TW201305209A - 胰高血糖素受體之人類抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供與人類胰高血糖素受體(稱為GCGR)結合之抗體及使用彼等之方法。根據本發明之特定具體實例，彼等抗體係與人類GCGR結合之完全人類抗體。本發明抗體可用於降低血糖量及血酮量，且亦可用於治療與一或多種GCGR生物活性相關之疾病與失調症，包括治療糖尿病、糖尿病酮酸症及與糖尿病相關之長期併發症、或其部分特徵為血糖量升高之代謝失調症。

Description

胰高血糖素受體之人類抗體 發明領域
本發明係有關特異性地結合胰高血糖素受體之人類抗體與人類抗體之抗原結合片段，及使用彼等抗體之治療方法。
相關技藝說明
胰高血糖素係由胰小島α細胞產生之29個胺基酸激素。胰高血糖素利用胰島素之配平作用維持動物(包括人類)之正常葡萄糖量。胰高血糖素與胰島素之不平衡可能於數種疾病(例如糖尿病與糖尿病酮酸症)中扮演重要角色。特別是，研究已證實較高之基礎胰高血糖素量及餐後胰高血糖素分泌缺乏抑制促成人類之糖尿病症狀[Muller et al.,N Eng J Med 283：109-115(1970)]。
一般相信，胰高血糖素提升血糖量之作用部分係由胰高血糖素(GCG)與其受體(稱為GCGR)結合後，特定細胞路徑之活化所媒介。GCGR係G蛋白偶連受體之分泌素次家族(家族B)之成員，主要於肝臟中表現。胰高血糖素與其受體之結合觸發G蛋白訊息轉導級聯，活化胞內環狀AMP及導致經由重新合成之葡萄糖生成量(葡萄糖新生)增加與糖原分解(肝醣分解)[Wakelam et al.,Nature,(1986)323：68-71；Unson et al.,Peptides,(1989),10：1171-1177；及Pittner and Fain,Biochem.J.(1991),277：371-378]。
大鼠胰高血糖素受體首先被Jelinek等單離及純化[Jelinek,L.J.et al.(1993)Science 259(5101)：1614-1616]。接著，使用大鼠序列鑑定及選殖該477胺基酸人類胰高血糖素受體序列[Lok,S.et al.(1994)Gene 140：203-209；MacNeil,D.J.et al.(1994)Biochem.and Biophys.Res.Comm]。美國專利案No.5,776,725揭示編碼人類或大鼠胰高血糖素受體之單離核酸序列。
以胰高血糖素受體拮抗劑(例如抗GCGR抗體)靶向胰高血糖素生產或作用，可為控制及降低血糖之一方法，且就其本身而論證明可用於治療例如糖尿病或糖尿病酮酸症之疾病。再者，藉由降低葡萄糖量，可能預防或改善糖尿病患中與升高葡萄糖量相關之特定長期併發症。
早期研究證明大鼠胰高血糖素受體之多株抗體能封阻胰高血糖素之結合[Unson,C.G.(1996)PNAS 93(1)：310-315]。人類胰高血糖素受體之單株抗體已由Buggy等敘述[Buggy,J.J.et al.(1995)J.Biol.Chem.270(13)：7474；Buggy,J.J.et al.(1996)Horm Metab Res.28(5)：215-9]。Buggy等所述之抗體與胰高血糖素競爭受體之激素結合位置，及辨識人類與大鼠胰高血糖素受體二者，惟不能辨識小鼠受體。Wright等揭示小鼠中之抗人類胰高血糖素受體之單株抗體，並進行對該受體的單株抗體之詳細蛋白質結構測定[Wright,L.M.(2000)Acta Crystallographica Section D.56(5)：573-580]。胰高血糖素受體之其他抗體亦見述於美國專利案5,770,445與 7,947,809；歐洲專利申請案EP2074149A2；歐洲專利案EP0658200B1；美國專利公告案2009/0041784、2009/0252727、與2011/0223160；及PCT公告案WO2008/036341。
發明簡述
於第一態樣中，本發明提供與人類胰高血糖素受體(hGCGR)結合及抑制或封阻其活性(例如，封阻胰高血糖素與其受體之結合，從而封阻血糖量上升)之完全人類單株抗體(mAbs)與其抗原結合片段。該等抗體或其抗原結合片段可於罹患特徵為血糖量增加疾病(例如糖尿病)之病患中，用於降低血糖量。該等抗體亦可用以治療寬廣範圍之需要封阻胰高血糖素與胰高血糖素受體交互作用之症狀與疾患，因此具有利作用。該等抗體最後可用以預防糖尿病患中與升高血糖量相關之長期併發症，或改善糖尿病患中與升高血糖量相關之至少一種徵候。
本發明抗體可為全長(例如，IgG1或IgG4抗體)或可僅包含抗原結合部分[例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段]，及可能經修飾以影響功能性，例如，消除殘餘效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164：1925-1933)。
於一具體實例中，本發明提供特異性地結合人類胰高血糖素受體(hGCGR)之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體結合人類GCGR之胞外結構區域(ectodomain)及/或細胞外(EC)環，該胞外結構區域係 GCGR之N端功能區域及該EC環係一或多個EC1、EC2與EC3。
於一具體實例中，本發明提供一種抗體或其片段，其結合N端功能區(包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基27至約胺基酸殘基144範圍之胺基酸殘基)，或結合hGCGR之EC環，其中該EC環係一或多個EC1、EC2與EC3，EC1包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基194至約胺基酸殘基226範圍之胺基酸殘基；EC2包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基285至約胺基酸殘基305範圍之胺基酸殘基；及EC3包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基369至約胺基酸殘基384範圍之胺基酸殘基。
於一具體實例中，結合hGCGR之人類抗體或人類抗體之抗原結合片段包含具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130與146，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之重鏈可變區(HCVR)。於特定具體實例中，結合hGCGR之抗體或抗體之抗原結合片段包含具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：34、70、86、110與126，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之HCVR。
於一具體實例中，結合hGCGR之人類抗體或人類抗體之抗原結合片段包含具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、68、78、88、 98、108、118、128、138與148，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之輕鏈可變區(LCVR)。於特定具體實例中，結合hGCGR之抗體或抗體之抗原結合片段包含具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：42、78、88、118與128，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之LCVR。
於特定具體實例中，結合hGCGR之人類抗體或其片段包含選自由下列組成之組群之HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138、與146/148。於特定具體實例中，HCVR/LCVR胺基酸序列對係選自由下列組成之組群：SEQ ID NO：34/42、70/78、86/88、110/118與126/128。
於相關具體實例中，本發明包含特異性地結合hGCGR之抗體或抗體之抗原結合片段，其中該抗體或其片段包含於選自由SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138與146/148組成之組群之重鏈及輕鏈序列對內所含之重鏈及輕鏈CDR功能部位。用於鑑定HCVR及LCVR胺基酸序列內之CDR之方法與技術為此項技藝中悉知，可用以鑑定本文揭示之詳細說明之HCVR及/或LCVR胺基酸序列內之諸CDR。可用以鑑定CDR範圍之習知例示包括，例如，卡巴特(Kabat)界定、巧西亞(Chothia)界定、 及AbM界定。一般而言，卡巴特界定係基於序列變異性，巧西亞界定係基於環狀結構區域之位置，及AbM界定則是卡巴特及巧西亞方法間之折衷。參見，例如，Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公開之數據庫亦可用於鑑定抗體內之CDR序列。
於特定具體實例中，本發明提供特異性地結合hGCGR之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含HCVR，其包含選自由SEQ ID NO：2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130與146組成之組群之HCVR序列內所含之三個重鏈CDRs(HCDR1、HCDR2與HCDR3)；及LCVR，其包含選自由SEQ ID NO：10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138與148組成之組群之LCVR序列內所含之三個輕鏈CDRs(LCDR1、LCDR2與LCDR3)。
於一具體實例中，本發明提供結合hGCGR之單離人類抗體或人類抗體之抗原結合片段，其包含具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、76、96、116與136，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之HCDR3功能部位；及具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：16、32、48、64、84、104、124與 144，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之LCDR3功能部位。
於一具體實例中，本發明提供一種抗體或其片段，其進一步包含具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、72、92、112與132，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之HCDR1功能部位；具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、74、94、114與134，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之HCDR2功能部位；具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、80、100、120與140，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之LCDR1功能部位；及具有選自由下列組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、82、102、122與142，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之LCDR2功能部位。
於一具體實例中，該抗體或抗體之抗原結合片段包含：(a)具有選自由SEQ ID NO：8、24、40、56、76、96、116與136組成之組群之胺基酸序列之HCDR3功能部位；及(b)具有選自由SEQ ID NO：16、32、48、64、84、 104、124與144組成之組群之胺基酸序列之LCDR3功能部位。
於一具體實例中，該抗體或抗體之抗原結合片段進一步包含：(c)具有選自由SEQ ID NO：4、20、36、52、72、92、112與132組成之組群之胺基酸序列之HCDR1功能部位；(d)具有選自由SEQ ID NO：6、22、38、54、74、94、114與134組成之組群之胺基酸序列之HCDR2功能部位；(e)具有選自由SEQ ID NO：12、28、44、60、80、100、120與140組成之組群之胺基酸序列之LCDR1功能部位；及(f)具有選自由SEQ ID NO：14、30、46、62、82、102、122與142組成之組群之胺基酸序列之LCDR2功能部位。
於一具體實例中，該抗體或其抗原結合片段包含由具有選自SEQ ID NO：4、20、36、52、72、92、112與132之一之胺基酸序列之HCDR1功能部位，具有選自SEQ ID NO：6、22、38、54、74、94、114與134之一之胺基酸序列之HCDR2功能部位；具有選自SEQ ID NO：8、24、40、56、76、96、116與136之一之胺基酸序列之HCDR3功能部位組成之HCVR；及由具有選自SEQ ID NO：12、28、44、60、80、100、120與140之一之胺基酸序列之LCDR1功能部位，具有選自SEQ ID NO：14、30、46、62、82、102、122與142之一之胺基酸序列之LCDR2功能部位，及具有選自SEQ ID NO：16、32、48、64、84、 104、124與144之一之胺基酸序列之LCDR3功能部位組成之LCVR。
於特定具體實例中，結合人類GCGR之人類抗體或人類抗體之抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、76/84、96/104、116/124與136/144組成之組群之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。具有彼等HCDR3/LCDR3對之抗GCGR抗體之非限制性實例為分別稱為H4H1345N、H4H1617N、H4H1765N、H4H1321B與H4H1321P、H4H1327B與H4H1327P、H4H1328B與H4H1328P、H4H1331B與H4H1331P、H4H1339B與H4H1339P之抗體。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：4、6與8之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：12、14與16之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：20、22與24之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：28、30與32之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：36、38與40之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：44、46與48之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含 分別為SEQ ID NO：52、54與56之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：60、62與64之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：72、74與76之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：80、82與84之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：92、94與96之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：100、102與104之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：112、114與116之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：120、122與124之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該人類抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO：132、134與136之HCDR1、HCDR2與HCDR3胺基酸序列及分別為SEQ ID NO：140、142與144之LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列。
於一具體實例中，該抗hGCGR抗體或其抗原結合片段由包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO：202)之HCDR1序列，其中X1為Gly，X2為Phe，X3為Thr，X4為Phe或Ser，X5為Ser，X6為Ser或Asn，X7為Tyr或Phe，與X8為Asp、Leu、或Gly；包含式X1- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO：203)之HCDR2序列，其中X1為Ile，X2為Ser、Gln、Asp、Trp，X3為Ser、Glu、Thr、或Phe，X4為Asp或Ala，X5為Gly或Glu，X6為Arg、Ile、或不存在，X7為Asp或Glu，與X8為Lys或Thr；包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18--X19-X20-X21(SEQ ID NO：204)之HCDR3序列，其中X1為Ala或Thr，X2為Lys或Arg，X3為Glu，X4為Met、Pro、Gly、或Asp，X5為Val、Ser、Lys、Arg、或不存在，X6為Tyr、His、Asn、或不存在，X7為Tyr，X8為Asp或Glu，X9為Ile，X10為Leu，X11為Thr，X12為Gly，X13為Tyr、Asp、或His，X14為His、Asp、Tyr、或不存在，X15為Asn、Tyr、His、或不存在，X16為Tyr，X17為Tyr或His，X18為Gly或Ala，X19為Met，X20為Asp與X21為Val或Ile；包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO：205)之LCDR1序列，其中X1為Gln，X2為Gly或Ala，X3為Ile，X4為Asn或Arg，X5為Asn，與X6為Tyr或Asp；包含式X1-X2-X3(SEQ ID NO：206)之LCDR2序列，其中X1為Thr或Ala，X2為Ala或Thr，與X3為Ser或Phe；及包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：207)之LCDR3序列，其中X1為Gln或Leu，X2為Gln，X3為Tyr、His、或Asp，X4為Asn或Tyr，X5為Thr或Ser，X6為Tyr、Asn、或His，X7為Pro，X8為Leu、Phe、Arg、或不存在，與X9為Thr 組成。
於一具體實例中，該抗體或抗原結合片段結合人類、猴子、小鼠與大鼠GCGR。
於一具體實例中，該抗體或抗原結合片段結合人類、猴子與小鼠GCGR，惟不結合大鼠GCGR。
於一具體實例中，該抗體或抗原結合片段結合人類、猴子與大鼠GCGR，惟不結合小鼠GCGR。
於一具體實例中，該抗體或抗原結合片段結合人類與猴子GCGR，惟不結合大鼠或小鼠GCGR。
於一具體實例中，該抗體或抗原結合片段結合人類GCGR，惟不結合猴子、小鼠或大鼠GCGR。
於一具體實例中，本發明提供中和hGCGR活性之完全人類單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段展現一或多個下述特性：(i)包含具有選自由SEQ ID NO：2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130與146組成之組群之胺基酸序列之HCVR；(ii)包含具有選自由SEQ ID NO：10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138與148組成之組群之胺基酸序列之LCVR；(iii)包含具有選自由SEQ ID NO：8、24、40、56、76、96、116與136組成之組群之胺基酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之HCDR3功能部位；及具有選自由SEQ ID NO：16、32、48、64、84、104、124與144組成之組群之胺基酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99% 序列相同性之實質上類似序列之LCDR3功能部位；(iv)包含具有選自由SEQ ID NO：4、20、36、52、72、92、112與132組成之組群之胺基酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之HCDR1功能部位；具有選自由SEQ ID NO：6、22、38、54、74、94、114與134組成之組群之胺基酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之HCDR2功能部位；具有選自由SEQ ID NO：12、28、44、60、80、100、120與140組成之組群之胺基酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之LCDR1功能部位；及具有選自由SEQ ID NO：14、30、46、62、82、102、122與142組成之組群之胺基酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列之LCDR2功能部位；(v)結合任一或多個人類、猴子、小鼠或大鼠GCGR；(vi)可能或可能不封阻人類以外至少一種物種之GCGR活性；(v)顯示約10-8至約10-12不等之KD；(vi)於經歷升高血糖量之哺乳動物中降低至少約25%至約75%之血糖量；(vii)可能或可能不使三酸甘油酯量降低至正常哺乳動物中之觀測量；或(viii)顯示對哺乳動物血液中之LDL、HDL、或總膽固醇量無不利影響。
於另一相關具體實例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其與包含選自由SEQ ID NO：2/10、18/26、 34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138與146/148組成之組群之重鏈及輕鏈序列對內所含重鏈及輕鏈CDR功能部位之抗體或抗原結合片段，競爭與hGCGR特異性結合。
於另一相關具體實例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其與被包含選自由SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138與146/148組成之組群之重鏈及輕鏈序列對辨識之hGCGR上之相同抗原決定部位結合。
於一具體實例中，本發明提供之抗hGCGR抗體具有下述一或多個特性：a)於投與約1毫克/公斤至約30毫克/公斤不等之劑量為期至少7天時，能減少血糖量約25%至約75%；b)於投與需要此等治療之哺乳動物時，能導致體重至少減少10%；c)於投與約1毫克/公斤至約30毫克/公斤不等之劑量時，能減少血酮量約25%至75%；或d)於投與對前趨蛋白轉化酶枯草桿菌素/克新(kexin)(PCSK)-9具特異性之抗體，且於治療後維持低血糖量至少7天時，能減少血糖量約20%至40%而不會引起血脂質或膽固醇之顯著升高。
於第二態樣中，本發明提供編碼抗hGCGR抗體或其片段之核酸分子。本發明亦涵蓋攜帶本發明核酸之重組表 現載體，及其內引入此等載體之宿主細胞，以及於容許抗體生產條件下培養宿主細胞以生產抗體，及回收所生產抗體之方法。
於一具體實例中，本發明提供一種抗體或其片段，其包含由選自由下列組成之組群之核酸序列：SEQ ID NO：1、17、33、49、65、69、85、89、105、109、125、129與145，或其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同源性之實質上相同序列編碼之HCVR。於一具體實例中，該HCVR係由選自由SEQ ID NO：33、69、85、109與125組成之組群之核酸序列編碼。
於一具體實例中，該抗體或其片段進一步包含由選自由下列組成之組群之核酸序列：SEQ ID NO：9、25、41、57、67、77、87、97、107、117、127、137與147，或其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同源性之實質上相同序列編碼之LCVR。於一具體實例中，該LCVR係由選自由SEQ ID NO：41、77、87、117與127組成之組群之核酸序列編碼。
於一具體實例中，本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原結合片段，其包含由選自由SEQ ID NO：7、23、39、55、75、95、115與135組成之組群之核苷酸序列，或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之其實質上類似之序列編碼之HCDR3功能部位；及由選自由SEQ ID NO：15、31、47、63、83、103、123與143組成之組群之核苷酸序列，或具有至少90%、至少95%、 至少98%或至少99%序列相同性之其實質上類似之序列編碼之LCDR3功能部位。
於一具體實例中，本發明提供一種抗體或其片段，其進一步包含由選自由SEQ ID NO：3、19、35、51、71、91、111與131組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之HCDR1功能部位；由選自由SEQ ID NO：5、21、37、53、73、93、113與133組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之HCDR2功能部位；由選自由SEQ ID NO：11、27、43、59、79、99、119與139組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之LCDR1功能部位；及由選自由SEQ ID NO：13、29、45、61、81、101、121與141組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之LCDR2功能部位。
於第三態樣中，本發明之特徵為一種人類抗hGCGR抗體或抗體之抗原結合片段，其包含由衍生自VH、DH與JH生殖系序列之核苷酸序列片段編碼之HCVR，及由衍生自VK及JK生殖系序列之核苷酸序列片段編碼之LCVR，其組合如表2所示。
本發明涵蓋具有經修飾之醣基化模式之抗hGCGR抗 體。於若干應用中，修飾以去除不需要的醣基化位點可能有用，或例如移除海藻糖部分以增加抗體依賴性之細胞胞毒性(ADCC)功能[參見Shield et al.(2002)JBC 277：26733]。於其他應用中，可修飾半乳糖基化作用俾使改進補體依賴性胞毒性(CDC)。
於第四態樣中，本發明之特徵為一種醫藥組成物，其包含特異性地結合hGCGR之重組人類抗體或其片段，及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
於一具體實例中，本發明之特徵為一種組成物，其係本發明抗體或抗體之抗原結合片段與第二治療劑之組合物。該第二治療劑可為與本發明抗體或其片段有利地組合之任何製劑。
於一具體實例中，該第二治療劑為能於罹患其特徵為高血糖之疾病或症狀(例如糖尿病)之病患中降低血糖或減少至少一種徵候之製劑。
於特定具體實例中，該第二治療劑可為有助於對抗或降低與本發明抗體或其抗原結合片段相關之任何可能副作用(若發生此等副作用)之製劑。舉例而言，於抗hGCGR抗體增加脂質或膽固醇量之任何情況中，投與有效降低脂質或膽固醇量之第二藥劑可能有利。
第二治療劑可為小分子藥物、蛋白質/多肽、抗體、核酸分子(例如反義分子、或siRNA)。第二治療劑可為合成或天然取得。
於一具體實例中，第二治療劑可為胰高血糖素拮抗 劑、或第二胰高血糖素受體拮抗劑，例如與本文所述抗體不同之胰高血糖素受體之另外抗體。亦可察知的是，本發明抗體及醫藥上可接受之組成物可於組合療法中使用，亦即，該抗體及醫藥上可接受之組成物可同時或於一或多個其他所需療法或醫療程序之前或之後投與。用於組合療法之治療(療法或程序)之特定組合將慮及所需療法及/或程序之相容性及欲達成之期望治療效果。亦可察知的是，所使用之療法可針對相同疾患達成所需效果(舉例而言，抗體可與用以治療相同疾患之另一製劑同時投與)，或彼等可達成不同效果(例如，控制任何不利作用)。本文中，通常投與以治療或預防特定疾病或症狀之附加治療劑，對於治療中之疾病或症狀均適用。
於一具體實例中，本發明之抗hGCGR抗體可與目前可購得之一或多個下述第2型糖尿病療法組合使用。彼等包括雙胍[滅糖錠(metformin)]、磺醯脲類[例如優降糖(glyburide)、泌樂得(glipizide)]、經過氧化體增殖子活化之受體(PPAR)γ促效劑[吡格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone)]；及α葡萄糖苷酶抑制劑[阿卡波糖(acarbose)、培欣(voglibose)]。附加之治療包括注射治療例如EXENATIDE®(胰高血糖素樣肽1)、與SYMLIN®[普蘭林(pramlintide)]。
於特定具體實例中，該組成物可包括選自下述製劑之組群之第二劑：非磺醯脲促分泌素、胰島素、胰島素類似物、依森錠(exendin)-4多肽、β 3腎上腺素受體促效劑、 PPAR促效劑、二肽基肽酶IV抑制劑、他汀類(statins)與含他汀之組合物、膽固醇攝取及/或膽酸再吸收抑制劑、LDL-膽固醇拮抗劑、膽固醇酯轉移蛋白拮抗劑、內皮素受體拮抗劑、生長激素拮抗劑、胰島素敏化劑、澱粉素類似物或促效劑、大麻鹼受體拮抗劑、胰高血糖素樣肽-1促效劑、黑細胞促素皮促素、黑色素濃集激素受體促效劑、SNRIs、纖維母細胞生長因子21(FGF21)類似物(參見，例如，US20110002845與US20080261236)、纖維母細胞生長因子受體1c(FGFR1c)促效劑(參見，例如，US20110150901)、晚期(advanced)糖化終產物形成抑制劑、例如，惟不限於，胺基胍、與蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑。
於特定具體實例中，該組成物可包括第二劑以幫助降低脂質或膽固醇量及可包括例如3-羥基-3-甲麩胺醯基-輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑[舉例而言，他汀類例如阿托伐他汀(atorvastatin)(LIPITOR®)、氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOL®)、洛伐他汀(lovastatin)(MEVACOR®)、匹伐他汀(pitavastatin)(LIVALO®)、普伐他汀(pravastatin)(PRAVACHOL®)、羅素伐他汀(rosuvastatin)(CRESTOR®)與辛伐他汀(simvastatin)(ZOCOR®)等製劑。
於特定具體實例中，使本發明抗體與下述任一或多者：(1)菸鹼酸，其增加脂蛋白分解代謝；(2)纖維酸類或兩親媒性羧酸類，其減少低密度脂蛋白(LDL)量，增進高密度脂蛋白(HDL)及TG量，並減少心臟病發作次數；及 (3)於膽固醇消除上具作用之LXR轉錄因子活化劑例如22-羥膽固醇，或固定組合物例如VYTORIN®)[伊增替邁(ezetimibe)加辛伐他汀]；他汀類與膽汁樹脂[例如，消膽胺(cholestyramine)、考來替泊(colestipol)、考來維倫(colesevelam)]、菸鹼酸加他汀類之固定組合物(例如，菸鹼酸與洛伐他汀)；或與其他脂質降低劑例如ω-3-脂肪酸乙酯類[例如，歐妙克(omacor)]組合投與可能有利。再者，第二治療劑可為胰高血糖素或GCGR之一或多個其他抑制劑，以及涉及脂質代謝(特別是，膽固醇及/或三酸甘油酯體內平衡)之其他分子例如血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)、血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)、血管生成素樣蛋白5(ANGPTL5)、血管生成素樣蛋白6(ANGPTL6)之抑制劑。彼等分子之抑制劑包括特異性地結合彼等分子並封阻其活性之小分子及抗體。
於特定具體實例中，使本發明抗GCGR抗體與抑制hPCSK9活性之核酸(例如反義分子、雙股RNA、或siRNA分子)組合投與可能有利。抑制PCSK9活性之核酸分子，其實例見述於US2011/0065644、US2011/0039914、US2008/0015162與US2007/0173473。
於特定具體實例中，使本發明之抗hGCGR抗體與特異性地結合hPCSK9並抑制其活性之抗體組合投與，從而抑制其活性，可能有利，其中該抗體具降低脂質或膽固醇量之作用。抗hPCSK9抗體之實例見述於US2010/0166768。特異性地結合人類PCSK9之單離抗體， 或其抗原結合片段，可以約0.01毫克/公斤至約30毫克/公斤不等之劑量投與；其可呈單一劑量或多次劑量投與。抗hPCSK9抗體可與抗GCGR抗體同時投與，或可於抗GCGR抗體之前或之後投與。
於一具體實例中，與本發明抗體組合使用之第二治療劑包含特異性地結合人類PCSK9之單離抗體，或其抗原結合片段，其中該抗hPCSK9抗體包含選自由SEQ ID NOs：173與177組成之組群之任一HCVR序列內所含三個重鏈CDRs(HCDR1、HCDR2與HCDR3)；及選自由SEQ ID NOs：175與185組成之組群之任一LCVR序列內所含三個輕鏈CDRs(LCDR1、LCDR2與LCDR3)。
於一具體實例中，特異性地結合人類PCSK9之單離抗體，或其抗原結合片段，包含選自由SEQ ID NO：173與177組成之組群之之重鏈可變區(HCVR)。
於一具體實例中，特異性地結合人類PCSK9之單離抗體，或其抗原結合片段，包含選自由SEQ ID NO：175與185組成之組群之輕鏈可變區(LCVR)。
於一具體實例中，特異性地結合人類PCSK9之單離抗體，或其抗原結合片段，包含具有選自由SEQ ID NO：173與177組成之組群之胺基酸序列之HCVR及具有選自由SEQ ID NO：175與185組成之組群之胺基酸序列之LCVR。
於一具體實例中，特異性地結合人類PCSK9之單離抗體，或其抗原結合片段，包含重鏈可變區(HCVR)及輕 鏈可變區(LCVR)，其中該HCVR/LCVR序列對係選自由SEQ ID NO：173/175；與SEQ ID NO：177/185組成之組群。
於一具體實例中，特異性地結合人類PCSK9之單離抗體，或其抗原結合片段，包含：含有選自由SEQ ID NO：161與179組成之組群之胺基酸序列之HCDR1；含有選自由SEQ ID NO：163與181組成之組群之胺基酸序列之HCDR2；含有選自由SEQ ID NO：165與183組成之組群之胺基酸序列之HCDR3；含有選自由SEQ ID NO：167與187組成之組群之胺基酸序列之LCDR1；含有選自由SEQ ID NO：169與189組成之組群之胺基酸序列之LCDR2及含有選自由SEQ ID NO：171與191組成之組群之胺基酸序列之LCDR3。
於特定具體實例中，與本發明之抗GCGR抗體組合使用之hPCSK9抗體係由如本文敘述之核酸分子編碼。舉例而言，於一具體實例中，本發明提供一種抗hPCSK9抗體或其片段，其包含由選自由SEQ ID NO：172與176組成之組群之核酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同源性之實質上相同序列編碼之HCVR，及由選自由SEQ ID NO：174與184組成之組群之核酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%同源性之實質上相同序列編碼之LCVR。
於一具體實例中，本發明提供與本發明之抗GCGR抗體組合使用之抗hPCSK9抗體，其中該抗PCSK9抗體或 其片段包含由選自由SEQ ID NO：160與178組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之HCDR1功能部位；由選自由SEQ ID NO：162與180組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之HCDR2功能部位；由選自由SEQ ID NO：164與182組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之HCDR3功能部位；由選自由SEQ ID NO：166與186組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之LCDR1功能部位；由選自由SEQ ID NO：168與188組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之LCDR2功能部位；及由選自由SEQ ID NO：170與190組成之組群之核苷酸序列，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同性之實質上類似序列編碼之LCDR3功能部位。
共投與多個治療劑時，劑量可如相關技藝中所認可，進行對應之調整。
於第五態樣中，本發明之特徵為使用本發明抗hGCGR抗體或抗體之抗原結合部分抑制hGCGR活性之方法，其中該治療方法包括投與治療有效量之包含該抗體 或其抗原結合片段之醫藥組成物。本發明抗體可用以治療藉由去除、抑制或減少hGCGR活性，使其增進、改善、被抑制或預防之任何症狀或疾患。可設想的是，本發明抗體可單獨使用，或成為與已知用於治療罹患部分特徵為血糖或血酮量升高之疾病或症狀(例如，惟不限於，糖尿病)的病患之其他護理製劑或標準方法之輔助療法。此類標準療法可包括輸液(fluid administration)、或投與用於降低血糖、血酮、或脂質，或用於減重之任何其他醫藥劑。
本發明之抗hGCGR抗體可封阻胰高血糖素與其受體間之相互作用，從而抑制胰高血糖素之葡萄糖升高效應。使用胰高血糖素受體拮抗劑，例如本文敘述之抗體，可能為達到正常葡萄糖量，從而改善、或防止與例如糖尿病相關之一或多個徵候或長期併發症之有效方式。使用胰高血糖素受體拮抗劑，例如本文敘述之抗體，亦可為由於非關糖尿病之症狀或疾患而經歷高血糖症之非糖尿病[例如手術期間高血糖症(於正要手術前或手術後病患觀察到之高血糖症)]患者達到正常葡萄糖量之有效方法。於特定具體實例中，設想於糖尿病酮酸症降低血糖量或血酮量之方法中使用本發明抗體。於特定具體實例中，亦設想於治療病患以達成體重減輕、或防止體重增加、或維持正常體重之方法中使用本發明抗體。
本發明抗體亦可用於改善舉例而言，如，葡萄糖耐量異常、肥胖症等等症狀，或用於治療糖尿病症狀，或用於預防或減少熟習此項技藝者已知之任一或多個與糖尿病 相關之長期併發症例如腎病、神經病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥狀硬化症、傷口癒合能力受損及與糖尿病相關之其他併發症之嚴重性。
可利用本發明治療方法治療之其他症狀或疾患包括糖尿病酮酸症、高血糖症(包括手術期間高血糖症、加護病房病患高血糖症、與高滲透壓高血糖症候群)、高胰島素血症、代謝症候群、胰島素抗性症候群、空腹血糖異常、或與高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症、高脂血症、及一般血脂異常相關之高血糖症。於特定具體實例中，本發明提供如本文敘述之對GCGR具特異性之單離抗體或其抗原結合片段，以用於降低血糖或血酮量，或用於治療具有與高血糖或血酮量相關、或其部分特徵係高血糖或血酮量之疾病或症狀之病患，其中該症狀或疾病係選自糖尿病、葡萄糖耐量異常、肥胖症、腎病、神經病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥狀硬化症、傷口癒合能力受損、糖尿病酮酸症、高血糖症、高血糖高滲壓症候群、手術期間高血糖症、加護病房病患高血糖症、高胰島素血症、代謝症候群、胰島素抗性症候群與空腹血糖異常。於特定具體實例中，使用本發明之單離抗體或抗原結合片段擬用於製備降低血糖或血酮量，或治療具有與高血糖或高血酮量相關之疾病或症狀或部分特徵為高血糖或血酮量之病患，或改善此類疾病或症狀之至少一種徵候(其中該症狀或疾病係選自任何上述疾病或症狀)用之藥劑。
該抗體亦可用於治療罹患不能動手術之胰高血糖素 瘤(帶或不帶遷移性表皮壞死紅斑症與高血糖症之胰臟內分泌腫瘤)之病患。
其他具體實例從審查下文詳細說明將明顯可見。
詳細說明
於敘述本發明方法之前，須瞭解的是，本發明不受限於所敘述之特定方法及實驗條件，因為此等方法及條件可能有所不同。亦須瞭解的是，本文所用之專門用語僅為說明特定具體實例之目的，而不擬構成侷限，本發明範圍僅受隨附申請專利範圍之限制。
除非另行界定，否則本文所用之所有技術及科學用語具有熟習此項技藝(本發明所屬)者一般瞭解之相同意義。儘管於實施或測試本發明時可使用與本文所述類似或等同之任何方法與材料，茲於下文僅敘述較佳之方法與材料。本文所提及之所有公告案其全部內容均併入本文以資參考。
界定
"胰高血糖素受體"，亦簡稱"GCGR"，屬於G蛋白偶連受體第2類家族及由長胺基終端細胞外功能部位(參見編碼N端細胞外功能部位之DNA之SEQ ID NO：158及N端細胞外功能部位之胺基酸序列之SEQ ID NO：159)、七個跨膜片段、及細胞內C端功能部位[Jelinek et al.,Science 259：1614-1616(1993)；Segre et al.,Trends Endocrinol.Metab 4：309-314(1993)]組成。胰高血糖素受體顯著地於肝細胞表面表現，從而結合於胰高血糖素及轉 導由此提供的訊號至細胞中。因此，"胰高血糖素受體"一詞亦係指特異性地與胰高血糖素相互作用而產生生物訊號之一或多個受體。編碼大鼠及人類來源胰高血糖素受體之DNA序列已被單離，並揭示於此項技藝中(EP0658200B1)。亦已單離出鼠類及食蟹猴同系物並予以定序[Burcelin,et al.,Gene 164(1995)305-310)；McNally et al.,Peptides 25(2004)1171-1178]。於本文中，"胰高血糖素受體"與"GCGR"可交換使用。本文所用之"GCGR”、“hGCGR”或其片段等表示法，除非具體指明係得非人類物種(例如“小鼠GCGR”、“大鼠GCGR”、或“猴子GCGR”，否則係指人類GCGR蛋白或其片段。此外，本文所用之"GCGR"或“hGCGR”係指具有示於SEQ ID NO：157之核酸序列及SEQ ID NO：153之胺基酸序列或其生物活性片段之人類GCGR。具有下述基因庫存取編號(Genbank Accession Numbers)之多種序列與該GCGR基因相關：NP_000151.1(人類)、NP_742089.1(大鼠)、XP_001111894.1(恆河猴)、及NP_032127.2(小鼠)。本文揭示之其他序列包括人類GCGR(SEQ ID NO：153)、小鼠GCGR(SEQ ID NO：154)、食蟹猴(SEQ ID NO：155)、大鼠GCGR(SEQ ID NO：156)。於特定具體實例中，用於本發明之融合蛋白可包括SEQ ID NO：149(hGCGR-hFc，融合於人類IgG之Fc區域之NP_000151.1殘基27-144)SEQ ID NO：150(hGCGR-hFc，融合於人類IgG之Fc區域之NP_000151.1殘基27-144)、SEQ ID NO： 151(hGCGR-mmH，融合於myc-myc-his標記之NP_000151.1之殘基27-144)、及SEQ ID NO：152{MfGCGR-hFc，含有融合於人類IgG Fc區域之Mf(食蟹猴)之N端序列[與恆河猴(Macaca mulatta)GCGR之殘基27-144相同，其存取編號為XP_001111894.1]}。彼等核酸序列、由其編碼之多肽、及其他核酸與多肽序列整體以及其中所含之個別子序列均併入本文以資參考。
本文所用之“人類前趨蛋白轉化酶枯草桿菌素/克新第9型”或"hPCSK9"，係指由示於SEQ ID NO：192之核酸序列編碼及具有SEQ ID NO：193之胺基酸序列或其生物活性片段之hPCSK9。
本文所用之"抗體"一詞擬意指由四個多胜肽鏈、利用雙硫鍵互相連接的兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈組成之免疫球蛋白分子(亦即，"完全抗體分子")，以及其單體集合體。各重鏈由重鏈可變區(“HCVR”或“VH”)及重鏈恒定區(由功能部位CH1、CH2與CH3組成)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(“LCVR”或“VL”)及輕鏈恒定區(CL)組成。VH及VL可進一步細分為稱為互補決定區(CDR)之高度可變區，其間散置著更保守之區域，稱為框架區(FR)。各VH及VL由三個CDRs及四個FRs組成，自胺基端至羧基端之排列順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。於本發明特定具體實例中，抗GCGR抗體(或其抗原結合片段)之FRs可與人類生殖系序列相同，或可經天然或人工修飾。胺基酸一致序列可根據二或多個CDRs之並列分 析予以界定。
一或多個CDR殘基之置換或一或多個CDR之刪除亦有可能。於科學文獻中已敘述，抗體中一或兩個CDR可被用以進行結合。根據公告之晶體結構，Padlan et al.(1995 FASEB J.9：133-139)分析抗體及其抗原間之接觸區，結果斷定僅約五分之一至三分之一之CDR殘基真正接觸抗原；亦發現有許多抗體，其一或兩個CDR無胺基酸與抗原接觸(亦參見，Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320：415-428)。
從位於巧西亞CDRs外側之卡巴特CDRs區域，不接觸抗原之CDR殘基可根據先前之研究，利用分子模型及/或經驗予以鑑定(例如，CDRH2中之H60-H65殘基常不需要)。若有CDR或其殘基被刪除，通常會以於另一人類抗體序列或此等序列之一致序列中佔用對應位置之胺基酸置換。CDRs內之置換位置及欲置換之胺基酸可憑經驗挑選；憑經驗之置換可為保守性或非保守性置換。
本文揭示之完全人類抗GCGR抗體可包含重鏈及輕鏈可變功能部位之框架及/或CDR區中，相較於對應生殖系序列之一或多個胺基酸置換、插入及/或刪除。此等變異藉由比較本文揭示之胺基酸序列與自，例如，公開抗體序列資料庫取得之生殖系序列，可容易地確定。本發明涵蓋抗體及其抗原結合片段，該等抗原結合片段係衍生自本文揭示之任何胺基酸序列，其中一或多個框架及/或CDR區內之一或多個胺基酸變異至該抗體衍生之生殖系序列 之對應殘基，或至另一人類生殖系序列之對應殘基，或至對應生殖系殘基之保守性胺基酸置換(此等序列變化於本文中稱為"生殖系變異")。熟習此項技藝人士，從本文揭示之重鏈及輕鏈可變區序列出發，可容易地製造許多包含一或多個個別生殖系變異或其組合之抗體及抗原結合片段。於特定具體實例中，VH及/或VL功能部位中之所有框架及/或CDR殘基均回復變異成為衍生抗體之原始生殖系序列中之殘基。於其他具體實例中，只有特定殘基回復變異成為原始生殖系序列，例如，僅於FR1之頭8個胺基酸中或FR4之最後8個胺基酸中發現變異殘基，或僅於CDR1、CDR2或CDR3中發現變異殘基。於其他具體實例中，一或多個框架及/或CDR殘基變異成為不同生殖系序列(亦即，與原始衍生抗體生殖系序列不同之生殖系序列)之對應殘基。再者，本發明抗體可含有框架及/或CDR區內兩個或兩個以上生殖系變異之任何組合，例如，其中特定個別殘基變異成為特定生殖系序列之對應殘基，而仍保留與原始生殖系序列不同之特定其他殘基，或變異成為不同生殖系序列之對應殘基。一旦獲得含有一或多個生殖系變異抗體及抗原結合片段，則可容易地測試其一或多個所需性質，例如，增進之結合特異性、增加之結合親和性、改善或增強之拮抗或促效性生物性質(視情況而定)、降低之免疫原性等。於此一般方式中獲得之抗體及抗原結合片段均涵蓋於本發明範圍之內。
本發明亦包括抗GCGR抗體，其包含本文揭示之任何 HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列之具有一或多個保守性置換之變異體。舉例而言，本發明包括抗hGCGR抗體，相較於本文揭示之任何HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列，其具有帶著例如，10個或10個以下、8個或8個以下、6個或6個以下、4個或4個以下等保守性胺基酸置換之HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列。
本文所用之"人類抗體"一詞意欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變及恒定區之抗體。本發明之人類mAbs可包括，例如於CDRs中，特別是CDR3中，非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，由活體外無規或定位突變或由活體內體細胞突變引起之變異)。然而，本文所用之"人類抗體"一詞不擬包括其中衍生自另一哺乳類物種(例如小鼠)生殖系之CDR序列已嫁接至人類FR序列上之mAbs。本發明之抗人類GCGR抗體可稱為“抗-hGCGR”或“抗-GCGR”。
"特異性地結合"等詞意指抗體或其抗原結合片段與於生理條件下相當穩定之抗原形成複合物。特異性地結合之特徵為可至少約1x10-6 M或更小之平衡解離常數(亦即，較小KD值表示較緊密之結合)。測定兩個分子是否特異性結合之方法於此項技藝中已悉知及包括，例如，平衡透析、表面電漿子共振等。然而，與hGCGR特異性結合之單離抗體可能對其他抗原(例如得自其他物種之GCGR分子)展現交叉反應性。此外，結合於hGCGR及一或多個附加抗原之之多重特異性抗體仍然被視為係如本文使用 之“特異性地結合”hGCGR之抗體。
“高度親和性”抗體一詞係指如利用表面電漿子共振，例如BIACORETM或溶液親和性ELISA所測定，對hGCGR具有以KD表示之至少10-9 M，較佳為10-10 M，更佳為10-11 M，又更佳為10-12 M之結合親和性之彼等mAbs。
“緩離速率”、“Koff”或“kd”等詞意指如利用表面電漿子共振例如BIACORETM所測定，抗體以1 x 10-3 s-1或更小，較佳為1 x 10-4 s-1或更小之速率常數與hGCGR解離。
本文所用抗體之"抗原結合部分"、抗體之"抗原結合片段"等詞，係包括特異性地結合抗原形成複合物之任何天然存在、可利用酵素獲得、合成或經基因工程改造之多肽或醣蛋白。本文所用抗體之"抗原結合部分"、或"抗體片段”等詞，係指保留特異性地結合hGCGR能力之抗體之一或多個片段。
於特定具體實例中，本發明之抗體或抗體片段可接合於具療效成分(“免疫接合物”)，例如第二GCGR拮抗劑，或接合於雙胍類(滅糖錠)、磺醯脲類(例如優降糖、泌樂得)、PPAR γ促效劑(例如吡格列酮，或羅格列酮)、α葡萄糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖、或培欣)、EXENATIDE®(胰高血糖素樣肽1)、SYMLIN®(普蘭林)、用於治療部分係由有害之胰高血糖素活性引起之疾病或症狀之化療劑、放射性同位素、或任何其他具療效成分。
本文所用之"單離抗體"一詞擬意指實質上不含具有 不同抗原特異性之其他抗體(mAbs)之抗體(例如，與hGCGR或其片段特異性結合之單離抗體實質上不含與hGCGR以外之抗原特異性結合之Abs)。
本文所用之“封阻抗體”或"中和抗體"(或"中和GCGR活性之抗體")擬意指與hGCGR之結合導致抑制至少一種GCGR生物活性之抗體。舉例而言，本發明抗體可幫助防止與胰高血糖素量上升相關之血糖量增加。替代地，本發明抗體可展現對於反應胰高血糖素之cAMP生產之封阻能力。GCGR生物活性之此抑制可利用此項技藝中已知之數種標準活體外或活體內分析之一或多種測定GCGR生物活性之一或多種指標予以評估(亦參見下文實施例)。
本文所用之"表面電漿子共振"一詞係指於生物感測器基質內，例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)，藉由檢測蛋白質濃度變化，得以分析即時生物分子相互作用之一種光學現象。
本文所用"KD"一詞擬意指特定抗體-抗原互相作用之平衡解離常數。
“抗原決定部位”一詞係指與抗體分子可變區中所謂互補位(paratope)之特異性抗原結合位置相互作用之抗原決定區。單一抗原可具有一個以上抗原決定部位。因此，不同抗體可結合於抗原上之不同區域及可具有不同生物效應。“抗原決定部位”一詞亦係指抗原上B及/或T細胞反應之部位；亦係指被抗體結合之抗原區域。抗原決定部 位可界定為結構性或功能性；功能性抗原決定部位通常為結構性抗原決定部位之子集，具有直接促成相互作用之親和性之彼等殘基；抗原決定部位亦可為構形，亦即，由非線型胺基酸組成。於特定具體實例中，抗原決定部位可包括為分子之化學活性表面群集之決定子例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，及，於特定具體實例中，可具有特異性三度空間結構特性，及/或特異性電荷特性。
"實質上相同性"或"實質上相同"等詞於述及核酸或其片段時，係指與另一核酸(或其互補股)進行適當核苷酸插入或刪除之最適排比時，如下文所述，利用任何悉知序列相同性演算法(例如FASTA、BLAST或GAP)所測定，核苷酸鹼基存在至少約90%，更佳為至少約95%、96%、97%、98%或99%之核苷酸序列相同性。與基準核酸分子具有實質上相同性之核酸分子，於特定情況下，可編碼與由該基準核酸分子編碼之多肽具有相同或實質上類似之胺基酸序列之多肽。
應用於多肽時，"實質上相似性"或"實質上相似"等詞意指兩個肽序列進行最適排比[例如利用GAP或BESTFIT程式，使用預設空位權重(gap weights)]時，享有至少90%序列相同性，又更佳為至少95%、98%或99%序列相同性。較佳為，不相同之殘基位置，其保守性胺基酸置換不同。"保守性胺基酸置換"乃其中胺基酸殘基被具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)側鏈(R基團)之胺基酸殘基置換者。一般而言，保守性胺基酸置換不會實質上改變蛋白 質之功能性。於兩個或多個胺基酸序列之保守性置換彼此不同之情形下，可向上調整相似百分比或相似度以校正該置換之保守性。進行此調整之方法為熟習此項技藝者所悉知。參見，例如，Pearson(1994)Method Mol.Biol.24：307-331，將其併入本文以資參考。具有相似化學性質側鏈之胺基酸組群之實例包括(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸；(2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；(3)含醯胺之側鏈：天冬醯胺與麩醯胺；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸、與色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸、與組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸與麩胺酸、及(7)含硫側鏈：半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳之保守性胺基酸置換組群為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸、及天冬醯胺-麩醯胺。替代地，保守性替換乃於Gonnet et al.(1992)Science 256：1443-1445中(將其併入本文以資參考)揭示之PAM250似對數矩陣中具有正值之任何變化。"適度保守性"替換乃於PAM250似對數矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列相似性通常係使用序列分析軟體測定。蛋白質分析軟體使用指定各種置換、刪除及其他修改(包括保守性胺基酸置換)之相似性測量法，使相似序列匹配。舉例而言，GCG軟體含有例如GAP及BESTFIT之程式，可使用預設參數以測定密切相關多肽間之序列同質性或序列相同性，例如得自不同生物物種或野生型蛋白與其變 異蛋白間之同源多肽。參見，例如，GCG Version 6.1。亦可使用預設或建議參數之FASTA(GCG Version 6.1中之程式)比較多肽序列；FASTA(例如，FASTA2及FASTA3)提供查詢與搜尋序列間最佳重疊區域之排比及序列相同性百分比[Pearson(2000)，文獻同前]。比較本發明序列與含有得自不同生物大量序列之資料庫之另一較佳演算法為電腦程式BLAST，尤其是使用預設參數之BLASTP或TBLASTN。參見，例如，Altschul et al.1990,J.Mol.Biol.215：403-410及1997,Nucleic Acids Res.25：3389-402，各併入本文以資參考。
於特定具體實例中，用於本發明方法之抗體或抗體片段可具單一特異性、雙重特異性、或多重特異性。多重特異性抗體可對一標靶多肽之不同抗原決定部位具特異性或可含有對一種以上標靶多肽之諸抗原決定部位具特異性之抗原結合功能部位。可用於本發明場合之例示雙重特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白(Ig)CH3功能部位及第二個Ig CH3功能部位，其中第一及第二個Ig CH3功能部位至少一個胺基酸彼此不同，及其中至少一個胺基酸差異，相較於缺乏該胺基酸差異之雙重特異性抗體，減少了雙特異性抗體與蛋白A之結合。於一具體實例中，第一個Ig CH3功能部位結合蛋白A，第二個Ig CH3功能部位含有減少或破壞蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(根據IMGT表現序列編號；H435R，根據EU編號)。第二個CH3可進一步包含Y96F修飾(根據IMGT；Y436F，根據 EU)。可於第二個CH3中發現之進一步修飾包括於IgG1 mAbs情形下之D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、與V82I(根據IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、與V422I，根據EU)；於IgG2 mAbs情形下之N44S、K52N、與V82I(IMGT；N384S、K392N、與V422I，根據EU)；及於IgG4 mAbs情形下之Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、與V82I(根據IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、與V422I，根據EU)。雙重特異性抗體形式上之上述變異均涵蓋於本發明範圍之內。
“治療有效量”一詞意指投與而產生期望作用之量；精確量係取決於治療目的，將由熟習此項技藝者使用已知技術予以確定[參見，例如，Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding]。“正常葡萄糖量”係意指空腹量小於約80毫克/公合，及餐後量約小於110-120毫克/公合之人類血漿葡萄糖值。血漿葡萄糖可依照Etgen et al.[Metabolism 2000；49(5)：684-688]測定，或依照D'Orazio et al.[Clin.Chem.Lab.Med.2006；44(12)：1486-1490]，以全血葡萄糖濃度轉換計算。“膽固醇標準化”或“正常膽固醇量”係指約小於200毫克/公合，慮及高臨界值時為約200-240毫克/公合範圍內之人類總膽固醇量。以正常總膽固醇量計，人類之平均LDL值約100至約129毫克/公合被認為正常，及45毫克/公合以上之HDL值被認為正常。人類之正常三酸甘油酯量為小於150毫克/公 合。正常之總量/HDL比為4.5以下，正常之LDL/HDL比為小於3。彼等值可依照標準實驗室程序[亦參見，Friedewald,WT,Clin.Chem(1972),18：499-502；Chen,Y.et al.Lipids Health Dis.(2010)；9：52；Keevil,JG,et al.,Circulation(2007),115：1363-1370；及Bairaktari,E.et al.,Clin.Biochem.(2000),33：549-555]。於本發明特定具體實例中，該抗GCGR抗體可用以降低血糖量至正常範圍內。於本發明特定具體實例中，該抗GCGR抗體可用以增加HDL-C之量。於本發明特定具體實例中，該抗GCGR抗體可用以降低三酸甘油酯之量。
一般說明
由於胰高血糖素藉由透過胰高血糖素受體傳訊發揮其生理效應，因此胰高血糖素受體可能為糖尿病及其他胰高血糖素相關代謝失調症之潛在治療標的。使用胰高血糖素受體拮抗劑，例如本文敘述之抗體，可能為達到正常葡萄糖量，從而改善、或防止與糖尿病相關之一或多個徵候或長期併發症之有效方式。本發明抗體亦可用於改善與例如葡萄糖耐量異常相關之症狀、用於治療肥胖症、用於防止體重增加、用於治療代謝症候群、或用於治療糖尿病(包括糖尿病酮酸症)症狀、或用於防止及/或降低罹患熟習此項技藝者已知之任一或多種與糖尿病相關之併發症(例如腎病、神經病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥狀硬化症、傷口癒合能力受損)及與糖尿病相關之其他併發症之風險。
使用如本文敘述之抗hGCGR抗體亦可用於治療其他症狀，包括高血糖症、高血糖高滲壓症候群[Stoner,G.D.,American Family Physician,(2005),71(9)：1723-1730；Diabetes Spectrum,Umpierrez,G.E.,(2002),15(1)：28-36；Nugent,B.W.,Emergency Medicine Clinics of North America,(2005),23：629-648]、手術期間高血糖症[Frisch,A.et al.Diabetes Care,(2010),33(8)：1783-1788；Hanazaki,K.et al.World J Gastroenterol,(2009),15(33)：4122-4125；Smiley,D.D.et al.Southern Medical Journal,(2006),99(6)：580-589；Hermanides,J.et al.,The Netherlands J.of Med.67(6)：226-229；Maerz,L.L.et al.,Current Opinion in Critical Care,(2011),17：370-375]、加護病房病患高血糖症[Gunst,J.et al.,Seminars in Dialysis,(2010),23(2)：157-162；Losser,M-R.,Critical care,(2010),14：231]、高胰島素血症、及胰島素抗性症候群與胰高血糖素瘤(帶或不帶遷移性表皮壞死紅斑症與高血糖症之胰臟內分泌腫瘤)[參見例如，Boden,G.et al.,N Engl J Med(1986)；314：1686-1689]。
於特定具體實例中，本發明抗體係得自以原始免疫原免疫處理，隨後以二次免疫原免疫處理之小鼠。免疫原可為表現GCGR蛋白、或其生物活性片段之細胞株，或編碼GCGR蛋白或其活性片段之DNA，或GCGR蛋白或其活性片段。舉例而言，於特定具體實例中，原始免疫原可為使用此項技藝中已知標準程序建造以大量表現全長 hGCGR之細胞株(例如小鼠MG87細胞株)。替代地，可使用編碼全長hGCGR之DNA(例如衍生自存取編號NP_000151.1之hGCGR構築體)，或編碼其生物活性片段之DNA，例如，編碼GCGR N端功能之DNA(參見，例如，編碼SEQ ID NO：159之SEQ ID NO：158)、或編碼可溶性N端蛋白包括SEQ ID NO：159之可溶性N端蛋白、或跨越SEQ ID NO：153之殘基27-144之DNA進行DNA免疫處理。二次免疫原可為GCGR蛋白、或生物其活性片段、或融合蛋白，例如hGCGR-mmH(REGN547，SEQ ID NO：151)或hGCGR-hFc(REGN315，SEQ ID NO：150；REGN316，SEQ ID NO：149)。
於本發明特定具體實例中，可使用具有示於SEQ ID NO：159之胺基酸序列(無訊號序列)之N端功能區，或GCGR之任一或多個胞外結構區域，例如任一或多個細胞外區域(或其片段)，製備結合GCGR並抑制其功能(例如其結合胰高血糖素之能力)而導使血糖量降低之抗體。
人類GCGR之全長胺基酸序列如SEQ ID NO：153所示。訊號胜肽跨越SEQ ID NO：153之胺基酸殘基1-26；N端功能區跨越SEQ ID NO：153之殘基27-144；胞外區域1(EC1)跨越SEQ ID NO：153之胺基酸殘基194-226；胞外區域2(EC2)跨越SEQ ID NO：153之胺基酸殘基285-305；及胞外區域3(EC3)跨越SEQ ID NO：153之胺基酸殘基369-384。
於特定具體實例中，特異性地結合GCGR之抗體可使 用上文標註之細胞外區域片段、或自本文所述區域N或C端之一或二者超出約5至約20個胺基酸殘基之標明區域之胜肽予以製備。於特定具體實例中，上文標註區域或其片段之任何組合均可用於製備GCGR特異性抗體。於特定具體實例中，GCGR之任一或多個上文標註區域或其片段均可用於製備單一特異性、雙重特異性、或多重特異性抗體。
抗體之抗原結合片段
除非另行具體指示，否則本文所用之"抗體"一詞應被理解為欲涵蓋包含兩個免疫球蛋白重鏈及兩個免疫球蛋白輕鏈之抗體分子(亦即，"完全抗體分子")以及其抗原結合片段。本文所用之抗體之"抗原結合部分"、抗體之"抗原結合片段"等詞，係包括特異性地結合抗原形成複合物之任何天然存在、可利用酵素獲得、合成或經基因工程改造之多肽或醣蛋白。本文所用抗體之"抗原結合部分"、或"抗體片段”等詞係指保留特異性地結合hGCGR能力之抗體之一或多個片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含CDR之片段、或單離之CDR。抗體之抗原結合片段可，例如，使用如蛋白水解消化或涉及編碼抗體可變及(視需要之)恒定功能部位之DNA操控及表現之重組基因工程技術等任何適當標準技術，自完整抗體分子衍生。此等DNA為已知及/或可自例如商業來源、DNA庫(包括，例如，噬菌體-抗體庫)容易地取得，或可予以合成。DNA可定序及進行化學操作，或藉由使 用分子生物技術，例如，安置一或多個可變及/或恒定功能部位至適當結構中，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、更改、增加或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體高度可變區(例如，CDR3胜肽之單離互補決定區(CDR))之胺基酸殘基或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽組成之最小識別單元。其他經基因工程改造之分子，例如功能部位特異性抗體、單一功能部位抗體、功能部位刪除抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、二聚抗體(diabodies)、三聚抗體(triabodies)、四聚抗體(tetrabodies)、微型抗體(minibodies)、奈米抗體(nanobodies)(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小組合單元免疫藥劑(SMIPs)、及鯊魚可變IgNAR功能部位，亦均涵蓋於本文所用之"抗原結合片段"表示法中。
抗體之抗原結合片段典型地包含至少一個可變功能部位。可變功能部位可為任何大小或胺基酸組成，通常包含與一或多個框架序列鄰接或於框架內之至少一個CDR。於具有與VL功能部位相關的VH功能部位之抗原結合片段中，VH及VL功能部位可呈任何適當排列互相關連。舉例而言，該可變區可由兩部分組成及含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。替代地，抗體之抗原結合片段可含單體之VH或VL功能部位。
於特定具體實例中，抗體之抗原結合片段可含有與至 少一個恒定功能部位共價連接之至少一個可變功能部位。於本發明抗體之抗原結合片段中可發現的可變及恒定功能部位之非限制性、例示結構包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。於可變及恒定功能部位之任何結構(包括上文列舉之任何例示結構)中，該等可變及恒定功能部位可直接彼此互相連接或者利用完整或部分鉸合或鏈接區連接。鉸合區可由至少2個(例如，5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸組成，彼等於單一多肽分子之相鄰可變及/或恒定功能部位間產生柔性或半柔性之鏈結。再者，本發明抗體之抗原結合片段可包含上文列舉的任何可變及恒定功能部位結構彼此及/或與一或多個單體VH或VL功能部位呈非共價結合(例如，利用雙硫鍵)之同質二聚體或異質二聚體(或其他多聚體)。
與完整抗體分子相同地，抗原結合片段可具單一特異性或多重特異性(例如，雙特異性)。抗體之多重特異性抗原結合片段典型地包含至少兩個不同的可變功能部位，其中各可變功能部位能特異性地與個別抗原或與相同抗原上之不同抗原決定部位結合。任何多重特異性抗體形式，包括本文揭示之例示雙特異性抗體形式，可使用此項技藝中可利用之例行技術，使其適用於本發明抗體之抗原結合 片段。
人類抗體之製備
於基因轉殖小鼠中產生人類抗體之方法為此項技藝中已知。任何此等已知方法均可於本發明場合中使用，以製造特異性地結合人類GCGR之人類抗體。
使用產生單株抗體之VELOCIMMUNETM技術(參見，例如，US 6,596,541，Regeneron Pharmaceuticals，VELOCIMMUNE®)或任何其他已知方法，首先單離出具有人類可變區與小鼠恒定區之對GCGR之高親和性嵌合抗體。VELOCIMMUNE®技術涉及產生具有包含可操作地連接於內源小鼠恒定區部位之人類重鏈及輕鏈可變區基因體之基因轉殖小鼠，俾使小鼠反應抗原刺激而產生包含人類可變區及小鼠恒定區之抗體。單離編碼該抗體重鏈及輕鏈可變區之DNA，可操作地連接於編碼人類重鏈及輕鏈恒定區之DNA；然後於能表現完全人類抗體之細胞中表現該DNA。
通常，係以所關注抗原挑釁VELOCIMMUNE®小鼠，自表現抗體之小鼠回收淋巴細胞(例如B細胞)。使淋巴細胞與骨髓瘤細胞株融合以製備不朽之融合瘤細胞株，篩選此等融合瘤細胞株，挑選以鑑定對所關注抗原產生特異性抗體之融合瘤細胞株。可單離編碼重鏈及輕鏈可變區之DNA，使其連接於期望之重鏈及輕鏈同型恒定區。此等抗體蛋白可於細胞(例如CHO細胞中產生。替代地，編碼該輕鏈及重鏈可變功能部位之抗原特異性嵌合抗體之DNA 可直接從抗原特異性淋巴細胞單離。
首先，單離出具有人類可變區與小鼠恒定區之高親和性嵌合抗體。與下文實驗部分一樣地，就期望之特性(包括親和性、選擇性、抗原決定部位等)鑑定及挑選抗體。小鼠恒定區以所需人類恒定區替換，以產生本發明之完全人類抗體，例如野生型或經修飾之IgG1或IgG4。雖然所選定之恒定區可能根據特定用途而不同，惟高親和性抗原結合及標的特異性特徵係存在可變區中。
一般而言，本發明抗體具有很高的親和性，與固定於固相或呈溶液相之抗原結合進行測定時，典型地具有約10-12 M至約10-9 M之KD。小鼠恒定區以所需人類恒定區替換，以產生本發明之完全人類抗體。雖然所選定之恒定區可能根據特定用途而不同，惟高親和性抗原結合及標靶特異性特徵係存在可變區中。
生物等效性
本發明之抗GCGR抗體及抗體片段涵蓋具有與所述抗體不同惟保留結合人類GCGR能力的胺基酸序列之蛋白質。此等變異抗體及抗體片段相較於母序列時，包含一或多個胺基酸增添、刪除、或置換，惟展現實質上等同所述抗體之生物活性。同樣地，本發明之編碼抗GCGR抗體之DNA序列涵蓋相較於所揭示序列時，包含一或多個核苷酸增添、刪除、或置換，惟編碼實質上與本發明抗GCGR抗體或抗體片段具生物等效性之抗GCGR抗體或抗體片段之序列。
兩個抗原結合蛋白或抗體若，舉例而言，於類似實驗條件下，投與相同莫耳劑量(無論單一劑量或多次劑量)時，其吸收率及吸收程度未顯示明顯差異，為醫藥等效物或醫藥替代物，則被認為具生物等效性。一些抗體之吸收程度相同惟其吸收率不同，卻仍被視為具生物等效性，因為此等吸收率差異乃有意圖且反映在標記測定上，對於獲得有效體內藥物濃度並非必要，例如，長期使用；被認為對於所研究之特定藥品就醫藥上而言無足輕重，因此被視為係等效物或醫藥替代物。
於一具體實例中，兩個抗原結合蛋白若其安全性、純度、及效力無臨床上具意義之差異，則具生物等效性。
於一具體實例中，若病患可於參考產品與生物產品間轉換一或多次，相較於無此等轉換之持續治療下，並無預期之不利影響(包括免疫原性於臨床上顯著變化或有效性減少)風險增加，則此二抗原結合蛋白具生物等效性。
於一具體實例中，兩個抗原結合蛋白若均經由使用狀況之共同機制作用至該等機制為已知之程度，則此二抗原結合蛋白具生物等效性。
生物等效性可利用活體內及活體外方法證明。生物等效性測定法包括，例如，(a)於人類或其他哺乳動物中之活體內試驗，其中係以時間為函數測定血液、血漿、血清、或其他生物液體中抗體或其代謝物之濃度；(b)相關聯並合理預測人類活體內生物利用率數據之活體外試驗；(c)於人類或其他哺乳動物中之活體內試驗，其中係以時間為函數 測定抗體(或其標靶)之適當急性藥理效應；及(d)建立抗體之安全性、功效、或生物利用性或生物等效性之經良好控制之臨床試驗。
本發明抗GCGR抗體之生物等效性變異體可利用，例如，進行非生物活性需要之殘基或序列置換或終端或內部殘基或序列之刪除予以構築。舉例而言，可刪除非生物活性必要之半胱胺酸殘基或以其他胺基酸替換，以防止復性後形成不需要或不正確之分子內雙硫橋鍵。於其他場合中，生物等效抗體可包括包含胺基酸變化(修飾抗體之醣化特性，例如，消除或去除醣化之變異)之抗GCGR抗體變異體。
抗體之生物特性
一般而言，本發明抗體可藉由結合於hGCGR之至少一細胞外區域而作用。於特定具體實例中，本發明抗體可結合於至少位於hGCGR之N端區域之抗原決定部位，或位於至少一細胞外(EC)環之抗原決定部位。
於特定具體實例中，本發明抗體可藉由結合於細胞外N端區域(其胺基酸序列示於SEQ ID NO：159，係由示於SEQ ID NO：158之核酸序列編碼)，利用封阻或抑制GCGR活性而作用。
於特定具體實例中，本發明抗體藉由結合於整個受體內至少一個EC環或環片段，利用封阻或抑制GCGR活性而作用。於一具體實例中，本發明抗體可結合於位於EC1之抗原決定部位，其係位於SEQ ID NO：153之約胺基酸 殘基194至約胺基酸殘基226之間。替代地，或附加地，本發明抗體可結合於在EC2中發現之抗原決定部位，其係位於SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基285至約胺基酸殘基302之間。替代地，或此外，本發明抗體可結合於在EC3中發現之抗原決定部位，其係位於SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基369至約胺基酸殘基384之間。
於特定具體實例中，本發明抗體可為雙重特異性抗體。本發明之雙重特異性抗體可結合EC1中之一抗原決定部位，亦可結合EC1以外的hGCGR區域中之一抗原決定部位。於特定具體實例中，本發明之雙重特異性抗體可結合EC1中之一抗原決定部位，亦可結合EC2或EC3中、或N端區域中、或hGCGR之EC1、EC2、或EC3內任何其他區域中、或其任何組合之一抗原決定部位。於特定具體實例中，本發明之雙重特異性抗體可結合於相同細胞外區域內的兩個不同部位。
更具體而言，本發明之抗GCGR抗體可展現一或多個下述特性：(1)結合於人類GCGR或其片段及結合於非人類(例如，小鼠、猴子、大鼠、兔、狗、豬等)GCGR或其片段之能力；(2)結合於人類GCGR或其片段，惟不結合於非人類(例如，小鼠、猴子、大鼠、兔、狗、豬等)GCGR或其片段之能力；(3)結合於人類GCGR或其片段及結合於非人類靈長類(例如猴子)GCGR或其片段，惟不結合於小鼠、大鼠、兔、狗或豬GCGR或GCGR片段之能力；(4)結合於人類GCGR或其片段與結合於非人類靈長類(例如 猴子)GCGR或其片段，及結合於小鼠GCGR或其片段，惟不結合於大鼠GCGR之能力；(5)結合於人類GCGR或其片段與結合於非人類靈長類(例如猴子)GCGR或其片段，及結合於大鼠GCGR或其片段，惟不結合於小鼠GCGR之能力；6)封阻胰高血糖素結合於GCGR；7)封阻胰高血糖素誘發cAMP生產；8)於罹患糖尿病人類及糖尿病動物模式中展現降低血糖量之能力；9)可能或可能不會將三酸甘油酯量降低至於正常哺乳動物中之觀測量；或10)對血漿脂質量不會有負面影響。
本發明之特定抗GCGR抗體能於活體外或活體內分析中抑制或減弱GCGR活性。本發明抗體與GCGR結合及抑制胰高血糖素與GCGR結合之能力可使用熟習此項技藝者已知之任何標準方法，包括結合分析、報導子生物分析(例如螢光素酶報導子分析)進行測定。
於本文實例4及5中，說明用於測量GCGR活性之非限制性例示活體外分析。實例4，利用表面電漿子共振測定人類抗hGCGR抗體之結合親和性及動力學常數，於T100 Biacore儀器上進行測量。實例5，於表現全長人類、猴子及小鼠GCGR以及螢光素酶報導子之HEK293細胞株中展開生物分析，俾便檢測經由Gαs之活化，及隨後之cAMP量上升與轉錄活化。實例6、7、8、9與10證明於各種動物模式中，該抗體於活體內對血糖量、血酮量降低，及減重之影響。
本發明亦包括結合於下述任何蛋白質、或胜肽之至少 一個生物活性片段之抗GCGR抗體及其抗原結合片段：SEQ ID NO：153(全長hGCGR)、SEQ ID NO：153之殘基編號27-144(hGCGR N端功能區)；SEQ ID NO：153之殘基194-226；SEQ ID NO：153之殘基285-305；SEQ ID NO：153之殘基369-384。本文敘述之任何GCGR胜肽、或其片段，可用以產生抗GCGR抗體。
該等胜肽可經修飾而包括供標記用或為達接合於載劑分子(例如，KLH)目的之特定殘基之添加或替換。舉例而言，可於胜肽之N端或C端添加半胱胺酸，或可添加連接子序列以製備供接合於，例如，免疫處理用KLH之胜肽。GCGR特異性抗體可不含附加之標誌或部分，或可含N端或C-終端標誌或部分。於一具體實例中，該標誌或部分為生物素。於結合分析中，標誌(若有的話)之位置可確定相對於胜肽所結合表面，該胜肽之位向。舉例而言，若表面被覆抗生物素蛋白，則含N端生物素之胜肽將會定向使該胜肽之C端部分在該表面之遠側。
於一具體實例中，本發明提供特異性地結合hGCGR及中和hGCGR活性之完全人類單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段展現一或多個下述特性：(i)包含具有選自由SEQ ID NO：2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130、與146組成之組群之胺基酸序列之HCVR；(ii)包含具有選自由SEQ ID NO：10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138、與148組成之組群之胺基酸序列之LCVR；(iii)包含選自由SEQ ID NO：4、20、36、52、72、92、112與132組成之組群之任一或多個重鏈CDR1序列；選自由SEQ ID NO：6、22、38、54、74、94、114與134組成之組群之任一或多個重鏈CDR2序列；選自由SEQ ID NO：8、24、40、56、76、96、116與136之組群之任一或多個重鏈CDR3序列；選自由SEQ ID NO：12、28、44、60、80、100、120與140組成之組群之任一或多個輕鏈CDR1序列；選自由SEQ ID NO：14、30、46、62、82、102、122與142組成之組群之任一或多個輕鏈CDR2序列；選自由SEQ ID NO：16、32、48、64、84、104、124與144組成之組群之任一或多個輕鏈CDR3序列；及其組合；(iv)對下述任一或多者顯示結合特異性：包含SEQ ID NO：153之胺基酸殘基27-144之GCGR N端區域，或GCGR之任一或多個細胞外環(包括，例如，EC1、EC2、或EC3；其中EC1包含SEQ ID NO：153之約殘基194至約殘基226範圍內之胺基酸殘基；及其中EC2包含SEQ ID NO：153之約殘基285至約殘基305範圍之胺基酸殘基；及其中EC3包含SEQ ID NO：153之約殘基369至約殘基384範圍之胺基酸殘基)；(v)結合任一或多個人類、猴子、小鼠或大鼠GCGR；(vi)封阻胰高血糖素與GCGR之結合；vi)封阻胰高血糖素誘發之cAMP生產；vii)於罹患糖尿病人類或糖尿病動物模式中顯示降低血糖量或血酮量之能力；viii)可能或可能不會使三酸甘油酯量降低至於正常哺乳動物中之觀測量；或ix)對血漿脂質量不會有負面影響。
抗原決定部位圖譜定位(Mapping)及相關技術
為了篩選結合於特定抗原決定部位之抗體，可進行例如見述於Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)之例行交叉封阻試驗。其他方法包括丙胺酸掃描式突變分析、肽墨點分析法(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248：443-463)(其全部內容特別併入本文以資參考)、或肽切割分析法。此外，可使用例如去除抗原決定部位、抽取抗原決定部位及抗原之化學修飾等方法(Tomer,2000,Protein Science 9：487-496)(其全部內容特別併入本文以資參考)。
"抗原決定部位"一詞係指於抗原上B及/或T細胞有反應之位點。B細胞抗原決定部位可由蛋白質三級摺疊而相鄰之連續胺基酸或者非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定部位暴露於變性溶劑時通常仍保留；而由三級摺疊形成之抗原決定部位以變性溶劑處理時通常會喪失。於獨特空間構形中，抗原決定部位通常包括至少3個，更通常為至少5個或8至10個胺基酸。
修飾-輔助剖析(Modification-Assisted Profiling)(MAP)，亦為所謂以抗原結構為基底之抗體剖析(ASAP)，乃根據各抗體與經化學或酵素修飾之抗原表面結合概況之相似性，針對相同抗原將大量mAbs分類之方法(US 2004/0101920，其全部內容特別併入本文以資參考)。各類別可能反映出獨特抗原決定部位與其他類別所示抗原決定部位係明顯不同或係部分重疊。此技術容許迅速過濾基 因相同之mAbs，俾使集中精力鑑定基因不同之mAbs。應用於融合瘤篩選時，MAP有助於確認產生具有所需特徵之mAbs之罕見融合瘤株。MAP可用以將本發明抗GCGR mAbs依結合抗原決定部位之不同進行分類。
於特定具體實例中，抗體之抗GCGR抗體或抗原結合片段結合GCGR至少一個細胞外區域內之抗原決定部位或其片段，其中胞外區域為N端功能區，或如先前敘述EC環(包括EC1、EC2、或EC3)之一。
於一具體實例中，抗體結合GCGR N端區域內之抗原決定部位，或其片段包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基27至144範圍內之胺基酸序列。於一具體實例中，抗體結合EC1內之抗原決定部位，或其片段包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基194至226範圍內之胺基酸序列。於一具體實例中，抗體結合EC2內之抗原決定部位，或其片段包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基285至305範圍內之胺基酸序列。於一具體實例中，抗體結合EC3內之抗原決定部位，或其片段包含SEQ ID NO：153之約胺基酸殘基369至384範圍內之胺基酸序列。
於特定具體實例中，抗體或抗體片段結合包括N端功能區內，或EC1、EC2、或EC3內，及/或二或三個不同細胞外區域內GCGR之一個以上列舉之抗原決定部位(例如，N端區域、EC1、EC2與EC3環內，或EC1、EC2、與EC3內，或N端區域、EC2與EC3環內，或N端區域、EC1與EC3環內之抗原決定部位。
於特定具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合GCGR一胞外區域內之一抗原決定部位及GCGR不同胞外區域內之另一抗原決定部位，其中胞外區域包括N端功能區、或EC1、EC2、或EC3。
於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR N端區域中之一抗原決定部位及hGCGR EC1中之另一抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR N端區域中之一抗原決定部位及hGCGR EC1中之另一抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR N端區域中之一抗原決定部位及hGCGR EC2中之另一抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR N端區域中之一抗原決定部位及hGCGR EC3中之另一抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR EC1中之一抗原決定部位及hGCGR EC2中之另一抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR EC1中之一抗原決定部位及hGCGR EC3中之另一抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR EC2中之一抗原決定部位及hGCGR EC3中之另一抗原決定部位。
於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR N端功能部位中之一抗原決定部位(其中該一抗原決定部位之範圍為SEQ ID NO：153之約殘基27至約殘基144)及hGCGR EC1中之第二抗原決定部位(其中該第 二抗原決定部位之範圍為SEQ ID NO：153之殘基編號約194至殘基編號約226)。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR N端功能部位中上文標註殘基內之一抗原決定部位，及hGCGR EC2中之第二抗原決定部位(其中該第二抗原決定部位之範圍為SEQ ID NO：153之殘基編號約285至殘基編號約305)。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR N端功能部位中上文標註殘基內之一抗原決定部位，及hGCGR EC3中之第二抗原決定部位，(其中該第二抗原決定部位之範圍為SEQ ID NO：153之殘基編號約369至殘基編號約384)。
於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合hGCGR EC1中SEQ ID NO：153之約殘基194至約殘基226之一抗原決定部位及GCGR EC2中SEQ ID NO：153之約殘基285至約殘基305之一抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合EC1中SEQ ID NO：153之約殘基194至約殘基226之一抗原決定部位及GCGR EC3中SEQ ID NO：153之約殘基369至約殘基384之第二抗原決定部位。於一具體實例中，抗體為雙重特異性抗體，其結合EC2中SEQ ID NO：153之約殘基285至約殘基305之一抗原決定部位及GCGR EC3中SEQ ID NO：153之約殘基369至約殘基384之第二抗原決定部位。
本發明包括與如本文所述任何特定例示抗體相同抗原決定部位結合之抗GCGR抗體(例如，H4H1345N、H4H1617N、H4H1765N、H4H1321B與H4H1321P、 H4H1327B與H4H1327P、H4H1328B與H4H1328P、H4H1331B與H4H1331P、H4H1339B與H4H1339P)。同樣地，本發明亦包括與本文所述任何特定例示抗體競爭與GCGR或GCGR片段結合之抗GCGR抗體。
使用此項技藝中已知之例行方法易於測定抗體是否與基準抗GCGR抗體結合於相同抗原決定部位，或與基準抗GCGR抗體競爭結合。舉例而言，欲確定測試抗體與本發明之基準抗GCGR抗體是否結合於相同抗原決定部位時，則於飽和條件下，令基準抗體與GCGR蛋白或胜肽結合。接著，評估測試抗體與GCGR分子結合之能力。若測試抗體能結合於與基準抗GCGR抗體飽和結合後之GCGR，即可斷定該測試抗體與基準抗GCGR抗體結合於不同抗原決定部位。另一方面，若測試抗體不能結合於與基準抗GCGR抗體飽和結合後之GCGR分子，則該測試抗體可能結合於與本發明基準抗GCGR抗體結合之相同抗原決定部位
欲確定抗體是否與基準抗GCGR抗體競爭結合，乃從兩個方向進行上述結合方法：第一個方向中，於飽和條件下，令基準抗體結合於GCGR分子，隨後評估測試抗體與該GCGR分子之結合；第二個方向中，於飽和條件下，令測試抗體結合於GCGR分子，隨後評估基準抗體與該GCGR分子之結合。若，兩個方向中，僅有第一個(飽和)抗體能與GCGR分子結合，則可斷定測試抗體與基準抗體競爭結合於GCGR。熟習此項技藝人士將察知，與基準抗 體競爭結合之抗體不必然與基準抗體結合於相同抗原決定部位，惟可能藉由結合重疊或相鄰抗原決定部位而立體位阻基準抗體之結合。
兩個抗體若各自競爭性地抑制(封阻)另一者與抗原之結合，亦即，如競爭性結合試驗(參見，例如，Junghans et al.,Cancer Res.1990：50：1495-1502)之測定中，1-、5-、10-、20-或100-倍過量之一抗體抑制至少50%惟較佳為75%、90%或甚至99%另一抗體之結合，則此二抗體結合於相同或重疊之抗原決定部位。替代地，若實質上抗原中減少或消除一抗體之結合之所有胺基酸變異亦減少或消除另一抗體之結合，則兩個抗體具有相同抗原決定部位。只要減少或消除一抗體之結合之若干胺基酸變異減少或消除另一抗體之結合，則此二抗體具有重疊之抗原決定部位。
然後可進行附加之例行實驗(例如，肽突變及結合分析)，以確定所觀察測試抗體之未結合是否事實上係由於結合於與基準抗體相同之抗原決定部位，或者立體位阻(或另一現象)為所觀察之未結合之主因。此類實驗可使用此項技藝中可用之ELISA、RIA、表面電漿子共振、流式細胞測量術或任何其他定量或定性抗體結合試驗進行。
物種選擇性及物種交叉反應性
根據本發明之特定具體實例，抗GCGR抗體結合於人類GCGR惟不結合於得自其他物種之GCGR。替代地，本發明之抗GCGR抗體，於特定具體實例中，結合於人類GCGR及結合於得自一或多個非人類物種之GCGR。舉例 而言，本發明之抗GCGR抗體可結合於人類GCGR，及視情況而可結合或不結合於小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、乳牛、馬、駱駝、食蟹獼猴、狨猴、恆河猴或黑猩猩GCGR之一或多者。
免疫接合物
本發明涵蓋與具療效成分(例如能減少血糖量之製劑、或放射性同位素、或化學治療劑)接合之抗GCGR單株抗體(“免疫接合物”)。可接合於抗GCGR抗體之具療效成分類型將慮及擬治療之症狀及欲達成之期望治療效果。舉例而言，就治療糖尿病，或需要降低血糖之任何其他症狀，及/或欲維持正常血糖量而言，可使下述製劑例如雙胍(例如滅糖錠)、磺醯脲(例如優降糖、泌樂得)、PPAR γ促效劑(例如吡格列酮、羅格列酮)；α葡萄糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖、培欣)、晚期糖化終產物形成抑制劑(例如胺基胍)、或第二GCGR抑制劑等與GCGR抗體接合。替代地，若期望治療之效果為治療與糖尿病相關之後遺症或徵候，由於高血糖或或不受控制之血糖量產生之任何其他症狀，則以接合適用於治療該症狀之後遺症或徵候之製劑為有利。用於形成免疫接合物之適當製劑為此項技藝中已知，參見，例如，WO 05/103081。
多重特異性抗體
本發明抗體可具單一特異性、雙重特異性、或多重特異性。多重特異性抗體可對標靶多肽之不同抗原決定部位具特異性或可含有對一種以上標靶多肽具特異性之抗原 結合功能部位。參見，例如，Tutt et al.,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明之抗GCGR抗體可連接於另一功能分子(例如，另一胜肽或蛋白質)或與其共表現。舉例而言，抗體或其片段可功能性地連接(例如，利用化學偶聯、基因融合、非共價結合或其他方法)於一或多個其他分子實體(例如另一抗體或另一片段)，以產生具有第二個結合特異性之雙重特異性或多重特異性抗體。舉例而言，本發明包括雙重特異性抗體，其中免疫球蛋白之一臂對人類GCGR或其片段具特異性，其另一臂對第二治療標靶具特異性或係接合於具療效成分。於本發明特定具體實例中，免疫球蛋白之一臂對hGCGR N端功能區或其片段上之抗原決定部位具特異性，其另一臂對hGCGR一EC環或其片段上之抗原決定部位具特異性。於特定具體實例中，免疫球蛋白之一臂對一EC環或其片段具特異性，第二臂對第二EC環或其片段具特異性。於特定具體實例中，免疫球蛋白之一臂對hGCGR一EC環上之一抗原決定部位具特異性，另一臂對hGCGR相同EC環上之第二抗原決定部位具特異性。
可用於本發明場合之例示雙重特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白(Ig)CH3功能部位及第二個Ig CH3功能部位，其中該第一及第二個Ig CH3功能部位至少一個胺基酸彼此不同，及其中至少一個胺基酸差異，相較於缺乏該胺基酸差異之雙重特異性抗體，減少了雙特異性抗體 與蛋白A之結合。於一具體實例中，第一個Ig CH3功能部位結合蛋白A，第二個Ig CH3功能部位含有減少或破壞蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(根據IMGT表現序列編號；H435R，根據EU編號)。第二個CH3可進一步包含Y96F修飾(根據IMGT；Y436F，根據EU)。可於第二個CH3中發現之進一步修飾包括於IgG1抗體情形下之D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、與V82I(根據IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、與V422I，根據EU)；於IgG2抗體情形下之N44S、K52N、與V82I(IMGT；N384S、K392N、與V422I，根據EU)；及於IgG4抗體情形下之Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、與V82I(根據IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、與V422I，根據EU)。雙重特異性抗體形式上之上述變異均涵蓋於本發明範圍之內。
治療性投與及調配物
本發明提供包含本發明抗GCGR抗體或其抗原結合片段之治療組成物。根據本發明治療組成物之投與係與併入調配物中之適當載劑、賦形劑、及其他製劑一起投與以提供增進轉移、遞送、耐受性等。許多適當調配物可於所有醫藥化學家已知之處方中發現：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。彼等調配物包括，舉例而言，粉劑、糊劑、軟膏、凝膠、蠟類、油類、脂質類、含囊泡之脂質(陽離子性或陰離子性)(例如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收 糊劑、水包油型及油包水型乳劑、碳蠟乳劑(各種分子量之聚乙二醇)、半固態凝膠、及含碳蠟之半固態混合物。亦參見Powell et al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
抗體劑量可隨投與對象年齡與大小、標的疾病、症狀、投與途徑等而不同。當本發明抗體於用於降低血糖量之與GCGR活性相關之各種症狀及疾病(例如成人病患之糖尿病)時，可有利地以約0.01至約30毫克/公斤體重，更佳為約0.02至約7、約0.03至約5、或約0.05至約3毫克/公斤體重之單一劑量經靜脈內投與本發明抗體。視症狀嚴重性而定，可調整治療頻率及持續時間。於特定具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可呈至少約0.1毫克至約800毫克、約1至約500毫克、約5至約300毫克、或約10至約200毫克、至約100毫克、或至約50毫克之初始劑量投與。於特定具體實例中，初始劑量之後可投與其量與初始劑量大約相同或較少之抗體或其抗原結合片段之第二個或多個接續劑量，其中接續劑量係相隔至少1天至3天、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少12週、或至少14週。
已知有多種遞送系統可用於投與本發明醫藥組成物，例如：封裝於脂質體、微粒、微膠囊中；能表現突變病毒之重組細胞；受體媒介之胞吞作用(參見，例如，Wu et al.(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入之方法包括，惟不限於，皮膚內、經皮、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上、及經口等途徑。組成物可利用任何方便之途徑投與，例如輸注或推注、經由上皮或皮膚黏膜層(例如，口腔黏膜、直腸與腸黏膜等)吸收，及可與其他生物活性劑一起投與；投與可為全身性或局部性。
醫藥組成物亦可於囊泡(特別是脂質體)中遞送(參見，例如，Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
於特定情況下，醫藥組成物可於控制釋放系中遞送。於一具體實例中，可使用泵。於另一具體實例中，可使用聚合物材料。於又另一具體實例中，控制釋放系係置於組成物之標的附近，因此只需要全身性劑量之一小部分。
注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌內注射、滴注等劑量型。彼等注射製劑可利用公開已知之方法製備；舉例而言，注射製劑可，例如，在習用於注射之無菌水性介質或油性介質中溶解、懸浮或乳化上述抗體或其鹽進行製備。注射用水性介質，舉例而言，為生理鹽液、含有葡萄糖及其他輔助劑之等張溶液等，彼等可與適當助溶劑例如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50莫耳)加成物)]等組合使用。油性介質，可使用，例如，芝麻油、大豆油等，彼等可與助溶劑例如苯甲酸苄酯、苄醇等組合使 用。如此製備之注射劑較佳為裝填於適當安瓿中。
本發明醫藥組成物可使用標準注射針與注射器經由皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送、一種筆型遞送裝置很容易地已應用於遞送本發明醫藥組成物。此等筆型遞送裝置可為重複使用式或拋棄式。重複使用式筆型遞送裝置通常利用含有醫藥組成物之可置換匣；匣內所有醫藥組成物一旦投與完畢成為空匣，則該空匣即被丟棄，替換成含有醫藥組成物之新匣；然後重複使用該筆型遞送裝置。拋棄式筆型遞送裝置中則無可置換匣；而於裝置內儲存器中預先裝填醫藥組成物；儲存器內之醫藥組成物一旦用完後，整個裝置即被丟棄。
許多重複使用式筆型及自動注射器遞送裝置已應用於本發明醫藥組成物之皮下遞送；其實例包括，惟當然不限於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆型(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆型、HUMALOGTM筆型、HUMALIN 70/30TM筆型(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、IIh與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆型(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM、及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)等等。已應用於本發明醫藥組成物皮下遞送之拋棄式筆型遞送裝置之實例包 括，惟當然不限於SOLOSTARTM筆型(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、與KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)、及HUMIRATM筆型(Abbott Labs,Abbott Park IL)等等。
有利地，供上述經口或非經腸用途之醫藥組成物係配合活性成分之劑量，製備為呈單位劑量之劑量型。此等呈單位劑量之劑量型包括，舉例而言，錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。每一呈單位劑量之劑量型所含前述抗體之量通常為約5至約500毫克；尤其是呈注射形式，較佳為所含前述抗體為約5至約100毫克，其他劑量型則為約10至約250毫克。
抗體之治療用途
本發明抗體由於與胰高血糖素受體相互作用，因此可用於降低血糖量，亦可用於封阻胰高血糖素與其受體之相互作用對其有利之寬廣範圍之症狀與疾患。彼等疾患與症狀可選自任何胰高血糖素相關代謝失調症(其涉及導致該失調症之病理生理學或對該失調症之恆定反應之胰高血糖素受體傳訊)。因此，彼等抗體舉例而言可於預防、治療、或減輕內分泌系、中樞神經系、周邊神經系、心血管系、肺系、及胃腸系之疾病或症狀或相關徵候或後遺症之同時，減少及/或消除與目前治療相關之一或多個有害副作用上尋得用途。胰高血糖素相關代謝失調症包括，惟不 限於，第1型與第2型糖尿病、糖尿病酮酸症、高血糖症、高血糖高滲壓症候群、手術期間高血糖症、加護病房病患高血糖症、高胰島素血症、餐後糖尿病酮酸症、空腹血糖異常(IFG)、代謝症候群、高/低鉀血症、LDL/HDL比低、飲食失調、體重增加、糖尿病後果之肥胖症、小兒糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病晚期併發症、微量/巨量白蛋白尿、腎病、視網膜病變、神經病變、糖尿病足潰瘍、創傷癒合、葡萄糖耐量異常(IGT)、胰島素抗性症候群、X症候群、胰高血糖素瘤、胃腸失調、肥胖症、肥胖症後果之糖尿病等。本發明進一步提供：於哺乳動物中治療起因於過量胰高血糖素之疾病之方法；於哺乳動物中抑制胰高血糖素受體之方法；於哺乳動物中抑制胰高血糖素受體媒介之細胞反應之方法；或於哺乳動物中減少血糖量之方法，包括投與需要此等治療之哺乳動物胰高血糖素受體抑制量之抗GCGR抗體或其生物活性片段。
本發明抗體於空腹及餐後階段均具降低血糖之效力。於本發明特定具體實例中，本發明抗體係用於製備治療第2型糖尿病之醫藥組成物。於本發明又進一步具體實例中，本發明抗體係用於製備延緩或預防從葡萄糖耐量異常進展成為第2型糖尿病之醫藥組成物。於本發明又另一具體實例中，本發明抗體係用於製備延緩或預防從非胰島素需要型糖尿病進展成為胰島素需要型糖尿病之醫藥組成物。於本發明進一步具體實例中，本發明抗體係用於製備治療第1型糖尿病之醫藥組成物；此類治療通常伴隨胰 島素治療。
組合療法
組合療法可包括本發明之抗hGCGR抗體及可有利地與本發明抗體或本發明抗體之生物活性片段組合之任何附加治療劑。
舉例而言，第二治療劑可於罹患特徵為高血糖量之疾病或症狀(例如糖尿病)之病患中，用以幫助進一步降低葡萄糖量，或減少至少一種徵候。此類第二劑可選自，舉例而言，胰高血糖素拮抗劑或另一GCGR拮抗劑(例如抗胰高血糖素或抗GCGR抗體或胰高血糖素或GCGR之小分子抑制劑)，或可包括用於治療糖尿病、或與血糖量升高相關或由其產生之其他疾病或症狀、或葡萄糖代謝不良之其他治療成分，或用於治療與升高及/或不受控制之血糖量相關之任何長期併發症之製劑。彼等製劑包括雙胍類[降低肝臟中之葡萄糖生產及增加對胰島素之敏感性(例如滅糖錠)]、或磺醯脲類[刺激胰島素生產(例如優降糖、泌樂得)]。針對維持葡萄糖體內平衡之附加處理包括PPAR γ促效劑[具胰島素敏化劑之作用(例如吡格列酮、羅格列酮)]、及α葡萄糖苷酶抑制劑[減緩澱粉吸收及葡萄糖生產(例如阿卡波糖、培欣)]。附加之治療包括例如Exenatide®(胰高血糖素樣肽1)、Symlin®(普蘭林)等之注射治療。
於其他特定具體實例中，該組成物可包括選自包括非 磺醯脲促分泌素、胰島素、胰島素類似物、依森錠-4多肽、β 3腎上腺素受體促效劑、PPAR促效劑、二肽基肽酶IV抑制劑、他汀類與含他汀之組合物、膽固醇吸收抑制劑、LDL-膽固醇拮抗劑、膽固醇酯轉移蛋白拮抗劑、內皮素受體拮抗劑、生長激素拮抗劑、胰島素敏化劑、澱粉素類似物或促效劑、大麻鹼受體拮抗劑、胰高血糖素樣肽-1促效劑、黑細胞促素皮促素、黑色素濃集激素受體促效劑、SNRIs、與蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑之組群之第二劑。
於其他特定具體實例中，組合療法可包括投與對抗由於投與本發明抗體產生之任何潛在副作用(若存在此類副作用)之第二劑。舉例而言，於任何抗GCGR抗體增加脂質或膽固醇量之情形下，以投與降低脂質或膽固醇量之第二劑，使用例如HMG-CoA還原酶抑制劑[舉例而言，他汀類例如阿托伐他汀(LIPITOR®)、氟伐他汀(LESCOL®)、洛伐他汀(MEVACOR®)、匹伐他汀(LIVALO®)、普伐他汀(PRAVACHOL®)、羅素伐他汀(CRESTOR®)與辛伐他汀(ZOCOR®)等製劑為有利。替代地，本發明抗體可與例如VYTORIN®(其為他汀類製劑)及另一製劑-例如伊增替邁/辛伐他汀組合。
於特定具體實例中，以組合投與本發明抗體及下述任一或多者為有利：(1)菸鹼酸(增加脂蛋白分解代謝)；(2)纖維酸類或兩親媒性羧酸類(減少低密度脂蛋白(LDL)量、增進高密度脂蛋白(HDL)與TG量、及減少心臟病發作次數)；與(3)LXR轉錄因子之活化劑(於膽固醇消除上 具作用)例如22-羥膽固醇、或他汀類與膽汁樹脂(例如，消膽胺、考來替泊、考來維倫)、菸鹼酸加他汀類之固定組合物(例如，菸鹼酸與洛伐他汀)；或與其他脂質降低劑如ω-3-脂肪酸乙酯類(例如，歐妙克)組合。
再者，第二治療劑可為胰高血糖素或GCGR之一或多個其他抑制劑，以及涉及脂質代謝，特別是，膽固醇及/或三酸甘油酯體內平衡之其他分子，例如血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)、血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)、血管生成素樣蛋白5(ANGPTL5)、血管生成素樣蛋白6(ANGPTL6)等之抑制劑。彼等分子之抑制劑包括特異性地結合於彼等分子並封阻其活性之小分子及抗體。
於特定具體實例中，以組合投與本發明抗體及具降低脂質或膽固醇量作用之抗體，例如，惟不限於，任何抗PCSK9(前趨蛋白轉化酶枯草桿菌素/克新第9型)抗體，例如見述於US2010/0166768者為有利。其他抗PCSK9抗體見述於US2010/0040611、US2010/0041102、US2010/0040610、US2010/0113575、US2009/0232795、US2009/0246192、US2010/0233177、US2009/0142352、US2009/0326202、US2010/0068199、US2011/0033465、US2011/0027287、US2010/0150937、US2010/0136028與WO2009/055783。
於特定具體實例中，以組合投與本發明抗GCGR抗體與抑制PCSK9(前趨蛋白轉化酶枯草桿菌素/克新第9型)活性之核酸例如反義分子、雙股RNA、或siRNA分子為 有利。抑制PCSK9活性之例示核酸分子見述於US2011/0065644、US2011/0039914、US2008/0015162與US2007/0173473。
彼等附加之治療活性成分可於投與本發明抗GCGR抗體之前、之後、或一起投與。為達本發明揭示內容之目的，此類投與療法被認為係抗GCGR抗體與第二治療活性成分之“組合”投與。
抗體之診斷用途
本發明之抗GCGR抗體亦可用以檢測及/或測定試樣中之GCGR，例如，以供診斷用途。舉例而言，抗GCGR抗體、或其片段可用以診斷其特徵為GCGR異常表現(例如，過度表現、表現不足、沒有表現等)之症狀或疾病。GCGR之診斷分析法可包含，例如，以本發明抗GCGR抗體接觸得自病患之試樣，其中該抗GCGR抗體以可檢測標記或報導分子予以標記，或作為捕捉配體用，以自病患試樣中選擇性地單離出GCGR蛋白。替代地，於診斷應用中可組合使用未標記之抗GCGR抗體及其本身已具檢測標記之二次抗體。可檢測標記或報導分子可為放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、或125I；螢光或化學發光成分例如異硫氰酸螢光素、或若丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶、或螢光素酶。可用以檢測或測定試樣中之GCGR之特定測定法實例包括酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)、及螢光活化細胞分類法(FACS)。
於根據本發明GCGR診斷分析法可使用之試樣包括，於正常或病理狀況下，可自病患獲得之含有可檢測量之GCGR蛋白、或其片段之任何組織或流體試樣。通常，係測定自健康病患(例如，未罹患與異常GCGR量或活性相關疾病或症狀之病患)可獲得之特定試樣中GCGR之量，首先建立GCGR之基線或標準量。然後將此GCGR基線量與得自懷疑具有GCGR相關疾病或症狀的個體之試樣中測得之GCGR量進行比較。
實施例
茲提出下述實例以提供一般熟習此項技藝者如何製造及使用本發明方法與組成物之完整揭示內容與說明，惟不擬限制發明人等視為其發明之範圍。發明人等已致力於確保有關所用數值(例如，數量、溫度等)之準確性，惟若干實驗誤差及偏差應予以說明。除非另行指示，否則份數為重量份，分子量為平均分子量、溫度為攝氏度數，壓力則接近大氣壓力。
實例1. 產生對人類GCGR之人類抗體
包含下述任一者之免疫原可用以產生對hGCGR之抗體。舉例而言，於特定具體實例中係使用表現hGCGR之細胞作為免疫原以產生對hGCGR之抗體。此外，於特定具體實例中係使用編碼hGCGR之DNA作為免疫原以製備本發明抗體。再者，於特定具體實例中，係使用包含得自HGCGRN端功能區之胺基酸序列之胜肽作為免疫原， 以產生對人類GCGR之抗體。此外，於特定具體實例中，可使用包含得自hGCGR之任何細胞外環區域EC1、EC2、或EC3之胺基酸序列之胜肽作為免疫原以產生對人類GCGR之抗體。直接投與如上所述作為免疫原用之細胞、DNA、或胜肽(帶有激發免疫反應之佐劑)於含有編碼人類免疫球蛋白重鏈與輕鏈可變區之DNA之VELOCIMMUNE®小鼠；利用GCGR特異性免疫分析法監測抗體免疫反應。於達成所需免疫反應時，收集脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合以保存其活力及形成融合瘤細胞株。篩檢融合瘤細胞株，鑑別出產生GCGR特異性抗體之細胞株。使用此技術，及上述各種免疫原，獲得數個抗GCGR嵌合抗體(亦即，具有人類可變功能部位及小鼠恒定功能部位之抗體)；以此方式產生之特定例示抗體標明為H4H1345N、H4H1617N與H4H1765N。
如U.S.2007/0280945A1(其全部內容併入本文以玆參考)所述，直接自未融合於骨髓瘤細胞之抗原陽性B細胞中單離出抗GCGR抗體。使用此方法，獲得數個完全人類抗GCGR抗體(亦即，具有人類可變功能部位及人類恒定功能部位之抗體)；以此方式產生之例示抗體標明如下：H4H1321B、H4H1321P、H4H1327B、H4H1327P、H4H1328B、H4H1328P、H4H1331B、H4H1331P、H4H1339B與H4H1339P。
茲於下文提出之實施例中詳細敘述根據此實例方法產生之例示抗GCGR抗體之生物性質。
實例2. 重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列
表1列載所選定抗GCGR抗體及其對應抗體識別符之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列對。具有相同數值抗體名稱，惟詞尾字母N、B或P不同之抗體係指具有相同CDR序列惟序列變異落在CDR序列外側區域(亦即，於框架區中)之重鏈及輕鏈之抗體。因此，特定抗體之N、P與G變異體於其重鏈及輕鏈可變區內具有相同CDR序列，惟其框架區內彼此不同。
實例3. 可變基因利用分析
欲分析所產生抗體之結構，乃將編碼抗體可變區之核酸轉殖並定序。從核酸序列及預測之抗體胺基酸序列，鑑定各重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)之基因用 法。表2顯示根據本發明所挑選抗體之基因用法。
實例4. 利用表面電漿子共振測定之抗體與可溶性GCGR之結合
於25℃及37℃，利用表面電漿子共振測定人類單株抗hGCGR抗體結合於人類及猴子可溶性重組hGCGR胞外結構區域(分別為hGCGR及MfGCGR)之結合親和性及動力學常數；於T100 Biacore儀器上進行測定。經由共價連接之抗人類抗體捕捉表面，捕捉抗體於Biacore感測器晶片表面，施敷呈單價(以myc-myc-六-組胺酸C端標記表現之hGCGR)或二價(以N端Fc融合表現之hGCGR及MfGCGR)形式之可溶性GCGR蛋白於該表面。此實例所用試劑之胺基酸序列識別符示於表3。
以3.1 nM至50 nM不等之多個濃度、分別注射施加可溶性GCGR於流式細胞，使用Scrubber v2.0a曲線擬合軟體，藉由擬合數據於1：1結合模式，測定動力學結合(ka)與解離(kd)速率常數。結合解離平衡常數與解離半衰期係以動力學速率常數計算如下：KD=kd/ka；t1/2=(ln2/kd)。
如表4a與4b所示，例示抗體展現結合於人類與猴子GCGR可溶性蛋白之高親和性。當流動之二價hGCGR與 單價hGCGR比較時，觀察到結合親和性顯著增加(5倍至15倍)。相較於hGCGR，諸抗體一致地以較高親和性(3倍至10倍)與猴子變異體(MfGCGR)結合。
實例5. 測定抗GCGR抗體對GCGR活化作用之生物分析
GCGR係G蛋白偶合性受體，其配體，胰高血糖素(GCG)，經由Gαs及由於Gq之磷酸肌醇轉變刺激腺苷酸環化酶活性[Jiang and Zhang,(2003),Am J Physiol Endocrinol Metab 284：E671-E678]。一種生物分析法被開發，以檢測經由Gαs，隨後cAMP量上升及轉錄活化之活化作用。產生HEK293細胞株，以穩定表現全長人類GCGR(GenBank存取編號NP_000151.1；SEQ ID NO：153)、猴子[食蟹獼猴(Macaca fascicularis)]GCGR(SEQ ID NO：155)、及小鼠GCGR(NP_032127.2；SEQ ID NO：154.)以及進行螢光素酶報導子分析。單離穩定之細胞株，保存於10% FBS、DMEM、NEAA、Pen/Strep、與500毫克/毫升G418中。針對大鼠GCGR，表現報導子基因[CRE(4X)-螢光素酶-IRES-GFP]之HEK293細胞株係使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)短暫轉染全長大鼠GCGR(NP_742089.1；SEQ ID NO：156)。
為了進行生物分析，以20,000個細胞/槽之濃度接種293/GCGR細胞於含低血清培養基、0.1%FBS與OPTIMEM之96-槽分析盤中；於37℃與5% CO2下培育過夜。隔天， 使GCG進行1：3系列稀釋，從100nM開始至0.002nM(包括無GCG之對照組)添加至細胞中，進行劑量反應。關於抑制作用，係使抗體進行1：3系列稀釋，從200開始至0.003(hGCGR細胞)或從100 nM開始至0.002 nM(猴子、小鼠與大鼠GCGR細胞)添加至細胞中，包括固定濃度100pM GCG之無抗體對照組。於37℃與5% CO2下培育5.5小時後，檢測螢光素酶活性。
100 pM GCG刺激各報導子細胞株之EC50值示於表5a。抗體封阻100 pM GCG刺激細胞之IC50值結果示於表5b，包括二對照抗體，對照mAb1(呈hIgG4同型表現之正對照；例如，參見WO2008/036341，標明“A-9”之抗體，其具有SEQ ID NO：275之HCVR、SEQ ID NO：102之HCDR1、SEQ ID NO：128之HCDR2與SEQ ID NO：169之HCDR3，及SEQ ID NO：229之LCVR、SEQ ID NO：14之LCDR1、SEQ ID NO：50之LCDR2與SEQ ID NO：74之LCDR3)及對照mAb2(同型配對之負對照)之結果。
關於抗GCGR抗體對人類GCGR之抑制作用，GCG之活化GCGR顯示以113 pM之EC50刺激螢光素酶活性，且除對照mAb2(同型配對之負對照)外，所有抗體封阻100 pM GCG之活化並降低螢光素酶活性。
有關抗GCGR抗體對猴子GCGR之抑制作用，GCG之活化GCGR顯示以36 pM之EC50刺激螢光素酶活性，且除對照mAb2(同型配對之負對照)外，所有抗體封阻100 pM GCG之活化並降低螢光素酶活性。H4H1765N顯示於所測試抗體最高濃度下GCG之部份抑制。
關於抗GCGR抗體對小鼠GCGR之抑制作用，GCG之活化GCGR顯示以83 pM之EC50刺激螢光素酶活性，且除H4H1345N、H4H1617N、H4H1765N與對照mAb2(同型配對之負對照)外，所有抗體封阻100 pM GCG之活化並降低螢光素酶活性。
有關抗GCGR抗體對大鼠GCGR之抑制，GCG之活化GCGR顯示以252 pM之EC50刺激螢光素酶活性，且除H4H1765N與對照mAb2(同型配對之負對照)外，所有抗體封阻100 pM GCG之活化並降低螢光素酶活性。
總言之，測試8種抗hGCGR完全人類抗體，證實於僅受GCG刺激即顯現113 pM之EC50之報導子細胞株中，對100 pM GCG活化人類GCGR之封阻作用。於猴子GCGR報導子細胞株中，8種測試抗體中有7種完全抑制100 pM GCG之活化。H4H1765N於所測試抗體最高濃度(100 nM)不能完全抑制猴子GCGR。於小鼠GCGR報導子細胞株中，8種抗體中有5種完全抑制100 pM GCG之活化；於大鼠GCGR轉染之報導子細胞中，8種抗體中有7種抑制100 pM GCG之活化。
實例6. 於ob/ob小鼠中抗GCGR抗體之作用
選擇與小鼠GCGR交叉反應之抗hGCGR抗體，測試其於ob/ob小鼠(第2型糖尿病小鼠模式)中降低血糖量之能力。將ob/ob小鼠分成10組，每組5或6隻動物。使各組別接受1或10毫克/公斤各抗體之皮下注射。對照組注射不結合任何已知小鼠蛋白之hIgG同型對照抗體。於分別施用劑量1或10毫克/公斤之抗體2或7天後，以尾部採血從小鼠收集幾滴血液。具體而言，針對給予10毫克/公斤名稱為H4H1327P抗體之組別，於用劑後更頻繁地於2、4、7、9、11、14、16、18、與21天收集尾部血液。以ACCU-CHEK® Compact Plus(Roche)測定尾部血液試 樣之血糖量。於各時間點計算各動物相較於對照組平均血糖量之血糖減少百分比。針對各抗體組別計算平均血糖減少百分比。表6摘述對照組之平均血糖量。血糖減少百分比結果以(平均±SEM)表示，示於表7a與7b。
與注射對照抗體之小鼠相較下，以所測試之抗 hGCGR抗體處理之小鼠(示於表7a與7b)顯示血糖量顯著減少。
實例7. 抗GCGR抗體於表現人類GCGR蛋白之基因轉殖小鼠中之作用
於表現人類GCGR蛋白之基因轉殖小鼠(“人類化GCGR小鼠”)中，測定抗hGCGR抗體對血糖與血漿脂質量之影響。於C57BL6/129(F1H4)胚胎幹細胞中，以人類GCGR基因(SEQ ID NO：157；編碼全長蛋白質，GenBank存取編號NP_000151.1；SEQ ID NO：153)置換小鼠GCGR基因，以產生人類化GCGR小鼠。建立生殖細胞系傳遞後，將異型接合小鼠(GCGR hum/+)一起飼養以產生於C57BL6背景上為同型接合之小鼠(GCGR hum/hum )。將同型接合人類化GCGR小鼠分成10組，每組3或4隻動物。使各組別接受3毫克/公斤各抗體之皮下注射。第I對照組注射不結合任何已知小鼠蛋白之hIgG同型對照抗體。第II對照組注射已被確認減少人類化GCGR小鼠血糖量之抗hGCGR hIgG4抗體。施用抗體後，飼養小鼠3天，以ACCU-CHEK® Compact Plus(Roche)測定血糖量。計算各動物相較於第I對照組平均血糖量之血糖減少百分比。針對各抗體組別計算平均血糖減少百分比。表8a摘述對照組之平均血糖量。血糖減少百分比結果以(平均±SEM)表示，示於表8b。
此外，針對第I對照組、第II對照組及H4H1765N組小鼠，於抗體用劑之前及3與8天後，進行採血，以 ADVIA® 1650 Chemistry System(Siemens)測定血漿脂質量。測定該三組別各者之低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TOTAL-C)、三酸甘油酯(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)量，並計算平均值。血漿脂質濃度結果以(平均±SEM)表示，示於表8c。
與接受對照抗體之小鼠相較下，大部分經所測試抗hGCGR抗體處理之小鼠(示於表8b)顯示血糖量顯著減少。與接受對照抗體之小鼠相較下，經特定測試抗hGCGR抗體處理之小鼠(示於表8c)顯示三酸甘油酯量顯著減少。特別是，觀察到經二抗GCGR抗體，一者為H4H1765N(數據示於下文表8c)，另一者為H4H1327P(數據未示)，降低三酸甘油酯量。
實例8：於小鼠中以抗GCGR抗體及PCSK9(前趨蛋白轉化酶枯草桿菌素/克新第9型)特異性抗體組合治療對血糖、血漿脂質與肝臟三酸甘油酯量之影響
試劑
用於研究C57BL/6小鼠中以抗GCGR抗體與PCSK9特異性抗體組合治療對血糖量、血漿脂質量與肝臟三酸甘油酯量影響之抗體如下：名稱為REGN496之抗hIL4R抗體，其為hIgG4同型對照；名稱為H4H1327P之抗GCGR(hIgG4)抗體；及名稱為H1H316P之抗PCSK9(hIgG1)抗體。HCVR、LCVR、HCDRs、與LCDRs之胺基酸序列識別符示於下文表9。
實驗程序
於C57BL/6小鼠中測定H4H1327P(抗hGCGR抗體)與H1H316P(抗hPCSK9抗體)組合對血糖、血漿脂質、與肝臟三酸甘油酯(TG)量之影響。
H4H1327P與小鼠GCGR交叉反應，H1H316P與小鼠PCSK9交叉反應。將C57BL/6小鼠分成6組，每組6隻動物。各組別一週一次，接受抗體或二抗體組合物之皮下注射。第一組注射10毫克/公斤不結合於任何已知小鼠蛋白之hIgG4同型對照抗體；第二及第三組分別接受3毫克/公斤與10毫克/公斤之H4H1327P；第四組注射10毫克/公斤之H1H316P；第五組接受3毫克/公斤H4H1327P與10毫克/公斤H1H316P之組合物；及第六組注射10毫克/公斤H4H1327P與10毫克/公斤H1H316P之組合物。開始抗體用劑第11與19天後，採取小鼠血液測定血糖與血漿脂質。於第19天，採取肝臟，測定肝臟TG含量。以ACCU-CHEK® Compact Plus(Roche)測定血糖量。計算各動物相較於同型對照組平均血糖量之血糖減少百分比。然後以各組中個別動物之平均交叉值計算各處理組別之血糖減少百分比與相關誤差。血糖減少百分比結果以(平均± SEM)表示，示於表10a及圖1。
以ADVIA® 1650 Chemistry System(Siemens)測定血漿脂質量。以氯仿/甲醇從組織萃取TG後，使用比色分析法(Teco Diagnostics)測定肝臟TG含量。計算各組別各個血漿低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TOTAL-C)、TG及肝臟TG量測定值之平均值。血漿與肝臟脂質濃度結果以(平均±SEM)表示，示於表10b及圖2(血漿LDL-C量)、圖3(血漿HDL-C量)、圖4(血漿Total-C量)、圖5(血漿TG量)、及圖6(肝臟TG含量)。
結果摘要與結論：
表列數據摘要：
與接受對照mAb之小鼠相較下，僅以H4H1327P處理之小鼠展現顯著之血糖量減少及LDL、HDL、與總膽固醇量增加。僅以H1H316P處理之小鼠展現顯著之膽固醇量減少，血糖量則無變化。與接受對照mAb之小鼠相較下，以H4H1327P與H1H316P組合處理之小鼠展現顯著之血糖量減少，膽固醇量則無改變。與同型對照組相較下，於任何處理組別中，肝臟TG含量均未改變。
實例9. 抗GCGR抗體於飼料誘導肥胖症小鼠模式中之作用
於第2型糖尿病(T2D)之飼料誘導肥胖症(DIO)小鼠模式中，測定H4H1327P(與小鼠GCGR交叉反應之抗hGCGR抗體)對血糖量與體重之影響。
DIO模式係小鼠從5~6週齡起飼養高脂質(60%大卡)飼料(HFD)而逐漸養成。飼養該飼料約6週後，小鼠成為 代謝異常，包括胰島素抗性、葡萄糖失耐、及肥胖症。該DIO模式於小鼠誘發之生理症狀，比由另二常用之T2D模式(ob/ob與db/db小鼠)誘發者更接近人類T2D，因後二模式分別係由於瘦素或瘦素受體基因突變所導致，很少為人類T2D之原因。
於本研究中，自Taconic farms,Inc.購得自5週齡起以HFD飼養之11週齡C57BL/6公小鼠，繼續飼養該飼料8週。於19週齡時，將小鼠分成4組，每組10隻動物。每週(於第0、7、14、與21天)使各組別接受3、10、或30毫克/公斤H4H1327P，或30毫克/公斤不結合任何已知小鼠蛋白之hIgG4同型對照之皮下注射。定期測定血糖量與體重，於投與最後抗體劑量6天後(第27天)，每組犧牲6隻小鼠。接下來6週，監測各組剩餘4隻小鼠之血糖與體重。計算各動物與同型對照組平均血糖量相較之血糖量減少百分比。然後以各組別中個別動物之平均交叉值計算各處理組別之血糖減少百分比與相關誤差。血糖減少百分比結果以(平均±SEM)表示，示於表11。計算各動物與基線(第0天之重量)比較之體重變化百分比。然後以各組別中個別動物之平均交叉值計算各處理組之體重變化百分比與相關誤差。與基線比較之體重變化百分比結果以(平均±SEM)表示，示於表12。
結果摘要與結論：
與同型對照組相較下，所有測試劑量下之H4H1327P減少DIO小鼠之血糖與體重。最大相對血糖減少(48.5%) 出現於最高劑量(30毫克/公斤)組之第10天，最大相對體重減少(12.8%)出現於最高劑量組之第28天。最低劑量(3毫克/公斤)組之相對血糖降低平均值與體重降低平均值，達到最高劑量組經28天(最後劑量之後一週)展現值之至少70%。較高H4H1327P劑量組別與較低劑量組別相較下，第21天最後處理後(亦即，第28、47、與68天)觀察到之血糖與體重降低作用持續較久。
實例10. 抗GCGR抗體於鏈佐黴素(STZ)誘導之糖尿病酮酸症小鼠模式中之作用
於鏈佐黴素(STZ)誘導之糖尿病酮酸症(DKA)小鼠模式中，測定H4H1327P(與小鼠GCGR交叉反應之抗 hGCGR抗體)對血漿酮與葡萄糖量之影響。STZ對哺乳動物之胰臟β細胞具化學毒性，因此，於投與囓齒動物時，破壞此細胞類型。注射單一、高劑量(200毫克/公斤)STZ於C57BL/6小鼠，導致於3天內形成顯現人類DKA狀態之嚴重高血糖症與酮尿症。自Taconic farms,Inc.購得9週齡C57BL/6公小鼠，將其分成2組，每組10隻動物，使各組別接受200毫克/公斤STZ(於檸檬酸鹽緩衝液中)或載劑(亦於檸檬酸鹽緩衝液中)之腹膜內注射。三天後，確定所有經STZ處理之動物罹患嚴重高血糖症(血糖量>400毫克/公合)與酮尿症。第二天早上，將STZ處理小鼠分成2組，每組5隻動物，使各組別接受10毫克/公斤H4H1327P或hIgG4同型對照之靜脈內注射。檸檬酸鹽緩衝液處理小鼠亦分成2組，每組5隻動物，使各組別接受10毫克/公斤H4H1327P或hIgG4同型對照之靜脈內注射。於抗體用劑前18小時(STZ投與後2.5天)及抗體用劑28小時後，在異氟烷麻醉下進行小鼠採血以收集血漿。以β-羥基丁酸分析法(Biovision)測定血漿酮量，及以ADVIA® 1650 Chemistry System(Siemens)測定血漿葡萄糖量。計算四組別各自測定之β-羥基丁酸量平均值與葡萄糖量平均值。血漿β-羥基丁酸與葡萄糖濃度之結果以(平均±SEM)表示，示於表13。
結果摘要與結論：
觀察到STZ誘導糖尿病酮酸血症小鼠於H4H1327P處理28小時後之血漿β-羥基丁酸(酮)濃度，比處理前18 小時之血漿量減少(平均67%)，證明H4H1327P於DKA小鼠模式中有效降低血漿酮量。施用同型對照抗體之STZ處理小鼠，觀察到對照抗體處理28小時後收集之血清試樣，比抗體處理前18小時收集試樣之血糖平均增加14%；而施用H4H1327P之STZ處理小鼠組，於此二時間點收集之血清試樣間，觀察到葡萄糖平均變化少於1%。
實例11. 雙重特異性抗體之產生
產生各種雙重特異性抗體以供實施本發明方法之用。舉例而言，產生雙重特異性形式("雙重特異性")之GCGR特異性抗體，其中結合於GCGR上不同胞外結構區域及/或EC環抗原決定部位之可變區連接在一起，以於單一結合分子內賦予雙環特異性。適當設計之雙重特異性，可經由增強GCGR特異性與結合親合力二者，提高整體之胰高血糖素受體封阻效力。對個別胞外結構區域抗原決定部位(例如，N端功能區、或EC1、EC2、或EC3 GCGR環之片段)具特異性或可結合於一胞外結構區域片段或環 內不同區域之可變區，於容許各可變區同時結合於不同抗原決定部位或一胞外結構區域或EC環內不同區域之結構支架上配對。於雙重特異性之一實例中，使得自具一胞外結構區域或環特異性之結合子(binder)之重鏈可變區(VH)與得自具第二胞外結構區域或EC環特異性之一系列結合子之輕鏈可變區(VL)再結合，以鑑定可與原始VH配對而不破壞對VH之原始特異性之非同源VL夥伴。以此方式，單一VL片段(例如，VL1)可與兩個不同VH功能部位(例如，VH1與VH2)結合以產生由兩個結合"臂"(VH1-VL1與VH2-VL1)構成之。單一VL片段之使用減少系統之複雜性，從而簡化用以產生雙重特異性之轉殖、表現、及純化程序並提升效率(參見，例如，USSN13/022759與US2010/0331527)。
替代地，結合GCGR以及第二標靶(例如，惟不限於，舉例而言，人類前趨蛋白轉化酶枯草桿菌素/克新第9型)(hPCSK9)之抗體，可使用本文所述技術或熟悉此項技藝者已知之其它技術呈雙重特異性形式予以製備。使結合暴露於細胞外不同GCGR區域之抗體可變區，與結合例如PCSK9上相關部位之可變區連接在一起，以於單一結合分子內賦予雙抗原特異性。適當設計具此性質之雙重特異性可提供雙重功能。舉例而言，於結合GCGR以及PCSK9之雙重特異性抗體之情形下，能藉由結合GCGR之雙重特異性抗體之一臂降低血糖，同時藉由結合PCSK9之該抗體之另一臂降低血漿脂質。對GCGR之個別胞外結構區域 抗原決定部位具特異性之可變區，與對PCSK9具特異性之可變區結合，並於容許各可變區結合於不同抗原之結構支架上配對。
以上述針對抗體之任何分析法測試雙重特異性結合子對標靶抗原(例如，GCGR及/或PCSK9)之結合及功能性封阻。舉例而言，使用測定可溶性蛋白質結合之標準方法評估雙重特異性-PCSK9之相互作用，例如Biacore、ELISA、大小排除層析法、多角度雷射光散射、直接掃描熱析法、及其他方法。使用能辨識結合於細胞之二標靶抗原之任一或二者之螢光標記二次抗體，經由流式細胞術測定雙重特異性抗體與GCGR表現細胞之結合。使用ELISA結合分析法評估不同物種變異體內與其間不同GCGR胞外結構區域或環之交叉反應性，其中將代表不同胞外結構區域或環之合成胜肽塗覆於微量測試盤諸槽上，經由使用二次檢測抗體測定雙重特異性之結合。與環胜肽之結合實驗亦可使用表面電漿子共振實驗進行，其中胜肽與抗體之即時結合相互作用係利用使胜肽或雙重特異性流過感測器表面，於其上分別捕捉雙重特異性或胜肽而測定。GCGR受體由於雙重特異性之功能性活體外封阻係使用例如本文所述之任何生物分析法，或利用例如本文所述之於適當動物模式中之活體內血糖量測定予以測定；PCSK9由於雙重特異性之功能性活體外封阻係使用例如見述於WO2010/077854、或US2010/0166768中之任何生物分析法，或利用例如本文所述之於適當動物模式中之活體內血 漿脂質量測定予以測定。
第1圖顯示單獨或組合投與H4H1327P(抗GCGR抗體)、及/或H1H316P(抗PCSK9抗體)後，C57BL6小鼠之血糖量變化百分比。對照組(X實線)；3毫克/公斤H4H1327P(■實線)；10毫克/公斤H4H1327P(▲實線)；10毫克/公斤H1H316P(▲實線)；3毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(▼虛線)；10毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(○虛線)。
第2圖顯示單獨或組合投與H4H1327P、及/或H1H316P後，C57BL6小鼠之血漿LDL-C量。對照組(X實線)；3毫克/公斤H4H1327P(■實線)；10毫克/公斤H4H1327P(▲實線)；10毫克/公斤H1H316P(▲實線)；3毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(▼虛線)；10毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(○虛線)。
第3圖顯示單獨或組合投與H4H1327P、及/或H1H316P後，C57BL6小鼠之血漿HDL-C量。對照組(X實線)；3毫克/公斤H4H1327P(■實線)；10毫克/公斤H4H1327P(▲實線)；10毫克/公斤H1H316P(▲實線)；3毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(▼虛線)；10毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(○虛線)。
第4圖顯示單獨或組合投與H4H1327P、及/或H1H316P後，C57BL6小鼠之血漿總膽固醇量。對照組(X實線)；3毫克/公斤H4H1327P(■實線)；10毫克/公斤 實線)；3毫克/公斤H4H1327P(■實線)；10毫克/公斤H4H1327P(▲實線)；10毫克/公斤H1H316P(85實線)；3毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(86虛線)；10毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(○虛線)。
第4圖顯示單獨或組合投與H4H1327P、及/或H1H316P後，C57BL6小鼠之血漿總膽固醇量。對照組(X實線)；3毫克/公斤H4H1327P(■實線)；10毫克/公斤H4H1327P(▲實線)；10毫克/公斤H1H316P(85實線)；3毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(86虛線)；10毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(○虛線)。
第5圖顯示單獨或組合投與H4H1327P、及/或H1H316P後，C57BL6小鼠之血漿三酸甘油酯量。對照組(X實線)；3毫克/公斤H4H1327P(■實線)；10毫克/公斤H4H1327P(▲實線)；10毫克/公斤H1H316P(85實線)；3毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(86虛線)；10毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(○虛線)。
第6圖顯示單獨或組合投與H4H1327P、及/或H1H316P後，C57BL6小鼠之肝臟三酸甘油酯量。對照組(X)；3毫克/公斤H4H1327P(■)；10毫克/公斤H4H1327P(▲)；10毫克/公斤H1H316P(85)；3毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(86)；10毫克/公斤H4H1327P+10毫克/公斤H1H316P(○)。
<110> Regeneron Pharmaceuticals,Inc. <120> 胰高血糖素受體之人類抗體<130> 1400A-WO <140> To be assigned <141> Filed herewith <150> 61/416,409 <151> 2010-11-23 <150> 61/481,958 <151> 2011-05-03 <150> 61/551,032 <151> 2011-10-25 <160> 207 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 1 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 2 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 3 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 4 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 6 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 7 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 8 <210> 9 <211> 336 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 9 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 10 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 11 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 12 <210> 13 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 13 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 14 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 15 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 16 <210> 17 <211> 375 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 17 <210> 18 <211> 125 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 18 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 19 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 21 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 22 <210> 23 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 23 <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 24 <210> 25 <211> 336 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 25 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 26 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 27 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 28 <210> 29 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 29 <210> 30 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 30 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 31 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 32 <210> 33 <211> 372 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 33 <210> 34 <211> 124 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 34 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 35 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 36 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 37 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 38 <210> 39 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 39 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 40 <210> 41 <211> 336 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 41 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 42 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 43 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 44 <210> 45 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 45 <210> 46 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 46 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 47 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 48 <210> 49 <211> 384 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 49 <210> 50 <211> 128 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 50 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 51 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 52 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 53 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 54 <210> 55 <211> 63 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 55 <210> 56 <211> 21 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 56 <210> 57 <211> 324 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 57 <210> 58 <211> 108 <212> PRT <213> \人工序列<220> <223> 合成<400> 58 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 59 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 60 <210> 61 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 61 <210> 62 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 62 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 63 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 64 <210> 65 <211> 381 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 65 <210> 66 <211> 127 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成 <400> 66 <210> 67 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 67 <210> 68 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 68 <210> 69 <211> 384 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 69 <210> 70 <211> 128 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 70 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 71 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 72 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 73 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 74 <210> 75 <211> 63 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 75 <210> 76 <211> 21 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 76 <210> 77 <211> 324 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 77 <210> 78 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 78 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 79 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 80 <210> 81 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 81 <210> 82 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 82 <210> 83 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 83 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 84 <210> 85 <211> 381 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成 <400> 85 <210> 86 <211> 127 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 86 <210> 87 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 87 <210> 88 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 88 <210> 89 <211> 381 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 89 <210> 90 <211> 127 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 90 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 91 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 92 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 93 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 94 <210> 95 <211> 63 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 95 <210> 96 <211> 21 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 96 <210> 97 <211> 324 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 97 <210> 98 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 98 <210> 99 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 99 <210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 100 <210> 101 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 101 <210> 102 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 102 <210> 103 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 103 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 104 <210> 105 <211> 378 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 105 <210> 106 <211> 126 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 106 <210> 107 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 107 <210> 108 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 108 <210> 109 <211> 372 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 109 <210> 110 <211> 124 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 110 <210> 111 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 111 <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 112 <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 113 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 114 <210> 115 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 115 <210> 116 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 116 <210> 117 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 117 <210> 118 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 118 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 119 <210> 120 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 120 <210> 121 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 121 <210> 122 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 122 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 123 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 124 <210> 125 <211> 369 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 125 <210> 126 <211> 123 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 126 <210> 127 <211> 318 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 127 <210> 128 <211> 106 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 128 <210> 129 <211> 381 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 129 <210> 130 <211> 127 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 130 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 131 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 132 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 133 <210> 134 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 134 <210> 135 <211> 63 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 135 <210> 136 <211> 21 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 136 <210> 137 <211> 324 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 137 <210> 138 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 138 <210> 139 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 139 <210> 140 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 140 <210> 141 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 141 <210> 142 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 142 <210> 143 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 143 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 144 <210> 145 <211> 378 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 145 <210> 146 <211> 126 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 146 <210> 147 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 147 <210> 148 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 148 <210> 149 <211> 345 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 149 <210> 150 <211> 348 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 150 <210> 151 <211> 146 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 151 <210> 152 <211> 351 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 152 <210> 153 <211> 477 <212> PRT <213> 智人<400> 153 <210> 154 <211> 485 <212> PRT <213> 小鼠(家鼷鼠) <400> 154 <210> 155 <211> 491 <212> PRT <213> 食蟹獼猴<400> 155 <210> 156 <211> 485 <212> PRT <213> 大鼠(褐鼠) <400> 156 <210> 157 <211> 1434 <212> DNA <213> 智人<400> 157 <210> 158 <211> 354 <212> DNA <213> 智人<400> 158 <210> 159 <211> 118 <212> PRT <213> 智人<400> 159 <210> 160 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 160 <210> 161 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 161 <210> 162 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 162 <210> 163 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 163 <210> 164 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 164 <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 165 <210> 166 <211> 36 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成 <400> 166 <210> 167 <211> 12 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 167 <210> 168 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 168 <210> 169 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 169 <210> 170 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 170 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 171 <210> 172 <211> 354 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 172 <210> 173 <211> 118 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 173 <210> 174 <211> 339 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 174 <210> 175 <211> 113 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 175 <210> 176 <211> 381 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 176 <210> 177 <211> 127 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 177 <210> 178 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 178 <210> 179 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 179 <210> 180 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成 <400> 180 <210> 181 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 181 <210> 182 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 182 <210> 183 <211> 20 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 183 <210> 184 <211> 336 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 184 <210> 185 <211> 112 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 185 <210> 186 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 186 <210> 187 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 187 <210> 188 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 188 <210> 189 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 189 <210> 190 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 190 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 191 <210> 192 <211> 2076 <212> DNA <213> 智人<400> 192 <210> 193 <211> 692 <212> PRT <213> 智人<400> 193 <210> 194 <211> 115 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成<400> 194 <210> 195 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 195 <210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 196 <210> 197 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 197 <210> 198 <211> 109 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 198 <210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 199 <210> 200 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 200 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 201 <210> 202 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<220> <221> 變異體 <222> (1)...(1) <223> Xaa=Gly <220> <221> 變異體 <222> (2)...(2) <223> Xaa=Phe <220> <221> 變異體 <222> (3)...(3) <223> Xaa=Thr <220> <221> 變異體 <222> (4)...(4) <223> Xaa=Phe或Ser <220> <221> 變異體 <222> (5)...(5) <223> Xaa=Ser <220> <221> 變異體 <222> (6)...(6) <223> Xaa=Ser或Asn <220> <221> 變異體 <222> (7)...(7) <223> Xaa=Tyr或Phe <220> <221> 變異體 <222> (8)...(8) <223> Xaa=Asp、Leu、或Gly <400> 202 <210> 203 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<220> <221> 變異體 <222> (1)...(1) <223> Xaa=Ile <220> <221> 變異體 <222> (2)...(2) <223> Xaa=Ser、Gln、Asp、或Trp <220> <221> 變異體 <222> (3)...(3) <223> Xaa=Ser、Glu、Thr、或Phe <220> <221> 變異體 <222> (4)...(4) <223> Xaa=Asp或Ala <220> <221> 變異體 <222> (5)...(5) <223> Xaa=Gly或Glu <220> <221> 變異體 <222> (6)...(6) <223> Xaa=Arg、Ile、或不存在<220> <221> 變異體 <222> (7)...(7) <223> Xaa=Asp或Glu <220> <221> 變異體 <222> (8)...(8) <223> Xaa=Lys或Thr <400> 203 <210> 204 <211> 21 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<220> <221> 變異體 <222> (1)...(1) <223> Xaa=Ala或Thr <220> <221> 變異體 <222> (2)...(2) <223> Xaa=Lys或Arg <220> <221> 變異體 <222> (3)...(3) <223> Xaa=Glu <220> <221> 變異體 <222> (4)...(4) <223> Xaa=Met、Pro、Gly、或Asp <220> <221> 變異體 <222> (5)...(5) <223> Xaa=Val、Ser、Lys、Arg、或不存在<220> <221> 變異體 <222> (6)...(6) <223> Xaa=Tyr、His、Asn、或不存在<220> <221> 變異體 <222> (7)...(7) <223> Xaa=Tyr <220> <221> 變異體 <222> (8)...(8) <223> Xaa=Asp或Glu <220> <221> 變異體 <222> (9)...(9) <223> Xaa=Ile <220> <221> 變異體 <222> (10)...(10) <223> Xaa=Leu <220> <221> 變異體 <222> (11)...(11) <223> Xaa=Thr <220> <221> 變異體 <222> (12)...(12) <223> Xaa=Gly <220> <221> 變異體 <222> (13)...(13) <223> Xaa=Tyr、Asp、或His <220> <221> 變異體 <222> (14)...(14) <223> Xaa=His、Asp、Tyr、或不存在<220> <221> 變異體 <222> (15)...(15) <223> Xaa=Asn、Tyr、His、或不存在<220> <221> 變異體 <222> (16)...(16) <223> Xaa=Tyr <220> <221> 變異體 <222> (17)...(17) <223> Xaa=Tyr或His <220> <221> 變異體 <222> (18)...(18) <223> Xaa=Gly或Ala <220> <221> 變異體 <222> (19)...(19) <223> Xaa=Met <220> <221> 變異體 <222> (20)...(20) <223> Xaa=Asp <220> <221> 變異體 <222> (21)...(21) <223> Xaa=Val或Ile <400> 204 <210> 205 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成 <220> <221> 變異體 <222> (1)...(1) <223> Xaa=Gln <220> <221> 變異體 <222> (2)...(2) <223> Xaa=Gly或Ala <220> <221> 變異體 <222> (3)...(3) <223> Xaa=Ile <220> <221> 變異體 <222> (4)...(4) <223> Xaa=Asn或Arg <220> <221> 變異體 <222> (5)...(5) <223> Xaa=Asn <220> <221> 變異體 <222> (6)...(6) <223> Xaa=Tyr或Asp <400> 205 <210> 206 <211> 3 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<220> <221> 變異體 <222> (1)...(1) <223> Xaa=Thr或Ala <220> <221> 變異體 <222> (2)...(2) <223> Xaa=Ala或Thr <220> <221> 變異體 <222> (3)...(3) <223> Xaa=Ser或Phe <400> 206 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成<220> <221> 變異體 <222> (1)...(1) <223> Xaa=Gln或Leu <220> <221> 變異體 <222> (2)...(2) <223> Xaa=Gln <220> <221> 變異體 <222> (3)...(3) <223> Xaa=Tyr、His、或Asp <220> <221> 變異體 <222> (4)...(4) <223> Xaa=Asn或Tyr <220> <221> 變異體 <222> (5)...(5) <223> Xaa=Thr或Ser <220> <221> 變異體 <222> (6)...(6) <223> Xaa=Tyr、Asn、或His <220> <221> 變異體 <222> (7)...(7) <223> Xaa=Pro <220> <221> 變異體 <222> (8)...(8) <223> Xaa=Leu、Phe、Arg、或不存在<220> <221> 變異體 <222> (9)...(9) <223> Xaa=Thr <400> 207

Claims (22)

  1. 一種特異性與人類胰高血糖素受體(hGCGR)結合之單離人類抗體或其抗原結合片段，其中該抗體結合人類GCGR之胞外結構區域(ectodomain)及/或胞外(EC)環，其中胞外結構區域係GCGR之N端功能部位，且其中EC環係EC1、EC2與EC3之一或多者。
  2. 根據申請專利範圍第1項之抗體或其片段，其中該N端功能部位包含SEQ ID NO：153之從約胺基酸殘基27至約胺基酸殘基144範圍之胺基酸殘基；EC1包含SEQ ID NO：153之從約胺基酸殘基194至約胺基酸殘基226範圍之胺基酸殘基；EC2包含SEQ ID NO：153之從約胺基酸殘基285至約胺基酸殘基305範圍之胺基酸殘基；及EC3包含SEQ ID NO：153之從約胺基酸殘基369至約胺基酸殘基384範圍之胺基酸殘基。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項之抗體或其片段，其包含重鏈可變區(HCVR)之互補決定區(CDRs)，其中該HCVR具有選自SEQ ID NOs：2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130與146之一之胺基酸序列；及輕鏈可變區(LCVR)之CDRs，其中該LCVR具有選自SEQ ID NOs：10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138與148之一之胺基酸序列。
  4. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或其片段，其中該HCVR包含具有選自SEQ ID NO：4、20、36、52、72、92、112與132之一之胺基酸序列之HCDR1 功能部位；具有選自SEQ ID NO：6、22、38、54、74、94、114與134之一之胺基酸序列之HCDR2功能部位；具有選自SEQ ID NOs：8、24、40、56、76、96、116與136之一之胺基酸序列之HCDR3功能部位；及LCVR包含具有選自SEQ ID NO：12、28、44、60、80、100、120與140之一之胺基酸序列之LCDR1功能部位；具有選自SEQ ID NO：14、30、46、62、82、102、122與142之一之胺基酸序列之LCDR2功能部位；及具有選自SEQ ID NQ：16、32、48、64、84、104、124與144之一之胺基酸序列之LCDR3功能部位。
  5. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)具有選自SEQ ID NO：2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130與146之一之胺基酸序列之HCVR；及(b)具有選自由SEQ ID NO：10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138與148組成的組群之胺基酸序列之LCVR。
  6. 根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138、與146/148組成的組群之HCVR/LCVR序列對。
  7. 一種抗體或其抗原結合片段，其與根據申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體或抗原結合片段競爭特異 性地結合hGCGR。
  8. 一種抗體或其抗原結合片段，其與根據申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體或抗原結合片段結合hGCGR上相同之抗原決定部位。
  9. 一種單離之核酸分子，其編碼根據申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或抗體之抗原結合片段。
  10. 一種表現載體，其包含申請專利範圍第9項之核酸分子。
  11. 一種生產抗人類GCGR抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括下列步驟：將申請專利範圍第10項之表現載體引入單離之宿主細胞中，在容許抗體或其片段生產之條件下使該細胞生長，及回收如此產生之抗體。
  12. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
  13. 一種用於降低血糖或血酮量、或用於治療與高血糖或血酮量相關、或其部分特徵係高血糖或血酮量之症狀或疾病、或與該症狀或疾病相關之至少一種徵候或併發症之方法，該方法包括投與有其需要之病患根據申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或抗原結合片段、或申請專利範圍第12項之醫藥組成物，使得血糖或血酮量降低或所媒介之症狀或疾病、或與該症狀或疾病相關之至少一種徵候或併發症之嚴重性減輕或減 少。
  14. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中該症狀或疾病係選自由下列組成之組群：糖尿病、葡萄糖耐量異常、肥胖症、腎病、神經病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥狀硬化症、傷口癒合能力受損、糖尿病酮酸症、高血糖症、高血糖高滲壓症候群、手術期間高血糖症、加護病房病患高血糖症、高胰島素血症、代謝症候群、胰島素抗性症候群與空腹血糖異常。
  15. 根據申請專利範圍第13或14項之方法，其中該抗體或抗原結合片段係與第二治療劑組合投與病患。
  16. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中該第二治療劑係選自由下列組成之組群：胰島素、雙胍[滅糖錠(metformin)]、磺醯脲類[例如優降糖(glyburide)、泌樂得(glipizide)]、PPAR γ促效劑[吡格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone)]、α葡萄糖苷酶抑制劑[阿卡波糖(acarbose)、培欣(voglibose)]、EXENATIDE®(胰高血糖素樣肽1)、SYMLIN®[普蘭林(pramlintide)]、胰高血糖素拮抗劑、與第二GCGR拮抗劑。
  17. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中該第二治療劑係3-羥基-3-甲基-戊二醯基-CoA還原酶(HMG-CoA還原酶)抑制劑。
  18. 根據申請專利範圍第17項之方法，其中HMG-CoA還原酶抑制劑係選自由下列組成的組群之他汀：阿托伐 他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素伐他汀(rosuvastatin)與辛伐他汀(simvastatin)。
  19. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中該第二治療劑係特異性地結合人類前趨蛋白轉化酶枯草桿菌素/克新(kexin)第9型(PCSK9)之單離抗體或其抗原結合片段。
  20. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至8項中任一項之抗體或其抗原結合片段、與包含特異性地結合人類PCSK9之單離抗體或其抗原結合片段之第二治療劑、及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
  21. 根據申請專利範圍第1至8項中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，或根據申請專利範圍第12或20項之醫藥組成物，其係用於降低血糖或血酮量，或用於治療具有與高血糖或血酮量相關、或其部分特徵係高血糖或血酮量之疾病或症狀之病患，其中該症狀或疾病係選自由下列組成之組群：糖尿病、葡萄糖耐量異常、肥胖症、腎病、神經病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥狀硬化症、傷口癒合能力受損、糖尿病酮酸症、高血糖症、高血糖高滲壓症候群、手術期間高血糖症、加護病房病患高血糖症、高胰島素血症、代謝症候群、胰島素抗性症候群與空腹血糖異常。
  22. 一種使用根據申請專利範圍第1至8項中任一項之單 離抗體或其抗原結合片段、或根據申請專利範圍第12或20項之醫藥組成物之用途，其用於製造藥劑以降低血糖或血酮量，或治療具有與高血糖或血酮量相關、或其部分特徵係高血糖或血酮量之疾病或症狀之病患之用途，其中該症狀或疾病係選自由下列組成之組群：糖尿病、葡萄糖耐量異常、肥胖症、腎病、神經病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥狀硬化症、傷口癒合能力受損、糖尿病酮酸症、高血糖症、高血糖高滲壓症候群、手術期間高血糖症、加護病房病患高血糖症、高胰島素血症、代謝症候群、胰島素抗性症候群與空腹血糖異常。
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