SK3662002A3 - Factor ix/factor ixa antibodies and antibody derivatives - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka protilátok a derivátov protilátok k faktoru IX alebo faktoru

IXa.

Doterajší stav techniky

Krvné zrazeniny (tromby) vznikajú sériou aktivácií zymogénov, nazývanou koagulačná (zrážacia) kaskáda. V priebehu tejto enzymatickej kaskády aktivovaná forma každého z týchto zymogénov (označovaných faktormi) katalyzuje aktiváciu toho nasledujúceho. Tromby sú usadeniny zložiek krvi na povrchu steny ciev a sú prevažne tvorené agregovanými krvnými doštičkami a nerozpustným zosieťovaným fibrínom. Tvorba fibrínu sa uskutočňuje prostredníctvom trombínu obmedzenou proteolýzou fibrinogénu. Trombín je konečným produktom koagulačnej kaskády (K. G. Mann, Blood, 1990, zv. 76, str. 1-16).

Aktivácia faktoru X komplexom aktivovaného faktoru IX (FIXa) a aktivovaného faktoru VIII (FVIIIa) je pri koagulácii kľúčovým stupňom. Absencia zložiek tohto komplexu alebo narušenie ich funkcie je spojené s poruchou zrážanlivosti krvi nazývanou hemofília (J. E. Sadler & E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebrand’s disease, v: G. Stamatoyannopoulos a spol. (vyd.): The molecular basis of blood diseases. W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, str. 576-602. Hemofília A značí (funkčnú) absenciu aktivity faktoru VIII, zatiaľ čo hemofília B je charakterizovaná absenciou aktivity faktoru IX. V súčasnosti sa liečba hemofílie A uskutočňuje substitučnou terapiou podávaním koncentrátov faktoru VIII. Približne 20 až 30 % pacientov s hemofíliou A si však vyvíja inhibítory faktoru VIII (tj. protilátky proti faktoru VIII), čím je inhibovaný efekt podávaných preparátov faktoru VIII. Liečba pacientov s inhibítorom faktoru VIII je veľmi obtiažna a riziková a dosiaľ existuje len obmedzený počet metód.

V prípade pacientov s nízkou hladinou inhibitoru FVIII je možné, avšak nákladné, týmto pacientom podávať vysoké dávky faktoru VIII a tak neutralizovať protilátky proti faktoru VIII. Množstvo faktoru VIII nad množstvo, ktoré je potrebné na neutralizáciu inhibičných protilátok, potom má hemostatický účinok. V mnohých prípadoch je možné uskutočniť desenzibilizáciu, po ktorej je potom možné opäť aplikovať štandardnú liečbu faktorom VIII. Táto liečba vysokými dávkami faktoru VIII však vyžaduje veľké množstvá faktoru VIII, je časovo náročná a môže zahrnovať vážne anafylaktické vedľajšie reakcie. Alternatívne je možné uskutočňovať liečbu molekulami prasačieho faktoru VIII.

Ďalšia nákladná metóda spočíva v odstraňovaní inhibítorov faktoru VIII mimotelovou imunoadsorpciou na lektíny, ktoré sa viažu na imunoglobulíny (proteín A, proteín G) alebo na imobilizovaný faktor VIII. Pretože pacient musí byť počas tejto liečby napojený na aferézny prístroj, znamená táto liečba pre pacienta tiež veľkú záťaž. Týmto spôsobom je možné tiež liečiť akútnu hemoragiu.

V súčasnosti je preferovanou terapiou podávania koncentrátov komplexov aktivovaného protrombínu (activated prothrombin complex concentrates, APCC), napríklad FEIBA® a AUTOPLEX®, ktoré sú vhodné na liečbu akútnej hemoragie i u pacientov s vysokým titrom inhibítora (DE 31 27 318).

V intravaskulárnom systéme zrážania krvi je posledným stupňom aktivácia faktoru X. Táto reakcia je stimulovaná väzbou faktoru VHIa na faktor IXa a vznikom „tenázy“ - komplexu pozostávajúceho z faktorov IXa, VlIIa, X a fosfolipidu. Bez naviazania FVIIIa nevykazuje FIXa žiadnu alebo veľmi slabú enzymaticku aktivitu vo vzťahu k FX.

V niekoľkých posledných rokoch bolo charakterizovaných niekoľko možných väzbových miest pre faktor VlIIa na faktor IXa a ukázalo sa, že protilátky alebo peptidy, ktoré sa viažu na tieto regióny, inhibujú aktivitu FIXa (Fay a spol., J. Biol. Chem., 1994, zv. 269, str. 20522-20527, Lenting a spol., J. Biol. Chem., 1996, zv. 271, str. 1935-1940, Jorquera a spol., Circulation, 1992, zv. 86, abstrakt 2725). Inhibícia koagulačných faktorov, ako je faktor IX, bola dosiahnutá taktiež použitím monoklonálnych protilátok s cieľom zabrániť vzniku trombózy (WO 97/26010).

Opačný efekt, tj. zvýšenie aktivácie faktoru X, sprostredkovanej faktorom IXa, bolo opísané v Liles D. K. a spol. (Blood, 1997, zv. 90, dod. 1, 2054) ako väzba peptidu faktoru VIII (aminokyseliny 698-712) na faktor IX. Napriek tomu sa však tento efekt dostavuje len v neprítomnosti faktoru VlIIa, zatiaľ čo v prítomnosti faktoru VlIIa je štiepenie faktoru X, sprostredkované faktorom IXa/faktorom VlIIa, týmto peptidom inhibované.

Podstata vynálezu

S ohľadom na možné riziká a vedľajšie účinky, ktoré môžu nastať pri liečbe hemofilických pacientov, existuje potreba terapie, ktorá umožňuje efektívnu liečbu pacientov s inhibítorom FVIII. Cieľom vynálezu je teda poskytnúť prípravok na liečbu porúch krvnej zrážanlivosti, ktorý má zvláštne výhody pre pacientov s inhibítorom faktoru VIII.

Podľa vynálezu je tento cieľ dosiahnutý použitím protilátok alebo derivátov protilátok proti faktoru IX alebo faktoru IXa, ktoré majú aktivitu kofaktoru faktoru VlIIa alebo aktivačnú aktivitu pre faktor IXa a vedú k zvýšeniu prokoagulačnej aktivity faktoru IXa. Pôsobenie týchto protilátok a derivátov protilátok aktivujúcich faktor IX a faktor IXa podľa vynálezu prekvapivo nie je negatívne ovplyvňované prítomnosťou inhibítorov, ako sú inhibítory proti faktoru VIII a faktoru VlIIa, ale naopak je v tomto prípade tak zvýšená prokoagulačná aktivita faktoru IXa. ,

Dalšou výhodou vynálezu je, že podávanie preparátu podľa vynálezu umožňuje rýchle zrážanie krvi i v neprítomnosti faktoru VIII alebo faktoru VlIIa, dokonca v prípade pacientov s inhibítorom FVIII. Tieto prostriedky sú prekvapivo účinné i v prítomnosti faktoru VlIIa.

Protilátky a deriváty protilátok podľa vynálezu teda majú aktivitu typu kofaktoru FVIII, ktorá v teste FVIII (napríklad COATEST® v teste Imunochrom) po 2 hodinách inkubácie vykazuje pomer pozadia (základný šum) k nameranej hodnote aspoň 3. Výpočet tohto pomeru je možné uskutočniť napríklad podľa schémy:

hodnota protilátky (OD 405) - porovnávacia hodnota činidla > 3 hodnota myšieho IgG (OD 405) - porovnávacia hodnota činidla po dvoch hodinách inkubácie.

Protilátky podľa vynálezu majú výhodne poločas životnosti aspoň 5 dní, prednostne aspoň 10 dní, avšak predovšetkým aspoň 20 dní.

' Ďalej je predmetom vynálezu preparát zahrnujúci protilátky a/alebo deriváty protilátok proti faktoru IX alebo faktoru IXa a farmaceutický prijatelný nosič. Preparát podľa vynálezu môže navyše zahrnovať faktor IX a/alebo faktor IXa.

Ďalším predmetom vynálezu je použitie protilátok alebo derivátov protilátok na zvýšenie acidolytickej aktivity faktoru IXa.

Protilátky a deriváty protilátok

Vynález zahrnuje tiež nukleové kyseliny kódujúce protilátky podľa vynálezu a deriváty protilátok, expresné vektory, hybridómové bunkové línie a spôsoby ich výroby.

Protilátky sú molekuly imunoglobulínov so špecifickou aminokyselinovou sekvenciou, ktoré sa viažu len na antigény, ktoré indukujú ich syntézu (resp. jej imunogén), alebo na antigény (alebo imunogény), ktoré sú im veľmi podobné. Každá imunoglobulínová molekula je tvorená dvoma typmi polypeptidových reťazcov. Každá molekula má veľké identické ťažké reťazce (reťazce H) a dva ľahké, taktiež identické reťazce (reťazce L). Polypeptidy sú spojené disulfidickými mostíkmi a nekovalentnými väzbami. In vivo sú ťažké a ľahké reťazce vytvárané na rôznych ribozómoch, zostavené v bunke a vylučované ako intaktné imunoglobulíny (Roitt J. a spol., Immunology, druhé vyd., 1989).

Protilátky podľa vynálezu a ich deriváty a organické zlúčeniny od nich odvodené zahrnujú ľudské a zvieracie monoklonálne protilátky alebo ich fragmenty, jednoreťazcové protilátky a ich fragmenty a miniprotilátky, bišpecifické protilátky, „diabodies“, „triabodies“ alebo ich di-, oligo- alebo multiméry. Zahrnujú taktiež peptidomimetiká alebo peptidy odvodené od

I protilátok podľa vynálezu, ktoré napríklad zahrnujú jeden alebo niekoľko CDR regiónov, prednostne región CDR3.

Vynález ďalej zahrnuje ľudské monoklonálne protilátky a peptidové sekvencie, ktoré sú na základe súvislosti štruktúry s aktivitou produkované umelými modelovacími procesmi (Greer J. a spol., J. Med. Chem., 1994, zv. 37, str. 1035-1054).

Termín týkajúci sa protilátok a derivátov protilátok aktivujúcich faktor ΐΧ/IXa môže taktiež zahrnovať proteíny produkované expresiou pozmeneného regiónu, kódujúceho imunoglobulín, v hostiteľskej bunke, napríklad „technicky modifikované protilátky“, ako sú syntetické protilátky, chimerické alebo humanizované protilátky alebo ich zmesi, alebo fragmenty protilátok, ktorým čiastočne alebo celkom chýba konštantný región,· napríklad Fv, Fab, Fab‘ alebo F(ab)^l2 atď. V týchto technicky modifikovaných protilátkach môže byť napríklad nahradená časť alebo časti ľahkého a/alebo ťažkého reťazca. Také molekuly môžu napríklad zahrnovať protilátky tvorené humanizovaným ťažkým reťazcom a nemodifikovaným ľahkým reťazcom (alebo chimerickým ľahkým reťazcom) alebo naopak. Označenia Fv, Fc, Fd, Fab, Fab‘ alebo F(ab)‘2 sa používajú takisto ako v doterajších prácach (Harlow E. a Lane D., „Antibodies, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Vynález taktiež zahrnuje použitie fragmentov Fab a/alebo fragmentov F(ab)2, ktoré sú odvodené od monoklonálnych protilátok (mAb), ktoré sú zamerané proti faktoru IX/faktoru IXa a vyvolávajú zvýšenie prokoagulačnej aktivity faktoru IXa.

Heterologné úseky základnej štruktúry a konštantné regióny sú výhodne vybrané z tried a izotypov ľudského imunoglobulínu, ako je IgG (subtypy 1 až 4),

IgM, IgA a IgE. V priebehu imunitnej odpovedi môže dôjsť k prešmyku tried imunoglobulínov, napríklad k prešmyku z IgM na IgG; pritom sa vymenia konštantné oblasti, napríklad z μ na γ. Prešmyk tried môže byť vyvolaný tiaž riadene metódami génového inžinierstva („rekombinácia riadená na prešmyk tried“), ako je známe z skorších správ (Esser C. a Radbruch A., Annu. Rev. Immunol., 1990, zv. 8, str. 717-735). Protilátky a deriváty protilátok podľa vynálezu však nemusia obsahovať výlučne ľudské sekvencie imunoglobulínových proteínov.

V jednom konkrétnom uskutočnení humanizovaná protilátka zahrnuje regióny určujúce komplement (CDR) z myších monoklonálnych protilátok, ktoré sú vložené do úsekov základnej štruktúry sekvencii zvolenej ľudskej protilátky. Môžu byť však použité i ľudské regióny CDR. Výhodne sú jednou alebo viacerými výmenami CDR technicky pozmenené variabilné regióny v ľudských ťažkých a ľahkých reťazcoch. Je taktiež možné použiť všetkých šesť CDR alebo rôzne kombinácie menej než šestich CDR.

Humanizovaná protilátka podľa vynálezu má výhodne štruktúru ľudskej protilátky alebo jej fragmentu a zahrnuje kombináciu charakteristík nevyhnutných pre terapeutickú aplikáciu, napríklad liečbu porúch zrážanlivosti u pacientov, najmä u pacientov s inhibítorom faktoru VIII.

Chimerická protilátka sa od humanizovanej protilátky líši v tom, že zahrnuje celé variabilné regióny zahrnujúce úseky základnej štruktúry ťažkých a ľahkých reťazcov ne-ľudského pôvodu v kombinácii s konštantnými regiónami oboch reťazcov z ľudského imunoglobulínu. Môže byť produkovaná napríklad chimerická protilátka tvorená myšími a ľudskými sekvenciami. Podľa vynálezu môžu byť protilátkami a derivátmi protilátok tiež jednoreťazcové protilátky alebo miniprotilátky (fragmenty scFv, ktoré sú napríklad napojené na sekvencie bohaté na prolín a oligomerizačné domény, napríklad Pluckthun A. a Pack P., Immunotechnology, 1997, zv. 3, str. 83-105) alebo jednoreťazcové Fv (sFv), ktoré zahrnujú celý väzbový región protilátky v jedinom polypeptidickom reťazci. Jednoreťazcové protilátky je možné napríklad vytvárať napojením V-génov na oligonukleotid, ktorý bol konštruovaný ako linkerová sekvencia a spojuje C koniec prvého V regiónu s N koncom druhého V regiónu, napríklad v usporiadaní V_H-linker-V_L alebo V_L-linker-V_H; ako V_H, tak V_L pritom môžu predstavovať N7 terminálnu doménu (Huston JS a spol., Int. rev. Immunol., 1993, zv. 10, str. 195217; Raag R. a Whitlow M., FASEB J., 1995, zv. 9, str. 73-80). Proteín, ktorý môže byť použitý ako linkerová sekvencia, môže mať napríklad dĺžku až 150 Ä, výhodne až 80 Á a predovšetkým a± 40 é . LinkerovÔsekvencie obsahujúce glycín a serín, resp. glutamín a lyzín, sú zvlášť výhodné pre svoju flexibilitu, resp. rozpustnosť. Výber aminokyseliny je ovplyvňovaný kritériami imunogenity a stability a taktiež závisí od toho, či majú byť tieto jednoreťazcové protilátky vhodné pre fyziologické či priemyselné aplikácie (napríklad imunoafinitnú chromatografiu). Jednoreťazcové protilátky môžu byť prítomné tiež ako agregáty, napríklad ako triméry, oligoméry alebo multiméry. Linkerové sekvencie však môžu tiež chýbať a ku spojeniu reťazcov Vh a Vl môže dochádzať priamo.

Bišpecifické protilátky sú makromolekulárne heterobifunkčné priečne spoje (cross-linkery), ktoré majú dve rôzne väzbové špecifity v jedinej molekule. Do tejto skupiny patria napríklad bišpecifické (bs) IgG, bs IgM-IgA, bs IgA-diméry, bs (Fab‘)2, bs(scFv)2, „diabodies“ a bs bis Fab Fc (Cao Y. a Suresh M.R., Bioconjugate Chem., 1998, zv. 9, str. 635-644).

Peptidomimetikami sa rozumejú proteínové komponenty s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré imitujú prírodný peptidový komponent, alebo s templátmi, ktoré indukujú tvorbu špecifickej peptidovej štruktúry v susednej peptidovej sekvencii (Kemp DS, Trends Biotechnol., 1990, str. 249-255). Peptidomimetiká môžu byť odvodené napríklad od CDR3 domén. Metodická mutačná analýza danej peptidovej sekvencie, tj. skenovacia mutačná analýza alanínu alebo kyseliny glutamovej, umožňuje identifikáciu peptidických zvyškov kritických pre prokoagulačnú aktivitu. Iná možnosť zlepšenia aktivity určitej peptidovej sekvencie je použitie peptidových knižníc spojené s vysoko priepustným screeningom.

Termín protilátky a deriváty protilátok môže taktiež zahrnovať činidlá, ktoré boli získané analýzou dát týkajúcich sa vzťahu štruktúra-aktivita. Tieto zlúčeniny môžu byť taktiež používané ako peptidomimetiká (Grassy G. a spol., Náture Biotechnol., 1998, zv. 16, str. 748-752; Greer J. a spol., J. Med. Chem., 1994, zv. 37, str. 1035-1054).

Príklady hybridómových buniek exprimujúcich protilátky alebo deriváty protilátok podľa vynálezu boli uložené podľa Budapeštianskej zmluvy dňa 9. septembra 1999 pod číslami 99090924 (#198/A1), 99090925 (#198/B1) a 99090926 (#198/BB1) a 16. decembra 1999 pod číslami 99121614 (#193/A0), 99121615 (#196/C4), 99121616 (#198/D1), 99121617 (198/T2), 99121618 (#198/G2), 99121619 (#198/AC1) a 99121620 (# 198/U2).

Metódy produkcie:

Protilátky podľa vynálezu môžu byť pripravené známymi metódami, napríklad bežnými hybridómovými technikami alebo pomocou génových knižníc fágového zobrazenia, preskupením imunoglobulínového reťazca alebo humanizačnými metódami (Harlow E. a Lane D., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Produkcia protilátok a derivátov protilátok podľa vynálezu môže byť napríklad uskutočňovaná bežnými hybridómovými metódami (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, ed. Harlow a Lane, str. 148-242). Podľa vynálezu je možné na to použiť človeka a tiež ne-ľudské druhy, ako je hovädzí dobytok, prasatá, opice, kurčatá a hlodavce (myši, krysy). Môžu byť použité napríklad normálne imunokompetentné myši Balb/c alebo FIX-deficítne myši (myši deficitné na faktor IX môžu byť získané u Dr. Darrela Stafforda na Univerzite Severnej Karolíny, Chapel Hill). Imunizácia môže byť uskutočňovaná napríklad faktorom IX, faktorom IXaa alebo kompletne aktivovaným faktorom IXaP alebo ich fragmentárni.

Hybridómy sa volia s ohľadom na skutočnosť, že protilátky a deriváty protilátok v supernatantoch hybridómových buniek sa viažu na faktor IX/faktor IXa a vyvolávajú zvýšenie prokoagulačnej aktivity faktoru IXa. Zvýšenie prokoagulačnej aktivity môže byť preukázané testovacími metódami, známymi z doterajšieho stavu techniky pre meranie aktivity typu faktoru VIII, napríklad chromogénnymi testami.

Alternatívne môžu byť protilátky a deriváty protilátok podľa vynálezu produkované tiež rekombinačnými metódami. Pritom je možné známymi metódami určiť sekvenciu DNA protilátok podľa vynálezu a exprimovať celú DNA protilátky alebo jej časti vo vhodných systémoch. Môžu byť použité rekombinantné produkčné metódy, napríklad s použitím fágového zobrazenia, syntetických a prírodných knižníc, expresie protilátkových proteínov v známych expresných systémoch alebo expresie v transgénnych zvieratách (Jones a spol., Náture, 1986, zv. 321, str. 522-525; Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, 1996, ed. Kay a spol., str. 127-139; US 4 873 316, Vaughan TJ. a spol., Náture Biotechnology, 1998, str. 535-539; Persic L. a spol., Gene, 1997, str. 9-18; Ames R.S., a spol., J. Immunol. Methods, 1995, str. 177-186).

Expresia rekombinantné produkovaných protilátok môže byť uskutočnená pomocou bežných expresných vektorov, ako sú bakteriálne vektory, napríklad pBr322 a jeho deriváty, pSKF, alebo eukaryotické vektory, napríklad pMSG a SV40. Sekvencie, ktoré kódujú protilátku, môžu byť vybavené regulačnými sekvenciami, ktoré regulujú replikáciu, expresíu a sekréciu z hostiteľskej bunky. Tieto regulačné sekvencie zahrnujú promotory, napríklad CMV alebo SV40, a signálne sekvencie.

Expresné vektory môžu zahrnovať taktiež selekčné a amplifikačné markéry, ako je gén dihydrofolát reduktázy (DHFR), hygromycín B fosfotransferáza, tymidín kináza atď.

Používané komponenty vektorov, ako sú selekčné markery, replikóny, zosilňovače transkripcie, môžu byť získané komerčne alebo pripravené bežnými metódami. Vektory môžu byť konštruované na expresiu v rôznych bunkových kultúrach, napríklad pre bunky cicavcov ako CHO, COS, fibroblasty, bunky hmyzu, kvasinky alebo baktérie ako E. coli. Výhodne sa používajú také bunky, ktoré umožňujú optimálnu glykozyláciu exprimovaného proteínu. Zvlášť výhodný je vektor pBax (viď obr. 17), ktorý je exprimovaný v bunkách CHO alebo v SKHep.

Produkcia fragmentov Fab alebo fragmentov F(ab)₂ môže byť uskutočňovaná známymi metódami, napríklad štiepením mAb proteolytickými enzýmami, ako je papaín a/alebo pepsín, alebo rekombinačnými metódami. Tieto fragmenty Fab a F(ab)₂ môžu byť tiež pripravované s použitím génovej knižnice fágového zobrazenia (Winter a spol., 1994, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455).

Deriváty protilátok môžu byť pripravované taktiež známymi metódami, napríklad molekulárnym modelovaním, napríklad podľa Grassy a spol., Náture Biotechnol., 1998, zv. 16, str. 748-752, alebo Greer J. a spol., J. Med. Chem., z'v. 37, str. 1035-1054, alebo Rees A. a spol., „Protein Structure Prediction: A practical approach“, ed. Sternberg M.J.E., IRL Press, 1996, kap. 7-10, str. 141261.

Čistenie protilátok a derivátov protilátok podľa vynálezu môže byť uskutočňované taktiež známymi metódami, napríklad zrážaním síranom amónnym, afinitným čistením (protein G-Sepharose), ionexovou chromatografiou alebo gélovou chromatografiou. Ako skúšobné metódy na zistenie, či sa protilátky a deriváty protilátok podľa vynálezu viažu na faktor IX/faktor IXa, zvyšujú prokoagulačnú aktivitu faktoru IXa alebo majú aktivitu typu faktoru VIII, je možné použiť tieto metódy: jednostupňová koagulačná skúška (Mikaelsson a Oswaldson, Scand. J. Haematol., Suppl., 33, str. 79-86, 1984) alebo chromogénne testy, napríklad COATEST VIII:C® (Chromogenix) alebo Immunochrom (Immuno). V zásade môžu byť použité všetky metódy používané na stanovenie aktivity faktoru VIII. Ako kontrola môže byť použitý slepý pokus, napríklad s nešpecifickou myšacou protilátkou IgG.

Predkládané protilátky a deriváty protilátok sú vhodné na terapeutické použitie pri liečbe porúch zrážanlivosti, napríklad v prípade hemofílie A, pre pacientov s inhibítorom faktoru VIII atď. Podávanie môže byť uskutočňované akoukoľvek metódou vhodnou pre efektívne podanie terapeutického činidla pacientovi, napríklad orálnou, subkutánnou, intramuskulárnou, intravenóznou alebo intranazálnou aplikáciou.

Terapeutické činidlá podľa vynálezu môžu byť vyrábané ako preparáty, ktoré zahrnujú dostatočné množstvo protilátok alebo derivátov protilátok ako účinnú zložku vo farmaceutický prijateľnom nosnom materiály. Tieto činidlá môžu byť prítomné buď v kvapalnej alebo práškovej forme. Preparáty podľa vynálezu môžu navyše obsahovať zmesi rôznych protilátok, ich derivátov a/alebo organických zlúčenín, od nich odvodených, rovnako ako zmesi tvorené protilátkami a faktorom IX a/alebo faktorom IXa. Faktor IXa môže byť prítomný ako faktor IXaa a/alebo faktor IXap. Príkladom vodného nosiča je napríklad fyziologický roztok. Roztoky sú sterilné, pričom sa sterilizácia uskutočňuje bežnými metódami.

Protilátky a deriváty protilátok podľa vynálezu môžu byť prítomné vo forme lyofilizovanej pre skladovanie a pred aplikáciou môžu byť suspendované vo vhodnom rozpúšťadle. Táto metóda sa ukázala ako všeobecne výhodná pre bežné imunoglobulíny a v tomto prípade môžu byť aplikované známe metódy lyofilizácie a rekonštitúcie.

Protilátky a deriváty protilátok podľa vynálezu môžu byť navyše používané v priemyselných aplikáciách, napríklad na čistenie faktoru IX/faktoru IXa pomocou afinitnej chromatografie alebo ako komponenty detekčných metód (napríklad testov ELISA), alebo ako činidlá na identifikáciu a interakciu s funkčnými doménami cieľového proteínu.

Vynález bude podrobnejšie opísaný s ohľadom na pripojené obrázky a príklady uskutočnenia, na ktoré sa však neobmedzuje.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje výsledky screeningu supernatantov kultúr hybridómových buniek na aktivitu typu FVIII. Chromogénnemu testu boli podrobené vopred vybrané klony z fúznych experimentov č. 193, 195 a 196.

Obr. 2 ukazuje výsledky screeningu na aktivitu typu faktoru VIII sprostredkovanú IgG v supernatantoch hybridómovej bunkovej kultúry základnej platne.

Obr. 3 znázorňuje subklonovanie klonu 193/CO, konkrétne výsledky prvého klonovacieho cyklu.

Obr. 4 znázorňuje porovnanie chromogénnej aktivity typu FVIII a reaktivity faktoru IX pri ELISA u hybridómových kultúr odvodených z východiskového klonu 193/CO.

Obr. 5 zobrazuje výsledky merania chromogénnej aktivity niekoľkých základných klonov a subklonov.

Obr. 6A ukazuje aktivitu typu FVIII protilátok proti FIX/FIXa 193/AD3 a 196/AF2 v porovnaní s ľudským FVIII, TBS pufrom a médiom bunkovej kultúry. Po fáze lag vyvolali obe protilátky štiepenie chromogénneho substrátu, ako je možné súdiť zo vzrastajúcej optickej hustoty.

Obr. 6B zobrazuje porovnanie chromogénnej aktivity faktoru VIII, 196/AF1, 198/AC1/1 a myšacieho IgG.

Obr. 7A ukazuje porovnanie kinetiky tvorby faktoru Xa pôsobením faktoru VIII a 196/AF2 s prídavkom a bez prídavku špecifického inhibítora faktoru Xa.

Obr. 7B ukazuje porovnanie kinetiky tvorby faktoru Xa pôsobením faktoru VIII, myšacieho IgG a protilátky anti-faktor IX/IXa 198/AM1 s prídavkom a bez prídavku špecifického inhibítora faktoru Xa Pefabloc Xa®.

Obr. 8A zobrazuje meranie závislosti aktivity typu faktoru VIII u čistenej protilátky proti faktoru IX/IXa 198/AC1/1 v prítomnosti a neprítomnosti fosfolipidov, FIXa/FX a vápenatých iónov.

Obr. 8B znázorňuje meranie závislosti tvorby FXa pôsobením protilátky proti FIXa 196/AF1 v prítomnosti fosfolipidov, Ca²⁺ v FIXa/FX.

Obr. 8C ukazuje tvorbu FXa pôsobením nešpecifickej myšacej protilátky

IgG.

Obr. 9 je grafické znázornenie koagulačných časov plazmy s deficitom faktoru VIII v testu APTT s použitím rôznych koncentrácií protilátky proti faktoru IX/IXa 193/AD3.

Obr. 10A ukazuje, že v prítomnosti faktoru IXa spôsobuje protilátka 193/AD3 zníženie koagulačného času plazmy s deficitom faktoru VIII.

Obr. 10B ukazuje zníženie zrážanlivosti, závislé na dávke, pôsobením protilátky 193/AD3 v prítomnosti inhibítorov faktoru IXa a faktoru VIII.

Obr. 11 znázorňuje chromogénnu aktivitu protilátok 198/A1, 198/B1 a 198/AP1 v prítomnosti a neprítomnosti ľudského FIXap.

Obr. 12 znázorňuje primérové sekvencie na amplifikáciu génov variabilného ťažkého reťazca myšacej protilátky.

Obr. 13 znázorňuje primérové sekvencie na amplifikáciu génov variabilného ľahkého (kappa) reťazca myšacej protilátky.

Obr. 14 znázorňuje DNA a odvodenú proteínovú sekvenciu scFv z hybridómovej bunkovej línie 193/AD3 (SEQ ID NO 81 a 82).

Obr. 15 znázorňuje DNA a odvodenú proteínovú sekvenciu scFv z hybridómovej bunkovej línie 193/K2 (SEQ ID NO 83 a 84).

Obr. 16 znázorňuje DNA a odvodenú proteínovú sekvenciu scFv z hybridómovej bunkovej línie 198/AB2 (subklon 198/B1) (SEQ ID NO 85 a 86).

Obr. 17 znázorňuje DNA a dedukovanú proteínovú sekvenciu scFv odvodenú z bunkovej línie 198/A1 (SEQ ID NO 87 a 88).

Obr. 18 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII u peptidu Al/3 v prítomnosti 2,9nM ľudského FIXa. Pomiešaná verzia peptidu Al/3, peptid Al/5, nevyvoláva tvorbu FXa.

Obr. 19 demonštruje závislosť chromogénnej aktivity typu FVIII u peptidu Al/3 na prítomnosti ľudského FIXa. V neprítomnosti ľudského FIXa peptid Al/3 nevyvoláva vznik FXa. Kontrola s pufrom, prázdny imidazolový pufer, je označená IZ.

Obr. 20 ukazuje, že chiralita zvyškov Arg nehrá významnú úlohu pre chromogénnu aktivitu peptidov Al/3-rd a Al/3-Rd-srmb.

Obr. 21 ukazuje, že prídavok 2,4 μΜ peptidu Bl/7 k reakčnej zmesi viedol k merateľnej tvorbe FXa.

Obr. 22 ukazuje, že prídavok FX-špecifického inhibítora vyvoláva významné zníženie reakcie. Pokiaľ nebol prítomný FIXa a k reakčnej zmesi bol pridaný FX, nedošlo k syntéze FXa.

Obr. 23 znázorňuje vektor pBax-IgGl.

Obr. 24 ukazuje zvýšenie amidolytickej aktivity FIXa v prítomnosti protilátky 198/B1 (obr. 24A) a IgM protilátky 198/AF1 (obr. 24B).

Obr. 25 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII fragmentu protilátky 198/A1 v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívna kontrola bola použitá intaktná protilátka 198/A1 a 7,5 pM FVIII. Ako negatívna kontrola bol použitý pufer (IZ).

Obr. 26 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu fúzneho proteínu 198AB2 scFv-alkalická fosfatáza (ORF expresného vektora pDAP2198AB2#100, SEQ ID NO 89 a 90).

Gény pre domény VL a VH protilátky 198/AB2 (198/AB2 je identický subklon 198/B1) boli odvodené zo zodpovedajúcich hybridómových buniek, ako je opísané v príklade 10. PCR produkt VH-génu bol štiepený s použitím Sfil-AscI a PCR-produkt VL-génu bol štiepený pomocou AscI a Nôti. Gény VH a VL boli spojené cez miesto AscI a vložené do vektora pDAP2, štiepeného pomocou SfilNotl (Kerschbaumer R. J. a spol., Immunotechnology 2, 145-150, 1996;

prírastkové číslo GeneBank U35316). PelB leader: vedúca sekvencia pektát lyázy B Erwinia carotovora; His tag: histidínová značka pro iónovú chromatografiu.

Obr. 27 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII fragmentu dvoch fúznych proteínov fragmentu scFv protilátky 198/B1 (subklon AB2) a alkalickej fosfatázy (198AB2#1 a 198AB2#100) v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívna kontrola bol použitý 7,5 pM FVIII.

Obr. 28 znázorňuje aminokyselinovú a nukleotidovú sekvenciu pZipl98AB2#102 (SEQ ID NO 91 a 92).

Obr. 29 znázorňuje aminokyselinovú a nukleotidovú sekvenciu fúzneho proteínu scFv mAB#8860-alkalickej fosfatázy (vektor pDAP2-8860scFv#l 1, SEQ

ID NO 93 a 94). Gény pre domény VH a VL protilátky #8860 boli odvodené od zodpovedajúcich hybridómových buniek, ako je opísané v príklade 10. PCR produkt VH génu bol štiepený pomocou AscI a Nôti. Gény VH a VL boli spojené cez miesto AscI a vložené do vektora pADP2, štiepeného pomocou Sfil-NotI (Kerschbaumer R. J. a spol,, Immunotechnology 2, 145-150, 1996; prírastkové číslo GeneBank U35316).

Obr. 30 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu zipového fúzneho proteínu mAB #8860 scFv-leucín (miniprotilátka; vektor p8860-Zip#l.2, SEQ ID NO 95 a 96). Z mAB #8860 bol odvodený gén fragmentu scFv a bol presunutý z vektora pDAP2-8860scFv#l 1 do plazmidu pZipl, štiepeného pomocou Sfil-NotI (Kerschbaumer R. J. a spol., Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997; prírastkové číslo GeneBank U94951).

Obr. 31 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII miniprotilátky 198/B1 (subklon AB2) 198AB-Zip# 102 v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívna kontrola bolo použitých 4,8 pM FVIII, zatiaľ čo nepríbuzná miniprotilátka (8860-Zip#l.2) a prázdny reakčný pufer (IZ) slúžili ako negatívna kontrola.

Obr. 32 predstavuje schematické znázornenie plazmidu pMycHisó.

Obr. 33 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu časti plazmidu pMycHisó líšiacu sa od vektora pCOCK (SEQ ID NO 97 a 98). Vektor pMycHisó bol konštruovaný štiepením vektora pCOCK (Engelhardt a spol., 1994, Biotechniques, 17:44-46) pomocou Nôti a EcoRI a vložením oligonukleotidov:

mychis6-co: , '

5’ ggccgcag aacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3‘ (SEQ ID NO 79) a mycchis-ic:

5‘ aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgagatgagtttttgttctgc (SEQ ID NO 80).

Obr. 34 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu 198AB2 scFv (napojeného na c-myc tag a His6 tag): ORF expresného vektora pMycHisó198AB2#102. Vektor pMycHisó bol konštruovaný štiepením vektora pCOCK (Engelhardt a spol., 1994, Biotechniques 17, 44-46, 1994) pomocou Nôti a EcoRI a vložením týchto tepelne hybridizovaných oligonukleotidov:

(5‘-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACA TCACCATCACCATCACTAATAAG-3‘ (SEQ ID NO 103) a

5‘-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGA TGAGTTTTTGTTCTGC-3‘ (SEQ ID NO 104).

Vzniknutý vektor, nazvaný pMycHisó, bol štiepený pomocou Sfil-NotI a bol do nej prenesený gén scFv 198AB2 z vektora pDAP2-198AB2#100.

Obr. 35 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu mAB #8860 scFv napojeného na c-myc tag a na His6 tag (vektor p8860-M/H#4c, SEQ ID NO 101 a 102). Plazmid pMycHisó bol štiepený pomocou Sfil a Nôti a bola do ňho vnesená DNA sekvencia kódujúca proteín scFv 8860#l 1 z pDAP2-8860scFv#l 1 (viď obr. 29) za vzniku plazmidu p8860-M/H#4c.

Obr. 36 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII scFv fragmentu 198/B1 (subklon AB2) (MycHis-198AB2#102) v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívna kontrola bol použitý 4,8 pM FVIII, zatiaľ čo ako negatívna kontrola slúžila nepríbuzná scFv (8860-M/H#4c) a prázdny reakčný pufer (IZ).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Imunizácia imunokompetentných myší a vytvorenie hybridómových buniek vylučujúcich protilátku anti-FIX/IXa

Skupiny 1 až 3 normálnych imunokompetentných myší Balb/c vo veku 5 až 8 týždňov boli imunizované intraperitoneálnou (i.p.) cestou 100 pg antigénu (dávky 100 μΐ). V typickom experimente boli myši inokulované buď rekombinantným ľudským zrážacím faktorom (F) IX (Benefix™), ľudským aktivovaným FIXaa (Enzýme Research Laboratories, šarža FIXaa 1190L) alebo ľudským FIXap (Enzýme Research Laboratories, šarža HFIXap 1332 AL) s pomocnou látkou A1(OH)₃ alebo KFA.

Jednotlivé myši dostali v rôznych dobách posilňovaciu dávku 100 pg antigénu (dávky 100 pl i.p.) a o dva dni neskôr boli usmrtené. Boli odobrané bunky sleziny a fúzované s myelomovými bunkami P3 X63-Ag8 6.5.3 v podstate postupom opísaným v Lane a spol., 1985 (J. Immunol. Methods, zv. 81, str. 223228). Každý fúzny experiment bol očíslovaný zvlášť, tj. #193, 195, 196 alebo 198.

Hybridómové bunky boli kultivované na 96jamkových platniach na makrofágovej živnej vrstve (pribi. 10⁵ buniek/ml) a selektované v médiu HAT (médium RPMI-1640 doplnené antibiotikami, 10 % FCS, Na-pyruvátom, Lglutamínom, 2-merkaptoetanolom a HAT (HAT ΙΟΟχ: Ι,ΟχΙΟ'² M hypoxantínu v H2O (136,1 mg/100 ml H2O), 4,0xl0‘⁵ M aminopterínu v H2O (1,76 mg/100 ml H₂O) a l,6xl0’³ M tymidínu v H₂O (38,7 mg/100 ml H₂O). Médium bolo po prvý krát vymenené po 6 dňoch a potom dvakrát za týždeň. Po 2 až 3 týždňoch bolo médium HAT zmenené na médium HT (médium RPMI-1640 doplnené antibiotikami, 10 % FCS, Na-pyruvátom, L-glutamínom_:, 2-merkaptoetanolom a HT) a neskôr (po ďalšom 1 až 2 týdžňoch) na normálne rastové médium (médium RPMI-1640 doplnené 10 % FCS, Na-pyruvátom, L-glutamínom a 2merkaptoetanolom) (viď: HYBRIDOMA TECHNIQUES, EMBO, SKMB Course 1980, Basilej).

V inej sade experimentov boli pre imunizáciu a následnú produkciu hybridomov použité myši C57B16 deficitné na FIX (Lin a spol., 1997, Blood, 90:3962). Pretože myši s knockoutovaným (k.o.) FIX neexprimujú endogénny FIX, považuje sa dosiahnuteľné spektrum anti (a) FIX za odlišné v porovnaní s normálnymi myšami Balb/c (v dôsledku chýbajúcej tolerancie).

Príklad 2: Zisťovanie aktivity typu FVIII v supernatantoch hybridómových buniek vylučujúcich protilátku anti-FIX/FIXa

Za účelom zisťovania aktivity typu FVIII protilátok anti-FIXa, vylučovaných hybridómovými bunkami, bol použitý komerčne dostupný skúšobný kit COATEST VIII:C/4® (Chromogenix). Test bol uskutočňovaný v podstate podľa pokynov výrobcu s touto modifikáciou:

Aby sa umožnil screening s vysokou priepustnosťou, bolo meradlo testu zmenšené na formát mikrotitračnej platne. Stručne povedané boli 25 μΐ alikvóty hybridómových supernatantov prenesené do jamiek mikrotitračnej platne (Costar, #3598) a ohriate na 37 °C. Podľa návodu výrobcu bol rekonštituovaný chromogénny substrát (S-2222), syntetický inhibítor trombínu (1-2581), faktor (F) IXa a FX v sterilnej vode a FIXa/FX bol zmiešaný s fosfolipidem. Pre každú reakciu bolo 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX spojených s 25 μΐ CaCb (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibítor. Na zahájenie reakcie bolo 125 μΐ tohto premixu pridaných k hybridómovému supematantu v mikrotitračných platniach a inkubovaných pri 37 °C. V rôznych dobách (30 min až 12 h) bola pomocou prístroja Labsystems iEMS Reader MF™ zistená absorbancia vzoriek pri 405 nm a 490 nm proti slepému reagentu (MLW, bunkové kultivačné médium namiesto hybridómového supematantu). Aktivita typu FVIII pre vzorky bola počítaná z porovnania absorbancie vzoriek proti absorbancii zriedeného referenčného štandardu FVIII (IMMUNO AG # 5T4AR00) pomocou Software GENESIS™.

Výsledky screeningu na aktivitu typu FVIII v supernatantoch kultúr hybridómových buniek sú znázornené na obr. 1. Vopred zvolené klony odvodené zfúznych experimentov #193, #195 a #196 (viď vyššie) boli podrobené vyššie opísanému chromogénnemu testu FVIII. Klony 193/M1, 193/N1 a 193/P1 sú subklony odvodené od základného klonu 193/C0 (viď ďalej). Základný kloň 195/10 bol odvodený z fúzneho experimentu #195 a klony 196/AO, 196/BO a 196/CO boli odvodené z fúzneho experimentu #196. V typickom screeningovom experimente bolo približne 1000 klonov (v 96 jamkách) z jedného fúzneho experimentu podrobených pre-screeningu na aktivitu typu FVIII. Vybrané klony potom boli kultivované vo väčšom meradlu (3 až 5 ml supematantu) a znovu podrobené chromogénnemu testu. Ako negatívna kontrola bolo na každej platni testované kultivačné médium buniek (MLW).

Jamky vykazujúce buď vysokú aktivitu typu FVIII alebo podstatnú aktivitu typu FVIII boli podrobené subklonovaniu. Proces selekcie a subklonovania je opísaný pre screening a subklonovanie bunkovej línie produkujúcej IgG (tj. 193/CO), ale bol uskutočňovaný presne rovnako i pre kloň produkujúci IgM (tj. 196/CO, viď ďalej, obr. 5).

Proces selekcie spočíval v tom, že najprv boli všetky hybridómové bunkové klony odvodené z jedného fúzneho experimentu nanesené na desať 96 jamkových platní, ktoré tak vytvorili tzv. „základné platne“. Jednotlivé pozície (jamky) na základnej platni obsahovali obvykle viac než jeden kloň hybridómových buniek (obvykle 3 až 15 rôznych klonov). Potom bola testovaná protilátka vylučovaná len nekoľkými tisícmi buniek. Tieto bunky rástli za podmienok suboptimálnych na produkciu protilátky, o ktorej je známe, že najlepšia je v umierajúcich bunkách. Očakávaná koncentrácia špecifickej protilátky anti FIX v supernatante teda môže byť v rozmedzí 10'¹² až 10'¹⁴ M. To vysvetľuje, prečo bolo nutné predĺžiť inkubačné doby oproti štandardným testom pre FVIII. '

Výsledky screeningu na FVIII aktivitu sprostredkovanú IgG v supernatantoch hybridómovej bunkovej kultúry základnej platne sú znázornené na obr. 2. Supernatanty boli podrobené chromogénnemu testu na FVIII. Sú uvedené výsledky odvodené z piatej základnej platne fúzneho experimentu č. #193 (myši Balb/c imunizované FIXaa). Absorbancia bola zisťovaná po 4 hodinách inkubácie pri 37 °C. Pozícia ES bola identifikovaná ako vykazujúca aktivitu typu FVIII významne vyššiu než slepý pokus (MLW). Táto hotovosť buniek bola označená 193/CO a bola ďalej subklonovaná (obr. 3). Pretože každá jamka základnej platne obsahuje viac než jeden hybridomový bunkový kloň, boli bunky z jedinej pozitívnej jamky rozšírené a nanesené s vypočítanou hustotou 2 až 0,2 buniek/jamka na 96jamkovú platňu. Supernatanty boli opäť testované na aktivitu typu FVIII a pozitívne polohy boli podrobené ďalšiemu cyklu subklonovania. S každým klonom vykazujúcim aktivitu typu FVIII boli na získanie homogénnej bunkovej populácie uskutočnené typicky tri až štyri subklonovacie cykly. Tu sú uvedené výsledky chromogénneho testu subklonov

193/C0. Po 4 hodinách inkubácie pri 37 °C bola zisťovaná absorbancia. Polohy A6 a D5 vykazovali značnú aktivitu typu FVIII a boli označené 193/M1, resp. 193/P1. Tieto dva klony boli podrobené ďalšiemu cyklu subklonovania. Ako negatívna kontrola bolo na každej platni testované prázdne kultivačné médium (MLW(Hl)).

Porovnanie chromogénnej aktivity typu FVIII a FIX-ELISA reaktivity hybridómových kultúr v malom meradle (3 ml) je znázornené na obr. 4. Predtým, než bolo učinené rozhodnutie, či sa má základný kloň (alebo subklon) ďalej subklonovať, boli vypestované klony v meradle 3 až 5 ml a supernatanty boli znovu testované. Graf ukazuje výsledky ELISA špecifické pre FIX a chromogénnu aktivitu typu FVIII základného klonu 193/CO a všetkých jeho subklonov, ktoré boli identifikované ako pozitívne a znovu skontrolované. Ako v prípade ELISA, tak chromogénnych testov, ktoré sú tu znázornené, boli získané hodnoty slepých pokusov (absorbancie samotného chromogénneho reagentú). Kloň 193/M1 bol subklonovaný a poskytol klony 193/V2, I93/M2 a 193/U2. Ďalšie klony z druhého cyklu pochádzali z 193/P1, 193/AB2 a 193/P2 a boli subklonované. 193/AF3, 193/AB3 a 193/AE3 sú subklony 193/AB2. Zvyšné klony z tretieho cyklu pochádzali z 193/P2. Konečne boli subklonované 193/AF3 (->193/AF4), AE3 (->193/AE4, 193/AL4, 193/AN4 a 193/AO4) a 193/AD3 (->193/AG4, 193/AH4, 193AD4, 193/AI4, 193/AK4).

Z každého fúzneho experimentu bolo identifikovaných niekoľko (5 až 15) základných klonov (vybraných zo základnej platne) a podrobených subklonovaniu. Po 3 cykloch subklonovania bola väčšina bunkových línií homogénnych, ako demonštruje ELISA a chromogénna analýza aktivity (viď obr.

4), rovnako ako sekvenčná analýza cDNA. Konkrétny základný kloň a všetky jeho subklony produkujú tú istú protilátku viažúcu FIX/FIXa. Existujú však veľké rozdiely v proteínových sekvenciách protilátok klonov odvodených od rôznych základných klonov (viď príklad 11). Väčšina hybridómových bunkových línií exprimuje protilátky z podtriedy IgG (tj. klony #193, #198, ako 198/A1, 198/B1, 198/BB1). Boli sme ale taktiež schopní vybrať nejaké klony exprimujúce protilátky IgM.

Bola stanovená chromogénna aktivita hybridómového supernatantu niektorých významných základných klonov a subklonov. Absorbancia bola meraná po 1 h 30 min a 3 h 30 min inkubácie pri 37 °C (obr. 5). V kontraste ku všetkým klonom zo 193. fúzie produkoval kloň 196/C0 a jeho subklon 196/AP2 FIX/FIXa-špecifickú IgM protilátku, ktorá dávala silnú chromogénnu aktivitu i po kratšej dobe inkubácie.

U Európskej zbierky bunkových kultúr (ECACC) boli v súlade s Budapeštianskou zmluvou uložené tieto bunkové línie: 98/B1 (č. ECACC 99090925); 98/Al (č. ECACC 99090924); 98/BB1 (č. ECACC 99090926); 98/AO (č. ECACC 99121614); 196/C4 (č. . ECACC 99121615); . 198/D1 (č. ECACC 99121616); 198/T2 (č. ECACC 99121617); 198/G2 (č. ECACC 99121618); 198/AC1 (č. ECACC 99121619) a 198/U2 (č. ECACC 99121620).

Za účelom hlbšej analýzy biochemických vlastností určitých protilátok boli expandované homogénne hybridómové bunkové línie exprimujúce rôzne protilátky s aktivitou typu FVIII a použité na expresiu daných protilátok vo väčšom meradle (100 až 1000 ml). Tieto protilátky boli pred použitím v ďalších experimentoch afinitne čistené (viď príklad 3).

Príklad 3: Väzbové vlastnosti faktoru IX/FIXa(_ajp) pre protilátky vykazujúce aktivačnú aktivitu FIX/FIXa

Faktor IX a obe aktivované formy FIX, FIXaa a FIXaP (FIX/FIXa(_a>p))boli zriedené TBS (25 mM Tris HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5) na konečnú koncentráciu 2 pg/ml. Platne Nunc Maxisorp pro ELISA boli povlečené 100 μΐ roztoku FIX/FIXa(_ajp) s použitím štandardného postupu (4 °C, cez noc) a niekoľkokrát premyté TBST (TBS, 0,1 obj. % Tween 20). 50 μΐ hybridómového supernatantu bolo v pomere 1:1 zriedených s 50 μΙ TBST/2 % BSA a pridaných na povlečenú platňu ELISA. Po 2 h inkubácie pri izbovej teplote (room temperature, RT) boli platne štyrikrát premyté TBST a inkubované (2 h, RT) so 100 μΙ/jamka antimyšacej IgG (Fc-špecifickej) protilátky konjugovanej s peroxidázou (Sigma, #A0168) v zriedení 1:25000. Jamky boli päťkrát premyté TBST a nakoniec ofarbené

100 μΐ čerstvo pripraveného farbiaceho roztoku (10 ml 50mM citrátu sodného, pH

5, doplneného 100 μΐ OPD (60 mg OPD/ml) a 10 μΐ 30% H2O2). Reakcia bola zastavená prídavkom 50 ml H2SO4 a bola zaznamenaná optická hustota pri 492 nm a 620 nm pomocou čítača mikrotitračných platní Labsystems iEMS Reader

MF™ s použitím Software GENESIS™.

V určitých prípadoch bola namiesto ELISA s anti-myšacím IgG vykonaná ELISA s anti-myšacím IgM.

Čistenie myšieho IgG zo supernatantov kultúry hybridómových buniek

Hybridómový supernatant (100 až 500 ml) bol doplnený pufrom 200 mM Tris/HCI (pH 7,0) a pevným NaCl na konečnú koncentráciu 20 mM Tris, resp. 3 M NaCl. Potom bol supernatant vyčírený odstredením po dobu 10 min pri 5500 x g. Jednomililitrová afinitná chromatografická kolóna s proteínom G (Protein G Sepharose Fast Flow, Amersham-Pharmacia) bola premytá 15 ml 20 mM Tris/Cl o pH 7,0 a potom ekvilibrovaná 10 ml 20 mM Tris/Cl pufru o pH 7,0 s obsahom 3 M NaCl. Na kolónu bol potom gravitačné nanesený hybridómový supernatant s obsahom 3 M NaCl. Kolóna bola premytá 15 ml 20 mM Tris/Cl pufru, pH 7,0, s obsahom 3 M NaCl. Naviazaný IgG bol potom eluovaný pomocou 12 ml pufru glycín/HCl s pH 2,8 a boli zbierané frakcie s objemom 1 ml. Ku každej frakcii bolo pre neutralizáciu pridaných 100 μΐ 1 M Tris, pH 9,0. Frakcie obsahujúce IgG boli identifikované zmiešaním 50 μΐ sa 150 μΐ farbiaceho roztoku (BioRad koncentrát, zriedený 1:5 vodou) v jamkách mikroplatne. Pozitívne frakcie boli spojené a skoncentrované na 1 ml v ultrafiltračnom zahusťovači (Centricon Plus 20, Amicon) podľa pokynov výrobcu. Koncentrát bol zriedený 19 ml TBS (20 mM Tris/Cl pufru o pH 7,0 s obsahom 150 mM NaCl) a znovu skoncentrovaný na 1 ml. Stupeň riedenia-koncentrovania bol ešte dvakrát opakovaný za účelom prevedenia IgG do TBS.

Čistenie myšacieho IgM zo supernatantov hybridómových buniek

100 až 500 ml supernatantu kultúry hybridómových buniek bolo skoncentrovaných na 5 až 10 ml buď ultrafiltračným zahusťovačom (Centricon Plus 20, Amicon) podľa pokynov výrobcu alebo zrážaním síranom amónnym (nasýtenie 40 %, 0 °C) a opätným rozpustením koncentrátu v 5 až 10 ml TBS. V každom prípade bol koncentrát dialyzovaný proti 20 mM Tris/Cl pufru s pH 7,4 s obsahom 1,25 M NaCl a ďalej zahustený na 1 ml v ultrafiltračnom zahusťovači Centricon Plus 20 (Amicon). IgM bol z tohto koncentrátu čistený pomocou prečisťovacieho kitu ImmunoPure IgM (Pierce) podľa pokynov výrobcu. Frakcie odobrané počas elúcie z kolóny s maltózovým väzbovým proteínom boli testované na IgM, spojené, zahustené a prevedené do TBS, ako je opísané pre IgG.

Stanovenie koncentrácie IgG v čistených preparátoch

Celkový obsah IgG 280 nm - bola meraná extinkcia príslušných riedení. E280 = 1,4 zodpovedá 1 mg/ml proteínu.

IgG špecifický pre faktor IXa (kvantitatívna ELISA)

Jamky mikroplatne (Nunc Maxisorp) boli cez noc pri 4 °C inkubované s 2 pg/ml faktoru IXa zriedeného v TBS (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, s obsahom 150 mM NaCl). Jamky boli štyrikrát premyté TBST (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, s obsahom 150 mM NaCl a 0,1 obj. % Tween 20). Ako štandardný monoklonálny AB bol použitý HIX1 anti-FIX (presný). Štandard i vzorky boli zriedené TBST s obsahom 2 obj. % BSA. Štandardný rad riedení a príslušné riedenia vzoriek boli inkubované 2 h pri izbovej teplote na platni ELISA. Platne boli štyrikrát premyté TBST a inkubované (2 h, RT) so 100 μΙ/jamka anti-myší IgG (Fc-špecifickej) protilátky konjugované s peroxidázou (Sigma, #A-0168) v zriedení 1:25000. Jamky boli päťkrát premyté TBST a nakoniec ofarbené 100 μΐ čerstvo pripraveného farbiaceho roztoku (10 ml 50mM citrátu sodného, pH 5, doplneného 100 μΐ OPD (60 mg OPD/ml) a 10 μΐ 30% H2O2). Reakcia bola zastavená prídavkom 50 ml H2SO4 a po 30 min bola zaznamenaná optická hustota pri 492 nm a 620 nm pomocou čítača mikrotitračných platní Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím Software GENESIS™.

Príklad 4: Protilátky anti-FIX/FIXa vykazujúce aktivitu typu FVIII v chromogénnom teste

Niekoľko hybridómových klonov produkujúcich protilátky anti-FIX/FIXa bolo až štyrikrát subklonovaných a vzniknutá monoklonálna hybridómová bunková línia bola použitá na získanie supernatantu obsahujúceho monoklonálnu protilátku. Protilátky izotypu IgG, odvodené z týchto supernatantov, boli čistené na afinitných kolónach a dialyzované proti TBS (viď vyššie). Protilátky IgM boli použité ako nečistené frakcie supernatantu. S dvomi sadami reprezentatívnych protilátok boli uskutočnené tieto experimenty: 193/AD3 a 198/AC1/1 (izotyp IgG, protilátka 198/AC1/1 je preparát z pôvodného hybridómového klonu 198/AC1, t. j. kultivuje sa (zmrazená) liekovka obsahujúca bunky 198/AC1 a získajú sa protilátky. Na tieto experimenty sa potom použije supernatant.) a 196/AF2 a 196/AF1 (izotyp IgM) (obr. 6A a 6B). Stručne povedané boli alikvóty 25 μΐ vzorky obsahujúcej monoklonálnu protilátku (nečistený hybridómový supernatant alebo, ak je to uvedené, určité množstvo FIX špecifickej protilátky) prenesené do jamiek mikrotitračných platní a zahriate na 37 °C. Chromogénny substrát (S2222), syntetický inhibítor trombínu (1-2581), faktor (F) IXa a FX boli rekonštituované v sterilnej vode a FIXa/FX bol zmiešaný s fosfolipidmi podľa pokynov dodávateľa. Na každú reakciu bolo zmiešaných 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX s 25 μΐ CaCl₂ (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibítór. Na zahájenie reakcie bolo 125 μΐ tohto premixu pridaných k roztoku monoklonálnej protilátky v mikrotitračných platniach a inkubovaných pri 37 °C. V rôznych intervaloch (5 min až 6 h) bola zistená absorbancia vzoriek pri 405 nm a 490 nm proti čistému reagentu (médium bunkovej kultúry namiesto hybridómového supernatantu) pomocou čítača mikrotitračných platní Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím Software GENESIS™.

Časový priebeh aktivity typu FVIII u monoklonálnych protilátok 193/AD3 (izotyp IgG) a 196/AF2 (izotyp IgM) v porovnaní s ľudským FVIII (12 a 16 mU/ml), TBS a s médiom bunkovej kultúry je znázornený na obr. 6A. Po lag fáze vyvolali obe protilátky štiepenie chromogénneho substrátu, ako je možné súdiť zo vzrastajúcej optickej hustoty nameranej pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Časový priebeh aktivity typu FVIII u monoklonálnych protilátok 198/AC1/1 (izotyp IgG, 10 pg/ml) a 196/AF1 (izotyp IgM, nečistený supernatant) v porovnaní s ľudským FVIII (16 mU/ml) a 10 pg/ml myšacieho IgG je znázornený na obr. 6B. Po lag fáze vyvolali obe protilátky štiepenie chromogénneho substrátu, ako je možné súdiť zo vzrastajúcej optickej hustoty nameranej pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Príklad 5: Aktivita typu FVIII u anti-FIX/FIXa protilátok vytvára faktor Xa a je závislá od fosfolipidu, FIXa/FX a Ca²⁺

Aktivita faktoru VIII sa obvykle stanovuje chromogénnym testom a/alebo zrážacím testom na báze APTT. Oba typy testov sú založené na tvorbe faktoru Xa sprostredkovanej FVIIIa/FIXa. V prípade chromogénneho testu FVIII bude vznikajúci faktor Xa následne reagovať s chromogénnym substrátom, čo môže byť monitorované spektroskopicky, napríklad v čítači ELISA. V zrážacom teste na báze APTT sa voľný faktor Xa bude spojovať s FVa a na povrchu fosfolipidov v tzv. protrombinázovom komplexe a bude aktivovať protrombín na trombín. Trombín potom vyvoláva tvorbu fibrínu a konečne vznik zrazeniny. Základom oboch skúšobných systémov je tvorba faktoru Xa komplexom FVIIIa/FIXa.

Na preukázanie, že aktivita typu FVIII, vyskytujúca sa u anti-FIX/FIXa protilátok, skutočne generuje faktor Xa, bol uskutočnený nasledujúci experiment. Niekoľko 25 μΐ alikvotných častí nečisteného hybridómového supernatantu 196/AF2 (izotyp IgM) bolo prenesených do jamiek mikrotitračnej platne a zahriatych na 37 °C. Ako pozitívna kontrola bolo 16 mU Recombinate™ zriedených do hybridómového média (196 HM 007/99) a spracovaných presne rovnakým spôsobom ako hybridómový supernatant. Ako negatívna kontrola bolo použité prázdne hybridómové médium. Chromogénny substrát (S-2222), syntetický inhibítor trombínu (1-2581), faktor IXa a FX boli rekonštituované v sterilnej vode a FIXa/FX bol zmiešaný s fosfolipidmi podľa pokynov dodávateľa. Pefabloc Xa®, faktor Xa-špecifický proteinázový inhibítor (Pentapharm, Ltd.), bol rekonštituovaný vodou na konečnú koncentráciu 1 mM/Ι. Na každú reakciu

I bolo spojených 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX s 25 μΐ CaCb (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibítor trombínu. Na zahájenie reakce bolo 125 μΐ tohto premixu pridaných ku vzorkám v mikrotitračných platniach a inkubovaných pri 37 °C. Pokiaľ je to uvedené, bolo pridaných 35 μΜ Pefabloc Xa®. V rôznych intervaloch (každých 5 min až 6 h) bola zistená absorbancia pri 405 nm a 490 nm proti prázdnemu reagentu (médium bunkovej kultúry) s použitím čítača mikrotitračných platní Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím Software GENESIS™.

Výsledky stimulácie faktoru IXa aktivitou typu FVIII vykazovanou protilátkou IgM 196/AF2 anti-FIX/FIXa pri tvorbe faktoru Xa, ako je možné súdiť z ľahko merateľného štiepenia chromogénneho substrátu S-2222 (porov. „16 mU FVIII“ a „196/AF2“) sú znázornené na obr. 7A. Aktivita faktoru Xa je efektívne blokovaná FXa-špecifickým inhibítorom „Pefabloc Xa®“ (porov. „196/AF2“ proti „196/AF2 35 μΜ Pefabloc Xa®“), čo ukazuje, že bol skutočne generovaný FXa.

Rovnaký experiment bol uskutočnený s použitím čistených preparátov IgG klonu 198/AM1 (obr. 7B). Čistený IgG bol zriedený TBS na konečnú koncentráciu 0,4 mg/ml a 25 μΐ (tj. celkovou 10 pg), prenesený do jamiek mikrotitračnej platne a zahriaty na 37 °C. Ako pozitívna kontrola bol použitý FVIII odvodený z 6 mU plazmy. 10 pg nešpecifického myšacieho IgG (Sigma, I5381) slúžilo ako negatívna kontrola. Test bol uskutočňovaný vyššie opísaným spôsobom.

Ďalšie experimenty ukazujú, že stimulácia faktoru IXa aktivitou typu FVIII prejavovanou IgG anti-FIX/FIXa protilátkou 198/AM1 generuje faktor Xa, ako je možné súdiť z ľahko merateľného štiepenia chromogénneho substrátu S-2222 (obr. 7b). Faktor VIII a protilátka 198/AM1 opäť generujú FXa, ktorý je efektívne blokovaný FXa špecifickým inhibítorom „Pefabloc Xa®“. Ako negatívna kontrola bol testovaný nešpecifický myšací IgG (Sigma. 15381).

V ďalšej sade experimentov bola demonštrovaná závislosť buď čistených protilátok anti-FIX/FIXa (IgM, obr. 8A) alebo nečistených protilátok odvodených zo supernatantov bunkovej kultúry (IgG, obr. 8B) od prítomnosti fosfolipidov (PL), FIXa/FX a Ca²⁺. Ako kontrola bol použitý myšací IgG (obr. 8C). Aktivita typu faktoru VIII bola testovaná v podstate vyššie opísaným spôsobom. Kde je to uvedené, bola z reakcie vynechaná buď zmes FIXa/FX, PL alebo Ca²⁺. V rôznych intervaloch bola zistená absorbancia vzoriek pri 405 nm a 490 nm proti prázdnemu reagentu (pufer namiesto čistenej protilátky) v čítači mikrotitračných platní Labsystems iEMS Reader MF™. Výsledky sú znázornené na obr. 8A, 8B a 8C.

Závislosť aktivity typu FVIII čistenej protilátky anti-FIXa 198/AC1/1 (izotyp IgG, koncentrácia použitá v celom pokuse bola 10 pg/ml) od prítomnosti fosfolipidov (PL), FIXa/FX a Ca je ďalej znázornená na obr. 8a. Ako je ľahko viditeľné, len v kompletnom teste, zahrnujúcom protilátku, PL, Ca²⁺ a FIXa/FX, dochádza k primeranej tvorbe FXa. Závislosť aktivity typu FVIII supernatantu bunkovej kultúry obsahujúceho nečistenú protilátku izotypu IgM anti-FIX/FIXa (196/AF1) od prítomnosti fosfolipidov, FIXa/FX a Ca je znázornená na obr. 8B.

Opäť, ako už bolo ukázané pre čistený preparát IgG (obr. 8A), protilátku 198/AC1/1, iba kompletný test, zahrnující PL, Ca²’, FIXa/FX, poskytuje primeranú tvorbu FXa. Na demonštráciu špecifity reakcie bol za rovnakých podmienok, aké sú opísané vyššie, testovaný celkový IgG, pripravený z normálnej myšacej plazmy. Výsledky sú znázornené na obr. 8C. Nebolo možno detegovať žiadnu aktivitu typu FVIII. Podľa očakávaní nie je žiadna aktivita detegovateľná v neprítomnosti fosfolipidov, FIXa/FX a Ca²⁺. Všetky experimenty boli uskutočňované na mikrotitračnej platni a OD405 bola snímaná každých 5 min po dobu 6 h.

Príklad 6: Určité protilátky anti-FIX/FIXa sú v prítomnosti FIXa prokoagulačné

Počas normálnej homeostázy dochádza k počiatočnej aktivácii FIX buď prostredníctvom dráhy tkáňový faktor (TF)/faktor Vila alebo neskôr aktivovaným faktorom XI (FXIa). Po aktivácii sa FIXa spojuje na povrchu doštičiek v membránovo viazanom komplexe s FVIII. Faktor IXa sám o sebe má voči FX nízku alebo žiadnu enzymatickú aktivitu, ale v prítomnosti FVIIIa sa stáva vysoko aktívnym. Na demonštráciu, že určité protilátky anti-FIX/FIXa majú aktivitu typu FVIII a teda sú prokoagulačné v ľudskej plazme s deficitom FVIII, bol uskutočnený nasledujúci experiment. V štandardnom jednostupňovom zrážacom teste na báze aPTT boli použité rôzne množstvá protilátky 193/AD3 alebo myšacieho IgG (ako kontrola). Stručne povedané boli 100 μΐ vzorky obsahujúce protilátku inkubované v zrážecím analyzátoru KC10A s 100 μΐ plazmy s deficitom FVIII (DP) a 100 μΐ činidla DAPTTIN (činidlo PTT na stanovenie času aktivovaného tromboplastínu; IMMUNO AG). Kde je to uvedené, bolo v reakčnej zmesi zahrnutých celkom 50 ng aktivovaného FIX. Po 4 min inkubácie bola zahájená reakcia prídavkom 100 μΐ CaCl₂ (25 mM). Výsledky sú uvedené v tabuľke 1 a na obr. 9.

zrážací čas (s)
mg AB	193/AD3	myšací IgG
	50 ng FIXa	50 ng FIXa
9	101,6	102,5
4,5	95,6	103,2
2,25	93,1	103,2
1,8	93,7	101,9
1,35	91,4	103,4
0,9	94,4	102,2
0,45	98,1	101,9
0,34	97,1	103,9
0,23	99,3	103,7

Tabulka 1: Zrážacie časy plazmy s deficitom FVIII v zrážacom pokuse na báze APTT s použitím rôznych množstiev prokoagulantu (193/AD3) a kontrolnej protilátky (myšací IgG) v prítomnosti 50 ng aktivovaného FIX (0,01 U FIX).

Molárny pomer protilátky v reakcii a aktivovaného FIX je 10:1. Molárny pomer medzi protilátkou a celkovým FIX (FIX a FIXa za predpokladu, že ľudská plazma s deficitom FVIII obsahuje 1 U (5 pg) FIX) sa pohybuje medzi 6:1 (9 pg protilátky v reakcii) a 1:6 (0,23 pg protilátky v reakcii). Pri optimálnom skrátení zrážacieho času je molárny pomer medzi protilátkou a celkovým FIX 1:1. Zrážací čas bez prídavku FIX je v rozmedzí 120 s.

Obr. 9 graficky znázorňuje zrážacie časy plazmy s deficitom FVIII v zrážacom teste na báze aPTT s použitím rôznych množstiev prokoagulantu (193/AD3) a kontrolnej (myšací IgG) protilátky v prítomnosti 50 ng aktivovaného FIX. U vzoriek doplnených protilátkou 193/AD3 došlo ku zreteľnému skráteniu zrážacích časov v závislosti od dávky. Tieto výsledky implikujú, že protilátka 193/AD3 je v prítomnosti FIXa prokoagulačná.

Príklad 7: Protilátky anti-FIX/FIXa sú prokoagulačné v prítomnosti inhibítorov FVIII a FIXa

Vážnou komplikáciou štandardnej substitučnej terapie FVIII je vývin alloprotilátok zameraných proti FVIII, vedúcich k neutralizácii FVIII a ku stavu, kedy sa pacientova krv prestane zrážať.

Na demonštráciu, že určité protilátky anti-FIXa majú aktivitu typu FVIII i v prítomnosti inhibítorov FVIII bol uskutočnený nasledujúci experiment. V štandardnom jednostupňovom zrážacom teste na báze APTT boli použité rôzne množstvá protilátky 193/AD3 alebo ako kontrola myšací IgG. Stručne povedané boli vzorky 100 pl protilátky v zrážacom analyzátore KC10A inkubované buď so 100 pl plazmy s deficitom FVIII (obr. 10A) alebo plazmy s inhibítorom FVIII (kapacita inhibítora 400 BU/ml, obr. 10B) a taktiež so 100 pl činidla DAPTTIN. V reakčnej zmesi bolo navyše obsiahnuté celkové množstvo 50 ng aktivovaného FIXa. Po 4 min inkubácie bola reakcia zahájená prídavkom 100 pl CaCU (25 mM). Na zaistenie rovnakých podmienok boli experimenty s použitím plazmy s deficitom FVIII a plazmy s inhibítorom FVIII uskutočňované paralelne. Výsledky sú znázornené na obr. 10A a 10B. Ako je demonštrované už v príklade

6, došlo ku zreteľnému skráteniu zrážacích časov v závislosti od dávky u vzoriek doplnených protilátkou 193/AD3 v prítomnosti inhibítorov FVIII.

Príklad 8: Protilátky anti-FIX/FIXa sú prokoagulačné v prítomnosti defektného

I

FVIII a FIXa

Na demonštráciu, že určité protilátky anti-FIXa majú v prítomnosti defektného FVIII aktivitu typu FVIII, je možné uskutočniť nasledujúci experiment. V štandardnom jednostupňovom zrážacom teste na báze aPTT sa použijú vzrastajúce množstvá protilátky 193/AD3 alebo ako kontrola myšací IgG. V tomto zrážacom teste sa použije plazma pacienta s hemofíliou A s veľmi nízkou zrážacou aktivitou v dôsledku prítomnosti defektného FVIII (DF8). Stručne povedané sa vzorky 100 μΐ protilátky inkubujú v zrážacom analyzátore KC10A buď so 100 μΐ plazmy DF8 alebo plazmy s deficitom FVIII a takisto so 100 μΐ činidla DAPTTIN. V reakčnej zmesi je navyše obsiahnuté celkové množstvo 50 ng aktivovaného FIXa. Po krátkej inkubácii sa zaháji reakcia prídavkom 100 μΐ CaCb (25 mM)., Na zaistenie rovnakých podmienok sa experimenty s použitím plazmy s deficitom FVIII a plazmy DF8 uskutočňujú paralelne.

Príklad 9: Protilátky anti-FIX/FIXa s prokoagulačnou aktivitou v prítomnosti FIXa sa rozlišujú medzi ľudským a hovädzím FIXa

FIX/FIXa-špecifické monoklonální protilátky vybrané zo 198. fúzneho experimentu boli čistené z príslušných hybridómových supernatantov a kvantifikované spôsobom opísaným v príklade 3. Tieto protilátky boli analyzované v modifikovanom jednostupňovom zrážacom teste (ako je opísané v príklade 6) a niektoré vykázali prokoagulačnú aktivitu.

Chromogénna aktivita týchto preparátov protilátok bola meraná v tomto kinetickom teste tvorby FXa: 10 μg monoklonálnej protilátky (ve 25 μΐ) bolo prenesených do jamiek mikrotitračnej platne a zahriatych na 37 °C. Chromogénny substrát (S-2222), syntetický inhibítor trombínu (1-2581), faktor IXa a FX boli rekonštruované v sterilnej vode a FIXa/FX (oba hovädzie) boli zmiešané s fosfolipidmi podľa pokynov dodávateľa. Na každú reakciu bolo 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX spojených s 25 μΐ CaCl₂ (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibítor. Na zahájenie reakcie bolo 125 μΐ tohto premixu pridaných k roztoku monoklonálnej protilátky v mikrotitračných platniach a inkubovaných pri 37 °C. V rôznych časoch (5 min až 2 h) bola zistená absorbancia vzoriek pri 405 nm proti prázdnemu činidlu (25 ml TBS namiesto monoklonálnych protilátok) s použitím čítača mikrotitračných platní Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím Software GENESIS™. Rovnaké reakcie boli uskutočňované paralelne, avšak na každú reakciu bolo pridaných 50 ng ľudského FIXa. Protilátky, ktoré vykazovali prokoagulačnú aktivitu, nemali chromogénnu aktivitu v prípade bovínneho FIX, ale vykazovali vysokú aktivitu, keď bol prítomný ľudský FIXa.

Obr. 11 znázorňuje časový priebeh aktivity typu FVIII, vykazovanej monoklonálnymi protilátkami 198/A1, 198/B1 a 198/AP1 s prídavkom (+) a bez prídavku (-) 50 ng ľudského FIXap. Ako kontrola bol použitý nešpecifický polyklonálny myšací IgG. 198/A1 a 198/B1 vykazujú prokoagulačnú aktivitu (podobnú ako 193/AD3 v príklade 6), zatiaľ čo 198/AP1 nie. Protilátka 198/BB1 mala rovnaký vzorec aktivity (údaje neznázornené).

Dalšie monoklonálne protilátky vybrané zo 198. fúzneho experimentu zahrnujú 198/D1 (ECACC č. 99121616), 198/T2 (ECACC č. 99121617), 198/G2 (ECACC č. 9912118), 198/U2 (ECACC č. 99121620).

Príklad 10: Štruktúra a prokoagulačná aktivita derivátov protilátok odvodených z anti-FIX/FIXa protilátok; subklonovanie variabilných domén protilátok z hybridómových bunkových línií 193/AD3, 193/K2, 198/A1 a 198/B1 (kloň AB2)

Postup klonovania: Mesengerová RNA bola pripravená z 1x106 hybridómových buniek príslušnej bunkovej línie (buď 193/AD3, 193/K2, 198/A1 alebo 198/B1 (klonAB2)) s použitím „QickPrep® Micro mRNA Purification Kit“ (Pharmacia) podľa pokynov výrobcu. Zodpovedajúca cDNA bola získaná retrotranskripciou mRNA s použitím „Ready-To-Go-You-Prime-First Strand

Beads kit“ (Pharmacia) podľa pokynov výrobcu. Sekvencie kódujúce ťažké a ľahké reťazce boli konvertované na zodpovedajúcu cDNA s použitím sady primérov. Na reverzný prepis mRNA špecifickej pre ťažký reťazec (VH) bola použitá ekvimolárna zmes oligonukleotidov M0CG1-2F0R (5‘ CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC 3‘) (SEQ ID NO 1), M0CG3F0R (5‘ CTC GAT TCT CTT GAT CAA CTC AGT CT 3‘) (SEQ ID NO 2) a MOCMFOR (5‘ TGG AAT GGG CAC ATG CAG ATC TCT 3‘) (SEQ ID NO 3) (RTmixl). V tej istej skúmavke bola syntetizovaná cDNA špecifická pre ľahký reťazec (VL) s použitím priméru MOCKFOR (5‘ CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC 3‘) (SEQ ID NO 4).

Kódujúce sekvencie pre VH boli amplifikované pomocou PCR s použitím primérových sád znázornených na obr. 12 a špecifickej cDNA, odvodenej z vyššie uvedenej reverznej transkripčnej zmesi (RTmixl), ako templátu. Gény reťazca VK boli amplifikované s použitím primérových sad znázornených na obr. 13 a tiež s použitím RTmixl ako templátu. VH-PCT produkt bol štiepený pomocou Sfil-AscI a vložený do vektora pADP2 digerovaného Sfil-AscI (prístupové číslo GeneBank U35316). Takto získané konštrukty pDAP2-VH boli nazvané pDAP2193AD3/VH, pDAP2-l98A1/VH, pDAP2-l98AB2/VH (odvodený z protilátky 198/B1) a pDAP2-193/K2/VH. Plazmidy potom boli štiepené pomocou AscI-NotI a bol do nich vložený zodpovedajúci PCR produkt génu VK digerovaný AscINotl. Výsledné vektory boli označené pDAP2-l93/AD3scFv, pDAP2-198/AlscFv, pDAP2-198/AB2scFv (odvodený z protilátky 198/B1) a pDAP2-l93/K2scFv a kódujú VH gén a VL gén monoklonálnych protilátok 193/AD3, 198/A1, 198/AB2 (odvodené z protilátky 198/B1) a 193/K2. Ťažké a ľahké reťazce sú spojené kódujúcou sekvenciou na umelý ohybný linker (G4SGGRASG4S; Engelhardt a spol., 1994), čo umožňuje expresiu variantu scFv príslušnej protilátky.

Na obr. 14 je znázornená DNA a dedukovaná proteínová sekvencia scFv odvodeného z hybridómovej bunkovej línie 193/AD3. Nukleotidy 1 až 357 kódujú variabilnú doménu ťažkého reťazca, nukleotidy 358 až 402 umelý ohybný linker a nukleotidy 403 až 726 variabilný región ľahkého reťazca. Proteínová sekvencia CDR3 regiónu ťažkého reťazce má sekvenciu YGNSPKGFAY (SEQ ID NO 5) a je uvedená tučným písmom. Je znázornená umelá linkerová sekvencia (G4SGGRASG4S).

Na obr. 15 je znázornená DNA a dedukovaná proteínová sekvencia scFv odvodeného z hybridómovej bunkovej línie 193/K2. Nukleotidy 1 až 363 kódujú variabilnú doménu ťažkého reťazca, nukleotidy 364 až 408 umelý ohybný linker a nukleotidy 409 až 747 variabilný región ľahkého reťazca. Proteínová sekvencia CDR3 regiónu ťažkého reťazca má sekvenciu DGGHGYGSSFDY (SEQ ID NO 6) a je uvedená tučným písmom. Je znázornená umelá linkerová sekvencia (G4SGGRASG4S).

Na obr. 16 je znázornená DNA a dedukovaná proteínová sekvencia scFv odvodeného z hybridómovej bunkovej línie 198/AB2 (odvodené z protilátky 198/B1). Nukleotidy 1 až 366 kódujú variabilnú doménu ťažkého reťazca, nukleotidy 367 až 411 umelý ohybný linker a nukleotidy 412 až 747 variabilný región ľahkého reťazca. Proteínová sekvencia CDR3 regiónu ťažkého reťazca má sekvenciu EGGGFTVNWYFDV (SEQ ID NO 7) a je uvedená tučným písmom. Je tiež znázornená umelá linkerová sekvencia (G4SGGRASG4S).

Na obr. 17 je znázornená DNA a dedukovaná proteínová sekvencia scFv odvodeného z hybridómovej bunkovej línie 198/A1. Nukleotidy 1 až 366 kódujú variabilnú doménu ťažkého reťazca, nukleotidy 367 až 411 umelý ohýbný linker a nukleotidy 412 až 747 variabilný región ľahkého reťazca. Proteínová sekvencia CDR3 regiónu ťažkého reťazca má sekvenciu EGGGYYVNWYFDV (SEQ ID NO 8) a je uvedená tučným písmom. Je znázornená tiež umelá linkerová sekvencia (G4SGGRASG4S).

Príklad 11: Prokoagulačná aktivita peptidov odvodených z CDR3 regiónov antiFIX/FIXa protilátok

V zásade je možné molekulu protilátky považovať za biologický inštrument prezentácie kombinačného radu peptidových prvkov v trojrozmernom priestore (viď Gao a spol., 1999, PNAS, 96:6025). Preto môže byť protilátka (alebo derivát protilátky, napríklad scFv, Fab atď.) použitá buď ako nástroj na detekciu funkčne významných domén špecifického cieľového proteínu alebo na druhej strane na vymedzenie aminokyselinových sekvencií špecificky sprostredkujúcich určité interakcie, tj. aktiváciu alebo zvýšenie aktivity FIXa voči fyziologickému substrátu FX. Posledne uvedený proces viedol ku zhodnoteniu mnohých peptidických sekvencií odvodených z CDR3 regiónu ťažkého reťazca (CDR3h) ako prostriedkov na posilnenie FIXa.

Zvýšenie prokoagulačnej aktivity peptidov, ktoré takú aktivitu vykazujú, môže byť uskutočnené obmenami sekvencií v regiónoch peptidu kritických pre sprostredkovanie zvýšenia aktivity FIXa. Ako možný krok smerom k peptidickým sekvenciám so zvýšenou prokoagulačnou aktivitou sa mapuje väzbové miesto protilátky, napr. 198/A1 alebo 198/B1, na molekule FIXa s použitím sekvenčných porovnávacích analýz, kompetitívnych väzbových testov, Westernových blottingových analýz a kompetitívnych ELISA analýz. Pretože kryštálová štruktúra FIX je známa, použije sa následne molekulárne modelovanie na spresnenie polohy napr. peptidov odvodených od 198/B1 vo väzbovom mieste 198/B 1 ľudského FIXa.

Na druhej strane, metodická mutačná analýza danej peptidickej sekvencie, ako sú peptidické sekvencie odvodené z CDR3h 198/A1 alebo 198/B1, napríklad „alanínová skenovacia mutačná analýza“, umožňuje identifikáciu peptidických zvyškov kritických pre prokoagulačnú aktivitu. Inou možnosťou zlepšenia aktivity určitej peptidickej sekvence je použitie peptidových knižníc v kombinácii s vysoko priepustným screeningom.

Antigénové väzbové miesto protilátky je odvodené z juxtapozície šiestich „komplement určujúcich regiónov (CDR)“ na N-terminálnom konci diméru VLHL (alebo oblasti Fv). Príspevok jedného regiónu CDR ku špecificite protilátky pre daný antigén sa môže značne líšiť, ale všeobecne sa má za to, že zvláštny vplyv má CDR3 región ťažkého reťazca (CDR3h), tzn. na rozpoznanie antigénu môže byť vysoko dôležitá konkrétna proteínová sekvencia regiónu CDR3h· Uvádza sa, že dĺžka regiónov CDR3h sa značne líši a je v rozmedzí 4 až 25 aminokyselín (Borreback, str. 16).

Ďalej je uvedený príklad metodickej mutačnej analýzy peptidických sekvencií. Na zlepšenie rozpustnosti/prokoagulačnej účinnosti peptidov odvodených z CD3 regiónu anti-FIX/FIXa protilátok boli zmenené ako Nterminálne, tak C-terminálne aminokyselinové sekvencie. Okrem toho bol konštruovaný a analyzovaný rad mutovaných peptidov.

Princíp tejto štúdie je dokumentovaný na rade peptidov odvodených z regiónu CDR3h protilátok 198/A1 a 198/B1. Pôvodný peptid Al (viď tabuľka 2) je odvodený z regiónu CDR3h protilátky 198/A1 a peptid Bl je odvodený z regiónu CDR3h protilátky 198/B1 (viď príklad 10, obr. 16 a 17). Označenie „pomiešaná verzia“ znamená, že peptid má rovnaké aminokyseliny, ale v náhodnom poradí.

peptid	sekvencia	amino- kyseliny	MW (D)	pi	poznámka
Al	EGGGYYVNWYFDV (SEQ ID NO 9)	(13 aa)	1569	7,2	znížená rozpustnosť
Al/1	VYGFGWGYEVNDY (SEQ ID NO 10)	(13 aa)	1569	7,1	pomiešaná verzia Al
Al/2	EEEEGGGYYVNWYFDEEE (SEQ ID NO 11)	(18 aa)	2244	5,8	kyslé pl, rozpustný
Al/3	RRREGGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 12)	(18 aa)	2407	9,9	zásadité pl, rozpustný
Al/4	EYGEGYGEVNEYDEFEWE (SEQ ID NO 13)	(18 aa)	2244	5,8	pomiešaná verzia Al/2
Al/5	VRYRNRYRWGYRGRFGDE (SEQ ID NO 14)	(18 aa)	2407	9,9	pomiešaná verzia Al/3
Al/3- scr3	RRRGEYGVYWNGDFYRRR (SEQ ID NO 15)	(18· aa)	2407	9,9	pomiešaná verzia Al/3
Al/3- Rd	RdRdRdEGGGYYVNWYFDRdRdRd (SEQ ID NO 16)	(18 aa)	2407	9,9	peptid Al/3, ale L-Arg nahradený D-Arg
Al/83 -Rd- srmb	RdRdRdGEYGVYWNGDFYRdRdRd (SEQ ID NO 17)	(18 aa)	2407	9,9	pomiešaná verzia Al/3Rd

Tabuľka 2. Zoznam radu peptidov odvodených od protilátky 198/A1. Je uvedená dĺžka peptidu (aa, počet aminokyselín), vypočítaná molekulová hmotnosť (MW, v daltonoch (D)) a štatistický izoelektrický bod (pl); D-Arg sa skracuje ako Rd.

V prvej sérii experimentov sme zlepšili rozpustnosť pôvodnej peptidickej sekvencie CDR3_H (Al; EGGGYYVNWYFDV) odstránením C-terminálneho zvyšku Val a pridaním niekoľkých zvyškov s nábojom na N- i C-terminálny koniec peptidu. Vzniknuté peptidy Al/2 (kyslý pl), Al/3 (bázický pl) a ich pomiešané verzie Al/4, Al/5 a Al/3scr3 boli ľahko rozpustné v rôznych tlmivých systémoch pri fyziologickom pH.

Za účelom analýzy aktivity typu FVIII (aktivácia FIXa) u týchto peptidov bol vyvinutý testovací systém, založený na komerčne dostupnom FVIII teste (viď príklady 2 a 4). Základným princípom je, že bez kofaktoru má FIXa veľmi obmedzenú aktivitu voči svojmu prirodzenému substrátu FX. Len v prítomnosti látky s aktivačnými vlastnosťami FIXa, t. j. FVIII alebo látky vykazujúcej aktivitu typu FVIII, je produkované podstatné množstvo FXa štiepením FX cez komplex FIXa/aktivátor. Množstvo vznikajúceho FXa sa monitoruje na základe štiepenia chromogénneho substrátu. Princíp revidovaného chromogénneho testuje opísaný pre dva reprezentatívne peptidy: Al/3 a Al/5 (tabuľka 2). Stručne povedané boli alikvotné časti 25 μΐ zásobného roztoku peptidu (v imidazolovom pufre (IZ); 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,2) prenesené do jamiek mikrotitračnej platne a ohriate na 37 °C. Chromogénny substrát FXa (S-2222), syntetický inhibítor trombínu (1-2581), hovädzí FIXa a hovädzí FX boli rekonštituované v sterilnej vode a FIXa/FX boli zmiešané s fosfolipidom podľa pokynov dodávateľa. Pretože peptidy nereagujú s hovädzím FIXa (ktorý sa v skúšobnom kite vyskytuje ako zmes s hovädzím FX), bolo pridaných 2,9 nM (vo väčšine prípadov 2,3 nM) ľudského FIXa (ERL) (viď príklad 11, obr. 19). Na každú reakciu bolo 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX spojených s 25 μΐ CaCl₂ (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibítor. Na zahájenie reakcie bolo k roztoku peptidu v mikrotitračnej platni pridaných 125 μΐ tohto premixu a inkubovaných pri 37 °C. V rôznych časoch (5 min až 2 h) bola zistená absorbancia vzoriek pri 405 nm a 490 nm proti prázdnemu činidlu s použitím Čítača mikrotitračných platní Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím Software GENESIS™. Výsledky tohto experimentu sú znázornené v príklade 11 a na obr. 18. Peptid Al/3 v prítomnosti 2,9 nM ľudského FIXa vyvolával ľahko merateľnú tvorbu FXa, zatiaľ čo pomiešaná verzia Al/5 bola inaktívna. Navyše pri testovaní za porovnateľných podmienok neposkytol významnú chromogénnu aktivitu ani kyslý peptid Al/2 ani pomiešané verzie Al/4 a Al/3-scr-3 (údaje neznázornené). Za účelom demonštrácie, že peptid Al/3 ako základná protilátka 198/A1 nereaguje s hovädzím FIXa a FX, bol uskutočnený experiment znázornený na obr. 19. Peptid Al/3 bol inkubovaný vyššie opísaným spôsobom s (Al/3 (24 μΜ), +hFIXa) a bez (Al/3 (24 μΜ), bez hFIXa), 2,3 nM ľudského FIXa (hFIXa). V kontrolnom zariadení sme k reakčnej zmesi pridali prázdny riediaci pufer (IZ), doplnený 2,3 nM hFIXa. Ako je znázornené na obr. 19, reakcia prebieha len v prítomnosti ľudského FIXa.

Obr. 18 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII peptidu Al/3 v prítomnosti 2,9 nM ľudského FIXa (hFIXa). Pomiešaná verzia peptidu Al/3, peptid Al/5, nevyvoláva tvorbu FXa. Obr. 19 demonštruje závislosť chromogénnej aktivity typu FVIII peptidu Al/3 od prítomnosti ľudského FIXa (hFIXa). V neprítomnosti ľudského FIXa peptid Al/3 nevyvoláva tvorbu FXa. Kontrola, prázdny imidazolový pufer, je označená IZ.

Peptidy boli analyzované taktiež na schopnosť skracovať dobu zrážania u plazmy s deficitom FVIII. Jednostupňový zrážací test na báze aPTT bol uskutočňovaný v podstate tak, ako je opísané (viď príklad 6). Zrážacie časy (doba od zahájenia reakcie do vytvorenia „zrazeniny“) boli porovnávané buď proti FVIII, kontrolnému pufru (IZ) alebo kontrolnému peptidu (pomiešaná verzia). Výsledky dvoch typických zrážacích experimentov, uskutočňovaných s dvomi rôznymi činidlami aPTT (DAPTTIN a Pathromtin SL) sú uvedené v tabuľkách 3A a 3B.

exp. 1	kone. peptidu	bez FIXa (s)	bez FIXa (s)	priemer (s)	2,2 nM FIXa (s)	2,2 nM FIXa (s)	priemer (s)
IZ	0	107,7	106,8	107	93,1	94,5	94
Al/3	15 μΜ	78,2	77,1	78	59,3	59,9	60
	12,5 μΜ	80,2	80,6	80	60,2	58,9	60
	7,5 μΜ	97,8	97,9	98	73,1	72,7	73
	2,5 μΜ	105,2	104,8	105	91,1	91	91
Al/3- scr3	15 μΜ	122,5	122	122	106,1	105,5	106
	12,5 μΜ	116	117,6	117	103,1	104,5	104
	7,5 μΜ	114,2	113,9	114	100,8	100,6	101
	2,5 μΜ	107,8	107,4	108	96,3	95,2	96
exp. 2	kone. peptidu	bez FIXa (s)	bez FIXa (s)	priemer (s)	2,2 nM FIXa (s)	2,2 nM FIXa (s)	priemer (s)
IZ	0	111	109,7	110	94,7	95,5	95
Al/3	12,5 μΜ	83,6	85,5	85	56,7	56,7	57
	10 μΜ	79,1	78,5	79	63,1	62,5	63
	7,5 μΜ	100,1	100,5	100	71,6	73,9	73
	5 μΜ	103,4	104,8	104	77	76	77
	2,5 μΜ	110,1	108,9	110	. 88	88,8	88
	1,25 μΜ	108,7	109,3	109	90,7	90,8	91

Tabuľka 3A. Zrážacia aktivita peptidov Al/3 a Al/3-scr (pomiešaná verzia Al/3) v plazme s deficitom FVIII buď v prítomnosti alebo v neprítomnosti („bez“) 2,2 nM ľudského FIXa. Sú uvedené dva nezávislé reprezentatívne experimenty (exp. 1 a exp. 2). Všetky zrážacie experimenty boli uskutočnené dvojmo. Sú uvedené zrážacie časy pre jednotlivé experimenty a priemerné zrážacie časy v sekundách (s). Experimenty uvedené v tabuľke 3A boli uskutočnené s použitím aPTT činidla DAPTTIN (Baxter Hyland Immuno). V porovnaní s pufrom ako kontrolou (IZ, imidazolový pufer) vyvolával peptid Al/3 spôsobom závislým od dávky skrátenie zrážacieho času. Skrátenie zrážacieho času sa značne zvýraznilo prídavkom 2,2 nM aktivovaného ľudského FIX do reakčnej zmesi. Pomiešaná verzia peptidu Al/3, Al/3-scr-3, nevykazovala skrátenie zrážacieho času. V koncentrácii na 2,5 μΜ sa pomiešaný peptid stal inhibičným a vlastne zrážací čas predlžoval. Peptidy Al/1, Al/2, Al/4 a Al/5 neposkytli žiadne skrátenie zrážacieho času, čo ukazuje, že nemajú prokoagulačnú aktivitu (údaje neznázornené).

	konečná kone.	bez FIXa (s)	bez FIXa (s)	priemer (s)	2,2 nM FIXa (s)	2,2 nM FIXa (s)	priemer (s)
IZ	0	131,8	132,1	132	107,9	108,7	108
FVII I	12,5 mU/ml	68,9	69	69	52,9	53,6	53
	6,25 mU/ml	77,8	77,9	78	58,6	58,9	59
Al/ 3	15 μΜ	152,8	149,3	151	75,4	75,2	75
	10 μΜ	135,7	134,6	135	76,2	79,8	78
	5 μΜ	152,6	155,6	154	86,6	90,2	88
	1 μΜ	138,3	138,8	139	103,7	105,9	105

Tabuľka 3B. Zrážacia aktivita peptidu Al/3 v plazme s deficitom FVIII, kedy sa ako činidlo aPTT použije Patromtín SL (DADE Behring). Zrážacie experimenty boli uskutočnené dvojmo, buď v prítomnosti alebo v neprítomnosti („bez“) 2,2 nM ľudského FIXa. Sú uvedené zrážacie časy pre jednotlivé experimenty a priemerné zrážacie časy v sekundách (s). Ako pozitívna, resp. negatívna kontrola bol použitý faktor VIII, resp. imidazolový pufer (IZ).

V kontraste k experimentom uvedeným v tabuľke 3A boli experimenty uvedené v tabuľke 3B uskutočnené s použitím aPTT činidla Patromtín SL. V prítomnosti FIXa vyvolával peptid Al/3 spôsobom závislým od dávky skrátenie zrážacieho času, zatiaľ čo v neprítomnosti FIXa nebolo skrátenie zrážacieho času detegovateľné.

V ďalšej sérii experimentov sme vytýčili zlepšenie stability peptidu Al/3 v plazme (napríklad ochranu pred proteolytickou degradáciou). Jeden prístup spočíval v náhrade N- a C-terminálnych L-Arg zvyškov zvyškami D-Arg (reprezentované peptidy Al/3-rd a Al/3-Rd-srmb). Peptidy Al/3-rd a Al/3-Rdsrmb (pomiešaná verzia peptidu) potom boli podrobené analýze chromogénnym testom a zrážacím testom na báze aPTT. Tieto experimenty ukázali, že výmena koncových zvyškov L-Arg za zvyšky R-Arg nemení aktivitu typu FVIII, merané chromogénnym testem, čo ukazuje, že chiralita zvyškov Arg nehraje v chromogénnej aktivite významnú úlohu (obr. 20). Navyše jednostupňová zrážacia aktivita na báze aPTT, aj keď bola trochu znížená, zostala detegovateľná (tabuľka 4).

	kone. peptidu	bez FIXa (s)	bez FIXa (s)	priemer (s)	2,2 nM FIXa (s)	2,2 nM FIXa (s)	priemer (s)
IZ	0	110	109,1	110	96	96	96
Al/3	15 pM	77,8	78	78	56,1	55,5	56
	12,5 pM	99,4	100,5	100	65	68	67
	10 pM	104,4	104,5	104	72	73,2	73
	7,5 pM	105,2	105,2	105	80,7	80,5	81
	5 pM	108,4	107,7	108	89,7	88,3	89
	2,5 pM	107,9	107,6	108	93,6	93,3	93
	1,25 pM	106,7	107	107	94,4	95	95
Al/3-Rd	15 pM	96,4	95,4	96	76,1	74,4	75
	12,5 pM	98	98,6	98	72,3	73,7	73
	10 pM	93,5	95,8	95	74,2	77,2	76
	7,5 pM	97,6	98,1	98	80,9	82,2	82
	5 pM	99,2	99,1	99	86	85,1	86
	2,5 pM	102,7	103,4	103	94,4	94,7	95
	1,25 pM	107,5	17,7	108	96,6	96	96
Al/3-Rd- srmb	15 pM	121,9	121,3	122	112,7	112,4	113
	12,5 pM	117,2	118	118	108,1	107,8	108
	10 pM	115,8	115,3	116	107,2	107,8	108
	7,5 pM	114,666	113,6	114	107,6	106,6	107
	5 pM	113,1	112,4	113	108,5	108,2	108
	2,5 pM	111,9	111,9	112	105	104,2	105
	1,25 pM	107,2	107,1	107	101,1	105,3	103

Tabuľka 4. Jednostupňová zrážacia aktivita peptidov Al/3, Al/3-Rd a Al/3-Rdsrmb (sekvencie viď tabuľka 2). IZ - pufer ako kontrola.

Obr. 20 demonštruje nezmenenú chromogénnu aktivitu peptidu A 1/3-Rd. Peptidy v konečnej koncentrácii 12 μΜ alebo pufer ako kontrola (IZ) boli

I inkubované v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa (+). Bolo zistené, že chromogénna aktivita peptidu Al/3 a Al/3-Rd je v podstate nezmenená a poskytuje v chromogénnom teste takmer identické výsledky. Pomiešaná verzia peptidu Al/3, Al/5 rovnako ako pufer nevyvolávali významnú tvorbu FXa.

V ďalšej sérii experimentov sme vytýčili stanovenie individuálnej úlohy jednotlivých aminokyselín sekvencie peptidového jadra náhradou každého zvyšku aminokyselinou alanínom (tabuľka 5).

peptid	sekvencia	počet aminokyselín	MW (D)	pi	poznámka
Al/3	RRREGGGYYVNWYFDRRR (SEQ IDNO 18)	(18 aa)	2407	9,9	zásaditý pi, rozpustný
Al/3-13	RRRAGGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 19)	(18 aa)	2349	10,4	Ei-Ai
Al/3-1	RRREAGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 20)	(18 aa)	2421	9,9	g2-a2
Al/3-2	RRREGAGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 21)	(18 aa)	2421	9,9	G3-A3
Al/3-3	RRREGGAYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 22)	(18 aa)	2421	9,8	G4-A4
Al/3-4	RRREGGGAYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 23)	(18 aa)	2315	9,9	y5-a5
Al/3-5	RRREGGGYAVNWYFDRRR (SEQ ID NO 24)	(18 aa)	2315	9,9	y6-a6
Al/3-6	RRREGGGYYANWYFDRRR (SEQ ID NO 25)	(18 aa)	2379	9,9	v7-a7
Al/3-7	RRREGGGYYVAWYFDRRR (SEQ ID NO 26)	(18 aa)	2364	9,9	Ng-Ag
Al/3-8	RRREGGGYYVNAYFDRRR (SEQ ID NO 27)	(18 aa)	2292	9,9	W9-A9
Al/3-9	RRREGGGYYVNWAFDRRR (SEQ IDNO 28)	(18 aa)	2315	9,9	Yio-Aio
Al/3-10	RRREGGGYYVNWYADRRR (SEQ ID NO 29)	(18 aa)	2331	9,9	Fii-An
Al/3-11	RRREGGGYYVNWYFARRR	(18 aa)	2363	10,5	D12-A12

	(SEQ ID NO 30)
Al/3- 12srmb	RRRYVYNGWGYFEGARRR (SEQ IDNO31)	(18 aa)	2363	10,4	pomiešaná verzia

Tabuľka 5. Sú uvedené peptidy určené na osvetlenie úlohy jednotlivých aminokyselín v sekvencii peptidového jadra (EiG2G3G₄Y₅Y₆V7N8W9Y|₀FiiDi₂). Číselné indexy označujú polohu aminokyseliny v peptide. Každá z aminokyselín bola postupne nahradena alanínom, malou aminokyselinou bez náboja („alanine scan“). Sú uvedené taktiež dĺžky peptidov (počet aminokyselín), vypočítaná molekulová hmotnosť (MW, v daltonoch (D)) a štatistický izoelektrický bod (pi).

Každý z peptidov bol jednotlivo rozpustený v imidazolovom pufre (50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,2) a následne zriedený zrážacím pufrom (50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, 1 % ľudského albumínu, pH 7,4) na požadovanú konečnú koncentráciu. Peptidy boli analyzované na chromogénnu aktivitu a takisto na schopnosť znižovať zrážací čas v plazme s deficitom FVIII. Jednostupňový zrážací test bol uskutočňovaný v podstate vyššie opísaným spôsobom (viď príklad 6). Zrážacie časy (doba od zahájenia reakcie do vytvorenia „zrazeniny“) boli porovnávané buď proti pufru ako kontrole alebo proti kontrolnému peptidu (pomiešaná verzia). Niektoré z výsledkov „alanínového skenovania“ sú uvedené pre peptidy Al/3-2 a Al/3-3. Zámena G3-A3, ako je uvedená pre peptid Al/3-2, poskytuje v prítomnosti 2,2 nM ľudského FIXa vysokú chromogénnu aktivitu a silné zníženie jednostupňového zrážacieho času (34 s pri koncentrácii 12,5 μΜ). Peptid Al/3-3 (G₄-A₄) vykazuje optimum chromogénnej aktivity okolo konečnej koncentrácie 12 μΜ so zníženou aktivitou pri vyššej alebo nižšej koncentrácii. Tento peptid je v jednostupňovom zrážacom teste trochu inhibičný v neprítomnosti FIXa pri vyšších koncentráciách (12,5 μΜ), ale v prítomnosti 2,2 nM FIXa sa stáva silne aktívnym (31 s, 12,5 μΜ).

V ďalšej sérii experimentov sme vytýčili stanovenie individuálnej úlohy jednotlivých aminokyselín sekvencie peptidového jádra náhradou každého zvyšku glutamovou kyselinou ako aminokyselinou (viď tabuľka 6).

peptid	sekvencia	počet aminokyselín	MW (D)	pi	poznámka
Al/3	RRREGGGYYVNWYFDRRR	(18 aa)	2407	9,9	zásaditý pi, rozpustný
Al/3-22	RRREEGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 32)	(18 aa)	2479	9,5	g2-e2
Al/3-23	RRREGEGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 33)	(18 aa)	2479	9,5	g3-e3
Al/3-24	RRREGGEYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 34)	(18 aa)	2479	9,5	G4-E4
A1/3-26	RRREGGGEYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 35)	(18 aa)	2373	9,4	Y5-E5
Al/3-27	RRREGGGYEVNWYFDRRR (SEQ ID NO 36)	(18 aa)	2373	9,4	y6-e6
A1/3-28	RRREGGGYYENWYFDRRR (SEQ ID NO 37)	(18 aa)	2437	9,5	V7-E7
A1/3-29	RRREGGGYYVEWYFDRRR (SEQ ID NO 38)	(18 aa)	2422	9,5	Ng-Ee
Al/3-30	RRREGGGYYVNEYFDRRR (SEQ ID NO 39)	(18 aa)	2350	9,5	W9-E9
Al/3-31	RRREGGGYYVNWEFDRRR (SEQ ID NO 40)	(18 aa)	2373	9,4	Y10-E10
Al/3-32	RRREGGGYYVNWYEDRRR (SEQ IDNO41)	(18 aa)	2389	9,5	F| 1-E11
Al/3-33	RRREGGGYYVNWYFERRR (SEQ ID NO 42)	(18 aa)	2421	9,9	D12-E12
Al/3- 34srmb	RRRGEYGEYWNGDFYRRR (SEQ ID NO 43)	(18 aa)	2437	9,5	pomiešaná verzia

Tabuľka 6. Sú uvedené peptidy určené na osvetlenie úlohy jednotlivých aminokyselín v sekvencií peptidového jadra (E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12). Číselné indexy označujú polohu aminokyseliny v peptide. Každá z aminokyselín bola postupne nahradená kyselinou glutamovou, záporne nabitou veľkou aminokyselinou („glutamic acid scan“). Sú uvedené taktiež dĺžky peptidov (počet aminokyselín), vypočítaná molekulová hmotnosť (MW, v daltonoch (D)) a štatistický izoelektrický bod (pi).

Každý z peptidov bol jednotlivo rozpustený v imidazolovom pufre (50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,2) a následne zriedený zrážacím pufrom (50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, 1 % ľudského albumínu, pH 7,4) na požadovanú konečnú koncentráciu. Peptidy získané pomocou „glutamic acid scan“ boli analyzované na chromogénnu aktivitu typu FVIII a taktiež na schopnosť znižovať zrážací čas v plazme s deficitom FVIII. Jednostupňový zrážací test bol uskutočňovaný v podstate vyššie opísaným spôsobom (viď príklad 6).

Peptid Al/3-24 vykazoval niektoré zaujímavé vlastnosti. Molekula vykazovala v koncentráciách medzi 6,5 μΜ a 12 μΜ vysokú chromogénnu aktivitu typu FVIII, ale pri vyšších koncentráciách (až do 24 μΜ) aktivitu strácala. V neprítomnosti ľudského FIXa nemal tento peptid žiadnu prokoagulačnú aktivitu, ale v prítomnosti 2, 2 nM hFIXa bol silne aktívny.

V druhej sérii experimentov sme vytýčili zlepšenie prokoagulačnej aktivity peptidickej sekvencie Bl, odvodenej z CDR3H protilátky 198/B1. V prvom stupni sme zlepšili rozpustnosť pôvodnej peptidickej sekvencie (Bl; EGGGFTVNWYFDV) odstránením C-terminálneho zvyšku Val a pridaním niekoľkých nabitých zvyškov na N- i C-terminálny koniec peptidu. Vzniknuté peptidy Bl/4, Bl/6 (kyslý pl), Bl/7 (bázický pl) a ich pomiešané verzie Bl/5, Bl/7scr3 sú pri fyziologickom pH ľahko rozpustné v rôznych tlmivých systémoch.

peptid	sekvencia	počet aminokyselín	MW (θ)	Pl	poznámka
Bl	EGGGFTVNWYFDV (SEQ ID NO 44)	(13 aa)	1491	6,0	znížená rozpustnosť
Bl/4	REGGGFTVNWYFDR (SEQ ID NO 45)	(14 aa)	1704	7,9	rozpustný
Bl/5	FGVGYRGETRNFDW (SEQ ID NO 46)	(14 aa)	1704	8,0	pomiešaná verzia, rozpustný
Bl/6	EEEEGGGFTVNWYFDEEE (SEQ ID NO 47)	(18 aa)	2166	5,0	kyslý pl, rozpustný
Bl/7	RRREGGGFTVNWYFDRRR (SEQ ID NO 48)	(18 aa)	2329	9,9	zásaditý pl, rozpustný
Bl/7scr3	RRRFGVGYGETNFDWRRR (SEQ ID NO 49)	(18 aa)	2329	9,9	zásaditý pl, rozpustný, pomiešaná verzia

Tabuľka 7 predstavuje zoznam radu peptidov odvodených od protilátky 198/B1. Sú uvedené taktiež dĺžky peptidov (počet aminokyselín, aa), vypočítaná molekulová hmotnosť (MW, v daltonoch (D)) a štatistický izoelektrický bod (pl).

Peptidy Bl/4 a Bl/5 boli rozpustné v 50 mM Tris, 100 mM NaCI, pH = 6,5. Oba peptidy boli analyzované chromogénnym testom FVIII. Bola zistená určitá chromogénna aktivita u peptidú Bl/4, ale nie u pomiešanej verzie Bl/5 (údaje neznázornené).

Potom boli analyzované peptidy Bl/6, Bl/7 a Bl/7scr3. Každý peptid bol individuálne rozpustený v 50 mM imidazolu, 100 mM NaCI, pH 7,2, a potom riedený buď v zrážacom pufre (50 mM imidazolu, 100 mM NaCI, 1 % ľudského albumínu, pH 7,4) alebo v imidazolovom pufre na požadovanú konečnú koncentráciu. Peptidy boli analyzované na chromogénnu aktivitu a na schopnosť znižovať zrážací čas v plazme s deficitom FVIII (tabuľka 8 a 9). Jednostupňový zrážací test bol uskutočnený v podstate vyššie opísaným spôsobom (viď príklad 6). Zrážacie časy (doba od zahájenia reakcie do vytvorenia „zrazeniny“) boli porovnávané buď proti pufru ako kontrole alebo proti kontrolnému peptidú (pomiešaná verzia).

Aktivita aktivujúca FIXa (aktivita typu kofaktoru FVIII) z peptidu B1/7 bola vo vyššie opísanom chromogénnom teste nameraná prvý krát.

Ako je zobrazené na obr. 21, prídavok 2,4 μΜ peptidu Bl/7 k reakčnej zmesi viedol k dobre merateľnej tvorbe FXa. Naproti tomu prídavok 35 μΜ Pefabloc Xa, špecifického inhibítora proteázovej aktivity FXa, viedol k významnému zníženiu štiepenej reakcie chromogénneho substrátu (obr. 22), čo demonštruje, že skutočne dochádza k tvorbe FXa, sprostredkovanej peptidomFlXa. Pokiaľ sa k reakčnej zmesi nepridal ani FIXa ani FX, syntéza FXa neprebiehala (obr. 22). Peptid Bl/6 ani kontrolné peptidy Bl/5 a Bl/7scr3 nevykazovali žiadnu aktivitu (údaje neznázornené).

Obr. 21 demonštruje chromogénnu aktivitu peptidu Bl/7. Peptid v konečnej koncentrácii 2,4 μΜ alebo pufer ako kontrola (IZ) bol inkubovaný v prítomnosti

2,3 nM ľudského FIXa.

Na obr. 22 bol peptid Bl/7 v konečnej koncentrácii 2,4 μΜ alebo pufer ako kontrola (IZ) inkubovaný v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa (označené buď „+2,3 nM hFIXa“ alebo „+“). Bolo zistené, že chromogénna aktivita peptidu Bl/7 je závislá od prítomnosti FIXa a FX, pretože nie je detegovateľná žiadna reakcia, ak sa FIXa a FX z reakčnej zmesi vynechajú (w/o FIXa/FX). Na potvrdenie, že peptid Bl/7 skutočne sprostredkuje tvorbu FXa bol do reakčnej zmesi pridaný FXa špecifický proteázový inhibítor Pefabloc Xa (35 μΜ Pefabloc Xa). V druhej sade experimentov bol testovaný prokoagulačný efekt peptidov Bl/6, B 1/7 a Bl/7scr3 v jednostupňovom zrážacom teste na báze aPTT. Experimenty boli uskutočňované v podstate spôsobom opísaným v príklade 6. Výsledky sú znázornené v tabuľkách 8 a 9.

peptid	12,5 μΜ (-)	1,25 μΜ (-)	0,125 μΜ (-)	12,5 nM (-)	pufer (-)	poznámka
Bl/6	115	110	111	111	110
Bl/7	157	112	109	110	110
Bl/7scr3	115	105	106	105	107

Tabuľka 8. Plazma s deficitom FVIII bola inkubovaná jednotlivo s peptidom Bl/6, Bl/7scr3 alebo Bl/7 v neprítomnosti aktivovaného ľudského FIX. Ako negatívna kontrola bol k deficitnej plazme pridaný prázdny pufer. Sú uvedené zrážacie časy pre jednotlivé kombinácie. Za týchto podmienok sa peptid Bl/7 vo svojej najvyššej koncentrácii (12,5 μΜ) stáva inhibičným voči procesu zrážania, ako ukazuje predĺžený zrážací čas 157 sekúnd.

peptid	12,5 μΜ (+)	1,25 μΜ (+)	0,125 μΜ (+)	12,5 nM (+)	pufr (+)	poznámka
Bl/6	103	100	101	100	100
Bl/7	83	92	99	99	100
Bl/7scr3	102	94	94	94	94

Tabuľka 9. Plazma s deficitom FVIII bola inkubovaná jednotlivo s peptidom Bl/6, Bl/7scr3 alebo Bl/7 v neprítomnosti aktivovaného ľudského FIX. Ako negatívna kontrola bol k deficitnej plazme pridaný prázdny pufer. Sú uvedené zrážacie časy pre jednotlivé kombinácie. V prítomnosti FIXa sa peptid Bl/7 stáva prokoagulačným, ako ukazuje znížený zrážací čas (83 sekúnd v porovnaní so 102 sekundami pre pomiešaný peptid a 100 sekundami pre kontrolný pufer).

Príklad 12: Prokoagulačná aktivita derivátov peptidov odvodených z CDR.3 regiónov anti-FIX/FIXa protilátok v plazme s inhibítorom FVIII

Na skúmanie prokoagulačnej aktivity peptidu Al/3 v plazme s inhibítorom

FVIII bol uskutočnený nasledujúci experiment. Vykonali sme štandardný jednostupňový zrážací test na báze aPTT, ale namiesto plazmy s deficitom FVIII sme použili plazmu s inhibítorom FVIII. Inhibičná schopnosť plazmy bola 8,1 jednotiek Bethesda na ml.

	kone. peptidu	bez FIXa (s)	bez FIXa (s)	priemer (s)	FIXa (s)	FIXa (s)	priemer (s)
IZ	0	104,8	103,6	104	94,2	94,1	94
Al/ 3	12,5 μΜ	85,8	85,3	86	61	60,2	61
	ΙΟμΜ	88,4	87,9	88	61,3	61,8	62
	7,5 μΜ	93,7	92,7	93	68,8	70,9	70
	5 μΜ	101,5	101,1	101	81	82	82
	2,5 μΜ	106,1	105,3	106	90,2	90,5	90
	1,25 μΜ	104,5	104,3	104	91,3	91,4	91

Tabulka 10: K plazme s inhibítorom FVIII boli (buď v prítomnosti 2,2 nM FIXa „FIXa“ - alebo v neprítomnosti FIXa - „bez FIXa“) pridané rôzne množstvá peptidu Al/3 (12,5 μΜ až 1,25 μΜ). Ako negatívna kontrola bol k plazme pridaný prázdný pufer (IZ). Experimenty boli vykonávané dvojmo a bol vypočítaný priemer. Sú uvedené zrážacie časy (v sekundách) jednotlivých kombinácií. Je zrejmé, že peptid Al/3 skracuje (spôsobom závislým od dávky) zrážací čas plazmy s inhibítorom FVIII v prítomnosti FIXa, ale, aj keď v omnoho menšom rozsahu, tiež v neprítomnosti FIXa.

Príklad 13: Konverzia 196/C4 IgM na IgGl

Pretože niektoré protilátky IgM vykazujú v chromogénnych testoch vysokú aktivitu typu FVIII, boli činené pokusy tieto IgM protilátky previesť na IgG protilátky (i keď môžu vznikať i deriváty protilátok, ako je Fab, F(ab)₂, scFv atď.) Ďalej je podrobne popísané získanie génov variabilného regiónu IgM. Najprv bol opakovaným klonovaním konštruovaný vektor pBax-IgGl (obr. 23) z vektora pSI (Promega) a pEF/Bsd (Invitrogen). Z krvi darcu sa čistia Blymfocyty, z týchto buniek sa čistí maturovaná mRNA s použitím „micro-mRNA purification kit“ (Pharmacia). S použitím špecifických primérov sa pomocou „you-primefirst-strand-cDNA kit“ (Pharmacia) pripraví cDNA ľudského kappa reťazca a ľudského gamma 1 reťazca.

Kódujúca sekvencia konštantnej domény ľudského ľahkého kappa reťazca sa z cDNA amplifikuje pomocou PCR s použitím špecifických primérov.

Gén konštantného regiónu ľudského gamma 1 reťazca (CH1-hinge-CH2CH3) sa amplifikuje z cDNA pomocou PCR s použitím špecifických primérov.

PCR produkt konštantnej domény ľahkého reťazca sa digeruje s Xbal a NheI a vloží sa do digerovaného pSI. Vzniknutý vektor sa štiepi pomocou EcoRI a Xbal a vloží sa tepelne hybridizované oligonukleotidy za vzniku vektora pSICkappa. Tepelne hybridizované oligonukleotidy poskytujú vedúce a Sacl-Xbal miesta na vloženie variabilného regiónu kappa reťazca. PCR produkt konštantného regiónu ľudského gamma 1 reťazca sa digeruje s Spel a BamHI a vloží do digerovaného pSI. Vzniknutý vektor sa štiepi pomocou Spel a Nôti a vložia sa tepelne hybridizované oligonukleotidy za vzniku vektora pSI-Cgamma. Tepelne hybridizované oligonukleotidy poskytujú vedúce a XhoI-BstEI miesta na vloženie variabilného regiónu ťažkého reťazca. Vektor pEF/Bad sa digeruje s NheI a Sfil, zarovná Klenowom a vloží sa celá expresná kazeta pSI-Ckappa, vystrihnutá pomocou BglII a BamHI (po ošetrení Klenowom). Vzniknutý vektor sa digeruje s EcoRI a HindlII a ošetrí Klenowom. Pomocou BglII a BamHI sa vystrihne celá expresná kazeta pSI-Cgamma a vloží sa (po ošetrení Klenowom). Vzniknutý vektor sa označuje pBax-IgGl.

Medzi miesta Sacl-Xbal je možné vložiť variabilný región ľahkého reťazca za vzniku kompletnej kódujúcej sekvencie ľahkého kappa reťazca. Medzi miesta XhoI-BstEI môže byť klonovaný variabilný región ťažkého reťazca za vzniku kompletného génu ťažkého reťazca IgGl. Oba otvorené čítacie rámce sú exprimované pod kontrolou promótora SV40 a na 5‘ konci génov obsahujú kódujúcu sekvenciu signálneho peptidu pre sekréciu ťažkého a ľahkého reťazca do endoplazmatického retikula. Transfekcia do buniek COS umožňuje expresiu IgGl s rovnakými väzbovými vlastnosťami ako u pôvodného IgM.

Ďalej sa uskutoční konštrukcia plazmidu pBax-196/C4 amplifikáciou VH 196/C4 scFv (subklonované spôsobom opísaným v príklade 10) pomocou PCR s použitím špecifických primérov. PCR produkt sa digeruje s Xhol a BstEII a vloží do pBax IgGl, digerovaného s Xhol a BstEII. VL 196/C4 sa amplifikuje pomocou PCR s použitím špecifických primérov. PCR produkt sa digeruje s Sací a Xbal a vloží do pBax IgGl-VH, digerovaného s Sací a Xbal. Vzniknutý vektor (pBax-196/C4) sa transfektuje elektroporáciou do buniek COS a exprimujú sa hybridné molekuly IgGl (myšací variabilný región a ľudský konštantný región) s rovnakou špecifitou ako u pôvodného IgM.

Príklad 14: Aktivácia amidolytickej aktivity FIXa anti-FIXa protilátkami

Stručne povedané bolo 20 μί faktoru IXa (obsahujúceho 200 mU FIXa (Stago)) inkubovaných pri 37 °C s 200 μί reakčného pufru (50 mM TrisHCl pH

7,4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ a 40 % etylénglykolu), 25 μί substrátu FIXa (CH₃SO₂-D-CHG-Gly-Arg-pNA,AcOH, 10 μΜ/ml, Pentapharm LTD) v neprítomnosti alebo prítomnosti rôznych množstiev anti-FIX protilátok 198/B1 (izotyp IgG) alebo 196/AF1 (izotyp IgM). Špecifické štiepenie FIXa substrátu bolo monitorované v čítači ELISA pri 405 nm.

Prítomnosť anti-FIX protilátok zvýšila amidolytickú aktivitu FIXa aspoň dvojnásobne.

Obr. 24 ukazuje zvýšenie amidolytickej aktivity FIXa v prítomnosti protilátky 198/B1 (obr. 24A) a protilátky 198/AF1 (obr. 24B).

Príklad 15: Aktivita typu FVIII vykazovaná fragmentárni Fab odvodenými od anti-FIX/FIXa protilátok

Fab fragmenty anti-FIX/FIXa protilátok boli pripravené a čistené podľa štandardných postupov. Stručne povedané bol 1 ml protilátky 198/A1 (4 mg/ml v 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,4) inkubovaný cez noc pri 37 °C s 87 μί fragmentačného pufru (IM Na acetát, 10 mM EDTA, 67,5 mg/ml L-cysteínu) a 0,25 mg papaínu (imobilizovaného na agarózových guličkách). Preparát bol prefiltrovaný na odstránenie papaínu. Bol pridaný L-histidín (konečná koncentrácia 50 mM) a potom bolo pH upravené na 7,0. Nakoniec bol pridaný pevný NaCl do konečnej koncentrácie 1 M.

Následne bol čistený fragment 198/A1 väzbou na proteín L: Použili sme imobilizovaný proteín L Plus ImmunoPure (Pierce) v kolóne PHARMACIA XK 16/20 (objem gélu: 2 ml). Pufry na chromatografiu boli: 1) ekvilibračný pufe: 50 mM L-histidínu, pH 7,0, 1 M NaCl, 0,1 hm. % NaN₃, 2) premývací pufer: 50 mM L-histidínu, pH 7,0, 0,1 hm. % NaN₃, 3) elučný pufer: 100 mM glycinu, pH 2,5, 0,1 hm. % NaN₃, 4) neutralizačný pufer: 2 M Tris/Cl, pH 8,0.

Chromatografia bola vykonávaná v podstate v stupňoch 1 až 7, uvedených v tabuľce 11. Za účelom neutralizácie nízkeho pH elučného pufru bolo do frakcionačných skúmaviek predložených 0,2 ml Tris, pH 8,0.

	stupeň	Pufer	prietok	objem	CV	frakcia
1.	preoplach kolóny	Elučný	2,0 ml/min	10 ml	5	odpad
2.	ekvilibrácia	Ekvilibračný	2,0 ml/min	10 ml	5	odpad
3.	nástrek vzorky	Vzorkový	1,0 ml/min	x ml	x	prietok
4.	premytie 1	Ekvilibračný	1,0 ml/min	20 ml	10	prietok
5.	premytie 2	Premývací	1,0 ml/min	10 ml	5	prietok
6.	elúcia	Elučný	1,0 ml/min	15 ml	7,5	1,0 ml frakcia
7.	neutralizácia	Premývací	2,0 ml/min	10 ml	5	odpad

Tabulka 11

Konečný preparát 198/A1 Fab bol dialyzovaný proti 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,4 a analyzovaný v chromogénnom teste FVIII vyššie opísaným spôsobom (obr. 25). V porovnaní s intaktnou protilátkou má fragment 198/A1 Fab trochu nižšiu aktivitu; Fab fragment však napriek tomu vyvoláva tvorbu FXa nezávisle od FIX. Obr. 25 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII fragmentu protilátky 198/A1 Fab v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívnu kontrolu sme použili intaktnú protilátku 198/A1 a 7,5 pM FVIII. Ako negatívna kontrola bol použitý pufer (IZ) namiesto 198/A1 Fab fragmentu alebo FVIII.

Príklad 16: Aktivita typu FVIII vykazovaná fúzními proteíny medzi scFv fragmenty anti-FIX/FIXa protilátok a alkalickou fosfatázou E. coli.

Jednoreťazcový fragment Fv (viď príklad 10) protilátky 198/B1 (subklon AB2) bol fúzovaný s N-koncom alkalickej fosfatázy E. coli s použitím vektorového systému pDAP2 (Kerschbaumer a spol., 1996). Boli izolované dva identické klony a označené pDAP2-l98AB2#1 a pDAP2-l98AB2#100 (obr. 26). Vzniknuté fúzne proteíny boli exprimované v E. coli, čistené kovovou afinitnou chromatografiou (Kerschbaumer a spol., 1997) a analyzované štandardným chromogénnym testom (obr. 27).

Obr. 27 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII u dvoch fúznych proteínov scFv fragment protilátky 198/B1 (subklon AB2) - alkalická fosfatáza (198AB2#1 a 198AB2#100) v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívnu kontrolu sme použili 7,5 pM FVIII.

Príklad 17: Aktivita typu FVIII vykazovaná bivalentnou miniprotilátkou.

Na získanie bivalentnej miniprotilátky bol scFv fragment protilátky 198/B1 (subklon AB2) fúzovaný s amfipatickou helikálnou štruktúrou s použitím vektorového systému pZipl (Kerschbaumer a spol., Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997). Stručne povedané bol gén scFv fragmentu 198/B1 izolovaný z plazmidu pDAP-198AB2#100 (príklad 16) digesciou s Sfil a Nôti. Fragment DNA bol gélovo purifikovaný a vložený do vektora pZipl digerovaného s Sfil/Notl. Vzniknutý plazmid bol sekvenovaný a označený pZip-198AB2#102 (obr. 28). Paralelne sme konštruovali verziu miniprotilátky z irelevantnej monoklonálnej protilátky nazvanej #8860. V prvom stupni bol zostavený jednoreťazcový Fv fragment protilátky #8860 vo vektore pDAP2. Klonovanie bolo vykonávané v podstate postupom opísaným v príklade 10. Konštrukt bol označený pDAP2-8860scFv#l 1 (obr. 29). Subklonovaním scFv fragmentu obsiahnutého v pDAP2-8860scFv#l 1 do plazmidu pZipl (viď vyššie) vznikol konštrukt miniprotilátky p8860-Zip#l .2 (obr. 30). Pretože protilátka #8860 nereaguje s FIX/FIXa (ako vyplýva z analýzy Westernovým blottingom a ELISA), predstavuje vhodnú negatívnu kontrolu. Následne boli v E. coli exprimované proteíny miniprotilátky a čistené z bakteriálnych supernatantov väzbou na proteín L týmto postupom: Na afinitnú chromatografiu sme použili imobilizovaný proteín L Plus ImmunoPure (Pierce) v kolónach PHARMACIA XK 16/20 s objemom gélu 4 ml. Použité pufry boli: ekvilibračný pufer: 50 mM L-histidínu, pH 7,0, 1 M NaCl, 0,1 hm. % NaN₃, premývací pufer: 50 mM L-histidínu, pH 7,0, 0,1 hm. % NaN₃, elučný pufer: 100 mM glycínu, pH 2,5, 0,1 hm. % NaN₃ a neutralizačný pufer: 2 M Tris/Cl, pH 8,0.

Vzorky boli pripravené takto: Odstredením bakteriálnej expresnej kultúry (11 000 x g, 4 °C, 10 min) bol získaný supernatant bakteriálnej kultúry, k 1 1 supernatantu bolo pridaných 470 g síranu amónneho a roztok bol 1 h miešaný na ľade na vyzrážanie proteínu. Zrazenina bola 35 min pri 2 °C peletovaná pri 14 000 x g a znovu rozpustená v 100 ml 20 mM Tris, pH 7,0. Koncentrát potom bol dialyzovaný proti 20 mM Tris, pH 7,0, bol pridaný L-histidín do konečnej koncentrácie 50 mM a pH bolo upravené na 7,0. Nakoniec bol pridaný pevný NaCl do konečnej koncentrácie 1 M. Pred nanesením na kolónu bola vzorka najskôr 15 min odstreďovaná pri 16 000 x g pri izbovej teplote a potom prefiltrovaná cez sterilný filter 0,45 pm.

Chromatografia bola vykonávaná v podstate v stupňoch 1 až 7, uvedených v tabuľke 12. Za účelom neutralizácie nízkeho pH elučného pufru bolo do frakcionačných skúmaviek predložených 0,2 ml Tris, pH 8,0.

	stupeň	pufer	Prietok	objem	CV	frakcia
1.	preplacb kolóny	elučný	2,0 ml/min	20 ml	5	odpad
2.	ekvilibrácia	ekvilibračný	2,0 ml/min	20 ml	5	odpad
3.	nástrek vzorky	vzorkový	1,0 ml/min	x ml	x	prietok
4.	premytie 1	ekvilibračný	1,0 ml/min	40 ml	10	prietok
5.	premytie 2	premývací	1,0 ml/min	20 ml	5	prietok
6.	elúcia	elučný	1,0 ml/min	30 ml	7,5	1,0 ml frakcia
7.	neutralizácia	premývací	2,0 ml/min	20 ml	5	odpad

Tabuľka 12. Konečný preparát 198/B1 (subklon AB2) miniprotilátky (označený

198AB-Zip#102) a negatívna kontrola 8860-Zip#1.2 boli dialyzované proti 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,4 a analyzované v chromogénnom teste FVIII vyššie opísaným spôsobom (obr. 31).

Ako je zrejmé z obr. 31, konštrukt miniprotilátky 198AB-Zip# 102 vyvoláva podstatnú tvorbu FXa (porov. s FVIII), zatiaľ čo miniprotilátka 8860-Zip#1.2 ako negatívna kontrola nie.

Obr. 31 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII miniprotilátky 198/B1 (subklon AB2) 198AB-Zip#102 v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívnu kontrolu sme použili 4,8 pM FVIII, zatiaľ čo ako negatívne kontroly slúžili nepríbuzná miniprotilátka (8860-Zip#l.2) a prázdny reakčný pufer (IZ).

Príklad 18: Aktivita typu FVIII vykazovaná scFv fragmentárni anti-FIXa/FIX protilátok

Bol exprimovaný jednoreťazcový Fv fragment protilátky 198/B1 (subklon AB2) a scFv fragment protilátky #8860 s použitím vektorového systému pMycHisó. Vektor pMycHisó (obr. 32 a 33) bol konštruovaný štiepením vektora pCOCK (Engelhardt a spol., 1994, Biotechniques, 17:44-46) pomocou NotI a EcoRI a vložením týchto oligonukleotidov: mychis6-co: 5‘ ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3‘ (SEQ ID NO 79) a mychis-ic: 5‘ aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgag atgagtttttgttctgc 3‘ (SEQID NO 80).

Obr. 32 predstavuje schematické znázornenie plazmidu pMyHisó. Sekvenčný úsek c-myc sa používa na detekciu scFv fragmentu pri analýze ELISA alebo Westernovým blottingom (Evan a spol., Mol. Celí Biol., 1985, 5(12), str. 3610-6). Sekvenčný úsek His6 bol zahrnutý na uľahčenie čistenia scFv fragmentov chromatografiou s kovovými iónami (Hochuli a spol., 1988, Biotechnology, 6:1321-1325). Plazmid obsahuje PelB-vedúcu sekvenciu promotora lacZ génu (PlacZ) (viď legendu k obr. 26), začiatok replikácie E. coli (colElori) a začiatok replikácie fágu M13 (M13ori). Aby umožnil špecifickú selekciu, nesie plazmid tiež gén pre enzým β-laktamázu (AmpR), sprostredkujúci rezistenciu na antibiotikum ampicilín.

Gén 198/B1 (kloň AB2)-scFv bol získaný z plazmidu pDAP2-198AB2#100 (príklad 16) digesciou s Sfil a Nôti a bol vložený do pMycHisó, štiepeného > ₄ pomocou Sfil/Notl. Vzniknutý plazmid bol označený pMycHis-198AB2#102. Obr. 34 znázorňuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu 198AB2 scFv (napojeného na úseky c-myc a His6); vzniknutý otvorený čítací rámec expresného vektora sa nazýva pMycHis6-l98AB2#102. Vektor pMYcHisó bol konštruovaný štiepením vektora pCOCK (Engelhardt O. a spol., BioTechniques 17, 44-46,

1994) Notl-EcoRI a vložením týchto tepelne hybridizovaných oligonukleotidov: 5‘-GGCCGCAGAACAA

AAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCAT CACT AATAAG-3‘ (SEQ ID NO 103) a 5‘TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGT

GCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC-3¹ (SEQ ID NO 104). Výsledný vektor, nazvaný pMycHisó, bol štiepený pomocou Sfil-NotI a do tohto vektora bol prenesený gén scFv 198AB2 z vektora pDAP2-198AB2#100.

Analogicky ke konstruktu 198AB2 bol fragment #8860 scFv klonovaný z plazmidu označeného pDAP2-8860scFv kloň 11. Čistý scFv proteín z #8860 bol označen 8860-M/H#4c (plazmid p8860-M/H#4c, obr. 35). Proteíny scFv boli exprimované v E. coli a afinitne čistené z bakteriálnych supernatantov na kolónach s proteínom L (viď príklad 17). Konečné preparáty MycHisl98AB2#102 a 8860-M/H#4c boli dialyzované proti 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH ,7,4, a analyzované v chromogénnom teste FVIII, ako je vyššie opísané (obr. 36).

Ako je zrejmé z obr. 36, scFv konštrukt MycHis-198AB2#102 vyvolával podstatnú tvorbu FXa, zatiaľ čo negatívne kontroly 8860-M/H#4c a prázdny reakčný pufer nie.

Obr. 36 demonštruje chromogénnu aktivitu typu FVIII u scFv fragmentu 198/B1 (subklon AB2) v prítomnosti 2,3 nM ľudského FIXa. Ako pozitívnu kontrolu sme použili 4,8 pM FVIII, zatiaľ čo nepríbuzný scFv (8860-M/H#4c) a prázdny reakčný pufer (IZ) slúžili ako negatívne kontroly.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protilátka alebo derivát protilátky proti faktoru IX/faktoru IXa, zvyšujúci prokoagulačnú aktivitu FIXa.
2. 2. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 1, kde táto protilátka alebo derivát protilátky zvyšuje prokoagulačnú aktivitu FIXa v prítomnosti inhibítorov FVIII.
3. 3. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 1, kde táto protilátka je vybraná zo skupiny zahrnujúcej protilátky IgG, IgM, IgA a IgE.
4. 4. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 1, kde táto protilátka alebo derivát protilátky sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej monoklonálne protilátky, fragmenty protilátok, chimerické protilátky, humanizované protilátky, jednoreťazcové protilátky, bišpecifické protilátky, „diabodies“ a ich di-, oligo- alebo multiméry.
5. 5. Derivát protilátky podľa nároku 1, kde tento derivát protilátky zahrnuje peptid komplement určujúceho regiónu (CDR).
6. 6. Derivát protilátky podľa nároku 5, kde CDR peptidom je CDR3 peptid.
7. 7. Derivát protilátky podľa nároku 6, kde tento CDR3 peptid zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej:

   Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr;

   Cys-X-X-Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr-X-X-Cys, kde

   X môže byť akákoľvek požadovaná aminokyselina;

   Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr;

   Asp-Gly-Gly-His-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Phe-Asp-Tyr; a

   Phe-Arg-Asn-Arg-Gly-Met-Thr-Ala-Leu-Leu-Lys-Val-Ser-Ser-Cys-Asp.
8. 8. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 1, kde variabilný región tejto protilátky alebo derivátu protilátky zahrnuje aminokyseliny 1 až 357 a/alebo aminokyseliny 403 až 726 podľa obr. 14.
9. 9. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 8, kde táto protilátka alebo derivát protilátky navyše zahrnuje umelú linkerovú sekvenciu.
10. 10. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 1, kde variabilný región tejto protilátky alebo derivátu protilátky zahrnuje aminokyseliny 1 až 363 a/alebo aminokyseliny 409 až 747 podľa obr. 15.
11. 11. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 10, kde táto protilátka alebo derivát protilátky navyše zahrnuje umelú linkerovú sekvenciu.
12. 12. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 1, kde variabilný región tejto protilátky alebo derivátu protilátky zahrnuje aminokyseliny 1 až 366 a/alebo aminokyseliny 412 až 747 podľa obr. 16.
13. 13. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 12, kde táto protilátka alebo derivát protilátky navyše zahrnuje umelú linkerovú sekvenciu.
14. 14. Hybridómová bunková línia, exprimujúca protilátku alebo derivát protilátky proti faktoru IX/faktoru IXa podľa nároku 1.
15. 15. Hybridómová bunková línia podľa nároku 14, kde táto bunková línia je vybraná zo skupiny zahrnujúcej #196/AF1, #196/AF2, #193/AD3, #193/K21, #198/AC1/1, #198/AM1, #198/A1, #198/B1, #198/AP1, 198/A1, 198/BI, 198/BB1, 198/A1, 198/BI, 198/BB1.
16. 16. Protilátka alebo derivát protilátky podľa nároku 1, ktoré sú exprimované hybridómovou bunkovou líniou podľa nároku 14.
17. 17. Molekula DNA, kde táto molekula DNA kóduje protilátku alebo derivát protilátky podľa nároku 1.
18. 18. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje protilátku alebo derivát protilátky podľa nároku 1 a farmaceutický prijatelný nosič.
19. 19. Prípravok podľa nároku 18, vyznačujúci a tým, že navyše zahrnuje faktor IXaa a/alebo faktor IXa3.
20. 20. Spôsob liečby pacientov postihnutých poruchami zrážanlivosti krvi, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva farmaceutický účinné množstvo prípravku podľa nároku 18.
21. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že poruchy zrážanlivosti krvi sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej hemofíliu A a hemoragickú diatézu.
22. 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje stupeň výberu pacientov s inhibítorom hemofílie.
23. 23. Spôsob získavania protilátky alebo derivátu protilátky, ktoré interagujú s faktorom IX/faktorom IXa a zvyšujú prokoagulačnú aktivitu faktoru IXa, vyznačujúci sa tým, že

    - sa imunokompetentná myš imunizuje antigénom vybraným zo skupiny zahrnujúcej FIX, FIXaa, FIXaP alebo ich fragmenty,

    - izolujú sa bunky sleziny imunizovanej myši,

    - produkujú sa hybridómové klony,

    - supernatanty hybridómových buniek sa podrobujú screeningu na zvýšenie prokoagulačnej aktivity faktoru IXa, izolujú sa a čistia protilátky alebo deriváty protilátok zo supernatantov hybridómových buniek, ktoré vykazujú zvýšenie prokoagulačnej aktivity faktoru IXa.
24. 24. Použitie protilátky alebo derivátu protilátky podľa nároku 1 na zvyšovanie amidolytickej aktivity faktoru IXa.