CN112816686B - 一种多重信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用 - Google Patents

一种多重信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112816686B
CN112816686B CN202011604884.3A CN202011604884A CN112816686B CN 112816686 B CN112816686 B CN 112816686B CN 202011604884 A CN202011604884 A CN 202011604884A CN 112816686 B CN112816686 B CN 112816686B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
rna
strand
detection
signal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011604884.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112816686A (zh
Inventor
刘密
彭作富
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aikefa Beijing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Aikefa Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aikefa Beijing Biotechnology Co ltd filed Critical Aikefa Beijing Biotechnology Co ltd
Publication of CN112816686A publication Critical patent/CN112816686A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112816686B publication Critical patent/CN112816686B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用。本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫斑点法的检测的方法，包括下述步骤：(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；(2)加入待检测细胞和细胞刺激物或者直接加入已经和刺激物作用过的待检测细胞；(3)加入抗体‑DNA/RNA连接链或者加入抗原‑DNA/RNA连接链，作用一定时间；(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；(5)加入DNA/RNA检测链，反应一定时间；(6)进行洗涤，检测DNA/RNA检测链上的待检测信号强度；(7)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。本发明检测方法具有信号多重放大、检测限低、灵敏度更高、可同时检测多种目标物、可多轮检测、操作简便等优点。

Description

一种多重信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种基于DNA/RNA互补配对的多重信号放大系统及其用于免疫斑点法的检测。
背景技术
免疫斑点法是指将抗体结合到PVDF、醛基化多孔板等固相载体上，然后利用抗原抗体特异性结合检测细胞所分泌的细胞因子等物质的免疫学检测方法。酶联免疫斑点法(ELISPOT)是最常用的免疫斑点法，通过显色反应，在待检测细胞分泌可溶性蛋白等物质的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在仪器下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌特定物质的细胞的数量。传统的ELISPOT检测方法受限于酶和底物显色的种类，一次实验只能检测一种抗原。荧光免疫斑点法(FluoroSpot)虽然可以一次检测两种抗原，但是只能进行一轮检测且因为缺乏放大系统而导致灵敏度低。为了实现同时检测多种抗原或抗体信号并实现多轮检测，本发明采用DNA互补配对技术制备了一种检测灵敏度高的多级多重信号放大系统，并将其应用于免疫斑点法的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫斑点法的检测的方法，包括下述步骤：
(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；
(2)加入待检测细胞和细胞刺激物或者直接加入已经和刺激物作用过的待检测细胞或者直接加入未经刺激物刺激的待检测细胞后作用一段时间；
(3)去除细胞和/或细胞刺激物并洗涤；加入抗体-DNA/RNA连接链或者加入抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；
(5)加入DNA/RNA检测链，反应一定时间；
(6)进行洗涤，检测DNA/RNA检测链上的待检测信号强度；
(7)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，在固相基质上包被抗体或抗原后，加入封闭液进行封闭。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测细胞包括但不限于人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒、其他任何来源的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述细胞刺激物可为任何与细胞作用后可使细胞分泌任何抗原或抗体的物质。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗体/抗原分子连接一个或多个连接中间体。
本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基或其他任何可行的连接基团中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体连接1个或多个DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述用于连接抗体或抗原和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种官能团的比例为一比一、一比多中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
本发明的优选技术方案中，步骤(4)中，可先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链，根据需要连接更多级别DNA/RNA放大链。
本发明的优选技术方案中，步骤(6)中，可先进行第一轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第二轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮DNA/RNA检测链进行检测；根据需要进行多轮检测。
本发明优选的技术方案中，检测过程中不低于1轮的检测，优选为2轮到6轮；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗原或抗体。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前解离洗脱的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链、连接链与检测链互补配对的位置。
本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，所述检测信号包括但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行免疫斑点法检测的检测系统，所述检测系统包括可以与包被抗体或包被抗原结合的固相基质、可以与固相基质结合的包被抗体或包被抗原、经过刺激或未经任何刺激可以分泌特定物质的细胞、抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有待检测信号的DNA/RNA检测链，其中，多重信号放大系统包括抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有待检测信号的DNA/RNA检测链，用于将细胞分泌的信号放大后进行检测。
本发明优选的技术方案中，所述包被抗体或包被抗原、细胞分泌的特定物质、抗体/抗原-DNA/RNA连接链三者可以形成双抗体夹心或者双抗原夹心的结构。
本发明的优选技术方案中，所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质等任何可吸附包被抗体/抗原或者通过化学键包被抗体/抗原的固相基质。
本发明的优选技术方案中，所述包被抗体或抗原选自任何可与相应抗原或抗体结合，并可被包被于固相基质的抗体或抗原。
本发明的优选技术方案中，所述抗体或抗原可通过化学键、吸附等作用包被于固相基质。
本发明优选的技术方案中，所述细胞包括但不限于人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒、其他任何来源的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述细胞刺激物可为任何与细胞作用后可使细胞分泌任何抗原或抗体的物质。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统，所述多重信号放大系统包括连有待检测信号的DNA/RNA检测链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、抗体或抗原分子、连接DNA/RNA连接链与抗体或抗原的连接中间体，其中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链可互补配对后连接，或者，DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接，其中，各链之间的碱基可互补配对相互连接。
本发明优选的技术方案中，一个抗体或抗原的连接中间体可以连接一条或多条DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链直接互补配对连接为DNA/RNA检测链的碱基可直接与DNA/RNA连接链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链直接与DNA/RNA连接链互补配对时，互补配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA放大链部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，一条DNA/RNA放大链与其他多条放大链的部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，不同级DNA/RNA放大链之间互补配对时(例如，一级连接二级时，二级连接三级时，以此类推)，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链互补配对时，配对部分碱基长度为5-180个碱基对，优选为7-140个，更优选为8-100个，再优选9-70个，还优选10-50个。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA连接链之间、同一级DNA/RNA放大链之间(例如，一级链之间的配对，二级链之间的配对)、DNA/RNA检测链之间的可配对部分碱基长度为0-5个碱基对。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前采用洗脱液解离洗脱掉的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、检测链与连接链互补配对的位置。
本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
本发明优选的技术方案中，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中可含有碱基重复单元。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体两端或中间任意位置双功能化，一官能团连接抗体或抗原上对应的官能团，另一官能团连接DNA/RNA连接链上对应的官能团，连接中间体的双官能团中两种官能团的比例为一比一或一比多的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述抗体、抗原、DNA或RNA上用于与连接中间体反应或连接的官能团包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的一种官能团与抗原或抗体上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的另一种官能团可以与DNA/RNA上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的抗体或抗原分子，一个抗体或抗原分子可连接一个或同时连接多个连接中间体。
本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的DNA/RNA连接链，一个一个连接中间体可连接一个或同时连接多个DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，所述检测链连接有待检测信号。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于DNA/RNA检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
本发明优选的技术方案中，所述待检测信号选自但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统可应用于免疫斑点法的检测中。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统，所述的多重信号放大系统采用DNA/RNA放大链，其中，所述的DNA/RNA放大链可为一条或多条。
本发明的优选技术方案中，所述的DNA/RNA放大链可为一级放大或多级放大。
本发明的优选技术方案中，当DNA/RNA放大链为一条或多条时，DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA连接链碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明的优选技术方案中，当DNA/RNA放大链为多条时，一条DNA/RNA放大链部分片段与DNA/RNA检测链碱基互补配对，同时与其他多条DNA/RNA放大链部分片段互补配对。
本发明优选的技术方案中，当DNA/RNA放大链为多条时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，当DNA/RNA放大链为多级放大时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA放大链，该放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA连接链，该连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明的另一目的在于提供一种DNA/RNA检测链，该检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U。
本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统的制备方法，包括抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备、DNA/RNA放大链的制备。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备为抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链相连，其中，所述连接中间体具有双官能团，一官能团与抗体或抗原相连，另一官能团与DNA/RNA连接链相连。
本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原或者DNA/RNA连接链上的用于与连接中间体连接的官能团包括但不限于腙基、氨基、羧基、羟基、巯基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
本发明优选的技术方案中，所述连接中间体的双官能团中一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羧基反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羟基的反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羧基结合，另一官能团可与羟基结合；或者一个官能团可与羧基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羟基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或任何其他可行的连接方案。
本发明优选的技术方案中，抗体或抗原上的氨基与连接中间体上的一个官能团反应连接，而DNA/RNA连接链上的巯基与连接中间体上的另一个官能团反应连接。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备包括下述步骤：
(1)将抗原或抗体、连接中间体，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-连接中间体；
(2)将抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-DNA/RNA连接链。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，反应温度为1-25℃，优选为2-8℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗原或抗体-连接中间体可通过脱盐离心柱或者超滤或者透析进行纯化。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链的摩尔比为1:0.05-1:1000，优选为1:0.1-1:100。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，反应温度为1-25℃，优选为2-8℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述的抗原或抗体-DNA/RNA连接链可采用超滤离心纯化或透析纯化。
本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链连接成功的验证方法，包括使用质谱进行验证。
本发明优选的技术方案中，所述质谱选自基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)、电喷雾离子化质谱(ESI-MS)的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A(40≤n≤60)、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A(40≤n≤60)、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A(40≤n≤60)、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A(40≤n≤60)、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A(40≤n≤60)、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A(40≤n≤60)、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A(40≤n≤60)、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A(40≤n≤60)、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A(40≤n≤60)、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A(40≤n≤60)、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A(40≤n≤60)、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A(40≤n≤60)、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A(40≤n≤60)。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链的制备方法包括下述步骤：
(1)将聚合酶和相应的引物、发卡结构、底物按一定比例混合并反应一定时间；
(2)反应完成后，灭活聚合酶，制得DNA/RNA放大链反应产物；
(3)所得DNA/RNA放大链直接使用或进行纯化后使用。
本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链合成后不纯化直接使用。本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA放大链合成后纯化时所采用的纯化方法包括但不限于切胶回收、高效液相色谱法，凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、超滤离心、透析、沉淀法、结晶法等纯化方法中的一种或多种。
本发明的优选技术方案中，DNA/RNA连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC。
本发明的另一目的在于多重信号放大系统在免疫斑点法检测中的应用。
本发明的另一目的在于多重信号放大检测系统在免疫斑点法检测中的应用。
本发明中，“DNA/RNA”是指DNA或RNA。
本发明中，“抗体/抗原”是指抗体或抗原。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明通过DNA/RNA连接链和一条或多条DNA/RNA放大链连接，DNA/RNA放大链与多个DNA/RNA检测链连接，实现信号单级多重放大；甚至，DNA/RNA放大链还可与多个DNA/RNA放大链连接，实现二级或二级以上的多重放大，本发明不仅实现了待检测细胞被激活后的单细胞水平的检测，并且很大程度地增强了检测灵敏度。在目标分子密度较低的情况下，可实现信号放大，节约成本。
2、本发明可实现一轮或多轮同时检测被激活细胞所同时分泌的多种抗原或抗体。
3、本发明可实现对分泌多种抗体或抗原的待检测细胞的多轮检测，适用性更广，降低时间成本和材料成本。
4、本发明通过检测链、放大链、连接链互补配对部分碱基对的长度差异导致的结合力强弱不同来实现梯度洗脱和多轮检测，使用一定浓度的洗脱液洗脱时可以只解离洗脱掉小于特定长度的互补配对的碱基。解离互补配对链的位置可以为DNA/RNA连接链与放大链互补配对的位置、多级放大链之间互补配对的位置、放大链与检测链互补配对的位置、连接链与检测链互补配对的位置。
5、本发明可量化偶联到每个抗原或抗体上的DNA/RNA连接链的数量。
6、本发明所述的免疫斑点法可以检测同时分泌两种或两种以上不同抗原或抗体的细胞的数量。
7、本发明放大链的制备方法具有通用性，可以用于设计和制备任意所需长度的放大链。
8、本发明所述的免疫斑点法可以在单细胞水平进行检测，检测灵敏度高，可同时检测同一细胞同时分泌的不同抗原或抗体。
附图说明
表1-表6为本发明实施例中DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链的序列信息。
图1抗体与DNA/RNA连接链的连接过程。(1)抗体与连接中间体反应连接；(2)抗体-连接中间体偶联物与DNA/RNA连接链反应结合；(3)抗体与DNA/RNA连接链连接成为抗体-DNA/RNA连接链。
图2本发明所述检测系统信号放大的原理机制。其中图a表示一级多重信号放大系统示意图，图b表示二级多重信号放大系统示意图。(1)引物Z*-A、发夹结构和底物在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物1:Z*-AAAA…AA；(2)长链复合物1与抗体上的DNA/RNA连接链Z结合；(3)检测链A*A*与已经连接到抗体上的长链复合物1结合并发光，实现单次多重信号放大；(4)与步骤1同理，引物在A*A*-B和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物2:A*A*-BBBB…BB；(5)长链复合物2与已经连接到抗体上的长链复合物1结合；(6)检测链B*B*与已经连接到抗体上的长链复合物2结合并发光，实现2次多重信号放大。
Figure BDA0002871664240000241
代表抗体。
Figure BDA0002871664240000242
代表互补链。例如单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA的序列，那么A*表示A链的互补链的序列。
Figure BDA0002871664240000243
代表荧光基团
图3一级多重放大系统的免疫斑点法检测抗原的流程。(1)在固相基质上包被抗体a；(2)加入细胞，待其分泌抗原并与抗体a结合；(3)加入抗体b-DNA/RNA连接链，使其与抗原和抗体a的结合物形成双抗体夹心结构；(4)加入DNA一级放大链进行信号放大；(5)加入两条检测链并随之进行第一轮检测；(6)将上一步骤中的两条检测链洗掉，加入另外两条检测链后进行第二轮检测；(7)将上一步骤中的两条检测链洗掉，加入另外两条检测链后进行第三轮检测。
Figure BDA0002871664240000251
代表抗体
Figure BDA0002871664240000252
代表互补链，例如单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA片段序列，那么A*表示A链互补链的序列
Figure BDA0002871664240000253
代表抗原1
Figure BDA0002871664240000254
代表抗原2
Figure BDA0002871664240000255
代表抗原3
Figure BDA0002871664240000256
代表抗原4
Figure BDA0002871664240000257
代表抗原5
Figure BDA0002871664240000258
代表抗原6
Figure BDA00028716642400002510
代表绿色荧光基团a
Figure BDA0002871664240000259
代表红色荧光基团b
图4二级多重放大系统的免疫斑点法检测抗原的流程。(1)在固相基质上包被抗体；(2)加入细胞，待其分泌抗原并与抗体结合；(3)加入抗体b-DNA/RNA连接链；(4)加入DNA一级放大链进行一次信号放大；(5)加入DNA二级放大链进行二次信号放大；(6)加入两条检测链并随之进行第一轮检测；(7)将上一步骤中的两条检测链洗掉，加入另外两条检测链后进行第二轮检测；(8)将上一步骤中的两条检测链洗掉，加入另外两条检测链后进行第三轮检测。
Figure BDA00028716642400002511
代表抗体。
Figure BDA00028716642400002512
代表互补链。例如单链DNA或RNA：A链表示某一DNA或RNA片段序列，那么A*表示A链互补链的序列。
Figure BDA0002871664240000261
代表抗原1
Figure BDA0002871664240000262
代表抗原2
Figure BDA0002871664240000263
代表抗原3
Figure BDA0002871664240000264
代表抗原4
Figure BDA0002871664240000265
代表抗原5
Figure BDA0002871664240000266
代表抗原6
Figure BDA0002871664240000269
代表绿色荧光基团a
Figure BDA0002871664240000268
代表红色荧光基团b
图5实施例1中制备所得放大链采用凝胶电泳跑胶结果示意图。
图6实施例1的实验结果。纵坐标为被刺激物激活后可以分泌特定抗原的细胞所形成的斑点数量，一个斑点代表一个细胞；横坐标为细胞被刺激物激活后所分泌的被检测抗原。其中IL-2&TGF-β表示被激活后可以同时分泌IL-2和TGF-β；IL-6&IL-10表示被激活后可以同时分泌IL-6和IL-10；TNF-α&IFN-γ表示被激活后可以同时分泌TNF-α和IFN-γ。
图7实施例2的实验结果。纵坐标为被刺激物激活后可以分泌特定抗原的细胞所形成的斑点数量，一个斑点代表一个细胞；横坐标为细胞被刺激物激活后所分泌的被检测抗原。其中IL-2&TGF-β表示被激活后可以同时分泌IL-2和TGF-β；IL-6&IL-10表示被激活后可以同时分泌IL-6和IL-10；TNF-α&IFN-γ表示被激活后可以同时分泌TNF-α和IFN-γ。
具体实施方式
下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明的实施例在免疫斑点法检测过程中检测的是抗原并且形成了双抗体夹心的结构，在实际应用过程中也可以检测抗体并形成双抗原夹心的结构。
对比例1采用传统ELISPOT方法检测TGF-β
(1)将包被抗体a(Anti-human TGF-βcapture antibody)用PBS缓冲液稀释至10μg/mL并包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除包被抗体a并用PBS缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液，用RPMI-1640培养基将人外周血单个核细胞(HPBMC)稀释至5×105/mL，将100μL稀释后的HPBMC与刺激物(20μg/mL PHA和20μg/mL LPS)混合并加入相应的孔中，在37℃含5％CO2条件下孵育过夜。
(4)去除细胞并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20in PBS)洗涤6遍，加入检测抗体b(Anti-human TGF-βdetection antibody)，用封闭液将检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤6遍，同时将链霉亲和素在PBS缓冲液中1:1000稀释，并将稀释后的链霉亲和素加入相应的孔中，室温孵育45分钟。
(6)去除链霉亲和素并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用PBS缓冲液洗3遍，将BCIP/NBTplus底物(一片稀释于10mL的超纯水中)加入相应的孔中，室温孵育15分钟。
(7)去除底物，用水冲洗96孔板，并将96孔板在黑暗中晾干，进行检测分析。实验结果见图6。
对比例2采用传统ELISPOT方法检测TNF-α
(1)将包被抗体a(Anti-human TNF-αcapture antibody)用PBS缓冲液稀释至10μg/mL后包被至96孔板，并在4℃过夜。
(2)去除包被抗体a并用PBS缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液，用RPMI-1640培养基将人外周血单个核细胞(HPBMC)稀释至5×105/mL，将100μL稀释后的HPBMC与刺激物(20μg/mL PHA和20μg/mL LPS)混合并加入相应的孔中，在37℃，5％CO2条件下孵育过夜。
(4)去除细胞并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20in PBS)洗涤6遍，加入检测抗体b(Anti-human TNF-αdetection antibody)，用封闭液将检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤6遍，同时将链霉亲和素在PBS缓冲液中1:1000稀释，并将稀释后的链霉亲和素加入相应的孔中，室温孵育45分钟。
(6)去除链霉亲和素并用洗涤缓冲液洗涤3遍，再用PBS缓冲液洗3遍，将BCIP/NBTplus底物(一片稀释于10mL的超纯水中)加入相应的孔中，室温孵育15分钟。
(7)去除底物，用水冲洗96孔板，并将96孔板在黑暗中晾干，进行检测分析。实验结果见图6。
实施例1采用一级多重放大系统和免疫斑点法检测抗原
在本实施例中，将一级多重放大系统应用于免疫斑点法同时检测细胞被激活后所分泌的6种抗原，6种抗原分别为IL-10、TGF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-6。
一、抗体和DNA连接体的制备(以Anti-human IL-10antibody和DNA连接链1的连接为例)
(1)将抗体(Anti-human IL-10antibody)通过超滤离心管(100kDa MWCO)浓缩到2mg/mL，去除掉叠氮化物和其他防腐剂。
(2)通过脱盐离心柱(7000Da MWCO)将抗体交换至PBS缓冲液中(pH7.4)。
(3)抗体与LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸盐])(摩尔比1:20)在4℃下反应3小时。
(4)通过脱盐离心柱(7000Da MWCO)去除多余的连接中间体。
(5)将已经与连接中间体相连接的抗体与纯化后的DNA连接链(AAATTCCTCTACCACCTACATCAC，摩尔比1:15)混合，4℃下反应12小时。
(6)通过超滤离心管(100kDa MWCO)纯化并浓缩抗体-DNA连接链。
(7)抗体与DNA连接链连接成功的验证：使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)验证是否成功地将DNA连接链偶联到抗体上，并量化偶联到每个抗体上的DNA的数量。结果显示，每个抗体上连接上了1个DNA连接链。
二、DNA一级放大链的制备(以C.1放大链的制备为例)
(1)在100μL PBS反应液中分别加入10mM MgSO4，80units/ml的聚合酶，600μM的dATP/dCTP/dTTP，10μM发卡结构(h.1.1)和10μM相应的引物(p.1)，将反应液置于37℃反应9小时。
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mM乙二胺四乙酸，50％甘油，0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照体积比9:1混合后，在95℃反应5分钟。
(4)制备6％TBE-UREA PAGE胶(还可用1％琼脂糖凝胶)，采用gelred为染料。
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75V，运行30分钟，然后在泳道中分别加入样品和DL 1000DNA marker，将电压调至200V，运行25分钟，结果如图5所示。
(6)将目的DNA条带从凝胶中切下，通过DNA回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA进行冻干，-20℃进行保存。
三、采用免疫斑点法检测多种抗原
(1)将6种不同的包被抗体a(Anti-human IL-2capture antibody/anti-humanIL-6capture antibody/anti-human IL-10capture antibody/anti-human IFN-γcapture antibody/anti-human TNF-αcapture antibody/anti-human TGF-βcaptureantibody)混合，用PBS缓冲液将每种包被抗体的浓度稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除6种包被抗体a并用PBS缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液，用RPMI-1640培养基将人外周血单个核细胞(HPBMC)稀释至5×105/mL，将100μL稀释后的HPBMC与刺激物(20μ/mL PHA和20μ/mL LPS)混合并加入相应的孔中，在37℃含5％CO2条件下孵育过夜。
(4)去除细胞并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20in PBS)洗涤6遍，加入6种检测抗体b(Anti-human IL-2detection antibody/anti-human IL-6detection antibody/anti-human IL-10detection antibody/anti-human IFN-γdetection antibody/anti-humanTNF-αdetection antibody/anti-human TGF-βdetection antibody)-DNA连接链，(IL-2抗体连接DNA连接链1，TGF-β抗体连接DNA连接链2，IFN-γ抗体连接DNA连接链3，TNF-α抗体连接DNA连接链4，IL-10抗体连接DNA连接链5，IL-6抗体连接DNA连接链6)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除各个检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤6遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺,1mM EDTA)洗涤1遍，并加入6种DNA放大链C.1、C.2、C.3、C.4、C.5、C.6(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(6)去除DNA一级放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液(500mMNaCl in 1mM Tris-HCl)洗涤1遍，加入第一轮的两种DNA检测链i.1*和i.2*(1μM)，室温反应1小时，i.1*检测链上连有绿色荧光探针(FAM，激发波长485nm，发射波长528nm)，i.2*检测链连接有红色荧光探针(Texas Red，激发波长579nm，发射波长620nm)。
(7)去除第一轮DNA检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，进行成像。
(8)加入解离缓冲液(50％甲酰胺)，室温反应20分钟。
(9)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮检测的两种检测链i.3*和i.4*(1μM)并于室温反应1小时，i.3*检测链上连有绿色荧光探针(FAM)，i.4*检测链连接有红色荧光探针(Texas Red)。
(10)去除第二轮DNA检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，进行成像。
(11)加入解离缓冲液(50％甲酰胺)，室温反应20分钟。
(12)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第三轮检测的两种检测链i.5*和i.6*(1μM)并于室温反应1小时，i.5*检测链上连有绿色荧光信号(FAM)，i.6*检测链连接有红色荧光信号(Texas Red)。
(13)去除第三轮DNA检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，进行成像。
四、实验结果
结果如图6所示。将本发明所述放大系统与免疫斑点法结合可以一次检测细胞激活后分泌的2种不同的抗原(细胞因子)；而且可以在每轮检测两种抗原的同时检测三轮共6种抗原。此外，在每一轮的检测种，还可以检测同时分泌两种不同抗原的细胞的数量，比如本实施例中同时分泌IL-2和TGF-β的细胞的数量约为90个。与传统酶联免疫斑点法(ELISPOT)法相比，本发明所述的免疫斑点法可以在相同的情况下灵敏度更高可以检测出更多的斑点，比如被刺激物刺激后可以分泌TGF-β的细胞采用传统ELISPOT方法无法检测出，而采用本发明所述的放大系统与免疫斑点法结合时可以检测出约350个被刺激后可以分泌TGF-β的细胞。
实施例2采用二级多重放大系统和免疫斑点法检测抗原
在本实施例中，将二级多重放大系统应用于免疫斑点法同时检测细胞所分泌的6种抗原，6种抗原分别为IL-10，TGF-β，IFN-γ，TNF-α，IL-2和IL-6。
一、抗体和DNA连接体的制备
本实施例采用以抗体蛋白上的氨基与GMBS(N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯)反应，再利用GMBS与DNA连接链上的巯基相连的方式来将抗体与DNA连接体相连，所使用的连接中间体具有双官能团，一端可与抗体相连，另一端可与DNA相连。具体实验步骤与实施例1相同。
二、信号放大系统中DNA一级放大链的制备
DNA一级放大链的制备过程和具体步骤与实施例1相同。
三、信号放大系统中DNA二级放大链的制备(例如：针对C.1放大链，需要制备C.7放大链，以下内容为C.7放大链的制备)
(1)在100μL PBS反应液中分别加入10mM MgSO4，80units/ml的聚合酶，600μM的dATP/dCTP/dTTP，10μM发卡结构(h.7.7)和10μM相应的引物(p.7)，将反应液置于37℃反应9小时。
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(Loading buffer)按照体积比9:1混合为样品，在95℃反应5分钟。
(4)制备6％TBE-UREA PAGE胶(还可采用1％琼脂糖凝胶)，采用gelred为染料。
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75V，运行30分钟，之后在泳道中分别加入样品和DL 1000DNA marker，将电压调至200V，运行25分钟。
(6)将目的DNA条带从凝胶中切下，通过DNA回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA进行冻干，-20℃进行保存。
四、采用放大系统和免疫斑点法检测多种抗原
(1)将6种不同的包被抗体a(Anti-human IL-2capture antibody/anti-humanIL-6capture antibody/anti-human IL-10capture antibody/anti-human IFN-γcapture antibody/anti-human TNF-αcapture antibody/anti-human TGF-βcaptureantibody)混合，用PBS缓冲液将每种包被抗体的浓度稀释至10μg/mL，将混合液包被至96孔板，4℃过夜。
(2)去除6种包被抗体a并用PBS缓冲液洗涤3遍，加入封闭液(1％BSA in PBS)，37℃封闭2小时。
(3)去除封闭液，用RPMI-1640培养基将人外周血单个核细胞(HPBMC)稀释至5×105/mL，将100μL稀释后的HPBMC与刺激物(20μ/mL PHA和20μ/mL LPS)混合并加入相应的孔中，在37℃含5％CO2条件下孵育过夜。
(4)去除细胞并用洗涤缓冲液(0.1％tween-20in PBS)洗涤6遍，加入6种检测抗体b(anti-human IL-2detection antibody/anti-human TGF-βdetection antibody/anti-human TNF-αdetection antibody/anti-human IFN-γdetection antibody/anti-humanIL-6detection antibody/anti-human IL-10detection antibody)-DNA连接链，(IL-2抗体连接DNA连接链1，TGF-β抗体连接DNA连接链2，IFN-γ抗体连接DNA连接链3，TNF-α抗体连接DNA连接链4，IL-10抗体连接DNA连接链5，IL-6抗体连接DNA连接链6)，用封闭液将各个检测抗体稀释至2μg/mL，并加入相应的孔中后于室温孵育2小时。
(5)去除各个检测抗体并用洗涤缓冲液洗涤6遍，再用杂交洗涤缓冲液(15％甲酰胺,1mM EDTA)洗涤1遍，并加入6种一级DNA放大链C.1、C.2、C.3、C.4、C.5、C.6(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(6)去除一级DNA放大链，用杂交洗涤液洗涤4次，然后加入与一级DNA放大链部分互补的4种二级DNA放大链C.7、C.8、C.9、C.10、C.11、C.12(60nM-150nM)，37℃过夜孵育。
(7)去除二级DNA放大链并用杂交洗涤缓冲液洗涤3遍，再用检测缓冲液(500mMNaCl in 1mM Tris-HCl)洗涤1遍，加入第一轮的两种DNA检测链i.7*和i.8*(1μM)，室温反应1小时，i.7*检测链上连有绿色荧光信号(FAM)，i.8*检测链连接有红色荧光信号(TexasRed)。
(8)去除第一轮DNA检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，进行成像。
(9)加入解离缓冲液(50％甲酰胺)，室温反应20分钟。
(10)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第二轮检测的两种检测链i.9*和i.10*(1μM)并于室温反应1小时，i.9*检测链上连有绿色荧光信号(FAM)，i.10*检测链连接有红色荧光信号(Texas Red)。
(11)去除第二轮DNA检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，进行成像。
(12)加入解离缓冲液(50％甲酰胺)，室温反应20分钟。
(13)去除解离缓冲液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再用检测缓冲液洗涤2遍，加入第三轮检测的两种检测链i.11*和i.12*(1μM)并于室温反应1小时，i.11*检测链上连有绿色荧光信号(FAM)，i.12*检测链连接有红色荧光信号(Texas Red)。
(14)去除第三轮DNA检测链，并用检测缓冲液洗涤2遍，进行成像。
五、实验结果
结果如图7所示。采用本发明所述多级多重放大系统与免疫斑点法结合可以一次检测细胞激活后分泌的2种不同的抗原(细胞因子)；而且可以在每轮检测两种抗原的同时检测三轮共6种抗原。此外，在每一轮的检测种，还可以检测同时分泌两种不同抗原的细胞的数量，比如本实施例中同时分泌IL-2和TGF-β的细胞的数量约为2100个。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。
序列表
<110> 艾克发（北京）生物技术有限公司
<120> 一种信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用
<150> 2020112536617
<151> 2020-11-11
<150> 2020112536246
<151> 2020-11-11
<150> 2020112536299
<151> 2020-11-11
<150> 2020112562382
<151> 2020-11-11
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttcctgta gtatcccgtc gcatagtcgt acattcaccg tc 42
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatttagtgt tcgaatagtt cgatctag 28
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattctatga caccgccacg ccctatatcc tcgcaataac cc 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttcctata tttagcgtcc gtgtcgttct cccgcgcaac ag 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatccaaat cgtccgttag cagtgaaccg taccgtctca at 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagtctagt ccaaggtccg tcaaggtctc cgacgcatac tc 42
<210> 7
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 7
gacggtgaat gtacgactat gcgacgggat actacaggaa ctttccaata ataaccaata 60
ataaccaata ataa 74
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(60)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 8
ctagatcgaa ctattcgaac actaaatatt catcatcata catcatcata catcatcata 60
catcatcata 70
<210> 9
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 9
gggttattgc gaggatatag ggcgtggcgg tgtcatagaa ttttaatact ctcaaatact 60
ctcaaatact ctca 74
<210> 10
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 10
ctgttgcgcg ggagaacgac acggacgcta aatataggaa acttcaactt aacacaactt 60
aacacaactt aaca 74
<210> 11
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 11
attgagacgg tacggttcac tgctaacgga cgatttggat tcttttcatt tacattcatt 60
tacattcatt taca 74
<210> 12
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(64)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 12
gagtatgcgt cggagacctt gacggacctt ggactagact tgttcaatca aaaacaatca 60
aaaacaatca aaaa 74
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 13
tattattggt tattattggt tattattggt ttttcttact cattcttact cattcttact 60
cattcttact ca 72
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 14
atgatgatgt atgatgatgt atgatgatgt ttttttctac cattttctac cattttctac 60
cattttctac ca 72
<210> 15
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 15
gagagtattt gagagtattt gagagtattt tttcctttta tatcctttta tatcctttta 60
tatcctttta ta 72
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 16
gttaagttgt gttaagttgt gttaagttgt ttccttctat taccttctat taccttctat 60
taccttctat ta 72
<210> 17
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 17
gtaaatgaat gtaaatgaat gtaaatgaat ttttattcac tattattcac tattattcac 60
tattattcac ta 72
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(62)
<223> 重复单元，重复次数40-60次
<400> 18
ttttgattgt ttttgattgt ttttgattgt tttcattact tatcattact tatcattact 60
tatcattact ta 72
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 19
tttattattg gttattattg gt 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 20
ttatgatgat gtatgatgat gt 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 21
ttgagagtat ttgagagtat tt 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgttaagtt gtgttaagtt gt 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 23
ttgtaaatga atgtaaatga at 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 24
ttttttgatt gtttttgatt gt 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgagtaaga atgagtaaga at 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 26
ttggtagaaa atggtagaaa at 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 27
ttataaaagg atataaaagg at 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 28
ttaatgaaag ataatgaaag at 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 29
ttagtgaata atagtgaata at 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 待检测信号(Artificial Sequence)
<400> 30
ttaagtaatg ataagtaatg at 22
<210> 43
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccaataata 9
<210> 44
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
catcatcat 9
<210> 45
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aatactctc 9
<210> 46
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caacttaac 9
<210> 47
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ttcatttac 9
<210> 48
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
caatcaaaa 9
<210> 49
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttcttactc 9
<210> 50
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttttctacc 9
<210> 51
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tccttttat 9
<210> 52
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccttctatt 9
<210> 53
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttattcact 9
<210> 54
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tcattactt 9
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 31
accaataata gggccttttg gccctattat tggttattat tgg 43
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 32
acatcatcat gggccttttg gcccatgatg atgtatgatg atg 43
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 33
aaatactctc gggccttttg gcccgagagt atttgagagt att 43
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 34
acaacttaac gggccttttg gcccgttaag ttgtgttaag ttg 43
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 35
attcatttac gggccttttg gcccgtaaat gaatgtaaat gaa 43
<210> 36
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 36
acaatcaaaa gggccttttg gcccttttga ttgtttttga ttg 43
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 37
attcttactc gggccttttg gcccgagtaa gaatgagtaa gaa 43
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 38
attttctacc gggccttttg gcccggtaga aaatggtaga aaa 43
<210> 39
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 39
accaataata gggccttttg gccctattat tggttattat tgg 43
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 40
atccttttat gggccttttg gcccataaaa ggatataaaa gga 43
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 41
attattcact gggccttttg gcccagtgaa taatagtgaa taa 43
<210> 42
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'端，反向dT修饰
<400> 42
atcattactt gggccttttg gcccaagtaa tgataagtaa tga 43

Claims (76)

1.一种利用多重信号放大系统进行免疫斑点法检测的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）固相基质上固定包被抗体或者抗原；
（2）加入待检测细胞和细胞刺激物或者直接加入已经和刺激物作用过的待检测细胞或者直接加入未经刺激物刺激的待检测细胞后作用一段时间；
（3）去除细胞和/或细胞刺激物并洗涤；加入抗体-DNA/RNA连接链或者加入抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；
（4）加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；
（5）加入DNA/RNA检测链，反应一定时间；
（6）进行洗涤，检测DNA/RNA检测链上的待检测信号强度；
（7）定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量；
所述DNA/RNA放大链包括以下序列：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；
所述DNA/RNA连接链包括以下序列：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC；
所述DNA/RNA检测链包括以下序列：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
所述n的范围为40≤n≤60；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，在固相基质上包被抗体或抗原后，加入封闭液进行封闭。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述待检测细胞包括人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的任一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述细胞刺激物为与细胞作用后可使细胞分泌任何抗原或抗体的物质。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基的连接基团中的任一种或其组合。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗体/抗原分子连接一个或多个连接中间体。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述抗体或抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述DNA/RNA连接链与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个连接中间体连接1个或多个DNA/RNA连接链。
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述用于连接抗体或抗原和DNA/RNA连接链的连接中间体中的两种官能团的比例为一比一或一比多。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中，可先连接一级DNA/RNA放大链，连接后再加入二级DNA/RNA放大链，再连接更多级别DNA/RNA放大链。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（6）中，可先加入第一轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第二轮DNA/RNA检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮DNA/RNA检测链进行第三轮检测或多轮检测。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测过程中不低于1轮的检测；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗原或抗体。
15.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于，检测过程中不低于1轮的检测为2轮到6轮；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗原或抗体。
16.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
17.根据权利要求16所述的检测方法，其特征在于，每一轮检测后下一轮检测前解离洗脱的位置为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链、连接链与检测链互补配对的位置。
18.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
19.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测信号连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端或者检测链中间的任何位置。
20.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测信号包括荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
21.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
22.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中含有碱基重复单元。
23.一种利用多重信号放大系统进行免疫斑点法检测的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括可以与包被抗体或包被抗原结合的固相基质、可以与固相基质结合的包被抗体或包被抗原、经过刺激或未经任何刺激可以分泌特定物质的细胞、抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有待检测信号的DNA/RNA检测链，其中，多重信号放大系统包括抗体/抗原-DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、连有待检测信号的DNA/RNA检测链，用于将细胞分泌的信号放大后进行检测,
所述DNA/RNA放大链包括以下序列：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；
所述DNA/RNA连接链包括以下序列：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC；
所述DNA/RNA检测链包括以下序列：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
所述n的范围为40≤n≤60；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
24.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述包被抗体或包被抗原、细胞分泌的特定物质、抗体/抗原-DNA/RNA连接链三者可以形成双抗体夹心或者双抗原夹心的结构。
25.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述固相基质选自多孔板、PVDF膜、醛基化的固相基质。
26.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述包被抗体或抗原选自可与相应抗原或抗体结合并可被包被于固相基质的抗体或抗原。
27.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述抗体或抗原可通过化学键、吸附作用包被于固相基质。
28.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述细胞包括人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的任一种或多种。
29.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述细胞刺激物为与细胞作用后可使细胞分泌抗原或抗体的物质。
30.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述待检测信号连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端或者检测链中间的任何位置。
31.根据权利要求23所述的检测系统，其特征在于，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中含有碱基重复单元。
32.一种多重信号放大系统，其特征在于，所述多重信号放大系统包括连有待检测信号的DNA/RNA检测链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA连接链、抗体或抗原分子、连接DNA/RNA连接链与抗体或抗原的连接中间体，其中，DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链可互补配对后连接，或者，DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接，其中，各链之间的碱基可互补配对相互连接，所述DNA/RNA放大链包括以下序列：
GTGATGTAGGTGGTAGAGGAATTT-TT-ATAAACCTA-A-(ATAAACCTA-A)n-ATAAACCTA-A、
CTAGATCGAACTATTCGAACACTAAATA-TT-CATCATCAT-A-(CATCATCAT-A)n-CATCATCAT-A、
GGGTTATTGCGAGGATATAGGGCGTGGCGGTGTCATAGAATT-TT-AATACTCTC-A-(AATACTCTC-A)n-AATACTCTC-A、
CTGTTGCGCGGGAGAACGACACGGACGCTAAATATAGGAAAC-TT-A-CAACTTAAC-A-(CAACTTAAC-A)n-CAACTTAAC-A、
ATTGAGACGGTACGGTTCACTGCTAACGGACGATTTGGATTC-TT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A、
GAGTATGCGTCGGAGACCTTGACGGACCTTGGACTAGACTTG-TT-CAATCAAAA-A-(CAATCAAAA-A)n-CAATCAAAA-A、
GACGGTGAATGTACGACTATGCGACGGGATACTACAGGAACT-TT-CCAATAATA-A-(CCAATAATA-A)n-CCAATAATA-A、
TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-TTT-TTCATTTAC-A-(TTCATTTAC-A)n-TTCATTTAC-A、
ATGATGATG-T-ATGATGATG-T-ATGATGATG-TTT-TTTTCTACC-A-(TTTTCTACC-A)n-TTTTCTACC-A、
GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-TTT-TCCTTTTAT-A-(TCCTTTTAT-A)n-TCCTTTTAT-A、
GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-TTT-CCTTCTATT-A-(CCTTCTATT-A)n-CCTTCTATT-A、
GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-TTT-TTATTCACT-A-TTATTCACT-A-(TTATTCACT-A)n-TTATTCACT-A、
TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T-TTTTGATTGTTT-TCATTACTT-A-TCATTACTT-A-(TCATTACTT-A)n-TCATTACTT-A、
TATTATTGG-T-TATTATTGG-T-TATTATTGG-TTT-TTCTTACTC-A-TTCTTACTC-A-(TTCTTACTC-A)n-TTCTTACTC-A；
所述DNA/RNA连接链包括以下序列：
AAAUUCCUCUACCACCUACA、
AAATTCCTCTACCACCTACATCAC、
TATTTAGTGTTCGAATAGTT、
TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG、
AATTCTATGACACCGCCACGCCCTATATCCTCGCAATAACCC、
GTTTCCTATATTTAGCGTCCGTGTCGTTCTCCCGCGCAACAG、
GAATCCAAATCGTCCGTTAGCAGTGAACCGTACCGTCTCAAT、
CAAGTCTAGTCCAAGGTCCGTCAAGGTCTCCGACGCATACTC、
AGTTCCTGTAGTATCCCGTCGCATAGTCGTACATTCACCGTC、
AAAUUCCUCUACCACCUACAUCAC；
所述DNA/RNA检测链包括以下序列：
待检测信号-TT-TAGGTTTAT-T-TAGGTTTAT-T、
待检测信号-TT-ATGATGATG-T-ATGATGATG-T、
待检测信号-TT-GAGAGTATT-T-GAGAGTATT-T、
待检测信号-TT-GTTAAGTTG-T-GTTAAGTTG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-TTTTGATTG-T-TTTTGATTG-T、
待检测信号-TT-TATTATTGG-T-TATTATTGG-T、
待检测信号-TT-GTAAATGAA-T-GTAAATGAA-T、
待检测信号-TT-GGTAGAAAA-T-GGTAGAAAA-T、
待检测信号-TT-ATAAAAGGA-T-ATAAAAGGA-T、
待检测信号-TT-AATGAAAGA-T-AATGAAAGA-T、
待检测信号-TT-AGTGAATAA-T-AGTGAATAA-T、
待检测信号-TT-AAGTAATGA-T-AAGTAATGA-T、
待检测信号-TT-GAGTAAGAA-T-GAGTAAGAA-T、
待检测信号-UU-GUAAAUGAA-U-GUAAAUGAA-U；
所述n的范围为40≤n≤60；
序列从左到右为序列的5’端到3’端。
33.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，一个抗体或抗原的连接中间体连接一条或多条DNA/RNA连接链。
34.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链与DNA/RNA连接链直接互补配对连接为DNA/RNA检测链的碱基可直接与DNA/RNA连接链的碱基互补配对。
35.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，同时DNA/RNA放大链的部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
36.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述DNA/RNA放大链再与一条或多条DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者DNA/RNA放大链部分片段与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
37.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链通过DNA/RNA放大链与DNA/RNA连接链连接时，DNA/RNA连接链与一级DNA/RNA放大链的部分片段的碱基互补配对，一级DNA/RNA放大链与一条或多条二级DNA/RNA放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级DNA/RNA放大链与一条或多条DNA/RNA检测链的碱基互补配对。
38.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
39.根据权利要求38所述的多重信号放大系统，其特征在于，多条放大链为两条及以上放大链。
40.根据权利要求38所述的多重信号放大系统，其特征在于，多级放大为两级及以上放大。
41.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA检测链通过碱基互补配对连接。
42.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述DNA/RNA检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与DNA/RNA放大链或者DNA/RNA连接链通过碱基互补配对连接。
43.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
44.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，每一轮检测后下一轮检测前采用洗脱液解离洗脱掉的位置为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、检测链与连接链互补配对的位置。
45.根据权利要求44所述的多重信号放大系统，其特征在于，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
46.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，DNA/RNA连接链、DNA/RNA放大链、DNA/RNA检测链中含有碱基重复单元。
47.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述连接中间体两端或中间任意位置双功能化，一官能团连接抗体或抗原上对应的官能团，另一官能团连接DNA/RNA连接链上对应的官能团，连接中间体的双官能团中两种官能团的比例为一比一或一比多。
48.根据权利要求47所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述抗体、抗原、DNA或RNA上用于与连接中间体反应或连接的官能团包括氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
49.根据权利要求48所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述连接中间体上的双官能团中的一种官能团与抗原或抗体上的包括氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
50.根据权利要求49所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述连接中间体上的双官能团中的另一种官能团与DNA/RNA上的包括氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
51.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述与连接中间体相连的抗体或抗原分子，一个抗体或抗原分子可连接一个或同时连接多个连接中间体。
52.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述与连接中间体相连的DNA/RNA连接链，一个连接中间体可连接一个或同时连接多个DNA/RNA连接链。
53.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述待检测信号连接于DNA/RNA检测链的5’端、3’端或者检测链中间的任何位置。
54.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述待检测信号选自荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
55.根据权利要求32所述的多重信号放大系统，其特征在于，所述多重信号放大系统可应用于免疫斑点法的检测中。
56.如权利要求32-55任一项所述的多重信号放大系统的制备方法，其特征在于，包括抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备、DNA/RNA放大链的制备，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备为抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链相连，其中，所述连接中间体具有双官能团，一官能团与抗体或抗原相连，另一官能团与DNA/RNA连接链相连。
57.根据权利要求56所述的制备方法，其特征在于，所述抗体或抗原或者DNA/RNA连接链上的用于与连接中间体连接的官能团包括腙基、氨基、羧基、羟基、巯基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
58.根据权利要求56所述的制备方法，其特征在于，所述连接中间体的双官能团中一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羧基反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羟基的反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羧基结合，另一官能团可与羟基结合；或者一个官能团可与羧基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羟基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接。
59.根据权利要求56所述的制备方法，其特征在于，抗体或抗原上的氨基与连接中间体上的一个官能团反应连接，而DNA/RNA连接链上的巯基与连接中间体上的另一个官能团反应连接。
60.根据权利要求56所述的制备方法，其特征在于，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链的制备包括下述步骤：
（1）将抗原或抗体、连接中间体，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-连接中间体；
（2）将抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链，按摩尔比1:0.01-1:10000进行混合，0-50℃反应，形成抗原或抗体-DNA/RNA连接链。
61.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.05-1:1000。
62.根据权利要求61所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.1-1:100。
63.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应温度为1-25℃。
64.根据权利要求63所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应温度为2-8℃。
65.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，抗原或抗体-连接中间体可通过脱盐离心柱或者超滤或者透析进行纯化。
66.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链的摩尔比为1:0.05-1:1000。
67.根据权利要求66所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，抗原或抗体-连接中间体、DNA/RNA连接链的摩尔比为1:0.1-1:100。
68.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，反应温度为1-25℃。
69.根据权利要求68所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，反应温度为2-8℃。
70.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的抗原或抗体-DNA/RNA连接链可采用超滤离心纯化或透析纯化。
71.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，所述抗原或抗体-DNA/RNA连接链连接成功的验证方法，包括使用质谱进行验证。
72.根据权利要求71所述的制备方法，其特征在于，所述质谱选自基质辅助激光解吸飞行时间质谱、电喷雾离子化质谱的任一种或其组合。
73.根据权利要求60所述的制备方法，其特征在于，所述DNA/RNA放大链的制备方法包括下述步骤：
（1）将聚合酶和相应的引物、发卡结构、底物按一定比例混合并反应一定时间；
（2）反应完成后，灭活聚合酶，制得DNA/RNA放大链反应产物；
（3）所得DNA/RNA放大链直接使用或进行纯化后使用。
74.根据权利要求73所述的制备方法，其特征在于，所述DNA/RNA放大链合成后纯化时所采用的纯化方法包括切胶回收、高效液相色谱法、凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、超滤离心、透析、沉淀法、结晶法中的一种或多种。
75.如权利要求32-55任一项所述的多重信号放大系统或权利要求56-74任一项所述方法制备得到的多重信号放大系统在免疫斑点法检测中的应用。
76.如权利要求23-31任一项所述的多重信号放大检测系统在免疫斑点法检测中的应用。
CN202011604884.3A 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用 Active CN112816686B (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011253661 2020-11-11
CN2020112562382 2020-11-11
CN202011256238 2020-11-11
CN2020112536299 2020-11-11
CN202011253624 2020-11-11
CN2020112536246 2020-11-11
CN2020112536617 2020-11-11
CN202011253629 2020-11-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112816686A CN112816686A (zh) 2021-05-18
CN112816686B true CN112816686B (zh) 2022-06-10

Family

ID=75854694

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011604836.4A Active CN114544937B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附间接法检测中的应用
CN202011606225.3A Active CN114544966B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用
CN202011604884.3A Active CN112816686B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用
CN202011606413.6A Active CN114544967B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附直接法检测中的应用
CN202011604915.5A Active CN114544965B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附竞争法检测中的应用
CN202110631376.2A Active CN113341132B (zh) 2020-11-11 2021-06-07 一种多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用
CN202110631383.2A Active CN113355396B (zh) 2020-11-11 2021-06-07 一种多重信号放大系统及其在组织细胞病理检测中的应用

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011604836.4A Active CN114544937B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附间接法检测中的应用
CN202011606225.3A Active CN114544966B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附夹心法检测中的应用

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011606413.6A Active CN114544967B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附直接法检测中的应用
CN202011604915.5A Active CN114544965B (zh) 2020-11-11 2020-12-30 一种多重信号放大系统及其在免疫吸附竞争法检测中的应用
CN202110631376.2A Active CN113341132B (zh) 2020-11-11 2021-06-07 一种多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用
CN202110631383.2A Active CN113355396B (zh) 2020-11-11 2021-06-07 一种多重信号放大系统及其在组织细胞病理检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (7) CN114544937B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114854736B (zh) * 2022-06-23 2023-12-15 香港中文大学（深圳） 环状核酸分子、其制备方法以及核酸探针和检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101221173A (zh) * 2007-01-12 2008-07-16 中国人民解放军总医院第二附属医院 ELISpot结核感染诊断试剂盒及其应用
CN101988920A (zh) * 2009-07-30 2011-03-23 韩国科学技术研究院 抗原检测试剂盒和方法
CN106636318A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 核酸信号放大检测试剂盒
CN111693718A (zh) * 2020-07-06 2020-09-22 苏州科技大学 基于dna信号放大和血糖仪的超灵敏蛋白检测方法

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
HUT64623A (en) * 1990-05-04 1994-01-28 Chiron Corp Protein and nucleinic acid samples and immunic essays containing them
US6117631A (en) * 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
CA2363703A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-23 Royce Technologies Llc, A Nevada Corporation Method for amplification of molecular bio-assay signals
US20030175828A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-18 Lazar James G. Signal amplification by Hybrid Capture
JP2005257641A (ja) * 2004-03-15 2005-09-22 Geneticlab Co Ltd Ｒｎａポリメラーゼを用いて複数の蛋白質を同時に検出する方法
US20080305486A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Signal amplification using circular hairpin probes
CN101566626A (zh) * 2008-07-22 2009-10-28 深圳市人民医院 一种抗原检测方法及其应用
CN101403016A (zh) * 2008-10-30 2009-04-08 兰州普利生物技术开发有限公司 Hbv病毒抗原及配体管式pcr检测试剂盒及其制备方法和应用
US8445199B2 (en) * 2008-12-31 2013-05-21 Abbott Point Of Care Inc. Method and device for immunoassay using nucleotide conjugates
CN101907573B (zh) * 2010-08-17 2012-08-22 复旦大学 一种高灵敏度的集成cmos光学生物芯片
CN104849472A (zh) * 2010-10-21 2015-08-19 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
CN102141567B (zh) * 2010-12-19 2014-03-12 浙江大学 一种制备酶标记抗体的方法
WO2012088302A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
CN102492772A (zh) * 2011-12-02 2012-06-13 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种分子检测信号放大技术
CN103235116B (zh) * 2013-04-13 2015-06-03 福州大学 一种抗体标记信号或核酸探针标记信号放大的方法
TWI553122B (zh) * 2013-05-21 2016-10-11 Ｓｒｃ公司 用於分子與蛋白質基於螢光之定量偵測的方法與系統
CN103592431B (zh) * 2013-10-15 2016-02-24 中山大学 一种基于核酸酶信号放大的检测方法
CN107153052B (zh) * 2016-03-03 2020-10-09 湖北中医药大学 酶引发的自由基聚合反应及检测应用
WO2017184682A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 President And Fellows Of Harvard College Methods for attaching cellular constituents to a matrix
KR101913163B1 (ko) * 2016-06-30 2018-11-01 주식회사 바이오이즈 이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법
CN106501505A (zh) * 2016-10-03 2017-03-15 王贤俊 一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白（a）的方法
EP3568492B1 (en) * 2017-01-10 2025-01-01 President and Fellows of Harvard College Multiplexed signal amplification
CN107523630B (zh) * 2017-09-26 2021-01-29 中国人民解放军东部战区总医院 一种基于信号放大dna逻辑门的基因突变多重检测方法
CN107764804B (zh) * 2017-10-09 2020-02-07 郑州大学 一种自组装聚hrp探针、制备方法、试剂盒及其应用
CN108414735B (zh) * 2018-02-08 2020-05-12 斯格特生物 一种基于三次延伸-rna扩增介导的生物大分子免疫分析方法
CN109001167B (zh) * 2018-05-21 2021-02-19 南京医科大学 一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒
CN110643682A (zh) * 2018-06-26 2020-01-03 Tdk株式会社 一种用于dna检测的信号放大系统、试剂盒和方法
CN109030829A (zh) * 2018-06-29 2018-12-18 南京航思生物科技有限公司 一种均相化学发光法检测犬il-6的定量试剂盒及其使用方法
CN109406787A (zh) * 2018-10-15 2019-03-01 青岛大学 一种检测癌胚抗原的新型蛋白质-dna复合物及其合成方法和应用
KR102205032B1 (ko) * 2018-10-25 2021-01-19 (주)에스비바이오사이언스 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법
CN110208538B (zh) * 2019-06-27 2022-02-25 临沂大学 一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用
CN110514829A (zh) * 2019-07-30 2019-11-29 华东理工大学 一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法
CN110878356B (zh) * 2019-11-29 2022-02-18 西安交通大学 一种多重核酸指数扩增探针及其肿瘤多靶标检测应用
CN111172242B (zh) * 2019-12-19 2023-06-02 武汉中帜生物科技股份有限公司 一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101221173A (zh) * 2007-01-12 2008-07-16 中国人民解放军总医院第二附属医院 ELISpot结核感染诊断试剂盒及其应用
CN101988920A (zh) * 2009-07-30 2011-03-23 韩国科学技术研究院 抗原检测试剂盒和方法
CN106636318A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 核酸信号放大检测试剂盒
CN111693718A (zh) * 2020-07-06 2020-09-22 苏州科技大学 基于dna信号放大和血糖仪的超灵敏蛋白检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A hybridization-chain-reaction-based method for amplifying immunosignals;Rui Lin et al.;《Nature Methods》;20180430;第15卷(第4期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114544967A (zh) 2022-05-27
CN113341132A (zh) 2021-09-03
CN114544965A (zh) 2022-05-27
CN114544967B (zh) 2022-11-29
CN114544966A (zh) 2022-05-27
CN113355396A (zh) 2021-09-07
CN113355396B (zh) 2022-02-22
CN113341132B (zh) 2022-04-22
CN114544966B (zh) 2023-05-09
CN114544937A (zh) 2022-05-27
CN112816686A (zh) 2021-05-18
CN114544965B (zh) 2023-04-28
CN114544937B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6357154B2 (ja) 荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法
CN112816686B (zh) 一种多重信号放大系统及其在免疫斑点法检测中的应用
US9562900B2 (en) Methods and compositions of nucleic acid ligands for detection of foodborne and waterborne pathogens
JP2000017183A (ja) ロタキサン構造を有する色素、ラベル化剤、およびラベル化方法
CN117969854A (zh) 一种用于检测细胞因子蛋白浓度的试剂盒及其应用
Stengl et al. TuPPL: Tub-tag mediated C-terminal protein–protein-ligation using complementary click-chemistry handles
CN101289760A (zh) 一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用
CN111777696B (zh) 一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法
WO2017189631A2 (en) Methods of identifying target binding ligands from tagged combinatorial libraries
US20210381026A1 (en) NOVEL IMMUNO-PCR METHOD USING cDNA DISPLAY
Tsouka et al. Synthetic High‐Throughput Microarrays of Peptidoglycan Fragments as a Novel Sero‐Diagnostic Tool for Patient Antibody Profiling
CN114717299B (zh) 一种糖基化外泌体pd-l1的检测方法
US9733240B2 (en) General strategy for antibody library screening
CN114437176A (zh) 一种新的光标记试剂及其在细胞表面蛋白质组和n-糖基化富集分析中的应用
EP1371985A2 (de) Mittel und Verfahren zum Anreichern und Nachweisen von Mikroorganismen
CN111206074B (zh) Dna纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法
Stengl et al. Organic & Biomolecular Chemistry rsc. li/obc
HK1198062A (zh) 抗体库筛选的一般策略
WO2003058240A2 (de) Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden detektion chemischer substanzen
Chou Phage Display Derived Fragment-based Discovery of Antigens for Antibodies associated with Mycobacterial Infections
RU2002124777A (ru) Способ получения пептидов путем применения in vitro транскрипционной/трансляционной системы
CN105646693A (zh) 用于疟疾辅助诊断的多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒
CN102822673A (zh) 制备多生物素化化合物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant