CN118483310A - 一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，利用串联质谱，对稳定同位素标记化合物MX_n的离子对丰度进行定量分析，从而获得该化合物各种同位素异数体的相对含量，进而得到同位素异数体分布x₀、x₁、x₂、……、x_n，并由下式计算得到该化合物的同位素丰度E；

Description

一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法

技术领域

本发明涉及稳定同位素分析技术领域，尤其是涉及一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法。

背景技术

稳定同位素标记试剂是科学研究中应用非常广泛的基础试剂，无论是作为检测内标还是示踪剂，在食品安全、药物分析、代谢组学与代谢流等领域都发挥了不可替代的作用。稳定同位素标记化合物的同位素丰度系指某一化合物中，标记原子占标记位点原子总数的百分比。同位素丰度是稳定同位素标记试剂重要的质控指标，同时也是代谢流等示踪应用中重要的研究对象。

目前测定稳定同位素丰度的主要手段为核磁共振波谱法与质谱法。其中，核磁共振波谱法是公认较为准确的方法，在计量溯源与标准物质定值中已有应用，但受制于核磁共振波谱仪较低的检测灵敏度以及在混合样品分离能力不足，该方法不适用于复杂样品基质中浓度较低的同位素标记化合物丰度测定，在纯品质控的应用中对样品的消耗量也较大，检测成本较高。质谱法与核磁共振法在量值溯源上同样无需依赖标准物质，在灵敏度上则有绝对优势，且由于能与色谱联用，因而在复杂基质样品中同位素标记组分的丰度测定上有更广泛而灵活的应用。

根据质谱仪的种类不同，质谱法又可被粗略地分为高分辨质谱法与低分辨质谱法。其中，低分辨质谱主要指四极杆质谱，受限于仪器分辨率，相近质荷比的离子(待测离子与“杂质”离子、待测离子与待测离子)无法得到有效分离，以卷积的形式被计入质谱数据，在同位素丰度结果计算的过程中首先需要进行较为复杂的去卷积计算；同时，未能完全分离的“杂质”离子也会在检测结果中引入误差。高分辨质谱主要有傅里叶变换质谱仪、飞行时间质谱、轨道离子阱质谱等，较高的仪器分辨率保证了相近质荷比的质谱峰的分离，一方面降低了结果计算的难度，一方面提高了选择性，降低了基质背景、待测组分中质荷比相近的“杂质”峰对待测峰测定的干扰，从而提高了准确性。然而，高分辨质谱仪高昂的价格大幅提高了检测门槛及成本，限制了该方法的推广使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，具有高准确性和高灵敏度。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，利用串联质谱，对稳定同位素标记化合物MX_n的离子对丰度进行定量分析，从而获得该化合物各种同位素异数体的相对含量，进而得到同位素异数体分布x₀、x₁、x₂、……、x_n，并由下式计算得到该化合物的同位素丰度E；

其中，X为标记的同位素，n为该标记元素的标记原子数，M为除去标记原子后的剩余分子式。

优选地，所述X为²H、¹³C、¹⁵N、¹⁸O中的一种或多种的组合。

优选地，所述串联质谱包括两个以上质谱质量分析器。

进一步优选地，所述串联质谱包括三重四极杆质谱、四极杆-飞行时间质谱、四极杆-离子阱质谱、四极杆-轨道离子阱质谱。

优选地，利用串联质谱，使用中性丢失扫描法和/或母(前体)离子扫描法对稳定同位素标记化合物MX_n的离子对丰度进行定量分析。

进一步优选地，所述中性丢失扫描法包括固定第二级质谱中监测的子离子或第一级质谱与第二级质谱中监测的母离子与子离子质荷比差值(中性丢失)，扫描或检测第一级质谱中相应质荷比范围的母离子，获得所需测定的同位素异数体对应质荷比的离子相对丰度。

进一步优选地，所述母离子扫描法包括固定第二级质谱中监测的子离子质荷比，扫描或检测第一级质谱中相应质荷比范围的母离子，获得所需测定的同位素异数体对应质荷比的离子相对丰度。

优选地，在通过对稳定同位素标记化合物MX_n的离子对丰度进行定量分析时，基于离子强度数据或峰面积，可以获得该化合物各种同位素异数体的相对含量。

优选地，获得该化合物各种同位素异数体的相对含量后，经过数据去卷积处理后得到同位素异数体分布x₀、x₁、x₂、……、x_n。

进一步优选地，所述去卷积处理方法包括质量簇法。

更进一步优选地，所述去卷积处理方法包括：基于下式联立求解方程组，得到同位素异数体分布x₀、x₁、x₂、……、x _i：

其中，设同位素标记化合物非标记位点部分单一分子质量为M，α₀、α₁、……、α_i即为该部分天然同位素同素异形体在分子质量M、M+1、……、M+i的分布系数，I_i为分子质量M、M+1、……、M+i对应的质谱峰强。

优选地，所述质谱峰强为相对离子强度。

优选地，所述α_i根据未标记部分天然同位素分布规律获得。

进一步优选地，所述α_i根据理论计算、模拟器计算(如chemcalc.org网站模拟器、同位素丰度分布计算器)或天然丰度质谱实验得到。

优选地，计算同位素异数体分布x₀、x₁、x₂、……、x₅时，去卷积处理方法包括联立求解以下方程组：

I₀＝α₀x₀

I₁＝α₁x₀+α₀x₁

I₂＝α₂x₀+α₁x₁+α₀x₂

I₃＝α₃x₀+α₂x₁+α₁x₂+α₀x₃

I₄＝α₃x₁+α₂x₂+α₁x₃+α₀x₄

I₅＝α₃x₂+α₂x₃+α₁x₄+α₀x₅。

其中，设同位素标记化合物非标记位点部分单一分子质量为M，α₀、α₁、α₂、α₃即为该部分天然同位素同素异形体在分子质量M、M+1、……、M+3的分布系数，I_i为分子质量M、M+1、……、M+i对应的质谱峰强。

优选地，所述稳定同位素标记化合物MX_n在串联质谱的碰撞室中被碎裂为AX_x及BX_n-x时，该化合物的总同位素丰度E通过加权平均来计算：

优选地，采用液相色谱或蠕动泵向串联质谱中引入样品。

本发明涉及的待测组分设为MX_n，其中，设X为标记的同位素，如²H(即D)、¹³C、¹⁵N、¹⁸O等中的一种或多种的组合，n为该标记元素的标记原子数，M为除去标记原子后的剩余分子式。

本发明所涉及的串联质谱法系指采用三重四极杆质谱中的母离子扫描模式、中性丢失扫描模式，以及在其他种类的串联质谱中，采用子离子扫描等模式获得特定质荷比(m/z)的母离子(parent ion或称先导离子，precursor ion)与子离子(product ion)离子对的强度，从而得到选择性较高的特定待测离子的强度数据。

具体地，设待测物组分能够在串联质谱的碰撞室中被碎裂为AX_x及BX_n-x，其相对分子(离子)质量在所有位点处于未被标记的状态下时为M_A及M_B并且假定AX_x继承了母离子MX_n的电荷。显然地，根据上述假设，待测分子MX_n在所有位点处于未被标记的状态下时的相对分子(离子)质量M_Z＝M_A+M_B。

则AX_x部分中X的同位素丰度可以通过中性丢失或相同原理的扫描模式，恒定m/z差为M_B+n-x(针对D、¹³C、¹⁵N等与H、¹²C、¹⁴N相对质量差为1的标记元素)或M_B+2(n-x)(针对¹⁸O等与¹⁶O相对质量差为2的标记元素)，获取母离子m/z等于M_Z+n-x，M_Z+n-x+1，……，M_Z+n(子离子m/z对应等于M_A，M_A+1，……，M_A+x)的峰面积(离子强度信息)，并经过必要的数据去卷积处理(如“质量簇”法等)，得到同位素异数体分布x₀、x₁、……、x_x，并由定义式计算得到AX_x部分的同位素丰度E_A：

而BX_n-x部分中X的同位素丰度可以通过母离子扫描或相同原理的扫描模式，恒定子离子m/z为M_A+x(针对¹³C、¹⁵N等与¹²C、¹⁴N相对质量差为1的标记元素)或M_B+2x(针对¹⁸O等与¹⁶O相对质量差为2的标记元素)，获取母离子m/z等于M_Z+x，M_Z+x+1，……，M_Z+n的峰面积(离子强度信息)，并经过必要的数据去卷积处理(如“质量簇”法等)，得到同位素异数体分布x₀、x₁、……、x_n-x，并由定义式计算得到BX_n-x部分的同位素丰度E_B：

在大多数情况下，可以通过调节碰撞室参数控制母离子的碎裂位点，使得标记的同位素全部出现在碎片AX_x或BX_n-x上，从而使上述步骤简化。如标记同位素全部出现在AX_x时，即x＝n时，只需进行中性丢失扫描，并且待测组分MX_n的同位素丰度E＝E_A；同理当标记同位素全部出现在BX_n-x时，即x＝0时，只需进行母离子扫描，并且待测组分MX_n的同位素丰度E＝E_B。

当标记同位素不可避免地同时出现在两个碎片上时，待测组分的总同位素丰度E可通过加权平均来计算：

需要说明的是，上述提到的母离子/子离子m/z的选择适用于待测组分标记率较高、同位素丰度较高的情况，在这种情况下，这样选择所得到的监测离子强度最高，利于监测的准确性。若待测组分标记率、同位素丰度不高甚至较低时(在代谢示踪等应用中，待测组分的同位素丰度往往会比示踪剂有明显下降)，可以在上述指导思想的基础上，选择强度最高的离子，从而保证检测灵敏度及准确性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种基于串联质谱的、高准确性、高灵敏度的稳定同位素丰度测定方法；

2.本发明能够更准确、更精密地测定稳定同位素产品的同位素丰度；

3.本发明利用串联质谱对稳定同位素标记化合物的离子对丰度进行定量分析，获得信噪比更高的同位素异数体分布，从而计算得到更准确的稳定同位素丰度；

4.本发明创造性地利用了串联质谱能够利用子/母离子对筛除质荷比相近的“杂质”离子的作用，从另外一种途径提高了对待测物的选择性，使其检测精度能够达到甚至超过高分辨质谱法的水平；

5.本发明发挥串联质谱检测灵敏度的优势，使得该方法在代谢组学等基质极其复杂、待测物浓度极低的应用领域更具应用价值；

6.本发明中，三重四级杆质谱与高分辨质谱法测得的结果不存在显著差异，可降低检测门槛及成本，有利于质谱法测定稳定同位素丰度的推广使用。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

除非特别说明，本发明采用的试剂，方法，仪器和设备为本领域常规试剂，方法，仪器和设备。除非特别说明，以下实施例所用的试剂和材料均为市购。

实施例1

采用三重四极杆质谱测定恩诺沙星-D₅(分子式C₁₉H₁₇D₅FN₃O₃)的同位素丰度，采用蠕动泵引入样品溶液，流速10μL/min；质谱扫描极性为正离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为12Arb，离子传输管温度设置为275℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

则M为C₁₉H₁₈FN₃O₃，X为D，n＝5，AX_x为C₁₈H₁₈FN₃OD₅，BX_n-x为CO₂，其中x＝5，且M_A＝316，M_B＝44，Mz＝360。由于标记原子D全部出现在继承了母离子电荷的AX_x部分，只需采用中性丢失扫描，恒定m/z差为M_B+n-x即44，获取母离子m/z等于M_Z+n-x，M_Z+n-x+1，……，M_Z+n(即360～365)的离子强度数据。采用标识氘同位素丰度为99.25atom D％(¹HNMR定值)的标准品配制成浓度为1mg/L样品溶液，在最优化的质谱离子源参数及上述扫描参数下进样分析，获得m/z＝360～365的离子强度数据依次为2177、339、48、24、3044、354148，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到MD₀H₅、MD₁H₄、MD₂H₃、MD₃H₂、MD₄H₁、MD₅H₀的同位素异数体的分布(归一化后)为0.0076(x₀)、-0.0004(x₁)、0.0001(x₂)、0.0001(x₃)、0.0106(x₄)、1.2308(x₅)，进而根据下式计算：

E＝((1×x₁+2×x₂+3×x₃+4×x₄+5×x₅)/(5×(x₀+x₁+x₂+x₃+x₄+x₅)))×100％

＝(1×-0.0004+2×0.0001+3×0.0001+4×0.0106+5×1.2308)/(5×

(0.0076-0.0004+0.0001+0.0001+0.0106+1.2308)))×100％＝99.24％。

即计算得恩诺沙星-D₅的同位素丰度E＝E_A＝99.24atom D％，六次平行测定的结果平均值为99.22atom D％，相对标准偏差RSD＝0.16％。作为对比，同样的样品采用同样的设备及传统的全扫描法，六次平行测定的结果平均值为96.53atom D％，RSD＝0.45％。显示出本发明的方法相比传统方法，精密度有小幅提升，而准确性则有大幅改善。

本实施例中，基于m/z＝360～365的离子强度数据获得相对离子强度I₀～I₅(对应的离子强度数据/最大离子强度数据)，基于同位素丰度分布计算器获得天然丰度恩诺沙星的同位素分布系数α₀、α₁、α₂、α₃分别为0.811、0.169、0.018、0.001。

联立以下方程组，计算得到x₀～x₅。

I₀＝α₀x₀

I₁＝α₁x₀+α₀x₁

I₂＝α₂x₀+α₁x₁+α₀x₂

I₃＝α₃x₀+α₂x₁+α₁x₂+α₀x₃

I₄＝α₃x₁+α₂x₂+α₁x₃+α₀x₄

I₅＝α₃x₂+α₂x₃+α₁x₄+α₀x₅。

实施例2

采用液相色谱-三重四极杆质谱测定葡萄糖-6-磷酸-¹³C₆(分子式¹³C₆H₁₃O₉P)的同位素丰度，采用液相色谱引入样品，色谱柱采用Waters BEH Amide(100mm×2.1mm，1.7μm)，流动相A为乙腈，流动相B为含20mmol/L的乙酸铵的水溶液，VA：VB＝90：10，在200μL/min流速下等度洗脱；进样量为10μL；质谱扫描极性为负离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为25Arb，辅助气流量设为15Arb，离子传输管温度设置为300℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

则M为H₁₂O₉P，X为¹³C，n＝6，AX_x为H₂PO₄，BX_n-x为¹³C₆H₁₀O₅，其中x＝0，且M_A＝97，M_B＝162，Mz＝259。由于标记原子¹³C全部出现在未继承母离子电荷的中性丢失BX_n-x部分，只需采用母离子扫描，恒定子离子m/z为M_A+x即97，获取母离子m/z等于M_Z+x，M_Z+x+1，……，M_Z+n(即259～265)的离子强度数据。采用最优化的色谱分离条件、质谱离子源参数及上述扫描参数下分析喂给葡萄糖-¹³C₆示踪剂的细菌经过一定时间代谢得到的代谢混合物(样本经过合适的前处理)，获得m/z＝259～265的离子强度数据依次为5044、788、152、305、128、1870、197049，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到M¹³C₀ ¹²C₆、M¹³C₁ ¹²C₅、M¹³C₂ ¹²C₄、M¹³C₃ ¹²C₃、M¹³C₄ ¹²C₂、M¹³C₅ ¹²C₁、M¹³C₆ ¹²C₀的同位素异数体的分布(归一化后)为0.026、0.004、0.000、0.001、0.001、0.009、1.000，进而计算得葡萄糖-6-磷酸-¹³C₆的同位素丰度E＝E_B＝96.97atom ¹³C％。同时，采用未经标记的、5mg/L的葡萄糖-6-磷酸标准品溶液，在上述同样条件下检测，得到m/z＝259～265的离子强度数据依次为357275、24996、7177、501、108、0、0，可以得到该样品中检测出葡萄糖-6-磷酸的浓度为2.63mg/L。显示出本发明的方法拥有用于代谢物同位素丰度及含量的同时测定的潜力。

实施例3

采用三重四极杆质谱测定赖氨酸-¹³C₆ ¹⁵N₂(分子式¹³C₆H₁₄ ¹⁵N₂O₂)的同位素丰度，采用蠕动泵引入样品溶液，流速10μL/min；质谱扫描极性为正离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为12Arb，离子传输管温度设置为275℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

则M为H₁₅O₂，X为¹³C/¹⁵N，n＝8，AX_x为¹³C₅H₁₀ ¹⁵N，BX_n-x为¹³3CH₅ ¹⁵NO₂，其中x＝6，且M_A＝84，M_B＝63，Mz＝147。由于标记原子¹³C及¹⁵N同时出现在子离子AX_x与中性丢失BX_n-x部分，需同时采用中性丢失扫描与母离子扫描模式。在中性丢失扫描模式中，恒定m/z差为M_B+n-x即65，获取母离子m/z等于M_Z+n-x，M_Z+n-x+1，……，M_Z+n(即149～155)的离子强度数据。采用自制的、浓度为0.5mg/L的赖氨酸-¹³C₆ ¹⁵N₂样品溶液，在最优化的质谱离子源参数及上述扫描参数下进样分析，获得m/z＝149～155的离子强度数据依次为27、97、237、1678、9012、95275、827632，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到AX₀、AX₁、AX₂、AX₃、AX₄、AX₅、AX₆的同位素异数体的分布(归一化后)为0.000、0.000、0.000、0.002、0.0011、0.115、1.000，进而计算得子离子部分的同位素丰度E_A＝97.86atom ¹³C(¹⁵N)％；在母离子扫描模式中，恒定子离子m/z为M_A+x即90，获取母离子m/z等于M_Z+x，M_Z+x+1，……，M_Z+n(即153～155)的离子强度数据。在相同的质谱离子源参数及上述扫描参数下分析同一个样品，获得m/z＝153～155的离子强度数据依次为438、65309、3607273，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到BX₀、BX₁、BX₂的同位素异数体的分布(归一化后)为0.000、0.019、1.000，进而计算得中性丢失部分的同位素丰度E_B＝99.08atom¹³C(¹⁵N)％。对子离子与中性丢失部分的同位素丰度部分进行加权平均处理，可以得到该赖氨酸-¹³C₆ ¹⁵N₂样品的两种同位素丰度(混合)为98.16％，即E＝(6×97.86％+(8-6)×99.08％)/8＝98.17％。平行测定8次得到的丰度平均值为98.17％，RSD＝0.01％。该样品采用高分辨质谱(四极杆-轨道离子阱质谱)测定其同位素丰度，平均结果为98.25％，RSD＝0.12(n＝8)。显示出本发明的方法与高分辨质谱法测得的结果不存在显著差异，相比之下，本发明的方法精密度更高，但无法像高分辨质谱法一样测得每一种同位素的丰度。

实施例4

采用液相色谱-三重四极杆质谱测定葡萄糖-¹³C₆(分子式¹³C₆H₁₂O₆)的同位素丰度，采用液相色谱引入样品，色谱柱采用Waters BEH Amide(100mm×2.1mm，1.7μm)，流动相A为乙腈，流动相B为含20mmol/L的乙酸铵的水溶液，VA：VB＝90：10，在200μL/min流速下等度洗脱；进样量为10μL；质谱扫描极性为负离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为25Arb，辅助气流量设为15Arb，离子传输管温度设置为300℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

则M为H₁₂O₆，X为¹³C，n＝6，AX_x为¹³C₃H₅O₃，BX_n-x为¹³C₃H₆O₃，其中x＝3，且M_A＝89，M_B＝90，Mz＝179。由于标记原子¹³C同时出现在子离子AX_x与中性丢失BX_n-x部分，需同时采用中性丢失扫描与母离子扫描，本例中用选择反应监测(SRM，或称多反应监测，MRM)模式实现中性丢失扫描与母离子扫描的数据采集功能。在中性丢失扫描模式中，恒定m/z差为M_B+n-x即93，获取母离子m/z等于M_Z+n-x，M_Z+n-x+1，……，M_Z+n(即182～185)的离子强度数据；在母离子扫描模式中，恒定子离子m/z为M_A+x即92，获取母离子m/z等于M_Z+x，M_Z+x+1，……，M_Z+n(即182～185)的离子强度数据；用SRM模式代替时，只需采集子离子/母离子m/z为89/182、90/183、91/184、92/185、92/182、92/183、92/184的离子对峰面积即可。将已知同位素丰度的葡萄糖-¹³C₆(E＝98.5atom ¹³C％)制成1mg/L样品溶液，在最优化的质谱离子源参数及上述扫描参数下进样分析，获得上述m/z的离子对对应的峰面积依次为0、20、801、24279、38、63、1391，采用“质量簇法”分别对上述数据作去卷积处理，得到AX₀、AX₁、AX₂、AX₃的同位素异数体的分布(归一化后)为0.000、0.001、0.033、1.000，并计算得到E_A＝98.9atom ¹³C％；BX₀、BX₁、BX₂、BX₃的同位素异数体的分布(归一化后)为0.000、0.001、0.033、1.000，并计算得到E_B＝97.9atom ¹³C％。对子离子与中性丢失部分的同位素丰度部分进行加权平均处理，可以得到该葡萄糖-¹³C₆样品的同位素丰度为98.4％。平行测定6次得到的丰度平均值为98.3％，RSD＝0.2％。显示出可以使用相对更常用的SRM或MRM模式代替中性丢失扫描及母离子扫描进行数据采集，达到相仿的检测效果。

本发明利用串联质谱对稳定同位素标记化合物的离子对丰度进行定量分析，获得信噪比更高的同位素异数体分布，从而计算得到更准确的稳定同位素丰度。与现有技术相比，本发明能够更准确、更精密地测定稳定同位素产品的同位素丰度；另一方面，本发明方法具有较高的灵敏度，检测浓度下限较低，可对低浓度样品进行检测。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，利用串联质谱，对稳定同位素标记化合物MX_n的离子对丰度进行定量分析，从而获得该化合物各种同位素异数体的相对含量，进而得到同位素异数体分布x₀、x₁、x₂、……、x_n，并由下式计算得到该化合物的同位素丰度E；

其中，X为标记的同位素，n为该标记元素的标记原子数，M为除去标记原子后的剩余分子式。

2.根据权利要求1所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，所述X为²H、¹³C、¹⁵N、¹⁸O中的一种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，所述串联质谱包括两个以上质谱质量分析器。

4.根据权利要求3所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，所述串联质谱包括三重四极杆质谱、四极杆-飞行时间质谱、四极杆-离子阱质谱、四极杆-轨道离子阱质谱。

5.根据权利要求1所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，利用串联质谱，使用中性丢失扫描法和/或母离子扫描法对稳定同位素标记化合物MX_n的离子对丰度进行定量分析。

6.根据权利要求5所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，所述中性丢失扫描法包括固定第二级质谱中监测的子离子或第一级质谱与第二级质谱中监测的母离子与子离子质荷比差值，扫描或检测第一级质谱中相应质荷比范围的母离子，获得所需测定的同位素异数体对应质荷比的离子相对丰度。

7.根据权利要求5所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，所述母离子扫描法包括固定第二级质谱中监测的子离子质荷比，扫描或检测第一级质谱中相应质荷比范围的母离子，获得所需测定的同位素异数体对应质荷比的离子相对丰度。

8.根据权利要求1所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，获得该化合物各种同位素异数体的相对含量后，经过数据去卷积处理后得到同位素异数体分布x₀、x₁、x₂、……、x_n。

9.根据权利要求8所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，所述去卷积处理方法包括质量簇法。

10.根据权利要求1～9任一项所述的基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法，其特征在于，所述稳定同位素标记化合物MX_n在串联质谱的碰撞室中被碎裂为AX_x及BX_n-x时，该化合物的总同位素丰度E通过加权平均来计算：