BR112016008125B1 - Domínio proteico isolado de fibronectina tipo iii modificado com cisteína, seu método de produção e método para produzir uma molécula isolada de de fibronectina tipo iii biespecífica modificada com cisteína - Google Patents

Domínio proteico isolado de fibronectina tipo iii modificado com cisteína, seu método de produção e método para produzir uma molécula isolada de de fibronectina tipo iii biespecífica modificada com cisteína Download PDF

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Abstract

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE DOMÍNIO DE FIBRONECTINA TIPO III MODIFICADAS COM CISTEÍNA. Moléculasmonoespecíficas e biespecíficascontendodomínios de FN3 anti-EGFR e/ou anti-c-Metmodificadas com cisteína que compreendem um oumaisaminoácidoscisteína livres sãoproduzidaspormutagenização de umasequência de ácidonucleico de umamolécula parental e porsubstituição de um oumaisresíduos de aminoácidoporcisteína para codificar as moléculasmonoespecíficas e biespecíficas que contêmdomínios de FN3 modificadas com cisteína; expressar as moléculas que contêmdomínios de FN3 modificadas com cisteína; e recuperar a molécula que contémdomínios de FN3 modificada com cisteína; As moléculasmonoespecíficasoubiespecíficas que contêmdomínios de FN3 modificadas com cisteínaisoladaspodem ser covalentementeligadas a um marcador de detecçãoou a umaporção de fármaco e usadasterapeuticamente.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001]A presenteinvenção se refereàsmoléculas de ligação modificadas com resíduos de cisteína e aosmétodos de produzir e usar as mesmas. Mais particularmente, a invençãotemporfinalidade as moléculas de domínio de fibronectinatipo III (FN3) que podem se ligarao EGFR e/ou a c-Met que estãomodificadas com cisteína.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002]O receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR ou ErbBlou HER1 - "epidermal growth factor receptor") é umaglicoproteína de transmembrana de 170 kDa que é codificadapelo proto-oncogene c-erbBl. O EGFR é um membro da família de receptores de fator de crescimentoepidérmicohumano (HER) de receptor tirosina-quinases (RTK, "Receptor Tyrosine Kinases") que inclui HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4). Estes RTKs compartilhamumaestruturahomóloga que consisteem um domínioextracelular (ECD, "ExtraCellular Domain") de ligaçãoaoligante, um únicodomínioatravessador de transmembrana e um domíniointracelular que contém um domíniocatalítico de quinase e uma cauda C-terminal. A sinalização de EGFR é iniciada pela ligaçãoaoliganteseguida pela indução de alteraçãoconformacional, dimerização e trans-autofosforilação do receptor (Ferguson et al., Annu Rev Biophys, 37: 353-73, 2008) que iniciaumacascata de transdução de sinais que finalmenteafetaumaamplavariedade de funçõescelulares, que incluemproliferação e sobrevivênciacelulares. Aumentosem expressãoouatividadequinásica de EGFR têmestadoligados a umaamplavariedade de câncereshumanos, tornando o EGFR um alvoatrativo para intervençãoterapêutica (Mendelsohn et al., Oncogene 19: 6550-6565, 2000; Grünwald et al., J Natl Cancer Inst 95: 851-67, 2003; Mendelsohn et al., Semin Oncol 33: 369-85, 2006). Alémdisso, osaumentos tanto emnúmero de cópias de gene EGFR quantoemexpressão de proteínatêmestadoassociados a respostasfavoráveisaoinibidor de EGFR tirosina-quinase, IRESSA™ (gefitinib), emcâncer de pulmão de célulasnãopequenas (Hirsch et al., Ann Oncol 18:75260, 2007).
[0003]As terapias com EGFR incluem tanto moléculaspequenas quantoanticorpos anti-EGFR, aprovadas (aprovados) para o tratamento de câncercolorretal, câncerpancreático, câncer de cabeça e pescoço, e câncer de pulmão de célulasnãopequenas (NSCLC, "Non-Small Cell Lung Cancer") (Baselga e Arteaga, J Clin Oncol 23:2445-2459 (20005; Gill et al., J Biol Chem, 259:7755-7760, 1984; Goldstein et al., Clin Cancer Res, 1:131 1-1318; 1995; Prewett et al., Clin Cancer Res, 4:2957-2966, 1998).
[0004]A eficácia das terapias anti-EGFR podedepender do tipo de tumor e do estado de amplificação/mutação de EFGR no tumor, e poderesultaremtoxicidade para a pele (De Roock et al., Lancet Oncol 11: 753-762, 2010; Linardou et al., Nat Rev Clin Oncol, 6: 352-366, 2009; Li e Perez-Soler, Targ Oncol 4: 107-119, 2009). Osinibidores de EGFR tirosina-quinase (TKI) sãocomumenteusadoscomoterapias de 2a linha para câncer de pulmão de célulasnãopequenas (NSCLC), mas com frequência param de funcionardentro de doze meses devidoàs vias de resistência (Riely et al., Clin Cancer Res 12: 839-44, 2006).
[0005]c-Met codifica um receptor tirosina-quinase. Ele foiprimeiro identificadocomo um proto-oncogene em 1984 apóstersidoverificado que otratamento com um carcinógenoresultouemumaproteína de fusãoconstitutivamenteativa TPR-MET (Cooper et al., Nature 311:2933, 1984). A ativação de c-Met medianteseuligante HGF estimulaumapletora de processoscelulares que incluemcrescimento, motilidade, invasão, metástase, transiçãoepitelial-mesenquimal, angiogênese/cicatrização de ferimento, e regeneração de tecido (Christensen et al., Cancer Lett 225:1-26, 2005; Peters e Adjei, Nat Rev Clin Oncol 9:314-26,2012). c-Met é sintetizadacomouma proteína de cadeiaúnica que é proteoliticamenteclivadaemumasubunidade-alfa de 50 kDa e umasubunidade-beta de 140 kDaligadasporumaligação de dissulfeto (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003). c-Met é estruturalmente similar aos outros receptores de membranacomo Ron e Sea e é compreendida de um domínioextracelular de ligaçãoaoligante, um domínio de transmembrana, e um domíniocitoplasmático (que contém o domínio de tirosina-quinase e umaregião de cauda C-terminal). A estequiometriaexata da ligação de HGF:c-Met é desconhecida, mas de modo geralacredita-se que duas moléculas de HGF ligam-se a duas moléculas de c-Met ocasionando a dimerização de receptor e a autofosforilaçãoemtirosinas 1230, 1234, e 1235 (Stamos et al., The EMBO Journal 23: 2325-2335, 2004). A autofosforilação de c-Met independente de ligantepodetambémocorrerdevido à amplificação, mutação de gene ousuperexpressão de receptor.
[0006]c-Met é, frequentemente, amplificada, mutadaou superexpressadaemmuitostipos de câncer que incluemcâncergástrico, câncerpulmonar, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncerovariano, câncer de próstata, câncer de tireoide, câncerpancreático, e câncer do SNC (Sistema Nervoso Central). Mutações com troca de sentidotipicamentelocalizadas no domínio de quinasesãocomumenteencontradasem carcinomas papilaresrenaishereditários (PRCC) e em 13% de PRCCs esporádicos (Schmidt et al., Oncogene 18: 23432350, 1999). Ao contrário, mutaçõesem c-Met localizadasnosdomínios de semaforinaoujustamembrana de c-Met são com frequênciaencontradasemcânceresgástrico, de cabeça e pescoço, hepático, ovariano, NSCLC e de tireoide (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22:309-325,2003; Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305). A amplificação de c- Met temsidodetectadaemcânceres de cérebro, colorretal, gástrico, e pulmonar, com frequênciacorrelacionando-se com a progressão da doença (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22:309-325, 2003). Até 4% e 20% de câncer de pulmão de célulasnãopequenas (NSCLC) e dos cânceresgástricos, respectivamente, apresentamamplificação de c-Met (Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305.: Sierra e Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011). Mesmonaausência da amplificação de gene, a superexpressado de c-Met é frequentementeobservadaemcâncer de pulmão (Ichimura et al., Jpn J Cancer Res, 87:1063-9, 1996). Alémdisso, emamostrasclínicas, quase a metade dos adenocarcinomas pulmonaresapresentouteores altos de c-Met e de HGF, ambos osquaiscorrelacionam-se com taxa de crescimento de tumor aumentada, metástaseaumentada e prognose desfavorável (Sierra and Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21- 35, 2011; Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66: 1915-8, 1998).
[0007]Quase 60% de todosostumores que se tornamresistentes aosinibidores de EGFR tirosina-quinaseaumentam a expressão de c- Met, amplificam c-Met, ouaumentamapenasseuliganteconhecido, HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77-88, 2010), sugerindo a existência de uma via compensatória para EGFR porintermédio de c- Met. A amplificação de c-Met foiprimeiroidentificadaemcélulascultivadas que se tornaramresistentesaogefinitib, um inibidor de EGFR quinase, e apresentaramsobrevivênciaaumentadaatravés da via Her3 (Engelman et al., Science, 316:1039-43,2007). Isto foi adicionalmentevalidadoemamostrasclínicasnasquaisnove dos 43 pacientes com resistênciaadquirida a quer erlotinib quer gefitinib apresentaramamplificação de c-Met, emcomparação com apenasdois dos 62 pacientesnãotratados. Curiosamente, quatro dos novepacientesnãotratadostambémadquiriram a mutaçãoativadora de EGFR, T790M, demonstrando vias de resistênciasimultâneas (Beat et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104:20932-7, 2007).
[0008]As funçõesindividuais tanto de EGFR quanto de c-Met em câncerestão agora bemestabelecidas, tornandoestesalvosatrativos para terapia de combinação. Ambos osreceptoressinalizamatravés das mesmas vias de sobrevivência e antiapoptótica (ERK e AKT); dessa forma, a inibição do par emcombinaçãopodelimitar o potencial para ativação de via compensatóriaotimizandoassim a eficácia total. As terapias de combinação que têmcomoalvos EGFR e c-Met sãotestadasem testes clínicos com Tarceva (erlotinib) emcombinação com anticorpomonovalente anti-c-Met para NSCL (Spigel et al., 2011 ASCO Annual Meeting Proceedings 2011, Journal of Clinical Oncology: Chicago, IL. p. 7505) e Tarceva (erlotinib) emcombinação com ARQ-197, um inibidor de moléculapequena de c-Met (Adjei et al., Oncologist, 16:788-99,2011). As terapias de combinaçãoou moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met estãodescritasporexemploem: publicaçãointernacional de patente n° WO2008/127710, publicação de patente US n° US2009/0042906, publicaçãointernacional de patente n° WO2009/111691, publicaçãointernacional de patente n° WO2009/126834, publicaçãointernacional de patente n° WO2010/039248, publicaçãointernacional de patente n° WO2010/115551.
[0009]As atuaisabordagens com moléculapequena e molécula grande (isto é, anticorpo) para antagonizar as vias de sinalização de EGFR e/ou c-Met para terapiapodem ser subótimasdevido à possívelfalta de especificidade com moléculaspequenas e portantopotenciaisatividadeinacurada e toxicidadelimitadora de dose encontradas com osinibidores de moléculapequena. Ostípicosanticorposbivalentespodemresultaremagrupamento de receptoresligados à membrana e ativaçãoindesejada das vias de sinalização a jusante, e osanticorposmonovalentes (metades de braços de anticorpo) apresentamcomplexidade e custosignificativos para o processo de fabricação.
[00010] Consequentemente, existe a necessidade de inibidoresmonoespecíficos e biespecíficos de EGFR e/ou c-Met que tambémtêm a capacidadeadicional de conjugarfármacoscitotóxicosdirecionando, dessa forma, estescompostospotentes para as célulastumorais que expressam EGFR/c-Met, intensificando a atividade antitumoral destesinibidores de EGFR/c-Met. Emboraexistamnatécnicaconjugados de anticorpo-fármaco, o meioconvencional para ligarumaporção de fármacoresulta, de modo geral, emumamisturaheterogênea de moléculasna qual as porções de fármacoestãoligadas a numerosossítios no anticorpo. Por exemplo, fármacoscitotóxicostêmsidotipicamenteconjugadosaosanticorposmedianteosfrequentementenumerososresíduos de lisina de um anticorpo, gerandoumamisturaheterogênea de conjugados de anticorpo- fármaco. Dependendo das condições de reação, a misturaheterogêneatipicamentecontémumadistribuição de anticorpos com de 0 a cerca de 8, oumais, porções de fármacoligadas. Alémdisso, dentro de cadasubgrupo de conjugados com umarazão de númerosinteirosespecífica entre as porções de fármaco e osanticorpos, estáumamisturapotencialmenteheterogêneana qual a porção de fármacoestáligada a váriossítios no anticorpo. Métodosanalíticos e preparativossãoinadequados para separar e caracterizar as moléculas de espécies de conjugados de anticorpo-fármacodentro da misturaheterogênearesultante de umareação de conjugação. Osanticorpossãobiomoléculasgrandes, complexas e estruturalmentediferentes, com frequência com muitosgruposfuncionaisreativos. As reatividades deles com osreagentesconectores ("linkers") e osintermediáriosconectores ("linkers") de fármacosãodependentes de fatores, como pH, concentração, concentração de sais, e cossolventes. Alémdisso, o processo de conjugação de multietapaspode ser nãoreproduzíveldevidoàsdificuldades no controle das condições de reação e nacaracterização dos reagentes e intermediários.
[00011] A conjugaçãoquímica via cisteínaspresentesemanticorpostambémtemsidodemonstrada. Entretanto, a modificação para grupostiolde cisteína pelamutação de váriosresíduosde aminoácidodeumaproteínapara aminoácidoscisteína é potencialmenteproblemática, particularmente no caso de resíduosnãopareados (Cys livre) ouaqueles que sãorelativamenteacessíveis à reaçãoouoxidação. Osresíduos de Cysnãopareadossobre a superfície da proteínapodemparear e oxidar para formardissulfetosintermoleculares, e consequentementedímerosoumultímeros de proteína. A formação de dímero de dissulfetotorna a nova Cysnãoreativa para conjugação a um fármaco, um ligante, ou um outro marcador. Alémdisso, se aproteínaoxidativamente forma umaligação de dissulfeto intramolecular entre o resíduo de Cysrecém-modificado e um resíduo de Cysexistente, ambos osgruposCysestãoindisponíveis para interações e participaçãocomosítioativo. Alémdisso, a proteínapode ser tornada inativaounãoespecífica, pordobramentoerradoouperda de estruturaterciária (Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9).
[00012] Dessa forma, existeumanecessidade de umamolécula que possa ser submetida à conjugaçãoquímica e evitarosproblemasconfrontadospelosconjugados de anticorpo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00013] A presenteinvençãofornece um domínioisolado de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína que compreendepelomenosumasubstituição de cisteínaemumaposiçãoselecionada do grupo que consisteemresíduos 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91, e 93 do domínio de FN3 com base na SEQ ID NO: 27, e emposiçõesequivalentesemdomínios de FN3 relacionados. Uma substituição de cisteínaemumaposição no domínioounaproteínacompreendeumasubstituição de resíduo de aminoácidoexistentepor um resíduo de cisteína.
[00014] A presenteinvençãofornecetambém um domínioisolado de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 com pelomenosumasubstituição de cisteína da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 27 e especificamente se ligaao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR.
[00015] A presenteinvençãoforneceadicionalmente um domínioisolado de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114 com pelomenosumasubstituição de cisteína da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 114 e especificamente se ligaao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met) e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met.
[00016] A presenteinvençãofornecenovasposiçõesnasquais as substituições de cisteínapodem ser realizadas para gerarosdomínios de FN3 modificados com cisteína. As ditas posiçõesincluemumaou maisdentreosresíduos 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91 ou 93 das SEQ ID NOS: 11 a 114 e/ou 122 a 137.
[00017] Um aspecto da invenção é um processo para produzirosdomíniosisolados de FN3 modificados com cisteínapormutagenização de umasequência de ácidonucleico de um domínio de FN3 parental pela substituição de um oumaisresíduos de aminoácidopor um resíduo de cisteína para codificar o domínio de FN3 modificado com cisteína; expressar o domínio de FN3 modificado com cisteína; e isolar o domínio de FN3 modificado com cisteína.
[00018] Um outro aspecto da invenção é um domínioisolado de FN3 modificado com cisteína, quimicamenteconjugadoem que odomínio de FN3 estácovalentementeligado a um reagentequímico que compreendeumaporçãomaleimida.
[00019] Uma outramodalidade da invenção é um domínioisolado de FN3 modificado com cisteína, quimicamenteconjugado que podeinibir o crescimento de linhagens de célulastumorais que expressam c-Met e/ousuperexpressam EGFR.
[00020] O presentepedidofornecetambémumamoléculaisolada de FN3 biespecíficamodificada com cisteína que compreende um primeirodomínio de fibronectinatipo III (FN3) e um segundodomínio de FN3, em que o primeiro e o segundodomínios de FN3 compreendemsubstituições de cisteínaemumaposiçãoselecionada do grupo que consisteemresíduos 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91, e 93, especificamente se ligaao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR, e o segundodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met), e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met.
[00021] Um outro aspecto da invenção é umamoléculaisoladabiespecíficamodificada com cisteína, quimicamenteconjugadaem que a moléculabiespecíficaestácovalentementeligada a um reagentequímico que compreendeumaporçãomaleimida.
[00022] Um aspectoadicional da invenção é um processo para produzir a FN3 biespecíficaisoladamodificada com cisteínapormutagenização de umasequência de ácidonucleico de umamoléculabiespecífica de FN3 parental pela substituição de um oumaisresíduos de aminoácidopor um resíduo de cisteína para codificar a moléculabiespecíficamodificada com cisteína; expressar a moléculamodificada com cisteína; e isolar a moléculabiespecíficamodificada com cisteína.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00023] Figuras 1A e 1B Alinhamento de aminoácidos dos domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR. As alças BC e FG estãodentro de retângulosnosresíduos 22-28 e 75-86 da SEQ ID NO: 18. Algumasvariantesincluemsubstituições de L17A, N46K e E86I que aprimoram a estabilidadetérmica (numeração de resíduo de acordo com Tencon SEQ ID NO: 1).
[00024] Figura 2. Estruturas de citotoxina/conector ("linker").
[00025] Figura 3. Representação da fita da estruturacristalina da proteína P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27). Posiçõesfinaisidentificadascomotolerantesàssubstituições de cisteínasãomostradascomobastões e de corcompletamentepreta. As alças de ligação BC/FG estãocoloridas de cinzagraduado.
[00026]Figura 4. O alinhamento de sequências do arcabouço Tencon27 (SEQ ID NO: 99) e umabiblioteca TCL14 (SEQ ID NO: 100) que temsuperfíciealternativa de C-CD-F-FG randomizada. Osresíduos de alçaestãodentro de retângulos. As alças e as fitasestãoindicadasacima das sequências.
[00027] Figuras 5A e 5B O alinhamento de sequências dos domínios de FN3 de ligação a c-Met. A alça C e a fita CD e a alça F e a fita FG estãodentro de retângulo e abarcamosresíduos 29-43 e 6581.
[00028] Figura 6. É mostrada a inibição de fosforilação de c-Met emcélulas H292 pré-tratadas com moléculasmonoespecíficasoubiespecíficas que contêmdomínios de FN3, e estimuladas com HGF. Aumentosubstancialnapotência da moléculabiespecífica anti- EGFR/c-Met (ECB1) foiobservadoquandocomparado com um domíniomonoespecífico de FN3 de ligação a c-Met (P114AR5P74-A5, mostradocomo A5 naFigura) sozinhoouemcombinação com um domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR (P54AR4-83v2, mostradocomo 83v2 naFigura).
[00029] Figura 7. Inibição da fosforilação de c-Met e de EGFR emcélulaspré-tratadas com moléculasmonoespecíficasoubiespecíficas que contêmdomínios de FN3. Em linhagenscelulares que expressamteores altos de EGFR, H292(A) e H596(B), as moléculas monoespecíficasoubiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti- EGFR sãoigualmentepotentes para decrescer a fosforilação de EGFR. Em linhagenscelulares que expressamteoresbaixos de EGFR emrelação a c-Met, H441(C), as moléculasbiespecíficas anti- EGFR/c-Met aprimoram a potência para a inibição de fosforilação EGFR emcomparação com o domíniomonoespecífico de FN3 de ligaçãoao EGFR sozinho. Em linhagenscelulares com teoresbaixos de c-Met, emrelação a EGFR, H292 (D) e H596 (E), a inibição de fosforilação de c-Met é significativamentepotencializada com moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met, emcomparação com somente o domíniomonoespecífico de FN3 de ligação a c-Met. As moléculasusadas no estudoforam: ECB5 biespecífica (mostradacomo 17-A3 naFigura), domíniomonoespecífico de FN3 de ligaçãoao EGFR, P53A1R5-17 (mostradocomo "17" naFigura), moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met, ECB3 (mostradacomo 83-H9 naFigura), e domíniomonoespecífico de FN3 de ligação a c-Met, P114AR7P93-H9 (mostradocomo H9 naFigura).
[00030] Figura 8. É mostrada a sinalizaçãofarmacodinâmicaemtumoresisolados de camundongos com moléculasbiespecíficas anti- EGFR/c-Met durante 6 h ou 72 h. Todas as moléculasreduziramsignificativamente a fosforilação de c-Met, EGFR e ERK durante tanto 6 h quanto 72 h, o grau de inibiçãofoidependente da afinidade dos domínios de FN3 por EGFR e/oupor c-Met. Moléculasbiespecíficasforamgeradas pela junção do domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com umaafinidadealta (83 é p54AR4-83v2) oumédia ("17v2" naFigura é P53A1R5-17v2) por um domínio de FN3 de ligação a c-Met com afinidadealta ("A3" naFigura é P114AR7P94-A3) oumédia ("A5" naFigura é P114AR5P74-A5).
[00031] Figura 9: Acumulaçõesem plasma (figura de cima) e em tumor (figura de baixo) de moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met de afinidadesvariáveisligadas a um domínio de ligação a albumina (ABD) sãomostradas 6 h (esquerda) e 72 h (direita) apósdosagem IP. Seis horas após a dosagem, a acumulaçãoem tumor é máximaemcamundongosdosados com umamoléculabiespecíficahospedando um domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR de afinidademédia (17v2) e um domínio de ligação a c-Met de afinidadealta (83v2). As moléculasbiespecíficasincorporaramdomínios de FN3 de ligação a c-Met ou EGFR de afinidadealtaoumédiacomo segue: 83v2-A5-ABD (ECB18; alta/média para EGFR/cMet) 83v2-A3-ABD (ECB38; alta/alta) 17v2-A5 (ECB28; média/média) 17v2-A3-ABD (ECB39; média/alta). 83v2 se refere a p54AR4-83v2; 17v2 se refere a p53A1R5-17v2; A3 se refere a p114AR7P94-A3; A5 se refere a p114AR5P74-A5.
[00032] Figura 10. Xenoenxertos de tumor H292-HGF foram implantadosemcamundongosbeges SCID. Quando ostumoresalcançaram um volume médio de aproximadamente 80 mm3, oscamundongosforamdosadostrêsvezesporsemana com moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met (25 mg/kg) ou com veículo PBS. Todas as moléculasbiespecíficasreduziram o crescimento de tumor, a inibição de crescimento de tumor (TGI) sendodependente das afinidades das moléculaspor c-Met e EGFR. (alta EGFR-altacMet se refere a p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3 (ECB38); (alta EGFR-médiacMet se refere a p54AR4-83v2-p114AR5P74-A5(ECB18); (média EGFR-altacMet se refere a p53A1R5-17v2-p114AR7P94-A3 (ECB39); (média EGFR-médiacMet se refere a p53A1R5-17-p114AR5P74-A 5 (ECB28));
[00033] Figura 11. Osxenoenxertos de tumor H292-HGF foramimplantadosemcamundongosbeges SCID e elesforamtratados com terapiasdiferentes. A atividade antitumoral das terapias é mostrada. (moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met se refere a p54AR4-83v2- p114AR7P94-A3-ABD (ECB38); as outrasterapiassãocrizotinib, erlotinib, cetuximab, e a combinação de crizotinib e erlotinib).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00034] O termo "domínio de fibronectinatipo III (FN3)" (domínio de FN3), conformeusado no presentedocumento, se refere a um domínio que ocorrefrequentementeemproteínas, incluindofibronectinas, tenascina, proteínascitoesqueletaisintracelulares, receptores de citoquinas e enzimasprocarióticas (Bork e Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665,1990). Domínios de FN3 exemplificadoressãoos 15 domínios de FN3 diferentespresentesemtenascina C humana, os 15 domínios de FN3 diferentespresentesfibronectina (N) humana (FN), e osdomínios de FN3 sintéticosnãonaturaisconformedescritosnapublicação de patente U.S. n° 2010/0216708. Osdomínios de FN3 individuaissãoreferidospelonúmero do domínio e nome da proteína, porexemplo, o 3° domínio de FN3 de tenascina (TN3), ou o 10° domínio de FN3 de fibronectina (FN10).
[00035] O termo "substituir" ou "substituído" ou "mutar/mutagenizar" ou "mutado/mutagenizado", conformeusado no presentedocumento, se refere a alterar, deletarouinserir um oumaisaminoácidosounucleotídeosemumasequência de polipeptídeosou de polinucleotídeos para gerarumavariantedaquelasequência.
[00036] O termo "randomizar" ou "randomizado" ou "diversificado" ou "diversificar", conformeusado no presentedocumento, se refere a fazerpelomenosumasubstituição, inserçãooudeleçãoemumasequência de polinucleotídeosou de polipeptídeos.
[00037] "Variante", conformeusado no presentedocumento, se refere a um polipeptídeoou um polinucleotídeo que difere de um polipeptídeo de referênciaou de um polinucleotídeo de referênciaporumaoumaismodificações, porexemplo, substituições, inserçõesoudeleções.
[00038] O termo " se ligaespecificamente " ou "ligaçãoespecífica" conformeusado no presentedocumento se refere à capacidade do domínio de FN3 da invenção para se ligar a um antígenopredeterminado com umaconstante de dissociação (KD) de 1x10-6 M oumenor, porexemplo 1x10-7 M oumenor, 1x10-8 M oumenor, 1x10-9 M oumenor, 1x10-10 M oumenor, 1x10-11 M oumenor, 1x10-12 M oumenor, ou 1x10-13 M oumenor. Tipicamente o domínio de FN3 da invençãoliga-se a um antígenopredeterminado (isto é, EGFR ou c- Met) com uma KD que é pelomenosdezvezesmenor que sua KD para um antígenonãoespecífico (porexemplo BSA oucaseína) conformemedidaporressonância de plasmon de superfície com o uso de porexemplo um InstrumentoProteon (BioRad). Dessa forma, uma moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invençãoliga-se especificamente a cada um de EGFR e c-Met com umaafinidade de ligação (KD) de pelomenos 1x10-6 M oumenor tanto para EGFR quanto para c-Met. O domínio de FN3 isolado da invenção que especificamente se liga a um antígenopredeterminadopode, entretanto, terreatividadecruzada com outros antígenosrelacionados, porexemplo com o antígenopredeterminadoigual de outrasespécies (homólogos).
[00039] O termo "biblioteca" se refere a umacoleção de variantes. A bibliotecapode ser compostaporvariantes de polipeptídeoou de polinucleotídeo.
[00040] O termo "estabilidade", conformeusado no presentedocumento, se refere à capacidade de umamolécula para manter um estadodobrado sob condiçõesfisiológicas, de tal modo que elaretémpelomenosuma de suasatividadesfuncionaisnormais, porexemplo, ligação a um antígeno-alvopredeterminadocomo EGFR ou c-Met.
[00041] "Receptor de fator de crescimentoepidérmico" ou "EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)" conformeusado no presentedocumento se refere a um EGFR humano (tambémconhecidocomo HER-1 ou Erb-B1 (Ullrich et al., Nature 309:418-425, 1984) que tem a sequênciamostradaem SEQ ID NO: 73 e no GenBank o número de acesso NP_005219, e também as suasvariantes que ocorremnanatureza. Tais variantesincluem o EGFRvIIIbemconhecido e outrasvariantesalternativamenteemendadas (porexemplo, conformeidentificadaspelosnúmeros de acessoemSwissProt de P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4), as variantes GLN-98, ARG-266, Lys- 521, ILE-674, GLY-962, e PRO-988 (Livingston et al., NIEHS-SNPs, environmental genome project, NIEHS ES15478).
[00042] "Ligante de EGFR" conformeusado no presentedocumentoincluitodososligantes (porexemplo, fisiológicos) para EGFR, que incluem EGF, TGF-a, EGF ligante de heparina (HB-EGF), anfirregulina (AR), e epirregulina (EPI).
[00043] "Fator de crescimentoepidérmico" (EGF, "Epidermal Growth Fator") conformeusado no presentedocumento se refereaobemconhecido EGF humano de 53 aminoácidos que temumasequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NO: 74.
[00044] "Receptor de fator de crescimento de hepatócito" ou "c-Met" conformeusado no presentedocumento se refere a c-Met humano que tem a sequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NO: 101 ou no GenBank o número de acesso: NP_001120972 e suasvariantesnaturais.
[00045] "Fator de crescimento de hepatócito" (HGF, "Hepatocyte Growth Factor") conformeusado no presentedocumento se refereaobemconhecido HGF humano que temumasequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NO: 102 que é clivado para formar um dímero de umacadeia alfa e umacadeia beta ligadasporumaligação de dissulfeto.
[00046] "Bloqueia a ligação" ou "inibe a ligação", conformeusado no presentedocumento se refere, de modo intercambiável, à capacidade dos domínios de FN3 da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met para bloquearouinibir a ligação do ligante de EGFR talcomo EGF ao EGFR e/ou HGF a c-Met, e inclui o boqueio/a inibição tanto parcialquantocompleto (completa). O bloqueio/a inibição de ligante de EGFR talcomo EGF ao EGFR e/ou HGF a c-Met pelodomínio de FN3 ou pela moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invençãoreduzparcialoucompletamente o nível normal de sinalização de EGFR e/ou de sinalização de c-Met quandocomparado com o ligante de EGFR que se ligaao EGFR e/ou o HGF que se liga a c-Met sembloqueioouinibição. O domínio de FN3 ou a moléculabiespecífica que contém domínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invenção "bloqueia a ligação" do ligante de EGFR talcomo EGF ao EGFR e/ou HGF a c-Met quando a inibição é pelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. A inibição de ligaçãopode ser medida com o uso de métodosbemconhecidos, porexemplo pela medição de inibição de ligação de EGF biotiniladosobrecélulas A431 que expressam EGFR expostasaodomínio de FN3 ou à moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invenção com o uso de FACS, e com a utilização de métodosdescritos no presentedocumento, ou pela medição de inibição de ligação de HGF biotiniladosobredomínioextracelular de c-Met com o uso de métodosbemconhecidos e de métodosdescritos no presentedocumento.
[00047] O termo "sinalização de EGFR" se refere à transdução de sinaisinduzidapeloligante de EGFR que se ligaao EGFR resultandonaautofosforilação de pelomenos um resíduo de tirosina no EGFR. Um ligante de EGFR exemplificador é EGF.
[00048] "Neutraliza a sinalização de EGFR" conformeusado no presentedocumento se refere à capacidade do domínio de FN3 da invenção para inibir a sinalização de EGFR induzidapeloligante de EGFR talcomo EGF empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00049] O termo "sinalização de c-Met" se refere à transdução de sinaisinduzidapeloligante de HGF que se liga a c-Met resultandonaautofosforilação de pelomenos um resíduo de tirosina no c-Met. Tipicamentepelomenos um resíduo de tirosinaemposições 1230, 1234 ou 1235 é autofosforilado sob ligação de HGF.
[00050] "Neutraliza a sinalização de c-Met" conformeusado no presentedocumento se refere à capacidade do domínio de FN3 da invenção para inibir a sinalização de c-Met induzidapor HGF empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[00051] "Superexpressa", "superexpressado", "superexpressão" e "superexpressar" conformeusados no presentedocumentoreferem- se, de modo intercambiável, a umacélulamalignaou de câncer que temteores, mensuravelmentemais altos, de EGFR e/ou de c-Met, sobre a superfície, emcomparação com umacélula normal do igualtipo de tecido. Tal superexpressãopode ser causadaporamplificação de gene ouportranscriçãooutraduçãoaumentada. Expressão e superexpressão de EGFR e/ou de c-Met pode ser medida com o uso de ensaiosbemconhecidos com a utilizaçãoporexemplo de ELISA, imunofluorescência, citometria de fluxoouradioimunoensaioemcélulasvivasoulisadas. Alternativa, ouadicionalmente, osteores de moléculas de ácidonucleico que codificam EGFR e/ou c-Met podem ser medidosnacélulaporexemplo com o uso de hibridizaçãofluorescente in situ, transferência de Southern ("Southern blotting"), outécnicas de PCR. EGFR e/ou c-Met é superexpressadoquando o teor de EGFR e/ou de c-Met sobre a superfície da célula é pelomenos 1,5 vezesmais alto quandocomparado com a célula normal.
[00052] "Tencon" conformeusado no presentedocumento se refereaodomínio de fibronectinatipo III (FN3) sintético que tem a sequênciamostradaem SEQ ID NO: 1 e descritonapublicação de patente US n° US2010/0216708.
[00053] Uma "célula de câncer" ouuma "célula de tumor" conformeusada no presentedocumento se refere a umacélulacancerosa, pré- cancerosaoutransformada, porqualquer um dos modos in vivo, ex vivo, e emcultura de tecido, que temalteraçõesfenotípicasinduzidasouespontâneas que necessariamentenãoenvolvem a absorção de material genético novo. Embora a transformaçãopossaprovir de infecção com um vírustransformante e incorporação de novo ácidonucleicogenômico, ouabsorção de ácidonucleicoexógeno, elatambémpodeocorrerespontaneamenteouapósexposição a um carcinógeno,mutandoassimumgeneendógeno. Transformação/câncer é exemplificada (exemplificado), porexemplo, poralteraçõesmorfológicas, imortalização de células, controle de crescimentoaberrante, formação de focos, proliferação, malignidade, teores de marcadoresespecíficos para tumores, invasividade, supressãooucrescimento de tumor emhospedeirosanimaisadequadoscomocamundongos nus, e semelhantes, in vitro, in vivo, e ex vivo (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" (3a ed. 1994)).
[00054] O termo "vetor" significa um polinucleotídeocapaz de ser duplicadodentro de um sistemabiológicoou que pode ser movido entre tais sistemas. Polinucleotídeosvetorescontêmtipicamenteelementos, como as origens de replicação, sinais de poliadenilaçãooumarcadores de seleção que funcionam para facilitar a duplicaçãooumanutençãodessespolinucleotídeosem um sistemabiológico. Exemplosdessessistemasbiológicospodemincluirumacélula, vírus, animal, planta, e sistemasbiológicosreconstituídos que utilizamcomponentesbiológicoscapazes de duplicar um vetor. O polinucleotídeo que compreende um vetorpode ser moléculas de DNA ou RNA ou um híbrido das mesmas.
[00055] O termo "vetor de expressão" significa um vetor que pode ser utilizadoem um sistemabiológicoouem um sistemabiológicoreconstituído para direcionar a translação de um polipeptídeocodificadoporumasequência de polinucleotídeospresente no vetor de expressão.
[00056] O termo "polinucleotídeo" significaumamolécula que compreendeumacadeia de nucleotídeosligadoscovalentementeporumacadeia principal de açúcar-fosfatoououtraligaçãoquímicacovalenteequivalente. DNAs e RNAs de dupla-hélice e única-hélicesãoexemplostípicos de polinucleotídeos.
[00057] O termo "polipeptídeo" ou "proteína" significaumamolécula que compreendepelomenosdoisresíduos de aminoácidosligadosporumaligaçãopeptídica para formar um polipeptídeo. Polipeptídeospequenos com menos de cerca de 50 aminoácidospodem ser chamados de "peptídeos".
[00058] O termo "moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met" ou "moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met" conformeusado no presentedocumento se refere a umamolécula que compreende um domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR e um domínio de FN3 de ligação a c-Met diferente que estãocovalentementeligadosjuntosquerdiretamentequer via um conector ("linker"). Uma moléculabiespecífica de ligação a EGFR/c-Met exemplificadoracompreende um primeirodomínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR e um segundodomínio de FN3 que especificamente se liga a c-Met.
[00059] "Valente (que temvalência(s))" conformeusado no presentedocumento se refere a um númeroespecífico de sítios de ligação para um antígenoemumamolécula. Como tais, ostermos "monovalente", "bivalente", "tetravalente", e "hexavalente" referem-se à presença de um, dois, quatro e seis sítios de ligação, respectivamente, específicos para um antígenoemumamolécula.
[00060] "Mistura" conformeusada no presentedocumento se refere a umaamostraoupreparação de doisoumaisdomínios de FN3 nãocovalentementeligadosjuntos. Uma misturapodeconsistiremdoisoumaisdomínios de FN3 idênticosoudomínios de FN3 diferentes. Composições de matéria
[00061] A presenteinvençãofornecemoléculasmonoespecíficas e biespecíficas que contêmdomínios de FN3 de ligação a c-Met e/ouao EGFR modificadas com cisteína e métodos de produzi-las e usá-las. Moléculasmonoespecíficas de ligaçãoao EGFR
[00062] A presenteinvençãofornecedomínios de fibronectinatipo III (FN3) que especificamente se ligamao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueiam a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR, e dessa forma podem ser amplamenteusadosemaplicaçõesterapêuticas e diagnósticas. A presenteinvençãofornecepolinucleotídeos que codificamosdomínios de FN3 da invençãoouácidosnucleicoscomplementares dos mesmos, vetores, célulashospedeiras e métodos de produzir e usar osmesmos (as mesmas).
[00063] Osdomínios de FN3 da invençãoligam-se ao EGFR com afinidadealta e inibem a sinalização de EGFR, e podemfornecer um benefícioemtermos de especificidade e toxicidadeinacuradareduzidaquandocomparados com inibidoresmolecularespequenos de EGFR, e penetraçãoemtecidoaprimoradaquandocomparados com osagentesterapêuticos à base de anticorposconvencionais.
[00064] Uma modalidade da invenção é um domínio de fibronectinatipo III (FN3) isolado que especificamente se ligaao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR.
[00065] Osdomínios de FN3 da invençãopodembloquear a ligação de EGF ao EGFR com um valor de IC50 menor que cerca de 1x10-7 M, menor que cerca de 1x10-8 M, menor que cerca de 1x10-9 M, menor que cerca de 1x10-10 M, menor que cerca de 1x10-11 M, oumenor que cerca de 1x10-12 M em um ensaio de competição que utilizacélulas A431 e detecta a quantidade de fluorescência de EGF biotiniladoligado com o uso de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina a 600 nMsobrecélulas A431 incubadas com ousemosdomínios de FN3 da invenção. Osdomínios de FN3 exemplificadorespodembloquear a ligação de EGF ao EGFR com um valor de IC50 entre cerca de 1x10-9 M e cerca de 1x10-7 M, tais comoosdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR que têm a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 18-29, 107-110, ou 122-137. Osdomínios de FN3 da invençãopodembloquear a ligação de EGF ao EGFR empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% quandocomparados com a ligação de EGF ao EGFR naausência dos domínios de FN3 da invenção com o uso de condições de ensaioiguais.
[00066] O domínio de FN3 da invençãopodeinibir a sinalização de EGFR empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% quandocomparada com o nível de sinalizaçãonaausência dos domínios de FN3 da invenção com o uso de condições de ensaioiguais.
[00067] A ligação de um ligantetalcomo EGF ao EGFR estimula a dimerização de receptor, a autofosforilação de receptor, a ativação do domínio de tirosina-quinasecitoplasmático, interno do receptor, e a iniciação de múltiplas vias de transativação e transdução de sinaisenvolvidasnasregulação da síntese de DNA (ativação de gene) e divisãoouprogressão de ciclocelular. A inibição de sinalização de EGFR poderesultareminibição de umaoumais vias de sinalização a jusante de EGFR e porconseguinte a neutralização de EGFR podeterváriosefeitos, que incluem a inibição de proliferação e diferenciaçãocelulares, angiogênese, metástase e motilidadecelulares.
[00068] A sinalização de EGFR pode ser medida com o uso de váriosmétodosbemconhecidos, porexemplo a medição da autofosforilação do receptor emqualqueruma das tirosinas Y1068, Y1148, e Y1173 (Downward et al., Nature 311:483-5, 1984) e/ou a fosforilação de substratosnaturaisousintéticos. A fosforilaçãopode ser detectada com o uso de métodosbemconhecidoscomo um ensaio ELISA ouumatransferência de Western ("western blot") com a utilização de um anticorpoespecífico para fosfotirosina. Ensaiosexemplificadorespodem ser encontradosem Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44,1997 e Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998.
[00069] Em umamodalidade, o domínio de FN3 da invençãoinibe a fosforilação de EGFR induzidapor EGF naposição de resíduo de Tirosina 1173 de EGFR com um valor de IC50 menor que cerca de 2,5x10-6 M, porexemplomenor que cerca de 1x10-6 M, menor que cerca de 1x10-7 M, menor que cerca de 1x10-8 M, menor que cerca de 1x10-9 M, menor que cerca de 1x10-10 M, menor que cerca de 1x10-11 M, oumenor que cerca de 1x10-12 M quandomedidaemcélulas A431 com a utilização de EGF humano a 50 ng/mL.
[00070] Em umamodalidade, o domínio de FN3 da invençãoinibe a fosforilação de EGFR induzidapor EGF naposição de resíduo de Tirosina 1173 de EGFR com um valor de IC50 entre cerca de 1,8 x 10-8 M e cerca de 2,5 x 10-6 M quandomedidaemcélulas A431 com a utilização de EGF humano a 50 ng/mL. Tais domínios de FN3 exemplificadoressãoaqueles que têm a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 18 a 29, 107 a 110, ou 122 a 137.
[00071] Em umamodalidade, o domínio de FN3 da invençãoliga-se ao EGFR humano com umaconstante de dissociação (KD) menor que cerca de 1x10-8 M, porexemplomenor que cerca de 1x10-9 M, menor que cerca de 1x10-10 M, menor que cerca de 1x10-11 M, menor que cerca de 1x10-12 M, oumenor que cerca de 1x10-13 M conformedeterminadaporressonância de plasmon de superfícieoupelométodo de Kinexa, conformepraticadoporaquelaspessoasversadasnatécnica. Em algumasmodalidades, o domínio de FN3 da invençãoliga se ao EGFR humano com uma KD entre cerca de 2x10-10 e cerca de 1x10-8 M. A afinidade de um domínio de FN3 por EGFR pode ser determinadaexperimentalmente com o uso de qualquermétodoadequado. (Consulte, porexemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, EUA (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, EUA (1992); e métodosaquidescritos). A afinidademedida de umainteraçãoespecífica de antígeno - domínio de FN3 podevariar se for medida sob diferentescondições (porexemplo, osmolaridade, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e de outros parâmetros de ligaçãoaoantígeno (porexemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluçõespadronizadas de arcabouço de proteína e antígeno, e com um agentetamponantepadronizado, como o agentetamponentedescrito no presentedocumento.
[00072] Domínios de FN3 exemplificadores da invenção que se ligamao EGFR incluemdomínios de FN3 das SEQ ID NOs: 18 a 29, 107 a 110, ou 122 a 137.
[00073] Em umamodalidade, o domínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR compreendeumasequência de aminoácidospelomenos 87% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
[00074] Em umamodalidade, o domínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR compreende
[00075] umaalça FG que compreende a sequência HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO:179) ou a sequência LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), em que X9 é M ou I; e
[00076] umaalça BC que compreende a sequência X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181); em que X1 é A, T, G ou D; X2 é A, D, Y ou W; X3 é P, D ou N; X4 é L ouestáausente; X5 é D, H, R, G, Y ou W; X6 é G, D ou A; X7 é A, F, G, H ou D; e X8 é Y, F ou L.
[00077] Osdomínios de FN3 da invenção que especificamente se ligamao EGFR e inibem a autofosforilação de EGFR podemcompreendercomoumacaracterísticaestruturalumaalça FG que compreende a sequência HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) ou a sequência LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), em que X9 é M ou I. Tais domínios de FN3 podemcompreenderadicionalmenteumaalça BC de comprimento de 8 ou 9 aminoácidos e definida pela sequência X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181), e inibir a autofosforilação de EGFR com um valor de IC50 menor que cerca de 2,5x10-6 M, e com um valor de IC50 entre cerca de 1,8x10-8 M e cerca de 2,5x10-6 M quandomedidoemcélulas A431 com a utilização de EGF humano a 50 ng/mL.
[00078] Osdomínios de FN3 da invenção que especificamente se ligamao EGFR e inibem a autofosforilação de EGFR compreendemadicionalmente a sequência de LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVG EAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), ou a sequência LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVG EAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), em que X1 é A, T, G ou D; X2 é A, D, Y ou W; X3 é P, D ou N; X4 é L ouestáausente; X5 é D, H, R, G, Y ou W; X6 é G, D ou A; X7 é A, F, G, H ou D; X8 é Y, F ou L; e X9 é M ou I.
[00079] Osdomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR podem ser gerados e testados para a suacapacidade para inibir a autofosforilação de EGFR com o uso de métodosbemconhecidos e métodosdescritos no presentedocumento.
[00080] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de FN3 isolado que especificamente se ligaao EGFR, em que odomínio de FN3 compreende a sequênciamostradaem SEQ ID NOs: 18 a 29, 107 a 110, ou 122 a 137.
[00081] Em algumasmodalidades, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR compreendem um iniciadormetionina (Met) ligado à terminação-N ouumacisteína (Cys) ligada a umaterminação-C de um domínio de FN3 específico, porexemplo para facilitar a expressão e/ou a conjugação de moléculas que prolongam a meia-vida.
[00082] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de fibronectinatipo III (FN3) isolado que especificamente se ligaao EGFR e bloqueia a ligação de EGF ao EGFR, em que odomínio de FN3 é isolado de umabibliotecaplanejada ("designed") com base nasequênciaTencon da SEQ ID NO: 1.
Moléculasmonoespecíficas de ligação a c-Met
[00083] A presenteinvençãofornecedomínios de fibronectinatipo III (FN3) que especificamente se ligamao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met) e bloqueiam a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met, e dessa forma podem ser amplamenteusadasemaplicaçõesterapêuticas e diagnósticas. A presenteinvençãofornecepolinucleotídeos que codificamosdomínios de FN3 da invençãoouácidosnucleicoscomplementares dos mesmos, vetores, célulashospedeiras e métodos de produzir e usar osmesmos (as mesmas).
[00084] Osdomínios de FN3 da invençãoligam-se a c-Met com afinidadealta e inibem a sinalização de c-Met, e podemfornecer um benefícioemtermos de especificidade e toxicidadeinacuradareduzidaquandocomparados com inibidoresmolecularespequenos de c-Met, e penetraçãoemtecidoaprimoradaquandocomparados com osagentesterapêuticos à base de anticorposconvencionais. Osdomínios de FN3 da invençãosãomonovalentes, porconseguinteprevinem o agrupamento e a ativação de receptores que podemocorrer com outrasmoléculasbivalentes.
[00085] Uma modalidade da invenção é um domínio de fibronectinatipo III (FN3) isolado que especificamente se ligaao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met) e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met.
[00086] Osdomínios de FN3 da invençãopodembloquear a ligação de HGF a c-Met com um valor de IC50 menor que cerca de 1x10-7 M, menor que cerca de 1x10-8 M, menor que cerca de 1x10-9 M, menor que cerca de 1x10-10 M, menor que cerca de 1x10-11 M, oumenor que cerca de 1x10-12 M em um ensaio que detecta a inibição de ligação de HGF biotinilado à proteína de fusão c-Met-Fc napresença dos domínios de FN3 da invenção. Domínios de FN3 exemplificadorespodembloquear a ligação de HGF a c-Met com um valor de IC50 entre cerca de 2x10-10 M e cerca de 6x10-8. Osdomínios de FN3 da invençãopodembloquear a ligação de HGF a c-Met empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% quandocomparados com a ligação de HGF a c-Met naausência dos domínios de FN3 da invenção com o uso de condições de ensaioiguais.
[00087] O domínio de FN3 da invençãopodeinibir a sinalização de c-Met empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% quandocomparada com o nível de sinalizaçãonaausência dos domínios de FN3 da invenção com o uso de condições de ensaioiguais.
[00088] A ligação de HGF a c-Met estimula a dimerização de receptor, a autofosforilação de receptor, a ativação do domínio de tirosina-quinasecitoplasmático, interno do receptor, e a iniciação de múltiplas vias de transativação e transdução de sinaisenvolvidasnasregulação da síntese de DNA (ativação de gene) e divisãoouprogressão de ciclocelular. A inibição de sinalização de c-Met poderesultareminibição de umaoumais vias de sinalização a jusante de c- Met e porconseguinte a neutralização de c-Met podeterváriosefeitos, que incluem a inibição de proliferação e diferenciaçãocelulares, angiogênese, metástase e motilidadecelulares.
[00089] A sinalização de c-Met pode ser medida com o uso de váriosmétodosbemconhecidos, porexemplo a medição da autofosforilação do receptor empelomenos um dentreosresíduos de tirosina Y1230, Y1234 ou I1235 e/ou a fosforilação de substratosnaturaisousintéticos. A fosforilaçãopode ser detectada, porexemplo, com o uso de um anticorpoespecífico para fosfotirosinaem um ensaio ELISA ouemumatransferência de Western ("western blot"). Algunsensaios para a atividade de tirosina-quinase (Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997; Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998).
[00090] Em umamodalidade, o domínio de FN3 da invençãoinibe a fosforilação de c-Met induzidapor HGF naposição de resíduo 1349 de c-Met com um valor de IC50 menor que cerca de 1x10-6 M, menor que cerca de 1x10-7 M, menor que cerca de 1x10-8 M, menor que cerca de 1x10-9 M, menor que cerca de 1x10-10 M, menor que cerca de 1x10-11 M, oumenor que cerca de 1x10-12 M quandomedidaemcélulas NCI- H441 com a utilização de HGF recombinantehumano a 100 ng/mL.
[00091] Em umamodalidade, o domínio de FN3 da invençãoinibe a fosforilação de c-Met induzidapor HGF natirosina Y1349 de c-Met com um valor de IC50 entre cerca de 4x10-9 M e cerca de 1x10-6 M quandomedidaemcélulas NCI-H441 com a utilização de HGF recombinantehumano a 100 ng/mL.
[00092] Em umamodalidade, o domínio de FN3 da invençãoliga-se a c-Met humano com umaconstante de dissociação (KD) de igual a oumenor que cerca de 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 1x10-14 M, ou 1x10-15 M conformedeterminadaporressonância de plasmon de superfícieoupelométodo de Kinexa, conformepraticadoporaquelaspessoasversadasnatécnica. Em algumasmodalidades, o domínio de FN3 da invençãoligase a c-Met humano com uma KD entre cerca de 3x10-10 e cerca de 5x10-8 M. A afinidade de um domínio de FN3 por c-Met pode ser determinadaexperimentalmente com o uso de qualquermétodoadequado. (Consulte, porexemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, EUA (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, EUA (1992); e métodosaquidescritos). A afinidademedida de umainteraçãoespecífica de antígeno - domínio de FN3 podevariar se for medida sob diferentescondições (porexemplo, osmolaridade, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e de outros parâmetros de ligaçãoaoantígeno (porexemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluçõespadronizadas de arcabouço de proteína e antígeno, e com um agentetamponantepadronizado, como o agentetamponentedescrito no presentedocumento.
[00093] Domínios de FN3 exemplificadores da invenção que se ligam a c-Met incluemdomínios de FN3 das SEQ ID NO: 32-49 ou 111-114.
[00094] Em umamodalidade, o domínio de FN3 que especificamente se liga a c-Met compreendeumasequência de aminoácidospelomenos 83% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.
[00095] Em umamodalidade, o domínio de FN3 que especificamente se liga a c-Met compreende
[00096] umafita C e umaalça CD compreendendo a sequência DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), em que X10 é W, F ou V; X11 é D, F ou L; X12 é V, F ou L; X13 é V, L ou T; X14 é V, R, G, L, T ou S; X15 é G, S, A, T ou K; e X16 é E ou D; e
[00097] umafita F e umaalça FG compreendendo a sequência TEYX17VX18IX19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), em que X17 é Y, W, I, V, G ou A; X18 é N, T, Q ou G; X19 é L, M, N ou I; X20 é G ou S; X21 é S, L, G, Y, T, R, H ou K; X22 é I, V ou L; e X23 é V, T, H, I, P, Y, T ou L.
[00098] Osdomínios de FN3 da invenção que especificamente se ligam a c-Met e inibem a autofosforilação de c-Met compreendemadicionalmente a sequência: LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PL SAEFTT (SEQ ID NO: 186), em que X10 é W, F ou V; e X11 é D, F ou L; X12 é V, F ou L; X13 é V, L ou T; X14 é V, R, G, L, T ou S; X15 é G, S, A, T ou K; X16 é E ou D; X17 é Y, W, I, V, G ou A; X18 é N, T, Q ou G; X19 é L, M, N ou I; X20 é G ou S; X21 é S, L, G, Y, T, R, H ou K; X22 é I, V ou L; e X23 é V, T, H, I, P, Y, T ou L.
[00099] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de FN3 isolado que especificamente se liga a c-Met, em que odomínio de FN3 compreende a sequênciamostradaem SEQ ID NOs: 32-49 ou 111114.
[000100] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de fibronectinatipo III (FN3) isolado que especificamente se liga a c-Met e bloqueia a ligação de HGF a c-Met, em que odomínio de FN3 é isolado de umabibliotecaplanejada ("designed") com base nasequênciaTencon da SEQ ID NO: 1.
Isolamento de domínios de FN3 que se ligam a EGFR ou c-Met a partir de umabiblioteca com base nasequênciaTencon
[000101] Tencon (SEQ ID NO: 1) é um domínio de fibronectinatipo III (FN3) de ocorrêncianão natural planejado ("designed") a partir de umasequênciaconsenso de quinze domínios de FN3 da tenascina-C humana (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117,2012; publicação de patenteUS n° 2010/0216708). A estruturacristalina de Tenconmostra seis alçasexpostasnasuperfície que conectamsetefitas-beta como é característico dos domínios de FN3, as fitas-betas sãochamadas de A, B, C, D, E, F, e G, e as alçassãochamadas de alças AB, BC, CD, DE, EF, e FG (Bork e Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992,1992; patente US n° 6.673.901). Estasalças, ouosresíduosselecionadosdentro de cadaalça, podem ser randomizadas (randomizados) com a finalidade de construirbibliotecas de domínios de fibronectinatipo III (FN3) que podem ser usados para selecionarnovasmoléculas que se ligamao EGFR. A Tabela 1 mostra as posições e as sequências de cadaalça e fita-beta emTencon (SEQ ID NO: 1).
[000102] Bibliotecaplanejada ("designed") com base nasequênciaTenconpode, dessa forma, teralça FG randomizada, oualças BC e FG randomizadas, tais como as bibliotecas TCL1 ou TCL2 conformedescritasabaixo. A alçaTencon BC é de comprimento de 7 aminoácidos, dessa forma 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidospodem ser randomizadosnabibliotecadiversificadanaalça BC e planejada ("designed") com base nasequênciaTencon. A alçaTencon FG é de comprimento de 7 aminoácidos, dessa forma 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidospodem ser randomizadosnabibliotecadiversificadanaalça FG e planejada ("designed") com base nasequênciaTencon. A diversidadeadi-cionalnasalçasnasbibliotecasTenconpode ser realizadaporinserção e/oudeleções de resíduosemalças. Por exemplo, as alças FG e/ou CD podem ser estendidaspor 1 a 22 aminoácidos, oudecrescidasem 1 a 3 aminoácidos. A alça FG emTencon é de comprimento de 7 aminoácidos, enquanto que a alçacorrespondenteemcadeiaspesadas de anticorpoestánafaixa de 4 a 28 resíduos. Para fornecerdiversidademáxima, a alça FG pode ser diversificadaemsequência e tambémemcomprimento para corresponderaocomprimento de CDR3 de anticorponafaixa de 4 a 28 resíduos. Por exemplo, a alça FG pode ser adicionalmentediversificadaemcomprimento pela extensão da alçapor 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidosadicionais.
[000103] A bibliotecaplanejada ("designed") com base nasequênciaTencontambémpodetersuperfíciesalternativasrandomizadas que se formamem um lado do domínio de FN3 e compreendem duas oumaisfitas-beta, e pelomenosumaalça. Uma talsuperfíciealternativa é formadaporaminoácidosnafita-beta C e nafita-beta F e naalça CD e naalça FG (umasuperfície C-CD-F-FG). Um planejamento ("design") de biblioteca com base nasuperfíciealternativa C-CD-F-FG de Tencon é mostradonaFigura 4 e a geraçãodetalhada de tais bibliotecas é descritaemdetalhe no pedido de patente US de n° de série 13/852.930.
[000104] A bibliotecaplanejada ("designed") com base nasequênciaTenconincluitambémbibliotecasplanejadas ("designed") com base emvariantes de Tencon, tais como as variantes de Tencon que têmsubstituiçõesnasposições de resíduo 11, 14, 17, 37, 46, 73, ou 86 (a numeração de resíduocorrespondendo à SEQ ID NO: 1), e cujasvariantesaprimoram a estabilidadetérmica. Variantes de Tenconexemplificadorassãodescritasnapublicação de patente US n° 2011/0274623, e incluem Tencon27 (SEQ ID NO: 99) que tem substituições E11R,L17A,N46V, E86I quandocomparada com Tencon da SEQ ID NO: 1. Tabela 1.
[000105] As bibliotecas com base nasequênciaTencon e emoutra sequência de FN3 podem ser randomizadasemposições de resíduoescolhidas com o uso de um conjunto definidoourandômico de aminoácidos. Por exemplo, variantesnabiblioteca que têmsubstituiçõesrandômicaspodem ser geradas com o uso de códons NNK, que codificamtodosos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em outros esquemas de diversificação, códons DVK podem ser usados para codificaraminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cys. Alternativamente, códons NNS podem ser usados para darorigem a todosos 20 resíduos de aminoácidos e simultaneamentereduzir a frequência de códons de terminação. Bibliotecas de domínios de FN3 com distribuição de aminoácidosviciada ("biased") emposições a seremdiversificadaspodem ser sintetizadas, porexemplo, com o uso de tecnologiaSlonomics® (http:_//www_sloning_com). Esta tecnologiausaumabiblioteca de tripletes de fitaduplapré-produzidos que atuamcomoblocos de construçãouniversaissuficientes para milhares de processos de síntese de gene. A biblioteca de tripletesrepresentatodas as combinações de sequênciapossíveisnecessárias para construir qualquermolécula de DNA desejada. As designações de códonestão de acordo com a bemconhecidacodificação da IUB (International Union of Biochemistry).
[000106] Osdomínios de FN3 que especificamente se ligamao EGFR ou a c-Met da invençãopodem ser isolados pela produção da biblioteca de FN3 talcomo a bibliotecaTencon com o uso de "cis display" para ligarfragmentos de DNA que codificamproteínas a um fragmento de DNA que codifica RepA para gerar um acervo de complexos de proteína-DNA formadosapóstradução in vitro em que cadaproteínaestáestavelmenteassociada com o DNA que a codifica (patente US n° 7.842.476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806-2810, 2004), e análise da biblioteca para ligaçãoespecíficaao EGFR e/ou a c-Met porqualquermétodoconhecidonatécnica e descrito no Exemplo. Osmétodosbemconhecidosexemplificadores que podem ser usadossão ELISA, imunoensaiosemsanduíche e ensaioscompetitivos e nãocompetitivos (consulte, porexemplo, Ausubel et al., eds, 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, EUA). Osdomínios de FN3 identificados que especificamente se ligamao EGFR ou a c-Met sãocaracterizadosadicionalmente para a capacidade deles para bloquear o ligante de EGFR talcomo EGF que se ligaao EGFR, ou HGF que se liga a c-Met, e para a capacidade deles para inibir a sinalização de EGFR e/ou de c-Met com o uso dos métodosdescritos no presentedocumento.
[000107] Osdomínios de FN3 que especificamente se ligamao EGFR ou a c-Met da invençãopodem ser gerados com o uso de qualquerdomínio de FN3 como um molde para gerar e selecionar a biblioteca para moléculas que especificamente se ligamao EGFR ou a c-Met com a utilização dos métodosfornecidosnestedocumento. Osdomínios de FN3 exemplificadores que podem ser usadossão o 3° domínio de FN3 de tenascina C (TN3) (SEQ ID NO: 75), Fibcon (SEQ ID NO: 76), e o 10° domínio de FN3 de fibronectina (FN10) (SEQ ID NO: 77). Técnicas de clonagem e expressãopadrãosãousadas para clonar as bibliotecasem um vetorousintetizarcassetes de cDNA de fitadupla da biblioteca, para expressar, ou para traduzir as bibliotecas in vitro. Outros métodospodem ser usados, porexemplo, "ribosome display" (Hanes e Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937 a 4942, 1997), "mRNA display" (Roberts e Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297 a 12302, 1997), ou outros sistemasisentos de célula (patente US n° 5.643.768). As bibliotecas das variantes de domínio de FN3 podem ser expressascomoproteínas de fusãoexpostassobre a superfície, porexemplo, de qualquerbacteriófagoadequado. Métodos para a exposição de polipeptídeos de fusãosobre a superfície de um bacteriófagosãobemconhecidos (publicação de patente US n° 2011/0118144; publicaçãointernacional de patente n° WO2009/085462; Patente US n° 6.969.108; Patente US n° 6.172.197; Patente US n° 5.223.409; Patente US n° 6.582.915; Patente US n° 6.472.147).
[000108] Osdomínios de FN3 que especificamente se ligamao EGFR ou a c-Met da invençãopodem ser modificados para aprimorar as propriedades deles talcomo para aprimorar a estabilidadetérmica e a reversibilidade de dobramento e desdobramentotérmicos. Váriosmétodostêmsidoaplicados para aumentar a estabilidadetérmicaaparente de proteínas e enzimas, incluindoplanejamento ("design") racional com base emcomparação com sequênciastermoestáveisaltamentesimilares, planejamento ("design") de pontes de dissulfetoestabilizantes, mutações para aumentar a propensão da alfa-hélice, manipulação de pontes salinas, alteração da carga superficial da proteína, evoluçãodirigida, e composição de sequênciasconsenso (Lehmann e Wyss, Curr OpinBiotechnol, 12, 371-375, 2001). A alta estabilidadetérmicapodeaumentar o rendimento da proteínaexpressada, aperfeiçoar a solubilidadeouatividade, diminuir a imunogenicidade, e minimizar a necessidade de umacadeiafrianafabricação. Osresíduos que podem ser substituídos para aprimorar a estabilidadetérmica de Tencon (SEQ ID NO: 1) sãoposições de resíduo 11, 14, 17, 37, 46, 73, ou 86, e sãodescritosnapublicação de patente US n° 2011/0274623. As substituições que correspondem a estesresíduospodem ser incorporadasaosdomínios de FN3 ouàsmoléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 da invenção.
[000109] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de FN3 isolado que especificamente se ligaao EGFR e bloqueia a ligação de EGF ao EGFR, que compreende a sequênciamostradaem SEQ ID NOs: 18 a 29, 107 a 110, 122 a 137, que compreendeadicionalmentesubstituiçõesemumaoumaisposições de resíduo que correspondemàsposições 11, 14, 17, 37, 46, 73, e 86 emTencon (SEQ ID NO: 1).
[000110] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de FN3 isolado que especificamente se liga a c-Met e bloqueia a ligação de HGF a c-Met, que compreende a sequênciamostradaem SEQ ID NOs: 32 a 49 ou 111 a 114, que compreendeadicionalmentesubstituiçõesemumaoumaisposições de resíduo que correspondemàsposições 11, 14, 17, 37, 46, 73, e 86 emTencon (SEQ ID NO: 1).
[000111] Substituiçõesexemplificadorassãosubstituições E11N, E14P, L17A, E37P, N46V, G73Y e E86I (numeração de acordo com a SEQ ID NO: 1).
[000112] Em algumasmodalidades, osdomínios de FN3 da invençãocompreendemsubstituições que correspondemàssubstituições L17A, N46V, e E86I emTencon (SEQ ID NO: 1).
[000113] Osdomínios de FN3 que especificamente se ligamao EGFR (Figura 1) têmumaalça FG estendidaquandocomparados com Tencon (SEQ ID NO: 1). Por conseguinte, osresíduos que correspondemaosresíduos 11, 14, 17, 37, 46, 73, e 86 emTencon (SEQ ID NO: 1) sãoosresíduos 11, 14, 17, 37, 46, 73 e 91 nosdomínios de FN3 que se ligamao EGFR mostradosnasFiguras 1A e 1B exceto o domínio de FN3 da SEQ ID NO: 24, em que osresíduoscorrespondentessãoosresíduos 11, 14, 17, 38, 74, e 92 devido a umainserção de um aminoácidonaalça BC.
[000114] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR e bloqueia a ligação de EGF ao EGFR, que compreende a sequênciamostradaem SEQ ID NOs: 18 a 29, 107 a 110, ou 122 a 137, tendo opcionalmentesubstituições que correspondemàssubstituições L17A, N46V, e E86I emTencon (SEQ ID NO: 1).
[000115] Uma outramodalidade da invenção é um domínio de FN3 que especificamente se liga a c-Met e bloqueia a ligação de HGF a c- Met, que compreende a sequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NOs: 32 a 49 ou 111 a 114, tendo opcionalmentesubstituições que correspondemàssubstituições L17A, N46V, e E86I emTencon (SEQ ID NO: 1).
[000116] A medição da estabilidade de proteína e da labilidade de proteínapode ser vista comoosaspectosiguaisoudiferentes da integridade da proteína. As proteínassãosensíveisou "lábeis" à desnaturaçãocausadaporcalor, porradiaçãoultravioletaouionizante, alterações da osmolaridadeambiente e do pH se emsoluçãolíquida, força de cisalhamentomecânicoimpostaporfiltração com tamanhos de porospequenos, radiaçãoultravioleta, radiaçãoionizante, comoirradiaçãogama, desidrataçãoquímicaoutérmicaouqualqueroutraaçãoouforça que possacausar a disrupção da estrutura da proteína. A estabilidade da moléculapode ser determinada com o uso de métodospadrão. Por exemplo, a estabilidade de umamoléculapode ser determinadamediante a medição da temperatura de fusãotérmica ("TM"), a temperaturaem °Celsius (°C) na qual metade das moléculas tornam-se desdobradas, com o uso de métodospadrão. Tipicamente, quantomaisalta a TM, maisestável é a molécula. Em adiçãoaocalor, o ambientequímicotambém altera a capacidade da proteína de manterumaestrutura tridimensional específica.
[000117] Em umamodalidade, osdomínios de FN3 que se ligamao EGFR ou a c-Met da invençãoapresentamestabilidadeaumentadaempelomenos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% oumais, emcomparação com o mesmodomínio antes da modificaçãomedidapeloaumentona TM.
[000118] A desnaturaçãoquímicapode, de modo semelhante, ser medidaporumavariedade de métodos. Desnaturantesquímicosincluemcloridrato de guanidínio, tiocianato de guanidínio, ureia, acetona, solventesorgânicos (DMF, benzeno, acetonitrila), sais (brometo de lítio, sulfato de amônio, cloreto de lítio, brometo de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de sódio); agentesredutores (porexemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenzeno, e hidretos, comoboro-hidreto de sódio), detergentesnãoiônicos e iônicos, ácidos (porexemplo, ácidoclorídrico (HCl), ácidoacético (CH3COOH), ácidosacéticoshalogenados), moléculashidrofóbicas (porexemplo, fosfolipídios), e desnaturantesdirecionados. A quantificação da extensão da desnaturaçãopodedepender da perda de umapropriedadefuncional, como a capacidade de se ligar a umamolécula- alvo, ouporpropriedadesfisioquímicas, como a tendência à agregação, exposição de resíduos de solventesanteriormenteinacessíveis, oudisrupçãoouformação de ligaçõesdissulfeto.
[000119] Em umamodalidade, osdomínios de FN3 da invenção que se ligamao EGFR ou a c-Met apresentamestabilidadeaumentadaempelomenos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% oumais, em comparação com o mesmoarcabouço antes da modificaçãomedida com o uso de cloridrato de guanidíniocomo um desnaturantequímico. A estabilidadeaumentadapode ser medidacomoumafunção de fluorescência de triptofanodecrescidamediante o tratamento com concentraçõescrescentes de cloridrato de guanidina com o uso de métodosbemconhecidos.
[000120] Osdomínios de FN3 da invençãopodem ser geradoscomomonômeros, dímerosoumultímeros, porexemplo, como um meio para aumentar a valência e, dessa forma, a avidez de ligação de molécula- alvo, ou para gerararcabouçosbiespecíficosoumultiespecíficossimultaneamenteligando duas oumaismoléculas-alvodiferentes. Osdímeros e multímerospodem ser geradosporligação de arcabouços de proteínamonoespecíficos, biespecíficosoumultiespecíficos, porexemplo, pela inclusão de um conector ("linker") de aminoácido, porexemplo, um conectorcontendopoliglicina, glicina e serina, oualanina e prolina. Conectores ("linkers") exemplificadoresincluemosconectores (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (AP)10 (SEQ ID NO: 82), (AP)20 (SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO: 84). Osdímeros e multímerospodem ser ligadosunsnos outros emumadireção de N (amino) para C (carboxila). O uso de conectores ("linkers") peptídicos de ocorrência natural e tambémartificiais para conectarpolipeptídeosemnovospolipeptídeos de fusãoligados é bemconhecidonaliteratura (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; patente US n° 5.856.456).
Moléculasbiespecíficas que se ligam a EGFR/c/Met
[000121] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invençãopodemfornecer um benefícioemtermos de especificidade e toxicidadeinacuradareduzidaquandocomparadas com inibidoresmolecularespequenos de EGFR, e penetraçãoemtecidoaprimoradaquandocomparadas com osagentesterapêuticos à base de antibióticoconvencionais. A presenteinvenção é baseada, pelomenosemparte, naconstataçãosurpreendente de que as moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c- Met da invençãofornecem um efeitoinibitóriosinérgicosignificativamenteaprimoradoquandocomparadas com umamistura de domínios de FN3 que se ligamao EGFR e que se ligam a c-Met. As moléculaspodem ser adaptadas para afinidadeespecífica tanto para EGFR quanto para c-Met para maximizar as penetração e retençãoemtumores.
[000122] Uma modalidade da invenção é umamoléculabiespecíficaisolada que contémdomínios de FN3 que compreende um primeirodomínio de fibronectinatipo III (FN3) e um segundodomínio de FN3, em que o primeirodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR, e o segundodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met), e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met.
[000123] As moléculasbiespecíficas que contêm o domínio de FN3 para EGFR/c-Met da invençãopodem ser geradasporligaçãocovalente, diretamenteou via um conector ("linker"), de qualquerdomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR e de qualquerdomínio de FN3 de ligação a c-Met da invenção. Por conseguinte, o primeirodomínio de FN3 da moléculabiespecíficapodetercaracterísticasconformedescritasacima para osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR, e o segundodomínio de FN3 de ligação a c-Met da moléculabiespecíficapodetercaracterísticasconformedescritasacima para osdomínios de FN3 de ligação a c-Met.
[000124] Em umamodalidade, o primeirodomínio de FN3 da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met inibe a fosforilação de EGFR induzidapor EGF no resíduoTirosina 1173 de EGFR com um valor de IC50 menor que cerca de 2,5x10-6 M quandomedidoemcélulas A431 com o uso de EGF humano a 50 ng/mL, e o segundodomínio de FN3 da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met inibe a fosforilação de c- Met induzidapor HGF no resíduo de Tirosina 1349 de c-Met com um valor de IC50 menor que cerca de 1,5x10-6 M quandomedidoemcélulas NCI-H441 com o uso de HGF humano a 100 ng/mL.
[000125] Em umaoutramodalidade, o primeirodomínio de FN3 da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met inibe a fosforilação de EGFR induzidapor EGF no resíduo de Tirosina 1173 de EGFR com um valor de IC50 entre cerca de 1,8 x 10-8 M e cerca de 2,5x10-6 M quandomedidoemcélulas A431 com o uso de EGF humano a 50 ng/mL, e o segundodomínio de FN3 da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met inibe a fosforilação de c-Met induzidapor HGF no resíduo de Tirosina 1349 de c-Met com um valor de IC50 entre cerca de 4x10-9 M e cerca de 1,5x10- 6 M quandomedidoemcélulas NCI-H441 com o uso de HGF humano a 100 ng/mL.
[000126] Em umaoutramodalidade, o primeirodomínio de FN3 da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met liga-se ao EGFR humano com umaconstante de dissociação (KD) menor que cerca de 1x10-8 M, e o segundodomínio de FN3 da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met liga-se a c-Met humano com uma KD menor que cerca de 5 x10-8 M.
[000127] Na moléculabiespecífica que se liga tanto ao EGFR quanto a c-Met, o primeirodomínio de FN3 liga-se ao EGFR humano com uma KD de entre cerca de 2x10-10 e cerca de 1x10-8 M, e o segundo domínio de FN3 liga-se a c-Met humano com uma KD de entre cerca de 3x10-10 e cerca de 5 x10-8 M.
[000128] A afinidade da moléculabiespecífica EGFR/c-Met para EGFR e c-Met pode ser determinadaconformedescritoacima para as moléculasmonoespecíficas.
[000129] O primeirodomínio de FN3 namoléculabiespecífica anti- EGFR/c-Met da invençãopodebloquear a ligação de EGF ao EGFR com um valor de IC50 de entre cerca de 1x10-9 M e cerca de 1,5x10-7 M em um ensaio que utilizacélulas A431 e detecta a quantidade de fluorescência do EGF biotiniladoligado com o uso de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina a 600 nMemcélulas A431 incubadas com ousem o primeirodomínio de FN3. O primeirodomínio de FN3 namoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met da invençãopodebloquear a ligação de EGF ao EGFR empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%,97%,98%,99% ou 100% quandocomparado com a ligação de EGF ao EGFR naausência dos primeirosdomínios de FN3 com o uso de condições de ensaioiguais.
[000130] O segundodomínio de FN3 namoléculabiespecífica anti- EGFR/c-Met da invençãopodebloquear a ligação de HGF a c-Met com um valor de IC50 de entre cerca de 2x10-10 M e cerca de 6x10-8 M em um ensaio que detecta a inibição de ligação de HGF biotinilado à proteína de fusão c-Met-Fc napresença do segundodomínio de FN3. O segundodomínio de FN3 namoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met podebloquear a ligação de HGF a c-Met empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% quandocomparado com a ligação de HGF a c-Met naausência do segundodomínio de FN3 com o uso de condições de ensaioiguais.
[000131] A moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met da invençãopode inibir a sinalização de EGFR e/ou de c-Met empelomenos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ou 100% quando comparada com a sinalização da moléculabiespecífica anti-EGFR/c- Met da invenção com o uso de condições de ensaioiguais.
[000132] A sinalização de EGFR e de c-Met pode ser medida com o uso de váriosmétodosconhecidosconformedescritosacima para as moléculasmonoespecíficas.
[000133] As moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met da invenção que compreendem o primeirodomínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR e o segundodomínio de FN3 que especificamente se liga a c-Met fornecemumainibiçãosinérgicasignificativamenteaumentada de sinalização de EGFR e de c/Met e de proliferação de célulastumoraisquandocomparada com a inibiçãosinérgicaobservadaporumamistura de o primeirodomínio de FN3 e o segundodomínio de FN3. A inibiçãosinérgicapode ser avaliadaporexemplo pela medição da inibição de fosforilação de ERK pelasmoléculasbiespecíficas que contêm o domínio de FN3 para EGFR/c-Met e porumamistura de duas moléculasmonoespecíficas, uma que se ligaao EGFR e a outra que se liga a c-Met. As moléculasbiespecíficas anti- EGFR/c-Met da invençãopodeminibir a fosforilação de ERK com um valor de IC50 pelomenoscerca de 100 vezesmenor, porexemplopelomenos 500, 1.000, 5.000 ou 10.000 vezesmenorquandocomparado com o valor de IC50 para umamistura de doisdomíniosmonoespecíficos de FN3, indicandopotênciapelomenos 100 vezesaumentada para as moléculasbiespecíficascontendo o domínio de FN3 para EGFR/c-Met quandocomparada com a mistura de doisdomíniosmonoespecíficos de FN3. Moléculasbiespecíficas que contêm o domínio de FN3 para EGFR-c-Met exemplificadoraspodeminibir a fosforilação de ERK com um valor de IC50 de cerca de 5x10-9 M oumenor. A fosforilação de ERK pode ser medica com o uso de métodospadrão e métodosdescritos no presentedocumento.
[000134] A moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti- EGFR/c-Met da invençãopodeinibir a proliferação de células H292 com um valor de IC50 que é pelomenos 30 vezesmenorquandocomparado com o valor de IC50 de inibição de crescimento de células H292 com umamistura de o primeirodomínio de FN3 e o segundodomínio de FN3, em que a proliferaçãocelular é induzida com um meiocontendo 10% de FBS suplementado com 7,5 ng/mL de HGF. A moléculabiespecífica da invençãopodeinibir a proliferação de célulastumorais com um valor de IC50 que é cerca de 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300,400, 500,600,700,800, oucerca de 1.000 vezesmenorquandocomparado com o valor de IC50 de inibição de proliferaçãode célulastumoraiscomumamisturade o primeiro domínio deFN3 e osegundodomínio de FN3.A inibição de proliferaçãode célulastumoraispodesermedidacom o uso de métodospadrão e métodosdescritos no presentedocumento.
[000135] Uma outramodalidade da invenção é umamoléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 que compreende um primeirodomínio de fibronectinatipo III (FN3) e um segundodomínio de FN3, em que o primeirodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR, e o segundodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met), e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met.
[000136] o primeirodomínio de FN3 compreende
[000137] umaalça FG que compreende a sequência HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO:179) ou a sequência LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), em que X9 é M ou I; e
[000138] umaalça BC que compreende a sequência X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181), em que XIé A, T, G ou D; X2 é A, D, Y ou W; X3 é P, D ou N; X4 é L ouestáausente; X5 é D, H, R, G, Y ou W; X6 é G, D ou A; X7 é A, F, G, H ou D; e X8 é Y, F ou L; e
[000139] o segundodomínio de FN3 compreende
[000140] umafita C e umaalça CD compreendendo a sequência DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), em que X10 é W, F ou V; XIIé D, F ou L; X12 é V, F ou L; X13 é V, L ou T; X14 é V, R, G, L, T ou S; X15 é G, S, A, T ou K; e X16 é E ou D; e
[000141] umafita F e umaalça FG compreendendo a sequência TEYX17VX18IX19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), em que X17 é Y, W, I, V, G ou A; X18 é N, T, Q ou G; X19 é L, M, N ou I; X20 é G ou S; X21 é S, L, G, Y, T, R, H ou K; X22 é I, V ou L; e X23 é V, T, H, I, P, Y, T ou L.
[000142] Em umaoutramodalidade, a moléculabiespecífica compreende o primeirodomínio de FN3 que se ligaao EGFR que compreende a sequência: LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVG EAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), ou a sequência LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8 DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV LGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), em que as SEQ ID NOs: X e X; XIIIé A, T, G ou D; X2 é A, D, Y ou W; X3 é P, D ou N; X4 é L ouestáausente; X5 é D, H, R, G, Y ou W; X6 é G, D ou A; X7 é A, F, G, H ou D; X8 é Y, F ou L; e X9 é M ou I.
[000143] Em umaoutramodalidade, a moléculabiespecíficacompreende o segundodomínio de FN3 que se liga a c-Met que compreende a sequência: LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186), em que X10 é W, F ou V; e XIVé D, F ou L; X12 é V, F ou L; X13 é V, L ou T; X14 é V, R, G, L, T ou S; X15 é G, S, A, T ou K; X16 é E ou D; X17 é Y, W, I, V, G ou A; X18 é N, T, Q ou G; X19 é L, M, N ou I; X20 é G ou S; X21 é S, L, G, Y, T, R, H ou K; X22 é I, V ou L; e X23 é V, T, H, I, P, Y, T ou L.
[000144] Moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti- EGFR/c-Met exemplificadorascompreendem a sequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NOs: 50 a 72, 106, 118 a 121, ou 138 a 165.
[000145] As moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met da invençãocompreendemdeterminadascaracterísticasestruturaisassociadas com as característicasfuncionais delas, comoinibição de autofosforilação de EGFR, como a alça FG do primeirodomínio de FN3 que se ligaao EGFR que compreende a sequência HNVYKDTNX9RGL(SEQ ID NO:179) ou a sequência LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), em que X9 é M ou I.
[000146] Em umamodalidade, as moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invenção
[000147] inibem a fosforilação de EGFR induzidapor EGF emresíduos de Tirosina 1173 com um valor de IC50 menor que cerca de 8x10-7 M quandomedidoemcélulas A431 com o uso de EGF humano a 50 ng/mL;
[000148] inibem a fosforilação de c-Met induzidapor HGF emresíduos de Tirosina 1349 de c-Met e com valor de IC50 menor que cerca de 8,4x10-7 M quandomedidoemcélulas NCI-H441 com o uso de HGF humano a 100 ng/mL;
[000149] inibem a proliferação de células NCI-H292 induzidapor HGF com um valor de IC50 menor que cerca de 9,5x10-6M em que a proliferaçãocelular é induzida com FBS 10% contendo 7,5 ng de HGF;
[000150] ligam-se ao EGFR com uma KD menor que cerca de 2,0x10-8 M;
[000151]ligam-se a c-Met com uma KD menor que cerca de 2,0x10-8 M.
[000152] Em umaoutramodalidade, as moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invenção
[000153] inibem a fosforilação de EGFR induzidapor EGF emresíduos de Tirosina 1173 de EGFR com um valor de IC50 entre cerca de 4,2x10-9 M e 8x10-7 M quandomedidoemcélulas A431 com o uso de EGF humano a 50 ng/mL;
[000154] inibem a fosforilação de c-Met induzidapor HGF emresíduos de Tirosina 1349 de c-Met com um valor de IC50 de entre cerca de 2,4x10-8 M e cerca de 8,4x10-7 M quandomedidoemcélulas NCI-H441 com o uso de HGF humano a 100 ng/mL;
[000155] inibem a proliferação de células NCI-H292 induzidapor HGF com um valor de IC50 entre cerca de 2,3x10-8 M e cerca de 9,5x10-6M em que a proliferaçãocelular é induzida com FBS 10% contendo 7,5 ng de HGF;
[000156] ligam-se ao EGFR com uma KD de entre cerca de 2x10-10 M e cerca de 2,0x10-8 M;
[000157] ligam-se a c-Met com uma KD de entre cerca de 1x10-9 M e cerca de 2,0x10-8 M.
[000158] Em umamodalidade, as moléculasbiespecíficas anti- EGFR/c-Met compreendem o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR que compreende a sequência LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVG EAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), em que XVé D; X2 é D; X3 é P; X4 estáausente; X5 é H ou W; X6 é A; X7 é F X8 é Y; e X9 é M ou I; e o domínio de FN3 de ligação a c-Met que compreende a sequência PAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23 PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186), em que X10 é W; XVIé F; X12 é F; X13 é V ou L; X14 é G ou S; X15 é S ou K; X16 é E ou D; X17 é V; X18 é N; X19 é L ou M; X20 é G ou S; X21 é S ou K; X22 é I; e X23 é P.
[000159] Moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met exemplificadorassãoaquelas que têm a sequênciamostradaem SEQ ID NOs: 57, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 e 68.
[000160] As moléculasbiespecíficas da invençãopodem compreenderadicionalmentesubstituiçõesemumaoumaisposições de resíduo no primeirodomínio de FN3 e/ou no segundodomínio de FN3 correspondendoàsposições 11, 14, 17, 37, 46, 73, e 86 emTencon (SEQ ID NO: 1) conformedescritoacima, e umasubstituiçãonaposição 29. Substituiçõesexemplificadorassãosubstituições E11N, E14P, L17A, E37P, N46V, G73Y, E86I e D29E (numeração de acordo com a SEQ ID NO: 1). A pessoaversadanatécnicareconhecerá que outros aminoácidospodem ser usados para substituições, comoaminoácidosdentro de umafamília de aminoácidos que estãorelacionadosemsuascadeiaslateraisconformedescritoabaixo. As variantesgeradaspodem ser testadas para a estabilidade delas e a ligação delas ao EGFR e/ou a c-Met com o uso de métodos do presentedocumento.
[000161] Em umamodalidade, a moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met compreende o primeirodomínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR e o segundodomínio de FN3 que especificamente se liga a c-Met, em que o primeirodomínio de FN3 compreende a sequência: LPAPKNLVVSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKV GEAIX30LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RG LPLSAX33FTT (SEQ ID NO: 187), em que X24 é E, N ou R; X25 é E ou P; X26 é L ou A; X27 é H ou W; X28 é E ou D; X29 é E ou P; X30 é N ou V; X31 é G ou Y; X32 é M ou I; e X33 é E ou I; e o segundodomínio de FN3 compreende a sequência: LPAPKNLVVSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X 40GX41AIX42LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIX43X44VKGGX45ISPPL SAX46FTT (SEQ ID NO: 188); em que X34 é E, N ou R; X35 é E ou P; X36 é L ou A; X37 é E ou P; X38 é V ou L; X39 é G ou S; X40 é S ou K; X41 é E ou D; X42 é N ou V; X43 é L ou M; X44 é G ou S; X45 é S ou K; e X46 é E ou I.
[000162] Em outrasmodalidades, a moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met compreende o primeirodomínio de FN3 que compreendeumasequência de aminoácidospelomenos 87% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, e o segundodomínio de FN3 que compreendeumasequência de aminoácidospelomenos 83% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.
[000163] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invençãopodem ser adaptadas para umaafinidadeespecíficapor EGFR e por c-Met para maximizar a acumulaçãoemtumores.
[000164] Uma outramodalidade da invenção é umamolécula biespecíficaisolada que contémdomínios de FN3 que compreende um primeirodomínio de fibronectinatipo III (FN3) e um segundodomínio de FN3, em que o primeirodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR, e o segundodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met), e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met, em que o primeirodomínio de FN3 e o segundodomínio de FN3 sãoisolados de umabibliotecaplanejada ("designed") com base emsequênciaTencon da SEQ ID NO: 1.
[000165] A moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti- EGFR/c-Met da invençãopode ser geradaporacoplamentocovalente do domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR e do domínio de FN3 de ligação a c-Met da invenção com o uso de métodosbemconhecidos. Osdomínios de FN3 podem ser ligados via um conector ("linker"), porexemplo um conector que contém poli-glicina, glicina e serina, oualanina e prolina. Conectores("linkers") exemplificadoresincluemosconectores (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (AP)10 (SEQ ID NO: 82), (AP)20 (SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO: 84). O uso de conectores ("linkers") peptídicos de ocorrência natural e tambémartificiais para conectarpolipeptídeosemnovospolipeptídeos de fusãoligados é bemconhecidonaliteratura (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; patente US n° 5.856.456). As moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met da invençãopodem ser ligadas juntas a partir de umaterminação-C (carboxila) do primeirodomínio de FN3 até a terminação-N (amino) do segundodomínio de FN3, ou a partir da terminação-C (carboxila) do segundo domínio de FN3 até a terminação-N (amino) do primeirodomínio de FN3. Qualquerdomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR pode ser covalentementeligado a um domínio de FN3 de ligação a c-Met. Osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR exemplificadoressãoosdomínios que têm a sequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NOs: 18 a 29, 107 a 110, e 122 a 137, e osdomínios de FN3 de ligação a c-Met exemplificadoressãoosdomínios que têm a sequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NOs: 32 a 49 e 111 a 114. Osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR a seremacopladosemumamoléculabiespecíficapodemcompreenderadicionalmente um iniciadormetionina (Met) naterminação-N (amino) deles.
[000166] Variantes das moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met estãodentro do escopo da invenção. Por exemplo, podem ser feitassubstituiçõesnamoléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met desde que a varianteresultantemantenhaseletividade e potênciasimilares para EGFR e para c-Met quandocomparadas com a molécula parental. Modificaçõesexemplificadorassãoporexemplosubstituiçõesconservativas que resultarãoemvariantes com característicassimilaresàquelas das moléculasparentais. As substituiçõesconservativassãoaquelas que ocorremdentro de umafamília de aminoácidos que estãorelacionadasemsuascadeiaslaterais. Osaminoácidosgeneticamentecodificadospodem ser divididosemquatrofamílias: (1) ácidos (aspartato, glutamato), (2) básicos (lisina, arginina, histidina), (3) nãopolares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), e (4) polaresnãocarregados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptofano, e tirosinasão, algumasvezes, classificadosjuntamentecomoaminoácidosaromáticos. Alternativamente, o repertório de aminoácidospode ser agrupado como (1) acídicos (aspartato, glutamato); (2) básicos (lisina, argininahistidina), (3) alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), com serina e treoninasendoopcionalmenteagrupadasseparadamentecomoalifáticos-hidroxilados; (4) aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano), (5) amida (asparagina, glutamina), e (6) contendoenxofre (cisteína e metionina) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2a edição, WH Freeman and Co., 1981). Podem ser feitassubstituiçõesnãoconservativasnamoléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met que envolvemsubstituições de resíduos de aminoácido entre classes diferentes de aminoácidos para aprimorar as propriedades das moléculasbiespecíficas. Se umaalteraçãonasequência de aminoácidos de um polipeptídeoou de seufragmentoresultaem um homólogofuncionalpode ser facilmentedeterminada pela avaliação da capacidade do polipeptídeooufragmentomodificado para produzirumarespostaemumamaneira similar à do polipeptídeooufragmentonãomodificado, com o uso dos ensaiosdescritos no presentedocumento. Ospeptídeos, polipeptídeosouproteínasem que mais de umasubstituiçãoocorreupodem ser facilmentetestadosnamesmamaneira.
[000167] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invençãopodem ser geradascomodímerosoumultímeros, porexemplo, como um meio para aumentar a valência e dessa forma a avidez de ligação à molécula-alvo. Osmultímerospodem ser geradosporligação de um oumaisdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR e de um oumaisdomínios de FN3 de ligação a c- Met para formarmoléculas que compreendempelomenostrêsdomínios de FN3 individuaisdiferentes que sãopelomenosbiespecíficos para quer EGFR quer c-Met, porexemplo pela inclusão de um conector ("linker") de aminoácido com o uso de métodosbemconhecidos.
[000168] Uma outramodalidade da invenção é umamoléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 que compreende um primeirodomínio de fibronectinatipo III (FN3) e um segundodomínio de FN3, em que o primeirodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR, e o segundodomínio de FN3 especificamente se ligaao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met), e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met que compreende a sequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NOs: 50 a 72 ou 106.
Porções que prolongam a meia-vida
[000169] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met ouosdomíniosmonoespecíficos de FN3 de ligaçãoao EGFR ou a c-Met da presenteinvençãopodemincorporaroutrassubunidadesporexemplo via interaçãocovalente. Em um aspecto da invenção, as moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invençãocompreendemadicionalmenteumaporção que prolonga a meia-vida. As porções que prolongam a meia- vidaexemplificadorassãoalbumina, domíniosouproteínas de ligação a albumina, transferrina e seusfragmentos e análogos, e regiões Fc. Um domínio de ligação a albuminaexemplificador é mostradona SEQ ID NO: 117.
[000170] A totalidadeouumaporção de umaregiãoconstante de anticorpopode ser ligadaàsmoléculas da invenção para concederpropriedadessemelhantesàquelas de anticorpo, especialmenteaquelaspropriedadesassociadas à região Fc, como as funçõesefetoras de Fc comoligação de C1q, citotoxicidadedependentecomplementar (CDC), ligação de receptor Fc, citotoxicidademediadaporcéluladependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, infrarregulação de receptores de superfíciecelular (porexemplo, receptor de célula B; BCR), e podem ser modificadas, adicionalmente pela modificação de resíduos no Fc que sãoresponsáveisporestasatividades (para exame; consulte Strohl, Curr OpinBiotechnol. 20, 685-691, 2009).
[000171] Porçõesadicionaispodem ser incorporadasnasmoléculasbiespecíficas da invenção, comomoléculas de poli(glicoletilênico) (PEG), como PEG5000 ou PEG20.000, ácidosgraxos e ésteres de ácidograxo de diferentescomprimentos de cadeia, porexemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, beenato, oleato, araquidonato, ácidooctanodioico,ácidotetradecanodioico,ácido octanodecanodioico, ácidodocosanodioico e similares, polilisina, octano, carboidratos (dextrana, celulose, oligo- oupolissacarídeos) para propriedadesdesejadas. Estasporçõespodem ser fusõesdiretas com as sequências que codificam o arcabouço de proteína e podem ser geradasportécnicas de expressão e clonagempadrão. Alternativamente, métodos de acoplamentoquímicobemconhecidospodem ser usados para ligar as porçõesàsmoléculasrecombinantementeproduzidas da invenção.
[000172] Uma porçãopeguilapode ser, porexemplo, adicionadaàsmoléculasmonoespecíficasoubiespecíficas da invenção pela incorporação de um resíduo de cisteína à terminação-C (carboxila) da molécula e pela ligação de um grupopeguila à cisteína com o uso de métodosbemconhecidos. Moléculasbiespecíficasexemplificadoras com a cisteínaC-terminal sãoaquelas que têm a sequência de aminoácidosmostradaem SEQ ID NO: 170 a 178
[000173] As moléculasmonoespecíficas e biespecíficas da invenção que incorporamporçõesadicionaispodem ser comparadas para funcionalidadeporváriosensaiosbemconhecidos. Por exemplo, as pro-priedadesalteradas de moléculasmonoespecíficas e/oubiespecíficasdevido à incorporação de domínios de Fc e/ou de variantes de domínio de Fc podem ser ensaiadasemensaios de ligação de receptor de Fc com o uso de formassolúveis dos receptores, comoosreceptores FCYRI, FCYRII, FCYRIII ouFcRn, ou com o uso de ensaiosbaseadosemcélulasbemconhecidos que medem, porexemplo, ADCC ou CDC, ou que avaliam as propriedadesfarmacocinéticas das moléculas da invençãoemmodelos in vivo. Polinucleotídeos, vetores, célulashospedeiras
[000174] A invençãoforneceácidosnucleicos que codificamosdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ou de ligação a c-Met ou as moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c- Met da invençãocomopolinucleotídeosisoladosoucomoporções de vetores de expressãooucomoporções de sequências de DNA linear, incluindosequências de DNA linear usadas para transcrição/tradução in vitro, vetorescompatíveis com secreção, exposição e/ouexpressãoemfagoprocariótico, eucarióticooufilamentoso das composiçõesouseusagentesmutagênicosdirecionados. Certospolinucleotídeosexemplificadoressãoapresentados no presentedocumento, entretanto, outros polinucleotídeos que, devido à degeneração do códigogenéticoouàspreferências de códonem um dado sistema de expressão, codificamosarcabouços de proteína e as bibliotecas dos arcabouços de proteína da invenção, tambémestãodentro do escopo da invenção.
[000175] Uma modalidade da invenção é um polinucleotídeoisolado que codifica o domínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR tendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 18 a 29, 107 a 110, ou 122 a 137.
[000176] Uma modalidade da invenção é um polinucleotídeoisolado que compreende a sequência de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 97 a 98 ou 168 a 169.
[000177] Uma modalidade da invenção é um polinucleotídeoisolado que codifica o domínio de FN3 que especificamente se liga a c-Met tendo a sequência de aminoácidos da sequênciamostradaem SEQ ID NOs: 32-49 ou 111-114.
[000178] Uma modalidade da invenção é um polinucleotídeoisolado que codifica a moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met tendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 50 a 72, 106, 118 a 121, ou 138 a 165.
[000179] Uma modalidade da invenção é um polinucleotídeoisolado que compreende a sequência de polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 115 a 116 ou 166 a 167.
[000180] Ospolinucleotídeos da invençãopodem ser produzidosporsíntesequímicacomosíntese de polinucleotídeosemfasesólidaem um sintetizadorautomatizado de polinucleotídeos e montadosemmoléculascompletas de fitaúnicaou de fitadupla. Alternativamente, ospolinucleotídeos da invençãopodem ser produzidospormeio de outrastécnicascomo PCR seguidaporclonagem de rotina. As técnicas para a produçãoou a obtenção de polinucleotídeos de uma dada sequênciaconhecidasãobemconhecidasnatécnica.
[000181] Ospolinucleotídeos da invençãopodemcompreenderpelomenosumasequêncianãocodificadora, comoumasequência de promotor ou de intensificador, íntron, sinal de poliadenilação, umasequência cis que facilita a ligação de RepA e similares. As sequências de polinucleotídeospodemtambémcompreendersequênciasadicionaiscodificadoras de aminoácidosadicionais que codificam, porexemplo, um marcadorouumasequência de etiquetacomoumaetiqueta de histidinaouumaetiqueta HA para facilitar a purificaçãoou a detecção da proteína, umasequência de sinal, um parceiro de proteína de fusãocomo RepA, Fc ouumaproteínacapsidial de bacteriófagocomopIXoupIII.
[000182] Uma outramodalidade da invenção é um vetor que compreendepelomenos um polinucleotídeo da invenção. Tais vetorespodem ser vetoresplasmidiais, vetoresvirais, vetores para expressão de baculovírus, vetores à base de transposon ouquaisquer outros vetoresadequados para a introdução dos polinucleotídeos da invençãoem um dado organismoouantecedentegenéticoporquaisquermeios. Tais vetorespodem ser vetores de expressão que compreendemelementos de sequência de ácidonucleico que podemcontrolar, regular, causaroupermitir a expressão de um polipeptídeocodificadopor um talvetor. Esses elementospodemcompreendersítios de ligação de intensificadorestranscricionais, sítios de iniciação de RNA polimerase, sítios de ligação de ribossomas, e outros sítios que facilitam a expressão de polipeptídeoscodificadosem um dado sistema de expressão. Tais sistemas de expressãopodem ser à base de célula, ousistemasisentos de célulabemconhecidosnatécnica.
[000183] Uma outramodalidade da invenção é umacélulahospedeira que compreende o polinucleotídeo da invenção. Um domíniomonoespecífico de FN3 de ligaçãoao EGFR ou de ligação a c-Met ouumamoléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti- EGFR/c-Met da invençãopode ser opcionalmenteproduzido (produzida) pormeio de umalinhagemcelular, umalinhagem de célulasmistas, umacélulaimortalizadaouumapopulação clonal de célulasimortalizadas, como é bemconhecidonatécnica. Consulte, porexemplo, Ausubel, et al., ed., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edition, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Harlow e Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Colligan, et al., eds., "Current Protocols in Immunology", John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1994-2001); Colligan et al., "Current Protocols in Protein Science", John Wiley & Sons, NY, NY, EUA (1997-2001).
[000184] A célulahospedeiraescolhida para a expressãopode ser de origem de mamíferooupode ser selecionadadentrecélulas COS-1, COS-7,HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2,SP2/0, HeLa, de mieloma, de linfoma, de levedura, de insetoou de plantas, ouqualquercéluladerivada, imortalizadaoutransformada das mesmas. Alternativamente, a célulahospedeirapode ser selecionada de umaespécieou um organismo que nãotem a capacidade de glicosilarpolipeptídeos, porexemplo, umacélulaprocarióticaou um organismoprocariótico, como BL21,BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), e qualquerumadentre as cepas de E. coli spp, Klebsiella spp., ou Pseudomonas sppnaturaisoumodificadas.
[000185] Uma outramodalidade da invenção é um método de produzir o domínioisolado de FN3 que especificamente se ligaao EGFR ou a c- Met da invençãoou a moléculabiespecíficaisolada que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invenção, que compreende cultivar a célulahospedeiraisolada da invenção sob condições tais que odomínioisolado de FN3 que especificamente se ligaao EGFR ou a c-Met sejaexpressadoou a moléculabiespecíficaisolada que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-MetAsejaexpressada, e purificar o domínioou a molécula.
[000186] O domínio de FN3 que especificamente se ligaao EGFR ou a c-Met ou a moléculabiespecíficaisolada que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met da invençãopode ser purificado (purificada) das culturas de célulasrecombinantespormétodosbemconhecidos, porexemploporpurificação com proteína A, precipitação com sulfato de amônioouetanol, extraçãoácida, cromatografia de troca de ânionsou de cátions, cromatografiaemfosfocelulose, cromatografia de interaçãohidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografiaemhidroxiapatita e cromatografiaemlectina, oucromatografialíquida de altaeficiência (HPLC, "High Performance Liquid Chromatography").
Usos de moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti- EGFR/c-Met e de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ou de ligação a c-Met da invenção
[000187] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ouosdomínios de FN3 de ligação a c-Met da invençãopodem ser usadas (usados) para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a evitar a incidência de, oureduzirossintomas de doençashumanasou de patologiasespecíficasemcélulas, tecidos, órgãos, fluidosou, de modo geral, em um hospedeiro. Osmétodos da invençãopodem ser usados para tratar um paciente animal pertencente a qualquerclassificação. Exemplos de tais animaisincluemmamíferoscomohumanos, roedores, cães, gatos e animais da fazenda.
[000188] Um aspecto da invenção é um método para inibir o crescimentoou a proliferação de células que expressam EGFR e/ou c- Met, que compreendecolocar as célulasemcontato com a moléculabiespecíficaisolada que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, com o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR ou com o domínio de FN3 de ligação a c-Met da invenção.
[000189] Um outro aspecto da invenção é um método para inibir o crescimentoou a metástase de células de câncerou de tumor que expressam EGFR e/ou c-Met em um indivíduo, compreendendoadministraraoindivíduoumaquantidadeeficaz da moléculabiespecíficaisolada que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, do domínio de FN3 de ligação a EGFR ou do domínio de FN3 de ligação a c-Met da invenção de modo que sejainibido o crescimento de célula de câncerou de tumor que expressa EGFR e/ou c-Met ousejainibida a metástase de célula de câncerou de tumor que expressa EGFR e/ou c-Met.
[000190] A moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti- EGFR/c-Met, o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR ou o domínio de FN3 de ligação a c-Met da invençãopodem ser usados para o tratamento de qualquerdoençaoudistúrbiocaracterizada (caracterizado) pela ativação anormal ouprodução anormal de EGFR, de c-Met, de EGF ou de outro ligante de EGFR ou de HGF, ou de distúrbiorelacionado com a expressão de EGFR ou de c-Met, que podeounãoenvolvermalignidadeoucâncer, em que a ativação anormal e/ou a produção anormal de EGFR, de c-Met, EGF ou de outro ligante de EGFR, ou de HGF estáocorrendoemcélulasouemtecidos de um indivíduo que tem, ou é predisposto, à doençaouaodistúrbio.
[000191] A moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti- EGFR/c-Met da invençãopode ser usada para o tratamento de tumores, incluindotumoresbenignos e cânceres. Oscânceres que sãosensíveisaotratamentopelasmoléculasbiespecíficas da invençãoincluemaqueles que superexpressam EGFR e/ou c-Met. Cânceresexemplificadores que sãosensíveisaotratamentopelasmoléculasbiespecíficas da invençãoincluemcânceres de célulasepiteliais, câncer de mama, câncerovariano, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célulasnãopequenas (NSCLC), adenocarcinoma pulmonar, câncercolorretal, câncer anal, câncer de próstata, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncerovariano, câncerpancreático, câncer de pele, câncer oral, cânceresofágico, câncer vaginal, câncer cervical, câncer do baço, câncer testicular, câncergástrico, câncer do timo, câncer de cólon, câncer de tireoide, câncer de fígado, ou carcinoma renal papilaresporádicoouhereditário (PRCC).
[000192] Osdomínios de FN3 que especificamente se ligam a c-Met e bloqueiam a ligação de HGF a c-Met da invençãopodem ser usados para o tratamento de tumores, incluindotumoresbenignos e cânceres. Oscânceres que sãosensíveisaotratamentopelosdomínios de FN3 de ligação a c-Met da invençãoincluemaqueles que superexpressam c-Met. Cânceresexemplificadores que sãosensíveisaotratamentopelos domínios de FN3 da invençãoincluemcânceres de célulasepite-liais, câncer de mama, câncerovariano, câncer de pulmão, câncercolorretal, câncer anal, câncer de próstata, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncerovariano, câncerpancreático, câncer de pele, câncer oral, cânceresofágico, câncer vaginal, câncer cervical, câncer do baço, câncer testicular, e câncer do timo.
[000193] Osdomínios de FN3 que especificamente se ligam a EGFR e bloqueiam a ligação de EGF a EGFR da invençãopodem ser usados para o tratamento de tumores, incluindotumoresbenignos e cânceres. Oscânceres que sãosensíveisaotratamentopelosdomínios de FN3 da invençãoincluemaqueles que superexpressam EGFR ouvariantes. Cânceresexemplificadores que sãosensíveisaotratamentopelosdomínios de FN3 da invençãoincluemcânceres de célulasepiteliais, câncer de mama, câncerovariano, câncer de pulmão, câncercolorretal, câncer anal, câncer de próstata, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncerovariano, câncerpancreático, câncer de pele, câncer oral, cânceresofágico, câncer vaginal, câncer cervical, câncer do baço, câncer testicular, e câncer do timo.
Administração/ComposiçõesFarmacêuticas
[000194] Para usoterapêutico, as moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ouosdomínios de FN3 de ligação a c-Met da invençãopodem ser produzidas (produzidos) comocomposiçõesfarmacêuticas que contêmumaquantidadeeficaz do domínioou da moléculacomo um ingredienteativoem um carreadorfarmaceuticamenteaceitável. O termo "carreador" se refere a um diluente, adjuvante, excipienteouveículo com o qual o compostoativo é administrado. Tais veículospodem ser líquidos, comoágua e óleos, incluindoaqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ousintética, comoóleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, podem ser usadassolução salina a 0,4% e glicina a 0,3%. Estassoluçõessãoestéreis e, emgeral, isentas de matériaparticulada. As mesmaspodem ser esterilizadasatravés de técnicas de esterilizaçãoconvencionaisbemconhecidas (porexemplo, filtração). As composiçõespodemcontersubstânciasauxiliaresfarmaceuticamenteaceitáveisconformeexigido para aproximá-las das condiçõesfisiológicas, comoagentestamponantes e ajustadores de pH, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração das moléculas da invençãoemtalformulaçãofarmacêuticapodevariaramplamente, isto é, desdemenor que cerca de 0,5%, habitualmente a oupelomenoscerca de 1% até tanto quanto 15% ou 20%, em peso, e seráselecionadaprincipalmente com base nadosagemexigida, nos volume de fluido, nasviscosidades, etc., de acordo com o modo específico de administraçãoselecionado. Veículosadequados e formulaçõesadequadas, inclusive de outrasproteínashumanas, porexemplo, albuminaséricahumana, sãodescritos, porexemplo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, EUA, Parte 5, "Pharmaceutical Manufacturing" páginas 691 a 1092, consulteespecialmente as páginas 958 a 989.
[000195] O modo de administração para usoterapêutico das moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, dos domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ou dos domínios de FN3 de ligação a c-Met da invençãopode ser qualquerrotaadequada que libera o agente para o hospedeiro, comoadministração parenteral, porexemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosaousubcutânea, pulmonar; transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, retal); com o uso de umaformulaçãoem um comprimido, umacápsula, umasolução, um pó, um gel, umapartícula; e contidadentro de uma seringa, um dispositivoimplantado, umabombaosmótica, um cartucho, umamicrobomba; ou outro meioreconhecido pela pessoaversadanatécnica, como é bemconhecidonatécnica. A administraçãosítio-específicapode ser realizada, porexemplo, poraplicação intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intracardíaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca,intraperitoneal,intrapleural,intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal outransdérmica.
[000196] Dessa forma, umacomposiçãofarmacêutica da invenção para injeção intramuscular poderia ser produzida para conter 1 mL de águatamponadaestéril, e entre cerca de 1 ng e cerca 100 mg, porexemplo, cerca de 50 ng a cerca de 30 mg ou, maispreferencialmente, de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, do domínio de FN3 da invenção. De maneira similar, umacomposiçãofarmacêutica da invenção para infusãointravenosapoderia ser produzida para contercerca de 250mL de solução de Ringer estéril, e cerca de 1 mg a cerca de 30 mg, porexemplo, cerca de 5 mg a cerca de 25 mg da moléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, do domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR ou do domínio de FN3 de ligação a c-Met da invenção. Osmétodosatuais para produzir as composiçõesparenteralmenteadministráveissãobemconhecidos e sãodescritosemmaisdetalhesem, porexemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA.
[000197] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ouosdomínios de FN3 de ligação a c-Met da invençãopodem ser liofilizadas (liofilizados) para armazenamento e reconstituídas (reconstituídos) em um carreadoradequado antes do uso. Esta técnicamostrou-se eficaz com preparações de proteínasconvencionais e as técnicas de reconstituição e de liofilizaçãoconhecidasnatécnicapodem ser utilizadas.
[000198] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ouosdomínios de FN3 de ligação a c-Met podem ser administradas (administrados) a um indivíduoemuma dose únicaou a administraçãopode ser repetida, porexemploapós um dia, doisdias, trêsdias, cincodias, seis dias, umasemana, duas semanas, trêssemanas, um mês, cincosemanas, seis semanas, setesemanas, dois meses outrês meses. A administraçãorepetidapode ser na dose igualouemuma dose diferente. A administraçãopode ser repetidaumavez, duas vezes, trêsvezes, quatrovezes, cincovezes, seis vezes, setevezes, oitovezes, novevezes, dezvezes, oumais.
[000199] As moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ouosdomínios de FN3 de ligação a c-Met da invençãopodem ser administradas (administrados) emcombinação com um segundoagenteterapêutico, de modo simultâneo, sequencialouseparado. O segundoagenteterapêuticopode ser um agentequimioterapêutico, um agenteantiangiogênico, ou um fármacocitotóxico. Quando usadas (usados) para o tratamento de câncer, as moléculasbiespecíficas que contêmdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR ouosdomínios de FN3 de ligação a c-Met podem ser utilizadas (utilizados) emcombinação com terapias contra câncerconvencionais, comocirurgia, radioterapia, quimioterapiaoucombinações das mesmas. Agentesexemplificadores que podem ser usadosemcombinação com osdomínios de FN3 da invençãosãoantagonistas de HER2, HER3, HER4, VEGF, e inibidores de proteínatirosina-quinasecomoIressa® (gefitinib) e Tarceva (erlotinib).
[000200] Embora a invençãotenhasidodescritaemtermosgerais, as modalidades da invençãoserãodescritasadicionalmentenosexemplos a seguir, que nãodevem ser interpretadoscomolimitadores do escopo das reivindicações.
Exemplo 1. Construção de bibliotecasTencon
[000201] Tencon (SEQ ID NO: 1) é um arcabouçosemelhante à imunoglobulina, um domínio de fibronectinatipo III (FN3), planejado a partir de umasequênciaconsenso de quinze domínios de FN3 da tenascina-C humana (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117,2012; publicação de patente US n° 2010/0216708). A estruturacristalina de Tenconmostra seis alçasexpostasnasuperfície que conectamsetefitas-beta. Estasalças, ouosresíduosselecionadosdentro de cadaalça, podem ser randomizadas (randomizados) com a finalidade de construirbibliotecas de domínios de fibronectinatipo III (FN3) que podem ser usados para selecionarnovasmoléculas que se ligam a alvosespecíficos.
Tencon: LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO 1): Construção de biblioteca TCL1
[000202] Uma bibliotecaplanejada para randomizarapenas a alça FG de Tencon (SEQ ID NO: 1), TCL1, foiconstruído para uso com o sistema "cis-display" (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012). Neste sistema, é produzido um DNA de fitaúnica que incorporasequências para um promotor Tac, sequênciacodificadora de bibliotecaTencon, sequênciacodificadora de RepA, elemento-cis, e elementoori. Após a expressãoem um sistema de transcrição/tradução in vitro, é produzido um complexo da proteína de fusãoTencon-RepA ligadoem cis ao DNA a partir do qual ele é codificado. Complexos que se ligam a umamolécula-alvosãoentãoisolados e amplificadosporreação emcadeia da polimerase (PCR, "Polymerase Chain Reaction"), conformedescritoabaixo.
[000203] A construção da biblioteca TCL1 para uso com "cis-display" foirealizadaporrodadassucessivas de PCR para produzir as moléculas de DNA de fitadupla, linear final em duas metades: o fragmento 5’ contém as sequências de promotor e Tencon, enquanto que ofragmento 3’ contém o gene repA e oselementos-cis e ori. Estas duas metadessãocombinadaspordigestão de restrição com a finalidade de produzir o constructointeiro. A biblioteca TCL1 foiplanejada ("designed") para incorporaraminoácidosrandomizadosapenasnaalça FG de Tencon, KGGHRSN (SEQ ID NO: 86). Oscódons NNS foramusadosnaconstruçãodestabiblioteca, resultandonapossívelincorporação de todosos 20 aminoácidos e de um códon STOP (de terminação) para dentro da alça FG. A biblioteca TCL1 contém seis sub-bibliotecasseparadas, cadauma tendo um comprimento de alça FG randomizadadiferente, desde 7 a 12 resíduos, com a finalidade de aumentaraindamais a diversidade. Osplanejamentos ("designs") de bibliotecas com base emtenconsãomostradosnaTabela 2. Tabela 2. # se refere à "distribuição de aminoácidosplanejada (designed)" descrita no texto.
[000204] Para construir a biblioteca TCL1, foramrealizadassucessivasrodadas de PCR para anexar o promotor Tac, desenvolverdegeneraçãodentro da alça F:G, e adicionarossítios de restriçãonecessários para a montagem final. Primeiro, umasequência DNA que contém a sequência de promotor e a sequênciaTencon 5’ da alça FG foigeradapor PCR em duas etapas. O DNA correspondendo à sequência de gene Tenconcompletafoiusadocomo um molde de PCR com osiniciadores POP2220 (SEQID NO: 2) e TC5’toFG (SEQID NO: 3). O produto de PCR resultantedestareaçãofoiusadocomo um molde para a rodadaseguinte de amplificaçãopor PCR com iniciadores de 130 meros (SEQID NO: 4) e Tc5’toFG para completar a anexação das sequências 5’ e de promotor aoTencon. A seguir, a diversidadefoiintroduzidanaalça F:G poramplificação do produto de DNA produzidonaprimeiraetapa com o iniciadordireto POP2222 (SEQID NO: 5), e iniciadores reversos TCF7 (SEQID NO: 6), TCF8 (SEQID NO: 7), TCF9 (SEQID NO: 8), TCF10 (SEQID NO: 9), TCF11 (SEQID NO: 10), ou TCF12 (SEQID NO: 11), que contémnucleotídeosdegenerados. Pelo menosoitoreações PCR em 100 µLforamrealizadas para minimizarosciclos de PCR e maximizar a diversidade da biblioteca. Pelo menos 5 µgdesteproduto de PCR forampurificadosem gel e usadosemumaetapa de PCR subsequente, com osiniciadores POP2222 (SEQ ID NO: 5) e POP2234 (SEQID NO: 12), resultandonaligação de umaetiqueta 6xHis e um sítio de restrição NotI naextremidade 3’ da sequênciaTencon. Esta reação PCR foirealizada com o uso de apenas quinze ciclos de PCR e de pelomenos 500 ng de DNA molde. O produto de PCR resultantefoipurificadoem gel, digerido com a enzima de restrição NotI, e purificado pela coluna Qiagen.
[000205] O fragmento 3’ da biblioteca é umasequência de DNA constante que contémelementos para "display" (expressão e exposição), que inclui um sítio de restriçãoPspOMI, a região de codificação do gene repA, e oselementos-cis e ori. As reações PCR foramrealizadas com o uso de um plasmídeo (pCR4Blunt) (Invitrogen) que contémestefragmento de DNA com iniciadoresDireto M13 e Reverso M13. Osprodutos de PCR resultantesforamdigeridosporPspOMI de um dia para outro e purificadosem gel. Para ligar a porção 5’ de DNA da bibliotecaao 3’ DNA que contém o gene repA, 2 pmols de 5’ DNA foramligados a umaquantidade molar igual de 3’ repA DNA napresença de enzimas NotI e PspOMI e T4 ligase. Após a ligação de um dia para outro a 37°C, umaporçãopequena do DNA ligadofoieluídaem um gel para checar a eficiência de ligação. O produto de bibliotecaligadofoidivididoem doze amplificaçõespor PCR e foirealizadaumareação PCR de 12 ciclos com o par de iniciadores POP2250 (SEQID NO: 13) e DidLigRev (SEQID NO: 14). O rendimento de DNA para cada sub-biblioteca de biblioteca TCL1 estevenafaixa de 32 µg a 34 µg.
[000206] Para avaliar a qualidade da biblioteca, umaporçãopequena da biblioteca de trabalhofoiamplificada com osiniciadores Tcon5new2 (SEQID NO: 15) e Tcon6 (SEQID NO: 16), e foiclonada, via clonagemindependente de ligase, em um vetorpETmodificado. O DNA plasmídeofoitransformado para dentro de célulascompetentes BL21- GOLD (DE3) (Stratagene) e 96 colôniasrandomicamenteselecionadasforamsequenciadas com o uso de um iniciador promotor T7. Nãoforamverificadassequênciasduplicadas. No total, aproximadamente 70% a 85% dos clones tiveramumasequência de codificaçãoTencon e promotor completasemmutação de mudança de fase de leitura. A taxa de sequênciafuncional, que excluios clones com códons STOP (de terminação), esteve entre 59% e 80%.
Construção de biblioteca TCL2
[000207] Foiconstruída a biblioteca TCL2 na qual ambas as alças BC e FG de Tenconforamrandomizadas e a distribuição de aminoácidosemcadaposiçãofoirigorosamentecontrolada. A Tabela 3 mostra a distribuição de aminoácidosemposições de alçadesejadasnabiblioteca TCL2. A distribuição de aminoácidosplanejada ("designed") tevedoisobjetivos. Primeiro, a bibliotecafoiviciada ("biased") para resíduos que forampreditoscomosendoestruturalmenteimportantes para o dobramento e a estabilidade de Tencon com base naanálise da estruturacristalina de Tencon e/ou a partir da modelagem de homologia. Por exemplo, a posição 29 foifixada para ser apenas um subconjunto de aminoácidoshidrofóbicos, porqueesteresíduofoiescondido no núcleohidrofóbico da dobra de Tencon. Uma segundacamada de planejamento ("design") incluiu a indução da distribuição de aminoácidos para aquela de resíduospreferencialmenteencontradosna HCDR3 de cadeiapesada de anticorpos, para eficientementeproduzirligantes de altaafinidade (Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007). Para esteobjetivo, a "distribuiçãoplanejada" ("designed") da Tabela 3 se refere à seguintedistribuição: 6% de alanina, 6% de arginina, 3,9% de asparagina, 7,5% de ácidoaspártico, 2,5% de ácidoglutâmico, 1,5% de glutamina, 15% de glicina, 2,3% de histidina, 2,5% de isoleucina, 5% de leucina, 1,5% de lisina, 2,5% de fenilalanina, 4% de prolina, 10% de serina, 4,5% de treonina, 4% de triptofano, 17,3% de tirosina, e 4% de valina. Esta distribuiçãoestáisenta de metionina, cisteína, e códons STOP (de terminação). Tabela 3. * a numeração de resíduo é baseadanasequênciaTencon da SEQ ID NO: 1
[000208] O fragmento 5’ da biblioteca TCL2 continha o promotor e a região de codificação de Tencon (SEQ ID NO: 1), que foiquimicamentesintetizadocomo um acervo de biblioteca (Sloning Biotechnology). Este acervo de DNA continhapelomenos 1 x 1011 de membrosdiferentes. Na extremidade do fragmento, foiincluído um sítio de restriçãoBsaI no planejamento ("design") para ligação a RepA.
[000209] O fragmento 3’ da bibliotecafoiumasequência de DNA constante que contémelementos para "display" (expressão e exposição), que incluiumaetiqueta 6xHis, a região de codificação do gene repA, e o elemento-cis. O DNA foiproduzido pela reação PCR com o uso de DNA moldeexistente (acima), e iniciadores LS1008 (SEQID NO: 17) e DidLigRev (SEQID NO: 14). Para montar a biblioteca TCL2 completa, um total de 1 µg de DNA de bibliotecaTencon 5' digerido com BsaIfoiligado a 3,5 µg do fragmento 3’ que foiproduzidopordigestão de restrição com a mesmaenzima. Após a ligação de um dia para outro, o DNA foipurificadoporcoluna Qiagen e o DNA foiquantificado pela medição de absorbância a 260 nm. O produto de bibliotecaligadofoiamplificadoporumareação PCR de 12 ciclos com o par de iniciadores POP2250 (SEQID NO: 13) e DidLigRev (SEQID NO: 14). UM total de 72 reaçõesfoirealizado, cadaumacontendo 50 ng de produtos de DNA ligadoscomo um molde. O rendimento total de DNA da biblioteca de trabalho TCL2 foicerca de 100 µg. Uma porçãopequena da biblioteca de trabalhofoisubclonada e sequenciada, conformedescritoacima para a biblioteca TCL1. Nãoforamverificadassequênciasduplicadas. Cerca de 80% das sequênciascontinhamsequências de codificaçãoTencon e de promotor completassemmutações de mudança de fase de leitura.
Construção de biblioteca TCL14
[000210] As alçassuperiores (BC, DE e FG) e as alçasinferiores (AB, CD e EF), porexemplo, as superfícies de ligaçãorelatadasnosdomínios de FN3, sãoseparadaspelasfitas-beta que formam o centro da estrutura de FN3. Superfíciesalternativasresidindonosdois "lados" dos domínios de FN3 tendo formatosdiferentes das superfíciesformadasapenaspelasalçassãoformadasem um lado do domínio de FN3 por duas fitas-beta antiparalelas, as fitas-beta C e F, e as alças CD e FG, e é denominada no presentedocumentocomo a superfície C-CD- F-FG.
[000211] Um biblioteca que randomizaumasuperfíciealternativa de Tenconfoigeradaporrandomização de resíduosexpostosnasuperfícieselecionados das fitas C e F, e também das porções das alças CD e FG conformemostradonaFigura 4. Uma variante de Tencon, Tencon27 (SEQ ID NO: 99) que tem as seguintessubstituiçõesquandocomparada com Tencon (SEQ ID NO: 1) foiusada para gerar a biblioteca; E11R,L17A,N46V,E86I. Uma descriçãocompleta dos métodosusados para construirestabiblioteca é descrita no pedido de patente US de n° de série 13/852.930.
Exemplo 2: Seleção de domínios de fibronectinatipo III (FN3) que se ligamao EGFR e inibem a ligaçãoao EGF Triagem de biblioteca
[000212] "Cis-display" foiusado para selecionarosdomínios que se ligamao EGFR das bibliotecas TCL1 e TCL2. Um domínioextracelularrecombinantehumano de EGFR fusionado a um Fc de IgG1 (R&D Systems) foibiotiniladousandométodospadrão e usado para isolamento e sequenciamento de clones individuais ("panning") (resíduos 25 a 645 de EGFR de comprimento total da SEQ ID NO: 73). Para transcrição e tradução in vitro (ITT, "in vitro transcription and translation"), 2 a 6 µg de DNA de bibliotecaforamincubados com 0,1 mM de aminoácidoscompletos, componentes de pré-mistura S30 X1, e 30 µL de extrato S30 (Promega) em um volume total de 100 µL e incubados a 30°C. Após 1 hora, 450 µL de solução de bloqueio (PBS pH 7,4, suplementado com 2% de albumina de sorobovino, 100 µg/mL de DNA de esperma de arenque, e 1 mg/mL de heparina) foramadicionados e a reaçãofoiincubadasobregelodurante 15 minutos. Oscomplexos de EGFR-Fc:EGFforammontadosemumarazão molar de 1:1 e 10:1 de EGFR emrelação a EGF pormisturação de EGF humaorecombinante (R&D Systems) com EGFR-Fc recombinantebiotiniladoemsolução de bloqueiodurante 1 hora à temperaturaambiente. Para ligação, 500 µL de reações de ITT bloqueadasforammisturados com 100µL de complexos de EGFR-Fc:EGF e incubadosdurante 1 hora à temperaturaambiente, após a qual oscomplexosligadosforamisolados ("pulled down") com microesferasmagnéticas de neutravidinaouestreptavidina (Seradyne). Osmembros da bibliotecanãoligadosforamremovidosporlavagenssucessivas com PBST e PBS. Após a lavagem, o DNA foieluído dos complexosligadosporaquecimento para 65°C durante 10 minutos, amplificadopor PCR, e ligado a um fragmento de DNA que codifica RepA por digestão de restrição e ligação para rodadasadicionais de isolamento e sequenciamento de clones individuais ("panning"). Osligantes de afinidadealtaforamisoladosporabaixamentosucessivo da concentração de EGFR-Fc alvodurantecadarodadadesde 200 nMaté 50 nM e aumento da estringência de lavagem. Nas rodadas 4 e 5, osdomínios de FN3 nãoligadosoufracamenteligadosforamremovidosporlavagemnapresença de um excesso molar de 10 vezes de EGFR-Fc nãobiotinilado de um dia para outro em PBS.
[000213] Após o isolamento e sequenciamento de clones individuais ("panning"), osdomínios de FN3 foramamplificadospor PCR com o uso de oligos Tcon5new2 (SEQID NO: 15) e Tcon6 (SEQID NO: 16), subclonadosem um vetorpETmodificado para incluir um sítio de clonagemindependente de ligase, e transformados para dentro de células BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) para expressãosolúvelem E. coli com o uso de técnicas de biologia molecular padrão. Uma sequência de gene que codificaumaetiqueta de poli-histidina C- terminal foiadicionada a cadadomínio de FN3 para permitir a purificação e a detecção. As culturasforamcrescidas para umadensidadeóptica de 0,6-0,8 em um meio 2YT suplementado com 100 µg/mL de carbenicilinaemblocos de 96 poços de 1 mL a 37°C antes da adição de IPTG para 1mM, emcujoponto a temperaturafoireduzida para 30°C. As célulasforamcolhidasaproximadamente 16 horas maistardeporcentrifugação e congeladas a -20°C. A lisecelularfoirealizadaporincubação de cadapéleteem 0,6 mL de agentetamponante de liseBugBuster® H (Novagen EMD Biosciences) com agitação à temperaturaambientedurante 45 minutos.
Seleção de domínios de FN3 que se ligamao EGFR sobrecélulas
[000214] Para avaliar a capacidade de diferentesdomínios de FN3 para se ligaremao EGFR em um contextomaisfisiológico, foimedida a capacidade deles para se ligaremàscélulas A431. As células A431 (American Type Culture Collection, n° de catálogo CRL-1555) superexpressam EGFR com ~2 x 106 receptoresporcélula. As célulasforamplaqueadas a 5.000/poçoemplacas de 96 poçospretasopacas e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C, sob umaatmosfera com 5% de CO2 umidificada. Oslisadosbacterianos que expressam o domínio de FN3 foramdiluídos 1.000 vezes para dentro de agentetamponante de coloração para FACS (Becton Dickinson) e incubadosdurante 1 hora à temperaturaambienteemplacasemtriplicata. Oslisadosforamremovidos e as célulasforamlavadas 3 vezes com 150µL/poço de agentetamponante de coloração para FACS. As célulasforamincubadas com 50 µL/poço de anticorpo anti- penta-His conjugado com Alexa488 (Qiagen) diluídas 1:100 emagentetamponante de coloração para FACS durante 20 minutos à temperaturaambiente. As célulasforamlavadas 3 vezes com 150 µL/poço de agentetamponante de coloração para FACS, após o qual ospoçosforamcheios com 100 µL de agentetamponante de coloração para FACS e lidos para fluorescência a 488 nm com o uso de umaleitora Acumen eX3. Oslisadosbacterianoscontendoosdomínios de FN3 foramtriados para a capacidade deles para se ligaremàscélulas A431(1.320 lisadosbacterianosbrutos para as bibliotecas TCL1 e TCL2) e 516 clones positivosforamidentificados, se a ligaçãofoi>10 vezesacima do sinal de fundo. 300 Lisados da biblioteca TCL14 foramtriados (detectados) para ligação, resultandoem 58 sequências de domínio de FN3 peculiares que se ligamao EGFR.
Seleção de domínios de FN3 que inibem a ligação de EGF ao EGFR sobrecélulas
[000215] Para melhorcaracterizar o mecanismo de ligaçãoao EGFR, a capacidade de vários clones de domínio de FN3 identificados para se ligaremao EGFR emumamaneiracompetitiva com EGF foi medida com o uso de células A431 e realizadaemparalelo com o ensaio de identificação de ligação a A431. As células A431 foramplaqueadas a 5.000/poçoemplacas de 96 poçospretasopacas e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C, sob umaatmosfera com 5% de CO2 umidificada. As célulasforamincubadas com 50µL/poço de lisadobacterianodiluído 1:1.000 durante 1 hora à temperaturaemplacasemtriplicata. EGF Biotinilado (Invitrogen, n° de catálogo E-3477) foiadicionado a cadapoço para darumaconcentração final de 30 ng/mL e incubadodurante 10 minutos à temperaturaam-biente.Ascélulasforamlavadas3 vezes com 150 µL/poçode agentetamponantede coloração para FACS. As célulasforamincubadas com 50 µL/poço de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Invitrogen) di-luídas 1:100 emagentetamponantede coloraçãopara FACSdurante20 minutos à temperaturaambiente.Ascélulasforamlavadas3 vezes com 150 µL/poço de agentetamponante de coloração para FACS, após o qual ospoçosforamcheios com 100 µL de agentetamponante de coloração para FACS e lidos para fluorescência a 600 nm com o uso de umaleitora Acumen eX3.
[000216] Oslisadosbacterianoscontendoosdomínios de FN3 foramtriados (detectados) no ensaio de competição com EGF descritoacima. 1.320 Lisadosbacterianosbrutos das bibliotecas TCL1 e TCL2 foramtriados (detectados) resultandoem 451 clones positivos que inibiram a ligaçãoao EGF em> 50%.
Expressão e purificação de domínios de FN3 identificados que se ligamao EGFR
[000217] Osdomínios de FN3 etiquetados com His forampurificados dos lisados de E. coli clarificados com placas His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) e eluídos com agentetamponantecontendo 20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio, e 250 mM de imidazol em pH 7,4. As amostraspurificadasforamtransferidas para PBS de pH 7,4 para análise com o uso de placas PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare).
Análise via cromatografiaporexclusão de tamanho
[000218] Foiusada a cromatografiaporexclusão de tamanho para avaliar o estado de agregação dos domínios de FN3 que se ligamao EGFR. Alíquotas (10 µL) de cadadomínio de FN3 purificadoforaminjetadasemumacolunaSuperdex 75 5/150 (GE Healthcare) a uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min com umafasemóvel de PBS de pH 7,4. A eluição da colunafoimonitoradaporabsorbância a 280 nm. Centirinas que apresentaramníveis altos de agregaçãopor SEC (cromatografiaporexclusão de tamanho) foramexcluídas de análiseadicional.
Taxa de dissociação de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR selecionados do EGFR-Fc
[000219] Osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR selecionadosforamtriados (detectados)paraidentificaraquelescom taxasde dissociaçãolentas (koff) naligaçãoao EGFR-Fc em um instrumentoProteOn XPR-36 (Bio-Rad)parafacilitar aseleçãode ligantesde afinidadealta. IgG de cabra anti-Fc de humano (R&D Systems), a umaconcentração de 5 µg/mL, foidiretamenteimobilizada via acoplamentoporamina (em pH 5,0) emtodosos 6 canaisligantesemorientação horizontal sobre a pastilha ("chip") com uma taxa de fluxo de 30 µL/min em PBS contendo 0,005% de Tween-20. As densidades de imobilizaçãoforamemmédiacerca de 1.500 Unidades de Resposta (UR) com variaçãomenor que 5% dentreoscanaisdiferentes. EGFR- Fc foicapturadosobre a superfície de IgG anti-Fc de humanoemumadensidade de cerca de 600 UR emorientação vertical de ligante. Todos osdomínios de FN3 testadosforamnormalizados para umaconcentração de 1 µM e testados para a ligação deles emorientação horizontal. Todos os 6 canais de analitoforamusados para os domínios de FN3 para maximizar a produtividade de triagem (detecção). A fase de dissociaçãofoimonitoradadurante 10 minutosemuma taxa de fluxo de 100 µL/min. Ossinais de ligação inter- manchasforamusadoscomoreferências para monitorar a ligaçãonãoespecífica entre osanalitos e a superfície com IgG imobilizada, e foramsubtraídos de todas as respostas de ligação. Os dados de ligaçãoprocessadosforamlocalmenteajustados para um modelo de ligação de Langmuir simples de 1:1 para extrairkoff para cadadomínio de FN3 que se ligaao EGFR-Fc capturado.
Inibição de fosforilação de EGFR estimuladapor EGF
[000220] Osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR purificadosforamtestados para a capacidade deles para inibirem a fosforilação de EGFR estimuladapor EGF emcélulas A431 emumaconcentraçãoúnica. A fosforilação de EGFR foimonitorada com o uso do kit "EGFR phospho(Tyr1173)" (Meso Scale Discovery). As célulasforampla- queadas a 20.000/poçoemplacas de 96 poçostransparentes (Nunc) tratadas para cultura de tecidoem 100 µL/poço de meio RPMI (Gibco) contendoGlutaMAX™ com 10% de soro fetal bovino (FBS, "Fetal Bovine Serum") (Gibco) e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C sob umaatmosfera de 5% de CO2 umidificada. O meio de culturafoiremovidocompletamente e as célulasforamprivadas de alimento de um dia para outro em 100 µL/poço de meionãocontendo FBS a 37°C sob umaatmosfera com 5% de CO2 umidificada. As célulasforamentãotratadas com 100 µL/poço de meio de privação de alimentopreaquecido (37°C) contendoosdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR emumaconcentração de 2 µMdurante 1 hora a 37°C sob umaatmosfera com 5% de CO2 umidificada. Oscontrolesforamtratados com apenas o meio de privação de alimento. As célulasforamestimuladaspelasadição e misturação suave de 100 µL/poço de meio de privação de alimentopreaquecido (37°C) contendo 100 ng/mL de EGF recombinante de humano (R&D Systems, n° de catálogo 236- EG), para concentraçõesfinais de 50 ng/mL de EGF e 1 µM de domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR, e incubação a 37°C, 5% de CO2 durante 15 minutos. Um conjunto de poços de controlefoideixadonãoestimuladocomocontrolesnegativos. O meiofoicompletamenteremovido e as célulasforamlisadas com 100 µL/poço de AgenteTamponante de Lise Completo ("Complete Lysis Buffer") (Meso Scale Discovery) durante 10 minutos à temperaturaambiente com agitação, conforme as instruções do fabricante. As placas de ensaioconfiguradas para medir o EGFR fosforiladonatirosina 1173 (Meso Scale Discovery) forambloqueadas com a solução de bloqueiofornecidaconforme as instruções do fabricante à temperaturaambientedurante 1,5 horas a 2 horas. As placasforamlavadas 4 vezes com 200 µL/poço de AgenteTamponante de Lavagem Tris 1X ("1X Tris Wash Buffer") (Meso Scale Discovery). Alíquotas de lisado de células (30 µL/poço) foramtransferidas para as placas de ensaio, que foramcobertas com filme de vedação de placa (VWR) e incubadas à temperaturaambiente com agitaçãodurante 1 hora. As placas de ensaioforamlavadas 4 vezes com 200 µL/poço de AgenteTamponante de Lavagem Tris, após as quais 25 µL de Solução de Detecção de Anticorpo gelada ("Detection Antibody Solution") (Meso Scale Discovery) foramadicionados a cadapoço, tendo o cuidado para nãointroduzirbolhas. As placasforamincubadas à temperaturaambiente com agitaçãodurante 1 hora, seguidapor 4 lavagens com 200 µL/poço de AgenteTamponante de Lavagem Tris. Ossinaisforamdetectados pela adição de 150 µL/poço de AgenteTamponante para Leitura ("Read Buffer") (Meso Scale Discovery) e pela leituraem um instrumento SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) com o uso das configuraçõespadrãoespecíficas para ensaioinstaladaspelofabricante. A inibição percentual do sinal de controlepositivo estimuladopor EGF foicalculada para cadadomínio de FN3 de ligaçãoao EGFRP.
[000221] A inibição de fosforilação de EGFR estimuladapor EGF foimedida para 232 clones identificados das bibliotecas TCL1 e TCL2. Destes clones, 22 inibiram a fosforilação de EGFR em>50% naconcentração de 1 µM. Após a remoção dos clones que querexpressavaminsatisfatoriamentequerforamjulgadosmultiméricos pela cromatografia de exclusãoportamanho, nove clones foramconduzidosadiante para a caracterizaçãobiológicaadicional. As sequências das alças BC e FG destes clones sãomostradasnaTabela 4. Oito dos nove clones selecionadostiveramumasequência de alça FG comum (HNVYKDTNMRGL; SEQ ID NO: 95) e áreas de similaridadesignificativaforam vistas entre vários clones nassequências de alça BC deles. Tabela 4.
Exemplo 3: Caracterização de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR que inibem a ligaçãoao EGF Expressãoemgrandeescala, purificação, e remoção de endotoxinas
[000222] Os 9 domínios de FN3 mostradosnaTabela 4 foramaumentadosemescala para fornecermais material para caracterizaçãodetalhada. Uma cultura de um dia para outro de cadavariante de domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR foiusada para inocular 0,8 L de meio de caldo Terrific suplementado com 100 µg/mL de ampicilinaemumadiluição de 1/80 de cultura de um dia para outro para dentro de meio novo, e incubada com agitação a 37°C. A culturafoiinduzidaquando a densidadeóptica a 600 nm alcançou ~1,2 a 1,5 pela adição de IPTG para umaconcentração final de 1 mM e a temperaturafoireduzida para 30°C. Após 4 horas, as célulasforamcolhidasporcentrifugação e o pélete de célulasfoiarmazenado a -80°C até ser necessário.
[000223] Para a lise das células, o péletedescongeladofoiressuspensoem 1X BugBuster® suplementado com 25 U/mL de Benzonase® (Sigma-Aldrich) e 1 kU/mL de rLysozyme™ (Novagen EMD Biosciences) a umarazão de 5 mL de BugBuster® por grama de pélete. A liseprocedeudurante 1 hora à temperaturaambiente com agitação suave, seguidaporcentrifugação a 56.000 x g durante 50 minutos a 4°C. O sobrenadantefoicolhido e filtradoatravés de um filtro de 0,2 µm, entãofoicarregadoemumacolunaHisTrap FF de 5 mL pré-equilibrada com AgenteTamponante A (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM) com o uso de um sistema de cromatografia GE Healthcare ÃKTAexplorer 100s. A colunafoilavada com 20 volumes de coluna de AgenteTamponante A e adicionalmentelavada com 6 volumes de coluna de 16% de AgenteTamponante B (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM). Osdomínios de FN3 forameluídos com 10 volumes de coluna com 50% de B, seguidopor um gradiente de 50% a 100% de B com 6 volumes de coluna. As fraçõescontendo a proteínadomínio de FN3 foramreunidas, concentradas com o uso de um concentrador Millipore 10K MWCO, e filtradas antes do carregamento para umacolunaHiLoad™ 16/60 Superdex™ 75 (GE Healthcare) pré- equilibrada com PBS. O pico de proteínamonoméricaeluindo da colunaporexclusão de tamanhofoiretido.
[000224] As endotoxinasforamremovidas com o uso de umaabordagemembatelada com a resina ActiCleanEtox (SterogeneBioseparations). Antes da remoção das endotoxinas, a resina foipré- tratada com NaOH 1 N durante 2 horas a 37°C (ou de um dia para outro a 4°C) e lavadaextensivamente com PBS até que o pH tivesse se estabilizadoem ~7 conformemedido com um papelindicador de pH. A proteínapurificadafoifiltradaatravés de um filtro de 0,2 µm antes da adição a 1 mL de resina Etoxemumarazão de 10 mL de proteína para 1mL de resina. A ligação de endotoxina à resina foipermitidaproceder à temperaturaambientedurantepelomenos 2 horas com rotação suave. A resina foiremovidaporcentrifugação a 500 x g durante 2 minutos e o sobrenadante de proteínafoiretido. Osteores de endotoxinasforammedidos com o uso de cartuchosEndoSafe®-PTS™ e analisadosemumaleitoraEndoSafe®-MCS (Charles River). Se osteores de endotoxinasestivessemacima de 5 EU/mg após o primeirotratamento com a resina Etox, o procedimentoacimafoirepetidoaté que osteores de endotoxinasfossemdecrescidos para <5 EU/mg. Nos casosnosquais o teor de endotoxinasestavaacima de 5 EU/mg e estabilizadoapósdoistratamentosconsecutivos com a resina Etox, foramestabelecidas, para a proteína, condições de cromatografia de interaçãohidrofóbicaou de troca de ânions para remover as endotoxinasrestantes.
Determinação de afinidadepor EGFR-Fc (afinidadepor EGFR-Fc) de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR selecionados
[000225] A afinidade de ligaçãopordomínioextracelular de EGFR recombinante dos domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR selecionadosfoiadicionalmentecaracterizadapormétodos de ressonância de Plasmon de superfície com o uso de um InstrumentoProteon (BioRad). A configuração de ensaio (preparação da pastilha ("chip"), captura de EGFR-Fc) foi similar àqueladescritaacima para a análise de dissociação. Osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR selecionadosforamtestadosemconcentração de 1 µMemsérie de diluição de 3 vezesnaorientação horizontal. Uma amostra de agente tamponantefoiinjetada para monitorar a estabilidade da linha base. A fase de dissociação para todas as concentrações de cadadomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR foimonitoradaemuma taxa de fluxo de 100 µL/min durante 30 minutos (para aqueles com koff ~10-2 s-1 a partir da detecção de dissociação), oudurante 1 hora (para aqueles com koff ~10-3 s-1 oumaislento).Doisconjuntosde dados dereferência foramsubtraídos dosdadosderesposta:1) ossinaisde inter- manchas para corrigir para as interaçõesnãoespecíficas entre o domínio de FN3 deligaçãoaoEGFR ea superfíciecom IgG imobilizada; 2) ossinais de canais de agentetamponante para corrigir para o desvio de linha base devido à dissociação da superfície com EGFR-Fc capturado no decorrer do tempo. Os dados de ligaçãoprocessadosemtodas as concentrações para cadadomínio de FN3 foramglobalmenteajustados para um modelo de ligação de Langmuir simples 1:1 para extrairestimativas das constantescinéticas (kon, koff) e de afinidade (KD). A Tabela 5 mostra as constantescinéticas para cada um dos constructos, com a afinidadenafaixa de 200 pM a 9,6 nM.
Ligação de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR selecionadosao EGFR sobrecélulas (ensaio de ligaçãosobrecélula A431)
[000226] As células A431 foramplaqueadas a 5.000/poçoemplacas de 96 poçospretasopacas e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C, sob umaatmosfera com 5% de CO2 umidificada. Osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR purificados (1,5 nM a 30 µM) foramadicionadosàscélulas (em 50 µL) durante 1 hora à temperaturaambienteemplacasemtriplicata. O sobrenadantefoiremovido e as célulasforamlavadas 3 vezes com 150 µL/poço de agentetamponante de coloração para FACS. As célulasforamincubadas com 50 µL/poço de conjugado de anticorpo anti-penta-His-Alexa488 (Qiagen) diluídas 1:100 emagente tamponante de coloração para FACS durante 20 minutos à temperaturaambiente. As célulasforamlavadas 3 vezes com 150 µL/poço de agentetamponante de coloração para FACS, após o qual ospoçosforamcheios com 100 µL de agentetamponante de coloração para FACS e lidos para fluorescência a 488 nm com o uso de umaleitora Acumen eX3. Os dados foramplotadoscomo o sinal de fluorescênciabrutoemfunção do logaritmo da concentração molar de domínio de FN3 e ajustados para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4" (GraphPad Software) para calcularosvalores de EC50. A Tabela 5 relata a EC50 para cada um dos constructosnafaixa de 2,2 µM a > 20 µM.
Inibição de ligação de EGF ao EGFR sobrecélulas com o uso de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR selecionados (ensaio de competição entre EGF e células A431)
[000227] As células A431 foramplaqueadas a 5.000/poçoemplacas de 96 poçospretasopacas e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C, sob umaatmosfera com 5% de CO2 umidificada. Osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR purificados (1,5 nM a 30 µM) foramadicionadosàscélulas (em 50 µL/poço) durante 1 hora à temperaturaambienteemplacasemtriplicata. EGF Biotinilado (Invitrogen, n° de catálogo E-3477) foiadicionado a cadapoço para darumaconcentração final de 30 ng/mL e incubadodurante 10 minutos à temperaturaambiente. As célulasforamlavadas 3 vezes com 150 µL/poço de agentetamponante de coloração para FACS. As célulasforamincubadas com 50 µL/poço de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Invitrogen) diluídas 1:100 emagentetamponante de coloração para FACS durante 20 minutos à temperaturaambiente. As célulasforamlavadas 3 vezes com 150 µL/poço de agentetamponante de coloração para FACS, após o qual ospoçosforamcheios com 100 µL de agentetamponante de coloração para FACS e lidos para fluorescência a 600 nm com o uso de umaleitora Acumen eX3. Os dados foramplotadoscomo o sinal de fluorescênciabrutoemfunção do logaritmo da concentração molar de domínio de FN3 e ajustados para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4" (GraphPad Software) para calcularosvalores de IC50. A Tabela 5 relata osvalores de IC50 nafaixa de 1,8 µM a 121 µM.
Inibição de fosforilação de EGFR estimuladapor EGF (ensaio de fosfo-EGRF)
[000228] Domínios de FN3 selecionados que significativamenteinibiram a fosforilação de EGFR estimuladapor EGF foramavaliadosmaiscompletamente pela medição dos valores de IC50 para inibição. A inibição de fosforilação de EGFR estimuladapor EGF foiavaliadaemconcentraçõesdiferentes de domínio de FN3 (0,5 nM a 10 µM) conformedescritoacimaem "inibição de fosforilação de EGFR estimuladapor EGF". Os dados foramplotadoscomo o sinal de eletroquimioluminescênciaemfunção do logaritmo da concentração molar de domínio de FN3 e osvalores de IC50 foramdeterminadospeloajuste dos dados para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4" (GraphPad Software). A Tabela 5 relata osvalores de IC50 nafaixa de 18 nM a >2,5 µM.
Inibição de crescimento de célulastumoraishumanas (ensaio de crescimento de NCI-H292 e de crescimento de NCI-H322)
[000229] A inibição de crescimento de célulasdependente de EGFR foiavaliada pela medição da viabilidade de linhagens de célulastumorais que superexpressam EGFR, NCI-H292 e NCI-H322 (American Type Culture Collection, n°s de catálogo CRL-1848 & CRL- 5806, respectivamente), após a exposiçãoaosdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR. As célulasforamplaqueadas a 500 células/poço (NCI-H292) ou a 1.000 células/poço (NCI-H322) emplacas de 96 poçosbrancasopacas (Nunc) tratadas para cultura de tecidoem 100 µL/poço de meio RPMI (Gibco) contendoGlutaMAX™ e 10 mM de HEPES, suplementado com 10% de soro fetal bovinoinativadoporcalor (Gibco) e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C sob umaatmosfera de 5% CO2 umidificada. As célulasforamtratadas pela adição de 5 µL/poço de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendoumafaixa de concentrações de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR. Oscontrolesforamtratados com 5 µL/poço de PBS apenasou 25 mM de ácidoetilenodiaminotetraacéticoem PBS. As célulasforamincubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 120 horas. As célulasviáveisforamdetectadas pela adição de 75 µL/poço de reagenteCellTiter-Glo® (Promega), seguidapormisturaçãosobre um agitador de placasdurante 2 minutos, e incubação no escuro à temperaturaambientedurantemais 10 minutos. As placasforamlidasemumaleitora de placaSpectraMax M5 (Molecular Devices) configurada para o modo de luminescência, com um tempo de leitura de 0,5 segundo/poço contra um brancocomomeioapenas. Os dados foramplotadoscomoumaporcentagem de crescimento de célulastratadas com PBS emfunção do logaritmo de concentração molar de domínio de FN3. Osvalores de IC50 foramdeterminadospeloajuste dos dados à equação para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4" (GraphPad Software). A Tabela 5 mostraosvalores de IC50 nasfaixas de 5,9 nM a 1,15 µM e 9,2 nM a > 3,1 µM, com o uso das células NCI-H292 e NCI-H322 respectivamente. A Tabela 5 mostra o sumáriodepropriedadesbiológicas de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR para cadaensaio. Tabela 5.
Exemplo 4: Modificação de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR
[000230] Um subconjunto de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR foimodificado para aumentar a estabilidadeconformacional de cadamolécula. As mutações L17A, N46V, e E86I (descritasnapublicação de patente US n° 2011/0274623) foramincorporadasaos clones P54AR4-83,P54CR4-31, e P54AR4-37 porsíntese de DNA. Os mutantesnovos, P54AR4-83v2, P54CR431-v2, e P54AR4-37v2 foramexpressados e purificadosconformedescritoacima. Calorimetriadiferencial de varreduraem PBS foiusada para avaliar a estabilidade de cadamutante com a finalidade de compará-la com aquela da molécula parental correspondente. A Tabela 6 mostra que cada clone foisignificativamenteestabilizado, com um aumentomédiona Tm de 18,5°C. Tabela 6.
Exemplo 5: Modificação com cisteína e conjugaçãoquímica de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR
[000231] Osmutantescontendocisteína dos domínios de FN3 sãoproduzidos a partir de moléculaTencon base e as variantes da mesma que nãotêmresíduos de cisteína. Estasmutaçõespodem ser realizadas com o uso de técnicas de biologia molecular padrãoconhecidasnatécnica para incorporar um resíduo de cisteínaúniconasequênciaTencon base (SEQ ID NO: 1) ouem outros domínios de FN3 com a finalidade de serviremcomo um sítio para conjugaçãoquímica de fármacos de moléculapequena, etiquetasfluorescentes, poli(glicoletilênico), ouqualquernúmero de outrasentidadesquímicas. O sítio de mutação a ser selecionadodeveatender a determinadoscritérios. Por exemplo, a moléculaTenconmutada para conter a cisteína livre deve: (i) ser elevadamenteexpressadaem E. coli, (ii) manter um nível alto de solubilidade e de estabilidadetérmica, e (iii), manterligaçãoaoantígeno-alvomedianteconjugação. Visto que oarcabouçoTencon é de apenas ~90 a 95 aminoácidos, variantes com cisteínaúnicapodem ser facilmenteconstruídasemcadaposição do arcabouço para rigorosamentedeterminar a posição ideal (as posiçõesideais) para a conjugaçãoquímica.
[000232] Cadaresíduo individual de aminoácido , das posições 1 a 95 (ou 2 a 96 quando a metionina N-terminal estiverpresente) do mutante P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), que se ligaao EGFR, foimutado para cisteína para avaliarosmelhoressítios para conjugaçãoquímica.
Construção, expressão e purificação
[000233] A sequência de aminoácidos de cadavariantecontendocisteína individual de P54AR4-83v2 foireversamentetraduzidaemsequências de ácidonucleico que codificam as proteínas com o uso de códonspreferenciais para a expressãoem E. coli e um gene sintéticofoiproduzido (DNA 2.0). Estes genes foramclonadosem um vetor pJexpress401 (DNA 2.0) para a expressãoconduzidaporumasequência de promotor T5 e transformadosem cepa E. coli BL21 (Agilent). A biblioteca P54AR4-83v2 "cys scan" foifornecidacomo estoques emgliceroldispostosemumaplaca de 96 poços e a expressão e a purificação de cadaseguiu o mesmoprocedimentodescrito no Exemplo 2.
Conjugaçãoquímica
[000234] Para a biblioteca P54AR4-83v2 "cys scan", a conjugaçãofoiintegradaaoprocesso de purificação. As variantescontendocisteínaemlisadoclarificadoforamligadas à resina Ni-NTA no formato de 96 poços com o uso de placas His-trap HP (n° de catálogo 28-4008-29, GE Healthcare) pela adição do lisadoaospoços e centrifugação a 100 x g durante 5 min. A resina foilavada 3 vezes com agentetamponante A, e então N-etilmaleimida (NEM) foiadicionadacomo 500 µL de umasolução 1,5 mM.Apósuma hora de incubação à temperaturaambienteem um agitador de eixogiratório (tipo "rotisserie"), o excesso NEM foiremovidoporcentrifugação e trêslavagens com agentetamponante A. As variantes com cisteínaconjugadasforameluídas com 2 x 150 µL de agentetamponanteB etransferidas para PBS com "MultiScreen Filter Plates" com membrana Ultracel-10 (n° de catálogo MAUF1010, Millipore) ou com placas PD MultiTrap de 96 poços (n° de catálogo 28-9180-06, GE Healthcare). Osconjugadosforamcaracterizadosporespectrômetro de massa (Tabela 7). As variantescontendocisteína que expressaraminsatisfatoriamente (menos que 0,1 mg de proteínaobtida de umacultura de 5 mL ounenhumaproteínadetectadaporespectrometria de massa) ouconjugaraminsatisfatoriamente à NEM (menos que 80% conjugado, conformedeterminadoporespectrometria de massa) foramexcluídas de análiseadicional. Isto eliminou L1C, W21C, Q36C, E37C, A44C, D57C, L61C, Y67C, e F92C devido à expressãoinsatisfatória e A17C, L19C, I33C, Y35C, Y56C, L58C, T65C, V69C, I71C, e T94C devido à baixaeficiência de conjugação. Tabela 7.xCromatografiaanalíticaporexclusão de tamanho
[000235] A cromatografiaporexclusão de tamanho de cadauma das variantescontendocisteínaconjugada à NEM de P54AR4-83v2 foirealizadaconformedescrito no Exemplo 2. A Tabela 8 resume osresultados. A porcentagem de monômeroemcadaproteínafoideterminada pela integração do sinal de Abs280 e porcomparação do piconaregião de monômero (5,5 a 6 minutos) com ospicosnaregião de oligômero (4 a 5,3 minutos). Tabela 8x
Ensaio de ligaçãoao EGFR
[000236] A afinidade de ligaçãorelativapor EGFR das variantes contendocisteínaconjugada à NEM de P54AR4-83v2 foirealizada conformedescrito no Exemplo 2. A Tabela 9 resume os dados que mostram as razões de afinidade de ligaçãopor EGFR de cadavariantecontendocisteínaemrelação à proteína parental P54AR4-83v2. Osconjugados de cisteína que tiveramligaçãoreduzidaao EGFR (<65% do sinalobservado com a proteína parental P54AR4-83v2 quandotratados com 10 nM de proteína) conformedeterminadapeloensaio ELISA foramexcluídos de análiseadicional: P2C, A3C, P4C, K5C, L7C, D23C, W25C, F27C, Y28C, F31C, S55C, G73C, H75C, V77C, Y78C, T81C, N82C, M83C, e G85C. Tabela 9
Estabilidadetérmica
[000237] A estabilidadetérmica dos conjugados de cisteína-NEM foiavaliadaporcalorimetriadiferencial de varredura (CDV, DSC "Differential Scanning Calorimetry"). Osúnicosconjugadostestadosforamaqueles que foramdeterminadosemexpressarteores altos, conjugar de modo eficiente, e manter a ligaçãoao EGFR. Adicionalmente, as variantescontendocisteínadentro das alças BC e FG foramexcluídas. Os dados de estabilidadeforamgeradosporaquecimento de um alíquota de 400 µL da variante de 25°C até 100°C emumavelocidade de varredura de 1°C porminutoem um instrumento VP-DSC (MicroCal). Uma segundavarreduraidênticafoicompletadanaamostra com a finalidade de avaliar a reversibilidade do dobramento/desdobramentotérmico. Os dados foramajustados a um modelo de desdobramento de 2 estados com a finalidade de calcular a temperatura de fusão (Tabela 10). As variantescontendoCys com temperaturas de fusãoreduzidas (<63°C, ou>8°C abaixo da proteína parental P54AR4-83v2) ou que demonstraramdesdobramentoirreversívelforamexcluídas de análiseadicional: V9C, V12C, T13C, R18C, E29C, E39C, G42C, V49C, P50C, G51C, P63C. Tabela 10
Ensaio de citotoxicidade
[000238] As variantescontendocisteína de P54AR4-83v2 foramconjugadasaoinibidor de tubulinacitotóxicomonometil-auristatina F (MMAF) via um conector ("linker") Val-Cit clivávelporenzimaou um conector ("linker") PEG4 nãoclivável (VC-MMAF; consulte a Figura 2) com o uso da metodologiadescrita para a conjugação à NEM. As 32 variantes que permaneceramapós as exclusõesnasetapaspréviasforamconjugadasjuntamente com a proteína parental P54AR4-83v2 (SEQ ID NOS: 217 e 255 e Tencon (SEQ ID NO: 265) como um controlenegativo.
[000239] O extermínio de célulasfoiavaliado pela medição da viabilidade da linhagem de célulastumorais H1573 que superexpressa EGFR após a exposiçãoaosconjugados de variante-contendo-cisteína - citotoxina. As célulasforamplaqueadasemplacas de poçospretos, de fundotransparente, tratadas para cultura de tecido (Falcon 353219) a 7.000/poçoem 100 µL/poço de meio RPMI isento de vermelho de fenol (Gibco 11835-030) com 5% de soro fetal bovino (Gibco). As célulasforampermitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C sob umaatmosfera com 5% de CO2 umidificada. O meiofoiaspirado da placa de 96 poços e as célulasforamtratadas com 50 µL de meio novo e 50µL de inibidor 2X preparado no meio novo. A viabilidade das célulasfoideterminadapor um ensaio de ponto final com Cell TiterGlo (Promega) a 70 horas. Osvalores de IC50 foramdeterminadospeloajuste dos dados à equação para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). A Tabela 11 relata osvalores de IC50 obtidos da análise dos dados de CellTiter Glo. A IC50 média de duas réplicas do conjugado 83v2-cys/vcMMAFfoi 0,7 nM. Quatro dos 32 conjugadostestadostiveramvalores de IC50 maiores que duas vezesaquele da proteína parental (acima de 1,4 nM) e foramrejeitados: L32C, T68C, Y72C, e V74C. Adicionalmente, trêsconjugadostiveramvalores de IC50 acima de duas vezesmaispotentes que aquele da proteína parental e podem ser especialmenteadequados para formação de conjugados de fármaco: N6C, E53C e T93C. Tabela 11
Variantes com cisteínafinais
[000240] Das 96 posiçõestestadas, foiverificado que 28 das variantes com cisteínaatendemaoscritérios de retenção de alto nível de expressãoem E. coli, conjugaçãoeficiente via a química de tiol- maleimida, retenção de ligaçãoaoantígeno-alvo EGFR, retenção de termoestabilidade e propriedades de desdobramentoreversível, e retenção de extermínio de células com altaexpressão de EGFR quando a variantecontendocisteína é conjugada a um fármacocitotóxico. Estasposiçõessão: N6C (SEQ ID NOS: 210 e 248), V8C (SEQIDNOS:189e227),S10C(SEQIDNOS:190e228),E11C (SEQIDNOS:191e229),E14C(SEQIDNOS:192e230),D15C (SEQIDNOS:193e231),S16C(SEQIDNOS:194e232),S20C (SEQIDNOS:195e233),S30C(SEQIDNOS:196e234),Q34C (SEQIDNOS:197e235),S38C(SEQIDNOS:198e236),K40C (SEQ ID NOS: 199 e 237), V41C (SEQ ID NOS: 200 e 238), I45C (SEQIDNOS:201e239),L47C(SEQIDNOS:202e240),T48C (SEQIDNOS:203e241),E53C(SEQIDNOS:204e242),R54C (SEQIDNOS:205e243),T59C(SEQIDNOS:206e244),G60C (SEQ ID NOS: 207 e 245), K62C (SEQ ID S 208 e 246), G64C (SEQ ID NOS: 209 e 247), T68C (SEQ ID NOS: 210 e 248), S70C (SEQ ID NOS: 211 e 249), L88C (SEQ ID NOS: 212 e 250), S89C (SEQ ID NOS: 213 e 251), A90C (SEQ ID NOS: 214 e 252), I91C (SEQ ID NOS: 215 e 253), e T93C (SEQ ID NOS: 216 e 254). As localizaçõesdestas 28 posiçõesdentro da estrutura da proteína 83v2 sãomostradasnaFigura 3.
6: Seleção de domínios de fibronectinatipo III (FN3) que se ligam a c-Met e inibem a ligaçãoao HGF Isolamento e sequenciamento de clones individuais ("panning") em c- Met de humano
[000241] A biblioteca TCL14 foitriadaemfunção de domínioextracelular de c-Met biotinilada (bt-c-Met) de humano para identificardomínios de FN3 capazes de especificamente se ligarem a c-Met. Para seleções, 3 µg de biblioteca de TCL14 foramtranscritos e traduzidos in vitro (IVTT) emExtrato Linear de E. Coli S30 (Promega, Madison, WI, EUA) e a bibliotecaexpressadafoibloqueada com Cis Block (BSA a 2% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 100 µg/mL de DNA de Esperma de Arenque (Promega, Madison, WI, EUA), 1 mg/mL de heparina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Para seleções, bt-c- Met foiadicionada a concentrações de 400 nM (Rodada 1), 200 nM (Rodadas 2 e 3) e 100 nM (Rodadas 4 e 5). Osmembros de bibliotecaligadosforamrecuperados com o uso de microesferasmagnéticas de neutravidina (Thermo Fisher, Rockford, IL, EUA) (Rodadas 1, 3 e 5) oumicroesferasmagnéticas de estreptavidina (Promega) (Rodadas 2 e 4) e osmembros de bibliotecanãoligadosforamremovidospormeio de lavagem das microesferas 5 a 14 vezes com 500 µL de PBS-T seguidopor 2 lavagens com 500 µL de PBS.
[000242] Rodadas de seleçãoadicionaisforamrealizadas para identificar as moléculas de domínios de FN3 com afinidadesaprimoradas. De modo resumido, osprodutos da rodada 5 foramproduzidoscomodescritoacima e submetidos a rodadasadicionais iterativas de seleção com as seguintesalterações: a incubação com btc-Met foidiminuída de 1 hora para 15 minutos e a captura de microesferafoidiminuída de 20 minutos para 15 minutos, a bt-c-Met diminuiu para 25 nM (Rodadas 6 e 7) ou 2,5 nM (Rodadas 8 e 9) e umalavagemadicional de 1 hora foirealizadanapresença de um excesso de c-Met nãobiotinilada. O objetivodestasmudançasfoiselecionarsimultaneamenteosligantes com uma taxa de associaçãopotencialmentemaisrápida e uma taxa de dissociaçãomaislentadandouma KD substancialmentemaisbaixa.
[000243] Osprodutos das Rodadas 5, 7 e 9 foramclonadospor PCR em um vetormodificado pET15 (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ, EUA) contendo um sítio de clonagemindependente de ligase (pET15- LIC) com o uso de iniciadorescurtos TCON6 (SEQ ID NO: 30) e TCON5 E86I (SEQ ID NO: 31), e as proteínasforamexpressadascomoproteínasetiquetadas com His6 C-terminal após as transformação e induçãopor IPTG (1 mM final, 30°C durante 16 horas) com o uso de protocolospadrão. As célulasforamcolhidaspormeio de centrifugação e, subsequentemente, lisadas com "Bugbuster HT" (EMD Chemicals) suplementado com 0,2 mg/mL de Lisozima de Clara de Ovo de Galinha (Sigma-Aldrich). Oslisadosbacterianosforamclarificadospormeio de centrifugação e ossobrenadantesforamtransferidos para novasplacas de 96 poçosprofundos.
Triagem de domínios de FN3 que inibem a ligação de a c-Met
[000244] Osdomínios de FN3 presentesemlisados de E. coli foramtriados para a capacidade deles para inibir a ligação de HGF aodomínioextracelular de c-Met purificadoem um formatobioquímico. Quimera de c-Met Fc recombinante de humano (0,5 µg/mL em PBS, 100µL/poço) foirevestidasobreplacas "White Maxisorp" de 96 poços (Nunc) e incubada de um dia para outro a 4°C. As placasforamlavadas duas vezes com 300 µL/poço de solução salina tamponada com Tris com 0,05% de Tween 20 (TBS-T, Sigma-Aldrich) em um lavador de placasBiotek. As placas de ensaioforambloqueadas com "StartingBlock T20" (200 µL/poço, Thermo Fisher Scientific, Rockland, IL, EUA) durante 1 hora à temperaturaambiente (RT, "Room Temperature") com agitação e de novo lavadas duas vezes com 300 µL de TBS-T. Oslisados de domínio de FN3 foramdiluídosem "StartingBlock T20" (de 1:10 para 1:100.000) com o uso do sistemarobótico "Hamilton STARplus". Oslisados (50 µL/poço) foramincubadossobre as placas de ensaiodurante 1 hora à RT com agitação. Sem lavagem das placas, bt-HGF (1 µg/mL em "StartingBlock T20", 50 µL/poço, biotinilado) foiadicionado à placadurante 30 min à RT sob agitação. Ospoços de controlecontendolisados de Tencon27 receberamquer "Starting Block T20" querbt-HGF diluído. As placasforamentãolavadasquatrovezes com 300 µL/poço de TBS-T e incubadas com 100 µL/poço de Estreptavidina-HRP (1:2.000 em TBS-T, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, EUA) durante 30 a 40 minutos à RT com agitação. De novo as placasforamlavadasquatrovezes com TBS-T. Para revelar o sinal, SubstratoQuimioluminescente POD ("POD Chemiluminescence Substrate") (50 µL/poço, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA), produzido de acordo com as instruções do fabricante, foiadicionado à placa e dentro de aproximadamente 3 minutos a luminescênciafoilida no "Molecular Devices M5" com o uso de "SoftMax Pro". A inibição percentual foideterminada com o uso do seguintecalculo: 100- ((RLUAmostra — RLU MédiaControlesembt-HGF)/(RLU MédiaControle com bt-HGF - RLU MédiaControlesembt-HGF)*100). Osvalores de inibição percentual de 50% oumaioresforamconsideradosresultadosbemsucedidos.
Expressãoemaltaprodutividade e purificação de domínios de FN3
[000245] Osdomínios de FN3 etiquetados com His forampurificados dos lisados de E. coli clarificados com placas His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) e eluídos com agentetamponantecontendo 20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio, e 250 mM de imidazolem pH 7,4. As amostraspurificadasforamtransferidas para PBS de pH 7,4 para análise com o uso de placas PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare). Determinação de IC50 de inibição da ligação de HGF a c-Met
[000246] Osdomínios de FN3 selecionadosforamadicionalmentecaracterizados no ensaio de competição com HGF. As curvas de resposta à dose para osdomínios de FN3 purificadosforamgeradasutilizando o ensaiodescritoacima (concentrações de partida de 5 µM). Osvalores de inibição percentual foramcalculados. Os dados foramplotadoscomoinibição % emfunção do logaritmo de concentraçõesmolares de domínio de FN3 e osvalores de IC50 foramdeterminadospeloajuste dos dados para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4" (GraphPad Software).
[000247] Foramidentificadas da Rodada 5, 35 sequênciaspeculiares que apresentamatividadeemdiluições de 1:10, com valores de IC50 nafaixa de 0,5 nM a 1500 nM. A Rodada 7 produziu 39 sequênciaspeculiares com atividadeemdiluições de 1:100 e valores de IC50 nafaixa de 0,16 nM a 2,9 nM. Da Rodada 9, foramidentificadas 66 sequênciaspeculiares, ondeosresultadosbemsucedidosforamdefinidoscomosendoativasemdiluições de 1:1.000. Osvalores de IC50 tãobaixosquanto 0,2 nMforamobservadosnaRodada 9 (Tabela 13).
Exemplo 7: Caracterização de domínios de FN3 que se ligam a c-Met e inibem a ligaçãoao HGF
[000248] Osdomínios de FN3 foramexpressados e purificadosconformedescritoacima no Exemplo 2. Cromatografia de exclusãoportamanho e análisecinéticaforamrealizadasconformedescritasacimanosExemplos 1 e 2, respectivamente. A Tabela 12 mostra as sequências da fita-C, da alça CD, da fita-F, e da alça FG, e uma SEQ ID NO: para a sequência de aminoácidosinteira para cadadomínio. Tabela 12. Osresíduos da alça C correspondemaosresíduos 28 a 37 da SEQ ID NO: indicada Osresíduos da fita CD correspondemaosresíduos 38 a 43 da SEQ ID NO: indicada Osresíduos da alça F correspondemaosresíduos 65 a 74 da SEQ ID NO: indicada Osresíduos da fita FG correspondemaosresíduos 75 a 81 da SEQ ID NO: indicada
Ligação dos domínios de FN3 de ligação a c-Met selecionados a c-Met sobrecélulas
[000249] As células NCI-H441 (n° de Catálogo HTB-174, American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foramplaqueadas a 20.000 célulasporpoçoemplacas de 96 poços de fundotransparentepretorevestidas com Poli-D-lisina (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C, sob 5% de CO2. Osdomínios de FN3 purificados (50 µL/poço; 0 nM a 1.000 nM) foram adicionadosàscélulasdurante 1 hora a 4°C emplacasemduplicata. O sobrenadantefoiremovido e as célulasforamlavadastrêsvezes com agentetamponante de coloração para FACS (150 µL/poço, BD Biosciences, n° de catálogo 554657). As célulasforamincubadas com anticorpobiotinilado anti-HIS (diluído 1:160 emagentetamponante de coloração para FACS, 50 µL/poço, R&D Systems, n° de catálogo BAM050) durante 30 minutos a 4°C. As célulasforamlavadastrêsvezes com agentetamponante de coloração para FACS (150 µL/poço), após a lavagemospoçosforamincubados com anticorpo anti-IgG1 de camundongoconjugado com Alexa 488 (diluído 1:80 emagentetamponante de coloração para FACS, 50 µL/poço, Life Technologies, n° de catálogo A21121) durante 30 minutos a 4°C. As célulasforamlavadastrêsvezes com agentetamponante de coloração para FACS (150 µL/poço) e deixadasdentro de agentetamponante de coloração para FACS (50 µL/po^o). A fluorescência total foideterminada com o uso de umaleitora Acumen eX3. Osdados foramplotadoscomo o sinal de fluorescênciabrutoemfunção do logaritmo da concentração molar de domínio de FN3 e ajustados para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4" (GraphPad Software) para calcularosvalores de EC50. Foiverificado que osdomínios de FN3 apresentamumafaixa de atividades de ligação, com valores de EC50 entre 1,4 e 22,0, conformemostradonaTabela 13.
Inibição de fosforilação de c-Met estimuladapor HGF
[000250] Osdomínios de FN3 purificadosforamtestados para a capacidade deles para inibirem a fosforilação de c-Met estimuladapor HGF em NCI-H441, com o uso do kit "c-Met phospho(Tyr1349)" da Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD, EUA). As célulasforamplaqueadas a 20.000/poçoemplacastransparentes de 96 poçostratadas para cultura de tecidoem 100 µL/po^o de meio RPMI (contendoGlutamax e HEPES, Life Technologies) com 10% de soro fetal bovino (FBS, "Fetal Bovine Serum"; Life Technologies) e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C, sob 5% de CO2. O meio de culturafoiremovidocompletamente e as célulasforamprivadas de alimento de um dia para outro emmeio RPMI isento de soro (100 µL/poço) a 37°C sob 5% de CO2. As célulasforamentãoreabastecidas com meio RPMI isento de soro (100 µL/poço) contendodomínios de FN3 a umaconcentração de 20 µM e abaixodurante 1 hora a 37°C, sob 5% de CO2. Oscontrolesforamtratados com apenas o meio. As célulasforamestimuladas com 100 ng/mL de HGF recombinante de humano (100 µL/po^o, R&D Systems, n° de catálogo 294-HGN) e incubadas a 37°C, sob 5% de CO2 durante 15 minutos. Um conjunto de poços de controlefoideixadonãoestimuladocomocontrolesnegativos. O meiofoicompletamenteremovido e as célulasforamlisadas com AgenteTamponante de Lise Completo ("Complete Lysis Buffer") (50 µL/poço, Meso Scale Discovery) durante 10 minutos à RT (temperaturaambiente) com agitação, conforme as instruções do fabricante. As placas de ensaioconfiguradas para medir a c-Met fosforiladaforambloqueadas com a solução de bloqueio, fornecidaconforme as instruções do fabricante, à temperaturaambientedurante 1 hora. As placasforamentãolavadastrêsvezes com o AgenteTamponante de Lavagem Tris ("Tris Wash Buffer") (200 µL/po^o, Meso Scale Discovery). Oslisados de células (30 µL/poço) foramtransferidos para placas de ensaio, e incubados à RT (temperaturaambiente) com agitaçãodurante 1 hora. As placas de ensaioforamentãolavadasquatrovezes com AgenteTamponante de Lise Completo ("Complete Lysis Buffer"), após a lavagemSolução de Anticorpo de Detecção gelada ("Detection Antibody Solution") (25 µL/poço, Meso Scale Discovery) foiadicionada a cadapoçodurante 1 hora à RT (temperaturaambiente) com agitação. As placasforam de novo lavadasquatrovezes com AgenteTamponante de Lavagem Tris "Tris Wash Buffer"). Ossinaisforamdetectados pela adição de "150 Read Buffer" (AgenteTamponante para Leitura) (150µL/poço, Meso Scale Discovery) e pela leituraem um instrumento SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) com o uso das configuraçõespadrãoespecíficas para ensaioinstaladaspelofabricante. Os dados foramplotadoscomo o sinal de eletroquimioluminescênciaemfunção do logaritmo da concentração molar de domínio de FN3 e osvalores de IC50 foramdeterminadospeloajuste dos dados para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4". Foiverificado que osdomínios de FN3 inibem a c- Met fosforilada com valores de IC50 nafaixa de 4,6nM a 1.415 nMconformemostradonaTabela 13.
Inibição de crescimento de célulastumorais do ser humano
[000251] A inibição do crescimento de célulasdependente de c-Met foiavaliada pela medição da viabilidade de células U87-MG (American Type Culture Collection, n° de catálogo HTB-14), após a exposiçãoaosdomínios de FN3 de ligação a c-Met. As célulasforamplaqueadas a 8.000/poçoemplacasbrancasopacas de 96 poços (Nunc) tratadas para cultura de tecidoem 100 µL/po^o de meio RPMI, suplementado com 10% de FBS e permitidas se aderirem de um dia para outro a 37°C sob 5% de CO2. Vinte e quatro horas após a plaqueação, o meiofoiaspirado e as célulasforamreabastecidas com meio RPMI isento de soro. Vinte e quatro horas após a privação de soro, as célulasforamtratadas pela adição de meioisento de sorocontendodomínios de FN3 de ligação a c-Met (30 µL/poço). As célulasforamincubadas a 37°C, sob 5% de CO2 durante 72 horas. As célulasviáveisforamdetectadas pela adição de 100 µL/poço de reagenteCellTiter-Glo® (Promega), seguidapormisturaçãoem um agitador de placasdurante 10 minutos. As placasforamlidasemumaleitora de placaSpectraMax M5 (Molecular Devices) configurada para o modo de luminescência, com um tempo de leitura de 0,5 segundo/poço. Os dados foramplotadoscomounidades de luminescênciabrutas ("Raw Luminescence Units", RLU) emfunção do logaritmo de concentração molar de domínio de FN3. Osvalores de IC50 foramdeterminadospeloajuste dos dados a umaequação para uma curva sigmoide de resposta à dose com coeficiente angular variável com o uso de "GraphPad Prism 4". A Tabela 13 relata osvalores de IC50 nafaixa de 1 nM a >1.000 µM. Tabela 13. Resumo das propriedadesbiológicas de domínios de FN3 de ligação a c-Met. Estabilidadetérmica de domínios de FN3 de ligação a c-Met Calorimetriadiferencial de varreduraem PBS foiusada para avaliar a estabilidade de cadadomínio de FN3. Osresultados do experimento sãomostradosnaTabela 14. Tabela 14.
Exemplo 8. Geração e caracterização de moléculasbiespecíficas anti- EGFR/c-Met Geração de moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met
[000252] Numerosascombinações dos domínios de FN3 de ligação a c-Met e ao EGFR descritosnosExemplos 1 a 6 foramunidasemmoléculasbiespecíficascapazes de se ligarem a ambos EGFR e c- Met. Adicionalmente, osdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR que têm as sequências de aminoácidosmostradasem SEQ ID NOs: 107 a 110, e osdomínios de FN3 de ligação a c-Met que têm as sequências de aminoácidosmostradasem SEQ ID NOs: 111 a 114 foramproduzidos e unidosemmoléculasbiespecíficas. Genes sintéticosforamcriados para codificarem as sequências de aminoácidosdescritasem SEQID No. 50 a 72 e 106 (Tabela 15) de tal modo que fosse mantido o seguinteformato: Domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR seguidopor um conector ("linker") peptídicoseguidopor um domínio de FN3 de ligação a c-Met. Uma etiqueta poli-histidinafoiincorporada à terminação-C para auxiliar napurificação. AlémdaquelasmoléculasdescritasnaTabela 15, o conector ("linker") entre osdoisdomínios de FN3 foivariado de acordo com o comprimento, a composição da sequência e a estrutura da sequência de acordo com aqueleslistados (aquelaslistadas) naTabela 16. É previsto que numerosos outros conectores ("linkers") poderiam ser usados para ligar tais domínios de FN3 moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met foramexpressadas e purificadas de E. coli conformedescrito para osdomíniosmonoespecíficos de FN3 que se ligamao EGFR ou a c-Met FN3 com o uso de etapas de cromatografia de filtraçãoem gel e IMAC. Tabela 15. Tabela 16.
Moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met intensificam a potênciaem comparação com as moléculasmonoespecíficassozinhas, sugerindoavidez
[000253] Células NCI-H292 foramplaqueadasemplacas de 96 poçosemmeio RPMI contendo 10% de FBS. 24 Horas maistarde, o meiofoisubstituídopor RPMI isento de soro. 24 Horas após a privação de soro, as célulasforamtratadas com concentraçõesdiferentes de domínios de FN3: quer um domíniomonoespecífico de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidadealta (P54AR4-83v2), um domíniomonoespecífico de FN3 de ligação a c-Met com afinidadebaixa (P114AR5P74-A5), a mistura dos doisdomíniosmonoespecíficos de ligaçãoao EGFR e a c-Met FN3, quermoléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met compreendidas do domínio de FN3 de ligação a c-Met com afinidadebaixaligadoaodomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidadealta (ECB1). As célulasforamtratadasdurante 1 h com as moléculasmonoespecíficasoubiespecíficas e entãoestimuladas com EGF, HGF, ouumacombinação de EGF e HGF durante 15 minutos a 37°C, sob 5% de CO2. As célulasforamlisadas com AgenteTamponante de Lise MSD e a sinalizaçãocelularfoiavaliada com uso de placas de Ensaio MSD, de acordo com as instruções do fabricante, conformedescritasacima.
[000254] O domínio de FN3 de ligação a c-Met com afinidadebaixainibiu a fosforilação de c-Met com uma IC50 de 610 nM (Figura 6). Conforme previsto, o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR nãofoicapaz de inibir a fosforilação de c-Met e a mistura das moléculasmonoespecíficaspareceuidênticaaodomínio de FN3 de ligação a c- Met sozinho. Entretanto, a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met inibiu a fosforilação de c-Met com uma IC50 de 1 nM (Figura 6), fornecendomais que um deslocamento de 2-log no aprimoramento da potênciaemrelação à moléculamonoespecífica anti-c-Met sozinha.
[000255] O potencial para a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met para intensificar a inibição de fosforilação de c-Met e/ou de EGFR mediante um efeito de avidezfoiavaliadoemmúltiplostipos de células com razões e densidades de c-Met e de EGFR variáveis (Figura 7). Células NCI-H292,NCI-H441, ou NCI-H596 foramplaqueadasem placas de 96 poçosemmeio RPMI contendo 10% de FBS. 24 Horas maistarde, o meiofoisubstituídopor RPMI isento de soro. 24 Horas após a privação de soro, as célulasforamtratadas com concentraçõesvariadas de querdomíniomonoespecífico de FN3 de ligaçãoao EGFR, domíniomonoespecífico de FN3 de ligação a c-Met, querumamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met (ECB5, compreendida de P53A1R5-17v2 e P114AR7P94-A3). As célulasforamtratadasdurante 1 h com as moléculasmonoespecíficasoubiespecíficas e entãoestimuladas com EGF, HGF, ouumacombinação de EGF e HGF durante 15 minutos a 37°C, sob 5% de CO2. As célulasforamlisadas com AgenteTamponante de Lise MSD e a sinalizaçãocelularfoiavaliada com uso de placas de Ensaio MSD, de acordo com as instruções do fabricante, conformedescritasacima.
[000256] A Figura 7 (A-C) mostra a inibição de EGFR com o uso de um domíniomonoespecífico de FN3 de ligaçãoao EGFR emcomparação com umamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met emtrêslinhagenscelularesdiferentes. Para avaliar a avidezem um ensaio de fosforilação de EGFR, um domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidademédia (1,9 nM) (P53A1R5-17v2) foicomparado com umamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met contendo o mesmodomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR ligado a um domínio de FN3 de ligação a c- Met com afinidadealta (0,4 nM) (P114AR7P94-A3). Em células H292 e H596, a inibição de fosforilação de EGFR foicomparável com a das moléculasmonoespecíficas e biespecíficas (Figuras 7A ed 7B), provavelmenteporqueestaslinhagenscelularestêmumarazãoalta entre receptor de EGFR e receptor de c-Met. Para testarestateoria, a inibição de fosforilação de EGFR foiavaliadaemcélulas NCI-H441 que apresentammaisreceptores de c-Met que de EGFR. O tratamento de células NCI-H441 com a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met decresceuem 30 vezes a IC50 para a inibição de fosforilação de EGFR emcomparação com o domíniomonoespecífico de FN3 de ligaçãoao EGFR (Figura 7C).
[000257] O potencial para a potênciaintensificada com umamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met foiavaliadoem um ensaio de fosforilação de c-Met com o uso de umamolécula com umaafinidadealtapor EGFR (0,26 nM) e umaafinidademédiapor c-Met (10,1 nM). Em ambas as células NCI-H292 e NCI-H596, a inibição de fosforilação de c-Met foiintensificada com a moléculabiespecíficaemcomparação com o domíniomonoespecífico de FN3 de ligação a c-Met, em 134 e 1.012 vezes, respectivamente (Figuras 7D e 7E).
[000258] Foiverificado que a potênciaintensificada para a inibição de fosforilação de EGFR e de c-Met com as moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met resultouemumainibiçãointensificada de sinalização e proliferação. Para estesexperimentos, a mistura de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR e domínios de FN3 de ligação a c-Met foicomparada com umamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met. Conforme descritonasTabelas 17 e 18, osvalores de IC50 para a fosforilação de ERK (Tabela 17) e proliferação de células H292 (Tabela 18) foramdecrescidosquando as célulasforamtratadas com a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met emcomparação com a mistura dos ligantesmonoespecíficos. A IC50 para a inibição de fosforilação de ERK para a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met foi 143 vezesmenoremrelação à mistura dos domíniosmonoespecíficos de FN3 de ligaçãoao EGFR e de ligação a c-Met, mostrando o efeito de avidezsobre a potência das moléculasnesteensaio. Na Tabela 17, osdomíniosmonoespecíficos de FN3 de ligação a c-Met e de deligaçãoao EGFR nãoinibemcompletamente a atividade e portantoosvalores de IC50 mostradosdevem ser consideradoslimitesinferiores. O ensaio de proliferaçãofoicompletado com o uso de combinaçõesdiferentes de domínios de FN3 de ligaçãoao EGFR e de ligação a c-Met quercomoumamisturaquerligados e um formatobiespecífico. A IC50 para a inibição de proliferação para a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met foi 34 a 236 vezesmenoremrelação à mistura dos domíniosmonoespecíficos de FN3 de ligaçãoao EGFR ou a c-Met parentais. Isto confirmou que oefeito de avidezobservado no nível dos receptores (Figura 6 e Figura 7) resultaem um aprimoramentonainibição de sinalizaçãocelular (Tabela 17) e de proliferaçãocelular (Tabela 18). Tabela 17.
[000259] Com a finalidade de determinar a eficácia das moléculas de domínio de FN3 monoespecíficas e biespecíficas in vivo, células de tumor forammodificadas para secretarem HGF de humano (HGF murinonão se ligaao HGF de humano). O HGF de humanofoiestavelmenteexpressadoemcélulas NCI-H292 com o uso de infecção lentiviral (vetor de DNA lentiviral que expressa HGF de humano (n° de acesso X16322) e kit de empacotamento lentiviral da Genecopoeia). Após a infecção, as células que expressam HGF foramselecionadas com 4µg/mL de puromicina (Invitrogen). A proteína HGF de humanofoidetectada no meiocondicionado de célulasreunidas com o uso de placas de ensaio da MesoScale Discovery.
[000260] Camundongosbeges SCID foramsubcutaneamenteinoculados com células NCI-H292 que expressam HGF de humano (2,0x106 célulasemCultrex (Trevigen) em um volume de 200 µL) no flanco dorsal de cada animal. As medições de tumor foramrealizadas duas vezesporsemanaaté que os volumes de tumor estivessemnafaixa de entre 150 e 250 mm3. Oscamundongosentãoreceberamuma dose IP única de moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met (ligadasaodomínio de ligação a albumina para aumentar a meia-vida) ou de veículo PBS. A 6 h ou 72 h após a dosagem, ostumoresforamextraídos e imediatamentecongeladosemnitrogêniolíquido. Amostras de sangueforamcoletadas via punçãocardíaca para dentro de citrato 3,8% contendoinibidores de protease. Imediatamenteapós a coleta, as amostras de sangueforamcentrifugadas e o plasma resultantefoitransferido para tubos de ensaio e armazenado a -80°C. Ostumoresforampesados, cortados empedaçopequenos, e lisadosemtubos "Lysing Matrix A" (LMA) contendoagentetamponante RIPA com inibidores de protease/fosfatase HALT (marcaregistrada) (Pierce), 50 mM de fluoreto de sódio (Sigma), 2 mM de ortovanadato de sódioativado (Sigma), e 1 mM de PMSF (MesoScale Discovery). Oslisadosforamremovidos da matriz LMA e centrifugados para remover a proteínainsolúvel. A proteínasolúvel de tumor foiquantificada com um ensaio de proteína BCA e diluída para teoresequivalentes de proteínaemagentetamponante de lise de tumor. Os c-Met, EGFR e ERK fosforiladosforammedidos com o uso das placas de ensaio da MesoScale Discovery (de acordo com o protocolo do fabricante e conformedescritoacima).
[000261] A Figura 6 mostraosresultados dos experimentos. Cadamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met reduziusignificativamenteosteores de c-Met, EGFR, e ERK fosforilados a ambas 6 h e 72h. Os dados apresentadosnaFigura 6 mostram a importância da inibição tanto de c-Met quanto de EGFR simultaneamente e como a afinidade da moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met porcada receptor desempenhaumafunçãonainibição de ERK a jusante. As moléculascontendoosdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidadealta (P54AR4-83v2; mostradascomo "8" naFigura, KD=0,26 nM) inibiram a fosforilação de EGFR emumaextensãomaioremcomparação com aquelascontendoosdomínios de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidademédia (P53A1R5-17v2; mostradascomo "17" nafigura KD =1,9 nM) a ambas 6 h e 72h. Todas as quatromoléculasbiespecíficastestadasinibiramcompletamente a fosforilação de ERK no instante de tempo de 6 horas, independente da afinidade. No instante de tempo de 72 horas, as moléculascontendo o domínio de ligação a c-Met com afinidadealta (P114AR7P94-A3; mostradascomo "A3" naFigura, KD=0,4 nM) inibiram a fosforilação de ERK emcomparação com o domínio de FN3 de ligação a c-Met com afinidademédia (P114AR5P74-A5; mostradocomo "A5" naFigura; KD =10,1 nM; Figura 6).
[000262] A concentração de cadamoléculabiespecífica anti- EGFR/c-Met foimedida a 6 horas e 72 horas após a dosagem no sangue e no tumor (Figura 9). Curiosamente, a moléculabiespecífica com o domínio de ligaçãoao EGFR com afinidademédia (P53A1R5- 17v2; KD =1,9 nM) mas com domínio de FN3 de ligação a c-Met com afinidadealta (P114AR7P94-A3; KD =0,4 nM) teveacumulaçãoem tumor significativamentemaior a 6 horas emrelaçãoàsoutras moléculas, enquanto que a diferença é diminuídaem 72 horas. Pode ser suposto que as células fora do tumor têmníveismaisbaixos de expressãoemsuperfície tanto de EGFR quanto de c-Met e porconseguinte a molécula anti-EGFR com afinidademédianão se ligaaotecido normal tãofirmementequandocomparada com o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidademaisalta.Portantohámaisdomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidademédia livre disponível para se ligar no tumor. Portanto, a identificação das afinidadesadequadasporcada receptor podepermitir a identificação de um agenteterapêutico com toxicidadessistêmicasdecrescidas e acumulaçãoem tumor aumentada.
Estudos de eficáciaem tumor com moléculasbiespecíficas anti- EGFR/c-Met
[000263] Camundongosbeges SCID foramsubcutaneamenteinoculados com células NCI-H292 que expressam HGF de humano (2,0x106 célulasemCultrex (Trevigen) em 200 µL) no flanco dorsal de cada animal. Uma semanaapós a implantação, oscamundongosforamseparadosemgrupos com volumes de tumor equivalentes (volume médio de tumor =77,9+/-1,7 mm3). Oscamundongosforamdosadostrêsvezesporsemana com as moléculasbiespecíficas e os volumes de tumor foramregistrados duas vezesporsemana. A inibição de crescimento de tumor (TGI, "Tumor Growth Inhibition") foiobservada com quatromoléculasbiespecíficasdiferentes, com afinidadesvariáveispor c-Met e por EGFR. A Figura 10 mostra o benefício de inibição tanto de c-Met quanto de EGFR porque um atraso no crescimento de tumor foiobservadonoscamundongostratados com as moléculascontendo o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidadealtaemcomparação com o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidademédiaquando o domínio de FN3 de ligação a c-Met era de afinidademédia (triângulosbrancos (vazios) em comparação com triânguloscinzas (cheios), P54AR4-83v2- P114AR5P74-A5 comparado com P53A1R5-17-P114AR5P74-A5). Alémdisso, os dados mostram a importância de haver um domínio de FN3 de ligação a c-Met com afinidadealtaporque as moléculasbiespecíficascontendodomínio de FN3 de ligaçãoao EGFR com afinidadequermédiaqueralta mas com domínio de FN3 de ligação a c-Met com afinidadealtamostraram a máximaeficácia (linhaspretas e cinzaspontilhadas, P54AR4-83v2- P114AR7P94-A3 e P53A1R5-17v2- P114AR7P94-A3).
Eficácia de moléculabiespecífica e de outros inibidores de EGFR e de c-Met
[000264] As eficáciasterapêuticas in vivo de umamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met (ECB38) e de inibidoresmolecularespequenoscrizotinib (inibidor de c-Met) e erlotinib (inibidor de EGFR), cetuximab (anticorpo anti-EGFR), cada um(a) como um agente individual, e a combinação de crizotinib e erlotinib, foramavaliadas no tratamento de modelo de xenoenxertosubcutâneo de câncerpulmonar de humano H292-HGF emcamundongosbeges/SCID (Figura 11).
[000265] As células H292-HGF forammantidas in vitro emmeio RPMI1640 suplementado com soro fetal bovino (10%v/v), e L- glutamina (2 mM) a 37°C emumaatmosfera de 5% de CO2 e, ar. As célulasforamrotineiramentesubcultivadas duas vezesporsemanaportratamento com tripsina-EDTA. As células que crescememumafase de crescimentoexponencialforamcolhidas e contadas para inoculação de tumor.
[000266] Cadacamundongofoiinoculadosubcutaneamentena região do flancodireito com células de tumor H292-HGF (2 x 106) em 0,1mL de PBS com cultrex (1:1) para o desenvolvimento de tumor. Ostratamentosforaminiciadosquando o tamanhomédio de tumor alcançou 139 mm3. A administração do artigo de teste e osnúmeros de animaisemcadagrupo de estudosãomostradosnaseguintetabela de planejamento ("design") experimental (Tabela 26). Os dados de inoculação de tumor foramdesignadoscomo o dia 0. Tabela 26 N:Número de animais; p.o.: administração oral; i.p.: injeção intraperitoneal 3 vezes/semana: doses foram dadas nosdias 1, 3 e 5 da semana. QD: umavezpordia; Q4d: umavez a cadaquatrodias; o intervalo da combinação de crizotinib e erlotinib foi 0,5 h; o volume de dosagemfoiajustado com base no peso corporal (10 L/g); a: dosagemnãofoi dada no dia 14 após o agrupamento.
[000267] Antes do começo do tratamento, todososanimaisforampesados e os volumes de tumor forammedidos. Visto que o volume de tumor podeafetar a efetividade de qualquerdeterminadotratamento, oscamundongosforamalocadosemgrupos com o uso de planejamento ("design") emblocosaleatórios com base nos volumes de tumor deles. Isto garante que todososgrupossejamcomparáveisnalinha base. O planejamento ("design") emblocosaleatóriosfoiusado para alocarosanimaisexperimentaisemgrupos. Primeiro, osanimaisexperimentaisforamdivididosemblocoshomogêneos de acordo com o volume de tumor inicial deles. Segundo, dentro de cadabloco, foiconduzida a randomização de animaisexperimentais para tratamentos. O uso do planejamento ("design") emblocosaleatórios para alocarosanimaisexperimentaisgarantiu que cada animal tivesse a mesmaprobabilidade de ser alocado para um determinadotratamento e porconseguinte o errosistemáticofoireduzido.
[000268] No momento de monitoração de rotina, osanimaisforamchecados para quaisquerefeitos de crescimento de tumor e de tratamentossobre o comportamento normal, comomobilidade, estimativa visual de consumo de alimento e de água, ganho/perda de peso corporal (pesos corporaisforammedidos duas vezesporsemana), opacificação de olho/pelo e qualquer outro efeito anormal.
[000269] O ponto final principal foi se o crescimento de tumor pode ser atrasadoouoscamundongospossuindo tumor podem ser curados. O tamanho de tumor foimedido duas vezesporsemanaem duas dimensões com o uso de um compasso de calibre, e o volume foiexpressadoem mm3 com o uso da fórmula: V = 0,5 a x b2 onde a e b sãoosdiâmetroslongo e curto do tumor, respectivamente. O tamanho de tumor foientãousado para cálculos de ambos osvalores de T-C e T/C. T-C foicalculado com T como o tempo (emdias) necessário para o tamanhomédio de tumor do grupo de tratamentoalcançar 1.000 mm3, e C foi o tempo (emdias) para o tamanhomédio de tumor do grupo de controlealcançar o mesmotamanho. O valor de T/C (emporcentagem) foiumaindicação de eficácia antitumoral; T e C foram o volume médio dos grupostratado e de controle, respectivamente, em um determinado dia. A regressão de tumor completa (CR, "Complete tumor Regression") é definidacomotumores que sãoreduzidos para abaixo do limite de palpação (62,5 mm3). A regressão de tumor parcial (PR, "Partial tumor Regression") é definidacomoostumores que sãoreduzidos a partir do volume de tumor inicial. Uma duraçãomínima de CR ou de PR em 3 oumaismedições de tumor sucessivas é exigida para uma CP [sic] ou PR ser consideradadurável.
[000270] Osanimaiscujaperda de peso corporal (BWL, "Body Weight Loss") ultrapassou 20%, oucujotamanhomédio de tumor ultrapassou 2.000 mm3 foramsubmetidos à eutanásia. O estudofoiterminadoapós duas semanas de observaçãodepois da dose final.
[000271] Dados estatísticosresumidos, incluindo o erropadrão da média (SEM, "Standard Error of the Mean"), sãofornecidos para o volume de tumor de cadagrupoemcadainstante de tempo (mostradonaTabela 19 abaixo). Análisesestatísticas de diferençaem volume de tumor dentreosgruposforamavaliadas com o uso de ANOVA univariadaseguidaporcomparaçõesindividuais com a utilização de Games-Howell (variânciaigualnãoaceita). Todos os dados foramanalisadosusando SPSS 18.0. p < 0,05 é consideradoestatisticamentesignificativo. Tabela 19 Tamanhostumoraisnosgrupos de tratamento
[000272] O tamanhomédio de tumor do grupotratado com veículo (Grupo 1) alcançou 1.758 mm3 no dia 23 após a inoculação de tumor. O tratamento com a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met aonível de dose de 25 mg/kg (Grupo 2) resultounaregressão de tumor completa (CR) emtodososcamundongos que foramduráveisem>3 medições de tumor sucessivas (VT médio =23 mm3, valor de T/C = 1%, p= 0,004 emcomparação com o grupotratado com veículo no dia 23).
[000273] O tratamento com Crizotinibcomo um agente individual aonível de dose de 50 mg/kg (Grupo 3) nãomostrouatividade antitumoral; o tamanhomédio de tumor foi 2.102 mm3 no dia 23 (valor de T/C =120%, p= 0,944 emcomparação com o grupotratado com veículo).
[000274] O tratamento com Erlotinib como um agente individual aonível de dosagem de 50 mg/kg (Grupo 4) mostrouatividade antitumoral pequena, mas nãofoiencontradadiferençasignificativaemcomparação com o grupotratado com veículo; o tamanhomédio de tumor foi 1.122 mm3 no dia 23 (valor de T/C = 64%, p= 0,429 emcomparação com o grupotratado com veículo), com 4 dias de atraso de crescimento de tumor com tamanho de tumor de 1.000 mm3 emcomparação com o grupotratado com veículo.
[000275] A combinação de Crizotinib (50 mg/kg, Grupo 5) e Erlotinib (50 mg/kg, Grupo 5) mostrouatividade antitumoral significativa; o tamanhomédio de tumor foi 265 mm3 no dia 23 (T/C=15%; p= 0,008), com 17 dias de atraso de crescimento de tumor com tamanho de tumor de 1.000 mm3 emcomparação com o grupotratado com veículo.
[000276] Cetuximab aonível de dosagem de 1 mg/camundongocomo um agente individual (Grupo 6) mostrouatividadesantitumoraissignificativas; o tamanhomédio de tumor foi 485 mm3 no dia 23 (T/C=28%; p= 0,018), com 17 dias de atraso de crescimento de tumor com tamanho de tumor de 1.000 mm3 emcomparação com o grupotratado com veículo. A Figura 11 mostra as atividadesantitumorais das váriasterapias. Tabela 20 Atividade antitumoral
[000277] Perda de peso corporal média a muitoaltafoiobservada no grupotratado com veículo que pode ser devido à carga de tumor crescente; 3 camundongosmorreram e 1 camundongofoisubmetido à eutanásiaquando BWL>20% pelodia 23. Toxicidade suave da moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met foiobservada no Grupo 2; 3 camundongosforamsubmetidos à eutanásiaquando BWL>20% durante o período de tratamento; o peso corporal foigradualmenterecuperadoquando o tratamentofoiinterrompidodurante as 2 semanas de período de observação. Perda de peso corporal muitomaisaltafoiobservada no grupotratado com monoterapia com Crizotinibou Erlotinib emcomparação com o grupotratado com veículo, sugerindo a toxicidaderelacionada com tratamento. A combinação de Crizotinib e Erlotinib foi, de modo geral, toleradadurante a fase de dosagem, mas perda de peso corporal muitoaltafoiobservada no término do estudo, que pôdetersidodevidoaorecomeço do crescimento de tumor rápidodurante o período de nãotratamento. A monoterapia de Cetuximab foibemtolerada no estudo; a perda de peso corporal foiapenasobservada no término do estudodevido à continuação do crescimento de tumor.
[000278] Em resumo, a moléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met a 25mg/kg (3 vezes/semana x 3 semanas) produziuumarespostacompletaemmodelo de xenoenxerto de câncer de pulmão H292-HGF de humanoemcamundongosbeges/SCID. O tratamentofoitoleradoem 7 dos 10 camundongos, e resultouemperda de peso corporal muitoaltaem 3 dos 10 camundongos. A Figura 11 e a Tabela 20 mostram a influência das váriasterapiassobre o tamanho de tumor duranteosinstantes de tempo após o tratamento.
Exemplo 9: Prolongamento da meia-vida das moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met
[000279] Têmsidodescritosnumerososmétodos para reduzir a filtração renal e dessa forma prolongar a meia-vidasérica de proteínasincluindo a modificação com poli(glicoletilênico) (PEG) ou outros polímeros, a ligação a albumina, a fusão a domínios de proteínas que se ligam a albuminaou a outrasproteínasséricas, a fusãogenética à albumina, a fusãoaosdomínios Fc de IgG, e fusãoàssequências de aminoácidos longas, nãoestruturadas.
[000280] As moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met forammodificadas com PEG com a finalidade de aumentar o raiohidrodinâmico pela incorporação de umacisteína livre naterminação-C da molécula. Mais comumente, o grupotiol livre do resíduo de cisteína é usado para ligarmoléculas de PEG que estãofuncionalizadas com gruposmaleimidaouiodoacetamida com o uso de métodospadrão. Váriasformas de PEG podem ser usadas para modificar a proteínaincluindo PEG linear de 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, ou 40.000 kDa. As moléculas de PEG ramificadasdestes pesos molecularestambémpodem ser usadas para modificação. Osgrupos PEG podemtambém ser ligados, emalgunscasos, medianteaminasprimáriasnasmoléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met.
[000281] Além da PEGuilação, a meia-vida de moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met foiprolongada pela produçãodestasproteínascomomoléculas de fusão com um domínio de ligação a albumina (ABD, "Albumin Binding Domain") sérica de feixe de 3 hélices de ocorrência natural ou com um domínioconsenso de ligação a albumina (ABDCon, "consensus albumin binding domain"). Estes domínios de proteínaforamligados à terminação-C do domínio de FN3 de ligação a c-Met via qualquer um dos conectores ("linkers") descritosnaTabela 16. O domínio ABD ouABDConpodetambém ser posicionado entre o domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR e o domínio de FN3 de ligação a c-Met nasequênciaprimária.
Exemplo 10: Caracterização de moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c- Met selecionadas
[000282] As moléculas anti-EGFR/c-Met selecionadasforam caracterizadas para a afinidade delas tanto por EGFR quantopor c- Met, para a capacidade delas para inibirem a autofosforilação de EGFR e de c-Met, e para o efeito delas sobre a proliferação de células que expressam HGF. A afinidade de ligação das moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met pordomínioextracelular de c-Met e/ou de EGFR recombinantefoiadicionalmentecaracterizadapormétodos de ressonância de Plasmon de superfície com o uso de um InstrumentoProteon (BioRad) de acordo com o protocolodescrito no Exemplo 3. Osresultados da caracterizaçãosãomostradosnaTabela 21. Tabela 21
Exemplo 11: Geração e caracterização de moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met modificadas com cisteína Geração de moléculasbiespecíficas anti-EGFR/c-Met
[000283] Com base nos dados gerados da varredura de cisteína do mutante P54AR4-83v2 (Exemplo 5), osmutantescontendocisteínaforamtambémplanejados ("designed") emumamoléculabiespecífica anti-EGFR/c-Met denotadapor ECB147 (SEQ ID NOS: 218 e 256), que consiste no P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), no ligante de c-Met: P114AR7P95-C5v2 (SEQ ID NO: 114), e um domínio de ligação a albumina para prolongamento da meia-vida. Estes trêsdomíniossãoconectadospelosconectores ("linkers") (Ala-Pro)5 (SEQ ID NO: 81). As variantes com uma, duas, ouquatrocisteínasforamplanejadas ("designed") com substituiçõesnaterminação-C, nasregiões de conector ("linker"), ounaposição de Lys-62 de um dos domínios de FN3 (SEQ ID NOS: 219 a 225 e 257 a 263). Uma outravariantebiespecífica, ECB82cys (SEQ ID NOS: 226 e 264), consistenos P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), P114AR7P94 (A3v22) (SEQ ID NO: 111), e umavariante do domínio de ligação a albumina, todosostrêsdomíniosconectadosporconectores ("linkers") AP, e umaúnicacisteína C-terminal. Uma variante com cisteínaadicional do arcabouçoTenconnãoetiquetado (SEQ ID NO: 265) foitambémusada para a construção de conjugados de controle. Todas as variantesforamconstruídas, expressadas, e purificadasconformedescritonosexemplosprévios. A purezafoiavaliadaporanálise via SDS-PAGE. A cromatografiaporexclusão de tamanhoanalítica com o uso de umacolunaSuperdex 755/150 (GE Healthcare) mostra que as preparações de domínio de FN3 estãoisentas de agregados e eluemem um tempo consistente com umaproteínamonomérica. A espectrometria de massadeterminou que as massasestão de acordo com as massasteóricas (Tabela 22). Tabela 22
Conjugaçãoquímica
[000284] Para quimicamenteconjugar as variantesbiespecíficascontendocisteínapurificadasàsmoléculascontendomaleimida, as pro-teínasforamprimeiroreduzidas com TCEP para gerartióis livres. 1 a 2mg de cadavariantebiespecíficacontendocisteínaforammisturados com um excesso de TCEP em pH neutro (Sigma, n° de catálogo 646547) e incubados à RT (temperaturaambiente) durante 30 minutos a 60 minutos. TCEP foiremovida pela adição de 3 volumes de soluçãosaturada de sulfato de amônio (4,02 M) para precipitar as variantescontendocisteína. Após a centrifugação a 16.000-20.000 x g a 4°C durante 20 min e a remoção do sobrenadante, o pélete de proteínafoidissolvidoem PBS ouagentetamponantefosfato de sódio e misturadoimediatamente com um excesso de 5 a 10 vezes da moléculacontendomaleimida. A reaçãofoiincubadadurante 30 minutos a 60 minutos à temperaturaambiente e entãofoiinativada com um excesso de um tiol livre, comocisteínaou ß-mercaptoetanol, para sequestrar o excesso de maleimida. A maleimidanãoligadafoiremovida com colunas de dessalinização Zeba (Thermo, n° de catálogo 89890), por SEC preparativa com umacoluna Tosoh G3000SWxl (n° P4619-14N; de 7,8 mm x 30 cm; 5 µm), oupelasligação da variantecontendocisteína à resina Ni-NTA, lavagem, e eluiçãoessencialmenteconformedescritoacima. Osconjugadosforamcaracterizadospor SDS-PAGE e espectrometria de massa. Este métodogeralfoiusado para conjugar as variantesbiespecíficascontendocisteínaàsmoléculas de fluoresceína-maleimida (Thermo, n° de catálogo 62245), PEG24-maleimida (Quanta Biodesign, n° de catálogo 10319), e maleimida-citotoxina com umavariedade de conectores ("linkers") (veja as estruturasnaFigura 2).
Inibição de fosforilação de EGFR estimuladapor EGF
[000285] Osconjugadosbiespecíficos de PEG24-maleimida purificadosforamtestados para a capacidade deles para inibirem a fosforilação de EGFR estimuladapor EGF nalinhagem de célulastumorais de humano NCI-H292 (American Type Culture Collection, n° de catálogo CRL-1848) com o uso do kit "EGFR phospho(Tyr1173)" da Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD, EUA) e conformedescrito no Exemplo 3. Osconjugadosforamcomparados com ECB38 nãomodificado (SEQID No. 109), que difere de ECB147 pordois aminoácidos. Osconjugados e ECB38 inibiram EGFR com valores de IC50 similares, conformemostradosnaTabela 23, demonstrando que a modificaçãonossítiosplanejadosnãoafeta de modo significativo a ligaçãoaoalvo. Tabela 23
Inibição de fosforilação de c-Met estimuladapor HGF
[000286] Osconjugadosbiespecíficos de PEG24-maleimida purificadosforamtambémtestados para a capacidade deles para inibirem a fosforilação de c-Met estimuladapor HGF emcélulas NCI- H292, com o uso do kit "c-Met phospho(Tyr1349)" da Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD, EUA), e conformedescrito no Exemplo 7. Osconjugados e ECB38 inibiram c-Met com valores de IC50 similares, conformemostradosnaTabela 24, demonstrando que a modificaçãonestessítiosnão altera de modo significativo a ligaçãoaoalvo. Tabela 24
de citotoxicidade
[000287] Osconjugadosconsistindoemvariantescontendocisteína ECB147, 83v2-cys, ouTencon-cysligados a um inibidor de tubulinacitotóxico da família das auristatinas (Figura 2) foramtestados para a citotoxicidadedependente de alvoemcélulas de câncer. O inibidorfoiligado à proteínacontendocisteína via um conector ("linker") de PEG4 nãoclivávelou um conector ("linker") de valina-lisinaouvalina-citrulinaclivávelporenzima. O extermínio de célulasfoiavaliado pela medição da viabilidade das linhagens de célulastumorais de humano H1573 e A431 que superexpressam EGFR, e também da linhagem de célula de tumor MDA-MB-435 negativa para EGFR apósexposiçãoaosconjugados de proteína-citotoxina com o uso do procedimentodescrito no Exemplo 4. A Tabela 25 relata osvalores de IC50 obtidos da análise de dados de contagem de objetos via querCellTiter Glo querIncuCyte no instante de tempo de 66, 72, ou 90 horas. Osconjugados de proteína-fármacomostrarampotenteextermínio de células das células que expressam o antígeno-alvo EGFR. Osconjugados de multifármacostambémdemonstraramcitotoxicidadeaumentadaem muitas das linhagenscelularestestadas. Tabela 25 >SEQ ID NO: 101 PRT Homo sapiens cMet 1 mrpsgtagaallallaalcpasraleekkvcqgtsnkltqlgtfedhflslqrmfnncev 61 vlgnleityvqrnydlsflktiqevagyvlialntveriplenlqiirgnmyyensyala 121 vlsnydanktglkelpmrnlqeilhgavrfsnnpalcnvesiqwrdivssdflsnmsmdf 181qnhlgscqkcdpscpngscwgageencqkltkiicaqqcsgrcrgkspsd cchnqcaagc 241tgpresdclvcrkfrdeatckdtcpplmLynpttyqmdvnpegkysfgat cvkkcprnyv 301vtdhgscvracgadsyemeedgvrkckkcegpcrkvcngigigefkdsls inatnikhfk 361 nctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhaf 421 enleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkkl 481 fgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvs rgrecvdkcn 541 llegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvm 601 genntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvv 661 algiglfmrrrhivrkrtlrrllqerelvepltpsgeapnqallrilketefkkikvlgs 721 gafgtvykglwipegekvkipvaikelreatspkankeildeayvmasvdnphvcrllgi 781 cltstvqlitqlmpfgclldyvrehkdnigsqyllnwcvqiakgmnyledrrlvhrdlaa 841 rnvlvktpqhvkitdfglakllgaeekeyhaeggkvpikwmalesilhriythqsdvwsy 901 gvtvwelmtfgskpydgipaseissilekgerlpqppictidvymimvkcwmidadsrpk 961 freliiefskmardpqrylviqgdermhlpsptdsnfyralmdeedmddvvdadeylipq 1021 qgffsspstsrtpllsslsatsnnstvacidrnglqscpikedsflqryssdptgalted 1081 siddtflpvpeyinqsvpkrpagsvqnpvyhnqplnpapsrdphyqdphstavgnpeyln 1141 tvqptcvnstfdspahwaqkgshqisldnpdyqqdffpkeakpngifkgstaenaeylrv 1201 apqssefiga SEQ ID NO: 75, PRT, Homo Sapiens, Tenascina-C 1 mgamtqllagvflaflalateggvlkkvirhkrqsgvnatlpeenqpvvfnhvyniklpv 61 gsqcsvdlesasgekdlappsepsesfqehtvdgenqivfthriniprracgcaaapdvk 121 ellsrleelenlvsslreqctagagcclqpatgrldtrpfcsgrgnfstegcgcvcepgw 181kgpncsepecpgnchlrgrcidgqcicddgftgedcsqlacpsdcndqgk cvngvcicfe 241gyagadcsreicpvpcseehgtcvdglcvchdgfagddcnkplclnncyn rgrcvenecv 301cdegftgedcselicpndcfdrgrcingtcyceegftgedcgkptcphac htqgrceegq 361 cvcdegfagvdcsekrcpadchnrgrcvdgrcecddgftgadcgelkcpngcsghgrcvn 421 gqcvcdegytgedcsqlrcpndchsrgrcvegkcvceqgfkgydcsdmscpndchqhgrc 481vngmcvcddgytgedcrdrqcprdcsnrglcvdgqcvcedgftgpdcael scpndchgqg 541rcvngqcvchegfmgkdckeqrcpsdchgqgrcvdgqcichegftgldcg qhscpsdcnn 601 lgqcvsgrcicnegysgedcsevsppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpth 661 egglemqfrvpgdqtstiiqelepgveyfirvfailenkksipvsarvatylpapeglkf 721 ksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpetsyrqtglapgqeye 781 islhivknntrgpglkrvtttrldapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygik 841 dvpgdrttidltedenqysignlkpdteyevslisrrgdmssnpaketfttgldaprnlr 901 rvsqtdnsitlewrngkaaidsyrikyapisggdhaevdvpksqqattkttltglrpgte 961 ygigvsavkedkesnpatinaateldtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnys 1021lptgqwvgvqlprnttsyvlrglepgqeynvlltaekgrhkskparvkas teqapelenl 1081tvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravd ipglkaatpy 1141 tvsiygviqgyrtpvlsaeastgetpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvq 1201 eadtveaaqnltvpgglrstdlpglkaathytitirgvtqdfsttplsvevlteevpdmg 1261 nltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsmeipglragt 1321 pytvtlhgevrghstrplavevvtedlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviq 1381 vqevnkveaaqnltlpgslravdipgleaatpyrvsiygvirgyrtpvlsaeastakepe 1441 ignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertahisglpp 1501 stdfivylsglapsirtktisatattealpllenltisdinpygftvswmasenafdsfl 1561 vtvvdsgklldpqeftlsgtqrklelrglitgigyevmvsgftqghqtkplraeivteae 1621 pevdnllvsdatpdgfrlswtadegvfdnfvlkirdtkkqsepleitllapertrditgl 1681 reateyeielygiskgrrsqtvsaiattamgspkevifsditensatvswraptaqvesf 1741 rityvpitggtpsmvtvdgtktqtrlvklipgveylvsiiamkgfeesepvsgsfttald 1801 gpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdlepa 1861 teytlrifaekgpqksstitakfttdldsprdltatevqsetalltwrpprasvtgyllv 1921 yesvdgtvkevivgpdttsysladlspsthytakiqalngplrsnmiqtifttigllypf 1981 pkdcsqamLngdttsglytiylngdkaealevfcdmtsdgggwivflrrkngrenfyqnw 2041 kayaagfgdrreefwlgldnlnkitaqgqyelrvdlrdhgetafavydkfsvgdaktryk 2101 lkvegysgtagdsmayhngrsfstfdkdtdsaitncalsykgafwyrnchrvnlmgrygd 2161 nnhsqgvnwfhwkghehsiqfaemklrpsnfrnlegrrkr a >SEQ ID NO: 101 PRT Homo sapiens cMet 1 mkapavlapgilvllftlvqrsngeckealaksemnvnmkyqlpnftaetpiqnvilheh 61 hiflgatnyiyvlneedlqkvaeyktgpvlehpdcfpcqdcsskanlsggvwkdninmal 121 vvdtyyddqliscgsvnrgtcqrhvfphnhtadiqsevhcifspqieepsqcpdcvvsal 181 gakvlssvkdrfinffvgntinssyfpdhplhsisvrrlketkdgfmfltdqsyidvlpe 241 frdsypikyvhafesnnfiyfltvqretldaqtfhtriirfcsinsglhsymemplecil 301 tekrkkrstkkevfnilqaayvskpgaqlarqigaslnddilfgvfaqskpdsaepmdrs 361 amcafpikyvndffnkivnknnvrclqhfygpnhehcfnrtllrnssgcearrdeyrtef 421 ttalqrvdlfmgqfsevlltsistfikgdltianlgtsegrfmqvvvsrsgpstphvnfl 481 ldshpvspevivehtlnqngytlvitgkkitkiplnglgcrhfqscsqclsappfvqcgw 541 chdkcvrseeclsgtwtqqiclpaiykvfpnsapleggtrlticgwdfgfrrnnkfdlkk 601 trvllgnesctltlsestmntlkctvgpamnkhfnmsiiisnghgttqystfsyvdpvit 661 sispkygpmaggtlltltgnylnsgnsrhisiggktctlksvsnsilecytpaqtistef 721 avklkidlanretsifsyredpivyeihptksfistwwkeplnivsflfcfasggstitg 781 vgknlnsvsvprmvinvheagrnftvacqhrsnseiiccttpslqqlnlqlplktkaffm 841 ldgilskyfdliyvhnpvfkpfekpvmismgnenvleikgndidpeavkg evlkvgnksc 901 enihlhseavlctvpndllklnselniewkqaisstvlgkvivqpdqnftgliagvvsis 961 talllllgfflwlkkrkqikdlgselvrydarvhtphldrlvsarsvspttemvsnesvd 1021 yratfpedqfpnssqngscrqvqypltdmspiltsgdsdisspllqntvhidlsalnpel 1081 vqavqhvvigpsslivhfnevigrghfgcvyhgtlldndgkkihcavkslnritdigevs 1141 qfltegiimkdfshpnvlsllgiclrsegsplvvlpymkhgdlrnfirnethnptvkdli 1201 gfglqvakgmkylaskkfvhrdlaarncmLdekftvkvadfglardmydkeyysvhnktg 1261 aklpvkwmaleslqtqkfttksdvwsfgvllwelmtrgappypdvntfditvyllqgrrl 1321 lqpeycpdplyevmLkcwhpkaemrpsfselvsrisaifstfigehyvhvnatyvnvkcv 1381 apypsllssednaddevdtr pasfwets >SEQ ID NO: 179 PRT Artificial Uma alça FG de domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR HNVYKDTNX9RGL; em que X9 é M ou I; >SEQ ID NO: 180 PRT Artificial Uma alça FG de domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), >SEQ ID NO: 181 PRT Artificial Uma alça BC de domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181); em que X1 é A, T, G ou D; X2 é A, D, Y ou W; X3 é P, D ou N; X4 é L ouestáausente; X5 é D, H, R, G, Y ou W; X6 é G, D ou A; X7 é A, F, G, H ou D; e X8 é Y, F ou L. >SEQ ID NO: 182 PRT Artificial domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVG EAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), X1 é A, T, G ou D; X2 é A, D, Y ou W; X3 é P, D ou N; X4 é L ouestáausente; X5 é D, H, R, G, Y ou W; X6 é G, D ou A; X7 é A, F, G, H ou D; X8 é Y, F ou L; e X9 é M ou I. >SEQ ID NO: 183 PRT Artificial domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVG EAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), em que X1 é A, T, G ou D; X2 é A, D, Y ou W; X3 é P, D ou N; X4 é L ouestáausente; X5 é D, H, R, G, Y ou W; X6 é G, D ou A; X7 é A, F, G, H ou D; e X8 é Y, F ou L. >SEQ ID NO: 184 PRT Artificial Uma sequência de fita C e umasequência de alça CD de domínio de FN3 de ligação a c-Met DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), em que X10 é W, F ou V; X11 é D, F ou L; X12 é V, F ou L; X13 é V, L ou T; X14 é V, R, G, L, T ou S; X15 é G, S, A, T ou K; e X16 é E ou D; e >SEQ ID NO: 185 PRT Artificial Uma fita F e umaalça FG de domínio de FN3 de ligação a c-Met TEYX17VX18IX19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), em que X17 é Y, W, I, V, G ou A; X18 é N, T, Q ou G; X19 é L, M, N ou I; X20 é G ou S; X21 é S, L, G, Y, T, R, H ou K; X22 é I, V ou L; e X23 é V, T, H, I, P, Y, T ou L. >SEQ ID NO: 186 PRT Artificial um domínio de FN3 de ligação a c-Met LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PL SAEFTT (SEQ ID NO: 186), em que X10 é W, F ou V; e X11 é D, F ou L; X12 é V, F ou L; X13 é V, L ou T; X14 é V, R, G, L, T ou S; X15 é G, S, A, T ou K; X16 é E ou D; X17 é Y, W, I, V, G ou A; X18 é N, T, Q ou G; X19 é L, M, N ou I; X20 é G ou S; X21 é S, L, G, Y, T, R, H ou K; X22 é I, V ou L; e X23 é V, T, H, I, P, Y, T ou L. >SEQ ID NO: 187 PRT Artificial domínio de FN3 de ligaçãoao EGFR de umamoléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met LPAPKNLVVSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKV GEAIX30LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RG LPLSAX33FTT (SEQ ID NO: 187),em que X24 é E, N ou R; X25 é E ou P; X26 é L ou A; X27éHouW; X28éEouD; X29éEouP; X30éNouV; X31 é G ou Y; X32 é M ou I; e X33 é E ou I; >SEQ ID NO: 188 domínio de FN3 de ligação a c-Met de umamoléculabiespecífica que contémdomínios de FN3 anti-EGFR/c-Met LPAPKNLVVSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X 40GX41AIX42LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIX43X44VKGGX45ISPPL SAX46FTT (SEQ ID NO: 188); em que X34 é E, N ou R; X35 é E ou P; X36 é L ou A; X37 é E ou P; X38 é V ou L; X39 é G ou S; X40 é S ou K; X41 é E ou D; X42 é N ou V; X43 é L ou M; X44 é G ou S; X45 é S ou K; e X46 é E ou I.

Claims (33)

1.Domínioproteicoisolado de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, caracterizadopelofato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, apresentandopelomenosumasubstituição de cisteínanasequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, sendo que oreferidodomínioproteico de FN3 modificado com cisteínaisolado se ligaespecificamenteao EGFR.
2.Domínioproteico de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelofato de que oditodomínio de FN3 modificado com cisteínaisolado se ligaespecificamenteao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR.
3.Domínioproteicoisolado de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, caracterizadopelofato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114 com pelomenosumasubstituição de cisteínaemumaposiçãoselecionadadentre o grupo que consistenosresíduos 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88 e 89 da SEQ ID NO: 114, em que a dita FN3 modificada com cisteínaisolada se ligaespecificamenteao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c- Met) e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met.
4.Domínio de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelofato de que compreendeaindaumaporção que prolonga a meia-vida.
5.Domínio de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelofato de que a porção que prolonga a meia-vida é umamolécula de ligação a albumina, um poli(glicoletilênico) (PEG) oupelomenosumaporção de umaregião Fc de umaimunoglobulina.
6.Método para produzir um domínio de FN3 modificado com cisteínacomodefinidonareivindicação 1 ou 3, caracterizadopelofato de que compreende: (i)mutagenizarumasequência de ácidonucleico de um domínio de FN3 parental pormeio da substituição de um oumaisresíduos de nucleotídeoporresíduos de nucleotídeo que codificam um resíduo de aminoácidocisteína para codificar o domínioproteico de FN3 modificado com cisteína; (ii)expressar o domínioproteico de FN3 modificado com cisteína; e (iii)recuperar o domínioproeico de FN3 modificado com cisteína.
7.Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelofato de que a etapa de mutagenizarcompreendefazermutagênesesítio-direcionada.
8.Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelofato de que compreendeexpressar o domínio de FN3 modificado com cisteínaem E. coli.
9.Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelofato de que compreendeainda, após a etapa de recuperar: reagir o domínioproteico de FN3 modificado com cisteína com um reagentequímicoreativo a tiol para gerar um domínioproteico de FN3 modificado com cisteínaquimicamenteconjugado.
10.Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelofato de que compreendeainda, após a etapa de reagir, medir a ligaçãoao EGFR do domínioproteico de FN3 modificado com cisteínaquimicamenteconjugado.
11.Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelofato de que compreendeainda, após a etapa de reagir, medir a inibição de crescimentocelular de umalinhagem de célulastumorais que superexpressa EGFR após a adição do domínioproteico de FN3 modificado com cisteínaquimicamenteconjugado.
12.Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelofato de que compreendeainda, após a etapa de reagir, medir a ligação a c-Met do domínioproteico de FN3 modificado com cisteínaquimicamenteconjugado.
13.Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelofato de que compreendeainda, após a etapa de reagir, medir a inibição de crescimentocelular de umalinhagem de célulastumorais que superexpressa c-Met após a adição do domínio de FN3 modificado com cisteínaquimicamenteconjugado.
14.Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelofato de que oreagentereativo a tiolcompreendeumaporçãomaleimida.
15.Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelofato de que oreagentereativo a tiol que compreende a porçãomaleimida é selecionado do grupo que consisteem NEM, MMAE, e MMAF.
16.Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelofato de que odomínioproteico de FN3 modificado com cisteínaquimicamenteconjugadoapresenta um valor de IC50 de crescimentocelular entre cerca de 1,7 x 10-10 M e cerca de 1,3 x 10-9 M quandomedidoemcélulas H1573 que superexpressam EGFR.
17.Domínioproteicoisolado de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelofato de que compreendeaindaumametionina no N- terminal da proteína e em que odomínio FN3 apresentaumasequência de aminoácidosselecionadadentre o grupo que consistenas SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQIDNO:193,SEQIDNO:194,SEQIDNO:195,SEQIDNO: 196, SEQIDNO:197,SEQIDNO:198,SEQIDNO:199,SEQIDNO: 200, SEQIDNO:201,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO: 204, SEQIDNO:205,SEQIDNO:206,SEQIDNO:207,SEQIDNO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, and SEQ ID NO: 212.
18.Moléculaisolada de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, caracterizadapelofato de que compreende um primeirodomínio de fibronectinatipo III (FN3) e um segundodomínio de FN3, em que o primeirodomínio de FN3 compreende um domínioproteico de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, comodefinidonareivindicação 1, e o segundodomínio de FN3 compreende um domínioproteico de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, comodefinidonareivindicação 3, sendo que o primeirodomínio se ligaespecificamenteao receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e bloqueia a ligação de fator de crescimentoepidérmico (EGF) ao EGFR, e o segundodomínio de FN3 se ligaespecificamenteao receptor de fator de crescimento de hepatócito (c-Met), e bloqueia a ligação de fator de crescimento de hepatócito (HGF) a c-Met.
19.Moléculaisolada de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelofato de que compreendeumasequência de aminoácidosselecionadadentre o grupo que consistenas SEQ IDNOS: 219, SEQ IDNO:220,SEQID NO: 221,SEQIDNO:222,SEQIDNO:223,SEQIDNO:224,SEQID NO: 225,SEQIDNO:226,SEQIDNO:257,SEQIDNO:258,SEQID NO: 259,SEQIDNO:260,SEQIDNO:261,SEQIDNO:262,SEQID NO: 263, and SEQ ID NO: 264.
20.Moléculaisolada de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 18, sendo a dita moléculacaracterizadapelofato de que estáquimicamenteconjugada a um reagentereativo a tiol.
21.Moléculaisolada de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadapelofato de que oreagentereativo a tiolcompreendeumaporçãomaleimida.
22.Moléculaisolada de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelofato de que a porçãomaleimida é selecionada do grupo que consisteem NEM, PEG24-maleimida, fluoresceína-maleimida, MMAE e MMAF.
23.Molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadapelofato de que o primeirodomínio de FN3 inibe a fosforilação de EGFR induzidapor EGF no resíduo de Tirosina 1173 de EGFR com um valor de IC50 entre cerca de 0,9 x 10-9 M e cerca de 2,3x10-9 M quandomedidoemcélulas NCI-H292 com o uso de EGF de humano a 50 ng/mL, e o segundodomínio de FN3 inibe a fosforilação de c-Met induzidapor HGF no resíduo de Tirosina 1349 de c-Met com um valor de IC50 entre cerca de 4x10-10 M e cerca de 1,3x10-9 M quandomedidoemcélulas NCI-H292 com o uso de HGF humano a 100 ng/mL.
24.Molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 23, a dita moléculabiespecíficamodificada com cisteína, caracterizadapelofato de que tem um valor de IC50 de crescimentocelularselecionado do grupo que consisteem: (i)entre cerca de 5,0 x 10-11 M e cerca de 5,8 x 10-10 M quandomedidoemcélulas H1573 que superexpressam EGFR; e (ii)entre cerca de 7,8 x 10-12 M e cerca de 1,1 x 10-9 M quandomedidoemcélulas A731 que superexpressam EGFR.
25.Molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadapelofato de que compreendeadicionalmenteumaporção que prolonga a meia-vida.
26.Molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína, de acordo com a reivindicação 25, caracterizadapelofato de que a porção que prolonga a meia-vida é umamolécula de ligação a albumina, um poli(glicoletilênico) (PEG) oupelomenosumaporção de umaregião Fc de umaimunoglobulina.
27.Método para produzirumamoléculaisolada de FN3 biespecíficamodificada com cisteínacomodefinidanareivindicação 18 ou 19, caracterizadopelofato de que compreende: (i)mutagenizarumasequência de ácidonucleico de umamolécula de FN3 biespecífica parental pela substituição de um oumaisresíduos de nucleotídeoporresíduos de nucleotídeo que codificam um resíduo de cisteína para codificar a molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína; (ii)expressar a molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína; e (iii)recuperar a molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína.
28.Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelofato de que a etapa de mutagenizarcompreendefazermutagênesesítio-direcionada.
29.Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelofato de que compreendeexpressar a molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteínaem E. coli.
30.Método, de acordo com a 28, caracterizadopelofato de que compreendeainda, após a etapa de recuperar, reagir a molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteína com um reagentequímicoreativo a tiol para gerarumamoléculabiespecíficamodificada com cisteínaquimicamenteconjugada.
31.Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelofato de que compreendeaindaumaetapaselecionadadentre o grupo que consisteem: (i)medir a ligaçãoao EGFR da molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteínaquimicamenteconjugada; (ii)medir a inibição de fosforilação de EGFR estimuladapor EGF emumalinhagemcelular pela molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteínaquimicamenteconjugada; (iii)medir a inibição de fosforilação de c-Met estimuladapor HGF emumalinhagemcelular pela molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteínaquimicamenteconjugada; e (iv)medir a inibição de crescimentocelular de umalinhagem de célulastumorais que superexpressa EGFR após a adição da molécula de FN3 biespecíficamodificada com cisteínaquimicamenteconjugada.
32.Domínioproteico de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelofato de que compreendeaindaumaporção que prolonga a meia-vida.
33.Domínioproteico de fibronectinatipo III (FN3) modificado com cisteína, de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelofato de que a porção que prolonga a meia-vida é umamolécula de ligação a albumina, um polietilenoglicol (PEG) oupelomenosumaporção de umaregião Fc de umaimunoglobulina.
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