KR101707437B1 - 구아니딘 가교를 갖는 인공 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

구아니딘 가교를 갖는 인공 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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Abstract

본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약리학상 허용되는 염은, 식 I 또는 II로 표시되는 화합물 또는 이의 염, 및 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유한다. 본 발명에 의하면, 표적 핵산에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성을 가지며, 높은 뉴클레아제 내성을 나타내는 올리고뉴클레오티드용의 핵산 분자가 제공된다.
Figure 112015038184419-pct00053

Description

구아니딘 가교를 갖는 인공 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드{OLGIONUCLEOTIDE AND ARTIFICIAL NUCLEOSIDE HAVING GUANIDINE BRIDGE}
본 발명은, 인공 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 구아니딘 가교를 갖는 인공 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
핵산 의약에 의한 질병의 치료법으로서, 안티센스법, 안티진법, 앱타머를 사용하는 방법, siRNA를 사용하는 방법 등이 있다. 이 중, 안티센스법은, 질병에 관련된 mRNA와 상보적인 올리고뉴클레오티드(안티센스쇄)를 외부로부터 도입하여, 이중쇄를 형성시킴으로써, 병원 RNA의 번역 과정을 저해하여, 질병의 치료나 예방을 실시하는 수법이다. siRNA를 사용하는 방법도 안티센스법과 유사하며, 생체에 투여한 이중쇄 RNA에 의해 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해한다. 한편, 안티진법은, 병원 RNA를 전사하는 DNA 부위에 대응하는 삼중쇄 형성 올리고뉴클레오티드를 외부로부터 도입함으로써 DNA로부터 RNA로의 전사를 억제한다. 또한, 앱타머는, 짧은 핵산 분자(올리고뉴클레오티드)이기 때문에, 질병의 원인이 되는 단백질 등의 생체 성분과 결합함으로써 기능을 발휘한다.
이러한 핵산 의약의 소재로서, 다양한 인공 핵산이 개발되고 있지만, 아직 결정적인 분자가 존재하지 않는다. 예를 들면, 지금까지 개발되어 온 핵산 의약의 소재로서, 포스포로티오에이트(Phosphorothioate: S-PO3)형 올리고뉴클레오티드(S-올리고), 2',4'-브릿지드(가교) 핵산(bridged nucleic acid)(BNA)/2',4'-록트 핵산(locked nucleic acid)(LNA)(특허문헌 1 내지 4 및 비특허문헌 1 내지 4) 등이 있다. S-올리고는, 사이토메갈로바이러스에 대한 안티센스 의약품으로서, 이미 미국에서 시판되고 있다. 이것은, 높은 뉴클레아제 내성을 갖지만, 표적 핵산쇄와의 결합 친화성이 낮다는 난점을 가지고 있어, 개선이 필요하다. 지금까지 개발되어 있는 2',4'-BNA/LNA는, 어느 것이나 표적 핵산쇄와의 결합 친화성이 높고, 앞으로의 핵산 의약의 소재로서 가장 기대되는 분자이다. 그러나, 뉴클레아제에 대한 내성이 충분하지 않아, 생체 내에서의 안정성이라는 점에서 개량의 여지가 있다.
국제공개 제98/39352호 국제공개 제2005/021570호 국제공개 제2003/068795호 국제공개 제2011/052436호
C. Wahlestedt 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000년, 97권, 10호, 5633-5638페이지 Y. Hari 외, Bioorg. Med. Chem., 2006년, 14권, 1029-1038페이지 K. Miyashita 외, Chem. Commun., 2007년, 3765-3767페이지 S.M.A. Rahman 외, J. Am. Chem. Soc., 2008년, 130권, 14호, 4886-4896페이지 M. Kuwahara 외, Nucleic Acids Res., 2008년, 36권, 13호, 4257-4265페이지 S. Obika 외, Bioorg. Med. Chem., 2001년, 9권, 1001-1011페이지
본 발명은, 표적 핵산에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성을 가지며, 높은 뉴클레아제 내성을 나타내는 올리고뉴클레오티드용 핵산 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 2',4'-BNA/LNA의 가교 구조에 구아니딘을 도입한 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드가, 특히 DNA에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성을 가지며, 높은 뉴클레아제 내성을 나타내는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은, 이하의 식 I 또는 II로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 제공한다:
Figure 112015038184419-pct00001
상기 식 I 및 II에 있어서,
B1은, α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 푸린-9-일기 또는 2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이고, 여기서, 상기 α그룹은, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알콕시기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬티오기, 아미노기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬아미노기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 아미노기, 및 할로겐 원자로 이루어지고;
R1, R12 및 R13은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 분기(分岐) 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 아미노기의 보호기, 또는
Figure 112015038184419-pct00002
이고; 그리고
R2 및 R3은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 핵산 합성의 수산기의 보호기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴 부분을 갖는 아르알킬기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 아실기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 실릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 인산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기, -P(R4)R5[여기서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6의 시아노알콕시기, 및/또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아미노기이다]이다.
하나의 실시형태에서는, 상기 식 I 또는 II에 있어서, 상기 B1은, 6-아미노푸린-9-일기, 2,6-디아미노푸린-9-일기, 2-아미노-6-클로로푸린-9-일기, 2-아미노-6-플루오로푸린-9-일기, 2-아미노-6-브로모푸린-9-일기, 2-아미노-6-하이드록시푸린-9-일기, 6-아미노-2-메톡시푸린-9-일기, 6-아미노-2-클로로푸린-9-일기, 6-아미노-2-플루오로푸린-9-일기, 2,6-디메톡시푸린-9-일기, 2,6-디클로로푸린-9-일기, 6-머캅토푸린-9-일기, 2-옥소-4-아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-플루오로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-클로로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-메톡시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-머캅토-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 또는 4-아미노-5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이다.
하나의 실시형태에서는, 상기 식 I 또는 II에 있어서, 상기 B1은, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이다.
본 발명은 또한, 이하의 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약리학상 허용되는 염을 제공한다:
Figure 112015038184419-pct00003
상기 식 I' 및 II'에 있어서,
B1은, α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 푸린-9-일기 또는 2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이고, 여기서, 당해 α그룹은, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알콕시기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬티오기, 아미노기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬아미노기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 아미노기, 및 할로겐 원자로 이루어지고;
R1, R12 및 R13은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 아미노기의 보호기, 또는
Figure 112015038184419-pct00004
이고, 그리고
R14는 수소 원자이고; 그리고
R2 및 R3은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 핵산 합성의 수산기의 보호기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴 부분을 갖는 아르알킬기, 당해 α 그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 아실기, 당해 α 그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 실릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 인산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기, -P(R4)R5[여기서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6의 시아노알콕시기 및/또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아미노기이다]이다.
하나의 실시형태에서는, 상기 식 I' 또는 II'에 있어서, 상기 B1은, 6-아미노푸린-9-일기, 2,6-디아미노푸린-9-일기, 2-아미노-6-클로로푸린-9-일기, 2-아미노-6-플루오로푸린-9-일기, 2-아미노-6-브로모푸린-9-일기, 2-아미노-6-하이드록시푸린-9-일기, 6-아미노-2-메톡시푸린-9-일기, 6-아미노-2-클로로푸린-9-일기, 6-아미노-2-플루오로푸린-9-일기, 2,6-디메톡시푸린-9-일기, 2,6-디클로로푸린-9-일기, 6-머캅토푸린-9-일기, 2-옥소-4-아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-플루오로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-클로로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-메톡시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-머캅토-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 또는 4-아미노-5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이다.
하나의 실시형태에서는, 상기 식 I' 또는 II'에 있어서, 상기 B1은 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이다.
본 발명에 의하면, 표적 핵산에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성을 가지며, 높은 뉴클레아제 내성을 나타내는 올리고뉴클레오티드용의 핵산 분자를 제공할 수 있다.
도 1은 5'-d(TTTTTTTTXT)-3' 서열의 각종 올리고뉴클레오티드를 3'-엑소뉴클레아제로 처리한 경우의, 미반응의 올리고뉴클레오티드 비율의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.
도 2는 5'-d(TTTTTTTTX)-3' 서열의 각종 올리고뉴클레오티드를 3'-엑소뉴클레아제로 처리한 경우의, 미반응의 올리고뉴클레오티드 비율의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.
도 3은 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체 및 LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드의, 완전 상보 서열을 갖는 DNA 표적쇄(풀매치형) 및 1염기 미스매치를 갖는 DNA 표적쇄(미스매치형)의 각각에 대한 Tm 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 4는 화합물 57(A 내지 D) 및 화합물 61(E 내지 H)의 HuH-7 세포내의 동태를 도시하는 현미경 사진이며, A, E는 위상차상; B, F는 Alexa Fluor 488(올리고뉴클레오티드)의 형광상; C, G는 Hoechst 33342(핵)의 형광상: D, H는 LysoTracker(리소좀)의 형광상이다.
도 5는 화합물 57의 HuH-7 세포내의 동태를 도시하는 현미경 사진으로서, 도 4A 내지 D에 관해서 도 4B의 화살표로 나타내는 영역에 관해서 확대한 사진(A 내지 D)이다.
우선, 본 명세서 중에서 사용되는 용어를 정의한다.
본 명세서에 있어서, 용어「탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬기」는, 탄소수 1 내지 6의 임의의 직쇄 알킬기를 말하고, 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기, 또는 n-헥실기를 말한다.
본 명세서에 있어서, 용어「탄소수 1 내지 6의 직쇄 알콕시기」는, 탄소수 1 내지 6의 임의의 직쇄 알킬기를 갖는 알콕시기를 포함한다. 예를 들면, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬티오기」는, 탄소수 1 내지 6의 임의의 직쇄 알킬기를 갖는 알킬티오기를 포함한다. 예를 들면, 메틸티오기, 에틸티오기, n-프로필티오기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬아미노기」는, 탄소수 1 내지 6의 임의의 직쇄 알킬기를 1개 또는 탄소수 1 내지 6의 동일 또는 상이한 임의의 직쇄 알킬기를 2개 갖는 아미노기를 포함한다. 예를 들면, 메틸아미노기, 디메틸아미노기, 에틸아미노기, 메틸에틸아미노기, 디에틸아미노기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기」는, 탄소수 1 내지 7의 임의의 직쇄 알킬기, 동일 또는 상이한 분기쇄를 갖는 탄소수 3 내지 7의 임의의 분기쇄 알킬기, 탄소수 3 내지 7의 임의의 환상 알킬기 및 탄소수 4 내지 7의 이들의 조합을 포함한다. 예를 들면, 탄소수 1 내지 7의 임의의 직쇄 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기, 및 n-헵틸기를 들 수 있고, 동일 또는 상이한 분기쇄를 갖는 탄소수 3 내지 7의 임의의 분기쇄 알킬기로서는, 이소프로필기, 이소부틸기, tert-부틸기, 이소펜틸기 등을 들 수 있고, 그리고 탄소수 3 내지 7의 임의의 환상 알킬기로서는, 사이클로부틸기, 사이클로펜틸기, 사이클로헥실기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 2 내지 7의 알케닐기」는, 탄소수 2 내지 7의 임의의 직쇄 알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 임의의 분기쇄 알케닐기, 탄소수 3 내지 7의 임의의 환상 알케닐기 및 탄소수 4 내지 7의 이들의 조합을 포함한다. 예를 들면, 탄소수 2 내지 7의 임의의 직쇄 알케닐기로서는, 에테닐기, 1-프로페닐기, 2-프로페닐기, 1-부테닐기, 2-부테닐기, 1-펜테닐기, 2-펜테닐기, 3-펜테닐기, 4-펜테닐기, 1-헥세닐기 등을 들 수 있고, 탄소수 3 내지 7의 임의의 분기쇄 알케닐기로서는, 이소프로페닐기, 1-메틸-1-프로페닐기, 1-메틸-2-프로페닐기, 2-메틸-1-프로페닐기, 2-메틸-2-프로페닐기, 1-메틸-2-부테닐기 등을 들 수 있고, 그리고 탄소수 3 내지 7의 임의의 환상 알케닐기로서는, 사이클로부테닐기, 사이클로펜테닐기, 사이클로헥세닐기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 아릴기」는, 탄화수소만으로 구성된 탄소수 6 내지 12의 임의의 방향족 탄화수소 화합물, 및 탄소수 6 내지 12의 임의의 환 구조 중, 당해 환 구조를 구성하는 1 이상의 탄소 원자가 동종 또는 이종의 헤테로 원자(예를 들면, 질소 원자, 산소 원자, 또는 유황 원자)로 치환된 임의의 복소 방향족 화합물을 포함한다. 탄화 수소만으로 구성된 탄소수 6 내지 12의 방향족 탄화수소 화합물로서는, 페닐기, 나프틸기, 인데닐기, 아줄레닐기 등을 들 수 있고, 그리고 당해 복소 방향족 화합물로서는, 피리딘환, 피롤린환, 퀴놀린환, 인돌린환, 이미다졸린환, 푸린환, 티오펜환 등을 들 수 있다. 피리딘환으로서는, 예를 들면, 피리미딘환, 피페리딘환, 퀴놀린환, 아크리딘환을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 헤테로아릴 부분을 갖는 아르알킬기」는, 탄화 수소만으로 구성된 탄소수 5 내지 12의 임의의 방향족 탄화수소 화합물, 및 탄소수 5 내지 12의 임의의 환 구조 중, 당해 환 구조를 구성하는 1 이상의 탄소 원자가 동종 또는 이종의 헤테로 원자(예를 들면, 질소 원자, 산소 원자, 또는 유황 원자)로 치환된 임의의 복소 방향족 화합물을 포함한다. 용어「헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 헤테로아릴 부분을 갖는 아르알킬기」의 예로서는, 벤질기, 펜에틸기, 나프틸메틸기, 3-페닐프로필기, 2-페닐프로필기, 4-페닐부틸기, 2-페닐부틸기, 피리딜메틸기, 인돌릴메틸기, 푸릴메틸기, 티에닐메틸기, 피롤릴메틸기, 2-피리딜에틸기, 1-피리딜에틸기, 3-티에닐프로필기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「아실기」의 예로서는, 지방족 아실기 및 방향족 아실기를 들 수 있다. 구체적으로는, 지방족 아실기의 예로서는, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 펜타노일기, 피발로일기, 발레릴기, 이소발레릴기, 옥타노일기, 노나노일기, 데카노일기, 3-메틸노나노일기, 8-메틸노나노일기, 3-에틸옥타노일기, 3,7-디메틸옥타노일기, 운데카노일기, 도데카노일기, 트리데카노일기, 테트라데카노일기, 펜타데카노일기, 헥사데카노일기, 1-메틸펜타데카노일기, 14-메틸펜타데카노일기, 13,13-디메틸테트라데카노일기, 헵타데카노일기, 15-메틸헥사데카노일기, 옥타데카노일기, 1-메틸헵타데카노일기, 노나데카노일기, 아이코사노일기 및 헤나이코사노일기와 같은 알킬카르보닐기; 석시노일기, 글루탈로일기, 아디포일기와 같은 카르복시화 알킬카르보닐기; 클로로아세틸기, 디클로로아세틸기, 트리클로로아세틸기, 트리플루오로아세틸기와 같은 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 카르보닐기; 메톡시아세틸기와 같은 탄소수 1 내지 6의 알콕시알킬카르보닐기; (E)-2-메틸-2-부테노일기와 같은 불포화 알킬카르보닐기를 들 수 있다. 또한, 방향족 아실기의 예로서는, 벤조일기, α-나프토일기, β-나프토일기와 같은 아릴카르보닐기; 2-브로모벤조일기, 4-클로로벤조일기와 같은 할로게노아릴카르보닐기; 2,4,6-트리메틸벤조일기, 4-톨루일기와 같은 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아릴카르보닐기; 4-아니소일기와 같은 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 아릴카르보닐기; 2-카르복시벤조일기, 3-카르복시벤조일기, 4-카르복시벤조일기와 같은 카르복시화 아릴카르보닐기; 4-니트로벤조일기, 2-니트로벤조일기와 같은 니트로화 아릴카르보닐기; 2-(메톡시카르보닐)벤조일기와 같은 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 카르보닐화아릴카르보닐기; 4-페닐벤조일기와 같은 아릴화 아릴카르보닐기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「실릴기」의 예로서는, 트리메틸실리기, 트리에틸실릴기, 이소프로필디메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, 메틸디이소프로필실릴기, 메틸디-t-부틸실릴기, 트리이소프로필실릴기와 같은 트리 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 실릴기; 디페닐메틸실릴기, 부틸디페닐부틸실릴기, 디페닐이소프로필실릴기, 페닐디이소프로필실릴기와 같은 1 내지 2의 아릴기로 치환된 탄소수 1 내지 6의 3개의 알킬기로 치환된 실릴기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「할로겐 원자」로서는, 예를 들면, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 또는 요오드 원자를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「핵산 합성의 아미노기의 보호기」,「핵산 합성의 수산기의 보호기」,「핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기」,「핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기」, 및 「핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기」내에 기재되는 용어「보호기」란, 핵산 합성시에 안정적으로 아미노기, 수산기, 인산기 또는 머캅토기를 보호할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 산성 또는 중성 조건에서 안정적이며, 가수소 분해, 가수분해, 전기 분해, 및 광 분해와 같은 화학적 방법에 의해 개열될 수 있는 보호기를 말한다. 이러한 보호기로서는, 예를 들면, 탄소수 1 내지 6의 알킬기; 탄소수 1 내지 6의 알케닐기; 아실기; 테트라하이드로피라닐기 또는 테트라하이드로티오피라닐기; 테트라하이드로푸라닐기 또는 테트라하이드로티오푸라닐기; 실릴기; 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 메틸기; 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 메틸기; 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 메틸기; 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 에틸기; 할로겐 원자로 치환된 에틸기; 1 내지 3개의 아릴기로 치환된 메틸기; 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기, 할로겐 원자 및/또는 시아노기로 치환된 1 내지 3개의 아릴기로 치환된 메틸기; 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 카르보닐기; 할로겐 원자, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기 및/또는 니트로기로 치환된 아릴기; 할로겐 원자 및/또는 탄소수 1 내지 6의 3개의 알킬기로 치환된 실릴기로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 카르보닐기; 알케닐옥시카르보닐기; 탄소수 1 내지 6의 알콕시기 및/또는 니트로기로 치환된 아릴기로 치환되어 있어도 좋은 아르알킬옥시카르보닐기; 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 테트라하이드로피라닐기 또는 테트라하이드로티오피라닐기로서는, 테트라하이드로피란-2-일기, 3-브로모테트라하이드로피란-2-일기, 4-메톡시테트라하이드로피란-4-일기, 테트라하이드로티오피란-4-일기, 4-메톡시테트라하이드로티오피란-4-일기 등을 들 수 있다. 테트라하이드로푸라닐기 또는 테트라하이드로티오푸라닐기로서는, 테트라하이드로푸란-2-일기, 테트라하이드로티오푸란-2-일기를 들 수 있다. 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 메틸기로서는, 메톡시메틸기, 1,1-디메틸-1-메톡시메틸기, 에톡시메틸기, 프로폭시메틸기, 이소프로폭시메틸기, 부톡시메틸기, t-부톡시메틸기 등을 들 수 있다. 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 메틸기로서는, 2-메톡시에톡시메틸기 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 메틸기로서는, 2,2,2-트리클로로에톡시메틸기, 비스(2-클로로에톡시)메틸기 등을 들 수 있다. 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 에틸기로서는, 1-에톡시에틸기, 1-(이소프로폭시)에틸기 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로 치환된 에틸기로서는, 2,2,2-트리클로로에틸기 등을 들 수 있다. 1 내지 3개의 아릴기로 치환된 메틸기로서는, 벤질기, α-나프틸메틸기, β-나프틸메틸기, 디페닐메틸기, 트리페닐메틸기, α-나프틸디페닐메틸기, 9-안트릴메틸기 등을 들 수 있다. 「탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기, 할로겐 원자 및/또는 시아노기로 치환된 1 내지 3개의 아릴기로 치환된 메틸기」로서는, 4-메틸벤질기, 2,4,6-트리메틸벤질기, 3,4,5-트리메틸벤질기, 4-메톡시벤질기, 4-메톡시페닐디페닐메틸기, 4,4'-디메톡시트리페닐메틸기, 2-니트로벤질기, 4-니트로벤질기, 4-클로로벤질기, 4-브로모벤질기, 4-시아노벤질기 등을 들 수 있다. 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 카르보닐기로서는, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, t-부톡시카르보닐기, 이소부톡시카르보닐기 등을 들 수 있다. 「할로겐 원자, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기 및/또는 니트로기로 치환된 아릴기」로서는, 4-클로로페닐기, 2-플루오로페닐기, 4-메톡시페닐기, 4-니트로페닐기, 2,4-디니트로페닐기 등을 들 수 있다. 「할로겐 원자 및/또는 3개의 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 실릴기로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기로 치환된 카르보닐기」로서는, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐기, 2-트리메틸실릴에톡시카르보닐기 등을 들 수 있다. 알케닐옥시카르보닐기로서는, 비닐옥시카르보닐기, 아릴옥시카르보닐기 등을 들 수 있다. 「탄소수 1 내지 6의 알콕시기 및/또는 니트로기로 치환된 아릴기로 치환되어 있어도 좋은 아르알킬옥시카르보닐기」로서는, 벤질옥시카르보닐기, 4-메톡시벤질옥시카르보닐기, 3,4-디메톡시벤질옥시카르보닐기, 2-니트로벤질옥시카르보닐기, 4-니트로벤질옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.
「핵산 합성의 수산기의 보호기」로서는, 예를 들면, 지방족 아실기; 방향족 아실기; 1 내지 3개의 아릴기로 치환된 메틸기; 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기, 할로겐 원자 및/또는 시아노기로 치환된 1 내지 3개의 아릴기로 치환된 메틸기; 또는 실릴기를 들 수 있다. 「핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기」의 보호기로서는, 예를 들면, 지방족 아실기; 방향족 아실기; 1 내지 3개의 아릴기로 치환된 메틸기; 할로겐 원자, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기 및/또는 니트로기로 치환된 아릴기; 탄소수 1 내지 6의 알킬기; 또는 탄소수 1 내지 6의 알케닐기를 들 수 있다. 「핵산 합성의 아미노기의 보호기」로서는, 예를 들면, 아실기, 벤조일기를 들 수 있다. 「핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기」의 「보호기」로서는, 예를 들면, 탄소수 1 내지 6의 알킬기 및/또는 시아노기로 치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬기; 아르알킬기; 니트로기 및/또는 할로겐 원자로 치환된 아릴기로 치환된 아르알킬기; 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 할로겐 원자, 또는 니트로기로 치환된 아릴기; 2-시아노에틸기; 2,2,2-트리클로로에틸기; 벤질기; 2-클로로페닐기; 또는 4-클로로페닐기를 들 수 있다. 「핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기」의「보호기」로서는, 예를 들면, 지방족 아실기 또는 방향족 아실기, 벤조일기를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, -P(R4)R5[여기서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 6의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6의 시아노알콕시기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아미노기이다]로 표시되는 기 중, R4가 OR4a 그리고 R5가 NR5a로서 나타낼 수 있는 기는, 「포스포로아미다이트기」라고 한다. 포스포로아미다이트기로서는, 예를 들면, 화학식 -P(OC2H4CN)(N(iPr)2)로 표시되는 기, 또는 화학식 -P(OCH3)(N(iPr)2)로 표시되는 기를 들 수 있다. 여기서, iPr은 이소프로필기를 나타낸다.
본 명세서에 있어서, 용어「인공 뉴클레오시드」및「뉴클레오시드 유연체」란, 푸린 또는 피리미딘염기와 당이 결합한「뉴클레오시드」중 비천연형의 것(즉, 천연 뉴클레오시드가 아니며, 인공적으로만 제조할 수 있는 뉴클레오시드) 및, 푸린 및 피리미딘 이외의 방향족 복소환 및 방향족 탄화수소환으로 푸린 또는 피리미딘염기와의 대용이 가능한 것(예를 들면, 피리돈, 하이드록시벤젠, 아미노피리딘 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다)과 당이 결합한 것을 말한다.
본 명세서에 있어서, 용어「인공 올리고뉴클레오티드」및「올리고뉴클레오티드 유연체」란, 동일 또는 상이한「뉴클레오시드」또는「뉴클레오시드 유연체」가 인산디에스테르 결합으로 2 내지 50개 결합한「올리고뉴클레오티드」의 비천연형 유도체를 말한다. 그러한 유연체로서는, 예를 들면, 당 부분이 수식된 당 유도체; 인산디에스테르 부분이 티오에이트화된 티오에이트 유도체; 말단의 인산 부분이 에스테르화된 에스테르체; 푸린염기 위의 아미노기가 아미드화된 아미드체, 당 부분이 수식된 당 유도체를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「식 I 또는 II로 표시되는 화합물의 염」이란, 본 발명의 식 I 또는 II로 표시되는 화합물의 염을 말한다. 그러한 염으로서는, 예를 들면, 식 I 또는 II로 표시되는 화합물의 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염; 식 I 또는 II로 표시되는 화합물의 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디사이클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-펜에틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아민메탄염과 같은 유기 염 등의 아민염; 식 I 또는 II로 표시되는 화합물의 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐 원자화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염; 식 I 또는 II로 표시되는 화합물의 메탄설폰산염, 트리플루오로메탄설폰산염, 에탄설폰산염과 같은 탄소수 1 내지 6의 알칸설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염과 같은 아릴설폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸말산염, 석신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염; 및 식 I 또는 II로 표시되는 화합물의 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루탐산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어「식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오티드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드의 약리학상 허용되는 염」으로서는, 본 발명의 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체의 염을 말한다. 그러한 염으로서는, 예를 들면, 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드의 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염; 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드의 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디사이클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-펜에틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기염 등의 아민염; 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드의 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염과 같은 할로겐 원자화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염; 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드의 메탄설폰산염, 트리플루오로메탄설폰산염, 에탄설폰산염과 같은 탄소수 1 내지 6의 알칸으로 치환된 설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염과 같은 아릴설폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸말산염, 석신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염; 및, 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드의 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루탐산염, 아스파라긴산염과 같은 아민산염을 들 수 있다.
이하, 본 발명에 관해서 상세하게 서술한다.
본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 또는 이의 염은, 이하의 식 I 또는 II로 표시되는 구조를 가진다:
Figure 112015038184419-pct00005
상기 식 I 및 II에 있어서,
B1은, α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 푸린-9-일기 또는 2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이고, 여기서, 상기 α그룹은, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알콕시기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬티오기, 아미노기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬아미노기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 아미노기, 및 할로겐 원자로 이루어지고;
R1, R12 및 R13은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 아미노기의 보호기, 또는
Figure 112015038184419-pct00006
을 나타내고; 그리고
R2 및 R3은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 핵산 합성의 수산기의 보호기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴 부분을 갖는 아르알킬기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 아실기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 실릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 인산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기, -P(R4)R5[여기서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6의 시아노알콕시기, 및/또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아미노기이다]이다.
상기 식 I 또는 II에 있어서, B1은, 푸린염기(즉, 푸린-9-일기) 또는 피리미딘염기(즉, 2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기)이다. 이들 염기는, 수산기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알콕시기, 머캅토기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬티오기, 아미노기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬아미노기, 및 할로겐 원자로 이루어지는 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋다.
상기의 염기(B1)의 구체예로서는, 6-아미노푸린-9-일기(아데니닐기), 2,6-디아미노푸린-9-일기, 2-아미노-6-클로로푸린-9-일기, 2-아미노-6-플루오로푸린-9-일기, 2-아미노-6-브로모푸린-9-일기, 2-아미노-6-하이드록시푸린-9-일기(구아니닐기), 6-아미노-2-메톡시푸린-9-일기, 6-아미노-2-클로로푸린-9-일기, 6-아미노-2-플루오로푸린-9-일기, 2,6-디메톡시푸린-9-일기, 2,6-디클로로푸린-9-일기, 6-머캅토푸린-9-일기, 2-옥소-4-아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기(시토시닐기), 4-아미노-2-옥소-5-플루오로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-클로로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-메톡시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-머캅토-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기(우라실릴기), 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기(티미닐기), 및 4-아미노-5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기를 들 수 있다.
이 중에서도, B1은, 안전하고 효과적인 핵산 의약으로의 응용이라는 관점에서, 이하의 구조식으로 표시되는, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기(티미닐기), 2-옥소-4-아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기(시토시닐기), 6-아미노푸린-9-일기(아데니닐기), 2-아미노-6-하이드록시푸린-9-일기(구아니닐기), 4-아미노-5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 및 2-옥소-4-하이드록시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기(우라실릴기)가 적합하고, 특히, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기(티미닐기)가 적합하다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 합성시에는, 수산기가 보호기에 의해 보호되어 있는 것이 바람직하다.
Figure 112015038184419-pct00007
상기 식 I 또는 II에 있어서, R1, R12 및 R13은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 아미노기의 보호기, 또는,
Figure 112015038184419-pct00008
을 나타내고, 바람직하게는, 수소 원자 또는 메틸기이다. 「아미노기의 보호기」로서는, 아세틸기, 제3급 부톡시카르보닐(Boc)기, 9-플루올레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기 등을 들 수 있다.
상기 식 I 또는 II에 있어서, R2 및 R3은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 핵산 합성의 수산기의 보호기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴 부분을 갖는 아르알킬기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 아실기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 실릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 인산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기, -P(R4)R5[여기서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6의 시아노알콕시기, 및/또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아미노기이다]를 표시한다.
본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드는, 2',4'-BNA/LNA의 가교 구조에 구아니딘이 도입되어 있다. 구아니딘은 양의 전하를 갖기 때문에, 예를 들면, 인산디에스테르부의 음이온 반발 억제(정전 상호 작용) 및 수화 효과의 증강에 의한 표적 핵산에 대한 이중쇄 형성능의 향상, 및 효소 내성능의 향상이 기대된다.
본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드로부터, 2',4'-가교형 인공 뉴클레오티드를 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 2',4'-가교형 인공 뉴클레오티드의 3인산화는, 비특허문헌 5에 기재된 방법에 따라 용이하게 실시될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약리학상 허용되는 염은, 이하의 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유한다:
Figure 112015038184419-pct00009
상기 식 I' 및 II'에 있어서,
B1, R2 및 R3은, 상기 식 I 및 II에 관해서 정의한 것과 동일하다.
상기 식 I' 또는 II'에 있어서, R1, R12 및 R13은 각각 독립적으로, 수소 원자, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 아미노기의 보호기 또는
Figure 112015038184419-pct00010
을 나타내고, 바람직하게는, 수소 원자 또는 메틸기이고, 그리고 R14는, 수소 원자를 나타낸다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 상기 뉴클레오시드 구조를, 임의의 위치에 적어도 1개 가진다. 1개의 올리고뉴클레오티드에 함유되는 상기 뉴클레오시드 구조의 수 및 위치는, 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절히 설계될 수 있다. 수가 많을수록, 올리고뉴클레오티드는, 표적 핵산에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성을 가지며, 이중쇄 및 삼중쇄의 형성 속도가 빠르고, 높은 뉴클레아제 내성을 나타낸다. 본 명세서 중에서는, 본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 함유되는 상기 뉴클레오시드 구조를 총칭하여,「구아니딘 가교형 인공 핵산」또는「구아니딘 가교형 핵산」이라고도 칭한다.
이러한 뉴클레오시드 구조를 함유하는 올리고뉴클레오티드 및 이의 유연체는, 상기한 바와 같이 당부(糖部)의 가교에 의해 고정된 구조를 갖기 때문에, 각종 뉴클레아제에 대해 분해되기 어려워, 생체로의 투여후, 장시간 생체내에 존재할 수 있다. 또한, 당부의 가교 위에 존재하는 양이온성 구아니딘에 기인하는 정전 작용을 개재하여, 예를 들면, mRAN와 안정된 이중쇄를 형성하여 병원이 되는 단백질의 생합성을 저해하고, 또는 게놈 중의 이중쇄 DNA와의 사이에서 삼중쇄를 형성하여 mRNA로의 전사를 저해한다. 또한, 감염된 바이러스의 증식을 억제하는 것도 가능해진다.
이러한 점에서, 본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드를 사용하여 합성된 올리고뉴클레오티드 및 이의 유연체는, 항종양제, 항바이러스제를 비롯한, 특정 유전자의 작용을 저해하여 질병을 치료하는 의약품(안티센스 분자 등)으로서의 유용성이 기대된다.
특히, 안티센스법에서는, 상보 센스쇄 RNA에 대한 결합 친화성 및 생체내 DNA 분해 효소에 대한 내성 둘다가 필요해진다. 일반적으로, 핵산은, 1개쇄 상태에서는, 당부의 구조가 끊어지지 않아 DNA 이중쇄에 가까운 형과, DNA-RNA 이중쇄나 RAN 이중쇄에 가까운 형 사이에서 요동하고 있는 것이 알려져 있다. 1개쇄 핵산이 상보적인 RAN쇄와 이중쇄를 형성하는 경우, 그 당부 구조는 고정된다. 그래서, 본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드에서는, 당부를 미리 이중쇄를 형성하는 경우의 상태로 고정하고 있기 때문에, 목적의 RAN쇄와 이중쇄를 형성하기 쉬워, 안정적으로 존재시킬 수 있다. 또한, 핵산 이중쇄는, 물 분자의 네트워크라고 불리는 쇄와 같이 연결된 수화수에 의해 안정화되어 있는 것도 알려져 있다. 본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드에서는, 구아니딘을 갖기 때문에, 예를 들면, 정전 상호 작용 및 수화 효과에 의한 이중쇄 형성능의 향상, 및 효소 내성능의 향상이 기대된다. 또한, 구아니딘을 가교부에 도입함으로써 양이온의 위치가 고정되어, 정전 상호 작용 및 수화 효과의 증강도 기대된다. 본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드에서는, 분자 중에 구아니디늄기 유래의 양전하를 갖기 때문에, 천연 핵산이나 지금까지 알려져 있는 인공 핵산에 비해, 세포로의 도입 효율을 향상시킬 수 있고, 또한 표적 핵산에 대한 하이브리드 형성 속도의 향상도 또한 기대된다. 이들에 의해 안티센스 효과의 증강 및 체내 잔존 시간의 증대가 전망되어, 투여량을 감소시키는 것에 의한 부작용의 경감과 비용의 삭감이 가능하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 이의 유연체는, 예를 들면, 부형제, 결합제, 방부제, 산화안정제, 붕괴제, 활택제, 교미제 등의 의약의 제제 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 보조제를 배합하여, 비경구 투여 제제 또는 리포솜 제제로 할 수 있다. 또한, 예를 들면, 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 의약용 담체를 배합하여, 액제, 크림제, 연고제 등의 국소용 제제를 조제할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 2',4'-가교형 인공 뉴클레오시드 및 이의 유연체의 합성을, 실시예에 기초하여 더욱 상세하게 설명한다.
이하의 실시예에서는, 수소핵 자기 공명(1H-NMR) 스펙트럼은 니혼덴시 가부시키가이샤 제조 JNM-ECS400형(400MHz)을 사용하고, 테트라메틸실란(0.00ppm), 클로로포름-d(7.26ppm), 메탄올-d4(3.30ppm)을 내부 표준으로서 측정하였다. 분열 양식은 일중항, 이중항, 삼중항, 다중항, AB 사중항, 이중 사중항을 각각 s, d, t, m, AB, dd라고 약기하였다. 탄소핵 자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은 JNM-ECS400형(100MHz)을 사용하고, 클로로포름-d(77.0ppm), 메탄올-d4(49.0ppm)을 내부 표준으로서 측정하였다. 인 핵자기 공명(31P-NMR)은, 니혼덴시 가부시키가이샤 제조 JNM-ECS400형(161.8MHz)을 사용하고, 5% 인산-중수 용액(0.00ppm)을 외부 표준으로서 측정하였다. 질량 분석(FAB-MS)은 니혼덴시 가부시키가이샤 제조 JMS-600형, 동 JMS-700형, 동 JMS-D300형을 사용하여 측정하였다. 실리카겔 크로마토그래피의 흡착제는 후지실리시아가가쿠 가부시키가이샤 제조 PSQ-100B(ave.0.110mm)를, 플래시 실리카겔 크로마토그래피의 흡착제는 후지실리시아가가쿠 가부시키가이샤 제조 PSQ-60B(평균 0.060mm)를 사용하였다. 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)는 가부시키가이샤 시마즈세사쿠쇼 제조 SHIMADZU LC-10ATVP, SHIMADZU SPD-10AVP, SHIMADZU CTO-10VP를 사용하였다. HPLC 분석 칼럼에는 Waters XBridgeTM OST C18 2.5㎛(4.6×50mm)를, 분취 칼럼에는 Waters XBridgeTM OST C18 2.5㎛(10×50mm)를 사용하였다. Tm 측정은 가부시키가이샤 시마즈세사쿠쇼 제조 SHIMADZU UV-1650B, SHIMADZU UV-1650PC를 사용하여 실시하였다. MALDI-TOF-MS는 Bruker사 제조 Daltonics(등록상표) Autoflex II TOF/TOF를 사용하여 측정하였다.
염화메틸렌, 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로푸란(THF), 아세토니트릴, 피리딘은 칼슘하이드리드로 건조시킨 후에, 증류하여 반응 용매 및 염기로서 사용하였다. 기타 시약류에 관해서는, 특별히 기재가 없는 한, 시판중인 것을 그대로 사용하였다.
(실시예 1) 뉴클레오시드 유연체(화합물 8)의 합성
Figure 112015038184419-pct00011
(1) 화합물 5의 합성
Figure 112015038184419-pct00012
Nishida, M. 외, Chem. Commun., 2010년, 제46권, p.5283-5285.에 기재된 방법에 따라, D-글루코스로부터 15공정으로 화합물 1을 합성하였다.
수득된 화합물 1(2.00mg, 3.86mmol)의 메탄올 용액 50mL에 질소 기류하, 염화니켈(36mg, 0.28mmol)을 가한 후, 0℃에서 수소화붕소나트륨(600mg, 15.4mmol)을 가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 세라이트로 여과를 실시한 후에 용매를 증류 제거하여 조성적체(粗成績體)를 수득하였다. 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(메탄올)에 의해 정제하여, 화합물 2(1.47g, 81%)를 백색 비정질로서 수득하였다(상기 공정 a).
수득된 화합물 2의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00013
이어서, 수득된 화합물 2(576mg, 1.23mmol)의 디클로로메탄 용액 10mL에, 질소 기류하, 0℃에서 9-플루오레닐메톡시카르보닐이소시아네이트(350mg, 1.23mmol)의 디클로로메탄 용액(4mL)을 가하고 0℃에서 15분간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 물을 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하여 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=80:1)에 의해 정제하여, 화합물 3(638mg, 69%)을 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 b).
수득된 화합물 3의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00014
이어서, 수득된 화합물 3(335mg, 0.45mmol)의 디클로로메탄 용액 5mL에, 질소 기류하, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(103mg, 0.543mmol)을 가하고, 실온에서 6시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 물을 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하여 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=80:1)에 의해 정제하여, 화합물 4(268mg, 83%)를 황백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 c).
수득된 화합물 4의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00015
수득된 화합물 4(971mg, 1.36mmol)의 디클로로메탄 용액 8mL에, 질소 기류하, 디에틸아민(2mL)을 가하고 실온에서 5시간 교반하였다. 이어서, 용매 증류 제거한 후, 헥산으로 세정함으로써 화합물 5(609mg, 91%)를 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 d).
수득된 화합물 5의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00016
(2) 화합물 8의 합성
Figure 112015038184419-pct00017
상기에서 수득된 화합물 5(551mg, 1.12mmol)의 디클로로메탄 용액 12mL에, 질소 기류하, 실온에서 트리에틸아민(0.68mL, 4.93mmol)을 가한 후에, 0℃에서 무수 아세트산(0.23mL, 2.47mmol)을 가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 반응액에 포화 중조수를 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하고 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체(616mg)의 이소프로판올 용액 10mL에 탄산칼륨(400mg, 2.89mmol)을 가하고 실온에서 6시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 물을 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하고 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체(517mg)의 이소프로판올 용액 10mL에, 수소 기류하, 수산화팔라듐카본(1.40g)을 가하고 실온에서 26시간 교반하였다. 반응액을 여과하여 수득된 여과액의 용매를 증류 제거함으로써 화합물 6(319mg, 80%)을 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 e).
수득된 화합물 6의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00018
수득된 화합물 6(219mg, 0.62mmol)의 피리딘 용액 7mL에, 질소 기류하, 0℃에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(630mg, 1.86mmol)를 가하고, 실온에서 20시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 반응액에 포화 중조수를 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하고 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체를 실리카겔 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=40:1→5:1)에 의해 정제하여, 화합물 7(267mg, 66%)을 백색 비정질로서 수득하였다(상기 공정 f).
수득된 화합물 7의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00019
수득된 화합물 7(131mg, 0.21mmol)의 디클로로메탄 용액 2mL에, 질소 기류하, 디이소프로필에틸아민(146μL, 0.84mmol)을 가한 후, 0℃에서 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포로아미디트(96μL, 0.43mmol)를 가하고, 실온에서 14시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 반응액에 포화 중조수를 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하여 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체를 디클로로메탄, 헥산에 의해 재침전을 실시함으로써 정제하여, 화합물 8(110mg, 61%)을 백색 비정질로서 수득하였다(상기 공정 g).
수득된 화합물 8의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00020

(실시예 2) 올리고뉴클레오티드 유연체의 합성 및 정제
실시예 1에서 수득된 화합물 8을 사용하여, 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 9 내지 13: 이하의 표 1에 기재한다)를, DNA/RNA 올리고뉴클레오티드 자동 합성기 nS-8(가부시키가이샤 진디자인 제조)에 의해 0.2μmol 스케일의 CPG 담체를 사용하여 합성하였다. 화합물 8의 아세토니트릴 용액(0.1M)의 커플링 시간은 16분간으로 실시하고, 그 이외에는 천연 DNA 합성과 동조건으로 실시하였다. 활성화제는 5-에틸티오-1H-테트라졸(0.5M)을 사용하였다. 합성한 올리고뉴클레오티드는 28% 암모니아 수용액을 사용하여 CPG 담체로부터 잘라낸 후에, 55℃에서 12시간에 걸쳐 염기부의 보호기를 제거하였다. 수득된 조성적체를 역상 간이 칼럼(Sep-Pak@Plus C18 Environmental Cartridges, Waters사)에 의해 정제하고, 추가로 역상 HPLC 정제를 실시하였다.
합성한 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 9 내지 13)의 정제 및 순도 확인은 역상 HPLC에 의해 이하의 조건으로 실시하였다.
이동상
A액: 0.1M 아세트산트리에틸암모늄 완충액, pH 7.0
B액: 0.1M 아세트산트리에틸암모늄 완충액: 아세토니트릴=1:1, pH 7.0
그래디언트:
분석 5-9% MeCN(30분), 분취 5-9% MeCN(30분): 화합물 9
분석 4-8% MeCN(30분), 분취 4-8% MeCN(30분): 화합물 10
분석 3-7% MeCN(30분), 분취 3-7% MeCN(30분): 화합물 11
분석 4-8% MeCN(30분), 분취 4-8% MeCN(30분): 화합물 12
분석 7-11% MeCN(30분), 분취 7-11% MeCN(30분): 화합물 13
사용 칼럼:
분석 Waters XBridgeTMOST C18 2.5㎛(4.6×50mm)
분취 Waters XBridgeTM OST C18 2.5㎛(10×50mm)
유속:
분석 1.0mL/분
분취 4.5mL/분
칼럼 온도: 50℃
검출: UV(254nm)
합성한 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 9 내지 13)의 분자량은, 비행 시간형 질량 분석(MALDI-TOF-MS)에 의해 결정하였다. 결과를 표 1에 기재한다.
Figure 112015038184419-pct00021
표 1로부터 명백한 바와 같이, 비행 시간형 질량 분석(MALDI-TOF-MS)에 의한 분자량 측정의 결과가 이론값과 양호한 일치를 나타낸 점에서, 각각 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드가 수득된 것을 확인하였다.
비교를 위해, 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 14: 이하의 표 2, 서열번호 1), 및 우레아 가교형 인공 핵산 2',4'-BNA/LNA(5-메틸-2'-0,4'-C-메틸렌우리딘(비특허문헌 6에 따라 합성)을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 15 내지 18: 이하의 표 3)도, 표준적인 포스포로아미다이트 프로토콜에 따라 마찬가지로 합성하고, 정제하였다.
(실시예 3) 융해 온도(Tm)의 측정
실시예 2에서 수득된 각종 올리고뉴클레오티드(화합물 8을 사용하여 제조한 올리고뉴클레오티드 유연체의 화합물 9 내지 12, 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 화합물 14, 및 우레아 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체의 화합물 15 내지 18)와 표적쇄(5'-AGCAAAAAACGC-3': 서열번호 2)를 어닐링 처리하여 이중쇄를 형성시킨 후, 이중쇄의 50%가 해리되는 온도인 Tm값을 측정함으로써, 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 형성능을 조사하였다.
구체적으로는, NaCl 100mM, 인산나트륨 완충액(pH 7.2) 10mM, 올리고뉴클레오티드 4μM, 및 표적쇄 4μM을 함유하는 샘플 용액(130μL)을 비등 수욕에서 가열한 후, 10시간에 걸쳐 실온까지 냉각시켰다. 분광광도계(Shimadzu, UV-1650PC)의 셀실 내에 결로 방지를 위해 질소 기류를 통과시키고, 샘플 용액을 5℃까지 서서히 냉각시키고, 추가로 5분간 5℃로 유지한 후, 측정을 개시하였다. 90℃까지 매분 0.5℃의 비율로 온도를 완만하게 상승시키고, 0.1℃ 상승할 때마다 260nm에 있어서의 자외부 흡수를 측정하였다. 한편, 온도 상승에 의한 농도 변화를 방지하기 위해, 셀은 뚜껑이 있는 것을 사용하였다. 결과를 Tm값 및 수식 단위당 Tm값차로 표 2에 기재한다. Tm값이 높을수록, 이중쇄 형성능이 높은 것을 나타낸다.
Figure 112015038184419-pct00022
표 2로부터 명백한 바와 같이, 가교 구조 및 양이온의 효과에 의해 이중쇄 형성능이 향상된다는 예상에 반하여, 이중쇄 형성능은 천연 DNA와 거의 동정도이었다. 또한, 올리고뉴클레오티드로의 인공 핵산의 도입 비율이 많을수록, Tm값의 상승이 나타났다. 따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 유연체는, 안티센스법에 적합한 올리고뉴클레오티드의 합성에 유용하다고 생각된다.
가교부의 양이온에 의한 효과를 정밀 조사하기 위해, 보다 양이온의 효과가 나타나기 쉬운 저염 농도 조건(NaCl을 함유하지 않는 것 이외에는 상기 샘플 용액과 동일한 조성의 용액을 사용)에서의 Tm 측정을 실시하였다. 비교 대상으로서, 우레아 가교형 인공 핵산(화합물 15 내지 18)의 Tm값도 측정하였다. 결과를 표 3에 기재한다.
Figure 112015038184419-pct00023
표 3으로부터 명백한 바와 같이, RNA를 표적으로 하는 경우의 Tm값에는 그다지 차가 나타나지 않았다. 한편, DNA를 표적으로 하는 경우, 우레아 가교형 인공 핵산의 경우에는 인공 핵산의 도입수를 증가시킴에 따라 Tm값이 저하되는데 대해, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 도입한 경우에는 그러한 Tm값의 저하가 나타나지 않았다. 이러한 점에서, 가교부의 양이온은 DNA와의 이중쇄의 안정화에 영향을 주는 것이 시사되었다.
(실시예 4) 뉴클레오시드 유연체(화합물 28)의 합성
Figure 112015038184419-pct00024
(1) 화합물 20의 합성
Figure 112015038184419-pct00025
화합물 19를 Shrestha, A.R.외, J. Org. Chem., 2011년, 제76권, p.9891-9899에 기재된 화합물 7의 조제 수순에 따라 입수하였다. 질소 기류하, 화합물 19(2.86g, 4.10mmol)의 디클로로메탄 용액(40mL)에, 빙냉하에서 피리딘(1.65mL, 20.5mmol) 및 트리플루오로메탄설폰산 무수물(1.37mL, 8.20mmol)을 가하고, 빙냉 조건으로 1시간 교반하였다. 물을 가하여 산을 없앤 후, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매 증류 제거 후, 수득된 조성적체를 황색 유상 물질로서 수득하고, 플래시 크로마토그래피(n-헥산:아세트산에틸=3:1→2:1)에 의해 간이 정제하고, 조성적체를 담황색 비정질로서 수득하였다. 계속해서, 질소 기류하, 조성적체(1.96g, 2.34mmol)의 디메틸포름아미드 용액(80mL)에 아지화나트륨(0.23g, 3.60mmol)을 가하고 교반하였다. 48시간 후, 용매 증류 제거한 후 물을 가하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매 증류 제거 후, 수득된 조성적체를 플래시 칼럼 크로마토그래피(n-헥산:아세트산에틸=3:1)에 의해 정제하여, 화합물 20(1.71g, 66%)을 백색 비정질로서 수득하였다(상기 공정 a).
수득된 화합물 20의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00026
(2) 화합물 24 및 25의 합성
Figure 112015038184419-pct00027
수득된 화합물 20(622mg, 0.85mmol)의 메탄올 용액 8mL에, 질소 기류하, 염화니켈(11mg, 0.085mmol)을 가하고, 빙냉하에서 수소화붕소나트륨(64mg, 1.7mmol)을 가하고 실온에서 10분 교반하였다. 반응액을 여과하여 용매 증류 제거한 후, 물을 가하고 아세트산에틸로 추출하였다. 이어서, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조시켜 용매 증류 제거하여 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(아세트산에틸:트리에틸아민=200:1)에 의해 정제하여, 화합물 21(456mg, 76%)을 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 b).
수득된 화합물 21의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00028
수득된 화합물 21(50mg, 0.071mmol)의 디클로로메탄 용액 1mL에, 질소 기류하, N,N'-디-(tert-부톡시카르보닐)티오우레아(30.4mg, 0.11mmol), 디이소프로필에틸아민(9μL, 0.035mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(21mg, 0.11mmol)을 가하고 실온에서 3시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 물을 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고 황산나트륨으로 건조시켜 용매 증류 제거하여 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=4:1)에 의해 정제하여, 화합물 22(58mg, 86%)를 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 c).
수득된 화합물 22의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00029
수득된 화합물 22(106mg, 0.11mmol)의 테트라하이드로푸란 용액 1mL에, 질소 기류하, 불화테트라n-부틸암모늄(0.14mL, 0.14mmol)을 가하고 실온에서 4.5시간 교반하였다. 이어서, 용매 증류 제거하여 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=1:1)에 의해 정제하여, 화합물 23(80mg, 정량)을 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 d).
수득된 화합물 23의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00030
수득된 화합물 23(850mg, 1.20mmol)의 디클로로메탄 용액 12mL에, 질소 기류하, 피리딘(0.29mg, 3.59mmol)을 가하고, 0℃에서 트리플루오로메탄설폰산 무수물(0.3mL, 1.78mmol)을 가하고, 0℃에서 3시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 반응액에 포화 중조수를 가하여 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하여 조성적체를 수득하였다. 질소 기류하, 조성적체의 디클로로메탄 용액 8mL에 트리에틸아민 2mL를 가하고, 실온에서 27시간 교반하였다. 이어서, 용매 증류 제거하여 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=1:1)에 의해 정제하여, 화합물 24(644mg, 77%)를 황백색 비정질로서 수득하였다(상기 공정 e).
화합물 24(57mg, 0.082mmol)의 테트라하이드로푸란 용액 1mL에, 35% 염산(0.3mL)을 가하고, 실온에서 40분간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 반응액에 포화 중조수를 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거함으로써 화합물 25(44mg, 정량)를 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 e').
수득된 화합물 25의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00031
(2) 화합물 28의 합성
Figure 112015038184419-pct00032
상기에서 수득된 화합물 24(644mg, 0.93mmol)의 메탄올 용액 10mL에, 수소 기류하, 수산화팔라듐카본(900mg)을 가하고, 실온에서 14시간 교반하였다. 이어서, 반응액을 여과하여 수득된 여과액의 용매를 증류 제거함으로써, 화합물 26의 조성적체를 수득하였다(상기 공정 f).
화합물 26의 조성적체(354mg)의 피리딘 용액 7mL에, 질소 기류하, 0℃에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(469mg, 1.38mmol)를 가하고, 실온에서 12시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 반응액에 포화 중조수를 가하고 ??치한 후, 반응액을 디클로로메탄으로 추출하고 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이어서, 용매를 증류 제거하여 조성적체를 수득하였다. 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=1:1)에 의해 정제하여, 화합물 27(442mg, 58%)을 백색 고체로서 수득하였다(상기 공정 g).
수득된 화합물 27의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00033
수득된 화합물 27(141mg, 0.17mml)의 아세토니트릴 용액 2mL에, 질소 기류하, N,N-디이소프로필암모늄테트라졸리드(39mg, 0.23mmol)와 2-시아노에틸N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(73μL, 0.23mmol)를 가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 이어서, 0℃에서 반응액에 물을 가하고 ??치한 후 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 증류 제거하여 수득된 조성적체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=3:2)에 의해 정제하여, 화합물 28(148mg, 86%)을 백색 비정질로서 수득하였다(상기 공정 h).
수득된 화합물 28의 물성 데이터는, 이하와 같았다:
Figure 112015038184419-pct00034

(실시예 5) 올리고뉴클레오티드 유연체의 합성 및 정제
실시예 4에서 수득된 화합물 28을 사용하여, 10mer의 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 29 내지 32: 이하의 표 4에 기재한다)를, DNA/RNA 올리고뉴클레오티드 자동 합성기 nS-8(가부시키가이샤 진디자인 제조)에 의해 0.2μmol 스케일의 CPG 담체를 사용하여 합성하였다. 화합물 28의 아세토니트릴 용액(0.1M)의 커플링 시간은 8분간으로 실시하고, 그 이외에는 천연 DNA 합성과 동조건으로 실시하였다. 활성화제는 5-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]-1H-테트라졸(0.25M)을 사용하였다. 합성한 올리고뉴클레오티드는 28% 암모니아 수용액을 사용하여 CPG 담체로부터 잘라내었다. 수득된 화합물 29 내지 31의 조성적체에 관해서는, 역상 간이 칼럼(Sep-Pak@Plus C18 Environmental Cartridges, Waters사)에 의해 정제하고, 계속해서 트리플루오로아세트산(TFA) 50%로 24시간 처리한 후에 역상 HPLC 정제를 실시하였다. 수득된 화합물 32의 조성적체에 관해서는, 역상 간이 칼럼(Sep-Pak@Plus C18 Environmental Cartridges, Waters사)에 의해 정제하고, 추가로 역상 HPLC 정제를 실시하였다.
합성한 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 29 내지 32)의 정제 및 순도 확인은 실시예 2와 같이 실시하였다.
합성한 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 29 내지 32)의 분자량은, MALDI-TOF-MASS 측정에 의해 결정하였다. 결과를 표 4에 기재한다.
Figure 112015038184419-pct00035
비교를 위해, 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 33: 이하의 표 5에 기재한다)도, 표준적인 포스포로아미다이트 프로토콜에 따라 마찬가지로 합성하여 정제하였다.
(실시예 6) 융해 온도(Tm)의 측정
실시예 5에서 수득된 각종 올리고뉴클레오티드(화합물 28을 사용하여 제조한 올리고뉴클레오티드 유연체의 화합물 29 내지 31, 및 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 화합물 33)와 이하의 표 5 및 6에 기재된 표적쇄(10mer의 폴리 A 및 서열번호 3 내지 5)를 어닐링 처리하여 복합체를 형성시킨 후, 복합체의 50%가 해리되는 온도인 Tm값을 측정함으로써, 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 형성능을 조사하였다.
구체적으로는, NaCl 100mM, 인산나트륨 완충액(pH 7.2) 10mM, 올리고뉴클레오티드 4μM, 및 표적쇄 4μM을 함유하는 샘플 용액(130μL)을 비등 수욕으로 가열한 후, 10시간에 걸쳐 실온까지 냉각시켰다. 분광광도계(Shimadzu, UV-1650PC)의 셀실 내에 결로 방지를 위해 질소 기류를 통과시키고, 샘플 용액을 0℃까지 서서히 냉각시키고, 추가로 5분간 0℃로 유지한 후, 측정을 개시하였다. 80℃에서 매분 0.5℃의 비율로 온도를 완만하게 상승시키고, 0.1℃ 상승할 때마다 260nm에 있어서의 자외부 흡수를 측정하였다. 한편, 온도 상승에 의한 농도 변화를 방지하기 위해, 셀은 뚜껑이 있는 것을 사용하였다. 표 5는, 다양한 수의 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체의 폴리 A에 대한 하이브리드 형성능을 Tm값 및 수식 단위당 Tm값차로 나타낸다. 표 6은, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체 및 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 다양한 표적쇄에 대한 하이브리드 형성능을 Tm값으로 나타낸다.
Figure 112015038184419-pct00036
Figure 112015038184419-pct00037
표 5로부터 명백한 바와 같이, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 RNA에 대한 복합체 형성능뿐만 아니라 DNA에 대한 복합체 형성능도 우수하였다. 또한, 올리고뉴클레오티드로의 인공 핵산의 도입 비율이 많을수록, Tm값의 상승이 나타났다. 따라서, 본 발명의 구아니딘 가교형 인공 핵산은, 안티센스법에 적합한 올리고뉴클레오티드의 합성에 유용하다고 생각된다.
표 6으로부터 명백한 바와 같이, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 미스 매치 인식능도 가지고 있었다. 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드와 비교해도, 바람직한 표적쇄(즉, 폴리A)로의 복합체 형성능이 우수하였다. 이로 인해, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 서열 비특이적으로 복합체를 형성할 우려가 없는 것을 알 수 있었다.
(실시예 7) 올리고뉴클레오티드 유연체의 이중쇄 형성능의 평가
실시예 4에서 수득된 화합물 28을 사용하여, 다양한 염기로 이루어지는 9mer의 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 34: 이하의 표 7에 기재한다)를, 합성한 올리고뉴클레오티드를 28% 암모니아 수용액을 사용하여 CPG 담체로부터 잘라낸 후에, 55℃에서 12시간에 걸쳐 염기부의 보호기를 제거한 것 이외에, 실시예 5와 같이 하여 합성 및 정제하였다. 비교를 위해, 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 35: 이하의 표 7에 기재한다)도, 표준적인 포스포로아미다이트 프로토콜에 따라 마찬가지로 합성하여 정제하였다.
화합물 34 및 35의 올리고뉴클레오티드에 관해서, 각 올리고뉴클레오티드를 표적쇄 5'-GTGATATGC-3'와 어닐링 처리하여 이중쇄를 형성시킨 후, 이중쇄의 50%가 해리되는 온도인 Tm값을 측정함으로써, 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 형성능을 조사하였다. 표적쇄로의 어닐링 및 Tm값의 측정을, 실시예 6과 같이 실시하였다. Tm값의 결과를 표 7에 기재한다.
Figure 112015038184419-pct00038
표 7로부터 명백한 바와 같이, 다양한 염기로 이루어지는 서열로 설계한 경우도, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 34)는, 폴리T 서열의 경우와 같이, RNA 및 DNA 양자에 관해서, 이중쇄 형성능이 우수하였다.
(실시예 8) 올리고뉴클레오티드 유연체의 삼중쇄 형성능의 평가
Figure 112015038184419-pct00039
실시예 4에서 수득된 화합물 28을 사용하여, 15mer의 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 36: 상기 「X」가 구아니딘 가교형 인공 핵산이고, 밑줄을 부여한 C는, 2'-데옥시5-메틸시티딘이다. 이하의 표 8에도 기재한다)를, 합성한 올리고뉴클레오티드를 28% 암모니아 수용액을 사용하여 CPG 담체로부터 잘라낸 후에, 55℃에서 12시간에 걸쳐 염기부의 보호기를 제거한 것 이외에는, 실시예 5와 같이 하여 합성 및 정제하였다. 비교를 위해, 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 37: 상기「X」가 천연형 뉴클레오시드이고, 밑줄을 부여한 C는, 2'-데옥시5-메틸시티딘이다. 이하의 표 8에도 기재한다)도, 표준적인 포스포로아미다이트 프로토콜에 따라 마찬가지로 합성하여 정제하였다.
표적쇄 5'-GGCAAAAAGAYAGAGAGACGC-3'(서열번호 6) 및 이의 상보쇄의 5'-GCGTCTCTCTZTCTTTTTGCC-3'(서열번호 7)를 포함하는 표적 DNA 이중쇄는 이하와 같이 조제하였다. 5'-GGCAAAAAGAYAGAGAGACGC-「C18-스페이서」-GCGTCTCTCTZTCTTTTTGCC-3'(서열번호 6의 올리고뉴클레오티드쇄의 3' 말단과 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드쇄의 5' 말단을 링커로 하여 「C18 스페이서」로 연결한 쇄)를, 링커부의 합성에 18-O-디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜 및 1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포로아미다이트(Glen Research사 제조)를 사용한 것 이외에는 표준적인 포스포로아미다이트 프로토콜로 합성하여 정제하고, 목적의 표적 DNA 이중쇄를 수득하였다. 여기서, Y 및 Z는 염기쌍을 형성할 수 있는 조합이고, 이하와 같다: Y가 A이고, Z가 T이다; Y가 T이고, Z가 A이다; Y가 G이고, Z가 C이다; 또는 Y가 C이고, Z가 G이다.
화합물 36 및 37의 올리고뉴클레오티드에 관해서, 각 올리고뉴클레오티드를 표적 이중쇄와 어닐링 처리하여 삼중쇄를 형성시킨 후, 삼중쇄의 50%가 해리되는 온도인 Tm값을 측정함으로써, 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 형성능을 조사하였다.
구체적으로는, 카코딜산나트륨 완충액(pH 6.8) 10mM, KCl 100mM, 및 MgCl2 50mM, 올리고뉴클레오티드 1.89μM, 및 표적 이중쇄 1.89μM을 함유하는 샘플 용액(130μL)을 비등 수욕으로 가열한 후, 10시간에 걸쳐 실온까지 냉각시켰다. 분광광도계(Shimadzu, UV-1650PC)의 셀실 내에 결로 방지를 위해 질소 기류를 통과시키고, 샘플 용액을 5℃까지 서서히 냉각시키고, 추가로 20분간 5℃로 유지한 후, 측정을 개시하였다. 90℃까지 매분 0.5℃의 비율로 온도를 완만하게 상승시키고, 0.1℃ 상승할 때마다 260nm에 있어서의 자외부 흡수를 측정하였다. 한편, 온도 상승에 의한 농도 변화를 방지하기 위해, 셀은 뚜껑이 있는 것을 사용하였다. Tm값의 결과를 표 8에 기재한다. Tm값이 높을수록, 삼중쇄 형성능이 높다.
Figure 112015038184419-pct00040
표 8로부터 명백한 바와 같이, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 36)는, 바람직한 표적 이중쇄(Y가 A이고, Z가 T이다)에 대한 삼중쇄 형성능이 우수하였다.
(실시예 9) 올리고뉴클레오티드 유연체의 뉴클레아제 내성의 평가
5'-d(TTTTTTTTXT)-3' 서열의 X가 각각 이하에 나타내는 바와 같다. 10mer의 각종 올리고뉴클레오티드를 조제하였다. 즉, 이하의 각종 올리고뉴클레오티드를 조제하였다.: 실시예 1의 뉴클레오시드 유연체(화합물 8)를 사용하여 제조한, X가 구아니딘 가교형 인공 핵산인 올리고뉴클레오티드 유연체(즉「화합물 13」); 실시예 4의 뉴클레오시드 유연체(화합물 28)를 사용하여 제조한, X가 구아니딘 가교형 인공 핵산인 올리고뉴클레오티드 유연체(즉「화합물 32」); X가 LNA-T(티민LNA)인 올리고뉴클레오티드(가부시키가이샤 진디자인 제조: 화합물 38); X가 DNA-T(티민DNA)인 올리고뉴클레오티드(10mer의 올리고 dT, 즉「화합물 33」); 및 X에 S-올리고(산화제 대신 황화제로서 D-1,4-디티오트레이톨(DDTT, ChemGene사 제조)을 사용한 것 이외에는 표준적인 포스포로티오에이트 합성의 프로토콜에 따라, 합성 및 정제하였다)를 사용하여 표준적인 포스포로아미다이트 프로토콜에 따라 합성하여 정제한 올리고뉴클레오티드(화합물 39: 양성 컨트롤로서 사용).
뉴클레아제 내성의 평가는, 이하와 같이 실시하였다. 각종 올리고뉴클레오티드(750pmol) 중 어느 하나를 함유하는 완충액 100μL[50mM Tris·HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2]에, 3'-엑소뉴클레아제(Crotalus admanteus venom phosphodiesterase: CAVP, Pharmacia Biotech사 제조) 0.175㎍을 가하여 혼합하고, 37℃에서 인큐베이트하여, 반응 개시 후 일정 시간마다 반응액의 일부를 취출하였다. 취출한 반응액을 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 실활시키고, 올리고뉴클레오티드의 잔량을 HPLC에 의해 정량하였다. HPLC 조건은 이하와 같다: 그래디언트 6-12% MeCN(15분); 유속 0.8mL/분; 칼럼 온도 50℃. 올리고뉴클레오티드의 잔량을 미반응의 올리고뉴클레오티드의 비율(%)로서 산출하고, 반응 시간에 대해 플롯하였다. 결과를 도 1에 도시한다.
도 1은, 5'-d(TTTTTTTTXT)-3' 서열의 각종 올리고뉴클레오티드를 3'-엑소뉴클레아제로 처리한 경우의, 미반응의 올리고뉴클레오티드 비율의 경시 변화를 도시하는 그래프이다. 도 1의 세로축은, 뉴클레아제 처리에 대해 미반응의 올리고뉴클레오티드의 비율(%)을 나타내고, 가로축은, 뉴클레아제 처리 시간(분)을 나타낸다. 도 1의 기호는 이하를 나타낸다: 사각, 천연형 뉴클레오시드를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 33); 환, LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 38); 삼각, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 32); X, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 13); 및 역삼각, S-올리고를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 39).
도 1로부터 명백한 바와 같이, 화합물 13은, 뉴클레아제 처리의 20분 후에도 50% 이상이 미반응인채로 잔존하고 있어, 분해되기 어려웠다. 화합물 32는, 화합물 13에 비하면 미반응의 올리고뉴클레오티드의 잔존 비율이 낮았다. 그러나, 화합물 32는, 뉴클레아제 처리의 10분 후에는 거의 분해되는 화합물 38(LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드)과 비교하면, 분해되기 어려웠다.
(실시예 10) 올리고뉴클레오티드 유연체의 뉴클레아제 내성의 평가
5'-d(TTTTTTTTX)-3' 서열의 X가 구아니딘 가교형 인공 핵산인 올리고뉴클레오티드 유연체인, 9mer의 올리고뉴클레오티드(화합물 40)를, 이하와 같이 조제하였다.
화합물 32(3330pmol)를 함유하는 완충액 40μL[50mM Tris·HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2]에 3'-엑소뉴클레아제(Crotalus admanteus venom phosphodiesterase: CAVP, Pharmacia Biotech사 제조)(0.2㎍)을 가하여 혼합하고, 37℃에서 3시간 인큐베이트하였다. 이어서, 90℃에서 2분간 가열하여 효소를 실활시킨 후, HPLC로 정제를 실시하였다. 수득된 올리고뉴클레오티드에 관해서, 비행 시간형 질량 분석(MALDI-TOF-MS)에 의한 분자량 측정값(2743.07)이 이론값(2743.83)과 양호한 일치를 나타낸 점에서, 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드가 수득된 것을 확인하였다.
5'-d(TTTTTTTTX)-3' 서열의 X가 LNA인 올리고뉴클레오티드(가부시키가이샤 진디자인 제조: 화합물 41)를 비교를 위해 사용하였다.
뉴클레아제 내성의 평가는, 각종 올리고뉴클레오티드(750pmol) 중 어느 하나를 함유하는 완충액 100μL에 3'-엑소뉴클레아제 0.08㎍을 첨가한 것 이외에는, 실시예 9와 같이 실시하였다. 결과를 도 2에 도시한다.
도 2는, 5'-d(TTTTTTTTX)-3' 서열의 각종 올리고뉴클레오티드를 3'-엑소뉴클레아제로 처리한 경우의, 미반응의 올리고뉴클레오티드 비율의 경시 변화를 도시하는 그래프이다. 도 2의 세로축은, 뉴클레아제 처리에 대해 미반응의 올리고뉴클레오티드의 비율(%)을 나타내고, 가로축은, 뉴클레아제 처리 시간(분)을 나타낸다. 도 2의 기호는 이하를 나타낸다: 환, LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 41); 및 삼각, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 40).
도 2로부터 명백한 바와 같이, 화합물 40(구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드)은, 뉴클레아제 처리의 20분 후에도 80%가 미반응인채로 잔존하고 있었다. 이것에 대해, 화합물 41(LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드)은, 뉴클레아제 처리의 20분 후에는 미반응의 올리고뉴클레오티드는 거의 잔존하고 있지 않았다. 이와 같이, 실시예 4의 구아니딘 가교형 뉴클레오시드 유연체(화합물 28)와 같은 5원환 구아니딘 가교형 인공 핵산을 3' 말단에 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 매우 높은 뉴클레아제 내성능을 나타내었다.
(실시예 11) 올리고뉴클레오티드 유연체의 융해 온도(Tm)의 측정
이하의 표 9에 기재하는 화합물 33(10mer의 올리고 dT로 이루어지는 천연형 올리고뉴클레오티드); 화합물 29 내지 31, 42 및 43(화합물 28의 구아니딘 가교형 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체); 및 화합물 44 내지 48(LNA-T를 함유하는 올리고뉴클레오티드)에 관해서, 10mer의 폴리A에 어닐링 처리하여 복합체를 형성시킨 후, 복합체의 50%가 해리되는 온도인 Tm값을 측정함으로써, 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 형성능을 조사하였다.
화합물 29 내지 31, 42 및 43은, 역상 간이 칼럼에 의한 정제 후의 TFA 처리에 TFA 50% 대신 TFA 75%를 사용한 것 이외에는 실시예 5에 기재한 바와 같이 합성 및 정제하였다. 화합물 44 내지 48은, 가부시키가이샤 진디자인제이다.
복합체 형성 및 Tm값의 측정에 관해서는, KCl 200mM, 카코딜산칼륨 완충액(pH 6.8) 20mM, 올리고뉴클레오티드 4μM, 및 표적쇄 4μM을 함유하는 샘플 용액(130μL)을 사용한 것 이외에는, 실시예 6과 같이 실시하였다. 결과를 표 9에 기재한다. 표 9는, 천연형 올리고뉴클레오티드 및 다양한 수의 LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 다양한 수의 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체의 폴리A에 대한 하이브리드 형성능을 Tm값 및 수식 단위당 Tm값차로 나타낸다.
Figure 112015038184419-pct00041
표 9로부터 명백한 바와 같이, RNA를 표적으로 한 경우, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체는, 천연형 올리고뉴클레오티드와 비교하여 충분히 높은 결합 친화성을 나타내었다. 또한, 인공 핵산의 도입수가 3잔기 이하인 경우에는, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체는, LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드와 동정도의 Tm값이었지만, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 5잔기 도입한 올리고뉴클레오티드는, LNA를 5잔기 도입한 경우보다도 높은 결합 친화성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 1잔기당 Tm값의 상승을 비교하면, LNA를 도입한 경우에는, 도입수에 상관없이 Tm값의 상승은 6℃에서 7℃인 한편, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 도입한 경우에는, 도입수를 증가시킴에 따라 1잔기당 Tm값의 상승이 커지는 것이 밝혀졌다. 이러한 점에서, 가교 구조에 의한 결합 친화성에 대한 영향은 상가적(相加的)인데 대해, 구아니딘 유래의 양이온에 의한 결합 친화성에 대한 영향은 상승적인 것이 시사되었다. 또한, DNA를 표적으로 한 경우, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 매우 높은 결합 친화성을 나타내고, 천연형 올리고뉴클레오티드나 LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드보다도 훨씬 높은 결합 친화성을 갖는 것이 밝혀졌다.
(실시예 12) 올리고뉴클레오티드 유연체의 표적 염기 인식능의 평가
표 9의 구아니딘 가교형 인공 핵산이 5잔기 도입되어 있는 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 43) 및 LNA가 5잔기 도입되어 있는 올리고뉴클레오티드(화합물 48)에 관해서, 완전 상보 서열을 갖는 DNA 표적쇄(풀매치형) 및 1염기 미스매치를 갖는 DNA 표적쇄(미스매치형)의 각각에 대한 결합 친화성을 평가하였다. 표적쇄의 서열은, 풀매치형: 5'-(AAAAAAAAAA)-3', 미스매치형: 5'-(AAAAATAAAA)-3'이다. 결합 친화성은, 실시예 11과 같이, 어닐링 처리하여 복합체를 형성시킨 후, 복합체의 50%가 해리되는 온도인 Tm값을 측정함으로써 평가하였다.
결과를 도 3에 도시한다. 도 3은, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체 및 LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드의, 완전 상보 서열을 갖는 DNA 표적쇄(풀매치형) 및 1염기 미스매치를 갖는 DNA 표적쇄(미스매치형)의 각각에 대한 Tm 곡선을 나타낸다. 도 3의 세로축은 260nm의 흡광도를 나타내고, 가로축은 온도(℃)를 나타낸다. 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 43)의 미스매치형(가는 일중선) 및 풀매치형(가는 일중파선) 및 LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 48)의 미스매치형(굵은 일중선) 및 풀매치형(굵은 일중파선)에 대한 각각의 결과를 나타낸다.
도 3으로부터 명백한 바와 같이, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 43)는, 미스매치형 표적쇄에 대한 Tm값은 풀매치형 표적쇄에 대한 Tm값과 비교하여 충분히 낮으며, 그 Tm값의 저하는, LNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드(화합물 48)의 경우와 동정도이었다. 이러한 점에서, 구아니딘 가교형 인공 핵산을 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 표적 염기 인식능을 손상시키지 않고, 표적쇄와의 매우 높은 결합 친화성을 갖는 것이 명백해졌다.
(실시예 13) 구아니딘 가교형 인공 핵산(이하, GuNA라고 칭하는 경우가 있다)의 세포내 동태에 관한 평가
(1) 형광 표식 GuNA 수식 올리고뉴클레오티드(F-GuNA-ODN)의 합성과 동정
우선, 실시예 4에서 수득된 화합물 28, 천연형 뉴클레오시드, 및 후술하는 형광 수식을 위한 아미다이트체를 사용하여, DNA/RNA 올리고뉴클레오티드 자동 합성기 nS-8(가부시키가이샤 진디자인 제조)에 의해, 올리고뉴클레오티드 유연체를 합성하였다. 합성한 올리고뉴클레오티드 유연체는 표 10에 기재하는 화합물 53 내지 57의 전구체(화합물 49)가 되는 화합물이다. 이 전구체(화합물 49)의 구조를 이하에 나타낸다.
Figure 112015038184419-pct00042
올리고뉴클레오티드의 자동 합성에 있어서, 티미딘아미다이트체(형번: T111081)와 티미딘 CPG 고상 담체(형번: T361010), CapA(형번: L840020-06), CapB(형번: L850020-06), 산화제(형번: L860020-06)는 모두 SAFC(등록상표) Proligo(등록상표) Reagents로부터 입수하였다. 아세토니트릴(형번: 018-14451)과 디블로킹 용액(형번: 042-28921)은 와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤로부터 구입하였다. 활성화제는 0.25M 5-에틸티오-1H-테트라졸/드라이 아세토니트릴(제조원 코드: 30-3140-52, Glen Research사 제조)을 사용하였다. 화합물 28의 아세토니트릴 용액(0.1M)의 커플링 시간은 20분간 실시하고, 또한, 화합물 28을 3염기 연속하여 올리고뉴클레오티드에 도입하는 경우, 3염기째만 더블 커플링을 실시하였다. 그 이외에는 천연 DNA 합성과 동조건으로 실시하였다.
한편, 형광 수식에 관해서는, 형광제의 아미다이트체를 사용하여 올리고뉴클레오티드에 도입한 경우, 나중의 75% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리할 때에 형광제가 가수분해될 우려가 있다. 그래서, 우선은, 구조식을 이하에 나타내는 아미다이트체 Thiol-Modifer C6 S-S(제조원 코드: 10-1936-90, Glen Research)를 DNA 자동 합성기에 의해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단측에 부가하여, 보호기 디메톡시트리틸기(DMTr기)를 탈보호하지 않고 종료함으로써, 형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 53 내지 57)의 전구체(화합물 49)를 수득하였다. 한편, 아미다이트체 Thiol-Modifer C6 S-S의 디설피드 결합은 75% TFA에 대해, 충분한 내성이 있는 것이 확인되고 있다.
Figure 112015038184419-pct00043
비교를 위해, 화합물 28 대신 우레아 가교형 인공 핵산 2',4'-BNA/LNA(5-메틸-2'-0,4'-C-메틸렌우리딘을 함유하는 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 58 내지 61: 이하의 표 10에 기재한다)(가부시키가이샤 진디자인 제조)를 구입하여 사용하였다. 이 올리고뉴클레오티드 유연체의 전구체(화합물 50)의 구조를 이하에 나타낸다.
Figure 112015038184419-pct00044
수득된 전구체(화합물 49)를 28% 암모니아 수용액을 사용하여 CPG 담체로부터 잘라내고, NAP-10 칼럼(코드 번호: 17-0854-01, GE Healthcare)을 사용하여 암모니아를 제거하고, RP-HPLC에 의해 정제하고, 동결 건조시켰다. RP-HPLC는 Shimadzu LC-10ATVP, Shimadzu SPD-10AVP, Shimadzu CTO-10VP를 사용하고, 이하에 나타내는 조건으로 실시하였다.
이동상
A액: 0.1M 아세트산트리에틸암모늄 완충액, pH 7.0
B액 80% 아세토니트릴/0.1M 아세트산트리에틸암모늄 완충액
그래디언트:
B액 농도: 0-100%(80분)
사용 칼럼:
Waters XbridgeTM OST C18 2.5㎛(10×50mm 제품 번호: 186003954);
유속:
3.0mL/분
칼럼 온도: 50℃
검출: UV(254nm)
다음에, 75% 트리플루오로아세트산을 첨가하고, 6시간 실온에서 처리함으로써, 상기와 같이 정제된 전구체(화합물 49)로부터 Boc기와 DMTr기의 탈보호를 실시한 후, NAP-10 칼럼으로 트리플루오로아세트산을 제거하고, 동결 건조시켜 탈보호된 전구체(화합물 50)를 수득하였다.
상기의 탈보호된 전구체(화합물 50)에 관해서, Thiol-Modifer C6 S-S의 프로토콜에 따라, 100mM DTT/TE 완충액(pH 7.0)을 첨가하여 2시간 실온에서 디설피드 결합을 환원하고, SH기를 생성하였다. 수득된 환원 후의 전구체(화합물 51)를 RP-HPLC(B액: 50% 아세토니트릴/0.1M 아세트산트리에틸암모늄 완충액; 그래디언트: B액 농도 0-50%/25분)로 정제하고, 분취하였다. 수득된 환원 후의 전구체(화합물 51)의 구조를 이하에 나타낸다.
Figure 112015038184419-pct00045
상기 환원에 의해 SH기가 생성되고, 정제된 전구체(화합물 51)에, 구조식을 이하에 나타내는 Alexa Fluor 488 C5 말레이미드(제품 코드: A-10254, Life technologies사 제조)를 전구체(화합물 51)에 대해 10등량 첨가하고, 실온에서 하룻밤 반응시켜 SH기와 말레이미드를 결합하였다(Nucleic Acids Research, 36, 2764-2776, 2008).
Figure 112015038184419-pct00046
그 후, RP-HPLC(B액: 50% 아세토니트릴/0.1M 아세트산트리에틸암모늄 완충액; 그래디언트: B액 농도 0-50%/25분)로 정제하고, 형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 52: 화합물 53 내지 61)를 수득하였다. 한편, 이 중, 화합물 54 내지 57이 형광 표식 GuNA 수식 올리고뉴클레오티드(F-GuNA-ODN)이다. 수득된 형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 52)의 구조를 이하에 나타낸다.
Figure 112015038184419-pct00047
합성한 형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 53 내지 61)의 정제 및 순도 확인은 실시예 2와 같이 실시하였다.
합성한 형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 53 내지 61)의 질량 분석은, MALDI-TOF-MS(Spiral TOF JMS-S3000, JEOL)에 의해 실시하였다. 결과를 표 10에 기재한다.
Figure 112015038184419-pct00048
(2) 형광 표식 GuNA 수식 올리고뉴클레오티드 F-GuNA-ODN의 인간 간암 세포(HuH-7)로의 도입과 그 세포내 동태의 관찰
우선, 전준비로서, 세포 관찰용 유리 보텀 디쉬(품종 코드: 3970-035, Iwaki)의 유리 부분에 100㎍/mL 콜라겐/염산(pH 3.0)(Cellmatrix Type I-C, 닛타젤라틴 가부시키가이샤 제조)을 1mL 첨가함으로써, 콜라겐 코팅을 실시하였다.
이것을 실온에서 30분 정치 후, 콜라겐을 제거하고, 인산 완충 생리 식염수로 1회 세정 후, 실온에서 1시간 건조시켰다. 다음에, 4.5×105개의 HuH-7세포(JCRB 세포 뱅크로부터 구입하였다(세포 번호: JCRB0403))를 파종하고, 페놀레드 불함 배지 10% FBS/DMEM(제품 번호: 08490-05, 나카라이테스크 가부시키가이샤 제조) 하에서 하룻밤 배양을 실시하고(5% CO2), 그 후, 상기 (1)에서 수득된 형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 53 내지 61)를, 각각 500nM의 농도로 첨가하였다.
형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 53 내지 61)의 첨가 후, 추가로 12시간 배양을 계속하고, 그 후, 배양된 HuH-7 세포를 행크스 평형 염류 용액(HBSS, 제품번호: 14025-092, Life technologies사 제조)으로 1회 세정하고, 프로토콜에 따라 Hoechst 33342(제품 번호: H3570, Life technologies사 제조)와 LysoTracker(등록상표) Red DND-99(카탈로그 번호: L-7528, Life technologies사 제조)를 사용하여 핵과 리소좀을 염색하였다. 그 후, 행크스 평형 염류 용액을 2mL 첨가하고, 낙사형 형광 현미경(BZ-9000, 가부시키가이샤 키엔스 제조)을 사용하여 형광상을 수득하였다. 한편, 대물 렌즈는 40×위상차 렌즈(S Plan Fluor, 가부시키가이샤 니콘 제조)를 사용하였다.
각 형광제의 검출 필터 세트와 노광 시간을 이하에 나타낸다.
Alexa Fluor 488: Ex 470/40nm, DM 495nm, BA 535/50nm(GFP-B, 가부시키가이샤 키엔스 제조), 5초
Hoechst 33342: Ex 360/40nm, DM 400nm, BA 460/50nm(DAPI-B, 가부시키가이샤 키엔스 제조), 2초
LysoTracker(등록상표) Red DND-99: Ex 540/25nm, DM 565nm, BA 605/55nm(TRITC, 가부시키가이샤 키엔스 제조), 1.2초
형광 표식 수식 올리고뉴클레오티드 유연체(화합물 53 내지 61)를 HuH-7 세포에 도입한 결과, 화합물 28을 6잔기 도입한 화합물 57과 2',4'-BNA/LNA를 6잔기 도입한 화합물 61의 2종류의 올리고뉴클레오티드를 첨가한 경우에 세포 내에 있어서 특히 강한 형광 발광이 관찰되었다. 그 밖의 올리고뉴클레오티드에 관해서는, 이들과 비교하면 형광 발광이 약했다. 화합물 57(A 내지 D) 및 화합물 61(E 내지 H)의 HuH-7 세포 내의 동태를 나타내는 현미경 사진을 도 4에 도시한다. A, E는 위상차상; B, F는 Alexa Fluor 488(올리고뉴클레오티드)의 형광상; C, G는 Hoechst 33342(핵)의 형광상; D, H는 LysoTracker(리소좀)의 형광상이다(스케일 바 50㎛). 화합물 28을 6잔기 도입한 화합물 57의 올리고뉴클레오티드를 사용한 경우에는 강한 형광 발광이 확인되었다(도 4B). 이것에 대해, 2',4'-BNA/LNA를 6잔기 도입한 화합물 61의 올리고뉴클레오티드를 사용한 경우, 어느 정도의 형광 발광을 나타냈지만, 화합물 28을 사용한 화합물 57보다 형광 발광이 약했다(도 4F). 이것은, 화합물 57에서는, 화합물 28을 6잔기 도입함으로써, 세포로의 도입 효율이 높아지고, 또한 올리고뉴클레오티드 전체의 하전이 변화되어 세포 표면으로의 흡착 효율이 높아져 있는 결과라고 생각된다. 이것에 대해, 화합물 61에서는 2',4'-BNA/LNA를 6잔기 도입함으로써, 세포로의 도입 효율이 높아져 있지만, 하전이 변화되어 있지 않기 때문에 세표 표면으로의 흡착 효율이 높아져 있지 않고, 그 만큼, 화합물 57과 비교하면 형광 발광이 약했던 것으로 생각된다.
다음에, 화합물 57의 HuH-7 세포내의 동태를 나타내는 현미경 사진으로서, 도 4A 내지 D에 관해서 도 4B의 화살표로 나타내는 영역에 관해서 확대한 사진(A 내지 D)을 도 5에 도시한다. 수득된 형광 발광의 세포 내에서의 국재를 상세하게 관찰하면, 첨가한 올리고뉴클레오티드는 핵 내에는 존재하지 않으며, 세포질 내의 소포 내에 많이 축적되어 있고, 리소좀 내에도 다수 존재하고 있는 것도 밝혀졌다.
이상의 점에서, 음의 전하를 띠는 올리고뉴클레오티드에 대해, 양의 전하를 띠는 구아니디노기를 부여시킴으로써 올리고뉴클레오티드 전체의 전하를 변화시키는 것은, 올리고뉴클레오티드 자체의 세포 도입 효율을 향상시키는 유용한 수법인 것이 증명되었다.
한편, 종래는 드럭 딜리버리 시스템을 사용하지 않고, 올리고뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것은, 효소 내성이나 세포 투과성의 면에서 곤란하다고 여겨지고 있었다. 이들을 개선하기 위한 수법으로서는, 올리고뉴클레오티드의 인산 골격에 포스포로티오에이트 수식을 실시하는 수법이 범용되고 있다. 그러나, 포스포로티오에이트 수식에 있어서는, 인 원자 위에 발생하는 키럴리티(chirality)의 문제에서, 생산면, 안전면, 약효 저하가 우려되는 재료가 되었다. 이번에는, 포스포로티오에이트 수식을 실시하지 않고 세포내 투과성이 높아진 점에서, 본 발명의 구아니딘 가교를 갖는 인공 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드가 이러한 결점을 극복하고, 핵산의 의약품화에 공헌할 수 있는 것을 알 수 있다.
본 발명에 의하면, 표적 핵산에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성을 가지며, 높은 뉴클레아제 내성을 나타내는 올리고뉴클레오티드용의 핵산 분자를 제공할 수 있다. 이러한 핵산 분자는, 질병의 새로운 치료법이나 예방법으로서 기대되고 있는 안티센스법, 안티진법, 앱타머를 사용하는 방법, siRNA를 사용하는 방법 등에 사용하는 핵산 의약의 소재로서 크게 공헌할 수 있다.
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Claims (6)

  1. 이하의 식 I 또는 II로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    Figure 112015038184419-pct00049

    상기 식 I 및 II에 있어서,
    B1은, α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 푸린-9-일기 또는 2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이고, 여기서, 상기 α그룹은, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알콕시기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬티오기, 아미노기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬아미노기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 아미노기, 및 할로겐 원자로 이루어지고;
    R1, R12 및 R13은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 분기(分岐) 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 아미노기의 보호기, 또는
    Figure 112015038184419-pct00050
    이고; 그리고
    R2 및 R3은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 핵산 합성의 수산기의 보호기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴 부분을 갖는 아르알킬기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 아실기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 실릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 인산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기, -P(R4)R5[여기서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6의 시아노알콕시기, 및/또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아미노기이다]이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식 I 또는 II에 있어서, 상기 B1은, 6-아미노푸린-9-일기, 2,6-디아미노푸린-9-일기, 2-아미노-6-클로로푸린-9-일기, 2-아미노-6-플루오로푸린-9-일기, 2-아미노-6-브로모푸린-9-일기, 2-아미노-6-하이드록시푸린-9-일기, 6-아미노-2-메톡시푸린-9-일기, 6-아미노-2-클로로푸린-9-일기, 6-아미노-2-플루오로푸린-9-일기, 2,6-디메톡시푸린-9-일기, 2,6-디클로로푸린-9-일기, 6-머캅토푸린-9-일기, 2-옥소-4-아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-플루오로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-클로로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-메톡시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-머캅토-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 또는 4-아미노-5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기인, 화합물 또는 이의 염.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식 I 또는 II에 있어서, 상기 B1은, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기인, 화합물 또는 이의 염.
  4. 이하의 식 I' 또는 II'로 표시되는 뉴클레오시드 구조를 적어도 1개 함유하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약리학상 허용되는 염:
    Figure 112015038184419-pct00051

    상기 식 I' 및 II'에 있어서,
    B1은, α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 푸린-9-일기 또는 2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기이고, 여기서, 당해 α그룹은, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알콕시기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬티오기, 아미노기, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 알킬아미노기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 아미노기, 및 할로겐 원자로 이루어지고;
    R1, R12 및 R13은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 아미노기의 보호기, 또는
    Figure 112015038184419-pct00052
    이고, 그리고
    R14는 수소 원자이고; 그리고
    R2 및 R3은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 핵산 합성의 수산기의 보호기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 분기 또는 환을 형성하고 있어도 좋은 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋고 그리고 헤테로 원자를 함유하고 있어도 좋은 탄소수 3 내지 12의 아릴 부분을 갖는 아르알킬기, 당해 α 그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 아실기, 당해 α 그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 실릴기, 당해 α그룹으로부터 선택되는 임의의 치환기를 1 이상 가지고 있어도 좋은 인산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 인산기, -P(R4)R5[여기서, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 머캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 머캅토기, 아미노기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬티오기, 탄소수 1 내지 6의 시아노알콕시기 및/또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기로 치환된 아미노기이다]이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식 I' 또는 II'에 있어서, 상기 B1이, 6-아미노푸린-9-일기, 2,6-디아미노푸린-9-일기, 2-아미노-6-클로로푸린-9-일기, 2-아미노-6-플루오로푸린-9-일기, 2-아미노-6-브로모푸린-9-일기, 2-아미노-6-하이드록시푸린-9-일기, 6-아미노-2-메톡시푸린-9-일기, 6-아미노-2-클로로푸린-9-일기, 6-아미노-2-플루오로푸린-9-일기, 2,6-디메톡시푸린-9-일기, 2,6-디클로로푸린-9-일기, 6-머캅토푸린-9-일기, 2-옥소-4-아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-플루오로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 4-아미노-2-옥소-5-클로로-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-메톡시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-머캅토-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기, 또는 4-아미노-5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기인, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약리학상 허용되는 염.
  6. 제4항에 있어서, 상기 식 I' 또는 II'에 있어서, 상기 B1이 2-옥소-4-하이드록시-5-메틸-1,2-디하이드로피리미딘-1-일기인, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약리학상 허용되는 염.
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