RU2568059C1 - Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells - Google Patents
Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2568059C1 RU2568059C1 RU2014145167/10A RU2014145167A RU2568059C1 RU 2568059 C1 RU2568059 C1 RU 2568059C1 RU 2014145167/10 A RU2014145167/10 A RU 2014145167/10A RU 2014145167 A RU2014145167 A RU 2014145167A RU 2568059 C1 RU2568059 C1 RU 2568059C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- medium
- fibroblast
- cultivation
- stem cells
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title abstract 3
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 abstract description 14
- 239000010410 layer Substances 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 abstract 1
- 238000012835 hanging drop method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101710090028 Inositol-3-phosphate synthase 1 Proteins 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- -1 Nanog Proteins 0.000 description 2
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102100037126 Developmental pluripotency-associated protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000881868 Homo sapiens Developmental pluripotency-associated protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000998969 Homo sapiens Inositol-3-phosphate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100030742 Transforming growth factor beta-1 proprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- 101001029301 Xenopus tropicalis Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и трансплантологии (клеточной терапии). Изобретение позволяет получать донор- и пациент-специфические фибробластоподобные клетки для использования их в трансплантологии и в качестве аутологичного фидерного (питающего) слоя для культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и поддержания их в недифференцированном состоянии.The invention relates to biotechnology and transplantology (cell therapy). The invention allows to obtain donor and patient-specific fibroblast-like cells for use in transplantology and as an autologous feeder (feeding) layer for the cultivation of induced human pluripotent stem cells and maintaining them in an undifferentiated state.
В 2006 г. японским исследователям Такахаши и Яманака [1] удалось осуществить репрограммирование взрослых и эмбриональных фибробластов мыши в плюрипотентные стволовые клетки путем введения в эти клетки с помощью ретровирусных векторов, четырех транскрипционных факторов Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4. Авторы назвали эти клетки индуцированными плюрипотентными стволовыми (ИПС) клетками. Полученные в результате такой обработки ИПС клетки своей морфологией, ростовыми свойствами и экспрессией специфических маркеров были аналогичны эмбриональным стволовым (ЭС) клеткам. Уже через год Такахаши [2] и Накагава [3] из той же лаборатории Киотского университета сообщили об успешной дедифференцировке фибробластов взрослого человека и получении ИПС клеток с помощью тех же факторов (Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4). Недифференцированное состояние ИПС клеток характеризуется различными признаками и поддерживается, в частности, культивированием на слое питающих клеток. Эти клетки ингибируют и предотвращают дифференцировку ИПС клеток, обеспечивая их всеми необходимыми факторами (Lif, FGF, TGFβ, Activin, Wnt и др.) для поддержания роста и самообновления. Слой питающих клеток, называемых фидерными клетками, обычно представляет собой слой эмбриональных мышиных фибробластов или фибробластов человека, полученных из крайней плоти, инактивированных митомицином С или гамма-облучением. Недифференцированные ЭС и ИПС клетки характеризуются высокой активностью щелочной фосфатазы [2], экспрессией протеогликанов TRA-1-60 и TRA-1-81, гликолипида SSEA-4 и в меньшей степени гликолипида SSEA-3 [4]. SSEA-4 и SSEA-3 характерны только для ЭС и ИПС клеток человека и приматов, ЭС клетки мыши несут на своей поверхности только гликопротеин SSEA-1 [1]. Внутриклеточными маркерами недифференцированного состояния являются транскрипционные факторы (ТФ), необходимые для поддержания плюрипотентности ИПС и ЭС клеток, такие как Oct4, Nanog и Sox2 [1-3]. Недифференцированные ЭС и ИПС клетки растут плотными чаще всего круглыми колониями. Размер клеток составляет около 20 микрон, наблюдается высокое соотношение ядро-цитоплазма, хорошо видны ядрышки, характерно перинуклеарное расположение митохондрий, низкое содержание АТФ, высокий уровень потребления кислорода и низкий уровень содержания митохондриальной ДНК [5-8].In 2006, Japanese researchers Takahashi and Yamanaka [1] were able to reprogram adult and embryonic mouse fibroblasts into pluripotent stem cells by introducing four transcription factors Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, and Klf4 into these cells using retroviral vectors. The authors called these cells induced pluripotent stem (IPA) cells. The IPS cells obtained as a result of this treatment by their morphology, growth properties, and expression of specific markers were similar to embryonic stem (ES) cells. A year later, Takahashi [2] and Nakagawa [3] from the same laboratory at Kyoto University reported the successful dedifferentiation of adult fibroblasts and the production of IPA cells using the same factors (Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4). The undifferentiated state of IPA cells is characterized by various signs and is supported, in particular, by cultivation on a layer of feeding cells. These cells inhibit and prevent the differentiation of IPS cells, providing them with all the necessary factors (Lif, FGF, TGFβ, Activin, Wnt, etc.) to support growth and self-renewal. The layer of feeder cells, called feeder cells, is usually a layer of human embryonic murine fibroblasts or fibroblasts derived from the foreskin, inactivated by mitomycin C or gamma radiation. Undifferentiated ES and IPS cells are characterized by high alkaline phosphatase activity [2], expression of proteoglycans TRA-1-60 and TRA-1-81, glycolipid SSEA-4, and to a lesser extent glycolipid SSEA-3 [4]. SSEA-4 and SSEA-3 are characteristic only for ES and IPS cells of humans and primates, mouse ES cells carry only SSEA-1 glycoprotein on their surface [1]. Intracellular markers of an undifferentiated state are transcription factors (TFs) necessary for maintaining pluripotency of IPA and ES cells, such as Oct4, Nanog, and Sox2 [1-3]. Undifferentiated ES and IPS cells grow dense most often in round colonies. The cell size is about 20 microns, a high ratio of nucleus-cytoplasm is observed, nucleoli are clearly visible, the perinuclear arrangement of mitochondria is characteristic, low ATP content, high oxygen consumption and low levels of mitochondrial DNA [5-8].
ИПС клетки, находясь в недифференцированном состоянии, являются неисчерпаемым источником для получения любых дифференцированных клеток организма и поэтому представляются весьма перспективными для индивидуализированной клеточной терапии различных патологий человека. ИПС и ЭС клетки способны неограниченно пролиферировать in vitro, не теряя своих плюрипотентных свойств. В этих клетках работают каскады сигнальных путей, которые блокируют дифференцировку и способствуют поддержанию и активации ТФ плюрипотентности. В конце 20 века определили три главных ТФ, необходимых для поддержания плюрипотентности: Oct3/4 (POU5F1), Sox2 и Nanog. [9-11]. Они тесно взаимодействуют как между собой, так и с множеством активных и, что не менее важно, не активных генов. Часть генов ответственны за поддержание плюрипотентности ЭС и ИПС клеток, а часть за дифференцировку в экто-, энто- и мезодермальном направлении, а также в экстраэмбриональные ткани.IPA cells, being in an undifferentiated state, are an inexhaustible source for obtaining any differentiated cells of the body and therefore appear to be very promising for individualized cell therapy of various human pathologies. IPA and ES cells are capable of unlimited proliferation in vitro without losing their pluripotent properties. In these cells, cascades of signaling pathways work that block differentiation and contribute to the maintenance and activation of TF pluripotency. At the end of the 20th century, three major TFs needed to maintain pluripotency were identified: Oct3 / 4 (POU5F1), Sox2, and Nanog. [9-11]. They closely interact with each other, as well as with many active and, no less important, inactive genes. Some of the genes are responsible for maintaining the pluripotency of ES and IPS cells, and partly for differentiation in the ecto-, ento-, and mesodermal direction, as well as in extraembryonic tissues.
Дифференцировка ИПС и ЭС клеток в определенные типы клеток происходит вследствие восстановления маркеров метилирования, которые, в свою очередь, позволяют регулировать экспрессию тканеспецифичных генов.The differentiation of IPA and ES cells into certain cell types occurs due to the restoration of methylation markers, which, in turn, allow the expression of tissue-specific genes to be regulated.
Недавно были описаны способы получения фибробластоподобных клеток из ЭС клеток человека [12, 13]. Клетки имели схожий с фибробластами фенотип, и было показано, что фибробластоподобные клетки экспрессируют паттерн генов, характерных для первичных фибробластов (коллагены I, III, IV и V типов, фибронектин). При этом уровень экспрессии был в несколько раз выше, чем у первичных фибробластов. Для получения фибробластоподобных клеток использовали фактор роста фибробластов и проводили неоднократные пассирования, чтобы добиться моногенной культуры.Recently, methods for producing fibroblast-like cells from human ES cells have been described [12, 13]. The cells had a phenotype similar to fibroblasts, and it was shown that fibroblast-like cells express a pattern of genes characteristic of primary fibroblasts (type I, III, IV and V collagens, fibronectin). Moreover, the expression level was several times higher than that of primary fibroblasts. To obtain fibroblast-like cells, the fibroblast growth factor was used and repeated passages were performed to achieve a monogenic culture.
Однако работ по получению фибробластов из ИПС клеток к настоящему времени не известно.However, to date, the production of fibroblasts from IPA cells is not yet known.
Фибробласты являются важной составляющей частью технологии культивирования как ЭС, так и ИПС клеток человека в недифференцированном состоянии, выступая для них в качестве фидерного слоя.Fibroblasts are an important component of the cultivation technology of both ES and IPA of human cells in an undifferentiated state, acting for them as a feeder layer.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является получение пациент-специфических или индивидуализированных фибробластов из ИПС клеток в больших количествах, что открывает широкие перспективы для их использования не только в качестве фидерного слоя, но и в качестве материала для аутологичной трансплантации человеку при различных травмах или заболеваниях. Указанный технический результат достигается за счет подобранных условий диссоциации ИПС клеток до моноклеточной суспензии и дальнейшего культивирования в специальных ростовых средах.The technical result achieved by the implementation of the present invention is to obtain patient-specific or individualized fibroblasts from IPA cells in large quantities, which opens up wide prospects for their use not only as a feeder layer, but also as a material for autologous transplantation to humans with various injuries or diseases. The specified technical result is achieved due to the selected conditions for the dissociation of IPA cells to a single cell suspension and further cultivation in special growth media.
Под индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека понимаются клетки, полученные из дифференцированных соматических клеток человека путем репрограммирования.Under induced human pluripotent stem cells refers to cells obtained from differentiated somatic human cells by reprogramming.
Под фидерным слоем понимается слой фибробластов, на котором проходит культивирование ЭС и ИПС клеток человека.Under the feeder layer is meant a layer of fibroblasts, on which the cultivation of ES and IPS human cells.
ПримерыExamples
Авторы настоящего изобретения установили, что ИПС клетки человека способны дифференцироваться в производные трех зародышевых листков: эктодерму, мезодерму и энтодерму и что ИПС клетки человека способны дифференцироваться в фибробласты (фибробластоподобные клетки).The authors of the present invention have found that human IPA can differentiate into derivatives of three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm, and that human IPA can differentiate into fibroblasts (fibroblast-like cells).
Было установлено, что фибробласты, полученные из ИПС клеток человека, могут служить эффективным фидерным слоем для культивирования аутологичных ИПС клеток и ИПС клеток от других доноров и поддержания их в недифференцированном состоянии.It was found that fibroblasts obtained from human IPA cells can serve as an effective feeder layer for culturing autologous IPA cells and IPA cells from other donors and maintaining them in an undifferentiated state.
Пример 1.Example 1
Проводили исследование возможности дифференцировки ИПС клеток человека в фибробласты и способности полученных фибробластов служить эффективным фидерным слоем для культивирования ИПС клеток и поддержания их в недифференцированном состоянии.A study was made of the possibility of differentiating human IPA cells into fibroblasts and the ability of the obtained fibroblasts to serve as an effective feeder layer for culturing IPA cells and maintaining them in an undifferentiated state.
Эксперименты были проведены на линиях ИПС клеток человека. Для получения фибробластов были использованы 2 линии клеток от здорового донора.The experiments were carried out on the lines of human IPS cells. To obtain fibroblasts, 2 cell lines from a healthy donor were used.
ИПС клетки линия ПО2, 56 пассаж,IPS cells line PO2, 56 passage,
ИПС клетки линия ПО6, 32 пассаж.IPS cell line PO6, 32 passage
Способность сохранять плюрипотентность ИПС клеток на полученных фибробластах проверяли на линиях здорового донора (ПО2 и ПО6 - аутологичные клетки), а также на линиях от трех пациентов с болезнью Паркинсона: Тр5, Ку15 и Бл6.The ability to maintain the pluripotency of IPA cells on the obtained fibroblasts was tested on the lines of a healthy donor (PO2 and PO6 - autologous cells), as well as on lines from three patients with Parkinson's disease: Tr5, Ku15 and Bl6.
Способность сохранять плюрипотентность на полученных фибробластах также проверяли на линии ЭС клеток человека huES09 (клетки любезно предоставлены М.А. Лагарьковой, Институт Общей генетики им. Н.И. Вавилова, РАН).The ability to maintain pluripotency on the obtained fibroblasts was also tested on the huES09 human ES cell line (cells were kindly provided by M.A. Lagarkova, N.I. Vavilov Institute of General Genetics, RAS).
Недифференцированные ИПС клетки снимали стандартным способом с применением диспазы, далее клетки аккуратно ресуспендировали до моноклеточной суспензии и помещали в среду, состоящую из среды для культивирования недифференцированных ЭС клеток (mTeSr)+среда для культивирования эмбриоидных тел (ЭТ среда) в соотношении 1:1.Undifferentiated IPA cells were removed in a standard manner using dispase, then the cells were gently resuspended to a monocellular suspension and placed in a medium consisting of medium for culturing undifferentiated ES cells (mTeSr) + medium for culturing embryoid bodies (ET medium) in a 1: 1 ratio.
Среда для эмбриоидных тел:Medium for embryoid bodies:
DMEM/F12, 20% фетальной сыворотки коровы, 2 мМ L-глутамин, 1% заменимых аминокислот, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанол, пенициллин/стрептомицин (50 ед.мл / 50 мкг мл).DMEM / F12, 20% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 1% non-essential amino acids, 0.1 mM beta-mercaptoethanol, penicillin / streptomycin (50 units / 50 μg ml).
Для получения эмбриоидных тел ИПС клетки культивировали в СО-2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2 методом «висячей капли» или помещали в 96-луночный круглодонный планшет из расчета 3000-6000 клеток на лунку в 100 мкл среды. Суть метода «висячей капли» заключалась в следующем: на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри по каплям наносили суспензию клеток, в 20 мкл которой содержалось 2000 клеток. Капли наносили на таком расстоянии друг от друга, чтобы они не слились, когда крышку переворачивают и возвращают на чашку. В саму чашку наливали 4 мл среды DMEM, содержащей пенициллин/стрептомицин (50 ед. в мл / 50 мкг в мл), аккуратно переворачивали крышку с капельками суспензии и закрывали ею чашку. Через сутки наблюдали появление ЭТ в каплях. В случае посева клеток в 96-луночный круглодонный планшет также через сутки наблюдали образование ЭТ (фиг. 1).To obtain embryoid bodies, IPA cells were cultured in a CO-2 incubator at 37 ° C and 5% CO 2 by the “hanging drop” method or placed in a 96-well round-bottom plate at the rate of 3000-6000 cells per well in 100 μl of medium. The essence of the “hanging drop” method was as follows: a suspension of cells was applied dropwise to the inner surface of the lid of the Petri dish, 20 μl of which contained 2000 cells. Drops were applied at such a distance from each other that they did not merge when the lid was turned over and returned to the cup. 4 ml of DMEM containing penicillin / streptomycin (50 units per ml / 50 μg per ml) were poured into the cup itself, the lid with droplets of suspension was carefully turned over and the cup was closed with it. After a day, the appearance of ET in drops was observed. In the case of seeding cells in a 96-well round-bottom plate, ET formation was also observed after 24 hours (Fig. 1).
Далее трехдневные ЭТ переносили на 24-луночный планшет, покрытый 0,1% желатином или матригелем из расчета по 1 ЭТ на лунку в 1 мл среды для ЭТ. Прикрепление происходило одинаково хорошо как на желатиновую подложку, так и на подложку из матригеля. Через сутки по периметру ЭТ начинали появляться фибробластоподобные клетки (фиг. 2). Смену ростовой среды осуществляли каждые 2-3 дня. Культивирование проводили в СО-2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2 в течение 8-10 суток, за это время клетки достигали 50-60% монослоя.Next, three-day ETs were transferred to a 24-well plate coated with 0.1% gelatin or matrigel at the rate of 1 ET per well in 1 ml of ET medium. The attachment occurred equally well on both the gelatin substrate and the matrigel substrate. After a day, fibroblast-like cells began to appear around the perimeter of ET (Fig. 2). The growth medium was changed every 2-3 days. Cultivation was carried out in a CO-2 incubator at 37 ° C and 5% CO 2 for 8-10 days, during which time the cells reached 50-60% of the monolayer.
Для того чтобы при первом пересеве получить моногенную культуру из фибробластоподобных клеток, было необходимо механически отделить остатки эмбриоидного тела (на фиг. 2 выглядит как темное пятно в центре) от слоя фибробластоподобных клеток. Под микроскопом, при увеличении ×50, стерильным наконечником для автоматического дозатора на 200 мкл аккуратно отделяли остатки ЭТ и удаляли его из лунки. Клетки промывали средой DMEM пенициллин/стрептомицин (50ед.мл / 50 мкг мл) и в лунки вносили теплый (37°С) 0,05% раствор трипсина. Планшеты инкубировали 3-5 мин в СО-2-инкубаторе и пипетировали клетки в ЭТ среде до моноклеточной суспензии. Затем клетки переносили на чашку Петри (диаметр 35 мм) в 2 мл среды для ЭТ. Использовали как необработанные чашки Петри, так и покрытые матригелем и 0,1% желатином. Фибробластоподобные клетки одинаково хорошо росли на всех чашках. Через сутки делали смену среды с заменой ее на среду для роста фибробластов (среда DMEM, содержащая 10% фетальной сыворотки, 1% заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамин, пеницилин/стрептомицин (50ед.мл / 50 мкг мл) (фиг. 3). Все последующие смены среды и пересевы осуществляли на этой же среде для фибробластов. Через 3-4 дня по достижении монослоя клеток осуществляли пересев в соотношении 1:2 на новые чашки Петри диаметром 35 мм (фиг. 4). Как видно из фотографии, представленной на фиг. 4, полученные клетки морфологически схожи с фибробластами кожи человека. Имунноцитохимическое окрашивание антителами к AFP-alfa («abcam», ab28244) показал наличие специфического для фибробластов антигена в 100% клетках (фиг. 5).In order to obtain a monogenic culture from fibroblast-like cells at the first pass, it was necessary to mechanically separate the remains of the embryoid body (in Fig. 2 it looks like a dark spot in the center) from a layer of fibroblast-like cells. Under a microscope, at a magnification of × 50, a sterile tip for an automatic dispenser of 200 μl accurately separated the residues of ET and removed it from the well. The cells were washed with penicillin / streptomycin DMEM medium (50 U / ml / 50 μg ml) and a warm (37 ° C) 0.05% trypsin solution was added to the wells. The plates were incubated for 3-5 min in a CO-2 incubator and cells were pipetted in ET medium to a monocellular suspension. Then the cells were transferred to a Petri dish (diameter 35 mm) in 2 ml of medium for ET. Used both untreated Petri dishes, and coated with matrigel and 0.1% gelatin. Fibroblast-like cells grew equally well on all plates. After a day, a medium change was made with its replacement with fibroblast growth medium (DMEM medium containing 10% fetal serum, 1% non-essential amino acids, 2 mM L-glutamine, penicillin / streptomycin (50 units / 50 μg ml) (Fig. 3 ). All subsequent medium changes and transfers were carried out on the same medium for fibroblasts. After 3-4 days, upon reaching the monolayer of cells, 1: 2 transfer was performed on new Petri dishes with a diameter of 35 mm (Fig. 4). As can be seen from the photograph, shown in Fig. 4, the obtained cells are morphologically similar to fibroblasts of human skin. cytochemical staining with antibodies to AFP-alfa ( «abcam», ab28244) showed the presence of fibroblast-specific antigen in 100% of the cells (FIG. 5).
Полученные фибробласты (фибробластоподобные клетки) были способны проходить до 20 пассажей, при этом до 10-го пассажа они сохраняли активный пролиферативный потенциал. Далее он несколько снижался, что характерно и для первичных фибробластов кожи человека.The resulting fibroblasts (fibroblast-like cells) were able to pass up to 20 passages, while up to the 10th passage they retained active proliferative potential. Further, it decreased slightly, which is also characteristic of primary fibroblasts of human skin.
На полученных фибробластоподобных клетках (дериватах) в разных экспериментах культивировали ИПС клетки линий ПО2, Бл6, Ку15, Тр5, ПО6, а также ЭС клетки линии huES09. Для культивирования использовали среду DMEM/F12, содержащую 20% заменителя сыворотки, 2 мМ глутамин, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанол, 1% заменимых аминокислот, пенициллин/стрептомицин (50 ед. мл / 50 мкг мл). Все 6 линий клеток успешно культивировались на фидерном слое из полученных дериватов, при этом они сохраняли морфологию недифференцированных плюрипотентных клеток даже после 3-5 пассажей (фиг. 6-8). Не было отмечено фенотипических и морфологических отличий при культивировании на дериватах, полученных из линий ПО2 и ПО6 между аутологичными ИПС клетками (дериваты из линии ПО2 - ИПС клетки линии ПО2, дериваты из линии ПО6 - ИПС клетки линии ПО6) и ИПС клетками от других доноров (дериваты из линии ПО2 - ИПС клетки линий Тр5, Бл6, Ку15; дериваты ПО6 - ИПС клетки Тр5, Бл6, Ку15). Схожий фенотип сохраняли также ЭС клетки huES09 как на дериватах ПО2, так и на ПО6.On the obtained fibroblast-like cells (derivatives) in different experiments, IPS cells of the PO2, Bl6, Ku15, Tr5, PO6 lines, as well as ES cells of the huES09 line were cultivated. For cultivation, DMEM / F12 medium containing 20% serum substitute, 2 mM glutamine, 0.1 mM beta-mercaptoethanol, 1% non-essential amino acids, penicillin / streptomycin (50 units ml / 50 μg ml) was used. All 6 cell lines were successfully cultured on the feeder layer from the obtained derivatives, while they retained the morphology of undifferentiated pluripotent cells even after 3-5 passages (Fig. 6-8). There were no phenotypic and morphological differences during cultivation on derivatives obtained from PO2 and PO6 lines between autologous IPA cells (derivatives from the PO2 line - IPA cells of the PO2 line, derivatives from PO6 line - IPA cells of the PO6 line) and IPA cells from other donors ( Derivatives from the PO2 line — IPS cells of the Tr5, Bl6, Ku15 lines; Derivatives PO6 — IPS cells of the Tr5, Bl6, Ku15 lines). A similar phenotype was also retained by huES09 ES cells both on PO2 and PO6 derivatives.
ИПС клетки линий Тр5 и Ку15 были впоследствии перенесены на подложку из матригеля в ростовую среду mTeSr и прошли еще несколько пассажей, после чего были окрашены на меркеры плюрипотентности SSEA4 и Sox2 (фиг. 9). На линии ЭС huES09 методом ОТ-ПЦР была показана экспрессия генов Nanog, Oct4, Klf4, FoxD3, Hesx1, DPPA4, Sox. Экспрессия в ЭС клетках прошедших 5 пассажей на линии фибробластоподобных клеток, затем 4 пассажа на подложке из матригеля в среде mTeSr была сравнима с экспрессией в клетках, культивирующихся в стандартных условиях только на подложке из матригеля в среде mTeSr. (фиг. 10).IPS cells of the Tr5 and Ku15 lines were subsequently transferred onto a substrate from matrigel into mTeSr growth medium and passed several more passages, after which they were stained with pluripotency merckers SSEA4 and Sox2 (Fig. 9). On the huES09 ES line, the expression of the Nanog, Oct4, Klf4, FoxD3, Hesx1, DPPA4, Sox genes was shown by RT-PCR. Expression in ES cells of the past 5 passages on a fibroblast-like cell line, then 4 passages on a matrigel substrate in mTeSr medium was comparable to expression in cells cultured under standard conditions only on a matrigel substrate in mTeSr medium. (Fig. 10).
Надо отметить, что ИПС и ЭС клетки после переноса их на дериваты значительно улучшают свою морфологию, практически все колонии имеют правильную округлую форму, количество дифференцированных клеток, которые неизбежно появляются в процессе культивирования на матригеле, практически сводится к нулю.It should be noted that after transferring them to derivatives, IPA and ES cells significantly improve their morphology, almost all colonies have a regular round shape, the number of differentiated cells that inevitably appear during cultivation on matrigel is practically reduced to zero.
При стандартных условиях культивирования ИПС и ЭС клеток человека с использованием подложки из матригеля и специально созданной среды mTeSr необходима ежедневная смена среды. Было показано, что при культивировании ЭС и ИПС клеток человека на полученных нами фибробластоподобных клетках смену среды можно проводить через 2-3 суток без потери этими клетками свойств плюрипотентности.Under standard conditions for the cultivation of human IPA and ES cells using a matrigel substrate and a specially created mTeSr medium, a daily change of medium is necessary. It was shown that during the cultivation of ES and IPS human cells on the obtained fibroblast-like cells, a medium change can be carried out after 2-3 days without loss of pluripotency properties by these cells.
Полученные фибробластоподобные клетки можно подвергать криозамораживанию в фетальной сыворотке с 10% ДМСО, 1 час при -20°С, с последующим переносом в кельвинатор на -70°С. Для длительного хранения клетки переносятся в жидкий азот (-196°С).The obtained fibroblast-like cells can be subjected to cryo-freezing in fetal serum with 10% DMSO, 1 hour at -20 ° C, followed by transfer to -70 ° C in a kelvinator. For long-term storage, cells are transferred to liquid nitrogen (-196 ° C).
Разморозка полученных дериватов.Defrosting Derivatives Received.
Разморозку можно проводить двумя способами.Defrosting can be done in two ways.
1. Ампулы с клетками помещаются в водяную баню на 37°С, после полной разморозки суспензия клеток переносится на чашку Петри (диаметр 35 мм) в 2 мл среды для культивирования фибробластов, через 3-4 часа после прикрепления клеток делается полная замена среды на свежую.1. Ampoules with cells are placed in a water bath at 37 ° C, after complete defrosting, the cell suspension is transferred to a Petri dish (diameter 35 mm) in 2 ml of fibroblast culture medium, 3-4 hours after the cells are attached, the medium is completely replaced with fresh .
2. Ампулы с клетками помещаются в водяную баню на 37°С, после полной разморозки суспензия клеток переносится в 15 мл пробирку с 10 мл теплой среды DMEM, центрифугируется 5 мин, 2 тыс. об. мин. Надосадочная жидкость удаляется, клетки аккуратно ресуспендируются в ростовой среде для фибробластов и переносятся на чашку Петри (диаметр 35 мм) в 2 мл среды для культивирования фибробластов. Фибробластоподобные клетки можно размораживать как на чашки, обработанные желатином, так и на необработанные чашки Петри.2. Ampoules with cells are placed in a water bath at 37 ° C, after complete defrosting, the cell suspension is transferred to a 15 ml tube with 10 ml of warm DMEM medium, centrifuged for 5 min, 2 thousand vol. min The supernatant is removed, the cells are gently resuspended in the growth medium for fibroblasts and transferred to a Petri dish (diameter 35 mm) in 2 ml of medium for culturing fibroblasts. Fibroblast-like cells can be thawed on both gelatin-treated plates and untreated Petri dishes.
ЛитератураLiterature
1. Takahashi К., Yamanaka S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126: 663-676.1. Takahashi, K., Yamanaka S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126: 663-676.
2. Takahashi K., Tanabe K., et al. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131: 861-872.2. Takahashi K., Tanabe K., et al. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131: 861-872.
3. Nakagawa M., Koyanagi M., Tanabe K., et al. (2008) Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts, Nature Biotechnology, 26(1): 101-106.3. Nakagawa M., Koyanagi M., Tanabe K., et al. (2008) Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts, Nature Biotechnology, 26 (1): 101-106.
4. Park I. - H., Arora N., Huo H., et al. (2008) Disease-specific induced pluripotent stem (iPS) cells, Cell. 134(5): 877-886.4. Park I. - H., Arora N., Huo H., et al. (2008) Disease-specific induced pluripotent stem (iPS) cells, Cell. 134 (5): 877-886.
5. Parker, G.C., Acsadi, G., Brenner, C.A. (2009) Mitochondria: determinants of stem cell fate? Stem Cells and Development, 18, 803-806.5. Parker, G.C., Acsadi, G., Brenner, C.A. (2009) Mitochondria: determinants of stem cell fate? Stem Cells and Development, 18, 803-806.
6. Facucho-Oliveira, J.M., St John, J.C. (2009) The relationship between pluripotency and mitochondrial DNA proliferation during early embryo development and embryonic stem cell differentiation, Stem Cell Reviews and Reports, 5, 140-158.6. Facucho-Oliveira, J. M., St John, J. C. (2009) The relationship between pluripotency and mitochondrial DNA proliferation during early embryo development and embryonic stem cell differentiation, Stem Cell Reviews and Reports, 5, 140-158.
7. Mattout, Α., Meshorer, E. (2010) Chromatin plasticity and genome organization in pluripotent embryonic stem cells, Current Opinion in Cell Biology, 22, 334-341.7. Mattout, Α., Meshorer, E. (2010) Chromatin plasticity and genome organization in pluripotent embryonic stem cells, Current Opinion in Cell Biology, 22, 334-341.
8. Park, S.H., Kook, M.C, Kim, E.Y., Park, S., Lim, J. (2004) Ultra structure of human embryonic stem cells and spontaneous and retinoic acid-induced differentiating cells, Ultra structural Pathology, 28, 229-238.8. Park, SH, Kook, MC, Kim, EY, Park, S., Lim, J. (2004) Ultra structure of human embryonic stem cells and spontaneous and retinoic acid-induced differentiating cells, Ultra structural Pathology, 28, 229 -238.
9. Chambers, I., Colby, D., Robertson, M, Nichols, J., Lee, S., Tweedie, S., Smith, A. (2003) Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells, Cell, 113, 643-655.9. Chambers, I., Colby, D., Robertson, M, Nichols, J., Lee, S., Tweedie, S., Smith, A. (2003) Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells, Cell, 113, 643-655.
10. Schöler, H.R., Hatzopoulos, A.K., Balling, R., Suzuki, N., Gruss, P. (1989) A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germlinespecific expression of an Oct factor, The EMBO Journal, 8, 2543-2550.10. Schöler, HR, Hatzopoulos, AK, Balling, R., Suzuki, N., Gruss, P. (1989) A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germlinespecific expression of an Oct factor, The EMBO Journal, 8, 2543-2550.
11. Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C, Dailey, L. (1995) Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3, Genes & Development, 9, 2635-2645.11. Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C, Dailey, L. (1995) Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3, Genes & Development, 9, 2635-2645.
12. Hsin-Fu Chen, Ching-Yu Chuang, Yu-Kai Shieh, Hao-Wei Chang, Hong-Nerng Ho, and Hung-Chih Kuo. (2009) Novel autogenic feeders derived from human embryonic stem cells (hESCs) support an undifferentiated status of hESCs in xeno-free culture conditions, Human Reproduction, Vol. 24, No.5 pp. 1114-1125.12. Hsin-Fu Chen, Ching-Yu Chuang, Yu-Kai Shieh, Hao-Wei Chang, Hong-Nerng Ho, and Hung-Chih Kuo. (2009) Novel autogenic feeders derived from human embryonic stem cells (hESCs) support an undifferentiated status of hESCs in xeno-free culture conditions, Human Reproduction, Vol. 24, No.5 pp. 1114-1125.
13. Chunhui Xu, Jianjie Jiang, Virginie Sottile, Jim McWhir, Jane Lebkowski, Melissa K. Carpentera. (2004) Immortalized Fibroblast-Like Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Support Undifferentiated Cell Growth, STEM CELLS, 22, 972-980.13. Chunhui Xu, Jianjie Jiang, Virginie Sottile, Jim McWhir, Jane Lebkowski, Melissa K. Carpentera. (2004) Immortalized Fibroblast-Like Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Support Undifferentiated Cell Growth, STEM CELLS, 22, 972-980.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145167/10A RU2568059C1 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145167/10A RU2568059C1 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2568059C1 true RU2568059C1 (en) | 2015-11-10 |
Family
ID=54537299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014145167/10A RU2568059C1 (en) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2568059C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2555149A (en) * | 2016-04-21 | 2018-04-25 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| JPWO2020111271A1 (en) * | 2018-11-30 | 2021-10-14 | 株式会社 資生堂 | Compositions for treating or preventing skin pigmentation |
| CN114787341A (en) * | 2019-12-09 | 2022-07-22 | 株式会社大熊制药 | Method for preparing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells prepared thereby |
| RU2823729C1 (en) * | 2020-12-09 | 2024-07-29 | Тэвун Фармасьютикал Ко., Лтд. | Method of producing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells obtained according to this method |
-
2014
- 2014-11-11 RU RU2014145167/10A patent/RU2568059C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HSIN-FU CHEN et al, Novel autogenic feeders derived from human embryonic stem cells (hESCs) support an undifferentiated status of hESCs in xeno-free culture conditions, Human Reproduction, 2009, Vol. 24, No.5 pp. 1114-1125,RU 2492232 C2, 10.09.2013 * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11591471B2 (en) | 2016-04-21 | 2023-02-28 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11999853B2 (en) | 2016-04-21 | 2024-06-04 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US10711136B2 (en) | 2016-04-21 | 2020-07-14 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11091639B2 (en) | 2016-04-21 | 2021-08-17 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| GB2555149B (en) * | 2016-04-21 | 2022-10-05 | King S College London | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11377559B2 (en) | 2016-04-21 | 2022-07-05 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US10273549B2 (en) | 2016-04-21 | 2019-04-30 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11739217B2 (en) | 2016-04-21 | 2023-08-29 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US12410317B2 (en) | 2016-04-21 | 2025-09-09 | Faircraft | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| GB2555149A (en) * | 2016-04-21 | 2018-04-25 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| JPWO2020111271A1 (en) * | 2018-11-30 | 2021-10-14 | 株式会社 資生堂 | Compositions for treating or preventing skin pigmentation |
| US12357560B2 (en) | 2018-11-30 | 2025-07-15 | Shiseido Company, Ltd. | Composition for treating or preventing skin pigmentation |
| EP3888756A4 (en) * | 2018-11-30 | 2022-07-13 | Shiseido Company, Ltd. | Composition for treating or preventing skin pigmentation |
| CN114787341A (en) * | 2019-12-09 | 2022-07-22 | 株式会社大熊制药 | Method for preparing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells prepared thereby |
| RU2823729C1 (en) * | 2020-12-09 | 2024-07-29 | Тэвун Фармасьютикал Ко., Лтд. | Method of producing mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells obtained according to this method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7053551B2 (en) | Mediums, cell cultures and methods for culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state | |
| CN103380212B (en) | A cell culture platform for single-cell sorting and enhanced IPSC reprogramming | |
| US8609417B2 (en) | Methods and compositions for stem cell cultures | |
| Yusuf et al. | Embryonic fibroblasts represent a connecting link between mesenchymal and embryonic stem cells | |
| Meng et al. | Synergistic effect of medium, matrix, and exogenous factors on the adhesion and growth of human pluripotent stem cells under defined, xeno-free conditions | |
| WO2008007082A2 (en) | Cell growth medium | |
| RU2010147817A (en) | PLURIPOTENT CELLS | |
| EP3504324B1 (en) | Differentiation of pluripotent stem cells into corneal cells | |
| AU2021101223A4 (en) | METHOD FOR LONG-TERM IN VITRO CULTURE OF CHICKEN PGCs | |
| Zhang et al. | Differentiation and characterization of rhesus monkey atrial and ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells | |
| US20110142935A1 (en) | Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions using matrix overlay methods | |
| RU2568059C1 (en) | Method of obtaining of patient (donor) - specific fibroblast-like cells from induced pluripotent human stem cells | |
| CA3221435A1 (en) | Serum free media for suspension culture of mammalian livestock pluripotent stem cells | |
| KR20120118407A (en) | Placenta-derived cells conditioned media and animal-free, feeder-free culture method for maintaining undifferentiated stem cells using the same | |
| TWI280280B (en) | Culture system and method for expansion and undifferentiated growth of human embryonic stem cells | |
| CN106754657A (en) | A serum-free medium for monkey embryonic stem cells | |
| Wang et al. | Activin A can induce definitive endoderm differentiation from human parthenogenetic embryonic stem cells | |
| CN118995583A (en) | Methods for somatic reprogramming to generate induced pluripotent stem cells | |
| US20250051724A1 (en) | Medium composition for culturing porcine pluripotent stem cells | |
| Witteveldt et al. | Differentiation of mouse embryonic stem cells to neuronal cells using hanging droplets and retinoic acid | |
| Li et al. | Converting mouse epiblast stem cells into mouse embryonic stem cells by using small molecules | |
| Mohammadi et al. | Generation of rat embryonic germ cells via inhibition of TGFss and MEK pathways | |
| KR100856706B1 (en) | Methods for inducing differentiation from human embryonic stem cells to dopaminergic neurons by using vascular endothelial growth factor | |
| Azmi et al. | Neural fate commitment of rat full-term amniotic fluid stem cells via three-dimensional embryoid bodies and neurospheres formation | |
| WO2008018684A1 (en) | Culture medium for co-culturing of human stem cells and their feeder cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201112 |