DE69129154T2

DE69129154T2 - Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften

Info

Publication number: DE69129154T2
Application number: DE69129154T
Authority: DE
Inventors: Steven Redwood City Ca 94061 Bass; Lisa J. San Mateo Ca 94401 Garrard; Roland Durham Nc 27707 Greene; Dennis J. Pacifica Ca 94044 Henner; Henry B. Hercules Ca 94547 Lowman; David J. San Francisco Ca 94122 Matthews; James A. Burlingame Ca 94010 Wells
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1990-12-03
Filing date: 1991-12-03
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: CA2095633A1; DE69129154D1; WO1992009690A3; CA2095633C; US20060115874A1; EP0564531A1; DK0564531T3; US5821047A; US5834598A; WO1992009690A2; ATE164395T1; US6040136A; GR3026468T3; US5750373A; CA2405246A1; US20080038717A1; US20100035236A1; ES2113940T3; EP0564531B1

Description

Diese Erfindung betrifft die Herstellung und systematische Auswahl neuer bindender Proteine mit veränderten Bindungseigenschaften für ein Target-Molekül. Konkret betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung fremder Polypeptide, welche die Bindungsaktivität natürlich vorkommender Bindungspartner nachahmen. In bevorzugten Ausüihrungsformen betrifft die Erfindung die Herstellung therapeutischer oder diagnostischer Verbindungen, welche Proteine oder Nicht- Peptidmoleküle nachahmen, z.B. Hormone, Arzneimittel und andere kleine Moleküle, insbesondere biologisch aktive Moleküle wie Wachstumshormon.
Bindungspartner sind Substanzen, die spezifisch aneinander binden, üblicherweise durch nicht-kovalente Wechselwirkungen. Beispiele von Bindungspartnern umfassen Ligand-Rezeptor-, Antikörper-Antigen-, Arzneimittel- Target- und Enzym-Substrat-Wechselwirkungen. Bindungspartner sind sowohl auf therapeutischen als auch diagnostischen Gebieten äußerst nützlich.
In der Vergangenheit sind Bindungspartner durch eine Vielfalt von Methoden hergestellt worden, einschließlich deren Gewinnung aus der Natur (z.B. Antikörper- Antigen- und Ligand-Rezeptor-Paarungen) und der zufälligen Identifizierung (z.B. traditionelle Arzneimittelentwicklung unter Anwendung ungezielten Screenings von Kandidatenmolekiilen). In einigen Fällen wurden diese beiden Vorgehensweisen kombiniert. Beispielsweise wurden Varianten von Proteinen oder Polypeptiden, z.B. Polypeptidfragmente, hergestellt, welche funktionelle Schlüsselreste enthalten, die an der Bindung teilnehmen. Diese Polypeptidfragmente wurden wiederum nach Verfahren derivatisiert, die der traditionellen Arzneimittelentwicklung ähnlich sind. Ein Beispiel einer solchen Derivatisierung würde Strategien umfassen wie z.B. Zyklisierung zur Konformationsbeschränkung eines Polypeptidfragments, um einen neuen Kandidaten-Bindungspartner zu erzeugen.
Das Problem bei Verfahren des Standes der Techik liegt darin, daß natürlich vorkommende Liganden nicht die richtigen Eigenschaften für alle therapeutische Anwendungen haben könnten. Ferner könnten für einige Target-Substanzen Polypeptidliganden nicht einmal verfügbar sein. Darüber hinaus sind Verfahren zur Herstellung von nicht in der Natur vorkommenden synthetischen Bindungspartnern oft kostenaufwendig und schwierig und erfordern gewöhnlich komplexe synthetische Verfahren, um jeden Kandidaten herzustellen. Die fehlende Möglichkeit zur Charakterisiewng der Struktur des resultierenden Kandidaten&sub1; so daß rationelle Verfahren zum Arzneimitteldesign für eine weitere Optimierung von Kandidatenmolekülen angewandt werden könnten, beschränkt diese Verfahren weiter.
In einem Versuch zur Bewältigung dieser Probleme hat Geysen (Geysen, Immun. Today.6:364-369 [1985] und Geysen et al., Mol. Immun., 23:709-715 [1986]) den Einsatz der Polypeptidsynthese vorgeschlagen, um eine Grundlage zur systematischen iterativen Identifizierung und Herstellung von Bindungspartnern zu liefern. Gemäß Geysen et al., ebendort, werden zuerst kurze Polypeptide, z.B. Dipeptide, auf die Fähigkeit zur Bindung an ein Target-Molekül gescreent. Die aktivsten Dipeptide werden dann für einen weiteren Testdurchgang ausgewählt, der die Verknüpfung des Ausgangsdipeptids mit einem weiteren Rest (oder die interne Modifizierung der Komponenten des ursprünglichen Ausgangspeptids) und anschließendes Screening dieses Kandidatensets auf die gewünschte Aktivität umfaßt. Dieser Prozeß wird wiederholt, bis der Bindungspartner mit den gewünschten Eigenschaften identifiziert ist.
Das Verfahren von Geysen et al. leidet unter dem Nachteil, daß die Chemie, auf der es basiert, Peptidsynthese, Moleküle mit schlecht definierter oder variabler Sekundär- und Tertiärstruktur produziert. Mit fortschreitenden Durchgängen des iterativen Selektionsverfahrens nehmen ungezielte Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Substituentengruppen des Polypeptids zu, so daß eine echte statistische Population von interaktiven Molekülen mit einer reproduzierbaren Struktur höherer Ordnung zunehmend weniger erhältlich ist. Beispielsweise treten Wechselwirkungen zwischen zwei Seitenketten von Aminosäuren, die in der Sequenz weit voneinander entfernt, aber räumlich benachbart sind, ungehindert auf. Ferner ergeben Sequenzen, die keine konformationsstabilen Sekundärstrukturen fördern, komplexe Peptidseitenketten-Wechselwirkungen, die Seitenketten- Wechselwirkungen einer gegebenen Aminosäure mit dem Target-Molekül verhindern könnten. Solche komplexen Wechselwirkungen werden durch die Flexibilität des Polyamidgerüsts der Polypeptid-Kandidaten erleichtert. Ferner können Kandidaten in zahlreichen Konformationen vorliegen, was es schwierig macht, diejenige Konformation zu identifizieren, welche mit höchster Affinität oder Spezifität mit dem Target wechselwirkt oder daran bindet&sub1; was ein rationelles Arzneimitteldesign kompliziert.
Ein letztes Problem des iterativen Polypeptid-Verfahrens von Geysen besteht darin, daß es gegenwärtig keine praktischen Verfahren gibt, mit denen eine große Vielfalt verschiedener Peptide hergestellt, gescreent und analysiert werden kann. Bei Verwendung der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren beträgt die Gesamtzahl aller Kombinationen von Hexapeptiden, die synthetisiert werden müssen, 64.000.000. Selbst nach der Herstellung einer solchen Vielfalt von Peptiden stehen keine Verfahren zur Verfügung, mit denen Mischungen einer solchen Vielfalt von Peptiden schnell gescreent werden können, um diejenigen Peptide mit hoher Affinität für das Target-Molekül auszuwählen. Gegenwärtig muß jedes "haftende" Peptid in Mengen gewonnen werden, die groß genug sind, um eine Proteinsequenzierung durchzuführen.
Zur Bewältigung vieler Probleme, die mit der Vorgehensweise von Geysen verbunden sind, wurde biologische(s) Selektion und Screening als Alternative gewählt. Biologische Selektionen und Screenings sind wirkungsvolle Werkzeuge zur Untersuchung der Proteinfunktion und zur Isolierung von Variantenproteinen mit wünschenswerten Eigenschaften (Shortle, Protein Engineenng. Oxender und Fox, Hrsg., A.R. Liss, Inc., NY, S. 103-108 [1988] und Bowie et aL, Science 247:1306- 1310 [1990]). Eine gegebene Selektion oder ein gegebenes Screening ist jedoch nur für ein Protein oder eine kleine Anzahl verwandter Proteine anwendbar.
Kürzlich zeigten Smith und Mitarbeiter (Smith, Science 228:1315-1317 [1985]) und Parmley und Smith, Gene, 73:305-18 (1985], daß kleine Proteinfragmente (10-50 Aminosäuren) effizient auf der Oberfläche von filamentösen Phagen "präsentiert" werden können, indem kurze Genfragmente in das Gen III des fd-Phagen ("Fusionsphagen") inseriert werden. Das kleine Hüllprotein des Gens III (mit etwa 5 Kopien an einem Ende des Virions vorhanden) ist für den korrekten Phagenzusammenbau und für die Infektion durch Anhaftung an die Pili von E. coli wichtig (siehe Rasched et aL, Microbiol. Rev. 50:401-427 [1986]). Vor kurzem wurde gezeigt, daß "Fusionsphagen" geeignet sind zur Präsentation kurzer mutierter Peptidsequenzen, um Peptide zu identifizieren, die mit Antikörpern (Scoft et al., Science 249:386-390, [1990]) und Cwirla et aL, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 87: 6378- 6382, [1990]) oder einem fremden Protein (Deviln et aL, Science, 249:404-406 [1990]) reagieren können.
Es gibt jedoch mehrere wichtige Einschränkungen beim Einsatz solcher "Fusionsphagen" zur Identifizierung veränderter Peptide oder Proteine mit neuen oder verstärkten Bindungseigenschaften. Zunächst wurde gezeigt (Parmley et al., Gene. 73: 305-318, [1988]), daß Fusionsphagen nur zur Präsentation von Proteinen mit weniger als 100 und vorzugsweise weniger als 50 Aminosäureresten geeignet sind, da große Inserts mutmaßlich die Funktion des Gens III und damit den Phagenzusammenbau und die Infektivität beinträchtigen. Zweitens waren die Verfahren im Stand der Technik nicht in der Lage, Peptide mit der höchsten Bindungsaffinität für ein Target-Molekül aus einer Bank zu selektionieren. Beispielsweise konnten Cwirla und Mitarbeiter nach erschöpfender Durchmusterung einer statistischen Peptidbank mit einem monoklonalen Anti-β-Endorphin-Antikörper Peptide mit mäßiger Affinität (Kd 10 uM) nicht von Peptiden mit höherer Affinität (Kd 0,4 uM) trennen, die mit Phagen fusioniert waren. Darüber hinaus wurde die β- Endorphin-Stammpeptidsequenz, die eine sehr hohe Affinität (Kd 7 nM) aufweist, nicht aus der Epitop-Bank selektioniert.
Ladner, WO 90/02809, offenbart ein Verfahren zur Auswahl neuer bindender Proteine, die auf der äußeren Oberfläche von Zellen und Viruspartikeln präsentiert werden, wobei davon ausgegangen wird, daß die heterologen Proteine bis zu 164 Aminosäurereste haben können. Das Verfahren betrifft die Isolierung und Amplifizierung der präsentierten Proteine, um eine neue Familie bindender Proteine zu konstruieren, welche die gewünschte Affinität für ein Target-Molekül aufweisen. Konkreter offenbart Ladner einen "Fusionsphagen", der Proteine präsentiert, bei denen "ursprüngliche Proteinbindungsdomänen" von 46 Resten (Crambin) bis 164 Resten (T4-Lysozym) mit dem M13 Gen-III-Hüllprotein fusioniert sind. Ladner lehrt die Verwendung von Proteinen, die "nicht größer als erforderlich sind", da es leichter ist, Restriktionsstellen in kleineren Aminosauresequenzen zu arrangieren, und bevorzugt den Trypsininhibitor aus Rinderpankreas (BPTI) mit 58 Aminosäureresten. kleine Fusionsproteine wie BPTI sind bevorzugt, wenn das Target ein Protein oder
Makromolekül ist, während größere Fusionsproteine wie T4-Lysozym für kleine Target-Moleküle, z.B. Steroide, bevorzugt sind, da solche großen Proteine Spalten und Vertiefungen aufweisen, in die kleine Moleküle passen können. Es wird vorgeschlagen, das bevorzugte Protein, BPTI, mit Gen III an der von Smith et aL oder de la Cruz et al., J. Biol. Chem., 263: 4318-4322 [1988] offenbarten Stelle oder mit einem der Termini zu fusionieren, zusammen mit einer zweiten synthetischen Kopie des Gens III, so daß "etwas" unverändertes Gen III-Protein vorhanden sein wird. Ladner befaßt sich nicht mit dem Problem der erfolgreichen Selektionierung von hochaffinen Peptiden aus der statistischen Peptidbank, mit dem die biologischen Selektions- und Screeningverfahren des Standes der Technik kämpfen.
Humanwachstumshormon (hGH) ist an einem Großteil der Regulierung des normalen menschlichen Wachstums und der Entwicklung beteiligt. Dieses 22.000 Dalton-Hypophysenhormon zeigt eine Vielzahl vqn biologischen Wirkungen, einschließlich Linearwachstum (Somatogenese), Laktation, Aktivierung von Makrophagen, Insulin-ähnliche und diabetogene wirkungen u.a. (Chawla, R.K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, C.K., et al. (1988) Science 239, 769; Thorner, M.O., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81, 745). Wachstumshormonmangel bei Kindern führt zu Zwergwuchs, der seit über einem Jahrzehnt erfolgreich durch exogene Verabreichung von hGH behandelt worden ist. hGH ist ein Mitglied einer Familie von homologen Hormonen, die Placenta-Laktogene, Prolaktine und andere genetische und Spezies-Varianten von Wachstumshormon umfassen (Nicoll, C.S., et al., (1986) Endocrine Reviews 7,169). hGH ist darunter insofern ungewöhnlich, als es eine breite Spezies-Spezifität aufweist und sowohl an den klonierten somatogenen Rezeptor (Leung, D.W., et aL, [1987] Nature 330, 537) als auch den Prolaktin-Rezeptor (Boutin, J.M., et aL, [1988] Ce; 53, 69) bindet. Das klonierte Gen für hGH wurde in sekretierter Form in Escherichia coli exprimiert (Chang, C.N., et al., [1987] Gene 55 189) und dessen DNA- und Aminosäuresequenz wurde mitgeteilt (Goeddel et aL, [1979] Nature 281, 544; Gray et al., [1985] Gene 39, 247). Die dreidimensionale Struktur von hGH ist nicht bekannt. Jedoch wurde das dreidimensionale Faltungsmuster für Schweinewachstumshormon (pGH) bei mäßiger Auflösung und Verfeinerung mitgeteilt (Abdel-Meguid, S.S., et al., [1987] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6434). Rezeptor- und Antikörper-Epitope des Humanwachstumshormons wurden durch Homolog-Scanning-Mutagenese identifiziert (Cunningham et aL, Science 243:1330,1989). Die Struktur eines neuen Rinderwachstumshormons mit einem aminoterminalen Methionin, enthaltend eine eingespleißte Sequenz von Humanwachstumshormon, einschließlich Histidin 18 und Histidin 21, wurde dargestellt (US-Patent 4,880,910).
Humanwachstumshormon (hGH) verursacht eine Vielfalt physiologischer und metabolischer Wirkungen bei verschiedenen Tiermodellen, einschließlich linearem Knochenwachstum, Laktation, Aktivierung von Makrophagen, Insulin-ähnlicher und diabetogener Effekte u. a. (R.K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34, 519 (1983); O.G.P. Isaksson et aL, Annu. Rev. Physiol 47, 483 (1985); C.K. Edwards et al.) Science 239, 769 (1988); M.O. Thorner und M.L. Vance, J. Clin. Invest. 82, 745 (1988); J.P. Hughes und H.G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47, 469 (1985)). Diese biologischen Effekte beruhen auf der Wechselwirkung zwischen hGH und spezifischen zellulären Rezeptoren.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, ein schnelles und wirkungsvolles Verfahren zur systematischen Herstellung von Kandidaten für bindende Substanzen zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, konformationsstabile Kandidaten für bindende Substanzen herzustellen, die auf der Oberfläche eines Phagemid-Partikels präsentiert werden.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Herstellung von Kandidaten für bindende Substanzen, die Fusionsproteine eines Phagenhüllproteins und ein heterologes Polypeptid umfassen, wobei das Polypeptid eine Länge von mehr als 100 Aminosäuren aufweist und mehr als eine Untereinheit sein kann und auf einem Phagemid-Partikel präsentiert wird, wobei das Polypeptid von dem Phagemid Genom kodiert wird.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung und Auswahl von bindenden Substanzen, das ausreichend vielseitig ist, um alle Peptidyl-Gruppierungen zu präsentieren oder herauszustellen, die potentiell an einer nicht-kovalenten bindenden Wechselwirkung teilnehmen könnten, und die Präsentation dieser Gruppierungen in sterisch beschränkter Weise.
Ein noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von Wachstumshormonvarianten, die eine stärkere Affinität für den Wachstumshormon- Rezeptor und das Wachstumshormon-bindende Protein aufweisen.
Ein noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Herstellung von Expressionsvektor-Phagemiden, die ein supressierbares Terminationscodon funktionsfähig zwischen dem heterologen Polypeptid und dem Phagenhüllprotein lokalisiert enthalten, so daß ein nachweisbares Fusionsprotein in einer Supressor- Wirtszelle erzeugt wird und in einer Nicht-Supressor-Wirtszelle nur das heterologe Polypeptid produziert wird.
Schließlich ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Phagemid-Partikel herzustellen, das kaum mehr als eine Kopie von Kandidaten für bindende Proteine auf der äußeren Oberfläche des Phagemid-Partikels präsentiert, so daß eine effiziente Selektion von hochaffin bindenden Polypeptiden erzielt werden kann.
Diese Aufgaben wurden gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Auswahl neuer bindender Polypeptide, welches umfaßt:
(a) Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, umfassend ein regulatorisches Transkriptionselement in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer Genfusion, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei die Genfusion umfaßt
ein erstes Gen, das für ein Polypeptid kodiert, und ein zweites Gen, das für mindestens einen Teil eines Phagenhüllproteins kodiert;
(b) Mutation des Vektors an einer oder mehreren ausgewählten Position(en) innerhalb des ersten Gens, wodurch eine Familie verwandter Plasmide erzeugt wird;
(c) Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden;
(d) Infektion der transformierten Wirtszellen mit einem Helferphagen, der ein für das Phagenhüllprotein kodierendes Gen aufweist;
(e) Kultivierung der transformierten infizierten Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zur Bildung rekombinanter Phagemid-Partikel, welche mindestens einen Teil des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts imstande sind, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die Menge oder Anzahl der Phagemid-Partikel, welche mehr als eine einzige Kopie des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Partikels aufweisen, weniger als etwa 20% beträgt;
(f) Kontaktieren der Phagemid-Partikel mit einem Target-Molekül, so daß mindestens ein Teil der Phagemid-Partikel an das Target-Molekül bindet; und
(g) Abtrennung der bindenden Phagemid-Partikel von den nicht bindenden.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren ferner die Transformation geeigneter Wirtszellen mit rekombinanten Phagemid-Partikeln, welche an das Target-Molekül binden, und die ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (d) bis (g).
Ferner wird das Verfahren zur Auswahl neuer bindender Proteine, worin die Proteine aus mehr als einer Untereinheit bestehen, ausgeführt durch Auswahl neuer bindender Polypeptide, umfassend
(a) Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, der ein regulatorisches Transkriptionselement in funktionsfähiger Verknüpfung mit DNA umfaßt, die für ein interessierendes Protein kodiert, das eine oder mehrere Untereinheit(en) enthält, wobei die DNA, die für mindestens eine der Untereinheiten kodiert, mit der DNA fusioniert ist, die für mindestens einen Teil eines Phagenhüllproteins kodiert;
(b) Mutation der DNA, die für das interessierende Protein kodiert, an einer oder mehreren ausgewählten Position(en), wodurch eine Familie verwandter Vektoren erzeugt wird;
(c) Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Vektoren;
(d) Infektion der transformierten Wirtszellen mit einem Helferphagen, der ein für das Phagenhiillprotein kodierendes Gen aufweist;
(e) Züchtung der transformierten infizierten Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zur Bildung rekombinanter Phagemid-Partikel, die mindestens einen Teil des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts imstande sind, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die Menge oder Anzahl der Phagemid-Partikel, die mehr als eine einzige Kopie des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Partikels aufweisen, weniger als etwa 20% beträgt;
(f) Kontaktieren der Phagemid-Partikel mit einem Target-Molekül, so daß mindestens ein Teil der Phagemid-Partikel an das Target-Molekül bindet; und
(g) Abtrennung der bindenden Phagemid-Partikel von den nicht bindenden. Typischerweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Expressionsvektor ferner eine sekretorische Signalsequenz enthalten, die mit der DNA, die für jede Untereinheit des Polypeptids kodiert, fusioniert ist, und das regulatorische Transkriptionselement wird ein Promotorsystem sein. Bevorzugte Promotorsysteme sind ausgewählt aus: Lac Z-, λPL-, TAC-, T7-Polymerase-, Tryptophan- und alkalische Phosphatase-Promotoren und Kombinationen davon.
Typischerweise wird das erste Gen auch für ein Säugerprotein kodieren, vorzugsweise wird das Protein ausgewählt sein aus: Humanwachstumshormon (hGH), N-Methionyl-Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Parathormon, Thyroxin, A-Kette von Insulin, B-Kette von Insulin, Promsulin, A-Kette von Relaxin, B-Kette von Relaxin, Prorelaxin, Glykoprotein-Hormonen wie follikelstimulierendem Hormon (FSH), Thyrotropin (TSH) und luteinisierendem Hormon (LH), Glykoprotein-Hormon rezeptoren, Calciton in, Glucagon, Faktor VIII, einem Antikörper, lungenoberflächenaktivem Mittel, Urokinase, Streptokinase, Humangewebe-Plasminogenaktivator (tPA), Bombesin, Faktor IX, Thrombin, hämopoetischem Wachstumsfaktor, Tumornekrosefaktor α und β, Enkephalinase, Humanserumalbumin, Anti-Müiler-Hormon, Mäusegonadotropin-assoziiertem Peptid, einem mikrobiellen Protein, z.B. β-Lactamase, Gewebefaktor-Protein, Inhibin, Aktivin, Gefäßendothel-Wachstumsfaktor, Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin, Thrombopoetin, Protein A oder D, Rheumafaktoren, Nervenwachstumsfaktoren wie NGF-β, Thrombozytenwachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF) wie TGF-α und TGF-β, insulinähnlichem Wachstumsfaktor I und II, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Proteinen, CD-4, Dnase, Latenz-assoziiertem Peptid, Erythropoetin, Knochen-induzierenden Faktoren, Interferonen wie lnterferon-α, -β und -γ, Koionie-stimulierenden Faktoren (CSF) wie M-CSF, GM-CSF und G-CSF, Interleukinen (IL) wie IL-1, IL-2, IL-3, IL4, Superoxiddismutase; zerfallsbeschleunigendem Faktor ("decay accelerating factor"), viralem Antigen, HIV-Hüllproteinen wie GP120 und GP140, atrialen natriuretischen Peptiden A, B oder C, Immunglobulinen und Fragmenten der oben aufgeführten Proteine.
Vorzugsweise wird das erste Gen für ein Polypeptid mit einer oder mehreren Untereinheit(en) kodieren, das mehr als etwa 100 Aminosäurereste enthält und gefaltet sein wird&sub1; um eine Vielzahl starrer Sekundärstrukturen zu bilden, die eine Vielzahl von Aminosäuren präsentieren, welche zur Wechselwirkung mit dem Target imstande sind. Vorzugsweise wird das erste Gen an den Codons mutiert sein, die nur den Aminosäuren entsprechen, welche mit dem Target wechselwirken können, so daß die Integrität der starren Sekundärstrukturen erhalten bleiben wird.
Normalerweise wird das Verfahren dieser Erfindung einen Helferphagen einsetzen, der ausgewählt ist aus M13KO7, M13R408, M13-VCS und Phi X 174. Der bevorzugte Helferphage ist M13KO7 und das bevorzugte Hüllprotein ist das Hüllprotein des M13-Phagengens III. Der bevorzugte Wirt ist E. coli und Proteasedefiziente Stämme von E. coli. Es wurden neue hGH-Varianten nachgewiesen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurden. Phagemid- Expressionsvektoren wurden konstruiert, die ein supressierbares Terminationscodon funktionsfähig zwischen den Nukleinsäuren, die für das Polypeptid und das Phagenhüllprotein kodieren, lokalisiert enthalten.

FIGUR 1.

Strategie zur Präsentation großer Proteine auf der Oberfläche filamentöser Phagen und Anreicherung bezüglich geänderter Rezeptorbindungseigenschaften. Ein Plasmid, phGH-M13gIII, wurde konstruiert, bei dem die gesamte kodierende Sequenz von hGH mit der carboxyterminalen Domäne des M13-Gens III fusioniert ist. Die Transkription des Fusionsproteins steht unter der Kontrolle der lac-Promotor/Operator-Sequenz und die Sekretion wird durch die stII- Signalsequenz gesteuert. Phagemid-Partikel werden durch Infektion mit dem "Helfer"-Phagen M13KO7 produziert, und hGH-präsentierende Partikel können durch Bindung an eine Affinitätsmatrix, die den hGH-Rezeptor enthält, angereichert werden. Das Wildtyp-Gen III (abgeleitet von dem M13KO7-Phagen) ist durch die 4-5 Kopien der mehrfachen Pfeile an der Spitze des Phagen graphisch dargestellt und das Fusionsprotein (abgeleitet von dem Phagemid, phGH-Ml3gIII) ist schematisch dargestellt durch das Faltungsdiagramm von hGH, welches die Pfeilspitze ersetzt.

FIGUR 2.

Ein Immunoblot ganzer Phagenpartikel zeigt, daß hGH gemeinsam mit den Phagen wandert. Phagemid-Partikel, die in einem Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt worden waren, wurden in Vertiefungspaaren aufgetragen und auf einem 1 %igen Agarosegel in Puffer mit 375 mM Tris, 40 mM Glycin, pH 9,6 elektrophoresiert. Das Gel wurde 2 Stunden lang in Transferpuffer (25 mM Tris, pH 8,3, 200 mM Glycin, 20% Methanol) der 2% SDS und 2% β-Mercaptoethanol enthielt, getränkt und dann 6 Stunden lang in Transferpuffer gespült. Die Proteine im Gel wurden dann auflmmobilon-Membranen (Millipore) elektrogeblottet. Die Membran, die einen Probensatz enthielt, wurde mit Coomassie-Blau angefärbt, um die Position der Phagenproteine zu zeigen (A). Das Membranduplikat wurde hinsichtlich hGH immungefärbt, indem die Membran mit polyklonalen Anti-hGH- Kaninchenantikörpern umgesetzt wurde, gefolgt von einer Umsetzung mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Ziegenantikörpern (B). Spur 1 enthält den M13KO7-Stammphagen und ist nur in der mit Coomassie-Blau angefärbten Membran sichtbar, da ihr hGH fehlt. Die Spuren 2 und 3 enthalten separate Präparationen der Hormon-Phagemid-Partikel, die sowohl mittels Coomassie- als auch hGH-Immunfärbung sichtbar sind. Der Unterschied in der Wanderungsstrecke zwischen dem M13KO7-Stammphagen und den Hormon- Phagemid-Partikeln reflektiert die unterschiedlichen Genomgrößen, die darin verpackt sind (8,7 kb gegenüber 5,1 kb).

FIGUR 3.

Zusammenfassendes Diagramm der Schritte im Selektionsverfah ren für eine an den Codons 172, 174, 176 und 178 randomisierte hGH-Phagenbank. Die Matrizenmoleküle pH0415, enthaltend eine nur einmal vorkommende KpnI-Restriktionsstelle und das (R178G,I179T)-hGH-Gen, wurden mutagenisiert wie im Text beschrieben und dann in den E. coli-Stamm WJM101 elektrotransformiert, um die erste Phagemid-Bank, Bank 1, zu erhalten. Ein Aliquot (etwa 2%) der Bank 1 wurde direkt in einem ersten Selektionsdurchgang verwendet wie im Text beschrieben, um die Bank 1 G zu ergeben. Inzwischen wurde doppelsträngige DNA (dsDNA) aus der Bank 1 hergestellt, mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut, um Matrizenhintergrund zu eliminieren, und damit WMJ101 elektrotransformiert, um die Bank 2 zu ergeben. Nachfolgende Selektionsdurchgänge (oder Kpnl-Verdauung, schattierte Boxen) und anschließende Phagemid-Vermehrung erfolgten nach dem im Text beschriebenen Verfahren wie durch die Pfeile angezeigt. Vier unabhängige Klone aus der Bank 4G&sup4; und vier unabhängige Klone aus der Bank 5G&sup6; wurden durch Didesoxysequenzierung sequenziert. Alle diese Klone besaßen eine identische DNA-Sequenz, entsprechend der hGH-Mutante (Glu 174 Ser, Phe 176 Tyr).

FIGUR 4.

Strukturmodell von hGH, abgeleitet von einem 2,8 Å - Faltungsdiagramm von Schweinewachstumshormon, das kristallographisch bestimmt wurde. Im schattierten Kreis befinden sich diejenigen Reste in hGH, welche dessen Bindung an das hGH-bindende Protein stark modulieren. Alaninsubstitutionen, die eine mehr als zehnfache Herabsetzung ( ), eine vier- bis zehnfache Herabsetzung ( ), oder eine Erhöhung (O) oder eine zwei- bis vierfache Verringerung ( ) der Bindungsaffinität verursachen, sind angezeigt. Heiix-Radprojektionen in den Bereichen einer α-Helix zeigen deren amphipathische Eigenschaften. Geschwärzte, schattierte oder nicht schattierte Reste sind geladen, polar bzw. nicht polar. In der Helix-4 liegen die wichtigsten Reste für eine Mutation auf der hydrophilen Oberfläche.

FIGUR 5.

Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 172, 174, 176 und 178 von hGH (die Notation, z.B. KSYR, bezeichnet die hGH-Mutante 172K/174S/176Y/178R), die nach der Sequenzierung einer Anzahl von Klonen aus den Durchgängen 1 und 3 des Selektionsverfahrens für die angezeigten Verfahrenswege (hGH-Elution; Glycin-Elution; oder Glycin-Elution nach Voradsorption) gefunden wurden. Nicht-funktionelle Sequenzen (d.h. Vektor-Hintergrund oder andere vorzeitig terminierte und/oder Leserahmen-verschobene Mutanten) sind als "NF" dargestellt. Funktionelle Sequenzen, die eine nicht-schweigende, täuschende Mutation (d.h. außerhalb des Sets von Target-Resten) enthielten, sind mit einem "+" markiert. Proteinsequenzen, die mehr als einmal bei allen sequenzierten Klonen auftraten, jedoch mit verschiedenen DNA-Sequenzen, sind mit einem "#" markiert. Proteinsequenzen, die bei den sequenzierten Klonen mehr als einmal und mit derselben DNA-Sequenz auftraten,. sind mit einem "*" markiert. Es ist zu beachten, daß nach drei Selektionsdurchgängen zwei verschiedene kontaminierende Sequenzen gefunden wurden; diese Klone korrespondierten nicht mit Kasetten- Mutanten, sondern mit vorher konstruierten Hormon-Phagen. Die pS0643- Kontaminante entspricht dem hGH-Wildtyp-Phagen (hGH "KEFR"). Die pH0457- Kontaminante, welche den Glycin-selektionierten Phagenpool des dritten Durchgangs dominiert, entspricht einer vorher identifizierten Mutante von hGH, "KSYR". Die Amplifizierung dieser Kontaminanten betont die Fähigkeit des Hormon Phagen-Selektionsverfahrens zur Selektion selten vorkommender Mutanten. Die Konvergenz der Sequenzen ist ebenfalls bei allen drei Verfahrenswegen auffallend: R oder K tritt am öftesten an den Positionen 172 und 178 auf; Y oder F tritt am öftesten an der Position 176 auf; und 81 T, A und andere Reste treten an der Position 174 auf.

FIGUR 6.

Sequenzen von Phagen, die auf hPRLbp-Perlen in Gegenwart von Zink selektioniert wurden. Die Notation ist wie in Fig. 5 angegeben. Hier ist die Konvergenz von Sequenzen nicht voraussagbar, es scheint jedoch eine Tendenz zu hydrophoben Sequenzen unter den am meisten stringenten (Glycin) Selektionsbedingungen vorzuliegen; L-, W- und P-Reste werden häufig in diesem Pool gefunden.

FIGUR 7.

Sequenzen von Phagen, die auf hPRLbp-Perlen in Abwesenheit von Zink selektioniert wurden. Die Notation ist wie in Fig. 5 angegeben. Im Gegensatz zu den Sequenzen von Fig. 6 scheinen diese Sequenzen hydrophiler zu sein. Nach vier Selektionsdurchgängen unter Anwendung von hGH-Elution dominieren zwei Klone (ANHQ und TLDT/171V) den Pool.

FIGUR 8.

Sequenzen von Phagen, die auf unbeladenen Perlen selektioniert wurden. Die Notation ist wie in Fig. 5 angegeben. Nach drei Selektionsdurchgängen unter Glycin-Elution wurden keine verwandten Produkte beobachtet und es blieb ein Hintergrundniveau an nicht-funktionellen Sequenzen.

Figur 9.

Konstruktion des Phagemids fl on aus pHO415. Dieser Vektor für Kassetten-Mutagenese und Expression des hGH-Gen III-Fusionsproteins wurde folgendermaßen konstruiert. Das Plasmid pS0643 wurde konstruiert durch Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese von pS0132, welches die Replikationsursprünge von pBR322 und f1 enthält und ein hGH-Gen III- Fusionsprotein (hGH-Reste 1-191, gefolgt von einem einzelnen Gly-Rest, fusioniert mit Pro-198 des Gens III) unter der Kontrolle des E. coli phoA-Promotors exprimiert. Die Mutagenese wurde mit dem Oligonukleotid 5'-GGC-AGC-TGT-GGC-TTC-TAG- AGT-GGC-GGC-GGC-TCT-GGT-3' durchgeführt, das eine XbaI-Steile (unterstrichen) und ein Amber-Stopcodon (TAG) nach dem Phe-191 von hGH einführte.

Figur 10. A.

Diagramm des Plasmid pDH188-Inserts, das die DNA enthält, welche für die leichte Kette und schwere Kette (variable und konstante Domäne 1) des humanisierten Fab-Antikörpers gegen den HER-2-Rezeptor kodiert. VL und VH sind die variablen Regionen für die leichten bzw. schweren Ketten. Ck ist die konstante Region der leichten Human-Kappa-Kette. CH1G1 ist die erste konstante Region der Human-Gamma-1-Kette. Beide kodierenden Bereiche beginnen mit der bakteriellen st II-Signalsequenz. B. Ein schematisches Diagramm des vollständigen Plasmids pDH188, enthaltend das in 5A beschriebene Insert. Nach der Transformation des Plasmids in E. coli-SR101-Zellen und der Zugabe von Helferphagen wird das Plasmid in Phagenpartikel verpackt. Einige dieser Partikel zeigen die Fab-p III-Fusion (worin p III das Protein ist, welches von der M13 Gen III-DNA kodiert wird). Die Abschnitte in der Plasmidfigur entsprechen dem in 5A gezeigten Insert.

Die Figuren 11A bis C werden hier zusammen als Figur 11 bezeichnet

Die Nukleotid (Seq.-ID-Nr. 25)-Sequenz der DNA, welche für das 4D5 Fab-Molekül kodiert, das auf der Phagemid-Oberfläche exprimiert wird. Die Aminosäuresequenz der leichten Kette ist ebenfalls dargestellt (Seq.-ID-Nr. 26) sowie die Aminosäuresequenz der schweren Kette-p-III-Fusion (Seq.-ID-Nr. 27).
Figur 12. Anreicherung des 4D5-Fab-Wildtyp-Phagemids gegenüber dem 4D5-Fab-Varianten-Phagemid. Mischungen des Wildtyp-Phagemids und des 4D5-Fab- Varianten-Phagemids in einem Verhältnis von 1:1000 wurden auf Platten selektioniert, die mit dem Protein der extrazellulären Domäne des HER-2-Rezeptors beschichtet waren. Nach jedem Selektionsdurchgang wurde mit einem Teil der eluierten Phagemide E. coli infiziert und Plasmid-DNA hergestellt. Diese Plasmid- DNA wurde dann mit EcoRV und PstI verdaut, auf einem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Banden wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die auf das Wildtyp- und das Varianten-Plasmid zurückzuführenden Banden sind mit Pfeilen markiert. Der erste Selektionsdurchgang wurde nur unter sauren Bedingungen eluiert; nachfolgende Durchgänge wurden entweder mit einer sauren Elution (linke Seite der Figur) oder mit einem Waschschritt mit humanisiertem 4D5-Antikörper vor der sauren Elution (rechle Seite der Figur) unter Anwendung von in Beispiel VIII beschriebenen Verfahren eluiert. Es wurden drei 4D5-Fab-Variantenmoleküle hergestellt: H91A (Aminosäure Histidin an Position 91 der VL-Kette zu Alanin mutiert; in der Figur als "A"-Spuren angezeigt), Y49A (Aminosäure Tyrosin an Position 49 der VL-Kette zu Alanin mutiert; in der Figur als "Bu"-Spuren angezeigt) und Y92A (Aminosäure Tyrosin an Position 92 der VL-Kette zu Alanin mutiert; in der Figur als "C"-Spuren angezeigt). Die Zählung der Aminosäurepositionen entspricht Kabat et aL, (Sequences of proteins of immunological interest, 4. Auflage, U.S. Dept. Of Health and Human Services, Public Health Service, Nat'l. Institute of Health, Bethesda, MD (1987]).

Figur 13.

Hier ist die Scatchard-Analyse der in den Versuchsprotokollen beschriebenen RIA-Affinitätsbestimmung dargestellt. Die Menge des gebundenen markierten ECD-Antigens wird auf der X-Achse gezeigt, während die gebundene Menge geteilt durch die freie Menge auf der Y-Achse gezeigt wird. Die Steigung der Linie zeigt die Ka an; die berechnete Kd ist 1/Ka.
Die folgende Erörterung ist am besten unter Bezug auf Figur 1 zu verstehen. In seiner einfachsten Form umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Auswahl neuer bindender Polypeptide, wie z.B. Proteinliganden, mit einer gewünschten, gewöhnlich hohen, Affinität für ein Target-Molekül aus einer Bank strukturell verwandter bindender Polypeptide. Die Bank von strukturell verwandten Polypeptiden, die mit einem Phagenhüllprotein fusioniert sind, wird durch Mutagenese erzeugt und vorzugsweise wird eine einzige Kopie eines jeden verwandten Polypeptids auf der Oberfläche eines Phagemid-Partikels präsentiert, welches die für jenes Polypeptid kodierende DNA enthält. Diese Phagemid-Partikel werden dann mit einem Target-Molekül in Kontakt gebracht und diejenigen Partikel mit der höchsten Affinität für das Target werden von denjenigen mit geringerer Affinität abgetrennt. Die hochaffin bindenden Moleküle werden dann durch Infektion eines bakteriellen Wirts amplifiziert und der Schritt der Konkurrenzbindung wird wiederholt. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis Polypeptide der gewünschten Affinität erhalten werden.
Die neuen bindenden Polypeptide oder Liganden, welche nach dem Verfahren dieser Erfindung produziert werden, sind als solche geeignet als Diagnostika oder Therapeutika (z.B. Agonisten oder Antagonisten), die zur Behandlung biologischer Organismen eingesetzt werden. Die Strukturanalyse der ausgewählten Polypeptide kann auch zur Erleichterung eines rationellen Arzneimitteldesigns eingesetzt werden.
"Bindendes Polypeptid", wie hier verwendet, bedeutet jedes Polypeptid, das mit einer selektierbaren Affinität an ein Target-Molekül bindet. Vorzugsweise wird das Polypeptid ein Protein sein, das am meisten bevorzugt mehr als etwa 100 Aminosäurereste enthält. Typischerweise wird das Polypeptid ein Hormon oder ein Antikörper oder ein Fragment davon sein.
"Hohe Affinität", wie hier verwendet, bedeutet eine Affinitätskonstante (Kd) von < 10&supmin;&sup5; und vorzugsweise < 10&supmin;&sup7;M unter physiologischen Bedingungen.
"Target-Molekül", wie hier verwendet, bedeutet jedes Molekül, nicht notwendigerweise ein Protein, für das die Herstellung eines Liganden gewünscht wird. Vorzugsweise wird das Target jedoch ein Protein sein und besonders bevorzugt wird das Target ein Rezeptor, z.B. ein Hormonrezeptor, sein.
"Humanisierter Antikörper", wie hier verwendet, bedeutet einen Antikörper, bei dem die Komplementärität-bestimmenden Regionen (CDR) einer Maus oder eines anderen nicht-humanen Antikörpers auf ein Humanantikörper-Gerüst gepfropft sind. Humanantikörper-Gerüst bedeutet den gesamten Humanantikörper unter Ausschluß der CDR.

1. Wahl von Polypeptiden zur Präsentation auf der Oberfläche eines Phagen

Der erste Schritt bei dem Verfahren dieser Erfindung ist die Wahl eines Polypeptids, bei dem eine starre Sekundärstruktur auf der Oberfläche des Polypeptids exponiert ist, zur Präsentation auf der Oberfläche eines Phagens.
"Polypeptid", wie hier verwendet, bedeutet jedes Molekül, dessen Expression durch eine spezifische DNA-Sequenz gesteuert werden kann. Die Polypeptide dieser Erfindung können mehr als eine Untereinheit umfassen, wobei jede Untereinheit von einer separaten DNA-Sequenz kodiert wird.
"Starre Sekundärstruktur", wie hier verwendet, bedeutet jedes Polypeptid- Segment, das eine reguläre wiederholte Struktur aufweist, wie sie zum Beispiel gefunden wird in: α-Helices, 3&sub1;&sub0;-Helices, π-Helices, parallelen und antiparallelen β- Faltblättern und reversen Kehren ("reverse turns"). Bestimmte "ungeordnete" Strukturen, denen eine erkennbare geometrische Ordnung fehlt, sind ebenfalls in der Definition einer starren Sekundärstruktur eingeschlossen, unter der Voraussetzung, daß sie eine Domäne oder Ansammlung ("patch") von Aminosäureresten bilden, die zur Wechselwirkung mit einem Target imstande sind, und daß die Gesamtgestalt der Struktur durch den Austausch einer Aminosäure innerhalb der Struktur nicht zerstört wird. Es wird angenommen, daß einige ungeordnete Strukturen Kombinationen von reversen Kehren sind. Die Geometrie dieser starren Sekundärstrukturen ist durch die Torsionswinkel φ und ψ um die α-Kohlenstoffatome des Peptid-"Gerüsts" wohldefiniert.
Das Erfordernis, daß die Sekundärstruktur auf der Oberfläche des Polypeptids exponiert ist, soll eine Domäne oder "Ansammlung" von Aminosäureresten zur Verfügung stellen, die einem Target-Molekül ausgesetzt werden und daran binden können. In erster Linie sind es diese Aminosäurereste, welche durch Mutagenese ersetzt werden, welche die "Bank" strukturell verwandter bindender (Mutanten)- Polypeptide bilden, die auf der Oberfläche des Phagen präsentiert werden und aus denen neue Polypeptidliganden ausgewählt werden. Eine Mutagenese oder ein Austausch von Aminosäureresten, die zum Innern des Polypeptids hin gerichtet sind, wird im allgemeinen vermieden, so daß die Gesamtstruktur der starren Sekundärstruktur erhalten bleibt. Ein gewisser Austausch von Aminosäuren im inneren Bereich der starren Sekundärstrukturen, insbesondere bei hydrophoben Aminosäureresten, kann toleriert werden, da diese konservativen Substitutionen die Gesamtstruktur des Polypeptids wahrscheinlich nicht stören.
Es werden wiederholte Zyklen der "Polypeptid"-Selektion eingesetzt, um durch die Phagemid-Selektion mehrfacher Aminosäureaustausche, die über mehrfache Selektionszyklen selektiert werden, auf eine Bindung mit immer höherer Affinität zu selektionieren. Nach einem ersten Phagemid-Selektionsdurchgang, der eine erste Region oder Selektion von Aminosäuren im Liganden-Polypeptid beinhaltet, werden weitere Phagemid-Selektionsdurchgänge in anderen Regionen oder Aminosäuren des Liganden-Polypeptids durchgeführt. Die Zyklen der Phagemid-Selektion werden wiederholt, bis die gewünschten Affinitätseigenschaften des Liganden-Polypeptids erreicht werden. Zur Erläuterung dieses Verfahrens wurde in Beispiel VIII die Phagemid-Selektion von hGH in Zyklen durchgeführt. Im ersten Zyklus wurden die hGH-Aminosäuren 172, 174, 176 und 178 mutiert und Phagemid-selektioniert. In einem zweiten Zyklus wurden die hGH-Aminosäuren 167, 171, 175 und 179 Phagemid-selektioniert. In einem dritten Zyklus wurden die hGH-Aminosauren 10, 14, 18 und 21 Phagemid-selektioniert Optimale Aminosäureaustausche aus einem früheren Zyklus können vor dem nächsten Selektionszyklus in das Polypeptid inkorporiert werden. Beispielsweise wurden die hGH-Aminosäuresubstitutionen 174 (Serin) und 176 (Tyrosin) vor der Phagemid-Selektion der hGH-Aminosäuren 167, 171, 175 und 179 in das hGH inkorporiert.
Aus dem Vorstehenden wird ersichtlich sein, daß die Aminosäurereste, welche die bindende Domäne des Polypeptids bilden, nicht sequentiell verknüpft sein werden und auf verschiedenen Untereinheiten des Polypeptids liegen können. Das heißt, die bindende Domäne folgt der speziellen Sekundärstruktur an der Bindungsstelle und nicht der Primärstruktur. So werden im allgemeinen Mutationen in Codons, welche für Aminosäuren innerhalb einer speziellen Sekundärstruktur kodieren, an Stellen eingeführt, die vom Innern des Polypeptids weg gerichtet sind, so daß sie das Potential zur Wechselwirkung mit dem Target besitzen werden. Zur Illustration zeigt Figur 2 die Lokalisierung von Resten in hGH, von denen bekannt ist, daß sie dessen Bindung an das hGH-bindende Protein stark modulieren (Cunningham et al., Science 247:1461-1465 [1990]). So würden repräsentative Stellen, die zur Mutagenese geeignet sind, die Reste 172,174,176 und 178 auf der Helix-4, sowie Rest 64, lokalisiert in einer "ungeordneten" Sekundärstruktur, umfassen.
Es ist nicht erforderlich, daß das als Ligand für ein Target gewählte Polypeptid normalerweise an jenes Target bindet. So kann beispielsweise ein Glycoprotein Hormon wie TSH als Ligand für den FSH-Rezeptor gewählt werden und eine Bank von TSH-Mutantenmolekülen wird im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt, um neue Arzneimittelkandidaten zu erzeugen.
Diese Erfindung betrifllt so jedes Polypeptid, das an ein Target-Molekül bindet und schließt Antikörper ein. Bevorzugte Polypeptide sind diejenigen mit pharmazeutischer Anwendbarkeit. Noch bevorzugtere Polypeptide umfassen: ein Wachstumshormon, einschließlich Humanwachstumshormon, Des-N-methionyl- Humanwachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathormon; Thyrotropin; Thyroxin; A-Kette von Insulin; B-Kette von Insulin, Promsulin; follikelstimulierendes Hormon; Calcitonin; luteinisierendes Hormon; Glucagon; Faktor VIII; einen Antikörper; ein lungenoberflächenaktives Mittel; einen Plasminogenaktivator wie Urokinase oder Humangewebe-Plasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Faktor IX; Thrombin; hämopoetischen Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor α und β; Enkephalinase; ein Serumalbumin wie Humanserumalbumin; Anti-Müiler-Hormon; A- Kette von Relaxin, B-Kette von Relaxin; Prorelaxin; Mäusegonadotropin-assoziiertes Peptid; ein mikrobielles Protein wie β-Lactamase; Gewebefaktor-Protein; Inhibin; Aktivin; Gefäßendothel-Wachstumsfaktor; Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Thrombopoetin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; Nervenwachstumsfaktor wie NGF-β; Thrombozytenwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor wie aFGF und bFGF; epidermalen Wachstumsfaktor; transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) wie TGF-alpha und TGF-beta; Insulinähnlichen Wachstumsfaktor I und II; Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindende Proteine; CD4; Dnase; Latenz-assoziiertes Peptid; Erythropoetin; Knocheninduzierende Faktoren; ein Interferon wie Interferon-alpha, -beta und -gamma; Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (IL), z.B. IL-1, IL-2, IL-3, IL4, etc.; Superoxiddismutase; zerfallsbeschleunigenden Faktor; atriale natriuretische Peptide A, B oder C; ein virales Antigen wie z.B. ein Teil der HIV-Hülle; Immunglobuline; und Fragmente irgendwelcher der oben aufgeführten Polypeptide. Ferner können ein oder mehrere vorherbestimmte Aminosäurereste auf dem Polypeptid substituiert, inseriert oder deletiert werden, um beispielsweise Produkte mit verbesserten biologischen Eigenschaften herzustellen. Ferner sind Fragmente dieser Polypeptide, insbesondere biologisch aktive Fragmente, eingeschlossen. Noch bevorzugtere Polypeptide dieser Erfindung sind Humanwachstumshormon und atriale natriuretische Peptide A, B und C, Endotoxin, Subtilisin, Trypsin und andere Serienproteasen.
Noch bevorzugter sind Polypeptidhormone, welche definiert werden können als jede in einer ersten Zelle erzeugte Aminosäuresequenz, die spezifisch an einen Rezeptor desselben Zelltyps bindet (autokrine Hormone) oder eines zweiten Zelltyps (nicht-autokrin) und eine physiologische Antwort verursacht, die charakteristisch für die Rezeptor-tragende Zelle ist. Unter solchen Polypeptidhormonen sind Cytokine, Lymphokine, neurotrophe Hormone und Adenohypophysen-Polypeptidhormon, wie Wachstumshormon, Prolaktin, Placenta-Laktogen, luteinisierendes Hormon, follikelstimulierendes Hormon, Thyrotropin, Choriongonadotropin, Corticotropin, α- oder β- Melanozyten-stimulierendes Hormon, β-Lipotropin, γ-Lipotropin und die Endorphine; Freisetzung im Hypothalamus inhibierende Horrnone wie Corticotropin-Frei setzungsfaktor, Wachstumshormonfreisetzung inhibierendes Hormon, Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor; und andere Polypeptidhormone wie atriale natriuretische Peptide A, B oder C.

II. Gewinnung eines ersten Gens (Gen 1), welches für das gewünschte Polypeptid kodiert

Das Gen, welches für das gewünschte Polypeptid (d.h., ein Polypeptid mit einer starren Sekundärstruktur) kodiert, kann nach im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten Werden (siehe allgemein, Sambrook et aL, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989]). Falls die Sequenz des Gens bekannt ist, kann die DNA, die für das Gen kodiert, chemisch synthetisiert werden (Merrfield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 [1963]). Falls die Sequenz des Gens nicht bekannt ist oder das Gen vorher nicht isoliert worden ist, kann es aus einer cDNA-Bank (hergestellt aus RNA, die aus einem geeigneten Gewebe erhalten wurde, in dem das gewünschte Gen exprimiert wird) oder aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank kloniert werden. Das Gen wird dann mit Hilfe einer geeigneten Sonde isoliert. Für cDNA-Banken umfassen geeignete Sonden monoklonale oder polyklonale Antikörper (vorausgesetzt, daß die cDNA-Bank eine Expressionsbank ist), Oligonukleotide und komplementäre oder homologe cDNAs oder Fragmente davon. Die Sonden, welche zur Isolierung des interessierenden Gens aus genomischen DNA-Banken eingesetzt werden können, umfassen cDNAs oder Fragmente davon, die für dasselbe oder ein ähnliches Gen kodieren, homologe genomische DNAs oder DNA-Fragmente und Oligonukleotide. Das Screenen der cDNA- oder genomischen Bank mit der ausgewählten Sonde erfolgt unter Anwendung von Standardverfahren wie in den Kapiteln 10-12 von Sambrook et al., supra, beschrieben.
Ein alternatives Mittel zur Isolierung des Gens, welches für das interessierende Protein kodiert, ist die Anwendung des Polymerase kettenreaktionsverfahrens (PCR) wie in Abschnitt 14 von Sambrook et al., supra, beschrieben. Dieses Verfahren erfordert die Verwendung von Oligonukleotiden, welche mit dem interessierenden Gen hybridisieren; somit muß mindestens ein Teil der DNA-Sequenz für dieses Gen bekannt sein, um die Oligonukleotide zu erzeugen.
Nachdem das Gen isoliert wurde, kann es zur Amplifizierung in einen geeigneten Vektor (vorzugsweise ein Plasmid) inseriert werden, wie allgemein in Sambrook et al., supra, beschrieben.

III. Konstruktion replizierbarer Exdressionsvektoren

Obwohl mehrere Typen von Vektoren zur Verfügung stehen und zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden können, sind Plasmidvektoren die hier bevorzugt verwendeten Vektoren, da sie relativ leicht konstruiert werden können und ohne weiteres amplifiziert werden können. Plasmidvektoren enthalten im allgemeinen eine Vielfalt von Komponenten, einschließlich Promotoren, Signalsequenzen, Genen zur pHänotypischen Selektion, Replikations ursprungsstellen und andere erforderliche Komponenten, wie sie Durchschnittsfachleuten bekannt sind.
Die am häufigsten bei prokaryotischen Vektoren verwendeten Promotoren umfassen das lacZ-Promotorsystem, den alkalische Phosphatase-Dho-A-Promotor, den Bakteriophagen-λPL-Promotor (ein temperaturempfindlicher Promotor), den tac Promotor (ein hybrider trd-lac-Promotor, der von dem lac-Repressor reguliert wird), den Tryptophan-Promotor und den Baktenophagen-T7-Promotor Hinsichtlich allgemeiner Beschreibungen von Promotoren siehe Abschnitt 17 von Sambrook et aL, supra. Obwohl dies die am häufigsten verwendeten Promotoren sind, können ebenso andere geeignete mikrobielle Promotoren eingesetzt werden.
Bevorzugte Promotoren zur Ausführung dieser Erfindung sind diejenigen, die streng reguliert werden können, so daß die Expression des Fusionsgens gesteuert werden kann. Es wird angenommen, daß das Problem, das im Stand der Technik nicht erkannt wurde, darin bestand, daß die Präsentation mehrfacher Kopien des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Phagemid-Partikels zu einer Mehrpunktverknüpfung des Phagemids mit dem Target führte. Es wird angenommen, daß dieser Effekt, als "Chelat-Effekt" bezeichnet, in der Auswahl falscher "hochaffiner" Polypeptide resultiert, wenn mehrfache Kopien des Fusionsproteins auf dem Phagemid-Partikel in enger Nachbarschaft zueinander präsentiert werden, so daß das Target "cheliert" wurde. Wenn eine Mehrpunktverknüpfung auftritt, kann die effektive oder scheinbare Kd so hoch sein wie das Produkt der individuellen Kds für jede Kopie des präsentierten Fusionsproteins. Dieser Effekt kann der Grund sein, warum Cwirla und Mitarbeiter, supra, nicht imstande waren, Peptide mit mäßiger Affinität von Peptiden mit höherer Affinität zu trennen.
Es wurde entdeckt, daß durch strenge Regulation der Expression des Fusionsproteins, so daß nicht mehr als eine kleinere Menge, d.h., weniger als etwa 1 %, der Phagemid-Partikel mehrfache Kopien des Fusionsproteins enthalten, der "Chelat-Effekt" beseitigt wird, so daß eine geeignete Selektion hochaffiner Polypeptide erfolgen kann. So werden je nach Promotor die Kulturbedingungen des Wirts eingestellt, um die Anzahl an Phagemid-Partikeln, die eine einzige Kopie des Fusionsproteins enthalten, zu maximieren und die Anzahl der Phagemid-Partikel, die mehrfache Kopien des Fusionsproteins enthalten, zu minimieren.
Bevorzugte Promotoren, die zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden, sind der lac Z-Promotor und der Dho A-Promotor. Der lac Z-Promotor wird durch das lac-Repressorprotein lac i reguliert und die Transkription des Fusionsgens kann so durch Manipulation des Niveaus an lac-Repressorprotein gesteuert werden. Beispielsweise wird das Phagemid, welches den lac Z-Promotor enthält, in einem Zellstamm gezüchtet, der eine Kopie des lac i-Repressorgens, eines Repressors für den lac Z-Promotor, enthält. Beispielhafte Zellstämme, die das lac i-Gen enthalten, umfassen JM 101 und XL 1-Blue. Bei der Alternative kann die Wirtszelle mit einem Plasmid cotransflziert werden, welches sowohl den Repressor lac i als auch den lac Z-Promotor enthält. Gelegentlich werden beide obigen Techniken gleichzeitig eingesetzt, d.h., Phagemid-Partikel, die den lac Z-Promotor enthalten, werden in Zellstämmen gezüchtet, die das lac i-Gen enthalten, und die Zellstämme mit einem Plasmid cotransfiziert, das sowohl das lac Z-Gen als auch das lac i-Gen enthält. Ist die Expression eines Gens erwünscht, wird normalerweise dem obigen transfizierten Wirt ein lnducer wie Isopropylthiogalactosid (IPTG) zugegeben. In der vorliegenden Erfindung wird dieser Schritt jedoch unterlassen, um (a) die Expression des Gen III- Fusionsproteins zu minimieren, wodurch die Kopienzahl (d.h. die Anzahl von Gen III- Fusionen pro Phagemidanzahl) minimiert wird, und um (b) eine schlechte oder falsche Verpackung des Phagemids, die von lnducern wie IPTG sogar bei niedrigen Konzentrationen verursacht wird, zu verhindern. Wenn kein lnducer zugegeben wird, beträgt die Anzahl der Fusionsproteine pro Phagemid-Partikel typischerweise etwa 0,1 (Anzahl der Hauptfusionsproteinelanzahl der Phagemid-Partikel). Der am meisten bevorzugte Promotor zur Ausführung dieser Erfindung ist pho A. Man nimmt an, daß dieser Promotor durch das Niveau an anorganischem Phosphat in der Zelle reguliert wird, wobei das Phosphat zur Herunterregulierung der Aktivität des Promotors dient. So kann die Aktivität des Promotors durch Verarmung der Zellen an Phosphat erhöht werden. Das gewünschte Resultat wird erzielt, indem die Zellen in einem Phosphat-angereicherten Medium wie 2YT oder LB gezüchtet werden, wodurch die Expression der Gen III-Fusion gesteuert wird.
Eine andere nützliche Komponente der zur Ausführung dieser Erfindung verwendeten Vektoren ist eine Signalsequenz. Diese Sequenz befindet sich typischerweise unmittelbar 5' von dem Gen, welches für das Fusionsprotein kodiert, und wird so am Aminoterminus des Fusionsproteins transkribiert werden. In bestimmten Fällen ist jedoch gezeigt worden, daß die Signalsequenz an anderen Positionen als 5, von dem Gen, welches für das zu sekretierende Protein kodierte, lokalisiert war. Diese Sequenz bestimmt das damit verknüpfte Protein für ein Ziel jenseits der inneren Membran der Bakterienzelle. Die für die Signalsequenz kodierende DNA kann als Restriktionsendonukleasefragment von jedem Gen erhalten werden, das für ein Protein mit einer Signalsequenz kodiert. Geeignete prokaryotische Signalsequenzen können von Genen erhalten werden, die beispielsweise für Lamb oder OmpF (Wong et aL, Gene, 68:193 [1983]), Male, PhoA und andere Gene kodieren. Eine bevorzugte prokaryotische Signalsequenz zur Ausführung dieser Erfindung ist die Signalsequenz des hitzestabilen Enterotoxins II von E. coli (STII) wie von Chang et al., Gene, 55:189 [1987J beschrieben.
Eine weitere nützliche Komponente der zur Ausführung dieser Erfindung verwendeten Vektoren sind Gene zur phänotypischen Selektion. Typische Gene zur pHänotypischen Selektion sind diejenigen, welche für Proteine kodieren, die der Wirtszelle Antibiotikaresistenz verleihen. Beispielsweise werden das Ampicillinresistenz-Gen (arnd) und das Tetracyclinresistenz-Gen (Let) gerne für diesen Zweck eingesetzt.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die vorgenannten Komponenten sowie das Gen, welches für das gewünschte Polypeptid (Gen 1) kodiert, umfassen, werden hergestellt unter Anwendung von Standardverfahren rekombinanter DNA wie in Sambrook et aL, supra beschrieben. Isolierte DNA- Fragmente, die zur Bildung des Vektors kombiniert werden müssen, werden gespalten, zugeschnitten und miteinander in spezifischer Reihenfolge und Orientierung ligiert, um den gewünschten Vektor herzustellen.
Die DNA wird mit Hilfe des geeigneten Restriktionsenzyms oder der geeigneten Restriktionsenzyme in einem geeigneten Puffer gespalten. Im allgemeinen werden etwa 0,2-1 ug Plasmid oder DNA-Fragmente mit etwa 1-2 Einheiten des geeigneten Restriktionsenzyms in etwa 20 ul Pufferlösung eingesetzt. Geeignete Puffer, PNA-Konzentrationen und Inkubationszeiten und Temperaturen werden von den Herstellern der Restriktionsenzyme angegeben. Im allgemeinen sind lnkubationszeiten von etwa 1 oder 2 Stunden bei 37ºC adäquat, obwohl mehrere Enzyme höhere Temperaturen erfordern. Nach der Inkubation werden die Enzyme und anderen Verunreinigungen durch Extraktion der Verdauungslösung mit einer Mischung von Phenol und Chloroform entfernt und die DNA aus der wäßrigen Fraktion durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Um die DNA-Fragmente zur Bildung eines funktionellen Vektors miteinander zu ligieren, müssen die Enden der DNA-Fragmente miteinander kompatibel sein. In einigen Fällen werden die Enden nach der Endonukleaseverdauung direkt kompatibel sein. Es kann jedoch erforderlich sein, zuerst die kohäsiven Enden, die üblicherweise durch Endonukleaseverdauung erzeugt werden, in glatte Enden zu überführen, um sie für die Ligierung kompatibel zu machen. Zur Herstellung glatter Enden wird die DNA in einem geeigneten Puffer mindestens 15 Minuten lang bei 15ºC mit 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase 1 (Klenow) in Anwesenheit der vier Desoxynukleosid-Triphosphate behandelt. Die DNA wird dann durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt.
Die gespaltenen DNA-Fragmente können mit Hilfe von DNA-Gelelektrophorese nach der Größe aufgetrennt und selektioniert werden. Die DNA kann entweder durch eine Agarose- oder durch eine Polyacrylamidmatrix elektrophoresiert werden. Die Auswahl der Matrix wird von der Größe der aufzutrennenden DNA- Fragmente abhängen. Nach der Elektrophorese wird die DNA aus der Matrix durch Elektroelution extrahiert oder, falls niedrigschmelzende Agarose als Matrix verwendet wurde, durch Schmelzen der Agarose und Extraktion der DNA daraus wie in den Abschnitten 6.30-6.33 von Sambrook et al., supra, beschrieben.
Die miteinander zu ligierenden DNA-Fragmente (vorher mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, so daß die Enden eines jeden zu ligierenden Fragments kompatibel sind) werden in etwa äquimolaren Mengen in Lösung gebracht. Die Lösung wird auch ATP, Ligasepuffer und eine Ligase wie T4-DNA- Ligase mit etwa 10 Einheiten pro 0,5 ug DNA enthalten. Falls das DNA-Fragment in einen Vektor ligiert werden soll, wird der Vektor zuerst durch Schneiden mit der bzw. den geeigneten Restriktionsendonuklease(n) linearisiert. Der linearisierte Vektor wird dann mit alkalischer Phosphatase oder Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. Die Phosphatasebehandlung verhindert eine Selbstligierung des Vektors während des Ligierungsschrittes.
Nach der Ligierung wird der Vektor mit dem nun inserierten fremden Gen in eine geeignete Wirtszelle transformiert. Prokaryoten sind die bevorzugten wirtszellen für diese Erfindung. Geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen den E. coli- Stamm JM101, E. coli K12-Stamm 294 (ATCC-Nr. 31 446), E. coii -Stamm W3110 (ATCC-Nr. 27 325), E. coli X1776 (ATCC-Nr. 31 537), E. coli XL-1 Blue (Stratagene) und E. coli B; es können jedoch ebenso viele andere Stämme von E. coll, wie z.B. HB101, NM522, NM538, NM539, und viele andere Spezies und Gattungen von Prokaryoten eingesetzt werden. Neben den oben aufgeführten E. coli-Stämmen können Bazillen wie z.B. Bacillus subtilis, andere Enterobacteriaceae wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans, und verschiedene Pseudomonas Spezies alle als Wirte eingesetzt werden.
Die Transformation von prokaryotischen Zellen wird unter Anwendung des Calciumchloridverfahrens wie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et aL, supra, beschrieben unschwer erreicht. Alternativ kann Elektroporation (Neumann et al., EMBO J., 1:841 [1982]) zur Transformation dieser Zellen eingesetzt werden. Die transformierten Zellen werden durch Wachstum auf einem Antibiotikum, gewöhnlich Tetracyclin (tet) oder Ampicillin (amp), selektioniert, gegen das sie aufgrund der Anwesenheit von tet- und/oder amp-Resistenzgenen auf dem Vektor resistent gemacht werden.
Nach der Selektion der transformierten Zellen werden diese Zeilen in Kultur gezüchtet und die Plasmid-DNA (oder ein anderer Vektor mit dem inserierten fremden Gen) isoliert. Die Plasmid-DNA kann nach im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert werden. Zwei geeignete Verfahren sind die Präparation von DNA in kleinem Maßstab und die Präparation von DNA in großem Maßstab wie in den Abschnitten 1.25-1.33 von Sambrook et al.&sub1; supra, beschrieben. Die isolierte DNA kann nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden, wie z.B. denjenigen, die im Abschnitt 1.40 von Sambrook etal., supra, beschrieben werden. Diese gereinigte Plasmid-DNA wird dann durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung analysiert. Die DNA-Sequenzierung wird im allgemeinen entweder nach dem Verfahren von Messing et aL, Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] oder nach dem Verfahren von Maxam et aL Meth. Enzymol., 65: 499 [1980] durchgeführt.

IV. Genfusion

Diese Erfindung betrifft die Fusion des Gens, welches für das gewünschte Polypeptid kodiert (Gen 1), mit einem zweiten Gen (Gen 2), so daß während der Transkription ein Fusionsprotein erzeugt wird. Das Gen 2 ist typischerweise ein Hüllproteingen eines Phagen und vorzugsweise das Gen III-Hüllprotein des Phagen M13 oder ein Fragment davon. Die Fusion der Gene 1 und 2 kann erzielt werden, indem das Gen 2 in eine bestimmte Stelle in einem Plasmid inseriert wird, welches das Gen 1 enthält, oder durch die Insertion des Gens 1 in eine bestimmte Stelle in einem Plasmid, welches das Gen 2 enthält.
Die Insertion eines Gens in ein Plasmid erfordert, daß das Plasmid genau an der Stelle geschnitten wird, an der das Gen inseriert werden soll. Somit muß an diesem Ort eine Restriktionsendonuklease-Stelle vorliegen (vorzugsweise eine nur einmal vorkommende Stelle, so daß das Plasmid bei der Restriktionsendonukleaseverdauung nur an einer einzigen Stelle geschnitten wird). Das Plasmid wird verdaut, phosphatasebehandelt und gereinigt wie oben beschrieben. Das Gen wird dann in dieses linearisierte Plasmid durch Zusammenligierung der beiden DNAs inseriert. Die Ligierung kann erreicht werden, wenn die Enden des Plasmids mit den Enden des zu inserierenden Gens kompatibel sind. Falls die zum Schneiden des Plasmids und Isolierung des zu inserierenden Gens verwendeten Restriktionsenzyme glatte Enden erzeugen oder kompatible kohäsive Enden, können die DNAs unter Verwendung eines Ligase wie Baktenophagen-T4-DNA- Ligase und Inkubation der Mischung bei 16ºC für 14 Stunden in Gegenwart von ATP und Ligasepuffer wie beschrieben in Abschnitt 1.68 von Sambrook et al., supra, direkt miteinander ligiert werden. Falls die Enden nicht kompatibel sind, müssen sie zuerst glattendig gemacht werden mit Hilfe des Klenow-Fragments von DNA- Polymerase 1 oder Baktenophagen-T4-DNA-Polymerase, von denen beide die vier Desoxyribonukleosid-Triphosphate benötigen, um überhängende einzelsträngige Enden der verdauten DNA aufzufüllen. Alternativ können die Enden glattendig gemacht werden mit Hilfe einer Nuklease wie Nuklease 51 oder Mungobohnen- Nuklease, von denen beide durch Zurückschneiden der überhängenden DNA- Einzelstränge wirken. Die DNA wird dann unter Verwendung einer Ligase wie oben beschrieben erneut ligiert. In einigen Fällen mag es nicht möglich sein, die Enden des zu inserierenden Gens glattendig zu machen, da der Leserahmen des kodierenden Bereichs geändert würde. Zur Bewältung dieses Problems können Oligonukleotid-Linker verwendet werden. Die Linker dienen als Brücke, um das Plasmid mit dem zu inserierenden Gen zu verbinden. Diese Linker können synthetisch als doppelsträngige oder einzelsträngige DNA mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt werden. Die Linker haben ein Ende, das mit den Enden des zu inserierenden Gens kompatibel ist; die Linker werden zuerst mit diesem Gen unter Anwendung der oben beschriebenen Ligationsverfahren ligiert. Das andere Ende der Linker ist so konstruiert, daß es mit dem Plasmid zur Ligierung kompatibel ist. Bei der Konstruktion der Linker muß sorgfältig darauf geachtet werden, daß der Leserahmen des zu inserierenden Gens oder der Leserahmen des Gens, das auf dem Plasmid enthalten ist, nicht zerstört wird. In einige Fällen kann es erforderlich sein, die Linker so zu konstruieren, daß sie für einen Teil einer Aminosäure kodieren oder daß sie für eine oder mehrere Aminosäuren kodieren.
Zwischen Gen 1 und Gen 2 kann DNA inseriert werden, die für ein Terminationscodon kodiert. Solche Terminationscodons sind UAG (Amber), UM (Ocher) und UGA (Opel). (Microbiology, Davis et al. Harper & Row, New York, 1980, Seiten 237, 24547 und 274). Das Terminationscodon, das in einer Wildtyp- Wirtszelle exprimiert wird, resultiert in der Synthese des Gen 1-Proteinprodukts ohne ein damit verknüpftes Gen 2-Protein. Das Wachstum in einer Supressor-Wirtszelle resultiert jedoch in der Synthese nachweisbarer Mengen des Fusionsproteins. Solche Supressor-Wirtszellen enthalten eine tRNA, die modifiziert ist, um eine Aminosäure in die Terminationscodon-Position der mRNA zu inserieren, wodurch die Produktion nachweisbarer Mengen des Fusionsproteins resultiert. Solche Supressor- Wirtszellen sind wohlbekannt und beschrieben, wie z.B. der E. coli-Supressorstamm (Bullock et al., Biotechniques 5, 376-379 [1987]). Zur Plazierung eines solchen Terminationscodons in die mRNA, welche für das Fusionspolypeptid kodiert, kann jedes akzeptable Verfahren eingesetzt werden.
Das supressierbare Codon kann zwischen dem ersten Gen, welches für ein Polypeptid kodiert, und einem zweiten Gen, welches für mindestens einen Teil eines Phagenhüllproteins kodiert, inseriert werden. Als Alternative kann das supressierbare Terminationscodon neben der Fusionsstelle inseriert werden durch Ersatz des letzten Aminosäuretripletts im Polypeptid oder der ersten Aminosäure im Phagenhüllprotein. Wird das Phagemid, welches das supressierbare Codon enthält, in einer Supressor-Wirtszelle gezüchtet, so resultiert dies in der nachweisbaren Produktion eines Fusionspolypeptids, welches das Polypeptid und das Hüllprotein enthält. Wird das Phagemid in einer Nicht-Supressor-Wirtszelle gezüchtet, so wird das Polypeptid aufgrund der Termination an dem inserierten supressierbaren Triplett, das für UAG, UAA oder UGA kodiert, im wesentlichen ohne Fusion mit dem Phagenhüllprotein synthetisiert. In der Nicht-Supressor-Zelle wird das Polypeptid synthetisiert und aufgrund der Abwesenheit des fusionierten Phagenhüllproteins, welches dieses sonst in der Wirtszelle verankert, aus der Wirtszelle sekretiert.

V. Änderung (Mutation) des Gens 1 an ausgewählten Positionen

Das Gen 1, welches für das gewünschte Polypeptid kodiert, kann an einem oder mehreren ausgewählten Codons geändert werden. Eine Änderung ist definiert als Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Codons in dem Gen, welches für das Polypeptid kodiert, die zu einer Änderung in der Aminosäuresequenz des Polypeptids im Vergleich mit der unveränderten oder nativen Sequenz desselben Polypeptids führt. Vorzugsweise werden die Anderungen durch Substitution mindestens einer Aminosäure durch irgendeine andere Aminosäure in einem oder mehreren Bereich(en) des Moleküls erfolgen. Die Änderungen können mit einer Vielfalt von im Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden. Diese Methoden umfassen Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese und Kassetten-Mutagenese, sind jedoch nicht darauf beschränkt.

A. Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese

Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und lnsertionsvarianten des Gens 1. Diese Technik ist im Stand der Technik wohlbekannt, wie beschrieben von Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 [1987]. Kurz gesagt, wird das Gen 1 verändert durch Hybridisierung eines Oligonukleotids, das für die gewünschte Mutation kodiert, mit einer DNA-Matrize, wobei die Matrize die einzelsträngige Form des Plasmids ist, welche die unveränderte oder native DNA-Sequenz des Gens 1 enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase eingesetzt, um einen vollständigen zweiten komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren, dieser wird so den Oligonukleotid-Primer inkorporiert haben und für die ausgewählte Änderung im Gen 1 kodieren.
Im allgemeinen werden Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 25 Nukleotiden eingesetzt. Ein optimales Oligonukleotid wird 12 bis 15 Nukleotide aufweisen, die vollständig komplementär zu der Matrize auf jeder Seite des oder der Nukleotide(s), welche(s) für die Mutation kodiert(en), sind. Dies stellt sicher, daß das Oligonukleotid richtig mit dem einzelsträngigen DNA-Matrizenmolekül hybridisieren wird. Die Oligonukleotide werden ohne weiteres nach im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie sie z.B. von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978] beschrieben wurden, synthetisiert.
Die DNA-Matrize kann nur von entweder denjenigen Vektoren gebildet werden, welche sich von Baktenophage-M13-Vektoren ableiten (die im Handel erhältlichen Vektoren M13mp18 und M13mp19 sind geeignet), oder denjenigen Vektoren, die einen Einzelstrangphagen-Replikationsursprung enthalten, wie beschrieben von Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 [1987]. So muß die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren inseriert werden, um eine einzelsträngige Matrize zu erzeugen. Die Herstellung der einzelsträngigen Matrize wird in den Abschnitten 4.214.41 von Sambrook et al., supra, beschrieben.
Zur Änderung der nativen DNA-Sequenz wird das Oligonukleotid mit der einzeisträngigen Matrize unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Ein DNA-polymensierendes Enzym, gewöhnlich das Klenow-Fragment von DNA- Polymerase 1, wird dann zugegeben, um den komplementären Strang der Matrize unter Verwendung des Oligonukleotids als Primer für die Synthese zu synthetisieren. Ein Heteroduplex-Molekül wird so gebildet, daß ein Strang der DNA für die mutierte Form des Gens 1 kodiert und der andere Strang (die ursprüngliche Matrize) für die native unveränderte Sequenz des Gens 1 kodiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert, gewöhnlich ein Prokaryot wie z.B. E. coli JM101. Nach Züchtung der Zellen werden sie auf Agaroseplatten ausplattiert und mit Hilfe des mit 32-Phosphat radioaktiv markierten Oligonukleotidprimers gescreent, um die Bakterienkolonien, welche die mutierte DNA enthalten, zu identifizieren.
Das gerade oben beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, daß ein Homoduplex-Molekül erzeugt wird, bei dem beide Stränge des Plasmids die Mutation(en) enthalten. Die Modifikationen sind wie folgt: Das einzelsträngige Oligonukleotid wird mit der einzelsträngigen Matrize wie oben beschrieben verschmolzen. Eine Mischung von drei Desoxyribonukleosiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (DUP) wird mit einem modifizierten Thio-Desoxyribocytosin mit der Bezeichnung dCTP-(aS) (welches von Amersham bezogen werden kann) kombiniert. Diese Mischung wird dem Matrizen- Oligonukleotid-Komplex zugegeben. Nach Zugabe von DNA-Polymerase zu dieser Mischung wird ein DNA-Strang erzeugt, der mit Ausnahme der mutierten Basen identisch mit der Matrize ist. Ferner wird dieser neue DNA-Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP enthalten, was dazu dient, diesen von einer Restriktionsendonukleaseverdauung zu schützen. Nachdem ein Matrizenstrang des doppelsträngigen Heteroduplexes mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten ("nicked") ist, kann der Matrizenstrang mit ExoIII-Nuklease oder mit einer anderen geeigneten Nuklease bis jenseits der Region verdaut werden, welche die zu mutagenisierende(n) Stelle(n) enthält. Die Reaktion wird dann abgebrochen, um ein Molekül zurückzulassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Dann wird ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex gebildet unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxynbonukleosid-Tnphosphate, ATP und DNA-Ligase. Dieses Homoduplex-Molekül kann dann in eine geeignete Wirtszelle, wie z.B. E. coli JM101, wie oben beschrieben transformiert werden.
Mutanten mit mehr als einer zu ersetzenden Aminosäure können auf einem von mehreren Wegen erzeugt werden. Falls die Aminosäure in der Polypeptidkette nahe beieinander liegen, können sie gleichzeitig mit Hilfe eines Oligonukleotids mutiert werden, das für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Liegen die Aminosäuren jedoch in einiger Entfernung voneinander (durch mehr als etwa 10 Aminosäuren getrennt), ist es schwieriger, ein einziges Oligonukleotid zu erzeugen, das für alle gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren eingesetzt werden.
Bei dem ersten Verfahren wird ein separates Oligonukleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonukleotide werden dann gleichzeitig mit der einzelsträngigen Matrizen-DNA verschmolzen und der zweite DNA-Strang, der von der Matrize synthetisiert wird, wird für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodieren. Das alternative Verfahren beinhaltet zwei oder mehr Mutagenesedurchgänge, um die gewünschte Mutante zu erzeugen. Der erste Durchgang ist wie für die Einzelmutanten beschrieben: Wildtyp-DNA wird als Matrize eingesetzt, ein Oligonukleotid, das für die erste(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodiert, wird mit dieser Matrize verschmolzen und dann das Heteroduplex-DNA-Molekül erzeugt. Der zweite Mutagenesedurchgang verwendet die mutierte DNA, die im ersten Mutagenesedurchgang erzeugt wurde, als Matrize. So enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutation(en). Das Oligonukleotid, welches für die zusätzlich gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodiert, wird dann mit dieser Matrize verschmolzen und der resultierende DNA-Strang kodiert nun für Mutationen sowohl des ersten als auch des zweiten Mutagenesedurchgangs. Die resultierende DNA kann als Matrize in einem dritten Mutagenesedurchgang verwendet werden, usw.

B. Kassetten-Mutagenese

Dieses Verfahren ist auch ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten des Gens 1. Das Verfahren beruht auf dem von Wells et al, Gene, 34:315 [1985], beschriebenen Verfahren.
Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder der andere Vektor), welches(r) das Gen 1, das zu mutierende Gen, umfaßt. Das oder die Codons im Gen 1, welche(s) mutiert werden soll(en), wird bzw. werden identifiziert. Es muß eine nur einmal vorkommende Restriktionsendonukleasestelle auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) vorliegen. Falls keine solchen Restriktionsstellen vorhanden sind, können sie unter Anwendung des oben beschriebenen Oligonukleotid-vermittelten Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an geeigneten Stellen in das Gen 1 einzuführen. Nach der Einführung der Restriktionsstellen in das Plasmid wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppeisträngiges Oligonukleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, jedoch die gewünschte Mutation(en) enthält, wird nach Standardverfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden separat synthetisiert und dann unter Anwendung von Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppeisträngige Oligonukleotid wird als die Kassette bezeichnet. Diese Kassette wird so konstruiert, daß sie 3'- und 5'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so daß sie direkt mit dem Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte DNA-Sequenz von Gen 1.

VI. Gewinnung von DNA, die für das gewünschte Protein kodiert

In einer alternativen Ausführungsform betrifllt diese Erfindung die Produktion von Varianten eines gewünschten Proteins, das eine oder mehrere Untereinheiten enthält. Jede Untereinheit wird typischerweise von einem separaten Gen kodiert. Jedes Gen, das für jede einzelne Untereinheit kodiert, kann nach im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (siehe beispielsweise Abschnitt II). In einigen Fällen kann es erforderlich sein, das Gen, welches für die verschiedenen Untereinheiten kodiert, mit Hilfe von separaten Techniken zu erhalten, die aus irgendwelchen der in Abschnitt II beschriebenen Verfahren ausgewählt sind.
Bei der Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, wobei das interessierende Protein mehr als eine Untereinheit enthält, können alle Untereinheiten von demselben Promotor, der typischerweise 5' von der für die Untereinheiten kodierenden DNA lokalisiert ist, reguliert werden oder eine jede kann von einem separaten Promotor reguliert werden, der in dem Vektor geeignet orientiert ist, so daß jeder Promotor funktionsfähig mit der zu regulierenden DNA verknüpft ist. Die Auswahl von Promotoren erfolgt wie in Abschnitt III oben beschrieben.
Hinsichtlich der Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, der die DNA enthält, welche für das interessierende Protein mit mehreren Untereinheiten kodiert, wird der Leser auf Figur 10 verwiesen, wo zur Illustration ein Vektor als Diagramm dargestellt ist, das die DNA zeigt, die für jede Untereinheit eines Antikörperfragments kodiert. Diese Figur zeigt, daß im allgemeinen eine der Untereinheiten des interessierenden Proteins mit einem Phagenhüll protein wie dem M13-Gen III fusioniert sein wird. Diese Genfusion wird im allgemeinen ihre eigene Signalsequenz enthalten. Ein separates Gen kodiert für die andere Untereinheit oder die Untereinheiten und es ist offensichtlich, daß jede Untereinheit im allgemeinen ihre eigene Signalsequenz aufweist. Figur 10 zeigt auch, daß ein einziger Promotor die Expression beider Untereinheiten regulieren kann. Alternativ kann jede Untereinheit unabhängig von einem anderen Promotor reguliert werden. Das Konstrukt der Untereinheit des interessierenden Proteins und des Phagenhüllproteins kann wie in Abschnitt IV oben beschrieben hergestellt werden.
Bei der Konstruktion einer Familie von Varianten des gewünschten Multiein heiten-Proteins kann die DNA, die für jede Untereinheit in dem Vektor kodiert, an einer oder mehreren Positionen in jeder Untereinheit mutiert werden. Wenn Multieinheiten-Antikörpervarianten konstruiert werden, entsprechen bevorzugte Mutagenesestellen den Codons, welche für Aminosäurereste kodieren, die in den Komplementäritäts-bestimmenden Regionen (CDR) der leichten Kette, der schweren Kette oder beider Ketten lokalisiert sind. Die CDR werden üblicherweise als hypervariable Regionen bezeichnet. Verfahren zur Mutagenisierung der DNA, die für jede Untereinheit des interessierenden Proteins kodiert, werden im wesentlichen wie in Abschnitt V oben beschrieben durchgeführt.

VII. Herstellung eines Target-Moleküls und Bindung an Phagemid

Target-Proteine, z.B. Rezeptoren, können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder mittels rekombinanter Methoden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können Glykoprotein-Hormonrezep toren nach dem von Macfarland ot al., Science 245:494499 (1989] beschriebenen Verfahren hergestellt werden, nicht glykosylierte, in E. coli exprimierte Formen werden von Fuh et aL, J. Biol. Chem. 265:3111-3115 [1990] beschrieben. Andere Rezeptoren können nach Standardverfahren hergestellt werden.
Das gereinigte Target-Protein kann mit einer geeigneten Matrix wie Agaroseperlen, Acrylamidperlen, Glasperlen, Cellulose, verschiedenen Acryl-Copolymeren, Hydroxyalkylmethacrylat-Gelen, Polyacryl- und Polymethacryl-Copolymeren, Nylon, neutralen und ionischen Trägern und dgl. verknüpft werden. Die Verknüpfung des Target-Proteins mit der Matrix kann nach Verfahren erreicht werden, die in Methods in Enzymology. 44 [1976] beschrieben werden, oder durch andere im Stand der Technik bekannten Mittel.
Nach der Verknüpfung des Target-Proteins mit der Matrix wird das immobilisierte Target mit der Bank von Phagemid-Partikeln unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht, um mindestens einen Teil der Phagemid-Partikel an das immobilisierte Target zu binden. Norrnalerweise werden die Bedingungen, einschließlich pH, Ionenstärke, Temperatur und dgl., physiologische Bedingungen nachahmen.
Gebundene Phagemid-Partikel ("Binder"), die eine hohe Affinität für das immobilisierte Target aufweisen, werden von denjenigen mit niedriger Affinität (und denjenigen, die nicht an das Target binden) durch Waschen abgetrennt. Binder können von dem immobilisierten Target auf vielfältige Weise dissoziiert werden. Diese Verfahren umfassen konkurrierende Dissoziation unter Verwendung des Wildtyp-Liganden, Änderung des pH und/oder der Ionenstärke, und im Stand der Technik bekannte Verfahren.
Geeignete Wirtszellen werden mit den Bindern und Helferphagen infiziert und die Wirtszellen werden unter geeigneten Bedingungen zur Amplifizierung der Phagemid-Partikel kultiviert. Die Phagemid-Partikel werden dann gewonnen und der Selektionsprozeß ein oder mehrere Male wiederholt, bis Binder mit der gewünschten Affinität für das Target-Molekül selektioniert sind.
Optional kann die Bank von Phagemid-Partikeln nacheinander mit mehr als einem immobilisierten Target in Kontakt gebracht werden, um die Selektivität für ein bestimmtes Target zu verbessern. Beispielsweise ist es oft der Fall, daß ein Ligand wie hGH mehr als einen natürlichen Rezeptor besitzt. Im Falle von hGH binden sowohl der Wachstumshormon-Rezeptor als auch der Prolaktin-Rezeptor den hGH- Liganden. Es kann wünschenswert sein, die Selektivität von hGH für den Wachstumshormon-Rezeptor gegenüber dem Prolaktin-Rezeptor zu verbessern. Dies kann erzielt werden, indem zuerst die Bank von Phagemid-Partikeln mit immobilisiertem Prolaktin-Rezeptor in Kontakt gebracht wird, diejenigen mit einer niedrigen Affinität (d.h. niedriger als Wildtyp-hGH) für den Prolaktin-Rezeptor eluiert werden und dann die Prolaktin-"Binder" oder Nicht-Binder mit dem immobilisierten Wachstumshormon-Rezeptor in Kontakt gebracht werden und auf Wachstumshormon-Rezeptor-Binder mit hoher Affinität selektioniert wird. In diesem Fall würde eine hGH-Mutante mit niedrigerer Affinität für den Prolaktin-Rezeptor von therapeutischem Nutzen sein, selbst wenn die Affinität für den Wachstumshormon- Rezeptor etwas geringer wäre als diejenige des Wildtyp-hGH. Dieselbe Strategie kann eingesetzt werden, um die Selektivität eines bestimmten Hormons oder Proteins für dessen primären Funktionsrezeptor gegenüber dessen "Clearance"- Rezeptor zu erhöhen.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann eine verbesserte Substrat-Aminosäuresequenz erhalten werden. Diese kann nützlich sein, um bessere "Schnittstellen" für Protein-Linker herzustellen, oder für bessere Protease- Substrate/Inhibitoren. In dieser Ausführungsform wird ein immobilisierbares Molekül (z.B. hGH-Rezeptor, Biotin-Avidin oder eines, das zur kovalenten Verknüpfung mit einer Matriz imstande ist) mit dem Gen III über einen Linker fusioniert. Der Linker wird vorzugsweise eine Länge von 3 bis 10 Aminosäuren aufweisen und als Substrat für eine Protease dienen. Ein Phagemid wird wie oben beschrieben konstruiert werden, bei dem die DNA, welche für die Linker-Region kodiert, statistisch mutiert wird, um eine randomisierte Bank von Phagemid-Partikeln mit verschiedenen Aminosäuresequenzen an der Verknüpfungsstelle zu erzeugen. Die Bank von Phagemid-Partikeln wird dann auf einer Matrix immobilisiert und einer gewünschten Protease ausgesetzt. Phagemid-Partikel, die bevorzugte oder bessere Substrat- Aminosäuresequenzen in der Linker-Region für die gewünschte Protease aufweisen, werden eluiert werden und zuerst einen angereicherten Pool von Phagemid- Partikeln, die für bevorzugte Linker kodieren, bilden. Diese Phagemid-Partikel werden dann mehreren weiteren Zyklen unterworfen, um einen angereicherten Pool von Partikeln zu erzeugen, die für (eine) Konsensus-Sequenz(en) kodieren (siehe Beispiele XIII und XIV).

VIII. Wachstumshormonvarianten und Verwendungsverfahren

Das klonierte Gen für hGH wurde in sekretierter Form in Escherichia coli (Chang, C. N., et al. [1987] Gene 55, 189) exprimiert und dessen DNA- und Aminosäuresequenz mitgeteilt (Goeddel et al. [1979] Nature 281, 544; Gray et al. [1985] Gene 39, 247). Die vorliegende Erfindung beschreibt neue hGH-Varianten, die mit Hilfe der Phagemid-Selektionsverfahren erzeugt wurden. Es wurden Humanwachstumshormonvarianten beschrieben, die Substitutionen an den Positionen 10, 14, 18, 21, 167, 171, 172, 174, 175, 176, 178 und 179 enthalten. Diejenigen mit höheren Bindungsaffinitäten werden in den Tabellen VII, XIII und XIV beschrieben. Die Aminosäure-Nomenklatur zur Beschreibung der Varianten ist unten dargestellt. Wachstumshormonvananten können auf dieselbe Weise wie das reguläre Wachstumshormon verabreicht und formuliert werden. Die Wachstumshormonvarianten der vorliegenden Erfindung können in jedem rekombinanten System exprimiert werden, das zur Expression von nativem oder met-hGH imstande ist.
Therapeutische Formulierungen von hGH zur therapeutischen Verabreichung werden für die Lagerung vorbereitet durch Mischen von hGH mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, Osol, A., Hrsg. (1980)) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder wäßriger Lösungen. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; zweiwertige Metallionen wie Zink, Kobalt oder Kupfer; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie Natrium; und/oder nicht-ionische Tenside wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglycol (PEG). Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können ferner ein(en,e) pharmazeutisch annehmbare(n,s) Puffer, Aminosäure, Füllmittel und/oder nicht-ionisches Tensid enthalten. Diese umfassen beispielsweise Puffer, Chelatbildner, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Cosolventien und dgl.; spezifische Beispiele davon könnten Trimethylaminsalze ("Tris-Puffer") und Dinatriumedetat umfassen. Die Phagemide der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um Mengen der hGH-Varianten ohne das Phagenprotein zu erzeugen. Zur Expression von hGH-Varianten, die von dem Gen III-Abschnitt der Fusion frei sind, können pS0643 und dessen Derivate einfach in einem Nicht- Supressor-Stamm wie 16C9 gezüchtet werden. In diesem Fall führt das Amber- Codon (TAG) zur Termination der Translation, welche freies Hormon ohne das Erfordernis einer unabhängigen DNA-Konstruktion ergibt. Die hGH-Variante wird vom Wirt ausgeschieden und kann aus dem Kulturmedium isoliert werden.
Eine oder mehrere der acht hGH-Aminosäuren F10, M14, H18, H21, R167, D171, T175 und I179 können durch irgendeine andere Aminosäure als der in dieser Position bei natürlich vorkommendem hGH gefundenen wie angezeigt ersetzt werden. Deswegen können 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder alle 8 der angegebenen Aminosäuren, F10, M14, H18, H21, R167, D171, T175 und I179, durch irgendeine der anderen 19 Aminosäuren aus der unten aufgeführten Liste von 20 Aminosäuren ersetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden alle acht aufgeführten Aminosäuren durch eine andere Aminosäure ersetzt. Die zur Substitution am meisten bevorzugten acht Aminosäuren sind in Tabelle XIV in Beispiel XII angegeben.

Aminosäure-Nomenklatur

Ala (A)
Arg (R)
Asn (N)
Asp (D)
Cys (C)
GlN (Q)
Glu (E)
Gly(G)
His (H)
Ile (I)
Leu (L)
Lys (K)
Met (M)
Phe (F)
Pro (P)
Ser (S)
Thr(T)
Trp (W)
Tyr (Y)
Val (V)
Die einbuchstabige hGH-Varianten-Nomenklatur gibt zuerst die deletierte hGH- Aminosäure an, z.B. Glutamat 179, dann die inserierte Aminosäure, z.B. Serin, was zu (E179S) führt.

BEISPIELE

Es wird davon ausgegangen, daß ein Durchschnittsfachmann mit Hilfe der vorstehenden Beschreibung und illustrativen Beispiele ohne eine weitergehende Beschreibung die vorliegEnde Erfindung In vollstem Umfang ausführen und einsetzen kann. Die folgenden Arbeitsbeispiele betonen deshalb speziell bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sind nicht in irgendeiner Weise als Beschränkung der restlichen Offenbarung anzusehen.

BEISPIEL 1

Plasmidkonstruktionen und Herstellung von hGH-Phagemid-Partikeln

Das Plasmid phGH-M13GIII (Fig. 1) wurde aus M13KO7&sup7; und dem hGH- produzierenden Plasmid pBO473 (Cunningham, B.C., et al., Science, 243:1330-1336 [1989]) konstruiert. Ein synthetisches Oligonukleotid, 5'-AGC-TGT-GGC-UC-GGG- CCC-UA-GCA-TTT-AAT-GCG-GTA-3' wurde verwendet zur Einführung einer nur einmal vorkommenden ApaI-Restriktionsstelle (unterstrichen) in pBO473 nach dem letzten Phe191-Codon von hGH. Das Oligonukleotid 5'-TTC-ACA-AAC-GAA-GGG- CCC-CTA-ATT-AAA-GCC-AGA-3' wurde eingesetzt zur Einführung einer nur einmal vorkommenden Apal-Restrjktionsstelle (unterstrichen) und eines Glu 197-zu-Amber- Stopcodons (Fettdruck) in das M13KO7-Gen III. Das Oligonukleotid 5'-CAA-TAA- TAA-CGG-GCT-AGC-CAA-AAG-AAC-TGG-3' führt eine nur einmal vorkommende NheI-Stelle (unterstrichen) nach dem 3'-Ende der für Gen III kodierenden Sequenz ein. Das resultierende ApaI-NheI-Fragment von 650 Basenpaaren (bp) aus dem doppelmutierten M13KO7-Gen III wurde in das große ApaI-NheI-Fragment von pBO473 kloniert, um das Plasmid pSO132 zu erzeugen. Dies fusioniert den Carboxyterminus von hGH (Phe191) mit dem Pro198-Rest des Gen III-Proteins unter Insertion eines Glycinrests, der von der ApaI-Stelle kodiert wird, und bringt das Fusionsprotein unter die Kontrolle des alkalische Phosphatase (phoa)- E. coli- Promotors und der stII-Sekretionssignalsequenz (Chang, C.N., et al., Gene, 55:189- 196, [1987]). Zur induzierbaren Expression des Fusionsproteins in reichen Medien ersetzten wir den phoa-Promotor durch den lac-Promotor und -Operator. Ein 138 bp- EcoRI-XbaI-Fragment, enthaltend den lac-Promotor, -Operator und die Cap- Bindungsstelle, wurde durch PCR des Plasmids pUC119 erzeugt unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-CACGACAGAATTCCCGACTGGAAA-3' und 5'-CTGTT TCTAGAGTGAAAUGTTA-3', welche die gewünschten lac-Sequenzen flankieren und die EcoRI und XbaI-Restriktionsstellen (unterstrichen) einführen. Dieses lac- Fragment wurde gelgereinigt und in das große EcoRI-XbaI-Fragment von pSO132 ligiert, um das Plasmid phGH-Ml3glll zu erzeugen. Die Sequenzen aller angepassten DNA-Verbindungsstellen wurden durch das Didesoxy-Sequen zierungsverfahren (Sanger, F., et aL Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, [1977]) verifiziert. Das R64A-Varianten-hGH-Phagemid wurde wie folgt konstruiert: das NsiI-Bg/II-mutierte Fragment von hGH (Cunnigham et al., supra), kodierend für die Substitution von Arg64 zu Ala (R64A) (Cunningham, B.C., Wells, J.A., Science, 244:1081-1085, [1989]), wurde zwischen die korrespondierenden Restriktionsstellen in dem Plasmid phGH-M13gIII kloniert (Fig. 1), um die Wildtyp-hGH-Sequenz zu ersetzen. Die R64A-hGH-Phagemid-Partikel wurden vermehrt und titriert wie unten für das Wildtyp-hGH-Phagemid beschrieben.
Mit den Plasmiden wurde ein männlicher Stamm von E. coli (JM101) transformiert und auf Carbenicillin-Platten selektioniert. Eine einzelne Transformante wurde in 2 ml 2YT-Medium 4 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet und mit 50 ul M13KO7-Helferphagen infiziert. Die infizierte Kultur wurde in 30 ml 2YT verdünnt, über Nacht gezüchtet und Phagemid-Partikel durch Fällung mit Polyethylenglykol (Vierra, J., Messing, J., Methods in Enzymology, 153:3-11, [1987]) gewonnen. Typische Phagernid-Partikel-Titer lagen im Bereich von 2 bis 5x10¹¹ cfu/ml. Die Partikel wurden durch CSCI-Dichtezentrifugation (Day, L.A., J. Mol. Biol., 29:265-277, (1969]) bis zur Homogenität gereinigt, um jegliches nicht mit Virionen verknüpfte Fusionsprotein zu entfernen.

BEISPIEL II

Immunchemische Analysen von hGH auf dem Fusionsphagen

Polyklonale Kaninchenantikörper gegen hGH wurden mit Protein A gereinigt und dann damit Mikrotiterplatten (Nunc) in einer Konzentration von 2 ug/ml in 50 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 10) 16-20 Stunden lang bei 4ºC beschichtet. Nach einem Waschschritt in PBS mit 0,05% Tween 20 wurden hGH oder hGH-Phagemid-Partikel von 2,0-0,002 nM im Puffer A (50 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 5 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,05% Tween 20) reihenverdünnt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) wurden die Platten gut gewaschen und der angezeigte Mab (Cunningham et al., supra) mit 1 ug/ml im Puffer A 2 Stunden lang bei RT zugegeben. Nach dem Waschen wurde Meerrettichperoxidase-konjugierter Anti- Maus-IgG-Ziegenantikörper 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gebunden. Nach einem letzten Waschschritt wurde die Peroxidaseaktivität mit dem Substrat o-Phenylendiamin nachgewiesen.

BEISPIEL III

Kopplung des hGH-bindenden Proteins an Polyacrylamidperlen und Bindungsanreicherungen

Oxiran-Polyacrylamidperlen (Sigma) wurden mit der gereinigten extrazellulären Domäne des hGH-Rezeptors (hGHbp) (Fuh, G., et al., J. Biol. Chem., 265:3111-3115 [1990]) konjugiert, die einen zusätzlichen Cysteinrest enthielt, der durch stellengerichtete Mutagenese an Position 237 eingeführt worden war und die Bindung von hGH nicht beeinflußt (J. Wells, unveröffentlicht). Das hGHbp wurde wie vom Hersteller empfohlen bei einem Niveau von 1,7 pMol hGHbp/mg trockener Oxiranperlen konjugiert, wie gemessen durch Bindung von [¹²&sup5;I]-hGH an das Harz. Anschließend wurden etwaige nicht umgesetzte Oxirangruppen mit BSA und Tris blockiert. Als Kontrolle bezüglich nicht-spezifischer Bindung von Phagemid-Partikeln wurde BSA auf ähnliche Weise an die Perlen gekoppelt. Der Puffer zur Adsorption und zum Waschen enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mg/ml BSA und 0,02% Tween 20. Die Elutionspuffer enthielten Waschpuffer plus 200 nM hGH oder 0,2 M Glycin (pH 2,1). Der Stammphage M13KO7 wurde mit hGH- Phagemid-Partikeln in einem Verhältnis von nahezu 3000:1 (ursprüngliche Mischung) gemischt und 8-12 Stunden lang mit einem 5 ul-Aliquot (0,2 mg Acrylamidperlen) eines jeden Absorbens in einem 50 ul-Volumen bei Raumtemperatur über-Kopf-geschüttelt. Die Perlen wurden durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand sorgfältig entfernt. Die Perlen wurden in 200 ul Waschpuffer resuspendiert und bei Raumtemperatur 4 Stunden über-Kopfgeschüttelt (Waschschritt 1). Nach einem zweiten Waschschritt (Waschschritt 2) wurden die Perlen zweimal mit 200 nM hGH für jeweils 6-10 Stunden eluiert (Eluat 1, Eluat 2). Die letzte Elution erfolgte mit einem Glycinpuffer (pH 2,1) für 4 Stunden, um verbleibende hGH-Phagemid-Partikel zu entfernen (Eluat 3). Jede Fraktion wurde geeignet in 2YT-Medium verdünnt, mit frischem JM101 gemischt, 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und mit 3 ml 2YT-Weichagar auf LB- oder LB-Carbenicillin-Platten ausplattiert.

BEISPIEL IV

Konstruktion von hGH-Phagemid-Partikeln mit einer Mischung von Gen III-Produkten

Das Gen III-Protein ist aus 410 Resten aufgebaut, die in zwei Domänen aufgeteilt sind, welche von einer flexiblen Linker-Sequenz getrennt werden (Armstrong, J., et al., FEBS Lett.,135:167-172, [1981]). Die aminoterminale Domäne ist erforderlich zur Anhaftung an die Pih von E. coli, während die carboxyterminale Domäne in die Phagenhülle eingebettet ist und für den korrekten Phagenzusammenbau erforderlich ist (Crissman, J.W., Smith, G.P., Virology, 132:445455 [1984]). Die Signalsequenz und aminoterminale Domäne des Gens III wurde von dem stII-Signal und dem vollständigen hGH-Gen (Chang et aL, supra) ersetzt durch Fusion mit dem Rest 198 in der carboxyterminalen Domäne des Gens III (Fig. 1). Die hGH-Gen III-Fusion wurde unter die Kontrolle des lac- Promotor/Operators in einem Plasmid gestellt (pHGH-M13gIII; Fig. 1), welches das pBR322-β-Lactamasegen und den Col E1-Replikationsursprung und die intergene Region des Phagen f1 enthält. Der Vektor kann leicht als kleiner Plasmidvektor durch Selektion auf Carbenicillin aufrechterhalten werden, wodurch vermieden wird, daß man zur Vermehrung auf eine funktionelle Gen III-Fusion angewiesen ist. Alternativ kann das Plasmid effizient in Virionen (genannt Phagemid-Partikel) durch Infektion mit Helferphagen wie M13KO7 (Viera et al., supra) verpackt werden, was Probleme beim Phagenzusammenbau vermeidet. Die Phagemid-Infektivitätstiter, auf Basis der Transduktion zu Carbenicillinresistenz in diesem System, variierten von 2- 5 × 10¹¹ Kolonie-bildenden Einheiten (cfu)/ml. Der Titer der M13KO7-Helferphagen in diesen Phagemid-Stammlösungen beträgt etwa 1010 Plaque-bildende Einheiten (pfu)/ml.
Mit diesem System bestätigten wir frühere Studien (Parmley, Smith, supra), daß die homogene Expression von großen Proteinen in Fusion mit Gen III für die Phagenproduktion schädlich ist (Daten nicht gezeigt). Beispielsweise ergab die Induktion des lac-Promotors in phGH-M13gIII durch Zugabe von IPTG niedrige Phagemid-Titer. Darüber hinaus ergaben Phagemid-Partikel, die durch Coinfektion mit M13KO7, die eine Amber-Mutation im Gen III enthielten, erzeugt worden waren, sehr niedrige Phagemid-Titer (< 10¹&sup0; cfu/ml). wir nahmen an, daß mehrfache Kopien der Gen III-Fusion, verknüpft mit der Phagemid-Oberfläche, zu einer Mehrpunktverknüpfung (dem "Chelat-Effekt") des Fusionsphagen mit dem immobilisierten Target-Protein führen könnte. Um die Kopienzahl des Fusionsproteins zu steuern, beschränkten wir die Transkription der hGH-Gen III-Fusion deshalb durch Züchtung des Plasmids in E. coli JM101 (lacIQ), das ein konstitutiv hohes Niveau des lac- Repressorproteins enthält. Die E. coli JM 101-Kulturen, enthaltend phGH-M13gIII, wurden am besten vermehrt und mit M13O7 infiziert in Abwesenheit des lac- Operon-lnducers (IPTG); dieses System ist jedoch flexibel, so daß eine Coexpression anderer Gen III-Fusionsproteine ausgeglichen werden kann. Wir schätzen aus dem Verhältnis der Menge von hGH pro Virion (basierend auf hGH- immunreaktivem Material in CsCl-G radienten-gereinigtem Phagemid), daß etwa 10% der Phagemid-Partikel eine Kopie des hGH-Gen III-Fusionsproteins enthalten. Deshalb beträgt der Titer von Fusionsphagen, welche die hGH-Gen III-Fusion präsentieren, etwa 2 - 5 × 10¹&sup0;/ml. Diese Zahl ist wesentlich größer als der Titer von E. coli ( 108 - 10&sup9;/ml) in der Kultur, von der sie stammen. Somit erzeugt im Durchschnitt jede E. coli-Zelle 10 - 100 Kopien von Phagen, die mit einem hGH-Gen III-Fusionsprotein ausgestattet sind.

BEISPIEL V

Strukturelle Integrität der hGH-Gen III-Fusion

Die Immunoblot-Analyse (Fig. 2) des hGH-Gen III-Phagemids zeigt, daß hGH- kreuzreaktives Material in Agarosegelen zusammen mit Phagemid-Partikeln wandert. Dies zeigt an, daß das hGH eng mit Phagemid-Partikeln assoziiert ist. Das hGH-Gen III-Fusionsprotein aus den Phagemid-Partikeln läuft als einzelne immungefärbte Bande, was anzeigt, daß wenig Abbau des hGH stattfindet, wenn es mit dem Gen III verknüpft ist. Wildtyp-Gen III-Protein ist eindeutig vorhanden, da etwa 25% der Phagemid-Partikel infektiös sind. Dies ist vergleichbar mit Schätzungen der spezifischen Infektivität, die für Wildtyp M13-Phagen angestellt wurden, welche auf ähnliche Weise (durch CsCl-Dichtegradienten) gereinigt worden sind, und mit den durch UV-Extinktion bestimmten Konzentrationen (Smith, G.P., supra, und Parmley, Smith, supra). Somit werden sowohl Wildtyp-Gen III als auch die hGH-Gen III- Fusionsproteine im Phagenpool präsentiert.
Es war wichtig zu bestätigen, daß die Tertiärstruktur des präsentierten hGH beibehalten wurde, um darauf vertrauen zu können, daß die Ergebnisse aus den Bindungsselektionen auf das native Protein zu übertragen sind. Wir verwendeten monoklonale Antikörper (Mab) gegen hGH, um die strukturelle Integrität des präsentierten hGH Gen III-Fusionsproteins zu bewerten (Tabelle I).

TABELLE I. Bindung acht verschiedener monoklonaler Antikörper (Mab) an hGH und hGH-Phagemid-Partikel*

*Die angegebenen Werte repräsentieren die Konzentration (nM) von hGH oder hGH- Phagemid-Partikel, die eine halbmaximale Bindung an die speziellen Mab ergibt. Die Standardfehler in diesen Messungen liegen typischerweise bei oder unter ±30% des angegebenen Werts. Siehe Materialien und Methoden bezüglich weiterer Details.
Die Epitope für diese Mab auf hGH wurden kartiert (Cunningham et al., supra) und die Bindung von 7 der 8 Mab erfordert, daß hGH richtig gefaltet ist. Die IC&sub5;&sub0;- Werte für alle Mab waren dem Wildtyp-hGH äquivalent, mit Ausnahme von Mab 5 und 6. Mab 5 und 6 sind beide bekannt dafür, daß sie Bindungsdeterminanten in der Nähe des Carboxyterminus von hGH besitzen, welcher im Gen III-Fusionsprotein blockiert ist. Der relative IC&sub5;&sub0;Wert für Mab 1, der sowohl mit nativem als auch denaturiertem hGH reagiert, ist unverändert im Vergleich zu den konformationssensitiven Mab 2-5, 7 und 8. So dient Mab 1 als gute interne Kontrolle für etwaige Fehler bei der Zuordnung der Konzentration des hGH-Standards zu derjenigen der hGH-Gen III-Fusion.

BEISPIEL VI

Bindungsanreicherungen auf Rezeptoraffinitäts-Perlen

Frühere Forscher (Parmley, Smith, supra; Scott, Smith, supra; Cwirla et al., supra; und Devlin et aL, supra) haben Phagen fraktioniert durch Selektionierung mittels Streptavidin-beschichteter Polystyrol-Petrischalen oder Mikrotiterplatten. Chromatographische Systeme würden jedoch eine effizientere Fraktionierung von Phagemid-Partikeln, die Mutantenproteine mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten präsentieren, erlauben. Wir wählten nicht-poröse Oxiran-Perlen (Sigma), um ein Einfangen von Phagemid-Partikeln in dem Chromatographieharz zu vermeiden. Ferner besitzen diese Perlen eine kleine Partikelgröße (1 um), um das Verhältnis von Oberfläche zu Masse zu maximieren. Die extrazelluläre Domäne des hGH- Rezeptors (hGHbp) (Fuh et al., supra), enthaltend einen freien Cysteinrest, wurde effizient an diese Perlen gekoppelt und die Phagemid-Partikel zeigten sehr geringe nicht spezifische Bindung an Perlen, die nur an Rinderserumalbumin gekoppelt waren (Tabelle II). TABELLE II. Spezifische Bindung von Hormon-Phagen an hGHbp-beschichtete Perlen ergibt eine Anreicherung der hGH-Phagen gegenüber den M13KO7-Phagen*
* Die Titer der M13KO7- und hGH-Phagemid-Partikel in jeder Fraktion wurden bestimmt durch Multiplikation der Anzahl von Plaque-bildenden Einheiten (pfu) bzw. von carbenicillinresistenten Kolonien-bildendep Einheiten (cfu) mit dem Verdünnungsfaktor. Siehe Beispiel IV bezüglich Details.
Das Verhältnis der M13KO7- zu den hGH-Phagemid-Partikeln wurde in der ursprünglichen Mischung auf 3000:1 eingestellt.
Die Absorbentien wurden mit BSA oder hGHbp konjugiert.
§ Die Anreicherungen wurden berechnet durch Division des cfu/pfu-Verhältnisses nach jedem Schritt durch das cfu/pfu-Verhältnis in der ursprünglichen Mischung.
In einem typischen Anreicherungsexperiment (Tabelle II) wurde ein Teil hGH- Phagemid mit > 3000 Teilen M13KO7-Phagen gemischt. Nach einem Zyklus von Bindung und Elution wurden 106 Phagen gewonnen und das Verhältnis von Phagemid zu M13KO7-Phagen betrug 2:1. Somit ergab ein einziger Bindungs selektionsschritt > 5000fache Anreicherung. Zusätzliche Elutionen mit freiem hGH oder Säurebehandlung zur Entfernung verbleibender Phagemide ergaben sogar noch größere Anreicherungen. Die Anreicherungen sind vergleichbar mit denjenigen, welche von Smith und Mitarbeitern unter Anwendung diskontinuierlicher Elution von beschichteten Polystyrolplatten (Smith, G.P., supra, und Parmley, Smith, supra) erhalten worden waren, bei den Perlen werden jedoch viel kleinere Volumina eingesetzt (200 ul gegenüber 6 ml). Bei Verwendung von Perlen, die nur mit BSA verknüpft waren, gab es fast keine Anreicherung des hGH-Phagemids gegenüber M13KO7. Die leichte Anreicherung, die bei Kontrollperlen ( 10fach für die Elution bei pH 2,1; Tabelle 2) beobachtet wurde, könnte herrühren von Spurenverunreinigungen von Rinderwachstumshormon-bindendem Protein, das in dem mit den Perlen verknüpften BSA vorhanden ist. Nichtsdestoweniger zeigen diese Daten, daß die Anreicherungen der hGH-Phagen von der Anwesenheit des hGHbp auf der Perle abhängen, was nahelegt, daß die Bindung durch spezifische Wechselwirkung zwischen hGH und dem hGHbp geschieht.
Wir bestimmten die Anreicherung für Wildtyp-hGH gegenüber einer schwächer bindenden Variante des hGH auf Fusions-Phagemiden, um weiter eine Anreicherungsspezifität zu demonstrieren und um die Herabsetzung der Bindungsaffinität für die gereinigten Hormone mit Anreicherungsfaktoren nach der Selektionierung von Fusions-Phagemiden in Verbindung zu bringen. Es wurde ein Fusions-Phagemid mit einer hGH-Mutante konstruiert, in der Arg64 durch Ala ersetzt war (R64A). Das R64A-Variantenhormon besitzt eine etwa 20fach verringerte Rezeptorbindungsaffinität im Vergleich zu hGH (Kd-Werte von 7,1 nM bzw. 0,34 nM [Cunningham, Wells, supra]). Die Titer des R64A-hGH-Gen III-Fusions-Phagemids waren vergleichbar mit denjenigen des Wildtyp-hGH-Phagemids. Nach einem Durchgang von Bindung und Elution (Tabelle III) wurde das Wildtyp-hGH-Phagemid aus einer Mischung der beiden Phagemide plus M13KO7 um das 8fache angereichert im Vergleich zum Phagemid R64A und 10&sup4; im Verhältnis zu M13KO7-Helferphagen. TABELLE III. hGHbp-beschichtete Perlen selektionieren auf hGH-Phagemide gegenüber einem schwächer bindenden hGH-Varianten-Phagemid
* Die M13KO7-Stammphagen-, Wildtyp-hGH-Phagemid und R64A-Phagemid-Partikel wurden in einem Verhältnis von 10&sup4;:0,4:0,6 gemischt. Die Bindungsselektionen erfolgten unter Verwendung von Perlen, die mit BSA (Kontrollperlen) oder mit dem hGHbp (hGHbp Perlen) verknüpft waren, wie in Tabelle II und den Materialien und Methoden beschrieben. Nach jedem Schritt wurde aus carbenicillinresistenten Kolonien Plasmid-DNA isoliert (Birnboim, H.C., Doly, J., Nucleic Acids Res., 7:1513-1523, [1979]) und mittels Restriktionsanalyse analysiert, um zu bestimmen, ob sie das Wildtyp-hGH oder die R64A- hGH-Gen III-Fusion enthielt.
Die Anreicherung von wildtyp-hGH-Phagemid gegenüber der R64A-Mutante wurde berechnet aus dem Verhältnis von hGH-Phagemid, das nach jedem Schritt vorhanden war, zu demjenigen in der ursprünglichen Mischung (8/20), geteilt durch das entsprechende Verhältnis für R64A-Phagemide. WT = Wildtyp; ND = nicht bestimmt.
: Die Anreicherung von Phagemid gegenüber den gesamten M13KO7-Stammphagen betrug 10&sup4; nach diesem Schritt.

Schlußfolgerungen

Durch Präsentation einer Mischung des Wildtyp-Gen III-Proteins und des Gen III-Fusionsproteins auf Phagemid-Partikeln können Virionen zusammengesetzt und vermehrt werden, die ein großes und richtig gefaltetes Protein als Fusion mit Gen III präsentieren. Die Kopienzahl des Gen III-Fusionsproteins kann effektiv eingestellt werden, um "Chelat-Effekte" zu vermeiden, jedoch in ausreichend hohen Niveaus in dem Phagemid-Pool aufrechterhalten werden, um die Durchmusterung großer Epitop-Banken (> 10¹&sup0;) zu erlauben. Es wurde von uns gezeigt, daß hGH (ein 22 kD- Protein) in seiner nativen gefalteten Form präsentiert werden kann. Bindungsselektionen, durchgeführt auf Rezeptoraffinitätsperlen, die mit freiem hGH eluiert wurden, reicherten Wildtyp-hGH-Phagemide gegenüber einem MutantenhGH-Phagemid, von dem gezeigt wurde, daß es eine verringerte Rezeptorbindungsaktivität besitzt, effizient an. Somit ist es möglich, Phagemid- Partikel zu selektionieren, deren Bindungskonstanten unten im nanomolaren Bereich liegen.
Protein-Protein- und Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen werden von diskontinuierlichen Epitopen dominiert (Janin, J., et al., J. Mol. Biol., 204:155-164 [1988]; Argos, P., Prot. Eng., 2:101-113, [1988]; Barlow, D.J., et al., Nature, 322: 747-748 (1987]; und Davies, D.R., et al., J. Biol. Chem., 263:10541-10544 [1988]); das heißt, die Reste, welche direkt an der Bindung beteiligt sind, liegen in der Tertiärstruktur nahe beieinander, sind jedoch durch Reste getrennt, die nicht an der Bindung beteiligt sind. Das hier dargestellte Screening-System sollte es erlauben, Protein-Rezeptor-Wechselwirkungen bequemer zu analysieren und diskontinuierliche Epitope in Proteinen mit neuen und hochaffinen Bindungseigenschaften zu isolieren.

BEISPIEL VII

Selektion von hGH-Mutanten aus einer Bank, die an den hGH-Codons 172, 174, 176, 178 randomisiert wurde

Konstruktion einer Matrize

Eine Mutante des hGH-Gen III-Fusionsproteins wurde nach dem Verfahren von Kunkel et al, Meth. Enzymol., 154:367-382 [1987] konstruiert. Die Matrizen-DNA wurde hergestellt durch Züchtung des Plasmids pS0132 (enthaltend das natürliche hGH-Gen fusioniert mit der carboxyterminalen Hälfte des M13-Gens III unter der Kontrolle des Promotors der alkalischen Phosphatase) in CJ236-Zellen mit als Helfer zugegebenen MI 3-KO7-Phagen. Einzelstrangige, Uracil-enthaltende DNA wurde für die Mutagenese präpariert, um (1) eine Mutation in hGH einzuführen, welche die Bindung an das hGH-bindende Protein (hGHbp) stark verringern würde; und (2) eine nur einmal vorkommende Restriktionsstelle (KpnI) einzuführen, die zum Nachweis von - und Selektion gegen - Hintergrund-Stammphagen eingesetzt werden könnte. Eine oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese wurde durchgeführt unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase und des folgenden Oligodesoxynukleotids:
hGH-Codon:
Dieses Oligo führt die KpnI-Stelle wie gezeigt zusammen mit Mutationen (R178G, I179T) in hGH ein. Es steht zu erwarten, daß diese Mutationen die Bindung von hGH an hGHbp um mehr als das 30fache verringern. Klone aus der Mutagenese wurden durch KpnI-Verdauung gescreent und durch Didesoxy-DNA-Sequenzierung bestätigt. Das resultierende Konstrukt, das als Matrize für eine statistische Mutagenese verwendet werden sollte, erhielt die Bezeichnung pHO415.

Statistische Mutagenese innerhalb der Helix-4 von hGH

Die Codons 172, 174, 176, 178 wurden für eine statistische Mutagenese in hGH ausgewählt, wiederum unter Anwendung des Verfahrens von Kunkel. Eine einzelsträngige Matrize von pH0415 wurde wie oben hergestellt und die Mutagenese unter Verwendung des folgenden Oligo-Pools durchgeführt:
hGH-Codon:
Wie gezeigt, veranlaßt dieser Oligo-Pooi eine Reversion des Codons 179 zum Wildtyp (Ile), zerstört die nur einmal vorkommende KpnI-Stelle von pH0415 und führt statistische Codons (NNS, worin N = A, G, C oder T und S = G oder C) an den Positionen 172, 174, 176 und 178 ein. Bei Verwendung dieser Codonauswahl im Kontext der obigen Sequenz können keine weiteren Kpni-Stellen erzeugt werden. Die Wahl der NNS-degenerierten Sequenz ergibt 32 mögliche Codons (einschließlich eines "Stop"-Codons und mindestens eines Codons für jede Aminosäure) an vier Stellen für eine Öesamtzahl von (32)&sup4; = 1.048.576 möglichen Nukleotidsequenzen (von denen 12% mindestens ein Stopcodon enthalten) oder (20)&sup4; = 160.000 möglichen Polypeptidsequenzen plus 34.481 vorzeitig terminierten Sequenzen (d.h., Sequenzen, die mindestens ein Stopcodon enthalten).

Vermehrung der ursprünglichen Bank

Die Mutagenese-Produkte wurden zweimal mit Phenol:Chloroform (50:50) extrahiert und mit einem Überschuß an Träger-tRNA ethanolgefällt, um eine Salzzugabe zu vermeiden, welche den nachfolgenden Elektroporationsschritt stören würde. Etwa 50 ng (15 fmol) DNA wurden in WJM101-Zellen (2,8 × 10¹&sup0; Zellen/ml) in 45 ul Gesamtvolumen in einer 0,2 cm-Küvette mit einer angelegten Spannung von 2,49 kV mit einem einzigen Impuls (Zeitkonstante = 4,7 msek.) elektroporiert.
Den Zellen wurde 1 Stunde lang bei 37ºC unter Schütteln die Erholung gestattet, dann wurden sie mit 25 ml 2YT-Medium, 100 ug/ml Carbenicillin und M13- KO7 (Multiplizität der Infektion = 1000) gemischt. Die Ausplattierung von Reihenverdünnungen dieser Kultur auf carbenicillinhaltigen Medien zeigte an, daß 8,2 × 10&sup6; Elektrotransformanten erhalten worden waren. Nach 10' bei 23ºC wurde die Kultur über Nacht (15 Stunden) bei 37ºC unter Schütteln inkubiert.
Nach der Übernacht-Inkubation wurden die Zellen pelletiert und doppelsträngige DNA (dsDNA) mit der Bezeichung pLIB1 nach dem Verfahren der alkalischen Lyse hergestellt. Der Überstand wurde erneut zentrifugiert, um jegliche verbleibenden Zellen zu entfernen&sub1; und die Phagen, als Phagenpool φ1 bezeichnet, wurden PEG-gefällt und in 1 ml STE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,6,1 mM EDTA, 50 mM NaCl) resuspendiert. Die Phagentiter wurden als Kolonie-bildende Einheiten (CFU) für das rekombinante Phagemid, welches das hGH-g3p-Gen III-Fusions (hGH-g³)-Plasmid enthielt, und als Plaque-bildende Einheiten (PFU) für den M13- KO7-Helferphagen gemessen.

Bindungsselektion unter Verwendung von immobilisiertem hGHbp

1. BINDUNG:

Ein Aliquot des Phagenpools φ1 (6 × 10&sup9; CFU, 6 × 10&sup7; PFU) wurde 4,5fach in Puffer A (phosphatgepufferte Salzlösung, 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 0,01%Thimerosal) verdünnt und mit einer 5 ul-Suspension von Oxiran- Polyacrylamidperlen, an die das hGHbp mit einer Ser237Cys-Mutation gekoppelt war (350 fmol), in einem silanisierten 1,5 ml-Polypropylenröhrchen gemischt. Als Kontrolle wurde ein äquivalentes Aliquot an Phagen in einem separaten Röhrchen mit Perlen gemischt, die nur mit BSA beschichtet worden waren. Man ließ die Phagen durch 3-stündige Inkubation bei Raumtemperatur (23ºC) unter langsamer Rotation (etwa 7 UpM) an die Perlen binden. Die nachfolgenden Schritte wurden mit einem konstanten Volumen von 200 ul bei Raumtemperatur durchgeführt.

2. WASCHSCHRITT:

Die Perlen wurden 15 Sekunden lang zentrifugiert und der Überstand entfernt (Sup.1). Zur Entfernung von nicht spezifisch gebundenen Phagen/Phagemiden wurden die Perlen zweimal durch Resuspendieren in Puffer A und anschließendes Pelletieren gewaschen. Ein letzter Waschschritt bestand aus der Rotation der Perlen in Puffer A für 2 Stunden.

3. hGH-ELUTION:

Schwach an die Perlen bindende Phagen/Phagemide wurden durch schrittweise Elution mit hGH entfernt. Im ersten Schritt wurden die Perlen mit Puffer A rotiert, der 2 nM hGH enthielt. Nach 17 Stunden wurden die Perlen pelletiert und in Puffer A resuspendiert, der 20 nM hGH enthielt, und 3 Stunden rotiert, dann pelletiert. Beim letzten hGH-Waschschritt wurden die Perlen in Puffer A suspendiert, der 200 nM hGH enthielt, und 3 Stunden rotiert, dann pelletiert.

4. GLYCIN-ELUTION;

Zur Entfernung der am stärksten bindenden Phagemide (d.h., derjenigen, die nach den hGH-Waschschritten immer noch banden) wurden die Perlen in Glycinpuffer suspendiert (1 M Glycin, pH 2,0 mit HCl), 2 Stunden rotiert und pelletiert. Der Überstand (Fraktion "G"; 200 ul) wurde durch Zugabe von 30 ul 1 M Tris-Base neutralisiert.
Die von den höhbp-Perlen eluierte Fraktion G (1 × 10&sup6; CFU, 5 × 10&sup4; PFU) war hinsichtlich des Phagemids gegenüber dem KO7-Helferphagen nicht wesentlich angereichert. Wir nehmen an, daß dies auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß die während der Vermehrung des rekombinanten Phagemids verpackten KO7-Phagen die hGH-g3p-Fusion präsentieren.
Im Vergleich zur Fraktion G, die von den BSA-beschichteten Kontrollperlen eluiert wurde, ergaben die hGHbp-Perlen jedoch 14-mal mehr CFU. Dies reflektiert die Anreicherung der stark bindenden hGH-präsentierenden Phagemide gegenüber nicht-spezifisch bindenden Phagemiden.

5. VERMEHRUNG:

Ein Aliquot (4,3 × 10&sup5; CFU) der von den hGHbp-Perlen eluierten Fraktion G wurde eingesetzt zur Infektion von WJM101-Zellen in der logarithmischen Phase. Die Transduktionen erfolgten durch Mischen von 100 ul Fraktion G mit 1 ml WJM101-Zellen, 20-minütiger Inkubation bei 37ºC und anschließender Zugabe von KO7 (Multiplizität der Infektion = 1000). Die Kulturen (25 ml 2YT plus Carbenicillin) wurden wie oben beschrieben gezüchtet und der zweite Phagenpool (Bank 1 G für die erste Glycin-Elution) wurde wie oben beschrieben hergestellt.
Phagen aus der Bank 1G (Fig. 3) wurden ausgewählt zur Bindung an hGHbp- Perlen wie oben beschrieben. Die von den hGHbp-Perlen eluierte Fraktion G enthielt bei dieser Selektion 30-mal mehr CFU als die Fraktion G, die von den BSA-Perlen eluiert worden war. Wiederum wurde ein Aliquot der Fraktion G in WJM101-Zellen vermehrt, um die Bank 1G² (was anzeigt, daß diese Bank zweimal durch Glycin- Elution selektioniert worden war) zu ergeben. Aus dieser Kultur wurde ebenfalls doppelsträngige DNA (pLIB 1G²) hergestellt.

KpnI-Assay und Restriktionsselektion von dsDNA

Zur Verringerung des Niveaus an Hintergrund (KpnI&spplus;)-Matrize wurde ein Aliquot (etwa 0,5 ug) von pLIB 1G² mit KpnI verdaut und in WJM101-Zellen elektroporiert. Diese Zeilen wurden in Anwesenheit von KO7 (Multiplizität der Infektion = 100) wie für die ursprüngliche Bank beschrieben gezüchtet und ein neuer Phagenpool, pLIB 3, hergestellt (Fig. 3).
Ferner wurde ein Aliquot (etwa 0,5 pg) von dsDNA aus der ursprünglichen Bank (pLIB1) mit KpnI verdaut und direkt in WJM101-Zellen elektroporiert. Man ließ die Transformanten sich wie oben erholen, dann wurden sie mit M13KO7 infiziert und über Nacht gezüchtet, um eine neue Phagenbank mit der Bezeichnung Phagenbank 2 (Fig. 3) zu erhalten.

Aufeinanderfolgende Selektionsdurchgänge

Phagemidbindung, -elution und -vermehrung erfolgten sowohl für Phagemide, die von pLIB2 stammten, als auch für Phagemide, die von pLIB3 stammten, (Fig. 3) in aufeinanderfolgenden Durchgängen wie oben beschrieben, mit Ausnahme, daß (1) ein Überschuß (10fach über CFU) des gereinigten KO7-Phagen (der kein hGH präsentierte) in der Perlen-bindenden Mischung zugegeben wurde und (2) die schrittweisen hGH-Elutionen durch kurze Waschungen mit lediglich Puffer A ersetzt wurden. In einigen Fällen wurden auch XL1-Blue-Zellen zur Phagemidvermehrung eingesetzt.
Eine zusätzliche Verdauung von dsDNA mit KpnI wurde mit pLIB 2G³ und pLIB 3G&sup5; vor dem letzten Durchgang der Perlenbindungsselektion durchgeführt (Fig. 3).

DNA-Sequenzierung ausgewählter Plasmide

Vier unabhängig isolierte Klone von LIB 4G&sup4; und vier unabhängig isolierte Klone von LIB 5G&sup6; wurden durch Didesoxysequenzierung sequenziert. Alle diese acht Klone besaßen identische DNA-Sequenzen:
hGH-Codon:
Somit kodieren diese alle für dieselbe hGH-Mutante: (E174S, F176Y). Der Rest 172 in diesen Klonen ist Lys wie im Wildtyp. Das für 172 selektionierte Codon stimmt ebenfalls mit Wildtyp-hGH überein. Dies ist nicht überraschend, da MG das einzige Lysin-Codon ist, das mit einem degenerierten "NNS"-Codonsatz möglich ist. Der Rest 178-Arg ist ebenfalls mit dem Wildtyp identisch, aber hier war das aus der Bank selektionierte Godon MG anstelle von CGC, wie im Wildtyp-hGH gefunden, obwohl das letztere Codon unter Verwendung des "NNS"-Codonsatzes ebenfalls möglich ist.

Multiplizität der K07-Infektion

Die Infektionsmultiplizität der K07-Infektion ist ein wichtiger Parameter bei der Vermehrung von rekombinanten Phagemiden. Die K07-Infektionsmultiplizität muß hoch genug sein, um sicherzustellen, daß praktisch alle mit Phagemid transformierten oder transflzierten Zeilen in der Lage sind, neue Phagemid-Partikel zu verpacken. Darüber hinaus sollte die Konzentration des Wildtyp-Gens III in jeder Zelle hoch gehalten werden, um die Möglichkeit zu verringern, daß mehrfache hGH- Gen III-Fusionsmoleküle auf einem jeden Phagemid-Partikel präsentiert werden, wodurch Chelat-Effekte bei der Bindung herabgesetzt werden. Falls die K07- Infektionsmultiplizität jedoch zu hoch ist, wird die Verpackung von K07 mit derjenigen des rekombinanten Phagemids konkurrieren. Wir stellen fest, daß annehmbare Phagemid-Ausbeuten mit nur 1-10% K07-Phagenhintergrund erhalten werden, wenn die K07-Infektionsrnulti plizität 100 beträgt. TABELLE IV.
Die Phagenpools sind markiert wie dargestellt (Fig. 3). Die Multiplizität der Infektion (Moi) bezieht sich auf die Multiplizität der KO7-Infektion (PFU/Zellen) bei der Vermehrung von Phagemiden. Die Anreicherung von CFU gegenüber PFU ist in denjenigen Fällen gezeigt, in denen gereinigte KO7 beim Bindungsschrift zugegeben wurden. Das Verhältnis der von hGHbp-Perlen eluierenden CFU gegenüber den von BSA-Perlen eluierenden CFU ist gezeigt. Der Bruchteil der Kpnl-enthaltenden Matrize (d.h., pH0415), der im Pool verbleibt, wurde bestimmt durch Verdauung von dsDNA mit kpni plus EcoRI, Laufenlassen der Produkte auf einem 1%igen Agarosegel und Laserscannen eines Negativs der mit Ethidiumbromid angefärbten DNA.

Rezeptorbindungsafflnität des Hormons hGH (E174S, F176Y)

Die Tatsache, daß ein einzelner Klon auf zwei verschiedenen Selektionswegen isoliert wurde (Fig. 3) legte nahe, daß die Doppelmutante (E174S, F176Y) stark an hGHbp bindet. Um die Affinität dieser hGH-Mutante für hGHbp zu bestimmen, konstruierten wir diese hGH-Mutante durch stellengerichtete Mutagenese unter Einsatz eines Plasmids (pb0720), welches das Wildtyp-hGH-Gen als Matrize enthält, und des folgenden Oligonukleotids, welches die Codons 174 und 176 verändert:
hGH-Codon:
Das resultierende Konstrukt, pH0458B, wurde zur Expression des Mutantenhormons in den E. coli -Stamm 16C9 transformiert. Die Scatchard-Analyse der kompetitiven Bindung von hGH (E174S, F167Y) gegenüber ¹²&sup5;I-hGH an hGHbp zeigte an, daß die (E174S, F176Y)-Mutante eine Bindungsaffinität aufweist, die mindestens 5,0-mal stärker ist als dieienige von Wildtyp-hGH.

BEISPIEL VIII

Selektion von hGH-Varianten aus einer Heiix4-statistischen-Kassetten-Bank von Hormon-Phagen

Wachstumshormonvarianten wurden nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des in Fig. 9 beschriebenen Phagemids hergestellt.

Konstruktion eines de-fusionierbaren Hormon-Phagen-Vektors

Wir konstruierten einen Vektor für Kassetten-Mutagenese (Wells et al., Gene, 34, 315-323 [1985]) und Expression des hGH-Gen III-Fusionsproteins mit den Zielen, (1) die Verknüpfung zwischen hGH und der Gen III-Gruppierung zu verbessern, um die hGH-Gruppierung besser auf dem Phagen zu präsentieren, (2) die Expression des Fusionsproteins zu beschränken, um im wesentlichen "monovalente Präsentation" zu erhalten, (3) eine Restriktionsnukleaseselektion gegenüber dem Ausgangsvektor zu ermöglichen, (4) die Expression des Fusionsproteins aus dem Ausgangsvektor zu eliminieren, und (5) eine leichte Expression des korrespondierenden freien Hormons einer gegebenen hGH-Gen III- Fusionsmutante zu erreichen.
Das Plasmid pS0643 wurde konstruiert durch Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese (Kunkel et al., Methods Enzymol., 154, 367-382 [1987]) von pS0132, welches pBR322- und f1-Replikationsursprünge enthält und ein hGH-Gen III- Fusionsprotein (hGH-Reste 1-191, gefolgt von einem einzelnen Gly-Rest, fusioniert mit Pro-198 des Gens III) unter der Kontrolle des E. coli phoa-Promotors (Bass et al., Proteins 8, 309-314 (1990]) exprimiert (Figur 9). Die Mutagenese erfolgte mit dem Oligonukleotid 5'GGC-AGC-TGT-GGC-TTC-TAG-AGT-GGC-GGC-GGC- TCT-GGT-3', welches eine XbaI-Stelle (unterstrichen) und ein Amber-Stopcodon (TAG) nach dem Phe-191 von hGH einführt. Im resultierenden Konstrukt pS0643 wurde ein Teil des Gens III deletiert und es traten zwei stille Mutationen (unterstrichen) auf, was die folgende Verbindung zwischen hGH und Gen III ergab:
Dies verkürzt die Gesamtgröße des Fusionsproteins von 401 Resten in pS0132 auf 350 Reste in pS0643. Experimente unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen hGH haben gezeigt, daß der hGH-Anteil des neuen Fusionsproteins, auf einem Phagenpartikel zusammengesetzt, zugänglicher ist als die vorherige längere Fusion.
Zur Vermehrung von Hormon-präsentierenden Phagen können pS0643 und dessen Derivate in einem Amber-Supressorstamm von E. coli wie JM101 oder XL1- Blue (Bullock et aL, Bio Techniques 5, 376-379 [1987]) gezüchtet werden. Oben ist eine Glu-Substitution am Amber-Codon gezeigt, welche in supE-Supressorstämmen auftritt. Eine Supression mit anderen Aminosäuren ist ebenfalls möglich bei verschiedenen erhältlichen Stämmen von E. coli, die wohlbekannt und für die Öffentlichkeit verfügbar sind.
Zur Expression von hGH (oder Mutanten) ohne den Gen III-Anteil der Fusion können pS0643 und dessen Derivate einfach in einem Nicht-Supressorstamm wie 16C9 gez(ichtet werden. In diesem Fall führt das Amber-Codon (TAG) zur Termination der Translation, was freies Hormon ohne das Erfordernis einer unabhängigen DNA-Konstruktion ergibt.
Um Stellen für die Kassetten-Mutagenese zu erzeugen, wurde pS0643 mutiert mit den Oligonukleotiden (1) 5'-CGG-ACT-GGG-CAG-ATA-TTC-AAG-CAG-ACC-3', welches die nur einmal vorkommende BgIII-Stelle von pS0643 zerstört; (2) 5'-CTC- AAG-AAC-TAC-GGG-TTA-CCC-TGA-CTG-CTT-CAG-GAA-GG-3', welches eine nur einmal vorkommende BstEII-Stelle, eine einbasige Leserahmenverschiebung und ein Nicht-Amber-Stopcodon (TGA) einführt; und (3) 5'-CGC-ATC-GTG-CAG-TGC- AGA-TCT-GTG-GAG-GGC-3', welches eine neue BgIII-Stelle einführt, um den Ausgangsvektor pH0509 zu ergeben. Das Hinzufügen einer Leserahmenverschiebung zusammen mit einem TGA-Stopcodon stellt sicher, daß keine Gen III- Fusion mit dem Ausgangsvektor erzeugt werden kann. Das BstEII-BgIII-Segment wird aus pH0509 ausgeschnitten und durch eine DNA-Kassette ersetzt, die an den interessierenden Codons mutiert ist. Andere Restriktionsstellen für Kassetten- Mutagenese an anderen Orten in hGH wurden ebenfalls in den Hormon-Phagen Vektor eingeführt.

Kassetten-Mutagenese in der Helix 4 von hGH

Die Codons 172, 174, 176 und 178 von hGH wurden für eine statistische Mutagenese ausgewählt, da sie alle auf oder in der Nähe der Oberfläche von hGH liegen und signifikant zur Rezeptorbindung beitragen (Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 [1989]); sie liegen alle innerhalb einer wohldefinierten Struktur, die 2 "Windungen" auf derselben Seite der Helix 4 einnimmt; und sie sind bei bekannten Evolutionsvarianten von hGH jeweils durch mindestens eine Aminosäure ersetzt.
Wir entschlossen uns zu einer Substitution durch NNS (N=A/G/C/T; S=G/C) an jedem der Target-Reste. Die Wahl der NNS-degenerierten Sequenz ergibt 32 mögliche Codons (einschließlich mindestens eines Codons für jede Aminosäure) an 4 Stellen für eine Gesamtzahl von (32)&sup4; = 1.048.576 möglichen Nukleotidsequenzen oder (20)&sup4; = 160.000 möglichen Polypeptidsequenzen. Nur ein Stopcodon, Amber (TAG), wird durch diese Codonwahl zugelassen und dieses Codon ist als Glu in supE-Stämmen von E. coli suppressierbar.
Es wurden zwei degenerierte Oligonukleotide mit NNS an den Codons 172, 174, 176 und 178 synthetisiert, phosphoryliert und verschmolzen, um die mutagene Kassette zu konstruieren: 5'-GT-TAC-TCT-ACT-GCT-TTC-AGG-AAG-GAC-ATG- GAC-NNS-GTC-NNS-ACA-NNS-CTG-NNS-ATC-GTG-CAG-TCG-A-3' und 5'-GA- TCT-GCA-CTG-CAC-GAT-SNN-CAG-SNN-TGT-SNN-GAC-SNN-GTC-CAT-GTC- CTT-CCT-GM-GCA-GTA-GA-3'.
Der Vektor wurde hergestellt durch Verdauung von pH0509 mit BstEII, gefolgt von BgIII. Die Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel laufengelassen und das große Fragment ausgeschnitten, mit Phenol extrahiert und ethanolgefällt. Dieses Fragment wurde mit Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) behandelt, dann mit Phenol:Chloroform extrahiert, ethanolgefällt und für die Ligierung mit der mutagenen Kassette resuspendiert.

Vermehrung der ursprunglichen Bank in XL1-Blue-Zellen

Nach der Ligierung wurden die Reaktionsprodukte erneut mit BstEII verdaut, dann mit Phenol:,Chloroform extrahiert, ethanolgefällt und in Wasser resuspendiert. (Eine BstEII-Erkennungsstelle (GGTNACC) wird in Kassetten erzeugt, welche ein G an Position 3 des Codons 172 und ein ACC (Thr)-Codon an 174 enthalten. Die Behandlung mit Bstell in diesem Schritt sollte jedoch nicht gegen irgendeine der möglichen mutagenen Kassetten selektionieren, da praktisch alle Kassetten Heteroduplexe sein werden, welche durch das Enzym nicht gespalten werden können). Etwa 150 ng (45 fmol) DNA wurden in XL1-Blue-Zellen (1,8 × 10&sup9; Zellen in 0,045 ml) in einer 0,2 cm-Küvette mit einer angelegten Spannung von 2,49 kV mit einem einzigen Impuls (Zeitkonstante = 4,7 msek.) elektroporiert.
Den Zellen wurde gestattet, sich 1 Stunde lang bei 37ºC in S.O.C.-Medien unter Schütteln zu erholen, dann wurden sie mit 25 ml 2YT-Medium, 100 mglml Carbenicillin und M13-K07 (Moi = 100) gemischt. Nach 10' bei 23ºC wurde die Kultur über Nacht (15 Stunden) bei 37ºC unter Schütteln inkubiert. Die Ausplattierung von Reihenverdünnungen dieser Kultur auf carbenicillinhaltigen Medien zeigte an, daß 3,9 × 10&sup7; Elektrotransformanten erhalten wurden.
Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen pelletiert und doppelsträngige DNA (dsDNA) mit der Bezeichnung pH0529E (die ursprüngliche Bank) nach dem Verfahren der alkalischen Lyse hergestellt. Der Überstand wurde erneut zentrifugiert, um jegliche verbleibenden Zellen zu entfernen, und die Phagen, bezeichnet als Phagenpool φH0529E (die ursprüngliche Phagenbank), wurden PEG-gefällt und in 1 ml STE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,6, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl) resuspendiert. Die Phagentiter wurden gemessen als Kolonie-bildende Einheiten (CFU) für die rekombinanten Phagemide, die hGH-g3p enthielten. Es wurden etwa 4,5 × 10¹³ CFU aus der Ausgangsbank erhalten.

Degeneration der Ausgangsbank

Aus dem Pool von Elektrotransformanten wurden 58 Klone im Bereich der BstEII-BgIII-Kassette sequenziert. Davon entsprachen 17% dem Ausgangsvektor, 17% enthielten mindestens eine Leserahmenverschiebung und 7% enthielten eine nicht-schweigende (nicht-terminierende) Mutation außerhalb der vier Target-Codons. Wir kommen zu dem Ergebnis, daß 41% der Klone auf eine der obigen Arten defekt waren, was einen funktionellen Gesamtpool von 2,0 × 10&sup7; ursprünglichen Transformanten übrigläßt. Diese Anzahl übertrifft die mögliche Anzahl der DNÄ- Sequenzen immer noch um nahezu das 2ºoache. Deshalb gehen wir davon aus, alle möglichen Sequenzen in der Ausgangsbank repräsentiert zu haben.
Wir untersuchten die Sequenzen von nicht-selektionierten Phagen, um den Grad der Codon-Bevorzugtheit bei der Mutagenese zu bestimmen (Tabelle V). Die Ergebnisse zeigen, daß, obwohl einige Codons (und Aminosäuren) im Vergleich zur statistischen Erwartung unter- oder überrepräsentiert sind, die Bank sehr unterschiedlich ist, ohne Hinweise auf eine "Verwandtschafts"-Degeneration in großem Maßstab (Tabelle VI). TABELLE V Codonverteilung (pro 188 Codons) von nicht-selektionierten Hormon-Phagen. Die Klone wurden aus der Ausgangsbank (pH0529E) sequenziert. Alle Codons wurden in einer Tabelle aufgeführt, einschließlich derjenigen aus Klonen, welche falsche Mutationen und/oder Leserahmenverschiebungen enthielten. *Zur Beachtung: das Amber-Stopcodon (TAG) wird als Glu in XL1-Blue-Zellen supprimiert. Die fettgedruckten Codons waren um 50% oder mehr unter/überrepräsentiert. TABELLE VI. Nicht-selektionierte (pH0529E)-Klone mit einem offenen Leserahmen. Die Benennung, z.B. TWGS, bezeichnet die hGH-Mutante 172T/174W/176G/178S. Amber (TAG)-Codons, in XL1-Blue-Zelien als Glu transiatiert, sind als &epsi; dargestellt.

Herstellung von immobilisiertem hGHbp und hPRLbp

Immobilisiertes hGHbp ("hGHbp-Perlen") wurde hergestellt wie beschrieben (Bass et al., Proteins 8, 309-314 [1990]), mit der Ausnahme, daß Wildtyp-hGHbp (Fuh et al., J. Biol. Chem. 265, 3111-3115 [1990]) verwendet wurde. Konkurrenzbindungsexperimente mit [¹²&sup5;I]-hGH zeigten an, daß 58 fmol an funktionellem hGHbp pro ul der Perlensuspension gekoppelt wurden.
Immobilisiertes hPRLbp ("hPRLbp-Perlen") wurde wie oben hergestellt unter Verwendung der extrazellulären Domäne des Prolaktinrezeptors vön 211 Resten (Cunningham et al., Science 250, 1709-1712 [1990]). Konkurrenzbindungsexperimente mit [¹²&sup5;I]-hGH in Gegenwart von 50 uM Zink zeigten an, daß 2,1 fmol an funktionellem hPRLbp pro ul der Perlensuspension gekoppelt wurden.
"Unbeladene Perlen" wurden hergestellt durch Behandlung der Oxiran- Acrylamidperlen mit 0,6 M Ethanolamin (pH 9,2) für 15 Stunden bei 4ºC.

Bindungsselektion unter Verwendung von immobilisiertem hGHbp und hPRLbp

Die Bindung von Hormon-Phagen an Perlen erfolgte in einem der folgenden Puffer: Puffer A (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,01% Thimerosal) für Selektionen unter Verwendung von hGHbp- und unbeladenen Perlen; Puffer B (50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20, 100 mM ZnCl&sub2;) für Selektionen unter Verwendung von hPRLbp in Gegenwart von Zink (+Zn²&spplus;); oder Puffer C (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,01% Thimerosal, 10 mM EDTA) für Selektionen unter Verwendung von hPRLbp in Abwesenheit von Zink (+ EDTA). Bindungsselektionen wurden auf jedem der folgenden Wege durchgeführt:
(1) Bindung an unbeladene Perlen, (2) Bindung an hgl-lbp-Perlen, (3) Bindung an hPRLbp-Perlen (+ Zn²+), (4) Bindung an hPRLbp-Perlen (+ EDTA), (5) zweimalige Voradsorption an hGHbp-Perlen und anschließende Bindung der nicht-adsorbierten Fraktion an hPRLbp-Perlen ("-hGHbp, +h PRLBP"-Selektion), oder (6) zweimalige Voradsorption an hPRLbp-Perlen und anschließende Bindung der nicht-adsorbierten Fraktion an hGHbp-Perlen ("-hPRLbp, +hGHbp"-Selektion). Bei den letzteren beiden Prozeduren wurde eine Anreicherung von Mutanten erwartet, die hPRLbp binden, aber nicht hGHbp, bzw. von Mutanten, die hGHbp binden, aber nicht hPRLbp. Die Bindung und Elution der Phagen wurde in jedem Zyklus wie folgt durchgeführt:

1. BINDUNG:

Ein Aliquot von Hormon-Phagen (typischerweise 10&sup9;-10¹&sup0; CFU) wurde mit einer gleichen Menge an Nicht-Hormon-Phagen (pCAT) gemischt, im geeigneten Puffer (A, B oder C) verdünnt und mit einer 10 ul-Suspension von hGHbp-, hPRLbp- oder unbeladenen Perlen in einem Gesamtvolumen von 200 ul in einem 1,5 ml-Polypropylenröhrchen gemischt. Die Phagen wurden durch 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur (23ºC) unter langsamer Rotation (etwa 7 UpM) an die Perlen binden gelassen. Die nachfolgenden Schritte wurden mit einem konstanten Volumen von 200 ul und bei Raumtemperatur durchgeführt.

2. WASCHSCHRITTE:

Die Perlen wurden 15 Sekunden lang zentrifugiert und der Überstand enifemt. Zur Verringerung der Anzahl der nicht spezifisch gebundenen Phagen wurden die Perlen 5-mal durch kurzes Resuspendieren im geeigneten Puffer und anschließendes Pelletieren gewaschen.

2. hGH-ELUTION:

Die schwach an die Perlen bindenden Phagen wurden durch Elution mit hGH enifemt. Die Perlen wurden mit dem geeigneten Puffer, der 400 nM hGH enthielt, 15-17 Stunden lang rotiert. Der Überstand wurde als "hGH- Elution" gewonnen und die Perlen. Die Perlen wurden durch kurzes Resuspendieren in Puffer und Pelletieren gewaschen.

4. GLYCIN-ELUTION:

Zur Entfernung der am stärksten bindenden Phagen (derjenigen, welche nach dem hGH-Waschschritt immer noch banden) wurden die Perlen in Glycinpuffer (Puffer A plus 0,2 M Glycin, pH 2,0 mit HCl) suspendiert, 1 Stunde rotiert und pelletiert. Der Überstand ("Glycin-Elution"; 200 ul) wurde durch Zugabe von 30 ul 1 M Tris-Base neutralisiert und bei 4ºC gelagert.

5. VERMEHRUNG:

Aliquots der hGH-Elutionen und der Glycin-Elutionen aus jedem Satz von Perlen und unter jeder Kombination von Bedingungen wurden verwendet, um separate Kulturen von XL1 -Blue-Zellen in der logarithmischen Phase zu infizieren. Die Transduktionen erfolgten durch Mischen der Phagen mit 1 ml XL1- Blue-Zellen, 20-minütiger Inkubation bei 37ºC und anschließender Zugabe von KO7 (Moi = 100). Es wurden Kulturen (25 ml 2YT plus Carbenicillin) wie oben beschrieben gezüchtet und der nächste Phagenpool wie oben beschrieben hergestellt.
Phagenbindung, -elution und -vermehrung wurden in aufeinanderfolgenden Durchgängen nach dem oben beschriebenen Zyklus durchgeführt. Beispielsweise wurden die Phagen, welche aus der hGH-Elution von hGHbp-Perlen amplifiziert worden waren, erneut auf hGHbp-Perlen selektioniert und mit hGH eluiert und dann zur Infektion einer neuen Kultur von XL1-Blue-Zellen eingesetzt. Drei bis fünf Durchgänge von Selektion und Vermehrung wurden für jede der oben beschriebenen Selektionsprozeduren durchgeführt.

DNA-Sequenzierung selektionierter Plasmide

Aus den hGH- und Glycin-Elutionsschritten eines jeden Zyklus wurde ein Aliquot von Phagen zur Animpfung von XL1-Blue-Zellen eingesetzt, welche auf LB- Medium mit Carbenicillin und Tetracyclin ausplattiert wurden, um unabhängige Klone aus jedem Phagenpool zu erhalten. Einzelsträngige DNA wurde aus einer isolierten Kolonie hergestellt und im Bereich der mutagenen Kassette sequenziert. Die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung sind als abgeleitete Aminosäuresequenzen in den Figuren 5, 6, 7 und 8 zusammengefaßt.

Expression und Assay von hGH-Mutanten

Zur Bestimmung der Bindungsaffinität einiger selektionierter hGH-Mutanten für das hGHbp transformierten wir DNA von sequenzierten Klonen in den E. coli Stamm 16C9. Wie oben beschrieben, ist dies ein Nicht-Supressorstamm, welcher die Proteintranslation nach dem letzten Phe-191-Rest von hGH terminiert. Für diese Transformationen wurde einzelsträngige DNA eingesetzt, aber doppelsträngige DNA oder sogar ganze Phagen können leicht in einen Nicht-Supressorstamm zur Expression des freien Hormons elektroporiert werden.
Mutanten von hGH wurden aus Zellen, die einem osmotischen Schock unterworfen worden waren, wie für hGH beschrieben (Olson et al., Nature 293, 408-411 [1981]) mittels Ammoniumsulfatfällung präpariert und die Proteinkonzentrationen durch Laser-Densitometrie von Coomassie-angefärbten SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese-Gelen unter Verwendung von hGH als Standard (Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 [1989]) gemessen.
Die Bindungsaffinität jeder Mutante wurde bestimmt durch Verdrängung von ¹²&sup5;I-hGH wie beschrieben (Spencer et al., J. Biol. Chem. 263, 7862-7867 [1988]; Fuh et al., J. Biol. Chem. 265, 3111-3115 [1990] unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Rezeptor-Antikörpers (Mab263).
Die Ergebnisse für eine Anzahl von hGH-Mutanten, die auf verschiedenen Wegen selektioniert wurden (Fig. 6), sind in Tabelle VII dargestellt. Viele dieser Mutanten besitzen eine stärkere Bindungsaffinität für hGHbp als Wildtyp-hGH. Die am stärksten verbesserte Mutante, KSYR, besitzt eine 5,6fach höhere Bindungsaffinität als diejenige von Wildtyp-hGH. Die schwächste selektionierte Mutante unter den untersuchten besaß nur eine etwa 10fach geringere Bindungsaffinität als hGH.
Es können Bindungsassays für Mutanten, die hinsichtlich hPRLbp-Bindung selektioniert wurden&sub1; durchgeführt werden. TABELLE VII Konkurrierende Bindung an hGHbp Der selektionierte Pool, in dem jede Mutante gefunden wurde, ist als 1G (erste Glycin-Selektion), 3G (dritte Glycin-Selektion), 3H (dritte hGH-Selektion), 3* (dritte Selektion, keine Bindung an hPRLbp, jedoch Bindung an hGHbp) angezeigt. Die Häufigkeit, mit der jede Mutante bei allen sequenzierten Klonen auftrat, ist angegeben ().

Additive und nicht-additive Wirkungen auf die Bindung

Bei einigen Resten besitzt die Substitution einer bestimmten Aminosäure unabhängig von den umgebenden Resten im wesentlichen dieselbe Wirkung. Beispielsweise reduziert die Substitution von F176Y vor dem Hintergrund von 172R/174S die Bindungsaffinität um das 2,0fache (RSFR gegenüber RSYR). Gleichermaßen ist vor dem Hintergrund von 172K/174A die Bindungsaffinität der F176Y-Mutante (KAYR) 2,9fach schwächer als die der entsprechenden 176F- Mutante (KAFR; Cunningham und Wells, 1989).
Andererseits zeigen die Bindungskonstanten, die für verschiedene ausgewählte hGH-Mutanten bestimmt wurden, nicht-additive Wirkungen einiger Aminosäuresubstitutionen an den Resten 172, 174, 176 und 178. Beispielsweise resultiert vor dem Hintergrund von 172K /176Y die Substitution E174S in einer Mutante (KSYR), welche hGHbp 3,7fach stärker bindet als die entsprechende Mutante, die E174A (KAYR) enthält. Vor dem Hintergrund von 172R/176Y sind die Auswirkungen dieser E174-Substitutionen jedoch umgekehrt. Hier bindet die E174A- Mutante (RAYR) 1,5fach stärker als die E1745-Mutante (RSYR).
Solche nicht-additiven Wirkungen auf die Bindung bei Substitutionen an benachbarten Resten illustrieren die Anwendbarkeit der Protein-Phagen Bindungsselektion als Mittel zur Selektion optimierter Mutanten aus einer Bank, die an mehreren Positionen randomisiert wurde. In Abwesenheit detaillierter Strukturinformation könnten ohne einen solchen Selektionsprozeß viele Kombinationen von Substitutionen erprobt werden, bevor die optimale Mutante gefunden würde.

BEISPIEL IX

Selektion von hGH-Varianten aus einer Helix-1-statistischen-Kassetten-Bank von Hormon-Phagen

Unter Anwendung der in Beispiel VIII beschriebenen Verfahren bestimmten wir eine weitere Region von hGH, die an der Bindung an das hGHbp und/oder hPRLbp beteiligt ist, die Helix-1-Reste 10,14,18, 21, als Ziel einer statistischen Mutagenese im phGHam-g3p-Vektor (auch als p50643 bekannt; siehe Beispiel VIII).
Wir entschlossen uns, das "Amber"-hGH-93-Konstrukt (als phGHam-g3b bezeichnet) einzusetzen, da es scheint, daß es das Target-Protein hGH für die Bindung zugänglicher macht. Dies wird durch Daten aus vergleichenden ELISA- Assays monoklonaler Antikörper-Bindung gestützt. Phagen, die von pS0132 (S. Bass, R. Greene, J.A. Wells, Proteins 8, 309 (1990)) und die von phGHam-93 produziert wurden, wurden getestet mit drei Antikörpern (Medix 2, 1 B5.G2 und 587.C10), die bekanntermaßen bindende Determinanten in der Nähe des Carboxyterminus von hGH besitzen [B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ng, J.A. Wells, Science 243, 1330 (1989); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244,1081 (1989); L. Jin und J. Wells, unveröffentlichte Ergebnisse], und einem Antikörper (Medix 1), der Determinanten in den Helices 1 und 3 erkennt {B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ng, J.A. Wells, Science 243,1330 (1989); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244, 1081 (1989)]. Phagemid-Partikel von phGHam-93 reagierten viel stärker mit den Antikörpern Medix 2, 1B5.G2 und 5B7.C10 als Phagemid-Partikel von psol 32. Insbesondere wurde die Bindung von psol 32-Partikeln im Vergleich zur Bindung an Medix 1 um > 2000fach sowohl für Medix 2 als auch für 5B7.C10 verringert und um > 25fach für 1B5.G2. Andererseits war die Bindung von phGHam-93-Phagen für die Antikörper Medix 2, 185.G2 bzw. 587.C10 im Vergleich zur Bindung an Medix 1 nur um etwa 1,5fach, 1,2fach und 2,3fach geringer.

Konstruktion der Helix 1-Bank durch Kassetten-Mutagenese

Wir mutierten Reste in der Helix 1, die vorher durch Alanin-Scanning- Mutagenese [B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ng, J.A. Wells, Science 243,1330 (1989); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244, 1081 (1989), 15, 16] identifiziert worden waren, um die Bindung der extrazellulären Domänen der hGH- und/oder hPRL-Rezeptoren (hGHbp bzw. hPRLbp genannt) zu modulieren. Die Kassetten-Mutagenese erfolgte im wesentlichen wie beschrieben [J.A. Wells, M. Vasser, D.B. Powers, Gene 34, 315 (1985)]. Diese Bank wurde konstruiert durch eine Kassetten-Mutagenese, die vier Reste gleichzeitig vollständig mutierte (siehe Beispiel VIII), bei der eine mutierte Version von phGHam-93 eingesetzt wurde, worin nur einmal vorkommende Restriktionsstellen für KpnI (an dem hGH-Codon 27) und XhoI (an dem hGH-Codon 6) (im folgenden unterstrichen) durch Mutagenese (T.A. Kunkel, J.D. Roberts, R.A. Zakour, Methods Enzymol. 154, 367-382] mit den
Oligonukleotiden 5'-GCC TTT GAC AGG TAC CAG GAG TTT G-3' bzw. 5'-CCA ACT ATA CCA CTC TCG AGG TCT ATT CGA TM C-3' eingeführt worden waren. Das letztere Oligo führte auch eine a+1 Leserahmenverschiebung (in kursiv) ein, um die Transiation des Ausgangsvektors zu beenden und den Wildtyp-Hintergrund in der Phagemid-Bank zu minimieren. Dieser Ausgangsvektor erhielt die Bezeichnung pH0508B. Die Helix 1-Bank mit den mutierten hGH-Resten 10,14,18, 21 wurde konstruiert durch Ligierung des großen XhoI-KpnI-Fragments von pH0508B mit einer Kassette, die aus den komplementären Oligonukleotiden 5'-pTCG AGG CTC NNS GAC MC GCG NNS CTG CGT GCT NNS CGT CTT NNS CAG CTG GCC TTT GAC ACG TAC-3' und 5'-pGT GTC AAA GGC CAG CTG SNN MG ACG SNN AGC ACG CAG SNN CGC GTT GTC SNN GAC CC-3' erstellt wurde. Die kpnI-Stelle wurde an der Verknüpfungsstelle des Ligierungsprodukts zerstört, so daß eine Restriktionsenzymverdauung zur Analyse von nicht-mutiertem Hintergrund verwendet werden konnte.
Die Bank enthielt mindestens 10&sup7; unabhängige Transformanten, so daß, falls die Bank absolut statistisch wäre (10&sup6; verschiedene Codon-Kombinationen) wir einen Durchschnitt von etwa 10 Kopien eines jeden möglichen mutierten hGH-Gens haben würden. Die Restriktionsanalyse unter Verwendung von kpnl zeigte, daß mindestens 80% der Helix-1-Bank-Konstrukte die inserierte Kassette enthielten.
Die Bindungsanreicherungen von hGH-Phagen aus den Banken erfolgten unter Verwendung von hGHbp, das auf Oxiran-Polyacrylamidperlen (Sigma Chemical Co.) immobilisiert war, wie beschrieben (Beispiel VIII). Vier Reste in der Helix 1 (F10, M14, H18 und H21) wurden gleichermaßen mutiert und nach 4 und 6 Zyklen entwickelte sich ein Nicht-Wildtyp-Konsensus (Tabelle VIII). Die Position 10 auf der hydrophoben Oberfläche der Helix 1 neigt dazu, hydrophob zu sein, wohingegen die Positionen 21 und 18 auf der hydrophilen Oberfläche durch Asn dominiert wurden; für Position 14 war kein offensichtlicher Konsensus ersichtlich (Tabelle IX).
Die Bindungskonstanten dieser hGH-Mutanten für hGHbp wurden bestimmt durch Expression der freien Hormonvarianten in dem Nicht-Supressorstamm E. coli 16C9, Reinigung des Proteins und Nachweis durch konkurrierende Verdrängung von markiertem Wt-hGH von hGHbp (siehe Beispiel VIII). wie gezeigt, binden mehrere Mutanten stärker an hGHbp als Wt-hGH. TABELLE VIII. Selektion von Helix 1-hGH-Mutanten Auf Phagemid-Partikeln exprimierte Varianten von hGH (statistisch an den Resten F10, M14, H18, H21 mutiert) wurden selektioniert durch Bindung an hGHbp-Perlen und Elution mit hGH (0,4 mM)-Puffer, gefolgt von Glycinpuffer (0,2 M, pH 2) (siehe Beispiel VIII). TABELLE IX Konsensus-Sequenzen aus der selektionierten Helix 1-Bank Die beobachtete Frequenz ist der Bruchteil aller klone, die mit der angegebenen Aminosäure sequenziert wurden. Die nominale Frequenz ist auf der Basis der NNS 32-Codon-Degeneration berechnet. Der maximale Anreichemngsfaktor variiert von 11 bis 32 je nach dem nominalen Frequenzwert für einen gegebenen Rest. Werte von [Kd(Ala mut)/Kd(Wt-hGH)J für einzelne Alaninmutationen wurden entnommen aus B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244, 1081(1989); B.C. Cunningham, D.J. Henner, J.A. Wells, Science 247,1461(1990); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 3407 (1991). TABELLE X Bindung gereinigter Helix 1-hGH-Mutanten an hGHbp Konkurrenzbindungsexperimente wurden durchgeführt unter Verwendung von (¹²&sup5;I]- hGH (Wildtyp), hGHbp (enthaltend die extrazelluläre Rezeptordomäne; Reste 1-238) und Mab263 [B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ng, J. A. Wells, Science 243, 1330 (1989)]; die Zahl P zeigt die relative Häufigkeit des Auftretens einer jeden Mutante unter allen Klonen, die nach einem oder mehreren Selektionsdurchgängen sequenziert wurden.

BEISPIEL X

Selektion von hGH-Varianten aus einer Helix-4-statistischen-Kassetten-Bank, die vorher durch Anreicherung von Hormon-Phagen aufgefundene Mutationen enthielt

Konstruktion von Mutantenproteinen mit verbesserten Bindungseigenschaften durch iterative Selektion unter Verwendung von Hormon-Phagen

Unsere Erfahrung mit der Gewinnung nicht-bindender Homologe von hGH- Evolutionsvarianten legt nahe, daß viele individuelle Aminosäuresubstitutionen kombiniert werden können, um kumulativ verbesserte hGH-Mutanten bezüglich der Bindung an einen bestimmten Rezeptor zu ergeben [B.C. Cunningham, D.J. Henner, J.A. Wells, Science 247,1461(1990); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 3407 (1991); H.B. Lowman, B.C. Cunningham, J.A. Wells, J. Biol. Chem. 266, in Druck (1991)].
Die Konstruktion der Helix 4b-Bank erfolgte in einem Versuch, die aus der Helix 4a-Bank selektionierte Helix 4-Doppelmutante (E174S/F176Y), von der wir feststellten, daß sie stärker an den hGH-Rezeptor band (siehe Beispiel VIII), weiter zu verbessern. Mit der E174S/F176Y hGH-Mutante als Hintergrund Ausgangshormon wurden Reste mutiert, welche die Positionen 174 und 176 auf der hydrophilen Oberfläche der Helix 4 umgaben (R167, DI 71, T175 und I179).

Konstruktion der Helix 4b-Bank durch Kassetten-Mutagenese

Die Kassetten-Mutagenese erfolgte im wesentlichen wie beschrieben [J.A. Wells, M. Vasser, D.B. Powers, Gene 34, 315 (1985)]. Die Helix 4b-Bank mit den mutierten Resten 167, 171, 175 und 179 vor dem E174S/F176Y-Hintergrund, wurde konstruiert unter Anwendung von Kassetten-Mutagenese, welche gleichzeitig vier Reste vollständig mutierte (siehe Beispiel VIII) und bei der eine mutierte Version von phGHam-93, worin nur einmal vorkommende BstEII- und Bg/II-Restnktionsstellen vorher eingeführt worden waren (Beispiel VIII), eingesetzt wurde. In die BstEII-Bg/II- Stellen des Vektors wurde eine Kassette eingeführt, die aus den komplementären Oligonukleotiden 5'-pG TTA CTC TAC TGC TTC NNS AAG GAC ATG NNS AAG GTC AGC NNS TAC CTG CGC NNS GTG CAG TGC A-3' und 5'-PGA TCT GCA CTG CAC SNN GCG CAG GTA SNN GCT GAC CTT SNN CAT GTC CTT SNN GAA GCA GTA GA-3' hergestellt worden war. Die Bstell-Stelle war in der ligierten Kassette eliminiert. Aus der Helix 4b-Bank wurden 15 unselektionierte Klone sequenziert. Davon fehlte keinem ein Kassetten-Insert, 20% waren im Leserahmen verschoben und 7% besaßen eine nicht-schweigende Mutation.

Resultate der hGHbp-Anreicherung

Bindungsanreicherungen von hGH-Phagen aus den Banken erfolgten unter Verwendung von hGHbp, das auf Oxiran-Polyacrylamidperlen (Sigma Chemical Co.) immobilisiert war, wie beschrieben (Beispiel VI II). Nach 6 Bindungszyklen entwickelte sich ein einigermaßen klarer konsensus (Tabelle XI). Interessanterweise neigten alle Positionen dazu, polare Reste zu enthalten, insbesondere Ser, Thr und Asn (XII).

Assay von hGH-Mutanten

Die Bindungskonstanten für einige dieser hGH-Mutanten an hGHbp wurde bestimmt durch Expression der freien Hormonvarianten in dem Nicht- Suppressorstamm E. coli 16C9, Reinigung des Proteins und Nachweis durch konkurrierende Verdrängung von markiertem Wt-hGH von hGHbp (siehe Beispiel VIII). Wie angezeigt, waren die Bindungsaffinitäten mehrerer Helix-4b-Mutanten für hGHbp stärker als diejenige von Wt-hGH (Tabelle XIII).

Rezedtorselektivität von hGH-Varianten

Schließlich begannen wir die Bindungsaffinität mehrerer der stärker hGHbp-bindenden Mutanten hinsichtlich deren Fähigkeit zur Bindung an das hPRLbp zu analysieren. Die E174S/F176Y-Mutante bindet 200fach schwächer an das hPRLbp als hGH. Die Mutanten E174T/F176Y/R178K und R167N/D171S/E174S/F176Y/I179T binden jeweils > 500fach schwächer an das hPRLbp als hGH. So ist es möglich, neue Rezeptor-selektive Mutanten von hGH durch den Einsatz von Phagen-Präsentationstechnik zu erzeugen.

Hormon-Phagemidselektion identifiziert den Informationsgehalt bestimmter Reste

Von den 12 Resten, die in drei hGH-Phagemid-Banken (Beispiele VIII, IX, X) mutiert wurden, zeigten 4 eine starke, wenn auch nicht ausschließliche, Konservierung der Wildtyp-Reste (K172, T175, F176 und R178). Nicht überraschend waren es diese Reste, welche bei Überführung in Ala die größten Abschwächungen (4- bis 60fach) der Bindungsaffinität an das hGHbp verursachten. Es gab eine Klasse von vier anderen Resten (F10, M14, D171 und I179), wo Ala-Substitutionen schwächere Auswirkungen auf die Bindung verursachten (2- bis 7fach) und diese Positionen zeigten wenig Wildtyp-Konsensus. Schließlich zeigten die anderen vier Reste (H18, H21, R167 und E174), welche die Bindung an das hPRLbp, jedoch nicht an das hGHbp fördern, keinerlei Konsensus für die Wildtyp-hGH-Sequenz bei Selektion auf hGHbp-Perlen. In der Tat gibt es zwei Reste (E174 und H21), bei denen Ala-Substitutionen die Bindungsaffinität an das hGHbp um das 2- bis 4fache erhöhen (B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ng, J.A. Wells, Science 243,1330 (1989); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244,1081(1989); B.C. Cunningham, D.J. Henner, J.A. Wells, Science 247,1461(1990); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 3407 (1991)]. So korrelieren die Daten der Alanin- Seanning-Mutagenese einigermaßen gut mit der Flexibilität zur Substitution jeder Position. In der Tat ist die Herabsetzung der Bindungsaffinität, die durch Alaninsubstitutionen verursacht wird [B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ngl J.A. Wells, Science 243,1330 (1989); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244, 1081(1989); B.C. Cunningham, D.J. Henner, J.A. Wells, Science 247,1461(1990); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 3407 (1991)], ein vernünftiger Indikator des Prozentsatzes, mit dem der Wildtyp-Rest in dem Phagemid-Pooi nach 3 - 6 Selektionsgängen gefunden wird. Die Alanin-Scanning Information ist nützlich zur Auswahl von Seitenketten, welche die Bindung modulieren, und die Phagenselektion ist zu deren Optimierung und zur Bestimmung der Flexibilität jeder Stelle (und/oder Kombination von Stellen) für eine Substitution geeignet. Die Kombination von Scanning-Mutationsverfahren Science [B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ng, J.A. Wells, Science 243,1330 (1989); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244, 1081 (1989)] und Phagen-Präsentation ist ein wirkungsvoller Weg zur Konstruktion von Rezeptor-Ligand-Grenzflächen und zur Untersuchung von molekularer Evolution in vifro.

Variationen bei der iterativen Anreicherung von Hormon-Phagemid-Banken

In Fällen, in denen kombinierte Mutationen bei hGH additive Wirkungen auf die Bindungsaffinität an Rezeptor aufweisen, können Mutationen, von denen durch Hormon-Phagemid-Anreicherung festgestellt wurde, daß sie die Bindung verbessern, durch einfaches Schneiden und Ligieren von Restriktionsfragmenten oder Mutagenese kombiniert werden, um kumulativ optimierte Mutanten von hGH zu ergeben.
Andererseits können Mutationen in einer Region von hGH, welche die Rezeptorbindung optimieren, strukturell oder funktionell inkompatibel mit Mutationen in einem überlappenden oder in einem anderen Bereich des Moleküls sein. In diesen Fällen kann die Hormon-Phagemid-Anreicherung nach einer von mehreren Variationen des iterativen Anreicherungswegs durchgeführt werden: (1) statistische DNA-Banken können in jeder der beiden (oder vielleicht mehreren) Regionen des Moleküls durch Kassetten- oder ein anderes Mutageneseverfahren erzeugt werden. Danach kann eine kombinierte Bank erzeugt werden durch Ligierung von Restriktionsfragmenten aus den beiden DNA-Banken; (2) eine hGH-Variante, die durch Mutation in einer Region des Moleküls für die Bindung optimiert wurde, kann in einer zweiten Region des Moleküls statistisch mutiert werden, wie z.B. in dem Beispiel der Helix-4b-Bank; (3) zwei oder mehr statistische Banken können teilweise hinsichtlich verbesserter Bindung durch Hormon-Phagemid-Anreicherung selektioniert werden; nach dieser "Grobanreicherung" der optimierten Bindungsstelle können die immer noch teilweise diversen Banken durch Ligierung von Restriktionsfragmenten rekombiniert werden, um eine einzige Bank, die in zwei oder mehr Regionen der Moleküle teilweise divers ist, zu erzeugen, welche wiederum unter Anwendung von Hormon-Phagemid-Anreicherung weiter hinsichtlich optimierter Bindung selektioniert werden kann. TABELLE XI Mutanten-Phagemide von hGH, die aus der Helix 4b-Bank nach 4 und 6 Anreicherungszyklen selektion lert wurden Selektion von Helix 4b-hGH-Mutanten (statistisch an den Resten 167, 171, 175, 179 mutiert), die jeweils die E174S/F176Y-Doppelmutante enthalten, durch Bindung an hGHbp-Perlen und Elution mit hGH (0,4 mM)-Puffer, gefolgt von Glycinpuffer (0,2 M, pH 2). Eine Mutante (+) enthielt die falsche Mutation R178H. TABELLE XII Konsensus-sequenzen aus der Selektion lerten Bank Die beobachtete Frequenz ist der Bruchteil aller Klone, die mit der angegebenen Aminosäure sequenziert wurden. Die nominale Frequenz ist auf der Basis der NNS 32-Codon-Degeneration berechnet. Der maximale Anreicherungsfaktor variiert von 11 bis 16 bis 32, je nach dem Wert der nominalen Frequenz für einen gegebenen Rest. Werte von [Kd(Ala mut)/Kd(Wt-hGH)] für Alanin- Einzelmutationen wurden den folgenden Referenzen entnommen; für Position 175 haben wir nur einen Wert für die T175S-Mutante (B.C. Cunningham, P. Jhurani, P. Ng, J.A. Wells, Science 243,1330 (1989); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Science 244, 1081(1989); B.C. Cunningham, D.J. Henner, J.A. Wells, Science 247, 1461 (1990); B.C. Cunningham und J.A. Wells, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 3407 (1991)]. TABELLE XIII Bindung gereinigter hGH-Mutanten an hGHbp Konkurrenzbindungsexperjrnente wurden durchgeführt unter Verwendung von [¹²&sup5;I]- hGH (Wildtyp), hGHbp (enthaltend die extrazelluläre Rezeptordomäne; Reste 1-238) und Mab263 (11). Die Zahl P zeigt die relative Häufigkeit des Auftretens einer jeden Mutante unter allen sequenzierten klonen nach einem oder mehreren Selektionsdurchgängen Es ist zu beachten, daß die Helix 4b-Mutationen (*) vor dem Hintergrund von hGH (E174S/F176Y) vorliegen. In der Liste der Helix 4b-Mutanten ist die E174S/F176Y-Mutante (*) mit wildtyp-Resten bei 167, 171, 175, 179 in Fettdruck dargestellt.

BEISPIEL XI

Zusammenbau des Fab-Molekuis auf der Phagemid-Oberfläche

Konstruktion von Plasmiden

Das Plasmid pDH 188 enthält die DNA, welche für den Fab-Anteil eines humanisierten IgG-Antikörpers mit der Bezeichnung 4D5 kodiert, welcher den HER- 2-Rezeptor erkennt. Dieses Plasmid ist im E. coli-Stamm SR101 enthalten und wurde bei der ATCC in Rockville, MC, hinterlegt.
Kurz gesagt, wurde das Plasmid wie folgt hergestellt: das Ausgangsplasmid war PS0132, enthaltend den Promotor der alkalischen Phosphatase wie oben beschrieben. Die für das Humanwachstumshormon kodierende DNA wurde ausgeschnitten und nach einer Reihe von Manipulationen, um die Enden des Plasmids für die Ligierung kompatibel zu machen, wurde die für 4D5 kodierende DNA inseriert. Die 4D5-DNA enthält zwei Gene. Das erste Gen kodiert für die variablen und konstanten Regionen der leichten Kette und enthält an seinem 5'- Ende die DNA, welche für die stII-Signalsequenz kodiert. Das zweite Gen enthält vier Abschnitte: zuerst befindet sich an seinem 5'-Ende die DNA, welche für die stII- Signalsequenz kodiert; dieser folgt die DNA, welche für die variable Domäne der schweren Kette kodiert, welcher die DNA folgt, die für die erste Domäne der konstanten Region der schweren Kette kodiert&sub1; welcher wiederum die DNA folgt, die für das M13-Gen III kodiert. Die wesentlichen Merkmale djeses Konstrukts sind in Figur 10 gezeigt. Die Sequenz der DNA, die für 4D5 kodiert, ist in Figur 11 dargestellt.

E. coli-Transformation und Phagenproduktion

Sowohl Polyethylenglykol (PEG) als auch Elektroporation wurden eingesetzt, um Plasmide in SR101-Zellen zu transformieren (PEG-kompetente Zellen wurden hergestellt und transformiert nach dem Verfahren von Chung und Miller (Nucleic Acids Res. 16:3580 [1988]). Zellen, die für die Elektroporation kompetent waren, wurden hergestellt und anschließend durch Elektroporation transformiert nach dem Verfahren von Zabarovsky und Winberg (Nucleic Acids Res. 18:5912 (1990]). Nach der Plazierung der Zellen in 1 ml der SOC-Medien (beschrieben in Sambrook et al., supra) wurden sie 1 Stunde lang bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Konzentration der Zellen mit Hilfe von Lichtstreuung bei OD&sub6;&sub0; bestimmt. Es wurde eine titrierte KO7-Phagenstammlösung zugegeben, um eine Muliplizität der Infektion (MOI) von 100 zu erzielen, und den Phagen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur die Anhaftung an die Zellen gestattet. Diese Mischung wurde dann in 25 ml 2YT-Brühe (beschrieben in Sambrook et al., supra) verdünnt und unter Schütteln bei 37ºC über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 × g für 10 Minuten pelletiert, der Überstand gewonnen und die Phagenpartikel mit 0,5 M NaCl und 4% PEG (Endkonzentration) bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gefällt. Die Phagenpartikel wurden durch 10- minütige Zentrifugation bei 10.000 × g pelletiert, in 1 ml TEN (10 mM Tris, pH 7,6, 1 mM EDTA und 150 mM NaCl) resuspendiert und bei 4ºC gelagert.

Herstellung von Antigen-beschichteten Platten

Aliquots von 0,5 ml aus einer Lösung von 0,1 mg/ml der extrazellulären Domäne des HER-2-Antigens (ECD) oder einer Lösung von 0,5 mg/ml BSA (Kontroll-Antigen) in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,5 wurden eingesetzt, um eine Vertiefung einer Falcon-Gewebekulturplatte mit 12 Vertiefungen zu beschichten. Nachdem die Lösung auf die Vertiefungen aufgetragen war, wurden die Platten bei 4ºC auf einer Schüttelplattform über Nacht inkubiert. Die Platten wurden dann blockiert durch Entfernung der ursprünglichen Lösung, Aufbringen von 0,5 ml Blockierungspuffer (30 mg/ml BSA in 0,1 M Natriumbicarbonat) und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Schließlich wurde der Blockierungspuffer entfernt, 1 ml Puffer A (PBS, 0,5% BSA und 0,05% Tween-20) zugegeben und die Platten vor ihrer Verwendung zur Phagenselektion bis zu 10 Tage bei 4ºC gelagert.

Phagenselektionsverfahren

Etwa 10&sup9; Phagenpartikel wurden mit einem 100fachen Überschuß an KO7- Helferphagen und 1 ml Puffer A gemischt. Diese Mischung wurde in zwei 0,5 ml- Aliquots aufgeteilt; eines davon wurde auf ECD-beschichtete Vertiefungen aufgetragen und das andere auf BSA-beschichtete Vertiefungen aufgetragen. Die Platten wurden bei Raumtemperatur unter Schütteln 1 bis 3 Stunden inkubiert und dann dreimal innerhalb eines Zeitraums von 30 Minuten mit 1 ml-Aliquots von Puffer A gewaschen. Die Elution der Phagen von den Platten erfolgte bei Raumtemperatur nach einem von zwei Verfahren: 1) einer ersten Inkubation von 0,025 mg/ml gereinigtem Mu4D5-Antikörper (der Maus) über Nacht, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation mit 0,4 ml des sauren Elutionspuffers (0,2 M Glycin, pH 2,1, 0,5% BSA und 0,05% Tween-20), oder 2) einer Inkubation mit dem sauren Elutionspuffer allein. Die Eluate wurden dann mit 1 M Tris-Base neutralisiert und ein 0,5 ml-Aliquot von TEN zugegeben. Diese Proben wurden dann vermehrt, titriert und bei 4ºC gelagert.

Phagenvermehrung

Aliquots der eluierten Phagen wurden zu 0,4 ml 2YT-Brühe zugegeben und mit etwa 108 männlichen E. coli des Stammes SR101 in der Mitte der logarithmischen Phase gemischt. Den Phagen wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur die Anhaftung an die Zellen gestattet und dann wurden sie zu 5 ml 2YT-Brühe zugegeben, welche 50 pg/ml Carbenicillin und 5 pg/ml Tetracyclin enthielt. Diese Zellen wurden 4 bis 8 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet, bis sie die Mitte der logarithmischen Phase erreichten. Es wurde die OD&sub6;&sub0;&sub0; bestimmt und die Zellen mit KO7-Helferphagen zur Phagenproduktion superinfiziert. Nachdem Phagenpartikel erhalten worden waren, wurden sie titriert, um die Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten (cfu) zu bestimmen. Dies erfolgte, indem Aliquots von Reihenverdünnungen einer gegebenen Phagenstammlösung entnommen wurden, ihnen die Infektion von SR101 in der mittleren logarithmischen Phase gestattet wurde, und diese auf LB-Platten mit 50 ug/ml Carbenicillin ausplattiert wurden.

RIA-Affinitätsbestimmung

Die Affinität der h4D5-Fab-Fragmente und Fab-Phagen für das ECD-Antigen wurde bestimmt unter Anwendung eines kompetitiven Rezeptorbindungs-RIA (Burt, D.R., Receptor Binding in Drug Research. O'Brien, R.A. (Hrsg.), S. 3-29, Dekker, New York (1986]). Das ECD-Antigen wurde mit ¹²&sup5;-Iod markiert unter Anwendung des sequentiellen Chloramin-T-Verfahrens (De Larco, J.E., et al., J Cell Physiol 109:143-152 (1981]), welches einen radioaktiven "Tracer" mit einer spezifischen Aktivität von 14 uCi/ug und eine Inkubation von 0,47 Mol Iod pro Mol Rezeptor ergab. Eine Reihe von 0,2 ml-Lösungen, die 0,5 ng (nach ELISA) an Fab oder Fab- Phagen, 50 nCi an ¹²&sup5;I-ECD-Tracer und ein Spektrum unmarkierter ECD-Mengen (6,4 ng bis 3277 ng) enthielten, wurde hergestellt und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Der markierte ECD-Fab- oder ECD-Fab-Phagen-Komplex wurde von dem ungebundenen markierten Antigen abgetrennt durch Bildung eines Aggregatkomplexes, der durch die Zugabe eines Anti-Human-lgg (Fitzgerald 30-GH23) und 6% PEG 8000 induziert wurde. Der komplex wurde durch Zentrifugation (15.000 × g für 20 Minuten) pelletiert und die Menge an markiertem ECD (in CPM) mit einem Gamma-Zähler bestimmt. Die Dissoziationskonstante (Kd) wurde durch Verwendung einer modifizierten Version des Programms LIGAND (Munson, P., und Rothbard, D., Anal. Biochem. 107:220-239 [1980]), welches die Scatchard-Analyse anwendet (Scatchard, G., Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949]), berechnet. Die Kd-Werte sind in Figur 13 dargestellt.

Kompetitiver Zellbindungs-Assay

4D5-Maus-Antikörper wurde mit 125-I bis zu einer spezifischen Aktivität von 40-50 uCi/pg nach dem lodogen-Verfahren markiert. Lösungen, die eine konstante Menge an markiertem Antikörper und zunehmende Mengen an unmarkiertem Varianten-Fab enthielten, wurden hergestellt und zu nahezu konfluenten Kulturen von SK-BR-3-Zellen zugegeben, die in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gezüchtet worden waren (die End konzentration an markiertem Antikörper betrug 0,1 nM). Nach einer Inkubation bei 4ºC über Nacht wurde der Überstand enifemt, die Zellen gewaschen und die Zell-assozuerte Radioaktivität in einem Gamma-Zähler bestimmt. Kd-Werte wurden bestimmt durch Analyse der Daten mit Hilfe einer modifizierten Version des Programms LIGAND (Munson, P., und Rothbard, D., supra).
Diese Hinterlegung des Plasmids pDH188 ATCC-Nr. 68 663 erfolgte gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke eines Patentverfahrens und den entsprechenden Regeln (Budapester Vertrag). Dies stellt die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur für 30 Jahre ab dem Hinterlegungsdatum sicher. Die Organismen werden von ATCC gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags zugänglich gemacht werden und sind Gegenstand einer Vereinbarung zwischen Genentech, Inc. und ATCC, welche die andauernde und unbeschränkte Verfügbarkeit der Abkömmlinge der Kulturen für die Öffentlichkeit nach Erteilung des betreffenden US-Patents oder nach Offenlegung irgendeiner US- oder ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst erfolgt, sicherstellt und die Verfügbarkeit der Abkömmlinge für jemanden sicherstellt, der dazu durch den US-Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 35 USC §122 und den entsprechenden Regeln des Commissioners (einschließlich 37 CFR §1.14 unter besonderem Bezug auf 886 OG 638) ermächtigt wurde.
Der Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung hat zugestimmt, daß, falls die Kulturen der Hinterlegung bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen absterben oder verlorengehen oder zerstört werden sollten, diese sofort bei Mitteilung durch eine lebensfähige Probe derselben Kultur ersetzt würden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Kulturen ist nicht anzusehen als Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Mißachtung der Rechte, welche von einer staatlichen Autorität nach deren Patentgesetzen verliehen wurden.
Die vorstehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend betrachtet, um einem Fachmann die Ausführung der Erfindung zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung soll durch die hinterlegten Kulturen nicht in ihrem Umfang beschränkt werden, da die hinterlegten Ausführungsformen als separate Illustrationen bestimmter Aspekte der Erfindung anzusehen sind, und alle funktionell äquivalenten Kulturen werden vom Umfang dieser Erfindung umfaßt. Die hier vorgenommene Hinterlegung von Material bedeutet kein Zugeständnis, daß die vorliegende schriftliche Beschreibung nicht ausreicht, um die Ausführung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform, zu ermöglichen, noch ist sie als Beschränkung des Umfangs der Ansprüche auf die dadurch repräsentierten speziellen illustrativen Beispiele anzusehen. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung neben den hier dargestellten und beschriebenen für Fachleute anhand der vorstehenden Beschreibung offensichtlich sein und diese werden vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfaßt.
Obwohl die Erfindung notwendigerweise in Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, wird ein Durchschnittsfachmann nach der Lektüre der vorstehenden Beschreibung in der Lage sein, verschiedene Änderungen, Substitutionen von Äquivalenten und Variationen des dargestellten Anmeldegegenstands durchzuführen, ohne über dessen Geist und Umfang hinauszugehen. Somit kann die Erfindung auf anderen Wegen als den hier speziell beschriebenen in die Praxis umgesetzt werden. Der durch das Patent verliehene Schutz soll daher nur durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente beschränkt sein.

BEISPIEL XII Selektion von hGH-Varianten aus Kombinationen von Helix-1- und Helix4- Hormon-Phagen-Vananten

Konstruktion additiver Varianten von hGH

Nach Additionsprinzipien (J.A. Wells, Biochemistry 29, 8509 (1990)] steht zu erwarten, daß Mutationen in verschiedenen Abschnitten eines Proteins, wenn sie nicht miteinander wechselwirken, in Kombination additive Änderungen in der freien Energie der Bindung an ein anderes Molekül ergeben (Veränderungen sind additiv in bezug auf Aagbifldufl&sub9; oder multiplikativ als Kd = exp[-ΔG/RT]). Somit würde eine Mutation, die eine zweifache Erhöhung der Bindungsaffinität ergibt, in Kombination mit einer zweiten Mutation, die eine dreifache Erhöhung verursacht, voraussichtlich eine Doppelmutante mit einer 6fach erhthten Affinität gegenüber der Ausgangsvariante ergeben.
Zur Untersuchung, ob Mehrfachmutationen, die von hGH-Phagenselektionen erhalten wurden, kumulative günstige Auswirkungen auf die Bindung an hGHbp (hGH-bindendes Protein; die extrazelluläre Domäne des hGH-Rezeptors) ergeben würden, kombinierten wir Mutationen, die in den drei am stärksten bindenden hGH-Varianten aus der Helix-1-Bank gefunden wurden (Beispiel IX: F10A/MI4W/H18D/H21N, F10H/M14G/H18N/H21N und F10F/MI4S/H18F/H21L) mit denjenigen, welche in den drei am stärksten bindenden Varianten in der Helix-4b-Bank gefunden wurden (Beispiel X: R167N/D171S/T175/I179T, R167E/D171S/T175/I179 und R167N/D171N/T175/I179T).
Doppeisträngige hGH-Phagemid-DNA (dsDNA) von jeder der 1-Helix- Varianten wurde isoliert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BstXI verdaut. Das große Fragment von jeder Helix-4b-Vanante wurde dann isoliert und mit dem kleinen Fragment von jeder Helix-1-Variante ligiert, um die neuen 2-Helix-Varianten, die in Tabelle XIII gezeigt sind, zu ergeben. Alle diese Varianten enthielten auch die Mutationen E174S/F176Y, die in ffrüheren hGH-Phagenbindungsselektionen erhalten wurden (siehe Beispiel X bezüglich Details).

Konstruktion selektiver Kombinationsbanken von hGH

Obwohl die Additivitätsprinzipien eine Reihe von Kombinationen von Mutationen erklären, sind einige Kombinationen (z.B. E174Smit F176Y) eindeutig nicht-additiv (siehe Beispiele VIII und X). Zur sicheren Identifizierung der am stärksten bindenden Variante, mit beispielsweise 4 Mutationen in der Helix-1 und 4 Mutationen in der Helix-4, würde man idealerweise alle 8 Reste gleichzeitig mutieren und dann den Pool für die insgesamt am stärksten bindende Variante durchmustern. Solch ein Pool würde jedoch aus 1,1 × 10¹² DNA-Sequenzen (unter Verwendung der NNS-Codon-Degeneration) bestehen, die für 2,6 × 10¹&sup0; verschiedene Polypeptide kodieren. Die Erstellung einer statistischen Phagemid-Bank, die groß genug ist, um die Repräsentation aller Varianten ( vielleicht 10¹³ Transformanten) sicherzustellen, ist bei Einsatz der gegenwärtigen Transformationstechnologie nicht praktikabel.
Wir bewältigten diese Schwierigkeit, indem zuerst aufeinanderfolgende Mutagenesedurchgänge eingesetzt wurden, wobei die am stärksten bindende Variante aus einer Bank genommen wurde und dann andere Reste mutiert wurden, um die Bindung weiter zu verbessern (Beispiel X). Bei einem zweiten Verfahren verwendeten wir das Prinzip der Additivität, um die besten Mutationen von zwei unabhängig durchmusterten Banken zu kombinieren, um Mehrfachmutanten mit verbesserter Bindung zu erzeugen (oben beschrieben). Hier untersuchten wir ferner die möglichen kombinationen von Mutationen an den Positionen 10, 14, 18, 21, 167, 171, 175 und 179 in hGH, indem Kombinationsbanken von statistischen oder teilweise statistischen Mutanten erzeugt wurden. Wir konstruierten drei verschiedene Kombinationsbanken von hGH-Phagemiden unter Verwendung der gepoolten Phagemide aus der Helix-1-Bank (unabhängig für 0, 2 oder 4 Zyklen durchmustert; Beispiel IX) und des Pools aus der Helix 4b-.Bank (unabhängig für 0, 2 oder 4 Zyklen durchmustert; Äeispiel X) und durchmusterten den Kombinationsvarianten-Pool auf hGHbp-Bindung. Nachdem ein gewisses Maß an Sequenzunterschieden in jedem dieser Pools auftritt, kann die resultierende Kombinationsbank mehr Sequenzkombinationen untersuchen, als wir manuell konstruieren könnten (z. B. Tabelle XIII).
Doppelsträngige hGH-Phagemid-DNA (dsDNA) aus jedem der 1-Helix-Bank- Pools (selektioniert für 0, 2 oder 4 Durchgänge) wurde isoliert und mit den Restriktionsenzymen Acci und BstXI verdaut. Das große Fragment von jedem Helix- 1-Varianten-Pool Wurde dann isoliert und mit dem kleinen Fragment von jedem Helix- 4b-Varianten-Pool ligiert, um die drei kombinationsbanken pH0707A (unselektionierte Helix-1- und Helix-4b-Pools wie in den Beispielen IX und X beschrieben), pH0707B (zweimal selektionierter Helix-1-Pool mit zweimal selektioniertem Helix-4b- Pool) und PH0707C (viermal selektionierter Helix-1-Pool mit viermal selektioniertem Helix-4b-Pool) zu ergeben. Es wurden auch Ligierungen als Duplikate mit weniger DNA durchgeführt und als PH0707D, PH0707E und PH0707F, entsprechend den Ausgangsbanken mit 0, 2 bzw. 4 Durchgängen, bezeichnet. Alle diese Varianten- Pools enthielten auch die Mutationen E1714S/F176Y, die in früheren hGH-Phagen bindungsselektionen erhalten worden waren (siehe Beispiel X hinsichtlich Details).

Durchmusterung von Kombinationsbanken von hGH-Phagen-Varianten

Die Ligierungsprodukte pH0707A-F wurden weiterbehandelt und in XL1-Blue- Zeilen wie beschrieben elektrotransformiert (Beispiel VI II). Auf der Basis von Koloniebildenden Einheiten (CFU) war die Anzahl der aus jedem Pool erhaltenen Transformanten wie folgt; 2,4 x 10&sup6; von pH0707A, 1,8 × 10&sup6; von PH0707B, 1,6 × 10&sup6; von pH0707C, 8 × 10&sup5; von pH0707D, 3 × 10&sup5; von pH0707E und 4×10&sup5; von pH0707F. Die hGH-Phagemid-Partikel wurden hergestellt und auf hGHbp-Bindung über 2 bis 7 Zyklen selektioniert wie in Beispiel VIII beschrieben.

Schnelle Durchmusterung von hGH-Phagemid-Banken

Neben der Durchmusterung von Phagemid-Banken hinsichtlich stark bindender Proteinvarianten, wie durch Gleichgewichtsbindungsaffinität gemessen, ist es von Interesse, auch auf Varianten zu selektionieren, welche entweder eine veränderte Assoziationsgeschwindigkeit (kas; "kon") oder Dissoziationsgeschwindigkeit (kdis; "koff") der Bindung an einen Rezeptor oder ein anderes Molekül aufweisen. Nach der Thermodynamik stehen diese Geschwindigkeiten mit der Gleichgewichts dissoziationskonstante in Beziehung (Kd = (kdis/kas). Wir gehen davon aus, daß bestimmte Varianten eines bestimmten Proteins ähnliche Kd 'n für die Bindung aufweisen, obwohl sie sehr verschiedene kas 'n und kdis 'n aufweisen. Umgekehrt können Kd-Änderungen von einer Variante zur anderen auf Wirkungen auf die kas, Wirkungen auf die kdis oder auf beiden beruhen. Die pharmakologischen Eigenschaften eines Proteins können von der Bindungsaffinität oder von der kas oder kdis abhängen, je nach dem genauen Wirkungsmechanismus. Hier versuchten wir hGH-Varianten mit höheren Assoziationsgeschwindigkeiten zu identifizieren, um die Auswirkungen von kas-Änderungen zu untersuchen. Wir gehen davon aus, daß die Selektion alternativ hinsichtlich kdis beeinflußt werden könnte, indem die Bindungszeit erhöht und die Waschzeit und/oder die Konzentration mit dem entsprechenden Liganden (hGH) erhöht wird.
Nach Analysen des zeitlichen Verlaufs der Wiidtyp-hGH-Phagemid-Bindung an immobilisiertes hGHbp scheint es so, daß von den gesamten hGH-Phagemid- Partikeln, die in dem letzten Waschschritt bei pH 2 eluiert werden können (siehe Beispiel VIII für das vollständige Bindungs- und Elutionsprotokoll), weniger als 10% nach 1 Minute Inkubation gebunden sind, während mehr als 90% nach 15 Minuten Inkubation gebunden sind.
Zur "Schnellbindungsselektion" wurden Phagemid-Partikel aus dem Ph0707B- Pool (zweimal unabhängig für die Helices 1 und 4 selektioniert) nur 1 Minute lang mit immobilisiertem hGHbp inkubiert, dann sechsmal mit 1 ml Bindungspuffer gewaschen, der hGH-Waschschritt unterlassen und die verbleibenden hGH- Phagemid-Partikel mit einem Waschschritt bei pH2 (0,2 M Glycin in Bindungspuffer) eluiert. Die Anreicherung der hGH-Phagemid-Partikel gegenüber nichtpräsentierenden Partikeln zeigte, daß selbst mit einer kurzen Bindungszeit und keiner Herausforderung mit zugehörigem Ligand (hGH) die hGH-Phagemid Bindungsselektion stark bindende Varianten aus einem statistischen (randomisierten) Pool selektioniert.

Assay von hGH-Mutanten

Die Bindungskonstanten für einige dieser hGH-Varianten an hGHbp wurde bestimmt durch Expression der freien Hormonvarianten in dem Nicht- Suppressorstamm E. coli 16C9 oder 34B8, Reinigung des Proteins und Nachweis durch kompetitive Verdrängung von markiertem Wt-hGH von hGHbp (siehe Beispiel VIII) in einem Radioimmunopräzipitations-Assay. In Tabelle XIII-A unten weisen alle Varianten den Austausch von Glutamat&sub1;&sub7;&sub4; durch Serin&sub1;&sub7;&sub4; und von Phenylalanin&sub1;&sub7;&sub6; durch Thyrosin&sub1;&sub7;&sub6; auf (E174S und F176Y) plus die zusätzlichen Substitutionen wie an den hGH-Aminosäurepositionen 10,14,18, 21,176,171,175 und 179 angezeigt. TABELLE XIII-A hGH-Varianten aus der Addition von Helix-1- und Helix-4b-Mutationen

H rp(1 Helix4

In der folgenden Tabelle XIV wurden hGH-Varianten durch das Phagemid- Bindungsselektionsverfahren aus Kombinationsbanken selektioniert. Alle hGH- Varianten in der Tabelle XIV enthalten zwei Hintergrundmutationen (E174S/F176Y). hGH-Phagemid-Pools aus den Banken pH0707A (Teil A), pH0707B und pH0707E (Teil B) oder pH0707C (Teil C) wurden 2 bis 7 Zyklen lang auf die Bindung an hGHbp durchmustert. Die Zahl P zeigt die relative Häufigkeit des Auftretens eines jeden Variantentyps in dem Satz von Klonen, der aus jedem Pool sequenziert wurde. TABELLE XIV hGH-Varianten aus der Hormon-Phagemid-Bindungsselektion von Komblnationsbanken
* = enthielt auch die Mutationen L15R, K168R
In der folgenden Tabelle XV wurden hGH-Varianten nach dem Phagemid- Bindungsselektionsverfahren aus kombinationsbanken selektioniert. Alle hGH- Varianten in der Tabelle XV enthalten zwei Hintergrundmutationen (E174S/F176Y).
Die Zahl P ist die relative Häufigkeit des Auftretens einer gegebenen Variante bei allen Klonen, die nach 4 Zyklen einer Schnellbindungsselektion sequenziert wurden. TABELLE XV hGH-Varianten einer SCHNELL-hGHbp-Bindungsselektion einer hGH-Phagemid- Kombinationsbank
= enthielt auch die Mutation Y176F (Wildtyp-hGH enthält auch F176).
In der folgenden Tabelle XVI wurden die Bindungskonstanten gemessen durch konkurrierende Verdrängung von ¹²&sup5;I-markiertem Hörmon H0650BD oder markiertem hGH unter Verwendung von hGHbp (1-238) und entweder Mabs oder Mab263. Die Variante H0650BD scheint mehr als 30fach stärker als Wildtyp-hGH zu binden. TABELLE XVI

BEISPIEL XIII

Selektive Anreicherung von hGH-Phagen, die eine Protease-Substratsequenz enthalten, gegenüber Nicht-Substrat-Phagen

Wie im Beispiel 1 beschrieben, enthält das Plasmid pS0132 das Gen für hGH fusioniert mit dem Rest Pro 198 des Gen III-Proteins unter Insertion eines zusätzlichen Glycinrests. Dieses Plasmid kann verwendet werden, um hGH- Phagenpartikel zu produzieren, bei denen das hGH-Gen III-Fusionsprodukt monovalent auf der Phagenoberfläche präsentiert wird (Beispiel IV). Das Fusionsprotein umfaßt das gesamte hGH-Protein über eine flexible Linker-Sequenz mit der carboxyterminalen Domäne des Gens III fusioniert.
Um zu untersuchen, ob es möglich wäre, die Phagen-Präsentationstechnik zur Selektion günstiger Substratsequenzen für ein gegebenes proteolytisches Enzym einzusetzen, wurde ei ne gentechnisch konstruierte Variante von Subtilisin BPN' eingesetzt (Carter, P., et al., Proteins: Structure, function and genetics 6:240-248 (1989)). Diese Variante (im folgenden als A64SAL-Subtilisin bezeichnet) enthält die folgenden Mutationen: Ser24Cys, His64Ala, Glu156Ser, Gly169Ala und Tyr217leu. Nachdem diesem Enzym der wesentliche katalytische Rest Hi564 fehlt, ist dessen Substratspezifltät stark eingeschränkt, so daß bestimmte Histidin-enthaltende Substrate bevorzugt hydrolysiert werden (Carter et al., Science 237:394-399 (1987)).

Konstruktion eines hGH-Substrat-Phagenvektors

Die Sequenz der Linker-Region in pS0132 wurde unter Verwendung des Oligonukleotids 5'-TTC-GGG-CCC-TTC-GCT-GCT-CAC-TAT-ACG-CGT-CAG-TCG- ACT-GAC-CTG-CCT-3' mutiert, um eine Substratsequenz für A64SAL-Subtilisin zu erzeugen. Dies führte zur Einführung der Proteinsequenz Phe-Gly-Pro-Phe-Ala-Ala- His-Tyr-Thr-Arg-Gln-Ser-Thr-Asp in der Linker-Region zwischen hGH und der carboxyterminalen Domäne des Gens III, wo der erste Phe-Rest in der obigen Sequenz Phel 91 von hGH ist. Die Sequenz Ala-Ala-His-Tyr-Thr-Arg-Gln ist bekanntermaßen ein gutes Substrat für A64SAL-Subtilisin (Carter et al. (1989), supra). Das resultierende Plasmid wurde als pS0640 bezeichnet.

Selektive Anreicherung von hGH-Substrat-Phagen

Phagemid-Partikel, abgeleitet von pS0132 und pS0640, wurden konstruiert wie in Beispiel 1 beschrieben. In Vorexperimenten wurde ein 10 ul-Aliquot eines jeden Phagenpools separat mit 30 ul Oxiran-Perlen (hergestellt wie in Beispiel II beschrieben) in 100 ul Puffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 8,6 und 2,5 M NaCl umfaßte, gemischt. Die Bindungs- und Waschschritte erfolgten wie in Beispiel VII beschrieben. Die Perlen wurden dann in 400 ul des gleichen Puffers resuspendiert, mit oder ohne 50 nM an A64SAL-Subtilisin. Nach 1 0-minütiger Inkubation wurden die Überstände gewonnen und die Phagentiter (cfu) gemessen. Tabelle XVII zeigt, daß etwa 10-mal mehr Substrat-enthaltende Phagemid-Partikel (pS0640) in Gegenwart von Enzym eluiert wurden als in Abwesenheit des Enzyms, oder im Fall der Nicht-Substrat- Phagemide (pS0132) in Gegenwart oder Abwesenheit des Enzyms. Die Erhöhung der Enzym-, Phagemid oder Perlenkonzentrationen verbesserte dieses Verhältnis nicht.

Verbesserung des selektiven Anreicherungsverfahrens

In einem Versuch, die nicht-spezifische Elution immobilisierter Phagemide herabzusetzen, wurde ein stark bindende hGH-Variante anstelle des Wildtyp-hGH- Gens in pS0132 und pS0640 eingeführt. Die eingesetzte hGH-Variante war wie in Beispiel XI (pH0650bd) beschrieben und enthält die Mutationen Phe10Ala, Metl4trp, His18Asp, His21Asn, Arg167Asn, Asp171Ser, Glu174Ser, Phe176Tyr und Ile179Thr. Dies resultierte in der Konstruktion von zwei neuen Phagemiden: pDM0390 (enthaltend stark bindendes hGH und keine Substratsequenz) und pDM0411 (enthaltend stark bindendes hGH und die Substratsequenz Ala-Ala-His- Tyr-Thr-Arg-Gln). Das Bindungs-, Wasch- und Elutionsprotokoll wurde ebenfalls wie folgt geändert:
(i) Bindung: COSTAR-Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen wurden 16 Stunden lang mit 0,5 ml/Vertiefung an 2 ug/ml hGHbp in Natriumcarbonatpuffer, pH 10,0, beschichtet. Die Platten wurden dann mit 1 ml/Vertiefung Blockierungspuffer (phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), die 0,1% w/v Rinderserumalbumin enthielt) 2 Stunden lang inkubiert und in einem Assay-Puffer gewaschen, der 10 mM Tris-HCl pH 7,5,1 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt. Phagemide wurden wieder wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt: der Phagenpool wurde 1:4 im obigen Assay-Puffer verdünnt und 0,5 ml Phagen pro Vertiefung 2 Stunden lang inkubiert.
(ii) Waschschritte: Die Platten wurden sorgfältig mit PBS + 0,05% Tween 20 gewaschen und 30 Minuten lang mit 1 ml dieses Waschpuffers inkubiert. Dieser Waschschritt wurde dreimal wiederholt.
(iii) Elution: Die Platten wurden 10 Minuten lang in einem Elutionspuffer inkubiert, der aus 20 mM Tris-HCl, pH 8,6 + 100 mM NaCl bestand, dann wurden die Platten mit 0,5 ml des obigen Puffers mit oder ohne 500 nM A64SAL-Subtilisin eluiert.
Tabelle XVII zeigt, daß es im Vergleich zu dem vorher für pS0640 und pS0132 beschriebenen Verfahren eine dramatische Erhöhung des Verhältnisses von spezifisch eluierten Substrat-Phagemid-Partikeln gab. Es ist wahrscheinlich, daß dies auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß die stark bindende hGH-Mutante im Vergleich zu Wildtyp-hGH eine signifikant langsamere Dissoziationsgeschwindigkeit für die Bindung an das hGH-bindende Protein aufweist. TABELLE XVII Spezifische Elution von Substrat-Phagemiden durch A64SAL-Subtilisin Kolonie-bildende Einheiten (cfu) wurden bestimmt durch Ausplattieren von 10 ul an 10fach-Phagenverdünnungen auf 10 ul-Flecken von XL-1 Blue-Zeilen auf LB- Agarplatten, die 50 ug/ml Carbenicillin enthielten

BEISPIEL XIV

Identifizierung bevorzugter Substrate für A64SAL-Subtilisin unter Anwendung selektiver Anreicherung einer Bank von Substratsequenzen

Wir versuchten, das in Beispiel XIII beschriebene selektive Anreicherungsverfahren einzusetzen, um gute Substratsequenzen aus einer Bank von statistischen Substratsequenzen zu identifizieren.

Konstruktion eines Vektors zur Insertion randomisierter Substrat-Kassetten

Wir konstruierten einen Vektor, der sich zur Einführung von randomisierten Substrat-Kassetten und zur nachfolgenden Expression einer Bank von Substratsequenzen eignet. Der Ausgangspunkt war der Vektor pS0643, beschrieben in Beispiel VIII. Es wurde eine stellengerichtete Mutagenese durchgeführt unter Verwendung des Oligonukleotids 5'-AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-GCC-GCC- GCG-TCG-ACT-GGC-GGT-GGC-TCT-3³, welches ApaI (GGGCCC)- und SalI (GTCGAC)-Restnktionsstellen zwischen hGH und dem Gen III einführt. Dieses neue Konstrukt erhielt die Bezeichnung pDM0253 (die tatsächliche Sequenz von pDM0253 ist 5'AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-GCC-CCC-GCG-TCG-ACT-GGC- GGT-GGC-TCT-3', worin die unterstrichene Basensubstitution auf einem irrtümlichen Fehler in dem mutagenen Oligonukleotid beruht). Darüber hinaus wurde die im Beispiel beschriebene stark bindende hGH-Variante durch Austausch eines Fragments aus pDM0411 (Beispiel XIII) eingef(ihrt. Der resultierende Bank-Vektor erhielt die Bezeichnung pDM0454.

Herstellung des Bank-Kassetten-Vektors und Insertion einer mutagenen Kassette

Zur Einführung einer Bank-Kassette wurde pDM0454 mit Apal, gefolgt von Sall, verdaut, dann mit 13% PEG 8000 + 10 mM MgCl&sub2; gefällt, zweimal in 70% Ethanol gewaschen und resuspendiert. Dies fällt effizient den Vektor aus, läßt jedoch das kleine Apa-Sal-Fragment in der Lösung zurück (Paithankar, K.R., und Prasad, K.S.N., Nucleic Acids Research 19:1346). Das Produkt wurde auf einem 1%igen Agarosegel laufengelassen und der Apa-SalI-verdaute Vektor ausgeschnitten&sub1; unter Verwendung eines "Bandprep-Kits" (Pharmacia) gereinigt und für die Ligierung mit der mutagenen Kassette resuspendiert.
Die zu inserierende Kassette enthielt eine DNA-Sequenz, die der im Linker- Bereich von pS0640 und pDM0411 ähnlich war, bei der jedoch die Codons für die Histidin- und Tyrosinreste in der Substratsequeni durch randomisierte Codons ersetzt waren. Wir entschlossen zu einer Substitution durch NNS (N=G/A/T/C; S=G/C) an jeder der randomisierten Positionen wie im Beispiel VIII beschrieben. Die bei den mutagenen Kassetten verwendeten Oligonukleotide waren: 5'-C-TTC-GCT- GCT-NNS-NNS-ACC-CGG-CAA-3' (kodierender Strang) und 5'-T-CGA-TTG-CCG- GGT-SNN-SNN-AGC-AGC-GAA-GGG-CC-3' (nicht-kodierender Strang). Diese Kassette eliminiert auch die Sah-Stelle, so daß eine Verdauung mit Sah zur Verringerung des Vektorhintergrunds eingesetzt werden kann. Die Oligonukleotide wurden vor der Insertion in die Apa-SalI-Kassettenstelle nicht phosphoryliert, da befürchtet wurde, daß eine nachfolgende Oligomerisierung einer kleinen Population der Kassetten zu falschen Ergebnissen mit Mehrfachkassetten-lnserts führen könnte. Nach der Verschmelzung und Ligierung wurden die Reaktionsprodukte mit Phenol:Chloroform extrahiert, ethanolgefällt und in Wasser resuspendiert. Zunächst wurde keine Verdauung mit Sah zu Verringerung des Hintergrundvektors durchgeführt. Es wurden etwa 200 ng in XL-1-Biue-Zeiien elektroporiert und eine Phagemid-Bank wie in Beispiel VIII beschrieben hergestellt.

Selektion hoch spaltbarer Substrate aus der Substrat-Bank

Das angewandte Selektionsverfahren war mit dem für pDM0411 und pDM0390 in Beispiel XIII beschriebenen identisch. Nach jedem Selektionsdurchgang wurden die eluierten Phagen durch Transduktion einer frischen Kultur von XL-1- Blue-Zellen und Vermehrung einer neuen Phagemid-Bank wie für hGH-Phagen in Beispiel VIII beschrieben vermehrt. Der Fortschritt des Selektionsverfahrens wurde überwacht durch Messung eluierter Phagentiter und durch Sequenzierung von einzelnen Klonen nach jedem Selektionsdurchgang.
Tabelle A zeigt die sukzessiven Phagentiter für die Elution in Gegenwart und Abwesenheit von Enzym nach 1, 2 und 3 Selektionsdurchgängen.
Das Verhältnis von spezifisch eluierten Phagen zu unspezifisch eluierten Phagen (d.h., mit Enzym eluierte Phagen : ohne Enzym eluierte Phagen) nimmt von Durchgang 1 bis Durchgang 3 eindeutig dramatisch zu, was nahelegt, daß die Population guter Substrate mit jedem Selektionsdurchgang zunimmt.
Die Sequenzierung von 10 Isolaten aus der Ausgangsbank zeigte, daß sie alle aus der pDM0464-Wildtypsequenz bestanden. Dies wird der Tatsache zugeschrieben, daß nach der Verdauung mit Apal die Sah-Stelle sehr nahe am Ende des DNA-Fragments liegt, was so zu einer geringen Verdauungseffizienz führt. Nichtsdestoweniger gibt es nur 400 mögliche Sequenzen in der Bank, so daß diese Population immer noch gut repräsentiert sein sollte.
Die Tabellen B1 und B2 zeigen die Sequenzen von Isolaten, die nach dem zweiten und dritten Durchgang der Selektion erhalten wurden. Nach zwei Selektionsdurchgängen treten Histidinreste eindeutig vermehrt auf. Dies entspricht exakt der Erwartung: wie im Beispiel XIII beschrieben, erfordert A64SAL-Subtilisin Histidinrest im Substrat, da es einen Substrat-unterstützten katalytischen Mechanismus verwendet. Nach drei Selektions-durchgängen besitzt jeder der sequenzierten 10 Klone ein Histidin in der randomisierten Kassette. Es ist jedoch zu beachten, daß zwei der Sequenzen von pDM0411 stammen, das in der Ausgangsbank nicht vorhanden war und somit eine Verunreinigung darstellt. TABELLE A Titration der ersten Phagenpools und eluierten Phagen nach 3 Durchgängen selektiver Anreicherung Kolonie-bildende Einheiten (cfu) wurden bestimmt durch Ausplattieren von 10 ul an 10fach-Phagenverdünnungen auf 10 ul-Flecken von XL-1-Blue-Zellen auf LB- Agarplatten mit 50 ug/ml Carbenicillin.

TABELLE B1

Sequenzen eluierter Phagen nach zwei Durchgängen selektiver Anreicherung

Alle Proteinsequenzen sollten die Form AA**TRQ aufweisen, wobei * einen randomisierten Codon darstellt. In der folgenden Tabelle sind die randomisierten Codons und Aminosäuren unterstrichen und fettgedruckt.
≠- täuschende Deletion eines Codons innerhalb der Kassette
≠≠- zweideutige Sequenz TABELLE B2 Sequenzen eluierter Phagen nach zwei Durchgängen selektiver Anreicherung Alle Proteinsequenzen sollten die Form AA**TRQ aufweisen, wobei * einen randomisierten Codon darstellt. In der folgenden Tabelle sind die randomisierten Codons und Aminosäuren unterstrichen und fettgedruckt.
≠- kontaminierende Sequenz aus pDM0400
≠≠- enthält das "illegale" Codon CAT - T sollte in der drillen Position eines Codons nicht erscheinen.

Claims

1. Verfahren zur Auswahl neuer bindender Polypeptide, welches umfaßt:

(a) Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, umfassend ein regulatorisches Transkriptionselement in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer Genfusion, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei die Genfusion umfaßt

ein erstes Gen, das für ein Polypeptid kodiert, und ein zweites Gen, das für mindestens einen Teil eines Phagenhüliproteins kodiert;

(b) Mutation des Vektors an einer oder mehreren ausgewählten Position(en) innerhalb des ersten Gens, wodurch eine Familie verwandter Plasmide erzeugt wird;

(c) Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden;

(d) Infektion der transformierten Wirtszellen mit einem Helferphagen, der ein für das Phagenhüllprotein kodierendes Gen aufweist;

(e) Kultivierung der transformierten infizierten Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zur Bildung rekombinänter Phagemid-Pärtikel, welche mindestens einen Teil des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts imstande sind, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die Menge oder Anzahl der Phagemid-Partikel, welche mehr als eine einzige Kopie des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Partikels aufweisen, weniger als etwa 20% beträgt;

(f) Kontaktieren der Phagemid-Partikel mit einem Target-Molekül, sodaß mindestens ein Teil der Phagemid-Partikel an das Target-Molekül bindet; und

(g) Abtrennung der bindenden Phagemid-Partikel von den nicht bindenden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das erste Gen für ein Säugerprotein kodiert, das ausgewählt ist aus:

Wachstumshormon, Humanwachstumshormon (hGH), Des-N-methionylhumanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Parathormon, Thyroxin, A-Kette von Insulin, B-Kette von Insulin, Promsulin, A-Kette von Relaxin, B- Kette von Relaxin, Prorelaxin, follikelstimulierendem Hormon (FSH), Thyrotropin (TSH), luteinisierendem Hormon (LH), Glycoprotein- Hormonrezeptoren, Calcitonin, Glucagon, Faktor VIII, einem Antikörper, lungenoberflächenaktivem Mittel, Urokinase, Streptokinase, Humangewebe- Plasminogenaktivator (tPA), Bombesin, Faktor IX, Thrombin, hämopoetischem Wachstumsfaktor, Tumornekrosefaktor Alpha und Beta, Enkephalinase, Humanserumalbumin, Anti-Mülier-Hormon, Mäusegonadotropin-assoziiertern Peptid, β-Lactamase, Gewebefaktor-Protein, Inhibin, Aktivin, Gefäßendothel- Wachstumsfaktor, Integrin-Rezeptoren, Thrombopoetin, Protein A oder D, Rheumafaktoren, NGF-β, Thrombozytenwachstumsfaktor, transformierendem Wachstumsfaktor; TGF-α und TGF-β, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 und II, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Proteinen, CD-4, Dnase, Latenz-assoziiertem Peptid, Erythropoetin, HER2-Liganden, knocheninduzierenden Faktoren, Interferon-α, -β und -γ, Koloniestimulierenden Faktoren (CSF), M-CSF, GM-CSF und G-CSF, Interleukinen (1L), IL-1, 1L-2, 1L-3, 1L-4, Superoxiddismutase; zerfallsbeschleunigendem Faktor ("decay accelerating factor"), viralem Antigen, HIV-Hüllproteinen GP120 und GP140, atrialen natriuretischen Peptiden A, B oder C, oder Immunglobulinen, und Fragmenten der oben aufgeführten Proteine.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Protein ein Humanprotein ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Protein mehr als etwa 100 Aminosäurereste umfaßt.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Protein eine Vielzahl starrer Sekundärstrukturen umfaßt, welche Aminosäuren aufweisen, die mit dem Target wechselwirken können, und die Mutationen in erster Linie an Positionen erzeugt werden, welche für die Aminosäuren kodierenden Codons entsprechen, wobei diese starren Sekundärstrukturen Strukturen umfassen, die aus einer α-(3.6&sub1;&sub3;)-Helix, 3&sub1;&sub0;-Helix, π-(4.4&sub1;&sub6;)-Helix, parallelen und antiparallelen β-Faltblättern, reversen Kehren ("reverse turns") und nicht geordneten Strukturen ausgewählt sind.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Helferphage aus M13KO7, M13R408, M13-VCS und Phi X 174 ausgewählt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Helferphage M13KO7 ist und das Hüllprotein das M13 Phagengen III-Hüllprotein ist.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Wirt E. coll ist und das Plasmid sich unter der strengen Kontrolle des regulatorischen Transkriptionselements befindet.

9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Menge der Phagemid-Partikel, die mehr als eine einzige Kopie des Fusionproteins aufweisen, weniger als etwa 10%, vorzugsweise weniger als etwa 1%, beträgt.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, welches ferner in Schritt (a) umfaßt die Insertion eines DNA-Tripletts, das für ein suppressierbares mRNA-Terminatorcodon kodiert, zwischen dem ersten Gen, das für ein Polypeptid kodiert, und dem zweiten Gen, das für mindestens einen Teil eines Phagenhüllproteins kodiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das supressierbare mRNA-Terminatorcodon ausgewählt ist aus den folgenden: UAG (amber), UM (ocher) und UGA (opel).

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die suppressierbare Mutation in der nachweisbaren Produktion eines Fusionspolypeptids, welches das Polypeptid und das Hüllprotein enthält, resultiert, wenn der Expressionsvektor in einer Suppressor-Wirtszelle gezüchtet wird; und bei Züchtung in einer Nicht-Suppressor-Wirtszelle das Polypeptid im wesentlichen ohne eine Fusion an das Phagenhüllprotein synthetisiert wird.

13. Phagemid-Partikel, erhältlich durch

(a) Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, umfassend ein reg ulatorisches Transkriptionselement in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer Genfusion, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei die Genfusion umfaßt ein erstes Gen, das für ein Polypeptid kodiert, und ein zweites Gen, das für mindestens einen Teil eines Phagenhüllproteins kodiert, ein DNA-Triplett-Codon, das für ein suppressierbares mRNA-Terminatorcodon, ausgewählt aus UAG, UAA und UGA, kodiert, das zwischen den fusionierten Enden des ersten und zweiten Gens inseriert ist oder ein für eine Aminosäure kodierendes, neben der Verbindungsstelle der Genfusion gelegenes Triplett-Codon ersetzt,

(c) Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden;

(d) Infektion der transformierten Wirtszellen mit einem Helferphagen, der ein für das Phagenhüllprotein kodierendes Gen aufweist; und

(e) Züchtung der transformierten infizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Bildung rekombinanter Phagemid-Partikel geeignet sind, welche mindestens einen Teil des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts imstande sind, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die Menge oder Anzahl der Phagemid-Partikel, die mehr als eine einzige Kopie des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Partikels aufweisen, weniger als etwa 20% beträgt.

14. Phagemid-Partikel nach Anspruch 13, worin das erste Gen für ein Säugerprotein kodiert, das ausgewählt ist aus:

Wachstumshormon, Humanwachstumshormon (hGH), Des-N-methionylhumanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Parathormon, Thyroxin, A-Kette von Insulin, B-Kette von Insulin, Promsulin, A-Kette von Relaxin, B- Kette von Relaxin, Prorelaxin, follikelstimulierendem Hormon (FSH), Thyrotropin (TSH), luteinisierendem Hormon (LH), Glycoprotein- Hormonrezeptoren, Calcitonin, Glucagon, Faktor VIII, einem Antikörper, lungenoberflächenaktjvem Mittel, Urokinase, Streptokinase, Humangewebe- Plasminogenaktivator (TPA), Bombesin, Faktor IX, Thrombin, hämopoetischem Wachstumsfaktor, Tumornekrosefaktor Alpha und Beta, Enkephalinase, Humanserumalbumin, Anti-Müller-Hormon, Mäusegonadotropin-assoziiertem Peptid, β-Lactamase, Gewebefaktor-Protein, Inhibin, Aktivin, Gefäßendothel- Wachstumsfaktor, Integrin-Rezeptoren, Thrombopoetin, Protein A oder D, Rheumafaktoren, NGF-β, Thrombozytenwachstumsfaktor, transformierendem Wachstumsfaktor; TGF-α und TGF-β, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor I und II, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Proteinen, CD-4, DNase, Latenz-assoziiertem Peptid, Erythropoetin, HER2-Liganden, knocheninduzierenden Faktoren, Interferon-α, -β und -γ, Koloniestimulierenden Faktoren (CSF), M-CSF, GM-CSF und G-CSF, Interleukinen (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, Superoxiddismutase; zerfallsbeschleunigendem Faktor ("decay accelerating factor"), viralem Antigen, HIV-Hüllproteinen GP120 und GP140, atrialen natriuretischen Peptiden A, B oder C, oder Immunglobulinen, und Fragmenten der oben aufgeführten Proteine.

15. Phagemid-Partikel nach Anspruch 14, worin das Protein ein Humanprotein ist.

16. Phagemid-Partikel nach Anspruch 15, worin das Protein mehr als etwa 100 Aminosäurereste umfaßt.

17. Phagemid-Partikei nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 16, worin das Protein eine Vielzahl starrer Sekundärstrukturen umfaßt, welche Aminosäuren aufweisen, die mit dem Target wechselwirken können, wobei diese starren Sekundärstrukturen Strukturen umfassen, die aus einer α-(3.6&sub1;&sub3;)-Helix, 3&sub1;&sub0;- Helix, π(4.4&sub1;&sub6;)-Helix, parallelen und antiparallelen ß-Faltblättern, reversen Kehren ("reverse turns") und nicht geordneten Strukturen ausgewählt sind.

18. Phagemid-Partikel nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 17, worin der Helferphage aus M13KO7, M13R408, M13-VCS und Phi X 174 ausgewählt ist.

19. Phagemid-Partikel nach Anspruch 18, worin der Helferphage M13KO7 ist und das Hüllprotein das M13 Phagengen III-Hüllprotein ist.

20. Phagemid-Partikel nach Anspruch 19, worin der Wirt der E. Coii-Wildtyp oder - Suppressortyp ist und das Plasmid sich unter der strengen Kontrolle des regulatorischen Transkriptionselements befindet.

21. Phagemid-Partikel nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 20, worin die Anzahl der Phagemid-Partikel, die mehr als eine Kopie des Fusionproteins auf der Oberfläche des Partikels aufweisen, weniger als etwa 10%, vorzugsweise weniger als etwa 1 %, beträgt.

22. Verfahren zur Auswahl neuer bindender Polypeptide, welches umfaßt:

(a) Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, der ein regulatorisches Transkriptionselement in funktionsfähiger Verknüpfung mit DNA umfaßt, die für ein interessierendes Protein kodiert, das eine oder mehrere Untereinheit(en) enthält, wobei die DNA, die für mindestens eine der Untereinheiten kodiert, mit der DNA fusioniert ist, die für mindestens einen Teil eines Phagenhüliproteins kodiert;

(b) Mutation der DNA, die für das interessierende Protein kodiert, an einer oder mehreren ausgewählten Position(en), wodurch eine Familie verwandter Vektoren erzeugt wird;

(c) Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Vektoren;

(e) Züchtung der transformierten infizierten Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zur Bildung rekombinanter Phagemid-Partikel, die mindestens einen Teil des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts imstande sind, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die Menge oder Anzahl der Phagemid-Partikel, die mehr als eine einzige Kopie des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Partikels aufweisen, weniger als etwa 20% beträgt;

(g) Abtrennung der bindenden Phagemid-Partikel von den nicht bindenden.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin der Expressionsvektor ferner umfaßt eine sekretorische Signalsequenz in funktionsfähiger Verknüpfung mit der DNA, die für jede Untereinheit des interessierenden Proteins kodiert, welches ein Säugerprotein ist, das aus Insulin, Relaxin, follikelstimulierendem Hormon (FSH), Thyrotropin (TSH), luteinisierendem Hormon (LH), Glycoprotein- Hormonrezeptoren, monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, lungenoberflächenaktivem Mittel, Integrin-Rezeptoren, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor I und II, und Fragmenten der oben aufgeführten Proteine ausgewählt ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das interessierende Protein ein humanisierter Antikörper ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das interessierende Protein ein humanisiertes Fab-Fragment ist, das zur Bindung an den HER-2-Rezeptor (epidermaler Humanwachstumsfaktor- Rezeptor-2) imstande ist.

26. Verfahren zur Auswahl neuer bindender Polypeptide, welches umfaßt: (a) Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, umfassend ein regulatorisches Transkriptionselement in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer Genfusion, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei die Genfusion umfaßt ein erstes Gen, das für ein Polypeptid in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer verbrückenden Aminosäuresequenz kodiert, und ein zweites Gen, das für mindestens einen Teil eines Phagenhüllproteins kodiert;

(b) Mutation des Vektors an einer oder mehreren ausgewählten Position(en) innerhalb der verbrückenden Aminosäuresequenz des ersten Gens, wodurch eine Familie verwandter Plasmide gebildet wird;

(c) Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden;

(g) Kontaktieren der gebundenen Phagemid-Partikel mit einer Protease, die imstande ist, die verbrückende Aminosäuresequenz mindestens eines Teils der gebundenen Phagemid-Partikel zu hydrolysieren, und

(h) Isolierung der hydrolysierten Phagemid-Partikel.

27. Verfahren nach Anspruch 26, welches ferner die Infektion geeigneter Wirtszellen mit den hydrolysierten Phagemid-Partikeln und die Wiederholung der Schritte (d) bis (h) umfaßt.