CN120591277A - 调控htra1基因表达的生物材料及在抗病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和生物医药技术领域，具体涉及调控HTRA1基因表达的生物材料及在抗病毒中的应用。具体的，本发明通过研究发现，抑制HTRA1基因可显著促进H13N2亚型流感病毒的复制，从而促进H13N2亚型流感病毒的感染，而过表达HTRA1则可以有效抑制H13N2亚型流感病毒的复制，降低病毒滴度，从而提高抗流感病毒感染能力，因此HTRA1基因可作为调控H13N2亚型流感病毒复制的关键靶点，因此具有良好的实际应用价值。

Description

调控HTRA1基因表达的生物材料及在抗病毒中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物医药技术领域，具体涉及调控HTRA1基因表达的生物材料及在抗病毒中的应用。

背景技术

流感病毒是严重威胁人类及动物健康的重要病原体，可引发季节性流行甚至大流行。其根据病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同可以分为18种HA亚型和11种NA亚型。流感病毒根据感染宿主的不同又可以分为人流感病毒、禽流感病毒等。尽管已有神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦）和聚合酶抑制剂（如巴洛沙韦）等抗病毒药物应用于临床，但病毒的高突变率常导致耐药株的出现，且现有药物靶点多集中于病毒自身蛋白，作用机制相对单一。因此，探索宿主细胞中调控流感病毒感染与复制的关键因子，开发基于宿主靶向疗法（Host-Directed Therapy, HDT）的新型抗病毒策略，成为当前研究热点。

HTRA1基因，全名为HtrA serine peptidase 1，位于人类染色体10q26.13位置，具有PDZ结构域，是第一个被发现的人HtrA丝氨酸蛋白酶家族成员，编码高尔基体蛋白酶1（HtrA1），主要在细胞外基质中发挥作用。通过调节细胞外基质的降解和重塑，参与血管生成、神经保护和炎症反应等多种生物学过程。然而，发明人发现，HTRA1在宿主抗病毒天然免疫反应，特别是在流感病毒感染过程中的具体功能尚未有研究报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供调控HTRA1基因表达的生物材料及在抗病毒中的应用。具体的，本发明通过研究发现，抑制HTRA1基因可显著促进H13N2亚型流感病毒的复制，从而促进H13N2亚型流感病毒的感染，而过表达HTRA1则可以有效抑制H13N2亚型流感病毒的复制，降低病毒滴度，从而提高抗流感病毒感染能力，因此HTRA1基因可作为调控H13N2亚型流感病毒复制的关键靶点。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种调控HTRA1基因表达的生物材料，所述调控HTRA1基因表达的生物材料包括抑制HTRA1基因表达的生物材料和促进HTRA1基因表达的生物材料；

其中，所述抑制HTRA1基因表达的生物材料可以为短发夹RNA（shRNA）、重组慢病毒表达质粒、重组慢病毒表达载体或抑制HTRA1基因表达的宿主细胞；

所述促进HTRA1基因表达的生物材料可以为过表达HTRA1基因的表达质粒以及过表达HTRA1的宿主细胞。

其中，所述shRNA包括正义链和反义链，其中所述正义链具有如SEQ ID NO.1、SEQID NO.3或SEQ ID NO.5任一项所示的核苷酸序列，所述反义链具有如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.6任一项所示的核苷酸序列。

所述重组慢病毒表达质粒包含上述shRNA；更进一步的，所述重组慢病毒表达质粒由上述shRNA克隆至慢病毒质粒载体中获得。在本发明的一个具体实施方式中，所述慢病毒质粒载体可以为pLKO.1质粒载体。

所述重组慢病毒表达载体包含上述重组慢病毒表达质粒；更进一步的，所述重组慢病毒表达载体包含重组慢病毒表达质粒和辅助质粒。本发明中，所述辅助质粒包括psPAX2和pMD2.G。psPAX2是第二代慢病毒包装辅助质粒，载有病毒gag、pol、rev和tat基因。其与pMD2.G以及上述重组慢病毒载体质粒构成三质粒系统即构建重组慢病毒表达载体，共同转染293T等细胞以包装重组慢病毒，从而可实现对目标基因的敲降。

所述抑制HTRA1基因表达的宿主细胞可以为受到上述重组慢病毒感染从而特异性抑制HTRA1基因表达的细胞。在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞可以为A549细胞。所述重组慢病毒即为上述重组慢病毒表达载体转染293T细胞后包装获得。

本发明通过试验证明，与对照组相比，上述抑制HTRA1基因表达的宿主细胞在受到H13N2亚型流感病毒侵染后，其可显著促进H13N2亚型流感病毒复制，提高H13N2亚型流感病毒滴度，从而可解决病毒培养中滴度不足的问题，为疫苗生产、病毒学研究等提供高滴度病毒原料。

过表达HTRA1基因的表达质粒可以为HTRA1基因与质粒连接后获得；在本发明的一个具体实施方式中，所述质粒为pLV4ltr-PGK-ZsGreen(2A)PURO-CMV质粒。

过表达HTRA1的宿主细胞可以为将上述过表达HTRA1基因的表达质粒转染细胞从而获得。在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞可以为A549细胞。

因此，本发明的第二个方面，提供上述调控HTRA1基因表达的生物材料在如下任意一种或多种中的应用：

（a）制备病毒促进剂；

（b）制备病毒抑制剂。

其中，所述病毒为流感病毒，进一步为H13N2亚型流感病毒。

进一步的，所述抑制HTRA1基因表达的生物材料用于制备流感病毒促进剂。所述促进HTRA1基因表达的生物材料用于制备流感病毒抑制剂。其中，所述流感病毒为H13N2亚型流感病毒。

本发明中，所述流感病毒促进剂可以为非医药用途的普通试验试剂，所述普通试验试剂可用于促进H13N2亚型流感病毒的增殖以及复制，从而用于高滴度培养流感病毒，既能有效应用于基础研究，同时也为疫苗生产等提供高滴度病毒原料。

所述流感病毒抑制剂可以为药物或非医药用途的普通试验试剂，所述普通试验试剂同样可用于HTRA1基因与流感病毒之间的互作机制研究。

具体的，所述流感病毒抑制剂具体表现为抑制H13N2亚型流感病毒的增殖及复制，从而显著抑制H13N2亚型流感病毒的感染。

当所述流感病毒抑制剂为药物时，所述药物可以为抗流感病毒感染的药物；进一步的，所述药物还可以包括其他至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等；在此不做具体限定。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次揭示HTRA1基因作为调控H13N2亚型流感病毒复制的关键靶点。通过抑制HTRA1可显著促进病毒复制，从而提升病毒滴度，而过表达HTRA1则能有效抑制病毒复制，从而降低病毒滴度，为抗病毒策略提供了全新作用机制。具体的，基于抑制HTRA1的生物材料可高效提升H13N2病毒在宿主细胞中的复制效率，解决病毒培养中滴度不足的技术瓶颈，为疫苗生产、病毒学研究提供高滴度病毒原料。而基于过表达HTRA1的生物材料，能有效阻断H13N2病毒复制，降低感染率，为开发抗流感药物提供新的候选靶点，因此具有良好的实际应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例2中测序结果。

图2为本发明实施例3中shHTRA1包装慢病毒后侵染A549后，HTRA1的mRNA表达情况。

图3为本发明实施例4中敲降HTRA1后H13N2亚型流感病毒NP基因的mRNA表达情况。

图4为本发明实施例4中敲降HTRA1后H13N2亚型流感病毒PB2基因的蛋白表达情况。

图5为本发明实施例4中特异性抑制HTRA1基因对H13N2亚型流感病毒的病毒滴度的影响。

图6为本发明实施例6中pLV4ltr-PGK-ZsGreen(2A)PURO-CMV-HTRA1转染A549后，HTRA1的mRNA表达情况。

图7为本发明实施例6中过表达HTRA1后H13N2亚型流感病毒NP基因的mRNA表达情况。

图8为本发明实施例6中过表达HTRA1后H13N2亚型流感病毒PB2、PB1、NP基因的蛋白表达情况。

图9为本发明实施例6中过表达HTRA1基因对H13N2亚型流感病毒的病毒滴度的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。本发明使用了基因工程和分子生物学领域常规的技术和方法。本领域的技术人员可以在本发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。所述的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1 靶向HTRA1的shRNA的设计和筛选

（1）靶向HTRA1的shRNA的设计

以HTRA1基因为模板（Gene ID：NM_002775.5），利用赛默飞公司提供的在线设计shRNA的网站，进行靶基因的shRNA的设计，序列如表1所示。

表1 shRNA对应的序列

（2）shRNA引物退火

shRNA正反链引物，沸水加热4mins，自然冷却至室温后于-20℃保存备用。

实施例2 特异性抑制HTRA1基因表达的重组慢病毒表达质粒的构建

（1）pLKO.1-CMV-copGFP-PURO质粒酶切

将pLKO.1-CMV-copGFP-PURO用Age I和EcoR I双酶切，37 ℃至少孵育2小时。酶切产物使用0.8%的琼脂糖进行回收，用凝胶回收试剂盒回收5 kb条带。

（2）pLKO.1-CMV-copGFP-PURO shRNA连接转化

将回收后的酶切产物和shRNA用T4 连接酶连接，16 ℃连接1~5小时。连接产物转化DH5α感受态细胞，长出的单克隆菌落培养12h后，送测序，测序结果如图1所示。

（3）提取目的质粒

将阳性克隆利用25~35mL LB（含有氨苄青霉素）培养过夜（12~16小时），然后利用去内毒素/小提中量试剂盒提取目的质粒。

实施例3 特异性抑制HTRA1基因表达的A549细胞系的构建

（1）shRNA敲降质粒转染293T细胞产生慢病毒

培养HEK-293T细胞，待细胞长到80%左右时，将敲降质粒shRNA-HTRA1和辅助质粒psPAX2 、pMD2.G按照2:2:1的浓度用LipofectamineTM3000转染HEK-293T细胞。24h后收集5mL培养基（4°C保存），并再加入5~6 mL含有10%血清双抗的培养基。

转染48 h后收集细胞和上清液，15000 rpm 离心3 min，用0.45 µm的滤膜过滤。加入8~10 μg/mL聚凝胺(1000×)，-80°C贮存。

（2）最佳的嘌呤霉素（puromycin）浓度的确定

A549细胞达到80-90%融合率时加入嘌呤霉素进行筛选。嘌呤霉素的终浓度先在1~10 μg/mL以1 μg逐步增加，确定大致范围后，再以0.2 μg逐步增加，确定嘌呤霉素精确量。每天均需观察细胞的生长情况，添加嘌呤霉素3~5 d后细胞完全死亡的嘌呤霉素浓度即为筛选靶细胞的最佳浓度。本实验最终确定嘌呤霉素最佳浓度为1.2 μg/mL。

（3）慢病毒感染A549细胞

A549细胞铺6孔板中，长到80%左右时加入包装好的慢病毒（MOI=5）。根据细胞状态的不同，可在24h~48h间换液，并加入1.2 μg/mL的嘌呤霉素进行筛选。1周左右可形成稳定的细胞系。

（4）特异性抑制HTRA1基因表达的A549细胞系鉴定

收集稳定细胞系的细胞液，按照SimplyP总RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA，测定RNA浓度后，使用One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit II进行荧光定量PCR，测定HTRA1的mRNA水平，结果如图2所示，敲降HTRA1的A549细胞系（pLKO.1-CMV-copGFP-PURO-shHTRA1-1/2/3）的HTRA1 mRNA表达水平显著低于对照组（shNC），说明敲降HTRA1的A549细胞系构建成功，其中pLKO.1-CMV-copGFP-PURO-shHTRA1-1/2抑制效果更佳。

实施例4 特异性抑制HTRA1基因表达的A549细胞系对H13N2亚型流感病毒增殖的影响

（1）H13N2亚型流感病毒感染特异性抑制HTRA1基因表达的A549细胞系

将A549细胞和pLKO.1-CMV-copGFP-PURO-shHTRA1-1/2细胞培养到大约80%的汇合度时， H13N2亚型流感病毒（0.5MOI）接种细胞，在培养箱中孵育1h后，加入含有TPCK的F12K培养基，使TPCK的终浓度为2 μg/mL。培养24 h后，对病毒的复制情况进行检测。

（2）病毒复制检测

（2.1）荧光定量检测病毒NP基因的表达水平

病毒感染细胞24 h后，收集细胞，按照SimplyP总RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA，测定RNA浓度后，使用One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit II进行荧光定量PCR，测定NP的mRNA水平。结果如图3所示，结果表明，感染H13N2亚型流感病毒的A549-sh HTRA1-1/2细胞中NP基因的mRNA水平显著高于A549细胞对照组（shNC）。

（2.2）Western blot检测病毒PB2蛋白的表达水平

H13N2亚型流感病毒感染细胞24 h后，吸弃培养基，用PBS洗三次后，加入200 μL含有1%PMSF的RIPA裂解液，置于冰上裂解40 min，4℃ 12000 g离心5 min，取上清，测定蛋白浓度。取部分样品进行SDS-PAGE电泳，然后转印至PVDF膜，进行Western blot检测PB2蛋白的表达情况。结果如图4所示，结果显示，感染H13N2亚型流感病毒的A549-sh HTRA1-1/2细胞中PB2蛋白的量显著高于A549细胞对照组（shNC）。该结果表明，抑制HTRA1表达可以显著促进H13N2亚型流感病毒的复制。

（2.3）检测特异性抑制HTRA1基因对H13N2亚型流感病毒病毒滴度的影响

H13N2亚型流感病毒感染A549细胞（shNC）及特异性抑制HTRA1基因表达的A549细胞系（sh HTRA1）细胞24h 后收集上清。将收集的上清分别连续10倍稀释（稀释度分别为10^-1~10^-10）接种于铺有MDCK单层细胞的96孔板，培养60 h后免疫荧光法检测特异性抑制HTRA1基因对H13N2亚型流感病毒病毒滴度的影响。结果如图5所示，结果显示，特异性抑制HTRA1基因表达可以显著提高H13N2亚型流感病毒的病毒滴度。

实施例5过表达HTRA1基因的表达质粒的构建：

（1）以HTRA1基因为（Gene ID：NM_002775.5）目的基因，设计了一对用于扩增HTRA1基因的特异性引物（见表2）。利用PCR扩增HTRA1基因序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。

表2 用于扩增HTRA1基因的特异性引物

（2）利用限制性内切酶Xhol和BamHI双酶切pLV4ltr-PGK-ZsGreen(2A)PURO-CMV质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。

（3）将步骤（1）和步骤（2）中回收的产物使用无缝克隆试剂盒进行无缝拼接。将10μL无缝拼接产物转化DH5α感受态细胞，长出的单克隆菌落培养12h后，送测序，结果表明成功构建过表达HTRA1基因的表达质粒。

（4）将阳性克隆用25~35mL LB（ampicillin）培养过夜（12~16小时后），然后利用去内毒素/小提中量试剂盒提取目标质粒。

实施例6过表达HTRA1基因对H13N2亚型流感病毒的影响

（1）培养A549细胞，待细胞长到80%左右时，将过表达HTRA1基因的表达质粒用LipofectamineTM3000转染A549细胞(OE- HTRA1)。转染24 h后收集细胞，3000rpm 离心3min，处理好的细胞液按照SimplyP总RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA，测定RNA浓度后，使用One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit II进行荧光定量PCR，测定HTRA1的mRNA水平，结果如图6所示，结果说明HTRA1在A549细胞（OE-HTRA1）中过表达。

（2）将步骤（1）中获得的OE-NC组A549细胞 和OE- HTRA1组A549侵染H13N2流感病毒(MOI=0.01)，侵染病毒24h后，收集细胞液，按照SimplyP总RNA提取试剂盒说明书提取细胞RNA，测定RNA浓度后，使用One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit II进行荧光定量PCR，检测H13N2流感病毒NP基因的mRNA表达情况，结果如图7所示，结果说明过表达HTRA1后抑制了H13N2流感病毒的复制。

（3）同时将细胞裂解并收集上清液，进行SDS-PAGE电泳，然后转印至PVDF膜，进行Western blot检测H13N2流感病毒PB1、PB2和NP蛋白的表达情况。结果如图8所示，结果说明过表达HTRA1后抑制了H13N2流感病毒的复制。

（4）H13N2亚型流感病毒感染A549细胞（OE-NC）及过表达HTRA1的A549细胞（OE-HTRA1）24h后收集上清。将收集的上清分别连续10倍稀释（稀释度分别为10^-1~10^-10）接种于铺有MDCK单层细胞的96孔板，培养60 h后免疫荧光法检测H13N2亚型流感病毒在不同细胞系中的病毒滴度。结果如图9所示，结果显示过表达HTRA1可以显著降低H13N2亚型流感病毒的病毒滴度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种调控HTRA1基因表达的生物材料，其特征在于，所述调控HTRA1基因表达的生物材料包括抑制HTRA1基因表达的生物材料和促进HTRA1基因表达的生物材料；

其中，所述抑制HTRA1基因表达的生物材料为shRNA、重组慢病毒表达质粒、重组慢病毒表达载体或抑制HTRA1基因表达的宿主细胞；

所述促进HTRA1基因表达的生物材料为过表达HTRA1基因的表达质粒以及过表达HTRA1的宿主细胞。

2.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述shRNA包括正义链和反义链，其中所述正义链具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5任一项所示的核苷酸序列，所述反义链具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6任一项所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述重组慢病毒表达质粒包含所述shRNA。

4.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体包含所述重组慢病毒表达质粒和辅助质粒；所述辅助质粒包括psPAX2和pMD2.G。

5.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述抑制HTRA1基因表达的宿主细胞为受到重组慢病毒感染从而特异性抑制HTRA1基因表达的细胞；所述细胞为A549细胞；所述重组慢病毒为所述重组慢病毒表达载体转染293T细胞后包装获得。

6.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，过表达HTRA1基因的表达质粒为HTRA1基因与质粒连接后获得；所述质粒为pLV4ltr-PGK-ZsGreen(2A)PURO-CMV质粒。

7.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，过表达HTRA1的宿主细胞为将所述过表达HTRA1基因的表达质粒转染细胞从而获得；所述细胞为A549细胞。

8.权利要求1-7任一项所述调控HTRA1基因表达的生物材料在如下任意一种或多种中的应用：

（a）制备病毒促进剂；

（b）制备病毒抑制剂；

其中，所述病毒为H13N2亚型流感病毒。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制HTRA1基因表达的生物材料用于制备流感病毒促进剂；所述促进HTRA1基因表达的生物材料用于制备流感病毒抑制剂；其中，所述流感病毒为H13N2亚型流感病毒。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述流感病毒促进剂为非医药用途的普通试验试剂，所述流感病毒促进剂用于促进H13N2亚型流感病毒的增殖以及复制；

所述流感病毒抑制剂为药物或非医药用途的普通试验试剂；所述流感病毒抑制剂用于抑制H13N2亚型流感病毒的增殖及复制，从而抑制H13N2亚型流感病毒的感染。