CN101988920A

CN101988920A - 抗原检测试剂盒和方法

Info

Publication number: CN101988920A
Application number: CN2009102530181A
Authority: CN
Inventors: 安大鲁; 杨恩卿; 韩基喆
Original assignee: Korea Institute of Science and Technology KIST
Current assignee: Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2009-10-20
Publication date: 2011-03-23
Also published as: EP2284284B1; EP2284284A1; JP5070314B2; US20110027772A1; KR20110012353A; CA2700086A1; CA2700086C; JP2011033613A; KR101029343B1

Abstract

本发明涉及抗原检测试剂盒和方法。提供了一种抗原检测试剂盒和使用该试剂盒的抗原检测方法。该抗原检测试剂盒包括捕获抗体、结合至单链DNA寡核苷酸的检测抗体、互补于该DNA寡核苷酸的单链RNA寡核苷酸和RNA酶。

Description

抗原检测试剂盒和方法

与相关申请的交叉引用：

本申请要求了2009年7月30日向韩国知识产权局(Korean IntellectualProperty Office)提交的韩国专利申请号10-2009-0070041的优先权和利益，将其全部内容引入本文作为参考。

发明背景：

(a)技术领域

本发明提供了一种用于检测抗原的试剂盒，包含捕获抗体、结合单链DNA寡核苷酸的检测抗体、互补于该DNA寡核苷酸的单链RNA寡核苷酸以及RNA酶；和用上述试剂盒检测抗原的方法。本发明采用单一分析手段和单一RNA酶，实现了多种生物材料的免疫测定。

(b)背景技术

ELISA(酶联免疫吸附测定)是一种免疫测定，其利用材料与其相应抗体的反应来检测所要分析的特定材料。在ELISA开发之前，进行免疫测定的唯一选择是放射免疫测定，使用放射性标记的抗原或抗体的一种技术。由于放射性造成潜在的健康威胁，所以需要一种替代的免疫测定，其使用非放射性信号来取代放射性信号。响应这种需求，已经开发出ELISA，且其已经成为最常用的免疫测定之一，高灵敏度地检测各种靶物质的存在。

通常，ELISA包括用酶标记的抗体和与该酶反应以产生信号的底物来检测靶物质的步骤。酶促反应导致颜色或荧光中的改变。由于ELISA对每种物质应单独进行，所以当用于分析样品中的超过一种物质时，难于直接对比该样品中共存的各种物质的相对量。

ELISA和其他免疫测定的一个区别在于存在/不存在信号放大过程。大部分免疫测定不包括由酶引起的信号放大过程，且通常基于荧光信号。使用标记于抗体上的荧光团信号的免疫测定可简便地用于进行多重免疫测定，因为每个不同的荧光团在不同的波长的发射，可分别用于多种物质的分析。相比之下，基于酶的免疫测定，例如ELISA，利用由酶促反应导致的吸光度或荧光的改变，需要不同的酶-抗体缀合物来进行多重测定，并需要鉴定和使用多对酶-底物。因此，随着样品中分析物数量的增加，在技术上多重ELISA的完成变得比其他免疫测定更为困难。

最广为人知的没有酶促信号放大的多重免疫测定使用分别能够特异结合相应靶分子的不同种类的抗体，其固定于含有分别对应于靶分子的不同荧光物质的小球体相上。然后测量小球体的荧光信号，小球体中抗体结合至靶分子。但是，这种方法要求使用称为流式细胞仪的昂贵仪器，且因此不如ELISA划算，ELISA在许多实验室都可以方便地进行。近来，一些在单个微量培养板上进行的多重免疫测定被引入。例如在一种方法中，将抗-IgG固定在大约6微米的聚苯乙烯珠上并允许其结合捕获抗体。为进行多重测定，将不同种类分析物的检测抗体与不同的荧光物质一起加入。在另外一种叫做多重-FLISA(荧光联接免疫吸附测定)的方法中，针对多种分析物的抗体连接在不同的QDots上，其分别在不同的波长发射。相同样品中多种分析物的免疫测定可以通过荧光强度的分析同时进行。这些方法的缺陷在于，其检出限与ELISA相比不够灵敏，因为它们没有包含酶介导的信号放大过程。GenTel提供了一种多重免疫测定，其中多种抗体的每一种都直接结合在不同的荧光物质上，并就荧光强度进行测量。

采用酶促反应的基于ELISA的多重免疫测定，包括一种QuansysBiosciences，Inc.提供的方法。在这种方法中，20nl的小点沉积在96孔板的孔底，每个点代表单个靶物质的分析结果。由过氧化物酶-底物反应所增加的发光量通过读取发光图来定量，从而提供了多重-ELISA形式。这种方法有其缺陷，它需要在板上预设点，且需要采集和分析图象的昂贵仪器。另外一种基于ELISA多重免疫测定采用两种分别连接碱性磷酸酶和过氧化物酶的抗体以测量相同样品中两种类型的分析物。酶提供了信号放大作用。尽管原则上这种方法被认为是多重ELISA，但实际上当样品中所要分析的分析物数量增加到大于2时则变得更难进行操作。此外，由于使用不同种类的酶，该方法并不划算。因此，需要开发一种可以更方便进行的新的多重免疫测定。

发明内容：

发明人设计了一种可应用于多重分析的免疫测定，其仅使用一种酶、抗体包被的支持物和常规ELISA中已经使用的吸收或荧光测量仪器。

因此，一个实施方案提供了一种检测抗原的试剂盒，其包括捕获抗体、与单链DNA寡核苷酸缀合的检测抗体、互补于该DNA寡核苷酸并用荧光物质标记的单链RNA寡核苷酸以及RNA酶。

另外一个实施方案提供了一种检测抗原的方法，其使用捕获抗体、与单链DNA寡核苷酸缀合的检测抗体、互补于该DNA寡核苷酸并用荧光物质标记的单链RNA寡核苷酸以及RNA酶。

附图说明：

图1显示多重OLISA(寡核苷酸联接免疫吸附测定)的示意图。

图2为用OLISA获得的检测AFP(α-胎蛋白)——种肝癌标记——的图。

图3为用多重OLISA获得的同时检测AFP(α-胎蛋白)——种肝癌标记——和PSA(前列腺特异抗原)——种前列腺癌标记——的图。

具体实施方式：

本发明涉及一种技术，其基于现有ELISA形式的改进、利用抗体使得能够进行新的多重免疫测定。

据本发明的技术采用DNA寡核苷酸缀合的抗体来取代过氧化物酶融合的抗体，用于由酶实现的信号放大的目的。此外，本技术采用互补于该DNA寡核苷酸并在一个末端用荧光物质、且在另一个末端用荧光猝灭物质标记的RNA寡核苷酸和RNA酶(也就是RNA酶H)，这样当靶分子存在时，荧光信号通过由RNA酶H进行RNA降解来放大。由于本发明所述技术中寡核苷酸而不是酶缀合在抗体上，所以在本文中将该技术称为“OLISA”(寡核苷酸联接免疫吸附测定)。

使用OLISA技术，相同样品中存在的一种或多种类型的靶分子(抗原)可以被同时检测。通过使用分别特异于两种或更多种靶分子抗原并分别缀合不同序列的DNA寡核苷酸的抗体，以及使用分别互补于每种DNA寡核苷酸并在一个末端用荧光物质、另一个末端用荧光猝灭物质标记的RNA寡核苷酸，检测多种靶分子成为可能。通过RNA酶H进行信号放大，靶分子可以被同时分析。换句话说，本发明的技术使由单一种类的酶完成信号放大过程、以及在相同样品中不同种类的抗原(靶分子)同时进行分析成为可能(多重免疫测定)。

一个实施方案提供了一种使用寡核苷酸的新的免疫测定。换句话说，实施方案提供了一种基于OLISA(寡核苷酸联接免疫吸附测定)的免疫测定。根据实施方案的测定包含通过放大检测信号来免疫测定的步骤，其中采用缀合至DNA寡核苷酸的检测抗体(下文中，d-Ab-DNA)、互补于DNA寡核苷酸并在一个末端用荧光物质(荧光团，F)且另一个末端用荧光猝灭物质(猝灭剂，Q)标记的RNA寡核苷酸(下文中，F-RNA-Q)和RNA酶。提供了OLISA免疫测定基于的原理和实施其的方法，以及多重OLISA方法和多重OLISA试剂盒。

下文提供本发明详述。

一个实施方案提供一种基于免疫测定的靶材料(抗原)检测试剂盒，用来检测样品中的一种或多种类型的靶材料。

更具体地，检测试剂盒基本上含有支持物和固定在该支持物上且能够特异地结合样品中的靶材料(抗原)的捕获抗体(c-Ab)。该支持物可以是在基于固体的免疫测定中常规使用的任何种类的固体支持物，或ELISA中常用的微量滴定板孔。支持物的例子可包括但不限于：根据其形状而定的平底板、U形底板等等；根据配体或蛋白包被的存在而定的抗生物素蛋白包被的板、链霉抗生物素蛋白包被的板、谷胱甘肽包被的板、抗-GST包被的板等等；根据支持物所用的材料而定的聚苯乙烯板、聚丙烯板等等。捕获抗体可以以用于免疫测定目的的任意方式固定在支持物上，不限于特定的方法。例如，在一个实施方案中，捕获抗体可以被包被在支持物上。

与在液相中混合物上进行检测的情形相比，固定抗原-抗体对的一部分到固相上的方法对于使用液体样品例如体液的检测可以是有效的。这是因为，检测在液相中进行时，可能出现F-RNA-Qs被体液中存在的RNA酶降解，而不管它们是否与DNAs结合，且结果会产生假阳性信号。但是，如在ELISA和OLISA中一样，用固体支持物上固定的抗体进行抗原检测时，假阳性信号的发生可以被显著降低，因为加入了RNA酶H和F-RNA-Qs以在只要允许抗原-抗体相互作用后就产生信号，且未反应的流体和其他可能抑制基于RNA酶的测定的物质被通过洗涤去除。

当将试剂盒暴露于样品并允许足够时间的相互反应后，特异于样品中抗体的抗原结合至捕获抗体。随后，将d-Ab-DNA缀合物(其中能够特异结合抗原的检测抗体与单链DNA寡核苷酸缀合)应用于试剂盒。然后检测抗体结合至不同于捕获抗体所结合的抗原位点的抗原位点，从而导致产生捕获抗体-抗原-检测抗体-DNA寡核苷酸缀合物的复合体。接下来在试剂盒上应用F-RNA-Q缀合物，其含有互补于d-Ab-DNA的DNA寡核苷酸并在一个末端用荧光物质、且在另一个末端用荧光猝灭物质标记的单链RNA寡核苷酸。当DNA寡核苷酸和RNA寡核苷酸形成双链DNA/RNA互补复合体时，产生捕获抗体-抗原-检测抗体-DNA/F-RNA-Q复合体。这就是说，与检测抗体缀合的DNA寡核苷酸取代了ELISA中检测抗体的作用。

当用RNA酶(例如RNA酶H)处理双链DNA/RNA复合体时，复合体中的RNA被降解，以释放荧光物质，从而产生荧光。通过测量荧光的强度，可以实现对抗原是否存在的测定和定量分析。如本文所用的，术语“抗原检测”可指靶抗原的存在和/或量的确定。

因此，试剂盒除支持物和捕获抗体外，还可以进一步包含检测抗体-DNA寡核苷酸缀合物、荧光物质-RNA-荧光猝灭物质和RNA酶。它们全部均可与支持物和捕获抗体一起包含在单独的单元中。可选择地，仅有它们中一些可与支持物和捕获抗体一起包含在单独的单元中，其余的在分开的单元中提供。另外可选择地，它们中的所有或每个都可以在与支持物和捕获抗体分开的单元中提供。

另一个实施方案提供样品中特定抗原(靶材料)的抗原检测方法。特别地，方法可包括以下步骤：

使样品接触能够特异结合待检测抗原的捕获抗体(c-Ab)，从而允许抗原-抗体相互作用，以便样品中抗原与c-Ab结合(步骤(1))；

使检测抗体(d-Ab)-DNA寡核苷酸缀合物接触结合至捕获抗体的抗原，其中能够特异结合抗原的检测抗体和单链DNA寡核苷酸缀合，其中捕获抗体和检测抗体结合的抗原位点彼此不同，从而抗原结合至d-Ab-DNA寡核苷酸缀合物以形成c-Ab/抗原/d-Ab-DNA寡核苷酸缀合物(步骤(2))；

使F-RNA-Q与c-Ab/抗原/d-Ab-DNA寡核苷酸缀合物接触，其中F-RNA-Q由互补于DNA寡核苷酸的RNA寡核苷酸、在RNA寡核苷酸的一个末端的荧光物质(荧光团，F)和在RNA寡核苷酸的另一个末端的荧光猝灭物质(猝灭剂，Q)构建而成，从而通过DNA和RNA的杂交形成DNA-RNA双链(步骤(3))；

用特异降解DNA-RNA双链中RNA的RNA酶处理DNA-RNA双链，从而荧光物质从RNA释放，且产生荧光(步骤(4))；和

测量产生的荧光强度(步骤(5))。

通过检测方法，不仅当样品中只有一种类型的靶抗原时，而且当样品中有两种或更多种类型的靶抗原时，都可能通过一次执行来测定一种或多种靶抗原的存在和/或量(即多重免疫测定)。

此外，方法可以进一步在步骤(1)和步骤(2)之间包括下列步骤：洗涤未反应样品，以消除妨碍测定的物质，例如RNA酶，以防止假阳性信号，从而提高检测效率。

如果待检测的抗原种类为两种或更多，那么可以设计试剂盒，以便与检测抗体缀合的单链DNA寡核苷酸的核苷酸序列间彼此不同，并且DNA寡核苷酸之间没有互补性以避免DNA-DNA相互作用，其中检测抗体可特异结合相应抗原。

由于互补于DNA寡核苷酸的RNA序列和分别标记于RNA核苷酸末端的不同荧光物质的使用，取决于特定抗原的存在或其浓度，荧光的强度相应地变化。因此，两种或更多种类型的抗原的多重免疫测定可以通过一次执行来完成。

对于检测试剂盒或检测方法，待检测抗原包括任何用免疫测定可检测的生物活性材料。例如，抗原可以为选自以下的一种或多种：自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产物以及细菌和细菌产物，但不限于此。

用于上述抗原检测的样品——不管是检测它们的存在还是浓度——可未经处理使用或在合适的缓冲液中稀释。在所需时间的温育后，在进入下一步之前可加入另外的洗去步骤。洗去过程去除了样品中未能结合捕获抗体的靶材料和其他仍未结合的材料。

对于检测试剂盒或检测方法，捕获抗体和检测抗体可为单克隆或多克隆抗体。构建捕获抗体和检测抗体以结合相同抗原，不过是在抗原上的不同位点，从而捕获抗体和检测抗体是以非竞争方式结合抗原的，且从而形成捕获抗体-抗原-检测抗体复合体。为了使捕获抗体和检测抗体结合在抗原上的不同位点，相关领域中通常使用的任何技术均可应用，即，用分别衍生自抗原不同区域的表位来制备抗体。近来，结合在相同抗原上的不同位点的成对抗体已商业可获得，其可根据所需靶抗原购买。

具体确定与检测抗体缀合的DNA寡核苷酸序列并没有什么必要，因为单链DNA寡核苷酸是作为RNA酶特异降解DNA/RNA双链中的RNA这一活动的中间媒介发挥作用的。这就是说，DNA寡核苷酸附着结合至靶材料(抗原)的检测抗体，且互补结合荧光标记的RNA寡核苷酸以形成DNA/RNA双链，从而RNA酶特异识别DNA/RNA双链，且然后特异降解DNA/RNA双链中的RNA，由此释放RNA一个末端的荧光。因此，只要求DNA和RNA的序列互补，但具体限定其序列就不必要了。

此外，DNA寡核苷酸的长度没有限制，但为了与RNA的有效杂交和检测效率可包括2-10000，优选5-500个核苷酸。每个抗体连接的DNA寡核苷酸的平均数可以是一条或更多。例如，2-10条DNA寡核苷酸可以重复连接。此外，如果DNA寡核苷酸上RNA酶H的反应位点与抗体太近，那么RNA酶H的活性会受到负面影响，且因此，DNA寡核苷酸可在除RNA寡核苷酸杂交的区域之外进一步包括5’端的碱基序列重复，其中重复5-50，优选10-30的A、T、C、或G。如果重复序列中的碱基为G，那么可能会导致不需要的二级结构，如G-四链体(G-qudruplex)，且阻止酶的反应。因此，碱基重复序列更优选但不限于为A、T或C。

之前已经提及，对于多种抗原的免疫测定，与能够特异结合相应抗原的检测抗体缀合的DNA寡核苷酸的序列并不需要规定。但是，为了检测效率，有利的是设计这样的寡核苷酸，其根据相应的抗原具有不同序列，且寡核苷酸之间没有互补性，从而不发生DNA-DNA相互作用。另外，试剂盒可这样设计，从而即使在具有与抗原相应的不同序列的DNA寡核苷酸之间发生互补相互作用，DNA-DNA结合也不如DNA寡核苷酸与RNA寡核苷酸之间的互补结合稳定，且后者的结合(DNA-RNA)强于前者(DNA-DNA)。

在实施方案中，可以使用化学键(共价键)，例如酰胺键、二硫键、酯键、醚键、硫醚键，以将DNA寡核苷酸附着在检测抗体上。交联剂可应用于化学键的应用。交联剂的一端可通过化学键(如酰胺键、二硫键、酯键、醚键和硫醚键)连接检测抗体，而交联剂的另一端通过化学键(如酰胺键、二硫键、酯键、醚键和硫醚键)连接DNA寡核苷酸。

任何常用于连接两个生物分子的交联剂均可使用。例如，交联剂可以是选自下列的一种或多种：琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯(SMPH)，琥珀酰亚胺基-4-[p-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯(SMPB)，磺基琥珀酰亚胺基6-(3’-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP)，N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)，但不限于此，等等。

由于DNA寡核苷酸可通过化学键或交联剂连接至抗体，所以当识别抗原时，由共价键或交联剂连接至抗原-抗体复合体的DNA寡核苷酸可以发挥作用以起始酶反应。

本发明中用d-Ab-DNA寡核苷酸缀合物来取代ELISA中的检测抗体。如上文所述，缀合物中的DNA寡核苷酸结合随后加入的F-RNA-Q，并作为模板链，其使F-RNA-Q能够作为RNA酶H的底物。

在将d-Ab-DNA寡核苷酸与d-Ab-DNA寡核苷酸所特异结合的捕获抗体-抗原复合体接触，且温育所需时间后，可进行进一步去除未结合的d-Ab-DNA的过程。

在检测试剂盒或检测方法中，一端用荧光物质、且另一端用荧光猝灭物质标记的单链RNA寡核苷酸可被设计为与DNA序列具有序列互补性，这样RNA序列特异结合DNA寡核苷酸以形成DNA/RNA双链。

RNA寡核苷酸末端附着的荧光物质可为免疫测定中可使用的任何种类。荧光物质的例子包括但不限于选自以下的一种或多种：香豆素类化合物，例如7-羟基香豆素、4-甲基-7-羟基香豆素等等；呫吨类化合物，例如ROX、TET、德克萨斯红、荧光素、四甲基罗丹明等等；花菁类化合物，例如Cy3、Cy5等等；氟硼荧(Bodipy)类化合物，例如氟硼荧FL、氟硼荧530、氟硼荧R6G、氟硼荧TMR等等；Alexa Fluor类化合物，例如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor555、Alexa Fluor 532等等；以及DyLight Fluor类化合物，例如DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 750、DyLight 800等等。

附着至RNA寡核苷酸另一个末端的荧光猝灭物质可以是任何种类，没有特定限制。荧光物质的例子包括但不限于选自以下的一种或多种：DABCYL、QSY类化合物(例如QSY-35、QSY-7、QSY-9、QSY-21等等)和BHQ类化合物(例如BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3等等)。此外，它可以是进行FRET(荧光共振能量转移)的荧光物质，例如，蓝绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)等等。使用的荧光猝灭物质可根据结合在另一个末端的荧光物质的种类决定。

荧光物质和荧光猝灭物质可分别在5’端和3’端，或3’端和5’端标记。

在上面形成的c-Ab-抗原-(d-Ab-DNA/F-RNA-Q)复合体中，在单RNA链一端标记的荧光物质(F)的荧光由于另一端标记的位置与荧光物质接近的荧光猝灭物质的存在而猝灭。当使用RNA降解酶例如RNA酶H时，RNA酶H对结合至d-Ab-DNA的F-RNA-Q的降解活性可被启动，因而荧光物质和荧光猝灭物质之间的距离可以是远的。因此，对于RNA酶H允许足够量的反应时间后，可获得荧光的放大信号。结合捕获抗体的抗原量与d-Ab-DNA的量成比例，且d-Ab-DNAs中DNA的量与由RNA酶H进行的F-RNA-Q降解导致的荧光信号的放大程度成比例。从而，在抗原量和放大的荧光信号量之间存在正比例关系，从而使得能够通过荧光信号对抗原定量。RNA降解酶可与合适的缓冲液一起使用。可使用的缓冲液包括本发明所属相关领域中已知的缓冲液。

在检测试剂盒或检测方法中，RNA酶可为具有对DNA/RNA双链特异的RNA降解活性的任何种类，即，RNA酶H。特别地，RNA酶H对于使用各种RNA序列的多重测定非常有用，因为RNA酶H并不是序列特异的。RNA酶H可是从细胞中分离或纯化的，或是以重组蛋白的形式表达并纯化的。RNA酶H的例子包括但不限于源自大肠杆菌(E.coli)的RNA酶H(基因登录号：V00337，编码区域：243-707，蛋白登录号：CAA23620)。

同时检测至少两种抗原的根据本发明的多重测定(多重OLISA)进一步详细解释如下。

捕获抗体可以以抗体混合物的形式使用，其中每种在包括各种抗原的样品中特异性捕获其相应的抗原。为进行多重OLISA，可制备附着检测抗体的DNA寡核苷酸，以便附着至与特定种类抗原相应的检测抗体的每个DNA寡核苷酸具有与其他种类抗原的不同的碱基序列。例如，d-Ab-DNA缀合物可提供为d-Ab₁-DNA₁、d-Ab₂-DNA₂、d-Ab₃-DNA₃、......d-Ab_n-DNA_n(n为待检测的抗原数)。F-RNA-Qs中的RNAs如下进行制备，从而使得每种RNA的碱基序列互补于d-Ab-DNAs中的每种DNA，所述d-Ab-DNA中的每种DNA分别特异结合在相应的抗原上。选择标记在RNAs上的荧光物质，从而使其可易于彼此区别，例如，根据相应的抗原不同波长的荧光。合适种类的荧光猝灭物质与每种荧光物质匹配。F-RNA-Qs可提供为F₁-RNA₁-Q₁，F₂-RNA₂-Q₂，F₃-RNA₃-Q₃，......F_n-RNA_n-Q_n(n为待检测的抗原数)。只用一种荧光猝灭物质来猝灭来自超过一种荧光物质的荧光也是可能的。

对于多重OLISA，由F_n-RNA_n-Q_ns通过RNA酶H进行RNA降解而产生并放大的n种荧光信号具有彼此不同的波长，且因此，它们的每一种均可在其合适的波长上被检测。每种捕获抗体结合其相应的抗原；d-Ab-DNA结合于其上，其中检测抗体特异于抗原；且随后，F-RNA-Q结合其d-Ab-DNA，其中RNA序列互补于DNA，从而导致分别相应于待检测的抗原的复合体形成。随后，RNA酶H反应获取的荧光强度分别与相应抗原的量成比例。因此，通过使用上面提供的方法，通过多重-OLISA可以检测并定量相同样品中的多种抗原，其中荧光信号由RNA酶H产生并放大。

常规ELISA方法对于每种待检测抗原需要不同的酶以进行多重测定。此外，除非使用的酶专门特异于靶抗原，否则其他抗原有充当竞争底物的趋势，从而使得难于获得检测的特异性和精确性。但是，本发明提供的DNA寡核苷酸的每一种根据抗原的种类具有不同的序列，RNA寡核苷酸分别互补于DNA寡核苷酸，且RNA酶H不具序列特异性地降解DNA/RNA双链，这样不管靶抗原的数有多少，多种抗原都可以在单个测定操作中同时检测。

尽管ELISA免疫测定是抗原检测和医学诊断领域最常用的免疫测定之一，但由于基于ELISA的多重测定要求对于个别物质的分析过程分别进行，所以观察者难于比较相同样品中多种物质的相对量。此外，最近已知，诊断上困难的疾病，如癌症和阿尔茨海默病不能用单个标记进行诊断。更精确的诊断只可能通过由各种相关蛋白和生理学材料中增加/降低得出的相对关系分析来获得。为对相同样品中这样的多种标记进行概况分析，必须使用多重ELISA，通过这种方式多种标记可在单个微量培养板孔中同时分析。尽管常规多重ELISA利用超过一对的酶-底物，但根据本发明的多重-OLISA方法及其试剂盒可仅用一种类型的酶进行多重测定，其使用相同的抗体包被的微孔板和相同的微孔板分析工具，其中使用在常规ELISA中使用的荧光或吸收。因此，本发明提供了一种更简单且更划算的方法。在这点上，根据本发明的多重OLISA可有助于解决多种抗原必须同时检测的情况，且特别是在多种诊断标记必须同时分析的疾病诊断领域。

实施例

本发明参考如下实施例进一步更详细解释。但不应将这些实施例解释为以任何形式限制本发明的范围。

实施例1：对于单个抗原使用RNA酶H的OLISA分析

α-胎蛋白(AFP，来自人胎儿脐带血清，Fitzgerald，Inc.)的检测如下进行。

1.1制备检测探针(d-Ab-DNA)

将由Fitzgerald，Inc.以成对形式提供、用于夹心式ELISA的50μl 3.4mg/mL的针对AFP的单克隆抗体(1)(Cat#10C-CR1007M5，识别来自脐带血的AFP)，与50μl PBS缓冲液和1μl 100mM SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)混合，并在室温温育30分钟。将所获得的溶液稀释于15mL PBS缓冲液中，并用Amicon Ultra-15(Ultracel-30K)(Millipore)在4℃下于4,000rpm离心40分中。重复所述过程3次，且获得上清液①。

同时，将100μl 100μM的DNA溶液(DNA核苷酸的序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACCACAGTG-3’，SEQ ID NO：1，其中20个胸苷加在DNA寡核苷酸的5’端，以避免DNA寡核苷酸附着至抗体对RNA酶反应的抑制作用)和15μl 1M二硫苏糖醇(DTT)混合，并在室温温育15分钟。随后重复加入并取出100μl乙酸乙酯5次。残留的DDT和硫醇片段用MicroSpinG-25柱取出。将剩余的DNA溶液和上面获得的上清液①混合，并在室温温育30分钟。所获得的溶液稀释在15ml PBS缓冲液中，并用Amicon Ultra-15(Ultracel-30K)在4℃下于4,000rpm离心40分钟，进行四次。所得上清液为d-Ab-DNA缀合物(I)，其中单克隆抗体(1)和DNA片段缀合。将d-Ab-DNA缀合物(I)用作OLISA分析的检测探针。

1.2捕获抗体和RNA探针的制备，以及OLISA分析

将由Fitzgerald，Inc.以成对形式提供、用于夹心式ELISA的针对AFP的单克隆抗体(2)(Cat# 10C-CR1007M4，识别来自脐带血的AFP)在PBS缓冲液中稀释至10μg/mL的浓度。制备的溶液加入96孔微量培养板(每孔100μl)，且于4℃放置15小时。用200μl PBS缓冲液洗涤3次后，加入200μl 3％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)/PBS溶液。之后将微量培养板在室温温育2小时。用200μlPBST(PBS+0.05％(w/v)Tween-20)洗涤3次后，将抗原(AFP)在3％(w/v)BSA/PBS溶液中以各种浓度稀释，然后在96孔微量培养板中温育2小时(每孔100μl)。

随后，将孔用200μl PBST洗涤3次。将实施例1.1中制备的d-Ab-DNA缀合物(I)溶液在3％(w/v)BSA/PBS中以1∶30的比率稀释，以每孔100μl的量加入孔中，且在室温温育2小时。

将孔用200μl PBST溶液洗涤3次。然后将100μl含有40mM Tris-HCl、4mMMgCl₂、1mM DTT、0.003％BSA、400nM荧光素(FAM)-RNA1-dabcyl、0.1UProtector RNA酶抑制剂(Roche Inc.，Cat.#03335402001)和6U RNA酶H(Takarabio Inc.，编号No.2150A)的反应溶液加入孔中，且在室温温育2小时。荧光素(FAM)-RNA1-dabcyl的寡核苷酸序列为FAM-5’-CACUGUGGUU(SEQ IDNO：2)-3’-dabcyl。完成反应后，用微量培养板读取仪(Varioskan flash，Thermoscientific Inc.)以分别为485±10nm和535±10nm的激发和吸收波长测量荧光强度。

结果示于图2。如图2所示，荧光强度与靶材料AFP的浓度成比例地增加。也就是说，AFP用本实施例中的方法进行了有效的检测。

实施例2：对于同时分析相同样品中共存的两种类型的抗原的使用RNA酶H的多重-OLISA分析

进行对于α-胎蛋白(AFP)和前列腺特异抗原(PSA，Fitzgerald，Cat#30C-CP1017U)的同时检测的下面实验。

2.1制备检测探针(d-Ab-DNA)

AFP检测探针用实施例1.1所述的相同方式制备。

PSA检测探针用如下方式制备。将50μl浓度为2.25mg/mL的抗体溶液与50μl PBS缓冲液和1μl 100mM SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)混合。该抗体溶液含有由Fitzgerald Inc.以成对形式提供、用于夹心式ELISA中的总体PSA分析的针对PSA的单克隆抗体(3)，Cat#10-P20D。允许混合物在室温温育30分钟以发生反应。将所得溶液稀释于15mL PBS缓冲液中，且用Amicon Ultra-15(Ultracel-30K)在4℃下于4,000rpm离心40分钟。重复所述过程3次，且获得上清液(②)。

同时，将100μl 100μM的DNA溶液(DNA核苷酸的序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCTATGGG-3’，SEQ ID NO；3)和15μl 1M二硫苏糖醇(DTT)混合在一起，且允许在室温下反应15分钟。随后重复加入并取出100μl乙酸乙酯5次。然后用MicroSpin G-25柱取出残留的DDT和硫醇片段。将剩余的DNA溶液和上面获得的上清液②混合在一起，且允许在室温下反应30分钟。将所获得的溶液在15ml PBS缓冲液中稀释，并用Amicon Ultra-15(Ultracel-30K)在4℃下于4,000rpm离心40分钟，进行四次。所得上清液为d-Ab-DNA缀合物(Ⅱ)，其中单克隆抗体(3)和DNA片段缀合。将d-Ab-DNA缀合物(Ⅱ)用作OLISA分析中PSA的检测探针。

2.2捕获抗体和RNA缀合物的制备，以及OLISA分析

将针对AFP的单克隆抗体(2)(实施例1.2)和针对PSA的单克隆抗体(4)(Fitzgerald Inc.，Cat#10-P20E)在PBS缓冲液中分别在10μg/mL的浓度溶解。制备的溶液加入96孔微量培养板(每孔100μl)，且于4℃放置15小时。用200μlPBS缓冲液洗涤3次后，加入200μl 3％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)/PBS溶液。之后将微量培养板于室温温育2小时。用200l PBST(PBS+0.05％(w/v)Tween-20)洗涤3次后，将每种抗原(AFP(Fitzgerald))、PSA(Fitzgerald))在3％(w/v)BSA/PBS溶液中以各种浓度稀释，并在室温下置于96孔微量培养板中2小时(每孔100μl)。

随后，将孔用200μl PBST洗涤3次。实施例2.1中制备的相应于抗原的d-Ab-DNA缀合物在3％(w/v)BSA/PBS中以1∶30的比率稀释并置于孔中(每孔100μl)，于室温进行2小时。微量培养板用200μl PBST溶液洗涤3次。然后，将100μl含有40mMTris-HCl、4mM MgCl₂、1mM DTF、0.003％BSA、400nM荧光素(FAM)-RNA1-dabcyl、400nM ROX-RNA2-BHQ2(ROX-5’-CCCAUAGAGU(SEQ ID NO：4)-3’-BHQ2)，0.1U Protector RNA酶抑制剂(Roche Inc.，Cat.#03335402001)和6U RNA酶H(Takara bio Inc.，编号No.2150A)的反应溶液加入孔中，室温反应1小时。完成反应后，用微量培养板读取仪(Varioskan flash，Thermoscientific Inc.)对于荧光素和ROX以分别为535±10nm和589±5nm的发射波长测量荧光强度。

所得结果示于图3。如图3所示，荧光强度与靶物质AFP和PSA的浓度成比例地增加。也就是说，AFP和PSA用本实施例中的方法进行了有效的检测，彼此互不干扰。

序列表

<110>Korea Institute of Science and Technology

<120>抗原检测试剂盒和方法

<130>OPP20091490US

<160>4

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于癌胚抗原与检测抗体缀合的DNA寡核苷酸

<400>1

tttttttt tttttttttttt aaccacagt g 30

<210>2

<211>10

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于癌胚抗原的RNA寡核苷酸

<400>2

cacugugguu 10

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于前列腺特异抗原与检测抗体缀合的DNA寡核苷酸

<400>3

tttttttttt tttttttttt actctatggg 30

<210>4

<211>10

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>对于前列腺特异抗原的RNA寡核苷酸

<400>4

cccauagagu 10

Claims

1.一种抗原检测试剂盒，其包括：

支持物；

固定在所述支持物上的捕获抗体，其中该捕获抗体能够特异结合抗原；

检测抗体-DNA缀合物(d-Ab-DNA缀合物)，其包括能够在不同于捕获抗体结合位点的抗原位点特异结合抗原的检测抗体(d-Ab)，和单链DNA寡核苷酸；

荧光物质-RNA-荧光猝灭物质缀合物，其包括互补于所述DNA寡核苷酸的单链RNA寡核苷酸，与该单链RNA寡核苷酸的一个末端结合的荧光物质，和与该单链RNA寡核苷酸的另一个末端结合的荧光猝灭物质；和

RNA酶H。

2.权利要求1所述的抗原检测试剂盒，其中所述抗原为选自以下的一种或多种：自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产物以及细菌和细菌产物。

3.权利要求2所述的抗原检测试剂盒，其中所述抗原为选自以下的两种或更多种：自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产物以及细菌和细菌产物，且试剂盒能够同时检测两种或更多种类型的抗原。

4.权利要求3所述的抗原检测试剂盒，其中检测抗体-DNA缀合物具有与所检测的抗原种类对应的彼此不同的DNA寡核苷酸，且DNA寡核苷酸彼此之间不互补。

5.权利要求1至4中任一项所述的抗原检测试剂盒，其中检测抗体和DNA寡核苷酸通过一种或多种选自酰胺键、二硫键、酯键、醚键和硫醚键的化学键结合。

6.权利要求5所述的抗原检测试剂盒，其中检测抗体和DNA寡核苷酸通过一种或多种选自SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-[p-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯)、磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基-6-(3’-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)和SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯)的交联剂结合。

7.权利要求1至4中任意一项所述的抗原检测试剂盒，其中荧光物质为选自以下的一种或多种：香豆素类，呫吨类，花菁类，氟硼荧类，Alexa Fluor类以及DyLight Fluor类荧光物质。

8.权利要求1至4中任意一项所述的抗原检测试剂盒，其中荧光猝灭物质为选自以下的一种或多种：dabcyl类物质，QSY类物质，BHQ类物质以及FRET(荧光共振能量转移)。

9.一种抗原检测方法，包括如下步骤：

使样品接触能够特异结合待检测抗原的捕获抗体，以形成抗原-抗体结合；

使检测抗体-DNA寡核苷酸(d-Ab-DNA)缀合物接触结合至捕获抗体的抗原，其中检测抗体-DNA寡核苷酸缀合物包括能够在不同于捕获抗体结合位点的抗原位点特异结合抗原的检测抗体(d-Ab)，和结合至检测抗体的单链DNA寡核苷酸，以在抗原与d-Ab-DNA缀合物之间形成结合；

使荧光物质-RNA-荧光猝灭物质(F-RNA-Q)缀合物与既结合捕获抗体又结合d-Ab-DNA缀合物的抗原接触，其中F-RNA-Q缀合物包含互补于DNA寡核苷酸的单链RNA寡核苷酸、在RNA寡核苷酸的一个末端的荧光物质和在RNA寡核苷酸的另一个末端的荧光猝灭物质，以通过DNA-RNA的杂交形成DNA-RNA双链；

用降解DNA-RNA双链中RNA的RNA酶处理获得的DNA-RNA双链，以从RNA释放荧光物质，且产生荧光；以及

测量产生的荧光强度。

10.权利要求9所述的抗原检测方法，其中所述抗原为选自以下的一种或多种：自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产物以及细菌和细菌产物。

11.权利要求9所述的抗原检测方法，其中所述抗原为选自以下的两种或更多种：自身抗体、配体、天然提取物、肽、蛋白、金属离子、合成药物、天然药物、代谢物、基因组、病毒和病毒产物以及细菌和细菌产物，且所述方法能够用两种或更多种RNA寡核苷酸同时检测两种或更多种类型的抗原，其中每种RNA寡核苷酸相应于抗原的种类结合至不同的荧光物质。

12.权利要求11所述的抗原检测方法，其中检测抗体-DNA缀合物具有与所检测的抗原种类对应的彼此不同的DNA寡核苷酸，且DNA寡核苷酸彼此之间不互补。

13.权利要求9至12中任意一项所述的抗原检测方法，其中荧光物质为选自以下的一种或多种：香豆素类，呫吨类，花菁类，氟硼荧类，Alexa Fluor类以及DyLight Fluor类荧光物质。

14.权利要求9至12中任意一项所述的抗原检测方法，其中荧光猝灭物质为选自以下的一种或多种：dabcyl类物质，QSY类物质，BHQ类物质以及FRET(荧光共振能量转移)。