TWI695011B - 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供辨識HER2之全人單株抗體。本發明進一步係提供使用此單株抗體在各種治療、診斷及預防適應症之方法。

Description

抗HER2表位之單株抗體及其使用之方法 相關申請案
此申請案主張U.S.臨時申請案第62/013,944號，2014年6月18日申請；第62/034,489號，2014年8月7日申請；第62/147,960號，2015年4月15日申請；及第62/149,444號，2015年4月17日申請之優先權及權益。這些申請案各者內容整體以引用方式併入本案。
本發明一般關於產生辨識人HER2受體之單株抗體，關於辨識人HER2受體胞外域中特定HER2表位的單株抗體，以及關於使用這些單株抗體作為療法及/或診斷法之方法。
受體酪胺酸激酶ErbB家族成員為細胞生長、分化與存活之重要媒介者。受體家族包括4個不同成員，包括表皮生長因子受體(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)及HER4(ErbB4或tyro2)。由 EGFR家族4成員形成同型二聚體及異二聚體兩者，與HER2為其他ErbB受體較佳且最有力之二聚合搭擋(Graus-Porta et al.,Embo 3 1997；16：1647-1655；Tao et al.,J Cell Sci 2008；121：3207-3217)。HER2不具有已知配體，但當過度表現時可經由同型二聚體化、或藉由與其他配體佔領之ErbB受體異二聚體化而活化。
HER2基因(亦已知為HER2/neu及ErbB2基因)在20-30%之早期乳癌中被放大，使之過度表現細胞膜中之表皮生長因子(EGF)受體(Bange,et al.,Nature Medicine 7(5)：548-552)。除了乳癌之外，HER2表現亦與其他人癌類型相關，包括非小細胞肺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌及頭&頸之鱗狀細胞癌(Garcia de Palazzo et al.,Int J Biol Markers 1993；8：233-239；Ross et al.,Oncologist 2003；8：307-325；Osman et al.,J Urol 2005；174：2174-2177；Kapitanovic et al.,Gastroenterology 1997；112：1103-1113；Turken et al.,Neoplasma 2003；50：257-261；及Oshima et al.,Int J Biol Markers 2001；16：250-254)。
曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin®)為針對HER2蛋白質域IV之重組人化單株抗體，藉而阻擋配體-獨立性HER2同型二聚體化，及HER2與在帶有高HER2過度表現之細胞中其他家族成員較低程度地異二聚體化(Cho et al.,Nature 2003；421：756-760及Wehrman et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2006；103：19063-19068)。 Herceptin®已批准為HER2過度表現轉移性乳癌第一線及輔助治療，與化療組合或作為一或多化療方案之後的單一劑。已發現曲妥珠單抗(trastuzumab)僅在HER2過度表現乳腫瘤患者20-50%中有效且許多初始有反應者顯示幾個月之後復發(Dinh et al.,Clin Adv Hematol Oncol 2007；5：707-717)。
帕妥珠單抗(pertuzumab)(Omnitar/Perjeta® also called 2C4)為針對HER2蛋白質域II之另一人化單株抗體，導致抑制配體-誘導之異二聚體化(即，HER2與配體結合之ErbB家族另一成員二聚化)；經報告為不嚴格需要高HER2表現量之機制(Franklin et al.,Cancer Cell 2004；5：317-328.)。帕妥珠單抗(pertuzumab)經批准為治療HER2-陽性轉移性乳癌，與曲妥珠單抗(trastuzumab)及多西他賽(docetaxel)組合。
HER2抗體藥物共軛物(ADC)，曲妥珠單抗(trastuzumab)艾得辛(emtansine)(ado-曲妥珠單抗艾得辛，賀癌寧(Kadcyla)®)為抗體-藥物共軛物，由連接到細胞毒性劑美坦辛(mertansine)(DM1)之單株抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)所組成。作為單一劑之賀癌寧(Kadcyla)已批准用於治療先前分開或組合接受曲妥珠單抗(trastuzumab)及紫杉烷(taxane)之具HER2-陽性(HER2+)、轉移性乳癌(MBC)患者。
雖然選擇適當的抗體用於HER2標靶療法涉及許多因素，但通常若當抗體結合時HER2-抗體複合物有 效地內化(internalize)，ADC方法有優勢。然而，與EGFR相比，HER2內化被弱化。
調控HER2功能之複雜機制值得進一步針對此原癌基因研究新且最佳之治療策略。
因此，存在標靶HER2生物活性之療法的需求。
本發明係提供專一性辨識HER2，亦已知為(ErbB2、p185neu及/或HER2/neu)的單株抗體。本文揭露之抗體能夠且用於調節，例如：阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾PI3K-Akt途徑(藉由降低磷酸化AKT量而促進細胞存活)。本文揭露之抗體亦能夠且用於調節，例如：阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾HER2的配體-獨立性同型二聚體化及/或異二聚體化。本文所揭露的抗體亦包括結合可溶性HER2之抗體。
本發明抗體呈現不同於發明所屬技術領域中所述之抗體的HER2結合特徵。特別是，本文揭露之抗體結合到HER2不同表位，其彼此(但非曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、Fab37或chA21)交叉阻擋與HER2的結合。再者，與已知抗體相反，本文揭露之抗體可有效內化到HER2-表現細胞，但不會促進細胞增殖。
本文揭露之抗體為全人單株抗體，其結合到 新穎表位及/或具有其他用於治療用途的優秀特性。例示性特性包括但不限於對高度或低度表現人HER2癌症細胞之優秀結合特徵、專一結合到重組人及馬來猴(cynomolgus monkey)HER2、當結合到HER2時有效內化、當作為抗體藥物共軛物(ADC)投予時殺死表現高度或低度HER2的癌症細胞的高度能力、對HER2-表現癌症細胞的增殖無實質上促效效果、以及提供有效抗體-依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)-媒介之殺死HER2-表現細胞，以及上述特性之任何組合。
本文揭露之抗體亦包括專一性結合至人HER2受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括人HER2受體胞外域之殘基452至531，例如，SEQ ID NO：38之殘基474至553或SEQ ID NO：39之殘基452至531。
本文揭露之抗體包括經單離之抗體或其抗原結合片段，其結合至少部分人HER2受體域IV之N端但不與結合至人HER2受體表位4D5的抗體交叉競爭。舉例而言，本文所描述之抗體或其抗原結合片段不與曲妥珠單抗(trastuzumab)交叉競爭結合至人HER2受體，因為已知曲妥珠單抗(trastuzumab)結合人HER2受體表位4D5。如本文所用，術語人HER2受體表位4D5係指人HER2受體胞外域之胺基酸殘基529至627，例如SEQ ID NO：38之殘基551至649或SEQ ID NO：39之殘基529至627。在某些實施態樣中，經單離之抗體或其抗原結合片段亦結合 至少一馬來猴(cynomolgus monkey)HER2受體表位。
本文揭露之抗體亦包括專一性結合至人HER2受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括人HER2受體胞外域之殘基452至500，例如，SEQ ID NO：38之殘基474至522或SEQ ID NO：39之殘基452至500。
本文揭露之抗體亦包括專一性結合至人HER2受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少一胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基E521、L525及R530，例如：SEQ ID NO：38之殘基543、547及552，以及SEQ ID NO：39之殘基521、525及530。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少二胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基E521、L525及R530。本文揭露之抗體亦包括專一性結合至人HER2受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括人HER2受體胞外域的至少胺基酸殘基E521、L525及R530。在某些實施態樣中，這些經單離之抗體或其抗原結合片段任一或全部亦結合至少一馬來猴(cynomolgus monkey)HER2受體表位。
本文揭露之抗體亦包括經單離之抗體或其抗原結合片段，其結合至至少部分域III及至少部分人HER2受體域IV之N端，但不與Fab37單株抗體或結合 至人HER2受體表位4D5的抗體交叉競爭。舉例而言，本文所描述之抗體或其抗原結合片段不與Fab37單株抗體及/或曲妥珠單抗(trastuzumab)交叉競爭結合至人HER2受體。在某些實施態樣中，經單離之抗體或其抗原結合片段亦結合至少一馬來猴(cynomolgus monkey)HER2受體表位。
本文揭露之抗體亦包括專一性結合至人HER2受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括人HER2受體胞外域的殘基520至531，例如，SEQ ID NO：38之殘基542至553或SEQ ID NO：39之殘基520至531。
本文揭露之抗體亦包括專一性結合至人HER2受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少一胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的殘基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499，例如：SEQ ID NO：38之殘基475、478、495、498、517、518、519、及521或SEQ ID NO：39之殘基453、456、473、476、495、496、497及499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少二胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或 其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少三胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少四胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少五胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少六胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括至少人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497及W499。在某些實施態樣中，這些經單離之抗體或其抗原結合片段任一或全部亦結合至少一馬來猴(cynomolgus monkey)HER2受體表位。
本文揭露之抗體亦包括專一性結合至人HER2 受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少一胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的殘基C453、H473、N476、R495、H497及W499，例如：SEQ ID NO：38之殘基475、495、498、517、519及521或SEQ ID NO：39之殘基453、473、476、495、497及499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少二胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H473、N476、R495、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少三胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H473、N476、R495、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少四胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H473、N476、R495、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括選自下列所組成群組之至少五胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H473、N476、R495、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合 片段，其包括選自下列所組成群組之至少六胺基酸殘基：人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H473、N476、R495、H497及W499。舉例而言，本文揭露之抗體包括專一性結合至人HER2受體胞外域的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段，其包括至少人HER2受體胞外域的胺基酸殘基C453、H473、N476、R495、H497及W499。在某些實施態樣中，這些經單離之抗體或其抗原結合片段任一或全部亦結合至少一馬來猴(cynomolgus monkey)HER2受體表位。
以下更詳細描述本發明之該些與其他態樣。
本文所揭露的例示性單株抗體包括，例如，本文所描述之XMT 1517抗體、XMT 1518抗體、XMT 1519抗體及XMT 1520抗體。或者，單株抗體為抗體，其互相交叉阻擋但不結合至與曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、Fab37或chA21(其分別結合至HER2域IV、域II、域III及域I的特定表位)或其生物相似物相同的表位。這些抗體在本文中分別指為“HER2”抗體。HER2抗體包括全人單株抗體，以及人化單株抗體與嵌合抗體。這些抗體顯示對人HER2的專一性，且彼等已顯示調節，例如：阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾PI3K-Akt途徑(其藉由降低磷酸化AKT量而促進細胞存活)。這些抗體以相同於或實質上類似於曲妥珠單抗(trastuzumab)或其生物相似物內化的速率，自HER2-表現細胞的細胞表面內化。舉例而言，這些抗體及抗原結合片 段具有內化速率，其為在時間0被內化4小時之總表面結合的約50%。
本文揭露之抗體包含具有與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列的重鏈：SEQ ID NO：1、3、5及7與具有與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列的輕鏈：SEQ ID NO：2、4、6及8。
本文揭露之抗體包括選自下列所組成群組之重鏈與輕鏈胺基酸序列組合：(i)與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：2之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列；(ii)與SEQ ID NO：3之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列；(iii)與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：6之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列；及(iv)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：2之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：3之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：6之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈胺基酸序列。
本文揭露之抗體包括分別具有選自下列所組成群組之胺基酸序列的重鏈：SEQ ID NO：1、3、5及7與具有選自下列所組成群組之胺基酸序列的輕鏈：SEQ ID NO：2、4、6及8。
本文揭露之抗體包括選自下列所組成群組之重鏈與輕鏈胺基酸序列組合：(i)SEQ ID NO：1之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：2之輕鏈胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO：3之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：4之輕鏈胺基酸序列；(iii)SEQ ID NO：5之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：6之輕鏈胺基酸序列；以及(iv)SEQ ID NO：7之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：8之輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：2之輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：3之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：4之輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含 SEQ ID NO：5之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：6之輕鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：7之重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：8之輕鏈胺基酸序列。
本文揭露之抗體包括重鏈可變區，其具有與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：9、11、13及15，及輕鏈可變區，其具有與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：10、12、14及16。
本文揭露之抗體包括選自下列所組成群組之重鏈可變區與輕鏈可變區胺基酸序列組合：(i)與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：10之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈可變區胺基酸序列；(ii)與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：12之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈可變區胺基酸序列；(iii)與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：14之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈可變區胺基酸序列；及(iv)與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕可變區鏈胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：10之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈可變區胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：12之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈可變區胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：14之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕鏈可變區胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的重鏈可變區胺基酸序列及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的輕可變區鏈胺基酸序列。
本文揭露之抗體包括具有選自下列所組成群組之胺基酸序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：9、11、13及15與具有選自下列所組成群組之胺基酸序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：10、12、14及16。
本文揭露之抗體包括選自下列所組成群組之重鏈可變區與輕鏈可變區胺基酸序列的組合：(i)SEQ ID NO：9之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：10之輕鏈可變區胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO：11之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：12之輕鏈可變區胺基酸序列；(iii)SEQ ID NO：13之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：14之輕鏈可變區胺基酸序列；及(iv)SEQ ID NO：15之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：16之輕鏈可變區胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含 SEQ ID NO：9之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：10之輕鏈可變區胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：11之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：12之輕鏈可變區胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包括具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈可變區與具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：15之重鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：16之輕鏈可變區胺基酸序列。
本文揭露之抗體之三重鏈CDR包括重鏈互補性決定區1(CDRH1)，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：17、25及30；重鏈互補性決定區2(CDRH2)，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、23、26及31；及重鏈互補性決定區3(CDRH3)，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：19及27。
本文揭露之抗體的三輕鏈CDR包括輕鏈互補性決定區1(CDRL1)，其包括與選自下列所組成群組之序 列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：20及28；輕鏈互補性決定區2(CDRL2)，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：21及24；以及輕鏈互補性決定區3(CDRL3)，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：22及29。
抗體包括重鏈CDR與輕鏈CDR序列的組合，包括CDRH1，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：17、25與30；CDRH2，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、23、26及31；CDRH3，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：19及27；CDRL1，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：20及28；CDRL2，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：21及24；以及CDRL3，其包括與選自下列所組成群組之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：SEQ ID NO：22及29。
本文揭露之抗體的三重鏈CDR包括CDRH1，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：17、25與30；CDRH2，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：18、23、26及31；以及CDRH3，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：19及27。
本文揭露之抗體的三輕鏈CDR包括CDRL1，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：20及28；CDRL2，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：21及24；以及CDRL3，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：22及29。
本文揭露之抗體包括重鏈CDR與輕鏈CDR序列的組合，包括CDHR1，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：17、25與30；CDRH2，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：18、23、26及31；CDRH3，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：19及27；CDRL1，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：20及28；CDRL2，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：21及24；以及CDRL3，其包括選自下列所組成群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：22及29。
本文揭露之抗體包括選自下列所組成群組之重鏈互補性決定區及輕鏈互補性決定區胺基酸序列的組合：(i)SEQ ID NO：17之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：18之CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：19之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：20之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：21之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：22之CDRL3胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO：17之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：23之CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：19之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：20之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：24之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：22之CDRL3胺基酸序列；(iii)SEQ ID NO：25之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：26之CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：27之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：28之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：21之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：29之CDRL3胺基酸序列；以及(iv)SEQ ID NO：30之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：31之CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：27之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：28之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：21之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：29之CDRL3胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：17之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：18之 CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：19之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：20之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：21之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：22之CDRL3胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：17之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：23之CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：19之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：20之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：24之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：22之CDRL3胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：25之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：26之CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：27之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：28之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：21之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：29之CDRL3胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文揭露之抗體包含SEQ ID NO：30之CDRH1胺基酸序列、SEQ ID NO：31之CDRH2胺基酸序列、SEQ ID NO：27之CDRH3胺基酸序列、SEQ ID NO：28之CDRL1胺基酸序列、SEQ ID NO：21之CDRL2胺基酸序列、以及SEQ ID NO：29之CDRL3胺基酸序列。
在某些實施態樣中，本文所揭露的HER2抗體亦包括與抗體共軛之劑。在某些實施態樣中，該劑為治 療劑。在某些實施態樣中，該劑為抗腫瘤劑。在某些實施態樣中，該劑為毒素或其片段。在某些實施態樣中該劑為(a)奧瑞他汀(auristatin)化合物；(b)卡奇黴素(calicheamicin)化合物；(c)多卡米辛(多卡米星(duocarmycin))化合物；(d)SN38、(e)吡咯并苯并二氮雜環庚烯基(pyrrolobenzodiazepine)；(f)長春花化合物；(g)微管溶素(tubulysin)化合物；(h)非天然喜樹鹼(camptothecin)化合物；(i)類美登素(maytansinoid)化合物；(j)DNA結合藥物；(k)激酶抑制劑；(l)MEK抑制劑；(m)KSP抑制劑；(n)拓樸異構酶抑制劑；與其類似物或其相似物。在某些實施態樣中，該劑為經由連接子共軛到HER2抗體。在某些實施態樣中，連接子為可裂解連接子。在某些實施態樣中，連接子為非可裂解連接子。在某些實施態樣中，該劑為本文所描述之毒素任一。
在一態樣中，本文所描述之HER2抗體共軛物包括直接或間接連接到一或多治療或診斷劑(D)的經單離之HER2抗體或其抗原結合片段。在某些實施態樣中，HER2抗體共軛物亦包括連接到抗體或其抗原結合片段的一或多聚合物支架，其中一或多個D各者獨立地為經由一或多聚合物支架，連接到抗體或其抗原結合片段。
在某些實施態樣中，連接到經單離之HER2抗體或其抗原結合片段的一或多聚合物支架各者獨立地包括聚(1-羥基甲基伸乙基羥基甲基-甲醛)(poly(1-hydroxymethylethylene hydroxymethyl-formal))(PHF)具有 分子量範圍為約2kDa至約40kDa。
在某些實施態樣中，一或多聚合物支架各者獨立地為式(Ic)：
Figure 104119613-A0202-12-0023-51
 其中：LD1為含羰基之部分；
Figure 104119613-A0202-12-0023-52
中
Figure 104119613-A0202-12-0023-53
的各次出現獨立地為 包含生物可降解鍵之第一連接子，使得當該鍵斷裂時，D 以活性形式釋出達其所欲治療效果；以及
Figure 104119613-A0202-12-0023-54
中介於LD1與D之間之
Figure 104119613-A0202-12-0023-322
表示D與LD1的直接或間接連結；
Figure 104119613-A0202-12-0023-55
的各次出現獨立地為尚未連接到經單 離之抗體或其抗原結合片段的第二連接子，其中LP2為含官能基之部分，其還與經單離之抗體或其抗原結合片段之 官能基形成共價鍵，以及介於LD1與LP2之間的
Figure 104119613-A0202-12-0023-56
表示 LP2與LD1的直接或間接連結，及第二連接子的各次出現 不同於第一連接子的各次出現；
Figure 104119613-A0202-12-0024-57
的各次出現獨立地為連接各D-承 載聚合物支架到經單離之抗體或其抗原結合片段的第三連接子，其中連結到LP2之該端
Figure 104119613-A0202-12-0024-321
表示一旦在LP2之官能基與經單離之抗體或其抗原結合片段之官能基之間形成共價鍵，直接或間接連結LP2至經單離之抗體或其抗原結合片段；以及該第三連接子的各次出現不同於該第一連接子的各次出現；m為1至約300的整數，m1為1至約140的整數，m2為1至約40的整數，m3為0至約18的整數，m4為1至約10的整數；m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約15至約300；以及連接到經單離之抗體或其抗原結合片段之LP2的總數為10或更少。
本文所描述之共軛物可包括一或多個下述特徵： 舉例而言，在式(Ic)，經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段具有分子量為40kDa或更大(例如：60kDa或更大、80kDa或更大、100kDa或更大、120kDa或更大、140kDa或更大、160kDa或更大、180kDa或更大、或200kDa或更大、或約40-200kDa、40-180kDa、 40-140kDa、60-200kDa、60-180kDa、60-140kDa、80-200kDa、80-180kDa、80-140kDa、100-200kDa、100-180kDa、100-140kDa、或140-150kDa)。在某些實施態樣中，經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段(若為本揭露之任一抗體或抗原-結合片段)包括，透過非限制性例子，本文所描述之XMT 1517抗體、XMT 1518抗體、XMT 1519抗體及XMT 1520抗體。
舉例而言，在式(Ic)中，m1為1至約120之整數(例如：約1-90)及/或m3為1至約10的整數(例如：約1-8)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)中具有分子量範圍約6kDa至約20kDa(即m、m1、m2、m3、及m4之總和範圍為約45至約150)時，則m2為2至約20的整數、m3為0至約9的整數、m4為1至約10的整數及/或m1為1至約75的整數(例如：m1為約4-45)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約8kDa至約15kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約60至約110)時，則m2為2至約15的整數、m3為0至約7的整數、m4為1至約10的整數及/或m1為1至約5的整數5(例如：m1為約4-30)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約2kDa至約20kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約15至約150)時，則m2為1至約20的整數、m3為0至約10的整數(例如：m3範圍為0至約9)、m4為1至約8 的整數及/或m1為1至約70的整數，且LP2連接到經單離之抗體或其抗原結合片段的總數範圍約2至約8(例如：約2、3、4、5、6、7、或8)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約3kDa至約15kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約20至約110)時，則m2為2至約15的整數、m3為0至約8的整數(例如：m3範圍為0至約7)、m4為1至約8的整數及/或m1為2至約50的整數，且LP2連接到經單離之抗體或其抗原結合片段的總數範圍約2至約8(例如：約2、3、4、5、6、7、或8)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約5kDa至約10kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍約40至約75)時，則m2為約2至約10的整數(例如：m2為約3-10)、m3為0至約5的整數(例如：m3範圍為0至約4)、m4為1至約8的整數(例如：m4範圍為1至約5)及/或m1為約2至約35的整數(例如：m1為約5-35)，且LP2連接到經單離之抗體或其抗原結合片段的總數範圍約2至約8(例如：約2、3、4、5、6、7、或8)。
舉例而言，D的各次出現獨立地為具有分子量
Figure 104119613-A0202-12-0026-320
5kDa之治療劑。
舉例而言，D的各次出現獨立地為抗癌症藥物，例如，選自長春花生物鹼、奧瑞他汀(auristatin)、微管溶素、多卡米星(duocarmycin)、非天然喜樹鹼(camptothecin)化合物、類美登素(maytansinoid)、卡奇黴 素(calicheamicin)化合物、拓樸異構酶抑制劑、DNA結合藥物、激酶抑制劑、MEK抑制劑、KSP抑制劑、及其類似物。
舉例而言，各
Figure 104119613-A0202-12-0027-58
當不連接到經單離 之抗體或其抗原-結合片段時，獨立地包括端基團WP，其中各WP獨立地為：
Figure 104119613-A0202-12-0027-59
Figure 104119613-A0202-12-0028-60
其中R1K為離去基(例如：鹵化物或RC(O)O-，其中R為氫、脂肪族、雜脂肪族、碳環或雜環烷基部分)，R1A為硫保護基，及環A為環烷基或雜環烷基，且R1J為氫、脂肪族、雜脂肪族、碳環、或雜環烷基部分。
舉例而言，各R1A獨立地為
Figure 104119613-A0202-12-0028-61
Figure 104119613-A0202-12-0028-326
、或
Figure 104119613-A0202-12-0028-63
，其中r為1 或2且Rs1、Rs2、及Rs3各者為氫、脂肪族、雜脂肪族、碳環、或雜環烷基部分。
舉例而言，還與經單離之抗體或其抗原結合片段之官能基形成共價鍵的LP2之官能基係選自 -SRp、-S-S-LG、
Figure 104119613-A0202-12-0028-64
、及鹵基，其中LG為離去 基、Rp為H或硫保護基，且Xa及Xb之一者為H而另一者為水溶性馬來醯亞胺基(maleimido)阻擋部分，或Xa及Xb與其所連結之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。舉例而言， 還形成共價鍵的LP2之官能基為不與經單離之抗體或其抗 原結合片段之官能基反應的官能基，例如：
Figure 104119613-A0202-12-0029-65
作為 LP2之官能基，其中Xa及Xb之一者為H，而另一者為水溶性馬來醯亞胺基阻擋部分，或Xa及Xb。
舉例而言，LD1包括-X-(CH2)v-C(=O)-，帶有直 接連接到
Figure 104119613-A0202-12-0029-67
之羰基的X，其中X為CH2、 O、或NH，且v為1至6的整數。
舉例而言，
Figure 104119613-A0202-12-0029-66
的各次出現獨立 地為-C(=O)-X-(CH2)v-C(=O)-NH-(CH2)u-NH-C(=O)-(CH2)w-(OCH2)x-NHC(=O)-(CH2)y-M，其中X為CH2、O或NH，v、u、w、x及y各者獨立地為1至6的整數，且 M為
Figure 104119613-A0202-12-0029-68
，其中Xa及Xb之一者為H，而另一者為水 溶性馬來醯亞胺基阻擋部分，或Xa及Xb與其所連結之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。
舉例而言，v、u、w、x及y各者為2。
舉例而言，D與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為約25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
舉例而言，D與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為約20：1、15：1、10：1、5：1、2：1或1：1。
舉例而言，D與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為約16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
舉例而言，D與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為約15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
舉例而言，D與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為約15：1、14：1、13：1或12：1。
舉例而言，D與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為約6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
舉例而言，一或多個D各者-承載聚合物支架獨立地為式(Id)：
Figure 104119613-A0202-12-0031-69
 其中：m3a為0至約17的整數，m3b為1至約8的整數，且 端
Figure 104119613-A0202-12-0031-70
表示一或多聚合物支架與具有40kDa或更大 的分子量的經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之直接連結。
式(Id)之支架可包括一或多下述特徵：m3a與m3b之總和為1與18之間。
當PHF在式(Id)具有分子量範圍約2kDa至約40kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約15至約300、m1為1至約140的整數、m2為1至約40的整數、m3a為0至約17的整數、m3b為1至約8的整數、m3a與m3b之總和範圍為1至約18，且PHF與經單離之HER2抗 體或其抗原-結合片段之間的比為10或更少。
當PHF在式(Id)具有分子量範圍約2kDa至約20kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約15至約150、m1為1至約70的整數、m2為1至約20的整數、m3a為0至約9的整數、m3b為1至約8的整數、m3a與m3b之總和範圍為1至約10，且PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為2至約8的整數。
當PHF在式(Id)具有分子量範圍約3kDa至約15kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約20至約110、m1為2至約50的整數、m2為2至約15的整數、m3a為0至約7的整數、m3b為1至約8的整數、m3a與m3b之總和範圍為1至約8；且PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為2至約8的整數(例如：約2至約6或約2至約4)。
當PHF在式(Id)具有分子量範圍約5kDa至約10kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約40至約75、m1為約2至約35的整數、m2為約2至約10的整數、m3a為0至約4的整數、m3b為1至約5的整數、m3a與m3b之總和範圍為1至約5；以及PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為2至約8的整數(例如：約2至約6或約2至約4)。
在某些實施態樣中，奧瑞他汀(auristatin)F羥基丙基醯胺(“AF HPA”)與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約30：1、29：1、28：1、27： 1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在其他實施態樣中，AF HPA與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約15：1、14：1、13：1或12：1。
在某些實施態樣中，PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在某些實施態樣中，PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他實施態樣中，PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在其他實施態樣中，PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他實施態樣中，PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約6：1、5：1、4：1或3：1。
在某些實施態樣中，PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約5：1、4：1或3：1。
在某些實施態樣中，PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比可為約4：1、3：1或2：1。
水可溶性馬來醯亞胺基阻擋部分(例如：Xa或Xb)為當馬來醯亞胺基與式(II)之含硫醇之化合物反應時可共價連結到二烯烴碳原子之一的部分：R90-(CH2)d-SH(II)
其中： R90為NHR91、OH、COOR93、CH(NHR91)COOR93或經取代之苯基；R93為氫或C1-4烷基；R91為氫、CH3或CH3CO及d為1至3的整數。
於一實施態樣中，式(ii)之水可溶性馬來醯亞胺基阻擋化合物可為半胱胺酸、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸甲基酯、N-甲基半胱胺酸、2-巰基乙醇、3-巰基丙酸、2-巰基乙酸、巰基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇，其中苯基為經一或多親水性取代基、或3-胺基丙烷-1-硫醇取代。苯基上之一或多親水性取代基包括OH、SH、甲氧基、乙氧基、COOH、CHO、COC1-4烷基、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等。
在另一態樣中，水可溶性馬來醯亞胺基阻擋基團為-S-(CH2)d-R90，其中R90為OH、COOH或CH(NHR91)COOR93；R93為氫或CH3；R91為氫或CH3CO；以及d為1或2。
於另一實施態樣中，水可溶性馬來醯亞胺基阻擋基團為-S-CH2-CH(NH2)COOH。
在某些實施態樣中，本文所描述之共軛物包括一或多個D-承載PHF，其各者獨立地為式(If)，其中PHF具有分子量範圍為約2kDa至約40kDa：
Figure 104119613-A0202-12-0036-71
其中：m為1至約300的整數，m1為1至約140的整數，m2為1至約40的整數，m3a為0至約17的整數，m3b為1至約8的整數；m3a與m3b之總和範圍為1至約18；m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為約15至約300； 端
Figure 104119613-A0202-12-0036-72
表示一或多PHF聚合物支架與經單離之抗體 或其抗原結合片段的連結，經單離之抗體或其抗原結合片段專一性結合至人HER2受體的表位且包括可變重鏈互補性決定區1(CDRH1)，其包括胺基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO：25)；可變重鏈互補性決定區2(CDRH2)，其包括胺基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；可變重鏈互補性決定區3(CDRH3)，其包括胺基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO：27)；可變輕鏈互補性決定區 1(CDRL1)，其包括胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；可變輕鏈互補性決定區2(CDRL2)，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及可變輕鏈互補性決定區3(CDRL3)，其包括胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)；以及PHF與抗體之比為10或更少。
式(If)之支架可包括一或多下述特徵：當PHF在式(If)具有分子量範圍約2kDa至約20kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為約15至約150、m1為1至約70的整數、m2為1至約20的整數、m3a為0至約9的整數、m3b為1至約8的整數、m3a與m3b之總和範圍為1至約10，且該PHF與該抗體之比為2至約8的整數。
當PHF在式(If)具有分子量範圍約3kDa至約15kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為約20至約110、m1為2至約50的整數、m2為2至約15的整數、m3a為0至約7的整數、m3b為1至約8的整數、m3a與m3b之總和範圍1至約8；以及PHF與抗體之比為2至約8的整數(例如：約2至約6或約2至約4)。
當PHF在式(If)具有分子量範圍約5kDa至約10kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為約40至約75、m1為約2至約35的整數、m2為約2至約10的整數、m3a為0至約4的整數、m3b為1至約5的整數、m3a與m3b之總和範圍為1至約5；以及PHF與抗體之間的比 為2至約8的整數(例如：約2至約6或約2至約4)。
在某些實施態樣中，奧瑞他汀(auristatin)F羥基丙基醯胺(“AF HPA”)與抗體之間的比可為約30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在其他實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
在某些實施態樣中，AF與抗體之間的比可為約15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約15：1、14：1、13：1或12：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、 3：1、2：1或1：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在其他實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約6：1、5：1、4：1或3：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約5：1、4：1或3：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約4：1、3：1或2：1。
在另一態樣中，本文所描述之共軛物為式(Ib)：
Figure 104119613-A0202-12-0039-74
其中：HER2抗體表示本文所描述之經單離之HER2抗體或 其抗原-結合片段；LP2與HER2抗體之間的
Figure 104119613-A0202-12-0040-319
表示HER2抗體與LP2的直接或間接連結，HER2抗體的各次出現獨立地具有少於200kDa之分子量，m為1至約2200的整數，m1為1至約660的整數，m2為3至約300的整數，m3為0至約110的整數，m4為1至約60的整數；以及m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約150至約2200。
在式(Ib)中，m1為約10至約660的整數(例如：約10-250)。
當PHF在式(Ib)具有分子量範圍約50kDa至約100kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約370至約740)時，m2為5至約100的整數、m3為1至約40的整數、m4為1至約20的整數及/或m1為1至約220的整數(例如：m1為約15-80)。
在式(Ib)中，各HER2抗體獨立地具有分子量為120kDa或更少、80kDa或更少、70kDa或更少、60kDa或更少、50kDa或更少、40kDa或更少、30kDa或更少、20kDa或更少或10kDa或更少，或約4kDa至80kDa(例如：4-20kDa、20-30kDa、或30-70kDa)。
本發明之另一態樣特徵在於製備本文所描述之共軛物的方法。方法包括將經單離之抗體或其抗原-結合片段與式(Ia)的聚合物支架反應，使得形成共軛物：
Figure 104119613-A0202-12-0041-75
其中：LD1為含羰基之部分；
Figure 104119613-A0202-12-0041-81
中
Figure 104119613-A0202-12-0041-80
的各次出現獨立地 為包含生物可降解鍵之第一連接子，使得當該鍵斷裂時，D以活性形式釋出達其所欲治療效果；以及
Figure 104119613-A0202-12-0041-78
中介於LD1與D之間的
Figure 104119613-A0202-12-0041-79
表示D至LD1 的直接或間接連結；
Figure 104119613-A0202-12-0041-77
的各次出現獨立地為尚未連接到經 單離之抗體或其抗原-結合片段的第二連接子，其中LP2為含官能基之部分，其還與經單離之抗體或其抗原-結合片 段的官能基形成共價鍵，及LD1與LP2之間的
Figure 104119613-A0202-12-0041-82
表示 LP2與LD1的直接或間接連結，且第二連接子的各次出現不同於該第一連接子的各次出現；m為1至約300的整數， m1為1至約140的整數，m2為1至約40的整數，m3為1至約18的整數，及m、m1、m2及m3之總和範圍約15至約300。
對本文所揭露之聚合物支架的式中，聚縮醛單元之間的斷開或間隙係指單元可以任何順序彼此連接。換句話說，包含例如：D、LP2之附加基團，及經單離之抗體或其抗原-結合片段，可沿聚合物主鏈隨機地分布。
本發明亦係提供治療、預防、延遲與異常HER2表現、功能及/或活化相關之一或多病變進展或者改善與異常HER2表現、功能及/或活化相關之一或多病變的症狀或緩解與此病變相關之症狀的方法，藉由投予本文所揭露之單株抗體、其片段及/或其共軛物至個體，其中此治療或預防為所欲。欲治療之個體為例如：人。單株抗體、其片段及/或其共軛物以足以治療、預防或緩解與病變相關之症狀的量投予。
本發明亦係提供治療、預防、延遲與HER2表現、功能及/或活化相關之一或多病變的進展或者改善與HER2表現、功能及/或活化相關之一或多病變的症狀或緩解與此病變相關之症狀之方法，藉由投予本文所揭露之單株抗體、其片段及/或其共軛物至個體，其中此治療或預防為所欲。欲治療之個體為例如：人。單株抗體、其片段及/或其共軛物以足以治療、預防或緩解與病變相關之症狀的量投予。
使用本文所揭露之單株抗體、其片段及/或其共軛物所治療及/或預防之病變包括，例如，癌症。舉例而言，本文所揭露之抗體、其片段及/或其共軛物有用於治療選自下列所組成群組之癌症、預防選自下列所組成群組之癌症、延遲選自下列所組成群組之癌症的進展或者改善選自下列所組成群組之癌症的症狀：肛門癌、星狀細胞瘤、白血病、淋巴瘤、頭及頸癌症、肝癌、睾丸癌、子宮頸癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、間皮瘤、皮膚癌、骨髓瘤、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、胰腺癌、腎癌及胃癌。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或其PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療乳癌、預防乳癌、延遲乳癌的進展或者改善乳癌的症狀。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或其PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療胃癌、預防胃癌、延遲胃癌的進展或者改善胃癌的症狀。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或其PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)、預防非小細胞肺癌(NSCLC)、延遲非小細胞肺癌(NSCLC)的進展或者改善非小細胞肺癌(NSCLC)的症狀。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或其PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療卵巢癌、預防卵巢癌、延遲卵巢癌的進展或者改善卵巢癌的症狀。
在某些實施態樣中，用於治療癌症、預防癌症、延遲癌症的進展或者改善癌症的症狀(例如：選自下列所組成群組之癌症：肛門癌、星狀細胞瘤、白血病、淋巴瘤、頭及頸癌症、肝癌、睾丸癌、子宮頸癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、間皮瘤、皮膚癌、骨髓瘤、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、胰腺癌、腎癌及胃癌)的Her2抗體或其抗原結合片段與下述抗體競爭結合到Her-2的相同表位，該抗體包括(1)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO：25)；CDRH2，其包括胺基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；CDRH3，其包括胺基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO：27)；以及輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)與CDRL3，其包括胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)；(2)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSGRSMN(SEQ ID NO：30)；CDRH2，其包括胺基酸序列YISSDSRTIYYADSVKG(SEQ ID NO：31)；CDRH3，其包括胺基酸序列GGHGYFDL (SEQ ID NO：27)；輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)；(3)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO：17)；CDRH2，其包括胺基酸序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：18)；CDRH3，其包括胺基酸序列EAPYYAKDYMDV(SEQ ID NO：19)，及輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO：20)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYVSYWT(SEQ ID NO：22)；或(4)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO：17)；CDRH2，其包括胺基酸序列GIWWDGSNEKYADSVKG(SEQ ID NO：23)；CDRH3，其包括胺基酸序列EAPYYAKDYMDV(SEQ ID NO：19)；以及輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO：20)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASRRAT(SEQ ID NO：24)；以及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYVSYWT(SEQ ID NO：22)。
於另一實施態樣中，用於治療癌症、預防癌症、延遲癌症的進展或者改善癌症的症狀(例如：選自下列所組成群組之癌症：肛門癌、星狀細胞瘤、白血病、淋巴瘤、頭及頸癌症、肝癌、睾丸癌、子宮頸癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、間皮瘤、皮膚癌、 骨髓瘤、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、胰腺癌、腎癌及胃癌)的Her2抗體或其抗原結合片段與下述抗體競爭結合到Her-2的相同表位，該抗體包括(1)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO：25)；CDRH2，其包括胺基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；CDRH3，其包括胺基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO：27)；以及輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)；(2)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSGRSMN(SEQ ID NO：30)；CDRH2，其包括胺基酸序列YISSDSRTIYYADSVKG(SEQ ID NO：31)；CDRH3，其包括胺基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO：27)；輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)；(3)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO：17)；CDRH2，其包括胺基酸序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：18)；CDRH3，其包括胺基酸序列EAPYYAKDYMDV(SEQ ID NO：19)，及輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO：20)；CDRL2，其包括胺 基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYVSYWT(SEQ ID NO：22)；或(4)重鏈可變區CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO：17)；CDRH2，其包括胺基酸序列GIWWDGSNEKYADSVKG(SEQ ID NO：23)；CDRH3，其包括胺基酸序列EAPYYAKDYMDV(SEQ ID NO：19)；以及輕鏈可變區CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO：20)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASRRAT(SEQ ID NO：24)；以及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYVSYWT(SEQ ID NO：22)，其中Her2抗體或其抗原結合片段直接或間接與至少一治療劑共軛，其中治療劑為具有分子量
Figure 104119613-A0202-12-0047-311
約5kDa、
Figure 104119613-A0202-12-0047-316
約4kDa、
Figure 104119613-A0202-12-0047-317
約3kDa、
Figure 104119613-A0202-12-0047-313
約1.5kDa，或
Figure 104119613-A0202-12-0047-318
約1kDa的小分子。本發明亦係提供藉由在以本文所揭露之HER2抗體或其抗原結合片段及/或其共軛物治療之前，辨識具有HER2低表現的患者來辨識或者提取，例如：分選適於治療投予本文所揭露之HER2抗體或其抗原結合片段及/或其PBRM-聚合物-藥物共軛物的患者群之套組及/或方法。低HER2表現代表這些患者具有每細胞少於或等於100,000、少於或等於90,000、或少於或等於80,000 HER2分子，例如，在測試細胞群中每細胞測量。HER2表現量，即每細胞HER2分子的數目，可使用本領域認可之方法測量，包括但不限於使用以細胞為主之存活率分析，如本文提供之工作實施例中所示(見例如：實施例18)。
本發明亦提供藉由在以本文所揭露之HER2 抗體或其抗原結合片段及/或其共軛物治療之前，辨識個體HER2分數來辨識或者提取，例如：分選適於治療投予本文所揭露之HER2抗體或其抗原結合片段及/或其共軛物的患者群之套組及/或方法。在某些實施態樣中，個體經識別為對HER2表現具有分數為1+或2+。在某些實施態樣中，個體經識別為對HER2表現具有分數為1+或2+，此係由在測試細胞群上進行免疫組織化學(IHC)分析所偵測，且其中HER2基因在該測試細胞群中未被放大。在某些實施態樣中，測試細胞群為源自生檢樣本的新鮮未凍之組織。在某些實施態樣中，測試細胞群為源自生檢樣本的冷凍組織。
IHC測試測量癌症組織樣本(例如：乳癌組織樣本或胃癌樣本)中細胞表面上HER2受體蛋白質的量，且分配細胞表面HER2受體之偵測量0、1+、2+或3+的HER2分數。若個體的HER2分數為0至1+的範圍，則癌症被認為是“HER2陰性”。若分數為2+，則癌症被稱為“邊界”，而分數3+表示癌症為“HER2陽性”。
在某些實施態樣中，該個體經識別為對HER2表現具有分數為1+或2+且為對化療(包括標準前線化療劑)有耐性。如本文所用，術語個體包括人及其他哺乳動物。在某些實施態樣中，該個體經識別為對HER2表現具有分數為1+或2+且患有乳癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、或卵巢癌。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其 抗原結合片段及/或PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療患者乳癌、預防患者乳癌、延遲患者乳癌的進展或者改善患者乳癌的症狀，該患者具有HER2 IHC 1+或HER2 IHC 2+而無基因放大，例如：FISH-(或螢光原位雜交陰性)。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療患者乳癌、預防患者乳癌、延遲患者乳癌的進展或者改善患者乳癌的症狀，該患者具有晚期HER2陽性乳癌且已接受以賀癌寧(Kadcyla)前治療。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療患者乳癌、預防患者乳癌、延遲患者乳癌的進展或者改善患者乳癌的症狀，該患者具有晚期HER2陽性乳癌且先前尚未接受以賀癌寧(Kadcyla)前治療。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療患者胃癌、預防患者胃癌、延遲患者胃癌的進展或者改善患者胃癌的症狀，該患者具有HER2 IHC 1+或HER2 IHC 2+而無基因放大，例如：FISH-。
在某些實施態樣中，本文所揭露之抗體或其抗原結合片段及/或PBRM-聚合物-藥物共軛物有用於治療患者非小細胞肺癌(NSCLC)、預防患者非小細胞肺癌(NSCLC)、延遲患者非小細胞肺癌(NSCLC)的進展或者改善患者非小細胞肺癌(NSCLC)的症狀，該患者具有HER2 IHC 2+、HER2 IHC 3+、任一HER2基因放大或突變狀態。
在某些實施態樣中，個體為對化療(包括標準前線化療劑)有耐性。在某些實施態樣中，個體為對賀癌寧(Kadcyla)治療有抗性。
用於本文所提供之方法及用途的實施態樣任一的HER2抗體或其抗原結合片段及/或經共軛之HER2抗體或其抗原結合片段可在疾病的任何階段投予。舉例而言，此HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體可投予到患有任何階段(早期到轉移性)癌症的患者。
用於這些方法及用途之實施態樣任一的HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體可單獨或與一或多化療劑或其他劑組合投予。在某些實施態樣中，該劑為本文所描述之毒素任一。在某些實施態樣中，該劑為(1)HER2抑制劑、(2)EGFR抑制劑(例如：酪胺酸激酶抑制劑或標靶抗-EGFR抗體)、(3)BRAF抑制劑、(4)ALK抑制劑、(5)荷爾蒙受體抑制劑、(6)mTOR抑制劑、(7)VEGF抑制劑、或(8)癌症疫苗。在某些實施態樣中，該劑為標準第一線化療劑，諸如，例如，曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、ado-曲妥珠單抗艾得辛(trastuzumab emtansine)(賀癌寧(Kadcyla))、拉帕替尼(lapatinib)、阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、依維莫司(everolimus)、氟維司群(fulvestrant)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬 (toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟羥甲基睪酮(fluoxymesterone)、乙烯雌二醇(ethinyl estradiol)、紫杉醇(paclitaxel)、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、艾瑞布林(eribulin)、長春瑞濱(vinorelbine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、卡鉑(carboplatin)、多西他賽(docetaxel)、白蛋白結合型紫杉醇、順鉑(cisplatin)、表柔比星(epirubicin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、阿黴素(doxorubicin)、氟脲嘧啶(fluorouracil)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、氟嘧啶、伊立替康(irinotecan)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、絲裂黴素(mitomycin)、亞葉酸(leucovorin)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、克里唑替尼(crizotinib)、培美曲塞(permetrexed)、色瑞替尼(ceritinib)、依託泊苷(etoposide)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、異環磷醯胺(ifosfamid)、脂質體阿黴素(doxorubicin)、拓撲替康(topotecan)、六甲蜜胺(altretamine)、黴法蘭(melphalan)或乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)。在某些實施態樣中，該第二劑為賀癌寧(Kadcyla)。
在某些實施態樣中，該劑為專一性結合HER2的至少第二抗體或其抗原結合片段。在某些實施態樣中，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與HER2抗體、HER2二聚合抑制劑抗體或HER2抗體與HER2二聚合抑制劑抗 體(諸如，例如，曲妥珠單抗(trastuzumab)或帕妥珠單抗(pertuzumab)或其組合)的組合來組合投予。在某些實施態樣中，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與曲妥珠單抗(trastuzumab)之生物相似物或帕妥珠單抗(pertuzumab)之生物相似物或其組合來組合投予。
HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體的這些組合有用於治療病變諸如，例如，癌症。舉例而言，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體的這些組合，例如：本文所揭露之HER2抗體或其抗原結合片段及/或經共軛之HER2抗體(例如：HER2抗體-聚合物-藥物共軛物)組合曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)或曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab)兩者或曲妥珠單抗(trastuzumab)之生物相似物、帕妥珠單抗(pertuzumab)之生物相似物或兩個生物相似物有用於治療癌症、預防癌症、延遲癌症的進展或者改善癌症的症狀(例如：選自下列所組成群組之癌症：肛門癌、星狀細胞瘤、白血病、淋巴瘤、頭及頸癌症、肝癌、睾丸癌、子宮頸癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、間皮瘤、皮膚癌、骨髓瘤、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、胰腺癌、腎癌、及胃癌)。
這些組合亦有用於當HER2-表現細胞與這些組合接觸時增加HER2降解。使用任何本領域認可偵測HER2降解之方法偵測HER2降解量，包括但不限於在 HER2抗體(或其生物相似物)組合存在或不存在下，偵測HER2降解量，如本文提供之工作實施例(見例如：實施例14)所示。舉例而言，與未以HER2抗體的組合處理之HER2-表現細胞的HER2降解量相比，使用西方分析對經以HER2抗體的組合處理之HER2-表現細胞的溶解產物測定HER2降解量。
在某些實施態樣中，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與額外劑調配成單一治療組成物，且HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與額外劑同時投予。或者，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與額外劑彼此分開例如：各調配成分別之治療組成物，且HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與額外劑同時投予，或HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與額外劑在治療方案期間在不同時間投予。舉例而言，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體為在投予額外劑之前投予，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體為在接續投予額外劑之後投予，或HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體與額外劑以交替的方式投予。如本文所描述，HER2抗體及/或經共軛之HER2抗體及額外劑以單一劑量或以多劑量投予。
根據本發明之醫藥組成物可包括本文所揭露之抗體、其片段及/或其共軛物與適當的載劑。這些醫藥組成物可包含在套組，諸如，例如，診斷套組。
發明所屬技術領域中具有通常知識者將了解本文揭露之抗體具有多種用途。舉例而言，本文所揭露之 蛋白質用作為治療劑。本文揭露之抗體亦用作為在診斷套組或診斷工具中的試劑，或這些抗體可用於競爭分析以產生治療試劑。
除非特別定義，所有本文所用之技術與科學用語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常了解的相同意思。在說明書中，單數形式亦包括複數，除非文中清楚指定。雖然類似或等同於本文所描述之方法與材料可用於實施或測試本發明，但適當的材料與方法描述在下面。在衝突的情況下，本案說明書(包括定義)為主。此外，材料、方法與例子僅為說明之用而非意於限制。
本發明之其他特徵及優點從下述細節描述與申請專利範圍來看為顯而易知。
圖1a顯示由Octet Red384表位分級對抗體XMT 1517及XMT 1518表位分級。
圖1b顯示由Octet Red384表位分級對抗體XMT 1519及XMT 1520表位分級。
圖2顯示抗體XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520對JIMT-1細胞的細胞表面結合。
圖3a顯示抗體XMT 1517、XMT 1518對重組人HER2及馬來猴(cynomolgus monkey)HER2的結合親和性。
圖3b顯示抗體XMT 1519、XMT 1520對重組 人HER2及馬來猴(cynomolgus monkey)HER2的結合親和性。
圖3c顯示XMT 1519及實施例16H對重組人HER2的結合親和性。
圖3d顯示XMT 1519與實施例16H對馬來猴(cynomolgus monkey)HER2的結合親和性。
圖4顯示抗體XMT 1518及XMT 1519競爭結合至HER2。
圖5顯示對曲妥珠單抗(trastuzumab)及抗體XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520之抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)。
圖6顯示對曲妥珠單抗(trastuzumab)及抗體HT XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520的內化率。
圖7顯示在SKBR3細胞中HER2抗體之內化。
圖8顯示抗-HER2抗體之組合所誘導之HER2降解。
圖9說明實施例16A，曲妥珠單抗(trastuzumab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))及實施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在NCI-N87小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖10說明賀癌寧(Kadcyla)；實施例16A，曲妥珠單抗(trastuzumab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF- HPA-Ala)))；以及實施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在JIMT-1小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖11說明賀癌寧(Kadcyla)；帕妥珠單抗(pertuzumab)；賀癌寧(Kadcyla)與帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合；以及實施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在JIMT-1小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖12說明實施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))；曲妥珠單抗(trastuzumab)與帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合；或曲妥珠單抗(trastuzumab)之三重組合；帕妥珠單抗(pertuzumab)與實施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在NCI-N87小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖13說明賀癌寧(Kadcyla)、實施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))與實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在SNU5小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖14說明賀癌寧(Kadcyla)與實施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在TOV-21G小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖15說明賀癌寧(Kadcyla)、實施例16E， XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))與實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在H522小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖16說明賀癌寧(Kadcyla)、實施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))及實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在SKOV3小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖17說明實施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在Calu-3小鼠腫瘤異種移植模式測量。
圖18說明賀癌寧(Kadcyla)、實施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))與實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在BRE-0333 HER2 1+患者衍生之異種移植模式測量。
圖19說明賀癌寧(Kadcyla)、實施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))與實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在MAXF_1162 HER2 3+患者衍生之異種移植模式測量。
圖20說明賀癌寧(Kadcyla)、實施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))及實 施例17C，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))的抗腫瘤功效，是在BT474小鼠腫瘤異種移植模式測量。
本發明係提供專一性結合呈可溶性形式或膜結合(即當表現在細胞表面)之人HER2的單株抗體。本發明進一步提供專一性結合HER2的單株抗體。HER2。這些抗體在本文中統一稱為“HER2”抗體。
本發明抗體以平衡解離常數(Kd or KD)為
Figure 104119613-A0202-12-0058-305
1μM，例如：
Figure 104119613-A0202-12-0058-306
100nM，較佳地
Figure 104119613-A0202-12-0058-307
10nM，且更佳地
Figure 104119613-A0202-12-0058-308
1nM結合到HER2表位。舉例而言，本文提供之HER2抗體呈現Kd範圍大約介於
Figure 104119613-A0202-12-0058-309
1nM至約1pM之間。
本文所揭露的HER2抗體作為調節、阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾HER2之功能活性。HER2。HER2之功能活性包括例如，調節PI3K-Akt途徑活性。舉例而言，HER2抗體藉由部分或完全調節、阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾PI3K-Akt途徑活性而完全或部份抑制HER2功能活性。使用任一本領域認可之偵測PI3K-Akt途徑活性方法評估PI3K-Akt途徑活性，包括但不限於在存在或不存在本文所揭露之抗體或抗原結合片段下偵測磷酸化Akt之量。
當在HER2抗體存在下，HER2功能活性量降低至少95%，例如：96%、97%、98%、99%或100%(在無 與本文所描述之HER2抗體結合下的HER2功能活性量相比)時，HER2抗體被認為完全調節、阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾HER2功能活性。當在HER2抗體存在下，HER2活性量降低少於95%，例如：10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%(在無與本文所描述之HER2抗體結合下的HER2活性量相比)時，HER2抗體被認為部分調節、阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾HER2功能活性。
定義
除非另行定義，否則用於與本發明相關之科學與技術用語應具有發明所屬技術領域中具有通常知識者通常了解的意義。再者，除非文中所需，單數用語應包括複數，而複數用語應包括單數。一般而言，與本文所描述之細胞與組織培養、分子生物學、蛋白質及寡或多核苷酸化學及雜交相關運用之命名及技術為發明所屬技術領域中廣知且常用者。標準技術常用於重組DNA、寡核苷酸合成、及組織培養與轉形(例如：電穿孔、脂質體轉染)。依據製造商說明書或發明所屬技術領域中常完成者或如本文所描述者進行酵素反應及純化技術。上述技術與程序一般依據發明所屬技術領域中廣知的及本說明書通篇引用及討論之各種一般及更特定之文獻所述的習知方法進行。見例如：Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y。(1989))。本文所描述之分析化學、合成有機化學、及藥用與醫藥化學相關之命名及實驗室程序與技術為發明所屬技術領域中廣知且常用者。標準技術用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配、及遞送與患者治療。
如依據本發明所用者，下述術語，除非另行指明，否則應理解為具有下述意義：如本文所用，術語“HER2”(亦已知為ErbB-2、NEU、HER-2、及CD340)，當用於本文係指人表皮生長因子受體2(SwissProt P04626)且包括由細胞(包括腫瘤細胞)天然表現、或以HER2基因轉染之細胞上表現的任何HER2變體、異型體及種同源物。種同源物包括恆河猴HER2(恆河獼猴；Genbank登錄號GI：109114897)。這些用語為同義且可交替使用。
如本文所用，術語“HER2抗體”或“抗-HER2抗體”為專一性結合到抗原HER2的抗體。
如本文所用，術語“抗體”係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含專一性結合(免疫反應)抗原的抗原結合位置之分子。“專一性結合”或“免疫反應”“或針對”意指抗體與所欲抗原的一或多抗原性決定位反應且不與其他多胜肽群反應或以極低親和性(Kd>10-6)結合。抗體包括但不限於多株、單株、嵌合、dAb(域抗體)、單鏈、Fab、Fab’及F(ab’)2片段、scFvs、及Fab表現庫。
基本抗體結構單元已知包含四聚體。各四聚體由二相同多胜肽鏈對構成，各對具有一“輕”(約25kDa)及一“重”鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端部分包括主要負責抗原辨識的約100至110或更多胺基酸之可變區。各鏈羧基端部分定義主要負責效應子功能之恆定區。一般而言，得自人的抗體分子係關於類型IgG、IgM、IgA、IgE及IgD任一，其彼此之間因存在於分子中之重鏈本質而不同。某些類型亦具有子類，諸如：IgG1、IgG2及其他。再者，人當中，輕鏈可為卡帕(kappa)鏈或拉姆達(lambda)鏈。
本文所用之術語“單株抗體”(mAb)或“單株抗體組成物”係指抗體分子群，其包含僅一種分子品種由獨特輕鏈基因產物及獨特重鏈基因產物組成的抗體分子。特別是，單株抗體的互補性決定區(CDR)在群的所有分子中相同。mAb包含能夠與抗原之特別表位(特徵為對其獨特之結合親和性)免疫反應的抗原結合位置。
一般而言，得自人的抗體分子係關於類型IgG、IgM、IgA、IgE及IgD任一，其彼此之間因存在於分子中之重鏈本質而不同。某些類型亦具有子類，諸如：IgG1、IgG2及其他。再者，人當中，輕鏈可為卡帕(κ，kappa)鏈或拉姆達(λ，lambda)鏈。
術語“抗原-結合位置”或“結合部分”係指參與抗原結合的免疫球蛋白分子的部分。抗原結合位置由重(“H”)及輕(“L”)鏈的N端可變(“V”)區之胺基酸殘基形成。 重及輕鏈的V區中三高度相異延伸(highly divergent stretch)(稱為“高可變區”)夾在更保留之側翼延伸(已知為“框架區”或“FR”)之間。因此，術語“FR”係指在免疫球蛋白高可變區之間且相鄰的天然發現之胺基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三高可變區與重鏈的三高可變區在三維空間中相對於彼此配置而形成抗原結合表面。抗原結合表面為與結合之抗原的三維表面互補，且重及輕鏈各者的三高可變區稱為“互補性測定區”或“CDR”。對各域胺基酸的分配係依照Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987及1991))，或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987),Chothia et al.Nature 342：878-883(1989)的定義。
使用術語“片段”、“抗體片段”、“抗原-結合片段”及“抗原結合片段”如本文交替使用，除非另行指定。
如本文所用，術語“表位”包括能夠專一性結合至免疫球蛋白或其片段、或T-細胞受體的任一蛋白質決定位。術語“表位”包括能夠專一性結合至免疫球蛋白或T-細胞受體的任一蛋白質決定位。表位決定位通常由分子(諸如：胺基酸或糖側鏈)的化學活性表面分組組成且通常具有特定的三維結構特徵，以及特定的電荷特徵。當解離常數為
Figure 104119613-A0202-12-0062-303
1μM；例如：
Figure 104119613-A0202-12-0062-301
100nM、較佳地
Figure 104119613-A0202-12-0062-302
10nM及更佳地
Figure 104119613-A0202-12-0062-304
1nM時，抗體被稱為專一性結合抗原。
當用於本文於二或更多抗體情況下，術語“競 爭”或“交叉競爭”指二或更多抗體競爭結合到HER2，例如：在實施例5或8中所述的分析中競爭HER2結合。若抗體與一或多其他抗體競爭25%或更多時，則抗體“阻擋”或“交叉阻擋”一或多其他抗體結合至HER2，25%-74%表示“部分阻擋”而75%-400%表示“完全阻擋”，較佳地使用實施例5及8之分析測定。對一些抗體對而言，實施例5或8的分析中競爭或阻擋僅在當一抗體塗佈在盤上而另一用來競爭時觀察到，且非反之亦然。除非文中另行定義或否定，當本文使用術語“競爭”、“交叉競爭”、“阻擋”或“交叉阻擋”亦意於涵蓋此種抗體對。
如本文所用，“抑制HER二聚合”的抗體應表示抑制、或干擾HER二聚體形成的抗體。較佳地，此抗體在其異二聚體結合位置結合至HER2。在一實施態樣中，本文二聚合抑制抗體為帕妥珠單抗(pertuzumab)或MAb 2C4。抑制HER二聚合之抗體的其他例子包括結合至EGFR且抑制其與一或多其他HER受體二聚合的抗體，諸如，例如EGFR單株抗體806，MAb 806，其結合至經活化或“未縛之”EGFR(見Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))；結合至HER3且抑制其與一或多其他HER受體二聚合之抗體；以及結合至HER4且抑制其與一或多其他HER受體二聚合之抗體。
如本文所用術語“HER2二聚合抑制劑”應指抑制包括HER2之二聚體或異二聚體形成的劑。
如本文所用，術語“內化”當用於HER2抗體的 文中時包括任何機制，其中抗體從細胞表面及/或從周圍培養基例如：經由胞飲作用被內化到HER2-表現細胞。
如本文所用，術語“免疫結合”及“免疫結合特性”意指免疫球蛋白分子與免疫球蛋白專一之抗原之間所發生類型的非共價交互作用。免疫結合交互作用之強度或親和性可就交互作用之解離常數(Kd)表現，其中較小之Kd代表較高之親和性。所選的多胜肽群之免疫結合特性可使用發明所屬技術領域中廣知的方法量化。一此種方法意味測量抗原-結合位置/抗原複合物形成與解離的速率，其中該些速率依賴於複合物搭檔的濃度、交互作用之親和性、及幾何參數，其在兩方向平等地影響速率。因此，“開速率常數”(K開)及“關速率常數”(K關)兩者可由計算濃度及締合與解離的實際速率測定。(見Nature 361：186-87(1993))。K關/K開的比使得消除與親和性無關的所有參數，且等於解離常數Kd。(見，一般為Davies et al.(1990)Annual Rev Biochem 59：439-473)。當平衡解離常數(Kd或KD)為
Figure 104119613-A0202-12-0064-295
1μM，較佳地
Figure 104119613-A0202-12-0064-299
100nM，更佳地
Figure 104119613-A0202-12-0064-297
10nM，且最佳地
Figure 104119613-A0202-12-0064-298
100pM至約1pM時，稱本發明抗體專一性結合至HER2，其係由分析，諸如：放射配體結合分析或發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的類似分析測量。
如本文所用之術語“經單離之多核苷酸”應指基因體、cDNA、或合成來源或其一些組合之多核苷酸，依其來源之屬性，“經單離之多核苷酸”(1)不與其中自然界中發現的“經單離之多核苷酸”之多核苷酸的全部或部分相 關，(2)為可操作地連接到自然界中其不連接的多核苷酸，或(3)在自然界中不發生為較大序列的部分。依據本發明的多核苷酸包括SEQ ID NO：34及36的核酸序列，以及編碼以SEQ ID NO：1、3、5及7表示之重鏈免疫球蛋白分子的核酸分子、及SEQ ID NO：35與37的核酸序列，以及編碼以SEQ ID NO：2、4、6及8表示之輕鏈免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文所稱之術語“經單離之蛋白質”意指cDNA、重組RNA、或合成來源或其一些組合的蛋白質，依其來源之屬性、或衍生來源，“經單離之蛋白質”(1)不與自然界中發現的蛋白質相關，(2)沒有來自相同來源的其他蛋白質，(3)為來自不同種的細胞表現，或(4)不在自然界中發生。
術語“多胜肽”本文所用為通用術語，意指天然蛋白質、片段、或多胜肽序列的類似物。因此，天然蛋白質片段及類似物為多胜肽屬的種。依據本發明之多胜肽群包括以SEQ ID NO：1、3、5及7表示之重鏈免疫球蛋白分子、及以SEQ ID NO：2、4、6及8表示之輕鏈免疫球蛋白分子，以及組合所形成的抗體分子，其包括重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子，諸如：卡帕輕鏈免疫球蛋白分子，且反之亦然，以及其片段及類似物。
如本文所用適用於物之術語“天然發生”係指物可在自然界發現的事實。舉例而言，存在於有機體(包括病毒)可從自然界來源單離且尚未被實驗室中人員或其 他方式有意修飾的多胜肽或多核苷酸序列為天然發生。
如本文所用之術語“可操作地連接”係指所述之成分位置係呈允許彼等以其所欲方式作用的關係。“可操作地連接”到編碼序列的控制序列以此等在與控制序列可相比的條件下達到編碼序列表現方式連接。
本文所用之術語“控制序列”係指多核苷酸序列，其為必需者以達到其所連接之編碼序列的表現與處理。此控制序列的性質在原核生物中依宿主有機體而異，此控制序列在真核生物中一般包括啟動子、核糖體結合位置、與轉錄終止序列，一般而言，此控制序列包括啟動子與轉錄終止序列。術語“控制序列”意於包括，最低程度下，其存在對表現及處理為基本的所有成分，且亦可包括其存在為有利的額外成分，例如，前導序列及融合搭擋序列。本文所稱之術語“多核苷酸”意指長度至少10鹼基之核苷酸的聚合性硼，為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸的經修飾形式。術語包括DNA單股形式及雙股形式。
本文所稱之術語“寡核苷酸”包括天然發生，及由天然發生與非天然發生寡核苷酸鍵聯連接在一起的經修飾之核苷酸。寡核苷酸一般為多核苷酸子集，其包括200鹼基或更少的長度。較佳地，寡核苷酸為長度10至60鹼基且最佳地長度12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40鹼基。寡核苷酸通常為單股，例如：作為探針，然寡核苷酸可為雙股，例如：用作為構築基因突變 體。本文所揭露之寡核苷酸為正義或反義寡核苷酸。
本文所稱之術語“天然發生核苷酸”包括去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。本文所稱之術語“經修飾之核苷酸”包括帶有經修飾或經取代之糖基團等的核苷酸。本文所稱之術語“寡核苷酸鍵聯”包括寡核苷酸鍵聯，諸如：硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselerloate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)、磷酸醯胺酯(phosphoronmidate)等。見例如：LaPlanche et al.Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec et al.J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984),Stein et al.Nucl.Acids Res.16：3209(1988),Zon et al.Anti Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon et al.Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.,Oxford University Press,Oxford England(1991))；Stec et al.U.S.Patent No.5,151,510；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)。寡核苷酸如需要可包括用於偵測的標籤。
本文所稱之術語“選擇性雜交”意指可偵測及專一性結合。依據本發明之多核苷酸、寡核苷酸及其片段在最小化可偵測結合至非專一性核酸的可評估量之雜交及洗滌條件下選擇性雜交到核酸股。高嚴苛條件可用以達到發明所屬技術領域中所知及本文所討論之選擇性雜交條 件。一般而言，本文所揭露之多核苷酸、寡核苷酸、及片段與有興趣之核酸序列之間的核酸序列同源性將為至少80%，且最典型地具較佳地至少85%、90%、95%、99%及100%之增加的同源性。若其序列之間有部分或完全相同，則二胺基酸序列為同源。舉例而言，當二序列排列達最大配對時，85%同源性意指85%的胺基酸為相同。在最大配對中允許間隙(在被配對的二序列任一中)，較佳為5或更少的間隙長度，最佳為2或更少。或者及較佳地，同此用語在本文中所用，若其使用程式ALIGN與突變數據矩陣及間隙罰分6或更多具有排列分數超過5(以標準偏差單位)，則二蛋白質序列(或衍生自彼等長度至少30胺基酸的多胜肽序列)為同源。見Dayhoff,M.O.,in Atlas of Protein Sequence and Structure,pp.101-110(Volume 5,National Biomedical Research Foundation(1972))及對此卷的Supplement 2,pp.1-10。當使用ALIGN程式最佳地排列時，若其胺基酸大於或等於50%相同，則二序列或其部分更佳地同源。本文所用的術語“對應於”意指多核苷酸序列為與參考多核苷酸序列的全部或部分同源(即為相同，非嚴格進化地相關)，或多胜肽序列與參考多胜肽序列相同。對比下，本文所用的術語“互補”意指互補序列與參考多核苷酸序列的全部或部分同源。用於說明，核苷酸序列“TATAC”對應於參考序列“TATAC”且與參考序列“GTATA”互補。
使用下述用語描述二或更多多核苷酸或胺基 酸序列之間的序列關係：“參考序列”、“比對窗”、“序列相同”、“序列相同之百分比”、及“實質上相同”。“參考序列”為經定義之序列，用作為序列比對的基準。參考序列可為較大序列的子集，例如，為序列表中給定之全長cDNA或基因序列的節段或可包含完整cDNA或基因序列。一般而言，參考序列為至少18核苷酸或6胺基酸長度，常常為至少24核苷酸或8胺基酸長度，且通常至少48核苷酸或16胺基酸長度。由於二多核苷酸或胺基酸序列可各(1)包括二分子之間類似的序列(即完整多核苷酸或胺基酸序列之部分)，及(2)可進一步包括二多核苷酸或胺基酸序列之間為相異的序列，二(或更多)分子之間的序列比對典型藉由在“比對窗”比對二分子的序列進行，以辨識及比對局部區的序列相似性。本文所用之“比對窗”係指至少18連續核苷酸位置或6胺基酸的概念上之節段，其中多核苷酸序列或胺基酸序列可與參考序列的至少18連續核苷酸或6胺基酸序列比對，且其中當與參考序列(不包括加入或刪除)比對達二序列最佳排列時，比對窗中部分多核苷酸序列可包括20%或更少之加入、刪除、取代等(即間隙)。排列比對窗之序列最佳排列可由Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源性演算法、由Needleman and Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源性排列演算法、由對Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)之相似性方法檢索、由這些演算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)，Geneworks，或MacVector軟體套件)之電腦執行、或由檢測進行，且選擇各種方法產生之最佳排列(即在比對窗導致最高同源性百分比)。
術語“序列相同”意指在比對窗二多核苷酸或胺基酸序列相同(即在核苷酸-對-核苷酸或殘基-對-殘基基準上)。術語“序列相同之百分比”由在比對窗比對二最佳化排列序列計算，測定位置數目(其中相同核酸鹼基(例如：A、T、C、G、U或I)或殘基發生在兩序列中以產生配對位置數目)、以比對窗中位置的總數(即窗大小)除配對位置數目、且將結果乘以100以產生序列相同的百分比。如本文所用術語“實質上相同”表示多核苷酸或胺基酸序列的特徵，其中多核苷酸或胺基酸與參考序列在至少18核苷酸(6胺基酸)位置的比對窗，常為至少24-48核苷酸(8-16胺基酸)位置的窗比對，包括具有至少85%序列相同、較佳地至少90至95%序列相同、更常為至少99%序列相同的序列，其中序列相同的百分比由在比對窗比對參考序列與序列(可包括刪除或加入，為參考序列的總20%或更少)而計算。參考序列可為較大序列的子集。
如本文所用，20個習知的胺基酸及其縮寫沿循習知用法。見Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub及D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland7 Mass.(1991))。20個習知胺基酸的立體異構 物(例如：D-胺基酸)、非天然胺基酸諸如：α-、α-經二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸、及其他非習知的胺基酸亦可為本發明多胜肽群適當的成分。非習知的胺基酸例子包括：4羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥離胺酸、σ-N-甲基精胺酸、及其他類似胺基酸與亞胺基酸(例如：4-羥脯胺酸)。在本文所用之多胜肽標記法，依照標準用法與慣例，左手方向為胺基端方向而右手方向為羧基-端方向。
同樣地，除非特別指明，單股多核苷酸序列左手端為5’端，多核苷酸序列雙股左手方向稱為5’方向。初生RNA轉錄物5’至3’加入的方向稱為轉錄方向，DNA股上具有與RNA相同序列且為5’對到RNA轉錄物的5’端的序列區稱為“上游序列”，DNA股上具有與RNA相同序列且為3’對到RNA轉錄物的3’端的序列區稱為“下游序列”。
如多胜肽群所適用者，術語“實質上相同”意指當諸如：藉由程式間隙或使用默認值間隙權重(default gap weight)之BESTFIT最佳排列時，二胜肽序列共有至少80%序列相同、較佳地至少90%序列相同、更佳地至少95%序列相同、且最佳地至少99%序列相同。
較佳地，不相同的殘基位置因保留性胺基酸取代而不同。
保留性胺基酸取代係指具有類似側鏈之殘基的互換性。舉例而言，具有脂肪族側鏈的胺基酸群為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸；具有脂肪族-羥基側鏈的胺基酸群為絲胺酸及蘇胺酸；具有含醯胺之側鏈的胺基酸群為天冬醯胺及麩醯胺酸；具有芳香族側鏈的胺基酸群為苯丙胺酸、酪胺酸、及色胺酸；具有鹼性側鏈的胺基酸群為離胺酸、精胺酸、及組胺酸；以及具有含硫之側鏈的胺基酸群為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳的保留性胺基酸取代群為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸纈胺酸、麩胺酸-天門冬酸、及天冬醯胺-麩醯胺酸。
如本文所討論，抗體或免疫球蛋白分子之胺基酸序列的微小變異被預期由本發明所涵蓋，惟胺基酸序列變異維持至少75%、更佳地至少80%、90%、95%，且最佳地99%。特別是，預期保留性胺基酸取代。保留性取代為發生在其側鏈相關的胺基酸家族中者。遺傳編碼胺基酸一般分成幾族：(1)酸性胺基酸為天冬胺酸、麩胺酸；(2)鹼性胺基酸為離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性胺基酸為丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、及(4)不帶電極性胺基酸為甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。親水性胺基酸包括精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸。疏水性胺基酸包括丙胺酸、半胱胺酸、異白胺 酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。胺基酸其他族包括(i)絲胺酸及蘇胺酸，其為脂肪族-羥家族；(ii)天冬醯胺及麩醯胺酸，其為含醯胺家族；(iii)丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸，其為脂肪族家族；以及(iv)苯丙胺酸、色胺酸、及酪胺酸，其為芳香族家族。舉例而言，合理預期以異白胺酸或纈胺酸對白胺酸單離取代、以麩胺酸對天冬胺酸單離取代、以絲胺酸對蘇胺酸單離取代、或以結構相關之胺基酸類似取代胺基酸將不會對所得分子之結合或特性具有重大影響，特別是若取代不涉及框架位置中的胺基酸。胺基酸改變是否產生功能胜肽可由分析多胜肽衍生物的專一性活性來輕易測定。分析於本文中詳細描述。抗體或免疫球蛋白分子之片段或類似物可由發明所屬技術領域中具有通常知識者輕易地製備。較佳片段或類似物的胺基-與羧基-端發生在功能域邊界附近。結構域與功能域可由比對核苷酸及/或胺基酸序列資料與公開或私人序列資料庫來辨識。較佳地，使用電腦比較方法來辨識序列基序(motif)或預測之蛋白質構形域(發生在已知結構及/或功能的其他蛋白質)。辨識摺疊成已知三維結構的蛋白質序列的方法為已知者。Bowie et al.Science 253：164(1991)。因此，上述例子證實發明所屬技術領域中具有通常知識者可以辨識可用來定義依據本發明之結構域及功能域的序列基序(motif)及結構構形。
較佳的胺基酸取代為下述者：(1)降低對蛋白 分解的易感性、(2)降低對氧化的易感性、(3)改變對形成蛋白質複合物的結合親和性、(4)改變結合親和性、且(4)給予或修飾此類似物的物化或功能特性。類似物可包括除了天然發生之胜肽序列以外的序列的各種突變蛋白(mutein)。舉例而言，單一或多胺基酸取代(較佳地保留性胺基酸取代)可在天然發生之序列中進行(較佳地在形成分子間接觸之域(群)以外的多胜肽部分中)。保留性胺基酸取代不應實質上改變親代序列的結構特徵(例如：取代胺基酸不應意於打斷親代序列中發生的螺旋，或中斷特徵化親代序列之其他類型的二級結構)。所屬領域認可的多胜肽二級與三級結構之例子述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Proteins Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；以及Thornton et at.Nature 354：105(1991)。
本文所用之術語“多胜肽片段”係指具有胺基端及/或羧基-端刪除，但其中剩餘胺基酸序列與，例如，從全長cDNA序列推導之天然發生之序列的對應位置相同的多胜肽。片段典型地為至少5、6、8或10胺基酸長，較佳地至少14胺基酸長，更佳地至少20胺基酸長，通常至少50胺基酸長，且甚至更佳地至少70胺基酸長。本文所用之術語“類似物”係指多胜肽，包括至少25胺基酸節段，其與推導之胺基酸序列部分具有實質上相同處且在適 當的結合條件下具有專一性結合至HER2。典型地，多胜肽類似物相對於天然發生之序列包括保留性胺基酸取代(或加入或刪除)。類似物典型地為至少20胺基酸長、較佳地至少50胺基酸長或更長、且可通常與全長天然發生之多胜肽一樣長。
胜肽類似物通常用於醫藥產業作為具有類似於模板胜肽特性之非胜肽藥物。這些類型的非胜肽化合物稱為“胜肽模擬物”或“擬肽物”。Fauchere,J.Adv.Drug Res.15：29(1986)、Veber and Freidinger TINS p.392(1985)；以及Evans et al.J.Med.Chem.30：1229(1987)。此化合物通常在電腦分子模擬協助下發展。結構上類似於治療有用之胜肽的胜肽模擬物可用以產生相等之治療或預防效果。一般而言，擬肽物為結構上類似典範多胜肽(即具有生化特性或藥理活性之多胜肽)，諸如人抗體，但以發明所屬技術領域中廣知的方法，具有任意地經選自下列所組成群組之鍵聯取代的一或多胜肽鍵聯：--CH2NH--、--CH2S-、--CH2-CH2--、--CH=CH--(cis and trans)、--COCH2--、CH(OH)CH2--、及-CH2SO--。以相同類型之D-胺基酸有系統地取代共通序列的一或多胺基酸(例如：D-離胺酸取代L-離胺酸)可用以產生更安定的胜肽。此外，包括共通序列或實質上相同共通序列變異的約束胜肽(constrained peptide)可由發明所屬技術領域中已知的方法產生(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992))；例如，藉由加入能夠形成環化胜肽的分子內雙硫 鍵(disulfide bridge)之內半胱胺酸殘基。
術語“劑”用於本文表示化學化合物、化學化合物之混合物、生物巨分子或從生物材料所製之萃取物。
如本文所用，術語“標籤”或“經標記之”係指併入可偵測標幟物，例如：併入放射性經標記之胺基酸或連結到生物素部分之多胜肽(可被經標幟之抗生物素蛋白(例如：含有螢光標幟物或酵素活性之鏈霉親和素(streptavidin)，可由光學方法或量熱方法偵測)所偵測)。在某些情況下，標籤或標幟物亦可經處理。標記多胜肽群及醣蛋白的各種方法為發明所屬技術領域中所知且可使用。多胜肽群之標籤例子包括但不限於下述：放射性同位素或放射性核素(例如：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光標籤(例如：FITC、玫瑰紅、鑭族元素磷光體)、酵素標籤(例如：山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、對-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光、生物素基團、第二報告子(例如：白胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合位置、金屬結合域、表位標誌)辨認的預定多胜肽表位。在某些實施態樣中，標籤由各種長度的間隔子臂連結以降低潛在空間位阻。本文所用之術語“醫藥劑或藥物”係指當適當地投予到患者時能夠誘導所欲治療效果之化學化合物或組成物。
本文所使用的其他化學術語係根據發明所屬技術領域中習知用法，如下述所例示The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.,Ed.,McGraw- Hill,San Francisco(1985))。
如本文所用，“實質上純”意指一目標種類為主要存在的種類(即在一莫耳基礎上，其比組成物中任何其他個別種類為更大量)，且較佳地，實質上純化的片段為其中目標種類佔所有存在巨分子種類的至少約50%(在一莫耳基礎上)之組成物。
一般而言，實質上純組成物將佔所有存在於組成物的巨分子種類之超過約80%，更佳地超過約85%、90%、95%、及99%。最佳地，目標種類經純化到基本上同質(污染種類在組成物中無法以習知偵測方法偵測)，其中組成物主要由單一巨分子種類組成。
除非本文另行指出或文中清楚否定，否則冠詞“一(a)、(an)”及“該(the)”在下述文中及申請專利範圍中的使用被解釋為涵蓋單數與複數兩者。除非另行指出，否則術語“包括”、“具有”、“化學式所示”中為“所示”、“包含”、及“含有”被解釋為開放性用語(即代表“包含但不限於”)。舉例而言，某一式中的聚合物支架包括所有式中所示之單體單元且可包括未於式中所示的額外的單體單元。此外，不管何時“包括”或另一開放式用語用於實施態樣中，其理解為使用中間用語“主要由...組成”或封閉式用語“由...組成”的相同實施態樣可為申請專利範圍較窄者。
術語“約”、“大約地”或“大約”當與數值連接使用時，意指包括數值集或數值範圍。舉例而言，“約X”包括為X的±20%、±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、 ±0.2%、或±0.1%之數值範圍，其中X為數值。於一實施態樣中，術語“約”係指比指定值多或少5%之數值範圍。於另一實施態樣中，術語“約”係指比指定值多或少2%之數值範圍。於另一實施態樣中，術語“約”係指比指定值多或少1%之數值範圍。
除非本文另行指出，數值範圍的主張僅意於做為個別指各單獨值落入範圍的速記方法，且各單獨值如同其個別主張於本文中般併入說明書中。本文所用之範圍，除非指定，包括範圍的二端值。舉例而言，表述“x為介於1及6的整數”及“x為1至6的整數”兩者意指“x為1、2、3、4、5、或6”，即術語“介於X及Y”及“X至Y的範圍，包括X及Y與介於期間的整數。
除非本文另行指出或者文中清楚地否定，否則本文所描述之所有方法可以任何適當的順序進行。本文所提供的任一及所有例子、或例示性語言(例如：“諸如”)的使用僅意於較佳地說明發明且不欲被解釋為對申請專利範圍範疇的限制，除非有明白地主張。說明書中無一語言欲被解釋成表示任一非主張的元件對所主張者為必需的。
“蛋白質為主之辨認分子”或“PBRM”係指辨識且結合至細胞表面標幟物或受體(諸如跨膜蛋白質、表面固定之蛋白質、或蛋白多醣(protoglycan))之分子。PBRM的例子包括但不限於本文所描述之XMT 1517抗體、XMT 1518抗體、XMT 1519抗體及XMT 1520抗體，以及其他抗體(例如：曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗 (cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、依帕珠單抗(Epratuzumab)、維托珠單抗(Veltuzumab)、拉貝珠單抗(Labetuzumab)、B7-H4、B7-H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c-Met、MUC-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD-L1及抗-5T4)、及本文所描述之抗體或其抗原結合片段)或胜肽(LHRH受體標的之胜肽、EC-1胜肽)、脂質運載蛋白(lipocalin)，諸如，例如，抗運載蛋白(anticalin)、蛋白質諸如，例如，干擾素、淋巴因子、生長因子、群落刺激因子等、胜肽或胜肽模擬物等。蛋白質為主之辨認分子(除了標靶經修飾之聚合物共軛物至特定細胞、組織或位置)亦可具有某些治療效果諸如：對目標細胞或途徑有抗增殖(抑制細胞生長及/或細胞毒性)活性。蛋白質為主之辨認分子包括或可設計成包括至少一化學反應性基團，諸如-COOH、一級胺、二級胺-NHR、-SH、或化學反應性胺基酸部分或側鏈諸如，例如，酪胺酸、組胺酸、半胱胺酸，或離胺酸。
本文所用之“生物相容性(Biocompatibe)”意於描述在接觸體液或活細胞或組織時，發揮最低摧毀或宿主反應效果之化合物。因此，本文所用之生物相容性基團係指脂肪族、環烷基、雜脂肪族、雜環烷基、芳基、或雜芳基部分，其落入術語生物相容性之定義，如同上述及本文定義者。如本文所用之術語“生物相容性 (Biocompatibility)”亦採用為代表化合物與辨認蛋白質，例如：天然發生抗體、細胞蛋白質、細胞及生物系統的其他成分呈現最低交互作用，除非此交互作用為特定所欲者。因此，特定地意於造成上述最低交互作用的物質及官能基，例如：藥物及前藥，被視為生物相容性。較佳地(例外為意於為細胞毒性之化合物，諸如例如：抗腫瘤劑)，若其加至活體外正常細胞(濃度類似於預期之全身活體內濃度)，在等同於化合物活體內半衰期(例如：活體內投予之化合物的50%被消除/清除所需的那段時間)的時間期間造成少於或等於1%細胞死亡，且其投予活體內誘導最低且醫學上可接受之發炎、外來體反應、免疫毒性、化學毒性及/或其他此等不良效果，則化合物為“生物相容性”。在上述句子中，術語“正常細胞”係指不意於被所測試的化合物摧毀或者顯著地影響之細胞。
“生物可降解”：如本文所用，“生物可降解”聚合物為易受活體內生物處理影響之聚合物。如本文所用，“生物可降解”化合物或部分為下述者，當被細胞攝入時，可被溶體或其他化學方法或者藉由水解成細胞可再使用或去除而對細胞沒有顯著毒性影響的成分而分解。如本文所用之術語“生物可裂解”具有“生物可降解”之相同意義。降解片段較佳地誘導少或無器官或細胞負擔過重或因此負擔過重造成的病理過程或其他活體內不良影響。生物降解過程的例子包括酵素及非酵素水解、氧化及還原。對於本文所描述之生物可降解蛋白質-聚合物-藥物共軛物(或 其成分，例如：生物可降解之適當條件聚合性載體及介於載體與抗體或藥物分子的連接子)的非酵素水解之適當條件，例如，包含在溶體胞內間隔的溫度及pH下暴露生物可降解共軛物於水中。一些蛋白質-聚合物-藥物共軛物(或其成分，例如：生物可降解聚合性載體及介於載體與抗體或藥物分子之連接子)的生物降解亦可胞外增強，例如：在動物體的低pH區，例如：發炎區域，在活化之巨噬細胞的接近周圍地區或其他細胞釋出降解協助因子。在某些較佳實施態樣中，聚合物載體在pH~7.5的有效尺寸在1至7天間不會可偵測地改變，且維持在原聚合物尺寸的50%內達至少數週。另一方面，在pH~5，聚合物載體較佳地在1至5天間可偵測地降解，且在2週到數月的時間範圍內完全轉形為低分子量片段。在此測試中聚合物完整性可由例如，粒徑篩析HPLC測量。雖然較快的降解在某些情況下可為較佳，但一般而言，聚合物在細胞中降解的速率不會超過細胞代謝或排出聚合物片段的速率可為較所欲。在較佳的實施態樣中，聚合物及聚合物生物降解副產物為生物相容性。
本文所用之“馬來醯亞胺基阻擋化合物”：係指可與馬來醯亞胺反應將其轉換成琥珀醯亞胺的化合物且“馬來醯亞胺基阻擋部分”係指當轉換時連結到琥珀醯亞胺的化學部分。在某些實施態樣中，馬來醯亞胺基阻擋化合物為具有與馬來醯亞胺反應之末端硫醇基團的化合物。於一實施態樣中，馬來醯亞胺基阻擋化合物為半胱胺酸、N- 乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸甲基酯、N-甲基半胱胺酸、2-巰基乙醇、3-巰基丙酸、2-巰基乙酸、巰基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇，其中苯基經一或多親水性取代基取代、或3-胺基丙烷-1-硫醇。
“親水性”：術語“親水性”為其與例如：聚合物單體單元上或在馬來醯亞胺基阻擋部分上之取代基關聯使它們為親水性或水可溶性，不會基本上不同於發明所屬技術領域中此用語的通常意義，且表示包含可離子化、極性、或可極化原子之化學部分，或否則可由水分子溶劑化(solvated)之化學部分。因此，本文所用之親水性基團係指脂肪族、環烷基、雜脂肪族、雜環烷基、芳基或雜芳基部分，其落入如上所定義的術語親水性的定義。適當的特定親水性有機部分的例子包含但不限於包括介於約1與12個原子範圍的原子鏈之脂肪族或雜脂肪族基團、羥基、羥烷基、胺、羧基、醯胺、羧酸酯、硫酯、醛、硝醯(nitryl)、異硝醯(isonitryl)、亞硝基、羥基胺、巰基烷基、雜環、胺甲酸酯、羧酸及其鹽、磺酸及其鹽、磺酸酯、磷酸及其鹽、磷酸酯、聚二醇醚、多胺、聚羧酸酯、聚酯及聚硫酯。在某些實施態樣中，親水性取代基包括羧基基團(COOH)、醛基團(CHO)、酮基團(COC1-4烷基)、羥甲基(CH2OH)或二醇(例如，CHOH-CH2OH或CH-(CH2OH)2)、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等。
術語“親水性”當其與本文所揭露之聚合物關聯時一般不會不同於發明所屬技術領域中此術語的使用， 且表示包括如上所定義之親水性官能基的聚合物。在一較佳實施態樣中，親水性聚合物為水溶性聚合物。聚合物的親水性可通過測定水合能來直接測量、或通過介於二水相的調查測定、或藉由具已知疏水性，諸如，例如，C4或C18的固相上層析術。
“聚合性載體”：本文所用之術語聚合性載體係指聚合物或經修飾之聚合物，其為適於共價連接到或可共價連結到一或多個藥物分子(具有指定連接子及/或具指定連接子的一或多PBRM。
“生理條件”：用語“生理條件”，如本文所用，係關於活體組織胞外流體中可能遇到的化學(例如：pH、離子強度)及生化(例如：酵素濃度)條件範圍。對大部分正常組織而言，生理pH範圍為約7.0至7.4。循環血漿及正常間質性流體表示典型正常生理條件的例子。
“藥物”：如本文所用，術語“藥物”係指為生物活性之化合物且係在投予到有需要的個體(例如：活性醫藥成分)之後提供所欲生理效果。
“細胞毒性”：如本文所用，術語“細胞毒性”意指對細胞或對所選之細胞群(例如：癌症細胞)有毒性。毒性效果可造成細胞死亡及/或溶解。在某些例子中，毒性效果可為對細胞亞致死量破壞效果，例如：減緩或阻止細胞生長。為了達到細胞毒性效果，藥物或前藥可為選自下列所組成群組：DNA損壞劑、微管破壞劑，或細胞毒性蛋白質或多胜肽、諸如此類。
“抑制細胞生長”：如本文所用，術語“抑制細胞生長”係指抑制或停止細胞生長及/或繁殖的藥物或其他化合物。
“小分子”：如本文所用，術語“小分子”係指具有相當低分子量的分子(不管天然發生或人工創造(例如：經由化學合成)。較佳的小分子為生物活性，於此其在動物(較佳地哺乳動物、更佳地人類)中產生局部或全身效果。在某些較佳實施態樣中，小分子為藥物且小分子被指為“藥物分子”或“藥物”或“治療劑”。在某些實施態樣中，藥物分子具有低於或等於至約5kDa之MW。在其他實施態樣中，藥物分子具有低於或等於約1.5kDa的MW。在實施態樣中，藥物分子係選自長春花生物鹼、奧瑞他汀(auristatin)、多卡米星(duocarmycin)、微管溶素、非天然喜樹鹼(camptothecin)化合物、拓樸異構酶抑制劑、DNA結合藥物、激酶抑制劑、MEK抑制劑、KSP抑制劑、卡奇黴素(calicheamicin)、SN38、吡咯并苯并二氮雜環庚烯基、及其類似物。較佳地，雖非必要，藥物為已由適當政府機構或個體例如：FDA認為安全且使用有效者。舉例而言，21 C.F.R.§§ 330.5、331到361，及440到460下FDA所列之人使用藥物；21 C.F.R.§§ 500到589下FDA所列之獸用藥物，以引用方式併入本文，全被認為適於與本親水性聚合物使用。
本文所用之“藥物衍生物”或“經修飾之藥物”等係指包括意於由本文所揭露之共軛物遞送之藥物分子與能 夠連結藥物分子到聚合性載體之官能基的化合物。
本文所用之“活性形式”係指呈現所欲活體內或活體外醫藥功效之化合物形式。特別是，當意於由本文所揭露之共軛物遞送之藥物分子從共軛物釋出時，活性形式可為藥物本身或其衍生物，其呈現所欲治療性質。藥物從共軛物釋出可由裂解連接子(連結藥物到聚合性載體)的生物可降解鍵來達成。因此活性藥物衍生物可包括連接子的一部分。
“PHF”係指聚(1-羥基甲基伸乙基羥基甲基-甲醛)。
如本文所用，術語“聚合物單元”、“單體單元”、“單體”、“單體單元”、“單元”全指聚合物中可重複的結構單元。
如本文所用，聚合物或聚合性載體/支架或聚合物共軛物之“分子量”或“MW”係指未經修飾之聚合物的重量平均分子量，除非另行指明。
本發明為意於包括發生在本化合物的原子之所有同位素。同位素包括具有相同原子數但不同質量數的該些原子。藉由一般例子且不為限制，氫的同位素包括氚及氘。碳的同位素包括C-13及C-14。
本發明為意於包括化合物的所有異構物，其係指且包含，光學異構物、及互變異構物，其中光學異構物包括鏡像異構物及非鏡像異構物、掌性異構物及非掌性異構物，且光學異構物包括經單離之光學異構物以及光學 異構物的混合物，包括消旋及非消旋混合物；其中異構物可呈經單離之形式或與一或多其他異構物呈混合物。
HER2抗體
本文所揭露的單株抗體具有能力抑制HER2-媒介之PI3K-Akt途徑活性。
例示性本文所揭露的抗體包含，例如，XMT 1517抗體、XMT 1518抗體、XMT 1519抗體、及XMT 1520抗體。這些抗體顯示對人HER2之專一性且其已顯示抑制HER2活體外之功能活性。
本文所描述之HER2單株抗體各者包含重鏈(HC)、重鏈可變區(VH)、輕鏈(LC)、及輕鏈可變區(VL)，如下列呈現之胺基酸及對應之核酸序列中所示者。各抗體之可變重鏈區及可變輕鏈區在下列胺基酸序列中被劃陰影。重鏈及輕鏈之互補性決定區(CDR)在下列呈現的胺基酸序列中加底線。涵蓋互補性決定區(CDR)之胺基酸如同E.A.Kabat et al.(見Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Protein of immunological interest,Fifth Edition,US Department of Health and Human Services,US Government Printing Office(1991))所定義者。
>XMT 1517重鏈胺基酸序列(重鏈可變區(SEQ ID NO：9)+IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：32))
Figure 104119613-A0202-12-0087-83
Figure 104119613-A0202-12-0087-84
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>XMT 1517重鏈可變區核酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0087-88
Figure 104119613-A0202-12-0087-89
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>XMT 1517輕鏈胺基酸序列(輕鏈可變區(SEQ ID NO：10)+輕鏈恆定區(SEQ ID NO：33))
Figure 104119613-A0202-12-0087-90
Figure 104119613-A0202-12-0087-91
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Figure 104119613-A0202-12-0087-92
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>XMT 1517輕鏈可變區核酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0088-105
Figure 104119613-A0202-12-0088-106
(SEQ ID NO：35)
>XMT 1518重鏈胺基酸序列(重鏈可變區(SEQ ID NO：11)+IgG1重鏈恆定(SEQ ID NO：32))
Figure 104119613-A0202-12-0088-100
Figure 104119613-A0202-12-0088-101
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>XMT 1518輕鏈胺基酸序列(輕鏈可變區(SEQ ID NO：12)+輕鏈恆定(SEQ ID NO：33))
Figure 104119613-A0202-12-0088-95
Figure 104119613-A0202-12-0088-96
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>XMT 1519重鏈胺基酸序列(重鏈可變區(SEQ ID NO：13) +IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：32))
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>XMT 1519重鏈可變區核酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0089-111
Figure 104119613-A0202-12-0089-118
(SEQ ID NO：36)
>XMT 1519輕鏈胺基酸序列(輕鏈可變區(SEQ ID NO：14)+輕鏈恆定區(SEQ ID NO：33))
Figure 104119613-A0202-12-0089-112
Figure 104119613-A0202-12-0089-113
(SEQ ID NO：6)
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Figure 104119613-A0202-12-0089-114
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(SEQ ID NO：21)
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Figure 104119613-A0202-12-0089-116
(SEQ ID NO：29)
>XMT 1519輕鏈可變區核酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0090-129
Figure 104119613-A0202-12-0090-130
(SEQ ID NO：37)
>XMT 1520重鏈胺基酸序列(重鏈可變區(SEQ ID NO：15)+IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：32))
Figure 104119613-A0202-12-0090-125
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Figure 104119613-A0202-12-0090-126
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Figure 104119613-A0202-12-0090-127
(SEQ ID NO：31)
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Figure 104119613-A0202-12-0090-128
(SEQ ID NO：27)
>XMT 1520輕鏈胺基酸序列(輕鏈可變區(SEQ ID NO：16)+輕鏈恆定區(SEQ ID NO：33))
Figure 104119613-A0202-12-0090-119
Figure 104119613-A0202-12-0090-122
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(SEQ ID NO：28)
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Figure 104119613-A0202-12-0090-123
(SEQ ID NO：21)
CDRL3：
Figure 104119613-A0202-12-0090-124
(SEQ ID NO：29)
同樣包含在本發明者為與本文所描述之抗體 及其抗原結合片段結合至相同表位或交互競爭結合到相同表位的抗體及其抗原結合片段。舉例而言，本文所揭露之抗體與抗原結合片段專一性結合至HER2，其中抗體或片段結合至包括人HER2上一或多胺基酸殘基的表位(例如：GenBank登錄號P04626.1)。
本文所揭露之抗體及其抗原結合片段專一性結合至全長人HER2受體之表位，其包括胺基酸序列：
Figure 104119613-A0202-12-0091-131
Figure 104119613-A0202-12-0092-132
Figure 104119613-A0202-12-0092-135
(SEQ ID NO：38)
本文所揭露之抗體及其抗原結合片段專一性結合至人HER2受體胞外域(ECD)上之表位，其包括胺基酸序列：
Figure 104119613-A0202-12-0092-133
Figure 104119613-A0202-12-0092-134
(SEQ ID NO：39)
若單株抗體具有與本文所揭露的單株抗體(例如：XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519、及XMT 1520)相同的專一性，發明所屬技術領域中具有通常知識者將認可藉由確定是否前者避免後者結合至天然結合搭擋或其他已知與HER2相關之分子而可能測定而不需過度實驗。若測試的單株抗體競爭本文所揭露的單株抗體，以降低本文所揭露的單株抗體之結合顯示，之後二單株抗體結合至相同、或極度相關之表位。
測定單株抗體是否具有本文所揭露的單株抗 體之專一性的替代方法為預培養本文所揭露的單株抗體與可溶性HER2(其為正常反應)，之後加入所測試的單株抗體以測定所測試的單株抗體是否在結合HER2的能力上受到抑制。若所測試之單株抗體受到抑制，則在所有可能性，其具有相同、或功能上等同本文所揭露的單株抗體之表位專一性。
本文所揭露的單株抗體的篩選亦可由例如：藉由測量HER2-媒介之PI3K-Akt途徑活性，且測定是否測試單株抗體能夠調節、阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾PI3K-Akt途徑活性來進行。
HER2抗體之產生，例如，使用本文提供之實施例所述的方法。或者或此外，可使用發明所屬技術領域中已知的各種程序產生針對HER2，或針對其衍生物、片段、類似物、同源物或異種同源物的單株抗體。(見，例如，Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，以引用方式併入本文)。全人抗體為抗體分子其中輕鏈及重鏈兩者的整個序列(包括CDR)源自人基因。此抗體在本文被命為“人抗體”或“全人抗體”。製備人單株抗體，例如，使用以下提供之實施例中所述的程序。人單株抗體亦可使用三元融合瘤(trioma)技術；人B-細胞融合瘤技術(見Kozbor,et al.,1983 Immunol Today 4：72)；以及EBV融合瘤技術產生人單株抗體(見Cole,et al.,1985 In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)來製備。可運用且可使用人融合瘤(見Cote,et al.,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80：2026-2030)或以艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus)活體外轉形人B-細胞(見Cole,et al.,1985 In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)產生人單株抗體。
以廣知技術純化抗體，諸如：使用蛋白質A或蛋白質G之親和性層析術，其主要提供免疫血清的IgG片段。接著，或或者，免疫球蛋白尋找之標靶的特定抗原，或其表位，可被固定於管柱上來藉由免疫親和性層析術純化免疫專一性抗體。免疫球蛋白之純化討論於，例如，D.Wilkinson(The Scientist，由The Scientist,Inc.，公開Philadelphia PA,Vol.14,No.8(April 17,2000),pp.25-28)。
例如：藉由以膜結合及/或可溶性HER2諸如，例如，鼠科、大鼠或人HER2或其免疫原性片段、衍生物或變體來免疫動物而產生調節、阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾HER2媒介之PI3K-Akt途徑活性單株抗體。或者，以經含有編碼HER2之核酸分子之載體轉染的細胞來免疫動物，使得表現且與經轉染之細胞的表面相連的HER2。或者，藉由篩選含有結合至HER2的抗體或抗原結合域序列之庫獲得抗體。此庫的製備為例如：在噬菌體中作為到噬菌體外殼蛋白質之蛋白質或胜肽融合物，其表現在組合之噬菌體粒子表面且編碼之DNA序列 含在噬菌體粒子(即“噬菌體展示庫”)。之後篩選源自骨髓瘤/B細胞融合之融合瘤找對HER2有反應性。此外，抗體在酵母菌抗體展示庫及酵母菌庫顯示系統選擇，且任意地經優化，同描述於例如：Blaise L,Wehnert A,Steukers MP,van den Beucken T,Hoogenboom HR,Hufton SE.Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating：application to the affinity maturation of Fab antibody fragments.Gene.2004 Nov 24；342(2)：211-8；Boder ET,Wittrup KD.Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries.Nat Biotechnol.1997 Jun；15(6)：553-7；Kuroda K,Ueda M.Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology.Biotechnol Lett.2011 Jan；33(1)：1-9.doi：10.1007/s10529-010-0403-9.Review；Lauer TM,Agrawal NJ,Chennamsetty N,Egodage K,Helk B,Trout BL.Developability index：a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity.J Pharm Sci.2012 Jan；101(1)：102-15；Orcutt K.D.and Wittrup K.D.(2010),207-233 doi：10.1007/978-3-642-01144-3_15；Rakestraw JA,Aird D,Aha PM,Baynes BM,Lipovsek D.Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins.Protein Eng Des Sel.2011 Jun；24(6)：525-30；US 8,258,082；US 6,300,064；US 6,696,248；US 6,165,718；US 6,500,644；US 6,291,158； US 6,291,159；US 6,096,551；US 6,368,805；US 6,500,644。例示性酵母菌庫顯示系統述於例如：WO2008118476；WO2009/036379；WO2010105256；以及WO2012009568。在某些實施態樣中，指定各酵母菌抗體展示庫或酵母菌庫顯示系統模擬或反映人免疫前抗體譜(repertoire)之多樣性特徵。在某些實施態樣中，此酵母菌抗體展示庫多樣性或酵母菌庫顯示系統多樣性為在矽片產生。在某些實施態樣中，此酵母菌抗體展示庫或酵母菌庫顯示系統包括酵母菌屬(Saccharomyces)酵母菌細胞，諸如：啤酒酵母菌(Saccharomyces Cerevisiae)細胞。在某些實施態樣中，此酵母菌抗體展示庫或酵母菌庫顯示系統包括畢赤酵母菌屬(Pichia)細胞。
例如，使用融合瘤方法諸如：由Kohler and Milstein,Nature,256：495(1975)所述者製備單株抗體。在融合瘤方法中，小鼠、倉鼠、或其他適當的宿主動物典型以免疫劑免疫以誘發產生或能夠產生將專一性結合至免疫劑的抗體之淋巴球。或者，淋巴球可在活體外免疫。
免疫劑會典型包括蛋白質抗原、其片段或其融合蛋白。一般而言，若想要人來源的細胞，使用周邊血淋巴球，或想要非人哺乳動物來源，使用脾細胞或淋巴結細胞。使用適當融合劑諸如：聚乙二醇之後將淋巴球與永生之細胞株融合，來形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,(1986)pp.59-103)。永生之細胞株通常為轉形之哺乳動物 細胞，特別是囓齒類、牛及人來源的骨髓瘤細胞。通常，運用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。可在適當培養基(較佳地包含抑制未融合、永生之細胞的生長或存活的一或多種物質)中培養融合瘤細胞。舉例而言，若親代細胞缺乏酵素次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(phosphoribosyl transferase)(HGPRT或HPRT)，則針對融合瘤的培養基典型地將包括次黃嘌呤、胺喋呤、及胸腺核苷(“HAT介質”)，其物質避免HGPRT-缺陷之細胞生長。
較佳的永生之細胞株為有效融合、支持所選擇抗體-生產細胞的抗體穩定高量表現、且對介質諸如：HAT介質敏感者。更佳永生之細胞株為鼠科骨髓瘤株，其可例如從Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California and the American Type Culture Collection,Manassas,Virginia獲得。人骨髓瘤及小鼠-人雜骨髓瘤細胞株亦已被述於產生單株抗體。(見Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)pp.51-63))。
對於針對抗原的單株抗體存在，之後可分析其中培養融合瘤細胞的培養基。較佳地，融合瘤細胞所產生之單株抗體的結合專一性由免疫沉澱法或由活體外結合分析，諸如：放射性免疫分析(RIA)或酵素連結免疫吸附分析(ELISA)測定。此技術及分析為發明所屬技術領域中所知。單株抗體的結合親和性可由，例如，Scatchard analysis of Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107：220(1980)測定。再者，在單株抗體之治療應用，對於辨識具有高度專一性及對標靶抗原有高結合親和性之抗體為重要的。
在辨識所欲融合瘤細胞之後，可藉由有限的稀釋程序次選殖選殖株且由標準方法生長。(見Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,(1986)pp.59-103)。針對此目的的適當培養基包含，例如，Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium及RPMI-1640介質。或者，可如同哺乳動物中的腹水在活體內生長融合瘤細胞。
次選殖株分泌的單株抗體可從培養基或腹水流體以習知的免疫球蛋白純化程序諸如，例如，蛋白質A-Sepharose、羥磷石灰層析術、膠體電泳、透析、或親和性層析術來單離或純化。
亦可由重組DNA方法製造單株抗體，諸如：述於U.S.專利號4,816,567者。編碼本文所揭露的單株抗體之DNA可使用習知程序而輕易地單離並定序(例如：由使用能夠專一性結合到編碼鼠科抗體之重及輕鏈的基因之寡核苷酸探針)。本文所揭露之融合瘤細胞作為此等DNA的較佳的來源。一旦經單離，DNA可放到表現載體，其之後轉染到不會產生免疫球蛋白蛋白質之宿主細胞諸如：猴(simian)COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單株抗體合成。DNA 亦可經修飾，例如，藉由人重鏈重及輕鏈恆定域之編碼序列取代同源鼠科序列(見U.S.專利號4,816,567；Morrison,Nature 368,812-13(1994))或藉由共價連接全部或部分之非免疫球蛋白多胜肽編碼序列到免疫球蛋白編碼序列。此非免疫球蛋白多胜肽可取代本文所揭露的抗體的恆定域，或可取代本文所揭露的抗體一抗原-結合位置的可變域以創造嵌合二價抗體。
本文所揭露的單株抗體包括全人抗體或人化抗體。這些抗體適於投予到人而不會產生因人對抗所投予的免疫球蛋白而有的免疫反應。
產生人化或全人HER2抗體，例如，使用下述提供的實施例所述之程序。
在另外、替代的方法中，發展HER2抗體，例如，使用噬菌體-展示方法，使用包含僅人序列的抗體。此方法為發明所屬技術領域中所廣知，例如：在WO92/01047及U.S.專利號6,521,404，其以引用方式併入本文。在此方法中，帶有輕及重鏈隨機對的噬菌體組合庫使用天然或重組來源的HER2或其片段篩選。在另一方法中，HER2抗體可由其中方法的至少一步驟包含以人HER2蛋白質免疫轉基因、非人動物的方法產生。在此方法中，異種非人動物的一些內源性重及/或卡帕輕鏈基因座已失能且不能重排(產生編碼回應抗原之免疫球蛋白的基因所需者)。此外，至少一人重鏈基因座及至少一人輕鏈基因座已被穩定地轉染到動物。因此，回應所投予的抗 原，人基因座重排以提供編碼對抗原免疫專一之人可變區的基因。因此免疫時，基因轉殖鼠(xenomouse)產生分泌全人免疫球蛋白之B-細胞。
生產異種非人動物許多技術為發明所屬技術領域中所廣知。舉例而言，見U.S.專利號6,075,181及6,150,584，其整體以引用方式併入本文。此一般策略已經證實與產生1994年公開之第一基因轉殖鼠(xenomouse)TM品系有關。見Green et al.Nature Genetics 7：13-21(1994)，其整體以引用方式併入本文。亦見U.S.專利號6,162,963、6,150,584、6、114,598、6,075,181、及5,939,598與日本專利號3 068 180 B2、3 068 506 B2、及3 068 507 B2與歐洲專利號EP 0 463 151 B1和國際專利申請號WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310與相關家族成員。
在一替代方法中，其他運用“微基因座(minilocus)”方法，其中通過包括來自Ig基因座的片段(個別基因)模仿外源性Ig基因座。因此，形成一或多VH基因、一或多個DH基因、一或多JH基因、μ恆定區、及第二恆定區(較佳地γ恆定區)到用於插入至動物中的構築體。見例如：U.S.專利號5,545,806；5,545,807；5,591,669；5,612,205；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,643,763；5,661,016；5,721,367；5,770,429；5,789,215；5,789,650；5,814,318；5,877；397；5,874,299；6,023,010；以及6,255,458；以及歐洲專 利號0 546 073 B1；以及國際專利申請號WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852、及WO 98/24884與相關家族成員。
其中通過微細胞融合、大片段染色體、或整個染色體從小鼠產生人抗體已被介紹、亦被驗證。見歐洲專利申請號773 288及843 961。
人抗-小鼠抗體(HAMA)反應導致產業製備嵌合或者人化抗體。當嵌合抗體具有人恆定區域及免疫可變區時，預期將觀察到某些人抗-嵌合抗體(HACA)反應，特別是在長期或多劑量運用抗體時。因此，期望提供對抗HER2的全人抗體以無效或者減輕HAMA或HACA反應的關係及/或效果。
產生具降低之免疫原性的抗體亦透過使用適當庫的人化、嵌合化及展示技術完成。將了解鼠科抗體或其他品種之抗體可使用發明所屬技術領域中廣知的技術被人化或靈長類化。見例如：Winter and Harris Immunol Today 14：43 46(1993)及Wright et al.Crit,Reviews in Immunol.12125-168(1992)。有興趣的抗體可由重組DNA技術設計以對應人序列取代CH1、CH2、CH3、鉸鏈域及/或框架域(見WO 92102190及U.S.專利號5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,792；5,714,350；以及5,777,085)。同樣地，使用Ig cDNA於構築嵌合免疫球蛋白基因為發明所屬技術領域中已知(Liu et al.P.N.A.S. 84：3439(1987)及J.Immunol.139：3521(1987))。mRNA從融合瘤或其他生產抗體的細胞單離且用於產生cDNA。有興趣的cDNA可由聚合酶鏈反應使用特定引子放大(U.S.專利號4,683,195及4,683,202)。或者，製造與篩選庫以單離有興趣的序列。編碼抗體可變區之DNA序列之後融合到人恆定區域序列。人恆定區基因序列可在Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of immunological Interest,N.I.H.公開號91-3242發現。人C區域基因可從已知選殖株輕易獲得。同型的選擇將由所欲之效應子功能(諸如：補體結合)，或對抗體-依賴性細胞性細胞毒性之活性所引導。較佳的同型為IgG1、IgG3及IgG4。可使用人輕鏈恆定區，卡帕(kappa)或拉姆達(lambda)任一。嵌合、人化抗體之後由習知方法表現。
抗體片段，諸如：Fv、F(ab’)2及Fab可由裂解完整蛋白質，例如：由蛋白酶或化學裂解製備。或者，設計截取基因。舉例而言，編碼F(ab’)2片段部分的嵌合基因會包括編碼H鏈之CH1域及鉸鏈區的DNA序列，接著為轉譯終止密碼子以產生截取分子。
H及L J區的共通序列可用以設計用作為引子的寡核苷酸來引入有用的限制位到J區以後續鍵聯V區節段到人C區節段。可由定點突變修飾C區cDNA來置入限制位在人序列的類似位置。
表現載體包括質體、反轉錄病毒、YAC、EBV衍生之游離基因體等。方便的載體為編碼功能完全的 人CH或CL免疫球蛋白序列者，具有適當的限制位設計使得任一VH或VL序列可容易地插入及表現。在此載體中，剪接通常發生在介於插入之J區域的剪接供位與在前的人C區域之剪接接受位，且亦在發生在人CH外顯子中之剪接區。多腺核苷酸化及轉錄終止發生在編碼區下游的天然染色體位置。所得之嵌合抗體可結合到任一強啟動子，包括反轉錄病毒LTR，例如：SV-40早期啟動子、(Okayama et al.Mol.Cell.Bio.3：280(1983))、勞斯肉瘤病毒LTR(Gorman et al.P.N.A.S.79：6777(1982))、及莫洛尼鼠科白血病病毒LTR(Grosschedl et al.Cell 41：885(1985))。同樣地，將了解，可使用天然Ig啟動子等。
再者，可透過展示型技術，包括但不限於噬菌體展示、反轉錄病毒展示、核糖體展示、及其他技術，使用發明所屬技術領域中廣知之技術產生人抗體或來自其他品種的抗體且將所得分子經額外的成熟，諸如：親和性成熟，此技術為發明所屬技術領域中廣知。Wright et al.Crit,Reviews in Immunol.12125-168(1992)、Hanes and Plückthun PNAS USA 94：4937-4942(1997)(核糖體展示)、Parmley and Smith Gene 73：305-318(1988)(噬菌體展示)，Scott,TIBS,vol.17：241-245(1992)、Cwirla et al.PNAS USA 87：6378-6382(1990)、Russel et al.Nucl.Acids Research 21：1081-1085(1993)、Hoganboom et al.Immunol.Reviews 130：43-68(1992)、Chiswell and McCafferty TIBTECH；10：80-8A(1992)、及U.S。專利號 5,733,743。若運用展示技術產生不為人的抗體，則此抗體如上所述可被人化。
使用這些技術，可產生抗體到HER2表現細胞、可溶性形式的HER2、其表位或胜肽、及其表現庫(見例如：U.S.專利號5,703,057)，其之後可如上所述經篩選本文所描述之活性。
本文所揭露的HER2抗體可由含有編碼上述之單鏈抗體的DNA節段的載體表現。
這些可包括載體、脂質體、裸DNA、佐劑輔助之DNA、基因槍、導管等。載體包括化學共軛物諸如：述於WO 93/64701，其具有標靶部分(例如：針對細胞性表面受體的配體)、及核酸結合部分(例如：多離胺酸)、病毒載體(例如：DNA或RNA病毒載體)、融合蛋白質諸如：述於PCT/US 95/02140(WO 95/22618)，其為含有標靶部分(例如：對目標細胞專一的抗體)的融合蛋白及核酸結合部分(例如：魚精蛋白)、質體、噬菌體等。載體可為染色體、非染色體或合成。
較佳的載體包括病毒載體、融合蛋白質及化學共軛物。反轉錄病毒載體包括莫洛尼鼠科白血病病毒。DNA病毒載體為較佳的。這些載體包括痘載體諸如：正痘或鳥類痘載體、皰疹病毒載體諸如：單純皰疹I病毒(HSV)載體(見Geller,A.I.et al.,J.Neurochem,64：487(1995)；Lim,F.,et al.,in DNA Cloning：Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.et al.,Proc Natl.Acad.Sci.：U.S.A.90：7603(1993)；Geller,A.I.,et al.,Proc Natl.Acad.Sci USA 87：1149(1990),Adenovirus Vectors(見LeGal LaSalle et al.,Science,259：988(1993)；Davidson,et al.,Nat.Genet 3：219(1993)；Yang,et al.,J.Virol.69：2004(1995)及Adeno-associated Virus Vectors(見Kaplitt,M.G.et al.,Nat.Genet.8：148(1994)。
痘病毒載體將基因導入至細胞細胞質。鳥類痘病毒載體造成核酸僅短期表現。腺病毒載體、腺相關病毒載體及單純皰疹病毒(HSV)載體對於導入核酸到神經細胞為較佳。腺病毒載體造成比腺相關病毒(約4個月)更短期表現(約2個月)，其因而比HSV載體短。特定載體的選擇視目標細胞及所處理的條件而定。導入可藉由標準技術例如：感染、轉染；轉導或轉形。基因轉移模式的例子包括例如：裸DNA、CaPO4沉澱、DEAE聚葡糖(dextran)、電穿孔、原生質體融合、脂質體轉染(lipofection)、細胞顯微注射、及病毒載體。
可使用載體基本上標靶任何所欲之目標細胞。舉例而言，可使用立體定位注射(stereotaxic injection)引導載體(例如：腺病毒、HSV)到所欲位置。此外，由側腦室(intracerebroventricular)(icv)灌注使用微量泵灌注系統(諸如：SynchroMed Infusion System)遞送粒子。依據大流量的方法，稱為對流，亦證實在遞送大分子到腦的擴張區域有效且可用於遞送載體到目標細胞。(見 Bobo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076-2080(1994)；Morrison et al.,Am.J.Physiol.266：292-305(1994))。其他可使用的方法包括導管、靜脈內、腸胃外、腹膜內及皮下注射、及口服或其他已知的投予途徑。
可使用這些載體表現可用在各種方法的大量抗體。舉例而言，偵測樣本中的HER2存在。亦可使用抗體來試著結合並中斷HER2-相關的訊號傳遞。
可採用技術產生專一於本文所揭露之抗原性蛋白質的單鏈抗體(見例如：U.S.專利號4,946,778)。此外，可採用方法構築Fab表現庫(見例如：Huse,et al.,1989 Science 246：1275-1281)以使得快速且有效地辨識單株Fab片段(帶有對蛋白質或其衍生物、片段、類似物或同源物所欲之專一性)。包含對蛋白質抗原之個體基因型(idiotype)的抗體片段可由發明所屬技術領域中已知的技術產生，包括但不限於：(i)由胃蛋白酶分解抗體分子產生之F(ab’)2片段；(ii)由降低F(ab’)2片段之二硫化物橋產生之Fab片段；(iii)以木瓜酶及還原劑處理抗體分子產生之Fab片段及(iv)Fv片段。
本發明亦包括Fv、Fab、Fab’及F(ab’)2抗-HER2片段或抗-HER2片段、單鏈抗-HER2抗體、多專一性抗體(其中至少一臂結合HER2)、及雜共軛抗-HER2抗體。
雙專一性抗體為對至少二不同抗原具有結合專一性之抗體。在此情況中，結合專一性之一為針對HER2。該第二結合目標為任何其他抗原，包括細胞表面 蛋白質或受體或受體次單元。
製造雙專一性抗體的方法為發明所屬技術領域中所知。傳統上，雙專一性抗體重組產生係基於二免疫球蛋白重鏈/輕鏈對共表現，其中二重鏈具有不同的專一性(Milstein and Cuello,Nature,305：537-539(1983))。由於免疫球蛋白重及輕鏈隨機分選，這些融合瘤(細胞雜交瘤(quadromas))產生10種不同抗體分子的可能混合物，其中僅有一者具有正確的雙專一性結構。正確分子的純化通常由親和性層析術步驟完成。類似程序揭露於WO 93/08829，1993年5月13日公開，及在Traunecker et al.,EMBO J.,10：3655-3659(1991)。
具有所欲結合專一性(抗體-抗原結合位置)的抗體可變域可融合到免疫球蛋白恆定域序列。融合較佳地與免疫球蛋白重鏈恆定域，其包括至少部分之鉸鏈CH2、及CH3區。較佳具有第一重鏈恆定區(CH1)，其包含存在於至少一融合中輕鏈結合所必需之位置。編碼免疫球蛋白重鏈融合及如需要的免疫球蛋白輕鏈之DNA插入到分開的表現載體，且共轉染到適當的宿主有機體。產生雙專一性抗體的進一步細節見，例如，Suresh et al.,Methods in Enzymology,121：210(1986)。
依據述於WO 96/27011的另一方法，介於一對抗體分子的介面可設計成最大化異二聚體(從重組細胞培養恢復)的百分比。較佳的介面包括至少一部分的抗體恆定域之CH3區域。在此方法中，來自第一抗體分子界 面的一或多小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如：酪胺酸或色胺酸)取代。創造對大側鏈(群)相同或類似尺寸的補償“腔”在該第二抗體分子的介面，藉由以較小者(例如：丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈。此係提供一種機制，相較其他不要的終端產物諸如：同型二聚體，增加異二聚體的產量。
可製備雙專一性抗體為全長抗體或抗體片段(例如：F(ab’)2雙專一性抗體)。從抗體片段產生雙專一性抗體的技術已述於文獻中。舉例而言，雙專一性抗體可使用化學鍵聯製備。Brennan et al.,Science 229：81(1985)描述其中完整抗體被蛋白水解裂解來產生F(ab’)2片段的程序。二硫醇(dithiol)錯合劑亞砷酸鈉存在下還原這些片段來穩定鄰近二硫醇(dithiol)且避免分子間二硫化物形成。產生的Fab’片段之後轉換成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。Fab’-TNB衍生物之一之後再轉變成Fab’-硫醇，藉由以巰基乙基胺還原且與等莫耳量之其他Fab’-TNB衍生物混合形成雙專一性抗體。產生之雙專一性抗體可用作為選擇性固定酵素的劑。
此外，Fab’片段可直接從大腸桿菌恢復且化學偶合來形成雙專一性抗體。Shalaby et al.,J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述產生全人化雙專一性抗體F(ab’)2分子。各Fab’片段分別從大腸桿菌分泌出來且經過活體外導向化學偶合來形成雙專一性抗體。因而形成的雙專一性抗體能夠結合至過度表現ErbB2受體之細胞及正常的人T 細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴球對人乳房腫瘤標的的溶解活性。
亦已描述直接從重組細胞培養製造及單離雙專一性抗體片段的各種技術。舉例而言，使用白胺酸拉鍊產生雙專一性抗體。Kostelny et al.,J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。來自Fos及Jun蛋白質之白胺酸拉鍊胜肽由基因融合連接到二不同抗體的Fab’部分。在鉸鏈區域還原抗體同型二聚體來形成單體，之後再氧化來形成抗體異二聚體。亦可使用此方法產生抗體同型二聚體。述於Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)之“雙體抗體(diabody)”技術已提供製造雙專一性抗體片段的替代機制。片段包含由連接子(太短而不能配對介於相同鏈上的二域)連接到輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)。因此，一片段的VH及VL域與另一片段的互補VL及VH域強迫配對，而形成二抗原結合位置。亦已報告使用單鏈Fv(sFv)二聚體製造雙專一性抗體片段的另一策略。見，Gruber et al.,J.Immunol.152：5368(1994)。
預期具有超過二價之抗體。舉例而言，可製備三專一性抗體。Tutt et al.,J.Immunol.147：60(1991)。
例示性雙專一性抗體可結合至二不同，其中至少一者源自本文所揭露之蛋白質抗原。或者，免疫球蛋白分子的抗-抗原性臂可與下述臂結合，該臂結合至白血球(諸如：T-細胞受體分子(例如：CD2、CD3、CD28、或 B7)上之觸發分子，或結合至對於IgG(FcγR)(諸如：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之Fc受體，以集中細胞性防禦機制到表現特定抗原的細胞。雙專一性抗體亦可用以引導細胞毒性劑到表現特定抗原的細胞。這些抗體處理抗原結合臂與結合細胞毒性劑或放射性核素螯合劑(諸如：EOTUBE、DPTA、DOTA、或TETA)之臂。另一有興趣之雙專一性抗體結合本文所描述之蛋白質抗原且進一步結合組織因子(TF)。
雜共軛抗體亦於本發明之範疇中。雜共軛抗體由二共價連接抗體構成。此抗體已，例如，提出標靶免疫系統細胞細胞到不要的細胞(見U.S.專利號4,676,980)，且用於處理HIV感染(見WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。預期抗體可使用合成蛋白質化學中已知方法活體外製備，包括涉及交聯劑者。舉例而言，可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵構築免疫毒素。對此目的適當試劑的例子包括亞胺基硫醇酯(iminothiolate)及甲基-4-巰基丁基醯亞胺酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及揭露於下述者，例如，U.S.專利號4,676,980。
可為期望的修飾本文揭露之抗體關於效應子功能，以增強例如：抗體在治療與異常HER2表現及/或活性相關之疾病與失調的效用。舉例而言，半胱胺酸殘基(群)可導入到Fc區域，因而使得鏈間二硫化物鍵形成在此區域。因而產生的同型二聚體性抗體具有改良之內化能力及/或增加之補體媒介的細胞毒殺及抗體依賴性細胞性 細胞毒性(ADCC)。(見Caron et al.,J.Exp Med.,176：1191-1195(1992)及Shopes,J.Immunol.,148：2918-2922(1992))。或者，抗體可設計成具有雙Fc區且可因而具有增強之補體溶解與ADCC能力。(見Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design,3：219-230(1989))。
HER2抗體共軛物：
本發明亦涉及免疫共軛物，其包括共軛到細胞毒性劑諸如：毒素(例如：細菌、真菌、植物、或動物來源之酵素活性毒素或其片段)，或放射性同位素(即放射共軛物)之抗體。
可使用的酵素活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖蔴毒蛋白A鏈、相思子素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-次黃嘌呤(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素(dianthin)蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII、及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、及新月毒素(tricothecene)。各種放射性核素可獲得用於產生放射共軛之抗體。例子包括212Bi、131I、131In、90Y、及186Re。
使用下述各種雙功能性蛋白質偶合劑製造抗體及細胞毒性劑之共軛物，諸如：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇(pyridyldithiol))丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雑環戊烷(iminothiolane)(IT)、亞胺基酯之雙功能性衍生物(諸如：二甲基亞胺酸酯HCL)、活性酯(諸如：二琥珀醯亞胺基栓酸酯)、醛(諸如：戊醛(glutareldehyde))、雙-疊氮基化合物(諸如：雙(對疊氮基苯甲醯基)己烷二胺)、雙-重氮衍生物(諸如：雙-(p-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如：伸甲苯2,6-二異氰酸酯)、雙活性氟化合物(諸如：1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，可如述於Vitetta et al.,Science 238：1098(1987)製備蓖蔴毒蛋白免疫毒素。碳-14-經標記之1-異硫氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為例示性螯合劑用以共軛放射性核苷酸至抗體。(見WO94/11026)。
發明所屬技術領域中具有通常知識者將認可大量的可能部分可偶合到本文所揭露的所得抗體。(見，例如，“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse及R.E.Lewis,Jr(eds),Carger Press,New York,(1989)，其整體內容以引用方式併入本文)。
只要抗體與其他部分維持其個別活性，偶合可由任何化學反應(將結合二分子)完成。此鍵聯可包括許多化學機制，例如共價結合、親和性結合、插入 (intercalation)、配位結合及錯合。然而較佳的結合為共價結合。共價結合可由直接縮合現有側鏈或由併入外橋接分子而達成。許多二價或多價連接劑有用於偶合蛋白質分子，諸如：本發明抗體，到其他分子。舉例而言，代表性偶合劑可包括有機化合物諸如：硫酯、碳二亞胺、琥珀醯亞胺酯、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯與己二胺(hexamethylene diamine)s。此列表不為意於窮盡各種類發明所屬技術領域中已知的偶合劑，而是為例示更一般偶合劑。(見Killen及Lindstrom,Jour.Immun.133：1335-2549(1984)；Jansen et al.,Immunological Reviews 62：185-216(1982)；及Vitetta et al.,Science 238：1098(1987)。
較佳的連接子述於文獻中。(見，例如，Ramakrishnan,S.et al.,Cancer Res.44：201-208(1984)描述使用MBS(M-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥琥珀醯亞胺酯)。亦見U.S.專利號5,030,719，描述使用鹵素化乙醯基醯肼衍生物藉由寡胜肽連接子偶合到抗體。特別地，較佳的連接子包含：共軛到EDC之(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；(ii)SMPT(4-琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem.Co.,Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀醯亞胺基-6[3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基]已酸酯(Pierce Chem.Co.,Cat.# 21651G)；(iv)磺酸基-LC-SPDP(磺酸基琥珀醯亞胺基6[3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]已酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.# 2165-G)；以及(v)磺酸基-NHS(N-羥磺酸基- 琥珀醯亞胺：Pierce Chem.Co.,Cat.# 24510)。
上述之連接子包含具有不同特性之成分，因此導致共軛物帶有不同物理化學特性。舉例而言，烷基羧酸酯之磺酸基-NHS酯比芳香族羧酸酯之磺酸基-NHS酯更穩定。含NHS-酯之連接子比磺酸基-NHS酯可溶性較低。再者，連接子SMPT包含空間位阻二硫化物鍵、及可形成具增加之穩定性的共軛物。二硫化物鍵聯一般而言比其他鍵聯不穩定，因為二硫化物鍵聯活體外經裂解，導致較少共軛物可得。磺酸基-NHS，特別是，可增強碳二亞胺偶合的穩定性。碳二亞胺偶合(諸如：EDC)，當用於連接磺酸基-NHS時，形成比碳二亞胺偶合反應單獨對水解更有抗性的酯。
本文揭露之抗體亦可調配為免疫脂質體。含脂質體之抗體由發明所屬技術領域中已知的方法製備，諸如：述於Epstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；以及U.S.專利號4,485,045與4,544,545。具增強之循環時間的脂質體揭露於U.S.專利號5,013,556。
特別有用的脂質體可由逆相蒸發方法以脂質組成物(包括卵磷脂、膽固醇、及PEG-衍生之磷脂乙醇胺(PEG-PE))產生。通過所定義之孔尺寸的過濾器擠出脂質體以產生具有所欲直徑之脂質體。本發明抗體之Fab’片段可通過二硫化物-互換反應共軛到脂質體，如述於Martin et al.,J.Biol.Chem.,257：286-288(1982)。
在一態樣中，本文所描述之共軛物包含直接或間接連接到一或多個D-承載聚合物支架之經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段，支架獨立地包括具有分子量範圍約2kDa至約40kDa之聚(1-羥基甲基伸乙基羥基甲基-甲醛)(poly(1-hydroxymethylethylene hydroxymethyl-formal)(PHF)，其中一或多個D-承載聚合物支架各獨立地為式(Ic)：
Figure 104119613-A0202-12-0115-136
 其中：D的各次出現獨立地為治療或診斷劑；LD1為含羰基之部分；
Figure 104119613-A0202-12-0115-137
中
Figure 104119613-A0202-12-0115-138
的各次出現獨立地為 包含生物可降解鍵之第一連接子，使得當該鍵斷裂時，D 以活性形式釋出達其所欲治療效果；以及
Figure 104119613-A0202-12-0115-139
中介於LD1與D之
Figure 104119613-A0202-12-0115-141
表示D至LD1直接或間接連結；
Figure 104119613-A0202-12-0115-140
的各次出現獨立地為尚未連接到經 單離之HER2抗體或其抗原-結合片段的第二連接子，其 中LP2為含官能基之部分，其還與經單離之抗體或其抗原- 結合片段的官能基形成共價鍵、及介於LD1與LP2之
Figure 104119613-A0202-12-0116-143
表示直接或間接連結LP2到LD1、及第二連接子的各次出現不同於第一連接子的各次出現；
Figure 104119613-A0202-12-0116-142
的各次出現獨立地為連接各D- 承載聚合物支架到經單離之抗體或其抗原-結合片段之第 三連接子，其中連結到LP2之端
Figure 104119613-A0202-12-0116-144
表示一旦介於LP2之 官能基與經單離之抗體或其抗原-結合片段的官能基形成共價鍵，直接或間接連結LP2至經單離之抗體或其抗原-結合片段；以及第三連接子的各次出現不同於第一連接子的各次出現；m為1至約300的整數，m1為1至約140的整數，m2為1至約40的整數，m3為0至約18的整數，m4為1至約10的整數；m、m1、m2、m3、及m4之總和範圍約15至約300；以及連結到經單離之抗體或其抗原-結合片段的LP2總數為10或更少。
共軛物可包括一或多下述特徵。
舉例而言，在式(Ic)，m1為1至約120之整數(例如：約1-90)及/或m3為1至約10的整數(例如：約1-8)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約 6kDa至約20kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約45至約150)時，m2為2至約20的整數、m3為0至約9的整數、m4為1至約10的整數及/或m1為1至約75的整數(例如：m1為約4-45)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約8kDa至約15kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約60至約110)時，m2為2至約15的整數、m3為0至約7的整數、m4為1至約10的整數及/或m1為1至約55的整數(例如：m1為約4-30)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約2kDa至約20kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約15至約150)時，m2為1至約20的整數、m3為0至約10的整數(例如：m3範圍為0至約9)、m4為1至約8的整數及/或m1為1至約70的整數、及連接到經單離之抗體或其抗原結合片段的LP2總數範圍約2至約8(例如：約2、3、4、5、6、7、8)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約3kDa至約15kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為約20至約110)時，m2為2至約15的整數、m3為0至約8的整數(例如：m3範圍為0至約7)、m4為1至約8的整數及/或m1為2至約50的整數、及連接到經單離之抗體或其抗原結合片段的LP2總數範圍約2至約8(例如：約2、3、4、5、6、7、或8)。
舉例而言，當PHF在式(Ic)具有分子量範圍約 5kDa至約10kDa(即m、m1、m2、m3及m4之總和範圍約40至約75)時，m2為約2至約10的整數(例如：m2為約3-10)、m3為0至約5的整數(例如：m3範圍為0至約4)、m4為1至約8的整數(例如：m4範圍為1至約5)及/或m1為約2至約35的整數(例如：m1為約5-35)、及連接到經單離之抗體或其抗原結合片段的LP2總數範圍約2至約8(例如：約2、3、4、5、6、7、或8)。
舉例而言，當PHF具有分子量範圍2kDa至40kDa(例如：約6-20kDa或約8-15kDa、約2-20kDa、或約3-15kDa、或約5-10kDa)時，每PHF之藥物數目(例如：m2)為1至約40的整數(例如：約1-20，或約2-15或約3-10或約2-10)。此支架可用於，例如，共軛具有40kDa或更大的分子量(例如：60kDa或更大；80kDa或更大；100kDa或更大；120kDa或更大；140kDa或更大；160kDa或更大、180kDa或更大、或200kDa或更大、或約40-200kDa、40-180kDa、40-140kDa、60-200kDa、60-180kDa、60-140kDa、80-200kDa、80-180kDa、80-140kDa、100-200kDa、100-180kDa、100-140kDa或140-150kDa)之經單離之抗體或其抗原-結合片段。在此實施態樣中，經單離之抗體或其抗原-結合片段與PHF之比為介於約1：1及約1：10、介於約1：1及約1：9、介於約1：1及約1：8、介於約1：1及約1：7、介於約1：1及約1：6、介於約1：1及約1：5、介於約1：1及約1：4、介於約1：1及約1：3、介於約1：1及 約1：2、介於約1：2及約1：4、介於約1：2及約1：3、介於約1：3及約1：4，或介於約1：3及約1：5。
舉例而言，當PHF具有分子量範圍2kDa至40kDa、(例如：約6-20kDa或約8-15kDa、約2-20kDa、或約3-15kDa、或約5-10kDa)時，每PHF之藥物數目(例如：m2)為1至約40的整數(例如：約1-20，或約2-15或約3-10或約2-10)。此支架可用於，例如，共軛具有分子量為140kDa至180kDa或140kDa至150kDa之經單離之抗體或其抗原-結合片段。在此實施態樣中，經單離之抗體或其抗原-結合片段與PHF之比為介於約1：1及約1：10、介於約1：1及約1：9、介於約1：1及約1：8、介於約1：1及約1：7、介於約1：1及約1：6、介於約1：1及約1：5、介於約1：1及約1：4、介於約1：1及約1：3、介於約1：1及約1：2、介於約1：2及約1：4、介於約1：2及約1：3、介於約1：3及約1：4、或介於約1：3及約1：5。
在此分子量範圍之經單離之抗體或其抗原-結合片段包括但不限於，例如，全長抗體，諸如，IgG、IgM。
舉例而言，當PHF具有分子量範圍2kDa至40kDa時，每PHF之藥物數目(例如：m2)為1至約40的整數(例如：約1-20或約2-15或約3-10或約2-10)。此支架可用於，例如，共軛具有分子量為60kDa至120kDa之經單離之抗體或其抗原-結合片段。在此實施態樣中， 經單離之抗體或其抗原-結合片段與PHF之比為介於約1：1及約1：10、介於約1：1及約1：9、介於約1：1及約1：8、介於約1：1及約1：7、介於約1：1及約1：6、介於約1：1及約1：5、介於約1：1及約1：4、介於約1：1及約1：3、介於約1：1及約1：2、介於約1：2及約1：4、介於約1：2及約1：3、介於約1：3及約1：4、或介於約1：3及約1：5。
在此分子量範圍之經單離之抗體或抗原-結合其片段包括但不限於，例如，抗體片段諸如，例如，Fab2及駱馬羊駝類(camelid)。
在某些實施態樣中，D為治療劑。在某些實施態樣中，治療劑為具有分子量
Figure 104119613-A0202-12-0120-294
約5kDa、
Figure 104119613-A0202-12-0120-289
約4kDa、
Figure 104119613-A0202-12-0120-290
約3kDa、
Figure 104119613-A0202-12-0120-293
約1.5kDa，或
Figure 104119613-A0202-12-0120-291
約1kDa之小分子。
在某些實施態樣中，治療劑具有IC50為約小於1nM。
於另一實施態樣中，治療劑具有IC50為約大於1nM，例如，治療劑具有IC50為約1至50nM。
有些具有IC50大於約1nM(例如：“較低效力藥物”)之治療劑不適於使用本領域認可之共軛技術與抗體共軛。不欲受到理論限制，此治療劑所具有的效力使用習知技術不足以用於標的抗體-藥物共軛物，因為使用本領域認可技術(不會導致減少共軛物之藥物動力及物理化學特性)不能共軛藥物的足量副本(即超過8)。然而，使用本 文所描述之共軛策略可達到足夠大量承載這些較低效力藥物，因而造成高承載之治療劑同時維持所欲藥物動力及物理化學特性。因此，本發明亦關於抗體-聚合物-藥物共軛物，其包含經單離之抗體或其抗原-結合片段、PHF及至少8治療劑部分，其中D為奧瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(Dolastatin)、單甲基奧瑞他汀(monoauristatin)E(MMAE)、單甲基奧瑞他汀(monoauristatin)F(MMAF)、奧瑞他汀(auristatin)F、AF HPA、苯二胺(AFP)。
舉例而言，多卡米星(duocarmycin)或其類似物為多卡米星(duocarmycin)A、多卡米星(duocarmycin)B1、多卡米星(duocarmycin)B2、多卡米星(duocarmycin)C1、多卡米星(duocarmycin)C2、多卡米星(duocarmycin)D、多卡米星(duocarmycin)SA、CC-1065、阿多來新(adozelesin)、比折來新(bizelesin)，或卡折來新(carzelesin)。
D之其他例子包括揭露於下述者，例如，US申請公開號2013-0101546及US專利號8,815,226；以及具US序號14/512,316在2014年10月10日申請，61/988,011在2014年5月2日申請，及62/010,972在2014年6月11日申請之共同申請中申請案；其中各揭露整體併入本文。
在某些實施態樣中，可共軛到抗體之D-承載聚合物支架之數目由游離半胱胺酸殘基之數目限制。在某些實施態樣中，游離半胱胺酸殘基由本文所描述之方法被 導入到抗體胺基酸序列。本文所揭露之例示性共軛物可包括具有1、2、3、或4經設計之半胱胺酸胺基酸的抗體(Lyon,R.et al(2012)Methods in Enzym.502：123-138)。在某些實施態樣中，一或多游離半胱胺酸殘基已呈現在抗體中，而不需使用設計，於此例中，存在之游離半胱胺酸殘基可用於共軛抗體到D-承載聚合物支架。在某些實施態樣中，在共軛抗體之前，抗體暴露到還原條件以產生一或多游離半胱胺酸殘基。
在某些實施態樣中，本文所描述之共軛物中，式(Ic)之D-承載聚合物支架為式(Ie)：
Figure 104119613-A0202-12-0122-146
其中，PHF具有分子量範圍約2kDa至約40kDa；D的各次出現獨立地為具有分子量為
Figure 104119613-A0202-12-0122-286
5kDa之治療劑，且介於D與羰基之
Figure 104119613-A0202-12-0122-287
表示D至羰基之直接或間接連結， X為CH2、O、或NH；Xa及Xb之一者為H，而另一者為水溶性馬來醯亞胺基阻擋部分，或Xa及Xb，與其所連結之碳原子一起形成碳-碳雙鍵，m1為1至約140的整數，m7為1至約40的整數、且m1與m7之總和為約2至約180 m為1至約300的整數，m3a為0至約17的整數，m3b為1至約8的整數、及m3a與m3b之總和為介於1與18，及m、m1、m7、m3a、及m3b之總和範圍約15至約300。
在某些實施態樣中，在本文所描述之共軛物，式(Ie)之D-承載聚合物支架為式(Id)：
Figure 104119613-A0202-12-0123-147
 其中：Xa及Xb之一者為H，而另一者為水溶性馬來醯亞胺 基阻擋部分，或Xa及Xb，與其所連結之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；m3a為0至約17的整數，m3b為1至約8的整數，及m3a與m3b之總和為介於1與18，及m、m1、m2、m3a、及m3b之總和範圍約15至約300。
舉例而言，介於m2與m3b之比為大於1：1及少於或等於10：1。
舉例而言，介於m2與m3b之比為約9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1，或2：1。
舉例而言，介於m2與m3b之比為介於2：1及8：1。
舉例而言，介於m2與m3b之比為約8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1，或2：1。
舉例而言，介於m2與m3b之比為介於2：1及4：1。
舉例而言，介於m2與m3b之比為約4：1、3：1、或2：1。
舉例而言，介於m2與m3b之比為約3：1及5：1。
舉例而言，介於m2與m3b之比為約3：1、4：1或5：1。
舉例而言，當PHF在式(Id)具有分子量範圍 約2kDa至約20kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約15至約150，m1為1至約70的整數，m2為1至約20的整數，m3a為0至約9的整數，m3b為1至約8的整數且PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為2至約8的整數。
舉例而言，當PHF在式(Id)具有分子量範圍約3kDa至約15kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約20至約110，m1為2至約50的整數，m2為2至約15的整數，m3a為0至約7的整數，m3b為1至約8的整數且PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為2至約8的整數(例如：2至約6之整數或2至約4之整數)。
舉例而言，當PHF在式(Id)具有分子量範圍約5kDa至約10kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約40至約75，m1為約2至約35的整數，m2為約2至約10的整數，m3a為0至約4的整數，m3b為1至約5的整數且PHF與經單離之HER2抗體或其抗原-結合片段之間的比為2至約8的整數(例如：2至約6之整數或2至約4之整數)。
舉例而言，水可溶性馬來醯亞胺基阻擋部分為當馬來醯亞胺基與式(II)之含硫醇之化合物反應時，可共價連結到二烯烴碳原子之一的部分：R90-(CH2)d-SH(II)
其中：R90為NHR91、OH、COOR93、CH(NHR91)COOR93或經取代之苯基；R93為氫或C1-4烷基；R91為氫、CH3或CH3CO及d為1至3的整數。
舉例而言，式(ii)之水可溶性馬來醯亞胺基阻擋化合物可為半胱胺酸、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸甲基酯、N-甲基半胱胺酸、2-巰基乙醇、3-巰基丙酸、2-巰基乙酸、巰基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇，其中苯基經一或多親水性取代基或3-胺基丙烷-1-硫醇取代。苯基上的一或多親水性取代基包括OH、SH、甲氧基、乙氧基、COOH、CHO、COC1-4烷基、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等。
舉例而言，水可溶性馬來醯亞胺基阻擋基團為-S-(CH2)d-R90，其中R90為OH、COOH、或CH(NHR91)COOR93；R93為氫或CH3；R91為氫或CH3CO；以及d為1或2。
舉例而言，水可溶性馬來醯亞胺基阻擋基團為-S-CH2-CH(NH2)COOH。
舉例而言，當PHF具有分子量範圍2kDa至40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10 kDa)時，每PHF之藥物數目(例如：m2)為1至約40的整數(例如：約1-20或約2-15或約3-10或約2-10)。此支架可用於，例如，共軛具有40kDa或更大的分子量(例如：60kDa或更大；80kDa或更大；或100kDa或更大；120kDa或更大；140kDa或更大；160kDa或更大、180kDa或更大、或200kDa或更大、或約40-200kDa、40-180kDa、40-140kDa、60-200kDa、60-180kDa、60-140kDa、80-200kDa、80-180kDa、80-140kDa、100-200kDa、100-180kDa、100-140kDa或140-150kDa)之經單離之抗體或其抗原-結合片段。在此實施態樣中、經單離之抗體或其抗原-結合片段與PHF之比為介於約1：1及約1：10、介於約1：1及約1：9、介於約1：1及約1：8、介於約1：1及約1：7、介於約1：1及約1：6、介於約1：1及約1：5、介於約1：1及約1：4、介於約1：1及約1：3、介於約1：1及約1：2、介於約1：2及約1：8、介於約1：2及約1：6、介於約1：2及約1：5、介於約1：2及約1：4、介於約1：2及約1：3、介於約1：3及約1：4、或介於約1：3及約1：5。
舉例而言，當PHF具有分子量範圍2kDa至40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10kDa)時，每PHF之藥物數目(例如：m2)為1至約40的整數(例如：約1-20或約2-15或約3-10或約2-10)。此支架可用於，例如，共軛具有分子量為140kDa至180kDa或140kDa至150kDa之經單離之抗體或抗原-結合片段。在 此實施態樣中，經單離之抗體或其抗原-結合片段與PHF之比為介於約1：1及約1：10、介於約1：1及約1：9、介於約1：1及約1：8、介於約1：1及約1：7、介於約1：1及約1：6、介於約1：1及約1：5、介於約1：1及約1：4、介於約1：1及約1：3、介於約1：1及約1：2、介於約1：2及約1：8、介於約1：2及約1：6、介於約1：2及約1：5、介於約1：2及約1：4、介於約1：2及約1：3、介於約1：3及約1：4、或介於約1：3及約1：5。
在此分子量範圍之經單離之抗體或抗原-結合片段包括但不限於，例如，全長抗體，諸如，IgG、IgM。
舉例而言，當PHF具有分子量範圍2kDa至40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10kDa)時，每PHF之藥物數目(例如：m2)為1至約40的整數(例如：約1-20或約2-15或約3-10 or 2-10)。此支架可用於，例如，共軛具有分子量為60kDa至120kDa之經單離之抗體或抗原-結合片段。在此實施態樣中經單離之抗體或其抗原-結合片段與PHF之比為介於約1：1及約1：10、介於約1：1及約1：9、介於約1：1及約1：8、介於約1：1及約1：7、介於約1：1及約1：6、介於約1：1及約1：5、介於約1：1及約1：4、介於約1：1及約1：3、介於約1：1及約1：2、介於約1：2及約1：8、介於約1：2及約1：6、介於約1：2及約1：5、介於 約1：2及約1：4、介於約1：2及約1：3、介於約1：3及約1：4、或介於約1：3及約1：5。
在此分子量範圍的經單離之抗體或抗原-結合片段包括但不限於，例如，抗體片段諸如，例如Fab2、scFcFv與駱馬羊駝類(camelid)。
舉例而言，當PHF具有分子量範圍2kDa至40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10kDa)時，每PHF之藥物數目(例如：m2)為1至約40的整數(例如：約1-20或約2-15或約3-10 or 2-10)。此支架可用於，例如，共軛具有分子量為40kDa to 80kDa之經單離之抗體或其抗原-結合片段。在此實施態樣中經單離之抗體或其抗原-結合片段與PHF之比為介於約1：1及約1：10、介於約1：1及約1：9、介於約1：1及約1：8、介於約1：1及約1：7、介於約1：1及約1：6、介於約1：1及約1：5、介於約1：1及約1：4、介於約1：1及約1：3、介於約1：1及約1：2、介於約1：2及約1：8、介於約1：2及約1：6、介於約1：2及約1：5、介於約1：2及約1：4、介於約1：2及約1：3、介於約1：3及約1：4、或介於約1：3及約1：5。
在此分子量範圍，即約40kDa至約80kDa，的經單離之抗體或抗原-結合片段包括但不限於，例如，抗體片段諸如，例如，Fab。
在某些實施態樣中，在本文所描述之共軛物，式(Ie)之D-承載聚合物支架為式(If)，其中聚合物為 具有分子量範圍約2kDa至約40kDa之PHF：
Figure 104119613-A0202-12-0130-148
其中：m為1至約300的整數，m1為1至約140的整數，m2為1至約40的整數，m3a為0至約17的整數，m3b為1至約8的整數；m3a與m3b之總和範圍1與約18；m、m1、m2、m3a、及m3b之總和範圍約15至約300； 端
Figure 104119613-A0202-12-0130-149
表示一或多聚合物支架至專一性結合至人HER2 受體的表位之經單離之抗體或其抗原結合片段的連結且包括可變重鏈互補性決定區1(CDRH1)，其包括胺基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO：25)；可變重鏈互補性決定區2(CDRH2)，其包括胺基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；可變重鏈互補性決定區3(CDRH3)，其 包括胺基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO：27)；可變輕鏈互補性決定區1(CDRL1)，其包括胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；可變輕鏈互補性決定區2(CDRL2)，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及可變輕鏈互補性決定區3(CDRL3)，其包括胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)；以及PHF與抗體之比為10或更少。
式(If)之支架可包括一或多下述特徵：當PHF在式(If)具有分子量範圍約2kDa至約20kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約15至約150，m1為1至約70的整數，m2為1至約20的整數，m3a為0至約9的整數，m3b為1至約8的整數，m3a與m3b之總和範圍1與約10、及介於PHF與抗體之比為2至約8的整數。
當PHF在式(If)具有分子量範圍約3kDa至約15kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約20至約110，m1為2至約50的整數，m2為2至約15的整數，m3a為0至約7的整數，m3b為1至約8的整數，m3a與m3b之總和範圍1與約8；以及介於PHF與抗體之比為為2至約8的整數(例如：約2至約6或約2至約4)。
當PHF在式(If)具有分子量範圍約5kDa至約10kDa時，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍約40至約75，m1為約2至約35的整數，m2為約2至約10的整數，m3a為0至約4的整數，m3b為1至約5的整數，m3a 與m3b之總和範圍1與約5；以及介於PHF與抗體之比為2至約8的整數(例如：約2至約6或約2至約4)。
在某些實施態樣中，奧瑞他汀(auristatin)F羥基丙基醯胺(“AF HPA”)與抗體之間的比可為約30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在其他實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1或6：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1或10：1。
在某些實施態樣中，AF與抗體之間的比可為約15：1、14：1、13：1、12：1或11：1。
在某些實施態樣中，AF HPA與抗體之間的比可為約15：1、14：1、13：1或12：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可 為約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約6：1、5：1、4：1、3：1、2：1或1：1。
在其他實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。
在其他實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約6：1、5：1、4：1或3：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約5：1、4：1或3：1。
在某些實施態樣中，PHF與抗體之間的比可為約4：1、3：1或2：1。
在此分子量範圍的經單離之抗體或抗原-結合片段包括但不限於，例如，抗體片段，諸如，Fab。
抗體-聚合物藥物共軛物的其他實施態樣揭露於下述者，例如，US專利號8,815,226；以及US序號14/512,316，2014年10月10日申請、及61/988,011，2014年5月2日申請；其中各揭露整體併入本文。
本發明亦關於如此經修飾之藥物衍生物，其在無聚合性載體下可直接共軛到抗體或其抗原-結合片段、及其藥物-抗體共軛物。
在某些實施態樣中，抗體-藥物共軛物包括共 軛，即共價連結到藥物部分之抗體或其抗原-結合片段。在某些實施態樣中，抗體或其抗原-結合片段為通過連接子，例如：非聚合性連接子共價連結到藥物部分。
抗體-藥物共軛物(ADC)之藥物部分(D)可包括任何化合物、部分(moiety)或基團，其具有本文所定義之細胞毒性或抑制細胞生長效果。在某些實施態樣中，抗體-藥物共軛物(ADC)包括抗體(Ab)(其標靶腫瘤細胞)、藥物部分(D)、及連接子部分(L)(其連結Ab至D)。在某些實施態樣中，抗體通過一或多胺基酸殘基，諸如：離胺酸及/或半胱胺酸連結到連接子部分(L)。
在某些實施態樣中，ADC具有式(Ig)：Ab-(L-D)p(Ig)，其中p為1至約20。
在某些實施態樣中，可共軛到抗體的藥物部分之數目由游離半胱胺酸殘基之數目限制。在某些實施態樣中，由本文所描述之方法游離半胱胺酸殘基導入到抗體胺基酸序列。式Ig之例示性ADC包括但不限於具有1、2、3、或4經設計之半胱胺酸胺基酸(Lyon,R.et al(2012)Methods in Enzym.502：123-138)之抗體。在某些實施態樣中，一或多游離半胱胺酸殘基已經呈現在抗體中，而不需使用設計，在此例中存在之游離半胱胺酸殘基可用以共軛抗體到藥物。在某些實施態樣中，在抗體共軛之前，抗體暴露在還原條件以產生一或多游離半胱胺酸殘 基。
在某些實施態樣中，“連接子”(L)為雙功能性或多功能性部分，可用以連接一或多個藥物部分(D)到抗體(Ab)來形成式Ig之抗體-藥物共軛物(ADC)。在某些實施態樣中，可使用具有反應性官能性於共價連結到藥物與到抗體之連接子製備抗體-藥物共軛物(ADC)。舉例而言，在某些實施態樣中，抗體(Ab)之半胱胺酸硫醇可與連接子或藥物-連接子中間物之反應性官能基形成鍵以製造ADC。
在一態樣中，連接子具有官能性，其能夠與存在於抗體的游離半胱胺酸反應來形成共價鍵。非限制性例示性此反應性官能性包括馬來亞醯胺、鹵乙醯胺、α-鹵乙醯基、活化之酯諸如：琥珀醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、醯氯、磺醯氯、異氰酸酯、及異硫氰酸酯。見例如：在Klussman,et al(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773的第766頁之共軛方法、及本文實施例。
在某些實施態樣中，連接子具有官能性，能夠與存在於抗體上的親電性基團反應。例示性此親電性基團包括但不限於醛與酮羰基。在某些實施態樣中，連接子反應性官能性之雜原子與抗體上的親電性基團反應且形成共價鍵到抗體單元。非限制性例示性此反應性官能性包括但不限於醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴腙(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯、及芳基醯肼。
連接子可包括一或多連接子成分。例示性連接子成分包括6-馬來醯亞胺基己醯基(“MC”)、馬來醯亞胺基丙醯基(“MP”)、纈胺酸-瓜胺酸(“val-cit”或“vc”)、丙胺酸-苯丙胺酸(“ala-phe”)、對胺基苄基氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)、及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(“MCC”)。各種連接子成分為發明所屬技術領域中已知，其中一些於下描述。
連接子可為“可裂解連接子”，幫助釋出藥物。非限制性例示性可裂解連接子包括酸不穩定連接子(例如：包括腙)、蛋白酶敏感(例如：胜肽酶敏感)連接子、光不穩定連接子、或含二硫化物之連接子(Chari et al.,Cancer Research 52：127-131(1992)；U.S.專利號5,208,020)。
在某些實施態樣中，連接子具有下式(IIg)：-Aa-Ww-Yy(IIg)
其中：A為“延伸子單元”，且a為0至1的整數；W為“胺基酸單元”，且w為0至12的整數；Y為“間隔子單元”，且y為整數0、1、或2。包括式(IIg)之連接子的ADC具有式I(A)：Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p，其中Ab、D、及p如上述對式(Ig)定義者。此連接子例示性實施態樣述於U.S.專利號7,498,298，其整體以引用方 式併入本文。
在某些實施態樣中，連接子成分包括“延伸子單元”(A)，其連接抗體到另一連接子成分或藥物部分。非限制性例示性延伸子單元顯示如下(其中波浪線係指共價連結到抗體、藥物、或額外之連接子成分的位置)：
Figure 104119613-A0202-12-0137-150
在某些實施態樣中，連接子成分包括“胺基酸單元”(W)。在一些此實施態樣中，胺基酸單元允許藉由蛋白酶裂解連接子，因而在暴露到胞內蛋白酶(諸如：溶體酵素)時協助藥物從免疫共軛物釋出(Doronina et al.(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784)。例示性胺基酸單元包括但不限於二胜肽、三胜肽、四胜肽、及五胜肽。例示性二胜肽包括但不限於纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe- lys)；苯丙胺酸-高離胺酸(phe-homolys)；以及N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。例示性三胜肽包括但不限於甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可包括天然發生之胺基酸殘基及/或次要胺基酸及/或非天然發生胺基酸類似物、諸如：瓜胺酸。胺基酸單元可為了被特定酵素(例如，腫瘤相關蛋白酶、細胞自溶酶B、C及D、或胞漿素蛋白酶)酵素裂解而設計並最佳化。
典型地，胜肽型連接子可由在介於二或更多胺基酸及/或胜肽片段之間形成胜肽鍵而製備。此胜肽鍵可例如，根據液相合成方法(例如：E.Schrider and K.Lubke(1965)“The Peptides”,volume 1,pp 76-136,Academic Press)而製備。
在某些實施態樣中，連接子成分包括“間隔子”單元，其直接或透過延伸子單元及/或胺基酸單元連接抗體到藥物部分。間隔子單元可為“自我犧牲”或“非自我犧牲”。“非自我犧牲”間隔子單元為當ADC裂解時其中部分或全部間隔子單元維持鍵結到藥物部分者。非自我犧牲間隔子單元的例子包括但不限於甘胺酸間隔子單元及甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。在某些實施態樣中，含甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之ADC藉由腫瘤-細胞相關之蛋白酶的酵素裂解導致從ADC剩餘物釋出甘胺酸-甘胺酸-藥物部分。在一些此實施態樣中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分為在腫瘤細胞中經過水解步驟，因而從藥物部分裂解甘胺酸- 甘胺酸間隔子單元。
“自我犧牲”間隔子單元允許釋出藥物部分。在某些實施態樣中，連接子的間隔子單元包括對胺基苄基單元。在一些此實施態樣，通過醯胺鍵對胺基苄基醇連結到胺基酸單元，且製造胺甲酸酯、甲基胺甲酸酯、或碳酸酯介於苄基醇與藥物(Hamann et al.(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103)。在某些實施態樣中，間隔子單元包括對胺基苄基氧基羰基(PAB)。在某些實施態樣中，包括自我犧牲連接子的ADC具有結構：
Figure 104119613-A0202-12-0139-151
其中：Q為-C1-C8烷基，-O-(C1-C8烷基)、鹵素、硝基、或氰基；n6為0至4的整數；Xa可為一或多額外的間隔子單元或可不存在；以及p為1至約20之整數。
在某些實施態樣中，p為1至10、1至7、1至5、或1至4之整數。非限制性例示性Xa間隔子單元包括：
Figure 104119613-A0202-12-0140-152
其中R101與R102獨立地選自H及C1-C6烷基。在某些實施態樣中，R101與R102各為-CH3。
自我犧牲間隔子之其他例子包括但不限於芳香族化合物，其電子類似於PAB基團，諸如：2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(U.S.專利號7,375,078；Hay et al.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰或對胺基苄基縮醛。在某些實施態樣中，可使用間隔子在醯胺鍵水解時經歷環化，諸如：經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues et al(1995)Chemistry Biology 2：223)、適當經取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm et al(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry,et al(1990)J.Org.Chem.55：5867)。藥物到甘胺酸殘基之α-碳的鍵聯為另一自我犧牲間隔子的例子，其可用於ADC(Kingsbury et al(1984)J.Med.Chem.27：1447)。
在某些實施態樣中，連接子L可為樹狀型連接子，用於通過分枝、多功能性連接子部分共價連結超過一種藥物部分到抗體(Sun et al(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun et al(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。 樹狀連接子可增加藥物對抗體之莫耳比，即承載，其係關於ADC的效力。因此，該處抗體帶有僅一個反應性半胱胺酸硫醇基團，透過樹狀連接子可連結眾多藥物部分。
對於式(Ig)之ADC，非限制性例示性連接子如下所示：
Figure 104119613-A0202-12-0141-153
Figure 104119613-A0202-12-0142-154
其中R101與R102獨立地選自H及C1-C6烷基；n5為0至12的整數。
在某些實施態樣中，n為整數2至10。在某些實施態樣中，n為4至8的整數。
在某些實施態樣中，R101與R102各為-CH3。
進一步非限制性例示性ADC包括結構：
Figure 104119613-A0202-12-0142-155
Figure 104119613-A0202-12-0143-156
其中Xa為：
Figure 104119613-A0202-12-0143-157
 Y為：
Figure 104119613-A0202-12-0143-159
 各R103獨立地為H或C1-C6烷基；以及n7為1至12之整數。
在某些實施態樣中，連接子為經調節溶解度及/或反應性之基團取代。作為非限制性例子，帶電取代基諸如：磺酸根(-SO3 -)或銨可增加連接子試劑之水溶解度且協助連接子試劑與抗體及/或藥物部分之偶合反應，或協助Ab-L(抗體-連接子中間物)與D、或D-L(藥物-連接子 中間物)與Ab之偶合反應，端視用於製備ADC的合成途徑。在某些實施態樣中，連接子之部分偶合到抗體及連接子之部分偶合到藥物，之後Ab-(連接子部分)a偶合到藥物-(連接子部分)b來形成式Ig之ADC。
本文所揭露之化合物明確涵蓋，但不限於與下列連接子試劑製備之ADC：雙-馬來醯亞胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-馬來醯亞胺基丙基氧基)-N-羥琥珀醯亞胺酯(BMPS)、N-(ε-馬來醯亞胺基己醯基氧基)琥珀醯亞胺酯(EMCS)、N-[γ-馬來醯亞胺基丁醯基氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯基碸(HBVS)、琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸)(LC-SMCC)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥琥珀醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、琥珀醯亞胺基3-(溴乙醯胺基)丙酸酯(SBAP)、琥珀醯亞胺基碘乙酸酯(SIA)、琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、琥珀醯亞胺基4-(p-馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、琥珀醯亞胺基6-[(β-馬來醯亞胺基丙醯胺基)已酸酯](SMPH)、亞胺基硫雑環戊烷(亞胺基硫雜環戊烷)(IT)、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC、及磺酸基-SMPB、及琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯 (SVSB)、及包括雙-馬來醯亞胺之試劑：二硫基雙馬來醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙馬來醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4雙馬來醯亞胺基(bismaleimidyl)-2,3-二羥丁烷(BMDB)、雙馬來醯亞胺基己烷(BMH)、雙馬來醯亞胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(顯示如下)、及BM(PEG)3(顯示如下)；下述之雙功能性衍生物：亞胺基酯(諸如：二甲基亞胺酸酯HCl)、活性酯(諸如：二琥珀醯亞胺基栓酸酯)、醛(諸如：戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如：雙-(對疊氮基苯甲醯基)己烷二胺)、雙-重氮衍生物(諸如：雙-(p-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如：甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙-活性氟化合物(諸如：1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在某些實施態樣中，雙-馬來醯亞胺試劑允許抗體中半胱胺酸之硫醇基團連結到含硫醇藥物部分、連接子，或連接子-藥物中間物。其他與硫醇基團反應之官能基包括但不限於碘乙醯胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯、及異硫氰酸酯。
Figure 104119613-A0202-12-0145-160
可從各種商業來源獲得某些有用之連接子試劑，諸如：Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Ill.)、Molecular Biosciences Inc.(Boulder,Colo.)，或依照發明所屬技術領域中所述之程序合成；例如，在Toki et al(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；Dubowchik,et al.(1997)Tetrahedron Letters,38：5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355；Frisch et al(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；U.S.專利號6,214,345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；以及WO 04/032828中。
碳-14-經標記之1-異硫氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為例示性螯合劑，用於共軛放射性核苷酸到抗體。見，例如：WO 94/11026。
製造HER2抗體共軛物之方法：
在某些實施態樣中，共軛物在數個步驟中形成。這些步驟包括(1)修飾聚合物，使其包含可與藥物或其衍生物之官能基反應之官能基；(2)反應經修飾之聚合物與藥物或其衍生物，使得藥物連接到聚合物；(3)修飾聚合物-藥物共軛物，使得聚合物包含可與經單離之抗體或其抗原-結合片段的官能基或其衍生物反應之官能基；以及(4)反應經修飾之聚合物-藥物共軛物與抗體或其抗原-結合片段，來形成本文所揭露之共軛物。若步驟(1)產生之經修飾之聚合物包含可與抗體或其抗原-結合片段之官 能基反應的官能基，則步驟(3)可省略。
在另一實施態樣中，共軛物在數個步驟中形成：(1)修飾聚合物，使得其包含可與第一藥物或其衍生物之官能基反應之官能基；(2)反應經修飾之聚合物與第一藥物或其衍生物，使得第一藥物連接到聚合物；(3)修飾聚合物-藥物共軛物，使得其包含可與第二藥物或其衍生物的官能基反應之不同官能基(4)反應經修飾之聚合物-藥物共軛物與該第二藥物或其衍生物，使得該第二藥物連接到聚合物-藥物共軛物；(5)修飾含2種不同藥物的聚合物-藥物共軛物，使得聚合物包含可與抗體或其抗原-結合片段的官能基反應之官能基；以及(6)反應步驟(5)之經修飾之聚合物-藥物共軛物與經單離之抗體或其抗原-結合片段或其衍生物，來形成本文所揭露之共軛物。若2種不同經單離之抗體或抗原-結合其片段或其衍生物欲共軛來形成聚合物-藥物共軛物(包括二種不同藥物及二種不同抗體或抗原-結合其片段)，則步驟(5)及(6)可重複。
在又另一實施態樣中，共軛物在數個步驟中形成。這些步驟包括(1)修飾聚合物，使得其包含可與藥物或其衍生物的官能基反應之官能基；(2)進一步修飾聚合物，使得其亦包含可與抗體或其抗原-結合片段的官能基反應之官能基；(3)反應經修飾之聚合物與藥物或其衍生物，使得藥物連接到聚合物；以及(4)反應經修飾之聚合物-藥物共軛物與抗體或其抗原-結合片段，來形成本文所揭露之共軛物。步驟(1)及(2)之順序或步驟(3)及(4)之順 序可相反。再者，若經修飾之聚合物包含可與藥物或其衍生物的官能基及抗體或其抗原-結合片段的官能基兩者反應的官能基，步驟(1)或(2)可省略。
在另一實施態樣中，共軛物在數個步驟中形成：(1)修飾聚合物，使得其包含可與第一藥物或其衍生物之官能基反應的官能基；(2)進一步修飾聚合物，使得其包含可與抗體或其抗原-結合片段的官能基反應之官能基；(3)反應經修飾之聚合物與第一藥物或其衍生物，使得第一藥物連接到聚合物；(4)修飾聚合物-藥物共軛物，使得其包含可與第二藥物或其衍生物的官能基反應之不同官能基(5)反應經修飾之聚合物-藥物共軛物與該第二藥物或其衍生物，使得該第二藥物連接到聚合物-藥物共軛物；(6)反應含2種不同藥物之經修飾之聚合物-藥物共軛物，使得聚合物與經單離之抗體或其抗原-結合片段或其衍生物來形成本文所揭露之共軛物。若2種不同經單離之抗體或抗原-結合其片段或其衍生物欲共軛來形成聚合物-藥物共軛物(包括二種不同藥物及二種不同抗體或其抗原-結合片段)，則步驟(6)可重複。步驟(4)可在步驟(1)之後進行，使得經修飾之聚合物包含可與二種不同藥物或其衍生物反應的二種不同官能基。在此實施態樣中，含可與二種不同藥物或其衍生物反應之二種不同官能基的經修飾之聚合物可進一步經修飾，使得其包含可與抗體或其抗原-結合片段的官能基反應的官能基；在經修飾之聚合物與二種不同藥物(步驟(3)與步驟(5)或抗體或其抗原-結合片段(步 驟(6)反應之前。
在某些例示性實施態樣，本文所揭露之共軛物發現用於生物醫藥應用，諸如：藥物遞送及組織工程，且聚合性載體為生物相容性及生物可降解。在某些實施態樣中，載體為可溶性聚合物、奈米粒子、膠體、脂質體、微胞(micelle)、縫線(suture)、植入物等。在某些實施態樣中，術語“可溶性聚合物”涵蓋生物可降解生物相容性聚合物，諸如：聚醛(例如：親水性聚縮醛或聚縮酮)。在某些其他實施態樣中，載體為全合成、半合成或天然發生之聚合物。在某些其他實施態樣中，載體為親水性。生產本文所揭露之共軛物的適當聚合性載體例子述於US專利號8,815,226，其整體內容以引用方式併入本文。
於一實施態樣中，聚合性載體包括式(IV)之單元：
Figure 104119613-A0202-12-0149-161
 其中X’指對聚合物主鏈之羥基的取代基。如式(iv)所示及本文所描述之其他式子，各聚縮醛單元具有連結到單元之甘油部分的單一羥基及連結到單元之乙醇醛部分的X’基團。這是為了方便起見且應解釋為具有式(iv)的單元及其他本文所描述之式子的聚合物可包括具有X’基團(或另一取代基諸如：包括馬來醯亞胺終端的連接子)(連結到 單元之乙醇醛部分)的單元與具有單一X’基團(或另一取代基諸如：包括馬來醯亞胺終端的連接子)(連結到單元之甘油部分)之單元以及具有二X’基團(或其他取代基諸如：包括馬來醯亞胺終端的連接子)(一個連結到乙醇醛部分而另一個連結到單元之甘油部分)的單元之隨機分布。
於一實施態樣中，適於實施本發明之生物可降解生物相容性聚醛具有分子量為介於約0.5及約300kDa。舉例而言，生物可降解生物相容性聚醛具有分子量為介於約1及約300kDa(例如：介於約1及約200kDa、介於約2及約300kDa、介於約2及約200kDa、介於約5及約100kDa、介於約10及約70kDa、介於約20及約50kDa、介於約20及約300kDa、介於約40及約150kDa、介於約50及約100kDa、介於約2及約40kDa、介於約6及約20kDa、或介於約8及約15kDa)。舉例而言，用於本文所揭露之聚合物支架或共軛物之生物可降解生物相容性聚醛為具有分子量為介於約2及約40kDa(例如：約2-20kDa、3-15kDa、或5-10kDa)的PHF。
製備適於共軛到修飾劑之聚合物載體(例如：生物相容性、生物可降解聚合物載體)之方法為發明所屬技術領域中已知。舉例而言，合成引導可在U.S.專利號5,811,510；5,863,990；5,958,398；7,838,619；7,790,150；以及8,685,383發現。熟練操作者將知道如何採用這些方法來製造用於實施本發明之聚合物載體。
於一實施態樣中，形成本發明生物可降解生 物相容性聚醛共軛物的方法包括適當多醣與有效量之二醇專一性氧化劑結合來形成醛中間物的過程。醛中間物(為聚醛本身)之後可被還原成對應之多元醇、經琥珀酸化(succinylated)及與一或多適當修飾劑偶合來形成生物可降解生物相容性聚醛共軛物(包括含琥珀二醯胺之鍵聯)。
在另一較佳的實施態樣中，用於本發明之全合成生物可降解生物相容性聚醛可由反應適當起始劑與適當前驅物化合物來製備。
舉例而言，全合成聚醛可以經保護經取代之二醇縮合乙烯基來製備。其他方法，諸如：可使用開環聚合，其中該方法功效可依取代的程度與保護基團的蓬鬆度(bulkiness)而定。
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發明所屬技術領域中具有通常知識者將了解溶劑系統、催化劑及其他因素可經最佳化以獲得高分子量產物。
在某些實施態樣中，載體為PHF。
在實施態樣中，聚合物載體為具有多分散性指數(PDI)為
Figure 104119613-A0202-12-0151-285
1.5、例如：<1.4、<1.3、<1.2或<1.1之PHF。
舉例而言，為了共軛具有分子量為40kDa至200kDa的經單離之抗體或其抗原-結合片段，骨架之聚合 性載體為聚縮醛，例如：具有分子量(即未經修飾之PHF的MW)範圍為約2kDa至約40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10kDa)之PHF。
舉例而言，為了共軛具有分子量為40kDa至80kDa之抗體或其抗原-結合片段，本文所揭露之支架的聚合性載體為聚縮醛，例如：具有分子量(即未經修飾之PHF的MW)範圍為約2kDa至約40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10kDa)之PHF。舉例而言，PHF具有分子量為約5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、或15kDa。
在此分子量範圍的抗體或其抗原-結合片段包含但不限於，例如，抗體片段，諸如，例如，Fab。
舉例而言，為了共軛具有分子量為60kDa至120kDa之抗體或其抗原-結合片段，本文所揭露之支架的聚合性載體為聚縮醛，例如：具有分子量(即未經修飾之PHF的MW)範圍為約2kDa至約40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10kDa)之PHF。舉例而言，PHF具有分子量為約5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、或15kDa。
在此分子量範圍的抗體或其抗原-結合片段包含但不限於，例如，駱馬羊駝類(camelid)、Fab2、scFvFc等。
舉例而言，為了共軛具有分子量為140kDa至180kDa或140kDa至150kDa之抗體或其抗原-結合片段，本文所揭露之支架的聚合性載體為聚縮醛、例如：具有分子量(即未經修飾之PHF的MW)範圍為約2kDa至約40kDa(例如：約2-20kDa，或約3-15kDa，或約5-10kDa)之PHF。舉例而言，PHF具有分子量為約5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、或15kDa。
在此分子量範圍的抗體或其抗原-結合片段包含但不限於，例如，全長抗體，諸如，IgG、IgM。
可製備本文所揭露之生物可降解生物相容性共軛物以符合所欲生物降解性及親水性需求。舉例而言，在生理條件下，可達到介於生物降解性與安定性的平衡。例如，分子量超過某些門檻(一般而言，高於40-100kDa，視分子的物理形狀而定)之已知分子不會透過腎臟排泄，而小分子為且可僅通過細胞攝入且在胞內間隔(最顯著為溶體)降解而從身體清除。此觀察例示藉由調節其在一般生理條件(pH=7.5±0.5)及在溶體pH(pH近5)的安定性，如何可設計功能性安定還生物可降解材料。舉例而言，已知縮醛及縮酮基團的水解被酸催化，因此聚醛一般在酸性溶體環境將比例如，在血漿中較不穩定。可設計一測試比較在37℃水性介質，例如，pH=5及pH=7.5下聚合物降解概況，因而測定在正常生理環境及在細胞攝入後“消化”溶體間隔中預期之聚合物安定性平衡。可測量在此 測試中聚合物完整性，例如，藉由粒徑篩析HPLC。發明所屬技術領域中具有通常知識者可選擇其他適當方法研究本文所揭露之降解的共軛物之各種片段。
在許多情況下，較佳地在pH=7.5，聚合物的有效尺寸在1至7天期間不會可偵測地改變，且維持原狀50%內達至少幾週。另一方面，在pH=5，聚合物應較佳地在1至5天期間可偵測地降解，且在二週到數月時期內完全轉形成為低分子量片段。雖然較快的降解可在某些情況下較佳，一般而言，聚合物以不超過細胞代謝或排出聚合物片段速率的速率在細胞中降解可為較佳。因此，在某些實施態樣中，預期本發明之共軛物為生物可降解，特別是在當被細胞攝入時，且相較生物系統而言為相當“惰性”。載體降解的產物較佳地不帶電且不顯著變動環境的pH。提議大量的醇基團可提供低比率的聚合物辨識(被特別是吞噬細胞的細胞受體)。本發明聚合物主鏈一般包含少，如有，抗原性決定位(特徵為，例如，某些多醣及多胜肽群)且一般不包括能夠參與活體內“鑰-與-鎖”類型的交互作用(除非後者為所欲)的剛性結構。因此，預測本文所揭露之可溶性、交聯與固態共軛物具有低毒性及生物黏性，其使之適於數種生物醫藥應用。
在本發明某些實施態樣中，生物可降解生物相容性共軛物可形成線性或分支狀結構。舉例而言，本發明生物可降解生物相容性聚醛共軛物可為掌性(光學活性)。任意地，本發明生物可降解生物相容性聚醛共軛物 可為非外消旋(scalemic)。
在某些實施態樣中，本文所揭露之共軛物為水可溶性。在某些實施態樣中，本文所揭露之共軛物為水不可溶性。在某些實施態樣中，本發明共軛物係呈固態形式。在某些實施態樣中，本文所揭露之共軛物為膠體。在某些實施態樣中，本文所揭露之共軛物係呈粒子形式。在某些實施態樣中，本文所揭露之共軛物係呈膠體形式。
下面反應圖1顯示製造本文所揭露之聚合性藥物支架的合成反應圖。於一實施態樣中，共軛物在數個步驟中形成：(1)聚合物，PHF為經修飾成包括COOH部分(例如：-C(O)-X-(CH2)2-COOH)；(2)聚合物之後進一步經修飾使得其包含可與PBRM官能基反應之馬來醯亞胺基部分(例如：EG2-MI)；(3)含二種不同官能基的經修飾之聚合物與藥物或其衍生物(例如：AF-HPA-Ala)之官能基反應來形成聚合物-藥物共軛物；(4)還原PBRM之二硫化物鍵；(5)經還原之PBRM之後與聚合物-藥物共軛物反應來形成蛋白質-聚合物-藥物共軛物；以及(6)剩餘的馬來醯亞胺基部分任意地與馬來醯亞胺基阻擋化合物(例如：半胱胺酸)反應。
在另一實施態樣中，步驟(2)與(3)的順序可相反，如下列反應圖1中右側途徑所繪。
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在又另一實施態樣中，同時進行上述步驟(2)與(3)，如下述反應圖2中所繪。
Figure 104119613-A0202-12-0158-166
對抗HER2之抗體的用途
將了解依據本發明投予治療實體將與併入調 配物之適當載體、賦形劑、及其他劑投予以提供改良之轉移、遞送、耐受性等。許多適當調配物可在對所有醫藥化學家已知的處方集中發現：Remington’s Pharmaceutical Sciences(15th ed,Mack Publishing Company,Easton,PA(1975))，特別是其中的Blaug,Seymour之Chapter 87。這些調配物包含，例如，粉劑、糊劑、軟膏、凝膠、蠟類、油類、脂質類、含脂質(陽離子性或陰離子性)之小囊(諸如：LipofectinTM)、DNA共軛物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳劑、乳劑卡波蠟(carbowax)(各種分子量之聚乙二醇)、半固態膠體、及含卡波蠟(carbowax)之半固態混合物。上述混合物任一可適於依照本發明之治療及療法，惟調配物中活性成分不被調配物去活化且調配物與投予途徑為生理相容且可耐受。亦見Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2)：210-8(2000),Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000),Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000),Powell et al.“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)及本文之引證關於醫藥化學家廣知的與調配物、賦形劑及載體相關的額外資訊。
於一實施態樣中，本文所揭露之抗體、其片 段及/或其共軛物可用做為治療劑。此劑一般將用於診斷、預測、監控、治療、緩解、預防及/或延遲與例如：個體中異常HER2活性及/或表現相關之疾病或病變的進展。治療方案使用標準方法藉由辨識個體，例如：患有(或有發展的風險)與異常HER2活性及/或表現相關之疾病或失調，例如：癌症的人患者來進行。抗體製劑，較佳地為具有對其標靶抗原具有高專一性及高親和性者，投予到個體且一般因其與標的結合而將具有效果。抗體的投予可消除或抑制或干擾標的的訊號傳遞功能。抗體的投予可消除或抑制或干擾標的與其天然結合的內源性配體之結合。舉例而言，抗體結合至標的且調節、阻擋、抑制、降低、拮抗、中和或者干擾HER2活性及/或表現。
與異常HER2活性及/或表現相關之疾病或失調包括但不限於癌症。目標癌症可為肛門、星狀細胞瘤、白血病、淋巴瘤、頭與頸、肝、睪丸、子宮頸、肉瘤、血管瘤、食道、眼、喉、口、間皮瘤、皮膚、骨髓瘤、口腔、直腸、咽喉、膀胱、乳房、子宮、卵巢、前列腺、肺、結腸、胰臟、腎、或胃癌。
在另一態樣中，疾病或失調為選自下列所組成群組之癌症：乳癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、及卵巢癌。
一般而言，疾病或失調之減緩或治療涉及減少與疾病或失調相關之一或多症狀或醫療問題。舉例而言，在癌症的例子中，治療有效量之藥物可完成一或下述 之組合：降低癌症細胞之數目；降低腫瘤尺寸；抑制(即某些程度減少及/或停止)癌症細胞滲透到周邊器官；抑制腫瘤轉移；某些程度抑制腫瘤生長；及/或某些程度減輕一或多與癌症相關之症狀。在某些實施態樣中，本文所揭露之組成物可用於預防個體中疾病或失調的開始或再發生。
本文所揭露之抗體、其片段及/或其共軛物的治療有效量一般係關於需要達到治療目標的量。如上所述，此可為介於抗體及其目標抗原之結合交互作用，其在某些例子中，干擾目標的作用。需要投予的量將在依抗體對其專一性抗原的結合親和性而定，且亦將依所投予抗體從其所投予之自由體積其他個體耗盡的速率而定。本文所揭露之抗體或抗體片段及/或其共軛物之治療有效劑量的通常範圍可為，藉由非限制性例子，約0.1mg/kg體重至約50mg/kg體重、約0.1mg/kg體重至約100mg/kg體重或約0.1mg/kg體重至約150mg/kg體重。一般劑量頻率可範圍為，例如，每天二次到一個月一次(例如：每天一次、每週一次；每隔一週一次；每三週或每月一次)。舉例而言，可以約0.1mg/kg至約20mg/kg(例如：0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.67mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/k、或20mg/kg)投予本文所揭露之XMT 1519共軛物，諸如：XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物或XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物(例如：作為每週、每2週、每3週、或每月單一劑量)。舉例而言，可以約0.1mg/kg至約20mg/kg(例如：0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.67mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、或20mg/kg)投予本文所揭露之XMT 1519共軛物，諸如：XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物或XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物(例如：作為每週、每2週、每3週，或每月單一劑量)用於治療低HER2-表現乳癌或低HER2-表現胃癌。
治療功效性依據任何已知診斷或治療特定HER2相關之失調的方法測定。減緩HER2相關之失調的一或多症狀係指抗體賦予臨床效益。
篩選具有所欲專一性之抗體的方法包括但不限於酵素結合免疫吸附分析(ELISA)及其他發明所屬技術領域中已知的免疫媒介之技術。
於另一實施態樣中，針對HER2之抗體可用於發明所屬技術領域中已知與HER2定位及/或定量有關的方法(例如：用於測量在適當生理樣本中HER2的量、用於診斷方法、用於成像蛋白質等)。在給定的實施態樣 中，包含抗體衍生之抗原結合域的專一HER2的抗體、或其衍生物、片段、類似物或同源物係用作為藥理活性化合物(以下係指“療法”)。
於另一實施態樣中，專一HER2的抗體用於單離HER2多胜肽，藉由標準技術，諸如：免疫親和性、層析術或免疫沉澱法。針對HER2蛋白質的抗體(或其片段)可診斷用於監控組織中蛋白質量，作為臨床測試程序的一部分，例如：以，例如，測定給定之治療方案的功效。偵測可由偶合(即物理連接)抗體到可偵測之物質協助。可偵測物質的例子包括各種酵素、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、及放射性材料。適當酵素的例子包括山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，或乙醯基膽鹼酯酶；適當輔基錯合物的例子包括鏈霉親和素(streptavidin)/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適當螢光材料的例子包括繖形酮、螢光素、螢光素異硫氰酸酯、玫瑰紅、二氯三口井基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料的例子包含流明諾；生物發光材料的例子包括螢光素酶、螢光素(luciferin)、及水母發光蛋白(aequorin)、及適當放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
在又另一實施態樣中，根據本發明之抗體可用做為偵測HER2蛋白質(或其片段)在樣本存在的劑。在某些實施態樣中，抗體包含偵測標籤。抗體為多株，或更佳地，為單株。使用完整抗體，或其片段(例如：Fab、scFv、或F(ab)2)。術語關於探針或抗體的“經標記之”為意 於涵蓋藉由偶合(即物理連接)可偵測物質到探針或抗體而直接標記探針或抗體，以及藉由與直接標記之另一試劑反應而間接標記探針或抗體。間接標記的例子包括使用螢光-標記之二級抗體偵測初級抗體及以生物素末端標記DNA探針，使得其可以螢光-標記之鏈霉親和素(streptavidin)偵測。術語“生物樣本”為意於包括經單離自個體的組織、細胞及生物流體，以及存在於個體的組織、細胞及流體。包含在術語“生物樣本”的使用，因此為包括血清、血漿或淋巴的血液及血的片段或組份。亦即，本文所揭露之偵測方法可用以偵測活體外生物樣本中以及活體內分析物mRNA、蛋白質、或基因體DNA。舉例而言，偵測分析物mRNA的活體外技術包括北方雜交法及原位雜交法。偵測分析物蛋白質的活體外技術包括酵素結合免疫吸附分析(ELISAs)、西方墨點法、免疫沉澱法、及免疫螢光。偵測分析物基因體DNA的活體外技術包括南方雜交。進行免疫分析的程序述於，例如ELISA：Theory and Practice：Methods in Molecular Biology”,Vol.42,J.R.Crowther(Ed.)Human Press,Totowa,NJ,1995；“Immunoassay”,E.Diamandis and T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996；及“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985。再者，偵測分析物蛋白質的活體內技術包括導入個體經標記之抗-分析物蛋白質抗體。舉例而言，抗體可經放射性標幟物標記，其在 個體中的存在與定位可由標準成像技術偵測。
HER2抗體的治療投予與調配物
本文所揭露之抗體、衍生物、片段、類似物及其同源物及/或其共軛物(也為本文所稱之“活性化合物”)可併入適於投予的醫藥組成物。涉及製備此組成物的原則與考量，以及選擇組份的引導係提供於，例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences：The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R.Gennaro,et al.,editors)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences,Vol.4),1991,M.Dekker,New York。
此組成物典型地包括抗體、其片段及/或其共軛物與醫藥上可接受之載劑。當使用抗體片段時，專一性結合至目標蛋白質結合域的最小抑制片段為較佳。舉例而言，依據抗體可變-區域序列，可設計胜肽分子維持結合目標蛋白質序列的能力。此胜肽可化學合成及/或由重組DNA技術產生。(見，例如：Marasco et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：7889-7893(1993))。
如本文所用，術語“醫藥上可接受之載劑”為意於包括任何及所有與醫藥投予相容之溶劑、分散介質、 塗層、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑等。適當載體係述於最近版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences，該領域的標準參考書，其以引用方式併入本文。此載體或稀釋劑較佳的例子包括但不限於水、鹽水、林格氏液(ringer’s solution)、葡萄糖溶液(dextrose solution)、及5%人血清白蛋白。亦可使用脂質體及非水性媒劑諸如：固定油類(fixed oil)。對於醫藥活性物質此介質及劑之使用為發明所屬技術領域中所廣知。除了只要不與活性化合物相容之任何習知的介質或劑之外，預期其在組成物的使用。
欲用於活體內投予的調配物必需無菌。此可通過無菌過濾膜以過濾輕易完成。
本文所揭露之醫藥組成物經調配成與其所欲投予途徑相容。投予途徑的例子包括腸胃外，例如：靜脈內、皮內、皮下、口腔(例如：吸入)、經皮(即局部)、經黏膜、及直腸投予。用於腸胃外、皮內，或皮下應用的溶液或懸浮液可包括下述成分：無菌稀釋劑諸如：注射用水、鹽水溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑諸如：苄基醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如：抗壞血酸或亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)；螯合劑諸如：乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝液諸如：乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽、及用於調整張力之劑諸如：氯化鈉或葡萄糖(dextrose)。可以酸或鹼諸如：鹽酸或氫氧化鈉，調整pH。腸胃外製劑可封於安瓿、可拋 棄式注射器或玻璃或塑膠製的多劑量小瓶。
適於注射使用的醫藥組成物包括無菌水溶液(其中為水可溶性)或分散液及用於無菌注射溶液或分散液之即用製劑的無菌粉劑。對於靜脈內投予，適當載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)。在所有例子中，組成物必需為無菌且應為存在容易可注射程度的流體。其在製造與儲存條件下必需安定且必須防腐對抗微生物諸如：細菌及真菌的污染行為。載體可為溶劑或分散介質，包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇等)、及其適當混合物。可例如，藉由使用塗層諸如：卵磷脂、在分散液例子中藉由維持所需粒子尺寸及藉由使用介面活性劑而維持適當流動性。預防微生物的作用可由各種抗細菌及抗真菌劑，例如，對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等達成。在許多例子中，較佳在組成物包括等張劑，例如，糖類、多元醇諸如：甘露醇、山梨醇、氯化鈉。注射組成物的延長吸收可由包括在組成物中的延遲吸收劑(例如，硬脂酸鋁及明膠)實現。
無菌注射溶液可由併入所需量之活性化合物在適當溶劑與一或上述枚舉成份之組合(如需要)，接著過濾滅菌而製備。一般而言，由併入活性化合物到無菌媒劑(包含基本分散介質及上述枚舉之所需其他成分)而製備分散液。在用於製備之無菌注射溶液的無菌粉劑之例子中，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，產生活性成分加任何額 外所欲成分(來自其先前無菌過濾的溶液)。
口腔組成物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。其可封在明膠囊劑或壓縮成錠劑。為了口腔治療投予的目的，活性化合物可與賦形劑合併且以錠劑、片劑，或囊劑形式使用。口腔組成物亦可使用流體載體(用作為漱口水)而製備，其中流體載體中的化合物口腔施用並漱口(swished)並吐出或吞入。醫藥相容結合劑及/或佐劑材料可以組成物的部分包含。錠劑、丸劑、囊劑、片劑等可包含任何下述成分、或類似性質的化合物：黏合劑諸如：微晶型纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑諸如：澱粉或乳糖、崩解劑諸如：海藻酸、Primogel，或玉米澱粉；潤滑劑諸如：硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑諸如：膠體二氧化矽；甜味劑諸如：蔗糖或糖精；或調味劑諸如：薄荷、水楊酸甲酯、或橘子風味。
對於吸入投予，以氣溶膠噴霧形式從加壓的容器或分散器(其包含適當推進劑，例如：氣體諸如：二氧化碳)或噴霧器遞送化合物。
全身投予亦可由經黏膜或經皮方式。對於經黏膜或經皮投予，對欲穿透的屏障為適當的滲透劑係用於調配物。此滲透劑一般為發明所屬技術領域中所知，且包括，例如對於經黏膜投予，去污劑、膽鹽、及梭鏈孢酸衍生物。可通過使用鼻噴霧或栓劑完成經黏膜投予。對於經皮投予，活性化合物調配成一般發明所屬技術領域中已知的軟膏、油膏、膠劑、或乳劑。
化合物亦可製備成栓劑形式(例如：與習知的栓劑基質諸如：可可脂及其他甘油酯)或保留灌腸用於直腸遞送。
於一實施態樣中，以載體(將保護化合物對抗從體內快速消除)製備活性化合物，諸如：持續/控制釋放調配物，包括植入物與微囊封遞送。可使用生物可降解、生物相容性聚合物諸如：乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原、聚原酸酯(polyorthoester)、及聚乳酸。製備此調配物之方法對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言為顯而易見。
舉例而言，活性成分可陷入所製備的微囊劑，例如，藉由凝聚技術或藉由界面聚合，例如，羥基甲基纖維素或明膠-微囊劑及聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微囊劑分別在膠體藥物遞送系統(例如、脂質體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米粒子、及奈米囊劑)或在巨乳劑。
可製備持續釋放製劑。適當持續釋放製劑的例子包括含抗體之固態疏水性聚合物的半透性基質，基質係呈成形物件形式，例如：膜、或微囊劑。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(U.S.專利號3,773,919)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸之共聚物、不可降解之乙烯乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如：LUPRON DEPOTTM(由乳酸乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之注射微球體)、及聚-D-(-)-3-羥 丁酸。在聚合物諸如：乙烯乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸使得分子釋放100天期間，某些水凝膠釋放蛋白質達較短時期。
材料亦可從Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals,Inc商業上獲得。脂質體懸浮液(包括以具有對抗病毒抗原之單株抗體標靶受感染細胞的脂質體)亦可作為醫藥上可接受之載劑。這些可依據發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法製備，例如，如述於U.S.專利號4,522,811。
為了易於投予及劑量均勻度，特別有利為調配呈劑量單元形式的口腔或腸胃外組成物。本文所用之劑量單元形式係指物理分離單元，適作為給予所欲治療個體的單元劑量；含預定量之活性化合物的各單元，其結合所需醫藥載體經計算產生所欲治療效果。對本文所揭露之劑量單元形式的說明書受活性化合物的獨特特徵及欲達到之特定治療效果、及配制此活性化合物於個體治療領域中的固有限制影響且直接有賴於此。
醫藥組成物可連同投予指示含在容器、包裝或分配器。
調配物亦可包含超過一種必需用於特定欲治療適應症的活性化合物，較佳地彼等具有互補活性，不會不利地彼此影響。或者，或此外，組成物可包括增強其功能的劑諸如，例如，細胞毒性劑、細胞激素、化療劑、或生長抑制劑。此分子適於以組合呈現，其量對所欲目標有 效。
於一實施態樣中，活性化合物於合併療法投予，即合併其他劑，例如：治療劑，其有用於治療病理病症或失調，諸如：各種形式的癌症、自體免疫失調及炎症疾病。於此文中術語“合併”意指實質上同時，為同時或依序給予劑。若依序給予，在投予第二化合物的起始，二化合物間的第一個較佳地在治療位置仍可偵測有效濃度。
舉例而言，合併療法可包括本文所揭露之一或多抗體、其片段及/或其共軛物共配製及/或共投予一或多額外抗體例如：HER2抗體、HER2二聚合抑制劑抗體或HER2抗體的組合及HER2二聚合抑制劑抗體諸如，例如，曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)或曲妥珠單抗(trastuzumab)與帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合，或曲妥珠單抗(trastuzumab)及/或帕妥珠單抗(pertuzumab)之生物相似物或生物相似物的組合。
舉例而言，合併療法可包括本文所揭露之一或多抗體、其片段及/或其共軛物共配製及/或共投予一或多額外之治療劑，例如：紫杉烷(taxane)(紫杉醇(paclitaxel)或多西他賽(docetaxel))、蒽環類藥物(anthracycline)(阿黴素(doxorubicin)或表柔比星(epirubicin))、環磷醯胺(cyclophosphamide)、卡培他濱(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、來曲唑(letrozole)、卡鉑(carboplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、厄洛替尼(erlotinib)、伊立替康 (irinotecan)、氟脲嘧啶(fluorouracil)，或奧沙利鉑(oxaliplatin)。此組合療法可有利地應用較低劑量的所投予治療劑，因而避免可能毒性或與各種單療法相關之併發症。
在某些實施態樣中，用於合併本文所揭露之抗體、其片段及/或其共軛物的額外治療劑(群)為在免疫及/或炎症反應不同階段干擾的彼等劑。於一實施態樣中，本文所描述之一或多抗體可共配製及/或共投予一或多額外劑。
診斷及預防調配物
本文所揭露之HER2抗體、抗原-結合其片段及/或其共軛物係用於診斷與預防調配物。於一實施態樣中，本文所揭露之HER2抗體、抗原-結合其片段及/或其共軛物投予到有發展一或多上述疾病(諸如：例如而非限制，癌症)風險的患者。患者或器官易有一或多上述適應症的體質可使用基因型、血清學或生物化學標幟物來測定。
在本發明另一實施態樣中，本文所揭露之HER2抗體、抗原-結合其片段及/或其共軛物投予到經診斷有與一或多上述疾病(諸如：例如而非限制，癌症)相關之臨床適應症的人個體。經診斷，本文所揭露之HER2抗體、抗原-結合其片段及/或其共軛物投予以減輕或逆轉與一或多上述疾病相關之臨床適應症的效果。
在本發明另一實施態樣中，辨識符合以本文所揭露之共軛物治療之乳癌患者的方法，包括測量從患者所得之腫瘤樣本中某些特徵的狀態、及基於腫瘤樣本中某些特徵的狀態，辨識治療的患者。
本文所揭露的抗體亦有用於偵測患者樣本中的HER2，因而有用地作為診斷法。舉例而言，本文所揭露的HER2抗體用於活體外分析，例如：ELISA，以偵測患者樣本中HER2量。
於一實施態樣中，本文所揭露的HER2抗體為固定在固態支撐物(例如：微孔板的壁上)。經固定的抗體作為針對可存在於測試樣本中之任何HER2的補捉抗體。在接觸經固定的抗體與患者樣本之前，固態支撐物以阻擋劑諸如：牛奶蛋白質或白蛋白沖洗及處理以預防分析物的非專一性吸附。
接著，壁以疑似含有抗原的測試樣本，或以含有標準量之抗原的溶液處理。此樣本為例如：疑似具有認為是病變診斷的循環抗原量之個體的血清樣本。在沖洗掉測試樣本或標準品之後，以可檢測標記之第二抗體處理固態支撐物。經標記之二次抗體作為偵測抗體。測量可偵測標籤的量，且藉由與來自標準樣本發展的標準曲線比較測定測試樣本中HER2抗原的濃度。
將了解基於使用本文所揭露的HER2抗體在活體外診斷分析中所得的結果，可能基於HER2抗原的表現量分級個體中疾病。對於給定的疾病，血液樣本從診斷為 在疾病進展各種階段及/或在疾病治療處理的各種點之個體取出。使用對進展或療法各階段提供統計學上顯著結果的樣本群，指定可被認為是各階段特徵的抗原濃度範圍。
本文所引用之所有公開案與專利文件以引用方式併入本文，如同此公開案或文件各者特定地或個別地被點出以引用方式併入本文。公開與專利文件的引用不欲被視為承認任一為有關的先前技術，也不是構成關於對彼等之內容或日期的任何承認。現已以書寫說明方式描述的本發明，發明所屬技術領域中具有通常知識者將認可本發明可在各種實施態樣實施且上述描述與下面的實施例為說明目的而不為隨後之申請專利範圍的限制。
實施例
下述工作實施例為說明連接子、藥物分子與PBRM、及製備彼等的方法。這些不意於限制且發明所屬技術領域中具有通常知識者可輕易地了解可運用其他試劑或方法。
縮寫
下述縮寫係用於隨後之反應圖及合成實施例。此列表不代表為用於申請案中的所有含括縮寫列表，因為有機合成技術領域中具有通常知識者輕易了解的額外標準縮寫亦可用於合成反應圖及實施例中。
AF-HPA 奧瑞他汀(auristatin)F-羥丙基醯胺
Figure 104119613-A0202-12-0175-323
一般資訊
購買Genentech製造之注射用賀癌寧(Kadcyla)®(ado-曲妥珠單抗(trastuzumab)艾得辛(emtansine))。
由Kabat編號反應圖辨識CDR。
腫瘤生長抑制(%TGI)定義為在介於處理組與控制組的中值腫瘤體積(MTV)之%差異。
從研究期間觀察之發病率與腫瘤尺寸之退化(regression)反應幅度測定治療功效。治療可導致動物腫瘤之部分退化(PR)或完全退化(CR)。在PR反應中，腫瘤體積為其第一天體積的50%或更小(在研究過程中的三次連續測量)、並等於或大於13.5mm3(針對這三次測量的一或多次)。在CR反應中，腫瘤體積小於13.5mm3(在研究過程中的三次連續測量)。研究終止具有CR反應的動物被額外地分選為無腫瘤之存活者(TFS)。監控動物的退化反應。
在Phenomenex Gemini 5μm 110Å，250 x 10 mm，5微米，半製備管柱進行HPLC純化。
在Tosoh Biosciences TSK gel G5000管柱(7.8mm x 30cm，10um)或Superose 12管柱(GE Healthcare)進行SEC。
在ProPac WCX-10(94mm x 250mm)管柱(ThermoFisher)進行WCX。
只要有可能分光光度計測定共軛物之藥物量或者進行LC/MS或1H-NMR定量測定藥物量。
蛋白質-聚合物-藥物共軛物之蛋白質量用分光光度計在280nm或由ELISA測定。
以多醣或蛋白質分子量標準品由SEC測定聚合物共軛物分子量(以表觀重量平均分子量或峰分子量報告)。更特定的是，對於聚合物或聚合物-藥物共軛物，使用多醣分子量標準品，而對於蛋白質-藥物-聚合物共軛物，使用蛋白質標準品。除非特定指出，否則所報告之聚合物載體分子量為PHF之重量平均分子量；而聚合物-藥物共軛物分子量及蛋白質-聚合物-藥物共軛物為峰分子量。HER2-聚合物-藥物共軛物具有約170kDa至約230kDa之峰分子量。所合成/測量之聚合物及聚合物共軛物典型地具有多分散性
Figure 104119613-A0202-12-0176-284
1.5。
由大量滲濾從剩餘未反應之藥物-聚合物共軛物分離Her2-聚合物-藥物共軛物。如需要，進行由粒徑篩析層析術及/或WCX層析術額外純化以移除任何聚集的Her2-聚合物-藥物共軛物。一般而言，Her2-聚合物-藥物 共軛物典型地包含<5%(w/w，例如：<2% w/w)聚集片段，由SEC所測定；<0.5%(w/w，例如：<0.1% w/w)游離(未共軛)藥物，由RP-HPLC或LC-MS/MS所測定；<1%(w/w)之游離聚合物-藥物共軛物，由SEC及/或RP-HPLC所測定及<2%(w/w，例如：<1% w/w)未共軛之Her2，由HIC-HPLC及/或WCX HPLC所測定。使用述於文獻之程序製備還原或部分還原之抗體，見，例如，Francisco et al.,Blood 102(4)：1458-1465(2003)。總藥物(共軛及未共軛)濃度由LC-MS/MS所測定。
一般程序 一般程序A. 聚合物與連接子或藥物之共軛
一般而言，聚合物(PHF-BA或PHF-GA)與含胺連接子諸如，例如，EG2-馬來醯亞胺或含胺連接子藥物諸如，例如，AF-HPA-Ala、HPA-Ala之共軛在水性或10-90%有機/水性有機混合物在活化劑(諸如，例如EDC.HCl)存在下進行。典型的有機溶劑包括但不限於水可混溶溶劑，諸如，例如，DMSO、DMF、DMA、NMP及ACN。為加速偶合，加入共活化劑諸如，例如，NHS。聚合物首先與含胺基化合物混合，接著加入共活化劑(NHS)，之後加入活化劑(EDC.HCl)。在0-10℃，pH 4.5到7.5，在周遭溫度進行反應1至24小時。由滲濾或由SEC純化所得聚合物共軛產物。濃縮產物到2-50mg/mL，調整pH到4.5至6.5來確保藥物-聚合物連接子 安定性並將共軛物在-20至-80℃冷凍儲存直到進一步使用。
聚合物與含胺連接子或藥物之共軛可以任何順序依序或同時進行。
一般程序B. 蛋白質(HER2抗體)之部分選擇性還原
在與聚合物-藥物共軛物共軛之前，在相關HER2抗體中鏈間二硫化物基團或未配對二硫化物的部分選擇性還原藉由使用還原劑諸如，例如，TCEP、DTT或β-巰基乙醇達成。當以過量還原劑進行還原時，在由SEC共軛之前移除還原劑。HER2二硫化物基團轉換成反應性氫硫基的程度依賴於HER2之化學計量、還原劑、pH、溫度及/或反應持續時間。當PBRM中部分但非全部的二硫化物基團被還原時，所還原的PBRM為部分還原之HER2。
一般程序C. 部分還原之HER2與聚合物藥物共軛物之共軛
在中性或弱鹼性條件(pH 6.5-8.5)下，於PBRM濃度為1-10mg/mL且聚合物-藥物共軛物濃度為0.5-10mg/mL下，進行部分還原之PBRM到聚合物-藥物共軛物之共軛。典型以相對於所欲蛋白質-聚合物-藥物共軛物化學計量1-5.0倍過量使用聚合物-藥物共軛物。當PBRM共軛到聚合物-藥物共軛物之馬來醯亞胺基時，藉 由加入水溶性馬來醯亞胺基阻擋化合物，諸如，例如，N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸甲基酯、N-甲基半胱胺酸、2-巰基乙醇、3-巰基丙酸、2-巰基乙酸、巰基甲醇(即HOCH2SH)、苄基硫醇等任意地封端共軛。
典型由滲濾純化所得HER2-聚合物-藥物共軛物來移除任何未共軛之聚合物-藥物共軛物、未共軛藥物及小分子雜質。或者或此外，適當的層析分離程序諸如，例如，粒徑篩析層析術、疏水性交互作用層析術、離子層析術諸如，例如，WCX層析術；逆相層析術、羥基磷灰石層析術、親和性層析術或其組合可用來純化HER2-聚合物-藥物共軛物。所得純化之HER2-聚合物-藥物共軛物典型調配在pH 5.0-6.5的緩衝液。
實施例1：HER2抗體之FACS選擇
本文所揭露的HER2抗體兩者，XMT 1517及XMT 1519，使用下述程序選擇。各為~109多樣性的8種初級人合成酵母菌庫如先前(見，例如，WO 2009036379；WO2010105256；WO2012/009568；以及Xu et al.,Protein Eng Des Sel.2013 Oct；26(10)：663-70)所述擴張。對於前兩輪的選擇，進行使用Miltenyi MACs系統的磁珠粒分選技術，如所述(Siegel et al.,J Immunol Methods.2004 Mar；286(1-2)：141-53)。簡言之，酵母菌細胞(~1010細胞/庫)與3ml之200nM生物素化單體HER2抗原或10nM生物素化HER2-Fc融合抗原在FACS洗滌緩衝液PBS與 0.1% BSA(使用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit,Thermo Scientific,Cat.# 21425完成生物素化)中室溫培養15分鐘。以50ml冰冷洗滌緩衝液洗滌一次之後，將細胞團再懸浮於40mL洗滌緩衝液，且500μl Streptavidin MicroBeads(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany.Cat.# 130-048-101)加到酵母菌並4℃培養15分鐘。接著，團化酵母菌、再懸浮於5mL洗滌緩衝液、且裝填到MACS LS管柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany.Cat.# 130-042-401)。在裝填5mL之後，以3ml FACS洗滌緩衝液洗滌管柱3次。之後從磁場移出管柱，且以5mL的生長介質洗提酵母菌，之後生長過夜。接下來流式細胞測量術進行三輪的分選。團化大約1×108酵母菌、以洗滌緩衝液洗滌三次、及室溫分別與200nM、100或10生物素化HER2培養10分鐘。酵母菌之後洗滌二次且在4℃以山羊抗-人F(ab’)2卡帕(kappa)-FITC(經1：100稀釋)(Southern Biotech,Birmingham,Alabama,Cat.# 2062-02)與鏈霉親和素(streptavidin)-Alexa Fluor 633(Life Technologies,Grand Island,NY,Cat.# S21375)(經1：500稀釋)，或Extravidin-phycoerthyrin(Sigma-Aldrich,St Louis,Cat.# E4011)(經1：50稀釋)，二級試劑染色15分鐘。以冰冷洗滌緩衝液洗滌二次後，再懸浮細胞團於0.4mL洗滌緩衝液且轉移到濾器封蓋之分選管。使用FACS ARIA分選器(BD Biosciences)進行分選且測定分選區域以對二輪選擇僅HER2結合之選殖株而第三輪為陰性分選來 降低試劑結合劑。最後一輪分選之後，將酵母菌劃盤且挑出個別菌落來特徵化。
實施例2：HER2抗體之親和性成熟
本文所揭露的親和性成熟之HER2抗體，XMT 1518及XMT 1520，係使用下述程序製造。使用第5輪結合群於輕鏈批次多樣化(LCBD)。萃取重鏈質體且轉形到輕鏈庫(具多樣性為1 x 106)。如上所述以一輪之MACS分選及二輪之FACS分選，對分別輪次使用10nM或1nM生物素化抗原進行選擇。
進一步親和性成熟在來自LCBD之最佳的選殖株上進行。來自這些選殖株重鏈CDRH3之各者個別地重組到預製庫(具多樣性為1 x 108之變體)且如上所述進行選擇。藉由培養抗原抗體酵母菌複合物與親代Fab來施加親和性壓力達不同次數量以選擇最高親和性抗體。
第三輪之親和性成熟包括重鏈與輕鏈之易錯PCR(error prone PCR)。類似於先前循環，對全部三輪使用FACS分選且對Fab壓力以增加的次數進行選擇。
實施例3：抗體產生及純化
生長酵母菌選殖株到飽和，之後在30℃震動下誘導48h。誘導後，將酵母菌細胞團化且收集上清液純化。使用Protein A管柱純化IgG且以乙酸，pH 2.0洗提。以木瓜酶分解產生Fab片段並在KappaSelect(GE Healthcare LifeSciences,Cat.# 17-5458-01)純化。
藉由次選殖抗體到新表現載體完成IgG之哺乳動物表現，接著瞬時轉染且表現在HEK。簡言之，藉由與轉染試劑錯合，接著暴露到HEK細胞1小時，接著藉由稀釋培養基到最後密度為每mL 4百萬顆細胞，來將含有興趣抗體之表現載體轉染。之後培養細胞7天，每48小時有新鮮飼養介質。7天之後，在離心之後收集上清液且使用蛋白質A進行純化，且若需要，加入CHT管柱純化以達到>95%單體。
實施例4：HER2抗體親和性測量
藉由測量其KD(用ForteBio或MSD-SET)來測定HER2抗體親和性。ForteBio親和性測量一般如前述(Estep et al.,MAbs.2013 Mar-Apr；5(2)：270-8)進行。簡言之，由線上裝填IgG到AHQ感應器進行ForteBio親和性測量。在分析緩衝液中感應器離線平衡達30分鐘，之後線上監控60秒，作為基礎線建立。有裝填之IgG的感應器暴露到100nM抗原5分鐘，之後其轉移到分析緩衝液5分鐘，作為離速率測量(off-rate measurement)。使用1：1結合模式分析動力學。
如前所述進行平衡親和性測量(Estep et al.,2013)。在PBS+0.1% IgG-Free BSA(PBSF)進行溶液平衡滴定(SET)，帶有抗原維持不變50pM，並與從10nM開始3到5倍連續稀釋之抗體培養。將抗體(20nM在PBS) 塗佈在標準結合MSD-ECL盤4℃過夜或室溫30分鐘。之後以700rpm震動阻擋盤30分鐘，接著以洗滌緩衝液(PBSF+0.05% Tween 20)三次洗滌。以700rpm震動將SET樣本施用並培養在盤上150s，接著一次洗滌。捕捉在盤上的抗原以在PBSF中之250ng/mL磺酸基標籤-標記之鏈霉親和素(streptavidin)藉由培養在盤上3分鐘偵測。以洗滌緩衝液洗滌盤三次，之後在MSD Sector Imager 2400儀器使用1x Read Buffer T(帶界面活性劑)讀取。繪出%游離抗原作為在Prism中滴定抗體之函數且導入二次方程式以獲取KD。為了改良生產量(throughput)，在整個MSD-SET實驗，包括SET樣本製備，使用液體處理控制裝置。表I給予ForteBio及MSD-SET親和性測量結果。
Figure 104119613-A0202-12-0183-167
實施例5：Octet Red384表位分級
抗體表位分級在Forte Bio Octet Red384系統(Pall Forte Bio Corporation,Menlo Park,CA)使用標準品夾心形式之分級法進行。裝填控制組抗-目標IgG到AHQ 感應器而在感應器之未佔領之Fc-結合位置以非相關人IgG1抗體阻擋。之後將感應器暴露於100nM目標抗原，接著為第二抗-目標抗體。使用ForteBio’s Data Analysis Software 7.0處理數據。在抗原締合之後的第二抗體額外結合指未佔領之表位(非競爭者)，而無結合指表位阻擋(競爭者)。對4個控制組抗體重複此過程：(i)曲妥珠單抗(trastuzumab)，其結合至HER2之Domain IV(Cho et al.,Nature.2003 Feb 13；421(6924)：756-60)；(ii)帕妥珠單抗(pertuzumab)，其結合至HER2的Domain II(Franklin et al.,Cancer Cell.2004 Apr；5(4)：317-28)；(iii)Fab37，其結合至HER2的Domain III(Fisher et al.,J Mol Biol.2010 Sep 10；402(1)：217-29)；以及(iv)chA21，其結合至HER2的Domain I(Zhou et al.,J Biol Chem.2011 Sep 9；286(36)：31676-83.；Cheng et al.,Cell Res.2003 Feb；13(1)：35-48)。控制組抗體的序列顯示如下：
>曲妥珠單抗(trastuzumab)重鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0184-168
(SEQ ID NO：40)
>曲妥珠單抗(trastuzumab)輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0185-169
(SEQ ID NO：41)
>帕妥珠單抗(pertuzumab)重鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0185-170
(SEQ ID NO：42)
>帕妥珠單抗(pertuzumab)輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0186-176
(SEQ ID NO：43)
>Fab37重鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0186-174
Figure 104119613-A0202-12-0186-175
(SEQ ID NO：44)
>Fab37輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0186-325
Figure 104119613-A0202-12-0186-172
(SEQ ID NO：45)
>chA21重鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0187-178
Figure 104119613-A0202-12-0187-179
(SEQ ID NO：46)
>chA21輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 104119613-A0202-12-0187-180
Figure 104119613-A0202-12-0187-181
(SEQ ID NO：47)
選擇不與四個控制組抗體競爭之具有最高親和性之抗體XMT 1519、XMT 1520、XMT 1517、XMT 1518。
如圖1A所示，XMT 1517及XMT 1518抗體，而在圖1B，XMT 1519與XMT 1520抗體不與4個控制組抗體競爭。
實施例6：以JIMT-1細胞之抗體結合恆定測量
使用Macsquant流式細胞儀(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)評估HER2抗體細胞表面結合到JIMT-1細胞。JIMT-1細胞，在DMEM介質(ATCC,Manassas,VA)與10%FBS(Gibco®,Life Technologies,Grand Island,NY)長過夜到大約90%融合培養，以Accutase細胞分離液(Innovative Cell Technologies,San Diego,CA)處理從盤表面釋出。分離之細胞以冰冷介質(含6%山羊血清)洗滌一次且再懸浮於相同介質。V-底、96-孔盤的每孔等分100,000個細胞且與HER2抗體濃度範圍 (0.05-100nM)(在150μl DMEM與6%山羊血清中)在冰上培養3小時。之後以冰冷PBS洗滌細胞一次且再懸浮於帶2%山羊血清及6μg/ml之二級螢光標記之抗體，Alexa Fluor® 647-標記之山羊抗-人IgG(Life Technologies Cat.# A-21445)之100μl DMEM在冰上1小時。以冰冷PBS(Gibco®,Life Technologies,Cat.# 10010049)洗滌細胞一次且懸浮於帶1%聚甲醛的200μl之冰冷PBS。每細胞結合的螢光量由在流式細胞儀對各處理跑5000個細胞測定。對各處理的中數螢光值作圖、且以Graphpad Prism軟體由非線性迴歸使用單一位置、特定結合模式對各抗體計算解離常數，Kd。圖2顯示HER2抗體結合到JIMT-1細胞。所計算之Kd值對XMT 1517為3.4nM、對XMT 1518為0.4nM、對XMT 1519為1.2nM及對XMT 1520為1.1nM。
實施例7：ELISA之抗體親和性測量
抗體對重組人與馬來猴(cynomolgus monkey)HER2的親和性由ELISA分析測定。藉由各孔與50μl之在50mM重碳酸鹽緩衝液的1μg/ml溶液，pH 9.0，室溫培養2小時而將經純化、重組HER2胞外域，人衍生(胺基酸23-652，Acro Biosystems Cat.# HE2-H5225)或馬來猴(cynomolgus monkey)衍生(胺基酸1-652，Sino Biological,Cat.# 90295-C08H)塗佈在96孔盤之表面。以TTBS(50mM Tris-HCl、pH 7.4,150mM NaCl、及0.05% Tween 20)洗滌孔4次。藉由與50μl之TTBS(含5%牛血清白蛋白)培養1小時而阻擋孔。之後將在50μl之TTBS(有3% BSA)中之各測試抗體稀釋範圍(0.005至10nM，3倍連續稀釋)或實施例16H在室溫加入達2小時。以TTBS洗滌(4x)移除未結合之測試抗體。共軛到HRP(Bethyl Laboratories,#A80-115P)之二級抗-人IgG(濃度為0.2μg/ml在帶有3% BSA之TTBS)在各孔培養1小時。以4次TTBS洗滌移除未結合之二級抗體。HRP基質(TMB Bethyl Laboratories#E102)加到各孔且培養直到可見黃色。加入50μl之0.2N硫酸停止反應。在盤讀取器(Molecular Devices,Spectramax M5)測量450nm之吸光度。使用GraphPad Prism軟體對值作圖。由非線性迴歸使用一位置、特定結合模式測定Kd。
圖3a給出抗-HER2抗體XMT 1517、XMT 1518結合到人HER2及馬來猴(cynomolgus monkey)HER2的結果。圖3b給出抗-HER2抗體XMT 1519、XMT 1529結合到人HER2及馬來猴(cynomolgus monkey)HER2的結果。所計算之Kd值養在表II中。
Figure 104119613-A0202-12-0189-182
4個測試抗體結合到人HER2及馬來猴 (cynomolgus monkey)HER2之親和性類似。
圖3c與3d顯示抗-HER2抗體XMT 1519與實施例16H分別結合到人HER2及馬來猴(cynomolgus monkey)HER2之結果。所計算之Kd值養在下面表IIA中。
Figure 104119613-A0202-12-0190-183
XMT 1519與實施例16H結合到人HER2及馬來猴(cynomolgus monkey)HER2之親和性類似。
實施例8：與JIMT-1細胞之抗體競爭分析
為了確認XMT 1518及XMT 1519抗體結合至重疊表位，在JIMT-1細胞上競爭結合分析法分析抗體。如實施例6所述生長JIMT-1細胞。V-底、96孔盤之每孔等分在50μl中之50,000個細胞。之後在25μl之介質中共軛到Alexa Fluor®-647之30nM抗體XMT 1519單獨加入，或與第二、未標記之抗體(XMT 1518、XMT 1519、或曲妥珠單抗(trastuzumab))(經稀釋到濃度範圍(0.05-100nM))混合、且在冰上培養3小時。之後細胞以冰冷PBS洗滌一次且再懸浮於100μl DMEM(帶有2%山羊血清及6μg/ml之山羊Alexa Fluor® 647-標記之抗-人IgG(Life Technologies,Cat.# A-21445)在冰上1小時。細胞以冰冷PBS洗滌一次且懸浮於200μl之冰冷PBS(帶有1%聚甲醛)。每細胞結合的螢光量由在MacsQuant流式細胞儀(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)對各處理跑5000個細胞測定。對各處理的中數螢光值作圖、且以GraphPad Prism由非線性迴歸使用單一位置、特定結合模式對各抗體計算解離常數KD。如圖4所示，抗體XMT 1518類似程度競爭Alexa Fluor® 647-標記之XMT 1519之結合，因未標記之XMT 1519顯示二抗體辨識在HER2上重疊之表位，而曲妥珠單抗(trastuzumab)並未與Alexa Fluor® 647-標記之XMT 1519之結合競爭。
實施例9：抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性分析
抗-HER2抗體的抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)活性可在BT474細胞量化。96孔盤每孔給入5000個細胞在DMEM介質(含10% FBS)且在37°及5% CO2中生長過夜。將抗體濃度範圍從0.001至100nM(8連續、5倍稀釋)之XMT 1518、XMT 1519、XMT 1520或曲妥珠單抗(trastuzumab)加到細胞且以生物分析套組(來自Promega(Cat.# G7018))(其使用效應子細胞設計來產生螢光素酶酵素作為ADCC活性之報告子)測量ADCC活性。在分光光度計(Molecular Devices,Spectramax M5)測量螢光素酶活性。將值(以各抗體處理之細胞樣本的螢光素酶活性與未經抗體處理之細胞樣本的螢光素酶活性之比表 示)由非線性迴歸使用促效劑對反應之對數、可變斜率、使用GraphPad Prism軟體4參數模式作圖。
圖5為顯示ADCC值的圖。XMT 1519及XMT 1520顯示類似於曲妥珠單抗(trastuzumab)之最大活性：有抗體之訊號對無抗體之訊號比對XMT 1519為30.1而對XMT 1520為29.7，而曲妥珠單抗(trastuzumab)之比為34.6。XMT 1518具有最大活性11.0。對ADCC活性之EC50(半數最大結合)值分別對XMT 1518為0.16nM，對XMT 1519為0.18nM、對XMT 1520為0.54nM、及對曲妥珠單抗(trastuzumab)為0.07nM。
實施例10：在MCF7細胞之配體依賴性HER2訊號傳遞
藉由以HER3配體，神經調節蛋白(neuregulin)-β1處理細胞之後測量磷酸化AKT之量來測定在MCF7細胞(ATCC,HTB-22)中抗-HER2抗體對配體依賴性HER2訊號傳遞的效果。在6孔培養皿各孔中300,000個MCF7細胞養在MEM介質(有0.01mg/ml牛胰島素及10% FBS)且在37°、5% CO2氛圍下生長過夜。移除介質並以含10μg/ml之測試抗體的新鮮介質取代且培養1小時，接著以40pM神經調節蛋白(neuregulin)-β 1(R&D Systems,Minneapolis,MN,Cat.# 377-HB-050)處理15分鐘。細胞以冰冷PBS洗滌一次且由加入200μl的含50mM Tris HCl、pH 7.4、150mM NaCl、1% Triton X-100、cOmplete Protease Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche, Indianapolis,IN)及PhosSTOP磷酸酶Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche,Indianapolis,IN)之緩衝液溶解。4°下15,000rpm離心溶解產物15分鐘以移除不可溶性碎片。使用Cell Signaling Technology PathScan® Phospho-Akt1(Ser473)Sandwich ELISA Kit，依照製造商之指示測定磷酸化Akt之量。
表III顯示MCF7細胞之神經調節蛋白(neuregulin)處理所誘導之AKT磷酸化的增加，在未受刺激之細胞中所測量者的百分比表示。
Figure 104119613-A0202-12-0193-184
以神經調節蛋白(neuregulin)處理增加磷酸化Akt之量五倍(522%，相對於未受刺激之細胞)。XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520導致一點點或無降低神經調節蛋白(neuregulin)所誘導之AKT磷酸化增加分別為564、441、381、及439%，類似於曲妥珠單抗(trastuzumab)所造成者(369%)。帕妥珠單抗(pertuzumab)(已顯示抑制配體依賴性訊號傳遞(Franklin et al.,Cancer Cell.2004 April 19；5：317-28))降低神經調節蛋白(neuregulin)刺激到接近未受刺激之細胞(127%)者。這些 結果建議測試抗體不會藉由抑制HER2及HER3的異二聚體化(由神經調節蛋白(neuregulin)促進且被帕妥珠單抗(pertuzumab)抑制)而作用。
實施例11：在MCF7、SKBR3、及JIMT-1細胞中配體獨立性HER2訊號傳遞
抗-HER2抗體對在MCF7(ATCC,HTB-22)、SKBR3(ATCC,HTB-30)、JIMT-1(ATCC,HTB-30)細胞中HER2訊號傳遞的影響，由測量4小時抗體處理之後磷酸化AKT之量的改變來測定。在6孔培養皿各孔中細胞養在細胞特定之介質(有10% FBS)且在37°、5% CO2氛圍下生長過夜。移除介質且以含10μg/ml之測試抗體的新鮮介質取代並培養4小時。細胞以冰冷PBS洗滌一次且加入200μl之含有50mM Tris HCl、pH 7.4、150mM NaCl、1% Triton X-100、cOmplete Protease Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche,Indianapolis,IN)及PhosSTOP磷酸酶Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche,Indianapolis,IN)的緩衝液溶解。4°下15,000rpm離心溶解產物15分鐘以移除不可溶性碎片。使用Cell Signaling Technology PathScan® Phospho-Akt1(Ser473)Sandwich ELISA Kit，依照製造商之指示測定磷酸化Akt之量。
表IV顯示在MCF7、SKBR3、及JIMT-1細胞中抑制配體獨立性HER2訊號傳遞，以AKT磷酸化量所示。結果為相對於未處理之細胞的百分比呈現。
Figure 104119613-A0202-12-0195-185
測試抗-HER2抗體導致在SKBR3細胞中強烈抑制HER2訊號傳遞，其中XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520降低磷酸化Akt之量到在未經處理之細胞中發生者的43%、59%、34%、及29%，相較於曲妥珠單抗(trastuzumab)所導致的降低到64%。
抗-HER2抗體抑制在JIMT-1細胞中之HER2訊號傳遞，如分別對XMT 1517、XMT 1518、XMT 1519及XMT 1520，磷酸化AKT降低到未經處理細胞中所發生者的66%、62%、84%、及69%所示，類似於曲妥珠單抗(trastuzumab)所導致的降低到56%。
在MCF7細胞中XMT 1518，像曲妥珠單抗(trastuzumab)，不會抑制HER2訊號傳遞，然而，XMT 1517、XMT 1519及XMT 1520導致訊號傳遞適度降低，降低AKT磷酸化到未經處理細胞中所發生者的79%、76%、及66%。
實施例12：在BT474細胞中配體獨立性HER2訊號傳遞
抗-HER2抗體對BT474細胞(ATCC,HTB-20) 中HER2訊號傳遞的效果，由4小時抗體處理之後測量磷酸化AKT之量的改變來測定。在6孔培養皿各孔中將BT474細胞(300,000個細胞)養在DMEM介質(有10% FBS)並在37°、5% CO2氛圍下生長過夜。移除介質且以含10μg/ml之測試抗體的新鮮介質取代並培養4小時。細胞以冰冷PBS洗滌一次且加入200μl之含有50mM Tris HCl、pH 7.4、150mM NaCl、1% Triton X-100、cOmplete Protease Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche,Indianapolis,IN)及PhosSTOP磷酸酶Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche,Indianapolis,IN)的緩衝液溶解。4°下15,000rpm離心溶解產物15分鐘以移除不可溶性碎片。以西方分析法測定磷酸化Akt之量。20μl之各萃取物與7μl之NUPAGE裝填染料(Life Technologies,Cat.# NP0007)及2μl之10x還原劑(Life Technologies Cat.# NP0004)混合且裝填到4-12% Bis-Tris聚丙烯醯胺膠體(Life Technologies,Cat.# NP0341)，以120伏特跑在MOPS運行緩衝液(Life Technologies Cat.# NP000102)90分鐘。以10伏特在含10%甲醇之轉移緩衝液(Life Technologies,Cat.# NP0006)中轉移分離的蛋白質到在半乾式電泳轉移系統(Bio-Rad,Transblot system)的硝化纖維素膜30分鐘。在阻擋緩衝液(Li-cor,Cat.# 927-40000)中培養膜1小時，之後以在相同阻擋緩衝液中的小鼠抗體(辨識AKT蛋白質)(Cell Signaling Technology,#2920)(經1：1000稀釋)、兔抗體(辨識在絲胺酸473磷酸化之AKT)(Cell Signaling Technology,#4060)及兔抗體(辨識肌動蛋白)(LiCor,Cat.# 926-42210)(經1：5,000稀釋)培養1小時。培養之後，以10ml TTBS洗滌膜3次，之後與二級抗體：共軛到IRdye® 800CW之山羊抗-兔IgG(Li-Cor,Cat.# 926-32211)與共軛到IRdye® 680RD之山羊抗-小鼠IgG(Li-Cor,Cat.# 926-68070)(兩者在阻擋緩衝液經1：10,000稀釋)培養1小時。再次以10ml TTBS洗滌膜3次且在Li-Cor Odyssey掃描器掃描。使用掃描器軟體量化對應AKT，磷酸-AKT(phospho-AKT)、及對應肌動蛋白之帶。各磷酸-AKT(phospho-AKT)帶以總AKT帶標準化且表示為未以任何抗-HER2抗體處理之細胞的磷酸-AKT(phospho-AKT)蛋白質之百分比。
在相同實驗中同樣檢驗抗-HER2抗體對HER3磷酸化的效果。上述硝化纖維素墨點亦以兔抗體(辨識在酪胺酸1289磷酸化之HER3)(Cell Signaling Technology,#4791)(在阻擋緩衝液中經1：1000稀釋)探測1小時。培養後，以10ml TTBS洗滌膜3次，之後與共軛到IRdye® 800CW之山羊抗-兔IgG(Li-Cor,Cat.# 926-32211)(在阻擋緩衝液經1：10,000稀釋)培養1小時。再次以10ml TTBS洗滌膜3次且在Li-Cor Odyssey掃描器掃描。使用掃描器軟體量化對應磷酸-HER3(phospho-HER3)及對應肌動蛋白之帶。各磷酸-HER3(phospho-HER3)帶以總AKT帶標準化且表示為未以任何抗-HER2抗體處理之細胞的磷酸-HER3(phospho-HER3)蛋白質之百分比。
表V給出在BT474細胞中配體獨立性HER2訊號傳遞之抑制，由AKT磷酸化或Her3磷酸化之量所測定。結果為相對於未受刺激之細胞的百分比呈現。
Figure 104119613-A0202-12-0198-186
抗-HER2抗體XMT 1519降低AKT磷酸化至在BT474未經處理之細胞中所見者的約21%及HT19B至在BT474未經處理之細胞中所見者的約30%，相較於曲妥珠單抗(trastuzumab)導致降低至未經處理之細胞的約31%、及帕妥珠單抗(pertuzumab)導致降低至未經處理之細胞的約44%。HER3磷酸化適度地受到所有抗體影響：由XMT 1519、XMT 1520、曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab)分別為未經處理之細胞中所見者的71%、76%、80%、及85%。
實施例13：內化速率測量
各抗體XMT 1518、XMT 1519、XMT 1520及曲妥珠單抗(trastuzumab)從SKBR3細胞之細胞表面內化之速率由96孔為主之分析中之螢光測定。SKBR3細胞種在96孔盤且藉由在37°、5% CO2下過夜生長在DMEM介質(ATCC,Manassas,VA,Cat.# 30-2002)(有10%胎牛血清 (FBS)(Gibco®,Life Technologies,Grand Island,NY,Cat.# 16140-071))而使之貼附。細胞培養在含10μg/ml抗體之介質在冰上1小時，之後以冰冷介質洗滌且在冰上與75μl之介質(含1μg/ml之共軛到Alexa Fluor®-647的山羊抗-人IgG單價Fab片段(Rockland Immunochemicals,Gilbertsville,PA,Cat.# 809-1102))培養1小時。洗滌之後，細胞轉移到37°培養箱以允許各種時間點的內化。在Odyssey掃描器(Li-Cor Biosciences,Lincoln,NE)使用700nm通道掃描盤。之後，藉由在冰上與100mM甘胺酸、20mM MgSO4、50mM KCl、pH 2.2培養而酸洗盤，以移出結合到細胞表面之抗體，以冰冷PBS洗滌且再次掃描以測定被細胞內化之螢光量。圖6顯示4小時期間抗體內化速率。所有抗體內化速率為幾乎與曲妥珠單抗(trastuzumab)相同，全部具有在時間0結合4小時內化的總表面之約50%(圖6)。
實施例13A：在SKBR3細胞HER2內化
由螢光顯微鏡探究抗-HER2抗體之組合對SKBR3細胞中HER2內化的影響。曲妥珠單抗(trastuzumab)與Alexa Fluor-647共軛且用於顯現曲妥珠單抗(trastuzumab)的位置及推測在細胞中之HER2。SKBR3細胞種在4個室顯微鏡載玻片且藉由在37°、5% CO2下過夜生長在DMEM介質(ATCC,Manassas,VA,Cat.# 30-2002)(有10%胎牛血清(FBS)(Gibco®,Life Technologies, Grand Island,NY,Cat.# 16140-071))使之貼附。在含有(i)曲妥珠單抗(trastuzumab)-Alexa-647及帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合或(ii)曲妥珠單抗(trastuzumab)-Alexa-647與帕妥珠單抗(pertuzumab)與HER2抗體XMT 1519之組合的介質培養SKRB3細胞90分鐘。使用螢光顯微鏡顯現曲妥珠單抗(trastuzumab)之位置。如圖7所示，大部分的組合單獨帕妥珠單抗(pertuzumab)之曲妥珠單抗(trastuzumab)-Alexa Fluor-627以細胞罩橘(cell mask orange)共定位，顯示細胞膜定位，大部分的組合帕妥珠單抗(pertuzumab)及XMT 1519兩者之曲妥珠單抗(trastuzumab)-Alexa Fluor-647以Lysotracker共定位，顯示溶體定位。此結果顯示存在組合曲妥珠單抗(trastuzumab)與帕妥珠單抗(pertuzumab)之XMT 1519促進HER2到溶體之內化與通行(trafficking)。
實施例13B：抗-HER2抗體組合之內化速率測量
組合多抗-HER2抗體(辨識在HER2內化速率上不同的表位)的效果以96孔盤為主之分析測定，類似於述於實施例13者。在此實驗中，以測試HER2抗體單獨、組合曲妥珠單抗(trastuzumab)或組合曲妥珠單抗(trastuzumab)與帕妥珠單抗(pertuzumab)來處理細胞，且測量在各種時間內化之抗-HER2抗體量。
對於分析，在三個96孔盤(有清楚底壁之黑色盤)各孔中將40,000個SKBR3細胞養在DMEM介質(含 10% FBS)且在37°、5% CO2下使之貼附過夜。隔天，以抗體如下處理細胞。以新鮮、冰冷介質(含5μg/ml之測試HER2抗體之一，或曲妥珠單抗(trastuzumab))取代各孔中之介質、且在冰上培養1小時。以冰冷介質洗滌細胞二次來移除未結合之抗體。用於偵測，將5μg/ml之Alexa 647標記之抗-人IgG Fab片段加到冰冷介質的各孔且在冰上培養1小時。以冰冷介質洗滌各孔2次來移除未結合之二級抗體。接著，將含5μg/ml曲妥珠單抗(trastuzumab)、5μg/ml的曲妥珠單抗(trastuzumab)與帕妥珠單抗(pertuzumab)各者或無額外抗體之介質加到各孔。一式三次進行各處理。一組壁以Alexa 647標記之抗-人IgG單價Fab片段單獨處理，且這些壁測得的螢光係用來減去背景螢光。
對各處理留一盤在冰上來測定時間0值，而其他盤在37℃培養。1.5小時之後，37℃之一盤與時間0盤以冰冷PBS洗滌2次且使用680nm通道之Licor Odyssey掃描器掃描。各孔中所測螢光用作為各處理的總螢光。之後以100mM甘胺酸、50mM KCl、及20mM MgSO4、pH2.2酸洗滌細胞2次，之後以冰冷PBS洗滌2次以移出表面結合之抗體。再次掃描盤來測定各孔中內化之螢光量。隔天相同方法分析24小時盤。
各HER2抗體(或在控制組壁中的曲妥珠單抗(trastuzumab))內化的百分比由減去背景、平均各者的三重複、之後各處理的內化螢光除以總螢光並乘以100來計 算。
如表VA所示，當與曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab)兩者組合時，80-90%之XMT 1518、XMT 1519、及XMT 1520在1.5小時被內化。XMT 1517顯示60%內化，可能因為其非常高的離速率(off rate)，導致在培養期間從細胞擴散開。當與曲妥珠單抗(trastuzumab)組合時，20-40%的各測試抗體在1.5小時內經內化，而當各測試抗體單獨存在時，則約15%經內化。曲妥珠單抗(trastuzumab)單獨在1.5小時顯示約15%內化，而當其與帕妥珠單抗(pertuzumab)組合時，則約30%。
因此，三HER2抗體的組合；測試HER2抗體、曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab)之任一，增加抗體內化速率，最有可能是藉由增加HER2胞飲作用速率。
Figure 104119613-A0202-12-0202-187
Figure 104119613-A0202-12-0203-188
實施例14：HER2降解
抗-HER2抗體對SKBR3細胞中HER2降解的效果在以抗體處理後由西方分析測定。在6孔培養皿各孔中，300,000個SKBR3細胞養在DMEM介質(有10% FBS)並在37°、5% CO2氛圍下生長過夜。移除介質且以新鮮介質(含10μg/ml之各抗體)取代並培養4小時。細胞以冰冷PBS洗滌一次且加入200μl之含有50mM Tris HCl、pH 7.4、150mM NaCl、1% Triton X-100、cOmplete Protease Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche,Indianapolis,IN)及PhosSTOP磷酸酶Inhibitor雞尾酒錠劑(Roche,Indianapolis,IN)的緩衝液溶解。4°下15,000rpm離心溶解產物15分鐘以移除不可溶性碎片。20μl之各萃取物與7μl之NUPAGE裝填染料(Life Technologies,Cat.# NP0007)及2μl之10x還原劑(Life Technologies Cat.# NP0004)混合並裝填到4-12%Bis-Tris聚丙烯醯胺膠體(Life Technologies,Cat.# NP0341)，其以120伏特在MOPS運行緩衝液(Life Technologies Cat.# NP000102)中跑90分鐘。以10伏特在含10%甲醇之轉移緩衝液(Life Technologies,Cat.# NP0006)轉移分離的蛋白質到在半乾 式電泳轉移系統(Bio-Rad,Transblot system)之硝化纖維素膜30分鐘。在阻擋緩衝液(Li-cor,Cat.# 927-40000)中培養膜1小時，之後以在相同阻擋緩衝液之兔抗體(辨識HER2蛋白質(Cell Signaling Technology,Cat.# 2165)，經1：1,000稀釋)、及兔抗體(辨識肌動蛋白(LiCor,Cat.# 926-42210)，經1：5,000稀釋)培養1小時。培養後，以10ml TTBS洗滌膜3次，之後以在阻擋緩衝液中之二級抗體：共軛到IRdye® 800CW之山羊抗-兔IgG(Li-Cor,Cat.# 926-32211)及共軛到IRdye® 680RD(Li-Cor,Cat.# 926-68070)之山羊抗-小鼠IgG(兩者經1：10,000稀釋)培養1小時。再次以10ml TTBS洗滌膜3次且在Li-Cor Odyssey掃描器掃描。使用掃描器軟體量化對應全長HER2蛋白質及對應肌動蛋白的帶。各HER2帶經以肌動蛋白帶標準化且表示為未以任何抗-HER2抗體處理之細胞的HER2蛋白質之百分比。
圖8顯示以測試抗體單獨或組合曲妥珠單抗(trastuzumab)處理的SKBR3細胞對HER2量具有少或無影響，例外為XMT 1518及XMT 1520導致全長HER2分別減少到78及68%，且導致出現較低分子量降解產物。然而，曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)及測試HER2抗體之一的三重組合導致大量HER2降解，以及出現HER2降解產物。當XMT 1518、或XMT 1520與曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab)組合時見到最大量減少，20%、或31% HER剩餘。當抗體 XMT 1517或XMT 1519與曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab)組合時，減少分別為HER2正常量之40%或42%剩餘。
實施例15：表位繪圖
由Integral Molecular Inc.,3711 Market Street,Suite 900,Philadelphia,Pa.,USA使用其Shotgun Mutagenesis Technology進行抗體XMT 1517及XMT 1519之表位繪圖。Shotgun Mutagenesis使用特有的高生產量(throughput)細胞表現技術，使得表現及分析大庫的突變目標蛋白質在真核細胞中。蛋白質中每一殘基經個別突變，通常對多個其他胺基酸，以分析功能改變。蛋白質表現在標準哺乳動物細胞株中，因此即使是需要真核轉譯或轉譯後修飾的困難蛋白質可被繪圖。
Shotgun Mutagenesis Mapping辨識到對XMT 1517結合的6個重要胺基酸(C453、H473、N476、R495、H497、及W499)，顯示XMT 1517結合至HER2之域III的C-終端與域IV的N-終端上的區域。在H456及G496之二個次重要突變亦可涉及XMT 1517結合到HER2。
辨識到對XMT1519結合的三個重要胺基酸(E521、L525及R530)，顯示XMT 1519結合Her2之域IV的N-終端上之區域。
實施例16：HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))之合成
Figure 104119613-A0202-12-0206-189
使用述於US序號14/512,316(2014年10月10日申請)之程序製備HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物。表VI給出抗體-聚合物藥物共軛物之細節。
Figure 104119613-A0202-12-0207-190
HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物具有峰分子量為約170kDa至約230kDa。所合成/測量之聚合物及聚合物共軛物典型地具有多分散性
Figure 104119613-A0202-12-0207-283
1.5。聚合物-藥物共軛物(即連結到抗體之藥物-承載聚合物鏈)包含約27% mol至約33% molβ-丙胺酸，約6.4% mol至約9.6% mol AF-HPA-Ala及約1.5% mol至約4% mol EG2-MI。
實施例17：合成利妥昔單抗(Rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))
Figure 104119613-A0202-12-0208-191
使用述於US序號14/512,316(2014年10月10日申請)的程序製備利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物(非結合控制組)。表VII給出抗體-聚合物藥物共軛物的細節。
Figure 104119613-A0202-12-0208-192
HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物具有峰分子量為約170kDa至約230kDa。所 合成/測量之聚合物及聚合物共軛物典型地具有多分散性
Figure 104119613-A0202-12-0209-282
1.5。聚合物-藥物共軛物(即連結到抗體之藥物-承載之聚合物鏈)包含約27% mol至約33% mol β-丙胺酸、約6.4% mol至約9.6% mol AF-HPA-Ala及約1.5% mol至約4% mol EG2-MI。
實施例18：HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物之細胞毒性分析
使用Cell Titer-Glo(Promega Corp)評估HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物在活體外腫瘤細胞株中的抗增殖特性。JIMT-1(HER2中度表現細胞，DSMZ，Braunschweig，Germany，Cat.# ACC589)、MDA-MB-361(HER2介質表現人乳癌細胞，ATCC，Cat.# HTB-27)、MDA-MB-453細胞(三陰性乳癌細胞株，ATCC，Cat.# HTB-131)，培養在有10% FBS(Gibco®，Life Technologies，Grand Island，NY，Cat.# 16140-071)之DMEM介質(ATCC，Manassas，VA，Cat.# 30-2002)。NCI-H522(非小細胞肺癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-5810)、及NCI-H2170(非小細胞肺癌細胞株，ATCC，Cat.# CRL-5928)細胞培養在RPMI-1640介質(ATCC，Cat.# 30-2001)。NCI-H1581(非小細胞肺癌中度表現細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-5878)細胞培養在DMEM：F12介質(ATCC，Cat.# 30-2006)。SNU5(胃癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-5973)培 養在有20% FBS之Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(Invitrogen Life Technologies，Cat.# 12440053)。OVCAR3(卵巢腺癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# HTB-161)培養在有20% FBS之RPMI介質。MDA-MB-175-VII(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# HTB-25)培養在有20% FBS之Leibovitz's L-15 Medium。CAMA-1(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# HTB-21)培養在90% ATCC-調配之Eagle's Minimum Essential Medium。ZR75-1(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-1500)培養在RPMI-1640 Medium。HCC1187(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-2322)培養在RPMI-1640 Medium。HCC38(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-2314)培養在RPMI-1640 Medium。T47D(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# HTB-133)培養在RPMI-1640 Medium。HCC70(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-2315)培養在RPMI-1640 Medium。MDA-MB-231(人乳癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# HTB-26)培養在DMEM Medium。CALU3(人肺腺癌細胞株，ATCC，Cat.# HTB-55)培養在ATCC-調配之Eagle's Minimum Essential Medium。A549(人肺癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CCL-185)培養在F12K Medium。NCI-H2122(人肺腺癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-5985)培養在RPMI-1640 Medium，(ATCC，Cat.# 30-2001)。NCI-H460(人肺癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# HTB-177)培養在RPMI- 1640 Medium，(ATCC，Cat.# 30-2001)。SHP-77(人小細胞肺癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-2195)培養在RPMI-1640 Medium，(ATCC，Cat.# 30-2001)。KATO III(人胃癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# HTB-103)培養在有20% FBS之Iscove's Modified Dulbecco's Medium。MKN-45 III(人胃腺癌細胞株，未放大，DSMZ，Braunschweig，Germany，Cat.# ACC409)培養在RPMI-1640 Medium，(ATCC，Cat.# 30-2001)。SKOV3(人卵巢腺癌細胞株ATCC，Cat.# HTB-77)培養在McCoy's 5a Medium。TOV-21G(人卵巢腺癌細胞株，未放大，ATCC，Cat.# CRL-11730培養在MCDB 105介質(含最終濃度為1.5g/L重碳酸鈉)及Medium 199(含最終濃度為2.2g/L重碳酸鈉)之1：1混合物。BT474(HER2高表現人乳癌細胞，ATCC，Cat.# HTB-20)培養在有10% FBS之DMEM Medium。NCI-N87(高HER2表現胃癌細胞株，ATCC，Cat.# CRL-5822)長在10% FBS之RPMI-1640 Medium。
針對細胞毒性分析，細胞以密度為96孔盤中每孔3000個細胞種入且在37℃、5% CO2存在下過夜培養期間使之貼附。之後以新鮮介質(含一範圍之HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物(100nM至0.1pM)、或賀癌寧(Kadcyla)(Genentech))取代介質且在37°、5% CO2存在下培養細胞72小時或6天。使用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega,Madison,WI)如述於套組指示，測量細胞存活。細胞生存力以未處理之控制組標準化且表示為百分比。繪圖值且以Graphpad Prism軟體(San Diego,CA)使用4參數、可變斜率、劑量反應曲線擬合演算法計算IC50值。表VIII給出HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物及賀癌寧(Kadcyla)之細胞毒性的說明結果。
Figure 104119613-A0202-12-0213-193
如表VIII所示，在所有測試細胞株中，所有HER2抗體-聚合物-藥物共軛物比賀癌寧(Kadcyla)更有效力。
實施例19：在有突變之HER2的細胞株中，HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物的細胞毒性分析。
使用Cell Titer-Glo(Promega Corp)評估HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物在活體外腫瘤細胞株之抗增殖特性。NCI-H1781(HER2突變表現人肺癌細胞，ATCC，Cat.# CRL-5894)培養在含10% FBS之RPMI-1640介質。
針對細胞毒性分析，細胞以密度為96孔盤中每孔3000個細胞種入，且在37℃、5% CO2存在下過夜培養期間使之貼附。之後以新鮮介質(含一範圍之HER2-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物(100nM to 0.1pM)、實施例17A(利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))、或賀癌寧(Kadcyla)(Genentech))取代介質，並在37℃、5% CO2存在下培養細胞72小時。使用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(Promega,Madison,WI)如述於套組指示測量細胞存活。細胞生存力以未處理之控制組標準化且表示為百分比。繪圖值且以Graphpad Prism軟體(San Diego,CA)使用4參數、可變斜率、劑量反應曲線擬合演 算法計算IC50值。表IX給出這些分析的結果。
Figure 104119613-A0202-12-0215-194
如表IX所示，在測試細胞株中，所有HER2抗體-聚合物-藥物共軛物比利妥昔單抗(rituximab)抗體-聚合物-藥物共軛物或賀癌寧(Kadcyla)更有效力。
實施例20. 投予PBRM-聚合物-藥物共軛物之腫瘤生長反應
雌CB-17 SCID小鼠以NCI-N87細胞(對各組n=10)、JIMT-1細胞(對各組n=10)、SNU-5細胞(對各組n=10)、H522細胞(對各組n=10)、SKOV3細胞(對各組n=10)、Calu-3細胞(對各組n=10)、NCI-N87賀癌寧(Kadcyla)抗性細胞(對各組n=10)、NCI-N87-MSA賀癌寧(Kadcyla)抗性細胞(對各組n=10)或BT474腫瘤片段(對各組n=10)皮下接種。雌NCr nu/nu以TOV-21G細胞(對各組n=10)皮下接種。測試化合物或媒劑以IV給藥作為第1天的單一劑量或如所示者。使用數位卡尺在圖8至18所示的時間測量腫瘤尺寸。計算腫瘤體積且用於測定腫瘤生 長延遲。當腫瘤達到800至1500mm3尺寸時犧牲小鼠。報告腫瘤體積為對各組平均值±SEM。
圖9係提供在IV投予媒劑；實施例16A，曲妥珠單抗(trastuzumab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67mg/kg；或實施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67mg/kg作為第1天的單一劑量之後，經皮下接種NCI-N87細胞之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。媒劑及曲妥珠單抗(trastuzumab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))顯示增加腫瘤體積。基於第29天腫瘤生長抑制分析，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))顯示60%部分退化且導致潛在治療活性(TGI 88%)。
圖10係提供在IV投予媒劑；賀癌寧(Kadcyla)，20mg/kg；實施例16A，曲妥珠單抗(trastuzumab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67mg/kg；或實施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67mg/kg作為第1天的單一劑量之後，經皮下接種JIMT-1細胞之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。媒劑及賀癌寧(Kadcyla)顯示增加腫瘤體積。曲妥珠單抗(trastuzumab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))及XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物顯示治療潛力且分別具有40%與70%退化。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))具有5個部分退化及2個完全退化，其在 研究尾聲第69天維持無腫瘤之存活者。
圖11係提供在IV投予媒劑；賀癌寧(Kadcyla)，10mg/kg作為第1天的單一劑量；10mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)與15mg/kg之帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合每週給藥達3週；或實施例16D，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67mg/kg作為第1天的單一劑量之後，經JIMT-1細胞皮下接種之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。媒劑、賀癌寧(Kadcyla)及賀癌寧(Kadcyla)與帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合全部顯示增加腫瘤體積。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物顯示60%部分退化且為最有效。
圖12係提供結果經皮下接種之小鼠中的腫瘤反應NCI-N87細胞(對各組n=10)在IV投予媒劑之後；實施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67mg/kg作為第1天的單一劑量；15mg/kg之曲妥珠單抗(trastuzumab)與15mg/kg之帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合每週給藥達3週(即在第1、8、及15天)；或15mg/kg之曲妥珠單抗(trastuzumab)與15mg/kg之帕妥珠單抗(pertuzumab)各每週給藥達3週(即在第1、8、及15天)連同實施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))，0.67mg/kg作為第1天的單一劑量之三重組合。媒劑顯示增加腫瘤體積。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))單獨或組合全部顯示減少腫瘤，而曲妥珠單抗(trastuzumab)；帕妥 珠單抗(pertuzumab)及實施例16F之三重組合為最有效且導致100%部分退化，而實施例16F單獨或曲妥珠單抗(trastuzumab)與帕妥珠單抗(pertuzumab)之組合各造成10個中的一者部分反應。相較於實施例16F單一療法或曲妥珠單抗(trastuzumab)+帕妥珠單抗(pertuzumab)兩個一組，三個一組者具有數值較高速率的部分反應，且導致顯著較大的腫瘤體積減少(p<.05，Mann-Whitney測試)。部分反應被定義為退化到少於基準線腫瘤體積之50%持續至少3個連續腫瘤測量。
XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))組合帕妥珠單抗(pertuzumab)與曲妥珠單抗(trastuzumab)之總存活優勢顯著差異於XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))單獨投予(P<0.011，對數等級檢定)且優於帕妥珠單抗(pertuzumab)與曲妥珠單抗(trastuzumab)之組合(P<0.273，對數等級檢定)或XMT-1519抗體、帕妥珠單抗(pertuzumab)與曲妥珠單抗(trastuzumab)之三重組合(P<0.05，對數等級檢定)所達到的結果。
圖13係提供在IV投予媒劑；10mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)作為單一劑量；實施例16E，5mg/kg、2mg/kg或0.67mg/kg之XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為單一劑量；或實施例17B，5mg/kg之利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為第1天的單一劑量之後，經SNU- 5細胞皮下接種之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。在第18天，媒劑顯示增加腫瘤體積。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物顯示腫瘤減少且比賀癌寧(Kadcyla)或利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))更有效且在5mg/kg與2mg/kg劑量導致100%無腫瘤之存活者而在0.67mg/kg劑量導致90%無腫瘤之存活者。
圖14係提供在IV投予媒劑；10mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)作為單一劑量；5mg/kg或2mg/kg之實施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為第1天的單一劑量之後，經TOV-21G細胞皮下接種之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物顯示腫瘤延滯且比賀癌寧(Kadcyla)(未達到治療活性門檻)更有效。
圖15係提供在IV投予媒劑；10mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)作為單一劑量；5mg/kg之實施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為單一劑量；或5mg/kg之實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為第1天的單一劑量之後，經H522細胞皮下接種之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物顯示腫瘤延滯且比賀癌寧(Kadcyla)及利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))(未達到治療活性門檻)更有效。
圖16係提供在IV投予媒劑；10mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)作為單一劑量；5mg/kg之實施例16E，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為單一劑量；或5mg/kg之實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為第1天的單一劑量之後，經SKOV3細胞皮下接種之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。XMT1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))導致100%退化(由10個完全反應組成)且比賀癌寧(Kadcyla)或利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)(未達到治療活性門檻)更有效。
圖17係提供在IV投予媒劑；或5mg/kg之實施例16F，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala))作為第1天的單一劑量之後，經Calu-3細胞皮下接種之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))導致100%退化反應(由2個部分反應與8個完全反應所組成)，其中6個在第60天維持無腫瘤。
圖18係提供在IV投予媒劑；10mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)作為單一劑量；3mg/kg之實施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為單一劑量或在第一天3mg/kg之實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))之 後，患者衍生之異種移植模式BRE-0333 HER2 1+中的腫瘤反應結果(對各組n=8)。XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物顯示腫瘤延滯且比賀癌寧(Kadcyla)或利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))更有效。
圖19係提供在IV投予媒劑；10mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)作為單一劑量；1或3mg/kg之實施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))或3mg/kg之實施例17B，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為第1天的單一劑量之後，患者衍生之異種移植模式MAXF_1162 HER2 3+中之腫瘤反應結果(對各組n=10)。1及3mg/kg之XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))兩者導致100%退化反應及無腫瘤之存活者且比賀癌寧(Kadcyla)或3mg/kg之利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))更有效。
圖20係提供在IV投予媒劑；5mg/kg之賀癌寧(Kadcyla)作為單一劑量；5mg/kg或2mg/kg之實施例16H，XMT 1519-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為第1天的單一劑量；5mg/kg之實施例17C，利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))作為第1天的單一劑量或5mg/kg之XMT 1519作為單一劑量之後，經BT474腫瘤片段皮下接種之小鼠中的腫瘤反應結果(對各組n=10)。XMT 1519-(EG2-MI-(10 kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物顯示完全腫瘤退化且比賀癌寧(Kadcyla)、利妥昔單抗(rituximab)-(EG2-MI-(10kDa PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))或XMT-1519更有效。
單一劑量之1mg/kg或0.67mg/kg的XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物在低HER2-表現乳癌及胃癌模式顯示完全退化，其中ado-曲妥珠單抗艾得辛(賀癌寧(Kadcyla))在劑量10mg/kg及更高為無活性。在HER2-驅動的腫瘤模式中，XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物組合廣為使用的抗-HER2療法曲妥珠單抗(trastuzumab)與帕妥珠單抗(pertuzumab)顯示協同功效。XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物證實優異的藥物動力概況且以治療劑量在非人靈長類動物中為良好耐受。
臨床前數據顯示XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala)))共軛物具有潛力大幅地擴大可受惠於HER2-標靶療法的患者數目。共軛物係提供在癌症(其中有少至10,000個HER2受體，其中其他療法無活性)中有效的藥物遞送。
其他實施態樣
會同其實施方式已描述本發明，上述描述意為說明且並非限制本發明之範疇，其係由隨附之申請專利範圍的範疇所定義。其他態樣、優點與修飾係落入下述申請專利範圍之範疇中。
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<400> 1
Figure 104119613-A0305-02-0225-1
Figure 104119613-A0305-02-0226-2
Figure 104119613-A0202-12-0225-197
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 2
Figure 104119613-A0202-12-0225-198
Figure 104119613-A0202-12-0226-199
<210> 3
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 3
Figure 104119613-A0202-12-0227-200
Figure 104119613-A0202-12-0228-201
Figure 104119613-A0202-12-0229-202
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 4
Figure 104119613-A0202-12-0229-203
Figure 104119613-A0202-12-0230-204
<210> 5
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 5
Figure 104119613-A0202-12-0230-205
Figure 104119613-A0202-12-0231-206
Figure 104119613-A0202-12-0232-207
<210> 6
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 6
Figure 104119613-A0202-12-0232-208
Figure 104119613-A0202-12-0233-209
<210> 7
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 7
Figure 104119613-A0202-12-0234-210
Figure 104119613-A0202-12-0235-211
Figure 104119613-A0202-12-0236-212
<210> 8
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 8
Figure 104119613-A0202-12-0236-213
Figure 104119613-A0202-12-0237-214
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 9
Figure 104119613-A0202-12-0237-215
Figure 104119613-A0202-12-0238-216
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 10
Figure 104119613-A0202-12-0238-217
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 11
Figure 104119613-A0202-12-0238-218
Figure 104119613-A0202-12-0239-219
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 12
Figure 104119613-A0202-12-0239-220
Figure 104119613-A0202-12-0240-221
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 13
Figure 104119613-A0202-12-0240-222
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 14
Figure 104119613-A0202-12-0241-224
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 15
Figure 104119613-A0202-12-0241-223
Figure 104119613-A0202-12-0242-225
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 16
Figure 104119613-A0202-12-0242-226
Figure 104119613-A0202-12-0243-227
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 17
Figure 104119613-A0202-12-0243-228
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 18
Figure 104119613-A0202-12-0243-229
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 19
Figure 104119613-A0202-12-0243-230
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 20
Figure 104119613-A0202-12-0244-234
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 21
Figure 104119613-A0202-12-0244-233
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 22
Figure 104119613-A0202-12-0244-232
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 23
Figure 104119613-A0202-12-0244-231
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 24
Figure 104119613-A0202-12-0245-235
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 25
Figure 104119613-A0202-12-0245-236
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 26
Figure 104119613-A0202-12-0245-237
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 27
Figure 104119613-A0202-12-0246-242
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 28
Figure 104119613-A0202-12-0246-240
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 29
Figure 104119613-A0202-12-0246-239
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 30
Figure 104119613-A0202-12-0246-238
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡胜肽
<400> 31
Figure 104119613-A0202-12-0247-244
<210> 32
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Figure 104119613-A0202-12-0247-243
Figure 104119613-A0202-12-0248-245
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Figure 104119613-A0202-12-0249-246
<210> 34
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 34
Figure 104119613-A0202-12-0249-247
<210> 35
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 35
Figure 104119613-A0202-12-0250-252
<210> 36
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 36
Figure 104119613-A0202-12-0250-250
<210> 37
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 37
Figure 104119613-A0202-12-0250-249
Figure 104119613-A0202-12-0251-253
<210> 38
<211> 1255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Figure 104119613-A0202-12-0251-254
Figure 104119613-A0202-12-0252-255
Figure 104119613-A0202-12-0253-256
Figure 104119613-A0202-12-0254-257
Figure 104119613-A0202-12-0255-258
Figure 104119613-A0202-12-0256-259
Figure 104119613-A0202-12-0257-260
<210> 39
<211> 630
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Figure 104119613-A0202-12-0257-261
Figure 104119613-A0202-12-0258-262
Figure 104119613-A0202-12-0259-263
Figure 104119613-A0202-12-0260-264
<210> 40
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 40
Figure 104119613-A0202-12-0260-266
Figure 104119613-A0202-12-0261-267
<210> 41
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 41
Figure 104119613-A0202-12-0261-268
Figure 104119613-A0202-12-0262-269
Figure 104119613-A0202-12-0263-270
<210> 42
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 42
Figure 104119613-A0202-12-0263-271
Figure 104119613-A0202-12-0264-272
<210> 43
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 43
Figure 104119613-A0202-12-0265-273
Figure 104119613-A0202-12-0266-274
Figure 104119613-A0202-12-0267-275
<210> 44
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 44
Figure 104119613-A0202-12-0267-276
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 45
Figure 104119613-A0202-12-0268-277
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 46
Figure 104119613-A0202-12-0268-278
Figure 104119613-A0202-12-0269-279
<210> 47
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多胜肽
<400> 47
Figure 104119613-A0202-12-0269-280

Claims (24)

  1. 一種專一性結合至人HER2受體的表位(epitope)之經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段，其中該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段結合至少部分人HER2受體域IV之N端，但不與結合至人HER2受體表位4D5的抗體交叉競爭、及其中該人化或全人抗體或其抗原結合片段專一性結合至人HER2受體之表位，該表位包括該人HER2受體胞外域之胺基酸殘基452至531，其中該抗體或其抗原結合片段包括可變重鏈互補性決定區1(CDRH1)，其包括胺基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO：25)；可變重鏈互補性決定區2(CDRH2)，其包括胺基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；可變重鏈互補性決定區3(CDRH3)，其包括胺基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO：27)；可變輕鏈互補性決定區1(CDRL1)，其包括胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；可變輕鏈互補性決定區2(CDRL2)，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及可變輕鏈互補性決定區3(CDRL3)，其包括胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)。
  2. 如申請專利範圍第1項之經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的可變輕鏈，且其中該抗體或其抗原結合片段以放射配體結合分析測量展現對人HER2受 體少於100nM之Kd；或其中該抗體或其抗原結合片段包括包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體或其抗原結合片段以放射配體結合分析測量展現對人HER2受體少於100nM之Kd。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括CDRH1，其包括胺基酸序列FTFSSYGMH(SEQ ID NO：17)；CDRH2，其包括胺基酸序列VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：18)；CDRH3，其包括胺基酸序列EAPYYAKDYMDV(SEQ ID NO：19)；CDRL1，其包括胺基酸序列RASQSVSSDYLA(SEQ ID NO：20)；CDRL2，其包括胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及CDRL3，其包括胺基酸序列QQYVSYWT(SEQ ID NO：22)，或其中該抗體或其抗原結合片段包括包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的可變輕鏈，且其中該抗體或其抗原結合片段以放射配體結合分析測量展現對人HER2受體少於100nM之Kd，或其中該抗體或其抗原結合片段包括包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體或其抗原結合片段以放射配體結合分析測量展現對人HER2受體少於100nM之Kd。
  4. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之經單離之人 化或全人抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為單株抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈可變片段(scFv)、scFv-Fc片段、單鏈抗體(scAb)、域抗體(dAb)、單域重鏈抗體、或單域輕鏈抗體，或其中該抗體或其抗原結合片段為IgG同型，或其中該抗體或其抗原結合片段為IgG1同型。
  5. 一種經單離之核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至4項中任一項之經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段。
  6. 一種載體，其包括如申請專利範圍第5項之經單離之核酸分子。
  7. 一種生產經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段的方法，藉由將細胞培養在導致表現該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段的條件下，其中該細胞包括如申請專利範圍第6項之載體。
  8. 一種共軛物，其包括如申請專利範圍第1至4項中任一項之經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段及一或多治療或診斷劑(D)，其中各者獨立地直接或間接連接到該抗體或其抗原結合片段。
  9. 如申請專利範圍第8項之共軛物，進一步包括連接兩者到該抗體或其抗原結合片段之一或多聚合物支架，其中經由該一或多聚合物支架，該一或多個D各者獨立地連接到該抗體或其抗原結合片段。
  10. 如申請專利範圍第9項之共軛物，其中該一或多聚 合物支架各者獨立地包括聚(1-羥基甲基伸乙基羥基甲基-甲醛)(poly(1-hydroxymethylethylene hydroxymethyl-formal))(PHF)具有分子量範圍2kDa至40kDa，其中該一或多聚合物支架各者獨立地為式(Ic)：
    Figure 104119613-A0305-02-0275-3
     其中：LD1為含羰基之部分；
    Figure 104119613-A0305-02-0275-4
    中
    Figure 104119613-A0305-02-0275-5
    的各次出現獨立地為包含生物可降解鍵之第一連接子，使得當該鍵斷裂時，D以活性形式釋出達其所欲治療效果；以及
    Figure 104119613-A0305-02-0275-6
    中介於LD1與D之
    Figure 104119613-A0305-02-0275-7
    表示D與LD1的直接或間接連結；
    Figure 104119613-A0305-02-0275-8
    的各次出現獨立地為尚未連接到該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段的第二連接子，其中LP2為含官能基之部分，其還與該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段之官能基形成共價鍵，以及介於LD1與LP2之間的該
    Figure 104119613-A0305-02-0275-9
    表示LP2與LD1的直接或間接連結，及該第二連接子的各次出現不同於該第一連接子的各 次出現；
    Figure 104119613-A0305-02-0276-10
    的各次出現獨立地為連接各D-承載聚合物支架到該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段的第三連接子，其中連結到LP2之該端
    Figure 104119613-A0305-02-0276-11
    表示一旦在LP2之官能基與該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段之官能基之間形成共價鍵，直接或間接連結LP2至該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段；以及該第三連接子的各次出現不同於該第一連接子的各次出現；m為1至300的整數，m1為1至140的整數，m2為1至40的整數，m3為0至18的整數，m4為1至10的整數；m、m1、m2、m3、及m4之總和範圍為15至300；以及連接到該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段之LP2的總數為10或更少。
  11. 如申請專利範圍第10項之共軛物，其中m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為15至150、m1為1至70的整數、m2為1至20的整數、m3為0至10的整數、且PHF具有範圍2kDa至20kDa之分子量，或其中m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為20至110、m1為2至50的整數、m2為2至15的整數、m3為0至8的整數；以及PHF具有分子量範圍3kDa至15 kDa，或其中m、m1、m2、m3及m4之總和範圍為40至75、m1為2至35的整數、m2為2至10的整數、m3為0至5的整數；以及PHF具有分子量範圍5kDa至10kDa，或其中LP2之該官能基係選自-SRp、-S-S-LG、
    Figure 104119613-A0305-02-0277-12
    、及鹵基，其中LG為離去基，Rp為H或硫保護基，及Xa與Xb之一者為H而另一個為水溶性馬來醯亞胺基(maleimido)阻擋部分，或Xa及Xb與其所連結之碳原子一起形成碳-碳雙鍵。 或其中LD1包括-X-(CH2)v-C(=O)-，帶有直接連接到
    Figure 104119613-A0305-02-0277-14
    之羰基的X，其中X為CH2、O、或NH、及v為1至6的整數，或其中
    Figure 104119613-A0305-02-0277-15
    的各次出現獨立地為-C(=O)-X-(CH2)v-C(=O)-NH-(CH2)u-NHC(=O)-(CH2)w-(OCH2)x-NHC(=O)-(CH2)y-M，其中X為CH2、O、或NH，v、u、w、x及y各者獨立地為1至6的整數、及M為
    Figure 104119613-A0305-02-0277-13
    ，其中Xa及Xb之一者為H而另一者為水溶性馬來醯亞胺基阻擋部分，或者Xa及Xb與其所連結之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；其中v、u、w、x及y各者為2。
  12. 如申請專利範圍第8至11項中任一項之共軛物，其中一或多個D各者為具有分子量
    Figure 104119613-A0305-02-0278-27
    5kDa之治療劑。
  13. 如申請專利範圍第11項之共軛物，其中該一或多聚合物支架各者獨立地為式(Id)：
    Figure 104119613-A0305-02-0278-16
     其中：m3a為0至17的整數，m3b為1至8的整數，及
    Figure 104119613-A0305-02-0278-17
    端表示該一或多聚合物支架與該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段之直接連結。
  14. 如申請專利範圍第8至11項中任一項之共軛物，其中該一或多個D之至少一者為診斷劑。
  15. 如申請專利範圍第8至11項中任一項之共軛物， 其中該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段具有分子量為40kDa或更大。
  16. 如申請專利範圍第8項之共軛物，其中該一或多個D各者經由非聚合性連接部分獨立地連接到該抗體或其抗原結合片段。
  17. 如申請專利範圍第10項之共軛物，其中該一或多聚合物支架各者獨立地為式(If)：
    Figure 104119613-A0305-02-0279-18
     其中：m為1至300的整數，m1為1至140的整數，m2為1至40的整數，m3a為0至17的整數，m3b為1至8的整數；m3a與m3b之總和範圍為1至18；以及m、m1、m2、m3a與m3b之總和範圍15至300；
    Figure 104119613-A0305-02-0279-19
    端表示一或多聚合物支架連結到專一性結合至人 HER2受體的表位之經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段，其中該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段為經單離之抗-HER2抗體，其包括可變重鏈互補性決定區1(CDRH1)，其包含胺基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO：25)；可變重鏈互補性決定區2(CDRH2)，其包含胺基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：26)；可變重鏈互補性決定區3(CDRH3)，其包含胺基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO：27)；可變輕鏈互補性決定區1(CDRL1)，其包含胺基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：28)；可變輕鏈互補性決定區2(CDRL2)，其包含胺基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO：21)；以及可變輕鏈互補性決定區3(CDRL3)，其包含胺基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO：29)；以及該PHF與該抗體之比為10或更少。
  18. 如申請專利範圍第17項之共軛物，其中式(If)之該PHF具有分子量範圍為2kDa至20kDa，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為15至150，m1為1至70的整數，m2為1至20的整數，m3a為0至9的整數，m3b為1至8的整數，m3a與m3b之總和範圍為1至10、及該PHF與該經單離之抗-HER2抗體之間比為2至8的整數，或其中式(If)之該PHE具有分子量範圍為3kDa至15kDa，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為20至110，m1為2至50的整數，m2為2至15的整數，m3a為0至7的整數，m3b為1至8的整數，m3a與m3b之總和範圍為1 至8、及該PHF與該經單離之抗-HER2抗體或其抗原-結合片段之間比為2至8的整數，或其中式(If)之該PHF具有分子量範圍為5kDa至10kDa，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為40至75，m1為2至35的整數，m2為2至10的整數，m3a為0至4的整數，m3b為1至5的整數，m3a及m3b之總和範圍為1至5、及該PHF與該經單離之抗-HER2抗體之間比為2至8的整數，或其中式(If)之該PHF具有分子量範圍為5kDa至10kDa，m、m1、m2、m3a及m3b之總和範圍為40至75，m1為2至35的整數，m2為2至10的整數，m3a為0至4的整數，m3b為1至5的整數，m3a及m3b之總和範圍為1至5、及該PHF與該經單離之抗-HER2抗體之間比為2至6的整數。
  19. 一種製備根據申請專利範圍第8至18項中任一項之共軛物之方法，其包括將專一性結合至人HER2受體的表位之經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段與式(Ia)之聚合物支架反應，使得形成該共軛物：
    Figure 104119613-A0305-02-0282-20
     其中：LD1為含羰基之部分；
    Figure 104119613-A0305-02-0282-21
    中
    Figure 104119613-A0305-02-0282-23
    的各次出現獨立地為包含生物可降解鍵之第一連接子，使得當該鍵斷裂時，D以活性形式釋出達其所欲治療效果；以及
    Figure 104119613-A0305-02-0282-22
    中介於LD1與D之
    Figure 104119613-A0305-02-0282-24
    表示D與LD1的直接或間接連結；
    Figure 104119613-A0305-02-0282-25
    的各次出現獨立地為尚未連接到該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段之第二連接子，其中LP2為含官能基之部分，其還與該經單離之人化或全人抗體或其抗原結合片段之官能基形成共價鍵，以及介於LD1與LP2之該
    Figure 104119613-A0305-02-0282-26
    表示LP2與LD1的直接或間接連結，以及該第二連接子的各次出現不同於該第一連接子的各次出現；m為1至300的整數，m1為1至140的整數，m2為1至40的整數， m3為1至18的整數，以及m、m1、m2及m3之總和範圍為15至300。
  20. 一種如申請專利範圍第8至18項中任一項之共軛物用於製造供緩解需要彼之個體的癌症症狀的藥物之用途。
  21. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該個體為人。
  22. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該癌症係選自下列所組成之群組：肛門癌、星狀細胞瘤、白血病、淋巴瘤、頭及頸癌症、肝癌、睾丸癌、子宮頸癌、肉瘤、血管瘤、食道癌、眼癌、喉頭癌、口癌、間皮瘤、皮膚癌、骨髓瘤、口腔癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、胰腺癌、腎癌、及胃癌。
  23. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該方法進一步包括投予第二劑，其中該第二劑為專一性結合HER2的至少第二抗體或其抗原結合片段。
  24. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該個體經識別為對HER2表現具有分數為1+或2+，此係由在測試細胞群上進行免疫組織化學(IHC)分析所偵測、及其中HER2基因在該測試細胞群中未被放大，或其中該個體為對化療有耐性，或其中該個體為對賀癌寧(ado-trastuzumab emtansine)治療有抗性， 或其中該個體為不對賀癌寧(ado-trastuzumab emtansine)治療有抗性，或其中該個體經識別為對HER2表現具有分數為2+或3+，此係由在測試細胞群上進行免疫組織化學(IHC)分析所偵測、及其中HER2基因在該測試細胞群中經放大或突變。
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