DE69034150T2

DE69034150T2 - 2'-Modifizierte Oligonukleotide

Info

Publication number: DE69034150T2
Application number: DE69034150T
Authority: DE
Inventors: Chris A. Buhr; Mark Matteucci
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-10-24
Filing date: 1990-10-24
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2010-10-25
Also published as: JPH05504552A; ATE269870T1; DE69034150D1; US20030036649A1; US5466786B1; US6476205B1; EP0942000A3; AU658562B2; DE69033495D1; DK0497875T3; CA2071510C; US20050171048A1; DK0942000T3; EP0942000B1; CA2071510A1; EP0497875A4; ATE190981T1; EP0942000A2; EP0497875A1; US5792847A

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft modifizierte Oligonukleotide, die für Technologien nützlich sind, die auf der Komplementarität oder Spezifität von Oligomersequenzen für den Wirkstoff-Transport oder für die direkte Beeinflussung der Nukleinsäure-Aktivität beruhen. Spezifischer gesagt betrifft die Erfindung an der 2'-Position derivatisierte Oligomere, die gegenüber einer Nuklease-Aktivität stabil sind.
Hintergrund
In den letzten Jahren wurden beträchtliche Anstrengungen bezüglich des Designs von Nukleinsäuren als diagnostischen und therapeutischen Hilfsmitteln unternommen. Ein Aspekt dieses Designs beruht auf der spezifischen Anziehung bestimmter Oligomersequenzen für Nukleinsäure-Materialien in vivo, die Krankheiten oder Tumoren vermitteln. Dieser generelle Ansatz wird oftmals als "Antisense"-Technologie bezeichnet. Eine sehr stark vereinfachte Darstellung der allgemeinen Voraussetzung ist die, dass das verabreichte Oligomer komplementär zu der DNA oder RNA ist, die mit der Vermehrung eines infektiösen Organismus oder mit einer zellulären Bedingung, z. B. einer Malignität, verbunden oder dafür entscheidend ist. Die Voraussetzung ist, dass die Komplementarität die Bindung des Oligomers an die Ziel-Nukleinsäure zulässt, und sie so in jedweder Funktion, die sie herkömmlicherweise gehabt haben könnte, inaktiviert wird.
Eine einfache Veranschaulichung wäre die Verabreichung eines DNA-Oligomers, das zu einer mRNA komplementär ist, die für ein für die Entwicklung einer Infektion erforderliches Protein codiert. Diese verabreichte DNA würde die Translation der mRNA inaktivieren und so die Bildung des Proteins verhindern. Vermutlich könnte die DNA direkt verabreicht werden oder könnte zur Erzeugung eines mRNA-Komplements zur Ziel-mRNA in situ eingesetzt werden. Es gibt bereits eine umfangreiche Literatur, die sich mit diesem allgemeinen Ansatz beschäftigt, wobei die Methoden zur Nutzung von Oligomeren dieser Art, die zu Ziel-RNA- oder -DNA-Sequenzen komplementär sind, zum Beispiel bei van der Krol, A. R., et al., Biotechniques (1988) 6: 958–976; Stein, C. A., et al., Cancer Research (1988) 48: 2659–2668; Izant, J. G., et al., Science (1985) 229: 345–352; und Zon, G., Pharmaceutical Research (1988) 5: 539–549, angegeben sind, die alle hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind. Darüber hinaus wurde eine Bibliographie der Bezugnahmen auf Antisense-Oligonukleotide zusammengestellt von Dr. Leo Lee an der Frederick Cancer Research Facility in Frederick, MD.
Es gibt zwei konzeptionelle Erweiterungen der allgemeinen Idee, dass die Nutzung der Komplementarität die Nukleinsäure-Funktionalität in vitro beeinflusst. Die erste davon ist, dass die strenge Komplementarität im klassischem Sinne der Basenpaarung durch die spezifische Fähigkeit bestimmter Oligonukleotidsequenzen, Sequenzen in doppelhelikaler DNA zu erkennen und daran zu binden und sich selbst in die große Furche dieses Komplexes zu insertieren, ergänzt werden kann. Eine recht neue, doch ziemlich definitive Reihe von Aufsätzen hat die derzeit gültigen Regeln für diese Spezifität erhellt. Die Aufsätze beziehen sich auf sehr frühe Arbeiten, zum Beispiel von Arnott, S., et al., J. Mol. Biol. (1974) 88: 509–521, der auf das allgemeine Prinzip der Bindung als Triplexe poly-dT/poly-dA/poly-dT hinweist, und den entsprechenden analogen Triplex unter Einbeziehung von poly-dC, wie zusammengefasst von Moser, H. E., et al., Science (1987) 238: 645–650. Jüngere Untersuchungen zeigen, dass diese frühere Regel (die lautete, dass die Erkennung durch ein Homopyrimidin-Oligomer zu Homopurin/Homopyrimidin-Abschnitten im Duplex erreicht werden könnte) auf Modelle erweiterbar sein könnte, mit denen auch Mischsequenzen erkannt werden können (Griffin, L. C., et al., Science (1989) 245: 907–971). Weitere Zusammenfassungen dieser Phänomena sind zum Beispiel in einem Überblicksartikel von Maher III, L. J., et al., Science (1989) 245: 725–730 wiedergegeben. Weitere darauf bezogene Beschreibungen der Tripelhelix-Bildung sind die von Cooney, M., et al., Science (1988) 241: 456–459; Francois, J.–C., Nucleic Acids Res. (1988) 16: 11431–11440; und Strobel, S. A., et al., J. Am. Chem. Soc. (1988) 110: 7927–7929. Während weitere Einzelheiten zur Untersuchung der exakten Sequenzspezifität in diesem Zusammenhang erforderlich sind, ist klar, dass die Gesetzmäßigkeiten für "Komplementarität" in diesem Sinne der spezifischen Einbettung in die große Furche der Doppelhelix schnell erkennbar sein werden.
Der zweite Aspekt der Antisense-Technologie, der sich aus dem einfachen Konzept der Basenpaar-Komplementarität in nativen Oligonukleotiden ableitet, resultiert aus der frühen Erkenntnis, dass Oligonukleotide, insbesondere RNAs, in hohem Maße anfällig für eine Nuklease-Spaltung in biologischen Systemen sind. Damit diese Materialien Wirkstoffe bleiben, wäre es erforderlich, die verabreichten Oligonukleotide gegen diesen Abbau zu stabilisieren. Der Ansatz, der bisher angewendet wurde, besteht im Modizifizieren der Phosphodiester-Verknüpfungen, um gegen einen Angriff durch diese Enzyme resistent zu sein. Insbesondere wurde die Phosphodiester-Verknüpfung durch Phosphoramidat-Verknüpfungen, Methylphosphonat-Verknüpfungen und Phosphorthioat-Verknüpfungen ersetzt. Diese Ansätze zeigen gewisse Folgen hinsichtlich des Stereoisomerie und der damit verbundenen Wirkung auf die Hybridisation an die Zielsequenzen, was sie nicht ganz und gar zufriedenstellend macht. Ein alternativer Ansatz bestand im Modifizieren der Nukleoside durch Verwenden von 2'-O-Methylribose oder der Alpha-Anomeren der herkömmlichen Nukleosid-Reste. Darüber hinaus wurden Oligomere, die 2'-Aminogruppen enthielten, über ihre Triphosphat-Analoga und eine Enzym-katalysierte Polymerisation hergestellt von Hobbs, J., et al., Biochemistry (1973) 12: 5138–5145. Einige dieser Ansätze wurden im im vorangegangenen Absatz zitierten Überblick von Zon zusammengefasst.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzliche 2'-substituierte Pentose-Komponenten zur Aufnahme in die bei dieser Technologie nützlichen Oligomere bereit, die gegenüber einer Nuklease-Aktivität resistent sind, was wahlweise mit zusätzlichen Modifikationen, wie z. B. den oben angegebenen, kombiniert werden kann.
In Wo 88/00201 sind Verbindungen und Methoden zur Synthese von Oligonukleotiden beschrieben, die eine oder mehrere aliphatische Aminogruppen in Bindung an die Zuckerkomponenten der Nukleosid-Untereinheiten enthalten. Fluoreszenz-Farbstoffe oder andere nachweisbare Komponenten können kovalent an die Aminogruppen gebunden werden, um das entsprechende modifizierte Oligonukleotid zu erhalten.
In EP-A-267996 sind Nukleotid-Derivate beschrieben, die für die Synthese einer modifizierten DNA-Sonde nützlich sind.
In US-A-4458066 sind intermediäre Nukleotide in Bindung an einen anorganischen Polymerträger und Verfahren zur Umwandlung der Oligonukleotide beschrieben, die für die Synthese von Polynukleotiden, insbesondere RNA und DNA, nützlich sind.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung richtet sich auf Nukleoside und Nukleotide der folgenden Formel:
worin
B ein geschützter oder ungeschützter Purin- oder Pyrimidin-Rest oder Analogon davon ist;
W₁ H, (PO₃)_m ^–2, worin m eine ganze Zahl von 1–3 ist; eine Schutzgruppe oder eine Gruppe ist, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen reaktionsfähig ist;
W₂ H, PO₃ ^–2, eine Schutzgruppe oder eine Gruppe ist, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen reaktionsfähig ist;
X O, S oder CR₂ ist, worin jedes R unabhängig H oder Alkyl-(1-6C) ist;
Y ein Wirkstoff-Rest ist, der wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist, oder eine Markierung, die wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist.
Diese Materialien sind als Intermediate in der Synthese der Oligomere der Erfindung nützlich, welche Oligomere der folgenden Formel sind:
worin jedes B unabhängig ein Purin- oder Pyrimidin-Rest oder ein Analogon davon ist;
W₃ und W₄ jeweils unabhängig H, PO₃ ^–2, eine Schutzgruppe oder eine Gruppe ist, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen reaktionsfähig ist,
n eine ganze Zahl von 1–200 ist;
jedes Z unabhängig ein Nukleotid-verknüpfender Rest ist, der die Hydroxylgruppen der sequenziellen Nukleotid-Reste kovalent konjugiert;
jedes A unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, OH, zu einer Schutzgruppe derivatisiertem OH, und X-Y, worin
X O, S oder CR₂ ist, worin jedes R unabhängig H oder Alkyl-(1-6C) ist; und
Y ein Wirkstoff-Rest ist, der wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist,
oder eine Markierung, die wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist; worin mindestens ein A X-Y ist.
Die oligomeren Materialien der Formel (2) sind als therapeutische oder prophylaktische Mittel bei Protokollen nützlich, die sich auf eine Infektionskrankheit oder Malignität richten, indem die spezifischen DNA- und/oder RNA-Sequenzen in Verbindung mit dem Zustand angezielt werden, als auch bei diagnostischen Anwendungen.
Ausführungsformen der Erfindung
A. Definitionen
Die Oligomere der Erfindung enthalten den Rest mindestens eines Nukleotids der Formel (1). In dieser Formel, wie auch in den Oligomeren, steht B für eine herkömmliche Purin- oder Pyrimidin-Base wie Adenin (A), Thiamin (T), Cytosin (C), Guanin (G) oder Uracil (U) oder deren geschützte Formen. Zu geeigneten Schutzgruppen zählen Acyl, Isobutyryl, Benzoyl und ähnliche. B kann jedoch auch für eine modifizierte oder geschützte Form oder ein verwandtes Derivat dieser üblicherweise vorkommenden Basen, d. h. ein "Analogon", stehen. Ein breiter Bereich dieser analogen heterocyclischen Basen ist im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel sind üblicherweise unter diesen Analoga die folgenden anzutreffen: 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thioridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galaktosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarbonylmethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Da die Modifikation dieser Basen sowohl die Stabilität des resultierenden Oligomers als auch die Hybridisationsfähigkeit der Sequenz beeinflusst, ist in vielen Fällen eine lediglich begrenzte Anzahl solcher Substitutionen in einem bestimmten Oligomer erwünscht. Es gibt jedoch auch andere Fälle, bei denen sich das gesamte Oligomer aus Nukleotid-Resten, die ein Analogon enthalten, zusammensetzt. Zum Beispiel haben sich DNA-Polymere aus Uridin und Oligomere aus 5-Bromuridin und 5-Methylcytidin als therapeutisch und diagnostisch nützlich erwiesen. Wie für Fachleute in der Praxis des Fachgebiets erkennbar sein wird, muss ein vernünftiger Ansatz beim Design der Oligomeren gewählt werden, die entweder herkömmliche oder modifizierte Basenformen enthalten, so dass die Eigenschaften des resultierenden Monomers sich im gewünschten Bereich befinden. Daher werden in einigen Fällen weniger als 10% der Basen, wie angegeben als "B", in der Sequenz der Formel (2) durch analoge Basen ersetzt, vorzugsweise weniger als 5%, noch bevorzugter weniger als 1%, und am bevorzugtesten überhaupt keine. In anderen Fällen allerdings kann eine vollständige Ersetzung durch Analoga erwünscht sein.
Ähnliche Anmerkungen gelten für die Substitution der Basen mit nicht-funktionellen Substituenten, wie etwa nicht-heterocyclische Alkyl- oder Arylgruppen; allerdings können solche Substitutionen nur in stark beschränktem Umfang zulässig sein, zum Beispiel ein Rest pro 20 oder ähnliches ohne tatsächliche Zerstörung der Funktionalität des Oligomers. Es scheint nicht so zu sein, dass das Vornehmen dieser Ersetzungen zu irgendeinem besonderen Vorteil gereicht, weshalb diese lediglich deshalb zulässig sind, weil die Substitution durch die Funktionalität des restlichen Moleküls übertroffen wird.
Als W₁–W₄ bezeichnete Substituenten können H, PO₃ ^–2, (PO₃)_m ^–2, Schutzgruppen oder Gruppen sein, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen reaktionsfähig sind.
Eine "Schutzgruppe" im Zusammenhang mit W stellt einen Substituenten dar, der die Reaktivität des -OH unterdrückt, an das er in einer chemischen Reaktion, typischerweise einer Reaktion zur Verknüpfung sequentieller Nukleotide, gebunden wird, und die nach Abschluss der Reaktion entfernt werden kann. Zu typischen Schutzgruppen in den Verbindungen der Erfindung zählen 4,4'-Dimethoxytrityl(DMT), 4-Monomethoxytrityl und Trityl.
Eine "zum Verknüpfen von Hydroxylen reaktionsfähige Gruppe" stellt einen intermediären Rest bei der Bildung einer Internukleotid-Verknüpfung zwischen den 5'- und 3'-Hydroxylen dar. Daher ergibt die Reaktion dieser Gruppe mit dem entsprechenden -OH des benachbarten Nukleotids den Nukleotid-verknüpfenden Rest Z.
Der durch Z dargestellte Verknüpfungsrest ist typischerweise P(O)O^– bei natürlich vorkommenden Oligonukleotiden, kann aber auch P(O)S, P(O)NR₂, P(O)R oder P(O)OR' sein, oder kann CO oder CNR₂ sein, worin R H oder Alkyl-(1-6C) ist und R' Alkyl-(1-6C) ist, oder kann -CX₂- sein, worin jedes X unabhängig ein Elektronen-entziehender Substituent ist, wie beschrieben in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der Anwalts-Aktenregisternummer 4610-0005, eingereicht zum selben Datum hiermit, demselben Antragsteller erteilt und hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen. Generell kann Z jegliche Nukleotid-koppelnde Komponente sein, die herkömmlicher weise zum Konjugieren von Nukleotid-Resten zum Erhalt von Oligonukleotiden verwendet wird.
Eine Linkerkomponente, wie dargestellt durch Y (Y', wenn an einen zusätzlichen Substituenten kovalent gebunden), stellt einen zweiwertigen Brückenrest dar, der zur Bindung eines gewünschten Substituenten an das Monomer oder Oligomer dient. Der Linker kann in einfach bindenden Methylengruppen bestehen – d. h. -(CH₂)_n-, oder kann Heteroatome und funktionelle Gruppen enthalten, z. B. -CH₂OCH₂CH₂O- oder -CH₂O-CH₂CH₂NH- oder -COOCH₂CH₂O-. Der Linker-Rest kann auch ein von einem kommerziell verfügbaren bifunktionellen Linker abgeleiteter Rest sein, wie z. B. die hetero- und homo-bifunktionellen Linker, vertrieben von Pierce Chemical Co., Rockford, IL.
Ein "Wirkstoff-Rest", wie dargestellt durch Y, ist der angebundene Teil eines Wirkstoffs, der in Verbindung mit dem Oligomer nützlich ist, wie etwa ein zur Interkalation oder Insertion in die kleine Furche einer DNA-DNA- oder DNA-RNA-Doppelhelix fähiger Wirkstoff oder ein solcher, der die Oligonukleotid-Spaltung bewirken kann. Beispiele solcher Wirkstoffe sind im folgenden angegeben.
Ein "Marker-Rest" stellt den angebundenen Teil eines Markers dar, z. B. eine Komponente, die ein Radioisotop, ein Fluorophor, eine Chromophor, ein Enzym und ähnliches enthält. Solche Marker können erwünscht sein, wenn dieses Oligomer in der Diagnose verwendet werden soll.
Ein "Eigenschaften-beeinflussender" Rest ist ein Rest, der dank seines Vorhandenseins zu veränderten Eigenschaften des Oligomers führt. Zu solchen veränderten Eigenschaften zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Verbesserung der Zelldurchlässigkeits-Eigenschaften, eine Steigerung der Hybridisationsfähigkeit oder anderweitigen Bindungsfähigkeit des Oligomers an Oligonukleotidsequenzen und eine Erhöhung der Stabilität der Nukleotide.
Verbindungen der Erfindung, die bei neutralem pH-Wert negativ geladene Gruppen enthalten, können als deren Salze hergestellt werden. Die Salze werden aus anorga nischen Basen wie NaOH, KOH oder Ca(OH)₂, oder organischen Basen wie Koffein, verschiedenen Alkylaminen, TEA und DBU gebildet.
Verbindungen der Erfindung, die bei neutralem pH-Wert positiv geladene Gruppen enthalten, können als Säure-Additionssalze hergestellt werden, wie aus anorganischen Säuren wie HCl, H₂SO₄ oder H₃SO₄, oder aus organischen Säuren wie Essigsäure, Succinsäure oder Zitronensäure, gebildet.
So können die Nukleotide und ihre entsprechenden Oligonukleotide als Salze vorliegen, was vom pH-Wert abhängt, bei dem sie sich befinden oder bei dem sie hergestellt werden. Die mit diesen Molekülen verbundenen Phosphat- und Phosphodiester-Komponenten lassen die Bildung basischer Salze zu, wie etwa mit anorganischen Ionen wie Natrium-, Kalium-, Ammoniumionen, doch insbesondere zweiwertigen Ionen wie Calcium- und Magnesiumionen. Es ist möglich, doch weniger verbreitet, die Salze dieser Materialien mit organischen Basen wie organischen Aminen oder Heterocyclen zu bilden.
Die Verbindungen der Erfindung weichen von denen nach dem Stand der Technik dadurch ab, dass sie in der 2'-Position bei jeder Chiralität einen Substituenten aufweisen, der ihnen Nuklease-Stabilität verleiht und wahlweise die Fähigkeit zum Transportieren eines Wirkstoffs, z. B. eines Reagens, verleiht, das zum Wechselwirken mit Duplex-DNA in ihrer kleinen Furche wirksam ist, einen Marker oder irgendeine zusätzliche Eigenschaft verleiht. Zwar wird der Rest des Moleküls in Formel (2) manchmal aus Gründen der Bequemlichkeit als die Merkmale der nativen Oligonukleotide aufweisend gezeigt, wobei dies oftmals tatsächlich die bevorzugteste Ausführungsform ist, doch sind auch Moleküle von der Erfindung umfasst, die die 2'-Extensionen und Substitutionen der Erfindung, doch darüber hinaus zusätzliche Modifikationen umfassen, z. B. den Austausch einer oder mehrerer der Phosphodiester-Verknüpfungen durch z. B. eine Phosphorthioat- oder Methylphosphonat-Verknüpfung; eine Phosphoramidat-Verknüpfung, einschließlich solcher, die organische Amino-Substituenten enthalten, z. B. Morpholidate, einen Austausch aller Beta-Anomere durch das Alpha-Anomer, und das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Schutzgruppen oder Phosphat-Resten an den 5'- und 3'-Endigungen.
An der 2'-Position beschreibt die Erfindung mehrere allgemeine Kategorien von Substituenten, die eine gemeinsame Art von Knüpfung an den 2'-Kohlenstoff durch einen Substituenten teilen, gewählt aus O, S und CR₂, worin jedes R unabhängig ausgewählt ist. Bei allen Ausführungsformen steht X-Y für einen Substituenten, welcher dank seines Vorhandenseins zum Hemmen der Spaltung des Oligomers, in dem er enthalten ist, durch Nukleasen fähig ist. Alle Oligomere der Erfindung sind relativ stabil gegenüber Nukleasen.
Die Stabilität der Oligomere gegenüber Nukleasen kann unter Anwendung eines geeigneten Assays bestimmt werden, lässt sich aber in bequemer Weise unter Anwendung des nachstehend veranschaulichten Schlangengift-Assays bestimmen. Dieser Assay wird wie folgt durchgeführt: Der Assay-Puffer ist 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 100 μm/MgCl₂. Handelsübliche Phosphodiesterase, isoliert aus Croatalus durissus, wird bezogen von Boehringer Mannheim als eine 50%-ige (Vol/Vol) Lösung in Glycerol, pH 6, mit einer spezifischen Aktivität von etwa 1,2 E/mg. Ein μl der Phosphodiesterase-enthaltenden Lösung wird 100 μl Puffer zugegeben, und die Oligomere werden durch Wiederherstellen von 0,15 OD des Oligomers im zuvor zubereiteten 100 μl Puffer/Gift getestet. Der Abbau wird durch Beobachten des Verschwindens der Absorption des Oligomers bei 260 nm bei seiner charakteristischen Rückhaltezeit auf HPLC und Messen des Auftretens von Abbauprodukten überwacht.
Die Oligomere der Erfindung, die mindestens einen Nukleotid-Rest mit dem 2'-Substituenten enthalten, sind gegenüber Nuklease stabiler, wie mittels des vorstehend beschriebenen Assays beurteilt, als das entsprechende Oligomer, das eine unsubstituierte 2'-Position anstelle der substituierten Positionen in den Verbindungen der Erfindung enthält. Durch Vergleich der Hydrolyserate im Schlangengift-Assay mit der Verbindung der Erfindung zu der des entsprechenden Oligomers, welches in der 2'-Position nicht derivatisiert ist, lässt sich bestimmen, ob das Vorhandensein des/der 2'-Substituenten das Oligomer gegenüber einer Spaltung durch Nukleasen stabilisiert hat.
Zu typischen Ausführungsformen von Y, wenn seine einzige Funktion in der Änderung der Eigenschaften des Oligomers besteht, zählt Alkyl- oder Alkenyl-(2-20C), vorzugsweise 2-6C, welches durch nicht-eingreifende Substituenten substituiert sein kann oder auch nicht, wie etwa -OH, =O, Carboxyl, Halo, Aminogruppen und ähnliches, Aryl- oder substituiertes Aryl-(6-20C), verschiedene Alkylsilyl-Derivate der Formel SiR₃ (worin jedes R Alkyl von 2-6C ist), und ähnliche Substituenten, die außerdem Heteroatome enthalten. Umfasst Y eine Linkerkomponente, so wird dieser Anteil von Y (Y') eine oder mehrere funktionelle Gruppen zur Konjugation an zusätzliche Substanzen bereitstellen. Zum Beispiel kann eine Ausführungsform von Y' von 1-20C eine Hydroxyl-, Amino-, Mercaptyl-, Carboxy-, Keto- oder andere funktionelle Gruppe oder mehrere davon in Kombination enthalten. Zu typischen Beispielen zählen -CH₂COOH; -CH₂CONH₂; -CH₂COOEt; -CH₂CONHCH₂CH₂NH₂, und ähnliche.
Die Linkerkomponente kann zum Koppeln des Nukleosids, Nukleotids oder Rests innerhalb des Oligomers an ein Reagens oder einen Wirkstoff genützt werden, zum Beispiel einen Wirkstoff, der für seine Wechselwirkung mit der kleinen Furche der Duplex-DNA oder DNA/RNA bekannt ist. Eine breite Vielfalt dieser Reagenzien und Substanzen ist bekannt, wobei die Funktion in vivo generell im Inaktivieren des DNA-Duplex, mit dem diese Reagenzien wechselwirken, besteht. Zu typischen Beispielen dieser Agenzien zählen Netropsin und seine Derivate, Anthramycin, Chinoxalin-Antibiotika, Retinomycin, Pyrrolo-(1–4)-benzodiazepin-Derivate und Interkaliermittel.
Auch weitere Wirkstoffe neben denen, die die kleine Furche anzielen, können verwendet werden. Interkalatoren, Toxine, Abbauinduktoren und ähnliches können ebenfalls verwendet werden. Weiterhin braucht der Wirkstoff nicht durch die Linkerkomponente verknüpft zu sein, doch kann direkt mit dem Substituenten X verbunden sein, was von der Chemie des speziellen Wirkstoffs abhängt.
Eine andere Ausführungsform von Y steht für einen Marker, der wahlweise an X durch eine Linkerkomponente geknüpft ist, doch möglicherweise auch direkt angebunden ist, was wiederum von der Chemie im speziellen Falle abhängt. Zu geeigneten Markern zählen Radioisotope, Fluoreszenzmarker wie Fluorescein und Dansyl, Chromophoren, Enzyme und ähnliches. Eine breite Vielfalt von Markern ist bekannt und kann zur Erzielung der Nachweisbarkeit eingesetzt werden, wenn die Oligomere der Erfindung als Sonden oder in anderen diagnostischen Assays der spezifischen Bindung Verwendung finden.
Schließlich kann Y ein Substituent sein, der dem Oligomer veränderte Eigenschaften verleiht. Es wurde bereits angemerkt, dass alle Substituenten, einschließlich Wirkstoffen und Markern, eine erhöhte Nuklease-Stabilität verleihen. Es können jedoch auch weitere Eigenschaften beeinflusst werden – zum Beispiel können Agenzien, die angebundene Nukleotidketten spalten, angekoppelt werden; dank des Substituenten kann eine Erhöhung der Zelldurchlässigkeit erfolgen, oder Y kann die Hybridisation des Oligomers an komplementäre Oligonukleotide oder an eine DNA/DNA- oder DNA/RNA-Helix erhöhen. Wie bei all den vorangegangenen Ausführungsformen von Y kann die Aktivität des Eigenschaften-verändernden Substituenten direkt an X gebunden oder kann durch eine Linkerkomponente konjugiert werden.
B. Herstellung der Verbindungen der Erfindung
Ein Teil der Verbindungen der Erfindung, die Nukleoside oder Nukleotide sind, werden durch Umsetzen des entsprechenden Nukleotids oder Nukleosids mit OH in der 2'-Position mit geeigneten Reagenzien, um die Umwandlung zur substituierten Form zu bewirken. In einigen Fällen kann der 2'-Substituent von cyclischen Formen des Nukleosids oder Nukleotids abgeleitet sein. Weitere Umwandlungen können erforderlich sein, wie nachstehend veranschaulicht, um das Nukleotid oder Nukleosid zum Einbau in das Oligomer zu aktivieren. Die Techniken für diese Umwandlungen sind allgemein im Fachgebiet verstanden, ebenso wie die Techniken für die sequentielle Synthese der Oligomere.
Insbesondere können Dimere zur Beurteilung der Wirkung des 2'-Substituenten auf die Nuklease-Aktivität synthetisiert werden. Bei der Bildung des Dimers wird das umgewandelte Nukleosid oder Nukleotid der Erfindung, das an der 5'-Position geschützt ist und eine zum Verknüpfen der Hydroxylgruppen an der 3'-Position reaktionsfähige Gruppe enthält, zum Beispiel mit Thymidin oder Cytidin umgesetzt, das an der 3'-Position an den festen Träger gebunden ist, und der resultierende Dimer vom Träger abgespalten und entschützt.
In allen vorangegangenen Fällen können die Umwandlungen zur Veränderung der Funktionalität und des Charakters des 2'-Substituenten entweder am Monomer oder am Oligomer durchgeführt werden. Daher kann ein 2'-Substituent, der für X-Y die Formel OCH₂COOEt aufweist, zu einer Ausführungsform umgewandelt werden, bei der der Substituent in der freien Säure oder dem Amid besteht, wenn entweder der Ester ein Substituent des einzelnen Nukleosids oder Nukleotids oder eines Dimers ist oder in der Oligomerkette enthalten ist.
Die Verbindungen der Erfindung, bei denen es sich um Oligomere handelt, werden durch Aufnahme des derivatisierten Nukleotids oder Nukleosids in das Oligomer unter Anwendung standardmäßiger Festphasen-Oligonukleotid-Synthesetechniken erhalten. Diese Techniken stehen kommerziell zur Bildung sowohl der standardmäßigen Phosphodiester-Verknüpfungen als auch der oben beschriebenen herkömmlichen Substituenten-Verknüpfungen zur Verfügung.
C. Nutzen und Verabreichung
Die Verbindungen der Erfindung sind in einer im Fachgebiet bekannten Weise für Nuklease-gehemmte, spezifisch komplementäre oder bindende Oligomere nützlich. Wie oben angegeben, sind die allgemeinen Methoden zur Nutzbarmachung dieser Verbindungen bekannt und hängt ihre Anwendung auf spezifische Erkrankungen oder Bedingungen von der Beurteilung der geeigneten Bindungsspezifität ab. Die Bestimmung dieser Bindungsspezifität beeinflusst die Art und Weise der Präparierung oder Anwendung der modifizierten Verbindungen der Erfindung nicht.
Demgemäß sind die modifizierten Oligomere der Erfindung in therapeutischen, diagnostischen und wissenschaftlichen Zusammenhängen nützlich. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Oligomere in einer für die Antisense-Therapie im allgemeinen geeigneten Weise genutzt – wie oben beschrieben, beinhaltet die Antisense-Therapie, wie hierin verwendet, das Anzielen einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz durch Komplementarität oder durch eine andere spezifische Bindungsmethode, zum Beispiel die Sequenz-spezifische Orientierung in der großen Furche der DNA-Doppelhelix, oder eine weitere spezifische Bindungsweise. Für diese Therapie können die Oligomere der Erfindung zu einer Vielzahl von Verabreichungsformen formuliert werden, einschließlich der systemischen und topischen oder lokalen Verabreichung. Die Techniken und Formulierungen sind allgemein zu finden in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Auflage.
Für die systemische Verabreichung ist die Injektion bevorzugt, einschließlich intramuskulär, intravenös, intraperitoneal und subkutan. Für die Injektion werden die Oligomere der Erfindung in Flüssigkeitslösungen formuliert, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hank-Lösung oder Ringer-Lösung. Außerdem können die Oligomere in fester Form formuliert und direkt vor Anwendung wieder gelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen sind ebenfalls umfasst.
Die systemische Verabreichung kann auch auf dem transmukosalen oder transdermalen Wege erfolgen, die Verbindungen können aber auch oral verabreicht werden. Für die transmukosale oder transdermale Verabreichung werden für die zu überwindende Barriere geeignete Penetriermittel in der Formulierung verwendet. Solche Penetriermittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen zum Beispiel für die transmukosale Verabreichung Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate. Darüber hinaus können Detergenzien zur Erleichterung der Permeation verwendet werden. Die transmukosale Verabreichung kann durch Nasensprays oder zum Beispiel unter Verwendung von Zäpfchen erfolgen. Für die orale Verabreichung werden die Oligomere zu herkömmlichen oralen Verabreichungsformen wie Kapseln, Tabletten und Tonika formuliert.
Für die topische Verabreichung werden die Oligomere der Erfindung zu Salben, Pasten, Gelen oder Cremes formuliert, wie im Fachgebiet allgemein bekannt.
Über die Verwendung in der Therapie hinaus können die Oligomere der Erfindung als diagnostische Reagenzien zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der Ziel-DNA- oder -RNA-Sequenzen, an die sie spezifisch binden, verwendet werden.
Solche diagnostische Tests werden durch Hybridisation durch Basenkomplementarität oder Trippelhelix-Bildung durchgeführt, welche dann mittels herkömmlicher Methoden nachgewiesen wird. Zum Beispiel können die Oligomere unter Verwendung radioaktiver, fluoreszierender oder chromogener Marker markiert werden und das Vorhandensein der an den festen Träger gebundenen Markierung nachgewiesen werden. Alternativ kann das Vorhandensein einer Doppel- oder Trippelhelix durch Antikörper nachgewiesen werden, welche diese Formen spezifisch erkennen. Die Methoden zur Durchführung der Assays unter Verwendung solcher Oligomere als Sonden sind allgemein bekannt.
Über die vorangegangenen Anwendungen hinaus kann die Fähigkeit der Oligomere, die Genexpression in in vitro-Systemen zu hemmen, durch Messen der Expressionsmengen in rekombinanten Systemen verifiziert werden.
Es mag eingewendet werden, dass der Mechanismus, durch den die spezifisch bindenden Oligomere der Erfindung die Aktivität einer Ziel-RNA oder -DNA beeinflussen oder hemmen, nicht immer bekannt ist, was auch keinen Teil der Erfindung darstellt. Strebt das Oligomer zum Beispiel eine Ziel-mRNA an, so kann die Translation gehemmt sein. Durch Binden des Ziels kann außerdem der Abbau der mRNA-Boten verstärkt oder die Weiterverarbeitung der RNA gehemmt werden. Durch Bilden einer Trippelhelix kann die Transkription oder Replikation der vorliegenden DNA gehemmt werden; weiterhin wird die reverse Transkription von infektiöser RNA oder die Replikation von infektiöser DNA beeinträchtigt. Es wird auch angenommen, dass die Immunfunktion durch physiologische Mechanismen ähnlich den durch doppelsträngige RNA induzierten moduliert werden kann, wie durch das "Ampligen"-System beispielhaft veranschaulicht, oder ähnlich denen, die zur Unterdrücken von systemischem Lupus erythematosus verwendet werden. Die Oligomere der Erfindung sind durch ihre Fähigkeit zum Anzielen spezifischer Oligonukleotid-Sequenzen gekennzeichnet, und zwar unabhängig von den Anzielmechanismen oder deren Wirkmechanismen.
Schließlich ist klar, dass das Oilgonukleotid zu einer Vielzahl von Komponenten derivatisiert werden kann, welche Interkalatoren, Chelatbildner, lipophile Gruppen, Markier ungen oder jeglichen anderen Substituent umfassen, der den oligomeren Charakter des Rückgrats modifiziert, doch nicht materiell zerstört.
Bei allen Synthesereaktionen wurde eine Trockenargon-Atmosphäre eingesetzt.
Bezugsbeispiel 1
Herstellung der Nukleotide und Oligomere
A = NHAc
2'-N-Acetaminouridin wurde an der 5'-Position geschützt und an der 3'-Position zur Bildung einer Phosphodiester-Verknüpfung reaktiv gemacht, die die Reste in ein Oligomer wie folgt konjugiert:
2'-N-Acylaminouridin. 152 mg an 2'-N-Acylamino-3',5'-O-diacyluridin (Verheyden, J. P. H., et al., Org Chem (1971) 36: 250–254) (0,411 mmol) in 25 ml MeOH wurde eine katalytische Menge von KCN zugegeben. Nach 15 Std. wurden 1,00 g Kieselgel zugegeben, und die Reaktion wurde konzentriert. Das Pulver wurde oben auf eine 20-mm-Säule von Kieselgel aufgebracht, die in 5% H₂O in CH₃CN äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 5% H₂O in CH₃CN unter Anlegen standardmäßiger Flash-Chromatographie-Bedingungen eluiert (Still, W. C. et al., J Org Chem (1978) 43: 2923–2925). Die Isolierung und Konzentration des Produkts ergab 59,5 mg (50,8% Ausbeute) an Produkt.
2'-N-Acylamino-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin. 59,5 mg an 2'-N-Acylaminouridin (0,208 mmol) in 2,5 ml Trockenpyridin (das zunächst aus Trockenpyridin konzentriert wurde) wurden 77,6 mg (0,229 mmol, 1,10 Äq.) an 4,4'-Dimethoxytritylchlorid zugegeben. Die Reaktion wurde 15 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 3,0 ml H₂O verdünnt. Das Gemisch wurde zwischen H₂O und Et₂O aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Et₂O extrahiert, und die kombinierten organischen Stoffe wurden mit 1% wässrigem NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 20-mm-Säule unter Verwendung zunächst eines Säulenvolumens von CH₂Cl₂ und dann von 8% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Die Isolierung und Konzentration erbrachte 70,7 mg an Produkt (56,6% Ausbeute) als einen farblosen Schaum.
2'-N-Acylamino-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3-yl-hydrogenphosphonattriethylammoniumsalz. Einem Gemisch von 132 mg an 1,2,4-Triazol (1,91 mmol) und 0,476 ml anhydrischem 4-Methylmorpholin (4,33 mmol) in 2,40 ml trockenem CH₂Cl₂ wurden 0,236 ml einer 2,0 M-Lösung von PCl₃ in CH₂Cl₂ (0,472 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde dann auf einem Eiswasserbad für 30 Minuten gekühlt. Diesem Gemisch wurde eine Lösung von 70,7 mg an 2'-N-Acylamino-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin (0,188 mmol, vorab aus Trockenpyridin konzentriert) in 0,523 ml Trockenpyridin über mehrere Minuten hinweg zugetropft. Die Reaktion wurde 20 Minuten lang gerührt und dann auf 16,8 ml an kaltem wässrigem 1-M-Triethylammoniumbicarbonat (TEAB, pH 9,0) gegossen. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang schnell gerührt und dann mit 2 × 17 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die kombinierten organischen Stoffe wurden mit 11,7 ml an 1 M wässrigem TEAB gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 20-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens an 1% TEA in CH₂Cl₂, dann eines Säulenvolumens an 1% TEA und 2,5% MeOH in CH₂Cl₂ und dann 1% TEA und 10% MeOH in CH₂Cl₂ gereinigt. Das Produkt wurde isoliert und konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen CH₂Cl₂ und 1 M wässrigem TEAB aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde aus trockenem CH₃CN konzentriert, was 41,9 mg (43,6% Ausbeute) an Produkt als einen hellgelben Schaum ergab.
Die resultierende Titelverbindung wird in Oligomere unter Anwendung der Methode von Froehler, B. C., et al., Nucleic Acids Res (1986) 14: 5399–5407 gekoppelt.
Bezugsbeispiel 2 Herstellung der Nukleotide und Oligomere
2'-S-Phenylcytidin wurde aus 2,2'-Anhydro-(1-B-D-arabinofuranosyl)cytosin-HCl (einem cyclischen Nukleosid) durch geeignete Behandlung mit Thiophenol hergestellt. Das -NH₂ von Cytosin und 5'-Hydroxy wurde geschützt und das 3'-OH wie folgt aktiviert:
2'-S-Phenylthiocytidin. Einer Lösung von 500 mg (1,91 mmol) an 2,2'-Anhydro-(1-B-D-arabinofuranosyl)cytosin-Hydrochlorid (erworben von Sigma) in 50 ml trockenem DMF und 1,86 ml trockenem TEA (13,3 mmol) wurden 0,980 ml (9,54 mmol, 5,0 Äq.) Thiophenol zugegeben. Die Reaktion wurde 5 Stunden lang gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde aus MeOH auf 2,00 g Kieselgel konzentriert. Das Pulver wurde oben auf eine 30-mm-Säule von Kieselgel aufgebracht, die mit CH₂Cl₂ äquilibriert wurde. Die Säule wurde dann mit einem Säulenvolumen CH₂Cl₂, dann einem Säulenvolumen von 6,25% MeOH in CH₂Cl₂, dann einem Säulenvolumen von 12,5% MeOH in CH₂Cl₂, und dann 25% MeOH in CH₂Cl₂ eluiert. Die Konzentration der Produktfraktionen erbrachte 529 mg (82,5% Ausbeute) an Produkt als ein nahezu farbloses Öl.
N⁴-Benzoyl-2'-S-phenylthiocytidin. Die Methode des vorübergehenden Schutzes (Ti, G. S., et al., J. Am. Chem. Soc. (1982) 104: 1316–1319) wurde zur Herstellung der Titelverbindung angewendet. 429 mg (1,28 mmol) an 2'-S-Phenylthiocytidin (zunächst aus Trockenpyridin konzentriert) in 12,2 ml Trockenpyridin, das auf einem Eiswasserbad abgekühlt wurde, wurden 0,832 ml (6,56 mmol) Chlordimetylsilan zugegeben. Die Reaktion wurde 15 Minuten lang gerührt und dann 0,767 ml (6,61 mmol) Benzoylchlorid zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Rühren 2,5 Stunden lang fortgesetzt. Die Reaktion wurde nochmals auf einem Eiswasserbad abgekühlt und dem 2,56 ml H₂O zugegeben. Die Reaktion wurde 5 Minuten lang gerührt und dann 2,56 ml konzentriertes wässriges NH₄OH zugegeben. Das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt und dann das Gemisch zwischen EtOAc und H₂O aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert, und die kombinierten organischen Stoffe wurden mit H₂O gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 30-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens von CH₂Cl₂ und dann 5% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Die Konzentration der Produktfraktionen erbrachte 138 mg (32,2% Ausbeute) an Produkt als ein Öl.
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-S-phenylthiocytidin. 138 mg (0,314 mmol) an N⁴-Benzoyl-2'-S-Phenylthiocytidin (das zunächst aus Trockenpyridin konzentriert wurde) in 2,00 ml Trockenpyridin wurden 128 mg (0,377 mmol, 1,2 Äq.) an 4,4'-Dimethoxytritylchlorid zugegeben. Die Reaktion wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 2,00 ml H₂O verdünnt. Das Gemisch wurde zwischen Et₂O und H₂O aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Et₂O extrahiert, und die kombinierten organischen Stoffe wurden mit 1% wässrigem NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 30-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens an CH₂Cl₂, dann 2,5% MeOH in CH₂Cl₂ und dann 5% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Die Konzentration der Produktfraktionen erbrachte 206 mg (88,4% Ausbeute) an Produkt.
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-S-phenylthiocytidin-3'-yl-hydrogenphosphonattriethylammoniumsalz. Die Herstellung dieses Hydrogenphosphonats war dieselbe wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass 206 mg (0,278 mmol) an 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-S-phenylthiocytidin verwendet wurden und die Reagenzien auf den 0,278-mmol-Maßstab angepasst wurden. Nach der TEAB-Aufarbeitung wurden die organischen Stoffe mit 1 M wässrigem TEAB gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde auf einer 30-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens an 2% TEA in CH₂Cl₂, dann 2% TEA und 5% MeOH in CH₂Cl₂, und dann 2% TEA und 10% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Die Produktfraktionen wurden zu einem Schaum konzentriert, der zwischen CH₂Cl₂ und 1 M wässrigem TEAB aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde aus trockenem CH₃CN konzentriert, was 165 mg (65,5% Ausbeute) an Produkt als einen Schaum erbrachte.
Die resultierende Titelverbindung wird in die Oligomere unter Anwendung der Methode von Froehler, B. C., et al., Nucleic Acids Res (1986) 14: 5399–5407, gekoppelt.
Bezugsbeispiel 3
Herstellung weiterer Nukleotide und Oligomere
A. (A = OCH₂COOEt)
Das 2'-derivatisierte Nukleosid wurde aus N⁴-Benzoyl-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin durch Reaktion mit Ethyliodacetat und Schutzentfernung an den 2'- und 5'-Hydroxylen hergestellt. Die 5'-Position wurde geschützt und die 3'-Position zu einer zum Verknüpfen mit Hydroxylgruppen reaktionsfähigen Gruppe umgewandelt.
N⁴-Benzoyl-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin
Die Herstellung dieser Verbindung erfolgte mittels einer Adaptation einer ähnlichen Reaktion, die zur Herstellung des 2'-OMe verwendet wurde (Inoue, H., et al., Nucleic Acids Res (1987) 15: 6131–6149). 250 mg an N⁴-Benzoyl-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin (Markiewicz, W. J., J Chem Res (1979) 181–196) (0,424 mmol; zunächst aus Benzol konzentriert) wurden 1,00 ml (8,45 mmol, 19,9 Äq.) an Ethyliodacetat zugegeben, gefolgt von 294 mg an Ag₂O (1,27 mmol, 2,99 Äq.). Das Gemisch wurde schnell gerührt und auf 42°C für 32 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde dann filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ aufgenommen, mit H₂S behandelt und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 25-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens an CH₂Cl₂, dann eines Säulenvolumens an 2,5% MeOH in CH₂Cl₂ und dann 5% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Die Konzentration der Produktfraktionen erbrachte 270 mg (94,4% Ausbeute) an Produkt als einen Schaum.
N⁴-Benzoyl-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-cytidin
170 mg an N⁴-Benzoyl-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin (0,252 mmol) in 1,70 ml THF wurden 0,126 ml an einer 1,0 M-Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF (0,126 mmol, 0,50 Äq.) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 70 Minuten gerührt. Dann wurden 3,4 ml Pyridin/EtOH/H₂O bei 3/1/1 (Vol/Vol/Vol) zugegeben und das Rühren 5 Minuten lang fortgesetzt. Daraufhin wurden etwa 10 ml Amberlyst A-21 Ionenaustauscherharz (Pyridinium-Form) zugesetzt und das Rühren 5 Minuten lang fortgesetzt. Das Gemisch wurde filtriert und das Harz mit EtOH gespült. Die kombinierten Filtrate wurden konzentriert. Der Rückstand wurde dann aus EtOH auf 1,00 g Kieselgel konzentriert. Dieses Pulver wurde oben auf eine 25-mm-Säule von Kieselgel aufgebracht, die mit CH₂Cl₂ äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem Säulenvolumen an CH₂Cl₂, dann einem Säulenvolumen an 2,5% MeOH in CH₂Cl₂ und dann an 5% MeOH in CH₂Cl₂ eluiert. Die Konzentration der Produktfraktionen erbrachte 40,7 mg (37,6% Ausbeute) an Produkt als einem Öl.
N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-cytidin
40,7 mg an N⁴-Benzoyl-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-cytidin (0,0939 mmol, zunächst aus Trockenpyridin konzentriert) in 1,00 ml Trockenpyridin wurden 38,3 mg an 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,113 mmol, 1,2 Äq.) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt und dann mit 0,50 ml H₂O verdünnt. Das Gemisch wurde zwischen Et₂O und H₂O aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Et₂O extrahiert. Die kombinierten organischen Stoffe wurden mit 1% wässrigem NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 20-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens CH₂Cl₂, dann 2,5% MeOH in CH₂Cl₂ und dann 5,0% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Die Konzentration der Produktfraktionen erbrachte 55,2 mg (79,9% Ausbeute) an Produkt.
N⁴-Benzoyl-5'-O-(5,5'-dimethoxytrityl)-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-cytidin-3'-yl-hydrogenphosphonattriethylammoniumsalz. Die Herstellung dieser Verbindung war dieselbe wie bei der früheren Herstellung der Hydrogenphosphate beschrieben, mit der Ausnahme, dass in diesem Fall 55,2 mg (0,0750 mmol) an N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-cytidin verwendet wurden und die Reagenzien auf den 0,0750-mmol-Maßstab angepasst wurden. Nach der TEAB-Aufarbeitung wurde die organische Schicht mit 1 M wässrigem TEAB gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 25-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens an 1% TEA in CH₃CN, dann einem Säulenvolumen an 1% TEA und 5% H₂O in CH₃CN, und dann 1% TEA und 10% H₂O in CH₃CN gereinigt. Die Konzentration der Produktfraktionen ergab einen Schaum, der zwischen CH₂Cl₂ und 1 M wässrigem TEAB aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt wurde. Die organischen Stoffe wurden getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde aus trockenem CH₃CN konzentriert, was 23,8 mg (35,2% Ausbeute) an Produkt erbrachte.
Die derivatisierte resultierende Verbindung des vorangegangenen Absatzes wurde in ein Oligomer aufgenommen, wie oben beschrieben.
B. (A = OEt)
N⁴-Benzoyl-2'-O-ethyl-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin wurde in ähnlicher Weise wie N⁴-Benzoyl-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin hergestellt, mit Ausnahme, dass Iodethan anstelle von Ethyliodacetat verwendet wurde. Die Titelverbindung wurde dann zu N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-ethyl-cytidin-3'-yl-hydrogenphosphonattriethylammoniumsalz unter Anwendung derselben Abfolge von Schritten wie für die 2'-O-(Ethoxycarbonylmethyl)-Verbindung umgewandelt und dann in Oligomere aufgenommen, wie oben beschrieben.
C. (A=OCH₂CH₂CH₂CH₃)
N⁴-Benzoyl-2'-O-butyl-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin wurde in ähnlicher Weise wie N⁴-Benzoyl-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-cytidin hergestellt, mit der Ausnahme, dass Iodbutan anstelle von Ethyliodacetat verwendet wurde. Die Titelverbindung wurde dann zu N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-butyl-cytidin-3'-yl-hydrogenphosphonattriethylammoniumsalz unter Anwendung derselben Abfolge von Schritten wie für die 2'-O-(Ethoxycarbonylmethyl)-Verbindung verwendet und dann in Oligomere aufgenommen, wie oben beschrieben.
D. (A = O-SiMe₂tBu)
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-t-butyldimethylsilyluridin-3'-yl-hydrogenphosphonat-DBU-Salz. Diese Verbindung wurde anders als in der Literatur beschrieben hergestellt. Die Herstellung dieser Verbindung war dieselbe wie für die obige Verbindung, mit der Ausnahme, dass 400 mg (0,606 mmol) an 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-t-butyldimethylsilyluridin (erworben von Peninsula Labs) verwendet wurden und die anderen Bedingungen auf den 0,606-mmol-Maßstab angepasst wurden. Nach der TEAB-Aufarbeitung wurde die organische Schicht getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer 35-mm-Säule unter Verwendung eines Säulenvolumens an 1% TEA in CH₂Cl₂, dann eines Säulenvolumens an 1% TEA und 4% MeOH in CH₂Cl₂ und dann 1% TEA und 8% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel gereinigt. Das Produkt wurde isoliert und konzentriert. Der Schaum wurde zwischen CH₂Cl₂ und 1 M wässrigem 1,8-Diazabicyclo-[5.4.0]undec-7-en-Bicarbonat (DBU-Bicarbonat, pH = 9,0) aufgeteilt, geschüttelt und aufgetrennt. Die organische Schicht wurde wiederum mit 50 ml an 1 M wässrigem DBU-Bicarbonat gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde aus trockenem CH₃CN konzentriert, was 435 mg (81,9% Ausbeute) an Produkt als einem Öl ergab. Das resultierende Derivat wird in ein mittels standardmäßiger Methoden synthetisiertes Oligomer aufgenommen.
Bezugsbeispiel 4
Umwandlung von 2'-Substituenten in Oligomere

A = OCH₂COOEt → OCH₂COOH → OCH₂CONH₂ → OCH₂CONHCH₂CH₂NH₂

N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-(ethoxycarbonylmethyl)-cytidin-3'-yl-hydrogenphosphonattriethylammoniumsalz wurde in Oligonukleotide unter Anwendung der Hydrogenposphonat-Methode gekoppelt.
Um das 2'-OCH₂CO₂H zu erzeugen, wurde das Oligomer entschützt, vom Träger gespalten und das 2'-OCH₂CO₂Et zum 2'-OCH₂CO₂H unter Verwendung von 0,1 M wässrigem NaOH bei 45°C für 4,5 Std. hydrolysiert.
Um das 2'-OCH₂CONH₂ zu erzeugen, wurde das obige Oligomer, das das 2'-OCH₂CO₂Et enthielt, entschützt, vom Träger gespalten und das 2'-OCH₂CO₂Et zum 2'-OCH₂CONH₂ unter Verwendung von NH₃ in MeOH bei 45°C für 29 Std. umgewandelt; das entsprechende Amid der Formel -OCH₂CONHCH₂CH₂NH₂ wurde ähnlich hergestellt.
Bezugsbeispiel 5
Resistenz gegenüber der Nuklease-Aktivität der Verbindungen der Erfindung
Die Widerstandsfähigkeit der Dimeren der in Beispiel 1 synthetisierten Verbindungen gegenüber der Aktivität von Nukleasen wurde bestimmt. Die veranschaulichten Verbindungen der Formel 1 wurden an ein zusätzliches unmodifiziertes Thymidin unter Anwendung standardmäßiger Verfahrensweisen zum Erhalt der Verbindungen der folgenden Formel gekoppelt:
Die resultierenden dimeren Verbindungen wurden auf ihre Stabilität bezüglich der Nuklease aus Schlangengift wie oben beschrieben getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, erhöhte die Anfügung des Substituenten an die 2'-Position die Stabilität des resultierenden Dimers gegenüber einer Nuklease-Spaltung in starkem Maße.

Claims

Monomer der Formel:
worin B ein geschützter oder ungeschützter Purin- oder Pyrimidin-Rest oder ein Analogon davon ist; W₁ H, (PO₃)_m ^–2, worin m eine ganze Zahl von 1–3 ist; eine Schutzgruppe oder eine Gruppe ist, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen reaktionsfähig ist; W₂ H, PO₃ ^–2, eine Schutzgruppe oder Gruppe ist, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen reaktionsfähig ist; X O, S oder CR₂ ist, worin jedes R unabhängig H oder Alkyl-(1-6C) ist; Y ein Wirkstoff-Rest ist, der wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist, oder eine Markierung, die wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist.
Oligomer einer Mischsequenz der Formel:
worin jedes B unabhängig ein Purin- oder Pyrimidin-Rest oder ein Analogon davon ist; W₃ und W₄ jeweils unabhängig H, PO₃ ^–2, eine Schutzgruppe oder eine Gruppe ist, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen reaktionsfähig ist; n eine ganze Zahl von 1–200 ist; jedes Z unabhängig ein Nukleotid-verknüpfender Rest ist, der die Hydroxylgruppen der sequentiellen Nukleotid-Reste kovalent konjugiert; jedes A unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, OH, zu einer Schutzgruppe derivatisiertem OH, und X-Y, worin X O, S oder CR₂ ist, worin jedes R unabhängig H oder Alkyl-(1-6C) ist; und Y ein Wirkstoff-Rest ist, der wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist, oder eine Markierung, die wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist; worin mindestens ein A X-Y ist.
Monomer nach Anspruch 1 oder Oligomer nach Anspruch 2, worin Y ein Wirkstoff-Rest ist, der durch eine Linkerkomponente angebunden ist, und vorzugsweise Y gewählt ist aus Netropsin und seinen Derivaten, Anthramycin, Chinoxalin-Antikörpern, Actinomycin und Pyrrolo-(1–4)-benzodiazepin-Derivaten.
Monomer nach Anspruch 1 oder Oligomer nach Anspruch 2, worin Y eine Markierung ist, die wahlweise durch eine Linkerkomponente angebunden ist.
Monomer nach Anspruch 1 oder Oligomer nach Anspruch 2, worin das oder jedes B unabhängig gewählt ist aus A, T, G, C und U und den geschützten Formen.
Monomer nach Anspruch 1, worin W₂ ein Phosphonat-Rest ist.
Monomer nach Anspruch 1, worin W₁ eine Schutzgruppe ist.
Oligonukleotid einer Mischsequenz der Formel:
worin jedes B unabhängig ein geschützter oder ungeschützter Purin- oder Pyrimidin-Rest ist; jedes von W₃ und W₄ unabhängig H(PO₃ ^–2)_m, eine Schutzgruppe, eine Gruppe, die zum Verknüpfen von Hydroxylgruppen und so Bilden einer Internukleotid-Verknüpfung reaktionsfähig ist, oder einen festen Träger umfasst; m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; n eine ganze Zahl von 1 bis 200 ist; jedes Z unabhängig ein Nukleosid-verknüpfender Rest ist, der die Hydroxylgruppen der sequentiellen Nukleosid-Reste kovalent konjugiert; und jedes A unabhängig H, OH oder -Opr ist, worin Pr eine Schutzgruppe ist, und zumindest ein A X-Y ist; X O ist; und Y eine unsubstituierte C_2-20-Alkyl- oder C_6-20-Arylgruppe ist.
Oligomer einer Mischsequenz nach Anspruch 2 oder Anspruch 8, welches ein Dimer oder Trimer ist.
Oligomer einer Mischsequenz nach Anspruch 2 oder Anspruch 8, worin Z gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus P(O)O, P(O)S, P(O)NR₂, P(O)R, P(O)OR', CO, CNR₂, worin R H oder Alkyl-(C_1-6) ist, und worin R' Alkyl-(C_1-6) ist.
Oligomer einer Mischsequenz nach Anspruch 2 oder Anspruch 8, worin alle A die Formel X-Y aufweisen oder zumindest ein A die Formel X-Y aufweisen und alle verbliebenen A H oder OH, oder die phosphorylierte Form davon sind.
Verwendung des Oligomers einer Mischsequenz nach einem der Ansprüche 2 oder 8 bis 12 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch das Vorhandensein einer Ziel-RNA- oder DNA-Sequenz vermittelt ist, wobei das Oligomer zum spezifischen Binden der Sequenz fähig ist, um sie zu inaktivieren.