RU2817370C1

RU2817370C1 - Adhesive bioactive matrix for working with cell cultures and method for use thereof

Info

Publication number: RU2817370C1
Application number: RU2023101771A
Authority: RU
Inventors: Руслан Ильхомович Халимов; Николай Александрович Омелько
Filing date: 2023-01-25
Publication date: 2024-04-15

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions relates to a liquid heterogeneous protein matrix comprising free molecules of chitosan and collagen, as well as extracellular microvesicles of embryonic calf serum, characterized by the fact that it is obtained by incubation of embryonic calf serum with a solution of chitosan with concentration of 400–600 mcg/ml in ratio of 1:5 with subsequent neutralization, centrifuging, removing the supernatant and dissolving precipitate in 0.1% collagen solution at rate of 1 ml of collagen solution per 1 ml of the used foetal calf serum, also relates to a method of using a liquid heterogeneous protein matrix, where the liquid heterogeneous protein matrix is diluted 10 times with 0.25% solution of acetic acid and applied to a dish pre-conditioned by culturing human embryonic rhabdomyosarcoma cells on it for at least 24 hours, then washed with 1% glutaric aldehyde in phosphate buffer solution for not more than 5 minutes.

EFFECT: group of inventions provides a simplification of the technology of treating glassware with a composition which accelerates adhesion, that is, fixation of cells on laboratory glassware in cell culture conditions, which increases viability of cell lines having weak adhesion capacity.

2 cl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно обработке посуды для выращивания культур клеток эукариот. Предложен способ обработки культуральной посуды, повышающий скорость адгезии клеток. Предлагаемый способ включает предобработку посуды клетками эмбриональной рабдомиосаркомы человека, с последующим покрытием её композицией на основе биополимеров и везикулярных факторов роста. Предлагаемая композиция включает хитозан, обогащённый микровезикулами, выделенными из эмбриональной сыворотки КРС путём соосаждения, а также коллаген.The invention relates to the field of biotechnology, namely the processing of dishes for growing cultures of eukaryotic cells. A method for processing culture dishes that increases the rate of cell adhesion is proposed. The proposed method involves pre-treatment of dishes with human embryonal rhabdomyosarcoma cells, followed by coating them with a composition based on biopolymers and vesicular growth factors. The proposed composition includes chitosan enriched with microvesicles isolated from fetal bovine serum by coprecipitation, as well as collagen.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND ART

Клеточная адгезия, т.е. связывание клеток с внеклеточным матриксом, другими клетками или специфической поверхностью, является необходимым условием выживания и роста клеток, а также их взаимодействия между собой. Процесс адгезии включает ряд молекулярно-биологических событий, таких как трёхмерная пространственная реорганизация цитоскелета, изменения гомеостаза и экспрессии поверхностных маркеров. Раковые клетки, а в особенности клетки метастазирующих опухолей, считаются обладающими повышенными способностями к адгезии, которые, среди прочего, обуславливают их способность к миграции в пределах организма. В связи с этим, исследования клеточной адгезии зачастую используются для характеризации метастатической активности клеток.Cell adhesion, i.e. The binding of cells to the extracellular matrix, other cells or a specific surface is a necessary condition for the survival and growth of cells, as well as their interaction with each other. The adhesion process involves a number of molecular biological events, such as three-dimensional spatial reorganization of the cytoskeleton, changes in homeostasis and the expression of surface markers. Cancer cells, and in particular metastatic tumor cells, are considered to have increased adhesion abilities, which, among other things, determine their ability to migrate within the body. In this regard, cell adhesion studies are often used to characterize the metastatic activity of cells.

Таким образом, формирование гибко настраиваемых, воспроизводимых условий для клеточной адгезии in vitro является необходимым для исследования биологии клетки, особенно в областях, связанных с изучением стволовых клеток и онкологических заболеваний.Thus, the creation of highly customizable, reproducible conditions for cell adhesion in vitro is essential for the study of cell biology, especially in the areas related to the study of stem cells and cancer.

Существуют различные способы обработки лабораторной посуды, обеспечивающие повышение адгезии клеток, которые могут быть условно разделены на физические, химические и биологические. Каждый из этих способов воздействует на свою сторону процесса клеточной адгезии, и в настоящее время считается устоявшимся мнение о том, что наиболее благоприятные условия для культур клеток могут быть достигнуты только использованием комбинированных подходов. Так, заявляемый способ можно считать наиболее близким к сочетанию химических и биологических методов.There are various methods for treating laboratory glassware that increase cell adhesion, which can be divided into physical, chemical and biological. Each of these methods affects a different aspect of the cell adhesion process, and it is now accepted that the most favorable conditions for cell culture can only be achieved using combined approaches. Thus, the proposed method can be considered the closest to a combination of chemical and biological methods.

Физические способы в основном заключаться в модификации поверхности лабораторной посуды без изменения её состава - например, путём придания ей определённой степени гидрофобности, шершавости или даже формирования упорядоченного микрорельефа. Химические способы заключаются в обработке культуральной посуды различными веществами, такими как синтетические соединения (полилизин), биополимеры (коллаген) или биогенные многокомпонентные смеси (матригель). Биологические методы включают регуляцию метаболизма клеток, обеспечивающие бесперебойную работу белков адгезии, например, путём введения в культуральную среду кофакторов работы таких белков.Physical methods mainly consist of modifying the surface of laboratory glassware without changing its composition - for example, by giving it a certain degree of hydrophobicity, roughness, or even the formation of an ordered microrelief. Chemical methods involve treating culture dishes with various substances, such as synthetic compounds (polylysine), biopolymers (collagen) or biogenic multicomponent mixtures (Matrigel). Biological methods include the regulation of cell metabolism, ensuring the uninterrupted operation of adhesion proteins, for example, by introducing cofactors for the operation of such proteins into the culture medium.

При этом поиск новых решений в области стимуляции клеточной адгезии остаётся актуальным, т.к., несмотря на широту спектра существующих методов, они не лишены определённых недостатков, ограничивающих их применение.At the same time, the search for new solutions in the field of stimulation of cell adhesion remains relevant, because, despite the wide range of existing methods, they are not without certain disadvantages that limit their use.

Коллаген является наиболее известным материалом для формирования адгезивного покрытия культуральной посуды, что обусловлено его ролью, как основного белка, формирующего межклеточную среду в организме. Обработка культуральной посуды коллагеном известна со второй половины XX века и активно используется в настоящее время.Collagen is the most well-known material for the formation of an adhesive coating on culture dishes, due to its role as the main protein that forms the intercellular environment in the body. The treatment of culture dishes with collagen has been known since the second half of the 20th century and is currently actively used.

Так, известны способы выращивания кератиноцитов кожи на твердом покрытии, обработанном коллагеном и на нитроцеллюлозных подложках, предварительно обсеянных корнеальными клетками КРС (DOI:10.1111/1523-1747.ер12540324). Обработка коллагеном может быть достигнута путём выращивания на посуде клеток и её повторного использования. Именно такой подход приведен в описанном способе в части, касающейся обработки нитроцеллюлозных подложек. Также существуют технологии выращивания высокочувствительных клеточных линий на т.н. питающем слое, состоящем из более жизнеспособных клеток, однако подобные технологии относятся к иной области техники, нежели заявляемый способ.Thus, there are known methods for growing skin keratinocytes on a hard surface treated with collagen and on nitrocellulose substrates pre-seeded with corneal bovine cells (DOI: 10.1111/1523-1747.er12540324). Collagen treatment can be achieved by growing cells on a dish and reusing them. This is exactly the approach described in the described method in the part concerning the processing of nitrocellulose substrates. There are also technologies for growing highly sensitive cell lines using the so-called. a feeding layer consisting of more viable cells, however, such technologies belong to a different field of technology than the claimed method.

Обширный опыт работы с коллагеновыми покрытиями для исследовательских целей позволил адаптировать данные технологии и для медицинского применения.Extensive experience with collagen coatings for research purposes has allowed us to adapt these technologies for medical use.

Известен способ получения покрытия на основе коллагена, включающий нанесение водной дисперсии коллагена на различные поверхности, в том числе на поверхности имплантов, где нанесение проводят путём аэрозольного распыления. При этом для удаления остаточного количества растворителя из получаемого покрытия осуществляют его термообработку при температуре, не превышающей температуру денатурации коллагена, формируя покрытие из отдельных микрокапель, не образующих сплошного слоя. Этим достигается сохранение фибриллярной структуры коллагена, что позволяет фибробластам организма пациента эффективно закрепляться на поверхности импланта. (RU 2730839 С1).There is a known method for producing a collagen-based coating, which involves applying an aqueous dispersion of collagen to various surfaces, including the surfaces of implants, where the application is carried out by aerosol spraying. In this case, to remove the residual amount of solvent from the resulting coating, it is heat treated at a temperature not exceeding the temperature of collagen denaturation, forming a coating of individual microdroplets that do not form a continuous layer. This ensures the preservation of the fibrillar structure of collagen, which allows the fibroblasts of the patient’s body to effectively attach to the surface of the implant. (RU 2730839 C1).

Такие способы создают двухмерную поверхность, которая предоставляет основные условия способствующие закреплению на ней клеток. Зачастую они используются для культивирования фибробластов и кератиноцитов, т.е. клеток тех тканей, которые содержат большие количества коллагена. Однако, для высокочувствительных к структуре поверхности клеточных линий, эти условия могут оставаться недостаточными для обеспечения всей полноты физиологических условий. В связи с этим учёными разрабатываются всё новые способы, основанные на поперечном связывании молекул коллагена с различными соединениями, придающими поверхности желаемые свойства.Such methods create a two-dimensional surface that provides the basic conditions conducive to the attachment of cells to it. They are often used for culturing fibroblasts and keratinocytes, i.e. cells of those tissues that contain large amounts of collagen. However, for cell lines that are highly sensitive to surface structure, these conditions may remain insufficient to ensure the full physiological conditions. In this regard, scientists are developing more and more new methods based on the cross-linking of collagen molecules with various compounds that impart the desired properties to the surface.

Так, известен способ создания композитного материала путём формирования поперечных связок из молекул глутарового альдегида между желатином и силиконом. Такой материал обладает желаемым уровнем гидрофобности, что позволяет эффективно использовать его для культивирования клеток сосудистого эндотелия. При этом было продемонстрировано, что увеличение концентрации глутарового альдегида (до определённого порога) увеличивает эффективность покрытия и повышает адгезию эндотелиоцитов, что свидетельствует о ведущей роли поперечных связок между молекулами в его биологической активности. (DOI: 10.1290/1071-2690(2002)038<0487:GCOSRT>2.0.CO;2).Thus, there is a known method for creating a composite material by forming transverse ligaments from glutaraldehyde molecules between gelatin and silicone. This material has the desired level of hydrophobicity, which allows it to be effectively used for culturing vascular endothelial cells. It was demonstrated that increasing the concentration of glutaraldehyde (up to a certain threshold) increases the efficiency of the coating and increases the adhesion of endothelial cells, which indicates the leading role of cross-links between molecules in its biological activity. (DOI: 10.1290/1071-2690(2002)038<0487:GCOSRT>2.0.CO;2).

Недостатком таких носителей, имеющих в основе поперечно сшитые молекулы биоразлагаемых полимеров, является происходящее при биодеградации высвобождение глутаральдегида, оказывающего токсическое действие на клетки, вызывающего развитие непредвиденных побочных эффектов при лабораторных исследованиях и осложнений при выполнении лечебных мероприятий. В связи с этим, появляются новые способы, основанные на использовании других методов поперечного сшивания молекул, с использованием иных связующих соединений или иных физико-химических принципов. Данные способы, однако, также не лишены недостатков.The disadvantage of such carriers, which are based on cross-linked molecules of biodegradable polymers, is the release of glutaraldehyde that occurs during biodegradation, which has a toxic effect on cells, causing the development of unexpected side effects in laboratory tests and complications during therapeutic measures. In this regard, new methods are emerging based on the use of other methods of cross-linking molecules, using other binding compounds or other physicochemical principles. These methods, however, are also not without drawbacks.

Известен способ покрытия силиконовой поверхности коллагеном, отличающийся тем, что в нём используются силиконовые изделия, функционализированные аминогруппами. При этом в качестве связывающего агента используется аскорбиновая кислота, формирующая поперечные сшивки между аминогруппами в молекуле коллагена и аминогруппами на поверхности изделия (DOI: 10.1098/rsif.2017.0318). За счёт использования аскорбиновой кислоты вместо глутарового альдегида, авторам удалось в первые трое суток культивирования достичь значительного (до 2-4 раз) повышения численности стволовых клеток жировой ткани человека, высеянных на посуду, обработанную таким образом, по сравнению с посудой, обработанной аналогичным способом, но с использованием глутарового альдегида.There is a known method of coating a silicone surface with collagen, characterized in that it uses silicone products functionalized with amino groups. In this case, ascorbic acid is used as a binding agent, forming cross-links between the amino groups in the collagen molecule and the amino groups on the surface of the product (DOI: 10.1098/rsif.2017.0318). By using ascorbic acid instead of glutaraldehyde, the authors were able to achieve a significant (up to 2-4 times) increase in the number of human adipose tissue stem cells seeded on dishes treated in this way in the first three days of cultivation, compared to dishes treated in a similar way. but using glutaraldehyde.

Существенным недостатком данного способа является невозможность самостоятельного изготовления в большинстве лабораторий посуды и изделий на основе силикона, функционализированного аминогруппами.A significant disadvantage of this method is the impossibility of independent production in most laboratories of glassware and products based on silicone functionalized with amino groups.

Также известен способ получения синтетического покрытия для клеточных культур, заключающийся в том, что в растворе формируется ковалентное соединение линейного полимера с полипептидами, при этом используется такое соотношение полипептидов и полимера, что полипептидные участки обеспечивают полную водорастворимость полученного соединения. Затем полученное соединение помещают на поверхность изделия, которое необходимо обработать, и подвергают электромагнитному или тепловому воздействию, достаточному для того, чтобы полимерная часть его молекул связалась с поверхностью изделия. Таким образом, достигается иммобилизация полипептидов, которые, собственно, и отвечают за адгезию клеток, на поверхности изделия без использования токсичного глутарового альдегида (US10941312B2).There is also a known method for producing a synthetic coating for cell cultures, which consists in forming a covalent compound of a linear polymer with polypeptides in a solution, using such a ratio of polypeptides and polymer that the polypeptide sections ensure complete water solubility of the resulting compound. The resulting compound is then placed on the surface of the product to be treated and subjected to sufficient electromagnetic or thermal stimulation to cause the polymer portion of its molecules to bind to the surface of the product. Thus, the immobilization of polypeptides, which, in fact, are responsible for cell adhesion, is achieved on the surface of the product without the use of toxic glutaraldehyde (US10941312B2).

К недостаткам данного способа следует отнести манипуляции с культуральной посудой, требующие воздействия высоких температур или электромагнитного поля. Такие манипуляции невозможно проводить в условиях ламинарного шкафа, в которых, как правило, проводится работа с культурами клеток, из-за чего необходимо перемещать посуду внутри лаборатории, что, в свою очередь, чревато нарушением стерильности.The disadvantages of this method include manipulations with culture dishes that require exposure to high temperatures or an electromagnetic field. Such manipulations cannot be carried out in a laminar flow hood, in which, as a rule, work is carried out with cell cultures, which is why it is necessary to move the glassware inside the laboratory, which, in turn, can lead to a violation of sterility.

Другим природным носителем-полимером для выращивания клеток является хитозан, обладающий бактериостатическими и фунгицидными свойствами, а также высокой гигроскопичностью. Эти свойства позволяют успешно применять его в качестве биологически активного носителя при выращивании монослоя клеток человека и животных (DOI: 10.1021/cr030441b).Another natural polymer carrier for growing cells is chitosan, which has bacteriostatic and fungicidal properties, as well as high hygroscopicity. These properties make it possible to successfully use it as a biologically active carrier for growing a monolayer of human and animal cells (DOI: 10.1021/cr030441b).

Недостатком хитозана является его цитотоксичность для некоторых линий клеток. Ряд авторов связывает гибель клеток с особенностями химического строения хитозана. Полимерные цепи хитозана не позволяют полного прикрепления клеток к ним, а не прикрепившиеся клетки погибают, т.к. они не способны жить без прикрепления к поверхности. Данный недостаток ограничивает область применения хитозана. Следует отметить, что в настоящее время существуют данные, подтверждающие зависимость цитотоксичности и адгезионных свойств хитозана от его физико-химических свойств, которые, в свою очередь, зависят от метода и источника его получения.The disadvantage of chitosan is its cytotoxicity for some cell lines. A number of authors associate cell death with the peculiarities of the chemical structure of chitosan. The polymer chains of chitosan do not allow complete attachment of cells to them, and unattached cells die, because they are not able to live without attachment to a surface. This drawback limits the scope of application of chitosan. It should be noted that currently there is data confirming the dependence of the cytotoxicity and adhesive properties of chitosan on its physicochemical properties, which, in turn, depend on the method and source of its preparation.

Дополнительным недостатком однокомпонентных покрытий в целом и хитозана в частности является его инородность по отношению к клеткам млекопитающих, которая делает хитозан неспособным создать необходимое паракринное микроокружение, включающее факторы роста и продукты ремоделирования клетками окружающего покрытия. Для борьбы с этим недостатком исследователи вводят дополнительные компоненты в состав питательной среды, однако это приводит к тому, что факторы роста и сигнальные молекулы сначала поступают к клеткам в свободном, растворённом, виде в большой концентрации, а затем их концентрация снижается по мере истощения питательной среды. Хотя такой подход может быть допустим и даже желателен для некоторых клеточных линий (например, для имитации гормональных циклов в организме), существуют типы клеток, для которых необходимо поддерживать постоянство условий. С этой целью создаются различные технологии иммобилизации факторов роста и сигнальных молекул в составе покрытия.An additional disadvantage of one-component coatings in general and chitosan in particular is its foreignness to mammalian cells, which makes chitosan unable to create the necessary paracrine microenvironment, including growth factors and cell remodeling products of the surrounding coating. To combat this deficiency, researchers introduce additional components into the nutrient medium, but this leads to the fact that growth factors and signaling molecules first enter the cells in a free, dissolved form in a high concentration, and then their concentration decreases as the nutrient medium is depleted . While this approach may be acceptable and even desirable for some cell lines (for example, to mimic the body's hormonal cycles), there are cell types for which it is necessary to maintain constant conditions. For this purpose, various technologies for immobilizing growth factors and signaling molecules in the coating composition are being created.

Наиболее близким к заявляемому решению, по лежащему в основе принципу, является способ, предполагающий сбор внеклеточных везикул из культуральной среды, в которой выращивались плацентарные мезенхимальные стволовые клетки человека (hPMSC), и их конъюгацию с синтетическим коллаген-связывающим пептидом SILY [Hao et al., 2022.doi:10.7150/thno.70448]. Сбор микровезикул осуществлялся путём посева hPMSC при плотности 20000 клеток на квадратный сантиметр с последующим их выращиванием в культуральной среде, содержащей сыворотку КРС, обеднённую собственными микровезикулами, в течение 48 часов. Полученную таким образом кондиционированную среду очищали центрифугированием и фильтрацией, после чего собирали везикулы ультрацентрифугированием. Затем, к полученным везикулам добавляли дибензоциклооктинсульфо-N-гидроксисукцинимидиловый эфир (DBCO-sulfo-NHS), инкубировали в течение двух часов и промывали от остатков непрореагировавшего DBCO-sulfo-NHS с последующей очисткой повторным ультрацентрифугированием. Затем к микровезикулам добавляли синтетический пептид SILY, содержащий азидную группу в остатке лизина (SILY-azide), инкубировали, промывали и центрифугировали. В результате реакции между поверхностными белками микровезикул и пептидом SILY образовывался ковалентно связанный мостик из DBCO.The closest to the claimed solution, in terms of the underlying principle, is a method involving the collection of extracellular vesicles from the culture medium in which placental human mesenchymal stem cells (hPMSCs) were grown and their conjugation with the synthetic collagen-binding peptide SILY [Hao et al. , 2022.doi:10.7150/thno.70448]. Microvesicles were collected by seeding hPMSCs at a density of 20,000 cells per square centimeter and then growing them in a culture medium containing bovine serum depleted of their own microvesicles for 48 hours. The conditioned medium thus obtained was purified by centrifugation and filtration, after which the vesicles were collected by ultracentrifugation. Then, dibenzocyclooctine sulfo-N-hydroxysuccinimidyl ether (DBCO-sulfo-NHS) was added to the resulting vesicles, incubated for two hours and washed to remove any remaining unreacted DBCO-sulfo-NHS, followed by purification by repeated ultracentrifugation. Then the synthetic SILY peptide containing an azide group in the lysine residue (SILY-azide) was added to the microvesicles, incubated, washed and centrifuged. As a result of the reaction between the microvesicle surface proteins and the SILY peptide, a covalently linked DBCO bridge was formed.

Полученные конъюгированные микровезикулы in vitro продемонстрировали способность к повышенному связыванию с коллагеновым покрытием, а также статистически достоверное повышение пролиферации эндотелиальных колониеобразующих клеток человека (hECFC) и значительное повышение экспрессии про-ангиогенных генов (KDR и TIE2). Таким образом, можно утверждать, что с помощью везикулярных факторов роста и сигнальных молекул можно расширить спектр поведения, проявляемого культурами клеток in vitro, что является ценным результатом с точки зрения проведения исследований на клеточных культурах.The resulting conjugated microvesicles in vitro demonstrated increased binding to the collagen coating, as well as a statistically significant increase in the proliferation of human endothelial colony-forming cells (hECFC) and a significant increase in the expression of pro-angiogenic genes (KDR and TIE2). Thus, it can be argued that with the help of vesicular growth factors and signaling molecules, it is possible to expand the range of behavior exhibited by cell cultures in vitro, which is a valuable result from the point of view of conducting research on cell cultures.

Вместе с тем, описанный способ имеет ряд существенных недостатков. Первым из них является использование клеток, полученных из человеческой плаценты, что вызывает сложности на юридическом, моральном и техническом уровнях. Вторым недостатком является необходимость неоднократного ультрацентрифугирования, для выполнения которого необходимо дорогостоящее оборудование. Наконец, описанный способ предназначен для получения везикул в виде взвеси главным образом для применения in vivo, а не для нанесения на поверхность посуды. Это напрямую указывается авторами, и является причиной сложности способа, которая в противном случае могла бы считаться избыточной.However, the described method has a number of significant disadvantages. The first of these is the use of cells derived from human placenta, which poses legal, moral and technical challenges. The second disadvantage is the need for repeated ultracentrifugation, which requires expensive equipment. Finally, the described method is intended to obtain vesicles in the form of a suspension, mainly for use in vivo, and not for application to the surface of dishes. This is directly stated by the authors, and is the reason for the complexity of the method, which otherwise might be considered redundant.

Целью настоящего изобретения является разработка состава и способа применения белкового матрикса, включающего свободные молекулы хитозана и коллагена, а также внеклеточные микровезикулы FBS, которые позволяют добиться повышения адгезии клеток в культуре после обработки данным матриксом лабораторной посуды. При этом состав и способ получения композиции выбраны таким образом, чтобы избежать использования дорогостоящего оборудования и донорских клеток.The purpose of the present invention is to develop a composition and method of using a protein matrix, including free molecules of chitosan and collagen, as well as extracellular FBS microvesicles, which make it possible to achieve increased cell adhesion in culture after treatment of laboratory glassware with this matrix. Moreover, the composition and method of obtaining the composition are chosen in such a way as to avoid the use of expensive equipment and donor cells.

Технический результат - упрощение технологии обработки посуды композицией, вызывающей ускорение адгезии, т.е. закрепления клеток на лабораторной посуде в условиях клеточной культуры, что позволяет повысить жизнеспособность клеточных линий, обладающих слабой способностью к адгезии.The technical result is a simplification of the technology for processing dishes with a composition that causes acceleration of adhesion, i.e. fixing cells on laboratory dishes under cell culture conditions, which makes it possible to increase the viability of cell lines with weak adhesion ability.

Для достижения указанной цели культуральную посуду, предназначенную для обработки, обсеивают клетками эмбриональной рабдомиосаркомы человека и оставляют в течение суток в подходящей питательной среде в инкубаторе при 37°С, 5% концентрации углекислого газа и повышенной влажности. На следующие сутки клетки удаляют с поверхности посуды обработкой 0,02% раствором ЭДТА (раствор версена), вносят в посуду 100 мкл адгезионного матрикса на квадратный сантиметр поверхности (получение матрикса описано ниже) и оставляют до высыхания. Высушенную посуду сначала промывают фосфатным буферным раствором (PBS), содержащим 1% глутарового альдегида, в количестве 300 мкл на квадратный сантиметр поверхности, в течение 5 минут, а затем троекратно промывают обычным PBS. Обработанную данным способом посуду используют для посева клеток.To achieve this goal, the culture dishes intended for processing are seeded with human embryonal rhabdomyosarcoma cells and left for 24 hours in a suitable nutrient medium in an incubator at 37°C, 5% carbon dioxide concentration and high humidity. The next day, the cells are removed from the surface of the dish by treating with a 0.02% EDTA solution (versene solution), 100 μl of the adhesion matrix per square centimeter of surface is added to the dish (the preparation of the matrix is described below) and left until dry. Dried dishes are first washed with phosphate buffer saline (PBS) containing 1% glutaraldehyde at a rate of 300 μl per square centimeter of surface for 5 minutes, and then washed three times with regular PBS. Dishes treated in this way are used for cell seeding.

Для приготовления адгезионного матрикса к эмбриональной телячьей сыворотке добавляют раствор хитозана, предпочтительно с молекулярной массой не менее 200 кДа, в 1% (масс/об) растворе уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют от 1 до 3 часов при 4°С, после чего по каплям добавляют 5% раствор гидроксида калия или натрия до появления опалесценции. Опалесцирующую смесь инкубируют дополнительно в течение 30-60 минут, после чего центрифугируют при 12 000 g в течение 20 минут и собирают осадок, содержащий микровезикулы, адсорбированные на молекулах хитозана. Осадок растворяют в 0,1% растворе коллагена, инкубируют в течение 30 минут, разводят в 10 раз и используют для покрытия посуды, как описано выше.To prepare the adhesion matrix, a solution of chitosan, preferably with a molecular weight of at least 200 kDa, in a 1% (w/v) acetic acid solution is added to fetal calf serum. The mixture is thoroughly mixed and incubated for 1 to 3 hours at 4°C, after which a 5% solution of potassium or sodium hydroxide is added dropwise until opalescence appears. The opalescent mixture is incubated for an additional 30-60 minutes, after which it is centrifuged at 12,000 g for 20 minutes and the sediment containing microvesicles adsorbed on chitosan molecules is collected. The sediment is dissolved in a 0.1% collagen solution, incubated for 30 minutes, diluted 10 times and used to coat dishes as described above.

Поставленная цель достигается следующим образом:The goal is achieved as follows:

Приготовляют раствор хитозана, предпочтительно с молекулярной массой не менее 200 кДа, в концентрации от 400 до 600 мкг/мл. Для достижения наилучшего результата расчётное количество хитозана закладывают в половинный объём дистиллированной воды (800-1200 мкг/мл), тщательно перемешивают и оставляют данную взвесь при температуре 4°С для набухания на время от 2 до 16 часов. Отдельно подготавливают 2% (масс/об) раствор уксусной кислоты, а именно растворяют ледяную уксусную кислоту в дистиллированной воде из расчёта от 0,32 до 0,36 моль (19,2-21,6 г) кислоты на 1 литр воды. Взвесь хитозана доводят 2% раствором уксусной кислоты до конечной концентрации от 400 до 600 мкг/мл, что соответствует разведению в два раза. Возможно приготовление раствора хитозана напрямую путём смешивания сухого вещества с 1% раствором уксусной кислоты (9,6-10,8 г/литр), однако при таком подходе смесь содержит большое количество пузырьков, что, в свою очередь, может затруднять дозирование. Отдельно подготавливают 5% раствор гидроксида калия или натрия массо-объёмным способом из сухой щёлочи и дистиллированной воды. Раствор хитозана можно приготовить заранее и он остаётся пригодным для применения как минимум в течение 4 суток.Prepare a solution of chitosan, preferably with a molecular weight of at least 200 kDa, at a concentration of 400 to 600 μg/ml. To achieve the best result, the calculated amount of chitosan is placed in half the volume of distilled water (800-1200 µg/ml), mixed thoroughly and this suspension is left at a temperature of 4°C to swell for a period of 2 to 16 hours. Separately, prepare a 2% (wt/vol) solution of acetic acid, namely, dissolve glacial acetic acid in distilled water at the rate of 0.32 to 0.36 mol (19.2-21.6 g) acid per 1 liter of water. The chitosan suspension is adjusted with a 2% acetic acid solution to a final concentration of 400 to 600 μg/ml, which corresponds to a twofold dilution. It is possible to prepare a chitosan solution directly by mixing the dry substance with a 1% solution of acetic acid (9.6-10.8 g/liter), however, with this approach the mixture contains a large number of bubbles, which, in turn, can make dosing difficult. Separately, prepare a 5% solution of potassium or sodium hydroxide by mass-volume method from dry alkali and distilled water. The chitosan solution can be prepared in advance and remains suitable for use for at least 4 days.

Центрифугируют эмбриональную телячью сыворотку (FBS) в течение 10 минут при 3000 g, чтобы удалить возможные загрязнители в виде фрагментов клеток.Centrifuge fetal bovine serum (FBS) for 10 minutes at 3000 g to remove possible contaminants in the form of cell fragments.

К образцам сыворотки в асептических условиях добавляют полученный раствор хитозана с молекулярной массой не менее 200 кДа, в концентрации от 400 до 600 мкг/мл в соотношении хитозан:сыворотка, равном 1:5. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют от 1 до 3 часов при 4°С, после чего в асептических условиях по каплям добавляют 5% раствор гидроксида калия или натрия до появления опалесценции. Опалесценция чаще всего принимает вид тонких белёсых волокон у поверхности раствора. При её появлении добавление щёлочи прекращают и оставляют нейтрализованную смесь для дополнительной инкубации на 30-60 минут.После этого смесь центрифугируют при 12000 g в течение 20 минут и собирают осадок, содержащий микровезикулы, адсорбированные на молекулах хитозана. Осадок растворяют в 0,1% растворе коллагена в 0,25% уксусной кислоте с таким расчётом, чтобы на каждый миллилитр FBS, использованной для получения осадка, приходился 1 мл 0,1% раствора коллагена в 0,25% уксусной кислоте. Полученную смесь, инкубируют в течение 30 минут, после чего она может храниться в течение не менее 1 суток перед дальнейшим применением. Смесь представляет собой жидкий прозрачный гетерогенный белковый матрикс, включающий свободные молекулы хитозана и коллагена, а также внеклеточные микровезикулы FBS, содержащие фактора роста.The resulting chitosan solution with a molecular weight of at least 200 kDa, at a concentration of 400 to 600 μg/ml in a chitosan:serum ratio of 1:5, is added to the serum samples under aseptic conditions. The mixture is thoroughly mixed and incubated for 1 to 3 hours at 4°C, after which a 5% solution of potassium or sodium hydroxide is added dropwise under aseptic conditions until opalescence appears. Opalescence most often takes the form of thin whitish fibers at the surface of the solution. When it appears, the addition of alkali is stopped and the neutralized mixture is left for additional incubation for 30-60 minutes. After this, the mixture is centrifuged at 12,000 g for 20 minutes and the sediment containing microvesicles adsorbed on chitosan molecules is collected. The precipitate is dissolved in a 0.1% solution of collagen in 0.25% acetic acid in such a way that for each milliliter of FBS used to obtain the precipitate, there is 1 ml of a 0.1% solution of collagen in 0.25% acetic acid. The resulting mixture is incubated for 30 minutes, after which it can be stored for at least 1 day before further use. The mixture is a liquid transparent heterogeneous protein matrix, including free molecules of chitosan and collagen, as well as extracellular FBS microvesicles containing growth factors.

Перед непосредственным применением смесь разводят 0,25% уксусной кислотой в 10 раз и используют для покрытия посуды.Before direct use, the mixture is diluted 10 times with 0.25% acetic acid and used to coat dishes.

Для покрытия смесью культуральной посуды, в посуду сначала высаживают клетки перевиваемой линии RD (эмбриональная рабдомиосаркома человека) в количестве 30000 клеток на квадратный сантиметр поверхности посуды, добавляют рекомендованное количество питательной среды, при этом предпочтительно использовать ту питательную среду, которая используется в работе с данными клетками в данной лаборатории постоянно. Клетки оставляют на сутки в инкубаторе при 37°С, 5% концентрации углекислого газа и повышенной влажности. На следующие сутки клетки RD удаляют с поверхности посуды обработкой 0,02% раствором ЭДТА (раствор версена), вносят в посуду 100 мкл адгезионного матрикса на квадратный сантиметр поверхности и оставляют до высыхания. Высушенную посуду сначала промывают фосфатным буферным раствором (PBS), содержащим 1% глутарового альдегида, в количестве 300 мкл на квадратный сантиметр поверхности, в течение не более, чем 5 минут, а затем троекратно промывают обычным PBS. Более длительная экспозиция с глутаровым альдегидом может повысить цитотоксичность матрикса, сделаем его непригодным для применения.To cover the culture dishes with the mixture, cells of the continuous line RD (human embryonic rhabdomyosarcoma) are first planted in the dishes in an amount of 30,000 cells per square centimeter of the surface of the dish, the recommended amount of nutrient medium is added, and it is preferable to use the nutrient medium that is used in working with these cells in this laboratory constantly. The cells are left for a day in an incubator at 37°C, 5% carbon dioxide concentration and high humidity. The next day, RD cells are removed from the surface of the dish by treating with a 0.02% EDTA solution (versene solution), 100 μl of the adhesion matrix per square centimeter of surface is added to the dish and left to dry. Dried dishes are first rinsed with phosphate buffer saline (PBS) containing 1% glutaraldehyde at a rate of 300 µl per square centimeter of surface for no more than 5 minutes, and then rinsed three times with normal PBS. Longer exposure to glutaraldehyde can increase the cytotoxicity of the matrix, making it unsuitable for use.

В результате высушивания и последующей кратковременной обработки глутаровым альдегидом, матрикс переходит в сшитую форму, в которой между аминогруппами молекул хитозана и коллагена сформированы поперечные сшивки. Данные сшивки предотвращают повторное растворение матрикса после посева культур клеток. Обработанную данным способом посуду используют для посева клеток согласно необходимому дизайну эксперимента.As a result of drying and subsequent short-term treatment with glutaraldehyde, the matrix transforms into a cross-linked form, in which cross-links are formed between the amino groups of chitosan and collagen molecules. These crosslinks prevent re-dissolution of the matrix after cell culture seeding. The dishes treated in this way are used for seeding cells according to the required experimental design.

Предварительная обработка (прекондиционирование) обрабатываемой посуды клетками RD позволяет сформировать на поверхности посуды участки, покрытые выделяемым ими межклеточным веществом. Эти участки после дальнейшей обработки матрикса глутаровым альдегидом образуют межмолекулярные сшивки с молекулами биополимеров (хитозана и коллагена) в составе матрикса, чем улучшают его закрепление. Помимо этого, выделяемые клетками RD на посуду структурные белки и паракринные регуляторы способствуют адгезии сами по себе (пример 2).Pre-treatment (preconditioning) of the processed dishes with RD cells makes it possible to form areas on the surface of the dishes covered with the intercellular substance they secrete. These areas, after further processing of the matrix with glutaraldehyde, form intermolecular cross-links with molecules of biopolymers (chitosan and collagen) in the matrix, thereby improving its fixation. In addition, structural proteins and paracrine regulators secreted by RD cells onto dishes promote adhesion on their own (example 2).

Коллаген является основным структурным белком организма для многих видов животных, что обуславливает его роль в адгезии клеток к полученному матриксу. Поверхностные белки многих клеток способны избирательно распознавать молекулы коллагена и связываться с ними.Collagen is the main structural protein of the body for many animal species, which determines its role in the adhesion of cells to the resulting matrix. Surface proteins of many cells are able to selectively recognize collagen molecules and bind to them.

Хитозан за счёт распределения электронной плотности в его молекулах способен адсорбировать на себе микровезикулы, за счёт чего и достигается их сбор из FBS. При этом высокая молекулярная масса хитозана позволяет собрать микровезикулы без использования сверхвысоких ускорений, характерных для ультрацентрифугирования, что позволяет применять заявляемый способ без применения дорогостоящих ультрацентрифуг. В составе матрикса хитозан так же выступает в качестве компонента, связывающего везикулы, и обеспечивая медленный, постепенный выход из них факторов роста.Chitosan, due to the distribution of electron density in its molecules, is able to adsorb microvesicles on itself, due to which their collection from FBS is achieved. At the same time, the high molecular weight of chitosan allows the collection of microvesicles without the use of ultra-high accelerations characteristic of ultracentrifugation, which makes it possible to use the inventive method without the use of expensive ultracentrifuges. As part of the matrix, chitosan also acts as a component that binds vesicles and ensures a slow, gradual release of growth factors from them.

Глутаровый альдегид является связывающим агентом, обеспечивающим переход матрикса в слаборастворимую форму, создавая стабильное покрытие лабораторной посуды. При этом экспозиция матрикса с глутаровым альдегидом продолжается недолго, после чего матрикс промывается от излишков, чем снижается общее содержание глутарового альдегида в готовом матриксе в сшитой форме. Сокращение времени экспозиции позволяет, таким образом, контролировать цитотоксическое действие данного компонента.Glutaraldehyde is a binding agent that ensures the transition of the matrix into a slightly soluble form, creating a stable coating for laboratory glassware. In this case, the exposure of the matrix to glutaraldehyde does not last long, after which the matrix is washed from excess, which reduces the total content of glutaraldehyde in the finished matrix in cross-linked form. Reducing the exposure time allows, therefore, to control the cytotoxic effect of this component.

Везикулы, выделенные из FBS, представляют собой микроскопические внеклеточные везикулы диаметром от 30 до 100 нм с билипидным слоем, выделяемые в межклеточное пространство клетками различных тканей и органов эмбриона КРС, от которого была получена FBS. Сыворотки эмбрионов КРС богаты факторами роста и другими сигнальными молекулами, которые регулируют рост и развитие эмбриона, а в условиях клеточных культур обеспечивают благоприятные условия для адгезии, роста и пролиферации клеток.Vesicles isolated from FBS are microscopic extracellular vesicles with a diameter of 30 to 100 nm with a bilipid layer, secreted into the intercellular space by cells of various tissues and organs of the bovine embryo from which FBS was obtained. Bovine fetal serum is rich in growth factors and other signaling molecules that regulate the growth and development of the embryo, and in cell culture conditions provide favorable conditions for cell adhesion, growth and proliferation.

Таким образом, общий состав заявляемой композиции, а также способ её получения и применения, обеспечивают эффективное создание на поверхности лабораторной посуды условий, обеспечивающих ускоренную адгезию, т.е. закрепление клеток на лабораторной посуде в условиях клеточной культуры, что позволяет повысить жизнеспособность клеточных линий, обладающих слабой способностью к адгезии. Помимо этого, решается проблема использования факторов роста, полученных из везикул донорских тканей и клеток, и сокращается количество дорогостоящего оборудования, задействованного в процессе.Thus, the general composition of the claimed composition, as well as the method of its preparation and use, ensure the effective creation of conditions on the surface of laboratory glassware that ensure accelerated adhesion, i.e. fixation of cells on laboratory dishes under cell culture conditions, which makes it possible to increase the viability of cell lines with weak adhesion ability. In addition, the problem of using growth factors obtained from vesicles of donor tissues and cells is solved, and the amount of expensive equipment involved in the process is reduced.

Пример 1Example 1

Оценка токсичности прекондиционированной с клетками RD среды проводилась путём измерения индекса площади (ИП) первичных эксплантов.The toxicity of the medium preconditioned with RD cells was assessed by measuring the area index (AI) of primary explants.

Отбор фрагментов ткани для культуры первичных эксплантов проводился следующим образом. Самцов беспородных мышей-альбиносов наркотизировали парами диэтилового эфира, после чего умерщвляли путём цервикальной дислокации. С участка площадью 1 кв. см. сбривали волосяной покров и обрабатывали его 70% этанолом, после чего отделяли фрагмент кожи, удаляли фасции и переносили полученный фрагмент в среду DMEM с добавлением гентамицина (4 мг/мл). Затем обрабатывали спиртом задние лапы, удаляли кожу и отбирали m. gastrocnemius и m. soleus, которые так же переносили в DMEM с гентамицином. После этого проводили вскрытие брюшной полости, отбирали доли печени и переносили в среду DMEM с гентамицином. Ёмкость с фрагментами тканей осторожно взбалтывали, чтобы обеспечить полное покрытие фрагментов антибиотиком. Оба эксперимента на первичных эксплантах проводили в трёх повторениях, для каждого из которых использовалось одно животное.The selection of tissue fragments for the culture of primary explants was carried out as follows. Male outbred albino mice were anesthetized with diethyl ether vapor and then killed by cervical dislocation. From a plot of 1 sq. see, the hair was shaved and treated with 70% ethanol, after which a skin fragment was separated, the fascia was removed, and the resulting fragment was transferred to DMEM with the addition of gentamicin (4 mg/ml). Then the hind paws were treated with alcohol, the skin was removed and m. gastrocnemius and m. soleus, which were also transferred to DMEM with gentamicin. After this, the abdominal cavity was opened, liver lobes were collected and transferred to DMEM with gentamicin. The container with tissue fragments was gently shaken to ensure complete coverage of the fragments with the antibiotic. Both experiments on primary explants were performed in triplicate, each using one animal.

Собранные таким образом фрагменты тканей асептически переносили в ламинарный бокс и осторожно разделяли с помощью пинцета, скальпеля и ножниц на мелкие части величиной около 1 куб. мм., которые помещали в чашки Петри с обработанной поверхностью. Питательная среда состояла из 90% среды DMEM и 10% фетальной телячьей сыворотки. В среду добавляли гентамицин (0,4 мг/мл).The tissue fragments collected in this way were aseptically transferred to a laminar flow hood and carefully separated using tweezers, a scalpel and scissors into small parts measuring about 1 cubic meter. mm., which were placed in Petri dishes with a treated surface. The culture medium consisted of 90% DMEM and 10% fetal calf serum. Gentamicin (0.4 mg/ml) was added to the medium.

Культивирование клеток проводили в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Клетки наращивали в CO2-инкубаторе при температуре 37°С и 5% содержании углекислого газа. Для наращивания клеток использовали пластиковые чашки Петри с обработанной поверхностью.Cell cultivation was carried out in DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin solution. Cells were grown in a CO2 incubator at a temperature of 37°C and 5% carbon dioxide. To grow cells, plastic Petri dishes with a treated surface were used.

Экспланты тканей помещали в чашки Петри диаметром 3,5 см с обработанной поверхностью в количестве не более 9 эксплантов на чашку. В экспланты каждого вида ткани разделяли на две группы (n=40) - экспланты контрольной группы культивировали в обычной среде, как описано выше, а экспланты экспериментальной группы - в прекондиционированной среде. Прекондиционирование среды проводили путём засевания в чашку Петри клеток линии RD в количестве 500 тыс. клеток на чашку в среде DMEM, содержащей 10% FBS и гентамицин, как описано выше. Спустя сутки культуральную среду собирали и центрифугировали в течение 15 минут при 1500 оборотах в минуту на центрифуге LMC-3000 (bioSan, Латвия). Освобождённую таким образом от клеток и клеточного дебриса среду, содержащую метаболиты клеток линии RD, использовали в дальнейшем исследовании. На третьи сутки экспланты фотографировали на микроскопе Zeiss Imager.Zl. Индекс площади (ИП) рассчитывали как отношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для расчёта ИП эксплантатов использовали программу «AxioVision». Значения ИП выражали в процентах. Величину ИП в контрольных культурах (без добавления прекондиционированной среды) принимали за 100%.Tissue explants were placed in Petri dishes with a diameter of 3.5 cm with a treated surface in an amount of no more than 9 explants per dish. The explants of each type of tissue were divided into two groups (n=40) - the explants of the control group were cultured in normal medium, as described above, and the explants of the experimental group were cultured in preconditioned medium. Preconditioning of the medium was carried out by seeding RD cells into a Petri dish at a rate of 500 thousand cells per dish in DMEM medium containing 10% FBS and gentamicin, as described above. A day later, the culture medium was collected and centrifuged for 15 minutes at 1500 rpm in an LMC-3000 centrifuge (bioSan, Latvia). The medium, thus freed from cells and cellular debris, containing metabolites of the RD cell line, was used in further research. On the third day, the explants were photographed using a Zeiss Imager.Zl microscope. The area index (AI) was calculated as the ratio of the area of the entire explant (together with the zone of evicting cells) to the area of the central zone of the explant. To calculate the IP of explants, the AxioVision program was used. PI values were expressed as percentages. The PI value in control cultures (without adding preconditioned medium) was taken as 100%.

В ходе изучения активности кондиционированной среды, содержащей продукты метаболизма клеток линии RD, в отношении клеток в культуре первичных эксплантов тканей кожи, мышц и печени, были получены следующие значения среднего ИП в экспериментальных группах: для кожи - 98,90±2,1%, для мышц - 117,81±6,6%, для печени - 101,55±4,3%.In the course of studying the activity of the conditioned medium containing metabolic products of the RD cell line in relation to cells in the culture of primary explants of skin, muscle and liver tissues, the following values of the average PI were obtained in the experimental groups: for skin - 98.90±2.1%, for muscles - 117.81±6.6%, for liver - 101.55±4.3%.

Статистическая обработка результатов подтвердила отсутствие статистически достоверных отличий между контрольной и экспериментальной группами эксплантов кожи и печени. При этом было установлено, что повышение пролиферации ткани мышц носит достоверный характер (р=0.0487). Такое положительное воздействие среды, содержащей метаболиты клеток RD, на клетки мышц, может быть связано с тем, что линия RD представлена клетками рабдомиосаркомы, и выделяемые ей в кондиционированную среду факторы роста могут быть специфичны в отношении клеток мышц.Statistical processing of the results confirmed the absence of statistically significant differences between the control and experimental groups of skin and liver explants. It was found that the increase in muscle tissue proliferation was significant (p = 0.0487). This positive effect of the medium containing metabolites of RD cells on muscle cells may be due to the fact that the RD line is represented by rhabdomyosarcoma cells, and the growth factors released into the conditioned medium may be specific to muscle cells.

Таким образом, установлено, что метаболиты клеток линии RD не токсичны для первичных культур клеток мыши, и могут быть использованы в качестве ингредиента адгезионного матрикса.Thus, it was established that the metabolites of the RD cell line are not toxic to primary mouse cell cultures and can be used as an ingredient in the adhesion matrix.

Пример 2Example 2

Оценку адгезии опухолевых клеток к посуде, обработанной клетками RD, проводили по поглощению клетками, закрепившимися на подложке, красителя. Тест проводили в 24-луночных плоскодонных планшетах с необработанной поверхностью. Лунки были разделены на три экспериментальные группы, а также группы негативного и позитивного контроля (n=16). Лунки в экспериментальных группах были предварительно обсеяны клетками RD в количестве 50 тысяч клеток на лунку, после чего клетки RD были оставлены для роста на трое суток. На четвёртые сутки клетки RD удаляли из лунок посредством обработки раствором версена в течение 15 минут и троекратного отмывания PBS. После этого в лунки экспериментальной группы I не засевалось никаких клеток (0% адгезии), а в лунки групп II и III были засеяны клетки SK-MEL-2 в количестве 100 тысяч клеток на лунку, при этом в группе II клетки были смыты PBS через 20 минут, в группе III клетки смывались через 2 часа. Негативная контрольная группа включала лунки, не подвергавшиеся никакой обработке клетками, однако подвергавшиеся всем остальным процедурам. Группа позитивного контроля включала лунки, не подвергавшиеся предварительной обработке клетками RD, но засеянные клетками SC-MEL-2 так же, как экспериментальная группа III (без смывания).The adhesion of tumor cells to dishes treated with RD cells was assessed by the absorption of dye by cells attached to the substrate. The test was carried out in 24-well flat-bottomed plates with an untreated surface. The wells were divided into three experimental groups, as well as negative and positive control groups (n=16). The wells in the experimental groups were pre-seeded with RD cells in the amount of 50 thousand cells per well, after which the RD cells were left to grow for three days. On the fourth day, RD cells were removed from the wells by treatment with versene solution for 15 minutes and washing with PBS three times. After this, no cells were seeded into the wells of experimental group I (0% adhesion), and SK-MEL-2 cells were seeded into the wells of groups II and III in an amount of 100 thousand cells per well, while in group II the cells were washed off with PBS through 20 minutes, in group III the cells were washed off after 2 hours. The negative control group included wells that did not receive any cell treatment but were subject to all other treatments. The positive control group included wells that were not pretreated with RD cells, but seeded with SC-MEL-2 cells in the same way as experimental group III (without washing).

После обработки клетками в соответствии с вышеописанным протоколом, все лунки осторожно освобождали от остатков ростовых сред, клетки фиксировали раствором формальдегида и окрашивали 0,5% водным раствором кристаллического фиолетового в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и окрашивания планшеты тщательно промывали дистиллированной водой так, чтобы не повредить зафиксированные клетки. Затем в лунки на 60 минут добавляли 500 мкл 5% водного раствора ТВИН-20, чтобы растворить краситель, содержащийся в клетках, и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 490 нм. Оптическая плотность полученных растворов пропорциональна количеству красителя, количество которого, в свою очередь, зависит от числа клеток в лунках.After treating the cells in accordance with the protocol described above, all wells were carefully cleared of residual growth media, the cells were fixed with formaldehyde solution and stained with 0.5% aqueous crystal violet for 20 minutes at room temperature. After fixation and staining, the plates were thoroughly washed with distilled water so as not to damage the fixed cells. Then, 500 μl of a 5% aqueous solution of TWIN-20 was added to the wells for 60 minutes to dissolve the dye contained in the cells, and the optical density of the solution was measured at a wavelength of 490 nm. The optical density of the resulting solutions is proportional to the amount of dye, the amount of which, in turn, depends on the number of cells in the wells.

При проведении спектрофотометрии были получены следующие значения (в условных единицах, у.е.): Негативный контроль - 58,93±0,19; Позитивный контроль - 66,56±0,41; Группа I - 57,69±0,45; Группа II - 66,69±0,34; Группа III - 69,5±0,31.When carrying out spectrophotometry, the following values were obtained (in arbitrary units, a.u.): Negative control - 58.93±0.19; Positive control - 66.56±0.41; Group I - 57.69±0.45; Group II - 66.69±0.34; Group III - 69.5±0.31.

Статистическая обработка результатов не выявила статистически достоверных различий между группой I и негативным контролем, а также между группой II и позитивным контролем. Однако различия между группой III и позитивным контролем были статистически достоверны (р=0.032). Подобное повышение оптической плотности позволяет предполагать, что за равный временной промежуток в группе III, которая включала обработанные лунки, произошла адгезия большего числа клеток. Вместе с тем, отсутствие достоверных различий между группой II и позитивным контролем также свидетельствует о повышении адгезии, которая привела к равной оптической плотности при меньшем времени.Statistical processing of the results did not reveal statistically significant differences between group I and the negative control, as well as between group II and the positive control. However, the differences between group III and the positive control were statistically significant (p = 0.032). Such an increase in optical density suggests that over an equal period of time in group III, which included treated wells, adhesion of a larger number of cells occurred. However, the lack of significant differences between group II and the positive control also indicates an increase in adhesion, which led to equal optical density in less time.

Таким образом, установлено, что метаболиты клеток линии RD могут напрямую способствовать адгезии клеток к прекондиционированной посуде.Thus, it was found that metabolites of the RD cell line can directly promote cell adhesion to preconditioned dishes.

Claims

1. Liquid heterogeneous protein matrix, including free molecules of chitosan and collagen, as well as extracellular microvesicles of fetal calf serum, characterized by the fact that it is obtained by incubating fetal calf serum with a chitosan solution with a concentration of 400-600 μg/ml in a ratio of 1:5, followed by neutralization, centrifugation, removal of the supernatant and dissolution of the sediment in a 0.1% collagen solution at the rate of 1 ml of collagen solution per 1 ml of used fetal calf serum.

2. The method of using a liquid heterogeneous protein matrix according to claim 1, where the liquid heterogeneous protein matrix is diluted 10 times with a 0.25% acetic acid solution and applied to dishes preconditioned by culturing human embryonal rhabdomyosarcoma cells on it for at least 24 hours , then washed with a 1% solution of glutaraldehyde in phosphate buffer solution for no more than 5 minutes.