RU2663464C1

RU2663464C1 - Combination therapy for treating hemorrhagic shock

Info

Publication number: RU2663464C1
Application number: RU2018106931A
Authority: RU
Inventors: Вероника Николаевна Бадэ; Владимир Александрович Бобков; Армен Александрович Овсепян; Дмитрий Александрович Потеряев; Елена Валерьевна Рыжова; Александр Михайлович ШУСТЕР
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2018-08-06

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention relates to medicine, in particular to a kit for treating hemorrhagic shock in the form of two containers comprising tranexamic acid, recombinant full-length SERPING1 or serpin domain thereof, as well as a pharmaceutically acceptable solvent and diluent.EFFECT: implementation of the invention provides a synergistic effect of the active components included therein and allows significantly reducing mortality from hemorrhagic shock or massive blood loss.7 cl, 10 dwg, 4 tbl, 8 ex

Description

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к лечению геморрагического шока и кровотечений с использованием комбинации антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты, и полипептида, обладающего активностью SERPING1.The present invention relates to medicine, namely to the treatment of hemorrhagic shock and bleeding using a combination of an antifibrinolytic selected from the group consisting of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid and a polypeptide having SERPING1 activity.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Тяжелые травмы являются одной из проблем здравоохранения. По статистике ВОЗ ежегодно в мире тяжелую травму получает 10 млн. человек, 250 тыс. из них погибает от шока («ВОЗ | Дорожно-транспортные травмы», WHO. [Online]. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs358/ru). Основной причиной смерти таких пациентов является неконтролируемое посттравматическое кровотечение («Интенсивная терапия», №6, 2014 г., стр. 5). Уровень травматизма в РФ составляет 8730,3 случаев на 100 тыс. взрослого населения. При этом 80% смертей от травм на дорогах связаны с неоказанием помощи в течение первого часа («Травмы, первая медицинская помощь при травмах, виды травматизма, последствия травм». [Online], http://www.medicinform.net/medhelp/medhelp6.htm).Severe injuries are one of the health problems. According to WHO statistics, 10 million people are seriously injured in the world every year, 250 thousand of them die from shock ("WHO | Road traffic injuries", WHO. [Online]. Http://www.who.int/mediacentre/ factsheets / fs358 / en). The main cause of death in these patients is uncontrolled post-traumatic bleeding (Intensive Care, No. 6, 2014, p. 5). The level of injuries in the Russian Federation is 8730.3 cases per 100 thousand adults. At the same time, 80% of deaths from road injuries are associated with failure to provide assistance during the first hour (“Injuries, first aid for injuries, types of injuries, consequences of injuries.” [Online], http://www.medicinform.net/medhelp/ medhelp6.htm).

Геморрагический шок наступает, когда острая кровопотеря превышает примерно 20% от нормального объема крови. Главной особенностью геморрагического шока является уменьшение объема циркулирующей крови, что приводит к гипоперфузии основных систем органов. Гипоперфузия приводит к недостатку питательных веществ и вызывает локальную ишемию тканей, что ведет к прогрессирующему повреждению многих органов и их последующей дисфункции. (Keith 1986). При реанимации путем замещения внутрисосудистого объема кровью или физиологическими растворами, происходит дальнейшее повреждение, вызванное реперфузией (Keith 1986).Hemorrhagic shock occurs when acute blood loss exceeds approximately 20% of the normal blood volume. The main feature of hemorrhagic shock is a decrease in the volume of circulating blood, which leads to hypoperfusion of the main organ systems. Hypoperfusion leads to a lack of nutrients and causes local tissue ischemia, which leads to progressive damage to many organs and their subsequent dysfunction. (Keith 1986). During resuscitation by replacing the intravascular volume with blood or saline, further damage caused by reperfusion occurs (Keith 1986).

Коагулопатия, ассоциированная с травмой и геморрагическим шоком, диагностируется у одной трети пациентов с травматическими кровотечениями при поступлении в лечебные учреждения. Травмированные пациенты с коагулопатией имеют значительно более высокую смертность в сравнении с пациентами с похожими травмами без коагулопатии. При травме и индуцированной геморрагическим шоком коагулопатии, в ходе реанимационных предприятий, как правило, применяется инфузионно-трансфузионная терапия. Однако, наиболее эффективные меры, такие как протокол 1:1:1, который представляет собой комбинацию эритроцитарной массы, свежезамороженной плазмы крови и тромбоцитов, доступен только в стационарных пунктах квалифицированной медицинской помощи, таких как больницы. Кроме того, применение протокола 1:1:1 ограничивается сроком хранения отдельных компонентов. Рекомендуемый срок хранения эритроцитарной массы составляет 8 дней, а тромбоцитов - 5 дней. Более эффективной является трансфузия теплой свежей донорской крови, однако ее доступность еще более ограничена. (Vymazal 2015). Между тем, при лечении геморрагического шока чрезвычайно важно предпринять терапевтические меры как можно скорее, как правило, не позднее чем через 3 часа после начала массивного кровотечения. Во многих обстоятельствах, таких как дорожно-транспортные происшествия или ранения в ходе боевых действий, квалифицированная медицинская помощь доступна слишком поздно для эффективного лечения геморрагического шока. Поэтому для неотложной медицинской помощи, в машинах скорой помощи или пунктах сбора раненых необходимо наличие эффективного терапевтического средства для лечения геморрагического шока и вызванной травмой коагулопатии.Coagulopathy associated with trauma and hemorrhagic shock is diagnosed in one third of patients with traumatic bleeding upon admission to hospitals. Injured patients with coagulopathy have a significantly higher mortality rate compared to patients with similar injuries without coagulopathy. In case of trauma and coagulopathy induced by hemorrhagic shock, infusion-transfusion therapy is usually used during resuscitation enterprises. However, the most effective measures, such as the 1: 1: 1 protocol, which is a combination of red blood cells, freshly frozen blood plasma, and platelets, are available only in inpatient facilities such as hospitals. In addition, the application of the 1: 1: 1 protocol is limited by the shelf life of the individual components. The recommended shelf life of red blood cells is 8 days, and platelets - 5 days. Transfusion of warm fresh donated blood is more effective, but its availability is even more limited. (Vymazal 2015). Meanwhile, in the treatment of hemorrhagic shock, it is extremely important to take therapeutic measures as soon as possible, as a rule, no later than 3 hours after the onset of massive bleeding. In many circumstances, such as traffic accidents or injuries during the fighting, skilled care is available too late to effectively treat hemorrhagic shock. Therefore, for emergency medical care, in ambulances or collection points for the wounded, an effective therapeutic agent for the treatment of hemorrhagic shock and coagulopathy caused by trauma is necessary.

Во время геморрагического шока и реанимации также сильно повреждается желудочно-кишечный тракт. Происходит некроз кишечника и наблюдаются последующая бактериальная транслокация с выбросом эндотоксинов (Tamion, Richard et al. 1997). Это как правило, приводит к значительному увеличению уровня воспалительных цитокинов, которые могут усилить полиорганную дисфункцию.During hemorrhagic shock and resuscitation, the gastrointestinal tract is also severely damaged. Intestinal necrosis occurs and subsequent bacterial translocation with the release of endotoxins is observed (Tamion, Richard et al. 1997). This usually leads to a significant increase in the level of inflammatory cytokines, which can enhance multiple organ dysfunction.

Поэтому существует потребность в создании терапевтического средства, которое не только позволяет эффективно лечить геморрагический шок, но и противодействуют таким угрожающим жизни проявлениям геморрагического шока, как коагулопатия и секреция воспалительных цитокинов, проницаемость эпителия кишечника для бактерий и бактериальных эндотоксинов, снижает общую смертность после значительных кровотечений, и при этом может применяться при лечении геморрагического шока в полевых условиях.Therefore, there is a need to create a therapeutic agent that can not only effectively treat hemorrhagic shock, but also counteract such life-threatening manifestations of hemorrhagic shock as coagulopathy and secretion of inflammatory cytokines, permeability of the intestinal epithelium to bacteria and bacterial endotoxins, and reduces overall mortality after significant bleeding. and it can be used in the treatment of hemorrhagic shock in the field.

SERPING1, также известный как ингибитор эстеразы С1 или С1-ингибитор, является членом семейства ингибиторов сериновых протеаз, серпинов. Посредством ингибирования C1s и C1r, субкомпонентов комплекса С1 классического пути активации (Arlaud, Reboul, Sim, & Colomb, 1979; Nilsson, Sjoholm, & Wiman, 1983; Nilsson & Wiman, 1983; RatnoffSchena et al., 1980;, 1969; Sim, Arlaud, & Colomb, 1980), SERPING1 играет ключевую роль в регуляции активности системы комплемента. SERPING1 также регулирует кинин-калликриеновую систему, ингибирует калликреин, фактор XIa и фактор XIIa (Aasen, Erichsen, Gallimore, & Amundsen, 1980; Cullmann, Kovary, Dick, Czarnetzki, & Echternach-Happle, 1982; Harpel & Cooper, 1975; Harpel, 1970; Ratnoff, 1969; Revak & Cochrane, 1976; Schapira, Scott, & Colman, 1981; van der Graaf, Koedam, & Bouma, 1983). SERPING1 опосредованно предотвращает активацию плазминогена через ингибирование калликреина и фактора XIIa, а также напрямую ингибирует плазмин в крови (Beattie, Ogston, Bennett, & Douglas, 1976; Haselager, Goote, & Vreeken, 1976), что, в свою очередь, снижает фибринолиз (Travis & Salvesen, 1983), который является ключевой особенностью поздней стадии коагулопатии при тяжелом, жизнеугрожающем геморрагическом шоке. Опосредованное SERPING1 ингибирование калликреина, в свою очередь, снижает концентрацию в плазме брадикинина, вазоактивного пептида, который увеличивает проницаемость капилляров и экстравазацию плазмы. Действуя таким образом, SERPING1 противодействует эдеме и уменьшает отек, а также снижает индуцированную геморрагическим шоком проницаемость эндотелиальной ткани (Cheng et al., 2008; Schmidt, Stenzel, Gebhard, Martin, & Schmidt, 1999). В противном случае, проницаемость эндотелия часто приводит к повреждению тканей и сепсису.SERPING1, also known as C1 esterase inhibitor or C1 inhibitor, is a member of the serine protease inhibitor family, serpins. By inhibiting C1s and C1r, subcomponents of the C1 complex of the classical activation pathway (Arlaud, Reboul, Sim, & Colomb, 1979; Nilsson, Sjoholm, & Wiman, 1983; Nilsson & Wiman, 1983; RatnoffSchena et al., 1980 ;, 1969; Sim , Arlaud, & Colomb, 1980), SERPING1 plays a key role in regulating complement system activity. SERPING1 also regulates the kinin-kallikriene system, inhibits kallikrein, factor XIa and factor XIIa (Aasen, Erichsen, Gallimore, & Amundsen, 1980; Cullmann, Kovary, Dick, Czarnetzki, & Echternach-Happle, 1982; Harpel & Cooper, 1975; , 1970; Ratnoff, 1969; Revak & Cochrane, 1976; Schapira, Scott, & Colman, 1981; van der Graaf, Koedam, & Bouma, 1983). SERPING1 indirectly prevents plasminogen activation through inhibition of kallikrein and factor XIIa, and also directly inhibits blood plasmin (Beattie, Ogston, Bennett, & Douglas, 1976; Haselager, Goote, & Vreeken, 1976), which, in turn, reduces fibrinolysis ( Travis & Salvesen, 1983), which is a key feature of the late stage of coagulopathy in severe, life-threatening hemorrhagic shock. SERPING1-mediated inhibition of kallikrein, in turn, decreases the plasma concentration of bradykinin, a vasoactive peptide that increases capillary permeability and plasma extravasation. In this way, SERPING1 counteracts edema and reduces edema, and also reduces hemorrhagic shock-induced permeability of endothelial tissue (Cheng et al., 2008; Schmidt, Stenzel, Gebhard, Martin, & Schmidt, 1999). Otherwise, endothelial permeability often leads to tissue damage and sepsis.

В модели контролируемой кровопотери у свиней, SERPING1 существенно снижал повреждения тканей почек, кишечника и легких в дозо-зависимой манере (100 и 250 МЕ/кг). Кроме того, rhSERPING1 в дозе 250 МЕ/кг заметно снизил метаболический ацидоз и уровень циркулирующего TNF-α (Dalle Lucca, Li et al. 2012).In a controlled pig blood loss model, SERPING1 significantly reduced damage to kidney, intestine, and lung tissue in a dose-dependent manner (100 and 250 IU / kg). In addition, rhSERPING1 at a dose of 250 IU / kg markedly reduced metabolic acidosis and the level of circulating TNF-α (Dalle Lucca, Li et al. 2012).

Указанные свойства С1-эстеразного ингибитора свидетельствуют о возможности его использования в заместительной терапии при ангионевротических отеках, для профилактики и лечения сепсиса, в том числе септического шока, для профилактики и лечения полиорганной дисфункции, синдрома повышенной проницаемости капилляров при сепсисе и септическом шоке, для профилактики и лечения острого респираторного дистресс-синдрома, для адъювантной терапии при атеросклеротическом поражении сосудов, для профилактики и лечения ишемического инсульта и его осложнений, острого нарушения мозгового кровообращения, профилактики и лечения шоковых состояний в операционном и послеоперационном периодах при аортокоронарном шунтировании, для предупреждения и лечения шоковых состояний при проведении транслюминальной ангиопластики, для профилактики и лечения синдрома реперфузии после аортокоронарного шунтирования и транслюминальной ангиопластики в комбинации с прямыми антикоагулянтами, для профилактики и лечения реакции отторжения при трансплантации органов и тканей (в том числе - костного мозга), для лечения или предупреждения системных ревматологических заболеваний, протекающих с активацией комплемента (системная красная волчанка, системная склеродеромия, дерматомиозит, ревматоидный артрит и т.д.), для профилактики и лечения осложнений у больных с травматологическими повреждениями различной локализации, для адъювантной терапии любых состояний, в том числе - новообразований, протекающих с активацией системы комплемента (Davis, Cai et al. 2007, Liu, Lu et al. 2007, Davis, Mejia et al. 2008, Davis, Lu et al. 2010, Vo, Zeevi et al. 2015).The indicated properties of the C1 esterase inhibitor indicate the possibility of its use in replacement therapy for angioedema, for the prevention and treatment of sepsis, including septic shock, for the prevention and treatment of multiple organ dysfunction, increased capillary permeability syndrome in sepsis and septic shock, for prevention and treatment of acute respiratory distress syndrome, for adjuvant therapy for atherosclerotic vascular lesions, for the prevention and treatment of ischemic stroke and its complications, acute cerebrovascular accident, prevention and treatment of shock conditions in the surgical and postoperative periods during coronary artery bypass grafting, to prevent and treat shock conditions during transluminal angioplasty, to prevent and treat reperfusion syndrome after coronary artery bypass grafting and transluminal angioplasty, in combination with direct for the prevention and treatment of rejection reactions during transplantation of organs and tissues (including bone marrow zga), for the treatment or prevention of systemic rheumatological diseases associated with complement activation (systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma, dermatomyositis, rheumatoid arthritis, etc.), for the prevention and treatment of complications in patients with traumatic lesions of various localization, for adjuvant therapy any conditions, including neoplasms occurring with the activation of the complement system (Davis, Cai et al. 2007, Liu, Lu et al. 2007, Davis, Mejia et al. 2008, Davis, Lu et al. 2010, Vo, Zeevi et al. 2015).

Коммерчески доступные препараты Беринерт и Синрайз, на основе ингибитора С1-эстеразы выделенного из человеческой плазмы крови, одобрены для лечения ангионевротического отека.The commercially available drugs Berynert and Synraise, based on a C1 esterase inhibitor isolated from human blood plasma, are approved for the treatment of angioedema.

Производство SERPING1 может быть осуществлено различными способами. Получение pdSERPING1 (плазменного SERPING1) путем последовательной очистки из плазмы крови человека подробно описано, например, в международной заявке WO 2001046219 или патенте RU 2256464. Также описано производство рекомбинантного человеческого SERPING1 (rhSERPING1) из молока трансгенных животных (van Veen, Koiter et al. 2012) (патент US 7067713). Кроме того, rhSERPING1 может быть произведен в различных хозяевах в культуре эукариотических клеток (как описано, например, в WO 2011116291) или в прокариотах, с использованием общепринятых в настоящее время методов генетической инженерии. При этом С1-ингибитор может быть использован как в нативной форме, так и в виде активного фрагмента, полученного рекомбинантным или иным способом, и сохраняющего функциональные способности, а также в виде мутантных форм, например, таких, как предложены в WO 2010002453.The production of SERPING1 can be carried out in various ways. The preparation of pdSERPING1 (plasma SERPING1) by sequential purification from human plasma is described in detail, for example, in international application WO 2001046219 or patent RU 2256464. The production of recombinant human SERPING1 (rhSERPING1) from the milk of transgenic animals (van Veen, Koiter et al. 2012 is also described. ) (patent US 7067713). In addition, rhSERPING1 can be produced in various hosts in a culture of eukaryotic cells (as described, for example, in WO 2011116291) or in prokaryotes using currently accepted genetic engineering methods. In this case, the C1 inhibitor can be used both in the native form and in the form of an active fragment obtained by recombinant or other methods and retaining functional abilities, as well as in the form of mutant forms, for example, such as those proposed in WO 2010002453.

В качестве антифибринолитических средств, применяемых при кровотечениях, в настоящее время используются три препарата, обладающих общими функциональными особенностями и механизмом действия. Это транексамовая, ε-аминокапроновая и аминометилбензойная кислоты.As antifibrinolytic agents used for bleeding, currently used three drugs with common functional features and mechanism of action. These are tranexamic, ε-aminocaproic and aminomethylbenzoic acids.

Транексамовая кислота является синтетическим производным аминокислоты лизина и обладает антифибринолитической активностью вследствие обратимого связывания с плазминогеном, предотвращая его взаимодействие с фибрином и, таким образом препятствует лизису фибринового сгустка. Лизиновые аминокислотные остатки белковой молекулы фибрина опосредуют связывание фибрина с лизин-связывающими сайтами молекулы плазминогена (Ferring Pharmaceuticals Inc. Lysteda (tranexamic acid) tablets: US prescribing information [online]. Available from URL: http://lysteda.com/assets/pdf/PI_FERRING2010.pdf [Accessed 2012 Feb 23], (Dunn and Goa 1999)). Транексамовая кислота связывается с высокой аффинностью (константа диссоциации [Kd]=1.1 ммоль/л) с одним из лизинсвязывающих сайтов плазминогена и с низкой аффинностью ([Kd]=1.1 ммоль/л) с другими 4 или 5 сайтами (Ferring Pharmaceuticals Inc. Lysteda (tranexamic acid) tablets: US prescribing information [online]. Available from URL: http://lysteda.com/assets/pdf/PI_FERRING2010.pdf [Accessed 2012 Feb 23]). Транексамовая кислота практически полностью блокирует связывание плазминогена или тяжелой цепи плазмина с фибрином, в основном путем связывания с высокоаффинным лизинсвязывающим сайтом плазминогена. Несмотря на то, в присутствие активатора плазминогена, такого как тканевый активатор плазминогена, плазминоген все еще может быть конвертирован в плазмин, после связывания с транексамовой кислотой он не может взаимодействовать и разрушать фибрин (Dunn and Goa 1999). Транексамовая кислота также блокирует связывание α₂-антиплазмина с плазмином и его инактивацию плазмина. Кроме ингибирования плазмина, транексамовая кислота также конкурентно ингибирует активацию трипсиногена энтерокиназой, неконкурентно ингибирует трипсин и слабо ингибирует тромбин (Dunn and Goa 1999).Tranexamic acid is a synthetic derivative of the amino acid lysine and has antifibrinolytic activity due to reversible binding to plasminogen, preventing its interaction with fibrin and, thus, prevents the lysis of the fibrin clot. The lysine amino acid residues of the fibrin protein molecule mediate the binding of fibrin to the lysine binding sites of the plasminogen molecule (Ferring Pharmaceuticals Inc. Lysteda (tranexamic acid) tablets: US prescribing information [online]. Available from URL: http://lysteda.com/assets/pdf /PI_FERRING2010.pdf [Accessed 2012 Feb 23], (Dunn and Goa 1999)). Tranexamic acid binds with high affinity (dissociation constant [Kd] = 1.1 mmol / L) to one of the lysine-binding plasminogen sites and with low affinity ([Kd] = 1.1 mmol / L) to other 4 or 5 sites (Ferring Pharmaceuticals Inc. Lysteda (tranexamic acid) tablets: US prescribing information [online]. Available from URL: http://lysteda.com/assets/pdf/PI_FERRING2010.pdf [Accessed 2012 Feb 23]). Tranexamic acid almost completely blocks the binding of plasminogen or the plasmin heavy chain to fibrin, mainly by binding to the high affinity lysine binding site of plasminogen. Despite the presence of a plasminogen activator, such as a tissue plasminogen activator, plasminogen can still be converted to plasmin, after binding to tranexamic acid it cannot interact and destroy fibrin (Dunn and Goa 1999). Tranexamic acid also blocks the binding of α ₂ antiplasmin to plasmin and its inactivation of plasmin. In addition to plasmin inhibition, tranexamic acid also competitively inhibits trypsinogen activation by enterokinase, non-competitively inhibits trypsin and weakly inhibits thrombin (Dunn and Goa 1999).

По результатам различных фибринолитических тестов, сила связывания транексамовой кислоты с плазминогеном примерно в 6-10 раз больше, чем у другого синтетического производного лизина, ε-аминокапроновой кислоты, также являющейся антифибринолитическим препаратом (Dunn and Goa 1999). Лизинсвязывающие сайты плазминогена находятся в разных, так называемых доменах kringle, которые являются областью полипептидной цепи, состоящих из бета-структур, которые стабилизируются тремя дисульфидными связями. Как транексамовая, так и ε-аминокапроновая кислоты взаимодействуют с низкоаффинным лизинсвязывающим сайтом пятого домена kringle, который, по всей видимости, нужен для начальной ассоциации плазминогена с фибрином (Dunn and Goa 1999). Высокоаффинный лизинсвязывающий первый домен kringle необходим для связывания карбокси-концевого лизинового остатка, который присутствует в фибрине только после его частичного гидролиза (Anonick, Vasudevan et al. 1992).According to the results of various fibrinolytic tests, the binding strength of tranexamic acid with plasminogen is approximately 6-10 times greater than that of another synthetic lysine derivative, ε-aminocaproic acid, which is also an antifibrinolytic drug (Dunn and Goa 1999). The lysine binding sites of plasminogen are located in different so-called kringle domains, which are a region of the polypeptide chain consisting of beta structures that are stabilized by three disulfide bonds. Both tranexamic and ε-aminocaproic acids interact with the low affinity lysine binding site of the fifth kringle domain, which is likely to be needed for the initial association of plasminogen with fibrin (Dunn and Goa 1999). The high affinity lysine-binding first kringle domain is necessary for binding to the carboxy-terminal lysine residue, which is present in fibrin only after partial hydrolysis of it (Anonick, Vasudevan et al. 1992).

Аминометилбензойная кислота («Амбен») по механизму действия близка к ε-аминокапроновой кислоте; угнетает фибринолиз путем конкурентного торможения плазминогенактивирующего фермента и угнетения образования плазмина (Реестр лекарственных средств РФ http://ww.rlsnet.ru/mnn_index_id_342.htm. (Langenbach 2006)). По сравнению с ε-аминокапроновой кислотой аминометилбензойная кислота более активна, но в два раза менее активна, чем транексамовая кислота (DOBROKHOTOVA, DZHOBAVA et al. 2013) (Verstraete 1985).Aminomethylbenzoic acid ("Amben") by the mechanism of action is close to ε-aminocaproic acid; inhibits fibrinolysis by competitive inhibition of plasminogen-activating enzyme and inhibition of plasmin formation (Russian Drug Register http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_342.htm. (Langenbach 2006)). Compared to ε-aminocaproic acid, aminomethylbenzoic acid is more active, but half as active as tranexamic acid (DOBROKHOTOVA, DZHOBAVA et al. 2013) (Verstraete 1985).

Таким образом, все три препарата оказывают сходное фармакологическое действие, являются синтетическими аналогами аминокислот, действуют по одному механизму, насыщая лизинсвязывающие сайты плазминогена, и имеют общие показания к применению и пути элиминации. Общим недостатком указанных препаратов является возможность появления тромбозов и тромбоэмболических заболеваний при их применении.Thus, all three drugs have a similar pharmacological effect, are synthetic analogues of amino acids, act according to one mechanism, saturating the lysine-binding sites of plasminogen, and have common indications for use and elimination routes. A common drawback of these drugs is the possibility of thrombosis and thromboembolic diseases during their use.

Наиболее эффективным средством лечения геморрагического шока для применения в условиях, когда стационарные медицинские учреждения недоступны, в настоящее время является транексамовая кислота.Tranexamic acid is currently the most effective treatment for hemorrhagic shock for use in conditions where inpatient medical facilities are unavailable.

Транексамовая кислота значительно снижает общую смертность и смерть из-за кровотечения у пациентов с сильными кровотечениями, вызванными травмами, особенно при введении в ранние сроки после травмы (collaborators, Shakur et al. 2010, collaborators, Roberts et al. 2011, Ker, Kiriya et al. 2012, Roberts, Prieto-Merino et al. 2014). Транексамовая кислота в настоящее время используется как препарат выбора военными медиками в США и Великобритании для лечения тяжелых боевых травм и кровотечений.Tranexamic acid significantly reduces overall mortality and bleeding death in patients with severe bleeding caused by trauma, especially when administered early after the injury (collaborators, Shakur et al. 2010, collaborators, Roberts et al. 2011, Ker, Kiriya et al. 2012, Roberts, Prieto-Merino et al. 2014). Tranexamic acid is currently used as a drug of choice by military doctors in the US and the UK to treat severe war injuries and bleeding.

В США FDA (US Food and Drug Administration) транексамовая кислота также одобрена для перорального введения женщинам с тяжелыми менструальными кровотечениями и внутривенно для профилактики стоматологических кровотечений у пациентов с гемофилией. Однако транексамовая кислота часто используется не по прямому назначению, чтобы уменьшить кровотечение, вызванное различными причинами, в том числе травмой и хирургическими вмешательствами.In the United States, the FDA (US Food and Drug Administration) has also approved tranexamic acid for oral administration to women with severe menstrual bleeding and intravenously for the prevention of dental bleeding in patients with hemophilia. However, tranexamic acid is often used inappropriately to reduce bleeding caused by various causes, including trauma and surgical interventions.

В РФ применение транексамовой кислоты одобрено по следующим показаниям: кровотечения или риск кровотечений на фоне усиления фибринолиза (злокачественные новообразования поджелудочной и предстательной желез, операции на органах грудной клетки, послеродовые кровотечения, ручное отделение последа, лейкоз, заболевания печени, предшествующая терапия стрептокиназой - случаи генерализованного фибринолиза; маточные, носовые, желудочно-кишечные кровотечения, гематурия, кровотечения после простатэктомии, конизации шейки матки по поводу карциномы, экстракции зуба у больных с геморрагическим диатезом - случаи местного фибринолиза), наследственный ангионевротический отек, аллергические заболевания (экзема, аллергические дерматиты, крапивница, лекарственная и токсическая сыпь), воспалительные заболевания (тонзиллит, фарингит, ларингит, стоматит, афты слизистой оболочки полости рта) (http://medi.ru/doc/x0937.htm).In Russia, the use of tranexamic acid is approved for the following reasons: bleeding or the risk of bleeding due to increased fibrinolysis (malignant neoplasms of the pancreas and prostate gland, operations on the organs of the chest, postpartum hemorrhage, manual separation of the placenta, leukemia, liver disease, previous streptokinase therapy - cases of generalized fibrinolysis; uterine, nasal, gastrointestinal bleeding, hematuria, bleeding after prostatectomy, conization of the cervix due to carcinoma foreignomas, tooth extractions in patients with hemorrhagic diathesis - cases of local fibrinolysis), hereditary angioedema, allergic diseases (eczema, allergic dermatitis, urticaria, drug and toxic rash), inflammatory diseases (tonsillitis, pharyngitis, laryngitis, stomatitis, aphthous mucosa mouth) (http://medi.ru/doc/x0937.htm).

Крупное рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое, многонациональное клиническое испытание CRASH-2 (Clinical Randomization of an Antifibrinolytic in Significant Hemorrhage 2 - клиническая рандомизации антифибринолитика при значительном кровотечении) оценивало эффективность раннего использования транексамовой кислоты на взрослых пациентах с травмой (collaborators, Shakur et al. 2010). Исходя из результатов данного исследования, транексамовая кислота существенно снижала смертность по всем причинам в течение 4 недель (первичная конечная точка испытания) и риск смерти вследствие кровотечения. Смертность по всем причинам в группе плацебо составляла 16%, тогда как в группе с применением транексамовой кислоты - 14,5%. Смертность в результате кровотечения в группе плацебо составляла 5,7%, а в группе с применением транексамовой кислоты - 4,9%.A large randomized, double-blind, placebo-controlled, multinational clinical trial CRASH-2 (Clinical Randomization of an Antifibrinolytic in Significant Hemorrhage 2 - Clinical Randomization of Antifibrinolytic with Significant Bleeding) evaluated the effectiveness of the early use of tranexamic acid in adult patients with Shakur etiology, al. 2010). Based on the results of this study, tranexamic acid significantly reduced mortality for all reasons within 4 weeks (primary endpoint of the trial) and the risk of death due to bleeding. For all reasons, mortality in the placebo group was 16%, while in the group with tranexamic acid - 14.5%. The mortality due to bleeding in the placebo group was 5.7%, and in the group using tranexamic acid - 4.9%.

Вторичный анализ CRASH-2 (Roberts, Prieto-Merino et al. 2014), сфокусированный на механизме действия транексамовой кислоты у пациентов с кровотечением, позволил сделать заключение о том, что наибольший эффект транексамовая кислота оказывает на снижение смертности в первый день после травмы. Транексамовая кислота, будучи примененной в первые 3 часа после травмы, снижает общую смертность в первый день и увеличивает последующее выживание на 20%.A secondary CRASH-2 analysis (Roberts, Prieto-Merino et al. 2014), focused on the mechanism of action of tranexamic acid in patients with bleeding, concluded that tranexamic acid has the greatest effect on reducing mortality on the first day after an injury. Tranexamic acid, applied in the first 3 hours after injury, reduces overall mortality on the first day and increases subsequent survival by 20%.

Тем не менее, несмотря на значительное количество проведенных исследований, до сих пор никто не изучал применение транексамовой кислоты в комбинации с С1-ингибитором.However, despite the significant amount of research conducted, so far no one has studied the use of tranexamic acid in combination with a C1 inhibitor.

К недостаткам известных средств относится недостаточное снижение смертности, нежелательные побочные эффекты, вызванные реперфузией при применении стандартной инфузионно-трансфузионной терапии, характеризующиеся ранней активацией нейтрофилов и формированием свободных радикалов (Ioannou, Dalle Lucca et al. 2011). Секреция протеолитических ферментов, продуцируемых нейтрофилами, может приводить к дальнейшему повреждению тканей. Более того, образующиеся кислородные радикалы играют существенную роль в повреждении эндотелия после реперфузии и могут приводить к удлинению периода лечения раны. Широкое применение SERPING1, полученного из плазмы крови человека, осложняется его высокой стоимостью.The disadvantages of the known drugs include insufficient mortality, undesirable side effects caused by reperfusion using standard infusion-transfusion therapy, characterized by early activation of neutrophils and the formation of free radicals (Ioannou, Dalle Lucca et al. 2011). Secretion of proteolytic enzymes produced by neutrophils can lead to further tissue damage. Moreover, the formed oxygen radicals play a significant role in damage to the endothelium after reperfusion and can lead to an extended period of wound treatment. The widespread use of SERPING1 obtained from human blood plasma is complicated by its high cost.

Таким образом, сохраняется потребность в эффективных средствах лечения геморрагического шока и сопровождающих его явлений. В настоящее время отсутствует разработанный метод, включающий в себя совместное применение антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты, и полипептида, обладающего активностью SERPING1, для терапии геморрагического шока. Насколько известно авторам изобретения, не опубликовано ни одного примера, доказывающих повышенную эффективность подобной комбинации или просто показывающих совместное использование антифибринолитика из группы аминокислот и SERPING1 для терапии геморрагического шока.Thus, there remains a need for effective means of treating hemorrhagic shock and the phenomena accompanying it. Currently, there is no developed method that includes the combined use of an antifibrinolytic selected from the group consisting of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid and a polypeptide having SERPING1 activity for the treatment of hemorrhagic shock. As far as the authors of the invention know, not a single example has been published proving the increased effectiveness of such a combination or simply showing the joint use of an antifibrinolytic from the amino acid group and SERPING1 for the treatment of hemorrhagic shock.

Техническим результатом настоящего изобретения является расширение арсенала средств для лечения геморрагического шока посредством создания комбинации, включающей терапевтически эффективные количества полипептида, обладающего активностью SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты или их аналоги.The technical result of the present invention is to expand the arsenal of agents for treating hemorrhagic shock by creating a combination comprising therapeutically effective amounts of a polypeptide having SERPING1 activity and an antifibrinolytic selected from the group consisting of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid or their analogues.

Указанная комбинация также позволяет предотвратить развитие или снизить остроту таких нежелательных явлений, непосредственно связанных с геморрагическим шоком, как коагулопатия, воспаление, отек, повреждение тканей, в частности эпителия кишечника, и связанную с этим транслокацию бактерий и бактериальных эндотоксинов. Заявленный способ позволяет проводить лечение геморрагического шока и сильных кровотечений в экстренных ситуациях и условиях, когда пациент не может быть доставлен в стационарное лечебное учреждение, то есть когда доступна только инфузионная терапия на основе кристаллоидов, коллоидов и другие инъекционные медикаменты, но не переливание донорской крови или комбинации эритроцитарной массы, свежезамороженной плазмы крови и тромбоцитов в условиях высококвалифицированной медицинской помощи.This combination also allows you to prevent the development or reduce the severity of such adverse events that are directly associated with hemorrhagic shock, such as coagulopathy, inflammation, edema, tissue damage, in particular the intestinal epithelium, and the associated translocation of bacteria and bacterial endotoxins. The claimed method allows the treatment of hemorrhagic shock and severe bleeding in emergency situations and when the patient cannot be taken to a hospital, that is, when only infusion therapy based on crystalloids, colloids and other injectable medications is available, but not blood transfusion or a combination of red blood cells, freshly frozen blood plasma and platelets in a highly qualified medical care.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Заявители впервые обнаружили, что комбинированное применение полипептида, обладающего активностью SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты или их аналоги, обеспечивает синергетический эффект, за счет которого улучшается выживаемость млекопитающих в условиях геморрагического шока.Applicants first discovered that the combined use of a polypeptide having SERPING1 activity and an antifibrinolytic selected from the group consisting of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid or their analogues provides a synergistic effect, which improves the survival of mammals in hemorrhagic shock.

В настоящем изобретении предложена комбинация, состоящая из терапевтически эффективных количеств полипептида, обладающего активностью SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты или их аналогов, применение данной комбинации для лечения геморрагического шока, а также способы лечения геморрагического шока с использованием данной комбинации и наборы для лечения, содержащие указанную комбинацию.The present invention provides a combination of therapeutically effective amounts of a polypeptide having SERPING1 activity and an antifibrinolytic selected from the group consisting of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid or their analogues, the use of this combination for the treatment of hemorrhagic shock, and methods for treating hemorrhagic shock using this combination and treatment kits containing the specified combination.

В соответствии с представленным изобретением, термин «полипептид, обладающий активностью SEPRING1» (далее SEPRING1 или C1INH) относится к белкам или их фрагментам, функционирующим как ингибиторы сериновых протеаз и ингибирующих протеазы, связанные с системой комплемента, предпочтительно протеазы C1r и C1s, а также протеазы MASP-1 и MASP-2, связанные с калликреин-кининовой системой, предпочтительно плазменный калликреин и фактор XIIa, и протеазы связанные системой свертывания крови, предпочтительно фактор XIa. В настоящем изобретении «полипептид, обладающий активностью SEPRING1» может представлять собой С1-ингибитор как в нативной форме, так и в виде функционально активного фрагмента, или полипептида, содержащего мутации, и при этом сохраняющего функциональную активность.In accordance with the present invention, the term "polypeptide having SEPRING1 activity" (hereinafter SEPRING1 or C1INH) refers to proteins or fragments thereof that function as serine protease inhibitors and protease inhibitors associated with the complement system, preferably C1r and C1s proteases, as well as proteases MASP-1 and MASP-2 associated with the kallikrein-kinin system, preferably plasma kallikrein and factor XIIa, and proteases associated with the blood coagulation system, preferably factor XIa. In the present invention, a “polypeptide having SEPRING1 activity” can be a C1 inhibitor both in native form and in the form of a functionally active fragment, or a polypeptide containing mutations, while retaining functional activity.

В соответствии с представленным изобретением, в одном из вариантов SEPRING1 может быть модифицирован для улучшения биодоступности и/или периода полувыведения, для улучшения эффективности и/или снижения потенциальных побочных эффектов. Такие модификации могут быть выполнены рекомбинантным способом, химическим конъюгированием или другими известными специалисту в данной области способами. Примерами подобных модификаций могут быть гликозилирование, гибридный (химерный) белок, где С1-ингибитор слит с другим белком или полипептидом, таким, как например, альбумин или Fc-фрагмент иммуноглобулина. То есть, речь идет о таких производных, которые сохраняют активность на уровне исходного белка. Примеры возможных модификаций описаны, например, в ЕР 1984503, US 20130108629.In accordance with the present invention, in one embodiment, SEPRING1 may be modified to improve bioavailability and / or half-life, to improve efficacy and / or reduce potential side effects. Such modifications can be made by recombinant methods, chemical conjugation, or other methods known to the person skilled in the art. Examples of such modifications can be glycosylation, a hybrid (chimeric) protein, where the C1 inhibitor is fused to another protein or polypeptide, such as, for example, albumin or an immunoglobulin Fc fragment. That is, we are talking about such derivatives that retain activity at the level of the original protein. Examples of possible modifications are described, for example, in EP 1984503, US 20130108629.

Как понятно специалистам в данной области, любая форма SERPING1, которая сохраняет активность SERPING1, может быть использована в соответствии с настоящим изобретением.As understood by those skilled in the art, any form of SERPING1 that retains the activity of SERPING1 can be used in accordance with the present invention.

Предпочтительно, терапевтически эффективное количество SERPING1 включает в себя дозировку от примерно 10 до примерно 900 ME/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 80 до около 280 ME на кг массы тела.Preferably, the therapeutically effective amount of SERPING1 includes a dosage of from about 10 to about 900 ME / kg body weight of an animal or human, and most preferably from about 80 to about 280 ME per kg body weight.

Предпочтительно терапевтически эффективное количество антифибринолитика составляет от примерно 0,005 до 0,5 г/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 0,01 г до 0,05 г/кг массы тела. Наиболее предпочтительно использование в качестве антифибринолитика транексамовой кислоты.Preferably, a therapeutically effective amount of an antifibrinolytic is from about 0.005 to 0.5 g / kg body weight of an animal or human, and most preferably from about 0.01 g to 0.05 g / kg of body weight. Most preferably, tranexamic acid is used as an antifibrinolytic.

Комбинация может быть выполнена в виде фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективные количества SERPING1 и антифибринолитика, а также фармацевтически приемлемые добавки, разбавители, растворители, обычно используемые в фармацевтической химии.The combination may be in the form of a pharmaceutical composition comprising therapeutically effective amounts of SERPING1 and antifibrinolytic, as well as pharmaceutically acceptable additives, diluents, solvents commonly used in pharmaceutical chemistry.

Например, в качестве добавок могут применяться стабилизаторы, антиоксиданты, буферные агенты, наполнители, как это показано, например, в «Handbook of Pharmaceutical Excipients» (Rowe, Sheskey et al. 2012). Стандартные методы фармацевтических формуляций известны специалистам в данной области (Remington 1995).For example, stabilizers, antioxidants, buffering agents, and excipients can be used as additives, as shown, for example, in the Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe, Sheskey et al. 2012). Standard pharmaceutical formulation methods are known to those skilled in the art (Remington 1995).

В одном из вариантов фармацевтическая комбинация представляет собой раствор для внутривенного введения, содержащий терапевтически эффективные количества SERPING1 и транексамовой кислоты.In one embodiment, the pharmaceutical combination is an intravenous solution containing therapeutically effective amounts of SERPING1 and tranexamic acid.

В другом варианте фармацевтическая комбинация представляет собой раствор для внутривенного введения, содержащий терапевтически эффективные количества SERPING1 и аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты.In another embodiment, the pharmaceutical combination is an intravenous solution containing therapeutically effective amounts of SERPING1 and aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid.

В качестве дополнительных компонентов композиции могут содержать такие добавки как маннитол, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. В определенных вариантах фармацевтическая комбинация может содержать стабилизирующие рН буферные агенты, такие как цитрат или фосфат натрия, увлажнители и эмульгаторы, такие как полисорбат или плюроник. В определенных вариантах фармацевтическая комбинация может содержать стабилизаторы, такие как гистидин, аргинин, или консерванты, такие как бензиновый спирт, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или альфа-токоферол, технологические вспомогательные вещества, красители, разбавители, такие как физиологический раствор (0,9% хлорид натрия) и другие известные добавки.As additional components, the compositions may contain such additives as mannitol, starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, sodium chloride, glycerin, propylene, glycol, water, ethanol and the like. In certain embodiments, the pharmaceutical combination may contain pH stabilizing buffering agents, such as sodium citrate or phosphate, humectants, and emulsifiers, such as polysorbate or pluronic. In certain embodiments, the pharmaceutical combination may contain stabilizers, such as histidine, arginine, or preservatives, such as gasoline alcohol, antioxidants, such as ascorbic acid or alpha-tocopherol, processing aids, colorants, diluents, such as saline (0.9 % sodium chloride) and other known additives.

В одном из вариантов фармацевтические комбинации по изобретению могут быть приготовлены в виде композиции путем смешивания растворов транексамовой и/или аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты и SERPING1 при подходящем рН, с физиологически приемлемыми носителями. рН композиции может варьировать от примерно 6 до примерно 8. Композиции готовят, дозируют и вводят в соответствии с принципами надлежащей медицинской практики. Учитываемые факторы в связи с этим включают конкретное расстройство и клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, способ введения, режим введения и другие факторы, известные практикующим врачам.In one embodiment, the pharmaceutical combinations of the invention can be formulated by mixing solutions of tranexamic and / or aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid and SERPING1 at a suitable pH with physiologically acceptable carriers. The pH of the composition may vary from about 6 to about 8. The compositions are prepared, dosed and administered in accordance with the principles of good medical practice. Considered factors in this regard include the specific disorder and clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, route of administration, route of administration, and other factors known to practicing physicians.

В качестве примера, композиция для внутривенного введения может быть приготовлена путем растворения соединений по изобретению в подходящем буферном растворе, например, в натрий-фосфатном буфере с рН 6,5-7,5, добавления регулятора осмолярности, например, хлорида натрия, а также маннита в качестве стабилизатора. Полученный раствор может быть профильтрован с использованием, например, фильтра 0,22 микрон для удаления примесей и загрязнений. Полученный раствор может использоваться как таковой или быть подвергнут лиофилизации с использованием стандартных методов.As an example, an intravenous composition can be prepared by dissolving the compounds of the invention in a suitable buffer solution, for example, in sodium phosphate buffer at pH 6.5-7.5, adding an osmolarity regulator, for example sodium chloride, as well as mannitol as a stabilizer. The resulting solution can be filtered using, for example, a 0.22 micron filter to remove impurities and contaminants. The resulting solution can be used as such or lyophilized using standard methods.

Фармацевтическая композиция для применения может быть упакована множеством различных способов в зависимости от того, предназначена ли она для проведения экстренных мероприятий в амбулаторных или полевых условиях. Как правило, изделие для отпуска включает в себя набор, содержащий контейнер с помещенной в него фармацевтической композицией в подходящей форме и контейнер с растворителем. Подходящие контейнеры известны специалистам в данной области и включают флаконы (пластиковые и стеклянные), ампулы и т.п. Контейнер может также иметь устойчивое к внешним воздействиям приспособление для предотвращения неосторожного доступа к содержимому упаковки. Дополнительно, контейнер имеет закрепленную на нем этикетку, на которой описано содержимое контейнера. Этикетка может также содержать соответствующие предостережения.The pharmaceutical composition for use can be packaged in a variety of different ways, depending on whether it is intended for emergency events on an outpatient or field basis. Typically, a holiday product includes a kit comprising a container containing the pharmaceutical composition in a suitable form and a container with a solvent. Suitable containers are known to those skilled in the art and include vials (plastic and glass), ampoules, and the like. The container may also have a device resistant to external influences to prevent careless access to the contents of the package. Additionally, the container has a label attached to it that describes the contents of the container. The label may also contain appropriate warnings.

Предпочтительно фармацевтическая комбинация представляет собой набор, состоящий из фармацевтической композиции, включающей лиофилизат С1-ингибитора в смеси с порошком транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты и необходимыми фармацевтически приемлемыми добавками, в комплекте с растворителем или разбавителем. Наиболее предпочтительно использование транексамовой кислоты.Preferably, the pharmaceutical combination is a kit consisting of a pharmaceutical composition comprising a C1 inhibitor lyophilisate mixed with tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid powder and the necessary pharmaceutically acceptable additives, complete with a solvent or diluent. Most preferably, tranexamic acid is used.

Примером лиофилизата С1-ингибитора может быть лиофилизат раствора, состоящего из следующих компонентов: 20-40 мг/мл С1-ингибитора; 40-60 мг/мл трегалозы; 2-10 мг/мл NaCl; 1,78 мг/мл Na₂HPO₄; 1,38 мг/мл NaH₂PO₄, рН 6,8. Примером растворителя может быть вода для инъекций, а примерами разбавителя - 0,9% раствор хлорида натрия или раствор Рингера.An example of a C1 inhibitor lyophilisate can be a lyophilisate solution consisting of the following components: 20-40 mg / ml C1 inhibitor; 40-60 mg / ml trehalose; 2-10 mg / ml NaCl; 1.78 mg / ml Na ₂ HPO ₄ ; 1.38 mg / ml NaH ₂ PO ₄ , pH 6.8. An example of a solvent can be water for injection, and examples of a diluent are a 0.9% sodium chloride solution or Ringer's solution.

Другой предпочтительный вариант комбинации представляет собой набор, состоящий из фармацевтической композиции, включающей лиофилизат С1-ингибитора в комплекте с раствором транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты, где оба компонента набора также могут содержать фармацевтически приемлемые добавки. Например, лиофилизат С1-ингибитора может быть получен любым стандартным способом из раствора, содержащего 20-40 мг/мл С1-ингибитора; 40-60 мг/мл трегалозы; 2-10 мг/мл NaCl; 15-30 мМ Na₃PO₄, рН 6,8. Аминокислота, такая как транексамовая, аминометилбензойная и/или ε-аминокапроновая, может быть использована в качестве раствора в воде для инъекций с концентрацией от 10 до 150 мг/мл. Предпочтительно, 50-100 мг/мл. После растворения лиофилизата С1-ингибитора в растворе соответствующей кислоты, композиция может быть дополнительно разбавлена 0,9% раствором хлорида натрия или раствором Рингера.Another preferred combination option is a kit consisting of a pharmaceutical composition comprising a C1 inhibitor lyophilisate complete with a solution of tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid, where both components of the kit may also contain pharmaceutically acceptable additives. For example, a C1 inhibitor lyophilisate can be obtained by any standard method from a solution containing 20-40 mg / ml C1 inhibitor; 40-60 mg / ml trehalose; 2-10 mg / ml NaCl; 15-30 mm Na ₃ PO ₄ , pH 6.8. An amino acid, such as tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic, can be used as a solution in water for injection with a concentration of from 10 to 150 mg / ml. Preferably, 50-100 mg / ml. After the lyophilisate of the C1 inhibitor is dissolved in a solution of the corresponding acid, the composition can be further diluted with 0.9% sodium chloride solution or Ringer's solution.

В некоторых случаях комбинация может быть представлена в виде набора для последовательного введения, содержащего флакон с раствором транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты и флакон с раствором С1-ингибитора, где оба компонента набора присутствуют в эффективных количествах, указанных выше, а также могут содержать фармацевтически приемлемые добавки.In some cases, the combination may be presented in the form of a kit for sequential administration containing a vial with a solution of tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid and a vial with a solution of C1-inhibitor, where both components of the kit are present in effective amounts indicated above, and may contain pharmaceutically acceptable additives.

Формы, содержащие лиофилизат, являются предпочтительными для использования в сложных полевых условиях, т.к. потенциально обладают максимальным сроком хранения в сравнений с комбинацией в форме раствора/растворов для введения, которая, несмотря на большее удобство в применении, как правило, требует более строгих условий для хранения.Forms containing lyophilisate are preferred for use in difficult field conditions, as potentially have a maximum shelf life in comparison with the combination in the form of a solution / solutions for administration, which, despite being more convenient to use, usually requires more stringent storage conditions.

Одним из основных преимуществ предложенной комбинации является удобство одновременного использования двух активных компонентов, обладающих синергетическим действием в случае одновременного введения пациенту, то есть имеющими больший терапевтический эффект, выражающийся в снижении риска смерти в результате геморрагического шока, чем каждый из них по отдельности или если бы они были введены тому же пациенту, но с существенной (в несколько часов) разницей во времени. Важно отметить, что данная комбинация позволяет сохранять активные компоненты в течение длительного срока годности в недостаточно контролируемых условиях хранения. Более того, данная комбинация заранее включает в себя максимальную терапевтически эффективную и безопасную дозировку обоих компонентов, что позволяет снизить риск врачебной ошибки, связанной с дозировкой.One of the main advantages of the proposed combination is the convenience of the simultaneous use of two active components that have a synergistic effect in case of simultaneous administration to the patient, that is, have a greater therapeutic effect, manifested in a lower risk of death due to hemorrhagic shock than each of them individually or if they were introduced to the same patient, but with a significant (several hours) time difference. It is important to note that this combination allows you to save the active components for a long shelf life in insufficiently controlled storage conditions. Moreover, this combination in advance includes the maximum therapeutically effective and safe dosage of both components, which reduces the risk of medical error associated with the dosage.

Указанная комбинация может применяться для введения пациентам с геморрагическим шоком, а также для лечения кровотечений, потенциально могущих привести к геморрагическому шоку.This combination can be used for administration to patients with hemorrhagic shock, as well as for the treatment of bleeding, which could potentially lead to hemorrhagic shock.

В соответствии с настоящим изобретением, SERPING1 или его аналоги, или производные, такие как химерные или слитые белки, или его функционально активный фрагмент в сочетании с антифибринолитиком, выбранном из транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты, вводят пациентам, после появления симптомов, связанных с геморрагическим шоком.In accordance with the present invention, SERPING1 or its analogues or derivatives, such as chimeric or fusion proteins, or a functionally active fragment thereof, in combination with an antifibrinolytic selected from tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid, is administered to patients after the onset of symptoms associated with hemorrhagic shock.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения геморрагического шока, который позволяет снизить риск смерти, включающий в себя введение млекопитающему (животному или человеку), испытывающему шок, комбинации терапевтически эффективных количеств SERPING1 и транексамовой кислоты. В другом варианте, млекопитающему, испытывающему шок, вводят комбинацию терапевтически эффективных количеств SERPING1 и аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты.Another object of the present invention is a method of treating hemorrhagic shock, which allows to reduce the risk of death, including the introduction of a mammal (animal or human), experiencing shock, a combination of therapeutically effective amounts of SERPING1 and tranexamic acid. In another embodiment, a mammal experiencing a shock is administered a combination of therapeutically effective amounts of SERPING1 and aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid.

Введение может осуществляться посредством внутривенного введения путем трансфузии, вместе с кристаллоидными растворами в ходе стандартной терапии для замещения объема кровопотери, а также болюсным способом путем внутривенной инъекции.Administration can be carried out by intravenous administration by transfusion, together with crystalloid solutions during standard therapy to replace the volume of blood loss, as well as by a bolus method by intravenous injection.

В наиболее предпочтительном варианте способ предусматривает одновременное введение SERPING1 и транексамовой кислоты в виде раствора для инъекций.In a most preferred embodiment, the method provides for the simultaneous administration of SERPING1 and tranexamic acid in the form of an injection.

Однако, допустимо последовательное введение указанных препаратов в течение короткого промежутка времени в пределах 1 часа. Предпочтительно, интервал между введением препаратов составляет 0-30 минут.However, sequential administration of these drugs over a short period of time within 1 hour is acceptable. Preferably, the interval between drug administration is 0-30 minutes.

Предпочтительно, терапевтически эффективное количество SERPING1, вводимое пациенту, включает в себя дозировку от примерно 10 до примерно 900 МЕ/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 80 до около 280 МЕ/кг массы тела. Предпочтительно терапевтически эффективное количество транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты составляет от примерно 0,005 до 0,5 г/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 0,01 г до 0,05 г/кг массы тела.Preferably, a therapeutically effective amount of SERPING1 administered to a patient includes a dosage of from about 10 to about 900 IU / kg body weight of an animal or human, and most preferably from about 80 to about 280 IU / kg body weight. Preferably, the therapeutically effective amount of tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid is from about 0.005 to 0.5 g / kg body weight of an animal or human, and most preferably from about 0.01 g to 0.05 g / kg of body weight.

Авторы настоящего изобретения впервые показали, что комбинированное применение SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты имеет значительно более сильный защитный эффект при геморрагическом шоке и острой массивной кровопотере, чем SERPING1 или один из упомянутых антифибринолитиков, например, транексамовая кислота, используемые по отдельности. Комбинированное применение SERPING1 и транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты улучшает выживаемость при геморрагическом шоке путем нормализации гемостаза (препятствуя развитию коагулопатии), путем противодействия воспалению, предотвращения повреждения тканей, минимизации шока, а также минимизации связанной с геморрагическим шоком транслокации из кишечника бактерий и бактериальных эндотоксинов.The inventors of the present invention first showed that the combined use of SERPING1 and an antifibrinolytic selected from tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid has a significantly stronger protective effect in hemorrhagic shock and acute massive blood loss than SERPING1 or one of the mentioned antifibrinolytics, for example, tranexamic acid used individually. The combined use of SERPING1 and tranexamic, aminomethylbenzoic and / or ε-aminocaproic acid improves survival in hemorrhagic shock by normalizing hemostasis (preventing the development of coagulopathy), counteracting inflammation, preventing tissue damage, minimizing shock, and minimizing intestinal translocation-related hemorrhagic shock and bacterial endotoxins.

В подтверждение вышеизложенного авторы показали, что заявленная комбинация существенно более эффективна в повышении выживаемости опытных животных в модели острой кровопотери и геморрагического шока, чем стандартная инфузионная терапия кристаллоидами или каждый из активных компонентов комбинации по отдельности. Также авторы показали, что одним из возможных механизмов действия заявленной комбинации может быть подавление связанного с коагулопатией гиперфибринолиза, на модели вторичного фибринолиза in vitro. Далее, авторы продемонстрировали, на модели отека in vivo и индуцированного эндотоксинами выброса цитокинов ex vivo/in vitro, что дополнительным преимуществом данной терапии может быть противодействие SERPING1 воспалительному процессу, проницаемости сосудов и цитокиновому шторму. Наконец, авторы показали, что в модели геморрагического шока in vivo, на крысах, заявленная комбинация эффективно противодействует разрушению эпителия кишечника, что, как следствие, приводит к снижению риска транслокации бактерий и их токсинов и наступлению септического шока.In support of the foregoing, the authors showed that the claimed combination is significantly more effective in improving the survival of experimental animals in the model of acute blood loss and hemorrhagic shock than standard infusion therapy with crystalloids or each of the active components of the combination separately. The authors also showed that one of the possible mechanisms of action of the claimed combination may be the suppression of coagulopathy-related hyperfibrinolysis in an in vitro model of secondary fibrinolysis. Further, the authors demonstrated, in a model of in vivo edema and endotoxin-induced ex vivo / in vitro cytokine release, that an additional advantage of this therapy can be the counteraction of SERPING1 to the inflammatory process, vascular permeability and the cytokine storm. Finally, the authors showed that in the in vivo model of hemorrhagic shock in rats, the claimed combination effectively counteracts the destruction of the intestinal epithelium, which, as a result, reduces the risk of translocation of bacteria and their toxins and the onset of septic shock.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг. 1. Воздействие rhSERPING1 на выброс воспалительных цитокинов в модели ex vivo/in vitro на цельной крови. Гистограмма отражает общее количество (AUG, пг/мл за 24 часа) ИЛ-6 (А) или ИЛ-1 β (В), выброшенное за 24 часа после индукции с помощью ЛПС (ЛПС - бактериальные полисахариды); rhC1INH_23-500-зрелый полноразмерный rhSERPING1, аминокислотные остатки 23-500; C1INH_120-500 - усеченный по амино-концу rhSERPING1, содержащий серпиновый домен, аминокислотные остатки 120-500; rhC1INH_23-122 - усеченный по карбокси-концу rhSERPING1, без серпинового домена, аминокислотные остатки 23-122; rhC1INH_465ART/VKV - rhSERPING1 с мутациями в активном центре (аминокислотные остатки 465-467 Ala-Arg-Thr заменены на Val-Lys-Val), что привело к потери активности ингибитора сериновых протеаз; ЧСА - очищенный человеческий сывороточный альбумин.FIG. 1. The effect of rhSERPING1 on the release of inflammatory cytokines in an ex vivo / in vitro model on whole blood. The histogram reflects the total amount (AUG, pg / ml over 24 hours) of IL-6 (A) or IL-1 β (B) ejected 24 hours after induction with LPS (LPS - bacterial polysaccharides); rhC1INH _23-500 mature full-length rhSERPING1, amino acid residues 23-500; C1INH _120-500 - truncated at the amino end of rhSERPING1, containing a serpine domain, amino acid residues 120-500; rhC1INH _23-122 - truncated at the carboxy terminus of rhSERPING1, without a serpin domain, amino acid residues 23-122; rhC1INH _{465ART / VKV} - rhSERPING1 with mutations in the active center (amino acid residues 465-467 Ala-Arg-Thr replaced by Val-Lys-Val), which led to a loss of activity of the serine protease inhibitor; HSA is purified human serum albumin.

Фиг. 2. Уменьшение отека лапы мыши, индуцированного каррагинаном, под воздействием rhSERPING1. Капиллярный кровоток в месте отека измеряли методом лазер-Допплеровской флоуметрии. Ось Y - 100% нормальный кровоток в здоровой лапе.FIG. 2. Reduction of mouse paw edema induced by carrageenan by rhSERPING1. Capillary blood flow at the site of edema was measured by laser-Doppler flowmetry. Y axis - 100% normal blood flow in a healthy paw.

Фиг. 3. График выживаемости Каплана-Маейра для каждой экспериментальной группы: контроль - геморрагический шок без вмешательства (без инфузионной терапии); Раствор Рингера - инфузионная терапия раствором Рингера для компенсации гиповолемии; C1INH - rhSERPING1 (168 МЕ/кг); ТХА - транексамовая кислота (0,15 г/кг). Все крысы, прожившие 14 часов после геморрагического шока, были живы к 72 часам после геморрагического шока (время эвтаназии).FIG. 3. Kaplan-Mayer survival chart for each experimental group: control — hemorrhagic shock without intervention (without infusion therapy); Ringer's solution - infusion therapy with Ringer's solution to compensate for hypovolemia; C1INH - rhSERPING1 (168 IU / kg); TXA - tranexamic acid (0.15 g / kg). All rats that lived 14 hours after hemorrhagic shock were alive by 72 hours after hemorrhagic shock (euthanasia time).

Фиг. 4. (А) Гистограмма выживания животных в каждой из экспериментальных групп геморрагического шока (группы приведены, как показано на Фиг. 3) через 72 ч после геморрагического шока. (В) Выживание животных на 72 часа после геморрагического шока, которым ввели комбинацию rhSERPING1 (C1INH) и транексамовой кислоты, зависит от дозы rhSERPING.FIG. 4. (A) A histogram of the survival of animals in each of the experimental groups of hemorrhagic shock (groups are shown as shown in Fig. 3) 72 hours after hemorrhagic shock. (B) The survival of animals at 72 hours after hemorrhagic shock, which was administered a combination of rhSERPING1 (C1INH) and tranexamic acid, depends on the dose of rhSERPING.

Фиг. 5. Типичные микрофотографии срезов тощей кишки, окрашенные гематоксилином и эозином. Стрелки указывают на бокаловидные клетки, наконечники - на полости Грюнхагена, являющиеся признаками дегенерации ворсинок. (А) - контроль, показывающий нормальный эпителий кишечника. (В) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера. (С) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера и транексамовой кислотой; (D) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера и rhSERPING1; (Е) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера и комбинацией rhSERPING1 с транексамовой кислотой.FIG. 5. Typical micrographs of sections of the jejunum stained with hematoxylin and eosin. Arrows indicate goblet cells, tips - on the Grunhagen cavity, which are signs of villi degeneration. (A) is a control showing normal intestinal epithelium. (B) A group with hemorrhagic shock during resuscitation with Ringer's solution. (C) A group with hemorrhagic shock during resuscitation with Ringer's solution and tranexamic acid; (D) A group with hemorrhagic shock during resuscitation with Ringer's solution and rhSERPING1; (E) A group with hemorrhagic shock during resuscitation with Ringer's solution and a combination of rhSERPING1 with tranexamic acid.

Фиг. 6. Количественная оценка повреждения эпителия кишечника у животных с геморрагическим шоком и разными вариантами терапии. (А) Повреждения эпителия слизистой оболочки по шкале Чиу/Парк. (В) Количество бокаловидных клеток на срезе ворсинки. Экспериментальные группы обозначены как в Фиг. 3.FIG. 6. A quantitative assessment of damage to the intestinal epithelium in animals with hemorrhagic shock and various treatment options. (A) Damage to the epithelium of the mucous membrane according to the Chiu / Park scale. (B) The number of goblet cells in a villus section. The experimental groups are indicated as in FIG. 3.

Фиг. 7. Тромбоэластограмма активированной нормальной плазмы крови человека. (А) Формирование сгустка в активированной плазме (контроль) (В) Лизис сгустка, вызванный добавлением тканевого активатора плазминогена (t-РА/т-ПА). (С) Добавление транексамовой кислоты к активированной плазме крови человека не изменяет параметров свертываемости (образования сгустка) в активированной плазме.FIG. 7. Thromboelastogram of activated normal human blood plasma. (A) Clot formation in activated plasma (control) (B) Clot lysis caused by the addition of tissue plasminogen activator (t-PA / t-PA). (C) Addition of tranexamic acid to the activated human blood plasma does not change the coagulation parameters (clot formation) in the activated plasma.

Фиг. 8. Тромбоэластограмма активированной нормальной плазмы крови человека при добавлении т-ПА и rhSERPING1. (A) rhSERPING1 по отдельности не оказывает влияния на идуцированный т-ПА фибринолиз in vitro. (В) Частичное ингибирование фибринолиза, индуцированного т-ПА, с помощью транексамовой кислоты (ТХА). (С) Ингибирование транексамовой кислотой лизиса сгустка, вызванного т-ПА, потенциируется добавлением rhSERPING1.FIG. 8. Thromboelastogram of activated normal human blood plasma with the addition of t-PA and rhSERPING1. (A) rhSERPING1 alone does not affect the induced t-PA fibrinolysis in vitro. (B) Partial inhibition of fibrinolysis induced by t-PA with tranexamic acid (TXA). (C) Inhibition of transexamic acid by clot lysis induced by t-PA is potentiated by the addition of rhSERPING1.

Фиг. 9. Усеченный по амино-концу rhSERPING1 (rhC1INH_120-500), сохраняющий серпиновый домен, также имеет способность усиливать антифибринолитический эффект транексамовой кислоты. Наложение тромбоэластограмм. Каждая тромбоэластограмма была записана из активированной нормальной плазмы крови человека, в которой лизис сгустка был инициирован с помощью т-ПА.FIG. 9. Amino-truncated rhSERPING1 (rhC1INH _120-500 ), which retains the serpine domain, also has the ability to enhance the antifibrinolytic effect of tranexamic acid. The imposition of thromboelastograms. Each thromboelastogram was recorded from activated normal human blood plasma, in which clot lysis was initiated using t-PA.

Фиг. 10. Количественная оценка тромбоэластограмм. Показано время лизиса сгустка, от R (время реакции начала образования сгустка) до полного лизиса сгустка.FIG. 10. Quantification of thromboelastograms. The time of clot lysis is shown, from R (reaction time of the beginning of clot formation) to complete lysis of the clot.

Перечень последовательностейSequence listing

SEQ ID №1 - последовательность полноразмерного rhSERPING1, белка-предшественника с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид - аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок аминокислотные остатки 23-500.SEQ ID NO: 1 is the sequence of full length rhSERPING1, a precursor protein with cleavable leader peptide. Leader peptide - amino acid residues 1-22; mature protein amino acid residues 23-500.

SEQ ID №2 - последовательность rhC1INH_23-122, усеченного по карбокси-концу rhSERPING1, без серпинового домена. Белок-предшественник с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок - аминокислотные остатки 23-122SEQ ID NO: 2 — rhC1INH _23-122 sequence truncated at the carboxy terminus of rhSERPING1 without serpin domain. Protein precursor with cleavable leader peptide. Leader peptide amino acid residues 1-22; mature protein - amino acid residues 23-122

SEQ ID №3 - C1INH_120-500 - усеченный по амино-концу rhSERPING1, содержащий серпиновый домен. Белок-предшественник с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид - аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок соответствует аминокислотным остаткам 120-500 в предшественнике полноразмерного rhSERPING1SEQ ID No. 3 — C1INH _120-500 — truncated at the amino terminus of rhSERPING1 containing a serpin domain. Protein precursor with cleavable leader peptide. Leader peptide - amino acid residues 1-22; mature protein corresponds to amino acid residues 120-500 in the precursor of full-length rhSERPING1

SEQ ID №4 - последовательность rhC1INH_465ART/VKV - rhSERPING1 с мутациями в активном центре (аминокислотные остатки 465-467 Ala-Arg-Thr заменены на Val-Lys-Val). Белок-предшественник с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид - аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок - аминокислотные остатки 23-500.SEQ ID NO: 4 - rhC1INH _{465ART / VKV} - rhSERPING1 sequence with mutations in the active site (amino acid residues 465-467 of Ala-Arg-Thr replaced by Val-Lys-Val). Protein precursor with cleavable leader peptide. Leader peptide - amino acid residues 1-22; mature protein - amino acid residues 23-500.

Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.The present invention is illustrated by the following examples.

ПРИМЕР 1: Получение рекомбинантного человеческого SERPING1 (rhSERPING1) и его вариантовEXAMPLE 1: Obtaining recombinant human SERPING1 (rhSERPING1) and its variants

Экспрессия рекомбинантного человеческого SERPING1 (rhSERPING1) и его модифицированных форм (см. Таблицу 1) осуществлялась путем введения экспрессионной плазмиды pRA810, содержащей последовательность ДНК, кодирующую человеческий SERPING1 под контролем сильного промотора, в клеточную линию-хозяина, посредством трансфекции клеток. В качестве способа трансфекции применяли электропорацию. В результате чего введенная последовательность стабильно интегрирована в геном хозяина. Клеточная линия-хозяин представляла собой субклон линии клеток яичников китайского хомячка СНО-К1, приспособленный к выращиванию в виде суспензии в бессывороточной среде. Экспрессионная плазмида также несла ген устойчивости к пуромицину и обеспечивала устойчивость трансфицированной клеточной линии к селективному маркеру - антибиотику пуромицину.The expression of recombinant human SERPING1 (rhSERPING1) and its modified forms (see Table 1) was carried out by introducing the expression plasmid pRA810 containing the DNA sequence encoding human SERPING1 under the control of a strong promoter into the host cell line by transfection of cells. Electroporation was used as a transfection method. As a result, the introduced sequence is stably integrated into the host genome. The host cell line was a subclone of the Chinese hamster CHO-K1 ovary cell line adapted to grow in suspension in serum-free medium. The expression plasmid also carried the puromycin resistance gene and ensured the resistance of the transfected cell line to a selective marker, the antibiotic puromycin.

Для идентификации и выделения клеток, продуцирующих rhSERPING1, после трансфекции и добавления селективного антибиотика в культуральную среду, суспензия клеток разбавлялась и рассевалась таким образом, чтобы изолировать популяции, выросшие из единичных клеток, то есть клеточные клоны. После выделения клоны выращивались до состояния конфлюэнтности, и содержание rhSERPING1 в супернатанте оценивалось методом иммуноферментного анализа, для идентификации клеток, секретирующих rhSERPING1.To identify and isolate rhSERPING1 producing cells, after transfection and the addition of a selective antibiotic to the culture medium, the cell suspension was diluted and scattered so as to isolate populations grown from single cells, i.e. cell clones. After isolation, clones were grown to a state of confluence, and the content of rhSERPING1 in the supernatant was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay to identify cells secreting rhSERPING1.

Клеточные клоны, секретирующие rhSERPING1 на высоком уровне, размножали и хранили с помощью криоконсервации.Cell clones secreting rhSERPING1 at a high level were propagated and stored by cryopreservation.

Для производства белка rhSERPING1, клон клеток, стабильно экспрессирующий rhSERPING1, выращивали в одноразовом пластиковом мешке-биореакторе, который перемешивался с помощью качающейся платформы. Использовался биоректор Cultibag 20L Perf (Sartorius, Германия) Для роста клеток и продукции белка использовалась бессывороточная среда SFM4CHO (HyClone, США), содержащая 6 мМ L-глутамин, 0,1% Pluronic F68. Для культивирования использовали режим перфузии, где, в процессе фильтрации, примерно 80% культуральной среды в течение 24-часового цикла заменялось на свежую среду, В течение 22 дней производственного процесса, клеткам непрерывно подавалась свежая ростовая среда, а использованная среда, содержащая rhSERPING1, отделялась от клеточной биомассы и сохранялась. При этом клетки оставались в мешке-биореакторе. Отделенная от клеток среда, содержащая rhSERPING1, собиралась каждый день и использовалась для очистки rhSERPING1 с помощью четырехступенчатой хроматографии. Этапы хроматографии приведены ниже.To produce rhSERPING1 protein, a cell clone stably expressing rhSERPING1 was grown in a disposable plastic bioreactor bag, which was mixed using a swinging platform. We used a Cultibag 20L Perf bioreactor (Sartorius, Germany). For the growth of cells and protein production, serum-free SFM4CHO medium (HyClone, USA) containing 6 mM L-glutamine, 0.1% Pluronic F68 was used. For cultivation, a perfusion mode was used, where, during the filtration process, approximately 80% of the culture medium was replaced with a fresh medium during a 24-hour cycle. During 22 days of the production process, fresh growth medium was continuously supplied to the cells, and the used medium containing rhSERPING1 was separated from cell biomass and persisted. At the same time, the cells remained in the bioreactor bag. The cell-separated medium containing rhSERPING1 was collected every day and used to purify rhSERPING1 using four-step chromatography. The steps of chromatography are given below.

I. Аффинная хроматография на основе иммобилизованных ионов металлов (IMAC - Immobilized metal ion affinity chromatography). Собранную с разных дней процесса биосинтеза культуральную среду загружали в хроматографическую колонку IMAC Sepharose, предварительно промытую 100 мМ ZnCl₂ в количестве 2 объемов колонки и уравновешенную 20 мМ Tris, рН 7.2. Далее колонку промывали сначала 5 объемами 20 мМ Tris, рН 7.2 и затем, 5 объемами 50 мМ Tris, 15 мМ имидазол, рН 7.5. Белки, связанные с колонкой элюировали, раствором 20 мМ Tris, 150 мМ имидазол, рН 7.2.I. Affinity chromatography based on immobilized metal ions (IMAC - Immobilized metal ion affinity chromatography). The culture medium collected from different days of the biosynthesis process was loaded onto an IMAC Sepharose chromatography column, previously washed with 100 mM ZnCl ₂ in an amount of 2 column volumes and equilibrated with 20 mM Tris, pH 7.2. Next, the column was washed first with 5 volumes of 20 mM Tris, pH 7.2 and then, with 5 volumes of 50 mM Tris, 15 mM imidazole, pH 7.5. Proteins associated with the column were eluted with a solution of 20 mM Tris, 150 mM imidazole, pH 7.2.

II. Хроматография на гепариновой сефарозе. Белковую фракцию с этапа I загружали на колонку гепарин-сефароза, предварительно промытую 20 мМ Tris, 5 мМ фосфатом натрия, рН 7.2. Затем колонку промывали тремя объемами 20 мМ Tris, 5 мМ фосфата натрия. Далее, связавшиеся с колонкой белки элюировали 20 мМ Tris, 0.2 М NaCl, рН 7.2.II. Chromatography on heparin sepharose. The protein fraction from step I was loaded onto a heparin-Sepharose column, previously washed with 20 mM Tris, 5 mM sodium phosphate, pH 7.2. The column was then washed with three volumes of 20 mM Tris, 5 mM sodium phosphate. Further, the proteins bound to the column were eluted with 20 mM Tris, 0.2 M NaCl, pH 7.2.

III. СНТ-хроматография на керамическом гидроксиапатите. Собранные фракции с этапа II загружали на колонку СНТ, предварительно промытую одним объемом 0.5 М NaOH, одним объемом 200 мМ Tris, рН 7.2 и уравновешенную 20 мМ Tris, 5 мМ фосфат натрия, рН 7.2. Далее колонку промывали тремя объемами 20 мМ Tris, 5 мМ фосфат натрия, рН 7.2. Затем белки, связанные с колонкой элюировали 4 объемами 200 мМ Tris, 5 мМ фосфата натрия, 200 мМ NaCl, рН 8.5.III. Ceramic hydroxyapatite CHT chromatography. The collected fractions from stage II were loaded onto a SNT column pre-washed with one volume of 0.5 M NaOH, one volume of 200 mM Tris, pH 7.2 and balanced 20 mM Tris, 5 mM sodium phosphate, pH 7.2. The column was then washed with three volumes of 20 mM Tris, 5 mM sodium phosphate, pH 7.2. Then, the proteins associated with the column were eluted with 4 volumes of 200 mM Tris, 5 mM sodium phosphate, 200 mM NaCl, pH 8.5.

IV. Анионобменная хроматография на Q-сефарозе. Фракцию элюции с этапа III разводили водой для достижения проводимости раствора 6 mS/cm и загружали на колонку с Q-сефарозой, предварительно уравновешенную двумя объемами 20 мМ фосфата натрия, рН 6.8. Далее колонку промывали тремя объемами of 20 мМ фосфата натрия, рН 6.8, и затем связанные белки элюировали 20 мМ фосфата натрия, 0.25 М NaCl, рН 6.8.IV. Anion exchange chromatography on Q-Sepharose. The elution fraction from stage III was diluted with water to achieve a solution conductivity of 6 mS / cm and loaded onto a Q-Sepharose column, previously equilibrated with two volumes of 20 mM sodium phosphate, pH 6.8. The column was then washed with three volumes of 20 mM sodium phosphate, pH 6.8, and then the bound proteins were eluted with 20 mM sodium phosphate, 0.25 M NaCl, pH 6.8.

После IV стадии очистки и соответствующего разбавления, раствор rhSERPING1 имел следующие характеристики (Табл. 2):After the IV stage of purification and appropriate dilution, the rhSERPING1 solution had the following characteristics (Table 2):

Аналогичным образом получали и очищали модифицированные формы SERPING1, приведенные в Таблице 1. Полученные составы использовались для проведения дальнейших экспериментов и введения животным.In a similar manner, the modified forms of SERPING1 shown in Table 1 were prepared and purified. The resulting formulations were used for further experiments and administration to animals.

ПРИМЕР 2: Ингибирование сериновой протеазыEXAMPLE 2: Serine Protease Inhibition

Для определения специфической активности rhC1INH_23-500 и его модифицированных форм, полученных в Примере 1, и оценки способности ингибировать эстеразу C1q использовали стандартную методику хромогенного анализа. Для проведения эксперимента использовали набор TECHNOCHROM С1-INH, # 5345003 (Technoclone Gmbh). Данный способ основан на ингибировании избыточного количества образующегося комплекса С1-эстеразы с С1 эстеразным ингибитором, за которым следует гидролиз хромогенного субстрата избытком С1-эстеразы. Количество паранитроанилина, высвобождающееся при гидролизе, и измеренного при длине волны 405 нм, обратно пропорционально активности C1-ингибитора, присутствующего в реакционной среде.To determine the specific activity of rhC1INH _23-500 and its modified forms obtained in Example 1, and to evaluate the ability to inhibit C1q esterase, a standard chromogenic analysis technique was used. For the experiment, a TECHNOCHROM C1-INH kit, # 5345003 (Technoclone Gmbh) was used. This method is based on the inhibition of an excess of the resulting complex of C1 esterase with a C1 esterase inhibitor, followed by hydrolysis of the chromogenic substrate with an excess of C1 esterase. The amount of paranitroaniline released during hydrolysis, and measured at a wavelength of 405 nm, is inversely proportional to the activity of the C1 inhibitor present in the reaction medium.

Специфическая активность очищенных rhC1INH_23-500, и rhC1INH_120-300, полученных в Примере 1, составляла 5,0-12,0 МЕ/мг общего белка. Специфическая активность белков rhC1INH_23-122 и rhC1INH_465ART/VKV равнялась нулю, что являлось результатом делеции серпинового домена или мутации его активного центра.The specific activity of the purified rhC1INH _23-500 and rhC1INH _120-300 obtained in Example 1 was 5.0-12.0 IU / mg total protein. The specific activity of the rhC1INH _23-122 and rhC1INH _{465ART / VKV proteins} was zero, which was the result of a deletion of the serpine domain or a mutation of its active center.

ПРИМЕР 3: Ингибирование воспалительных цитокинов на ex vivo модели септического шока.EXAMPLE 3: Inhibition of inflammatory cytokines in an ex vivo septic shock model.

Для каждого отдельного эксперимента использовали 25 мл цельной крови, взятой у 6 здоровых добровольцев. В качестве антикоагулянта к цельной крови добавляли 5 мМ ЭДТА. Цельную кровь равномерно распределяли в тестовые пробирки, куда заранее были добавлены либо растворы белков, либо эквивалентный объем физиологического раствора. В качестве контроля использовали человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) (Baxter). Конечная концентрация белков (альбумина (контрольный белок), pdSERPING1 (Беринерт), rhC1INH_23-500, а также модифицированных (усеченных или с аминокислотными заменами) вариантов rhSERPING1 (полученных в Примере 1), приведенных в Таблице 1, в цельной крови составляла 22 нМ.For each individual experiment, 25 ml of whole blood taken from 6 healthy volunteers was used. As an anticoagulant, 5 mM EDTA was added to whole blood. Whole blood was evenly distributed into test tubes where either protein solutions or an equivalent volume of physiological saline were added in advance. Human serum albumin (HSA) (Baxter) was used as a control. The final concentration of proteins (albumin (control protein), pdSERPING1 (Berynert), rhC1INH _23-500 , as well as modified (truncated or with amino acid substitutions) variants of rhSERPING1 (obtained in Example 1), shown in Table 1, in whole blood was 22 nM .

После предварительного инкубирования при 37°С в течение 30 минут на орбитальном шейкере (60° угол поворота оси и скорость вращения 9 об/мин), к смеси, состоящей из цельной крови и белков, добавляли бактериальные липополисахариды (ЛПС E.coli O55:В5 (#L6629, Сигма)) до конечной концентрации 1 нМ. Таким образом, индуцировали воспалительное высвобождение цитокинов из макрофагов и нейтрофилов. После этого всю смесь оставляли в одинаковых условиях инкубации (описанных выше), и образцы для анализа отбирали после 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 24 часа.After preliminary incubation at 37 ° C for 30 minutes on an orbital shaker (60 ° axis rotation and rotation speed 9 rpm), bacterial lipopolysaccharides (LPS E.coli O55: B5) were added to the mixture consisting of whole blood and proteins (# L6629, Sigma)) to a final concentration of 1 nM. Thus, inflammatory release of cytokines from macrophages and neutrophils was induced. After that, the whole mixture was left under the same incubation conditions (described above), and samples for analysis were taken after 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 24 hours.

Плазму крови отделяли центрифугированием и хранили при -20°С. Концентрацию цитокинов в замороженной плазме определяли методом ИФА (Quantikine SixPak, R&D Systems). Для анализа цитокинового шторма определялись концентрации следующих цитокинов: ФНО-альфа, ИЛ-1β/ИЛ-1F2, ИЛ-6. Добавление rhC1INH_23-500 или C1INH_120-500 к цельной крови значительно снижало ЛПС-индуцированный выброс ИЛ-6 (Фиг. 1). Несмотря на то, что выброс ИЛ-1β не подавлялся полноразмерным rhSERPING (rhC1INH_23-500), амино-концевой фрагмент rhSERPING (rhC1INH_23-122) значительно снизил уровень ИЛ-1β. Уровень ФНО-альфа не изменялся значительно после добавления rhSERPING1 (или его вариантов) в модели цитокинового шторма.Blood plasma was separated by centrifugation and stored at -20 ° C. The concentration of cytokines in frozen plasma was determined by ELISA (Quantikine SixPak, R&D Systems). For the analysis of the cytokine storm, the concentrations of the following cytokines were determined: TNF-alpha, IL-1β / IL-1F2, IL-6. The addition of rhC1INH _23-500 or C1INH _120-500 to whole blood significantly reduced the LPS-induced release of IL-6 (Fig. 1). Despite the fact that the release of IL-1β was not suppressed by the full-size rhSERPING (rhC1INH _23-500 ), the amino-terminal fragment of rhSERPING (rhC1INH _23-122 ) significantly reduced the level of IL-1β. The level of TNF-alpha did not change significantly after the addition of rhSERPING1 (or its variants) in the cytokine storm model.

Таким образом, добавление rhC1INH_23-500 или его вариантов, сохраняющих функциональную активность, подавляет высвобождение определенных воспалительных цитокинов, а именно ИЛ-6 и ИЛ-1β, которые привлекают нейтрофилы в места инфекции и воспаления, вызывая дальнейшее увеличение воспаления. Более того, выше перечисленные провоспалительные цитокины играют важную роль в развитии септического шока, который часто является последствием геморрагического шока.Thus, the addition of rhC1INH _23-500 or functional variants preserving it inhibits the release of certain inflammatory cytokines, namely IL-6 and IL-1β, which attract neutrophils to the sites of infection and inflammation, causing a further increase in inflammation. Moreover, the proinflammatory cytokines listed above play an important role in the development of septic shock, which is often a consequence of hemorrhagic shock.

ПРИМЕР 4: Модель индуцированного каррагинаном отека задней лапы мыши.EXAMPLE 4: Model of carrageenan-induced hind paw edema of a mouse.

Для изучения противовоспалительного и противоотечного действия rhSERPING1 была использована модель воспалительного отека задней лапы мыши, вызванного введением каррагинана. В данной модели основные признаки воспаления, такие как отек, гипералгезия, и эритема - проявляются сразу же после подкожной инъекции каррагинана. Данные симптомы обусловлены действием таких провоспалительных агентов, как брадикинин, гистамин, тахикинины, система комплемента, а также реактивные формы кислорода и азота. Такие агенты могут образовываться непосредственно в месте воспаления, при этом нейтрофилы охотно мигрируют в участки воспаления и могут выделять реактивные формы кислорода и другие провоспалительные вещества. В используемой модели воспалительная реакция обычно определяется по увеличению в размере задней лапки (по отеку), в которую вводился каррагинан. Максимальный отек развивается уже через 10 минут после введения каррагинана и в это же время происходит выброс специфических молекул, характерных для воспалительного каскада. Степень отека также может оцениваться путем измерения капиллярного кровотока в лапе - чем сильнее отек, тем слабее кровоток. В проведенных экспериментах отек индуцировали путем подкожной инъекции 100 мкл 1% каррагинана (λ-каррагинан тип IV, Sigma) в физиологическом растворе в правую заднюю лапу. Левая задняя лапа была использована в качестве контроля. Сразу после инъекции каррагинана, внутривенно вводили rhSERPING1 (500 МЕ/кг) или pdSERPING1 (500 МЕ/кг, препарат Беринерт, производства Behring) или диклофенак (3 мг/кг, производства Хемофарм АД, Сербия) или раствор Рингера в качестве отрицательного контроля. Динамика капиллярного кровотока в лапе в течение 3 часов измерялась с методом лазер-Допплера. Через 24 часа после введения каррагинана измеряли уровень провоспалительного цитокина ИЛ-6.To study the anti-inflammatory and anti-edematous effects of rhSERPING1, a model of inflammatory edema of the mouse hind paw caused by the administration of carrageenan was used. In this model, the main signs of inflammation, such as edema, hyperalgesia, and erythema, appear immediately after a subcutaneous injection of carrageenan. These symptoms are due to the action of pro-inflammatory agents such as bradykinin, histamine, tachykinins, the complement system, as well as reactive forms of oxygen and nitrogen. Such agents can form directly at the site of inflammation, while neutrophils readily migrate to areas of inflammation and can release reactive oxygen species and other pro-inflammatory substances. In the model used, the inflammatory response is usually determined by the increase in the size of the hind paw (edema) into which the carrageenan was introduced. Maximum edema develops within 10 minutes after the introduction of carrageenan and at the same time there is a release of specific molecules characteristic of the inflammatory cascade. The degree of edema can also be assessed by measuring capillary blood flow in the paw - the stronger the swelling, the weaker the blood flow. In the experiments performed, edema was induced by subcutaneous injection of 100 μl of 1% carrageenan (λ-carrageenan type IV, Sigma) in saline into the right hind paw. The left hind paw was used as a control. Immediately after the injection of carrageenan, rhSERPING1 (500 IU / kg) or pdSERPING1 (500 IU / kg, Berinert drug, manufactured by Behring) or diclofenac (3 mg / kg, manufactured by Hemofarm AD, Serbia) or Ringer's solution as a negative control were injected intravenously. The dynamics of capillary blood flow in the paw for 3 hours was measured using the laser-Doppler method. 24 hours after administration of carrageenan, the level of the pro-inflammatory cytokine IL-6 was measured.

У животных, получившие в качестве терапии rhSERPING1 или pdSERPING1, отек спадал существенно быстрее, чем в случае применения нестероидного противовоспалительного препарата диклофенак. У животных в контроле, инъецированных только раствором Рингера, снижение отека не наблюдалось (Фиг. 2). Кроме того, у животных, получившие в качестве терапии rhSERPING1 или pdSERPING1 наблюдался более низкий уровень (в 10 раз меньше) ИЛ-6, по сравнению с контрольной группой животных, которым вводился раствор Рингера.In animals treated with rhSERPING1 or pdSERPING1 as therapy, the edema subsided much faster than with the non-steroidal anti-inflammatory drug diclofenac. In animals in the control, injected only with Ringer's solution, a decrease in edema was not observed (Fig. 2). In addition, in animals treated with rhSERPING1 or pdSERPING1 as therapy, a lower level (10 times less) of IL-6 was observed compared with the control group of animals that were injected with Ringer's solution.

ПРИМЕР 5. Фармацевтическая комбинация SERPING1 и транексамовой кислоты.EXAMPLE 5. A pharmaceutical combination of SERPING1 and tranexamic acid.

Фармацевтические композиции для введения были приготовлены следующим образом.Pharmaceutical compositions for administration were prepared as follows.

А. Раствор для введенияA. Solution for administration

Готовят следующий состав:Prepare the following composition:

Рассчитанное количество трегалозы и хлорида натрия взвешивают и растворяют при перемешивании в необходимом количестве 20 мМ натрий-фосфатного буфера с рН 6,8. Затем к раствору добавляют рассчитанное количество порошка транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты, перемешивают и проверяют рН. При необходимости рН доводят до значения 6,8 с использованием раствора 1М NaOH или 1М HCl. К полученному раствору добавляют необходимое количество rhSERPING1, полученного в Примере 1, и осторожно перемешивают. Раствор доводят до определенного объема водой для инъекций, фильтруют через 0,22-микронный мембранный фильтр и собирают в контейнер в стерильных условиях.The calculated amount of trehalose and sodium chloride is weighed and dissolved with stirring in the required amount of 20 mm sodium phosphate buffer with a pH of 6.8. Then, the calculated amount of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid powder is added to the solution, mixed and the pH is checked. If necessary, the pH is adjusted to a value of 6.8 using a solution of 1M NaOH or 1M HCl. To the resulting solution add the required amount of rhSERPING1 obtained in Example 1, and mix gently. The solution was adjusted to a certain volume with water for injection, filtered through a 0.22 micron membrane filter and collected in a container under sterile conditions.

Полученная жидкая композиция может вводиться любым способом внутривенно: струйно, капельно, болюсно; композиция может быть разбавлена раствором Рингера и другими кристаллоидами. Таким образом, последующее введение может осуществляться либо параллельно с инфузионной терапией (капельница), либо независимо от инфузионной терапии.The resulting liquid composition can be administered by any means intravenously: in a jet, drip, or bolus; the composition may be diluted with Ringer's solution and other crystalloids. Thus, subsequent administration can be carried out either in parallel with infusion therapy (dropper), or independently of infusion therapy.

Б. Растворы для последовательного введения.B. Solutions for sequential administration.

Готовят раствор препарата, способом, описанным в разделе А, но без добавления транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты, помещают в стерильные флаконы и запечатывают. Отдельно готовят раствор транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты в концентрации 50 мг/мл. Препарат вводится внутривенно, последовательно (до или после) или одновременно с внутривенным введением раствора транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты.A solution of the preparation is prepared by the method described in section A, but without the addition of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid, placed in sterile vials and sealed. A solution of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid is prepared separately at a concentration of 50 mg / ml. The drug is administered intravenously, sequentially (before or after) or simultaneously with the intravenous administration of a solution of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid.

В. Лиофилизированный порошокB. Lyophilized powder

Раствор для внутривенного введения, полученный в разделе А, лиофилизируют с использованием следующего способа:The intravenous solution obtained in section A is lyophilized using the following method:

Аликвоты раствора по 45 мл помещаются в стеклянные апирогенные флаконы, которые неплотно закрываются апирогенными пробками, чтобы допустить выход воздуха. Флаконы далее помещаются в камеру лиофильной сушки (Labconco FreeZone 6 Plus), где происходит лиофилизация при минус 40°С в течение 16 часов. Дополнительный цикл сушки происходит в течение 8 часов в той же камере с выключенным охлаждением. Флаконы далее укупориваются бутиловыми резиновыми пробками и запечатываются алюминиевыми колпачками.Aliquots of a solution of 45 ml are placed in glass pyrogen-free bottles, which are not tightly closed with pyrogen-free caps to allow air to escape. The vials are then placed in a freeze-drying chamber (Labconco FreeZone 6 Plus), where lyophilization occurs at minus 40 ° C for 16 hours. An additional drying cycle takes place for 8 hours in the same chamber with the cooling turned off. The vials are then sealed with butyl rubber stoppers and sealed with aluminum caps.

Восстановление раствора проводят при комнатной температуре добавлением во флакон необходимого количества воды для инъекций, физиологического раствора или раствора Рингера и тщательного взбалтывания до полного растворения содержимого флакона. Дальнейшее введение пациенту осуществляется, как описано в разделе А.The solution is reconstituted at room temperature by adding the necessary amount of water for injection, physiological saline or Ringer's solution to the vial and shaking thoroughly until the contents of the vial are completely dissolved. Further administration to the patient is carried out as described in section A.

Г. Набор с растворителемG. Solvent kit

Готовят раствор препарата, способом, описанным в разделе А, но без добавления транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты, и проводят его лиофилизацию в условиях, описанных в разделе Б. Готовый лиофилизат помещают в стерильные флаконы и запечатывают.A solution of the preparation is prepared by the method described in section A, but without the addition of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid, and its lyophilization is carried out under the conditions described in section B. The finished lyophilisate is placed in sterile vials and sealed.

Раствор транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты с концентрацией 10-100 мг/мл готовят путем растворения порошка соответствующей кислоты в воде для инъекций при перемешивании. Полученный раствор фильтруют через стерильный фильтр и разливают по флаконам.A solution of tranexamic, aminomethylbenzoic or ε-aminocaproic acid with a concentration of 10-100 mg / ml is prepared by dissolving the powder of the corresponding acid in water for injection with stirring. The resulting solution is filtered through a sterile filter and poured into vials.

Для получения раствора rhSERPING1 с аминокислотой, при помощи шприца набирают раствор соответствующей кислоты, вводят во флакон с лиофилизатом и осторожно перемешивают до полного растворения содержимого флакона.To obtain a solution of rhSERPING1 with an amino acid, a solution of the corresponding acid is collected using a syringe, injected into a vial with a lyophilisate and carefully mixed until the contents of the vial are completely dissolved.

Во всех случаях (А, Б, В, Г) приготовленный раствор rhSERPING1 с аминокислотой может быть дополнительно разбавлен 0,9% раствором хлорида натрия или раствором Рингера до требуемой концентрации.In all cases (A, B, C, D), the prepared rhSERPING1 solution with an amino acid can be additionally diluted with a 0.9% sodium chloride solution or Ringer's solution to the desired concentration.

ПРИМЕР 6: Оценка эффективности заявленной композиции на крысиной модели геморрагического шока.EXAMPLE 6: Evaluation of the effectiveness of the claimed composition on a rat model of hemorrhagic shock.

Для проведения эксперимента использовали крыс породы Sprague-Dawley, полученных в питомнике SPF-категории «Пущино» (Пущино, РФ), возрастом 12-16 недель, с массой 350-400 г.For the experiment, Sprague-Dawley rats were used, obtained in the nursery of the SPF category "Pushchino" (Pushchino, RF), 12-16 weeks old, weighing 350-400 g.

Крыс вводили в наркоз и вызывали геморрагический шок путем надреза бедренной артерии. Объем кровопотери, длившейся 20-25 минут, составлял 50% от расчетного общего объема циркулирующей крови (ОЦК). ОЦК для крыс вычисляли по уравнению:Rats were anesthetized and caused hemorrhagic shock by incision of the femoral artery. The volume of blood loss lasting 20-25 minutes was 50% of the estimated total circulating blood volume (BCC). BCC for rats was calculated by the equation:

ОЦК в миллилитрах = 0.77 + (0.06 × вес тела в граммах)BCC in milliliters = 0.77 + (0.06 × body weight in grams)

Кровотечение останавливали путем наложения лигатуры после эксфузии 50% ОЦК. Через 30 минут после завершения эксфузии начинали процесс реперфузии (инфузионной терапии). Все крысы путем рандомизации были поделены на 7 экспериментальных групп, минимальное количество животных в каждой группе составляло 10 особей.Bleeding was stopped by applying a ligature after exfusion with 50% bcc. 30 minutes after completion of exfusion, the reperfusion process (infusion therapy) was started. All rats by randomization were divided into 7 experimental groups, the minimum number of animals in each group was 10 individuals.

В экспериментальной группе номер 1 (10 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера : объем кровопотери).In the experimental group number 1 (10 animals): resuscitation was carried out by intravenous administration of Ringer's solution in a ratio of 2: 1 (volume of Ringer's solution: volume of blood loss).

В экспериментальной группе номер 2 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера : объем кровопотери), содержащим человеческий SERPING1 очищенный из плазмы крови (препарат Berinert) в дозировке 168 МЕ/кг.In experimental group No. 2 (11 animals): resuscitation was carried out by intravenous administration of Ringer's solution in a ratio of 2: 1 (volume of Ringer's solution: volume of blood loss) containing human SERPING1 purified from blood plasma (Berinert preparation) at a dosage of 168 IU / kg.

В экспериментальной группе номер 3 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера : объем кровопотери), содержащим рекомбинантный человеческий SERPING1 (rhC1INH_23-500) в дозировке 168 МЕ/кг.In experimental group No. 3 (11 animals): resuscitation was carried out by intravenous administration of Ringer's solution in a ratio of 2: 1 (volume of Ringer's solution: volume of blood loss) containing recombinant human SERPING1 (rhC1INH _23-500 ) at a dosage of 168 IU / kg.

В экспериментальной группе номер 4 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера : объем кровопотери), содержащим транексамовую кислоту в дозировке 0,015 г/кг.In experimental group No. 4 (11 animals): resuscitation was carried out by intravenous administration of Ringer's solution in a ratio of 2: 1 (volume of Ringer's solution: volume of blood loss) containing tranexamic acid at a dosage of 0.015 g / kg.

В экспериментальной группе номер 5 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера : объем кровопотери), содержащим рекомбинантный человеческий SERPING1 (rhC1INH_23-500) в дозировке 168 МЕ/кг и транексамовую кислоту в дозировке 0,015 г/кг.In experimental group No. 5 (11 animals): resuscitation was carried out by intravenous administration of Ringer's solution in a ratio of 2: 1 (volume of Ringer's solution: volume of blood loss) containing recombinant human SERPING1 (rhC1INH _23-500 ) at a dosage of 168 IU / kg and tranexamic acid in dosage of 0.015 g / kg.

В экспериментальной группе номер 6 (10 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера : объем кровопотери), содержащим рекомбинантный человеческий SERPING1 (rhC1INH_23-500) в дозировке 84 МЕ/кг и транексамовую кислоту в дозировке 0,015 г/кгIn experimental group number 6 (10 animals): resuscitation was carried out by intravenous administration of Ringer's solution in a ratio of 2: 1 (volume of Ringer's solution: volume of blood loss) containing recombinant human SERPING1 (rhC1INH _23-500 ) at a dosage of 84 IU / kg and tranexamic acid in dosage of 0.015 g / kg

В экспериментальной группе номер 7 (10 животных): реанимационные предприятия не проводились.In the experimental group number 7 (10 animals): resuscitation enterprises were not conducted.

Реперфузию животных осуществляли через бедренную вену либо раствором Рингера, либо раствором Рингера, содержащим SERPING1 или транексамовую кислоту, либо раствором Рингера содержащим вместе SERPING1 и транексамовую кислоту. Объем реперфузии равнялся примерно 200% объема эксфузии. Скорость реперфузии составляла примерно 1,2 мл/мин. Контрольную группу животных подвергали эксфузии без последующей реперфузии. После окончания реперфузии на бедренную вену также была наложена лигатура.Animals were reperfused through the femoral vein with either Ringer's solution, or Ringer's solution containing SERPING1 or tranexamic acid, or Ringer's solution containing together SERPING1 and tranexamic acid. The volume of reperfusion was approximately 200% of the volume of exfusion. The reperfusion rate was approximately 1.2 ml / min. The control group of animals was subjected to exfusion without subsequent reperfusion. After reperfusion, a ligature was also placed on the femoral vein.

С момента наступления наркоза, во время эксфузии, во время и после реперфузии мониторингу подвергались следующие физиологические параметры: частота дыхания и сердечных сокращений, насыщение кислородом, электрокардиограмма. В случае, когда физиологические параметры свидетельствовали о наступающем коллапсе животного, эксфузия временно прекращалась и животным проводилась искусственная вентиляция легких. После стабилизации физиологических параметров, эксфузия завершалась.Since the onset of anesthesia, during exfusion, during and after reperfusion, the following physiological parameters have been monitored: respiratory rate and heart rate, oxygen saturation, and an electrocardiogram. In the case when physiological parameters indicated the impending collapse of the animal, exfusion was temporarily stopped and the animals underwent mechanical ventilation. After stabilization of physiological parameters, exfusion was completed.

Параллельные группы животных, после пробуждения от наркоза, и в случае, если смерть не наступала под наркозом, наблюдали в течение 72 часов после завершения эксфузионно-реперфузионных предприятий. Фиксировали смертность в течение 72 часов, после чего животных подвергали эвтаназии.Parallel groups of animals, upon awakening from anesthesia, and in the event that death did not occur under anesthesia, were observed for 72 hours after completion of the exfusion-reperfusion enterprises. Mortality was recorded for 72 hours, after which the animals were euthanized.

90% животных, получавших комбинацию SERPING1 и транексамовой кислоты в растворе Рингера, выживало по крайней мере (более) 72 часов, в то время как только 20% животных из группы, получавшей раствор Рингера, выжило в течение такого же времени. В группе, получавшей транексамовую кислоту в растворе Рингера, в течение 72 часов выжило 36,4%. В группах, получавших раствор Рингера, содержащий SERPING1 из плазмы крови человека или рекомбинантный SERPING1, в течение 72 часа выжило 54,5% животных, при этом разницы между группами, получавшими рекомбинантный и плазменный SERPING1 обнаружено не было. В группе без реанимации ни одно из животных не выжило более 1 часа. Двукратное снижение дозы rhSERPING1 (с 168 МЕ/кг до 84 МЕ/кг) в комбинации с транексамовой кислотой, привело к примерно двукратному снижению выживаемости (с 90 до 50%). (Фиг. 3, 4).90% of the animals treated with the combination of SERPING1 and tranexamic acid in Ringer's solution survived at least (more) 72 hours, while only 20% of the animals from the group treated with Ringer's solution survived for the same time. In the group that received tranexamic acid in Ringer's solution, 36.4% survived within 72 hours. In the groups receiving Ringer's solution containing SERPING1 from human plasma or recombinant SERPING1, 54.5% of the animals survived within 72 hours, with no difference between the groups receiving recombinant and plasma SERPING1. In the group without resuscitation, none of the animals survived more than 1 hour. A twofold reduction in the dose of rhSERPING1 (from 168 IU / kg to 84 IU / kg) in combination with tranexamic acid led to an approximately twofold decrease in survival (from 90 to 50%). (Fig. 3, 4).

Таким образом был показан синергетический эффект комбинации rhSERPING1 и транексамовой кислоты, которая имеет наибольший эффект снижения смертности в модели геморрагического шока на крысах.Thus, the synergistic effect of the combination of rhSERPING1 and tranexamic acid, which has the greatest effect of reducing mortality in the rat hemorrhagic shock model, was shown.

ПРИМЕР 7. Эффективность заявленной комбинации в снижении повреждения эпителия кишечника в модели геморрагического шока на крысах.EXAMPLE 7. The effectiveness of the claimed combination in reducing damage to the intestinal epithelium in a model of hemorrhagic shock in rats.

Крысы были рандомизированно разделены на 5 экспериментальных групп по 5 животных в каждой. Крыс вводили в наркоз и вызывали геморрагический шок в четырех группах, способом, описанном в Примере 6. Контрольная группа, без геморрагического шока, была наркотизирована, но у нее не вызывалось кровотечение и геморрагический шок. Описание терапии экспериментальных групп приведено в Таблице 4.Rats were randomly divided into 5 experimental groups of 5 animals each. The rats were anesthetized and caused hemorrhagic shock in four groups, as described in Example 6. The control group, without hemorrhagic shock, was anesthetized, but it did not cause bleeding and hemorrhagic shock. The treatment of experimental groups is described in Table 4.

Животные в каждой экспериментальной группе были подвергнуты эвтаназии через 4 часа после окончания эксфузионно-инфузионных мероприятий. Сегменты тонкого кишечника, включающие тощую и подвздошную кишку были промыты холодным физиологическим раствором, зафиксированы в 20% забуференном формалине и 3% глутаровом альдегиде.Animals in each experimental group were euthanized 4 hours after the end of exfusion and infusion events. Segments of the small intestine, including the jejunum and ileum, were washed with cold saline, fixed in 20% buffered formalin and 3% glutaraldehyde.

Вырезанные сегменты тонкой кишки заливали парафином, делали срезы (5 мкм), и окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы анализировали с помощью светового микроскопа. Окрашенные срезы были закодированы и проанализированы. Повреждения кишечного эпителия классифицировались в соответствии со шкалой Чиу-Парк (Chiu, McArdle et al. 1970): 1-я степень - появление субэпителиальных полостей Грюнхагена и вакуолизация кончиков ворсинок; 2-я степень - расширение субэпителиального пространства с умеренным отслоением эпителия от lamina propria; 3-я степень - массивное отслоение эпителия и увеличение вакуолизации от кончика к середине ворсинок; 4-я степень - отслоение эпителия и вакуолизация от кончика до нижней части ворсинок; 5 степень - полное оголение ворсинки, изъязвление слизистой оболочки и lamina propria. Кроме того, два другие признаки кишечной повреждения были приняты во внимание - уменьшение количества или исчезновение бокаловидных клеток, и уменьшение длины при увеличении толщины ворсинки. Бокаловидные клетки выделяют слизь, которая образует защитный барьер кишечника. Уменьшение в длине ворсинок и увеличение толщины ворсинки является указанием отека.The excised segments of the small intestine were embedded in paraffin, sliced (5 μm), and stained with hematoxylin-eosin. Sections were analyzed using a light microscope. Stained sections were encoded and analyzed. Damage to the intestinal epithelium was classified according to the Chiu-Park scale (Chiu, McArdle et al. 1970): 1st degree - the appearance of subepithelial cavities of Grünhagen and vacuolization of the tips of the villi; 2nd degree - expansion of the subepithelial space with moderate exfoliation of the epithelium from lamina propria; 3rd degree - massive detachment of the epithelium and an increase in vacuolization from the tip to the middle of the villi; 4th degree - exfoliation of the epithelium and vacuolization from the tip to the bottom of the villi; 5 degree - complete exposure of the villi, ulceration of the mucous membrane and lamina propria. In addition, two other signs of intestinal damage were taken into account - a decrease in the number or disappearance of goblet cells, and a decrease in length with an increase in the thickness of the villi. Goblet cells secrete mucus, which forms the intestinal barrier. A decrease in the length of the villi and an increase in the thickness of the villus is an indication of edema.

Кишечник из группы 2 (геморрагический шок и реанимация раствором Рингера) показал наиболее серьезное повреждение (Средняя степень 4±1,2) (Фиг. 5), с часто встречающимся полным оголением или потерей ворсинок, увеличенной целлюляризацией или распадом lamina propria; уменьшением количества или полной потерей бокаловидных клеток. При применении транексамовой кислотой значительно снижался ущерб кишечника (средняя степень 1,9±0,7). Применение rhSERPING1 также снижало повреждение кишечника, примерно в такой же степени (средняя степень 1,7±0,5). Несмотря на в основном сохранившийся слизистый эпителий, ворсинки в группе с терапией rhSERPING1 были заметно короче и тоньше, чем в группе контроля без геморрагического шока или в группе с терапией транексамовой кислотой. В группе с комбинированным применением rhSERPING1 и транексамовой кислоты, повреждение слизистой оболочки было наименее выражено среди групп с геморрагическим шоком (средняя степень 0,4±0,7). (Фиг. 5, 6).The intestines from group 2 (hemorrhagic shock and resuscitation by Ringer's solution) showed the most serious damage (Medium 4 ± 1.2) (Fig. 5), with frequent complete exposure or loss of villi, increased cellularization or decay of lamina propria; a decrease in the number or complete loss of goblet cells. When using tranexamic acid, intestinal damage was significantly reduced (average degree 1.9 ± 0.7). The use of rhSERPING1 also reduced intestinal damage, to approximately the same degree (average degree 1.7 ± 0.5). Despite the largely preserved mucous epithelium, the villi in the rhSERPING1 therapy group were noticeably shorter and thinner than in the control group without hemorrhagic shock or in the group with tranexamic acid therapy. In the group with combined use of rhSERPING1 and tranexamic acid, mucosal damage was least pronounced among groups with hemorrhagic shock (average degree 0.4 ± 0.7). (Fig. 5, 6).

Таким образом, комбинация rhSERPING1 и транексамовой кислоты защищает кишечный эпителий значительно лучше, чем rhSERPING1 (Р=0,012) или транексамовая кислота (Р=0,038) в одиночку.Thus, the combination of rhSERPING1 and tranexamic acid protects the intestinal epithelium significantly better than rhSERPING1 (P = 0.012) or tranexamic acid (P = 0.038) alone.

ПРИМЕР 8. Синергетический эффект комбинации rhSERPING1 и транексамовой кислоты в отношении фибринолиза in vitro.EXAMPLE 8. The synergistic effect of the combination of rhSERPING1 and tranexamic acid in relation to in vitro fibrinolysis.

Для того чтобы проверить, достигается ли синергетический эффект комбинации rhSERPING1 и транексамовой кислоты в отношении вторичного фибринолиза, было проведено исследование in vitro методом тромбоэластографии на объединенных пробах человеческой плазмы крови здоровых доноров.In order to check whether the synergistic effect of the combination of rhSERPING1 and tranexamic acid with respect to secondary fibrinolysis is achieved, an in vitro study was performed by thromboelastography on pooled samples of human blood plasma from healthy donors.

Для инициации образования сгустка по пути контактной активации, 20 мкл 0,5 М CaCl₂ и 20 мкл каолин-кефалиновой смеси (производства РЕНАМ, РФ) добавляли к 260 мкл цитрированных образцов плазмы (нормальная плазма крови собранная и объединенная от здоровых доноров, РЕНАМ, РФ) в кювете для тромбоэластографии. После добавления 60 мкл фосфатно-солевого буфера, кювету помещали для немедленного измерения в тромбоэластограф Mono ТЕМ-А (Framar Hemologix, Италия).To initiate the formation of a clot along the pathway of contact activation, 20 μl of 0.5 M CaCl ₂ and 20 μl of kaolin-cephalin mixture (manufactured by PENAM, RF) were added to 260 μl of citrated plasma samples (normal blood plasma collected and combined from healthy donors, PENAM, RF) in a thromboelastography cuvette. After adding 60 μl of phosphate-buffered saline, the cuvette was placed for immediate measurement in a Mono TEM-A thromboelastograph (Framar Hemologix, Italy).

На Фиг. 7А приведена типичная тромбоэластограмма образования сгустка в активированной человеческой плазме. Добавление транексамовой кислоты до концентрации 1,43 мкг/мл к активированной плазме не изменило значимо параметров тромоэластограммы (Фиг. 7С).In FIG. 7A shows a typical thromboelastogram of clot formation in activated human plasma. The addition of tranexamic acid to a concentration of 1.43 μg / ml to the activated plasma did not significantly change the parameters of the thromoelastogram (Fig. 7C).

Чтобы инициировать фибринолиз, фармакологический препарат рекомбинантного тканевого активатора плазминогена, т-ПА (t-PA) (Ревелиза, производства Генериум, Россия) был добавлен до конечной концентрации 55 мкг/мл (0,57 МЕ/мл). При этом тромбоэластография показала быстрый фибринолиз после начального формирования сгустка (Фиг. 7В). Добавление rhSERPING (rhC1INH_23-500) до конечной концентрации 2,5 мг/мл не изменило активированный т-ПА фибринолиз (Фиг. 8А), в то время как добавление транексамовой кислоты (1,43 мкг/мл) значительно ингибировало т-ПА-зависимый фибринолиз (Фиг. 8В), что нашло свое отражение в длительности стабильности сгустка на тромбоэластограмме. Когда rhSERPING (rhC1INH_23-500) был использован в сочетании с транексамовой кислотой (конечные концентрации 2,5 мг/мл и 1,43 мкг/мл соответственно), степень ингибирования фибринолиза была примерно в два раза сильнее по сравнению применением одной только транексамовой кислоты (Фиг. 8С). При сочетанном применении rhSERPING1 (rhC1INH_23-500) и транексамовой кислоты время до полного растворения сгустка было в два раза больше, что хорошо видно на Фиг. 10. RhSERPING1 (C1INH_120-500), усеченный по амино-концу, содержащий серпиновый домен, имел схожий эффект, а именно: в случае фибринолиза, инициированного т-ПА, время лизиса сгустка, в случае добавления вместе с транексамовой кислотой, было существенно больше, чем в случае применения транексамовой кислоты или RhSERPING1 (C1INH_120-500), усеченный по амино-концу, по отдельности (Фиг. 9, 10).To initiate fibrinolysis, a pharmacological preparation of a recombinant tissue plasminogen activator, t-PA (t-PA) (Revelisa, manufactured by Generium, Russia) was added to a final concentration of 55 μg / ml (0.57 IU / ml). In this case, thromboelastography showed rapid fibrinolysis after the initial formation of a clot (Fig. 7B). The addition of rhSERPING (rhC1INH _23-500 ) to a final concentration of 2.5 mg / ml did not change the activated t-PA fibrinolysis (Fig. 8A), while the addition of tranexamic acid (1.43 μg / ml) significantly inhibited t-PA -dependent fibrinolysis (Fig. 8B), which was reflected in the duration of clot stability in thromboelastogram. When rhSERPING (rhC1INH _23-500 ) was used in combination with tranexamic acid (final concentrations of 2.5 mg / ml and 1.43 μg / ml, respectively), the degree of inhibition of fibrinolysis was about two times stronger compared with tranexamic acid alone (Fig. 8C). With the combined use of rhSERPING1 (rhC1INH _23-500 ) and tranexamic acid, the time to complete dissolution of the clot was twice as long, which is clearly seen in FIG. 10. RhSERPING1 (C1INH _120-500 ), truncated at the amino end, containing a serpin domain, had a similar effect, namely: in the case of fibrinolysis initiated by t-PA, the clot lysis time, if added together with tranexamic acid, was significantly more than in the case of the use of tranexamic acid or RhSERPING1 (C1INH _120-500 ), truncated at the amino end, separately (Fig. 9, 10).

Таким образом, пример показывает:Thus, the example shows:

1. Установлено действие антифибринолитика, например, такого как транексамовая кислота, выраженное в замедлении процесса фибринолиза, вызванного т-ПА (0,57МЕ/мл).1. The effect of an antifibrinolytic, for example, such as tranexamic acid, expressed in slowing down the process of fibrinolysis caused by t-PA (0.57MU / ml), has been established.

2. Вышеуказанный эффект не наблюдается при добавлении rhSERPING1.2. The above effect is not observed when rhSERPING1 is added.

3. rhSERPING1 и транексамовая кислота, примененные вместе, обладают синергетическим действием по ингибированию вторичного фибринолиза в плазме крови.3. rhSERPING1 and tranexamic acid, used together, have a synergistic effect on the inhibition of secondary fibrinolysis in blood plasma.

4. RhSERPING1 (C1INH_120-500), усеченный по амино-концу, содержащий серпиновый домен, также эффективно потенциирует антифибринолитическое действие транексамовой кислоты.4. RhSERPING1 (C1INH _120-500 ), truncated at the amino end, containing a serpine domain, also effectively potentiates the antifibrinolytic effect of tranexamic acid.

Список литературы:Bibliography:

Anonick, Р.K., J. Vasudevan and S.L. Gonias (1992). "Antifibrinolytic activities of alpha-N-acetyl-L-lysine methyl ester, epsilon-aminocaproic acid, and tranexamic acid. Importance of kringle interactions and active site inhibition." Arterioscler Thromb 12(6): 708-716.Anonick, P.K., J. Vasudevan and S.L. Gonias (1992). "Antifibrinolytic activities of alpha-N-acetyl-L-lysine methyl ester, epsilon-aminocaproic acid, and tranexamic acid. Importance of kringle interactions and active site inhibition." Arterioscler Thromb 12 (6): 708-716.

Chiu, C.J., A.H. McArdle, R. Brown, H.J. Scott and F.N. Gurd (1970). "Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal." Arch Surg 101(4): 478-483.Chiu, C.J., A.H. McArdle, R. Brown, H.J. Scott and F.N. Gurd (1970). "Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal." Arch Surg 101 (4): 478-483.

collaborators, С.-., I. Roberts, H. Shakur, A. Afolabi, K. Brohi, T. Coats, Y. Dewan, S. Gando, G. Guyatt, B.J. Hunt, C. Morales, P. Perel, D. Prieto-Merino and T. Woolley (2011). "The importance of early treatment with tranexamic acid in bleeding trauma patients: an exploratory analysis of the CRASH-2 randomised controlled trial." Lancet 377(9771): 1096-1101, 1101 e1091-1092.collaborators, S.-., I. Roberts, H. Shakur, A. Afolabi, K. Brohi, T. Coats, Y. Dewan, S. Gando, G. Guyatt, B.J. Hunt, C. Morales, P. Perel, D. Prieto-Merino and T. Woolley (2011). "The importance of early treatment with tranexamic acid in bleeding trauma patients: an exploratory analysis of the CRASH-2 randomized controlled trial." Lancet 377 (9771): 1096-1101, 1101 e1091-1092.

collaborators, C.-t, H. Shakur, I. Roberts, R. Bautista, J. Caballero, T. Coats, Y. Dewan, H. El-Sayed, T. Gogichaishvili, S. Gupta, J. Herrera, B. Hunt, P. Iribhogbe, M. Izurieta, H. Khamis, E. Komolafe, M.A. Marrero, J. Mejia-Mantilla, J. Miranda, C. Morales, O. Olaomi, F. Olldashi, P. Perel, R. Peto, P.V. Ramana, R.R. Ravi and S. Yutthakasemsunt (2010). "Effects of tranexamic acid on death, vascular occlusive events, and blood transfusion in trauma patients with significant haemorrhage (CRASH-2): a randomised, placebo-controlled trial." Lancet 376(9734): 23-32.collaborators, C.-t, H. Shakur, I. Roberts, R. Bautista, J. Caballero, T. Coats, Y. Dewan, H. El-Sayed, T. Gogichaishvili, S. Gupta, J. Herrera, B .Hunt, P. Iribhogbe, M. Izurieta, H. Khamis, E. Komolafe, MA Marrero, J. Mejia-Mantilla, J. Miranda, C. Morales, O. Olaomi, F. Olldashi, P. Perel, R. Peto, P.V. Ramana, R.R. Ravi and S. Yutthakasemsunt (2010). "Effects of tranexamic acid on death, vascular occlusive events, and blood transfusion in trauma patients with significant haemorrhage (CRASH-2): a randomised, placebo-controlled trial." Lancet 376 (9734): 23-32.

Dalle Lucca, J.J., Y. Li, M. Simovic, A.E. Pusateri, M. Falabella, M.A. Dubick and G.C. Tsokos (2012). "Effects of C1 inhibitor on tissue damage in a porcine model of controlled hemorrhage." Shock 38(1): 82-91.Dalle Lucca, J.J., Y. Li, M. Simovic, A.E. Pusateri, M. Falabella, M.A. Dubick and G.C. Tsokos (2012). "Effects of C1 inhibitor on tissue damage in a porcine model of controlled hemorrhage." Shock 38 (1): 82-91.

Davis, A.E., 3rd, S. Cai and D. Liu (2007). "C1 inhibitor: biologic activities that are independent of protease inhibition." Immunobiology 212(4-5): 313-323.Davis, A.E., 3rd, S. Cai and D. Liu (2007). "C1 inhibitor: biologic activities that are independent of protease inhibition." Immunobiology 212 (4-5): 313-323.

Davis, A.E., 3rd, F. Lu and P. Mejia (2010). "C1 inhibitor, a multi-functional serine protease inhibitor." Thromb Haemost 104(5): 886-893.Davis, A.E., 3rd, F. Lu and P. Mejia (2010). "C1 inhibitor, a multi-functional serine protease inhibitor." Thromb Haemost 104 (5): 886-893.

Davis, A.E., 3rd, P. Mejia and F. Lu (2008). "Biological activities of C1 inhibitor." Mol Immunol 45(16): 4057-4063.Davis, A.E., 3rd, P. Mejia and F. Lu (2008). "Biological activities of C1 inhibitor." Mol Immunol 45 (16): 4057-4063.

DeLano, F.A., D.B. Hoyt and G.W. Schmid-Schonbein (2013). "Pancreatic digestive enzyme blockade in the intestine increases survival after experimental shock." Sci Transl Med 5(169): 169ra111.DeLano, F.A., D.B. Hoyt and G.W. Schmid-Schonbein (2013). "Pancreatic digestive enzyme blockade in the intestine increases survival after experimental shock." Sci Transl Med 5 (169): 169ra111.

DOBROKHOTOVA, Y., E. DZHOBAVA, S. DANELYAN and S. ZALESSKAYA (2013). "Послеродовые кровотечения. Обоснование оптимальной гемостатической фармакотерапии."DOBROKHOTOVA, Y., E. DZHOBAVA, S. DANELYAN and S. ZALESSKAYA (2013). "Postpartum hemorrhage. Justification for optimal hemostatic pharmacotherapy."

Dunn, С.J. and K.L. Goa (1999). "Tranexamic acid: a review of its use in surgery and other indications." Drugs 57(6): 1005-1032.Dunn, C.J. and K.L. Goa (1999). "Tranexamic acid: a review of its use in surgery and other indications." Drugs 57 (6): 1005-1032.

Ioannou, A., J. Dalle Lucca and G.C. Tsokos (2011). "Immunopathogenesis of ischemia/reperfusion-associated tissue damage." Clin Immunol 141(1): 3-14.Ioannou, A., J. Dalle Lucca and G.C. Tsokos (2011). "Immunopathogenesis of ischemia / reperfusion-associated tissue damage." Clin Immunol 141 (1): 3-14.

Keith, J. C, Jr. (1986). "Effect of lidocaine pretreatment on acute hemorrhagic shock in the anesthetized rat." Circ Shock 19(3): 283-292.Keith, J. C, Jr. (1986). "Effect of lidocaine pretreatment on acute hemorrhagic shock in the anesthetized rat." Circ Shock 19 (3): 283-292.

Ker, K., J. Kiriya, P. Perel, P. Edwards, H. Shakur and I. Roberts (2012). "Avoidable mortality from giving tranexamic acid to bleeding trauma patients: an estimation based on WHO mortality data, a systematic literature review and data from the CRASH-2 trial." BMC Emerg Med 12: 3.Ker, K., J. Kiriya, P. Perel, P. Edwards, H. Shakur and I. Roberts (2012). "Avoidable mortality from giving tranexamic acid to bleeding trauma patients: an assessment based on WHO mortality data, a systematic literature review and data from the CRASH-2 trial." BMC Emerg Med 12: 3.

Langenbach, C. (2006). "Misoprostol in preventing postpartum hemorrhage: A meta-analysis." International Journal of Gynecology & Obstetrics 92(1): 10-18.Langenbach, C. (2006). "Misoprostol in preventing postpartum hemorrhage: A meta-analysis." International Journal of Gynecology & Obstetrics 92 (1): 10-18.

Liu, D., F. Lu, G. Qin, S.M. Fernandes, J. Li and A.E. Davis, 3rd (2007). "C1 inhibitor-mediated protection from sepsis." J Immunol 179(6): 3966-3972.Liu, D., F. Lu, G. Qin, S.M. Fernandes, J. Li and A.E. Davis, 3rd (2007). "C1 inhibitor-mediated protection from sepsis." J Immunol 179 (6): 3966-3972.

Remington, J.P. (1995). Remington, the science and practice of pharmacy. Easton, Pa.Remington, J.P. (1995). Remington, the science and practice of pharmacy. Easton, Pa.

London, UK, Mack Pub. Co.London, UK, Mack Pub. Co.

Pharmaceutical Press: v.Pharmaceutical Press: v.

Roberts, I., D. Prieto-Merino and D. Manno (2014). "Mechanism of action of tranexamic acid in bleeding trauma patients: an exploratory analysis of data from the CRASH-2 trial." Crit Care 18(6): 685.Roberts, I., D. Prieto-Merino and D. Manno (2014). "Mechanism of action of tranexamic acid in bleeding trauma patients: an exploratory analysis of data from the CRASH-2 trial." Crit Care 18 (6): 685.

Rowe, R.C., P.J. Sheskey, W.G. Cook, M.E. Fenton and American Pharmacists Association. (2012). Handbook of pharmaceutical excipients / edited by Raymond C. Rowe, BPharm, PhD, DSC, FRPharmS, FRSC, CPhys, MlnstP, chief scientist, Paul J. Sheskey, BSc, RPh, principal research scientist, the Dow Chemical Company, Midland, MI, USA, Walter G, Cook, BSc, PhD, research fellow, Materials Science group of Pharmaceutical R&D, Pfizer, Sandwich, Kent, UK, Marian E. Fenton, BSc, MSc, development editor, Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, London, UK. London, APhA/Pharmaceutical Press.Rowe, R.C., P.J. Sheskey, W.G. Cook, M.E. Fenton and American Pharmacists Association. (2012). Handbook of pharmaceutical excipients / edited by Raymond C. Rowe, BPharm, PhD, DSC, FRPharmS, FRSC, CPhys, MlnstP, chief scientist, Paul J. Sheskey, BSc, RPh, principal research scientist, the Dow Chemical Company, Midland, MI , USA, Walter G, Cook, BSc, PhD, research fellow, Materials Science group of Pharmaceutical R&D, Pfizer, Sandwich, Kent, UK, Marian E. Fenton, BSc, MSc, development editor, Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, London , UK. London, APhA / Pharmaceutical Press.

Tamion, F., V. Richard, S. Lyoumi, M. Daveau, G. Bonmarchand, J. Leroy, C. Thuillez and J.P. Lebreton (1997). "Gut ischemia and mesenteric synthesis of inflammatory cytokines after hemorrhagic or endotoxic shock." Am J Phvsiol 273(2 Pt 1): G314-321.Tamion, F., V. Richard, S. Lyoumi, M. Daveau, G. Bonmarchand, J. Leroy, C. Thuillez and J.P. Lebreton (1997). "Gut ischemia and mesenteric synthesis of inflammatory cytokines after hemorrhagic or endotoxic shock." Am J Phvsiol 273 (2 Pt 1): G314-321.

van Veen, H.A., J. Koiter, C.J. M. Vogelezang, N. van Wessel, T. van Dam, I. Velterop, K. van Houdt, L. Kupers, D. Horbach, M. Salaheddine, J.H. Nuijens and M.L.M. Mannesse (2012). "Characterization of recombinant human C1 inhibitor secreted in milk of transgenic rabbits." Journal of Biotechnology 162(2-3): 319-326.van Veen, H.A., J. Koiter, C.J. M. Vogelezang, N. van Wessel, T. van Dam, I. Velterop, K. van Houdt, L. Kupers, D. Horbach, M. Salaheddine, J.H. Nuijens and M.L.M. Mannesse (2012). "Characterization of recombinant human C1 inhibitor secreted in milk of transgenic rabbits." Journal of Biotechnology 162 (2-3): 319-326.

Verstraete, M. (1985). "Clinical application of inhibitors of fibrinolysis." Drugs 29(3): 236-261.Verstraete, M. (1985). "Clinical application of inhibitors of fibrinolysis." Drugs 29 (3): 236-261.

Vo, A.A., A. Zeevi, J. Choi, K. Cisneros, M. Toyoda, J. Kahwaji, A. Peng, R. Villicana, D. Puliyanda, N. Reinsmoen, M. Haas and S.C. Jordan (2015). "A phase I/II placebo-controlled trial of C1-inhibitor for prevention of antibody-mediated rejection in HLA sensitized patients." Transplantation 99(2): 299-308.Vo, A.A., A. Zeevi, J. Choi, K. Cisneros, M. Toyoda, J. Kahwaji, A. Peng, R. Villicana, D. Puliyanda, N. Reinsmoen, M. Haas and S.C. Jordan (2015). "A phase I / II placebo-controlled trial of C1-inhibitor for prevention of antibody-mediated rejection in HLA sensitized patients." Transplantation 99 (2): 299-308.

Vymazal, T. (2015). "Massive hemorrhage management-a best evidence topic report." Ther Clin Risk Manag 11: 1107-1111.Vymazal, T. (2015). "Massive hemorrhage management-a best evidence topic report." Ther Clin Risk Manag 11: 1107-1111.

Claims

1. Kit for the treatment of hemorrhagic shock in the form of two containers containing tranexamic acid and recombinant full-size SERPING1 or its serpine domain, as well as a pharmaceutically acceptable solvent or diluent.

2. A kit according to claim 1 for the treatment of hemorrhagic shock, characterized in that one of the containers contains tranexamic acid and the recombinant full-sized SERPING1 or its serpin domain, and the other a pharmaceutically acceptable solvent or diluent.

3. A kit according to claim 1 for the treatment of hemorrhagic shock, characterized in that one of the containers contains tranexamic acid, and the other contains the recombinant full-sized SERPING1 or its serpentine domain and a pharmaceutically acceptable solvent or diluent.

4. The kit according to claim 1 for the treatment of hemorrhagic shock, characterized in that the contents of the containers can be made in the form of a solution or lyophilisate.

5. A kit according to claim 1 for the treatment of hemorrhagic shock, characterized in that the pharmaceutically acceptable solvent or diluent is selected from the group comprising water for injection, saline or Ringer's solution.

6. A kit according to claim 1 for the treatment of hemorrhagic shock, characterized in that the therapeutically effective amount of tranexamic acid is from 0.005 to 0.5 g / kg body weight and the therapeutically effective amount of the recombinant full-sized SERPING1 or its serpine domain is from 10 to 900 ME / kg body weight.

7. A kit according to claim 1 for the treatment of hemorrhagic shock, characterized in that the therapeutically effective amount of tranexamic acid is from 0.01 to 0.05 g / kg body weight and the therapeutically effective amount of the recombinant full-sized SERPING1 or its serpin domain is from 80 up to 280 ME / kg body weight.