WO2015199119A1 - 接着型細胞の培養方法、培養容器およびタンパク質の産生方法 - Google Patents

接着型細胞の培養方法、培養容器およびタンパク質の産生方法 Download PDF

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    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing adherent cells that can be grown without dying even if the adherent cells are in a floating state, a liquid medium, and an adherent cell that is suspended and alive in the liquid medium.
  • the present invention relates to a culture vessel using an alicyclic structure-containing polymer, and a protein production method.
  • the target protein is produced by a genetic recombination method.
  • recombinant drugs those containing as an ingredient an antibody used for cancer treatment or rheumatism treatment or a protein such as erythropoietin (EPO) which is a hormone for increasing red blood cells are known.
  • EPO erythropoietin
  • These recombinant drugs are considered to have a lower risk of unexpected side effects than conventional chemical synthesis drugs, and are attracting much attention.
  • recombinant drugs have not been widely spread because they are administered in large amounts for treatment and can be expensive to produce. Therefore, raising productivity is an issue.
  • Recombinant pharmaceuticals for example, introduce the target protein gene into adherent cells such as CHO cells, acclimatize to serum-free medium, and grow in suspension in recombinant CHO cells. Is produced by biosynthesis. In order to increase the productivity of the recombinant drug, it is considered preferable to culture the cells with a high cell density.
  • Non-patent Document 1 a method using a microcarrier is known (Non-patent Document 1).
  • this method CHO cells are adhered to microcarriers and dispersed in the culture medium. For this reason, the CHO cells can be stirred and cultured in the culture solution without being suspended.
  • this method has a problem that the microcarrier is expensive and that cells exist only on the surface of the microcarrier, so that it is difficult to sufficiently increase the cell density in the culture solution.
  • a gene having a gene encoding a target protein and a plasmid having a dihydrofolate reductase gene are introduced into CHO cells.
  • a method is described in which the recombinant CHO cells are cultured in a suspended state by repeatedly culturing the obtained recombinant CHO cells under conditions where the cell density is lower than usual.
  • the culture is repeated until the CHO cells are brought into a floating state, a long time of about 8 weeks is required until then.
  • the subculture period becomes long, the labor and cost for managing and confirming the state such as gene mutation and cell alteration will increase.
  • Patent Document 2 discloses that a recombinant CHO cell in which a human antithrombin gene and a dihydrofolate reductase gene are incorporated into a dihydrofolate reductase gene-deficient cell and is suspended is cultured using a hollow fiber culture apparatus.
  • a method for producing human antithrombin while suspending the cells is described.
  • this method has a problem in terms of cost because a device incorporating a hollow fiber is complicated and expensive.
  • the hollow fiber size was increased for mass culture, medium exchange at both ends of the hollow fiber was not uniform, and the medium was likely to be non-uniform. As a result, the pH of the medium changes and stress is applied to the cells in the hollow fiber, which may reduce the productivity of the target protein.
  • a culture vessel comprising an alicyclic structure-containing polymer, comprising a liquid medium and an adherent cell floating and alive in the liquid medium, and a protein utilizing the method for culturing the adherent cell It is an object to provide a production method.
  • the present inventors contacted a cultured cell with an alicyclic structure-containing polymer molded product, and thus an adhesive cell that originally requires an extracellular matrix as a scaffold. Has been found to be able to survive and grow in a suspended state in a liquid medium, and the present invention has been completed.
  • adherent cell culture methods (6) and (7) culture vessels, and (8) protein production methods are provided.
  • a method for culturing an adherent cell wherein the adherent cell is allowed to grow in a suspended state in a liquid medium by contacting the adherent cell with an alicyclic structure-containing polymer molded product. .
  • the method for culturing adherent cells according to (1) or (2), wherein the adherent cells are CHO cells.
  • the adhesion type cell culture method which can be made to proliferate without making it kill even if it makes a floating state without requiring special operation, a liquid culture medium, and the said liquid culture medium in this liquid medium.
  • a culture vessel using an alicyclic structure-containing polymer which contains adhering cells that are floating and surviving, and a method for producing a protein using the adhering cell culture method.
  • FIG. 1 is a graph showing the number of living cells relative to the number of days elapsed when recombinant CHO cells are cultured.
  • FIG. 2 is a graph showing the concentration of EPO in the medium when recombinant CHO cells are cultured for 17 days.
  • FIG. 3 is a graph showing the correlation between the concentration of EPO in the culture medium and the measured value of LDH activity reflecting leakage of intracellular components when recombinant CHO cells are cultured.
  • the method of the present invention is characterized in that an adhesive type cell and an alicyclic structure-containing polymer molded product are brought into contact with each other to grow the adhesive type cell in a state of being suspended in a liquid medium.
  • a cell culture method is characterized in that an adhesive type cell and an alicyclic structure-containing polymer molded product are brought into contact with each other to grow the adhesive type cell in a state of being suspended in a liquid medium.
  • Adhesive cells used in the present invention are not particularly limited and can be arbitrarily selected according to the purpose.
  • the adherent cell may be an adherent cell itself or a cell derived from an adherent cell.
  • Adhesive cells themselves are cells that can survive and proliferate by adhering to an extracellular matrix under normal culture conditions, and are also referred to as anchorage-dependent cells.
  • Adherent cell-derived cells are those that do not adhere to the extracellular matrix by applying some external factor to the adherent cells, such as cells that have been cultivated and cultivated, and can survive and proliferate even in suspension. A cell that can survive and proliferate.
  • adherent cells examples include genetically engineered host cells and virus-sensitive cells, such as CHO cells, VERO cells, NIH3T3 cells, HEK293 cells, etc. Among them, CHO cells are preferable.
  • the adherent cells are preferably genetically modified to express a foreign gene.
  • Such cells include those capable of expressing foreign genes, such as by transduction using phage or plasmid vectors.
  • the foreign gene can be arbitrarily selected according to the purpose.
  • EPO erythropoietin
  • interferon ⁇ , ⁇ , ⁇
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • interleukin granulocyte macrophage / colony stimulating factor GM-CSF
  • human growth hormone genes encoding physiologically active proteins such as cytokines and hormones such as insulin, glucagon HGF, blood coagulation factor VIII, and human antibodies.
  • a liquid medium is used when culturing cells.
  • a medium having a pH buffering action having an osmotic pressure suitable for cells, containing nutrient components of cells, and not toxic to cells is used.
  • the component exhibiting pH buffering action include tris hydrochloride, various phosphates, and various carbonates.
  • the osmotic pressure of the liquid medium is usually adjusted using an aqueous solution in which the concentrations of potassium ions, sodium ions, calcium ions, glucose and the like are adjusted so as to be almost the same as the osmotic pressure of the cells.
  • aqueous solution examples include physiological saline such as phosphate buffered saline, Tris buffered saline, and HEPES buffered saline; Ringer's solution such as lactated Ringer's solution, acetated Ringer's solution, and bicarbonated Ringer's solution; It is done.
  • the nutrient component of the cell include amino acids, nucleic acids, vitamins, minerals and the like.
  • various commercial products such as RPMI-1640, HAM, ⁇ -MEM, DMEM, EMEM, F-12, F-10, and M-199 can be used.
  • additives can also be mix
  • additives include inducers such as proteins, low molecular compounds having differentiation-inducing activity, minerals, metals, and vitamin components.
  • Additives used include ligands, agonists and antagonists that act on receptors on the cell surface; ligands, agonists and antagonists of nuclear receptors; extracellular matrices such as collagen and fivenectin; Simulated compounds; components that act on proteins involved in intracellular signal transduction pathways; components that act on enzymes of primary or secondary metabolism in cells; affect gene expression in the nucleus or mitochondria in cells Components to be given; DNA and RNA that can be introduced into cells in combination with viral vectors and the like. These additives can be used alone or in combination of two or more.
  • the cell culture conditions are not particularly limited, and can be appropriately determined according to the cells to be used and the purpose.
  • the cells can be cultured using a humidified thermostat having a carbon dioxide concentration of about 5% and a constant temperature in the range of 20 ° C. to 37 ° C.
  • the alicyclic structure-containing polymer molded product used in the present invention is formed by molding an alicyclic structure-containing polymer into an arbitrary shape.
  • the alicyclic structure-containing polymer is a resin having an alicyclic structure in the main chain and / or side chain, and preferably contains an alicyclic structure in the main chain from the viewpoint of mechanical strength, heat resistance, and the like.
  • Examples of the alicyclic structure include a saturated cyclic hydrocarbon (cycloalkane) structure and an unsaturated cyclic hydrocarbon (cycloalkene) structure. From the viewpoint of mechanical strength, heat resistance, etc., a cycloalkane structure or a cycloalkene structure. A structure is preferable, and a structure having a cycloalkane structure is most preferable.
  • the number of carbon atoms constituting the alicyclic structure is not particularly limited, but is usually 4 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 5 to 15. When the number of carbon atoms constituting the alicyclic structure is within this range, mechanical strength, heat resistance, and moldability are highly balanced, which is preferable.
  • the proportion of the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer may be appropriately selected according to the purpose of use, but is usually 30% by weight or more, preferably 50% by weight or more, more preferably 70% by weight. %. If the proportion of the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer is excessively small, the heat resistance is inferior, which is not preferable.
  • the remainder other than the repeating unit having an alicyclic structure in the alicyclic structure-containing polymer is not particularly limited and is appropriately selected according to the purpose of use.
  • alicyclic structure-containing polymer examples include (1) norbornene polymer, (2) monocyclic olefin polymer, (3) cyclic conjugated diene polymer, and (4) vinyl alicyclic carbonization.
  • examples thereof include hydrogen polymers and hydrides of (1) to (4).
  • norbornene-based polymers and hydrides thereof are preferable from the viewpoints of heat resistance, mechanical strength, and the like.
  • Norbornene-based polymer The norbornene-based polymer is obtained by polymerizing a norbornene-based monomer that is a monomer having a norbornene skeleton, and is obtained by ring-opening polymerization or by addition polymerization. Broadly divided into things.
  • Examples of the ring-opening polymer obtained by ring-opening polymerization include ring-opening polymers of norbornene monomers, ring-opening polymers of norbornene monomers and other monomers capable of ring-opening copolymerization, and these A hydride etc. are mentioned.
  • Examples of those obtained by addition polymerization include addition polymers of norbornene monomers and addition polymers of norbornene monomers and other monomers copolymerizable therewith.
  • a ring-opening polymer hydride of a norbornene-based monomer is preferable from the viewpoint of heat resistance, mechanical strength, and the like.
  • norbornene monomer examples include bicyclo [2.2.1] hept-2-ene (common name: norbornene), 5-methyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5,5-dimethyl. -Bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-ethyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-ethylidene-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene 5-vinyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-propenylbicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-methoxycarbonyl-bicyclo [2.2.1] hepta Bicyclic single units such as -2-ene, 5-cyanobicyclo [2.2.1] hept-2-ene, 5-methyl-5-methoxycarbonyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-ene Mer; Tricyclo [4.3.0 1,6 .
  • deca-3,7-diene (common name dicyclopentadiene), 2-methyldicyclopentadiene, 2,3-dimethyldicyclopentadiene, 2,3-dihydroxydicyclopentadiene, etc. Mer; Tetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene (tetracyclododecene), tetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene, 8-methyltetracyclo [4.4.0.1 2,5 . 1 7,10 ] -3-dodecene, 8-ethyltetracyclo [4.4.0.1 2,5 .
  • dec-3-ene (common name methanotetrahydrofluorene: also called 1,4-methano-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene) 1,4-methano-8-methyl-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene, 1,4-methano-8-chloro-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene, 1,4-methano-8 -Tetracyclic monomers such as bromo-1,4,4a, 9a-tetrahydrofluorene;
  • monomers capable of ring-opening copolymerization with norbornene monomers include cyclohexene, cycloheptene, cyclooctene, 1,4-cyclohexadiene, 1,5-cyclooctadiene, 1,5-cyclodecadiene, And monocyclic cycloolefin monomers such as 1,5,9-cyclododecatriene and 1,5,9,13-cyclohexadecatetraene.
  • These monomers may have one or more substituents. Examples of the substituent include an alkyl group, an alkylene group, an aryl group, a silyl group, an alkoxycarbonyl group, and an alkylidene group.
  • ⁇ -olefin monomers having 2 to 20 carbon atoms such as ethylene, propylene, 1-butene, 1-pentene and 1-hexene; cyclobutene, cyclopentene, cyclohexene, cyclooctene, tetracyclo [9.2.1.0 2,10.
  • Cycloolefin monomers such as 0 3,8 ] tetradeca-3,5,7,12-tetraene (also referred to as 3a, 5,6,7a-tetrahydro-4,7-methano-1H-indene);
  • Non-conjugated diene monomers such as 4-hexadiene, 4-methyl-1,4-hexadiene, 5-methyl-1,4-hexadiene, 1,7-octadiene, and the like.
  • ⁇ -olefin monomers are preferable, and ethylene is more preferable.
  • These monomers may have one or more substituents. Examples of the substituent include an alkyl group, an alkylene group, an aryl group, a silyl group, an alkoxycarbonyl group, and an alkylidene group.
  • a ring-opening polymer of a norbornene-based monomer, or a ring-opening polymer of a norbornene-based monomer and another monomer capable of ring-opening copolymerization with a monomer component is a known ring-opening polymerization. It can be obtained by polymerization in the presence of a catalyst.
  • the ring-opening polymerization catalyst include a catalyst comprising a metal halide such as ruthenium or osmium, a nitrate or an acetylacetone compound, and a reducing agent, or a metal halide or acetylacetone such as titanium, zirconium, tungsten, or molybdenum.
  • a catalyst comprising a compound and an organoaluminum compound can be used.
  • the ring-opening polymer hydride of a norbornene-based monomer is usually obtained by adding a known hydrogenation catalyst containing a transition metal such as nickel or palladium to the polymerization solution of the ring-opening polymer and then adding a carbon-carbon unsaturated bond. Can be obtained by hydrogenation.
  • a catalyst composed of a titanium, zirconium or vanadium compound and an organoaluminum compound can be used.
  • Monocyclic cyclic olefin polymer for example, an addition polymer of a monocyclic olefin monomer such as cyclohexene, cycloheptene, or cyclooctene can be used. it can.
  • Cyclic conjugated diene polymer As the cyclic conjugated diene polymer, for example, a polymer obtained by subjecting a cyclic conjugated diene monomer such as cyclopentadiene or cyclohexadiene to 1,2- or 1,4-addition polymerization, and The hydride can be used.
  • Vinyl alicyclic hydrocarbon polymer examples include polymers of vinyl alicyclic hydrocarbon monomers such as vinyl cyclohexene and vinyl cyclohexane and their hydrides; And hydrides of aromatic ring portions of polymers of vinyl aromatic monomers such as ⁇ -methylstyrene.
  • the vinyl alicyclic hydrocarbon polymer may be a copolymer with other monomers copolymerizable with these monomers.
  • an alicyclic structure containing polymer Although there is no special restriction
  • the glass transition temperature of the alicyclic structure-containing polymer may be appropriately selected depending on the purpose of use, but is usually 50 to 300 ° C, preferably 100 to 280 ° C, particularly preferably 115 to 250 ° C, and more preferably 130. ⁇ 200 ° C. When the glass transition temperature is within this range, heat resistance and molding processability are highly balanced and suitable. In the present invention, the glass transition temperature is measured based on JIS K7121.
  • alicyclic structure-containing polymers can be used alone or in combination of two or more.
  • a compounding agent usually used in thermoplastic resin materials for example, a soft polymer, an antioxidant, an ultraviolet absorber, a light stabilizer, a near infrared absorber, a release agent.
  • Additives such as colorants such as dyes and pigments, plasticizers, antistatic agents, fluorescent brighteners, and the like can be added in amounts that are usually employed.
  • the alicyclic structure-containing polymer may be mixed with another polymer other than the soft polymer (hereinafter simply referred to as “other polymer”).
  • the amount of the other polymer mixed with the alicyclic structure-containing polymer is usually 200 parts by weight or less, preferably 150 parts by weight or less, more preferably 100 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the alicyclic structure-containing polymer. It is as follows. If the proportion of various compounding agents and other polymers to be blended with the alicyclic structure-containing polymer is too high, cells will not float easily, so all are blended within the range that does not impair the properties of the alicyclic structure-containing polymer. It is preferable.
  • the mixing method with the compounding agent and other polymers is not particularly limited as long as the compounding agent is sufficiently dispersed in the polymer. Moreover, there is no special restriction
  • a blending method for example, a method of kneading a resin in a molten state using a mixer, a uniaxial kneader, a biaxial kneader, a roll, a Brabender, an extruder, etc., after dissolving and dispersing in a suitable solvent, Examples thereof include a method of removing the solvent by a coagulation method, a casting method, or a direct drying method.
  • a biaxial kneader after kneading, it is usually extruded in a rod shape in a molten state, cut into an appropriate length with a strand cutter, and pelletized in many cases.
  • the molding method of the alicyclic structure-containing polymer can be arbitrarily selected according to the shape of the alicyclic structure-containing polymer molded product used when contacting the cells.
  • molding methods include injection molding, extrusion molding, cast molding, inflation molding, blow molding, vacuum molding, press molding, compression molding, rotational molding, calendar molding, and rolling molding. , Cutting molding method, spinning and the like, and these molding methods can be combined, or post-treatment such as stretching can be carried out as necessary after molding.
  • a plate shape, a powder form, a granular form, a string form, a sheet form, and other shapes may be sufficient.
  • the surface may be flat, may have an uneven shape, or may be a hollow molded body. Different shaped bodies can be combined into another shaped body with or without an adhesive or the like.
  • culture containers such as dishes, plates, bags, tubes, scaffolds, cups, jars and fermenters; parts of culture devices such as stirring blades, stirrers, baffles, and connecting tubes; It may be a member constituting part or all of a culture instrument used for culture operation such as a pipette, a stirring element, a filter, and a cell scraper.
  • the molded body when the molded body is brought into contact with the cultured cells, it is preferable to sterilize the molded body.
  • heating methods such as the high-pressure steam method and dry heat method; radiation methods that irradiate radiation such as ⁇ -rays and electron beams; irradiation methods that irradiate high-frequency;
  • the method can be selected from methods generally employed in the medical field, such as a gas method in which a gas is brought into contact; a filtration method using a sterilizing filter; Among these, the gas method is preferable because the change in the surface state is small.
  • these molded object surfaces can also perform processes other than the objective of sterilization generally performed with respect to a culture container, such as a plasma process, a corona discharge process, an ozone process, and an ultraviolet irradiation process.
  • processes other than the objective of sterilization generally performed with respect to a culture container such as a plasma process, a corona discharge process, an ozone process, and an ultraviolet irradiation process.
  • the surface treatment operation is not performed, or the water contact angle on the bottom surface of the container before the surface treatment (the side in contact with the culture solution) is ⁇ 20. %, Preferably ⁇ 10% weak surface treatment.
  • the water contact angle was determined by using a fully automatic contact angle meter (“LCD-400S” manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.), cutting the bottom of the dish with a circle cutter of ⁇ 30 mm, and one side centered on the sample.
  • a fully automatic contact angle meter (“LCD-400S” manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.)
  • any method may be adopted depending on the shape of the alicyclic structure-containing polymer molded product.
  • a method of culturing cells in a medium mixed with an alicyclic structure-containing polymer molded product; a method of culturing cells in a culture vessel formed using the alicyclic structure-containing polymer; an alicyclic structure-containing polymer A method of performing a culture operation using a culture device formed using the above, and the like can be mentioned, and these can also be combined.
  • the contact temperature between the cultured cell and the alicyclic structure-containing polymer molded product is not particularly limited as long as the cell can grow.
  • the cells cultured for a long time by the method of the present invention and surviving in a floating state usually form a cell mass.
  • a “cell mass” is a group of cells other than a single cell, and refers to a state in which two or more cells are combined into one.
  • the term “surviving” means a state in which the cell undergoes metabolic activity and can proliferate. For example, when a component contained in an extracellular medium has invaded and penetrated into the cell, if the component is unnecessary for the vital activity of the cell, it can cause a life activity that can be eliminated outside the cell. Say.
  • cells are in a state in which a dye that is not necessary for vital activities such as trypan blue is added to the extracellular fluid, and the dye that has entered and penetrated the cell can be excluded from the cell.
  • Cells that are alive or cannot be excluded can be determined as dead cells.
  • the cells in the cell mass are not killed, and if the cells are transduced cells, they have the ability to proliferate and produce proteins.
  • adhesive cells can be cultured in a floating state, and therefore can be cultured at a high density. “High density” means 1.5 times or more, preferably 2 or more times the number of confluent cells cultured in a polystyrene dish.
  • the culture method of the present invention can be cultured in a floating state at a high density even if it is an adherent cell, it is preferably used when producing protein in the cell.
  • the protein is produced in large quantities by contacting the cell with an alicyclic structure-containing polymer molded product. Can do.
  • virus particles containing the EPO gene were prepared by transducing the constructed plasmid pLXRN-EPO and the plasmid pVSV-G (Clontech) into package cells GP293T cells (Clontech).
  • Lipofectamine manufactured by Invitrogen was used as a gene introduction reagent for the introduction of plasmid pLXRN-EPO into cells, and the gene introduction was performed according to the manufacturer's manual.
  • the GP293T cells subjected to the gene transfer operation are cultured, the culture supernatant is removed, filtered, and 8 ⁇ g / ml polybrene (manufactured by Santacruz) is added to the culture containing virus particles retaining the EPO gene.
  • a clear sample was prepared.
  • the virus retaining the EPO gene The particles were infected with CHO cells. After 8 hours of incubation, the culture medium for CHO cells was changed to a culture operation for CHO cells producing recombinant EPO.
  • Viral infection was confirmed by genomic PCR as follows. First, using Instagene (manufactured by BioRad), the genome was extracted from the infected CHO cells, and it was confirmed by PCR that the pLXRN-EPO sequence was introduced into the genome. Primers used for PCR were pLXRN-seq-F (5′-CGCCCTCCGTCTGAATTTT) and pLXRN-seq-R (TCCCTATGCAAAAGCGAAAC). In order to select CHO cells infected with the virus and having the EPO gene incorporated in the genome, antibiotic G418 is added to the medium, the culture is maintained, and antibiotic E418 resistant CHO cells are selected by drug selection. Producing CHO cells (hereinafter referred to as EPO producing CHO cells) were selected.
  • Example 1 As an alicyclic structure-containing polymer, ZEONEX (registered trademark) 790R (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd., norbornene-based ring-opening polymer hydride; hereinafter simply referred to as “790R”) is used to produce a dish having a diameter of 3 cm by injection molding. Was made. Hereinafter, this dish is referred to as “790R dish”.
  • EPO-producing CHO cells were seeded at 1.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 using a 790R dish as a culture container and Ham medium containing 10% fetal calf serum as a liquid medium, and 5% CO Culturing was performed for 17 days under conditions of 2 atmospheres and 37 ° C.
  • the amount of the medium decreased due to the evaporation of water, so that the same amount of the medium as the decreased amount was added in order to maintain the amount of the medium.
  • the number of viable cells was measured by the following method.
  • Example 1 In Example 1, instead of using a 790R dish, a polystyrene dish [Falcon (registered trademark) dish (Becton Dickinson, model number 353001)] (hereinafter referred to as “polystyrene dish”) was used. The culture was performed in the same manner as in Example 1, and the number of viable cells was counted.
  • Falcon registered trademark
  • Becton Dickinson model number 353001
  • EPO-producing CHO cells in a dish made from 790R were observed to be agglomerated and proliferating in a non-contact state.
  • many of the living EPO-producing CHO cells are attached to the bottom surface, and the cells floating in the medium exist as a single cell, and most of them are , Was dead.
  • the number of viable cells in the culture using the 790R dish is about 5 times the value on the seventh day of culture compared to the culture using the polystyrene dish.
  • the dish made from 790R can re-increase the number of living cells easily by operation, such as addition of a culture medium.
  • the increase in the number of viable cells was hardly observed even when the medium was added.
  • Example 2 A 790R dish was used as a culture vessel, and EPO-producing CHO cells were repeatedly cultured three times. Using the medium on the 17th day of culture, the amount of active EPO was measured by ELISA (human EPO Platinum ELISA manufactured by eBioscience).
  • Example 2 In Example 2, instead of the 790R dish, the culture was performed in the same manner as in Example 2 except that a polystyrene dish was used, and the amount of active EPO was measured.
  • the amount of EPO produced from EPO-producing CHO cells cultured in a 790R dish is about 5 times that in a polystyrene dish corresponding to an existing culture technique. According to the present invention, it has been shown that a high concentration of EPO that cannot be obtained by the prior art can be produced.
  • Example 3 A 790R dish was used as a culture vessel, and EPO-producing CHO cells were cultured. Subsequently, the activity of lactate dehydrogenase (hereinafter referred to as “LDH”), an intracellular metabolic enzyme, was measured using the culture medium, and the degree of leakage of intracellular components due to the death of EPO-producing CHO cells was examined. . In addition, LDH measurement used LDH Cytotoxicity Detection Kit (made by Takara).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Example 3 In Example 3, instead of the 790R dish, the culture was performed in the same manner as in Example 3 except that a polystyrene dish was used, and LDH measurement was performed.
  • the horizontal axis represents the EPO concentration in the medium
  • the vertical axis represents the LDH activity value.
  • the measured values for the medium when cultured in the 790R dish are shown as circles, and the measured values for the medium when cultured in the polystyrene dish are shown as triangles. In both dishes, the amount of leaked cells increases as the EPO concentration increases, but the amount of leaked cells in the 790R dish compared to the culture in the polystyrene dish. It can be seen that there are fewer.
  • the cells when a recombinant protein is produced using cells, the cells can be cultured under higher density conditions, and the target protein can be obtained at a high concentration. For this reason, the number of operations in cell culture can be reduced, and the culture scale can be further reduced, thereby reducing labor costs, costs required for the apparatus, medium, and the like.
  • the target protein can be obtained at a high concentration, it is possible to reduce the trouble of concentrating easily denatured proteins and reduce the risk of denaturing such proteins.
  • purifying proteins purification costs are reduced and it is economically advantageous. This reduces the risk of contamination with components that can cause side effects.
  • the method of the present invention is a smooth progress in experiments for evaluating biological activity. Can contribute. As a result, development costs for pharmaceuticals and the like are suppressed, and manufacturing costs can be reduced.

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Abstract

　本発明は、接着型細胞を浮遊状態にしても、死滅させることなく増殖させることができる接着型細胞の培養方法、液体培地と、当該液体培地中に浮遊して生存している接着型細胞とを含む、脂環構造含有重合体を用いてなる培養容器、および、タンパク質の産生方法である。接着型細胞と脂環構造含有重合体成形体とを接触させることにより、当該接着型細胞を液体培地中に浮遊させた状態で増殖させることができる。

Description

接着型細胞の培養方法、培養容器およびタンパク質の産生方法
　本発明は、接着型細胞を浮遊状態にしても、死滅させることなく増殖させることができる接着型細胞の培養方法、液体培地と、当該液体培地中に浮遊して生存している接着型細胞とを含む、脂環構造含有重合体を用いてなる培養容器、および、タンパク質の産生方法に関する。
　創薬研究や、万能細胞、幹細胞を対象とした研究において、目的のタンパク質を遺伝子組み換え法により産生させることが行われている。例えば、組み換え医薬品として、ガン治療やリウマチ治療に用いられる抗体や、赤血球を増やすためのホルモンであるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）などのタンパク質を成分とするものが知られている。これらの組み換え医薬品は、予期しない副作用が起きるリスクが従来の化学合成による医薬品よりも少ないと考えられており、非常に注目されている。
　しかしながら、組み換え医薬品は、治療のために投与する量が多く、また、生産するための費用が高いことがあり、十分に普及するには至っていない。したがって、生産性を上げることが課題となっている。
　組み換え医薬品は、例えば、ＣＨＯ細胞などの接着型細胞に、目的のタンパク質の遺伝子を導入して、無血清培地に馴化させ、浮遊状態で増殖するようになった組み換えＣＨＯ細胞内で、目的のタンパク質を生合成させることにより生産される。組み換え医薬品の生産性を上げるためには、細胞の密度が高い状態で細胞を培養することが好ましいと考えられる。
　目的のタンパク質の生産性を向上させる方法として、マイクロキャリアを利用するものが知られている（非特許文献１）。この方法においては、ＣＨＯ細胞をマイクロキャリアに接着させ、これを培養液中に分散させる。このため、ＣＨＯ細胞を浮遊状態にせずに、培養液中で攪拌培養することができる。
　しかしながら、この方法においてはマイクロキャリアが高価であるという問題や、マイクロキャリアの表面にのみ細胞が存在するため、培養液中における細胞密度を十分に高くすることが困難であるという問題があった。
　また、接着型細胞であるＣＨＯ細胞を浮遊させて培養する方法としては、例えば、特許文献１には、目的のタンパク質をコードする遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有するプラスミドをＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、得られた組み換えＣＨＯ細胞を、通常よりも細胞密度が低い条件で培養を繰り返すことにより、組み換えＣＨＯ細胞を浮遊状態で培養する方法が記載されている。
　しかしながら、この方法は、ＣＨＯ細胞を浮遊状態にするまでに培養を繰り返すものであるため、それまでに８週間程度という長い時間が必要になる。また、継代培養期間が長くなると、遺伝子の変異や細胞の変質などの状態を管理し、確認する手間と費用が増加することとなる。
　また、特許文献２には、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損株細胞に、ヒトアンチトロンビン遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を組み込み、浮遊状態とした組み換えＣＨＯ細胞を、ホローファイバー型培養装置を用いて培養することで、この細胞を浮遊させながら、ヒトアンチトロンビンを製造する方法が記載されている。
　しかしながら、この方法には、ホローファイバーを組み込んだ装置が複雑で高価であるため、費用面での問題があった。また、大量培養のためにホローファイバーサイズを大きくすると、ホローファイバーの両端での培地交換が均等ではなく、培地が不均一になりやすかった。この結果、培地のｐＨ等が変化し、ホローファイバー内の細胞にストレスがかかるため、目的のタンパク質の生産性が低下するおそれがあった。
特開平２－００９３８８号公報 特開２００５－０７３５０９号公報
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｃａｔａｌｏｇ／０８３０．ｈｔｍｌ
　上記のように、これまでにも接着型細胞を高密度の条件で培養する技術がいくつか提案されてきたものの、より効率よく、かつ、より安価に培養し得る方法が要望されているのが現状である。
　本発明は、かかる実情に鑑みてなされたものであり、接着型細胞を特殊な操作を要さずに、浮遊状態にしても、死滅させることなく増殖させることができる接着型細胞の培養方法、液体培地と、当該液体培地中に浮遊して生存している接着型細胞とを含む、脂環構造含有重合体を用いてなる培養容器、および、前記接着型細胞の培養方法を利用したタンパク質の産生方法、を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、培養細胞に、脂環構造含有重合体成形体を接触させることで、本来、足場である細胞外基質を必要とする接着型細胞を、液体培地中に浮遊状態で生存かつ増殖させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　かくして本発明によれば、下記（１）～（５）の接着型細胞の培養方法、（６）、（７）の培養容器、及び（８）のタンパク質の産生方法が提供される。
（１）接着型細胞と脂環構造含有重合体成形体とを接触させることにより、当該接着型細胞を液体培地中に浮遊させた状態で増殖させることを特徴とする、接着型細胞の培養方法。
（２）前記接着型細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされたものである（１）に記載の接着型細胞の培養方法。
（３）前記接着型細胞がＣＨＯ細胞である（１）又は（２）記載の接着型細胞の培養方法。
（４）前記接着型細胞が、外来遺伝子を発現することのできる細胞である（１）又は（２）に記載の接着型細胞の培養方法。
（５）前記浮遊状態の接着型細胞が、細胞塊を形成したものである（１）～（４）のいずれかに記載の接着型細胞の培養方法。
（６）液体培地と、当該液体培地中に浮遊して生存している接着型細胞とを含む、脂環構造含有重合体を用いてなる培養容器。
（７）前記接着型細胞が細胞塊を形成したものである（６）に記載の培養容器。
（８）生理活性タンパク質をコードする外来遺伝子を発現することのできる組換え細胞の培養中に、当該細胞と脂環構造含有重合体成形体とを接触させることを特徴とする、当該タンパク質の産生方法。
　本発明によれば、接着型細胞を特殊な操作を要さずに、浮遊状態にしても、死滅させることなく増殖させることができる接着型細胞の培養方法、液体培地と、当該液体培地中に浮遊して生存している接着型細胞とを含む、脂環構造含有重合体を用いてなる培養容器、および、前記接着型細胞の培養方法を利用したタンパク質の産生方法、が提供される。
図１は、組換えＣＨＯ細胞を培養したときの、経過日数に対する生細胞数を示すグラフである。 図２は、組換えＣＨＯ細胞を１７日間培養したときの、培地中のＥＰＯの濃度を示すグラフである。 図３は、組換えＣＨＯ細胞を培養したときの、培地中のＥＰＯの濃度と、細胞内の成分の漏洩を反映したＬＤＨ活性測定値の相関を示すグラフである。
　本発明の方法は、接着型細胞と脂環構造含有重合体成形体とを接触させることにより、当該接着型細胞を、液体培地中に浮遊させた状態で増殖させることを特徴とする、接着型細胞の培養方法である。
　本発明に用いる接着型細胞は、特に限定されず、目的に応じて任意に選択することができる。本発明において、接着型細胞とは接着型細胞そのものであっても、接着型細胞由来の細胞であってもよい。接着型細胞そのものとは、通常の培養条件において、細胞外基質に接着することで生存及び増殖が可能な細胞のことで、足場依存性細胞とも言われる細胞である。接着型細胞由来の細胞とは、接着型細胞を馴化培養し浮遊状態でも生存・増殖可能になった細胞など、接着型細胞に何らかの外的要因を与えることで細胞外基質に接着しなくても生存し、かつ増殖が可能な細胞である。接着型細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞などに代表される、遺伝子操作の宿主細胞やウイルス感受性のある細胞が挙げられ、なかでもＣＨＯ細胞が好ましい。
　また、接着型細胞は、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされたものが好ましい。かかる細胞としては、ファージやプラスミドのベクター等を用いた形質導入などによって、外来遺伝子を発現することのできるものが挙げられる。
　ここで外来遺伝子は、目的に応じて任意に選択することができる。具体的には、エリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」という）、インターフェロン（α、β、γ）、顆粒球コロニー刺激因子Ｇ－ＣＳＦ、インターロイキン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子ＧＭ－ＣＳＦ、人成長ホルモン、インスリン、グルカゴンＨＧＦ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒト型抗体などのサイトカインやホルモンのような生理活性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
　こうした組換え細胞の培養中に脂環構造含有重合体成形体を接触させると、生理活性タンパク質の生産量が増大する。
　本発明において、細胞を培養する際には、液体培地が用いられる。
　液体培地としては、通常、ｐＨ緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
　ｐＨ緩衝作用を示す成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
　液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。かかる水溶液としては、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；等が挙げられる。
　細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
　液体培地としては、ＲＰＭＩ－１６４０、ＨＡＭ、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９等の各種市販品を利用することができる。
　液体培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、タンパク質等の誘導因子、分化誘導活性を有する低分子化合物、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
　用いる添加剤としては、細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチンなどの細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝または２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内またはミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；ウィルスベクターなどと組み合わせて細胞内に導入することができるＤＮＡやＲＮＡ；等が挙げられる。
　これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
　細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
　例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃～３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。
　本発明に用いる脂環構造含有重合体成形体は、脂環構造含有重合体を任意の形状に成形してなるものである。
　脂環構造含有重合体は、主鎖及び／又は側鎖に脂環構造を有する樹脂であり、機械的強度、耐熱性などの観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましい。
　前記脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造などが挙げられるが、機械的強度、耐熱性などの観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、中でもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。
　脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４～３０個、好ましくは５～２０個、より好ましくは５～１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、及び成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。
　脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。
　脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、（４）ビニル脂環式炭化水素系重合体、及び（１）～（４）の水素化物などが挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体及びその水素化物が好ましい。
（１）ノルボルネン系重合体
　ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
　開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体及びノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、ならびにこれらの水素化物などが挙げられる。付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体などが挙げられる。これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましい。
　ノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン（慣用名ノルボルネン）、５－メチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５，５－ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチリデン－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－ビニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メチル－５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン等の２環式単量体；
トリシクロ［４．３．０１，６．１２，５］デカ－３，７－ジエン（慣用名ジシクロペンタジエン）、２－メチルジシクロペンタジエン、２，３－ジメチルジシクロペンタジエン、２，３－ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８，９－ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチル－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチリデン－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－メチル－８－カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、
７，８－ベンゾトリシクロ［４．３．０．１２，５］デカ－３－エン（慣用名メタノテトラヒドロフルオレン：１，４－メタノ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４－メタノ－８－メチル－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－クロロ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－ブロモ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４－シクロヘキサジエン、１，５－シクロオクタジエン、１，５－シクロデカジエン、１，５，９－シクロドデカトリエン、１，５，９，１３－シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
　これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン等の炭素数２～２０のα－オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０２，１０．０３，８］テトラデカ－３，５，７，１２－テトラエン（３ａ，５，６，７ａ－テトラヒドロ－４，７－メタノ－１Ｈ－インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４－ヘキサジエン、４－メチル－１，４－ヘキサジエン、５－メチル－１，４－ヘキサジエン、１，７－オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
　これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α－オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
　これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
　ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウムなどの金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデンなどの金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
　ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウムなどの遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素－炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
　ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
（２）単環の環状オレフィン系重合体
　単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンなどの、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体を用いることができる。
（３）環状共役ジエン系重合体
　環状共役ジエン系重合体としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエンなどの環状共役ジエン系単量体を１，２－又は１，４－付加重合した重合体及びその水素化物などを用いることができる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体
　ビニル脂環式炭化水素重合体としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサンなどのビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体及びその水素化物；スチレン、α－メチルスチレンなどのビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；などが挙げられる。ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。
　脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリスチレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００～５００，０００、より好ましくは８，０００～２００，０００、特に好ましくは１０，０００～１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
　脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０～３００℃、好ましくは１００～２８０℃、特に好ましくは１１５～２５０℃、更に好ましくは１３０～２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
　本発明においてガラス転移温度は、ＪＩＳ　Ｋ　７１２１に基づいて測定されたものである。
　これらの脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
　また、脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
　また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００重量部に対して、通常２００重量部以下、好ましくは１５０重量部以下、より好ましくは１００重量部以下である。
　脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
　配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機などを用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法などが挙げられる。
　二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
　脂環構造含有重合体の成形方法は、細胞と接触させる際に用いる脂環構造含有重合体成形体の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
　脂環構造含有重合体成形体の形状に格別な制限はなく、板状、粉状、粒状、紐状、シート状、その他いかなる形状であってもよい。また、その表面は平らであっても、凹凸形状を有していてもよいし、中空状の成形体であってもよい。また異なる形状の成形体を、接着剤等を介して又は介さずに組み合わせて別の成形体にすることもできる。
　また、細胞と接触することができる限りにおいて、ディッシュ、プレート、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンターなどの培養容器；攪拌翼、攪拌子、バッフル、連結チューブなど培養装置の部品；ピペット、攪拌素子、フィルタ、セルスクレイパーなどの培養操作に用いる培養器具；等の一部又は全部を構成する部材であってもよい。
　本発明においては、成形体を、培養細胞と接触させるに当たり、成形体を滅菌処理することが好ましい。
　滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。なかでも、表面状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。
　また、これらの成形体表面は、プラズマ処理、コロナ放電処理、オゾン処理、紫外線照射処理など培養容器に対して一般的に施す、滅菌目的以外の処理を行うこともできる。ただし、これらの表面処理操作を施すことにより発生する費用を抑えることができることや、表面処理に伴う形成体表面の部分分解により清浄性が損なわれるおそれがあること、細胞の浮遊化能が低下するおそれがあることなどから、これらの表面処理操作を行わない、又は表面処理前の容器底面（培養液に接する側）の水接触角に対して、使用時の同底面の水接触角が±２０％、好ましくは±１０％の弱い表面処理しかされていないことが好ましい。ここで、水接触角は、全自動接触角計（協和界面科学社製「ＬＣＤ－４００Ｓ」）を用い、ディッシュ底面をΦ３０ｍｍのサークルカッターで切り取って試料の中心と、そこを中央とする１辺２０ｍｍの正方形の頂点４か所、計５か所を測定点とし、液滴の半径ｒと高さｈを求め、ｔａｎθ１＝ｈ／ｒ、θ＝２ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）で求められるθである（θ／２法）。
　培養細胞と脂環構造含有重合体成形体とを接触させる方法は、脂環構造含有重合体成形体の形状に応じて任意の方法を採用すればよい。例えば、脂環構造含有重合体成形体を混合した培地中で細胞を培養する方法；脂環構造含有重合体を用いて成形された培養容器内で細胞を培養する方法；脂環構造含有重合体を用いて成形された培養器具を用いて培養操作を行う方法；などが挙げられ、これらを組み合わせることもできる。
　尚、細胞には、情報伝達能があるため、培養中の全ての培養細胞が脂環構造含有重合体成形体に接触する必要はなく、また、培養期間全体に渡って両者が接触している必要もない。但し、接触による効果は経時的に低下するため、接触時間は長い方が好ましい。
　培養細胞と、脂環構造含有重合体成形体との接触温度は細胞が増殖できる温度であれば特に制限されない。
　本発明の方法により長期間培養され浮遊状態で生存している細胞は、通常、細胞塊を形成している。「細胞塊」とは、単独での細胞以外の細胞集合であり、２個以上の細胞が１つにまとまった状態をいう。
　本発明において細胞が「生存している」とは、細胞内で代謝活動を行い、細胞増殖が可能な状態をいう。例えば、細胞外の培地中に含まれる成分が細胞内部に侵入・浸透してきた場合に、その成分が細胞の生命活動に不要であれば、細胞外部に排除できる生命活動を起こすことが出来る状態をいう。細胞が生存しているかどうかは、実験的には、トリパンブルーなどの生命活動に不要な色素を細胞外の液に添加し、細胞内に侵入・浸透した色素を細胞外に排除できる状態の細胞が生存している細胞、排除できない細胞は死滅細胞として判定することができる。
　本発明の方法においては、細胞塊中の細胞も死滅はせず、細胞が形質導入された細胞であれば、増殖し、かつタンパク質を産生する能力を有している。
　このように、本発明の方法においては、接着型細胞であっても、浮遊状態で培養することが可能であるため、高い密度で培養することができる。
　「高い密度」とは、ポリスチレン製ディッシュで培養した接着細胞のコンフルエントの細胞数の１．５倍以上、望ましくは、２倍以上のことをいう。
　上記のように、本発明の培養方法は、接着型細胞であっても、浮遊状態で、高い密度で培養することができるため、当該細胞にタンパク質を産生させる際に、好ましく利用される。
　例えば、生理活性タンパク質をコードする外来遺伝子を発現することのできる組換え細胞の培養中に、当該細胞と脂環式構造含有重合体成形体とを接触させることにより、タンパク質を大量に産生させることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔製造例１〕組み換えＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の作製
　抗生物質Ｇ４１８への耐性遺伝子を内包するベクターｐＬＸＲＮ（Ｃｈｌｏｎｔｅｃｈ社製）の発現遺伝子の挿入サイトに、ＥＰＯ遺伝子配列を挿入してプラスミドｐＬＸＲＮ－ＥＰＯを構築した。構築したプラスミドの中のＥＰＯ遺伝子は、その塩基配列解析を行うことにより確認した。
　次に、構築したプラスミドｐＬＸＲＮ－ＥＰＯとプラスミドｐＶＳＶ－Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、パッケージ細胞であるＧＰ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に形質導入することにより、ＥＰＯ遺伝子を含有するウイルス粒子を調製した。
　なお、細胞へのプラスミドｐＬＸＲＮ－ＥＰＯの導入操作のための遺伝子導入試薬として、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用い、遺伝子導入操作は、メーカーのマニュアルに従った。
　遺伝子導入操作を行ったＧＰ２９３Ｔ細胞を培養し、その培養上清を取り出して、フィルタ濾過し、８μｇ／ｍｌのポリブレン（ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）を加えることにより、ＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子を含む培養上清試料を調製した。
　続いて、あらかじめ培養したＣＨＯ細胞試料の培養液を除いて、上記のＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子を含む培養上清試料を添加して、８時間培養維持することにより、ＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子をＣＨＯ細胞に感染させた。
　８時間のインキュベーションの後に、ＣＨＯ細胞の培養培地に交換を行い、組み換えＥＰＯを産生するＣＨＯ細胞の培養操作を行った。
　ウイルスの感染は、以下のようにゲノムＰＣＲにより確認した。まず、Ｉｎｓｔａｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、感染操作を行ったＣＨＯ細胞からゲノムを抽出し、ｐＬＸＲＮ－ＥＰＯ配列がゲノムに導入されていることをＰＣＲで確認した。ＰＣＲに用いたＰｒｉｍｅｒは、ｐＬＸＲＮ－ｓｅｑ－Ｆ（５’－ＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＴＧＡＡＴＴＴＴＴ）及びｐＬＸＲＮ－ｓｅｑ－Ｒ（ＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣ）とした。
　ウイルスが感染し、ゲノムにＥＰＯ遺伝子が組み込まれたＣＨＯ細胞を選抜するため、抗生物質Ｇ４１８を培地に添加し、培養維持して、抗生物質Ｇ４１８耐性のＣＨＯ細胞を薬剤選択することにより、組み換えＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞（以下、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞という。）を選抜した。
〔実施例１〕
　脂環構造含有重合体として、ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒ（日本ゼオン社製、ノルボルネン系開環重合体水素化物；以下、単に「７９０Ｒ」という）を用いて、射出成形法により、直径３ｃｍのディッシュを作製した。以下、このディッシュを「７９０Ｒ製ディッシュ」という。
　培養容器として７９０Ｒ製ディッシュを使用し、液体培地として１０％牛胎児血清を含むＨａｍ培地を使用して、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種して、５％ＣＯ２雰囲気３７℃の条件で１７日間培養を行った。培養途中１１日時点で、水の蒸散により培地液量が減少したので、培地液量を保持するために、減少した液量と同量の培地を添加した。
　培養から２日目、７日目、１０日目、１４日目及び１７日目に、以下の方法により生細胞数を計測した。
（細胞数の計測）
　浮遊状態にある細胞については、培養上清を取り出して遠心処理により沈殿回収した細胞をトリパンブルー染色して生細胞と死滅細胞を区別して、生細胞数を計測した。
　一方、ディッシュ底面に接着している細胞は、生理食塩水で洗浄後、トリプシン処理によりディッシュから細胞を剥離した後、これらをトリパンブルー染色して生細胞と死細胞を区別して、生細胞数を計測した。
〔比較例１〕
　実施例１において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、ポリスチレン製ディッシュ〔ファルコン（登録商標）ディッシュ（ベクトンデッキンソン社製、型番３５３００１）〕（以下、「ポリスチレン製ディッシュ」と称する）を使用したことを除き、実施例１と同様にして培養を行い、生細胞数を計測した。
　培養７日目では、７９０Ｒ製ディッシュのＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞は、塊状となって、非接触型の状態で増殖していることが観察された。一方、ポリスチレン製ディッシュでは、生きているＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の多くは底面に接着した状態のものであり、培地中に浮遊している細胞は、１個の細胞単独で存在し、かつ、ほとんどが、死滅状態にあった。
　図１に示すように、７９０Ｒ製ディッシュを用いた培養における生細胞数は、ポリスチレン製ディッシュを用いた培養のものに比較して、培養７日目で、約５倍の値である。
　また、培養１０日目では、７９０Ｒ製ディッシュとポリスチレン製ディッシュともに、生細胞数が減少したが、１１日目での培地追加により、７９０Ｒ製ディッシュでの生細胞は、再び増加している。このように、７９０Ｒ製ディッシュは、培地追加などの操作により、容易に、生細胞数を再増加させ得るものである。
　一方、ポリスチレン製ディッシュでは、培地追加によっても、生細胞数の増加はほとんど観察されなかった。
〔実施例２〕
　培養容器として７９０Ｒ製ディッシュを使用し、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を３回、繰り返し培養した。培養１７日目における培地を用いて、ＥＬＩＳＡ法（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のｈｕｍａｎ　ＥＰＯ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ　ＥＬＩＳＡ）により、活性型ＥＰＯ量の測定を行った。
〔比較例２〕
　実施例２において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、ポリスチレン製ディッシュを使用したことを除き、実施例２と同様にして培養を行い、活性型ＥＰＯ量の測定を行った。
　図２に示されるように、７９０Ｒ製ディッシュで培養したＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞から産生されたＥＰＯ量は、既存の培養技術に相当するポリスチレン製ディッシュで培養したものに比較して約５倍であり、本発明によれば、従来技術では得られない高濃度のＥＰＯを生産し得ることが示された。
〔実施例３〕
　培養容器として７９０Ｒ製ディッシュを使用し、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を培養した。次いで、その培養培地を用いて、細胞内の代謝酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＬＤＨ」という）の活性を測定し、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の死滅による細胞内の成分の漏洩の程度を調べた。なお、ＬＤＨ測定は、ＬＤＨ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いた。
〔比較例３〕
　実施例３において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、ポリスチレン製ディッシュを使用したことを除き、実施例３と同様にして培養を行い、ＬＤＨ測定を行った。
　図３のグラフにおいて、横軸は培地中のＥＰＯ濃度を表し、縦軸はＬＤＨ活性値を表す。７９０Ｒ製ディッシュで培養した際の培地についての測定値を丸で、ポリスチレン製ディッシュで培養した際の培地についての測定値を三角で示す。
　どちらのディッシュを用いた場合も、ＥＰＯ濃度が高くなるにつれて、細胞の漏洩成分量が増加するが、ポリスチレン製ディッシュでの培養に比較して、７９０Ｒ製ディッシュでの培養では、細胞の漏洩成分量がより少ないことが分かる。
　本発明の方法によれば、細胞を用いて、組み換えタンパク質を生産する場合において、より高密度な条件で細胞を培養することができ、目的のタンパク質が高濃度で得られる。このため、細胞培養における操作回数をより少なくしたり、培養規模をより小さくしたりすることができ、人件費や、装置、培地等に要する費用を抑えることができる。
　また、目的のタンパク質が高濃度で得られるため、変性しやすいタンパク質を濃縮する手間が軽減されるとともに、そのようなタンパク質が変性するリスクを軽減できる。
　さらに、細胞内からの漏洩物が少ないことから、タンパク質を精製する場合において、精製コストが軽減され、経済的に有利であることに加え、より高純度のタンパク質の精製が期待されるので、発熱などの副作用を引き起こす可能性のある成分の混入のリスクが軽減される。
　医薬品開発研究などのバイオテクノロジー研究においては、少量のスケールで、より高濃度で高純度の組み換えタンパク質を得ることが期待されるので、本発明の方法は、生理活性評価の実験などの円滑な進捗に貢献し得る。その結果、医薬品などの開発コストが抑制されるとともに、製造コストも低減できる。

Claims (8)

  1. 　接着型細胞と脂環構造含有重合体成形体とを接触させることにより、当該接着型細胞を液体培地中に浮遊させた状態で増殖させることを特徴とする、接着型細胞の培養方法。
  2. 　前記接着型細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされたものである請求項１に記載の接着型細胞の培養方法。
  3. 　前記接着型細胞がＣＨＯ細胞である請求項１又は２記載の接着型細胞の培養方法。
  4. 　前記接着型細胞が、外来遺伝子を発現することのできる細胞である請求項１又は２記載の接着型細胞の培養方法。
  5. 　前記浮遊状態の接着型細胞が、細胞塊を形成したものである請求項１～４のいずれかに記載の接着型細胞の培養方法。
  6. 　液体培地と、当該液体培地中に浮遊して生存している接着型細胞とを含む、脂環構造含有重合体を用いてなる培養容器。
  7. 　前記接着型細胞が細胞塊を形成したものである請求項５に記載の培養容器。
  8. 　生理活性タンパク質をコードする外来遺伝子を発現することのできる組換え細胞の培養中に、当該細胞と脂環構造含有重合体成形体とを接触させることを特徴とする、当該タンパク質の産生方法。
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