RU2332248C1 - Method of chromatographic purification of buserelin - Google Patents
Method of chromatographic purification of buserelin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2332248C1 RU2332248C1 RU2007120438/15A RU2007120438A RU2332248C1 RU 2332248 C1 RU2332248 C1 RU 2332248C1 RU 2007120438/15 A RU2007120438/15 A RU 2007120438/15A RU 2007120438 A RU2007120438 A RU 2007120438A RU 2332248 C1 RU2332248 C1 RU 2332248C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- buserelin
- solution
- sorbent
- hplc
- isopropyl alcohol
- Prior art date
Links
- 108010037003 Buserelin Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N buserelin Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](COC(C)(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 229960002719 buserelin Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 title claims description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 80
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 61
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 7
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 26
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Substances OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 5-aminoisoindole-1,3-dione Chemical compound NC1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 abstract 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 abstract 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 abstract 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 2
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=NC=C1 GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- -1 octadecylsilyl silica Chemical compound 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к способам хроматографической очистки синтетических пептидных препаратов и может быть использовано для получения высокоочищенных субстанций.The invention relates to methods for chromatographic purification of synthetic peptide preparations and can be used to obtain highly purified substances.
Бусерелин, применяющийся как противоопухолевое средство, является синтетическим аналогом природного гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ).Buserelin, used as an antitumor agent, is a synthetic analogue of natural gonadotropin-releasing hormone (GnRH).
Он представляет собой пептид, состоящий из 9 аминокислот: 5-оксо-L-пролил-L-гистидил-L-триптофил-L-серил-L-тиролил-О-трет-бутил-D-серил-L-лейцил-L-аргенил-L-пролил-N-этиламид ацетат. Молекулярная масса: 1299,5.It is a peptide consisting of 9 amino acids: 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophil-L-seryl-L-tyrolyl-O-tert-butyl-D-serial-L-leucyl-L- argenyl-L-prolyl-N-ethylamide acetate. Molecular mass: 1299.5.
Бусерелин обычно синтезируют классическим методом последовательного наращивания пептидной цепи в растворе, начиная с С-конца.Buserelin is usually synthesized by the classical method of sequential peptide chain extension in solution, starting from the C-terminus.
Известен способ твердофазного синтеза пептидов, в том числе бусерелина, в котором полученный пептид подвергают очистке. Неочищенный пептид растворяют в уксусной кислоте и подвергают хроматографической очистке. Указано, что пептид может быть очищен с использованием одного или нескольких видов хроматографий, таких как: ионообменная хроматография на слабоосновной смоле в ацетатной форме; гидрофобная абсорбционная хроматография на полистиролдивинилбензольном (например, Amberlite® XAD) сорбенте; адсорбционная хроматография на силикагеле; ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе; гель-хроматография (например, на Sephadex G-25) или противоточное распределение; высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), в частности на обращенно-фазовых ВЭЖХ колонках с октил- или октадецилсилил-кремнеземом (RU 2043362, 10.09.1995).A known method of solid-phase synthesis of peptides, including buserelin, in which the resulting peptide is subjected to purification. The crude peptide is dissolved in acetic acid and chromatographed. It is indicated that the peptide can be purified using one or more types of chromatography, such as: ion exchange chromatography on a weakly basic resin in acetate form; hydrophobic absorption chromatography on a polystyrene divinylbenzene (e.g. Amberlite® XAD) sorbent; silica gel adsorption chromatography; ion exchange chromatography on carboxymethyl cellulose; gel chromatography (e.g. on Sephadex G-25) or countercurrent distribution; high performance liquid chromatography (HPLC), in particular on reversed-phase HPLC columns with octyl or octadecylsilyl silica (RU 2043362, 09/10/1995).
Известен способ, согласно которому бусерелин, полученный на фирме Welding, очищают методом обращенно-фазной ВЭЖХ на колонне Spherisorb ODS II (250×4 мм, размер частиц 3 мкм), в качестве элюента используют смесь 50% ацетонитрил/0,15% трифторуксусная кислота, скорость элюирования составляет 0,5 мл/мин (RU 2280031, 20.07.2006).A known method is according to which the buserelin obtained by Welding is purified by reverse phase HPLC on a Spherisorb ODS II column (250 × 4 mm,
Известен также способ, в котором бусерелин растворяют в пиридин-ацетатном буфере, наносят на колонну с SP-сефадексом, элюируют в градиенте 0,05-1 М пиридин-ацетатного буфера. Выделенные фракции упаривают, растворяют в 2%-ной уксусной кислоте и лиофильно высушивают (RU 2086561, 10.08.1997).There is also known a method in which buserelin is dissolved in a pyridine acetate buffer, applied to a column of SP-Sephadex, eluted in a gradient of 0.05-1 M pyridine acetate buffer. The separated fractions are evaporated, dissolved in 2% acetic acid and freeze-dried (RU 2086561, 08/10/1997).
Следует отметить, что известные способы получения бусерелина характеризуются относительно низким содержанием целевого вещества (14-50%), большим количеством родственных примесей и присутствием в продукте синтеза сильно сорбирующихся смолообразных компонентов.It should be noted that the known methods for producing buserelin are characterized by a relatively low content of the target substance (14-50%), a large number of related impurities and the presence in the synthesis product of highly sorbing resinous components.
Эти обстоятельства препятствуют эффективной очистке сырья, содержащего бусерелин, путем его прямого нанесения на ВЭЖХ колону и определяют необходимость проведения многостадийной очистки.These circumstances hinder the effective purification of raw materials containing buserelin by directly applying it to an HPLC column and determine the need for multi-stage purification.
Наиболее близким к предложенному способу является способ, описанный в RU 2043362, 1995, который предусматривает обработку сырья уксусной кислотой и двухстадийную хроматографическую очистку. Недостатком известного способа является недостаточная производительность и степень очистки пептида, а также использование элюентов сложного состава, включающих строго контролируемые в субстанциях растворители, такие как ацетонитрил, хлористый метилен и метанол, что усложняет и удорожает процесс.Closest to the proposed method is the method described in RU 2043362, 1995, which involves the processing of raw materials with acetic acid and two-stage chromatographic purification. The disadvantage of this method is the lack of productivity and degree of purification of the peptide, as well as the use of eluents of complex composition, including solvents strictly controlled in substances, such as acetonitrile, methylene chloride and methanol, which complicates and increases the cost of the process.
Задачей настоящего изобретения является повышение степени очистки бусерелина, увеличение производительности и упрощение (удешевление) процесса.The objective of the present invention is to increase the degree of purification of buserelin, increase productivity and simplify (reduce the cost) of the process.
Поставленная задача решается описываемым способом хроматографической очистки бусерелина, включающим обработку бусерелина-сырца раствором уксусной кислоты и последующую двухстадийную хроматографическую очистку полученного раствора, в которой на первой стадии хроматографии раствор бусерелина пропускают через стиролдивинилбензольный сорбент с последующим элюированием раствором изопропилового спирта в уксусной кислоте, а на второй стадии полученный раствор элюата подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенно-фазном сорбенте в градиенте изопропилового спирта с добавкой органической кислоты.The problem is solved by the described method of chromatographic purification of buserelin, including the processing of raw buserelin with a solution of acetic acid and the subsequent two-stage chromatographic purification of the resulting solution, in which, at the first stage of chromatography, the buserelin solution is passed through a styrene-divinylbenzene sorbent followed by elution with a solution of isopropyl alcohol in acetic acid stages, the resulting eluate solution is subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) on aschenno-phase sorbent in a gradient of isopropyl alcohol with the addition of an organic acid.
Предпочтительно, элюирование бусерелина со стиролдивинилбензольного сорбента осуществляют 10-12%-ным раствором изопропилового спирта в 0,1 М уксусной кислоте.Preferably, the elution of buserelin from the styrene-divinylbenzene sorbent is carried out with a 10-12% solution of isopropyl alcohol in 0.1 M acetic acid.
Предпочтительно, ВЭЖХ осуществляют при содержании изопропилового спирта в элюенте от 4,0 до 6,6% с добавкой в качестве органической лимонной или трифторуксусной кислоты.Preferably, HPLC is carried out at a content of isopropyl alcohol in the eluent of from 4.0 to 6.6% with the addition of organic citric or trifluoroacetic acid.
Предпочтительно, ВЭЖХ проводят при линейной скорости элюента 1,9-2,5 см/мин и нагрузке по сырью 140-160 грамм на 1 кг сорбента.Preferably, HPLC is carried out at a linear eluent speed of 1.9-2.5 cm / min and a feed load of 140-160 grams per 1 kg of sorbent.
Предпочтительно, для обработки бусерелина-сырца используют 0,1 М раствор уксусной кислоты.Preferably, a 0.1 M solution of acetic acid is used to treat the raw buserelin.
Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием бусерелина более 97% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором изопропилового спирта, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.Additionally, after performing HPLC, the obtained fractions of the purified product with a buserelin content of more than 97% are concentrated on a hydrophobic sorbent, followed by elution with a solution of isopropyl alcohol, evaporation of the eluate and freeze drying.
Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием бусерелина от 30 до 97% подвергают концентрированию на сульфокатионите, элюированию и повторной очистке методом ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте, упариванию и лиофильному высушиванию.Additionally, after performing HPLC, the obtained fractions of the purified product with a buserelin content of 30 to 97% are subjected to concentration on sulfocationite, elution and re-purification by HPLC on a reverse phase sorbent, evaporation and freeze drying.
Ниже приведены конкретные примеры осуществления способа.The following are specific examples of the method.
Пример 1Example 1
1,5 кг бусерелина-сырца (чистота 14,8% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза бусерелина, содержащего 200 г целевого пептида и 10% тетрагидрофурана, перемешивают в 15 литрах 0,1 М раствора уксусной кислоты в течение 8 часов и оставляют на 8 часов для отстаивания. Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 0,5 литрами 0,1 М раствора уксусной кислоты. Фильтрат (15 литров) пропускают через стеклянную колонку 140×200 мм, заполненную стиролдивинилбензольным сорбентом с размером частиц 100-250 мкм, размером пор 10-15 нм и удельной поверхностью 750-900 м2/г, предварительно уравновешенную 0,1 М раствором уксусной кислоты. Первые от начала пропускания пробы 4 литра элюата отбрасывают, остальные 11 литров собирают. Колонну дополнительно промывают 5 литрами 10%-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 0,1 М уксусной кислоты, и объединяют с ранее полученными 11 литрами элюата. Получают 16 литров элюата предварительно очищенного сырья с содержанием бусерелина 11,8 мг/мл. Выход бусерелина на стадии предварительной хроматографической очистки составляет 95%.1.5 kg of raw buserelin (HPLC purity 14.8%) obtained by peptide synthesis of buserelin containing 200 g of the desired peptide and 10% tetrahydrofuran was stirred in 15 liters of a 0.1 M solution of acetic acid for 8 hours and leave for 8 hours to settle. The precipitate was separated on a 0.2 μm cellulose filter and washed with 0.5 liters of a 0.1 M solution of acetic acid. The filtrate (15 liters) is passed through a 140 × 200 mm glass column filled with a styrene-divinylbenzene sorbent with a particle size of 100-250 μm, a pore size of 10-15 nm and a specific surface area of 750-900 m 2 / g, previously balanced with a 0.1 M acetic solution acids. The first 4 liters of eluate from the beginning of the transmission of the sample are discarded, the remaining 11 liters are collected. The column is additionally washed with 5 liters of a 10% solution of isopropyl alcohol containing 0.1 M acetic acid, and combined with the previously obtained 11 liters of eluate. Get 16 liters of eluate of pre-purified raw materials with a content of buserelin 11.8 mg / ml The yield of buserelin at the stage of preliminary chromatographic purification is 95%.
Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 литра (со скоростью 150 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Диасфер-110-С18 с размером частиц 16 мкм и уравновешенную 4%-ным раствором изопропилового спирта, содержащим 0,1% лимонной кислоты (буфер А). Колонну промывают 35 литрами буфера А и элюируют компоненты линейным градиентом изопропилового спирта от 4 до 6,6% за 3,9 часа, добавляя буфер В (30%-ный раствор изопропилового спирта, содержащий 0,2% трифторуксусной кислоты) до содержания его в элюенте 10%. Этим элюентом с содержанием изопропилового спирта 6,6% продолжают элюирование в течение 3,3 часа, затем проводят регенерацию сорбента, повышая в течение 1,5 часа содержание изопропилового спирта до 40%. Скорость элюирования составляет 150 мл/мин (линейная скорость 1,9 см/мин). Фракции собирают по поглощению при 254 нм объемами 4-5 литров. Чистоту фракций контролируют аналитической ВЭЖХ.The resulting intermediate solution was subjected to HPLC. The solution is applied in portions of 2.5-3 liters (at a rate of 150 ml / min) onto a steel column of axial compression with a diameter of 100 mm and a height of 300 mm filled with a reverse phase sorbent Diasfer-110-C18 with a particle size of 16 μm and a balanced 4% solution of isopropyl alcohol containing 0.1% citric acid (buffer A). The column is washed with 35 liters of buffer A and the components are eluted with a linear gradient of isopropyl alcohol from 4 to 6.6% in 3.9 hours, adding buffer B (30% solution of isopropyl alcohol containing 0.2% trifluoroacetic acid) until it contains eluent 10%. This eluent with an isopropyl alcohol content of 6.6% continues to elute for 3.3 hours, then the sorbent is regenerated by increasing the isopropyl alcohol content to 40% within 1.5 hours. The elution rate is 150 ml / min (linear speed 1.9 cm / min). Fractions are collected by absorption at 254 nm in volumes of 4-5 liters. The purity of the fractions was monitored by analytical HPLC.
Фракции с содержанием бусерелина более 97% объединяют, разбавляют водой в 1,5 раза, концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируют 30%-ным раствором изопропилового спирта, упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают. Получают 142,5 г лиофильно высушенного продукта.Fractions with a buserelin content of more than 97% are combined, diluted 1.5 times with water, concentrated on a column with a hydrophobic sorbent, eluted with a 30% isopropyl alcohol solution, evaporated on a rotary evaporator and freeze-dried. 142.5 g of freeze-dried product are obtained.
Фракции с содержанием бусерелина от 30 до 97% объединяют, концентрируют на колонке с сульфокатионитом, элюируют и рехроматографируют методом ВЭЖХ. Получают 20 г лиофильно высушенного продукта.Fractions with a buserelin content of 30 to 97% are combined, concentrated on a column with sulfocationite, eluted and rechromatographed by HPLC. 20 g of freeze-dried product are obtained.
Всего получают 162,5 г бусерелина.A total of 162.5 g of buserelin is obtained.
Чистота продукта, по данным ВЭЖХ 97,7%.The purity of the product, according to HPLC 97.7%.
Выход - 81% от содержания бусерелина в сырье.The yield is 81% of the content of buserelin in the raw material.
Пример 2Example 2
1,6 кг бусерелина-сырца (содержание 20,8% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза бусерелина, содержащего 300 г целевого пептида и 10% тетрагидрофурана, перемешивают в 16 литрах 0,1 М раствора уксусной кислоты в течение 24 часов и оставляют на 24 часа для отстаивания. Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 1 литром 0,1 М раствора уксусной кислоты. Фильтрат (17 литров) пропускают через стеклянную колонку 140×200 мм, заполненную стиролдивинилбензольным сорбентом, предварительно уравновешенную 0,1 М раствором уксусной кислоты и затем промывают колонну 5 литрами 12%-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 0,1 М уксусной кислоты. Первые от начала пропускания пробы 4 литра элюата отбрасывают. Остаток собирают и получают 18 литров раствора предварительно очищенного сырья с содержанием бусерелина 16,3 мг/мл. Выход бусерелина после первой стадии хроматографии 98%.1.6 kg of raw buserelin (20.8% HPLC) obtained by peptide synthesis of buserelin containing 300 g of the desired peptide and 10% tetrahydrofuran is stirred in 16 liters of a 0.1 M solution of acetic acid for 24 hours and leave for 24 hours to settle. The precipitate was separated on a 0.2 μm cellulose filter and washed with 1 liter of a 0.1 M solution of acetic acid. The filtrate (17 liters) is passed through a 140 × 200 mm glass column filled with a styrene-divinylbenzene sorbent, pre-equilibrated with a 0.1 M solution of acetic acid and then the column is washed with 5 liters of a 12% solution of isopropyl alcohol containing 0.1 M acetic acid. The first 4 liters of eluate from the start of transmission of the sample are discarded. The residue is collected and 18 liters of a solution of pre-purified feedstock with a content of buserelin of 16.3 mg / ml are obtained. The yield of buserelin after the first stage of chromatography is 98%.
Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 литра (со скоростью 200 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Кромасил-100-С18 с размером частиц 16 мкм и уравновешенную 4%-ным раствором изопропилового спирта, содержащим 0,1% лимонной кислоты (буфер А). Колонну промывают 35 литрами буфера А и элюируют компоненты линейным градиентом изопропилового спирта от 4 до 6,6% за 2,9 часа, добавляя буфер В (30%-ный раствор изопропилового спирта, содержащий 0,2% трифторуксусной кислоты) до содержания его в элюенте 10%. Этим элюентом с содержанием изопропилового спирта 6,6% продолжают элюирование в течение 2,5 часа, затем проводят регенерацию сорбента, повышая в течение 1,1 часа содержание изопропилового спирта до 40%. Скорость элюирования составляет 200 мл/мин (линейная скорость 2,5 см/мин). Фракции собирают по поглощению при 254 нм объемами 4-5 литров. Чистоту фракций контролируют аналитической ВЭЖХ.The resulting intermediate solution was subjected to HPLC. The solution is applied in portions of 2.5-3 liters (at a rate of 200 ml / min) onto a steel column of axial compression with a diameter of 100 mm and a height of 300 mm filled with a reversed-phase sorbent Kromasil-100-C18 with a particle size of 16 μm and balanced 4% solution of isopropyl alcohol containing 0.1% citric acid (buffer A). The column is washed with 35 liters of buffer A and the components are eluted with a linear gradient of isopropyl alcohol from 4 to 6.6% in 2.9 hours, adding buffer B (30% solution of isopropyl alcohol containing 0.2% trifluoroacetic acid) until it contains eluent 10%. This eluent with an isopropyl alcohol content of 6.6% continues to elute for 2.5 hours, then the sorbent is regenerated, increasing the isopropyl alcohol content to 40% within 1.1 hours. The elution rate is 200 ml / min (linear speed 2.5 cm / min). Fractions are collected by absorption at 254 nm in volumes of 4-5 liters. The purity of the fractions was monitored by analytical HPLC.
Фракции с содержанием бусерелина более 97% объединяют, разбавляют водой в 1,5 раза, концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируют 30%-ным раствором изопропилового спирта, упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают.Получают 235 г лиофильно высушенного продукта.Fractions with a buserelin content of more than 97% are combined, diluted with water 1.5 times, concentrated on a column with a hydrophobic sorbent, eluted with a 30% isopropyl alcohol solution, evaporated on a rotary evaporator and freeze-dried. 235 g of freeze-dried product are obtained.
Фракции с содержанием бусерелина от 30 до 97% объединяют, концентрируют на колонке с сульфокатионитом, элюируют и рехроматографируют методом ВЭЖХ. Получают 31 г лиофильно высушенного продукта.Fractions with a buserelin content of 30 to 97% are combined, concentrated on a column with sulfocationite, eluted and rechromatographed by HPLC. Obtain 31 g of freeze-dried product.
Всего получают 266 г бусерелина. Чистота продукта, по данным ВЭЖХ - 97,9%.A total of 266 g of buserelin is obtained. The purity of the product, according to HPLC - 97.9%.
Выход - 88% от содержания бусерелина в сырье.The yield is 88% of the content of buserelin in the feed.
Пример 3.Example 3
На фиг.1-3 представлены типичные хроматограммы сырья, процесса ВЭЖХ очистки бусерелина и очищенного продукта.Figure 1-3 presents typical chromatograms of raw materials, an HPLC purification process of buserelin and a purified product.
Фиг.1. Хроматограмма бусерелина-сырца.Figure 1. Chromatogram of raw buserelin.
Колонка 4×250 мм с сорбентом Диасфер-110-С16, 5 мкм.Column 4 × 250 mm with a sorbent Diasfer-110-C16, 5 μm.
Элюент: 0,1 М NaCl, содержащий 0,2% ТФУ и 20% ацетонитрила,Eluent: 0.1 M NaCl containing 0.2% TFA and 20% acetonitrile,
Поток: 0,7 мл/мин, детектирование - УФ 280.Flow: 0.7 ml / min, detection - UV 280.
Фиг.2. Хроматограмма очистки бусерелина-сырца на колонне 100×330 мм с сорбентом Диасфер-110-С18, 16 мкм.Figure 2. The chromatogram of the purification of raw buserelin on a column of 100 × 330 mm with a sorbent Diasfer-110-C18, 16 μm.
Проба - 160 г пептидной смеси в 2,7 литрах раствора.Sample - 160 g of the peptide mixture in 2.7 liters of solution.
Буфер А - 4%-ный раствор i-PrOH и 0,1% лимонной кислоты;Buffer A - 4% solution of i-PrOH and 0.1% citric acid;
Буфер В - 30%-ный раствор i-PrOH и 0,2% трифторуксусной кислоты.Buffer B - 30% solution of i-PrOH and 0.2% trifluoroacetic acid.
Градиент: Буфер А (100%) от 0 до 260 мин, далее линейный градиент до 10% буфера В за 250 мин, далее изократическое элюирование при 10% буфера В (6,6% изопропилового спирта) до 700 мин. Далее регенерация колонки.Gradient: Buffer A (100%) from 0 to 260 minutes, then a linear gradient to 10% of buffer B in 250 minutes, then isocratic elution at 10% of buffer B (6.6% isopropyl alcohol) for 700 minutes. Next column regeneration.
Поток: 150 мл/мин, УФ детектирование 254 нм.Flow: 150 ml / min, UV detection 254 nm.
Целевую фракцию с чистотой более 97% собирают от 530 до 700 мин.The target fraction with a purity of more than 97% is collected from 530 to 700 minutes.
Фиг.3. Хроматограмма высокоочищенного бусерелина.Figure 3. Chromatogram of highly purified buserelin.
Колонка 4×250 мм с сорбентом Диасфер-110-С16, 5 мкм.Column 4 × 250 mm with a sorbent Diasfer-110-C16, 5 μm.
Элюент: 0,1 М NaCl, содержащий 0,2% ТФУ и 20% ацетонитрила.Eluent: 0.1 M NaCl containing 0.2% TFA and 20% acetonitrile.
Поток 0,7 мл/мин, детектирование - УФ 280.Flow 0.7 ml / min, detection - UV 280.
Чистота бусерелина - 97,72%.The purity of buserelin is 97.72%.
Представленные результаты свидетельствуют о том, что разработанный метод очистки в режиме ВЭЖХ реализуется при высоких нагрузках 140-160 грамм пептидной смеси на кг сорбента при линейных скоростях 1,9-2,5 см/мин, обеспечивая высокую чистоту целевого пептида (более 97,5%) при высоком выходе (более 80%).The presented results indicate that the developed purification method in the HPLC mode is implemented at high loads of 140-160 grams of the peptide mixture per kg of sorbent at linear speeds of 1.9-2.5 cm / min, ensuring high purity of the target peptide (more than 97.5 %) with a high yield (more than 80%).
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007120438/15A RU2332248C1 (en) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Method of chromatographic purification of buserelin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007120438/15A RU2332248C1 (en) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Method of chromatographic purification of buserelin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2332248C1 true RU2332248C1 (en) | 2008-08-27 |
Family
ID=46274419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007120438/15A RU2332248C1 (en) | 2007-06-01 | 2007-06-01 | Method of chromatographic purification of buserelin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2332248C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2441018C1 (en) * | 2010-09-28 | 2012-01-27 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Method of chromatographic purification of octreotide |
| CN113640409A (en) * | 2021-07-29 | 2021-11-12 | 宁波三生生物科技股份有限公司 | Method for determining content of buserelin in porcine plasma by HPLC-MS/MS method |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2043362C1 (en) * | 1991-08-12 | 1995-09-10 | Синтекс (Ю-Эс-Эй) Инк. | Method of solid-phase peptide synthesis |
| RU2086561C1 (en) * | 1995-09-25 | 1997-08-10 | Тихонов Александр Васильевич | Method for production of nonapeptide ethyl amide |
-
2007
- 2007-06-01 RU RU2007120438/15A patent/RU2332248C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2043362C1 (en) * | 1991-08-12 | 1995-09-10 | Синтекс (Ю-Эс-Эй) Инк. | Method of solid-phase peptide synthesis |
| RU2086561C1 (en) * | 1995-09-25 | 1997-08-10 | Тихонов Александр Васильевич | Method for production of nonapeptide ethyl amide |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2441018C1 (en) * | 2010-09-28 | 2012-01-27 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Method of chromatographic purification of octreotide |
| CN113640409A (en) * | 2021-07-29 | 2021-11-12 | 宁波三生生物科技股份有限公司 | Method for determining content of buserelin in porcine plasma by HPLC-MS/MS method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1315229C (en) | Chromatographic purification process | |
| US20200140473A1 (en) | Method for the enrichment of rebaudioside b and/or rebaudioside d in stevia-derived glycoside compositions using adsorb-desorb chromatography with a macroporous neutral adsorbent resin | |
| KR101514903B1 (en) | Process for purifying cyclic lipopeptide compounds or salts thereof | |
| KR101514904B1 (en) | Method for purifying cyclic lipopeptide or salt thereof | |
| CN111057142B (en) | Purification method of teriparatide | |
| CN106632609B (en) | A kind of preparation method of hexapeptide and product thereof | |
| US6180757B1 (en) | Process for the separation of proteins using a CA++ containing eluant | |
| CA2794688C (en) | A process for purification of pneumocandin | |
| KR100467127B1 (en) | Chromatographic methods for obtaining highly purified cyclosporin A and related cyclosporins | |
| CN102875515A (en) | Method for extracting malvidin from blueberry | |
| Boudesocque et al. | Concentration and selective fractionation of an antihypertensive peptide from an alfalfa white proteins hydrolysate by mixed ion-exchange centrifugal partition chromatography | |
| TWI488862B (en) | Separation and Purification of Cyclohexyl Compounds and Their Salts | |
| RU2332248C1 (en) | Method of chromatographic purification of buserelin | |
| Hou et al. | Preparative purification of corilagin from Phyllanthus by combining ionic liquid extraction, prep-HPLC, and precipitation | |
| JPS625917A (en) | Production of saponin containing no isoflavone from soybean embro bud | |
| CN1240697C (en) | Technical method for extracting oridinin from rabdosia rubescens | |
| CN101750460A (en) | Method for purifying microcystins MCLR through extraction and normal-pressure column chromatography | |
| CN113801201A (en) | Preparation method of caspofungin acetate impurity B | |
| CN108440619A (en) | The method that cornel extractive prepares high-purity horse loganin | |
| CN101367728B (en) | Method for purifying cichoric acid and monocaffeoyl tartaric acid from Echinacea purpurea extract | |
| CN117142936A (en) | Preparation method of euphorbia lunata extract A | |
| CN112250724B (en) | Preparation method of reference substance of cornflower-3-coumaroyl-diglucose-5-glucoside | |
| DK162104B (en) | PROCEDURE FOR CHROMATOGRAPHIC SEPARATION OF MIXTURES OF INSULIN, INSULIN DERIVATIVES AND ANY PURPOSES | |
| CN117820440B (en) | Separation and purification method of amatoxin in mushrooms | |
| KR102645011B1 (en) | Purification of tacrolimus by use of solid-phase extraction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20150206 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner |