TWI713598B

TWI713598B - 培養容器之顯示用封件

Info

Publication number: TWI713598B
Application number: TW105131647A
Authority: TW
Inventors: 山下直樹; 中田久美子; 河野博臣
Original assignee: 山下直樹
Priority date: 2015-10-05
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2020-12-21
Also published as: JPWO2017061097A1; WO2017061097A1; JP6774420B2; TW201716567A

Abstract

本發明的課題是提供一種受精卵或細胞培養方法或培養用套件，即使貼附在用於哺乳類受精卵或細胞培養的培養容器表面，也不會對受精卵的胚胎發生或哺乳類細胞的增殖/生存有壞影響的顯示用封件，或不會對受精卵的胚胎發生或細胞增殖/生存有壞影響，可製作哺乳類胚盤囊的胚胎，進行哺乳細胞的培養。在基材層的單面形成有水溶性黏著劑層，降低或抑制排氣（outgas）產生的顯示用封件，因為不會對受精卵的胚胎發生或哺乳類細胞的增殖/生存有壞影響，所以在貼附如此的水溶性黏著封件的培養容器中進行受精卵體外培養，可高效率地製作良好的胚盤囊的胚胎。

Description

培養容器之顯示用封件

本發明是關於一種貼附在用於哺乳類受精卵或哺乳類細胞培養的培養容器表面的顯示用封件、在貼附如此的顯示用封件的培養容器中培養的受精卵或細胞的培養方法，或具備上述顯示用封件的哺乳類受精卵或哺乳類細胞的培養用套件。

在日本，因晚婚化或晚產化的影響，四組中就有一組夫妻有不孕的問題。因此，除了以人工授精（AIH）進行的一般不孕治療以外，體外受精（IVF）、顯微授精（ICSI）等高度不孕治療（ART）的實施有增加的傾向。

現在，使在靠近本來的受精場所的輸卵管的條件下所培養的精子與卵子體外受精，製作受精卵後，可以在經過卵裂、桑椹胚、胚盤囊的階段，到從卵黃膜孵化的排出胚盤囊的階段進行培養。雖然在胚盤囊的階段將胚胎移植至子宮，獲得高懷孕率，但到胚盤囊的階段為止進行發生的胚胎的比率為40～50％，特別是良好的胚盤囊，其比率低至20～30％成為問題。

受精卵的體外培養，通常是以在盤上形成20～30μ L的液滴的培養液，在該液滴內放入單一或複數個受精卵進行培養的方法（微液滴法）來進行。為了改良如此的微液滴法，提出一種培養容器，將液滴內的受精卵，以滴管進行的操作性提昇，且可形成穩定的培養液液滴（專利文獻1）。又，也提出一種方法，藉由共同培養受精卵與子宮內膜細胞，在更接近活體內的環境培養，使發生效率提昇（專利文獻2）。

另一方面，因培養患者的胚胎的盤被個別管理，所以雖然進行以麥克筆的記載或以封件的樣本識別，但並沒有考慮到關於以往貼附於培養盤的封件對受精卵的胚胎發生有壞影響的可能性。先前技術文獻專利文獻

專利文獻1 特開2015-29431號公報專利文獻2 特開2012-75391號公報

發明所欲解決的問題

本發明的課題是提供一種受精卵或細胞培養方法或培養用套件，即使貼附在用於哺乳類受精卵或細胞培養的培養容器表面，也不會對受精卵的胚胎發生或哺乳類細胞的增殖/生存有壞影響的顯示用封件，或不會對受精卵的胚胎發生或細胞增殖/生存有壞影響，可製作哺乳類胚盤囊的胚胎，進行哺乳細胞的培養。解決問題的手段

如前述，在受精卵的體外培養，貼附於培養容器表面的顯示用封件對受精卵的胚胎發生有壞影響的問題本身，本領域人士並不知道。本案發明人們，因為用排氣的封件與少排氣的封件（水溶性黏著封件）來研究的結果，發現排氣（至少2-丙醇）對受精卵的胚胎發生有壞影響，以及抑制或降低排氣的水溶性黏著封件對受精卵的胚胎發生不會有壞影響，所以在貼附如此的水溶性黏著封件的培養容器中體外培養受精卵，可以高效率地製作良好的人等哺乳類胚盤囊的胚胎，完成本發明。

也就是說，本發明如以下所述。

[1]一種顯示用封件，用來貼附在用於哺乳類受精卵或細胞培養的培養容器表面，其特徵在於在基材層的單面形成有水溶性黏著劑層，降低或抑制排氣（outgas）產生。

[2]如上述[1]所述的顯示用封件，其中哺乳類為人。

[3]如上述[1]或[2]所述的顯示用封件，其中做為排氣的一成分，包含有2-丙醇。

[4]如上述[1]～[3]中任一所述的顯示用封件係少排氣。

[5]一種受精卵或細胞的培養方法，其特徵在於在貼附如上述[1]～[4]中任一所述的顯示用封件的培養容器中培養採取到的哺乳類受精卵或哺乳類細胞。

[6]如上述[5]所述的培養方法，其中哺乳類為人。

[7]一種用於哺乳類受精卵或細胞培養的套件，其特徵在於具備如上述[1]～[4]中任一所述的顯示用封件。

[8]如上述[7]所述的套件，其中哺乳類為人。發明效果

因為本發明的顯示用封件不會對受精卵的胚胎發生有壞影響，所以在貼附本發明的顯示用封件的培養容器中進行受精卵體外培養，可高效率地製作良好的胚盤囊的胚胎。又，對胚沒有影響的本發明的顯示用封件，可期待即使用於ES細胞、iPS細胞、神經細胞等的細胞培養中的樣本識別，也不會對細胞增殖或生存有壞影響。

本發明的顯示用封件是限定於「用於貼附在哺乳類受精卵或細胞培養的培養容器表面」的用途的，形成水溶性黏著劑層於基材層的表面，降低或抑制排氣產生的顯示用封件，在此「排氣」是指因揮發性物質揮發所產生的氣體。當使用具有如此性質的本發明的顯示用封件，因為可有效地減低或抑制溶解於培養液中排氣的量，所以可預防從封件釋放的排氣成為主因，對哺乳類受精卵的胚胎發生或哺乳類細胞的增殖有壞影響。

又，做為本發明的受精卵或細胞的培養方法，若是包含在體外，將採取到的哺乳類受精卵或哺乳類細胞，在貼附本發明的顯示用封件的培養容器中培養的步驟的方法，並沒有特別限制，但是不包含在培養哺乳類受精卵時，進行胚胎發生，使成為胚盤囊狀態的受精卵（胚胎）著床於女性子宮的步驟等的所謂醫師進行的醫療行為，或取捨選擇著床於女性子宮的胚胎的步驟等的有捨棄正常胚胎之虞的行為。哺乳類受精卵的培養，可以用微液滴法來進行。又，哺乳類細胞的培養是對應細胞種類，可適當選擇培養液的種類、繼代方法等來進行。

又，做為本發明的套件，限定為「用於哺乳類受精卵或細胞培養」的用途的，具備本發明的顯示用封件的套件。在如此的套件，通常包含一般用於此種套件者，除了例如培養容器、培養液之外，也包含關於本發明的顯示用封件的說明書等附加文件。

做為上述哺乳類，可例示為小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等囓齒類，兔等兔形目，豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄類動物的眼睛，如狗、貓等肉食目，如人、猴、恆河猴、食蟹猴、狨猴、紅毛猩猩、黑猩猩等靈長類，其中可較佳例示為人。

做為上述哺乳類細胞，具體來說可列舉胚胎幹細胞（embryonic stem cells：ES細胞）、胚胎生殖細胞（embryonic germ cells：EG細胞）、生殖系列幹細胞（germline stem cells：GS細胞）、誘導性多潛能幹細胞（iPS細胞；induced pluripotent stem cell）等的多潛能幹細胞，間質幹細胞、造血幹細胞、神經系統幹細胞、牙髓幹細胞等的多潛能幹細胞，心肌前驅細胞、血管內皮前驅細胞、神經前驅細胞、脂肪前驅細胞、皮膚成纖維細胞、骨骼肌成肌細胞、成骨細胞、生齒細胞等單潛能幹細胞（前驅細胞）等的幹細胞，或心肌細胞、血管內皮細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚纖維細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、肝細胞、臍靜脈內皮細胞、皮膚微淋巴管內皮細胞、表皮角質細胞、支氣管上皮細胞、黑色素細胞、平滑肌細胞、齒細胞、真皮乳頭細胞等成熟細胞。又，在上述哺乳類，也包含器官培養的睪丸的來自細精管的細胞或來自自身培養皮膚的細胞。再者，上述哺乳類細胞也可以是組織狀態的細胞。

做為基材，具體來說，可列舉玻璃紙、塑膠、紙、布、不織布等。

水溶性黏著劑層的厚度，一般為5〜250μ m，較佳為5〜150μ m。

做為排氣的成分，可列舉甲醛、D-檸檬烯、甲苯、丙酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、乙腈、1-丁醇、2-乙基己醇、己醛等的揮發性物質（有機化合物）中一或兩種以上，較佳為包含2-丙醇。

做為上述水溶性黏著劑，具體來說，可列舉甲基纖維素、甘藷澱粉、馬鈴薯澱粉、木薯澱粉、小麥澱粉、玉米澱粉、蒟蒻、鹿角菜、洋菜、藻酸鈉、木槿、黃蓍膠、阿拉伯膠、聚葡萄糖、聚果醣、明膠、吉利丁、酪蛋白、膠原蛋白、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、可溶性澱粉、羧甲基澱粉、二醛澱粉、聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚環氧乙烷、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸、聚-N－乙烯基吡啶等。

在上述基材層或水溶性黏著劑層，也可以添加不揮發的各種添加劑，例如水溶性增塑劑、界面活性劑、增黏劑、抗氧化劑、著色劑、油劑。

本發明的顯示用封件，為了在未使用的狀態下的水溶性黏著劑層表面（不形成基材層的單面），不附著塵埃等並維持黏著性能，通常以剝離紙（剝離膜）保護。又，本發明的顯示用封件為了防止矽氧烷氣體的產生，較佳為不包含聚矽氧（無矽）者。

做為本發明的顯示用封件，較佳為少排氣者。在本發明中，「少排氣」是指，在貼附本發明的顯示用封件（封件樣本）或複數片（例如2～15片的範圍內）本發明的顯示用封件的培養容器（多孔盤、培養皿（盤、碟）等）中，經任意時間（通常6小時～10天，較佳為3～7天）培養的培養液，加熱（通常40～150℃的範圍內，較佳為50～70℃）任意時間（通常10～180分，較佳為50～70分）時產生的氣體量，以氣相色譜質譜儀（GC-MS）來檢測/測定的情況下，一種或兩種以上的排氣的由來成分的峰值為幾乎或完全未檢出（檢出靈敏度以下）的狀況。

本發明的顯示用封件可藉由在減少或抑制排氣產生的基材的單面塗佈減少或抑制排氣產生的水溶性黏著劑來製作。又，做為本發明的顯示用封件也可以使用塗佈減少或抑制排氣產生的市售品，例如3M公司製造的3M（註冊商標）低排氣接著劑轉移膠帶（ATX203SF或ATX204SF），或LINTEC公司製造的無矽且極少排氣的黏著膠帶（雙面膠帶[TL-6177-12-GA]、少基材型[TL-607-GA或TL-609-GA]）或單面黏著型[H-41177-50、H-41041-50、H-41051-50或H-41081-50]。

做為貼附本發明的顯示用封件處，若為用於哺乳類受精卵或細胞培養的培養容器（多孔盤、培養皿（盤、碟）等）的表面為佳，在與哺乳類受精卵或細胞接觸的培養容器的外側表面，或在培養容器為多孔盤或培養皿的情況下，也可以是是培養容器的蓋上面的內側或蓋側周面的內側，但通常在不與哺乳類受精卵或細胞接觸的培養容器的外側表面，或在培養容器為多孔盤或培養皿的情況下，也可以是培養容器的蓋上面的外側或蓋側周面的外側。貼附於培養容器表面的顯示用封件的片數通常為一片，但本發明的顯示用封件因為具有不對受精卵的胚胎發生或哺乳類細胞的增殖/生存有壞影響的優越效果，所以也可以對應需要為複數片（若全封件的總面積在盤的面積以內為佳，例如2～15片的範圍內）。

以下以實施例來詳細說明本發明，但本發明並非受限於這些實施例。實施例1

1.確認在胚胎發生的從顯示用封件釋放的排氣的影響為了確認在胚胎發生的從顯示用封件釋放的排氣的影響，依以下[1]～[3]順序的方法來進行檢討。 1-1 方法 [1]做為少排氣的水溶性黏著封件，將排氣極少的黏著膠帶（厚度：0.075mm、產品編號：H-41177-50，LINTEC公司製造），切斷成長8mm、寬28mm者來使用。又，做為排氣的封件，使用ASONE公司製造的封件（長：8mm、寬：28mm、厚度：0.07mm，產品編號：72150）。將這兩種類的封件，在培養盤（3002，falcon公司製造）的蓋上面的內側貼7片，在側周面內側貼6片，在培養盤（1008，falcon公司製造）上盛著滴（液滴）狀的培養液（含有4mg/mLBSA[牛血清白蛋白]的M16培養液），其上以石蠟油（OVOIL，VitroLife公司製造）（3mL/盤）覆蓋後，放置於除去蓋的培養盤（3002，falcon公司製造）上（參照第1圖）。又，做為控制組，進行使用不貼標籤封件的培養盤的實驗。 [2]在滴狀的培養液中加入小鼠受精卵後，在孵化器（37℃、5％O2、5％CO2、90％N2）內培養。又，小鼠受精卵是用8週齡的雄BDF1與雌BDF1，依常規方法進行體外受精來製作。 [3]培養後2天，算出分割（卵裂）的受精卵的數量（參照表1、第2圖至第4圖的第2天），在培養後第5天，算出到達胚盤囊的受精卵的數量（參照表1、第2圖至第4圖的第5天），以Gardner分類評估胚盤囊的發生階段（等級1；初期胚盤囊[內腔是整體的1/2以下]、等級2；胚盤囊[內腔是整體的1/2以上]、等級3；完全胚盤囊、等級4；擴張胚盤囊、等級5；孵化中胚盤囊、以及等級6；孵化後胚盤囊）（參照表2、第2圖至第4圖的第5天）。

1-2 結果首先，以使用GC-MS分析來確認在將排氣的水溶性黏著封件（參照第5圖的「樣本3」）以少排氣處理者，即，在少排氣的水溶性黏著封件（參照第5圖的「樣本2」）的排氣量為檢出靈敏度以下者。使用貼了排氣的封件的培養盤來培養受精卵的情況，與未貼有封件的培養盤的情況相比較，分割的受精卵比率低至9％，又，完全沒有到達胚盤囊的受精卵（參照表1）。另一方面，使用貼了排氣少的水溶性黏著封件的培養盤來培養的情況，與未貼有封件的培養盤的情況一樣，確認到受精卵完全分割，到達胚盤囊的受精卵比率高達90％，且幾乎是做為良好胚胎的標準的等級3（完全胚盤囊）以上的胚盤囊（參照表1）。以上的結果表示降低或抑制揮發性物質產生的水溶性黏著封件，因為不會對受精卵的胚胎發生有壞影響，所以可做為用來貼附在使用於人的受精卵的培養的培養容器表面的顯示用封件來使用。

表1

表中的「*」表示相對於控制組在統計上有顯著差異（p＜0.01）。

表2

實施例2

2.對胚胎發生有壞影響的排氣的鑑別當貼附排氣的封件於培養盤，從封件釋放的揮發性物質溶解於培養液中，認為對受精卵的胚胎發生有壞影響。因此，為了確認對胚胎發生有壞影響的揮發性物質，依以下[1]～[3]順序的方法來進行檢討。 2-1 方法 [1]將在實施例1使用的兩種類的封件（少排氣的水溶性黏著封件及排氣的封件），在培養盤（3002，falcon公司製造）的蓋上面的內側貼7片，以及在側周面內側貼6片，在培養盤（1008，falcon公司製造）上盛著滴狀的培養液（含有4mg/mLBSA[牛血清白蛋白]的M16培養液），其上以石蠟油（OVOIL，VitroLife公司製造）（3mL/盤）覆蓋後，放置於除去蓋的培養盤（3002，falcon公司製造）上（參照第1圖）。又，做為控制組，進行使用不貼標籤封件的培養盤的實驗。 [2]在孵化器（37℃、5％O₂ 、5％CO₂ 、90％N₂ ）內培養5天後，將培養液樣本回收至頂空取樣瓶（headspace vial）。 [3]將培養液樣本以60℃加熱處理1小時後，藉由使用測量裝置（GCMS-TQ8030，島津公司製造）及管柱（InertCap 1，GL SCIENCE公司製造）的GC-MS來分析。又，做為控制組，藉由GC-MS來分析將排氣的封件（ASONE公司製造）本身加熱處理者（參照表3的「封件樣本」）。

2-2 結果相對於在使用少排氣的封件來培養的情況，未檢出乙醇以外的揮發性物質（參照表3的「培養液樣本少排氣」），在使用排氣的封件來培養的情況，除了乙醇還檢測到2-丙醇（參照表3的「培養液樣本排氣」）。從此結果，鑑別出做為對胚胎發生有壞影響的一個揮發性物質為2-丙醇。又，因為乙醇在未貼附封件的培養液樣本也被檢出（參照表3的「培養液樣本－」），所以在少排氣的封件被檢出的乙醇並非從封件釋放，被認為是用於殺菌、消毒的空氣中的乙醇混入。

表3

表中的「○」表示各種物質被檢出，「－」表示各種物質未被檢出。實施例3

3.從封件釋放的2-丙醇的定量當貼附排氣的封件於培養盤，培養液中的2-丙醇為檢出靈敏度以下。因此，定量分析關於排氣的封件本身釋放多少程度的2-丙醇。 3-1 方法以60℃加熱處理在實施例1使用的兩種類的封件（少排氣的水溶性黏著封件及排氣的封件）1小時後，藉由使用測量裝置（GCMS-TQ8030，島津公司製造）及管柱（InertCap 1，GL SCIENCE公司製造）的GC-MS來分析。

從排氣的封件釋放的2-丙醇，相對於以0.093μ L/g檢出者，從排氣的封件釋放的2-丙醇為檢出靈敏度以下（未滿0.08μ L/g）（參照表4）。

表4

表中的濃度表示每單位封件重量（g）的2-丙醇量（μL）。產業利用性

本發明是貢獻於不孕治療者。

第1圖是貼附本發明的顯示用封件的培養盤的概略圖。第2圖表示用不貼附封件的培養盤來培養小鼠受精卵後，第2天及第5天的顯微鏡影像的圖。第3圖表示用貼附排氣的封件的培養盤來培養小鼠受精卵後，第2天及第5天的顯微鏡影像的圖。第4圖表示用貼附少排氣的水溶性黏著封件的培養盤來培養小鼠受精卵後，第2天及第5天的顯微鏡影像的圖。第5圖表示用氣相色譜質譜儀（GC-MS）來分析在少排氣的水溶性黏著封件（圖中的「樣本2」）的排氣總量的結果的圖。圖中的樣本3表示少排氣處理前的樣本2，又，樣本1表示排氣的封件。

Claims

一種受精卵或細胞的培養方法，其特徵在於包含：將在基材層的單面形成有水溶性黏著劑層，降低或抑制排氣(outgas)產生的顯示用封件，貼附在培養容器表面，在貼附了前述顯示用封件的培養容器中，培養採取到的哺乳類受精卵或哺乳類細胞。
如申請專利範圍第1項所述的培養方法，其中哺乳類為人。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的顯示用封件，其中做為排氣的一成分，包含有2-丙醇。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的顯示用封件係少排氣。