CN104781271B - 具有生物可逆的基团的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于递送多核苷酸至细胞中的方法和组合物。本公开提供了包含带负电荷的中和部分/基团的临时保护的多核苷酸，其还可赋予其他的功能。这些化合物可通过内吞或巨胞饮机制进入细胞的胞质。所述临时保护的基团为生物可逆的，即在进入细胞后，其被设计为通过酶活性或被动的细胞内方法(例如，pH或还原性环境的改变)加以去除。

Description

具有生物可逆的基团的多核苷酸
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年8月20日递交的美国临时申请系列第61/691,175号的优先权，其公开内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于转染细胞的组合物和方法。
发明背景
已使用各种重组病毒载体、脂质递送系统和电穿孔进行了体外和体内递送核酸至细胞。这类技术试图通过敲除基因表达、提供用于基因治疗或研究各种生物系统的遗传构建体来治疗各种疾病和病症。
聚阴离子聚合物如多核苷酸在细胞膜中不容易扩散。为了克服培养的细胞这一问题，通常将阳离子型脂质组合阴离子多核苷酸来帮助摄取。不幸的是，该复合物通常对细胞有毒，这意味着必须仔细控制暴露时间和阳离子型脂质的浓度以确保转染活细胞。
作为选择性降解mRNA的细胞机制的RNA干扰(RNAi)的发现，使得在细胞培养物中进行细胞表型的定向操纵和开发定向治疗成为可能(Behlke,Mol.Ther.13,644-670,2006；Xie et al.,Drug Discov.Today 11,67-73,2006)。然而，由于其大小和负电荷(阴离子)性质，siRNA为不能进入细胞的大分子。确实，siRNA超过用于大小通常限制在小于500Da的膜扩散性分子细胞递送的Lipinski“5规则”25x。因此，在不存在递送载体或转染试剂时，裸露的siRNA不进入细胞，甚至在毫摩尔浓度下依然如此(Barquinero et al.,GneeTher.11Suppl 1,S3-9,2004)。大量的关注集中于使用缩合siRNA并在细胞膜中穿孔的阳离子型脂质，以解决siRNA递送问题。尽管被广泛使用，转染试剂不能实现至许多细胞类型，特别是原代细胞和造血细胞系(T和B细胞、巨噬细胞)的有效递送。此外，脂质转染试剂常常引起不同程度的细胞毒性，其范围为在肿瘤细胞中的中等毒性至在原代细胞中的高毒性。
发明概述
本公开提供了用于递送多核苷酸至细胞中的方法和组合物。本公开提供了临时保护的多核苷酸，其包含带负电荷的中和部分/基团，这些中和部分/基团还可赋予如本文所述的其他的功能。这些化合物可通过内吞或巨胞饮机制进入细胞胞质。在一个实施方案中，临时保护的基团为生物可逆的，即一旦进入细胞，其被设计为能通过酶活性或被动的细胞内方法(例如，pH或还原性环境的变化)去除。因此，本公开提供了可用作治疗剂、诊断剂和用作研究工具的多核苷酸。
本公开提供了多核苷酸构建体，其包含选自以下的组分(i)：肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸(endosomal escape)部分和以上物质的任意组合，其中组分(i)通过与核苷酸间桥连基团结合的生物可逆的基团与多核苷酸构建体连接。多核苷酸构建体还可包含至少一种第二组分(ii)，其选自：包含亲水性功能基团的生物可逆的基团、包含缀合部分的生物可逆的基团和包含缀合部分及亲水性基团的生物可逆的基团，其中缀合部分还可包含保护基团。在一个实施方案中，生物可逆的基团包含硫酯。在任何前述实施方案的又一个实施方能中，组分(i)允许多核苷酸构建体经胞内运输，由此生物可逆的基团被切割。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，构建体还可包含至少一种第三组分(iii)，其选自：小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合，其中组分(iii)经胞内生物可逆的基团与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团缀合。在又一个实施方案中，组分(iii)为小分子。在又一个实施方案中，小分子为任选取代的C1-6烷基。在一个实施方案中，多核苷酸构建体具有式II所示的结构：
或其盐，其中一个R2包含组分(i)，Z为0-150的数字；每个B1单独地为核苷酸碱基；每个X单独地选自O、S和NR5；每个Y单独地选自氢、羟基、卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；每个R2单独地为不存在、氢或包含亲水性功能基团的第一生物可逆的基团、包含缀合部分的第二生物可逆的基团或包含辅助部分的第三生物可逆的基团，所述辅助部分选自小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合，其中以保护基团任选保护了缀合部分或亲水性功能基团；每个R5单独地选自H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基和任选取代的C2-9杂环基；每个R9单独地为O或S；R10选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、5’帽、硫代磷、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合；并且R11选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、硫代磷、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合。在某个实施方案中，每个X为O或S。在又一个实施方案中，构建体具有包含式II(a)所示结构的核苷酸的一条或多条链：
在又一实施方案中，当上述多核苷酸构建体中R2为第一、第二或第三生物可逆的基团时，Y不为羟基，例如，为F或OMe。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，与生物可逆的基团结合的组分(i)具有结构式V：
其中，G1为肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合；L1为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且L2为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，与生物可逆的基团结合的组分(ii)具有结构式V：
其中，G1为缀合部分或亲水性功能基团；L1为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且L2为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，L1为
其中L2’为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；G2为缀合部分、亲水性功能基团、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，构建体还可包含式V’所示的结构：
其中，G1’为缀合部分、亲水性功能基团、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合；L1’为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；L2’为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。在又一个实施方案中，结构式V或V’选自：
在又一个实施方案中，结构式V或V’选自：
在又一个实施方案中，结构式V或V’选自：
在又一个实施方案中，结构式V或V’选自：
在又一个实施方案中，结构式V’选自：
在任何上述各种实施方案中，L1为任选取代的C2-10亚烷基。在另一个实施方案中，L1为未取代的或取代的C2、C4或C5亚烷基。在又一个实施方案中，L2为共价键。在又一个实施方案中，L2为任选取代的C1-10亚烷基或任选取代的C6-12亚芳基。在又一个实施方案中，G1为羟基，或者G1为缀合部分。在又一个实施方案中，缀合部分为-CHO、巯基或-N3。在任何上述实施方案的其他实施方案中，G1包含肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合。在另一个实施方案中，G1通过由选自以下的反应形成的键与L2结合：周环反应；羟基、巯基或氨基部分的烷基化或芳基化；以及羟基、巯基或氨基亲核试剂与亲电试剂的反应。在一个实施方案中，L2不为键，并且G1通过酰胺键、磺胺键、羧酸酯、硫酯、任选取代的C6-12芳基或C2-9杂芳基；亚胺；腙；肟；或琥珀酰亚胺与L2结合。在任何前述实施方案的又一实施方案中，以保护基团保护R2的一个或多个亲水性功能基团和/或缀合部分。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过与醛缀合部分的缩合反应与生物可逆的基团连接，从而形成亚胺、烯胺或腙键。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过一个或多个具有式III所示结构的含氮的缀合部分与生物可逆的基团连接：
其中，A1、A2和A4及A5每个单独地为N或CR8；A3和A6为C；R6-R7每个单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的亚胺和任选取代的烯胺；并且每个R8单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、卤素、羟基、-CHO、任选取代的C1-6酰基、羧基、氰基、硝基、任选取代的氨基、巯基、任选取代的C2-9杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C3-8环烷基和任选取代的C4-8环烯基。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，最多25％、50％、75％或90％的生物可逆的基团与肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合连接。在任何前述实施方案的具体实施方案中，组分(i)包含递送结构域。在又一个实施方案中，递送结构域包含一个或多个肽转导结构域(PTD)。在一个实施方案中，一个或多个PTD通过亚胺、烯胺或腙键与生物可逆的基团连接。例如，一个或多个PTD与生物可逆的基团连接而形成结构式IV：
其中，R2’为生物可逆的基团与PTD结合的残基；z’为1-10的数字，其中，当z’大于1时，PTD可通过具有1-10个重复单元的聚(C1-4环氧烷烃)基团连接在一起。在具体的实施方案中，一个或多个PTD为反式激活转录激活因子(TAT)肽。在前述实施方案的不同实施方案中，PTD通过包含式III所示结构的互补缀合部分与生物可逆的基团连接：
其中，A1、A2、A4和A5每个单独地为N或CR8；A3和A6为C；R6-R7每个单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的亚胺和任选取代的烯胺；并且每个R8单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、卤素、羟基、-CHO、任选取代的C1-6酰基、羧基、氰基、硝基、任选取代的氨基、巯基、任选取代的C2-9杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C3-8环烷基和任选取代的C4-8环烯基。在一个实施方案中，生物可逆的基团在缀合前选自：
在另一个实施方案中，PTD包含在5-15个氨基酸中具有5-10个精氨酸和/或赖氨酸残基的阳离子型肽序列。例如，PTD可包含序列RKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)。在又一个实施方案中，组分(i)包含与具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)(PEG)缀合的PTD。在一些具体的实施方案中，组分(i)包含选自如下的序列：PEG-(PTD)；GG-(PTD)-PEG-(PTD)；PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；GG-(PTD)-PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；和GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；其中PEG为具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)连接子。在另一个实施方案中，组分(i)包含靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分为配体、碳水化合物、抗体、Fab、ScFv或单结构域抗体。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，多核苷酸构建体包含非天然的核苷酸碱基。在又一个实施方案中，构建体仅包含天然存在的核苷酸碱基。在任何前述实施方案中，核苷酸碱基选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。在另一个实施方案中，多核苷酸构建体中不多于75％或65％的核苷酸具有生物可逆的基团。在任何前述实施方案中，多核苷酸构建体包含2-40个或5-10个生物可逆的基团。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，多核苷酸构建体具有10-32个核苷酸(例如，17-30个核苷酸)。当构建体中存在多于一个生物可逆的基团时，这样的基团可为相同的或不同的。具体而言，构建体可包含生物可逆的基团与肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合的混合物，以及生物可逆的基团与C1-6烷基或羟基-取代的C1-6烷基小分子基团的混合物。
在其他实施方案中，多核苷酸构建体具有式II(a)所示的结构：
或其盐，其中一个R2包含组分(i)，Z为0-30的数字；每个B1单独地为核苷酸碱基；每个Y单独地选自羟基、卤素或C1-6烷氧基；每个R2单独地为不存在；氢；式V所示的基团：
其中，G1为肽、多肽、中性有机聚合物或以上物质的任意组合；L1为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基或任选取代的C2-6亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1或2个氧原子；并且L2为共价键，或选自任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C2-6亚烯基；任选取代的C2-6亚炔基；和任选取代的C6-10亚芳基；或式V’所示的基团：
其中，G1’为氢、醛或经保护的醛、羟基、经保护的羟基、胺、经保护的胺或者被保护基团或C1-6烷基任选取代的5元或6元杂环胺；L1’为任选取代的C2-6亚烷基，其中每个亚烷基任选插入有1或2个氧原子；并且L2’为共价键，或选自任选取代的C1-6亚烷基和任选取代的C6-10亚芳基；R10选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、5’帽、硫代磷、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、肽、多肽、中性有机聚合物以及肽、多肽和中性有机聚合物的任意组合；并且R11选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、任选取代的C1-6烷基、肽、多肽、中性有机聚合物，以及肽、多肽和中性有机聚合物的任意组合。在其他实施方案中，对于其中R2为式V或V’所示的基团的核苷酸，Y为F或OMe。结构式V’任选选自：
在其他实施方案中，G1包含递送结构域，其包含一个或多个如本文所述的肽转导结构域(PTDs)。
本公开还提供了包含一个或多个生物可逆的基团的多核苷酸构建体，所述生物可逆的基团包含与核苷酸间桥连基团结合的羟基取代的C1-6烷基，或者包含与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团结合的缀合部分如–CHO、N3或巯基。本公开还提供了包含一个或多个生物可逆的基团的多核苷酸构建体，所述生物可逆的基团选自：
且与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团结合。在一个实施方案中，多核苷酸构建体具有式II所示的结构：
或其盐，其中Z为0-150的数字；每个B1单独地为核苷酸碱基；每个X单独地选自O、S和NR5；每个Y单独地选自氢、羟基、卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；每个R2单独地为不存在、氢、生物可逆的基团(i)、生物可逆的基团(ii)或生物可逆的基团(iii)；每个R5单独地选自H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基和任选取代的C2-9杂环基；每个R9单独地为O或S；R10选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、5’帽、硫代磷、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分，以及以上物质的任意组合；并且R11选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、硫代磷、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分，以及以上物质的任意组合，前提是至少一个R2为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)。在某个实施方案中，X为O或S。在又一个实施方案中，多核苷酸构建体包含具有式II(a)所示结构的核苷酸的一条或多条链：
在一个实施方案中，对于其中R2为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的核苷酸，Y不为羟基，例如，为F或OMe。在又一个实施方案中，多核苷酸构建体包含R2基团的混合物，其中一个或多个R2基团为不存在或H；一个或多个R2基团为生物可逆的基团(i)；并且一个或多个R2基团为生物可逆的基团(ii)或(iii)。在又一个实施方案中，为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:10至10:1。在又一个实施方案中，为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:5至5:1。在又一个实施方案中，为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:4至4:1。在又一个实施方案中，为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:3至3:1。在又一个实施方案中，为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:2至2:1。在具体的实施方案中，为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:1。在另一个实施方案中，为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:10至10:1。在又一个实施方案中，为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:5至5:1。在又一个实施方案中，为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:4至4:1。在又一个实施方案中，为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:3至3:1。在又一个实施方案中，为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:2至2:1。在具体的实施方案中，为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:1。
本公开还提供了杂交的多核苷酸，其包含与互补多核苷酸杂交的、任何前述实施方案所述的多核苷酸构建体。在一个实施方案中，互补多核苷酸包含与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团缀合的经胞内生物可逆的基团。在又一个实施方案中，多核苷酸构建体和互补多核苷酸每个包含不多于9个生物可逆的基团。在一个实施方案中，不多于75％的总核苷酸具有生物可逆的基团。在另一个实施方案中，互补链和多核苷酸构建体每个具有10-32(例如，19-25)个核苷酸。在一个实施方案中，杂交的多核苷酸为siRNA。在另一个实施方案中，多核苷酸构建体为引导链，并且互补多核苷酸为随从链。在另一个实施方案中，随从链包含磷酸三酯，其具有不可被细胞内酶切割的部分。在又一个实施方案中，不可被细胞内酶切割的部分为任选取代的C1-6烷基。
本公开还提供了药物组合物，其包含任何前述实施方案所述的多核苷酸构建体或多核苷酸以及药学上可接受的赋形剂。
本公开还提供了减少蛋白表达的方法，包括以足以降低反义或RNAi介导的基因表达减少的量，向细胞给予上述构建体或杂交的多核苷酸。
本公开还提供了包含式(I)所示结构的核苷酸构建体：
或其盐，其中，B1为核苷酸碱基；X为O、S或NR5；Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；R1为羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯或五磷酸酯；R2为包含辅助部分的生物可逆的基团，所述辅助部分选自肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合，其中辅助部分通过一个或多个共价键与生物可逆的基团连接；R3为O、S或任选取代的氨基；R4为H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯，或当R3为任选取代的氨基时不存在；并且R5为H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C2-9杂环基。在某个实施方案中，X为O或S。在一个实施方案中，核苷酸构建体包含式I(a)所示的结构：
在一个实施方案中，R1为4,4'-二甲氧三苯甲基(DMT)保护的羟基。在另一个实施方案中，R2包含结构式V：
其中，G1为肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合；L1为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且L2为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。在又一个实施方案中，L1为任选取代的C2-10亚烷基。在又一个实施方案中，L1为未取代的或取代的C2、C4或C5亚烷基。在又一个实施方案中，L2为共价键。在另一个实施方案中，L2为任选取代的C1-10亚烷基或任选取代的C6-12亚芳基。在又一个实施方案中，L2不为键，并且G1通过由选自以下的反应形成的键与L2结合：周环反应；羟基、巯基或氨基部分的烷基化或芳基化；和羟基、巯基或氨基亲核试剂与亲电试剂的反应。在一个实施方案中，L2不为键，并且G1通过酰胺键、磺胺键、羧酸酯、硫酯、任选取代的芳基或杂芳基、亚胺、腙、肟或琥珀酰亚胺与L2结合。具体而言，G1为肽、多肽、中性有机聚合物或以上物质的任意组合；L1为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基或任选取代的C2-6亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1或2个氧原子；并且L2为共价键，或选自任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C2-6亚烯基；任选取代的C2-6亚炔基；和任选取代的C6-10亚芳基。在这些实施方案中，G1可包含递送结构域，例如，包含一个或多个肽转导结构域(PTD)。G1的中性有机聚合物任选为聚(乙二醇)。在又一个实施方案中，L1为
其中L2’为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；G2为缀合部分、亲水性功能基团、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合。在一个实施方案中，X为O。在另一个实施方案中，肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过与醛基的缩合反应与生物可逆的基团连接，从而形成亚胺、烯胺或腙键。在又一个实施方案中，肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过一个或多个具有式III所示的结构的、含氮的互补缀合部分与生物可逆的基团连接：
其中，A1、A2、A4和A5每个单独地为N或CR8；A3和A6为C；R6-R7每个单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的亚胺和任选取代的烯胺；并且每个R8单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烯基、任选取代的C2-6炔基、卤化物、羟基、-CHO、任选取代的C1-6酰基、羧酸、氰基、硝基、任选取代的氨基、巯基、任选取代的C2-9杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C3-8环烷基和任选取代的C4-8环烯基。在一个实施方案中，R2包含递送结构域。在又一个实施方案中，递送结构域包含一个或多个肽转导结构域(PTD)。在又一个实施方案中，核苷酸构建体包含式I(c)所示的结构：
其中R2’为与PTD结合的生物可逆的基团的残基；并且z’为1-10的数字，其中当z’大于1时，PTD通过具有1-10个重复单元的聚(C1-4环氧烷烃)基团连接在一起。在另一个实施方案中，PTD为在5-15个氨基酸中具有5-10个精氨酸和/或赖氨酸残基的阳离子型肽序列。在具体的实施方案中，PTD包含序列RKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)。在又一个实施方案中，递送结构域包含与具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)缀合的PTD。例如，递送结构域包含选自如下的结构：PEG-(PTD)；GG-(PTD)-PEG-(PTD)；PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；GG-(PTD)-PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；和GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；其中PEG为具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)连接子。在又一个实施方案中，R2包含靶向部分。例如，靶向部分可包含配体、碳水化合物、抗体、Fab、ScFv或单结构域抗体。在任何前述实施方案的又一个实施方案中，B1为非天然的核苷酸碱基。在又一个实施方案中，B1为天然存在的核苷酸碱基。例如，B1可为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
本公开还提供了包含式(I)所示的结构的核苷酸构建体：
或其盐，其中，B1为核苷酸碱基；X为O、S或NR5；Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；R1为羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯或五磷酸酯；R2为
R3为O、S或任选取代的氨基；R4为H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯，或当R3为任选取代的氨基时不存在；并且R5为H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C2-9杂环基。在某个实施方案中，X为O或S。
本公开还提供了制备多核苷酸构建体的方法，包括：(1)通过在酸性条件下于非质子溶剂系统中去除DMT基团，将在5'位置包含DMT保护基团的第一核苷或核苷酸解除封闭，其中可在3'位置将第一核苷或核苷酸固定至固相载体，或者用非酸性的不稳定羟基保护基团保护3'位置，并且第一核苷或核苷酸在溶液中；(2)在酸性唑催化剂存在下，使解除封闭的第一核苷或核苷酸与如上所述的活化的核苷酸或在3'位置包含亚磷酰胺的活化的核苷酸偶联；(3)在包含质子溶剂和弱碱的溶剂系统中用氧化试剂氧化所偶联的核苷酸；(4)在酸性条件下于非质子溶剂系统中，通过去除所偶联的核苷酸的5'位置的DMT基团，将所结合的核苷酸解除封闭；并且其中步骤(2)-(4)重复1-149次，并且其中多核苷酸构建体包含至少一种如上所述的核苷酸构建体。在一个实施方案中，将步骤(1)的第一核苷或核苷酸与固相载体结合，并且其中在最后的解除封闭步骤后将产生的多核苷酸构建体从固相载体切割下来。在另一个实施方案中，使用计算机控制的仪器进行所述步骤。在又一个实施方案中，在合成多核苷酸构建体后，如果核苷酸碱基包含一个或多个保护基团，则去除保护基团；和/或对于包含亲水性功能基团或通过保护基团保护的缀合部分的任何生物可逆的基团，则去除保护基团。在又一个实施方案中，在合成多核苷酸构建体后，将小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分和/或内体逃逸部分与一个或多个生物可逆的基团的一个或多个缀合部分连接。
本公开还提供了包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器包含肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合，所述肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合具有一个或多个能够与醛基缩合形成一个或多个共价键的缀合部分以及如上所述的多核苷酸构建体。
本公开包括所述化合物的所有同分异构(例如，对映体、非对映体和几何异构体(或构象异构体))形式；例如，顺式和反式异构体、每个非对映中心的R和S结构、Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本文包括本公开的化合物的单立体化学异构体以及对映体、非对映体和几何异构体(或构象异构体)混合物。具体而言，某些核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团上存在的生物可逆的基团可产生多种非对映体及其混合物。除非另有说明，本文包括本公开的化合物的所有的互变异构形式。本公开包括所有药学上可接受的同位素标记的本公开的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子量或质量数不同于天然下通常发现的原子量或质量数的原子取代。适于纳入本公开的化合物中的同位素的实例包括氢的同位素如2H和3H；碳的同位素如11C、13C和14C；氯的同位素如36Cl；氟的同位素如18F；碘的同位素如123I和125I；氮的同位素如13N和15N；氧的同位素如15O、17O和18O；磷的同位素如32P；以及硫的同位素如35S。
衍生自合适的碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。代表性的碱金属盐和碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。一类盐包括药学上可接受的盐。如本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示这样的盐，其属于合理的医学评判范围，适合用于与人和动物组织接触而不产生过多的毒性、刺激、过敏反应等，并且对应于合理的益处/风险比。药学上可接受的盐为本领域所熟知。例如，药学上可接受的盐描述于：Berge et al.,J.PharmaceuticalSciences 66:1-19,1977和Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,(Eds.P.H.Stahl and C.G.Wermuth),Wiley-VCH,2008。所述盐可在本文所述化合物的最后分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离的碱基团与合适的有机酸反应单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻朊酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月硅酸盐、月桂烷硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、乙基胺等。
如本文所用，术语“活化的羰基”表示具有式–C(O)RA的功能基团，其中RA为C1-6烷氧基、OH或卤化物。
如本文所用，术语“活化的磷中心”表示三价磷(III)或五价磷(V)中心，其中至少一个取代基为C1-6烷氧基。合适地，烷氧基为–OCH3或–OCH2CH3。
如本文所用，术语“活化的硅中心”表示四取代的硅中心，其中至少一个取代基为C1-6烷氧基。合适地，烷氧基为–OCH3或–OCH2CH3。
如本文所用，术语“活化的硫中心”表示四价硫，其中至少一个取代基为C1-6烷氧基。合适地，烷氧基为-OCH3或–OCH2CH3。
如本文所用，术语“酰基”表示通过羰基与亲本分子基团连接的氢或烷基(例如，卤代烷基)，并且示例为甲酰基(即羧基醛基)、乙酰基、丙酰基、丁酰基等。示例性的未取代的芳基基团包含1-7个碳。在一些实施方案中，烷基被如本文所述的1、2、3或4个取代基进一步取代。
如本文所用，术语“烷芳基”表示通过亚烷基与亲本分子基团连接的芳基。示例性的未取代的烷芳基基团为7-16个碳。在一些实施方案中，亚烷基和芳基每个可被1、2、3或4个如本文针对各个基团所定义的取代基进一步取代。加有前缀“烷-”的其他基团以相同的方式定义，其中除非另有说明，“烷”是指C1-6亚烷基，并且所连接的化学结构如本文所定义。
除非另有说明，如本文所用的术语“烯基”表示具有2-6个碳的单价直链或支链烃基，和含有一个或多个碳-碳双键的4-8个碳的环烯基，并且示例为乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基等。烯基基团可被1、2、3或4个取代基任选取代，所述取代基独立地选自芳基、环烷基或杂环基(例如，杂芳基)，或任何本文描述的示例性的烷基取代基。另外，当烯基存在于本公开的生物可逆的基团中时，其可被与如本文所定义的与缀合部分、亲水性功能基团或辅助部分结合的硫酯或二硫基团取代。
如本文所用，术语“烷氧基”表示式–OR所示的化学取代基，其中除非另有说明，R为C1-6烷基。在一些实施方案中，烷基可被如本文所定义的1、2、3或4个取代基进一步取代。
除非另有说明，如本文所用的术语“烷基”包括1-6个碳原子的直链、支链和环烷基饱和烃基。烷基基团示例为甲基、乙基、正丙基和异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基、新戊基等，并且可被1个、2个、3个或在两个碳或更多个碳的烷基情况下，4个取代基任选取代，所述取代基独立地选自：(1)烷氧基；(2)烷基亚磺酰基；(3)氨基；(4)芳基烷氧基；5)叠氮基；(6)卤素；(7)(杂环基)氧；(8)羟基；(9)硝基；(10)氧代(例如，羧基醛或酰基)；(11)螺环基(spirocyclyl)；(12)硫代烷氧基；(13)巯基；(14)CO2RA，其中RA选自：(a)烷基，(b)芳基，(c)氢，和(d)烷芳基；15)-C(O)NRBRC，其中每个RB和RC独立地选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基；(16)-SO2RD，其中RD选自：(a)烷基，(b)芳基，和(c)烷芳基；(17)-SO2NRERF，其中每个RE和RF独立地选自：(a)氢，(b)烷基，c)芳基和(d)烷芳基；(18)甲硅烷基；(19)氰基；和(20)-S(O)RH，其中RH选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基。在一些实施方案中，这些基团中的每个还可如本文所述被进一步取代。例如，C1-烷芳基的亚烷基可被氧基(oxo)进一步取代，以提供各自的芳酰基(aryloyl)取代基。
如本文所用，术语“亚烷基”和前缀“烷-(alk-)”表示通过去除至少两个氢原子而衍生自直链或支链饱和烃的饱和的二价烃基，并且示例为亚甲基、亚乙基、亚异丙基等。术语“Cx-y亚烷基”和前缀“Cx-y烷-”表示具有x-y个碳的亚烷基基团。x的示例性值为1、2、3、4、5和6，并且y的示例性值为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，亚烷基可被1、2、3或4个如本文针对烷基所定义的取代基取代。类似地，后缀“亚ene)”是指如本文所定义的单价基团相应的二价基团。例如，亚芳基、亚杂环基、亚烯基和亚炔基为芳基、杂环基、烯基和炔基的二价形式。另外，当烷基或亚烷基、烯基或亚烯基或者炔基或亚炔基存在于本公开的生物可逆的基团中时，其可被与如本文所定义的与缀合部分、亲水性功能基团或辅助部分结合的酯、硫酯或二硫基团取代。
如本文所用，术语“炔基”表示含有至少1个碳-碳三键的2-6个碳原子的单价直链或支链烃基，并且示例为乙炔基、1-丙炔基等。炔基基团可被1、2、3或4个取代基任选取代，所述取代基独立地选自如本文所定义的芳基、环烷基或杂环基(例如，杂芳基)，或本文描述的示例性的烷基取代基中的任何一种。
如本文所用，术语“氨基”表示–N(RN1)2或–N(＝NRN1)(NRN1)2，其中每个RN1独立地为H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、环烷基、烷环烷基、杂环基(例如，杂芳基)、烷杂环基(例如，烷杂芳基)，或者两个RN1结合形成杂环基，并且其中每个RN2独立地为H、烷基或芳基。在一个实施方案中，氨基为–NH2或–NHRN1，其中RN1独立地为OH、NO2、NH2、NRN2 2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、烷基或芳基，并且每个RN2可为H、烷基或芳基。如本文所述，RN1基团自身可为未取代的或取代的。另外，当炔基存在于本公开的生物可逆的基团中时，其可被与如本文所定义的与缀合部分、亲水性功能基团或辅助部分结合的酯、硫酯或二硫基团取代。
如本文所用，术语“抗体”以最广的含义使用，并且具体包括，例如单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体和抗体片段(例如，抗原结合片段或Fc区)。如本文所用，“抗体”包括完整的免疫球蛋白或抗体分子、多克隆抗体、多特异性抗体(即由至少两个完整的抗体形成的双特异性抗体)和免疫球蛋白片段(如Fab、F(ab’)2或Fv)，只要它们识别抗原和/或展现本文所述的任何所需的激动或拮抗特性。抗体或片段可为人源化的、人的或嵌合的。
如本文所用，术语“芳基”表示具有一个或两个芳环的单环、双环或多环碳环环系，并且示例为苯基、萘基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、芴基、二氢茚基、茚基等，并且可被独立选自如下的1个、2个、3个、4个或5个取代基任选取代：(1)酰基(例如，羧基醛)；(2)烷基(例如，烷氧基烷基、烷基亚磺酰基烷基、氨基烷基、叠氮基烷基、(羧基醛)烷基、卤代烷基(例如，全氟烷基)、羟基烷基、硝基烷基或硫代烷氧基烷基)；(3)烷氧基(例如，全氟烷氧基)；(4)烷基亚磺酰基；(5)芳基；(6)氨基；(7)烷芳基；(8)叠氮基；(9)环烷基；(10)烷环烷基；(11)卤素；(12)杂环基(例如，杂芳基)；(13)(杂环基)氧；(14)羟基；(15)硝基；(16)硫代烷氧基；(17)-(CH2)qCO2RA，其中q为0-4的整数，并且RA选自：(a)烷基，(b)芳基，(c)氢，和(d)烷芳基；(18)-(CH2)qCONRBRC，其中q为0-4的整数，并且其中RB和RC独立地选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基；(19)-(CH2)qSO2RD，其中q为0-4的整数，并且其中RD选自：(a)烷基，(b)芳基，和(c)烷芳基；(20)-(CH2)qSO2NRERF，其中q为0-4的整数，并且其中每个RE和RF独立地选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基；(21)巯基；(22)芳基氧；(23)环烷氧基；(24)芳基烷氧基；(25)烷杂环基(例如，烷杂芳基)；(26)甲硅烷基；(27)氰基；和(28)-S(O)RH，其中RH选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基和(d)烷芳基。在一些实施方案中，这些基团中的每个可如本文所述被进一步取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可被氧基进一步取代，以提供各个芳酰基和(杂环基)酰基取代基。另外，当芳基存在于本公开的生物可逆的基团中时，其可被与如本文所定义的与缀合部分、亲水性功能基团或辅助部分结合的酯、硫酯或二硫基团取代。
术语“辅助部分”是指任何部分，包括但不限于：小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合，其可与本文公开的核酸构建体缀合。一般而言，但并非总是如此，“辅助部分”通过与生物可逆的基团上存在的一个或多个缀合基团形成一个或多个共价键，而与本文公开的核酸构建体连接或结合。然而，在替代的实施方案中，“辅助部分”可通过与生物可逆的基团上存在的除缀合基团外的核酸构建体的任何部分，如与核苷酸糖分子的的2'、3'或5'位置或核苷酸碱基的任何部分上形成一个或多个共价键而与本文公开的核酸构建体连接或结合。尽管特定辅助部分的名称可指游离分子，应理解，这样的游离分子结合有核酸构建体。本领域技术人员容易理解特定辅助部分与核酸构建体的合适的结合点。
如本文所用，术语“叠氮基”表示N3基团。
如本文所用，术语“生物可逆的基团”表示包含功能基团的部分，所述功能基团可经胞内主动切割，例如，通过一种或多种细胞内酶(例如，细胞内硫酯酶或细胞内还原酶)作用，或者可经胞内被动切割，如通过将基团暴露于细胞内环境或细胞内存在的条件(例如，pH、还原性或氧化性环境，或与细胞内物质如谷胱甘肽的反应)。示例性的生物可逆的基团包括硫酯或二硫化物。
如本文所用，术语“碳烯”表示功能基团，其具有6价电子和结构＝C:或-CRB:的二价碳物质，其中RB选自H、任选取代的C1-12烷基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C1-12烷C6-12芳基或任选取代的羰基；并且C为具有不为共价键的一部分的2个电子的碳。两个电子可为配对的(例如，单重态碳烯)或未配对的(例如，三重态碳烯)。
如本文所用，术语“碳环”是指任选取代的C3-C12单环、二环或三环结构，其中环(其可为芳香族或非芳香族的)通过碳原子形成。碳环结构包括环烷基、环烯基和芳基基团。
如本文所用，术语“碳水化合物”表示包含一个或多个单糖单元的化合物，所述单糖单元包含至少5个碳原子(其可为线性的、支链的或环形的)，每个碳原子结合有氧、氮或硫原子。因此，术语“碳水化合物”包括单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖和寡糖，其含有约4-9个单糖单元)和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5-6糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元的糖(例如，C5-6糖)。
如本文所用，“羰基”表示C(O)基团。包含“羰基”的功能基团的实例包括酯、酮、醛、酐、酰基氯化物、酰胺、羧酸和羧化物。
如本文所用，术语“偶联反应的组分”表示能够参与偶联反应的分子物质。偶联反应的组分包括氢化硅烷(hydridosilane)、烯烃和炔烃。
如本文所用，术语“环加成反应的组分”表示能够参与环加成反应的分子物质。在其中键形成包含[4n+2]π电子(其中n为1)的环加成反应中，一种组分将提供2π电子，并且另一种组分将提供4π电子。提供2π电子的环加成反应的代表性的组分包括烯烃和炔烃。提供4π电子的环加成反应的代表性的组分包括1,3-二烯、α,β-不饱和羰基及叠氮化物。
如本文所用，术语“缀合部分”表示功能基团，其在合适的条件下能够与另一辅助部分(例如，功能基团，即亲核试剂、亲电试剂、环加成反应中的组分或偶联反应中的组分)形成一个或多个共价键。这样的基团的实例在本文中有提供。
如本文所用，术语“偶联反应”表示两种组分的反应，其中一种组分包含非极性σ键如Si-H或C-H，并且第二组分包含π键如烯烃或炔烃，所述反应造成在π键中净加入σ键从而形成C-H、Si-C或C-C键或者在两种组分键形成单个共价键。一种偶联反应为在烯烃中加入Si-H(也称为氢化硅烷化)。其他偶联反应包括Stille偶联、Suzuki偶联、Sonogashira偶联、Hiyama偶联和Heck反应。催化剂可用于促进偶联反应。典型的催化剂为包括Pt(0)、Pt(II)或Pt(IV)的那些。
如本文所用，术语“环加成反应”表示两种组分的反应，其中当没有活化，通过化学催化剂活化，或使用热能活化，并且n为1、2或3时，[4n+2]个π电子参与键形成。环加成反应也是两种组分的反应，其中涉及[4n]个π电子，存在光化学活化，并且n为1、2或3。可取地，[4n+2]个π电子参与键形成，并且n＝1。代表性的环加成反应包括烯烃与1,3-二烯的反应(Diels-Alder反应)、烯烃与α,β-不饱和的羰基的反应(不对称Diels-Alder反应)和炔烃与叠氮化物的反应(Hüisgen环加成)。
除非另有说明，如本文所用的术语“环烷基”表示单价饱和的或不饱和的3-8个碳的非芳环烃基，并且示例为环丙级、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、二环[2.2.1.]庚基等。当环烷基包含一个碳-碳双键时，环烷基可被称为“环烯基”。示例性的环烯基基团包括环戊烯基、环己烯基等。本公开的环烷基基团可被如下基团任选取代：(1)酰基(例如，羧基醛)；(2)烷基(例如，烷氧基烷基、烷基亚磺酰基烷基、氨基烷基、叠氮基烷基、(羧基醛)烷基、卤代烷基(例如，全氟烷基)、羟基烷基、硝基烷基或硫代烷氧基烷基)；(3)烷氧基(例如，全氟烷氧基)；(4)烷基亚磺酰基；(5)芳基；(6)氨基；(7)烷芳基；(8)叠氮基；(9)环烷基；(10)烷环烷基；(11)卤素；(12)杂环基(例如，杂芳基)；(13)(杂环基)氧；(14)羟基；(15)硝基；(16)硫代烷氧基；(17)-(CH2)qCO2RA，其中q为0-4的整数，并且RA选自：(a)烷基，(b)芳基，(c)氢，和(d)烷芳基；(18)-(CH2)qCONRBRC，其中q为0-4的整数，并且其中RB和RC独立地选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基；(19)-(CH2)qSO2RD，其中q为0-4的整数，并且其中RD选自：(a)烷基，(b)芳基，和(c)烷芳基；(20)-(CH2)qSO2NRERF，其中q为0-4的整数，并且其中每个RE和RF独立地选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基；(21)巯基；(22)芳基氧；(23)环烷氧基；(24)芳基烷氧基；(25)烷杂环基(例如，烷杂芳基)；(26)氧；(27)甲硅烷基；(28)氰基；(29)-S(O)RH，其中RH选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基。在一些实施方案中，这些基团中的每个可如本文所述被进一步取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可被氧基进一步取代，从而提供各自的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文所用，术语“亲电试剂”或“亲电基团”表示能与富含电子的中心结合，并能够从一种或多种亲核试剂接受电子对，从而形成一个或多个共价键的功能基团。亲电试剂包括但不限于：阳离子；极化的中性分子；氮烯、氮烯前体如叠氮化物；碳烯；碳烯前体；活化的硅中心；活化的羰基；烷基卤化物；烷基假卤化物；环氧化合物；缺乏电子的芳基；活化的磷中心；和活化的硫中心。通常遇到的亲电试剂包括诸如H+和NO+的阳离子、极化的中性分子如HCl、烷基卤化物、酰基卤化物、含有羰基的化合物如醛，以及与良好的离去基团连接的原子，如甲磺酸、三氟甲磺酸酯和甲苯磺酸酯。
如本文所用，术语“内体逃逸部分”表示促进胞内内容物释放或允许分子从内部细胞区室如核内体逃逸的部分。
如本文所用的术语“卤代”表示选自溴、氯、碘和氟的卤素。
如本文所用，术语“卤代烷基”表示被卤素基团(即F、Cl、Br或I)取代的如本文所定义的烷基。卤代烷基可被1、2、3个，或在两个或多个碳的烷基情况下4个卤原子取代。卤代烷基包括全氟烷基。在一些实施方案中，卤代烷基可进一步被1、2、3或4个如本文针对烷基定义的取代基取代。
如本文所用，术语“杂芳基”表示如本文所定义的杂环基的子集，其为芳香族基团：即它们在单环或多环环系中含有4n+2个π电子。在一个实施方案中，杂芳基被1、2、3或4个如针对杂环基所定义的取代基取代。
除非另有说明，如本文所用的术语“杂环基”表示5、6或7元环，其含有1个、2个、3个或4个独立地选自包含氮、氧和硫的组的杂原子。5元环具有0-2个双键，并且6和7元环具有0-3个双键。某些杂环基基团包含2-9个碳原子。其他这样的基团可包含多达12个碳原子。术语“杂环基”还表示具有桥连的多环结构的杂环化合物，其中一个或多个碳原子和/或杂原子桥连两个非邻近的单环成员如喹啉环基。术语“杂环基”包括双环、三环和四环基团，其中上述杂环中的任一个与1个、2个或3个碳环，例如，芳环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环或另一个单环杂环如吲哚基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基等稠合。稠合的杂环基的实例包括莨菪烷和1,2,3,5,8,8a-六氢吲哚嗪。杂环基团包括吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、哌啶基、高哌啶基、吡嗪基、哌嗪基、嘧啶基、哒嗪基、恶唑基、恶唑烷基、异恶唑基、异恶唑烷基(isoxazolidiniyl)、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑基、四氢噻唑基、异噻唑基、异四氢噻唑基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并恶唑基、呋喃基、噻吩基、四氢噻唑基、异噻唑基、异吲唑基、三唑基、四唑基、恶二唑基、嘌呤基、噻二唑基(例如，1,3,4-噻二唑)、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、二氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、吡喃基、二氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基等。其他示例性的杂环基包括：2,3,4,5-四氢-2-氧-恶唑基；2,3-二氢-2-氧-1H-咪唑基；2,3,4,5-四氢-5-氧-1H-吡唑基(例如，2,3,4,5-四氢-2-苯基-5-氧-1H-吡唑基)；2,3,4,5-四氢-2,4-二氧-1H-咪唑基(例如，2,3,4,5-四氢-2,4-二氧-5-甲基-5-苯基-1H-咪唑基)；2,3-二氢-2-硫氧-1,3,4-恶二唑基(例如，2,3-二氢-2-硫氧-5-苯基-1,3,4-恶二唑基)；4,5-二氢-5-氧-1H-三唑基(例如，4,5-二氢-3-甲基-4-氨基5-氧-1H-三唑基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧吡啶基(例如，1,2,3,4-四氢-2,4-二氧-3,3-二乙基吡啶基)；2,6-二氧-哌啶基(例如，2,6-二氧-3-乙基-3-苯基哌啶基)；1,6-二氢-6-氧嘧啶基；1,6-二氢-4-氧嘧啶基(例如，2-(甲基硫代)-1,6-二氢-4-氧-5-甲基嘧啶-1-基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧嘧啶基(例如，1,2,3,4-四氢-2,4-二氧-3-乙基嘧啶基)；1,6-二氢-6-氧-哒嗪基(例如，1,6-二氢-6-氧-3-乙基哒嗪基)；1,6-二氢-6-氧-1,2,4-三嗪基(例如，1,6-二氢-5-异丙基-6-氧-1,2,4-三嗪基)；2,3-二氢-2-氧-1H-吲哚基(例如，3,3-二甲基-2,3-二氢-2-氧-1H-吲哚基和2,3-二氢-2-氧-3,3’-螺丙烷-1H-吲哚-1-基)；1,3-二氢-1-氧-2H-异吲哚基；1,3-二氢-1,3-二氧-2H-异吲哚基；1H-苯并吡唑基(例如，1-(乙氧羰基)-1H-苯并吡唑基)；2,3-二氢-2-氧-1H-苯并咪唑基(例如，3-乙基-2,3-二氢-2-氧-1H-苯并咪唑基)；2,3-二氢-2-氧-苯并恶唑基(例如，5-氯-2,3-二氢-2-氧-苯并恶唑基)；2,3-二氢-2-氧-苯并恶唑基；2-氧-2H-苯并吡喃基；1,4-苯并二氧己环基；1,3-苯并二氧己环基；2,3-二氢-3-氧,4H-1,3-苯并噻嗪基；3,4-二氢-4-氧-3H-喹唑啉基(例如，2-甲基-3,4-二氢-4-氧-3H-喹唑啉基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧-3H-喹唑啉基(例如，1-乙基-1,2,3,4-四氢-2,4-二氧-3H-喹唑啉基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-7H-嘌呤基(例如，1,2,3,6-四氢-1,3-二甲基-2,6-二氧-7H–嘌呤基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧-1H–嘌呤基(例如，1,2,3,6-四氢-3,7-二甲基-2,6-二氧-1H–嘌呤基)；2-氧苯并[c,d]吲哚基；1,1-二氧-2H-萘[1,8-c,d]异噻唑基和1,8-二甲酰胺亚萘基。杂环基团还包含式所示的基团，其中
F′选自-CH2-、-CH2O-和-O-，并且G′选自-C(O)-和-(C(R’)(R”))v-，其中每个R’和R”独立地选自氢或具有1-4个碳原子的烷基，且v为1-3，并且包括诸如1,3-苯并二氧杂环戊烯基(1,3-benzodioxolyl)、1,4-苯并二氧己环基等的基团。本文中提及的任何杂环基基团可被独立地选自如下的1个、2个、3个、4个或5个取代基任选取代：(1)酰基(例如，羧基醛)；(2)烷基(例如，烷氧基烷基、烷基亚磺酰基烷基、氨基烷基、叠氮基烷基、(羧基醛)烷基、卤代烷基(例如，全氟烷基)、羟基烷基、硝基烷基或硫代烷氧基烷基)；(3)烷氧基(例如，全氟烷氧基)；(4)烷基亚磺酰基；(5)芳基；(6)氨基；(7)烷芳基；(8)叠氮基；(9)环烷基；(10)烷环烷基；(11)卤素；(12)杂环基(例如，杂芳基)；(13)(杂环基)氧；(14)羟基；(15)硝基；(16)硫代烷氧基；(17)-(CH2)qCO2RA，其中q为0-4的整数，并且RA选自：(a)烷基，(b)芳基，(c)氢和(d)烷芳基；(18)-(CH2)qCONRBRC，其中q为0-4的整数，并且其中RB和RC独立地选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基和(d)烷芳基；(19)-(CH2)qSO2RD，其中q为0-4的整数，并且其中RD选自：(a)烷基，(b)芳基，和(c)烷芳基；(20)-(CH2)qSO2NRERF，其中q为0-4的整数，并且其中每个RE和RF独立地选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基；(21)巯基；(22)芳基氧；(23)环烷氧基；(24)芳基烷氧基；(25)烷杂环基(例如，烷杂芳基)；(26)氧；和(27)(杂环基)亚氨基；(28)甲硅烷基；(29)氰基；和(30)-S(O)RH，其中RH选自：(a)氢，(b)烷基，(c)芳基，和(d)烷芳基。在一些实施方案中，这些基团中的每个可如本文所述被进一步取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可被氧基进一步取代，以提供各自的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。另外，当杂环基存在于本公开的生物可逆的基团中时，其可被与如本文所定义的缀合部分、亲水性功能基团或辅助部分结合的酯、硫酯或二硫基团取代。
如本文所用，术语“亲水性功能基团”表示能赋予对水的亲和力并增加烷基部分在水中的溶解度的部分。亲水性功能基团可为离子型的或非离子型的，并且包括带正电荷的部分、带负电荷的部分，和/或可以参与氢键相互作用。示例性的亲水性功能基团包括羟基、氨基、羧基、羰基、巯基、磷酸酯(例如，单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯)、聚亚烷基氧化物(例如，聚乙二醇)和杂环基。
如本文所用，术语“羟基(hydroxyl)”是指-OH。
如本文所用，术语“羟基(hydroxy)”是指存在的羟基。
如本文所用，术语“亚胺”表示具有碳和氮之间的双键的基团，其可表示为“C＝N”。在一个具体实施方案中，当质子对于亚胺功能基团的为α位时，亚胺也可为互变异构的烯胺形式。一类亚胺键为腙键，其中亚胺键的氮与三价氮(例如，C＝N-N(R)2)共价结合。在一些实施方案中，每个R可独立地为H、OH、任选取代的C1-6烷氧基或任选取代的C1-6烷基。
如本文所用，术语“氮烯”表示具有6价电子和结构＝N:或–NRA:的单价氮物质，其中RA选自任选取代的C1-12烷基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C1-12烷C6-12芳基或任选取代的羰基；并且N为具有4价电子(其中的至少两个为配对的)的氮。剩下的两个电子可为配对的(即单重态氮烯)或未配对的(即三重态氮烯)。
如本文所用，术语“硝基”表示-NO2。
“非天然存在的氨基酸”为非天然产生的或未在哺乳动物中发现的氨基酸。
“非极性的σ键”是指具有根据鲍林标度测得的电负值(差异小于或等于1.0个单位)的两个元素间的共价键。非极性σ键的非限制性实例包括C-C、C-H、Si-H、Si-C、C-Cl、C-Br、C-I、C-B和C-Sn键。
如本文所用，术语“核苷酸碱基”表示在核苷酸或核苷的糖部分的1’位置处的含氮杂环。核苷酸碱基可为未修饰的或修饰的。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核苷酸碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷酸碱基包括其他合成的和天然的核苷酸碱基如5-甲基胞嘧啶(5-me-C或m5c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤及鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤及鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-叠氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-二氮杂鸟嘌呤和7-二氮杂腺嘌呤和3-二氮杂鸟嘌呤和3-二氮杂腺嘌呤。其他的核苷酸碱基包括美国专利第3,687,808号中公开的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些；Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中公开的那些；和Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,第289302页(Crooke et al.,ed.,CRC Press,1993)中公开的那些。某些核苷酸碱基对增加本公开的聚合化合物，包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶的结合亲和力特别有用。已显示5-甲基胞嘧啶取代能将核酸双链稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi et al.,eds.,Antisense Researchand Applications 1993,CRC Press,Boca Raton,第276-278页)。在特定的实施方案中，这些可与2’-O-甲氧乙基糖修饰组合。教导这些修饰的核苷酸碱基以及其他修饰的核苷酸碱基中某些的制备的美国专利包括但不限于，上述的美国专利第3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；和5,681,941号。为了本公开的目的，如本文所用的“修饰的核苷酸碱基”还表示天然的或非天然的包含如本文所述的一个或多个保护基团的核苷酸碱基。
如本文所用，术语“亲核试剂”或“亲核功能基团”表示通过从电子对或π键捐赠电子而参与形成共价键的任选取代的功能基团。亲核试剂可选自烯烃、炔烃、芳基、杂芳基、肼基、羟基、苯氧基、氨基、烷基氨基、苯胺基(anilido)、巯基和硫代苯氧基。
如本文所用，术语“核苷”表示核苷酸碱基-糖组合。核苷的核苷酸碱基部分通常为杂环碱基。如本文所用的术语“核苷酸”是指还包含与核苷的糖部分共价连接的核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团如磷酸基团的核苷。对于包含五呋喃糖基糖核苷酸间桥连基团或末端基团如磷酸基团的那些核苷，可与糖的2’、3’或5’羟基部分连接。糖可为或可以不为天然存在的糖，例如，核糖或脱氧核糖，并且其可为天然存在的糖的修饰形式如2’修饰的核糖。示例性的经修饰的糖包括2-位置糖修饰，其中2-OH被诸如H、OR、R、卤素(例如，F)、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R为烷基部分。经修饰的糖还包括，例如，非核糖的糖，如甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4-硫代核糖和其他糖、杂环化合物或碳环。核苷酸还包括锁核酸(LNA)、肽核酸、甘油核酸、吗啉代核酸和苏糖核酸。
在其他实施方案中，天然的糖磷酸二酯骨架可被具有通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元的蛋白核苷酸(PNA)骨架替换。经设计为更耐核酸酶降解的多核苷酸的其他类型修饰，描述于美国专利第6,900,540和6,900,301号，其通过引用并入本文。
如本文所用，术语“多核苷酸”表示通过核苷酸间桥连基团共价结合在一起的两个或更多个核苷酸和/或核苷。多核苷酸可为线性的或环形的。此外，为了本公开的目的，术语“多核苷酸”涉及寡核苷酸和较长的序列，以及核苷酸的混合物，例如，DNA和RNA的混合物或者RNA和2’修饰的RNA的混合物。术语“多核苷酸”包括由一条或多条链组成的多核苷酸，除非另有说明。
如本文所用，术语“核苷酸间桥连基团”表示将核苷酸和/或核苷共价连接在一起的基团。“末端核苷酸”基团位于核苷酸的5’、3’或2’端。末端核苷酸基团可能或可能不能够与其他核苷或核苷酸连接。示例性的核苷酸间桥连基团和末端核苷酸基团包括磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯(例如，磷酸甲酯)、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、酰胺、亚甲基甲基亚氨基、甲乙缩醛(formacetal)、硫代甲乙缩醛、磺酰基、胍和甲硫脲。其他在本领域是已知的，参见，例如，Current Medicinal Chemistry,2001,Vol.8,No.10,1157。应理解核苷酸间桥连基团与两个核苷结合，并且末端核苷酸基团与单个核苷结合，例如，在3’或5’端。
如本文所用，术语“氧代”表示＝O。
如本文所用，术语“肽”表示通过肽键连接的2个至约50个氨基酸残基。本文使用的术语“多肽”表示通过肽键连接的50个或更多个氨基酸链。此外，为了本公开的目的，在所有情况下，术语“多肽”和术语“蛋白”在本文中可互换使用，除非是为了用于例如，天然存在的或改造的蛋白。可使用本文提供的方法和组合物的范围内的多种多肽。在某个实施方案中，多肽包括抗体或含有抗原结合位点的抗体片段。合成制备的多肽可包括在天然下不由DNA编码的氨基酸替代(例如，非天然存在的或非天然的氨基酸)。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有与半胱氨酸的硫原子结合的乙酰基氨甲基的氨基酸、PEG化的氨基酸、式NH2(CH2)nCOOH(其中n为2-6)所示的ω氨基酸、中性非极性氨基酸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。
如本文所用，术语“Ph”表示苯基。
如本文所用，术语“光促活化”或“光解”表示通过用光来照射该反应以促进或启动化学反应。适于光促活化的光波长范围为200-500nm，并且包括200-260nm和300-460nm范围的波长。其他可用的范围包括200-230nm、200-250nm、200-275nm、200-300nm、200-330nm、200-350nm、200-375nm、200-400nm、200-430nm、200-450nm、200-475nm、300-330nm、300-350nm、300-375nm、300-400nm、300-430nm、300-450nm、300-475nm和300-500nm。
如本文所用，术语“保护基团”表示旨在于化学合成(例如，多核苷酸合成)期间保护功能基团(例如，羟基、氨基或羰基)免于参与一种或多种不需要的反应的基团。如本文所用，术语“O-保护基团”表示旨在于化学合成期间保护含氧的(例如，苯酚、羟基或羰基)基团免于参与一种或多种不需要的反应的基团。如本文所用，术语“N-保护基团”表示旨在于化学合成期间保护含氮的(例如，氨基或肼)基团免于参与一种或多种不需要的反应的基团。通常使用的O-和N-保护基团公开于Greene,“Protective group in Organic Synthesis,”第3版(John Wiley&Sons,New York,1999)，其通过引用并入本文中。示例性的O-和N-保护基团包括：酰基、芳酰基或氨甲酰基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、酞酰基、邻硝基苯氧乙酰基、α-氯代丁酰基、苯甲酰基、4-氯代苯甲酰基、4-溴代苯甲酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三-异丙基甲硅烷基氧甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、异丁酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、二甲基甲脒和4-硝基苯甲酰基。
用于保护含有羰基的基团的示例性O-保护基团包括但不限于：缩醛；缩羰酯、1,3-二噻烷、1,3-二氧己环、1,3-二氧戊环和1,3-二硫戊环(1,3-dithioane)。
其他O-保护基团包括但不限于：取代的烷基、芳基和烷芳基醚(例如，三苯甲基；甲基硫代甲基；甲氧甲基；苄氧甲基；硅氧甲基；2,2,2,-三氯乙氧甲基；四氢吡喃基；四氢呋喃基；乙氧乙基；1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基；2-三甲基甲硅烷基乙基；叔丁基醚；对氯苯基、对甲氧苯基、对硝基苯基、苄基、对甲氧苄基和硝基苄基)；甲硅烷基醚(例如，三甲基甲硅烷基；三乙基甲硅烷基；三异丙基甲硅烷基；二甲基异丙基甲硅烷基；叔丁基二甲基甲硅烷基；叔丁基二苯基甲硅烷基；三苄基甲硅烷基；三苯基甲硅烷基；和二苯基甲基甲硅烷基)；碳酸酯(例如，甲基、甲氧基甲基、9-芴基甲基；乙基；2,2,2-三氯乙基；2-(三甲基甲硅烷基)乙基；乙烯基、烯丙基、硝基苯基；苄基；甲氧基苄基；3,4-二甲氧基苄基；和硝基苄基)。
其他N-保护基团包括但不限于手性助剂，如经保护的或未经保护的D、L或D,L-氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；含有磺酰基的基团如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；形成氨基甲酸酯的基团，如苄氧羰基、对氯代苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、对溴代苄氧羰基、3,4-二甲氧基苄氧羰基、3,5-二甲氧基苄基氧羰基、2,4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧羰基、1-(对二苯基基)-1-甲基乙氧羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧羰基、二苯甲基氧(benzhydryloxy)羰基、叔丁氧羰基、二异丙基甲氧羰基、异丙基氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙基氧羰基、2,2,2,-三氯乙氧羰基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲氧羰基、环戊氧羰基、金刚烷氧羰基、环己基氧羰基、苯基硫代羰基等，烷芳基基团如苄基、三苯甲基、苄氧甲基等，和甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基等。可用的N-保护基团为甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、丙氨酰基、苯磺酰基、苄基、叔丁氧羰基(Boc)和苄氧羰基(Cbz)。
如本文使用，术语“对象”表示人或非人的动物(例如，哺乳动物)。
如本文所用，术语“靶向部分”表示特异性结合或反应性地与和给定靶细胞群相关的受体或其他接受性部分结合或复合的任何部分。
如本文所用，术语“治疗有效剂量”表示根据本公开进行改善、治疗或至少部分阻止疾病或病症的症状(例如，抑制细胞增殖)所需的siRNA或多核苷酸的量。对该应用有效的量当然取决于对象的疾病的严重性和体重和一般状况。通常，体外使用的剂量能可在体内给予药物组合物的量上提供有用的指导，并且可使用动物模型来测定治疗特定病症的有效剂量。
如本文所用，术语“巯基”表示–SH基团。
如本文所用，术语“病症”应理解为与术语“疾病”、“症状”和“病况”(如在医疗条件下的)通常同意，并且可与之互换使用，它们均反映了对象出现的或其一部分的损害正常功能的异常状况，并且通常显示为不同的病征和症状。
如提及对象中的病症术语所用的“治疗”，应理解为是指通过向对象给予治疗剂(例如，本公开的核酸构建体)来减少病症的至少一种症状。
如本文和所附的权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数参照物，除非上下文明确另有所述。因此，例如，提及“一个PTD”包括多个这样的PTD，并且提及“所述细胞”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种细胞，等等。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似或等同于本文描述的那些的方法和材料可用于实施所公开的方法和组合物，在本文中描述了示例性的方法、装置和材料。
同样，使用“或(or)”是指“和/或(and/or)”，除非另有说明。类似地，“包含(comprise/comprises/comprising)”、“包括(include/includes/including)”可互换使用，并且不旨在为限制性的。
还应理解在不同实施方案的描述使用术语“包含(comprising)”时，本领域技术人员应理解在一些特定的情况下，实施方案可替代性地使用语言“基本上由…组成(consisting essentially of)”或“由…组成(consisting of)”描述。
提供上述的和整个文本中的出版物仅仅是由于他们的公开先于本申请的申请日。本文中的内容不应理解为承认由于在先的公开发明人没有权利先于这样的公布。本公开中引用的出版物的所有公开内容被完整并入本文中。但是，为了本公开的目的，任何存在于出版物或者本领域与本公开中明确定义的任何术语相同的任何术语，本公开中存在的术语的定义将在所有方面控制。
附图说明
图1显示了制备和纯化本公开的核酸构建体的合成方案。
图2A-2L提供了可用于制备本公开的多核苷酸构建体的化学合成的中间物和核苷酸构建体的结构和分析数据。
图3显示了包含tBu-SATE生物可逆的基团的多核苷酸构建体定量转化为野生型siRNA。该转化与包含不含有可切割功能基团的磷酸三酯的构建体相反。
图4表明可通过使用本公开的多核苷酸构建体沉默GFP表达，并且这一结果与野生型siRNA相当。
图5-6表明可使用本公开的多核苷酸构建体，在体外(图5)和体内(图6)沉默荧光素酶表达。
图7显示了本公开的包含6个肽转导结构域(PTD)的示例性多核苷酸构建体，并且表明这些多核苷酸构建体可导致细胞中GFP表达的降低。
图8表明本公开的双链多核苷酸构建体，可使用在10％非变性凝胶中的银染(上图)；或通过使用SDS-PAGE凝胶和溴化乙锭染色(下图)定量测量。
图9-10显示了使用本公开的在随从链和引导链上不同位点处的具有不同数目的生物可逆的基团的多核苷酸构建体的杂交研究的概述。
图11显示了纯化本公开的多核苷酸构建体的方法。
图12表明多个PTD辅助部分可与本公开的核酸构建体有效缀合。
图13-14表明本公开的与生物可逆的基团缀合的具有PTD辅助部分的多核苷酸构建体允许将多核苷酸经细胞内有效地递送至H1299细胞中。这些多核苷酸构建体显示出能在200nM至500nM的浓度范围内在体外降低GFP的表达。
图15显示了连接子长度对针对具有不同的生物可逆的基团的6种不同多核苷酸构建体的RNAi反应的影响。
发明详述
由于细胞质膜的选择性渗透，递送某些生物活性试剂至细胞内部的能力存在着问题。细胞的质膜形成了屏障，其将细胞内摄取的分子局限于足够非极性且尺寸小于约500道尔顿的那些。先前的促进蛋白的细胞内化的努力集中于将蛋白与受体配体(Ng et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:10706-11,2002)融合，或通过将其包装在锁住的脂质体载体(Abu-Amer et al.,J.Biol.Chem.276:30499-503,2001)。然而，这些技术可造成不良的细胞摄取和进入内吞通道的细胞内隔离。由于它们的负电荷和约14,000道尔顿的较大的尺寸，siRNA的递送是哺乳动物包括人中的重要挑战。然而，带正电荷的肽和蛋白已引起了多核苷酸递送的进展。例如，将肽转导结构域(PTD)与核酸连接已在多核苷酸递送中提供了一些进展。然而，甚至在这些情况下，siRNA和PTD分别的负电荷和正电荷常常彼此中和，从而显著降低这些核酸构建体的摄取。
本公开提供了包含一个或多个生物可逆的基团的核酸构建体。本公开证明相对大的部分如肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合，可与连有核苷酸间桥连基团的生物可逆的基团连接，而不影响生物可逆的基团被经胞内切割的能力。本公开还提供了核酸构建体，其包含具有疏水或亲水性功能基团和/或缀合部分的生物可逆的基团，其中这些缀合部分允许将肽、多肽、小分子、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团结合。本公开还提供了包含一个或多个生物可逆的基团的基于核苷酸的核酸构建体，所述生物可逆的基团含有一个或多个疏水或亲水性功能基团和/或一个或多个缀合部分,其中所述缀合部分允许辅助部分如，肽、多肽、小分子、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合与核苷酸结合。在某个实施方案中，本文公开的核酸构建体包含某个数目的生物可逆的基团，以便减少构建体的总负电荷，从而允许或促进构建体被细胞摄取。本文描述的核酸构建体可允许或促进多核苷酸自身或与结合的辅助部分如小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合连接的多核苷酸的细胞内运输。细胞内酶(例如，细胞内硫酯酶)作用或暴露于细胞内环境可引起从多核苷酸切割辅助部分，从而允许释放辅助部分以及解除多核苷酸掩蔽。然后，可解除掩蔽的多核苷酸，例如，开始反义或RNAi介导的反应。此外，本公开的核酸构建体还允许或促进多核苷酸或与结合的辅助部分如，小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合连接的多核苷酸的细胞内递送，而不需要载体如脂质体或阳离子型脂质。每种特征在本文中有进一步的描述。
本公开提供了通过保护/中和与带负电荷的多核苷酸相关的电荷，以及任选向分子如阳离子型肽、靶向部分和/或内体逃逸部分添加其他功能，促进和改善核酸分子的细胞摄取的方法和组合物。在具体的实施方案中，本公开的组合物通过生成具有正电荷的核酸构建体可促进核酸摄取。
本公开提供了递送用于选择性治疗人类病症和用于促进研究的序列特异性多核苷酸的组合物和方法。本公开的组合物和方法选择性递送多核苷酸(包括siRNA、RNA和DNA)至对象和细胞，而无当前的核酸递送方法的缺点。本公开提供了组合物和方法，其克服了使得RNAi构建体难以递送至细胞或使得构建体不可被递送的大小和电荷限制。通过可逆地中和核酸(例如，dsRNA)的负电荷，包含根据本公开的磷酸三酯和/或硫代磷酸酯生物可逆的保护基团的核酸构建体可在体外和体内递送核酸至细胞。
本公开提供了包含带电的中和部分(例如，磷酸三酯和/或硫代磷酸酯保护基团)的核酸构建体。构建体还可包含用于细胞转染和细胞调节的辅助部分。这样的辅助部分可包括、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合。
如本文所述，向核酸中添加一种或多种可去除的(例如，可逆结合的)带电中和部分能有效促进细胞转染。不管序列组成如何，任何核酸均可被修饰。因此，本公开不限于任何特定的序列(即任何特定的siRNA、dsRNA、DNA等)。
在一些实施方案中，本公开提供了具有一个或多个生物可逆的部分的核酸构建体，所述生物可逆的部分有助于增加细胞膜渗透和耐受外切酶和内切酶降解的化学和生物物理特性。本公开还提供了用于合成本文公开的核酸构建体的试剂，例如，亚磷酰胺试剂。此外，这些生物可逆的基团在合成过程中是稳定的。
在细胞中，可通过酶(例如，内源性羧酸酯酶和硫代酯酶)作用或通过暴露于细胞内条件(例如，pH和氧化或还原环境)或反应物(例如，谷胱甘肽或其他游离巯基)来去除生物可逆的部分，从而产生能够与特定内源性核酸杂交和/或对特定内源性核酸具有亲和力的、具有生物活性的多核苷酸化合物。
生物可逆的部分可与合成的DNA或RNA的反义多核苷酸或者靶标序列的互补序列的混合分子一起使用，所述靶标序列属于它们专门设计用于封闭或下调其表达的基因或mRNA。这些抑制性多核苷酸可针对靶标mRNA序列或者针对靶标DNA序列，并与和它们互补的核酸杂交从而抑制转录或翻译。因此，本文公开的核酸构建体可有效封闭或下调基因表达。
本公开的核酸构建体也可针对某些双悬链(bicatenary)DNA区(同型嘌呤/同型嘧啶序列或富含嘌呤/嘧啶的序列)，并因此形成三螺旋。特定序列处形成三螺旋可封闭蛋白因子的相互作用，所述蛋白因子能调节或者控制基因表达和/或可促进待引入至特定核酸位点的不可逆损伤(如果所产生的多核苷酸被制备成具有反应性功能基团)。
本公开提供了由多核苷酸组成的核酸构建体(“多核苷酸构建体”)，所述多核苷酸具有一个或多个与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团结合的辅助部分。这样的辅助部分的实例包括小分子、缀合部分、亲水性功能基团、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合。这样的辅助部分可通过生物可逆的基团与多核苷酸结合，以便辅助部分在被细胞摄取时从多核苷酸释放出来。生物可逆的基团也可能能够经历单独的反应(例如在分子内)，以留下未修饰的核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团。虽然可采用不同的糖和骨架，如本文提供给的核苷酸的定义中所述，多核苷酸通常采用核糖、脱氧核糖或LNA糖，和磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间桥连基团。还包括单个多核苷酸中这些糖和桥连基团的混合物。
本文描述的多核苷酸构建体的特征为生物可逆的基团，其可选择性经胞内被切割(例如，通过暴露至被动环境、酶作用或其他反应物)，从而促进多核苷酸至细胞的细胞内递送。示例性的生物可逆的基团包括二硫键、酯和硫酯。
例如，本文描述的多核苷酸构建体可包含可被细胞内硫酯酶切割的部分(例如，硫酯功能基团)。在进入细胞后，这些酶可选择性切割硫酯基团(包括如本文描述的式(I)所示的部分)，以去除核酸的掩蔽。硫酯基团如式(I)还可提供有用的处理，借此用诸如PTD和其他缀合物的基团或用能改良核酸的物理化学特性的基团(例如，亲水性基团如羟基(-OH))来功能化核酸。所述策略可容易地推广至多种结构和功能上不同的核酸，以允许在不使用单独递送试剂的情况下的靶向细胞递送。
本文描述的多核苷酸构建体可包含例如，1-40个独立的生物可逆的基团。例如，本文公开的多核苷酸构建体可包含2-30、2-25、2-20、5-15、5-10或2-5个独立的生物可逆的基团。在具体的实施方案中，不多于75％的组成性核苷酸包含生物可逆的基团(例如，不多于50％、55％、60％、65％、70％或75％包含生物可逆的基团)。在另一个实施方案中，多达90％可具有生物可逆的基团。在又一个实施方案中，不多于一半的生物可逆的基团包含疏水性末端，例如，烷基基团。本文公开的多核苷酸构建体的特征可为生物可逆的基团的任意组合，例如，其包含缀合部分、亲水性功能基团、肽、多肽、小分子、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合。多核苷酸构建体通常为多达150个核苷酸的长度。示例性的大小为10-100、10-75、10-50或10-25个核苷酸的长度。
在某个实施方案中，多核苷酸构建体选自：
(a)多核苷酸，其包含选自肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合的组分(i)，其中组分(i)通过与核苷酸间桥连基团结合的生物可逆的基团与多核苷酸连接；
(b)多核苷酸，其包含选自肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合的至少一种组分(i)，以及至少一种第二组分(ii)：包含亲水性功能基团的生物可逆的基团、包含缀合部分的生物可逆的基团、或包含缀合部分和亲水性基团的生物可逆的基团，其中组分(i)通过与核苷酸间桥连基团结合的生物可逆的基团与多核苷酸连接，其中缀合部分为功能基团，其可与肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合形成一个或多个共价键，并且其中缀合部分或亲水性功能基团还可包含保护基团；并且
(c)多核苷酸，其包含一个或多个与选自如下的核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团结合的生物可逆的基团：
在具体的实施方案中，挑选了多核苷酸构建体中的生物可逆的基团的位置，以提高所产生的构建体的稳定性(例如，以将立体和/或电子排斥减至最小)。具体而言，对于双链多核苷酸，生物可逆的基团的位置使得能形成稳定的双链分子。
在另一个实施方案中，可挑选每个生物可逆的基团的性质，以产生有利的溶解性和递送特性。这样的变异可包括调节连接子长度，例如，核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团与可切割部分之间的长度，和/或可切割部分与任何缀合部分、亲水性功能基团或辅助部分之间的长度。疏水性生物可逆的基团造成的溶解性的降低可部分地被多核苷酸其他部位的一种或多种亲水性生物可逆的基团的使用所抵消。在具体的实施方案中，具有生物可逆的基团的核苷酸间桥连基团的3’端上的糖不包含2’OH，例如，包含2’F或OMe基团。
例如，本文描述的一些多核苷酸构建体可以具有式I所示的结构，
其中，
Z为0-150的数字；
每个B1单独地为核苷酸碱基；
每个X单独地选自O、S和NR5；
每个Y单独地选自卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
每个R2单独地为不存在、氢或包含通过一个或多个共价键与生物可逆的基团连接的亲水性功能基团、缀合部分、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合的生物可逆的基团，其中缀合部分或亲水性功能基团被保护基团任选保护；
每个R5单独地选自H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基和任选取代的C2-9杂环基；
每个R9单独地为O或S；
R10选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、5’帽、硫代磷、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合；并且
R11选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、硫代磷、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合。
式(I)的示例性的实施方案包括其中X和R9均为O的那些。在替选的实施方案中，本文公开的多核苷酸构建体大部分包含式(I)所示的结构，但是式(I)所示的核苷酸间桥连基团被本文描述的另一个核苷酸间桥连基团(例如，修饰的多核苷酸骨架)取代。在替选的实施方案中，本文公开的多核苷酸构建体大部分包含式(I)所示的结构，但是式(I)所示的基团R10和/或R11被具有生物可逆的基团R2的末端核苷酸基团取代。本文公开的多核苷酸构建体可具有修饰的多核苷酸骨架。修饰的多核苷酸骨架的实例包括例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基烷基-磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯，包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯，包括具有正常的3’-5’连接、这些的2’-5’连接的类似物，以及具有反转的极性的那些的3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯，其中临近的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或者2’-5’至5’-2’连接。教导上述含磷的连接的制备的代表性美国专利包括：美国专利第3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050号，其每篇通过引用并入本文中。本文公开的具有修饰的其中不包含磷原子的多核苷酸骨架的核酸构建体，可具有通过短链烷基或环烷基核苷酸间桥连基团、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷酸间桥连基团，或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间桥连基团形成的骨架。这些包括具有如下组分的的那些：吗啉代连接(部分从核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物；亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺和亚甲基肼骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组分的其他骨架。教导上述多核苷酸的制备的代表性美国专利包括：美国专利第5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439号，其每篇通过引用并入本文中。
在本文所述的任何式子中，可通过下式V来描述R2，
其中，
G1为缀合部分、亲水性功能基团、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合；
L1为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
L2为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。对于本文提供的式V的任何基团，硫酯(-C(O)S-)可被酯(-C(O)O-)或二硫化物(-S-S-)取代。
示例性的R2基团提供在表1中。
表1
应该理解，表1中的某些生物可逆的基团包含经保护的胺基、羟基、杂环基或醛基。示例性的保护基团可被如本文描述的其他保护基团取代。
另一种生物可逆的基团的形式为：
其中，PP为小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合。
在其他实施方案中，L1为
其中G2选自与G1相同的取代基。
在又一个实施方案中，本公开的核酸构建体包含一种或多种本领域已知的生物可逆的基团，例如，如国际公开第WO 98/07734、96/07392、2008/008476、2010/036905、2011/005761和2010/039546号，以及美国专利第6,399,589和6,124,445号中所述。
在特定的实施方案中，本公开的多核苷酸构建体包含式IV所示的结构：
其中，
PTD为肽转导结构域；
R2’为与PTD结合的生物可逆的基团的残基；
z’为1-10的数字，其中，当z’大于1时，PTD通过诸如具有1-10个重复单元的聚(C1-4环氧烷烃)基团的连接子基团连接在一起。
本公开的多核苷酸构建体可为单链的或双链的。当为双链时，一条或两条链可包含一个或多个生物可逆的基团。当多核苷酸用作siRNA时，随从链可包含与核苷酸间桥连基团如烷基磷酸三酯不可逆结合的基团。通常，这样的基团位于从3’端起的第一个或第二个核苷酸之后。不可逆基团防止随从链用作引导链，从而避免或减少可能的脱靶效应。
本公开还提供了制备本公开的多核苷酸构建体的方法。制备核苷酸和多核苷酸的方法为本领域已知。例如，制备多核苷酸的亚磷酰胺化学法的实施可从发表的Caruthers和Beaucage及其他人的工作了解。参见，例如，美国专利第4,458,066；4,500,707；5,132,418；4,415,732；4,668,777；4,973,679；5,278,302；5,153,319；5,218,103；5,268,464；5,000,307；5,319,079；4,659,774；4,672,110；4,517,338；4,725,677；和RE34,069号，其每篇通过引用并入本文中，描述多核苷酸合成的方法。另外，Beaucage et al.,Tetrahedron,48:2223-2311,1992；及Beaucage et al.,Tetrahedron,49:6123-6194,1993，以及其中引用的参考文献，已系统综述了亚磷酰胺化学法的实施，所有这些均通过引用并入本文。
核酸合成仪可以商购获得，并且其应用通常为本领域技术人员所理解，其可有效产生具有可能需要的合理长度的几乎任何多核苷酸。
在实施亚磷酰胺化学法中，可用的5’OH糖封闭基团为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，特别是二甲氧基三苯甲基(DMTr)。在实施亚磷酰胺化学法中，可用的亚磷酸酯活化基团为二烷基取代的氮基团和氮杂环化合物。一种方法包括使用二异丙基氨基活化基团。
可通过Mermade-6固相自动化多核苷酸合成仪或任何常用的自动化多核苷酸合成仪合成多核苷酸。这些合成仪采用三酯、亚磷酰胺或膦酸氢酯偶联化学法(描述于，例如M.Caruthers,Oligonucleotides:Antisense Inhibitors of Gene Expression,pp.7-24,J.S.Cohen,ed.(CRC Press,Inc.Boca Raton,Fla.,1989)；Oligonucleotide synthesis,apractical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,1984；and Oligonucleotides andAnalogues,A Practical Approach,Ed.F.Eckstein,IRL Press,1991)来提供所需的多核苷酸。如Journal of American Chemical Society,112:1253-1255,1990中所述的Beaucage试剂或Beaucage et al.,Tetrahedron Letters 22:1859-1862,1981中所述的元素硫，与亚磷酰胺或膦酸氢酯化学法一起使用来提供取代的硫代磷酸酯多核苷酸。
例如，包含本文所述的保护基团的试剂可用于多种其中需要经保护的应用。这样的应用包括但不限于固相和液相多核苷酸合成等。
例如，结构基团被任选添加至核苷的核糖或碱基，用于掺入至多核苷酸中，如核糖上2’-O位置处的甲基、丙基或烯丙基,或取代2’-O基团的氟基，或核糖核苷碱基上的溴基。对于亚磷酰胺化学法的应用，可商购获得多种亚磷酰胺试剂，包括2’-脱氧亚磷酰胺、2’-O-甲基亚磷酰胺和2’-O-羟基亚磷酰胺。还可采用用于这样的合成的任何其他方式。多核苷酸的实际合成属于本领域技术人员的能力范围内。同样众所周知的是，使用类似的技术来制备其他多核苷酸，如硫代磷酸酯、膦酸甲酯和烷基化的衍生物。同样众所周知的是，使用类似的技术和可商购获得的经修饰的亚磷酰胺和可控孔径的玻璃(CPG)产品如生物素、Cy3、荧光素、吖啶或补骨脂素-修饰的亚磷酰胺和/或CPG(可从Glen Research,Sterling Va.购得)，来合成荧光标记的、生物素化的或其他缀合多核苷酸。
在特定的实施方案中，本公开的制备多核苷酸构建体的方法包括
(1)通过在酸性条件下于非质子溶剂系统中去除O-保护基团，将5'位置处的包含O-保护基团如(4,4'-二甲氧基三苯甲基)基团(DMT)的第一核苷或核苷酸解除封闭，以提供游离的羟基，其中第一核苷或核苷酸可在3'位置固定至固相载体，或者用耐受酸的O-保护基团保护3'位置，并且第一核苷或核苷酸在溶液中；
(2)在诸如酸性唑的催化剂存在下，将去封闭的第一核苷或核苷酸与本文公开的活化的核苷酸构建体或本领域已知的在3'位置包含亚磷酰胺的活化的核苷酸偶联至溶剂系统；
(3)在包含质子溶剂和弱碱的溶剂系统中以氧化试剂氧化所述偶联的核苷酸；
(4)在酸性条件下于非质子溶剂系统中，通过去除5'位置处的O-保护基团如DMT基团将偶联的核苷酸解除封闭；以及
将步骤(2)-(4)重复1-149次，其中生成的多核苷酸构建体包含一种或多种本公开的核苷酸构建体。
在又一个实施方案中，步骤(1)的第一核苷或核苷酸结合至固相载体。在又一个实施方案中，如果步骤(1)的第一核苷或核苷酸结合至固相载体，则在最后的解除封闭步骤后从固相载体切割生成的合成多核苷酸构建体。在替代的实施方案中，步骤(1)的第一核苷或核苷酸结合至固相载体。
在另一个实施方案中，可使用计算机控制的仪器实施制备本文的多核苷酸构建体的方法。在替代的实施方案中，可在不使用计算机控制的仪器的情况下实施制备本文的多核苷酸构建体的方法。
在又一个实施方案中，制备多核苷酸构建体的方法包括使用一种或多种具有式I(a)所示结构的核苷酸构建体：
其中，
B1为核苷酸碱基；
X为O或S；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为4,4'-二甲氧三苯甲基(DMT)保护的羟基；并且
R2为生物可逆的基团，如本文中所述或表1中所示例的。
在又一个实施方案中，制备多核苷酸构建体的方法包括使用一种或多种具有式I(a)所示结构的核苷酸构建体：
其中，
B1为核苷酸碱基；
X为O；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为4,4'-二甲氧三苯甲基(DMT)保护的羟基；并且
R2为选自如下的生物可逆的基团：
本公开还提供了处理通过使用本文公开的制备方法合成的多核苷酸构建体的方法。例如，在合成多核苷酸构建体后，如果核苷酸碱基包含一个或多个保护基团，则去除保护基团；和/或对于任何包含亲水性功能基团或被保护基团保护的缀合部分的生物可逆的基团，则去除保护基团。
另外，在合成多核苷酸构建体后，可将小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分和/或内体逃逸部分与一个或多个生物可逆的基团的一个或多个缀合部分连接。
本公开还提供了由单个核苷酸组成的核酸构建体(“核苷酸构建体”)。
本公开的特征为具有式(I)所示结构的核苷酸构建体：
其中，
B1为核苷酸碱基；
X为O、S或NR5；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯或五磷酸酯；
R2为包含亲水性功能基团、缀合部分或者亲水性功能基团和缀合部分的生物可逆的基团，其中缀合部分和/或亲水性功能基团任选被保护基团保护；
R3为O、S或任选取代的氨基；
R4为H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯，或当R3为任选取代的氨基时不存在；并且
R5为H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C2-9杂环基。
在另一个实施方案中，核苷酸构建体具有式I(a)所示的结构：
其中，
B1为核苷酸碱基；
X为O；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为4,4'-二甲氧三苯甲基(DMT)保护的羟基；并且
R2为如本文中所述的生物可逆的基团，例如，如表1中所示例的。
在又一个实施方案中，核苷酸构建体具有式I(a)所示的结构：
其中，
B1为核苷酸碱基；
X为O；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为4,4'-二甲氧三苯甲基(DMT)保护的羟基；并且
R2为选自如下的生物可逆的基团：
应理解，这些生物可逆的基团包括经保护的羟基或经保护的醛基。所示例的保护基团可被如本文所述的其他羟基或羰基保护基团取代。
本公开另外提供了将包含保护的缀合部分的核酸构建体如核苷酸构建体的缀合部分去保护。例如，可通过添加酸或氟化物，将作为甲硅烷基醚保护的基于羟基的缀合部分去保护为羟基；并且可通过添加催化剂量的酸如催化剂量的甲苯磺酸，将作为1,3-二氧己环或1,3-二氧戊环保护的基于羰基的缀合部分去保护而形成醛或酮。
本公开还提供了包含辅助部分的核苷酸构建体，所述辅助部分选自小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合，其中辅助部分通过一个或多个共价键与生物可逆的基团连接。在特定的实施方案中，辅助部分可通过与生物可逆的基团上发现的缀合部分形成一个或多个共价键而与生物可逆的基团结合。
在特定的实施方案中，核苷酸构建体包含式I(b)所示的结构：
其中，
PTD为肽转导结构域；
z'为1-10的数字，其中，当z’大于1时，PTD可通过连接基团如具有1-10个重复单元的聚(C1-4环氧烷烃)基团连接在一起；
B1为核苷酸碱基；
X为O、S或NR5；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯或五磷酸酯；
R2'为已与辅助部分|PTD|z’形成一个或多个共价键的生物可逆的基团的残基；
R3为O、S或任选取代的氨基；
R4为H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯，或当R3为任选取代的氨基时不存在；并且
R5为H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C2-9杂环基。
本公开的核酸构建体可包含不同的缀合部分。所述缀合部分可依次用于将不同的其他辅助部分，例如，小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合，与核酸构建体结合。在某些实施方案中，核酸构建体中存在多于一种缀合部分，从而允许选择性和/或顺序地将辅助部分与核酸构建体偶联。可通过将合适的核苷酸构建体用于合成聚合物来确定多核苷酸构建体中结合的位置。在合适的条件下，包含一个或多个缀合部分的核酸构建体将与辅助部分上一个或多个相应的缀合部分反应。辅助部分可在内部具有缀合部分，例如，肽或多肽中的末端或赖氨酸胺基团和巯基基团，或者其可被修饰而包含小的连接基团以便引入缀合部分。引入这样的连接基团为本领域所熟知。应理解，与本公开的核酸构建体结合的辅助部分包括任何必要的连接基团。
可使用不同的形成键的方法来将辅助部分与本文所述的核酸构建体缀合。示例性的反应包括：在叠氮化物与炔烃之间形成三唑的Huisgen环加成；亲二烯体与二烯/异二烯之间的Diels-Alder反应；通过其他周环反应如烯反应的键形成；酰胺或硫代酰胺键形成；磺胺键形成；醇或苯酚烷基化(例如，与二氮化合物)、缩合反应以形成肟或腙键、通过亲核试剂(例如，胺和巯基)的共轭加成反应、二硫键形成和羧基功能(例如，通过胺、巯基或羟基亲核试剂)处的亲核取代。形成键的其他示例性的方法在本文中有描述，并且为本领域已知。
亲核试剂和亲电试剂可参与选自如下的键形成反应(但不限于)：通过亲电试剂插入至C-H键、通过亲电试剂插入至O-H键、通过亲电试剂插入至N-H键、在烯烃间加成亲电试剂、在炔烃间加成亲电试剂、加成至亲电子的羰基中心、亲电子的羰基中心的取代、加成至烯酮、亲核加成至异氰酸酯、亲核加成至异硫氰酸酯、活化的硅中心的亲核取代、烷基卤化物的亲核置换、烷基假卤化物的亲核置换、活化的羰基的亲核加成/消除、1,4-缀合物加成亲核试剂至α,β-不饱和羰基、环氧化物的亲核环打开、缺电子的芳族化合物的亲核芳族取代、亲核加成至活化的磷中心、活化的磷中心的亲核取代、亲核加成至活化的硫中心，以及活化的硫中心的亲核取代。
亲核缀合部分可选自任选取代的烯烃、任选取代的炔烃、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、羟基、氨基、烷基氨基、苯胺基和硫代基。
亲电子缀合部分可选自氮烯、氮烯前体如叠氮化物、碳烯、碳烯前体、活化的硅中心、活化的羰基、酸酐、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酸琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、烷基卤化物、烷基假卤化物、环氧化物、环硫化物、氮杂环丙烷、缺电子的芳基、活化的磷中心和活化的硫中心。
例如，缀合可通过缩合反应发生而形成腙键连接。
通过活化基于羧基的缀合部分以及随后与基于伯胺的缀合部分进行反应，可介导通过形成酰胺键的缀合。活化剂可为各种碳二亚胺，如：EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、EDAC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、DCC(二环己基碳二亚胺)、CMC(1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺)、DIC(二异丙基碳二亚胺)或伍德沃德氏试剂K(N-乙基-3-苯基异恶唑鎓-3’-磺酸盐)。基于活化的NHS-酯的缀合部分与基于伯胺的缀合部分进行反应还导致形成酰胺键。
核酸构建体可包含基于羰基的缀合部分。可通过使基于胺的缀合部分与基于醛的缀合部分反应，然后使用氢化物供体如氰基硼氢化钠还原，实现通过形成仲胺的缀合。可例如通过糖部分的氧化或通过与SFB(琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯甲酸酯)或SFPA(琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯氧乙酸酯)的反应，引入基于醛的缀合部分。
醚形成也可用于将辅助部分与本公开的核酸构建体缀合。可通过使基于环氧化物的缀合部分与基于羟基的缀合部分进行反应来介导通过醚键的缀合。
巯基也可用作缀合部分。例如，可通过吡啶基二硫化物介导的巯基-二硫化物交换来完成通过形成二硫键的缀合。基于巯基的缀合部分的引入例如通过如下试剂介导：劳氏试剂(Traut’s Reagent)(2-亚氨基硫杂环戊烷)SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯、SATP(琥珀酰亚胺基乙酰基硫代丙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、SMPT(琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)、N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯、SAMSA(S-乙酰基巯基琥珀酸酐)、AMBH(2-乙酰氨基-4-巯基丁酸酰肼)和半胱胺(2,2’-二硫代二(乙胺)。
可通过使基于巯基的缀合部分与基于马来酰亚胺或碘代乙酰基的缀合部分反应或者通过与基于环氧化物的缀合部分反应，进行通过形成硫醚键的缀合。可通过如下物质引入基于马来酰亚胺的缀合部分：SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯)、MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、磺基-MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-磺基羟基琥珀酰亚胺酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、GMBS(N-α-马来酰亚胺基丁酰基-氧琥珀酰亚胺酯)、磺基GMBS(N-α-马来酰亚胺基丁酰基-氧磺基琥珀酰亚胺酯)。
基于巯基的缀合部分也可与基于碘代乙酰基的缀合部分反应。基于碘代乙酰基的缀合部分可插入有SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯、磺基SIAB(磺基-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯)、SIAX(琥珀酰亚胺基6-[(碘代乙酰基-氨基]己酸酯)、SIAXX(琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘代乙酰基)氨基)-己酰基)氨基]己酸酯)、SIAC(琥珀酰亚胺基4-(((碘代乙酰基)氨基)甲基)-环己烷-1-羧酸酯)、SIACX(琥珀酰亚胺基6-((((4-(碘代乙酰基)氨基)甲基)-环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯)和NPIA(对硝基苯基碘代乙酸酯)。
可通过使基于羟基的缀合部分与CDI(N,N’-羰基二咪唑)或DSC(N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯反应以及随后与基于胺的缀合部分反应，进行通过形成氨基甲酸酯连接的缀合。
可选地，缀合部分可采用光解或热放射活化，以形成所需的共价键。包含叠氮化物功能的缀合部分是一个实例。因此，也可通过引入光反应性缀合部分实现缀合。光反应性缀合部分为芳基叠氮化物、卤化的芳基叠氮化物、苯甲酮、某些重氮化合物和双吖丙啶衍生物。它们与基于氨基的缀合部分或与具有活化的氢键的缀合部分反应。
基于叠氮化物的缀合部分为UV不稳定的，并且，在光分解后，可引起形成氮烯亲电试剂，其可与亲核缀合部分如基于芳基的缀合部分或基于烯基的缀合部分反应。可选地，加热这些叠氮化物也能导致氮烯形成。
环加成反应可用于形成所需的共价键。代表性的环加成反应包括但不限于，基于烯烃的缀合部分与基于1,3-二烯的缀合部分的反应(Diels-Alder反应)、基于烯烃的缀合部分与基于α,β-不饱和羰基的缀合部分的反应(不对称Diels-Alder反应)，和基于炔烃的缀合部分与基于叠氮化物缀合部分的反应(Hüisgen环加成)。包含用于环加成反应的反应物的缀合部分的选择性的、非限制性实例为：烯烃、炔烃、1,3-二烯、α,β-不饱和的羰基和叠氮化物。例如，叠氮化物与炔烃之间的Huisgen环加成已被用于不同生物实体的功能化。
缀合部分还包括但不限于：用于氢化硅烷化、Stille偶联、Suzuki偶联、Sonogashira偶联、Hiyama偶联和Heck反应的反应物。用于这些反应的缀合部分包括氢化硅烷、烯烃和炔烃。
可将不同的辅助部分与本公开的核酸构建体(例如，siRNA)缀合，并且辅助部分可具有任何数目的生物或化学效应。生物效应包括但不限于：诱导细胞内化、结合至细胞表面、靶向特定细胞类型、允许内体逃逸、改变多核苷酸的体内半衰期以及提供治疗效应。化学效应包括但不限于：改变溶解性、电荷、大小和反应性。
可将基于小分子的辅助部分(例如，具有～1000Da或更小分子量的有机化合物)与本公开的核酸构建体缀合。这样的小分子的实例包括但不限于：取代的或未取代的烷烃、烯烃或炔烃，例如，羟基取代的、NH2-取代的、单、二或三烷基氨基取代的、胍基取代的、杂环基取代的以及以上基团的受保护形式。其他小分子包括类固醇(例如，胆固醇)、其他脂质、胆汁和氨基酸。可将小分子添加至多核苷酸以提供中性或带正电荷的，或用以改变多核苷酸的亲水性或疏水性。
肽或多肽(包括融合多肽)是指这样的聚合物，其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体。肽或多肽包括氨基酸序列，并且包括修饰的序列如糖蛋白、逆反(retro-inverso)多肽、D-氨基酸等。肽或多肽包括天然存在的蛋白，以及重组或合成性合成的那些。多肽(和较不常见的肽)可包含多于一个结构域，其具有可归因于多肽的特定片段或部分的功能。结构域，例如，包含肽或多肽的展示至少一个可用表位或功能结构域的部分。两个或更多个结构域可被功能性连接，使得每个结构域保留其功能但包含单种肽或多肽(例如，融合多肽)。例如，PTD的功能片段包含保留了转导活性的片段。生物功能片段，例如，其大小可从如表位那样小的片段到大的多肽进行变化，所述表位能够结合抗体分子，所述大的多肽能够参与细胞内的特征性诱导或表型改变的程序化。
在一些实施方案中，使用了逆反肽或多肽。“逆反”是指一个或多个氨基酸的氨基-羧基反转以及对映体改变(即左旋(L)至右旋(D))。本公开的肽或多肽包括，例如，氨基酸序列的氨基-羧基反转、包含一个或多个D-氨基酸的氨基-羧基转换，以及包含一个或多个D-氨基酸的未反转序列。可按Brugidou et al.(Biochem.Biophys.Res.Comm.214(2):685-693,1995)和Chorev et al.(Trends Biotechnol.13(10):438-445,1995)描述的设计稳定且保留了生物活性的逆反模拟肽。逆反肽或多肽的总体结构特征类似于亲本L-多肽的那些。然而，两个分子大致成镜像，因为它们内在共用手性二级结构元素。基于肽键逆转和手性反转的主链模拟肽代表肽和蛋白的重要结构改变，并且对于生物技术非常重要。可通过代谢稳定的抗原如天然抗原肽和多肽的均为D和逆反-异构体，实现抗原性和免疫原性。在本文中提供了几种来源于PTD的模拟肽。
多肽和片段可具有与天然来源的多肽或结构域相同的或基本上相同的氨基酸序列。“基本上相同的”是指氨基酸序列大幅但非完全相同，但保留了与其相关的序列的功能活性。功能活性的实例为片段能够转导，或能够与RNA结合。例如，在本文中描述了具有转导活性的全长TAT的片段。通常，如果两个肽或多肽或结构域的序列为至少85％、90％、95％、98％或99％相同，或者如果在序列中存在保守变异，则它们为“基本上相同的”。计算机程序如BLAST程序(Altschul et al.,1990)可用于比较序列一致性。
本公开的肽或多肽可由通过肽键或修饰的肽键即肽同电子排列体彼此连接在一起的氨基酸组成，并且可包含除20个基因编码的氨基酸外的氨基酸。可通过天然方法如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰肽或多肽。这样的修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量的研究文献中得到良好描述。修饰可存在于肽或多肽中的任何地方，包括骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。应理解，相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定肽或多肽中的数个位点处。同样，给定的肽或多肽可包含许多类型的修饰。肽或多肽可例如由于泛素化而为支链的，并且其可为有或无分支的环形。环形的、支链的和支链环形肽和多肽，可源于翻译后天然加工，或者可通过合成方法制备。修饰包括乙酰基化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒基化(selenoylation)、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸至蛋白的加成如精胺酰化和泛素化(参见，例如Proteins--Structure And MolecularProperties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,New York,pgs.1-12(1983)；Seifter et al.,Meth Enzymol182:626-646(1990)；Rattan et al.,Ann N.Y.Acad Sci 663:48-62(1992))。
可通过诸如包括t-BOC或FMOC保护α-氨基的那些常用方法来合成本公开的肽或多肽结构域或者融合多肽。两种方法包括逐步合成，其中在每个步骤从肽或多肽的C-端开始添加单个氨基酸(参见，Coligan,et al.,Current Protocols in Immunology,WileyInterscience,1991,Unit 9)。也可通过熟知的固相肽合成方法如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149,1962；和Stewart and Young,Solid Phase PeptidesSynthesis,Freeman,San Francisco,1969,pp.27-62描述的那些，使用包含0.1-1.0mMol胺/g聚合物的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，合成本公开的多肽和肽。在完成化学合成后，可将肽或多肽去保护，并通过在0℃用液态HF-10％苯甲醚处理约1/4-1小时来从聚合物切割。在蒸发掉溶剂后，以1％乙酸溶液从聚合物提取肽或多肽，然后冻干以产生粗制物质。可通过诸如使用5％乙酸作为溶剂在Sephadex G-15上凝胶过滤的技术来纯化肽或多肽。冻干柱洗脱物的合适级分来产生均质的肽或多肽，然后可通过标准技术如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光或测量溶解度来进行定征。如有需要，可通过固相埃德曼降解定量肽或多肽。
可结合至本公开的核酸构建体的基于碳水化合物的辅助部分包括单糖、二糖和多糖。实例包括阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、红霉支糖、赤藓糖、赤藓酮糖、果糖、D-岩藻糖醇、L-岩藻糖醇、岩藻糖胺、岩藻糖、墨角藻糖、半乳糖胺、D-乳糖氨醇、N-乙酰基-半乳糖胺、半乳糖、葡萄糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、葡糖胺醇、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸酯古洛糖甘油醛、L-甘油-D-甘露糖-heprose、甘油、甘油酮、古洛糖艾杜糖、来苏糖、甘露糖胺、甘露糖、甘露糖-6-磷酸酯、阿洛酮糖、异鼠李糖、奎诺糠胺(quinovosamine)、鼠李糖醇、鼠李糖胺、鼠李糖、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、山梨糖、塔格糖、塔罗糖、酒石酸(tararic acid)、苏阿糖、木糖和木酮糖。单糖可为D或L构象。单糖还可为脱氧糖(被氢取代的醇羟基)、氨基糖(被氨基取代的醇羟基)、硫代糖(被巯基取代的醇羟基，或被C＝S取代的C＝O，或被硫取代的环状形式的环氧)、硒基糖、碲基(telluro)糖、氮杂糖(被氮取代的环碳)、亚胺糖(被氮取代的环氧)、膦基糖(被磷取代的环氧)、磷基糖(被磷取代的碳环)、C-取代的单糖(被碳取代的非末端碳原子处的氢)、不饱和单糖、糖醇(被CHOH基团取代的羰基)、醛糖酸(被羰基取代的醛基)、酮醛糖酸、糖醛酸、糖二酸等。氨基糖包括氨基单糖，如半乳糖胺、葡糖胺、甘露糖胺、fucosmine、quinavosamine、神经氨酸、胞壁酸、乳糖二胺、acosamine、细菌糖胺(bacillosamine)、六碳氨糖(daunosamine)、红霉脱氧糖胺(desosamine)、福乐糖胺(forosamine)、加拉糖胺(garosamine)、卡糖胺(kanosamine)、卡糖胺、mycaminese、肌胺(myosamine)、persosamine、pneumosamine、绛红糖胺(purpurosamine)、rhodosmine。应理解，单糖等可被进一步取代。二糖和多糖包括阿比可糖、阿卡波糖(acrabose)、amicetose、支链淀粉、直链淀粉、芹菜糖、arcanose、蛔糖(ascarylose)、抗坏血酸、波伊文糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维素、马铃薯三糖、查耳霉糖(chalcose)、几丁质、可立糖、环糊精、磁麻糖、糊精、2-脱氧核糖、2-脱氧葡萄糖迪吉糖、毛地黄糖、洋地黄毒糖、evalose、evemitrose、果寡糖、galto-寡糖、龙胆三糖、龙胆二糖(genitiobiose)、葡聚糖、gluicogen、糖原、金缕梅糖、肝素、菊粉、异左旋葡萄糖酮、异麦芽糖、异麦芽三糖、异潘糖、曲二糖、乳糖、乳糖胺、乳糖二胺、laminarabiose、左旋葡聚糖、左旋葡萄糖酮、β-麦芽糖、麦芽三糖、甘露聚糖-寡糖、甘露三糖、松三糖、蜜二糖、胞壁酸、霉菌糖、阿洛糖、神经氨酸、migerose、野尻霉素(nojirimycon)、诺维糖、齐墩果糖、潘糖、泊雷糖(paratose)、车前糖(planteose)、樱草糖(primeverose)、棉子糖、rhodone、芸香糖、齐墩果糖、潘糖、泊雷糖、车前糖、樱草糖、棉子糖、夹竹桃糖(rhodinose)、芸香糖、箭毒羊角拗糖(sarmentose)、景天庚酮糖、景天庚酮聚糖、茄三糖(solatriose)、槐糖、水苏糖、链霉糖、蔗糖、α,α-海藻糖、海藻糖胺、松二糖、泰威糖、木二糖、伞形糖等。
本文描述的核酸构建体还可包含共价结合的中性或带电荷的(例如，阳离子型)基于聚合物的辅助部分。带正电荷聚合物的实例包括：聚(乙烯亚胺)(PEI)、精胺、亚精胺和聚(酰胺)(PAMAM)。中性聚合物包括：聚(C1-4环氧烷烃，例如，聚(乙二醇)和聚(丙二醇)以及它们的共聚物，例如，二嵌段和三嵌段共聚物。聚合物的其他实例包括：酯化的聚(丙烯酸)、酯化的聚(谷氨酸)、酯化的聚(天冬氨酸)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯-乙烯醇共聚物)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(丙烯酸)、聚(乙基恶唑啉)、聚(烷基丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(N-烷基丙烯酰胺)、聚(N-丙烯酰吗啉)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(二氧环己酮)、聚(己内酯)、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-顺丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚尿烷、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、聚膦嗪和聚(N,N-二烷基丙烯酰胺)。示例性的聚合物辅助部分可具有小于100、300、500、1000或5000的分子量。其他聚合物为本领域已知。
包含诊断/成像试剂的治疗剂，可作为辅助部分与本公开的核酸构建体共价结合，或者可按本文所述作为协同治疗来给药。它们可为天然存在的化合物、合成的有机化合物或无机化合物。示例性的治疗剂包括但不限于：抗生素、抗增殖剂、雷帕霉素大环内酯类、止痛剂、麻醉剂、抗血管生成剂、血管活性剂、抗凝血剂、免疫调节剂、细胞毒性剂、抗病毒剂、抗血栓形成药物、抗体、神经递质、精神药物及以上物质的组合。治疗剂的其他实例包括但不限于：细胞周期控制剂；抑制周期蛋白产生的试剂；细胞因子，包括但不限于白介素1-13和肿瘤坏死因子；抗凝血剂、抗血小板剂；TNF受体结构域等。通常，治疗剂为中性的或带正电荷。在某些情况下，当治疗剂带负电荷时，可使用另外的电荷中和部分(例如，阳离子型肽)。
治疗部分可作为辅助部分与本文公开的核酸构建体连接，以允许诊断性测定/成像。这样的部分的实例包括但不限于：可检测的标记如同位素、放射性成像试剂、标记物、示踪物、荧光标记(例如，若丹明)和报告分子(例如，生物素)。
示例性的诊断试剂包括但不限于：成像剂如用于正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助断层扫描(CAT)、单光子发射计算机化断层扫描、X-射线、荧光镜检查和磁共振成像(MRI)的那些。可在MRI中用作造影剂的合适物质包括但不限于：钆螯合物以及铁、镁、锰、铜和铬螯合物。可用于CAT和X-射线的物质的实例包括但不限于基于碘的物质。
发射可能合适的辐射(可检测的放射标记)的放射性成像剂的实例的示例为铟-111、锝-99或低剂量碘-131。用于与本公开的核酸构建体连接或结合而作为辅助部分的可检测标记或标志物可为：放射性标记、荧光标记、核磁共振活性标记、发冷光标记、发色团标记、用于PET扫描的正电子发射同位素、化学发光标记或酶标记。荧光标记包括但不限于：绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素和若丹明。标记可为例如医用同位素，诸如但不限于：锝-99、碘-123和碘-131、铊-201、镓-67、氟-18、铟-111等。
本领域已知的其他治疗剂同样也可用于与本公开的核酸构建体连接或结合而作为辅助部分。
本公开提供了可与本文公开的核酸构建体连接而作为辅助部分，例如作为靶向辅助部分的一个或多个靶向部分。可基于其将本公开的构建体靶向所需的或选定的表达所选定的靶向部分的相应结合伴侣(例如，相应的受体或配体)的细胞群体的能力，来选择靶向部分。例如，本公开的构建体可通过选择表皮生长因子(EGF)作为靶向部分来靶向表达表皮生长因子受体(EGFR)的细胞。
在一个实施方案中，靶向部分为受体结合结构域。在另一个实施方案中，靶向部分为或特异性结合选自包含如下物质的组的蛋白：胰岛素、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、IGF2R、胰岛素样生长因子(IGF；例如，IGF 1或2)、间叶细胞上皮过渡因子受体(c-met；也称为肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、调蛋白、纤维母细胞生长因子受体(FGFR)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、血小板来源的生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸、转移、转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整合素(例如，α4整合素或β-1整合素)、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸受体-1(S1PR)、透明质酸受体、白血球功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1)、CD166(活化的白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(基质细胞来源的因子1(SDF-1))、白细胞介素1(IL-1)、IL-1ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、肝配蛋白(Eph)受体、粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、LewisY、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原和以上物质的片段。在又一个实施方案中，靶向部分为成红细胞白血病病毒癌基因同系物(ErbB)受体(例如，ErbB1受体；ErbB2受体；ErbB3受体；和ErbB4受体)。
靶向部分也可选自蛙皮素、胃泌素、胃泌素释放肽、肿瘤生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，以及牛痘病毒生长因子(VVGF)。非肽基配体也可用作靶向部分，并且可包括，例如类固醇、碳水化合物、维生素和凝集素。靶向部分也可选自肽或多肽，如生长激素抑制素(例如，具有核心序列环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]的生长激素抑制素，并且其中，例如生长激素抑制素类似物的C端为：Thr-NH2)，生长激素抑制素类似物(例如，奥曲肽和兰瑞肽)、蛙皮素、蛙皮素类似物或抗体，如单克隆抗体。
用作本公开的核酸构建体中的靶向辅助部分的其他肽或多肽可选自：KiSS肽和类似物、尾加压素II肽和类似物、GnRH I和II肽及类似物、地普奥肽(depreotide)、伐普肽(vapreotide)、血管活性肠肽(VIP)、缩胆囊素(CCK)、包含RGD的肽、黑色素细胞刺激素(MSH)肽、神经降压素、降钙素、来自抗肿瘤抗体的互补决定区的肽、谷胱甘肽、YIGSR(白血球-偏好(avid)肽，例如，P483H，其包含血小板因子-4(PF-4)的肝素结合区和富含赖氨酸的序列)、心房利钠肽(ANP)、β-淀粉样肽、δ-阿片拮抗剂(如ITIPP(psi))、膜联蛋白-V、内皮素、白三烯B4(LTB4)、趋化肽(例如，N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸-赖氨酸(fMLFK))、GP IIb/IIIa受体拮抗剂(例如，DMP444)、人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(EPI-HNE-2和EPI-HNE-4)、胞浆素抑制剂、抗微生物肽、Apticide(P280和P274)、血小板反应蛋白受体(包括类似物如TP-1300)、Bitistatin、脑垂体腺苷酸环化酶I型受体(PAC1)、纤维蛋白α-链、来源于噬菌体展示文库的肽，以及以上物质的保守替换。
用作本公开的核酸构建体中的靶向部分的免疫反应性配体包括抗原识别免疫球蛋白(也称为“抗体”)，或其抗原识别片段。如本文所用，“免疫球蛋白”是指任何识别的免疫球蛋白类型或亚类，如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。典型的为归入免疫球蛋白的IgG类型中的那些免疫球蛋白。免疫球蛋白可来源于任何物种。然而，通常，免疫球蛋白为人、鼠或兔来源的。另外，免疫球蛋白可为多克隆或单克隆，但通常为单克隆的。
本公开的靶向部分可包括抗原识别免疫球蛋白片段。这样的免疫球蛋白片段可包括，例如Fab’、F(ab’)2、Fv或Fab片段、单结构域抗体、ScFv或其他抗原识别免疫球蛋白片段。Fc片段也可用作靶向部分。可例如通过蛋白水解酶消化，例如，通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化、还原性烷基化或重组技术来制备这样的免疫球蛋白片段。用于制备这样的免疫球蛋白的材料和方法为本领域技术人员熟知。参见Parham,J.Immunology,131,2895,1983；Lamoyi et al.,J.Immunological Methods,56,235,1983。
本公开的靶向部分包括本领域已知的但在本公开中未提供为特定实例的那些靶向部分。
本公开提供了可与本文公开的核酸构建体结合而作为辅助部分，例如作为内体逃逸辅助部分的一个或多个内体逃逸部分。示例性的内体逃逸部分包括化疗剂(例如，喹诺酮如氯喹)；融合脂质(例如，二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE))；和聚合物如聚乙二胺(PEI)；聚(β-氨基酯)；肽或多肽如聚精氨酸(例如，八精氨酸)和聚赖氨酸(例如，八赖氨酸)；质子海绵、病毒衣壳和如本文所述的肽转导结构域。例如，融合肽可来源于流感A病毒的M2蛋白；流感病毒血球凝集素的肽类似物；流感C病毒的HEF蛋白；丝状病毒的跨膜糖蛋白；狂犬病毒的跨膜糖蛋白；水疱性口炎病毒的跨膜糖蛋白(G)；仙台病毒的融合蛋白；塞姆利基森林病毒的跨膜糖蛋白；人呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白；麻疹病毒的融合蛋白；新城疫病毒的融合蛋白；绵羊髓鞘脱落病毒的融合蛋白；鼠白血病病毒的融合蛋白；HTL病毒的融合蛋白；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的融合蛋白。可用于促进内体逃逸的其他部分描述于Dominskaet al.,Journal of Cell Science,123(8):1183-1189,2010中。
本公开提供了可与本文公开的核酸构建体结合而作为辅助部分，例如作为递送结构域辅助部分的一个或多个递送结构域部分。递送结构域为通过任何机制诱导本公开的多核苷酸运输至细胞中的部分。通常，本公开的核酸构建体将通过大胞饮、吞噬作用或内吞作用(例如，网格蛋白介导的内吞作用、胞膜凹陷介导的内吞作用和依赖于脂筏的内吞作用)内化，参见，例如，Chem.Soc.Rev.,2011,40,233–245。递送结构域可包含肽或多肽(例如，肽转导结构域)、碳水化合物(透明质酸)和带正电荷的聚合物(聚(乙二胺)，如本文所述。
可通过大分子形式的“货物”生物试剂(在该情况下为多核苷酸)至阳离子型肽转导结构域(PTD；也称为细胞渗透肽(CPP))如TAT或(Arg8)来完成细胞递送(Snyder andDowdy,2005,Expert Opin.Drug Deliv.2,43-51)。PTD可用于递送多种大分子货物，包括本文描述的多核苷酸(Schwarze et al.,1999,Science 285,1569-1572；Eguchi et al.,2001,J.Biol.Chem.276,26204-26210；和Koppelhus et al.,2002,Antisense NucleicAcid Drug Dev.12,51-63)。阳离子型PTD通过大胞饮(一种所有细胞均进行的流体相摄取的特化形式)进入细胞。
对模式囊泡的生物物理研究表明，货物逃离大胞饮体囊泡进入细胞质，从而需要pH降低(Magzoub et al.,2005,Biochemistry 44,14890-14897)。PTD的正电荷为分子穿过细胞膜所必需。一点也不奇怪，阳离子型PTD(6-8个正电荷)与阴离子型siRNA(～40个负电荷)的缀合引起电荷中和及PTD失活，没有siRNA进入细胞(Turner et al.,Blood CellMol.Dis.,38(1):1-7,2007)。然而，阳离子型PTD与本文描述的核酸构建体(例如，阴离子RNA或DNA)的化学缀合仍然引起核酸构建体能够被细胞摄取，因此本文公开的新的和非显而易见的核酸构建体不遭受其他类似方法可见的任何电荷中和有害人工迹象(artifact)。此外，这些PTD经胞内的切割允许多核苷酸不可逆地递送至靶标细胞。
可以有效通过真核细胞质膜的几种蛋白的发现，促成了肽转导结构域所源自的蛋白类型的鉴定。这些蛋白中定征最好的为果蝇同源蛋白触角足蛋白转录蛋白(AntHD)(Joliot et al.,New Biol.3:1121-34,1991；Joliot et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1864-8,1991；Le Roux et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:9120-4,1993)、单纯疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliott and O’Hare,Cell 88:223-33,1997)、HIV-1转录激活因子TAT蛋白(Green and Loewenstein,Cell 55:1179-1188,1988；Frankel and Pabo,Cell 55:1189-1193,1988)，以及最近的朊病毒蛋白的阳离子型N-端结构域。示例性的PTD序列提供在表2中。本公开还提供了与本文中公开的核酸构建体缀合而作为辅助部分的表2中列出的一种或多种PTD或本领域已知的其他PTD(参见，例如，Joliot et al.,Nature CellBiology,6(3):189-196,2004)。缀合策略包括使用包含可通过细胞内酶作用被切割的功能基团的双功能连接子。
表2
包含可缀合至任何本文描述的核酸构建体的TAT肽的示例性的辅助部分提供在表3中。
表3
序列(N’-C’)
PEG-(PTD)
GG-(PTD)-PEG-(PTD)
PEG-(PTD)-PEG-(PTD)
GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)
PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)
GG-(PTD)-PEG-(PTD)-PEG-(PTD)
GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)
PEG＝具有6个重复单元的聚(乙二醇)连接子
在特定的实施方案中，表3中描述的辅助部分包含N’端与Z’的共价键，其中Z’为多肽RZ的6-肼基烟酸或氨基与醛缀合的残基。
因此，可与本公开的核酸构建体缀合的PTD包括但不限于：AntHD、TAT、VP22、阳离子型朊病毒蛋白结构域，及其功能片段。不仅这些肽可以通过质膜，并且结合其他肽或多肽如酶β-半乳糖苷酶足以刺激细胞摄取这些复合物。这样的嵌合蛋白在胞质和细胞核中以生物活性形式存在。这一过程的特征表明，这些融合多肽的摄取较快，常常在数分钟内以不依赖于受体的方式发生。而且，这些蛋白的转导似乎不受细胞类型影响，并且这些蛋白可有效转导培养物中～100％的细胞，而不产生明显的毒性(Nagahara et al.,Nat.Med.4:1449-52,1998)。除了全长蛋白外，肽转导结构域也被成功用于诱导细胞内摄取DNA(Abu-Amer,同上)、反义多核苷酸(Astriab-Fisher et al.,Pharm.Res,19:744-54,2002)、小分子(Polyakov et al.,Bioconjug.Chem.11:762-71,2000)，和甚至无机的40nm铁粒子(Doddet al.,J.Immunol.Methods 256:89-105,2001；Wunderbaldinger et al.,Bioconjug.Chem.13:264-8,2002；Lewin et al.,Nat.Biotechnol.18:410-4,2000；Josephson et al.,Bioconjug.,Chem.10:186-91,1999)，这表明在该过程中颗粒大小存在相当大的灵活性。
因此，在特定的实施方案中，本公开提供了组合使用PTD如TAT和聚-Arg与本文公开的核酸构建体，以促进靶向摄取构建体进入靶标细胞和/或释放于靶标细胞中的方法和组合物。因此，本文公开的核酸构建体提供了这样的方法，凭借该方法通过还包含作为辅助部分连接的一个或多个PTD的核酸构建体，作为辅助部分连接的治疗或诊断试剂可被靶向而在某些细胞中递送。
本公开的核酸构建体可为siRNA或自身提供了治疗或诊断益处的其他抑制性核酸序列。然而，在一些情况下，可能可取的是结合另外的辅助部分作为治疗剂或用于促进摄取。在PTD的情况下，PTD用作另外的电荷改性部分，以通过中和核酸构建体上的电荷或通常为核酸构建体提供少量的净正电荷来促进核酸构建体的摄取。还应理解，核酸构建体可包含其他的辅助部分，诸如但不限于：靶向部分、生物活性分子、治疗剂、小分子(例如，细胞毒素)等。在这样的情况下，具有这样的辅助部分的核酸构建体基于辅助部分大小和电荷，可为电荷中性的或带正电荷的。在辅助部分带负电荷的情况下，添加带正电荷的肽(例如，PTD)还可中和构建体的电荷或改善其净正电荷。
通常，与本文公开的核酸构建体连接的递送结构域几乎可为任何合成的或天然存在的氨基酸序列，其有助于将本文公开的核酸构建体经细胞内递送至靶标细胞。例如，可根据本公开，通过使用与本公开的核酸构建体的缀合部分共价连接的肽转导结构域如HIVTAT蛋白或其片段来实现转染。可选地，肽转导结构域可包含触足(Antennapedia)同源域或HSV VP22序列、朊病毒蛋白的N-端片段或其合适的转导片段，如本领域已知的那些。
可通过包括所需转染程度在内的几个参数来指导PTD的类型和大小。通常，PTD能够转染至少约20％、25％、50％、75％、80％或90％、95％、98％和多达并且包括约100％的细胞。可通过几种常规的方法测定转染效率，通常表示为转染的细胞的百分比。
PTD将显示有利于至少皮摩尔量的本文公开的核酸构建体进入靶细胞的细胞进入和离去速率(有时分别称为k1和k2)。可使用可检测标记的融合分子，通过标准动力学分析容易地测定或至少估计PTD和任何货物(cargo)的进入和离去速率。通常，进入速率与离去速率的比例范围为约5比约100至约1000。
在一个实施方案中，可用于本公开的方法和组合物的PTD包含特征在于大量的α-螺旋的肽或多肽。已发现当PTD展现大量的α-螺旋时转染是最佳的。在另一个实施方案中，PTD包含这样的序列，其含有基本上沿着肽或多肽的至少一个表面对齐的碱性氨基酸残基。可用于本公开的PTD结构域可为天然存在的肽或多肽或者合成的肽或多肽。
在另一个实施方案中，PTD包含这样的氨基酸序列，其包含在螺旋柱下方具有精氨酸(Arg)残基的强α螺旋结构。
在又一个实施方案中，PTD结构域包含由以下通式表示的肽：BP1-XP1-XP2-XP3-BP2-XP4-XP5-BP3(SEQ ID NO:14)，其中BP1、BP2和BP3每个独立地为相同的或不同的碱性氨基酸；并且XP1、XP2、XP3、XP4和XP5每个独立地为相同的或不同的促α-螺旋氨基酸。
在另一个实施方案中，PTD结构域可由以下通式表示：BP1-XP1-XP2-BP2-BP3-XP3-XP4-BP4(SEQ ID NO:15)，其中BP1、BP2、BP3和BP4每个独立地为相同的或不同的碱性氨基酸；并且XP1、XP2、XP3和XP4每个独立地为相同的或不同的促α-螺旋氨基酸。
另外，PTD结构域包含碱性残基，例如，赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，并且还可包含至少一个足以引入“扭结(kink)”至结构域中的脯氨酸(Pro)残基。这样的结构域的实例包括朊病毒的转导结构域。例如，这样的肽包括KKRPKPG(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，结构域为如下序列所示的肽：XP-XP-R-XP-(P/XP)-(BP/XP)-BP-(P/XP)-XP-BP-(BP/XP)(SEQ ID NO:17)，其中X为任意促α螺旋残基如丙氨酸；P/XP为脯氨酸或先前所定义的XP；BP为碱性氨基酸残基，例如，精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)；R为精氨酸(Arg)，并且BP/XP为如上文所定义的BP或XP。
在另一个实施方案中，PTD为阳离子型的，并且由7-10个氨基酸组成，并且具有式KXP1RXP2XP1(SEQ ID NO:18)所示的结构，其中XP1为R或K，并且XP2为任意氨基酸。这样的肽的实例包括RKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)。在另一个实例中，PTD为在5-15个氨基酸中具有5-10个精氨酸(和/或赖氨酸)残基的阳离子型肽序列。
根据本公开的另外的递送结构域包括TAT片段，其包含TAT的至少氨基酸49-56且多达约全长TAT序列(参见，例如，SEQ ID NO:1)。TAT片段可包含一个或多个氨基酸改变，其足以增加片段的α-螺旋。在一些情况下，引入的氨基酸改变包括添加识别的促α-螺旋氨基酸。可选地，氨基酸改变包括从TAT片段去除一个或多个妨碍α螺旋形成或稳定性的氨基酸。在更具体的实施方案中，TAT片段包含至少一个具有促α-螺旋氨基酸的氨基酸替换。尽管在一些情况下可使用重组DNA方法，通常通过标准肽合成技术制备TAT片段。在一个实施方案中，选择取代以使得TAT片段中至少两个碱性氨基酸残基基本上沿着TAT片段的至少一个表面对齐。在更具体的实施方案中，选择取代以使得TAT 49-56序列中至少两个碱性氨基酸残基基本上沿着该序列的至少一个表面对齐。
可用于本公开的组合物和方法的另外的转导蛋白(PTD)包括TAT片段，其中TAT49-56序列被修饰，以使得至少序列中两个碱性氨基酸沿着TAT片段的至少一个表面基本上对齐。示例性的TAT片段包含TAT的至少氨基酸49-56中至少一个特定的氨基酸取代，其中所述取代沿着片段的至少一个表面并且通常为TAT 49-56序列与49-56序列的碱性氨基酸残基对齐。
还包括嵌合的PTD结构域。这样的嵌合PTD包含至少两种不同的转导蛋白的一部分。例如，可通过融合两个不同的TAT片段，例如，一个来自HIV-1且另一个来自HIV-2，或者一个来自朊病毒蛋白并且一个来自HIV，形成嵌合的PTD。
可使用氨基磷酸酯或磷酸三酯连接子，在核苷酸间桥连基团或在3’或5’端处将PTD作为辅助部分连接至本公开的核酸构建体。例如，可使用具有3-碳连接子的包含3’-氨基的siRNA构建体，将siRNA构建体与PTD连接。可通过不对称-双功能交叉连接子将siRNA构建体缀合至PTD。
可通过生物可逆的基团将PTD作为辅助部分结合至核酸构建体，其中生物可逆的基团可被胞内切割，例如，可被细胞内酶(例如，硫酯酶)切割从而释放多核苷酸。
例如，PTD除了可被缀合在5’和3’端之间外，PTD也可通过游离巯基在5’和/或3’端直接缀合至包含本文公开的核酸构建体的多核苷酸(例如，RNA或DNA)。例如，可通过生物灵敏和可逆的方式如二硫键或可通过细胞内酶(例如，硫酯)作用而切割的功能基团，将PTD连接至多核苷酸。该方法可适用于任何多核苷酸长度，并且允许递送多核苷酸(例如，siRNA)至细胞中。多核苷酸也可包含，例如一个或多个递送结构域和/或包含碱性基团的保护基团。一旦进入细胞后，所述多核苷酸即基于细胞内条件，例如，还原性环境，通过水解或其他酶活性(例如，硫酯酶活性)转化为未经保护的多核苷酸。
可用于本公开的构建体和方法的肽连接子通常包含多达约20或30个氨基酸、通常多达约10或15个氨基酸，并且更通常约1-5个氨基酸。所述连接子序列通常为柔性的，以便不会将融合分子保持为单一刚性构象。所述连接子序列可用于，例如，将PTD结构域与核酸隔开。例如，肽连接子序列可位于肽转导结构域与核酸结构域之间，例如，以提供分子柔性。选择连接子部分的长度，以优化包含例如PTD结构域融合构建体的肽或多肽的生物活性，并且可凭经验确定而不需过多的实验。连接子部分的实例为：-Gly-Gly-、GGGGS(SEQ ID NO:19)、(GGGGS)N(SEQ ID NO:20)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:21)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ IDNO:22)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:23)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:24)或EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO:25)。肽或多肽链接部分描述于，例如Huston et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.85:5879,1988；Whitlow et al.,Protein Engineering 6:989,1993；和Newton et al.,Biochemistry 35:545,1996中。其他合适的肽或多肽连接子为描述于美国专利第4,751,180和4,935,233号中的那些，其通过引用并入本文中。
可使用本领域技术人员已知的多种方法，通过使细胞与构建体接触来实现本公开的核酸构建体的递送。在特定的实施方案中，使用不同的载体、分散剂等配制本公开的核酸构建体，如本文中其他地方更完整描述的。
可将根据本公开的药物组合物制备成包含本文公开的核酸构建体且适于使用载体、赋形剂和添加剂或辅助物给予至对象的形式。常用的载体或辅助物包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其他糖、滑石、牛奶蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂，如无菌水、乙醇、甘油和多羟基醇。静脉内媒介物包括流体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其他药学上可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等，如例如Remington's PharmaceuticalSciences,和The National Formulary,30th ed.中所述的，其内容通过引用并入本文中。根据本领域的常规经验调节药物组合物不同组分的pH和准确浓度。参见Goodman andGilman's,The Pharmacological Basis for Therapeutics。
可局部或系统给予根据本公开的药物组合物。治疗有效量将根据诸如对象的感染程度、个体的年龄、性别和体重的因素而改变。可调节给药方案以提供最佳的治疗响应。例如，可每天给予几次分开的剂量，或者可按治疗情况的紧急状况所示按比例减少剂量。
可以便利的方式给予药物组合物，如通过注射(例如，皮下、静脉内、眶内等)、经口给药、眼睛施用、吸入、经皮施用、局部施用或直肠给药。基于给药途径，可用材料包被药物组合物以保护药物组合物免受酶、酸和可失活药物组合物的其他天然条件作用。也可经肠胃外或腹腔内给予药物组合物。也可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中，以及在油中制备分散剂。在储存和使用的常规条件下，这些制剂可包含防腐剂以防止微生物生长。
适于注射应用的药物组合物包括无菌的水溶液(其中水溶的)或分散剂，和用于临时制备无菌的可注射溶液或分散剂的无菌粉末。该组合物通常为无菌的，并且流动程度使得存在易注射性。通常，该组合物在制备和储存的条件下是稳定的，并且保存免于微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油。例如可通过使用包衣如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，来维持合适的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂实现防止微生物作用，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在一些情况下，等渗试剂如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠被用于组合物中。可通过在组合物中纳入延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射的组合物的延长吸收。
可通过将药物组合物以所需的量掺入至具有上述成分的一种或组合(如有需要)的合适溶剂，然后过滤除菌来制备无菌的可注射溶液。通常，通过将药物组合物掺入至包含基本分散介质和所需的来自上述那些其他成分的无菌媒介物中来制备分散剂。
药物组合物可与例如惰性缓释剂或可同化的可食用载体一起经口给药。药物组合物和其他成分也可包封于硬的或软壳胶囊中，压缩成片剂或直接掺入至对象的膳食中。对于经口治疗给药，药物组合物可掺入有赋形剂，并以可吸收的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、圆片剂(wafer)等使用。这样的组合物和制剂应当包含至少1％重量的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以发生变化，并且可方便地为单位重量的约5％至约80％。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可包含下述物质：粘合剂如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；以及甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精，或者风味剂如薄荷、冬青油或樱桃风味。当剂量单位形式为胶囊时，其除了上述类型的物质外还可包含液体载体。可提供各种其他材料作为包衣或者改良剂量单位的物理形式。例如，可用虫胶、糖或二者来包被片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂可包含试剂蔗糖作为甜味剂，甲基和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和风味剂，如樱桃或或橘子风味。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应当为药学上纯的，并且在所用的量下基本上无毒。另外，可将药物组合物掺入至缓释制备物和制剂。
因此，药学上可接受的载体旨在包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药学活性物质的应用为本领域所熟知。除了与药物组合物不相容的任何常规介质或试剂外，包括其在治疗组合物和治疗方法中的应用。补充的活性化合物也可包含在组分中。
特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以易于剂量的给药和一致性。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗对象的一致剂量的生理上分离的单位；计算每个包含预定量药物组合物的单位，以产生与所需药物载体相关的所需治疗效应。本公开的剂量单位形式的规格与药物组合物的特性和所实现的特定治疗效应相关。将主要的药物组合物组合，以方便和有效地给予有效量可接受的剂量单位的合适药学上可接受的载体。在包含补充活性成分的组合物的情况下，通过参考所述成分的常用给药剂量和方式来确定剂量。
对于局部制剂，可以任何溶剂系统如美国食品和药物管理局(FDA)批准的一般认为安全(GRAS)的那些，制备基本组分。GRAS溶剂系统包含许多短链烃类如丁烷、丙烷、正丁烷或其混合物作为递送媒介物，其被FDA批准用于局部应用。可使用任何皮肤可接受的载体配置局部组合物。示例性的载体包括固体载体如氧化铝、粘土、微晶纤维素、二氧化硅或滑石；和/或液体载体如乙醇、乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物。也可在允许化合物进入皮肤的脂质体制剂中给予化合物。这样的脂质体制剂描述于美国专利第5,169,637；5,000,958；5,049,388；4,975,282；5,194,266；5,023,087；5,688,525；5,874,104；5,409,704；5,552,155；5,356,633；5,032,582；4,994,213号；和PCT公布第WO 96/40061号。其他合适的媒介物的实例描述于美国专利第4,877,805号、U.S.4,980,378、U.S.5,082,866、U.S.6,118,020和EP公布第0586106A1号。本公开的合适媒介物也可包括矿物油、矿脂、聚癸烯、硬脂酸、肉豆蔻酸异丙酯、聚乙二醇40硬脂酸酯、十八烷醇或植物油。
可以任何可用的形式提供局部组合物。例如，可将本公开的组合物配制为用于施用至可使用所述组合物的皮肤或其他组织的溶液、乳剂(包括微乳液)、悬浮液、霜剂、泡沫、洗剂、凝胶、粉末、软膏或其他典型的固体、半固体或液体组合物。这样的组合物可包含通常用于这样的产品中的其他成分，如着色剂、芳香剂、增稠剂、抗菌剂、溶剂、表面活性剂、洗涤剂、胶凝剂、抗氧化剂、填充剂、染料、粘度控制剂、防腐剂、湿润剂、软化剂(例如，天然或合成的油、烃油、蜡或硅酮)、水合剂、螯合剂、缓和剂、增溶剂、佐剂、分散剂、皮肤渗透促进剂、增塑剂、防腐剂、稳定剂、反乳化剂、润湿剂、遮光剂、乳化剂、保湿剂、收敛剂、除臭剂，并且任选包含麻醉剂、止痒活性物、植物提取物、调节剂、深色剂或增亮剂、闪光剂(glitter)、保湿剂、云母、矿物、多酚类、硅酮或其衍生物、防晒霜、维生素和植物药物(phytomedicinal)。
在一些制剂中，组合物被配制用于眼部施用。例如，用于眼部施用的药剂可包含如本文所述的多核苷酸构建体，其量为例如，以多达99％重量与生理上可接受的眼睛载体介质如水、缓冲剂、盐水、甘氨酸、透明质酸、甘露醇等混合。对于眼部递送，如本文所述的多核苷酸构建体可与眼睛可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、粘度增强剂、渗透促进剂、缓冲剂、氯化钠或水混合，以形成含水的、无菌眼用悬液或溶液。可通过将多核苷酸构建体溶解在生理上可接受的等渗水性缓冲液中来制备眼用溶液制剂。此外，眼用溶液可包含眼可接受的表面活性剂以帮助溶解抑制剂。可将粘性建立试剂如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等，添加至本公开的组合物中以改善化合物的截留。
例如，可根据熟练的临床医生的常规判断，每天1-4次，或基于延长的递送方案如每天、每周、每两周、每月或更长时间将局部组合物递送至眼睛表面。制剂的pH范围可为约pH 4-9，或约pH 4.5至pH 7.4。
对于本公开的核酸构建体，合适的药学上可接受的盐包括：(i)与阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、聚胺如精胺和亚精胺等形成的盐；(ii)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(iii)与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；以及(iv)从元素阴离子如氯、溴和碘形成的盐。
虽然本文描述的核酸构建体可能不需要使用递送至靶标细胞的载体，载体的使用在一些实施方案中可能是有利的。因此，对于至靶细胞的递送，本公开的核酸构建体可非共价结合载体而形成复合物。载体可用于改变递送后的生物分布，以增加摄取，从而增加多核苷酸的半衰期或稳定性(例如，改善核酸酶耐受性)，和/或增加对特定细胞或组织类型的靶向。
示例性的载体包括缩合剂(例如，能够通过离子或静电相互作用吸引或结合核酸的试剂)；融合剂(例如，能够融合细胞膜和/或通过细胞膜运输的试剂)；靶向特定细胞或组织类型的蛋白(例如，促甲状腺素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A或任何其他的蛋白)；脂质；脂多糖；脂质胶束或脂质体(例如，由磷脂如磷脂酰胆碱、脂肪酸、糖脂、神经酰胺、甘油酯、胆固醇或以上物质的任意组合形成的)；纳米粒子(例如，二氧化硅、脂质、碳水化合物或其他药学上可接受的聚合物纳米粒子)；由阳离子型聚合物和阴离子试剂(例如，CRO)形成的聚合物，其中示例性的阳离子型聚合物包括聚胺(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚酰胺和聚乙二胺)；胆固醇；树状物(例如，聚酰胺(PAMAM)树状物)；血清蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)或低密度脂蛋白(LDL))；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；脂质；合成的聚合物(例如，聚赖氨酸(PLL)、聚乙二胺、聚-L-天冬氨酸、聚-L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-乙醇酸)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚尿烷、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺共聚物、假肽-聚胺、模拟肽聚胺或聚胺)；阳离子型部分(例如，阳离子型脂质、阳离子型卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽)；多价糖(例如，多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖或多价海藻糖)；维生素(例如，维生素A、维生素E、维生素K、维生素B、叶酸、维生素B12、核黄素、生物素或吡哆醛)；辅因子；或用于破坏细胞骨架以增加摄取的药物(例如，分类单位(taxon)、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、Japlakinolide、拉春库林A、鬼笔环肽、Swinholide A、Indanocine或肌基质蛋白(myoservin))。
本公开的药物组合物可包含本文公开的其他治疗剂与本公开的核酸构建体的组合。
本公开提供了用于递送本文公开的核酸构建体(例如，RNA、DNA、核酸包含修饰的碱基、其他阴离子核酸等)的组合物和方法。因此，本公开提供了方法和组合物，其可用于递送赋予对基因或蛋白表达的调控效应的非编码核酸构建体。
RNA干扰(RNAi)为这样的过程，凭借该过程信号RNA(mRNA)被来源于包含与待沉默的靶标基因相同的或非常类似的核苷酸序列的双链RNA(dsRNA)的小干扰RNA(siRNA)降解。该过程通过转录后、翻译前操作来阻止产生由靶标基因编码的蛋白。因此，可完成显性疾病基因或其他靶标基因的沉默。
体内RNAi通过这样的过程进行，其中dsRNA被称为Dicer的酶(dsRNA内切核糖核酸酶)切割成短的干扰RNA(siRNA)(Bernstein et al.,2001；Hamilton&Baulcombe,1999,Science 286:950；Meister and Tuschl,2004,Nature 431,343-9)，从而从原来的单个dsRNA产生多个分子。siRNA被加载至多聚RNAi沉默复合物(RISC)，其产生催化激活和mRNA靶特异性(Hannon and Rossi,Nature 431,371-378,2004；Novina and Sharp,Nature430,161-164,2004)。在siRNA加载至RISC期间，反义链或引导链从siRNA分离，并保持停留(docked)在Argonaute-2(Ago2)(RISC催化亚基)中(Leuschner et al.,EMBO Rep.7,314-320,2006)。从细胞核输出而进入胞质中的mRNA被认为是在到达核糖体之前通过活化的RISC，从而允许基因表达的转录后、翻译前定向调节。理论上，每个细胞mRNA均可通过诱导选择性RNAi响应进行调节。
目前常用的是21-23bp siRNA在哺乳动物细胞中有效诱导RNAi响应的能力(Sontheimer,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.6,127-138,2005)。siRNA的IC50的范围为10-100pM，显著低于最佳药物的1-10nM范围IC50值。因此，由于其精确的选择性，RNAi已成为细胞表型、绘制遗传通路、发现和验证治疗靶标的定向操作基石，并且具有重要的治疗潜力。
RNAi的方面包括：(1)dsRNA，而非单链反义RNA，为干扰试剂；(2)该过程是高度特异性的，并且相当有效(对于有效干扰，每个细胞仅需要一些dsRNA分子)；(3)干扰活性(并且推测为dsRNA)可造成细胞和组织中远离引入位点的干扰。然而，有效递送dsRNA是很难的。例如，分子量为13,860道尔顿的21bp dsRNA不能穿过细胞膜而进入细胞质，这是由于RNA的(1)大小和(2)非常多的负(酸性)电荷。本公开提供的方法和组合物使得能够通过电荷中和及改善摄取而递送核酸构建体如dsRNA至细胞中。
可以多种方法制备包含与靶标基因核苷酸序列互补的siRNA序列的dsRNA。用于确定siRNA序列的方法和技术为本领域已知。提供来自国家生物技术信息中心网站(可用的为万维网ncbi.nlm.nih.gov)的登录号或GI号后，siRNA核苷酸序列可获自siRNA挑选程序，Whitehead Institute for Biomedical Research,Massachusetts Institute ofTechnology,Cambridge,Mass.(目前可用的为http:[//]jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/；注意，添加了括号已去除超链接)。可选地，可使用Miyagishi and Taira(2003)的策略确定含有合适的siRNA序列的dsRNA。也存在可商购获得的RNAi设计者算法(http:[//]rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)。可订购的RNA制剂可商购获得。
本公开的核酸构建体还可用作miRNA来诱导mRNA切割。可选地，本公开的核酸构建体可用作反义试剂来结合mRNA，以通过RNA酶诱导切割或空间上封闭翻译。
可借以运输本公开的核酸构建体至细胞中的示例性方法在本文中有描述。
可使用本公开的核酸构建体治疗不同疾病或病症。例如，在递送抗肿瘤siRNA后，可抑制、阻止或破坏肿瘤细胞的生长。例如，抗肿瘤siRNA可为靶向编码促进血管生成的多肽基因的siRNA。与肿瘤生长相关的不同的血管生成蛋白为本领已知。因此，本文描述的核酸构建体可用于治疗诸如抗增殖性疾病(例如，癌症)、病毒感染和遗传疾病的疾病。可使用本公开的多核苷酸治疗的其他疾病为眼睛病症如年龄相关的黄斑变性(例如，如U.S.7,879,813和U.S.2009/0012030中所述的)，以及局部病症如牛皮癣。
可给予包含有效量的组合物用于预防或治疗性治疗。在预防性应用中，可将组合物给与至临床上确定的对癌症或本文描述的任何疾病具有倾向或增加的敏感性的对象。可用足以延迟、减少或改善临床疾病发作的量将本公开的组合物给与至对象(例如，人)。在治疗应用中，用足以治愈或至少部分阻止病况及其并发症症状的量将组合物给与至已患疾病(例如，癌症如白血病或骨髓增生异常综合症)的对象(例如，人)。
对该应用有效的量可取决于对象的疾病或病况的严重性，以及体重和一般状态，但通常范围为每次剂量每名对象约0.05μg至约1000μg(例如，0.5-100μg)当量的试剂。典型的用于初始给药和增强给药的合适方案为，初始给药后间隔每小时、每天、每周或每月一次或多次的重复剂量给药。可将总有效量的存在于本公开的组合物中的试剂给予至哺乳动物作为单次剂量(作为大丸剂或通过在相对短的时段内输注)给药，或者可以使用分级治疗方案给药，其中在更长的时段内给予多次剂量(例如，每4-6小时、8-12小时、14-16小时、18-24小时、每2-4天、每1-2周一次剂量，以及每月一次)。可选地，包括足以在血液中维持治疗有效浓度的连续静脉输注。
在本公开的和用于本公开的应用于哺乳动物(例如，人)的方法的组合物中，一种或多种试剂的治疗有效量可由本领域技术人员考虑哺乳动物的年龄、体重和状况的个体差异后确定。可采用治疗医生选择的剂量水平和模式来实施单次或多次给予本公开的包含有效量的组合物。可基于对象疾病或病况的严重性来确定和调整剂量和给药方案，所述严重性可在根据临床医生通常实施的方法或本文中描述的那些的整个治疗过程中监测。
本公开的一种或多种核酸构建体可结合处理或治疗的常规方法使用，或者可与处理或治疗的常规方法分开使用。
当将一种或多种本公开的核酸构建体与其他试剂组合给药治疗时，可将它们依次或同时给予至个体。可选地，根据本公开的药物组合物可由如本文所述的药学上可接受的赋形剂结合的本公开的核酸构建体与本领域已知的其他治疗或预防试剂的组合组成。
实施例
RNN寡核苷酸的一般合成&纯化。在以下实施例中，本公开的核酸构建体被称为RNN或核糖核酸中性物(neutral)。可根据本文所述的一般的和具体的方法和方案制备本公开的多核苷酸构建体。例如，将含有起始物质的羧酸与巯基醇缩合(例如，参见图1，左上图)，然后与核苷亚磷酰二胺反应从而生成RNN核苷酸构建体(例如，参见图1，中上图)。然后将这些RNN核苷酸构建体用于标准的寡核苷酸合成方案，以形成RNN多核苷酸构建体。然后将这些RNN多核苷酸构建体去保护、HPLC纯化(例如，参见图1，下左图)，并通过MALDI-TOF质谱分析进行分析(例如，参见图1，下中图)。含有20个磷酸基团的21mer多核苷酸通过15％变性PAGE凝胶(用亚甲蓝染色)的迁移速率逐渐减缓，因为越来越多的磷酸阴离子被中和为磷酸三酯基团(例如，参见图1，下右图)。RNN多核苷酸构建体上数目增加的中性磷酸三酯基团造成较慢的迁移，这主要是由于电荷损失，直到添加16磷酸三酯基团后，RNN多核苷酸不具有足够的残留磷酸二酯负电荷来进入凝胶(例如，参见图1，下右图)。
RNN核酸构建体的具体合成&纯化。可用于本文所述方法的核苷酸构建体的示例性合成提供在方案1中。
方案1
方案1显示了制备可用于制备本文所述的多核苷酸构建体的核苷酸构建体的两种替选途径。一种途径采用以P(N(iPr)2)2Cl、然后S-芳基硫代乙醇(SATE)试剂顺序处理保护的核苷。可选地，可用预先形成的硫代亚磷酰胺试剂处理保护的核苷。
类似地，可按方案2中所示进行醛SATE和类似的丙级和丁基(SATB)亚磷酰胺的合成。
方案2
然后可将亚磷酰胺用于制备相应的三酯基团，其可为或可以不为生物可逆的。已制备和研究的示例性的三酯基团示出在表4中，除非另有说明，表4中示例的所有三酯基团均为生物可逆的。
表4
此外，对于表4中的包含一个或多个保护基团如Si-O2-SATE的任何生物可逆的三酯基团，本公开还提供了这些以其去保护形式存在的生物可逆的三酯基团。例如，本文公开的亚磷酰胺方法可用于制备保护的核苷酸构建体，其在低聚合成和去保护后，可提供所需的多核苷酸构建体。已制备了包含方案3中所示生物可逆的硫酯的示例性核酸构建体。
方案3
通过该方法制备的核酸构建体可通过多种分析方法来定征，例如，HPLC、质谱、NMR和凝胶分析。
根据本文所述方法还制备了本公开其他示例性的核酸构建体，所述构建体及证明其合成的分析数据示出在图2A-2L中。
TBSOSATE的合成。
反应1：
将3-羟基-2,2-二甲基丙酸(5g,42.4mmol)和咪唑(7.2g,106mmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(10ml)中。然后在15分钟的时间内将于DMF(8ml)中的叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(TBS-Cl)(7.6g,51mmol)缓慢添加至溶液中。将产生的混合物搅拌12小时，并通过添加水(10ml)来淬灭反应。通过用EtOAc/水(250ml:250ml)提取来分离得到的产物。用水(3X250ml)洗涤乙酸乙酯层，然后在真空中蒸发EtOAc来获得粗制混合物。将粗制混合物溶解于1M NaOH(10ml)和水(40ml)中。通过用EtOAc提取去除不溶杂质后，用1M HCl(40ml)中和水层。用EtOAc(250ml)提取得到的产物，用盐水(2X 200ml)洗涤，并在无水Na2SO4上干燥。在真空中蒸发掉溶剂以提供3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧)-2,2-二甲基丙酸(82％收率，8g)，其不经过进一步纯化被用于接下来的反应。
反应2：
在干冰中冷却于二氯甲烷(CH2Cl2)(120ml)中的3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧)-2,2-二甲基丙酸(4.2g,18mmol)的同时，在10分钟的时间内逐滴添加氯甲酸异丁酯(2.36ml,18mmol)和三乙胺(Et3N)(2.5ml,18mol)。将得到的混合物在干冰浴中搅拌10分钟，然后在环境温度下搅拌30分钟。之后，添加Et3N(2.5ml)和β-巯基乙醇(36mmol；2.5ml)。在环境温度下将混合物搅拌2.5小时。在将反应用饱和NaHCO3溶液(30ml)淬灭后，分离有机层并在无水Na2SO4上干燥。在真空中蒸发掉溶剂，然后通过硅胶柱层析使用(己烷:乙酸乙酯)(Combi Flash Rf仪器上0-30％梯度)纯化得到的粗制混合物来获得TBSOSATE(78％收率；4g)。1H NMR(400MHz)δ0.01(s,6H),0.8(s,9H),1.2(s,6H),1.9(s,1H),3.0(t,2H),3.6(s,2H),3.7(m,2H)。C13H28O3Ssi的ESI MS Calc.292.15Obs.[M+H]+293.17,[M+NH4]+310.16,[M+Na]+315.17。TBSOSATE的代表性谱图提供在图2A中。
TBSOSATE亚磷酰胺的合成。
将于干燥CH2Cl2(5ml)中的二-(N,N-二异丙基氨基)-氯代膦(1g,4mmol)的溶液逐滴添加至于干燥CH2Cl2(24ml)中的磁力搅拌且冷冻(-78℃)的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-尿苷(2g,3.64mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.71ml,0.4mmol)的溶液中。允许反应混合物升温至环境温度，同时维持搅拌1-1.5小时。在分部分添加于干燥CH2Cl2(5ml)中的TBSOSATE(1g,4mmol)后，将反应混合物搅拌10分钟。然后将乙基硫代四唑(7.3ml，于乙腈中的0.25M溶液,1.82mmol)添加至反应混合物中。将反应混合物搅拌4-6小时，然后添加CH2Cl2(60ml)。以饱和碳酸氢钠(20ml)水溶液和盐水(2x 20ml)洗涤反应混合物，然后在无水硫酸钠上干燥。在真空中蒸发掉溶剂，并通过快速硅胶柱层析(在combiflash Rf仪器上，使用己烷:乙酸乙酯(0.5％TEA)作为溶剂)纯化产生的粗制残留物。收集含有产物的级分，合并在一起，然后蒸干。将得到的泡沫样残留物重新溶解于苯中，冷冻并冻干以提供TBSOSATE_U，其为无色粉末(80％收率，作为非对映体混合物；2.8g)。C49H69FN3O10PSSi的ESI MS计算值为969.42,观察值为[M+H]+969.89,[M+Na]+992.29。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ150.21(d,JP-F＝7.9Hz),150.53(d,J P-F＝8.5Hz)。TBSOSATE U的代表性谱图示出在图2B和图2D中。
TBOSATE CPa亚磷酰胺的合成。
通过本文公开的针对TBSOSATE U亚磷酰胺的如下方案，但将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-CPac替换为5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-尿苷，来合成TBSOSATE CPac亚磷酰胺。TBSOSATE_CPac的分离收率为70％。C57H76FN4O11PSSi的ESI MS计算值为1102.47，观察值为[M+Na]+1125.9,[M+K]+1141.62。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ150.18(d,J P-F＝8.4Hz),150.43(d,J P-F＝8.7Hz)。TBSOSATE_CPac的代表性谱图示出在图2C和图2D中。
TBOSATE APac亚磷酰胺的合成。
通过本文公开的针对TBSOSATE U亚磷酰胺的如下方案，但将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-APac替换为5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-尿苷，来合成TBSOSATE APac亚磷酰胺。TBSOSATE_APac的分离收率为70％。C59H79N6O11PSSi的ESI MS计算值为1138.503，观察值为[M+H]+1139.6,[M+Na]+1161.65。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ149.88&150.53。TBSOSATE_APac的代表性谱图示出在图2C和图2E中。TBSOSATE_GiPac的合成。
反应1：
将于干燥CH2Cl2(5ml)中的二-(N,N-二异丙基氨基)-氯代膦(1.75g,6.6mmol)的溶液逐滴添加至于干燥CH2Cl2(15ml)中的磁力搅拌且冷冻(-78℃)的TBSOSATE(1.6g,5.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.71ml,6.6mmol)的溶液中。在-78℃维持搅拌1小时。在真空中蒸发掉溶剂。然后添加己烷(50ml)，这产生了副产物二异丙基乙基盐酸盐的白色沉淀。在氩气气氛下过滤沉淀。在真空中蒸发掉滤液以获得～3g的粗制TBSOSATE四异丙基亚磷酰胺，其不经过进一步纯化被用于接下来的反应。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ125ppm。
反应2：
向于干燥CH2Cl2(15ml)中的二甲氧基三苯甲基-2’-OMe-异丙基苯氧乙酰基-鸟苷(1g,1.3mmol)和二异丙基四唑胺(0.22g,1.3mmol)的溶液中，添加TBSOSATE四异丙基亚磷酰胺(1.4g,2.6mmol)。将混合物搅拌16小时，然后添加DCM(50ml)和饱和的NaHCO3溶液(20ml)。分离有机层并在无水硫酸钠上干燥。真空中蒸发掉溶剂，并通过快速硅胶柱层析(在combiflash Rf仪器上)，使用己烷:乙酸乙酯(0.5％TEA)作为溶剂(0-100％)纯化产生的粗制残留物。分离包含产物的级分，合并在一起，并蒸干。将产生的泡沫样残留物重新溶解在苯中，冷冻并冻干，这提供了无色粉末(60％收率，作为非对映体混合物；0.75g)。C62H85N6O12PSSi的ESI MS计算值为1196.54，观察值为[M+H]+1197.33,[M+Na]+1219.5。31PNMR(121MHz,CDCl3)δ150.23&150.74。TBSOSATE_GiPac的代表性谱图示出在图2B和图2E。
乙缩醛AldSATE的合成。
反应1：
将BF3·Et2O(2.5ml,20mmol)添加至于CH2Cl2(30ml)中的4-甲酰基苯甲酸(3g,20mmol)、2,2-二乙基1,3-丙二醇(3.25g,26mmol)中。将反应混合物在环境温度下搅拌2小时。通过添加三乙胺(2.8ml)来淬灭反应，然后在真空中蒸发掉溶剂。将产生的残留物重新溶解在DCM(100ml)中，用水(2X 100ml)洗涤，并在无水硫酸钠上干燥。在真空中蒸发掉溶剂，以提供4-(5,5-二乙基-1,3-二氧己环-2-基)苯甲酸(3.5g)。产物不经过任何进一步的纯化用于接下来的反应。C15H20O4的ESI MS计算值为264.136，观察值为[M+H]+265.1,[M+Na]+287.1。
反应2：
在干冰浴中冷却于二氯甲烷(CH2Cl2)(120ml)中的4-(5,5-二乙基-1,3-二氧己环-2-基)苯甲酸(3.4g,13.3mmol)的同时，在10分钟的时间内逐滴添加氯甲酸异丁酯(1.8ml,13.3mmol)和三乙胺(Et3N)(1.85ml,13.3mol)。将混合物在干冰浴中搅拌10分钟，然后在环境温度下搅拌30分钟。然后添加Et3N(1.85ml)和β-巯基乙醇(26.6mmol)(1.9ml)。在环境温度下将反应混合物搅拌2.5小时。通过薄层层析验证产物形成。在通过添加饱和的NaHCO3溶液(30ml)淬灭反应后，分离有机层，并在无水Na2SO4上干燥。在真空中蒸发掉溶剂，并通过硅胶柱层析使用己烷:乙酸乙酯(0-30％梯度，在Combi Flash Rf仪器上)纯化粗制混合物，以提供乙缩醛AldSATE(80％收率；3.4g)。1H NMR(400MHz)δ0.79-0.88(m,6H),1.13(m,2H),1.8(t,2H),3.25(t,2H),3.6(t,2H),3.8(m,2H),3.85(m,2H),5.42(s,1H),7.6(d,2H)。C17H24O4S的ESI MS计算值为324.14，观察值为[M+H]+325.2,[M+Na]+347.2。乙缩醛AldSATE的代表性谱图示出在图2F中。
乙缩醛AldSATB的合成。
通过本文公开的针对乙缩醛AldSATE的下述方案，但将4-巯基-丁-1-醇替换为β-巯基乙醇，合成了乙缩醛AldSATB。AldSATB的分离收率为80％。1H NMR(400MHz)δ0.8-1.0(m,6H),1.1(t,2H),1.7-1.8(m,10H),3.1(t,2H),3.6-3.7(m,5H),3.9(t,2H),5.4(s,1H),7.6(d,2H),7.9(d,2H)。C19H28O4S的ESI MS计算值为352.17，观察值为[M+H]+353.3,[M+Na]+375.3。AldSATB的代表性谱图示出在图2I中。
乙缩醛AldSATE亚磷酰胺的合成。
将于干燥CH2Cl2(5ml)中的二-(N,N-二异丙基氨基)-氯代膦(1g,4mmol)的溶液，逐滴添加至于干燥CH2Cl2(24ml)中的磁力搅拌且冷却(-78℃)的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-尿苷(2g,3.64mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.71ml,4mmol)的溶液中。允许反应混合物升温至环境温度，同时持续搅拌1-1.5小时。在将于干燥CH2Cl2(5ml)中的乙缩醛AldSATE(1g,3.3mmol)分部分添加至反应混合物后，将混合物搅拌10分钟，然后添加乙基硫代四唑(7.3ml,于乙腈中的0.25M溶液，1.82mmol)。将反应混合物搅拌4-6小时，然后添加CH2Cl2(60ml)。用饱和的碳酸氢钠水溶液(20ml)和盐水(2x 20ml)洗涤反应混合物，然后在无水硫酸钠上干燥。真空下蒸发溶剂，并通过快速硅胶层析(在combiflash Rf仪器上，使用己烷:乙酸乙酯(0.5％TEA)作为溶剂)纯化生成的粗制残留物。分离包含产物的级分，合并在一起，并蒸干。将生成的泡沫残基重新溶解在苯中，冷冻并冻干，以提供乙缩醛AldSATE_U亚磷酰胺，其为无色粉末(80％收率的非对映体混合物；2.9g)。
C53H65FN3O11PS的ESI MS计算值为1001.4，观察值为[M+H]+1002.07,[M+Na]+1024.41。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ150.27(d,JP-F＝8.0Hz),150.63(d,J P-F＝7.8Hz)。乙缩醛AldSATE_U的代表性谱图示出在图2H中。
乙缩醛AldSATB_U亚磷酰胺的合成。
通过本文所述的针对乙缩醛AldSATE_U亚磷酰胺的下述方案，但将乙缩醛AldSATB替换为乙缩醛AldSATE，合成乙缩醛AldSATB_U亚磷酰胺。AldSATB_U的分离收率为70％。C55H69FN3O11PS的ESI MS计算值为1029.43，观察值为[M+H]+1030.12,[M+Na]+1052.35。31PNMR(121MHz,CDCl3)δ150.27(d,JP-F＝8.0Hz),150.63(d,J P-F＝7.8Hz)。乙缩醛AldSATB_U的代表性谱图示出在图2J和图2K中。
乙缩醛AldSATE_CPac亚磷酰胺的合成。
通过本文公开的针对乙缩醛AldSATE_U亚磷酰胺的如下方案，但将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-CPac替换为5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-尿苷，来合成乙缩醛AldSATE_CPac亚磷酰胺。乙缩醛AldSATE_CPac亚磷酰胺的分离收率为70％。C61H72FN4O12PS的ESI MS计算值为1132.46，观察值为[M+Na]+1157.44。
31P NMR(121MHz,CDCl3)δ150.44(d,J P-F＝8.1Hz),150.74(d,J P-F＝8.5Hz)。乙缩醛AldSATE_CPac亚磷酰胺的代表性谱图示出在图2G和图2L中。
乙缩醛AldSATB_CPac亚磷酰胺的合成。
通过本文公开的针对乙缩醛AldSATE_CPac亚磷酰胺的如下方案，但将乙缩醛AldSATB替换为乙缩醛AldSATE，来合成乙缩醛AldSATB_CPac亚磷酰胺。乙缩醛AldSATB_CPac亚磷酰胺的分离收率为70％。C63H76FN4O12PS的ESI MS计算值为1162.49，观察值为[M+Na]+1185.45。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ149.9(d,J P-F＝8.2Hz),150.4(d,J P-F＝8.3Hz)。AldSATB_CPac亚磷酰胺的代表性谱图示出在图2J中。
乙缩醛AldSATE_APa亚磷酰胺的合成。
通过本文公开的针对乙缩醛AldSATE_U亚磷酰胺的如下方案，但将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-APac替换为5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-F-尿苷，合成了乙缩醛AldSATE_APac亚磷酰胺。乙缩醛AldSATE_APac亚磷酰胺的分离收率为70％。C63H75N6O12PS的ESI MS计算值为1170.49，观察值为[M+Na]+1193.43。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ149.9&150.8。乙缩醛AldSATE_APac亚磷酰胺的代表性谱图示出在图2H中。
乙缩醛AldSATB_APac亚磷酰胺的合成
通过本文公开的针对乙缩醛AldSATE_APac亚磷酰胺的如下方案，但将乙缩醛AldSATB替换为乙缩醛AldSATE，来合成乙缩醛AldSATB_APac亚磷酰胺。乙缩醛AldSATB_APac亚磷酰胺的分离收率为70％。C65H79N6O12PS的ESI MS计算为值1198.52，观察值为[M+Na]+1221.43。31P NMR(121MHz,CDCl3)δ149.3&150.3。乙缩醛AldSATB_APac亚磷酰胺的代表性谱图示出在图2K和图2L中。
生物可逆的中性磷酸三酯至带负电荷的磷酸二酯的定量细胞内转化。示例性的多核苷酸和示例性的脂质转染数据提供在图3中。如图3中所述，将包含可水解的tBu-SATE生物可逆的部分的经修饰的多核苷酸(SEQ ID NO:26)定量切割以提供siRNA(具有2’修饰)。相反，包含不可逆的二甲基丁基磷酸三酯(DMB)基团的功能化的多核苷酸在胞内被切割为siRNA。
由包含寡核苷酸的磷酸三酯诱导RNAi响应需要将磷酸三酯切割、分解和溶解为磷酸二酯连接，以用于TRBP介导的装载至Ago2/RISC。合成了靶向GFP mRNA的双链siRNN(磷酸三酯基团表示为气泡)(参见图3，上图)。将包含生物可逆的tBut-SATE或对照不可逆的二甲基丁基(DMB)或对照野生型磷酸二酯(参见图3，下图)的引导(反义)链的5’端进行32P标记。将siRNN转染至细胞。在使用抗-Ago2免疫共沉淀后，在15％变性PAGE凝胶上加载细胞溶解物并电泳30小时。如同所示的，存在硫酯酶定量细胞内转化tBut-SATE RNN寡核苷酸，以及与野生型磷酸二酯寡核苷酸的共迁移(参见图3，中间的图)。相反，仅检测到背景水平的与Ago2相关的对照32P标记的不可逆DMB RNN，表明这些构建体未经历细胞内切割。数据表明，包含siRNN的SATE磷酸三酯在胞内被转化为具有生物活性的siRNA，并装载至Ago2。
siRNN体外诱导GFP和荧光素酶RNAi响应。H1299细胞中siRNN诱导GFP RNAi响应，并沉默GFP表达(参见图4)。合成了靶向GFP mRNA的双链siRNN(磷酸三酯基团表示为蓝色气泡)(参见图4，上图)。将野生型磷酸二酯GFP siRNA或非靶向对照siRNA，以及SATE磷酸三酯siRNN GFP或非靶向对照siRNN转染至组成性表达GFP的H1299细胞。生成了第2天GFP表达的RNAi抑制的剂量和动力学曲线，其为通过流式细胞术测定的GFP表达的曲线(参见图4，中左图和中右图)。通过PCR扩增GFP mRNA进行来自转染的细胞的GFP表达的5’RACE研究。虽然从用靶向GFP的SATE磷酸三酯siRNN和siRNA转染的细胞发现了正确的189bp片段，未发现非靶向对照siRNA的该片段(参见图4，下左图)。来自下左图的5’RACE cDNA片段的cDNA序列分析，显示了Ago2介导的RNAi响应的正确GFP mRNA切割(参见图4，下右图)。
以组成性表达荧光素酶的H1299细胞进行类似的沉默实验(参见图5)。类似于组成性GFP表达的结果，通过以siRNN转染细胞观察到RNAi响应的诱导，这与对照载体相反(参见图5)。
在表达肝荧光素酶的小鼠模型中siRNN体外诱导荧光素酶RNAi响应。合成了靶向荧光素酶mRNA的双链siRNN(磷酸三酯基团表示为蓝色气泡)(参见图7，上图)。将选择性表达肝(liver)荧光素酶的小鼠随机分组(参见图7，上左图)。将模拟物(PBS)、荧光素酶siRNA或tBut-SATE和O-SATE磷酸三酯荧光素酶siRNN，或对照不可逆的DMB荧光素酶siRNN，经水动力递送至肝。尾静脉水动力递送在肝中临时(2-5min)产生孔，这允许siRNA/siRNN通过孔扩散并进入细胞质。然后在30天的过程中通过体内IVIS成像分析小鼠的荧光素酶表达。以靶向荧光素酶的野生型siRNA、tBut-SATE siRNN或O-SATE siRNN处理的小鼠诱导了在量级和持续时间上相当的荧光素酶RNAi响应，然而对照不可逆的DMB荧光素酶siRNN不能诱导RNAi响应(参见图7，右图)。这些结果表明，生物可逆的磷酸三酯siRNN在体内被细胞内硫酯酶有效转化为活性RNAi分子。
TAT PTD-siRNN的自我递送。进行了通过与TAT PTD递送肽缀合的siRNN的自我递送实验(参见图8，上图)。生成了靶向GFP报告基因的可溶和单体自我递送siRNN、靶向GFP报告基因的对照不可逆的siRNN和模拟物处理的GFP细胞的剂量曲线。使用0.22nmole通过FACS直方图分析比较和分析了曲线(参见图8，下左图)，然后标准化至模拟物处理的GFP细胞(参见图8，下右图)。对于图8，P6(A6)表示具有6个Ald-SATE的随从链；并且G6(A6)表示具有6个Ald-SATE的引导链。结果表明，以生物可逆的TAT PTD-siRNN缀合物处理表达GFP的细胞引起自我递送和RNAi响应诱导，而以对照不可逆的TAT PTD-siRNN缀合物处理不能诱导RNAi响应。这些结果表明，siRNN作为可溶、单体缀合物(非纳米颗粒)自我递送至细胞中、转化为活性带电荷的磷酸二酯RNAi分子和诱导RNAi响应的能力。
利用SDS-PAGE分析确定dsRNN形成。为了确定耐受siRNN双链的磷酸三酯插入的最大数目，将包含不同数目的磷酸三酯的随从链和引导链ssRNN分子退火并通过SDS-PAGE进行分析。通过将随从链和引导链混合物加热至65℃持续5分钟，然后冷却至环境温度15分钟来完成退火。通过在非变性SDS-PAGE凝胶上电泳，然后进行溴化乙锭染色(参见图8，下图)或银染(参见图8，上图)来分析退火的dsRNN双链。通过测定银染的SDS-PAGE凝胶的密度确定了每种dsRNN组合的dsRNN形成百分比。在图8中，显示了与包含位于不同位置(P13a、P13b、P13c)的磷酸三酯插入的13x磷酸三酯随从链退火的13x磷酸三酯引导链(G13b)。注意，退火效率(％双链)的偏差与dsRNN骨架上的磷酸三酯插入位点的差异相关。
具有不同O-SATE ssRNN组合的dsRNN形成效率的概述。图9和图10表明，本公开的多核苷酸构建体的杂交依赖于生物可逆的基团的类型和间隔。在这些图中，随从链(P)为5’-CCACUACCUGAGCACCCAGUU-3’(SEQ ID NO:27)，并且引导链(G)为5’-CUGGGUGCUCAGGUAGUGGUU-3’(SEQ ID NO:28)。所述数字指示生物可逆的基团的位置(从5’端开始计数)。默认的生物可逆的基团为O-SATE；其他生物可逆的基团为4-甲酰基苯甲酸酯-SATE(A)。
在进行图8中描述的方案后，将O-SATE ssRNN分子的不同组合退火，并分析通过测定银染的SDS-PAGE凝胶的密度来测定dsRNN形成的效率(参见图9)。在图9中，测试了包含不同数目和位置的O-SATE磷酸三酯的随从链(P)和引导链(G)(参见图9，下图用于命名)。将dsRNN的形成效率分类成了5类(>90％、>75％、～50％、<10％或0％)。注意两种野生型随从链(PWT)和引导链(GWT)与包含大量O-SATE插入的ssRNN分子有效退火的能力(分别为G16a和P15a)(参见图9，上图)。然而，一些组合不会产生大量的杂交(例如，<50％杂交)。在一些研究中，未测量杂交。当两条链达到特定的磷酸三酯数目和位置时，dsRNN形成被折衷(即P15a/G16a dsRNN＝0％)(参见图9，上图)。仅以>90％效率退火的dsRNN分子被用于后面的研究。
Ald-SATE ssRNN寡核苷酸的dsRNN形成的概述。在进行图8中所述的方案后，将Ald-SATE或SPTE ssRNN分子的不同组合退火，并通过测定银染的SDS-PAGE凝胶的密度进行分析，以确定dsRNN的形成效率(参见图10)。在图10中，测试了包含不同数目和位置的Ald-SATE或SPTE磷酸三酯的随从链(P)和引导链(G)(参见图10，下图用于命名)。与图9中研究的核酸相反，图10中提供的随从链和引导链包含很少功能化的多核苷酸(例如，每条链3-6个磷酸三酯)。将dsRNN的形成效率分成了5类(>90％、>75％、～50％、<10％或0％)。注意，如通过银染的SDS-PAGE凝胶的密度测定分析所确定的，所有含有dsRNN组合的Ald-SATE均显示>90％的dsRNN形成效率。所有Ald-SATE dsRNN组合均被用于接下来的缀合和细胞内递送研究。
ssRNN寡核苷酸的反相HPLC纯化的实例。在进行寡核苷酸合成和去保护后，通过反相HPLC(RP-HPLC)分离ssRNN寡核苷酸(参见图11)。通过与柱子的疏水相互作用，在三乙基铵乙酸酯(TEAA)和递增的乙腈梯度存在下，从污染物分离所需的低聚产物(参见图11，上图)。跨越产物主峰的级分引起所需的低聚合成产物的纯化(参见图11，下图)。注意，RP-HPLC级分6–8含有最终的低聚产物，其纯度>95％。
含有dsRNN寡核苷酸的Ald-SATE的肽缀合。在RP-HPLC纯化后，将尿素变性凝胶用于合成最终的ssRNN寡核苷酸产物(参见图12)。分离含有ssRNN寡核苷酸(P5(A5)a和P6(A6)a)的Ald-SATE的纯度>95％(参见图12，左图)。在将不同Ald-SATE随从链与含有6x SPTE的引导链(G6(S6)a)形成双链后，通过Ald-SATE末端上的游离醛将dsRNN分子与肽转导结构域3T3S缀合。在肽缀合后，通过银染的SDS-PAGE凝胶评估缀合效率(参见图12，中间的图)。在图12中，示出了siRNN寡核苷酸基于存在的Ald-SATE插入的数目与递增数目的肽缀合的能力(参见图12，右图)。应注意，存在Ald-SATE插入与3T3S肽的几乎定量的缀合。
TAT PTD-siRNN的自我递送的比较。使用图9和图10中的siRNN命名法缩写，将Ald-SATE和tBut-SATE磷酸三酯放置于所示的siRNN上的不同位置，与TAT递送肽缀合，纯化并分析自我递送(参见图13)。在自我递送后48小时，通过流式细胞术测量在组成性表达GFP的H1299细胞中诱导的GFP RNAi响应，并与非靶向的对照荧光素酶siRNN比较。提供了FACS直方图(参见图13，上右图)和标准化至模拟物处理的GFP细胞的剂量曲线(参见图13，下图)。
限制Ald-SATE磷酸三酯数目的TAT PTD-siRNN的自我递送的比较。类似于上述的图13，图14显示了通过自我递送siRNN和靶向组成性表达GFP的对照H1299细胞诱导的RNAi响应。通过改变随从链上Ald-ASTE磷酸三酯基团的数目和位置(参见图14，上图)(对于具体的位置，参见图9和图10的命名)，可检测RNAi响应相比非靶向对照荧光素酶siRNN的差异。提供了FACS直方图(参见图14，上右图)和标准化至模拟物处理的GFP细胞的剂量曲线(参见图14，下图)。
磷酸三酯连接子-1长度的比较。为了研究硫酯酶切割硫酯键(第一步骤)后，第二步骤连接子-1(L1)长度对完全的磷酸三酯剔除的贡献，合成了靶向GFP的引导链RNN，其中RNN在所有6个尿苷核苷酸间桥连基团处含有如同所示的磷酸三酯基团(参见图15，上面的直方图)(参见图4的序列)，以及野生型磷酸二酯随从链。将25nM siRNN转染至组成性表达GFP的H1299细胞，并通过FACS分析随时间的GFP RNAi响应，并标准化至模拟物处理的GFP细胞(参见图15，下图)。tBut-SATE(L1＝乙基)、Ipr-SATB(L1＝丁基)诱导类似于野生型磷酸二酯siRNA的GFP RNAi响应，而对照不可逆的DMB磷酸三酯siRNN未诱导RNAi响应，并且tBut-SATP(L1＝丙基)在72小时产生仅～50％的响应(参见图15，下左图)。相比Ipr-SATB，tBut-SATB(L1＝丁基)诱导延迟的RNAi响应，证明了L2和G基团对磷酸三酯转化率的影响。Ipr-SATEE(L1＝乙氧基乙基)也诱导了延迟的和差的RNAi响应(参见图15，下左图)。因此，图15表明以包含tBu-SATE和iPR-SATB磷酸三酯的siRNN实现了类似于野生型的RNAi响应，所述tBu-SATE和iPR-SATB磷酸三酯分别形成了3元和5元环中间物。利用包含SATP(4元中间物)或SATEE(在连接子中含有杂原子的5元中间物)磷酸三酯的siRNN观察到延迟的和/或不完全的RNAi响应。硫酯基团的空间结构也能影响RNAi响应，因为tBuSATB显示相对于iPrSATB磷酸三酯的延迟响应。
不脱离本公开范围和精神的本公开所述方法和系统的各种修改和变化，对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的可取实施方案描述了本公开，应理解，要求保护的本公开不应过度地限制于这样的具体实施方案。确实，用于执行本公开所述实施方式的不同修改对药物、药理学领域或相关领域技术人员是显而易见的，且其旨在归入本公开的范围中。

Claims (133)

1.多核苷酸构建体，其具有通过核苷酸间桥连基团共价结合在一起的10至32个核苷酸，并且任选地具有末端核苷酸基团，所述多核苷酸构建体包含选自如下的组分(i)：肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分以及以上物质的任意组合，
其中所述组分(i)通过包含硫酯或二硫化物的生物可逆的基团与所述核苷酸间桥连基团之一连接。
2.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其还包含至少一种选自如下的第二组分(ii)：包含亲水性功能基团的生物可逆的基团、包含缀合部分的生物可逆的基团和包含缀合部分及亲水性基团的生物可逆的基团，
其中所述缀合部分还可以包含保护基团，并且
其中至少一种第二组分(ii)与所述核苷酸间桥连基团之一连接或者如果存在所述末端核苷酸基团的话，与所述末端核苷酸基团之一连接。
3.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述生物可逆的基团包含硫酯。
4.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述组分(i)允许所述多核苷酸构建体经胞内运输，由此所述生物可逆的基团被切割。
5.如权利要求2所述的多核苷酸构建体，其还包含选自如下的至少一种第三组分(iii)：小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合，其中所述组分(iii)经胞内生物可逆的基团与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团缀合，并且
其中至少一种第三组分(iii)与所述核苷酸间桥连基团之一连接或者如果存在所述末端核苷酸基团的话，与所述末端核苷酸基团之一连接。
6.如权利要求5所述的多核苷酸构建体，其中组分(iii)为所述小分子。
7.如权利要求6所述的多核苷酸构建体，其中所述小分子为任选取代的C1-6烷基。
8.多核苷酸构建体，其具有式II所示的结构或其盐：
其中一个R2包含组分(i)，
Z为8-30的数字；
每个B1单独地为核苷酸碱基；
每个X单独地选自O、S和NR5；
每个Y单独地选自氢、羟基、卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
每个R2单独地为不存在、氢，或者包含亲水性功能基团的第一生物可逆的基团、包含缀合部分的第二生物可逆的基团，或者包含辅助部分的第三生物可逆的基团，所述辅助部分选自小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合，其中所述缀合部分或所述亲水性功能任选地被保护基团保护；
每个R5单独地选自H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基和任选取代的C2-9杂环基；
每个R9单独地为O或S；
R10选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、5’帽、硫代磷、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合；并且
R11选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、硫代磷、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合；
前提是至少一个R2是所述第三生物可逆的基团。
9.如权利要求8所述的多核苷酸构建体，其包含具有式II(a)所示结构的核苷酸的一条或多条链：
10.如权利要求8所述的多核苷酸构建体，其中对于R2为所述第一、第二或第三生物可逆的基团的核苷酸，Y为F或OMe。
11.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中与所述生物可逆的基团结合的组分(i)具有结构式V：
其中，
G1为肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合；
L1为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
L2为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。
12.如权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中与所述生物可逆的基团结合的组分(ii)具有结构式V：
其中，
G1为缀合部分或亲水性功能基团；
L1为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
L2为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。
13.如权利要求11所述的多核苷酸构建体，其中L1为
其中L2’为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；
G2为缀合部分、亲水性功能基团、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合。
14.如权利要求11所述的多核苷酸构建体，其还包含式V’所示的结构：
其中，
G1’为缀合部分、亲水性功能基团、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合；
L1’为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
L2’为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。
15.如权利要求11所述的多核苷酸构建体，其中结构式V选自：
16.如权利要求15所述的多核苷酸构建体，其中结构式V选自：
17.如权利要求15所述的多核苷酸构建体，其中结构式V选自：
18.如权利要求15所述的多核苷酸构建体，其中结构式V选自：
19.如权利要求14所述的多核苷酸构建体，其中结构式V’选自：
20.如权利要求19所述的多核苷酸构建体，其中结构式V’选自：
21.如权利要求11所述的多核苷酸构建体，其中L1为任选取代的C2-10亚烷基。
22.如权利要求21所述的多核苷酸构建体，其中L1为未取代的或取代的C2、C4或C5亚烷基。
23.如权利要求11所述的多核苷酸构建体，其中L2为共价键。
24.如权利要求11所述的多核苷酸构建体，其中L2为任选取代的C1-10亚烷基或任选取代的C6-12亚芳基。
25.如权利要求12所述的多核苷酸构建体，其中G1为羟基。
26.如权利要求12所述的多核苷酸构建体，其中G1为缀合部分。
27.如权利要求26所述的多核苷酸构建体，其中所述缀合部分为-CHO、巯基或-N3。
28.如权利要求11所述的多核苷酸构建体，其中G1包含肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合。
29.如权利要求28所述的多核苷酸构建体，其中L2不为键，并且G1通过由选自如下的反应形成的键与L2结合：周环反应；羟基、巯基或氨基部分的烷基化或芳基化；以及羟基、巯基或氨基亲核试剂与亲电试剂的反应。
30.如权利要求28所述的多核苷酸构建体，其中L2不为键，并且G1通过酰胺键、磺胺键、羧酸酯、硫酯、任选取代的C6-12芳基或C2-9杂芳基；亚胺；腙；肟；或琥珀酰亚胺与L2结合。
31.如权利要求12所述的多核苷酸构建体，其中用保护基团保护了R2的一个或多个亲水性功能基团和/或缀合部分。
32.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过与醛缀合部分的缩合反应与所述生物可逆的基团连接，从而形成亚胺、烯胺或腙键。
33.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过一个或多个含氮的缀合部分与所述生物可逆的基团结合，所述含氮的缀合部分具有式III所示的结构：
其中，
A1、A2、A4和A5每个单独地为N或CR8；
A3和A6为C；
R6-R7每个单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的亚胺和任选取代的烯胺；并且
每个R8单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、卤素、羟基、-CHO、任选取代的C1-6酰基、羧基、氰基、硝基、任选取代的氨基、巯基、任选取代的C2-9杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C3-8环烷基和任选取代的C4-8环烯基。
34.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中最多25％的所述生物可逆的基团与所述肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合连接。
35.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中最多50％的所述生物可逆的基团与所述肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合连接。
36.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中最多75％的所述生物可逆的基团与所述肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合连接。
37.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中最多90％的所述生物可逆的基团与所述肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合连接。
38.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述组分(i)包含递送结构域。
39.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中所述递送结构域包含一个或多个肽转导结构域(PTD)。
40.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中所述一个或多个PTD通过亚胺、烯胺或腙键与所述生物可逆的基团连接。
41.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中所述一个或多个PTD与所述生物可逆的基团连接而形成结构式IV：
其中，
R2’为所述生物可逆的基团与所述PTD结合的残基；
z’为1-10的数字，其中当z’大于1时，所述PTD可通过具有1-10个重复单元的聚(C1-4环氧烷烃)基团连接在一起。
42.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中所述一个或多个PTD为反式激活转录激活因子(TAT)肽。
43.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中所述PTD通过互补缀合部分与所述生物可逆的基团连接，所述互补缀合部分包含式III所示的结构：
其中，
A1、A2、A4和A5每个单独地为N或CR8；
A3和A6为C；
R6-R7每个单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的亚胺和任选取代的烯胺；并且
每个R8单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、卤素、羟基、-CHO、任选取代的C1-6酰基、羧基、氰基、硝基、任选取代的氨基、巯基、任选取代的C2-9杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C3-8环烷基和任选取代的C4-8环烯基。
44.如权利要求43所述的多核苷酸构建体，
其中所述生物可逆的基团在缀合前选自：
45.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中所述PTD包含在5-15个氨基酸中具有5-10个精氨酸和/或赖氨酸残基的阳离子型肽序列。
46.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中所述PTD包含序列RKKRRQRRR(SEQ IDNO:1)。
47.如权利要求38所述的多核苷酸构建体，其中组分(i)包含与具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)(PEG)缀合的PTD。
48.如权利要求47所述的多核苷酸构建体，其中组分(i)包含选自如下的序列：
PEG-(PTD)；
GG-(PTD)-PEG-(PTD)；
PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；
GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；
PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；
GG-(PTD)-PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；和
GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；
其中PEG为具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)连接子。
49.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中组分(i)包含靶向部分。
50.如权利要求49所述的多核苷酸构建体，其中所述靶向部分为配体、碳水化合物、抗体、Fab、ScFv或单结构域抗体。
51.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其包含非天然的核苷酸碱基。
52.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其仅包含天然存在的核苷酸碱基。
53.如权利要求52所述的多核苷酸构建体，其中所述核苷酸碱基选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
54.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体中不多于75％的核苷酸具有所述生物可逆的基团。
55.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体中不多于65％的核苷酸具有所述生物可逆的基团。
56.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含5-10个生物可逆的基团。
57.如权利要求56所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体具有17-30个核苷酸。
58.如权利要求8所述的多核苷酸构建体，其具有式II(a)所示的结构或其盐：
其中一个R2包含所述组分(i)，
Z为8-30的数字；
每个B1单独地为核苷酸碱基；
每个Y单独地选自羟基、卤素或C1-6烷氧基；
每个R2单独地为不存在；氢；式V所示的基团：
其中，
G1为肽、多肽、中性有机聚合物或以上物质的任意组合；
L1为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基或任选取代的C2-6亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1或2个氧原子；并且
L2为共价键，或选自任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C2-6亚烯基；任选取代的C2-6亚炔基；和任选取代的C6-10亚芳基；或
式V’所示的基团：
其中，
G1’为氢、醛或经保护的醛、羟基、经保护的羟基、胺、经保护的胺，或以保护基团或C1-6烷基任选取代的5元或6元杂环胺；
L1’为任选取代的C2-6亚烷基，其中每个亚烷基任选插入有1或2个氧原子；并且
L2’为共价键，或选自任选取代的C1-6亚烷基和任选取代的C6-10亚芳基；
R10选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、5’帽、硫代磷、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、肽、多肽、中性有机聚合物以及肽、多肽和中性有机聚合物的任意组合；并且
R11选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、任选取代的C1-6烷基、肽、多肽、中性有机聚合物以及肽、多肽和中性有机聚合物的任意组合，
前提是至少一个R2是式V所示的基团。
59.如权利要求58所述的多核苷酸构建体，其中对于R2为式V或V’所示基团的核苷酸，Y为F或OMe。
60.如权利要求58所示的多核苷酸构建体，其中结构式V’选自：
61.如权利要求58所述的多核苷酸构建体，其中G1包含递送结构域。
62.如权利要求61所述的多核苷酸构建体，其中所述递送结构域包含一个或多个肽转导结构域(PTD)。
63.如权利要求58所述的多核苷酸构建体，其中G1、R10或R11的中性有机聚合物为聚(乙二醇)。
64.包含一个或多个生物可逆的基团的多核苷酸构建体，所述生物可逆的基团与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团连接，并且选自：
65.如权利要求64所述的多核苷酸构建体，其具有式II所示的结构或其盐：
其中Z为0-150的数字；
每个B1单独地为核苷酸碱基；
每个X单独地选自O、S和NR5；
每个Y单独地选自氢、羟基、卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
每个R2单独地为不存在、氢、生物可逆的基团(i)、生物可逆的基团(ii)或生物可逆的基团(iii)；
每个R5单独地选自H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基和任选取代的C2-9杂环基；
每个R9单独地为O或S；
R10选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、5’帽、硫代磷、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合；并且
R11选自H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、任选取代的C1-6烷基、含氨基的基团、含生物素的基团、含地高辛的基团、含胆固醇的基团、含染料的基团、含淬灭剂的基团、硫代磷、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的任意组合。
66.如权利要求65所述的多核苷酸构建体，其包含具有式II(a)所示结构的核苷酸的一条或多条链：
67.如权利要求65所述的多核苷酸构建体，其中对于R2为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的核苷酸，Y为F或OMe。
68.如权利要求65所述的多核苷酸构建体，其中多核苷酸构建体包含R2基团的混合物，其中
一个或多个R2基团为不存在或H；
一个或多个R2基团为生物可逆的基团(i)；并且
一个或多个R2基团为生物可逆的基团(ii)或(iii)。
69.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:10至10:1。
70.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:5至5:1。
71.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:4至4:1。
72.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:3至3:1。
73.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:2至2:1。
74.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为不存在或H的R2基团与为生物可逆的基团(i)、(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:1。
75.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:10至10:1。
76.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:5至5:1。
77.如权利要求68所示的多核苷酸构建体，其中为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:4至4:1。
78.如权利要求68所示的多核苷酸构建体，其中为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:3至3:1。
79.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:2至2:1。
80.如权利要求68所述的多核苷酸构建体，其中为生物可逆的基团(i)的R2基团与为生物可逆的基团(ii)或(iii)的R2基团的比例为1:1。
81.包含权利要求1-80中任一项所述的多核苷酸构建体的杂交的多核苷酸，其与互补多核苷酸杂交。
82.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述互补多核苷酸包含与核苷酸间桥连基团或末端核苷酸基团缀合的胞内生物可逆的基团。
83.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸构建体和互补多核苷酸每个包含不多于9个生物可逆的基团。
84.如权利要求81所述的多核苷酸，其中不多于75％的总数核苷酸具有生物可逆的基团。
85.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸构建体和互补核苷酸每个具有10-32个核苷酸。
86.如权利要求85所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸构建体和互补核苷酸每个具有19-25个核苷酸。
87.如权利要求81所述的多核苷酸，其中所述杂交的多核苷酸为siRNA。
88.如权利要求87所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸构建体为引导链，并且所述互补多核苷酸为随从链。
89.如权利要求88所述的多核苷酸，其中所述随从链包含具有不可被细胞内酶切割的部分的磷酸三酯。
90.如权利要求89所述的多核苷酸，其中所述不可被细胞内酶切割的部分为任选取代的C1-6烷基。
91.药物组合物，其包含权利要求1-80中任一项所述的多核苷酸构建体，以及药学上可接受的赋形剂。
92.药物组合物，其包含权利要求81所述的杂交的多核苷酸，以及药学上可接受的赋形剂。
93.减少蛋白表达的方法，包括以足以诱导反义或RNAi介导的基因表达减少的量，向体外细胞给予权利要求1-80中任一项所述的构建体。
94.减少蛋白表达的方法，包括以足以诱导反义或RNAi介导的基因表达减少的量，向体外细胞给予权利要求81所述的杂交的多核苷酸。
95.具有式(I)所示结构或其盐的核苷酸构建体：
其中，
B1为核苷酸碱基；
X为O、S或NR5；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯或五磷酸酯；
R2为包含缀合部分或辅助部分的生物可逆的基团，所述辅助部分选自肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分和以上物质的组合，其中所述辅助部分通过一个或多个共价键与所述生物可逆的基团连接，所述生物可逆的基团包含硫酯或二硫化物；
R3为任选取代的氨基；
R4不存在；并且
R5为H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C2-9杂环基。
96.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其包含式I(a)所示的结构：
97.如权利要求96所述的核苷酸构建体，其中R1为4,4'-二甲氧三苯甲基(DMT)保护的羟基。
98.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中R2包含结构式V
其中，
G1为缀合部分、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合；
L1为任选取代的C2-10亚烷基、任选取代的C2-10亚烯基或任选取代的C2-10亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；并且
L2为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子。
99.如权利要求98所述的核苷酸构建体，其中L1为任选取代的C2-10亚烷基。
100.如权利要求99所述的核苷酸构建体，其中L1为未取代的或取代的C2、C4或C5亚烷基。
101.如权利要求98所述的核苷酸构建体，其中L2为共价键。
102.如权利要求98所述的核苷酸构建体，其中L2为任选取代的C1-10亚烷基或任选取代的C6-12亚芳基。
103.如权利要求98所述的核苷酸构建体，其中L2不为键，并且G1通过由选自如下的反应形成的键与L2结合：周环反应；羟基、巯基或氨基部分的烷基化或芳基化；以及羟基、巯基或氨基亲核试剂与亲电试剂的反应。
104.如权利要求98所述的核苷酸构建体，其中L2不为键，并且G1通过酰胺键、磺胺键、羧酸酯、硫酯、任选取代的C6-12芳基或C2-9杂芳基、亚胺、腙、肟或琥珀酰亚胺与L2结合。
105.如权利要求98所述的核苷酸构建体，其中G1为肽、多肽、中性有机聚合物或以上物质的任意组合；
L1为任选取代的C2-6亚烷基、任选取代的C2-6亚烯基或任选取代的C2-6亚炔基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1或2个氧原子；并且
L2为共价键，或选自任选取代的C1-6亚烷基；任选取代的C2-6亚烯基；任选取代的C2-6亚炔基；和任选取代的C6-10亚芳基。
106.如权利要求105所述的核苷酸构建体，其中G1包含递送结构域。
107.如权利要求106所述的核苷酸构建体，其中所述递送结构域包含一个或多个肽转导结构域(PTD)。
108.如权利要求105所述的核苷酸构建体，其中G1的中性有机聚合物为聚(乙二醇)。
109.如权利要求98所述的核苷酸构建体，其中L1为
其中L2’为共价键，或选自任选取代的C1-10亚烷基；任选取代的C2-10亚烯基；任选取代的C2-10亚炔基；和任选取代的C6-12亚芳基，其中每个亚烷基、亚烯基或亚炔基任选插入有1-10个选自O、N和S的杂原子；
G2为缀合部分、亲水性功能基团、小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分以及以上物质的组合。
110.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中X为O。
111.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中所述肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过与醛基的缩合反应与所述生物可逆的基团连接，从而形成亚胺、烯胺或腙键。
112.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中所述肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的组合通过一个或多个含氮的互补缀合部分与所述生物可逆的基团连接，所述含氮的互补缀合部分具有式III所示的结构：
其中，
A1、A2、A4和A5每个单独地为N或CR8；
A3和A6为C；
R6-R7每个单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的亚胺和任选取代的烯胺；并且
每个R8单独地为H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烯基、任选取代的C2-6炔基、卤化物、羟基、-CHO、任选取代的C1-6酰基、羧酸、氰基、硝基、任选取代的氨基、巯基、任选取代的C2-9杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C3-8环烷基和任选取代的C4-8环烯基。
113.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中R2包含递送结构域。
114.如权利要求103所述的核苷酸构建体，其中所述递送结构域包含一个或多个肽转导结构域(PTD)。
115.如权利要求104所述的核苷酸构建体，其包含式I(c)所示的结构：
其中R2’为所述生物可逆的基团与所述PTD结合的残基；并且
z’为1-10的数字，其中当z’大于1时，所述PTD通过具有1-10个重复单元的聚(C1-4环氧烷烃)基团连接在一起。
116.如权利要求114所述的核苷酸构建体，其中所述PTD为在5-15个氨基酸中具有5-10个精氨酸和/或赖氨酸残基的阳离子型肽序列。
117.如权利要求114所述的核苷酸构建体，其中所述PTD包含序列RKKRRQRRR(SEQ IDNO:1)。
118.如权利要求114所述的核苷酸构建体，其中所述递送结构域包含与具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)缀合的PTD。
119.如权利要求118所述的核苷酸构建体，其中递送结构域包含选自如下的序列：
PEG-(PTD)；
GG-(PTD)-PEG-(PTD)；
PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；
GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；
PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；
GG-(PTD)-PEG-(PTD)-PEG-(PTD)；和
GG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)-PEG-PEG-PEG-(PTD)；
其中PEG为具有1-10个重复单元的聚(乙二醇)连接子。
120.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中R2包含靶向部分。
121.如权利要求120所述的核苷酸构建体，其中所述靶向部分为配体、碳水化合物、抗体、Fab、ScFv或单结构域抗体。
122.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中B1为非天然的核苷酸碱基。
123.如权利要求95所述的核苷酸构建体，其中B1为天然存在的核苷酸碱基。
124.如权利要求123所述的核苷酸构建体，其中B1为胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
125.核苷酸构建体，其具有式(I)所示的结构或其盐：
其中，
B1为核苷酸碱基；
X为O、S或NR5；
Y为卤素、任选取代的C1-6烷氧基或经保护的羟基；
R1为羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯或五磷酸酯；
R2为
R3为O、S或任选取代的氨基；
R4为H、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、经保护的羟基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯，或当R3为任选取代的氨基时不存在；并且
R5为H、任选取代的C1-6烷基、S-新戊酰硫代乙醇、羟基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C2-9杂环基。
126.制备多核苷酸构建体的方法，包括
(1)通过在酸性条件下于非质子溶剂系统中去除所述DMT基团，将在5'位置包含DMT保护基团的第一核苷或核苷酸解除封闭，其中所述第一核苷或核苷酸可在3'位置固定至固相载体，或者以非酸性的不稳定羟基保护基团保护3'位置，并且所述第一核苷或核苷酸在溶液中；
(2)在酸性唑催化剂存在下，将所述解除封闭的第一核苷或核苷酸与权利要求95-125中任一项所述的活化的核苷酸或在3'位置包含亚磷酰胺的活化的核苷酸偶联；
(3)在包含质子溶剂和弱碱的溶剂系统中用氧化试剂氧化所述偶联的核苷酸；以及
(4)在酸性条件下于非质子溶剂系统中，通过去除所述偶联的核苷酸的5'位置的DMT基团将所述偶联的核苷酸解除封闭；
其中步骤(2)-(4)重复1-149次，并且其中所述多核苷酸构建体包含至少一种来自权利要求95-125中任一项所述的核苷酸构建体。
127.如权利要求126所述的制备方法，其中步骤(1)的第一核苷或核苷酸已被连接至固相载体，并且其中所生成的多核苷酸构建体在最后的解除封闭步骤后被从所述固相载体切割下来。
128.如权利要求126所述的制备方法，其中使用计算机控制的仪器进行所述步骤。
129.如权利要求126所述的制备方法，其中在合成所述多核苷酸构建体后，如果核苷酸碱基包含一个或多个保护基团，则去除所述保护基团；和/或对于包含通过保护基团保护的亲水性功能基团或缀合部分的任何生物可逆的基团，则去除所述保护基团。
130.如权利要求126所述的制备方法，其中在合成所述多核苷酸构建体后，将所述小分子、肽、多肽、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分和/或内体逃逸部分与一个或多个生物可逆的基团的一个或多个缀合部分连接。
131.包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器含有肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合，以及权利要求1-80中任一项所述的多核苷酸构建体，所述肽、多肽、蛋白、碳水化合物、中性有机聚合物、带正电荷的聚合物、治疗剂、靶向部分、内体逃逸部分或以上物质的任意组合具有一个或多个能够与醛基缩合形成一个或多个共价键的缀合部分。
132.权利要求1-80中任一项所述的多核苷酸构建体在制备用于诱导反义或RNAi介导的基因表达减少的产物中的用途。
133.权利要求81所述的杂交的多核苷酸在制备用于诱导反义或RNAi介导的基因表达减少的产物中的用途。
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