkey: möglich
Koloniefarbe: Cremefarben
Optimale Temperatur: 25°C > 30°C > 35°C
Beweglichkeit: negativ (in einem halbfesten Kulturmedium)
TSI (Schräge/Stich): alkalisch/alkalisch, H₂S (–)
Oxydase: positiv (schwach)
Katalase: positiv
Zuckervergärung:
Glukose: negativ
Saccharose: negativ
Raffinose: negativ
Galactose: negativ
Maltose: negativ
Urease: positiv
Äskulinhydrolyse (β-Glucosidase): positiv
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: negativ
Glucoseansäuerung: negativ
Arginindihydrolase: negativ
Gelatinhydrolyse (Protease): negativ
β-Galactosidase: negativ
Assimilierung von Verbindungen
Glucose: negativ
L-Arabinose: negativ
D-annose: negativ
D-Mannitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: negativ
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: negativ
Der Stamm JM1 (FERM BP-5352) kann aromatische Verbindungen assimilieren und chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen abbauen. Die Oxygenase nimmt am Abbauvorgang teil. Er kann vollständig TCE und andere chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen in einer Konzentration von etwa 20 ppm bei 15°C abbauen, einer Temperatur nahe der Bodentemperatur in der natürlichen Umwelt.
Der erfindungsgemäße, mutierte Stamm hat die gleiche mikrobiologischen Eigenschaften wie der Ausgangsstamm JM1 und hat zusätzlich ein Potential des Wachstums und des biologischen Abbaus von TCE bei einer Temperatur von nur 4°C, wo der Ausgangsstamm JM1 (FERM BP-5352) praktisch dazu nicht in der Lage ist. Dieses Potential wird stabil nach einer Anzahl von Kulturpassagen erhalten, so dass die Erfinder der vorliegenden Erfindung ihn als einen neu etablierten mikrobiellen Stamm eingeordnet, als JMC1 benannt und ihn im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, eines der internationalen Hinterlegungsinstitute in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages, am 13. Juli 1996 (Hinterlegungsnummer FERM BP-5960) hinterlegt hat. Der erfindungsgemäße Stamm JMC1 (FERM BP-5960) ist vollständig unterschiedlich von dem vorher beschriebenen PR1₃₀₁, da die Beschreibung von PR1₃₀₁ in Environmental Science & Technology Band 30, Nr. 6, 1986, Seiten 2045-2052 sich nicht auf die mikrobiologischen Eigenschaften von PR1₃₀₁ bezieht, wird dort angegeben, dass PR1₃₀₁ eine spontane Reveratante von Burkholderia cepacia G4301 ist, abgeleitet von Burkholderia (Pseudomonas) cepacia G4 durch Mutagenese mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoquanidin (NTG) . Daher wird angenommen, dass R1₃₀₁ die gleichen mikrobiologischen Eigenschaften wie der Ausgangsstamm G4 hat. Gemäß WO 90/06901 hat G4 die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:
Gramfärbung und Morphology: Gram-negativ, Stäbchen
Urease: negativ
Äskulinhydrolyse (β-Glucosidase): negativ
Nitratreduktion: positiv
Indolproduktion: negativ
Glucoseansäuerung: negativ
Arginindihydrolase: negativ
Gelatinhydrolyse (Protease): negativ
β-Galactosidase: negativ
Assimilierung von Verbindungen
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumglukonat: positiv
n-Caprinsäure: positiv
Adipinsäure: negativ
dl-Äpfelsäure: positiv
Natriumcitrat: positiv und negativ
Phenylacetat: positiv
Die vorher aufgelisteten mikrobiologischen Eigenschaften des G4-Stamm sind klar unterschiedlich zu denen des Stamms MC1 und daher ist R1301 ein vom Stamm JMC1 unterschiedlicher mikrobieller Stamm.
Der Stamm JMC1 kann aromatische Verbindungen einschließlich Phenol und Cresol als auch chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen abbauen und ist folglich gegen diese Verbindungen resistent. Diese Verbindungen sind schädlich für viele Mikroorganismen und viele von ihnen werden herkömmlicherweise als Mikrobizide verwendet und sind oftmals in Abfallflüssigkeiten in einer beträchtlichen Konzentration enthalten. Falls eine derartige Verbindung vorhanden wäre, würde der Stamm JMC1 überleben und seine Abbauaktivität würde nicht gehemmt werden, so dass chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen wirkungsvoll abgebaut werden.
Der Stamm JMC1 ist sehr vorteilhaft darin, dass er nicht die Verwendung eines Induktors, wie etwa Phenol, für den Abbau im Grundwasser und Boden enthaltener chlorierter aliphatischer Kohlenwasserstoffe benötigt. Nur herkömmliche Nährstoffe müssen zu den Zellen zugegeben werden, um ihr Wachstum und den biologischen Abbau zu fördern, so dass der Abbauvorgang unter Verwendung dieses Stamms einfach ist und frei vom Einbringen von toxischen und gefährlichen Induktoren in die Umwelt. Bei einem Mikroorganismus dessen Oxygenase durch einen Induktor wie etwa Phenol induziert wird, werden sowohl die chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen als auch der Induktor durch den Mikroorganismus abgebaut, in einer Reduktion der Wirksamkeit im Abbau der chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen durch kompetitive Hemmung resultiert. Andererseits exprimiert der Stamm JMC1 konstitutiv eine Oxygenase, die ein Enzym bis zum Abbau von chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen ist, was ihn von der kompetitiven Hemmung befreit und einenwirkungsvollen und wirksamen Abbau von chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen ermöglicht.
Nahrungsquellen, die für das Wachstum des erfindungsgemäßen Stammes JMC1 verwendet werden können, enthalten viele herkömmliche Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen oder anorganische Salzquellen, welche herkömmlich für die mikrobielle Kultur verwendet werden können, wenn sie durch diesen Stamm assimilierbar sind. Ein derartiges Kulturmedium ist Bouillonmedium, M9-Medium, 2 × YT-Medium und L-Brühe ergänzt mit einigen Polypeptonen und/oder Hefeextrakt, kann geeigneterweise für den Zweck der Erfindung verwendet werden.
Die Zusammensetzung des M9-Mediums wird im Folgenden gezeigt.
NaHP₂O₄: 6,2 g
KHP₂O₄: 3,0 g
NaCl: 0,5 g
NH₄Cl: 1,0 g
(pro Liter, pH 7,0)
Nährstoffe, die zu einem M9-Kulturmedium für den Zweck der Erfindung zugegeben werden können, enthalten organische Säuren, wie etwa Äpfelsäure, Zitronensäure, Brenztraubensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure und Fumarsäure und Salze davon; Zucker wie etwa Lactose, Rhamnose und Inositol; und Aminosäuren, wie etwa Glycin, Valin und Histidin.
Als anorganische Salze werden bevorzugt die hauptsächlichen essentiellen Elemente für lebende Organismen, wie etwa Kohlenstoff (C), Wasserstoff (H), Stickstoff (N), Phosphor (P), Kalium (K), Kalzium (Ca), Magnesium (Mg) und Schwefel (S) zu dem Kulturmedium zugegeben in einer Größenordnung von 10^–2 des Trockengewichts der Mikroorganismen, während unbedeutendere essentiellerer Elemente, wie etwa Eisen (Fe), Mangan (Mn), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Chlor (Cr), Bor (B) und Molybdän (Mo) in einer Größenordnung von 10^–5 des Trockengewichts der Mikroorganismen zugegeben werden.
Die Kultur kann in einer aeroben Umwelt kultiviert werden, und kann eine flüssige oder feste Kultur sein. Ein weiterer Bereich der Kulturtemperatur zwischen 4°C und 30°C kann für den Zweck der Erfindung verwendet werden, obwohl bevorzugt ein Temperaturbereich zwischen 4°C und 25°C und bevorzugter ein Temperaturbereich zwischen 4°C und 15°C verwendet wird.
Der biologische Abbau von aromatischen Verbindungen und/oder chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen kann durch in Kontakt bringen der aromatischen Verbindungen und/oder der chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen, enthalten in einem wässrigen Medium, Boden oder in einer Gasphase, mit dem erfindungsgemäßen Stamm JMC1 erfolgen. Jedes Verfahren zum in Kontakt bringen der Mikroorganismen mit den organischen Verbindungen kann verwendet werden, vorausgesetzt der Organismus kann seine Abbauaktivitäten ausbilden, wobei ein absatzweises Verfahren, ein halbkontinuierliches Verfahren oder ein kontinuierliches Verfahren anwendbar ist. Die Mikroorganismen können in einem halbimmobilisierten Zustand oder auf einem geeigneten Träger verwendet werden. Die zu behandelnden Objekte, wie etwa Abfallflüssigkeit, Boden oder Luft können, wenn notwendig, einer Vorbehandlung unterworfen werden.
Die in einem wässrigen Medium als Verunreinigungen enthaltenen aromatischen Verbindungen und/oder die chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen, können durch in Kontakt bringen der aromatischen Verbindungen und/oder der chlorierten aliphatischen Verbindungen mit den Zellen des Stamms JMC1 biologisch abgebaut werden. Für den Erfindungszweck kann der Stamm JMC1 alleine oder in Kombination mit einem weiteren Stamm verwendet werden. Während mögliche Arten zur Durchführung der vorliegenden Erfindung im Folgenden beschrieben werden, sollte festgestellt werden, dass die vorliegende Erfindung auf keine Weise darauf begrenzt ist.
In der einfachsten Weise der Durchführung der Erfindung werden Zellen vom Stamm JMC1 direkt in ein wässriges Medium eingebracht, das durch aromatische Verbindungen und/oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen verunreinigt ist. Obwohl es bevorzugt ist den pH, die Salzkonzentration, die Temperatur und die Konzentration der Schadstoffe in dem wässrigen Medium einzustellen, kann der Stamm JMC1 seine Abbauaktivität aufrecht erhalten, es sei denn die Umwelt ist extrem sauer oder alkalisch oder hat eine hohe Salzkonzentration. Zusätzlich kann der Stamm bei einer Temperatur von nur 4°C proliferieren und seine biologische Abbauaktivität behalten, was bedeutend niedriger als die normale Laborkulturtemperatur ist.
Bei einer weiteren Art der Durchführung der Erfindung, werden Zellen des Stamms JMC1 in einem Kulturtank kultiviert, in dem ein wässriges Medium verunreinigt mit aromatischen Verbindungen und/oder chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen in einer festgesetzten Rate für den biologischen Abbau eingespeist wird. Das verunreinigte wässrige Medium kann kontinuierlich eingespeist und abgeleitet werden, es kann alternativ intermittierend oder in einem absatzweisen Modus in Abhängigkeit von der Verarbeitungskapazität des Kulturtanks behandelt werden. Es ist hier wichtig, das Behandlungssystem in Abhängigkeit von der Konzentration der Verunreinigungen zu optimieren.
Bei einer noch breiteren Art der Durchführung der Erfindung werden Zellen des Stamms JMC1 an einen Träger angehaftet, zum Beispiel Bodenpartikel, gefolgt durch Einfüllen des Trägers in ein Reaktionsgefäß, in welches ein mit organischen Verbindungen verunreinigtes wässriges Medium zur Abbaubehandlung eingeleitet wird. Für diesen Zweck kann jeder Träger als ein Träger verwendet werden, wie auch die Bodenpartikel, aber diejenigen mit einer hohen Haltekapazität für Mikroorganismen und welche nicht hinderlich für die Belüftung sind, sind mehr bevorzugt. Zum Beispiel können die herkömmlich in der lebensmittelverarbeitenden Industrie und in Abwasserbehandlungssystemen verwendeten, um Mikroorganismen mit einem Lebensraum in Bioreaktoren der pharmazeutischen Industrie zu versehen, verwendet werden. Spezifische Mikroorganismenträger enthalten anorganische partikelförmige Träger, wie etwa poröses Glas, Keramik, Metalloxide, Aktivkohle, Kaolinit, Bentonit, Zeolit, Sepiolit, Silicagel, Aluminiumoxid und Anthrazit, gelartige Träger, wie etwa Stärke, Agar, Chitin, Chitosan, Polyvinylalkohol, Algininsäure, Polyacrylamid, Carrageenan, Agarose und Gelatine, Ionenausstauscherzellulose, Ionenausstauscherharz, Zellulosederivate, Glutaraldehyd, Polyacrylsäure, Polyurethan und Polyester. Zusätzlich können natürliche Zellulosematerialien, wie etwa Baumwolle, Jute und Papier, und Ligninmaterialien, wie etwa Sägespäne und Borke ebenfalls für den Zweck der Erfindung verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Abbaubehandlung der aromatischen Verbindungen und/oder chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen im Boden durch den Kontakt der aromatischen Verbindungen und/oder chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen im Boden mit dem Stamm JMC1 durchgeführt. Typische Anwendungsarten werden hiernach beschrieben, diese Stämme können zur Reinigung aromatischer Verbindungen und/oder chlorierter aliphatischer Kohlenwasserstoffverbindungen in jedem Boden verwendet werden, ohne darauf beschränkt zu sein.
Ein vergleichsweise einfaches und bevorzugtes Verfahren umfasst das direkte Anbringen des Stamms JMC1 in den mit aromatischen Verbindungen und/oder chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen verschmutzen Boden. Zellen von JMC1 können auf die Oberfläche des Bodens gesprüht werden, oder durch ein in den Boden gegrabenes Loch eingebracht werden, wenn eine relativ tiefe Untergrundschicht behandelt werden muss. Die Zellen von JMC1 können wirkungsvoll verteilt werden, wenn sie durch unter Druck gesetzte Luft oder Wasser angetrieben werden. Während verschiedene Parameter in dem Boden gesteuert werden müssen, kann der Stamm JMC1 vorteilhafterweise in Boden verwendet werden, da der Stamm JMC1 schneller in der Anwesenheit eines Trägermaterials wie den Bodenpartikeln proliferieren kann. Zusätzlich proliferiert und erhält der Stamm seine biologische Abbauaktivität bei einer Temperatur von nur 4°C, welche bemerkenswert niedriger als die normale Bodentemperatur von 15°C ist.
Bei einer anderen Art der Durchführung der Erfindung wird ein Reaktionsgefäß mit einem Trägermaterial gefüllt, an welches JMC1-Zellen angeheftet werden, und dann in den Boden gebracht, üblicherweise in den Grundwasserleiter, verunreinigt durch aromatische Verbindungen und/oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung für den biologischen Abbau. Das Reaktionsgefäß hat bevorzugt eine Konfiguration als ein Zaun oder ein Filmblatt, so dass es einen weiteren Bereich im Boden abdecken kann. Für den Erfindungszweck kann jedes Trägermaterial verwendet werden, so lange es wirksam zum Tragen von Mikroorganismen ist und nicht die Belüftung hemmt. Für den Zweck der Erfindung verwendbare Mikroorganismenträger, enthalten die herkömmlicherweise verwendeten, um Mikroorganismen einen Lebensraum in Bioreaktoren in der pharmazeutischen Industrie, in der lebensmittelverarbeitenden Industrie und in Abwasserbehandlungssystemen zur Verfügung zu stellen. Spezifische Trägermaterialien enthalten anorganische, partikuläre Träger, wie etwa poröses Glas, Keramik, Metalloxide, Aktivkohle, Kaolit, Bentonit, Zeolit, Sepiolit, Silicagel, Aluminiumoxid und Anthrazit, gelartige Träger, wie etwa Stärke, Agar, Chitin, Chitosan, Polyvinylalkohl, Algeninsäure, Polyacrylamid, Carrageenan, Agarose und Gelatine, Ionenausstauscherzellulose, Ionenausstauscherharz, Zellulosederivate, Glutaraldehyd, Polyacrylsäure, Polyurethan und Polyester. Zusätzlich können natürliche Zellulosematerialien, wie etwa Baumwolle, Jute und Papier, und Ligninmaterialien, wie etwa Sägespäne und Borke ebenfalls für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können in einer gasförmigen Phase als Verunreinigungen enthaltene aromatische Verbindungen und/oder chlorierte aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen, durch in Kontakt bringen der aromatischen Verbindungen und/oder der chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffverbindungen mit den Zellen des Stamms JMC1 biologisch abgebaut werden. Mögliche Arten der Durchführung der Erfindung werden im Folgenden beschrieben, sind aber nicht darauf beschränkt.
Zum Beispiel werden in einer bevorzugten Durchführungsart der Erfindungen Zellen des Stamms JMC1 in einem Kulturtank kultiviert, in dem ein durch aromatische Verbindungen und/oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen verunreinigtes Gas in einer bestimmten Rate für den biologischen Abbau eingespeist werden. Obwohl verunreinigtes Gas durch jede Einrichtung Mittel eingespeist werden kann, wird die Flüssigkultur bevorzugt durch das eingeleitete Gas bewegt, um die Belüftung des Systems zu fördern. Das verunreinigte Gas kann kontinuierlich eingespeist und abgeleitet werden, intermittierend oder in einer absatzweisen Art, in Abhängigkeit von der Verarbeitungskapazität des Kulturtanks. Es ist hier wichtig, das Behandlungssystem in Abhängigkeit von der Konzentration der Verunreinigungen zu optimieren.
Bei einer anderen Durchführungsart der Erfindungen werden Zellen des Stamms JMC1 an einen Träger angeheftet, zum Beispiel Bodenpartikel, gefolgt vom Einfüllen des Trägers in ein Reaktionsgefäß, in welches ein gasförmiges Medium, verunreinigt mit organischen Verbindung, für die Abbaubehandlung eingeleitet wird. Zu diesem Zweck kann jeder Träger als ein Träger verwendet werden, als auch die Bodenpartikel, aber diejenigen mit einer hohen Haltekapazität für Mikroorganismen und die nicht hinderlich für die Belüftung sind, sind bevorzugter. Zum Beispiel jene, welche herkömmlicherweise verwendet werden, um Mikroorganismen mit einem Lebensraum in Bioreaktoren in der pharmazeutischen Industrie, in der lebensmittelverarbeitenden Industrie und in Abwasserbehandlungssystemen versehen, können verwendet werden.
Spezifische Trägermaterialien enthalten anorganische partikuläre Träger, wie etwa poröses Glas, Keramik, Metalloxide, Aktivkohle, Kaolit, Bentonit, Zeolit, Sepiolit, Silicagel, Aluminiumoxid und Anthrazit, gelförmige Träger, wie etwa Stärke, Agar, Chitin, Chitosan, Polyvinylalkohol, Algininsäure, Polyacrylamid, Carrageenan, Agarose und Gelatine, Ionenausstauscherzellulose, Ionenausstauscherharz, Zellulosederivate, Glutaraldehyd, Polyacrylsäure, Polyurethan und Polyester. Zusätzlich können natürliche Zellulosematerialien, wie etwa Baumwolle, Jute und Papier, und Ligninmaterialien, wie etwa Sägespäne und Borke, ebenfalls zu dem Zweck der Erfindung verwendet werden.
Materialien, die verwendet werden können um die Mikroorganismen zu dem Zweck der Erfindung zu erhalten und zu füttern, enthalten Komposte und viele andere in der Landwirtschaft und der Fischzucht beliebte ähnliche Produkte, wie etwa Kornstroh, Sägespäne, Reiskleie, getrocknete Drusen von Bohnengallerte, Zuckerrohrrückstände und andere getrocknete Pflanzenprodukte, als auch Fischereiabfälle einschließlich Krabbenschalen und Shrimpsschalen.
Um verunreinigtes Gas zum Zweck der Erfindung zu behandeln, können in einen mit einem Trägermaterial gefüllten Tank eingeführte Zellen vorher kultiviert werden, oder sie können allein vorher kultiviert werden. Die Nährstoffzufuhrrate, der Wassergehalt, die Sauerstoffkonzentration und andere Faktoren sollten in den entsprechenden bevorzugten Bereichen für einen wirksamen biologischen Abbau gehalten werden. Das Verhältnis zwischen dem Volumen des Trägers und dem Wassergehalt in dem Reaktionsgefäß kann unter Berücksichtigung des mikrobiellen Wachstums und der Belüftungswirksamkeit ausgewählt werden, und die Form des Reaktionsgefäßes kann angemessen eingestellt werden, in Abhängigkeit vom Volumen und der Schadstoffkonzentration der zu behandelnden Luft. Vorsicht sollte walten, um den Kontakt zwischen dem Gas und den vom dem Träger gehaltenen Zellen sicherzustellen. Zum Beispiel kann er die Form einer Säule, einer Röhre, eines Tanks oder einer Kiste haben. Das Reaktionsgefäß kann mit einer Abgasleitung und einem Filter, eingesetzt in einer genormten Einheit, kombiniert werden, oder eine Anzahl von Reaktionsgefäßen kann in Serie angeordnet werden, um eine erwünschte Behandlungskapazität zu verwirklichen.
Das in ein Reaktionsgefäß gespeiste, verunreinigte Gas kann zunächst an den Träger anhaften, und es kann seltene Fälle geben, wo der Effekt der Nutzung des Mikroorganismus nicht deutlich beobachtet werden kann, insbesondere in den anfänglichen Stadien der Bearbeitung, die Verunreinigungen auf dem Träger werden nach einer bestimmten Zeitspanne abgebaut, und neuer Schadstoff wird auf der Oberfläche des Trägers absorbiert, von dem der erste Schadstoff durch Abbau entfernt wurde, so dass die Kapazität des Reaktionsgefäßes nicht gesättigt, und das biologische Abbauverfahren auf einem konstanten Niveau gehalten werden kann.
Jedes normalerweise für die Kultivierung von Mikroorganismen wie vorher beschrieben verwendete Kulturmedium kann geeigneterweise für den Stamm JMC1 in einem Behandlungsverfahren unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Spezifischer sind Kulturmedien wirkungsvoll, wie etwa Bouillonmedium, M9-Medium, 2 × YT-Medium, L-Medium oder ein Medium, welche Polypepton, Hefeextrakt und Kohlenstoffquellen, wie etwa Zucker und organische Säuren in einem angemessenen Verhältnis enthält. Diese Medien sind in einer flüssigen Form oder in einer gelartigen Form wirkungsvoll, erzeugt durch Zugabe von Agarose zu der flüssigen Form.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann in einem geschlossenen oder offenem System zur Behandlung von Abwasser, Boden und/oder Luft verwendet werden. Es kann mit Verfahren zur Verankerung von Mikroorganismen an einen Träger und/oder Förderung des Wachstums der Mikroorganismen kombiniert werden.
Nun wird die vorliegende Erfindung mit mehr Einzelheiten mit Hilfe von Beispielen beschrieben, obwohl diese Beispiele auf keine Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzen.
Beispiel 1: Isolation des Stamms JMC1 und Oxygenasanalyse
Auf einem Agarmedium gewachsene Zellen des Stamms JM1 werden in 100 ml M9-Medium mit 1% Natriummalat in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultivierung bei 22°C für 23 Stunden unterzogen. Zu diesem Zeitpunkt erreichte die Zelldichte des Stamms JM1 in dem Sakaguchi-Kolben 4 × 10⁸ Zellen/ml. Dann wurden drei 2 ml-Aliquots der Kultur entnommen und durch aufeinanderfolgende zehnfache Verdünnungen verdünnt, um Verdünnungen von 4 × 10³ Zellen/ml, 4 × 10² Zellen/ml bzw. 4 × 10 Zellen/ml zu erhalten. Danach wurden aus jeder Verdünnung zweifach 100 μl entnommen und auf M9-Agarplatten mit 1% Natriummalat ausplattiert. Insgesamt wurden 2 × 3 mit JM1 Zellen inokulierte Agarplatten, dann bei 4°C für 6 Tage inkubiert, gefolgt durch die Inkubation bei Raumtemperatur (22°C) für 3 Tage. Auf einer von zwei Agarplatten mit einer ausplattierten 10⁵fachen Verdünnung traten milchig-weiße Kolonien auf (hiernach als „Kolonie A" bezeichnet).
Als Kontrollen wurden zweifach 100 μl von jeder Verdünnung entnommen und auf M9-Agarplatten mit 1% Natriummalat ausplattiert. Diese 2 × 3 Platten mit ausplattierten JM1-Zellen wurden bei Raumtemperatur (22°C) für 3 Tage inkubiert, um zu finden, dass alle Agarplatten mit milchig-weißen Kolonien des Stamms JM1 bewachsen waren (hiernach als „Kolonie B" bezeichnet).
Dann wurden Zellen der Kolonie A und der Kolonie B separat in 100 ml M9-Medium mit 2% Natriummalat in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultivierung bei 4°C für 7 Tage unterzogen. Im Ergebnis wuchs die Zellzahl der Kolonie A von anfänglich 3 × 10⁶ Zellen/ml auf 1,5 × 10⁸/ml nach 7 Tagen. Auf der anderen Seite stieg die Zellzahl der Kolonie B von anfänglich 3 × 10⁶ Zellen/ml auf etwa 5,2 × 10⁷ Zellen/ml.
Inzwischen wurden Zellen der Kolonie A und der Kolonie B separat in 200 ml M9-Medium mit 0,2% Hefeextrakt in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 22°C für 24 Stunden unterzogen. Dann wurde jeder durch Zentrifugation gesammelte Zellhaufen durch eine French-Press aufgeschlossen, um einen Zellextrakt zu erhalten. Catechol-1-2-Oxygenase (C120) und Catechol-2-3-Oxygenase (C230) in dem Zellextrakt jeder Kolonie A und Kolonie B wurden durch Spektroskopie bestimmt (Microbiol., 6B, 463–478 (1997)). Die Proteinmenge wurde unter Verwendung eines Biorad-Proteinassaykits bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 C120 und C23-0 Aktivitäten (μmol/min/mg Proteine)
Mit dem Vorherigen wurde bestätigt, dass die Zellen der Kolonie A Oxygenase den Stamm JM1 exprimieren.
– Vergleich der Kolonie A und des Stamms JM1 –
(1) Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Zellen der Kolonie A, welche unterschiedlich vom Stamm JM1 sind, in ihren Wachstumseigenschaften bei 4°C mit den Zellen des Stamms JM1 zu vergleichen. Die Zellen der Kolonie A und die JM1-Zellen wurden separat in 100 ml M9-Medium (2% Natriummalat) in einen Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur unterzogen. Das Zellwachstum wurde in regelmäßigen Abständen durch Plattenzählung beider Kulturen überwacht. Die 4 zeigt die Ergebnisse.
Inzwischen wurden Zellen der Kolonie A und JM1-Zellen separat in 200 ml M9-Medium mit 2% Natriummalat in einem Sakaguchi Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 4°C für 7 Tage unterzogen. Dann wurde eine Mehrzahl von Glasfläschchen in zwei Gruppen aufgeteilt und jedes Glasfläschchen enthielt 5 ml von M9-Medium mit 20 ppm TCE und 1% Natriummalat als einer Kohlenstoffquelle. Zu jedem Glasfläschchen einer Gruppe wurden 0,1 ml der Kultur der Zellen der Kolonie A kultiviert wie vorher beschrieben bei 4°C für 7 Tage, inokuliert und 0,1 ml des Stamms JM1 zu jedem Glasfläschchen der anderen Gruppe. Danach wurde jedes Glasfläschchen hermetisch mit einem Butylgummistopfen und einer Aluminiumkappe versiegelt und unter Schütteln bei 4°C kultiviert. Dann wurde der TCE-Abbau durch Mikroorganismen in regelmäßigen Abständen durch Gaschromatographie des Kopfraums überwacht. Als eine Kontrolle wurde ein ähnliches System aufgebaut, welches TCE in der gleichen Konzentration aber keine Mikroorganismen enthielt, und das TCE wurde in regelmäßigen Abständen quantifiziert. Das Verhältnis des restlichen TCE zu dem Kontroll-TCE wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 4 gezeigt.
Wie aus der 4 ersichtlich, zeigten die Zellen der Kolonie A ein weit größeres Wachstumspotenzial und einen TCE-Abbau bei 4°C als der Stamm JM1.
Als nächstes wurde eine Kolonie der auf einem Agarmedium in 200 ml M9-Medium ergänzt mit 2% Natriummalat gewachsenen Kolonie A in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert und unter Schütteln bei 4°C für 7 Tage kultiviert. Die Kultivierung in einem Sakaguchi-Kolben wurde fünfmal wiederholt und die aus der fünften Kulturpassage erhaltenen Mikroorganismen wurden auf ihr Wachstumspotenzial und den TCE-Abbau bei 4°C in der gleichen Art und Weise wie vorher beschrieben untersucht. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die in der 4 für die Kolonie A gezeigten. Spezifischer, obwohl die Zellen der Kolonie A wie der Stamm JM1 konstitutiv Oxygenase exprimieren und die gleichen mikrobiologischen Charakteristiken wie der Stamm JM1 haben, ist der erstere sehr viel besser als der letztre im Wachstum und dem TCE-Abbau bei niedriger Temperatur (4°C) und das Potenzial wurde nicht durch Kulturpassagen reduziert. Folglich bestimmten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass die Zellen der Kolonie A von einem mutierten vom Stamm JM1 abgeleiteten Stamm sind, und nannten den neuen Stamm JMC1, welcher dann in dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (FERM BP-5960) hinterlegt wurde.
Beispiel 2: Abbau von TCE durch den Stamm JMC1 (Flüssigkultursystem bei 10°C)
Eine Kolonie des Stamms JMC1 auf Agarmedium, erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in 200 ml M9-Medium mit 2% Natriummalat in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 15°C für 70 Stunden unterzogen.
Währenddessen wurden 5 ml M9-Medium mit 20 ppm TCE und 1% Natriummalat als Kohlenstoffquelle in ein Glasgefäß getan, in das 0,1 ml der vorherigen Kultur inokuliert wurde. Das Glasgefäß wurde hermetisch mittels eines Butylgummistopfens und einer Aluminiumkappe versiegelt und einer Schüttelkultur bei 10°C unterzogen. Der TCE-Abbau über die Zeit durch den Mikroorganismus wurde in regelmäßigen Abständen durch ein Kopfraum-Gastomatografieverfahren überwacht. Als eine Kontrolle wurde ein ähnliches experimentelles System mit TCE in der gleichen Konzentration aber ohne JMC1-Zellen aufgebaut, und TCE in regelmäßigen Zeitabständen quantifiziert. Das Verhältnis vom restlichen TCE zu dem TCE der Kontrolle wurde bestimmt. Die Ergebnisse werden zusammengefasst in der 1 gezeigt. Wie aus der 1 ersichtlich, wurde nachgewiesen, dass der Stamm JMC1 TCE in einen Flüssigkultursystem bei 10°C abbauen kann.
Beispiel 3: Abbau von DCE durch den Stamm JMC1 (Flüssigkultursystem bei 15°C)
Dem Vorgehen des Beispiels 1 wurde gefolgt, außer dass die abzubauende Verbindung zu cis-1-2-Dichloroethylen (cis-1-2-DCE) (8 ppm) und trans-1-2-Dichloroethylen (trans-1-2-DCE) (8 ppm) geändert und die Temperatur auf 15°C angehoben wurde, um die Reduktion von DCE über die Zeit zu beobachten. Die 2 zeigt die Ergebnisse (wobei c-DCE und t-DCE sich auf cis-1-2-DCE bzw. trans-1-2-DCE beziehen). Wie aus der 2 ersichtlich, wurde nachgewiesen, dass der Stamm JMC1 DCE in einem Flüssigkultursystem bei 15°C abbauen kann.
Beispiel 4: Abbau von aromatischen Verbindungen durch den JMC1 (Flüssigkultursystem bei 15°C)
Dem Vorgehen des Beispiels 1 wurde gefolgt, außer dass die Kohlenstoffquelle des M9-Mediums zu 0,1% Hefeextrakt geändert und TCE durch Phenol, o-Cresol, m-Cresol, p-Cresol bzw. Toluol mit einer Konzentration von 10 ppm ersetzt wurde, um die Reduktion der aromatischen Verbindungen über die Zeit zu bestimmen. Für Phenol und Cresol wurde Flüssigchromatographie verwendet, während für Toluol Gaschromatographie verwendet wurde. Die 3 zeigt die Ergebnisse. Wie aus der 3 ersichtlich, wurde gezeigt, dass der Stamm JMC1 die vorherigen aromatischen Verbindungen in einem Flüssigkultursystem bei 15°C abbauen kann.
Beispiel 5: Abbau von TCE in Boden durch den Stamm JMC1 (gesiebter Sawarasand bei 10°C)
Mehrere 78 ml Glasgefäßen wurde vorbereitet und in jedes Glasgefäß wurden 3 ml M9-Medium mit 50 ppm TCE und 2% Natriumcitrat und 30 g Sawarasand (sterilisiert durch Autoklavieren bei 120°C für 10 Minuten) getan. Eine auf einem Agarmedium gewachsene Kolonie des Stamms JMC1 wurde in 200 ml M9-Medium mit 2% Natriummalat in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 4°C für 7 Tage unterzogen. Dann wurden 0,3 ml dieser Kultur in jedes der Glasgefäße inokuliert und die Glasgefäße hermetisch mittels eines Butylgummistopfens und einer Aluminiumkappe versiegelt und bei 10°C stehen gelassen. Dann wurde die TCE-Abbauleistung des Mikroorganismenstamms in regelmäßigen Zeitabständen durch Kopfraum-Gaschromatographie beobachtet. Als eine Kontrolle wurde ein ähnliches experimentelles System mit TCE in der gleichen Konzentration aber ohne JMC1-Zellen aufgebaut, um TCE in regelmäßigen Zeitabständen zu bestimmen. Das Verhältnis des restlichen TCE zu dem TCE der Kontrolle wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 5 gezeigt.
Beispiel 6: Abbau von TCE im Boden durch den Stamm JMC1 (gesiebter Sawarasand bei 4°C).
Dem Vorgehen des Beispiels 5 wurde gefolgt, außer dass die Bodentemperatur bei 4°C erhalten wurde, um den TCE-Abbau über die Zeit zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der 6 gezeigt. Wie aus der 6 ersichtlich wurde gezeigt, dass der Stamm JMC1 TCE im Boden bei 4°C abbauen kann.
Beispiel 7: Abbau von TCE im Boden durch Stamm JMC1 Kantolehm bei 8°C)
Dem Vorgehen des Beispiels 5 wurde gefolgt, außer dass der Boden von Sand zu Lehm geändert und die Temperatur bei 8°C gehalten wurde, um die TCE-Abnahme über die Zeit zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der 7 gezeigt. Wie aus der 7 ersichtlich, wurde gezeigt, dass der Stamm JMC1 TCE im Boden bei 8°C abbauen kann.
Beispiel 8: Abbau von DCE im Boden durch den Stamm JMC1 (brauner Waldboden bei 8°C)
Dem Vorgehen des Beispiels 6 wurde gefolgt, außer dass die folgenden vier Punkte geändert wurden, um die Abnahme der Zielverbindung über die Zeit zu bestimmen;

1. Abzubauende Chemikalie: cis-1-2-Dichlorethylen (cis-1-2-DCE), trans-1-2-Dichlorethylen (trans-1-2-DCE), oder 1,1-Dichlorethylen (1,1-DCE) anstelle von TCE,
2. Konzentration: 10 ppm anstelle von 50 ppm,
3. Nährstoff: Natriummalat anstelle von Natriumcitrat,
4. Abbautemperatur: 8°C anstelle von 5°C.
Die 8 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 9: Abbau von Phenol im Boden durch den Stamm JMC1 (brauner Waldboden bei 10°C)
Dem Vorgehen des Beispiels 8 wurde gefolgt, außer dass die abzubauende Verbindung 100 ppm Phenol war, deren Abnahme über die Zeit bestimmt wurde. Das Phenol wurde durch das JIS-Verfahren (JIS K 0102-1993, 28.1) unter Verwendung von Aminoantipyrin quantifiziert. Die Ergebnisse sind in der 9 gezeigt. Wie aus der 9 ersichtlich, wurde nachgewiesen, dass der Stamm JMC1 Phenol im Boden bei 10°C abbauen kann.
Beispiel 10: Abbau von TCE in einer gasförmigen Phase durch mit einer JMC1-Flüssigkultur
Wie in Beispiel 1 wurde eine Kultur des Stamms JMC1 gewachsen auf einem Agarmedium in 100 ml M9-Medium mit 2% Natriummalat in einem Sakaguchi-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 4°C für 7 Tage unterzogen. Dann wurden 0,1 ml der vorherigen Kultur zu einem Glasgefäß mit 30 ml M9-Medium ergänzt mit 0,5% Natriumcitrat zugegeben. Luft, welche eine gesättigte TCE-Lösung gelüftet hatte, strömte durch die Flüssigkeit in das Glasgefäß bei einer Rate von 60 ml/min für 30 Minuten, und dann wurde das Glasgefäß hermetisch mittels eines Butylgummistopfens und einer Aluminiumkappe versiegelt und einer Schüttelkultur bei 10°C unterzogen. Die TCE-Menge wurde über die Zeit durch einen Kopfraum-Gaschromatographieverfahren bestimmt. Als eine Kontrolle wurde ein ähnliches experimentelles System mit TCE in der gleichen Konzentration, aber ohne JMC1-Zellen aufgebaut und gleichzeitig das TCE quantifiziert. Das Verhältnis des restlichen TCE zu dem TCE der Kontrolle wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 10 gezeigt. Wie aus der 10 ersichtlich, wurde gezeigt, dass der Stamm JMC1 TCE in einer gasförmigen Phase bei 10°C abbauen kann.
Beispiel 11: Abbau von Toluol in einer gasförmigen Phase durch mit einer JMC1 Flüssigkultur.
Dem Vorgehen des Beispiels 10 wurde gefolgt, außer dass TCE durch Toluol ersetzt wurde, um den Toluolabbau über die Zeit zu bestimmen. Toluol wurde durch ein Kopfraum-Gaschromatographieverfahren über die Zeit quantifiziert. Die Ergebnisse sind zusammengefasst in der 11 gezeigt. Wie aus der 10 ersichtlich wurde gezeigt, dass der Stamm JMC1 Toluol in einer gasförmigen Phase bei 10°C abbauen kann.
Beispiel 12: Abbau von TCE in einer gasförmigen Phase durch von Boden mit dem Stamm JMC1.
Eine Kultur des Stamms JMC1 wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 10 hergestellt und 0,1 ml der Kultur wurden zu 30 ml M9-Medium mit 2% Natriummalat in einem Glasgefäß zugegeben, zu dem sterilisierter brauner Waldboden gegeben wurde, bis er die Oberfläche der Flüssigkeit erreichte. Das Glasgefäß wurde hermetisch mittels eines Butylgummistoppens versiegelt und über Nacht bei 13°C stehen gelassen und danach wurde überflüssige Flüssigkeit durch Dekantieren abgegossen. Dann wurde Luft, die eine gesättigte TCE-Lösung gelüftet hat, durch den Boden in dem Glasgefäß bei einer Rate von 65 ml/min für 30 Minuten durchströmen gelassen. Dann wurde das Glasgefäß hermetisch mittels eines Butylgummistopfens und einer Aluminiumkappe versiegelt und einer statischen Kultur bei 13°C unterzogen. Die TCE-Konzentration wurde quantitativ durch einen Kopfraum-Gaschromatographieverfahren über die Zeit bestimmt. Die 12 zeigt die Ergebnisse.
Beispiel 13: Abbau von DCE in einer gasförmigen Phase durch kontinuierliche Belüftung einer JMC1-Flüssigkultur
Eine Kultur des Stamms JMC1 wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 10 vorbereitet und 0,1 ml der Kultur wurden zu 30 ml M9-Medium mit 2% Natriummalat in einem Glasgefäß gegeben. Das Glasgefäß wurde hermetisch mittels eines Butylgummistopfens versiegelt. Danach wurde Luft, welche eine gesättigte TCE-Lösung belüftet hat, kontinuierlich in die Flüssigkultur in dem Glasgefäß in einer Rate von 0,5 ml/min unter statischen Kulturbedingungen bei 10°C eingeströmt. Das TCE in der Abgasluft wurde durch Gaschromatographie über die Zeit bestimmt.
Die 13 zeigt die Ergebnisse.
Beispiel 14: Abbau von DCE in einer gasförmigen Phase durch Belüftung von den Stamm JMC1 enthaltenden Boden
Eine Kultur des Stamms JMC1 wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 10 hergestellt, und 0,1 ml der Kultur wurden zu 30 ml M9-Medium mit 0,1% Hefeextrakt in einem Glasgefäß zugegeben, zu dem sterilisierter brauner Waldboden gegeben wurde, bis er die Oberfläche der Flüssigkeit erreichte. Das Glasgefäß wurde hermetisch mittels eines Butylgummistopfens versiegelt und über Nacht bei 13°C stehen gelassen und danach wurde überflüssige Flüssigkeit durch Dekantieren abgegossen. Nachdem das Glasgefäß hermetisch mittels eines Butylgummistopfens und einer Aluminiumkappe versiegelt wurde, wurde Luft, welche eine gesättigte TCE-Lösung belüftet hat, kontinuierlich durch den Boden in dem Glasgefäß in einer Rate von 0,5 ml/min unter statischen Kulturbedingungen bei 30°C geströmt. Das TCE in der Abluft wurde durch Gaschromatographie über die Zeit bestimmt. Die 14 zeigt die Ergebnisse.
Wie aus dem vorherigen Beispiel ersichtlich, kann der neuartige JMC1-Stamm wirkungsvoll aromatische Verbindungen und/oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindungen, enthalten in einem wässrigen Medium, Boden oder in einer gasförmigen Phase, bei einer Temperatur nicht höher als 15°C abbauen.

Claims

Neuartiger Mikroorganismenstamm JMC1 (FERM BP-5960), dadurch gekennzeichnet, dass er ein konstitutiv Oxygenase exprimierender, von JM1 (FERM BP-5352) abgeleiteter Mikroorganismus ist.
Verfahren des biologischen Abbaus einer aromatischen Verbindung oder eines chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffs durch Verwendungen eines neuartigen, konstitutiv Oxygenase exprimierenden Mikroorganismus JMC1 (FERM BP-5960), wobei der Stamm ein vom Stamm JM1 (FERM BP-5352) abgeleiteter, mutierter Stamm ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die aromatische Verbindung wenigstens eine aus der Gruppe bestehend aus Phenol, Toluol und Kresol ausgewählte Verbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung wenigstens eine aus Trichlorethylen und Dichlorethylen ausgewählte Verbindung ist.
Verfahren zur Umgebungssanierung, mit einem Schritt des biologischen Abbaus eines Schadstoffs in einer Umgebung durch Verwendung eines neuartigen Mikroorganismusstamms JMC1 (FERM BP-5960), der konstitutiv Oxygenase exprimiert, wobei der Stamm ein vom Stamm JM1 (FERM BP-5352) abgeleiteter, mutierter Stamm ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Umgebung ein den Schadstoff enthaltendes, wässriges Medium ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das wässrige Medium mit einer den Mikroorganismus tragenden Trägersubstanz in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das wässrige Medium in einen Behälter, der die den Mikroorganismus tragende Trägersubstanz enthält, durch ein Ende des Behälters eingebracht und es vom anderen Ende abgelassen wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Umgebung ein den Schadstoff enthaltender Boden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, mit den Schritten: Herstellen eines den Mikroorganismus enthaltenden, wässrigen Mediums; und Einbringen des wässrigen Mediums in den Boden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei ferner wenigsten entweder ein Nährstoff für den Mikroorganismus oder Sauerstoff in den Boden eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 10, mit den Schritten: Einrichten einer Einspritzvertiefung in dem Boden; und Einbringen des den Mikroorganismus enthaltenden, wässrigen Mediums in den Boden durch die Einspritzvertiefung unter Druck.
Verfahren nach Anspruch 9, mit den Schritten: Einbringen des Mikroorganismus in eine Flüssigkeit; und Einbringen des Bodens in die Flüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Umgebung ein den Schadstoff enthaltendes Gas ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Gas in eine den Mikroorganismus enthaltende Flüssigkeit eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Gas mit einer den Mikroorganismus tragenden Trägersubstanz in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Gas in einen Behälter, der die den Mikroorganismus tragende Trägersubstanz enthält, durch ein Ende des Behälters eingebracht und es vom anderen Ende abgelassen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17, wobei der Schadstoff in der Umgebung eine aromatische Verbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die aromatische Verbindung wenigstens eine aus der Gruppe bestehend aus Phenol, Toluol und Kresol ausgewählte Verbindung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17, wobei der Schadstoff in der Umgebung eine chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung wenigstens eine aus Trichlorethylen und Dichlorethylen ausgewählte Verbindung ist.