RS65011B1 - Peptid za lečenje makularne degeneracije povezane sa starenjem - Google Patents

Peptid za lečenje makularne degeneracije povezane sa starenjem

Info

Publication number
RS65011B1
RS65011B1 RS20231250A RSP20231250A RS65011B1 RS 65011 B1 RS65011 B1 RS 65011B1 RS 20231250 A RS20231250 A RS 20231250A RS P20231250 A RSP20231250 A RS P20231250A RS 65011 B1 RS65011 B1 RS 65011B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
htra1
peptide
amino acid
acid sequence
seq
Prior art date
Application number
RS20231250A
Other languages
English (en)
Inventor
Daisuke Nishimiya
Ryuji Hashimoto
Toshiyuki Sato
Takako Kimura
Atsushi Yamasaki
Tatsuya Inoue
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of RS65011B1 publication Critical patent/RS65011B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8135—Kazal type inhibitors, e.g. pancreatic secretory inhibitor, ovomucoid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/25—Animals on a special diet
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/35—Animals modified by environmental factors, e.g. temperature, O2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/107—Rabbit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Napomene:
Celokupni dokument uključujući referentnu tebelu (referentne tabele) i listu (liste) sekvenci može se preuzeti sa veb-stranice EPO
Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na peptid, polinukleotid, vektor, ćeliju, postupak za proizvodnju peptida, peptid dobijen postupkom, kompoziciju koja sadrži peptid, farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid, farmaceutsku kompoziciju za lečenje ili prevenciju različitih oboljenja, koja sadrži peptid, upotrebu peptida za lečenje ili prevenciju različitih oboljenja, postupak za lečenje različitih oboljenja, koji uključuje korak administriranja peptida, itd.
Stanje tehnike
[0002] Visokotemperaturno-zahtevajuća serinska peptidaza A1 (high temperature requirement A serine peptidase 1, HTRA1) je serinska proteaza slična tripsinu (PRSS11; klan PA, familija S1) i sačinjena je od N-terminalnog domena koji se sastoji od modula sličnog IGFBP i modula sličnog Kazal motivu, proteaznog domena i C-terminalnog PDZ domena. HTRA1 pripada familiji HTRA koja obuhvata i HTRA2, HTRA3, i HTRA4 i reverzibilno ispoljava aktivnu i neaktivnu strukturu, na isti način kao drugi HTRA molekuli (nepatentna literatura 1 i 2). Neujednačene je distribucije u ljudskom telu i eksprimira se u relativno visokim nivoima u hrskavici, sinovijalnoj membrani, placenti i slično. Poznato je da HTRA1 kao supstrate seče mnoge konstituente vanćelijskog matriksa kao što su amiloidni prekursorski protein, fibromodulin, klasterin, ADAM9, i vitronektin, i da je u vezi sa bolestima koje su tipski predstavljene artritisom i koštanom kalcifikacijom (nepatentna literatura 3, 4, 5, i 6). Poznato je takođe da je nivo transkripcije HTRA1 povišen ako promotorski region HTRA1 ima genski polimorfizam (rs11200638). Analiza asocijacija celokupnog genoma otkrila je i to da je polimorfizam u snažnoj korelaciji sa makularnom degeneracijom povezanom sa starenjem (age-related macular degeneration, kasnije u ovom tekstu označena kao AMD) (nepatentna literatura 7 i 8).
[0003] AMD je hronično degenerativno oboljenje povezano sa starenjem i karakteriše se gubitkom centralnog vida. Ovo oboljenje je vodeći uzročnik stečenog slepila u SAD i četvrti najčešći uzročnik stečenog slepila u Japanu, posle glaukoma, dijabetičke retinopatije i retinitis pigmentosa (nepatentna literatura 12). Kod pacijenata sa AMD, nivoi iRNK i proteina HTRA1 povišeni su u limfocitima ili ćelijama pigmentnog epitela retine (nepatentna literatura 13). Saopšteno je takođe da je ekspresija HTRA1 proteina povišena u druzama ili degenerisanim ćelijama pigmentnog epitela retine, koje su prekursorske lezije AMD-a, ili neovaskularnim membranama (nepatentna literatura 11 i 14 do 16). Saopšteno je takođe da je HTRA1 protein detektovan u staklastom telu, zajedno sa odlubljivanjem retine, okluzijom vena retine, hemoragijom u staklastom telu, rupturom makule, i slično, i da je njegova vrednost u sinhronizaciji sa markerom angiogeneze VEGF (nepatentna literatura 17). Pored toga, razgradnja proteina koji čine bazalnu membranu, na primer fibulina 5 ili tropoelastina, i fragmentacija elastičnog sloja Bruch-ove membrane zapažene su kod HTRA1-transgenih miševa (nepatentna literatura 9). Međutim, nije direktno prikazano ni da je inhibicija proteazne aktivnosti HTRA1 efektivna, ni da nije efektivna, u lečenju gore opisanih oboljenja i zaštiti retine.
[0004] SPINK2 (serine protease inhibitor Kazal-type 2, inhibitor serinske proteaze, Kazal tip 2) je Kazal-sličan domen koji ima tri disulfidne veze i funkcioniše kao inhibitor tripsina/akrozina (nepatentna literatura 10). Međutim, njegov odnos sa AMD još uvek nije razjašnjen.
[0005] Modeli miša i kunića poznati su kao animalni modeli za evaluiranje AMD (nepatentna literatura 18, 19, i 20). Što se tiče kunića koji su poželjniji kao modeli za ekstrapolisanje na bolesti oka kod ljudi (nepatentna literatura 21), konvencionalni modeli se koriste samo za posmatranje abnormalnih nalaza u retini i horoidei, a postoje poteškoće u evaluiranju abnormalnih funkcija ćelija pigmentnog epitela retine (RPE ćelije), itd. Dodatni problem u vezi sa njima je period od čak 8 meseci koji je potreban za formiranje modela (nepatentna literatura 20).
Lista navoda
Nepatentna literatura
[0006]
Nepatentna literatura 1: Truebestein L, i sarad, 2011, Nat Struct Mol Biol., tom 18 (br.3): str. 386-8
Nepatentna literatura 2: Eigenbrot C, i sarad, 2012, Structure, tom 20 (br.6): str.1040-50 Nepatentna literatura 3: Grau S, i sarad., 2005, Proc Natl Acad Sci U S A., tom 102 (br.
17): str.6021-26
Nepatentna literatura 4: Grau S, i sarad, 2006, J Biol Chem., tom 281 (br.10): str.6124-29 Nepatentna literatura 5: Hadfield KD, i sarad, 2008, J Biol Chem., tom 283, (br. 9): str.
5928-38
Nepatentna literatura 6: An E, i sarad, 2010, Invest Ophthalmol Vis Sci., tom 51 (br. 7): str. 3379-86
Nepatentna literatura 7: Yang Z, i sarad, 2006, Science, tom 314 (br.5801): str.992-93 Nepatentna literatura 8: Tang NP, i sarad, 2009, Ann Epidemiol., tom 19 (br.10): str.740-45
Nepatentna literatura 9: Vierkotten S, i sarad, 2011, PLoS One, tom 6 (br.8): str. e22959 Nepatentna literatura 10: Chen T, i sarad, 2009, Proteins, tom 77 (br.1): str.209-19 Nepatentna literatura 11: Yang Z i sarad, Science, 2006, tom 314, br.5801: str.992-93 Nepatentna literatura 12: Kimihiro Nakae, i sarad, 2007 Annual report of the Research Committee on Chorioretinal Degenerations and Optic Atrophy, Research on Measures for Intractable Diseases, the Ministry of Health, Labour and Welfare of Japan (2007) Nepatentna literatura 13: Black JR and Clark SJ, Genet. Med., 2016, tom 18, br.4: str.283-89
Nepatentna literatura 14: Cameron DJ, i sarad, Cell Cycle, 2007, tom 6, br.9: str.1122-25 Nepatentna literatura 15: Chan CC i sarad, Trans. Am. Soc., 2007, tom 105: str.92-97 Nepatentna literatura 16: Tuo J i sarad, 2008, tom 115, br.11: str.1891-98 Nepatentna literatura 17: Ng TK i sarad, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 2011, tom 52, br.6: str. 3706-12
Nepatentna literatura 18: Espinosa-Haidemann D.G, i sarad, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2006, tom 47 (br.2): str.729-37
Nepatentna literatura 19: Pons M, i sarad, American Journal of Pathology, 2010, tom 177: str. 1198-1213
Nepatentna literatura 20: Trivino A, i sarad, Experimental Eye Research, 2006, tom 83: str.
357-366
Nepatentna literatura 21: Zernii E.Y, i sarad, CNS & Neurological Disorders-Drug Targets, 2016, tom 15: str.267-291
Kratak opis pronalaska
Tehnički problem
[0007] Predmet ovog pronalaska je obezbediti novi inhibitor visokotemperaturno-zahtevajuće serinske peptidaze A1 (HTRA1).
Rešenje problema
[0008] Predmetni pronalazak je definisan kako je navedeno u patentnim zahtevima.
Povoljni efekti pronalaska
[0009] Peptid obezbeđen predmetnim pronalaskom, i farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid imaju HTRA1-inhibitornu aktivnost i korisni su u lečenju ili prevenciji, itd. makularne degeneracije povezane sa starenjem.
Kratak opis crteža
[0010]
[Slika 1(A)] Slika 1(A) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate upoređivanja sličnosti sekvenci HTRA1 čoveka, miša, pacova, i majmuna. Isprekidana linija prikazuje enzimski aktivan domen (204Gly do 364Leu).
[Slika 1(B)] Slika 1(B) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate upoređivanja sličnosti sekvenci HTRA1 čoveka, miša, pacova, i majmuna (nastavak).
[Slika 2] Slika 2 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (kat) inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida korišćenjem stope razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora. Svaki od panela A do C prikazuje rezultate evaluacije svakog od inhibirajućih peptida, i panel D prikazuje rezultate evaluacije kontrolnog, divljeg tipa SPINK2.
[Slika 3] Slika 3 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (potpun) inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida korišćenjem stope razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (paneli A do C).
[Slika 4(A)] Slika 4(A) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (kat) inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida korišćenjem razgradnje humanog vitronektina kao indikatora. Analiza je izvedena western blot analizom uz korišćenje antitela na humani vitronektin (human vitronectin antibody, R&D Systems, Inc.; MAB2349).
[Slika 4(B)] Slika 4(B) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (kat) inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida korišćenjem razgradnje humanog vitronektina kao indikatora (nastavak).
[Slika 5(A)] Slika 5(A) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza korišćenjem razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 1). Za naziv svake od upotrebljenih proteaza i njihove koncentracije i naziv supstrata i njegove koncentracije, itd., videti Primer 3.
[Slika 5(B)] Slika 5(B) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza korišćenjem razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 2).
[Slika 5(C)] Slika 5(C) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza korišćenjem razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 3).
[Slika 5(D)] Slika 5(D) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza korišćenjem razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 4).
[Slika 6] Slika 6 predstavlja dijagram koji prikazuje kompleks HTRA1 (kat)/HTRA1-inhibirajući peptid, dobijen kristalografijom X zracima. Inhibirajući peptid je povezan sa svakim molekulom HTRA1 trimera formiranog od strane HTRA1 (kat).
[Slika 7] Slika 7 predstavlja dijagram koji prikazuje kompleks HTRA1 (kat)/HTRA1-inhibirajući peptid, dobijen kristalografijom X zracima, kao monomer. Inhibirajući peptid je povezan sa regionom koji sadrži aktivni centar HTRA1 (kat).
[Slika 8] Slika 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO (SEK ID BR): 54) H2-Opt. N-terminalni "Mca-I" označava N-(4-metilkumaril-7-amid)-izoleucin, i C-terminalni "(Dnp)K" označava N epsilon-(2,4-dinitrofenil)-lizin.
[Slika 9] Slika 9 je dijagram koji prikazuje da je ekspresija HTRA1 bila povišena u staklastom telu, u modelu oštećenja retine pacova, koje je indukovano izlaganjem svetlosti. Analiza je sprovedena western blot-om uz korišćenje antitela na humani HTRA1/PRSS11 (R&D Systems, Inc.; AF2916).
[Slika 10] Slika 10 predstavlja dijagram koji prikazuje da je u modelu oštećenja retine kod pacova, koje je izazvano izlaganjem svetlosti, u grupi u kojoj je primenjen HTRA1-inhibirajući peptid, suprimirano smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju, na poprečnim presecima retine. n = 4 za grupu kod koje je administriran normalni fiziološki rastvor, i n = 5 za ostale grupe.
[Slika 11] Slika 11 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (kat) -inhibitorne aktivnosti za pet derivata HTRA1-inhibirajućeg peptida, uz korišćenje stope razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora.
[Slika 12] Slika 12 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja vezivanja tri HTRA1-inhibirajuća peptida za HTRA (kat), postupkom imunoprecipitacije.
[Slika 13] Slika 13 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 1) humanog SPINK2.
[Slika 14] Slika 14 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 2) koja kodira aminokiselinsku sekvencu humanog SPINK2.
[Slika 15] Slika 15 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3) peptida H218.
[Slika 16] Slika 16 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 4) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H218.
[Slika 17] Slika 17 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5) peptida H223.
[Slika 18] Slika 18 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 6) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H223.
[Slika 19] Slika 19 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7) peptida H228.
[Slika 20] Slika 20 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 8) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H228.
[Slika 21] Slika 21 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 9) peptida H308.
[Slika 22] Slika 22 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 10) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H308.
[Slika 23] Slika 23 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11) peptida H321.
[Slika 24] Slika 24 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 12) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H321.
[Slika 25] Slika 25 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 13) peptida H322.
[Slika 26] Slika 26 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 14) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H322.
[Slika 27] Slika 27 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 15) peptidnog derivata H308AT.
[Slika 28] Slika 28 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 16) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptidnog derivata H308AT.
[Slika 29] Slika 29 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 17) peptidnog derivata H321AT.
[Slika 30] Slika 30 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 18) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptidnog derivata H321AT.
[Slika 31] Slika 31 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 19) peptidnog derivata H322AT.
[Slika 32] Slika 32 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 20) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptidnog derivata H322AT.
[Slika 33] Slika 33 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 21) peptida M7.
[Slika 34] Slika 34 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 22) koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida M7.
[Slika 35] Slika 35 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 23) peptidnog derivata H308_S16A.
[Slika 36] Slika 36 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 24) peptidnog derivata H308_D1G_S16A.
[Slika 37] Slika 37 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 25) peptidnog derivata H308_D1S_S16A.
[Slika 38] Slika 38 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 26) peptidnog derivata H308_D1E_S16A.
[Slika 39] Slika 39 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 27) peptidnog derivata H308_D1SLI_S16A.
[Slika 40] Slika 40 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 28) peptidnog derivata H321AT_D1S_S16A.
[Slika 41] Slika 41 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 29) peptidnog derivata H322AT_D1S_S16A.
[Slika 42] Slika 42 prikazuje opštu formulu (SEQ ID NO: 30) HTRA1-inhibirajućeg peptida. Svaki od X1do X11predstavlja arbitrarnu amino-kiselinu.
[Slika 43] Slika 43 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 31) koja se sastoji od S oznake i linkera.
[Slika 44] Slika 44 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 32) C-terminalnog heksamera.
[Slika 45] Slika 45 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 33) prajmera 1.
[Slika 46] Slika 46 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 34) prajmera 2.
[Slika 47] Slika 47 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 35) prajmera 3.
[Slika 48] Slika 48 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 36) prajmera 4.
[Slika 49] Slika 49 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 37) prajmera 5.
[Slika 50] Slika 50 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 38) prajmera 6.
[Slika 51] Slika 51 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 39) prajmera 7.
[Slika 52] Slika 52 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 40) prajmera 8.
[Slika 53] Slika 53 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 41) prajmera 9.
[Slika 54] Slika 54 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 42) prajmera 10.
[Slika 55] Slika 55 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 43) prajmera 11.
[Slika 56] Slika 56 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 44) prajmera 12.
[Slika 57] Slika 57 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 45) prajmera 13.
[Slika 58] Slika 58 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 46) prajmera 14.
[Slika 59] Slika 59 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 47) prajmera 15.
[Slika 60] Slika 60 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 48) prajmera 16.
[Slika 61] Slika 61 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 49) prajmera 17.
[Slika 62] Slika 62 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 50) prajmera 18.
[Slika 63] Slika 63 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 51) prajmera 19.
[Slika 64] Slika 64 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 52) prajmera 20.
[Slika 65] Slika 65 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 53) humanog HTRA1 (potpun).
[Slika 66(A)] Slika 66(A) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (kat)-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućih peptida, uz korišćenje stope razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora.
[Slika 66(B)] Slika 66(B) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (potpun)-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida, uz korišćenje stope razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora.
[Slika 67] Slika 67 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja HTRA1 (kat)-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida, uz korišćenje razgradnje humanog vitronektina kao indikatora. Analiza se sprovodi western blot-om uz korišćenje antitela na humani vitronektin (R&D Systems, Inc.; MAB2349).
[Slika 68(A)] Slika 68(A) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućih peptida sa svakom od proteaza, uz korišćenje razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 1).
[Slika 68(B)] Slika 68(B) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza, uz korišćenje razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 2).
[Slika 68(C)] Slika 68(C) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza, uz korišćenje razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 3).
[Slika 68(D)] Slika 68(D) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza, uz korišćenje razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 4).
[Slika 68(E)] Slika 68(E) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja unakrsne reaktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida sa svakom od proteaza, uz korišćenje razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora (deo 5).
[Slika 69] Slika 69 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate evaluiranja vezivanja tri HTRA1-inhibirajuća peptida za HTRA1 (kat), postupkom imunoprecipitacije.
[Slika 70(A)] Slika 70(A) predstavlja dijagram koji prikazuje da je u modelu oštećenja retine pacova, koje je izazvano izlaganjem svetlosti, u grupi kod koje je administriran HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1G_S16A, suprimirano smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju, na poprečnim preseku retine. n = 6 za sve grupe. Doza HTRA1-inhibirajućeg peptida H308_D1G_S16A bila je 0.2 i 1 µg/oku.
[Slika 70(B)] Slika 70(B) predstavlja dijagram koji prikazuje da je u modelu oštećenja retine pacova, koje je izazvano izlaganjem svetlosti, u grupi kod koje je administriran HTRA1-inhibirajući peptid H321AT_D1G_S16A, suprimirano smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju, na poprečnom preseku retine. n = 6 za sve grupe. Doza HTRA1-inhibirajućeg peptida H321AT_D1G_S16A bila je 0.2 i 1 µg/oku.
[Slika 70(C)] Slika 70(C) predstavlja dijagram koji prikazuje da je u u modelu oštećenja retine pacova, koje je izazvano izlaganjem svetlosti, u grupi kod koje je administriran HTRA1-inhibirajući peptid H322AT_D1G_S16A, suprimirano smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju, na poprečnim preseku retine. n = 6 za sve grupe. Doza HTRA1-inhibirajućeg peptida H322AT_D1G_S16A bila je 0.2 i 1 µg/oku.
[Slika 71(A)] Slika 71(A) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate imunobojenja RPE ćelija kod kunića starog 12 nedelja, kunića starog 3 godine, i kunića starog 3 godine, kod kojeg je primenjivana HFD-HQ, uz korišćenje antitela na ZO-1 (Thermo Fisher Scientific Inc.).
[Slika 71(B)] Slika 71(B) prikazuje prosečne površine RPE ćelija kod kunića starog 12 nedelja, kunića starog 3 godine, i kunića 3 starog godine kod kojeg je primenjivana HFD-HQ.
[Slika 71(C)] Slika 71(C) predstavlja dijagram koji prikazuje povišenu ekspresiju iRNK komponente 3 komplementa, "C3", koja je faktor povezan sa AMD, u tkivu retine kunića starog 3 godine kod kojeg je primenjivana HFD-HQ.
[Slika 71(D)] Slika 71(D) predstavlja dijagram koji prikazuje povišenu ekspresiju iRNK komponente 3 komplementa, "C3", koja je faktor povezan sa AMD, u tkivu RPE/horoidee kunića starog 3 godine kod kojeg je primenjivana HFD-HQ.
[Slika 71(E)] Slika 71(E) predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate merenja koncentracije HTRA1 u staklastom telu kunića starog 12 nedelja, kunića starog 3 godine, i kunića starog 3 godine kod kojeg je primenjivana HFD-HQ, pomoću LC-MS/MS.
[Slika 72(A)] Slika 72(A) predstavlja dijagram koji prikazuje da je kod kunića starih 3 godine kod kojih je primenjivana HFD-HQ, u grupi kojoj je administriran HTRA1-inhibirajući peptid H308, ispoljen supresivni efekat na hipertrofiju RPE ćelija. n = 5 za sve grupe. Prosečna površina upotrebljena je kao indikator.
[Slika 72(B)] Slika 72(B) predstavlja dijagram koji prikazuje da je kod kunića starih 3 godine kod kojih je primenjivana HFD-HQ, u grupi kojoj je administriran HTRA1-inhibirajući peptid H308, ispoljen supresivni efekat na hipertrofiju RPE ćelija. n = 5 za sve grupe. Broj RPE ćelija koje imaju ćelijsku površinu od 1500 µm<2>ili više upotrebljen je kao indikator.
[Slika 73] Slika 73 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultate upoređivanja sličnosti sekvenci HTRA1 čoveka, majmuna, kunića, miša, i pacova. Isprekidana linija prikazuje enzimski aktivan domen (204Gly do 364Leu).
[Slika 74] Slika 74 predstavlja dijagram koji prikazuje da HTRA1-inhibirajući peptid ispoljava supresivni efekat na iRNK za VEGF, indukovan u ARPE-19 liniji ćelija pigmentnog epitela retine čoveka dodavanjem H2O2, komplementa normalnog humanog seruma, i HTRA1.
[Slika 75] Slika 75 predstavlja dijagram koji prikazuje da HTRA1-inhibirajući peptid ispoljava supresivan efekat na migraciju endotelskih ćelija humane umbilikalne vene (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) indukovanu serumom.
[Slika 76] Slika 76 prikazuje nukleotidnu sekvencu prajmera 21.
[Slika 77] Slika 77 prikazuje nukleotidnu sekvencu prajmera 22.
[0011] U predmetnom pronalasku, izraz "SEQ ID NO: X (Slika Y)" ili "Slika Y (SEQ ID NO: X)" znači da je sekvenca prikazana u SEQ ID NO: X ili je prikazana na Slici Y.
Opis tehničkih rešenja
1. Definicija
[0012] U predmetnom pronalasku, izraz "gen" koristi se da označi molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u proteinu, ili njen komplementarni lanac. Gen se sastoji od jednostrukog lanca, dvostrukog lanca ili trostrukog ili višestrukog lanca. Asocijacija DNK lanca i RNK lanca, ribonukleotida i dezoksiribonukleotida koji koegzistiraju na jednom lancu, i dvolančani ili tro- ili višelančani molekul nukleinske kiseline koji uključuje takav lanac, takođe su obuhvaćeni značenjem pojma "gen".
[0013] U predmetnom pronalasku, izrazi "gen", "polinukleotid" i "molekul nukleinske kiseline" su sinonimi jedan sa drugim i ni na koji način nisu ograničeni brojem jedinica od kojih se sastoje kao što su ribonukleotidi, dezoksiribonukleotidi, nukleotidi, i nukleozidi. Na primer, DNK, RNK, iRNK, cDNK, cRNK, proba, oligonukleotid, prajmer, i slično takođe su obuhvaćeni obimom istog. Izraz "molekul nukleinske kiseline" skraćen je i na "nukleinska kiselina".
[0014] U predmetnom pronalasku, izrazi "polipeptid", "peptid" i "protein" su sinonimi jedan sa drugim. Peptid koji inhibira ili suprimira jednu ili dve ili više aktivnosti ili funkcija ciljnog molekula X (kasnije u ovom tekstu, ovi inhibitorni ili supresivni efekti se zajedno označavaju kao "X-inhibitorna aktivnost") može se označiti kao "X-inhibirajući peptid".
[0015] Izraz "SPINK2" koristi se da označi inhibitor serinske proteaze, Kazal tip 2. Ovaj protein od 7 kDa sastoji se od Kazal-sličnog domena koji ima tri disulfidne veze. SPINK2 je poželjno humanog porekla. U predmetnom pronalasku, humani SPINK2 je jednostavno označen kao "SPINK2", ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0016] Izraz "HTRA1" koristi se da označi visokotemperaturno-zahtevajuću serinsku peptidazu A1. Ovaj protein je sačinjen od N-terminalnog domena koji se sastoji od modula sličnog IGFBP i modula sličnog Kazal motivu, proteaznog domena i C-terminalnog PDZ domena i pripada HTRA familiji. HTRA1 je poželjno humanog porekla. U predmetnom pronalasku, humani HTRA1 je jednostavno označen i kao "HTRA1", ukoliko nije drugačije specifikovano.
[0017] Izraz "HTRA1-inhibirajući peptid" koristi se da označi peptid koji inhibira ili suprimira jednu ili dve ili više aktivnosti ili funkcija HTRA1. Fragment peptida, adukt peptida sa dodatnim segmentom, ili konjugat peptida koji zadržava HTRA1-inhibitornu aktivnost obuhvaćen je obimom izraza "HTRA1-inhibirajući peptid". Specifično, fragment, adukt i modifikovana forma peptida, koji zadržavaju HTRA1-inhibitornu aktivnost takođe su obuhvaćeni izrazom "HTRA1-inhibirajući peptid".
[0018] U predmetnom pronalasku, izraz "ćelija" koristi se da uključi različite ćelije poreklom iz životinjskih jedinki, subkultivisane ćelije, ćelije primarne kulture, ćelijske linije, rekombinantne ćelije, kvasce, mikrobe i slično.
[0019] U predmetnom pronalasku, izraz "mesto" za koje se peptid vezuje, tj., "mesto" koje peptid prepoznaje, koristi se da označi kontinuiranu ili isprekidanu parcijalnu sekvencu amino-kiselina ili parcijalnu konformaciju na ciljnom molekulu za koju se peptid vezuje ili koju prepoznaje. U predmetnom pronalasku, takvo mesto može se označiti kao epitop ili vezujuće mesto na ciljnom molekulu.
[0020] Izraz "SPINK2 mutant" koristi se da označni peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz aminokiselinske sekvence divljeg tipa SPINK2, supstitucijom jedne ili dve ili više amino-kiselina amino-kiselinama različitim od onih divljeg tipa, delecijom jedne ili dve ili više amino-kiselina divljeg tipa, insercijom jedne ili dve ili više amino-kiselina kojih nema u divljem tipu, i/ili adicijom amino-kiseline(amino-kiselina) koje nema u divljem tipu, na amino-terminus (N terminus) i/ili karboksil-terminus (C terminus) divljeg tipa (kasnije u ovom tekstu zajedno označeno kao "mutacija"). "SPINK2 mutant" koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost obuhvaćen je izrazom HTRA1-inhibirajući peptid. U predmetnom pronalasku, "insercija" može takođe biti obuhvaćena izrazom "adicija".
[0021] U predmetnom pronalasku, izraz "nekoliko" u frazi "jedan ili nekoliko" odnosi se na 3 do 10.
[0022] U predmetnom pronalasku, fraza "hibridizovati pod stringentnim uslovima" koristi se da označi da se hibridizacija dešava pod uslovima koji podrazumevaju odvijanje hibridizacije na 65°C, u rastvoru koji sadrži 5 × SSC, i rezultat toga se zatim ispira na 65°C, 20 minuta u vodenom rastvoru koji sadrži 2 × SSC i 0.1% SDS, na 65°C, 20 minuta u vodenom rastvoru koji sadrži 0.5 × SSC i 0.1% SDS, i na 65°C, 20 minuta u vodenom rastvoru koji sadrži 0.2 × SSC i 0.1% SDS, ili pod uslovima ekvivalentnim tome. SSC označava vodeni rastvor 150 mM NaCl i 15 mM natrijum citrata, i n × SSC označava n-struku koncentraciju SSC.
[0023] U predmetnom pronalasku, izrazi "specifično" i "specifičnost" su sinonimi i koriste se naizmenično sa izrazima "selektivno", odnosno "selektivnost". Na primer, HTRA1-specifični inhibirajući peptid je sinonim za HTRA1-selektivni inhibirajući peptid.
2. Peptid
2-1. Amino-kiselina
[0024] Izraz "amino-kiselina" koristi se da označi organsko jedinjenje koje sadrži amino grupu i karboksilnu grupu i da označi α-amino-kiselinu koja je sadržana kao sastavna jedinica, poželjno u proteinu, i poželjnije u prirodnom proteinu. U predmetnom pronalasku, amino-kiselina je poželjnije Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val. Izraz "amino-kiselina" koristi se da označi ovih 20 amino-kiselina zajedno, ukoliko nije drugačije specifikovano. Ovih 20 amino-kiselina može se zajedno označiti kao "prirodne aminokiseline". HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska poželjno sadrži prirodne aminokiseline.
[0025] U predmetnom pronalasku, izraz "aminokiselinska rezidua" označava se i kao "aminokiselina".
[0026] U predmetnom pronalasku, amino-kiselina može biti L-amino-kiselina, D-amino-kiselina, ili njihova smeša (DL-amino-kiselina) i označava L-amino-kiselinu, ako nije drugačije specifikovano.
[0027] Prirodne amino-kiseline mogu se podeliti, na primer, u sledeće grupe, na osnovu zajedničkih osobina bočnih lanaca:
(1) grupa hidrofobnih amino-kiselina: Met, Ala, Val, Leu, i Ile;
(2) grupa neutralnih hidrofilnih amino-kiselina: Cys, Ser, Thr, Asn, i Gln;
(3) grupa kiselih amino-kiselina: Asp i Glu;
(4) grupa baznih amino-kiselina: His, Lys, i Arg;
(5) grupa amino-kiselina koje utiču na smer glavnog lanca: Gly i Pro; i
(6) grupa aromatičnih amino-kiselina: Trp, Tyr, i Phe.
[0028] Međutim, klasifikacija prirodnih amino-kiselina nije ograničena na ovu.
[0029] U predmetnom pronalasku, svaka prirodna amino-kiselina može podleći konzervativnoj aminokiselinskoj supstituciji.
[0030] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" označava supstituciju funkcionalno ekvivalentnom ili sličnom amino-kiselinom. Konzervativna aminokiselinska supstitucija u peptidu dovodi do statičke promene aminokiselinske sekvence peptida. Na primer, jedna ili dve ili više aminokiselinskih supstitucija sa sličnom polarnošću deluje funkcionalno ekvivalentno i donosi statičku promenu aminokiselinske sekvence peptida. Uopšteno, supstitucija unutar određene grupe može se smatrati konzervativnom u smislu struktura i funkcija. Međutim, kao što je stručnjaku u ovoj oblasti jasno, uloga specifične aminokiselinske rezidue može se odrediti prema njenoj poziciji u trodimenzionalnoj strukturi molekula koji sadrži amino-kiselinu. Na primer, cisteinska rezidua može zadobiti oksidisanu (disulfidnu) formu koja ima nižu polarnost od one koju ima redukovana (tiolna) forma. Dugi alifatični segment bočnog lanca arginina sposoban je da uspostavi strukturno i funkcionalno važne osobine. Alternativno, bočni lanac koji sadrži aromatični prsten (triptofan, tirozin, i fenilalanin) sposoban je da doprinese jonsko-aromatičnoj interakciji ili katjonsko-pi interakciji. U tom slučaju, čak i supstitucija amino-kiselina koje imaju ove bočne lance aminokiselinama koje pripadaju kiseloj ili nepolarnoj grupi može biti strukturno i funkcionalno konzervativna. Rezidue kao što su prolin, glicin, i cistein (disulfidna forma) mogu imati direktan efekat na trodimenzionalnu strukturu glavnog lanca i često se ne mogu supstituisati bez strukturne distorzije.
[0031] Konzervativna aminokiselinska supstitucija uključuje, kao što je prikazano u nastavku, specifičnu supstituciju na osnovu sličnosti bočnog lanca (L. Lehninger, Biochemistry, 2. izdanje, str. 73-75, Worth Publisher, Njujork (1975)) i tipičnu supstituciju.
(1) Grupa nepolarnih amino-kiselina: alanin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Ala" ili jednostavno "A"), valin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Val" ili jednostavno "V"), leucin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Leu" ili jednostavno "L"), izoleucin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Ile" ili jednostavno "I"), prolin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Pro" ili jednostavno "P"), fenilalanin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Phe" ili jednostavno "F"), triptofan (kasnije u ovom tekstu označen kao "Trp" ili jednostavno "W"), i metionin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Met" ili jednostavno "M")
(2) Grupa nenaelektrisanih polarnih amino-kiselina: glicin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Gly" ili jednostavno "G"), serin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Ser" ili jednostavno "S"), treonin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Thr" ili jednostavno "T"), cistein (kasnije u ovom tekstu označen kao "Cys" ili jednostavno "C"), tirozin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Tyr" ili jednostavno "Y"), asparagin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Asn" ili jednostavno "N"), i glutamin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Gln" ili jednostavno "Q") (3) Grupa kiselih amino-kiselina: asparaginska kiselina (kasnije u ovom tekstu označena kao "Asp" ili jednostavno "D") i glutaminska kiselina (kasnije u ovom tekstu označena kao "Glu" ili jednostavno "E")
(4) Grupa baznih amino-kiselina: lizin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Lys" ili jednostavno "K"), arginin (kasnije u ovom tekstu označen kao "Arg" ili jednostavno "R"), i histidin (kasnije u ovom tekstu označen kao "His" ili jednostavno "H")
[0032] U predmetnom pronalasku, amino-kiseline mogu biti amino-kiseline različite od prirodnih amino-kiselina. Njihovi primeri mogu uključivati selenocistein, N-formilmetionin, pirolizin, piroglutaminsku kiselinu, cistin, hidroksiprolin, hidroksilizin, tiroksin, O-fosfoserin, dezmozin, βalanin, sarkozin, ornitin, kreatin, γ-aminobuternu kiselinu, opin, teanin, triholomsku kiselinu, kainsku kiselinu, domoinsku kiselinu, i akromelinsku kiselinu, koje se nalaze u prirodnim peptidima ili proteinima, i mogu uključiti: N-terminalno protektovane amino-kiseline kao što su norleucin, Ac-amino-kiselina, Boc-amino-kiselina, Fmoc-amino-kiselina, Trt-amino-kiselina, i Z-amino-kiselina; C-terminalno protektovane amino-kiseline kao što su t-butil estar, benzil estar, cikloheksil estar, i fluorenil estar amino-kiselina; i druge amino-kiseline koje se ne nalaze u prirodnom svetu, uključujući diamin, ω amino-kiselinu, β amino-kiselinu, γ amino-kiselinu, Tic derivate amino-kiselina, i aminofosfonsku kiselinu. Amino-kiseline različite od 20 "prirodnih amino-kiselina" nisu ovim ograničene i u predmetnom pronalasku se, radi pogodnosti, zbirno označavaju kao "neprirodne amino-kiseline".
2-2. HTRA1-inhibirajući peptid
[0033] HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska je SPINK2 mutant koji bar delimično zadržava okvir SPINK2 (kasnije u ovom tekstu označen kao "SPINK2 mutant") i inhibira ili suprimira proteaznu aktivnost HTRA1 ili fragmenta koji zadržava njegovu enzimsku aktivnost (kasnije u ovom tekstu označen kao "funkcionalni fragment") (kasnije u ovom tekstu, ta inhibicija i supresija se zajedno označavaju kao "HTRA1-inhibitorna aktivnost").
[0034] HTRA1, koji je cilj inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska, poželjno je HTRA1 sisara, poželjnije HTRA1 primata, i još poželjnije humani HTRA1. Aminokisenska sekvenca zrelog humanog HTRA1 pune dužine (kasnije u ovom tekstu označenog kao "HTRA1 (potpun)") ima sekvencu amino-kiselina prikazanu u SEQ ID NO: 53 (Slika 65). Ova aminokiselinska sekvenca sastoji se od pozicija 23 do 480 i ne sadrži signalnu sekvencu koja se sastoji od pozicija 1 do 22. Aminokiselinska sekvenca funkcionalnog fragmenta humanog HTRA1 (kasnije u ovom tekstu označenog kao "HTRA1 (kat)") nije posebno ograničena, pod uslovom da funkcionalni fragment zadržava proteaznu aktivnost. Njegovi primeri mogu uključiti funkcionalni fragment koji se sastoji od 158Gly do 373Lys iz SEQ ID NO: 53 (Slika 65), i funkcionalni fragment koji sadrži 158Gly do 373Lys istog. HTRA1 ili njegov funkcionalni fragment koji je cilj inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska označava se i kao HTRA1 proteaza. HTRA1 proteaza je poželjno poreklom iz kičmenjaka, poželjnije poreklom je iz sisara, još poželjnije poreklom je iz primata, i najpoželjnije poreklom je iz čoveka, i može se pripremiti prečišćavanjem iz tkiva ili ćelija bilo koje od ovih životinja, ili postupkom koji je stručnjaku u ovoj oblasti poznat kao postupak pripremanja proteina, kao što je genska rekombinacija, in vitro translacija, ili sinteza peptida. HTRA1 ili njegov funkcionalni fragment može se povezati sa signalnom sekvencom, imunoglobulinskim Fc regionom, oznakom, obeleživačem, ili slično.
[0035] HTRA1-inhibitorna aktivnost može se evaluirati korišćenjem proteazne aktivnosti HTRA1 kao indikatora. Na primer, omogući se da HTRA1 ili njegov funkcionalni fragment, supstrat i inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ili kandidat istog međusobno koegzistiraju. U tom slučaju, kada proteazna aktivnost HTRA1 iznosi 70% ili manje, 50% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje, 5% ili manje, 1% ili manje ili 0% u poređenju sa onom u prisustvu kontrole ili u odsustvu inhibitora ili kandidata istog, inhibicija HTRA1 dešava se sa inhibitornom aktivnošću od 30% ili više, 50% ili više, 70% ili više, 80% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 99% ili više ili 100%, redom. HTRA1-inhibitorna aktivnost može se razlikovati u zavisnosti od uslova reakcije, tipa supstrata, koncentracije, itd. Primeri uslova reakcije mogu uključiti, ali se ne ograničavaju na one koji su opisani u Primerima. Enzimska aktivnost može se evaluirati dodavanjem supstratnog peptida ili supstratnog proteina datoj koncentraciji HTRA1, i reagovanjem smeše dato vreme, posle čega sledi detektovanje fluorescencije supstratnog peptida, ili detektovanje supstratnog proteina pomoću SDS-PAGE, western blot-a, tečne hromatografije, ili slično. Na primer, kao puferski rastvor mogu se koristiti fiziološki rastvor puferisan fosfatom (phosphate buffered saline, kasnije u ovom tekstu označen kao "PBS"), boratni pufer (50 mM borat, pH 7 do 9, na primer, pH 8.5), ili Tris pufer (50 mM Tris, pH 6 do 9, na primer, pH 8.0). U reakcioni sistem mogu se dodati NaCl (50 do 300 mM, na primer, 150 mM) ili surfaktant kao što je CHAPS, ili oktil β-D-glukopiranozid, iako se aditivi ne ograničavaju na njih.
[0036] Primeri supstrata za HTRA1 proteazu uključuju, ali se ne ograničavaju na endogene supstrate, egzogene supstrate, i sintetske supstrate. Primeri humanog endogenog supstrata mogu uključiti vitronektin. Primeri sintetskog supstrata mogu uključiti, ali se ne ograničavaju posebno na H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K), β-kazein, i druge supstrate za HTRA1. HTRA1-inhibitorna aktivnost (IC50ili Ki) peptida predmetnog pronalaska je 1 µM ili niža, poželjnije 100 nM ili niža.
[0037] Poželjno je da inhibitorni peptid predmetnog pronalaska ne inhibira niti suprimira aktivnost proteaza različitih od HTRA1, ili bi stepen inhibicije ili supresije te aktivnosti trebalo da bude relativno slab. Drugim rečima, inhibirajući peptid predmetnog pronalaska poželjno ima visoku specifičnost prema HTRA1. Poželjno, inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ne inhibira niti suprimira aktivnosti proteaza kao što su tripsin, α-himotripsin, triptaza, plazmin, trombin, matriptaza, protein C, tkivni plazminogen-aktivator (tissue plasminogen activator, tPA), urokinaza (urokinase, uPA), plazmin, i kalikrein plazme, ili ima relativno slab stepen inhibicije ili supresije tih aktivnosti. Takav poželjan peptid predmetnog pronalaska ne dovodi do neželjenih reakcija izazvanih inhibicijom ili supresijom aktivnosti drugih proteaza i može se poželjno koristiti kao terapijski lek ili profilaktički lek za oboljenje koje je u vezi sa HTRA1 (pomenuto u nastavku ovog teksta).
[0038] Kako je gore pomenuto, HTRA1 koji je cilj za peptid predmetnog pronalaska je poželjno poreklom iz kičmenjaka, poželjnije poreklom je iz sisara, još poželjnije poreklom je iz primata, i najpoželjnije poreklom je iz čoveka. Alternativno, HTRA1 koji je cilj za peptid predmetnog pronalaska može biti poreklom iz životinje koja nije čovek, na primer iz glodara kao što su pacov ili miš, ili iz primata kao što je majmun cinomolgus, obični marmozet, ili rezus majmun. Peptid sa inhibitornom aktivnošću prema HTRA1 poreklom iz životinje koja nije čovek može se upotrebiti za dijagnozu, ispitivanje, lečenje ili prevenciju, itd. oboljenja koje je u vezi sa HTRA1 kod životinje koja nije čovek. Kada takav peptid inhibira i humanu HTRA1, životinja koja nije čovek može se koristiti: u nekliničkom istraživanju i razvijanju peptida kao terapijskog leka ili profilaktičkog leka za oboljenje čoveka koje je u vezi sa HTRA1; ili za izvođenje farmakološkog testa ili farmakokinetičkog testa, uz korišćenje životinje koja nije čovek kao animalnog modela bolesti; ili za izvođenje testa bezbednosti, testa toksičnosti, ili slično, uz korišćenje životinje koja nije čovek kao zdrave životinje.
[0039] HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ima prednosti kao što su: manja molekulska masa od one koju imaju drugi biomolekuli, na primer antitela za upotrebu u vidu medikamenata i dijagnostički lekovi u stanju tehnike; njegova relativno laka proizvodnja (pomenuće se u nastavku); izvrsne fizičke osobine u pogledu prodiranja u tkivo, stabilnosti prilikom skladištenja, termičke stabilnosti, i slično; i širok raspon izbora puteva primene, postupka primene, pripremanja, i slično, kada se upotrebljava kao farmaceutska kompozicija (biće pomenuto u nastavku ovog teksta). Poluživot u krvi peptida predmetnog pronalaska upotrebljenog u vidu farmaceutske kompozicije može se produžiti primenom poznatog postupka kao što je dodavanje biomolekula ili polimera, čime se povećava molekulska masa peptida. Molekulska masa takvog HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska manja je od 10,000, poželjno manja je od 8,000, i poželjnije iznosi oko 7,000 do 7,200. Varijabilni segment u vidu petlje koji se sastoji od 15Cys do 31Cys iz SEQ ID NO: 23 (Slika 29) ili segment koji se sastoji od 15Cys do 63Cys istog (kasnije u ovom tekstu označena kao "segment koji sadrži šest Cys rezidua") i koja ima HTRA1-inhibirajuću aktivnost takođe je uključena u HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska. Molekulska masa varijabilnog segmenta u vidu petlje manja je od 2,500, i poželjno iznosi oko 1,800 do 2,000. Molekulska masa segmenta koji sadrži šest Cys rezidua manja je od 6,000, i poželjno iznosi oko 5,300 do 5,500.
[0040] SPINK2 mutant koji bar delimično zadržava okvir SPINK2 (kasnije u ovom tekstu označen kao "SPINK2 mutant"), obuhvaćen obimom HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska, može se vezati za HTRA1 i sposoban je da se veže za poželjno HTRA1 sisara, poželjnije HTRA1 primata, i još poželjnije humani HTRA1. Takav peptid koji se vezuje za HTRA1, prepoznaje ili se vezuje za parcijalni peptid, parcijalnu konformaciju, ili slično HTRA1 (kasnije u ovom tekstu, takvi efekti prepoznavanja i vezivanja označavaju se zajedno kao "aktivnost vezivanja za cilj").
[0041] U jednom aspektu, inhibirajući peptid predmetnog pronalaska sposoban je da se veže za imunogeni fragment HTRA1. Imunogeni fragment HTRA1 ima jedan ili dva ili više epitopa, mimotopa ili drugih antigenskih determinanti i stoga je sposoban da indukuje imunski odgovor ili, sposoban je da izazove sintezu antitela na fragment.
[0042] Vezivanje SPINK2 mutanta prema predmetnom pronalasku za HTRA1 ili njegov imunogeni fragment može se evaluirati, meriti ili odrediti upotrebom postupka poznatog osobi obučenoj u ovoj oblasti, na primer merenjem detektabilnog afiniteta vezivanja (ELISA, analiza rezonancije površinskog plazmona (surface plasmon resonance, kasnije u ovom tekstu označena kao "SPR") (označena i kao "BIAcore" postupak), izotermalna titraciona kalorimetrija (isothermal titration calorimetry, kasnije u ovom tekstu označena i kao "ITC"), protočna citometrija, postupak imunoprecipitacije, itd.).
[0043] Primeri ELISA uključuju postupak koji podrazumeva detektovanje HTRA1-inhibirajućeg peptida koji je prepoznao i vezao se za HTRA1 imobilisan na ploči. Pri imobilizaciji HTRA1 može se koristiti biotin-streptavidin kao i, na primer, antitelo za imobilizaciju, koje prepoznaje oznaku fuzionisanu sa HTRA1. Pri detekciji HTRA1-inhibirajućeg peptida može se koristiti obeleženi streptavidin kao i, na primer, obeleženo antitelo za detekciju, koje prepoznaje oznaku fuzionisanu sa HTRA1-inhibirajućim peptidom. Pri obeležavanju može se koristiti biotin kao i postupak pogodan za biohemijsku analizu, na primer HRP, alkalna fosfataza ili FITC. Pri detekciji korišćenjem enzimskog obeležavanja može se koristiti hromogeni supstrat kao što je TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin), BCIP (5-bromo-4-hloro-3-indolil fosfat), p-NPP (p-nitrofenil fosfat), OPD (o-fenilendiamin), ABTS (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina), ili SuperSignal ELISA piko hemiluminescentni supstrat (Thermo Fisher Scientific Inc.), fluorescentni supstrat kao što je QuantaBlu(TM) fluorogeni peroksidazni supstrat (Thermo Fisher Scientific Inc.), i hemiluminescentni supstrat. Pri merenju detekcionog signala mogu se koristiti čitač apsorbance sa ploča, čitač fluorescencije sa ploča, čitač luminescencije sa ploča, RI tečni scintilacioni brojač, ili slično.
[0044] Primeri instrumenta za upotrebu u SPR analizi mogu uključiti BIAcore(TM) (GE Healthcare), ProteOn(TM) (Bio-Rad Laboratories, Inc.), SPR-Navi(TM) (Oy BioNavis Ltd.), Spreeta(TM) (Texas Instruments Inc.), SPRi-PlexII(TM) (HORIBA, Ltd.), i Autolab SPR(TM) (Metrohm AG). Primeri instrumenta za upotrebu u BLI mogu uključiti Octet(TM) (Pall Corp.).
[0045] Primeri postupka imunoprecipitacije uključuju postupak koji podrazumeva detektovanje HTRA1 koji je prepoznao i vezao se za HTRA1-inhibirajući peptid imobilisan na perlicama. Kao perlice mogu se koristiti magnetne perlice, agarozne perlice, ili slično. Pri imobilizaciji HTRA1-inhibirajućeg peptida može se koristiti biotin-streptavidin, kao i antitelo koje prepoznaje peptid ili oznaku fuzionisanu sa peptidom, protein A ili protein G, itd. Perlice se razdvajaju korišćenjem magneta, centrifugiranjem, ili slično, i HTRA1 koji je precipitiran sa perlicama detektuje se pomoću SDS-PAGE ili western blot-a. Pri detekciji HTRA1 može se koristiti obeleženi streptavidin kao i, na primer, obeleženo antitelo za detekciju, koje prepoznaje oznaku fuzionisanu sa HTRA1. Pri obeležavanju može se koristiti biotin, kao i postupak pogodan za biohemijsku analizu, na primer HRP, alkalna fosfataza, ili FITC. Pri detekciji korišćenjem enzimskog obeležavanja može se koristiti isti supstrat kao za ELISA. Pri merenju detekcionog signala mogu se koristiti ChemiDoc(TM) (Bio-Rad Laboratories, Inc.), LuminoGraph (ATTO Corp.), ili slično.
[0046] U predmetnom pronalasku, izraz "specifično prepoznavanje", tj., "specifično vezivanje", koristi se da označi vezivanje koje ne predstavlja nespecifičnu adsorpciju. Primeri kriterijuma za određivanje da li je vezivanje specifično ili ne, mogu uključiti vezujuću aktivnost EC50u ELISA.
Drugi primeri kriterijuma određivanja mogu uključiti konstantu disocijacije (kasnije u ovom tekstu označena kao "KD"). Vrednost KDHTRA1-inhibirajućeg peptida prema predmetnom pronalasku za HTRA1 je 1 × 10<-4>M ili niža, 1 × 10<-5>M ili niža, 5 × 10<-6>M ili niža, 2 × 10<-6>M ili niža ili 1 × 10<-6>M ili niža, poželjnije 5 × 10<-7>M ili niža, 2 × 10<-7>M ili niža ili 1 × 10<-7>M ili niža, još poželjnije 5 × 10<-8>M ili niža, 2 × 10<-8>M ili niža ili 1 × 10<-8>M ili niža, još poželjnije 5 × 10<-9>M ili niža, 2 × 10<-9>M ili niža ili 1 × 10<-9>M ili niža. Drugi primeri kriterijuma za određivanje mogu uključiti rezultate analize postupkom imunoprecipitacije. Poželjni HTRA1-inhibirajući peptid prema predmetnom pronalasku imobiliše se na perlice, i dodaje mu se HTRA1. Zatim se perlice razdvajaju, i detektuje se HTRA1 precipitiran sa perlicama. U tom slučaju, detektuje se signal HTRA1.
[0047] I pored gornjeg opisa, sposobnost vezivanja za HTRA1 ili njegov imunogeni fragment nije esencijalna za SPINK2 mutant koji služi kao inhibirajući peptid predmetnog pronalaska sve dok SPINK2 mutant ima HTRA1-inhibitornu aktivnost.
[0048] Inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može kompetirati pri vezivanju proteaznog supstrata za HTRA1.
[0049] U nekim poželjnim aspektima, inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ima protektivni efekat na retinu. Na primer, poželjni inhibitor predmetnog pronalaska može suprimirati smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju, koje je indukovano izlaganjem svetlosti, u modelu oštećenja retine indukovanog izlaganjem svetlosti, koji je detaljno opisan u Primerima. Veća količina HTRA1 proteina bila je detektovana u staklastom telu grupe koja je izlagana svetlosti u ovom modelu, u poređenju sa neizlaganom grupom. Prema tome, predmetni pronalazak stavlja na uvid javnosti sledeće: HTRA1 je uključen u oštećenje retine; i HTRA1-inhibitorna aktivnost ima zaštitni efekat na retinu.
[0050] SPINK2 mutant koji služi kao inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može imati aktivnosti, osobine, funkcije, odlike, itd. kako je gore opisano, pri čemu njegova aminokiselinska sekvenca pune dužine ima visoku sekvencionu identičnost sa aminokiselinskom sekvencom humanog divljeg tipa SPINK2. Sekvenciona identičnost SPINK2 mutanta predmetnog pronalaska sa aminokiselinskom sekvencom (SEQ ID NO: 1: Slika 13) humanog SPINK2 iznosi 70% ili više, 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više ili 99% ili više.
[0051] Izraz "identičnost" koristi se da označi osobinu koja ukazuje na stepen sličnosti ili srodnosti između dve sekvence. Identičnost (%) sekvenci amino-kiselina izračunava se deljenjem broja identičnih amino-kiselina ili aminokiselinskih rezidua sa ukupnim brojem amino-kiselina ili aminokiselinskih rezidua i množenjem dobijene numeričke vrednosti sa 100.
[0052] Izraz "procep" koristi se da označi prostor u poravnavanju dveju ili više sekvenci, koji je rezultat delecije i/ili adicije u najmanje jednoj od dve ili više sekvenci.
[0053] Identičnost između dve aminokiselinske sekvence koje imaju potpuno identične aminokiselinske sekvence iznosi 100%. Pod uslovom da jedna od aminokiselinskih sekvenci ima supstituciju, deleciju ili adiciju jedne ili dve ili više amino-kiselina ili aminokiselinskih rezidua, u poređenju sa drugom aminokiselinskom sekvencom, identičnost između ove dve aminokiselinske sekvence niža je od 100%. Primeri algoritma ili programa za određivanje identičnosti između dve sekvence koji uzimaju u obzir procep, mogu uključivati one koji su poznati stručnjaku u oblasti, na primer BLAST (Altschul, i sarad, Nucleic Acids Res., tom 25, str.3389-3402, 1997), BLAST2 (Altschul, i sarad, J. Mol. Biol., tom 215, str.403-410, 1990), i Smith-Waterman (Smith, i sarad, J. Mol. Biol., tom 147, str.195-197, 1981).
[0054] U predmetnom pronalasku, izraz "mutiran" koristi se da označi da su jedan ili dva ili više nukleotida ili nukleotidnih rezidua ili amino-kiselina ili aminokiselinskih rezidua supstituisani, deletirani ili insertovani u nukleotidnu sekvencu ili aminokiselinsku sekvencu, u poređenju sa molekulom nukleinske kiseline ili peptidom koji se sreće u prirodi. Aminokiselinska sekvenca SPINK2 mutanta predmetnog pronalaska ima jednu ili dve ili više mutiranih amino-kiselina ili aminokiselinskih rezidua, u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom humanog SPINK2.
[0055] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, aminokiselinska sekvenca SPINK2 mutanta može imati bilo koje od:
supstitucije 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 amino-kiselina od 16Ser do 22Gly drugim amino-kiselinama ili aminokiselinskim reziduama;
supstitucije 1, 2, 3, 4 ili 5 amino-kiselina od 24Pro do 28Asn drugim amino-kiselinama ili aminokiselinskim reziduama;
supstitucije 1 ili 2 amino-kiseline od 39Ala i 43Thr drugim amino-kiselinama ili aminokiselinskim reziduama u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 1: Slika 13) humanog SPINK2,
ili može imati ove amino-kiseline kao one u divljem tipu (2 amino-kiseline ili aminokiselinske rezidue uključene su u α heliks) sve dok tercijarna struktura glavnog lanca petlje konstituisane aminokiselinskim reziduama na pozicijama 16 do 30, itd. može bar delimično ispoljavati HTRA1-inhibitornu aktivnost; svaka od 15Cys, 23Cys, 31Cys, 42Cys, 45Cys i 63Cys je poželjno Cys, kao u divljem tipu, da bi se održale prirodne disulfidne veze. 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 od njih mogu biti supstituisane drugim amino-kiselinama u cilju uklanjanja prirodnih disulfidnih veza ili stvaranja neprirodne disulfidne veze. Neki poželjni HTRA1-inhibirajući peptidi među SPINK2 mutantima predmetnog pronalaska zadržavaju Cys na ovih 6 pozicija, kao u prirodnom SPINK2, i zadržavaju disulfidne veze. U nekim poželjnijim formama takvog inhibirajućeg peptida, 15Cys-45Cys, 23Cys-42Cys, odnosno 31Cys-63Cys, formiraju disulfidne veze.
[0056] Kada je aminokiselinska sekvenca takvog SPINK2 mutanta sadržana u HTRA1-inhibirajućem peptidu, poželjno je da trodimenzionalna struktura sačinjena, na primer, od strukture petlje koja se sastoji od 16Ser do 30Val, β ploče sačinjene od β lanca (1) koji se sastoji od 31Cys i 32Gly i β lanca (2) koji se sastoji od 57Ile do 59Arg, α heliksa koji se sastoji od 41Glu do 51Gly, ili strukture petlje, β ploče, ili α heliksa sličnih tome ili koji im bar delimično odgovaraju (ili tim pozicijama), sadržana u aminokiselinskoj sekvenci divljeg tipa SPINK2, bude zadržana u meri da HTRA1-inhibitorna aktivnost može da se ispolji.
[0057] Aminokiselinske sekvence nekih HTRA1-inhibirajućih peptida među SPINK2 mutantima predmetnog pronalaska biće pomenute u nastavku ovog teksta. Kako je gore pomenuto, u predmetnom pronalasku, izraz "aminokiselinska rezidua" označava se jednostavno i kao "aminokiselina".
[0058] Svaka od prve do jedanaeste Xaa (koje su iste kao X1 do X11, redom) u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 30 (Slika 42) je bilo koja arbitrarna amino-kiselina bez posebnih ograničenja, sve dok se rezultujući mutant vezuje za HTRA1 i inhibira HTRA1 aktivnost. Kasnije u ovom tekstu biće opisane poželjne X1 do X11 amino-kiseline. Međutim, ove aminokiseline mogu uključiti prirodne amino-kiseline, tj., amino-kiseline identične sa onima u aminokiselinskoj sekvenci divljeg tipa humanog SPINK2.
X1 na poziciji 1 je poželjno Asp, Glu, Gly, Ser ili Ile, poželjnije Asp ili Gly, i još poželjnije Gly;
X2 na poziciji 16 je poželjno Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr ili Tyr, poželjnije Ala, Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser ili Thr, još poželjnije Ala, Gly, Lys, Leu, Ser ili Thr, još poželjnije Ala, Gly, Leu, Ser ili Thr, i još poželjnije Ala ili Ser;
X3 na poziciji 17 je poželjno Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ili Tyr, poželjnije Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ili Tyr, još poželjnije Asp, His, Lys, Met ili Gln, i još poželjnije Asp ili Gln;
X4 na poziciji 18 je poželjno Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ili Tyr, poželjnije Asp, Phe, His, Met, Asn, Gln, Ser ili Tyr, još poželjnije Asp, Phe, His, Ser ili Tyr, i još poželjnije Phe ili His;
X5 na poziciji 19 je poželjno Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ili Tyr, poželjnije Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ili Val, još poželjnije Ala, Asp, Glu, Met ili Asn, i još poželjnije Ala, Asp ili Glu;
X6 na poziciji 21 je poželjno Ala, Glu, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Trp ili Tyr, poželjnije Glu, Phe, Ile, Leu, Met, Gln, Arg ili Trp, još poželjnije Met ili Trp, još poželjnije Met;
X7 na poziciji 24 je poželjno Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ili Tyr, poželjnije Asp, Glu, His, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ili Tyr, još poželjnije Gln, Trp, Tyr ili Val, i još poželjnije Tyr ili Val;
X8 na poziciji 26 je poželjno Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Val ili Tyr, poželjnije Ala, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Val ili Tyr, još poželjnije Phe, Leu ili Tyr, i još poželjnije Phe ili Leu;
X9 na poziciji 27 je poželjno Glu, Phe, Leu, Ser, Thr ili Tyr, poželjnije Phe, Leu, Ser, Thr ili Tyr, još poželjnije Phe ili Tyr, još poželjnije Tyr;
X10 na poziciji 39 je poželjno Ala, Glu, Met ili Val, i poželjnije Ala ili Glu; i
X11 na poziciji 43 je poželjno Ala, Thr ili Val, poželjnije Thr ili Val.
[0059] X1 do X11 divljeg tipa su Asp, Ser, Gln, Tyr, Arg, Pro, Pro, His, Phe, Ala, i Thr, redom. Pozicija 20 je Leu, pozicija 22 je Gly, pozicija 25 je Arg, i pozicija 28 je Asn.
[0060] U predmetnom pronalasku, još jedna ili nekoliko ili više amino-kiselina može se dodati na N-terminalnu stranu prve amino-kiseline. Primeri takvih amino-kiselina koje se dodaju mogu uključiti Ser-Leu, i aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od S oznake i linkera (SEQ ID NO: 31: Slika 43).
[0061] Još jedna ili nekoliko amino-kiselina može se dodati na 63Cys pozicioniran na C terminusu. Primeri takve aminokiselinske sekvence mogu uključiti aminokiselinsku sekvencu koja ima 64Gly na C terminusu, i aminokiselinsku sekvencu koja ima 65Gly na C terminusu, posle dodavanja Gly-Gly. Primeri takvih amino-kiselina koje se dodaju mogu uključiti Gly-Gly, i C-terminalni heksamer (SEQ ID NO: 32: Slika 44).
[0062] Poželjnija forma aminokiselinske sekvence pripremljene dodavanjem drugih aminokiselina na N terminus i/ili C terminus aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 30 (Slika 42) ili aminokiselinska sekvenca izvedena iz SEQ ID NO: 30 uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 i 23 do 29 (Slike 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 i 35 do 41) i aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleotidnom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 i 22 (Slike 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 i 34). Još poželjnija forma istog uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 24, 28 i 29 (Slike 36, 40 i 41).
[0063] U predmetnom pronalasku, peptid pripremljen supstitucijom, adicijom i/ili delecijom jedne ili dve ili više amino-kiselina u, na ili iz SPINK2 mutantnog peptida ili N-terminalnog i/ili C-terminalnog adukta SPINK2 mutantnog peptida (kasnije u ovom tekstu označen kao "roditeljski peptid") označen je kao "derivat roditeljskog peptida" ili "roditeljsko-peptidni derivat" (npr., Primer 6). Takav "derivat" je takođe obuhvaćen obimom "peptida" predmetnog pronalaska.
[0064] Aminokiselinska sekvenca SPINK2 mutanta uključena u obim inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska može sadržati prirodnu amino-kiselinu ili mutiranu amino-kiselinu ili aminokiselinsku sekvencu na segmentima različitim od X1 do X11, tj., na pozicijama 2Pro do 15Cys, 20Pro, 22Gly, 23Cys, 25Arg, 28Asn do 38Tyr, 41Glu, 42Cys i 44Thr do 63Cys, u aminokiselinskoj sekvenci (SEQ ID NO: 1: Slika 13) divljeg tipa humanog SPINK2. Na primer, SPINK2 mutant može imati mutaciju na jednoj ili dve ili više pozicija sve dok to bar delimično niti ometa niti interferira sa HTRA1-inhibitornom aktivnošću ili nabiranjem. Takva mutacija postiže se upotrebom standardnog postupka poznatog stručnjaku u ovoj oblasti. Tipični primeri mutacije u aminokiselinskoj sekvenci mogu uključiti supstituciju, deleciju ili adiciju jedne ili dve ili više amino-kiselina. Primeri supstitucije mogu uključiti konzervativnu supstituciju. Pri konzervativnoj supstituciji određena aminokiselinska rezidua supstituiše se aminokiselinskom reziduom koja joj je slična po hemijskim osobinama u pogledu ne samo veličine nego i polarnosti. Primeri konzervativne supstitucije opisani su u drugim delovima predmetne specifikacije. Sa druge strane, segmenti različiti od X1 do X11 mogu prihvatiti nekonzervativnu supstituciju jedne ili dve ili više amino-kiselina sve dok to bar delimično niti ometa niti interferira sa HTRA1-inhibitornom aktivnošću ili nabiranjem.
[0065] U aminokiselinskoj sekvenci SPINK2 mutanta koji služi kao inhibirajući peptid predmetnog pronalaska, X1 do X11 su poželjno amino-kiseline X1 do X11, redom, u bilo kojoj od SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 i 23 do 29 (Slike 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 i 35 do 41), i poželjnije SEQ ID NO: 24, 28 i 29 (Slike 36, 40 i do 41), i segmenti različiti od X1 do X11 mogu imati amino-kiselinu ili aminokiselinsku sekvencu koja bar delimično niti ometa niti interferira sa HTRA1-inhibitornom aktivnošću ili nabiranjem.
[0066] Primeri aminokiselinske sekvence SPINK2 mutanta koji služi kao HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska mogu uključiti bilo koju od sledećih aminokiselinskih sekvenci (a) do (e):
(a) aminokiselinska sekvenca prikazana u bilo kojoj od SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, i 23 do 29 (Slike 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33, i 35 do 41);
(b) aminokiselinska sekvenca kodirana nukleotidnom sekvencom koja se pod stringentnim uslovima hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom koja kodira aminokiselinsku sekvencu (a) i kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u peptidu koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost;
(c) aminokiselinska sekvenca koja je izvedena iz aminokiselinske sekvence (a) supstitucijom, delecijom, adicijom i/ili insercijom 1 do 15, 1 do 10, 1 do 8, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, 1 ili 2, ili 1 amino-kiseline i sadržana je u peptidu koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost;
(d) aminokiselinska sekvenca koja ima 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili višu identičnost sa aminokiselinskom sekvencom (a) i sadržana je u peptidu koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost; i
(e) aminokiselinska sekvenca kodirana nukleotidnom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 i 22 (Slike 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 i 34).
[0067] Međutim, molekul nukleinske kiseline koji kodira HTRA1-inhibirajući peptid nije ograničen na (a) do (e). Svaki molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u SPINK2 mutantu, koja ima HTRA1-inhibitornu aktivnost, i poželjno aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 30 (Slika 42), uključena je u obim molekula nukleinske kiseline koja kodira HTRA1-inhibirajući peptid.
[0068] Mutacija se može uvesti u inhibirajući peptid predmetnog pronalaska u svrhu poboljšanja njegove stabilnosti pri nabiranju, termičke stabilnosti, stabilnosti pri skladištenju, poluživota u krvi, rastvorljivosti u vodi, biološke aktivnosti, farmakološke aktivnosti, sporednog efekta, itd. Na primer, nova reaktivna grupa kao što je Cys može se u njega uvesti mutacijom kako bi se inhibirajući peptid konjugovao sa dodatnom supstancom kao što je polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), biotin, peptid ili protein. U predmetnom pronalasku, HTRA1-inhibirajući peptid može se dodati, spojiti ili vezati za dodatni segment. Takvi konjugati se zajedno označavaju kao "konjugat HTRA1-inhibirajućeg peptida". U predmetnom pronalasku, izraz "konjugat" koristi se da označi molekul peptida predmetnog pronalaska ili njegov fragment dodat, spojen ili vezan za dodatni segment. Izraz "konjugat" ili "konjugacija" uključuje formu u kojoj je određeni segment spojen ili vezan, preko sredstva ili sličnog, pogodnog za spajanje određenog segmenta za bočni lanac amino-kiseline, uključujući hemijsku supstancu kao što je unakrsno povezujuće sredstvo, za N terminus i/ili C terminus peptida predmetnog pronalaska pristupom hemijske sinteze, pristupom genetičkim inženjerstvom, ili slično. Primeri takvog "segmenta" za poboljšanje poluživota u krvi mogu uključiti polialkilen glikolne molekule kao što su polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob, molekule masnih kiselina kao što je palmitinska kiselina, imunoglobulinske Fc regione, imunoglobulinske CH3 domene, imunoglobulinske CH4 domene, albumin ili njegove fragmente, albumin-vezujuće peptide, albumin-vezujuće proteine kao što je streptokokusni protein G, i transferin. Alternativno, "segment" može biti spojen sa peptidom predmetnog pronalaska preko linkera kao što je peptidni linker.
[0069] HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može biti konjugovan sa dodatnim lekom kako bi se ispoljila ili pojačala farmakološka aktivnost. U oblasti antitela, tehnika ili forma poznata stručnjaku u ovoj oblasti kao konjugati atitela i leka (antibody-drug conjugates, ADC) sačinjava neke aspekte predmetnog pronalaska zamenom antitela peptidom predmetnog pronalaska.
[0070] HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može sadržati još i jedan ili dv ili više segmenata koji ispoljavaju vezujući afinitet, inhibitornu aktivnost, antagonističku aktivnost, agonističku aktivnost, ili slično protiv ciljnog molekula različitog od HTRA1, ili se može konjugovati sa takvim segmentima. Primeri "segmenta" mogu uključiti antitela ili njihove fragmente, i proteine koji imaju okvir koji ne pripada antitelu, na primer SPINK2 mutante, ili njihove fragmente. U oblasti antitela, tehnika ili forma poznata stručnjaku u ovoj oblasti kao multispecifična antitela i bispecifična antitela čini neke aspekte konjugata predmetnog pronalaska zamenom bar jednog ili dva ili više u tome sadržanih "antitela" peptidom predmetnog pronalaska.
[0071] Peptid predmetnog pronalaska ili njegov prekursor može sadržati signalnu sekvencu. Signalna sekvenca prisutna ili dodata na N terminus određenog polipeptida ili njegovog prekursora korisna je za dostavu polipeptida specifičnom odeljku ćelije, na primer, periplazmi E. coli ili endoplazminom retikulumu eukariotske ćelije. Mnoge signalne sekvence poznate su stručnjaku u ovoj oblasti, i signalna sekvenca se može odabrati u skladu sa ćelijom-domaćinom. Primeri signalne sekvence za sekretovanje željenog peptida u periplazmu E. coli mogu uključiti OmpA. Forma koja sadrži signalnu sekvencu takođe može biti uključena u neke aspekte konjugata predmetnog pronalaska.
[0072] Peptid predmetnog pronalaska može se označiti unapred i pomoću toga prečistiti afinitetnom hromatografijom. Peptid predmetnog pronalaska može sadržati, na primer, biotin, Strep oznaku(TM), Strep oznaku II(TM), oligohistidin kao što je His6, polihistidin, imunoglobulinski domen, maltoza-vezujući protein, glutation-S-transferazu (GST), kalmodulinvezujući peptid (CBP), hapten kao što je digoksigenin ili dinitrofenol, epitopsku oznaku kao FLAG(TM), myc oznaku, ili HA oznaku (kasnije u ovom tekstu zajedno označene kao "afinitetna oznaka") na svom C-terminusu. Označena forma takođe može biti uključena u neke aspekte konjugata predmetnog pronalaska. Konjugat predmetnog pronalaska može biti peptid (polipeptid) kao celina.
[0073] Peptid predmetnog pronalaska može sadržati segment za obeležavanje. Specifično, peptid predmetnog pronalaska može biti konjugovan sa obeležavajućim segmentom kao što je enzimski obeleživač, radioobeleživač, obojeni obeleživač, fluorescentni obeleživač, obeleživač koji vrši bojenje, luminescentni obeleživač, hapten, digoksigenin, biotin, metalni kompleks, metal, ili koloidno zlato. Forma koja sadrži segment za obeležavanje takođe može biti uključena u neke aspekte konjugata predmetnog pronalaska.
[0074] Inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može sadržati bilo koju od prirodnih aminokiselina i neprirodnih amino-kiselina u svom peptidnom segmentu i može sadržati L-aminokiselinu i D-amino-kiselinu kao prirodnu amino-kiselinu.
[0075] Aminokiselinska sekvenca inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska može sadržati bilo koju od prirodnih amino-kiselina i neprirodnih amino-kiselina i može sadržati L-aminokiselinu i D-amino-kiselinu kao prirodnu amino-kiselinu.
[0076] Inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može biti prisutan kao monomer, dimer, ili trimer ili viši oligomer ili multimer. Dimer ili trimer ili viši oligomer ili multimer može biti bilo koja od homo formi sačinjenih od pojedinačnih monomera, i hetero formi sačinjenih od dva ili više različitih monomera. Monomer može da brzo difunduje i da odlično prodire u tkiva, na primer. Dimer, oligomer i multimer može imati izvrstan aspekt, na primer, visok lokalni afinitet ili vezujuću aktivnost prema ciljnom molekulu, sporu stopu disocijacije, ili visoku HTRA1-inhibitornu aktivnost. Pored spontane dimerizacije, oligomerizacije i multimerizacije, namerno izazvane dimerizacija, oligomerizacija i multimerizacija postižu se uvođenjem jun-fos domena, leucinskog patent-zatvarača, ili slično u inhibirajući peptid predmetnog pronalaska.
[0077] Inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može da se veže za jedan ili dva ili više ciljnih molekula ili da inhibira aktivnost ciljnih molekula, u formi monomera, dimera, ili trimera ili višeg oligomera ili multimera.
[0078] Primeri forme koju može zadobiti inhibirajući peptid predmetnog pronalaska mogu uključiti, ali se ne ograničavaju na izolovane forme (preparati sušeni zamrzavanjem, rastvori, itd.), konjugate pomenute gore, i forme vezane za druge molekule (imobilisane forme, udružene sa različitim molekulom, forme vezane za ciljni molekul, itd.). Forma kompatibilna sa ekspresijom, prečišćavanjem, upotrebom, skladištenjem, ili slično može se arbitrarno odabrati.
3. Identifikacija HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0079] HTRA1-inhibirajući peptid može se identifikovati postupkom dobro poznatim stručnjaku u oblasti, uz korišćenje polaznog materijala kao što je aminokiselinska sekvenca SPINK2 ili aminokiselinska sekvenca (npr., aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 i 23 do 29, ili grupe koja se sastoji od Slika 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 i 35 do 41) HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska, nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu, ili molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu. Kao poželjan primer, HTRA1-inhibirajući peptid može se identifikovati iz biblioteke humanih SPINK2 mutanata, korišćenjem HTRA1-inhibitorne aktivnosti kao indikatora, koja može da se kombinuje sa HTRA1-vezujućom aktivnošću kao još jednim indikatorom.
[0080] Na primer, molekul nukleinske kiseline koji služi kao polazni materijal može da se mutagenizuje i da se prenese u odgovarajućeg bakterijskog domaćina ili eukariotskog domaćina, upotrebom tehnike rekombinantne DNK. Biblioteka SPINK2 mutanata poznata je kao tehnika za identifikovanje vezivnog sredstva ili inhibitora ciljnog molekula. Na primer, objava WO2012/105616 Posle ekspresije mutagenizovane nukleotidne sekvence u pogodnom domaćinu, klon u kojem je SPINK2 mutant koji ima željene osobine, aktivnost, funkciju, itd. povezan sa svojim genotipom može se obogatiti i/ili odabrati iz biblioteke i identifikovati. Pri obogaćivanju i/ili odabiru klona koristi se postupak poznat stručnjaku u ovoj oblasti, kao što je postupak prikazivanja na bakterijama (Francisco, J.A., i sarad, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. SAD tom 90, str. 10444-10448), postupak prikazivanja na kvascu (Boder, E.T., i sarad, (1997), Nat. Biotechnol., tom 15, str.553-557), postupak prikazivanja na ćelijama sisara (Ho M, i sarad, (2009), Methods Mol Biol., tom 525: str. 337-52), postupak prikazivanja na fagima (Smith, G.P. (1985), Science., tom 228, str.1315-1317), postupak prikazivanja na ribozomima (Mattheakis LC, i sarad, (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. SAD tom 91, br. 19, str. 9022-9029), postupak prikazivanja na nukleinskoj kiselini, na primer, prikazivanje na iRNK (Nemoto N, i sarad, (1997), FEES Lett., tom 414, br. 2, str. 405-408), ili postupak skrininga kolonija (Pini, A. i sarad, (2002), Comb. Chem. High Throughput Screen., tom 5, str.503-510). Nukleotidna sekvenca SPINK2 mutanta sadržana u tako odabranom i identifikovanom klonu može se odrediti da bi se odredila aminokiselinska sekvenca kodirana nukleotidnom sekvencom, kao aminokiselinska sekvenca SPINK2 mutanta sadržanog u klonu, tj., HTRA1-inhibirajući peptid.
[0081] SPINK2 mutant predmetnog pronalaska može se dobiti, na primer, mutagenizovanjem prirodnog SPINK2. Izraz "mutageneza" koristi se da označi da jedna ili dve ili više amino-kiselina na svojim respektivnim pozicijama određene aminokiselinske sekvence, može biti supstituisano drugim amino-kiselinama ili deletirano, ili se amino-kiselina odsutna iz aminokiselinske sekvence može dodati ili insertovati na/u nju. Takva delecija ili takva adicija ili insercija mogu promeniti dužinu sekvence. U SPINK2 mutantu predmetnog pronalaska, mutageneza se poželjno može desiti na jednoj ili dve ili više pozicija X1 do X11 u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 30 (Slika 42).
[0082] Međutim, forma koja posle takve poželjne mutageneze zadržava prirodne amino-kiseline na jednoj ili dve ili više pozicija X1 do X11, tj. istu amino-kiselinu kao što je ona koja je prisutna na specifičnoj poziciji u prirodnoj aminokiselinskoj sekvenci, takođe je obuhvaćena obimom mutanta sve dok je najmanje jedna amino-kiselina mutirana u celini. Isto tako, u jednom aspektu predmetnog pronalaska, forma koja, posle mutageneze na jednoj ili više pozicija segmenata različitih od X1 do X11, zadržava prirodne amino-kiseline na tim pozicijama, tj., istu aminokiselinu kao što je ona koja je prisutna na specifičnoj poziciji u prirodnoj aminokiselinskoj sekvenci, takođe je obuhvaćena obimom mutanta sve dok je najmanje jedna amino-kiselina mutirana u celini.
[0083] Izraz "nasumična mutageneza" koristi se da označi da se na specifičnu poziciju u sekvenci, jedna ili dve ili više različitih amino-kiselina uvodi na tu poziciju mutagenezom, sa datom verovatnoćom. Verovatnoće uvođenja najmanje dve različite amino-kiseline ne moraju uvek biti iste. Predmetni pronalazak ne isključuje pomenute najmanje dve amino-kiseline iz uključivanja prirodne amino-kiseline (kao jedne od amino-kiselina). Takav slučaj je takođe uključen u obim izraza "nasumična mutageneza".
[0084] Standardni postupak poznat stručnjaku u ovoj oblasti može se upotrebiti kao postupak za nasumičnu mutagenezu na specifičnoj poziciji. Mutageneza se može postići, na primer, PCR (lančana reakcija polimeraze) uz korišćenje smeše sintetskih oligonukleotida koji uključuju degenerisanu kompoziciju nukleotida na specifičnoj poziciji u sekvenci. Na primer, upotreba kodona NNK ili NNS (N = adenin, guanin, citozin ili timin; K = guanin ili timin; i S = guanin ili citozin) izaziva mutagenezu za uvođenje bilo koje od svih 20 prirodnih amino-kiselina kao i stop kodona, dok upotreba kodona VVS (V = adenin, guanin ili citozin) eliminiše mogućnost uvođenja Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr i Val i dovodi do mutageneze za uvođenje bilo koje od preostalih 12 prirodnih amino-kiselina. Na primer, upotreba kodona NMS (M = adenin ili citozin) eliminiše mogućnost uvođenja Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp i Val i dovodi do mutageneze za uvođenje bilo koje od preostalih 11 prirodnih amino-kiselina. Specifični kodon, veštački kodon, ili slično može se koristiti za mutagenezu za uvođenje neprirodne amino-kiseline.
[0085] Usmerena mutageneza takođe se može izvesti korišćenjem strukturnih informacija o cilju, koje sadrže konformaciju, i/ili peptidu protiv cilja ili divljem tipu peptida iz kojeg je peptid izveden. U predmetnom pronalasku, usmerena mutacija se može uvesti korišćenjem strukturnih informacija koje uključuju informacije višeg reda o ciljnom HTRA1 i/ili SPINK2 mutantu protiv cilja ili divljem tipu SPINK2, ili kompleksu formiranom između njih. U jednom primeru, identifikovan je SPINK2 mutant koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost. Posledično, dobijen je kristalni kompleks HTRA1 i SPINK2 mutanta i izložen je kristalografiji X-zracima. Na osnovu rezultata analize, identifikovani su mesto na HTRA1 molekulu za koje se SPINK2 mutant vezuje, i aminokiselinska rezidua u SPINK2 mutantu uključena u interakciju sa mestom. Moguće je uspostaviti korelaciju strukturnih informacija dobijenih takvim procedurama sa HTRA1-inhibitornom aktivnošću. Na osnovu takve korelacije strukture i aktivnosti, moguće je dizajnirati supstituciju amino-kiseline na specifičnoj poziciji specifičnom amino-kiselinom, inserciju ili deleciju amino-kiseline na specifičnoj poziciji, ili slično, da bi se zaista potvrdila aktivnost HTRA1.
[0086] Mutageneza se može postići i korišćenjem, na primer, nukleotidne sastavne jedinice sa modifikovanom specifičnošću baznog para, na primer inozin.
[0087] Pored toga, mutageneza na nasumičnoj poziciji postiže se, na primer, pomoću PCR koja je sklona greškama, uz korišćenje DNK polimeraze kao što je Taq DNK polimeraza, kojoj nedostaje funkcija ispravljanja grešaka i koja proizvodi visoku stopu grešaka, ili hemijskom mutagenezom.
[0088] HTRA1-inhibitorni peptid može biti obogaćen i/ili odabran iz biblioteke kao što je biblioteka faga ili biblioteka kolonija, pogodna za odgovarajući postupak skrininga i poznata stručnjaku u ovoj oblasti, korišćenjem prikazivanja na bakterijama, prikazivanja na kvascu, prikazivanja na ćelijama sisara, prikazivanja na fagima, prikazivanja na ribozomima, prikazivanja na nukleinskim kiselinama, skriningom kolonija ili slično. Ove biblioteke mogu se konstruisati upotrebom vektora i postupka, na primer fagemida za biblioteku faga ili kozmida za skrining kolonija, koji su pogodni za svaku biblioteku i poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Takav vektor može biti virus ili virusni vektor koji inficira prokariotske ćelije ili eukariotske ćelije. Ovi rekombinantni vektori mogu se pripremiti postupkom poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, na primer manipulacijom genima.
[0089] Prikazivanje na bakterijama je tehnika fuzionisanja željenog proteina sa, na primer, delom lipoproteina (Lpp) spoljašnje membrane E. coli i proteina spoljašnje membrane OmpA, i prikazivanja željenog proteina na površini E. coli. DNK grupa dobijena nasumičnom mutagenezom nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu određenog proteina insertuje se u vektore pogodne za prikazivanje na bakterijama, i bakterijske ćelije se mogu transformisati vektorima da bi se dobila biblioteka koja prikazuje nasumično mutagenizovanu proteinsku grupu na površini transformisane bakterijske ćelije (Francisco, J.A., i sarad, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. SAD tom 90, str.10444-10448) .
[0090] Prikazivanje na kvascu je tehnika fuzionisanja željenog proteina sa proteinom omotača kao što je α-aglutinin koji je na površini ćelije kvasca, i prikazivanja željenog proteina na površini kvasca. α-aglutinin sadrži C-terminalni hidrofobni region sa navodnim glikozilfosfatidilinozitolnim (GPI) ukotvljujućim signalom za prikačinjanje, signalnu sekvencu, aktivni domen, domen ćelijskog zida, i slično. Željeni protein može da se prikaže na površini ćelije kvasca manipulisanjem. DNK grupa dobijena nasumičnom mutagenezom nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu određenog proteina insertuje se u vektore pogodne za prikazivanje na kvascu, i ćelije kvasca mogu da se transformišu vektorima da bi se dobila biblioteka koja prikazuje nasumično mutagenizovanu proteinsku grupu na površini transformisane ćelije kvasca (Ueda, M.& Tanaka, A., Biotechnol. Adv., tom 18, str. 121-, 2000; Ueda, M.& Tanaka, A., J. Biosci. Bioeng., tom 90, str.125-, 2000; itd.).
[0091] Prikazivanje na životinjskoj ćeliji je tehnika fuzionisanja željenog proteina sa, na primer, transmembranskim regionom membranskog proteina tipski predstavljenog receptorom za faktor rasta krvnih pločica (platelet-derived growth factor receptor, PDGFR), i prikazivanja željenog proteina na površini ćelija sisara (npr., HEK293 i ćelijama ovarijuma kineskog hrčka, Chinese hamster ovary (CHO) cells). DNK grupa dobijena nasumičnom mutagenezom nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu određenog proteina insertuje se u vektore pogodne za prikazivanje na čelijama životinja, i ćelije životinja mogu da se transfektuju vektorima da se dobije biblioteka za prikazivanje nasumično mutagenizovane proteinske grupe na površini transfektovanih životinjskih ćelija (Ho M, i sarad, (2009), Methods Mol Biol. tom 525: str. 337-52).
[0092] Željena biblioteka prikazana na ćelijama kao što su ćelije kvasca, ćelije bakterija, ili ćelije životinja, može se inkubirati u prisustvu ciljnog molekula ili dovesti u kontakt sa ciljnim molekulom. Na primer, ćelije koje sadrže biblioteku inkubiraju se dato vreme sa HTRA1 koji je modifikovan biotinom ili slično. Zatim se tome doda podloga kao što su magnetne perlice, i ćelije se odvoje od podloge. Posle toga, podloga može da se ispere kako bi se izvršilo uklanjanje nespecifične adsorbovane materije i vezane materije, u cilju oporavljanja grupe ćelija koje prikazuju peptid, kolekciju peptida ili obogaćenu kolekciju peptida vezanu za podlogu (za koje je vezan HTRA1). Slično tome, grupa ćelija koje prikazuju peptid, kolekciju peptida ili obogaćenu kolekciju peptida, vezana za podlogu (koja ima vezan HTRA1), ili grupa ćelija koje prikazuju peptid, kolekciju peptida ili obogaćenu kolekciju peptida vezanu za HTRA1, mogu se oporaviti magnetski aktiviranim sortiranjem ćelija (magnetic-activated cell sorting, MACS) posle dodavanja magnetnih perlica, odnosno pomoću FACS posle bojenja ćelija upotrebom anti-HTRA1 antitela. Nespecifičo adsorpciono mesto i/ili vezujuće mesto mogu se blokirati (zasititi), na primer. Korak blokiranja može ovde biti uključen sve dok se blokiranje obavlja odgovarajućim postupkom. Tako dobijeni vektor eksprimiranog peptida, kolekcije peptida ili obogaćene peptidne kolekcije se obnavlja, a nukleotidna sekvenca polinukleotida insertovanog u vektor može se odrediti kako bi se odredila aminokiselinska sekvenca kodirana nukleotidnom sekvencom. Štaviše, vektor može ponovo da se transferiše u ćeliju-domaćina, i ciklus gore pomenute operacije može da se ponovi jednom do nekoliko puta da bi se visoko obogatila kolekcija peptida koji se vezuju za ciljni molekul.
[0093] U slučaju prikazivanja na fagima, na primer, fagemid je bakterijski plazmid koji sadrži mesto početka replikacije plazmida kao i drugo mesto početka replikacije izvedeno iz jednolančanog bakteriofaga. Ćelija koja sadrži fagemid može replicirati fagemid jednolančanim načinom replikacije koinfekcijom sa M13 ili njemu sličnim pomažućim bakteriofagom. Tačnije, jednolančana fagemidna DNK upakovana je u infektivnu česticu obavijenu proteinom omotača bakteriofaga. Na taj način fagemidna DNK može se formirati kao klonski dvolančani DNK plazmid u inficiranoj bakteriji, dok se fagemid može formirati kao čestica slična bakteriofagu, iz supernatanta kulture koinficiranih ćelija. Čestica slična bakteriofagu injektira se u bakteriju sa F-pilusom, da bi se bakterija inficirala sa DNK tako da se sama čestica može ponovno formirati kao plazmid.
[0094] Fuzioni gen koji sadrži polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira aminokiselinsku sekvencu ispitivanog peptida i gen proteina omotača bakteriofaga, umetne se u fagemid, i bakterija se inficira rezultirajućim fagemidom. Ćelije se kultivišu tako da peptid može da se eksprimira ili prikaže na bakteriji ili na čestici sličnoj fagu, ili može da se proizvede kao fuzioni protein sa proteinom omotača u čestici faga ili u supernatantu bakterijske kulture.
[0095] Na primer, fuzioni gen koji sadrži polinukleotid i gen proteina omotača bakteriofaga gpIII insertuje se u fagemid, i E. coli se koinficira rezultujućim fagemidom i M13 ili njemu sličnim pomažućim fagom, tako da se fuzioni protein koji sadrži peptid i protein omotača može proizvesti i osloboditi u supernatant kulture E. coli.
[0096] U slučaju korišćenja različitih cirkularnih ili necirkularnih vektora, na primer, virusnog vektora, umesto fagemida, peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleotidnom sekvencom polinukleotida insertovanog u vektor može se eksprimirati ili prikazati na ćelijama ili česticama sličnim virusu, koje sadrže vektor, ili se može proizvesti i otpustiti u supernatant kulture ćelija, u skladu sa postupkom koji je poznat stručnjaku u ovoj oblasti.
[0097] Tako dobijena peptid-eksprimirajuća biblioteka može se inkubirati u prisustvu ciljnog molekula, ili dovesti u kontakt sa ciljnim molekulom. Na primer, podloga sa imobilisanim HTRA1 inkubira se dato vreme sa mobilnom fazom koja sadrži biblioteku. Posle toga, mobilna faza se odvoji od podloge. Zatim se podloga ispere da bi se izvršilo uklanjanje nespecifično adsorbovana materija i vezana materija. Peptid, kolekcija peptida ili obogaćena kolekcija peptida vezana za podlogu (koja za sebe ima vezan HTRA1) može se oporaviti eluiranjem. Eluiranje može da se izvede neselektivno, na primer, u prisustvu relativno visoke jonske snage, niskog pH, umerenih uslova denaturacije, ili haotropske soli, ili može da se izvede selektivno, dodavanjem rastvorljivog ciljnog molekula kao što je HTRA1, antitela koje se vezuje za ciljni molekul, prirodnog liganda, supstrata, ili slično i kompetiranjem sa imobilisanim ciljnim molekulom. Nespecifično adsorpciono mesto i/ili vezujuće mesto može se blokirati, na primer. Korak blokiranja može ovde biti uključen sve dok se blokiranje obavlja odgovarajućim postupkom.
[0098] Vektor tako dobijenog eksprimiranog peptida, kolekcije peptida ili obogaćene kolekcije peptida se obnavlja, a nukleotidna sekvenca polinukleotida insertovanog u vektor može se odrediti kako bi se odredila aminokiselinska sekvenca kodirana nukleotidnom sekvencom. Štaviše, vektor može ponovo da se transferiše u ćeliju-domaćina, i ciklus gore pomenute operacije može da se ponovi jednom do nekoliko puta da bi se visoko obogatila kolekcija peptida koja se vezuje za ciljni molekul.
[0099] Prikazivanje na ribozomima je tehnika korišćenja, na primer, iRNK koja kodira željeni protein i nema stop-kodon, i besćelijskog sistema za sintezu proteina, i time in vitro sintetisanja molekula željenog proteina, njegove odgovarajuće iRNK, i ribozoma, koji su povezani jedni sa drugima. Biblioteka koja prikazuje nasumično mutagenizovanu proteinsku grupu na ribozomima može se dobiti upotrebom grupe iRNK dobijene nasumičnom mutagenezom nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu određenog proteina, i besćelijskog sistema za sintezu proteina (Mattheakis LC, i sarad, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD tom 91, br.
19, str.9022-9029).
[0100] Prikazivanje na nukleinskim kiselinama, nazvano i prikazivanje na iRNK, je tehnika korišćenja, na primer, linkera kao što je puromicin strukturno sličan 3' kraju tirozil tRNK, i time sintetisanja molekula željenog proteina, njegove kodirajuće iRNK i ribozoma, koji su povezani jedni sa drugima. U ovoj tehnici koristi se besćelijski sistem za sintezu proteina, a ne žive ćelije, i prema tome, omogućena je sinteza in vitro. Biblioteka koja prikazuje nasumično mutagenizovanu proteinsku grupu na ribozomu može se dobiti upotrebom grupe iRNK dobijene nasumičnom mutagenezom nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu određenog proteina, linkera kao što je puromicin, i besćelijskog sistema za sintezu proteina (Nemoto N, i sarad, (1997), FEES Lett., tom 414, br.2, str.405-408).
[0101] Biblioteka za prikazivanje gena dobijena besćelijskim sistemom za sintezu, kao što je prikazivanje na ribozomima ili prikazivanje na nukleinskim kiselinama, može se inkubirati u prisustvu ciljnog molekula, ili dovesti u kontakt sa ciljnim molekulom. Na primer, podloga sa imobilisanim HTRA1 inkubira se dato vreme sa mobilnom fazom koja sadrži biblioteku. Tada se mobilna faza odvoji od podloge. Posle toga, podloga se ispere da bi se izvršilo uklanjanje nespecifično adsorbovane materije i vezane materije. Peptid, kolekcija peptida ili obogaćena kolekcija peptida vezana za podlogu (za koju je vezan HTRA1) može se oporaviti eluiranjem. Eluiranje može da se izvede neselektivno, na primer, u prisustvu relativno visoke jonske snage, niskog pH, umerenih uslova denaturacije, ili haotropske soli, ili može da se izvede selektivno dodavanjem rastvorljivog ciljnog molekula kao što je HTRA1, antitela koje se vezuje za ciljni molekul, prirodnog liganda, supstrata, ili slično i kompetiranjem sa imobilisanim ciljnim molekulom. Nespecifično adsorpciono mesto i/ili vezujuće mesto može se blokirati, na primer. Korak blokiranja može ovde biti uključen sve dok se blokiranje obavlja odgovarajućim postupkom.
[0102] Nukleinska kiselina tako dobijenog eksprimiranog peptida, kolekcije peptida ili obogaćene kolekcije peptida se oporavlja. U slučaju iRNK, nukleotidna sekvenca može da se odredi posle reakcije reverzne transkripcije u cDNK, da bi se odredila amino-kiselinska sekvenca kodirana nukleotidnom sekvencom. Štaviše, oporavljena nukleinska kiselina se transkribuje u iRNK, i ciklus gore pomenute operacije može da se ponovi jednom do nekoliko puta da bi se visoko obogatila kolekcija peptida koja se vezuje za ciljni molekul.
[0103] Uz uslov da se peptid, kolekcija peptida ili obogaćena kolekcija peptida unapred konjuguje sa afinitetnom oznakom, moguće je efikasno prečišćavanje peptida ili kolekcije. Na primer, kolekcija peptida se unapred konjuguje sa supstratom proteaze kao oznakom, tako da peptid može da se eluira odsecanjem aktivnošću proteaze.
[0104] Na osnovu dobijenih informacija o sekvenci i funkciji peptida, itd., dobijeni klon ili biblioteka mogu se dodatno mutagenizovati, i iz mutirane biblioteke može se dobiti peptid sa poboljšanom funkcijom (npr., HTRA1-inhibitorna aktivnost), fizičkim osobinama (termička stabilnost, stabilnost pri skladištenju, itd.), in vivo kinetikom (distribucija i poluživot u krvi), itd.
[0105] HTRA1-inhibirajući peptid može se identifikovati određivanjem da li dobijeni peptid ima HTRA1-inhibitornu aktivnost ili ne.
[0106] HTRA1-inhibirajući peptid je poželjno sposoban da zadrži trodimenzionalnu strukturu koju sačinjavaju, na primer, struktura petlje od 16Ser do 30Val, β ploča koju sačinjava β lanac (1) koji se sastoji od 31Cys i 32Gly i β lanac (2) koji se sastoji od 57Ile do 59Arg, i α heliks koji se sastoji od 41Glu do 51Gly, ili struktura petlje, β ploča, ili α heliks slični tome ili koji im bar delimično odgovaraju (ili tim pozicijama), sadržanu u aminokiselinskoj sekvenci divljeg tipa SPINK2, u meri da HTRA1-inhibitorna aktivnost može da se ispolji. Poželjniji HTRA1-inhibirajući peptid može da se identifikije korišćenjem takve trodimenzionalne strukture (cela struktura ili delimična struktura) kao dela indikatora.
4. Molekul nukleinske kiseline koji kodira HTRA1-inhibirajući peptid, vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline, ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor, i postupak za proizvodnju rekombinantnog HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0107] Predmetni pronalazak obezbeđuje i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u HTRA1-inhibirajućem peptidu (kasnije u ovom tekstu označen kao "molekul nukleinske kiseline koja kodira HTRA1-inhibirajući peptid"), rekombinantni vektor koji ima inserciju gena, ćeliju koja nosi gen ili vektor (kasnije u ovom tekstu označena kao "ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira HTRA1-inhibirajući peptid"), ili ćeliju koja proizvodi HTRA1-inhibirajući peptid (kasnije u ovom tekstu označena kao "ćelija koja proizvodi HTRA1-inhibirajući peptid").
[0108] Neki poželjni primeri molekula nukleinske kiseline koja kodira HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska mogu uključiti molekul nukleinske kiseline koji sadrži bilo koju od sledećih nukleotidnih sekvenci (a) do (e) (kasnije u ovom tekstu označena kao "nukleotidna sekvenca HTRA1-inhibirajućeg peptida"), molekul nukleinske kiseline koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja sadrži gensku sekvencu antitela, i molekul nukleinske kiseline koji se sastoji od genske sekvence antitela:
(a) nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, i 23 do 29 (Slike 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33, i 35 do 41);
(b) nukleotidna sekvenca prikazana u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 i 22 (Slike 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 i 34);
(c) nukleotidna sekvenca koja se hibridizuje pod stringentnim uslovima sa nukleotidnom sekvencom koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom (a) ili (b) i kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u peptidu koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost;
(d) nukleotidna sekvenca koja je izvedena iz nukleotidne sekvence (a) ili (b) supstitucijom, delecijom, adicijom i/ili insercijom 1 do 15, 1 do 10, 1 do 8, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, 1 ili 2, ili 1 nukleotida ili nukleotidne rezidue i kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u peptidu koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost; i
(e) nukleotidna sekvenca koja ima 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili veću identičnost sa nukleotidnom sekvencom (a) ili (b) i kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u peptidu koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost.
[0109] Međutim, molekul nukleinske kiseline koji kodira HTRA1-inhibirajući peptid nije ograničen na nukleotidne sekvence (a) do (e). Svaki molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u SPINK2 mutantu sa HTRA1-inhibitornom aktivnošću, i poželjno aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 30 (Slika 42), uključen je u obim molekula nukleinske kiseline koji kodira HTRA1-inhibirajući peptid.
[0110] Jedan ili dva ili više kodona koji odgovaraju svakoj od amino-kiselina mogu se upotrebiti za dizajniranje nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu. Prema tome, nukleotidna sekvenca koja kodira jednu aminokiselinsku sekvencu određenog peptida može imati veliki broj varijacija. U vezi sa izborom takvih kodona, kodoni se mogu pogodno odabrati u skladu sa upotrebom kodona u ćeliji-domaćinu za ekspresiju, da bi nosila polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu ili vektor koji sadrži polinukleotid, ili se frekvencija ili stopa velikog broja upotrebljenih kodona može na odgovarajući način podesiti. Na primer, u slučaju korišćenja ćelija Escherichia coli kao ćelija-domaćina, nukleotidna sekvenca može da se dizajnira uz korišćenje kodona koji se sa visokom učestalošću koriste u Escherichia coli.
[0111] Molekul nukleinske kiseline koja kodira HTRA1-inhibirajući peptid može biti funkcionalno povezan sa jednom ili dve ili više regulatornih sekvenci. Fraza "funkcionalno povezan" koristi se da označi da povezani molekul nukleinske kiseline može da se eksprimira, ili, da je nukleotidna sekvenca sadržana u molekulu ekspresibilna. Regulatorna sekvenca sadrži sekvencioni element koji uključuje informaciju o regulaciji transkripcije i/ili regulaciji translacije. Iako regulatorna sekvenca varira u zavisnosti od vrste, regulatorna sekvenca obično sadrži promotor i sadrži 5' nekodirajuću sekvencu uključenu u inicijaciju transkripcije i translacije, na primer, prokariotski -35/-10 boks i Shine-Dalgarno sekvencu ili eukariotski TATA boks, CAAT sekvencu, i 5' "capping" sekvencu. Ova sekvenca može sadržati pojačivački element i/ili represorski element, i translatabilnu signalnu sekvencu, lidersku sekvencu, ili slično za dostavljanje prirodnog ili zrelog peptida specifičnom odeljku unutar ili izvan ćelije-domaćina. Regulatorna sekvenca može uključiti još i 3' nekodirajuću sekvencu, i ova sekvenca može sadržati element uključen u terminaciju transkripcije ili poliadenilaciju, itd. Međutim, sekvenca povezana sa terminacijom transkripcije, kada funkcioniše nedovoljno u specifičnoj ćeliji-domaćinu, može se zameniti sekvencom koja je pogodna za ćelije.
[0112] Primeri promotorske sekvence mogu uključiti prokariotski tet promotor, lacUV5 promotor, i T7 promotor, i SV40 promotor i CMV promotor za eukariotske ćelije.
[0113] Molekul nukleinske kiseline koja kodira HTRA1-inhibirajući peptid može biti u izolovanoj formi ili u formi sadržanoj u vektoru ili drugom klonirajućem prenosniku (kasnije u ovom tekstu jednostavno označeno kao "vektor"; plazmid, fagemid, fag, bakulovirus, kozmid, itd.) ili u hromozomu, mada forma nije na to ograničena. Vektor može sadržati, pored nukleotidne sekvence HTRA1-inhibirajućeg peptida i regulatorne sekvence, replicirajuću sekvencu i kontrolnu sekvencu pogodne za ćelije-domaćine, za upotrebu u ekspresiji, i selektivni marker koji doprinosi fenotipu koji omogućava selekciju ćelija koje transformacijom nose molekul nukleinske kiseline ili slično.
[0114] Molekul nukleinske kiseline koja kodira HTRA1-inhibirajući peptid ili vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu HTRA1-inhibirajućeg peptida može se transferisati u ćelije-domaćine koje su sposobne za ekspresiju peptida ili nukleotidne sekvence, postupkom poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, kao što je transformacija. Ćelije-domaćini koje nose molekul nukleinske kiseline ili vektor mogu se kultivisati pod uslovima pogodnim za ekspresiju peptida ili nukleoitdne sekvence. Ćelijedomaćini mogu biti bilo koje prokariotske ili eukariotske ćelije. Primeri prokariota mogu uključiti E. coli i Bacillus subtilis. Primeri eukariotakih ćelija mogu uključiti ćelije kvasaca kao što su Saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris, ćelije insekata kao što su SF9 i High 5, i ćelije životinja kao što su HeLa ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, i NS0. Peptid predmetnog pronalaska eksprimiran korišćenjem ćelija-domaćina kao što su eukariotske ćelije može podleći željenoj posttranslacionoj modifikaciji. Primeri posttranslacione modifikacije mogu uključiti dodavanje funkcionalne grupe kao što je šećerni lanac, dodavanje peptida ili proteina, i konverziju hemijskih osobina amino-kiseline. Alternativno, peptid predmetnog pronalaska se može veštački modifikovati po želji. Takva modifikovana forma peptida takođe je obuhvaćena obimom "peptida" predmetnog pronalaska.
[0115] Predmetni pronalazak uključuje i postupak za proizvodnju HTRA1-inhibirajućeg peptida. Postupak obuhvata: korak 1 kultivisanja ćelije-domaćina koja nosi molekul nukleinske kiseline koja kodira HTRA1-inhibirajući peptid ili vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu HTRA1-inhibirajućeg peptida, ili ćeliju koja eksprimira HTRA1-inhibirajući peptid; i/ili korak 2 dobijanja HTRA1-inhibirajućeg peptida iz kulture dobijene u koraku 1. Operacija kao što je frakcionisanje, hromatografija, ili prečišćavanje, poznata stručnjaku u ovoj oblasti može se primeniti u koraku 2. Na primer, za to se može primeniti afinitetno prečišćavanje korišćenjem kasnije pomenutog antitela predmetnog pronalaska.
[0116] U nekim aspektima predmetnog pronalaska, HTRA1-inhibirajući peptid ima unutarmolekulsku disulfidnu vezu. Može biti poželjno da se peptid koji ima unutarmolekulsku disulfidnu vezu, korišćenjem signalne sekvence ili slično, dostavi ćelijskom odeljku koji ima oksidišuću redoks sredinu. Oksidišuću sredinu može obezbediti periplazma gram-negativne bakterije kao što je E. coli, vanćelijsko okruženje gram-pozitivne bakterije, lumen endoplazmatskog retikuluma eukariotske ćelije, ili slično. Takva sredina može da promoviše formiranje strukturne disulfidne veze. Alternativno, peptid koji ima unutarmolekulsku disulfidnu vezu može se pripremiti u citoplazmi ćelije-domaćina kao što je ćelija E. coli. U tom slučaju, peptid može da se dobije direktno u rastvorljivom nabranom stanju ili da se preuzme u formi inkluzionog tela i zatim rekonstruiše in vitro. Pored toga, odabere se ćelija-domaćin koja ima oksidišuću unutarćelijsku sredinu, i peptid koji ima unutarmolekulsku disulfidnu vezu može da se pripremi i u njenoj citoplazmi. Sa druge strane, kada HTRA1-inhibirajući peptid nema unutarmolekulske disulfidne veze, peptid može da se pripremi u ćelijskom odeljku koji ima redukujuće redoks okruženje, na primer, citoplazma gram-negativne bakterije.
[0117] HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska može da se proizvede i drugim postupcima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, kao što je hemijska sinteza, na primer, postupkom sinteze peptida na čvrstoj fazi, prema Merrifield, i sarad, i postupkom za sintezu peptida organske sintetske hemije uz korišćenje t-butoksikarbonila (Boc) ili 9-fluorenilmetoksikarbonila (Fmoc), i translacijom in vitro.
[0118] U nekim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za SPINK2 mutantni peptid koji ima HTRA1-inhibitornu aktivnost, i njegov funkcionalni fragment. Antitelo može biti bilo koje poliklonsko antitelo i monoklonsko antitelo. Monoklonsko antitelo nije posebno ograničeno sve dok je monoklonsko antitelo imunoglobulin ili je izvedeno iz njega. Funkcionalni fragment antitela nije ograničen sve dok funkcionalni fragment ima antigenvezujuću aktivnost, tj., vezujuću aktivnost prema SPINK2 mutantnom peptidu. Primeri ovoga uključuju oba ili jedan od teških i lakih lanaca ili njihov fragment, fragment antitela kojem nedostaje konstantni region ili Fc region, i konjugat sa dodatnim proteinom ili supstancom za obeležavanje. Takvo antitelo i njegov funkcionalni fragment mogu se pripremiti postupkom poznatim stručnjaku u ovoj oblasti i korisni su, na primer, za prečišćavanje SPINK2 mutantnog peptida afinitetnom hromatografijom, za klinička ispitivanja u vezi sa farmaceutskom kompozicijom koja sadrži peptid ili njegovom upotrebom, za detekciju peptida u dijagnozi ili slično, i za imunotest. Antitelo predmetnog pronalaska može se prečistiti afinitetnom hromatografijom uz korišćenje peptida predmetnog pronalaska za koji se antitelo vezuje.
5. Farmaceutska kompozicija
[0119] Predmetni pronalazak obezbeđuje i farmaceutsku kompoziciju koja sadrži HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat.
[0120] Farmaceutska kompozicija koja sadrži HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ili njegov konjugat korisna je u lečenju i/ili prevenciji različitih bolesti koje HTRA1 indukuje ili pogoršava i omogućava supresiju indukcije ili pogoršavanja, izlečenje, održavanje ili poboljšanje simptoma, izbegavanje sekundarne bolesti, itd. inhibicijom ili supresijom ekspresije ili funkcije HTRA1 (kasnije u ovom tekstu ove bolesti se označavaju kao "bolesti koje su u vezi sa HTRA1"). Bolesti koje su u vezi sa HTRA1 uključuju i različite bolesti u kojima su supresija indukcije ili pogoršanja, izlečenje, održavanje ili poboljšanje simptoma, izbegavanje sekundarne bolesti, itd. mogući preko efekta zaštite retine. HTRA1-inhibirajući peptid ima efekat zaštite retine i koristan je u lečenju i/ili prevenciji ovih bolesti povezanih sa HTRA1.
[0121] Primeri bolesti povezanih sa HTRA1 mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, retinopatiju kod nedonoščadi, polipoidnu horoidnu vaskulopatiju, reumatoidni artritis i osteoartritis. Primeri makularne degeneracije povezane sa starenjem mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na vlažnu makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, suvu makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem i geografsku atrofiju. Isto tako, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se koristiti kao sredstvo za zaštitu fotoreceptorskih ćelija, sredstvo za zaštitu retine i slično (zajednički označeno kao "sredstvo za zaštitu retine").
[0122] Makularna degeneracija povezana sa starenjem deli se na vlažni i suvi tip. Vlažni tip se dodatno klasifikuje u tipičnu makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem (tipična AMD), polipoidnu horoidnu vaskulopatiju (PCV) i retinalnu angiomatoznu proliferaciju (RAP). Za vlažni tip postoje postupci lečenja kao što su anti-VEGF lekovi i fotodinamička terapija (PDT), koji međutim nisu uvek dovoljni. Za suvi tip praktikuju se samo modifikacije ishrane ili uzimanje suplemenata na na osnovu Studije očnih bolesti koje su u vezi sa starenjem (AREDS).
[0123] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se koristiti u lečenju ili prevenciji makularne degeneracije povezane sa starenjem, na primer, kao što se vidi iz rezultata koji pokazuju da: je broj nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju smanjen u kontrolnoj grupi u modelu oštećenja retine pacova indukovanog izlaganjem svetlosti, dok je primena HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska pre ili posle izlaganja svetlosti suprimirala smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju u grupi kod koje je primena vršena, u modelu pacova (Primeri 5, 10 i 14); i površina ćelija pigmentnog epitela retine (RPE ćelije) ili broj RPE ćelija koje imaju ćelijsku površinu jednaku ili veću od date vrednosti povećan je u kontrolnoj grupi u modelima oštećenja retine kunića (pomenuće se kasnije) pripremljenim ishranom sa visokim sadržajem masti i hidrohinonom, dok je primena HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska suprimirala ovo povećanje u grupi kod koje je primena vršena, u modelu kunića (Primer 11). Model oštećenja retine kunića uzima u obzir faktore rizika za suvu makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem kod ljudi i stoga je odličan kao model posebno suve makularne degeneracije povezane sa starenjem.
[0124] U testu indukcije VEGF iRNK u kojem se koriste ćelije pigmentnog epitela retine (RPE ćelije), potvrđeno je da primena HTRA1-inhibirajućeg peptida suprimira ekspresiju VEGF iRNK (Primer 12). Indukcija VEGF u ćelijama pigmentnog epitela retine uključena je u patogenezu vlažne makularne degeneracije povezane sa starenjem (Klettner A. i sarad, (2009), Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol., tom 247: str. 1487-1492). Pored toga, smatra se da je takva morbidna indukcija VEGF uključena i u održavanje patološkog stanja, što ukazuje na to da je HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska koristan za lečenje i prevenciju suve makularne degeneracije povezane sa starenjem i vlažne makularne degeneracije povezane sa starenjem.
[0125] U testu migracije endotelskih ćelija humane umbilikalne vene (HUVEC), potvrđeno je da primena HTRA1-inhibirajućeg peptida suprimira migraciju (Primer 13), što ukazuje na to da je HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska koristan u lečenju i prevenciji vlažne makularne degeneracije povezane sa starenjem koja se karakteriše angiogenezom.
[0126] Vlažna makularna degeneracija povezana sa starenjem je progresivna. Iako primena anti-VEGF leka može privremeno da suprimira bolesno stanje, problem je u visokoj učestalosti ponavljanja recidiva (Yand S, i sarad, Drug Des Devel Ther., tom 2, br.10: str. 1857-67, 2016). Problemi kod pacijenata sa vlažnom makularnom degeneracijom povezanom sa starenjem, koji koriste lekove otkrivene poslednjih godina su razvoj atrofije i pad oštrine vida (Berg K, i sarad, Acta Ophthalmologica, tom 95, br.8: str.796-802, 2017). Primena HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska, samog ili u kombinovanoj upotrebi sa anti-VEGF lekom, može ispoljiti terapijski efekat na vlažnu makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem (uključujući polipoidnu horoidnu vaskulopatiju i retinalnu angiomatoznu proliferaciju). Pored toga, profilaktička primena peptida može prevenirati ili odložiti recidiv bolesnog stanja i odložiti početak ili ponovni početak lečenja anti-VEGF lekom, na primer. Pored toga, peptid deluje supresivno na razvoj atrofije kod pacijenata sa vlažnom makularnom degeneracijom povezanom sa starenjem i stoga može da donese dugotrajne koristi u pogledu oštrine vida.
[0127] HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska je odličan u pogledu prodiranja u tkivo (Primer 11), a takođe je odličan u pogledu svojih fizičkih osobina, stabilnosti, bezbednosti, kinetike posle primene, produktivnosti, itd. i tako se poželjno može nalaziti u farmaceutskoj kompoziciji kao aktivni sastojak.
[0128] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može sadržati terapijski ili profilaktički efektivnu količinu HTRA1-inhibitornog peptida ili njegovog konjugata i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, sredstvo za solubilizaciju, emulgator, konzervans i/ili adjuvans.
[0129] Izraz "terapijski ili profilaktički efektivna količina" koristi se da označi količinu koja ispoljava terapijski ili profilaktički efekat na specifičnu bolest, preko dozne forme i puta primene, i sinonim je sa "farmakološki efektivna količina".
[0130] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može sadržati supstancu za menjanje, održavanje ili zadržavanje pH, osmotskog pritiska, viskoznosti, prozirnosti, boje, izotoničnosti, sterilnosti ili stabilnosti, rastvorljivosti, stope produženog oslobađanja, apsorpcije, penetracije, dozne forme, snage, svojstava, oblika itd. kompozicije ili peptida predmetnog pronalaska ili njegovog konjugata sadržanog u njoj (kasnije u ovom tekstu označena kao "farmaceutska supstanca"). Farmaceutska supstanca nije posebno ograničena sve dok je supstanca farmakološki prihvatljiva. Na primer, odsustvo toksičnosti ili niska toksičnost je osobina koju poželjno poseduje farmaceutska supstanca.
[0131] Primeri farmaceutskih supstanci mogu uključiti sledeće supstance, ali se ne ograničavaju na njih: amino-kiseline kao što su glicin, alanin, glutamin, asparagin, histidin, arginin i lizin; antimikrobna sredstva; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfat i natrijum bisulfit; puferi kao što su fosfatni, citratni ili boratni puferi, natrijum bikarbonat i rastvori Tris-HCl; potporne supstance kao što su manitol i glicin; helirajuća sredstva kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); kompleksirajuća sredstva kao što su kofein, polivinilpirolidin, P-ciklodekstrin i hidroksipropil-P-ciklodekstrin; sredstva za povećanje zapremine kao što su glukoza, manoza i dekstrin; drugi ugljovodonici kao što su monosaharidi, disaharidi, glukoza, manoza i dekstrin; sredstva za bojenje; sredstva za poboljšanje ukusa; razblaživači; emulgatori; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidin; polipeptidi niske molekulske mase; kontrajoni koji formiraju so; antiseptici kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina, i vodonik peroksid; rastvarači kao što su glicerin, propilen glikol i polietilen glikol; šećerni alkoholi kao što su manitol i sorbitol; sredstva za suspendovanje; surfaktanti kao što je PEG, estar sorbitana, polisorbati kao što su polisorbat 20 i polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin i holesterol; pojačivači stabilnosti kao što su saharoza i sorbitol; sredstva za povećanje elastičnosti kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid, manitol i sorbitol; transportujuća sredstva; razblaživači: ekscipijensi; i/ili farmaceutski adjuvansi.
[0132] Takve farmaceutske supstance dodaju se HTRA1-inhibirajućem peptidu u količini od 0.001 do 1000 puta, poželjno 0.01 do 100 puta, i poželjnije 0.1 do 10 puta višoj od težine HTRA1-inhibirajućeg peptida.
[0133] Lipozom koji sadrži HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži modifikovanu formu koja sadrži HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat konjugovan sa lipozomom takođe su uključeni u farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska.
[0134] Ekscipijens ili nosač nije posebno ograničen pod uslovom da je ekscipijens ili nosač obično tečnost ili čvrsta supstanca i predstavljen je vodom je za injekciju, normalnim fiziološkim rastvorom, veštačkom cerebrospinalnom tečnošću ili drugim supstancama za upotrebu u preparatima za oralnu primenu ili parenteralnu primenu. Primeri normalnog fiziološkog rastvora mogu uključiti neutralni normalni fiziološki rastvor ili normalni fiziološki rastvor koji sadrži serumski albumin.
[0135] Primeri pufera mogu uključiti Tris pufer pripremljen da uspostavi finalni pH farmaceutske kompozicije od 7.0 do 8.5, acetatni pufer pripremljen da uspostavi njen finalni pH od 4.0 do 5.5, citratni pufer pripremljen da uspostavi njen finalni pH od 5.0 do 8.0, i histidinski pufer pripremljen da uspostavi njen finalni pH od 5.0 do 8.0.
[0136] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska je čvrsta supstanca, tečnost, suspenzija ili slično. Drugi primer farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska može uključiti preparate osušene zamrzavanjem. Preparati osušeni zamrzavanjem mogu se oblikovati pomoću ekscipijensa kao što je saharoza.
[0137] Put primene farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska može biti bilo koji od ukapavanja u oko, enteralne primene, lokalne primene i parenteralne primene. Njihovi primeri mogu uključivati ukapavanje na konjunktivu, intravitrealnu primenu, intravensku primenu, intraarterijsku primenu, intramuskularnu primenu, intradermalnu primenu, supkutanu primenu, intraperitonealnu primenu, transdermalnu primenu, intraosealnu primenu i intraartikularnu primenu.
[0138] Receptura farmaceutske kompozicije može se odrediti prema postupku primene, HTRA1-vezujućem afinitetu HTRA1-inhibirajućeg peptida, itd. HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska koji ima jaču inhibitornu aktivnost (manju IC50vrednost) protiv ciljnog HTRA1 ili ima viši afinitet (nižu KDvrednost) za HTRA1 protein može da ispolji svoj medicinski efekat pri nižoj dozi.
[0139] Doza HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska ili njegovog konjugata nije ograničena sve dok doza predstavlja farmakološki efikasnu količinu. Doza se može pogodno odrediti u skladu sa vrstom individue, tipom bolesti, simptomima, polom, starošću, prethodno postojećim stanjima, vezujućim afinitetom peptida prema HTRA1 proteinu ili njegovoj biološkoj aktivnosti, i drugim faktorima. Doza obično iznosi 0.01 do 1000 mg/kg, i poželjno 0.1 do 100 mg/kg, koja se može primeniti jednom svakog dana do svakih 180 dana ili dva ili tri puta ili više puta na dan.
[0140] Primeri forme farmaceutske kompozicije mogu uključiti injekcije (uključujući preparate osušene zamrzavanjem i kapajuće infuzije), supozitorije, preparate za transnazalnu apsorpciju, preparate za transdermalnu apsorpciju, sublingvalna sredstva, kapsule, tablete, masti, granule, aerosole, pilule, praškove, suspenzije, emulzije, kapi za oči, i formulacije za biološke implante.
[0141] Farmaceutska kompozicija koja kao aktivni sastojak sadrži HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat, može se primeniti istovremeno ili odvojeno od dodatnog medikamenta. Na primer, farmaceutska kompozicija koja kao aktivni sastojak sadrži HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat, može se primeniti posle primene dodatnog medikamenta, ili se dodatni medikament može primeniti posle primene farmaceutske kompozicije. Alternativno, farmaceutska kompozicija i dodatni medikament mogu se primeniti istovremeno. Za istovremenu primenu, HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat i dodatni medikament mogu se nalaziti u jednom preparatu ili se mogu nalaziti u zasebnim preparatima (više preparata).
[0142] Primeri dodatnog medikamenta koji se koristi u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronalaska mogu uključiti anti-VEGF sredstva, antiinflamatorna sredstva, sredstva koja neutrališu inflamatorne citokine, i inhibitore puta aktivacije komplementa. Anti-VEGF sredstva se klasifikuju u anti-VEGF antitela, inhibitore VEGF, antagoniste VEGF receptora i rastvorljive VEGF receptore, itd. i uključuju bevacizumab, ranibizumab, aflibercept, pegaptanib, brolucizumab, i slično. Antiinflamatorno sredstvo nije posebno ograničeno sve dok antiinflamatorno sredstvo može da se primeni lokalno u cilju suprimiranja inflamacije unutar oka ili unutar zgloba. Primeri sredstva koje neutrališe inflamatorne citokine uključuju anti-TNFα antitela, anti-interleukin-6 (kasnije u ovom tekstu označen kao "IL-6") antitela, anti-IL-6 receptorska antitela, i rastvorljive TNF receptore, i mogu specifično uključivati infliksimab, adalimumab, golimumab, certolizumab, tocilizumab, i etanercept. Primeri inhibitora puteva aktivacije komplementa mogu uključiti lampalizumab. Ovi medikamenti su pogodni za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa HTRA1, a mogu se kombinovati i sa farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronalaska u lečenju ili prevenciji bolesti različitih od bolesti koje su povezane sa HTRA1.
[0143] Može se koristiti jedan od ovih dodatnih lekova ili se mogu primeniti ili primiti dva, ili tri ili više njih. Ovi pristupi se zajedno nazivaju "kombinovana upotreba sa dodatnim medikamentom" ili "kombinacija sa dodatnim medikamentom", farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska koja sadrži dodatni medikament, pored antitela predmetnog pronalaska, njegovog vezujućeg fragmenta ili modifikovane forme antitela ili fragmenta, ili se koristi u kombinaciji sa dodatnom terapijom, takođe je uključena u predmetni pronalazak kao aspekt "kombinovane upotrebe sa dodatnim medikamentom" ili "kombinacije sa dodatnim medikamentom".
[0144] Predmetni pronalazak obezbeđuje i SPINK2 mutantni peptid ili njegov konjugat, kako je definisano u ovom tekstu, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije bolesti povezane sa HTRA1, kao što je makularna degeneracija povezana sa starenjem, upotrebu HTRA1-inhibirajućeg peptida predmetnog pronalaska ili njegovog konjugata za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje ili prevenciju bolesti, i upotrebu HTRA1-inhibitornog peptida ili njegovog konjugata za lečenje ili prevenciju bolesti. Predmetni pronalazak uključuje i komplet za lečenje ili prevenciju, koji sadrži HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ili njegov konjugat.
[0145] Predmetni pronalazak obezbeđuje još i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu HTRA1-inhibirajućeg peptida ili njegovog konjugata, vektor koji sadrži polinukleotid, i farmaceutsku kompoziciju koja sadrži polinukleotid ili vektor ili sadrži ćeliju koja eksprimira HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ili njegov konjugat. Na primer, polinukleotid i vektor mogu se primeniti u genskoj terapiji bolesti povezanih sa HTRA1, upotrebom poznatog pristupa. Ćelija se može primeniti u ćelijskoj terapiji bolesti povezanih sa HTRA1, korišćenjem poznatog pristupa. Isto tako, polinukleotid ili vektor može se transferisati u, na primer, autologne ćelije ili alogene ćelije (homologne ćelije) da bi se ćelije pripremile za ćelijsku terapiju. Takav polinukleotid i vektor takođe su uključeni u predmetni pronalazak kao kompozicije za pripremanje leka za ćelijsku terapiju. Međutim, forma farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska koja sadrži polinukleotid, vektor, ćeliju, ili slično nije ograničena na one koje su opisane gore.
6. Kompozicije za dijagnozu i postupci za detektovanje i izdvajanje HTRA1
[0146] HTRA1-inhibirajući peptid predmetnog pronalaska ili njegov konjugat može imati HTRA1-vezujuću aktivnost, pored aktivnosti inhibiranja HTRA1 proteaze i može se upotrebiti u različitim studijama, kao što je upotreba u vidu pozitivne kontrole u studijama potrage za HTRA1-inhibitorima, detekciji HTRA1, ispitivanju i dijagnostici uz korišćenje detekcije, izdvajanju HTRA1, reagenasa i u druge svrhe. Za detekciju ili izdvajanje HTRA1, najmanje jedan od peptida predmetnog pronalaska i HTRA1 mogu biti imobilisani.
[0147] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju za detekciju ili za dijagnozu (kasnije u ovom tekstu zajednički označenu kao "kompozicija za dijagnozu"), koja sadrži peptid predmetnog pronalaska koji se vezuje za HTRA1 ili njegov konjugat.
[0148] Kompozicija za dijagnozu predmetnog pronalaska korisna je u ispitivanju ili dijagnozi oboljenja povezanih sa HTRA1, ekspresije HTRA1, itd. U predmetnom pronalasku, primeri ispitivanja ili dijagnoze uključuju, ali se ne ograničavaju na određivanje ili merenje rizika za dobijanje bolesti, određivanje prisustva ili odsustva bolesti, merenje stepena progresije ili pogoršanja, merenje ili određivanje efekta lečenja farmaceutskom kompozicijom koja sadrži HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat, merenje ili određivanje efekta lečenja različitog od lečenja lekovima, merenje rizika za recidiv, i određivanje prisustva ili odsustva recidiva.
[0149] Kompozicija za dijagnozu prema predmetnom pronalasku korisna je u identifikaciji pojedinačnog primaoca peptida predmetnog pronalaska ili njegovog konjugata, kompozicije koja sadrži peptid ili njegov konjugat, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži peptid ili njegov konjugat.
[0150] Kompozicija za dijagnozu može sadržati pH-pufer, sredstvo za podešavanje osmotskog pritiska, soli, stabilizator, antiseptik, sredstvo za razvijanje, senzitizator, sredstvo za sprečavanje agregiranja, i slično.
[0151] Predmetni pronalazak obezbeđuje i in vitro postupak za ispitivanje ili dijagnostikovanje bolesti povezane sa HTRA1, upotrebu peptida predmetnog pronalaska za pripremanje kompozicije za dijagnozu bolesti, i upotrebu peptida predmetnog pronalaska koji se vezuje za HTRA1, ili njegovog konjugata za ispitivanje ili dijagnozu. Predmetni pronalazak uključuje i komplet za ispitivanje ili dijagnozu, koji sadrži peptid predmetnog pronalaska ili njegov konjugat.
[0152] Postupak ispitivanja ili dijagnoze, koji uključuje peptid predmetnog pronalaska koji se vezuje za HTRA1 poželjno je "sendvič" ELISA. Alternativno, može se koristiti uobičajeni postupak detekcije, na primer ELISA, RIA, ELISPOT, dot blot, Ouchterlony-jev postupak, CIE, CLIA, ili protočna citometrija. Ispitivanje ili dijagnoza postižu se i postupkom koji se zasniva na postupku imunoprecipitacije.
[0153] Predmetni pronalazak obezbeđuje i postupak za detektovanje ili merenje HTRA1 u ispitivanom uzorku. U takvom postupku detekcije ili merenja može se koristiti kompozicija za dijagnozu predmetnog pronalaska. HTRA1 u ispitivanom uzorku može se detektovati: dovođenjem u kontakt HTRA1-inhibirajućeg peptida ili njegovog konjugata sa ispitivanim uzorkom (korak 1); i posle toga merenjem količine HTRA1 vezane za peptid (korak 2). Korak 1 može uključiti, na primer, imobilizaciju konjugata HTRA1-inhibirajućeg peptida sa Fc regionom imunoglobulina na magnetnim perlicama, preko proteina G, i dodavanje tome ispitivanog uzorka. Korak 2 može uključiti, na primer, izdvajanje magnetnih perlica, i analiziranje rastvorljivog proteina precipitiranog sa perlicama, pomoću SDS-PAGE ili western blot-a za detektovanje HTRA1. Pored uzoraka dobijenih od ljudi ili životinja, ovom merenju se može podvrgnuti čak i veštački tretirani uzorak kao što je rekombinantni protein. Primeri ispitivanog uzorka dobijenog iz organizma mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na krv, sinovijalnu tečnost, fluid ascitesa, limfu, cerebrospinalnu tečnost, bronhoalveolarnu lavažnu tečnost, salivu, sputum, supernatante homogenata tkiva i tkivne preseke.
[0154] Detekcija HTRA1 se može izvesti ne samo in vitro nego i in vivo. U slučaju dijagnostičkog dobijanja slike, može se koristiti HTRA1-inhibirajući peptid ili njegov konjugat obeležen farmaceutski prihvatljivim radionuklidom ili emiterom svetlosti. Korak 1 može uključivati, na primer, administriranje obeleženog peptida ili njegovog konjugata subjektu koji se testira. Korak 2 može uključivati, na primer, dobijanje slike korišćenjem tehnike dijagnostičkog dobijanja slike kao što je PET/CT i određivanje ili ispitivanje prisustva HTRA1.
[0155] Peptid ili njegov konjugat sadržani u kompoziciji za dijagnozu, predmetnog pronalaska, vezuje se za HTRA1, i poželjno ima HTRA1-specifičnu vezujuću aktivnost.
[0156] Predmetni pronalazak uključuje i postupak za identifikovanje individue koja je primalac farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. U takvom postupku identifikacije, HTRA1 u uzorku dobijenom od individue meri se HTRA1-vezujućim peptidom predmetnog pronalaska, a individua se može odrediti kao pozitivna kada se HTRA1 otkrije u uzorku ili kada se otkrije ona količina HTRA1 koja je veća u poređenju sa količinom HTRA1 otkrivenom u uzorku dobijenom od zdrave osobe. U ovom postupku može se koristiti kompozicija za dijagnozu predmetnog pronalaska.
[0157] U poželjnom aspektu postupka identifikacije, individua ima bolest koja je u vezi sa HTRA1 ili ima rizik za dobijanje bolesti.
[0158] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se primeniti kod individue koja je u postupku identifikacije određena kao pozitivna.
[0159] HTRA1 se može specifično izdvojiti iz uzorka u kojem HTRA1 koegzistira sa drugim komponentama, korišćenjem peptida predmetnog pronalaska koji ima HTRA1-specifičnu vezujuću aktivnost, ili njegovog konjugata. Oslobađanje HTRA1 iz peptida može se izvesti neselektivno, na primer, u prisustvu relativno visoke jonske snage, niskog pH, umerenih uslova denaturacije, ili haotropske soli, i poželjno se izvodi bez atenuisanja proteazne aktivnosti HTRA1.
7. Postupak za identifikovanje terapijskog leka ili profilaktičkog leka za oboljenje koje je u vezi sa HTRA1
[0160] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za identifikovanje terapijskog leka ili profilaktičkog leka za oboljenje povezano sa HTRA1, i poželjno makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, ili njegovog kandidata, korišćenjem HTRA1-inhibitorne aktivnosti kao indikatora. Postupak može uključivati: korak 1 inkubiranja HTRA1 proteaze i supstrata u prisustvu ili odsustvu ispitivane supstance (ili u prisustvu prenosnika); korak 2 određivanja proteazne aktivnosti HTRA1 u prisustvu i odsustvu ispitivane supstance; i/ili korak 3 određivanja ispitivane supstance kao terapijskog leka ili profilaktičkog leka za makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem ili njegovog kandidata, kada je proteazna aktivnost HTRA1 u prisustvu ispitivane supstance manja nego protezana aktivnost HTRA1 u odsustvu ispitivane supstance. Ispitivana supstanca može biti peptidna ili nepeptidna. Peptidna ispitivana supstanca nije ograničena na SPINK2 mutante. Njeni primeri mogu uključiti, ali se ne ograničavaju na antitela, peptide različite od SPINK2 mutanata koji imaju neimunoglobulinski proteinski okvir, i analoge HTRA1 supstrata. Primeri nepeptidne ispitivane supstance mogu uključiti, ali se ne ograničavaju na sintetska niskomolekulska jedinjenja i nukleinske kiseline. Jedan ili dva ili više od gore opisanih koraka mogu poželjno biti uključeni i u postupak za identifikovanje supstance koja ima zaštitni efekat na ćelije pigmentnog epitela retine, ili njenog kandidata. Predmetni pronalazak se odnosi i na postupak za identifikovanje supstance koja ima zaštitni efekat na retinu, ili njenog kandidata.
8. Model oštećenja retine kunića
[0161] Predmetni pronalazak obezbeđuje i model oštećenja retine kunića, izazvanog unošenjem hrane sa visokim sadržajem masti (high-fat diet, kasnije u ovom tekstu označena kao "HFD") koja sadrži hidrohinon (hydroquinone, kasnije u ovom tekstu označen kao "HQ"), postupak za pripremanje modela, postupak testiranja u kojem se model koristi, itd.
[0162] U ovom modelu koristi se arbitrarno beli kunić, na primer NZW ili JW, starosti 2 godine ili više, bez obzira na pol.
[0163] HFD može sadržati arbitrarnu količinu arbitrarne masti ili ulja, na primer, 0.1 do 2% (m/v) holesterola, 1 do 10% (m/v) kokosovog ulja, 1 do 10% (m/v) ulja kikirikija, 1 do 10% (m/v) sojinog ulja, 10 do 20% (m/v) goveđeg loja, 10 do 50% (m/v) masti, ili 1 do 10% (m/v) ulja kukuruza, mada se komponenta ne ograničava na ovo sve dok je komponenta pogodna za pripremanje ovog modela.
[0164] Količina HQ sadržana u HQ-HFD iznosi 0 do 4% (m/v), poželjno 0.5 do 3.5% (m/v), poželjnije 1.0 do 3.0% (m/v), još poželjnije 2.2 do 2.8% (m/v), i najpoželjnije 2.4% (m/v).
[0165] Period hranjenja HQ-HFD je 3 do 6 meseci, poželjno 3.5 do 5 meseci, i poželjnije 4 meseca. Treba izbegavati produženje hranjenja na 8 meseci ili duže.
[0166] Model predmetnog pronalaska je poželjan jer je model sličniji ljudima po veličini očne jabučice i funkcijama, u poređenju sa mišjim modelima (nepatentna literatura 18 i 19). Konvencionalni modeli kunića (nepatentna literatura 20) zahtevaju 8 meseci za pripremanje. Nasuprot tome, model predmetnog pronalaska može se pripremiti u kraćem periodu, i pored toga, poželjniji je kao model makularne degeneracije povezane sa starenjem jer model može inukovati hipertrofiju RPE ćelija, koja nije jasna u konvencionalnim modelima.
[0167] Ćelije pigmentnog epitela retine (RPE ćelije) modela predmetnog pronalaska su hipertrofisane u poređenju sa RPE ćelijama normalnog kunića, što je manifestacija ranog patološkog stanja makularne degeneracije povezane sa starenjem. Sa druge strane, hipertrofija RPE ćelija ne može se vizuelno potvrditi kada se kunići stari 10 nedelja slični konvencionalnim modelima kunića (nepatentna literatura 20) hrane sa HQ-HFD tokom 4 meseca.
[0168] Terapijski lek i/ili profilaktički lek za makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem ili sredstvo za zaštitu retine može se identifikovati pomoću ovog modela koji manifestuje patološko stanje. Postupak identifikacije može uključivati sledeće korake: (i) merenje hipertrofije ćelija pigmentnog epitela retine kunića ovog modela sa ili bez primene ispitivane supstance; i (ii) određivanje ispitivane supstance kao pozitivne kada je hipertrofija ćelija pigmentnog epitela retine primenom ispitivane supstance suprimirana u poređenju sa hipertrofijom ćelija pigmentnog epitela retine bez njene upotrebe. Merenje u koraku (i) poželjno je merenje prosečne površine ćelija pigmentnog epitela retine i/ili broja hipertrofisanih ćelija pigmentnog epitela retine.
Primeri
[0169] Kasnije u ovom tekstu, neki aspekti predmetnog pronalaska biće opisani detaljnije uz pozivanje na Primere. Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen na ove primere.
[0170] U primerima koji slede, ukoliko nije drugačije navedeno, pojedinačne operacije koje se tiču genetičke manipulacije izvode se u skladu sa postupcima koji su opisani u "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., izdavač Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982 ili 1989) ili drugim postupcima opisanim u priručnicima za eksperimentalni rad koje koristi stručnjak u ovoj oblasti, ili, kada se koriste komercijalno raspoloživi reagensi ili kompleti, ovi primeri se izvode u skladu sa uputstvima koja se nalaze u komercijalno raspoloživim proizvodima.
Primer 1. Pripremanje HTRA1-inhibirajućeg peptida
(1-1) Konstruisanje ekspresionog vektora HTRA1-inhibirajućeg peptida
(1-1-1) Konstruisanje pET 32a (modifikovan)_HTRA1-inhibirajući peptid
[0171] Prvo, konstruiše se ekspresioni vektor HTRA1-inhibirajućeg peptida sa SPINK2 matricom (scaffold) kao okosnicom. Inhibitorni fragment se amplifikuje putem PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 30 sec) × 30 ciklusa) sa nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 i 22) svakog od inhibirajućih peptida i nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 2) SPINK2 kao šablonima uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 1: 5'-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Prajmer 2: 5'-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCACGGACC-3'
[0172] Svaki amplifikovani fragment podvrgne se elektroforezi na agaroznom gelu. Zatim se željeni DNK fragment iseče sa gela, i DNK se pripremi korišćenjem QIAquick kompleta za ekstrakciju sa gela (QIAquick Gel Extraction kit, Qiagen N.V.). Pripremljeni DNK fragment i pET 32a (modifikovani) se, svaki, tretira restrikcionim enzimima EcoRI (New England BioLabs Inc.) i XhoI (New England BioLabs Inc.) na 37°C, 1 sat ili duže. Posle elektroforeze na agaroznom gelu, željeni DNK fragmenti se iseku sa gela i prečiste korišćenjem QIAquick kompleta za prečišćavanje PCR proizvoda (QIAquick PCR Purification kit, Qiagen N.V.). Prečišćeni fragmenti reaguju preko noći na 16°C u reakciji ligacije, uz korišćenje T4 DNK ligaze (T4 DNA Ligase, New England BioLabs Inc.). Rastvor za ligaciju doda se u E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), i smeša se ostavi da stoji na ledu 30 minuta, zatim se tretira toplotom na 42°C u trajanju od 45 sekundi, ostavi da stoji na ledu još 5 minuta, i inokuliše u 2YT ploču koja sadrži 0.1 mg/ml ampicilina, što je praćeno kulivisanjem u statičnim uslovima preko noći na 37°C da bi se E. coli transformisala. Sledećeg dana, transformisana E. coli se inokuliše u Terrific Broth medijum (Invitrogen Corp.) koji sadrži 0.1 mg/ml ampicilina i kultiviše preko noći na 37°C. Zatim se plazmidna DNK oporavi korišćenjem QIAprep 96 Turbo Miniprep kompleta (Qiagen N.V.) (kasnije u ovom tekstu, ovaj tretman se označava kao "miniprep tretman") i podvrgava sekvencionoj analizi da bi se konstruisao "pET 32a (modifikovani)_HTRA1-inhibirajući peptid".
(1-1-2) Konstruisanje pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid_Kex2
[0173] Slično tome, inhibitorski fragment se amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 30 sec) × 30 ciklusa) sa sekvencom (Lista sekvenci) svakog od inhibitora i nukleotidnom sekvencom SPINK2 kao šablonima, uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus-(Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 3: 5'-
AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Prajmer 4: 5'-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAATTTTA-3'
[0174] Svaki amplifikovani fragment podvrgne se elektroforezi na agaroznom gelu. Zatim se željeni DNK fragment iseče sa gela, i DNK se pripremi korišćenjem QIAquick kompleta za ekstrakciju sa gela (Qiagen N.V.). Pripremljeni DNK fragment i pET 32a (Novagen) se, svaki, tretira restrikcionim enzimima BamHI (New England BioLabs Inc.) i XhoI (New England BioLabs Inc.) na 37°C, 1 sat ili duže. Posle elektroforeze na agaroznom gelu, željeni DNK fragmenti se iseku sa gela i prečiste korišćenjem QIAquick kompleta za prečišćavanje PCR proizvoda (Qiagen N.V.). Prečišćeni fragmenti reaguju preko noći na 16°C u reakciji ligacije, uz korišćenje T4 DNK ligaze (New England BioLabs Inc.). Rastvor za ligaciju doda se u E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), i smeša se ostavi da stoji na ledu 30 minuta, zatim se tretira toplotom na 42°C u trajanju od 45 sekundi, ostavi da stoji na ledu još 5 minuta, i inokuliše na 2YT ploču koja sadrži 0.1 mg/ml ampicilina, što je praćeno kultivisanjem u statičnim uslovima preko noći na 37°C da se E. coli transformiše. Transformisana E. coli se kultiviše i zatim se izvode miniprep i sekvenciona analiza da se konstruiše "pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid_Kex2". Operacija se izvodi u skladu sa postupkom opisanim u (1-1-1).
(1-2) Eksprimiranje i prečišćavanje HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0175] E. coli Origami B (DE3) (Novagen) transformiše se vektorom pET 32a (modifikovan)_HTRA1-inhibirajući peptid, konstruisanim u (1-1-1), i kultiviše na 37°C uz korišćenje 2YT medijuma koji sadrži 0.1 mg/ml ampicilina. Zatim se tome doda IPTG (finalna koncentracija: 1 mM) i E. coli se kultiviše preko noći na 16°C. Sledećeg dana, posle sakupljanja centrifugiranjem (3,000 g, 20 min, 4°C), lizat se pripremi korišćenjem BugBuster Master smeše (BugBuster Master Mix, Novagen), i His oznaka-fuzioni protein od interesa se prečisti korišćenjem TALON metal-afinitetne smole (TALON Metal Affinity Resin, Clontech Laboratories, Inc.). Zatim se tioredoksinska oznaka i željeni protein odseku korišćenjem kompleta za sečenje trombinom (Thrombin Cleavage Capture kit, Novagen) i prečiste korišćenjem TALON. Rezultat ovoga podvrgne se gel-filtracionoj hromatografiji (Superdex 75 10/300 GL) ili reverzno-faznoj hromatografiji (YMC-Pack ODS-AM) da bi se pripremio HTRA1-inhibirajući peptid. Dobijeni peptid se na svom N terminusu konjuguje sa segmentom koji se sastoji od S oznake i linkera (SEQ ID NO: 31: Slika 43) i na svom C terminusu sa C-terminalnim heksamerom (SEQ ID NO: 32: Slika 44) umesto Gly-Gly.
[0176] Slično tome, E. coli Origami B (DE3) (Novagen) transformiše se vektorom pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid_Kex2, konstruisanim u (1-1-2), i kultiviše na 37°C uz korišćenje 2YT medijuma koji sadrži 0.1 mg/ml ampicilina. Zatim se tome doda IPTG (finalna koncentracija: 1 mM), i E. coli se kultiviše preko noći na 16°C. Sledećeg dana, posle sakupljanja centrifugiranjem (3,000 g, 20 min, 4°C), lizat se pripremi korišćenjem BugBuster Master smeše (Novagen), i His oznaka-fuzioni protein od interesa se prečisti korišćenjem TALON metal-afinitetne smole (Clontech Laboratories, Inc.). Zatim se tioredoksinska oznaka i željeni protein odseku korišćenjem Kex2 (Saccharomyces cerevisiae: Pristupni broj CAA96143) i prečiste, uz korišćenje TALON. Rezultat ovoga podvrgne se gel-filtracionoj hromatografiji (Superdex 7510/300 GL) ili reverznofaznoj hromatografiji (YMC-Pack ODS-AM) da se pripremi HTRA1-inhibirajući peptid (ni N terminus ni C terminus nisu konjugovani sa oznakom, linkerom ili slično).
Primer 2. Evaluiranje HTRA1-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0177] Sličnost sekvenci HTRA1 čoveka, miša, pacova i majmuna prikazana je na Slici 1. Primarna sekvenca koja sačinjava HTRA1-proteazni domen (204Gly do 364Leu), koji je enzimski aktivan domen, potpuno je identična kod čoveka i majmuna. Sekvence HTRA1-proteaznog domena čoveka i miša ili pacova razlikuju se po 1 rezidui. Međutim, ova rezidua je strukturno pozicioirana na strani suprotnoj od aktivnog centra enzima i stoga se pretpostavlja da nema uticaja na aktivni centar enzima (Slika 1). Prema tome, HTRA1-proteazni domen ima efektivno istu sekvencu, bez obzira na vrstu (čovek/miš/pacov/majmun). Vrsta se, dakle, ne spominje posebno.
(2-1) Pripremanje HTRA1 proteaznog domena HTRA1 (kat)
(2-1-1) Konstruisanje pET 21b_HTRA1 (kat)
[0178] Proteazni domen (158Gly do 373Lys), izuzev N-terminalnog domena i PDZ domena humanog HTRA1 (Q92743), koristi se kao HTRA1 (kat) da bi se konstruisao HTRA1 (kat) ekspresioni vektor. Željeni DNK fragment se amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 45 sec) × 30 ciklusa) sa humanim HTRA1insertovanim plazmidom (GeneCopoeia, Inc.; GC-M0558) kao šablonom uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 5: 5'-AAACATATGGGGCAGGAAGATCCCAACAGTTTGC-3'
Prajmer 6: 5'-AAACTCGAGTTTGGCCTGTCGGTCATGGGACTC-3'
[0179] Amplifikovani fragment se podvrgne elektroforezi na agaroznom gelu. Zatim se željeni DNK fragment iseče sa gela, i DNK se pripremi korišćenjem QIAquick kompleta za ekstrakciju sa gela (Qiagen N.V.). Pripremljeni DNK fragment i pET 32a (Novagen) se, svaki, tretira restrikcionim enzimima NdeI (New England BioLabs Inc.) i XhoI (New England BioLabs Inc.) na 37°C u trajanju od 1 sata ili duže. Posle elektroforeze na agaroznom gelu, željeni DNK fragmenti se iseku sa gela i prečiste korišćenjem QIAquick kompleta za prečišćavanje PCR proizvoda (Qiagen N.V.). Prečišćeni fragmenti reaguju preko noći na 16°C u reakciji ligacije, uz korišćenje T4 DNK ligaze (New England BioLabs Inc.). Rastvor za ligaciju se doda u E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), i smeša se ostavi da stoji na ledu 30 minuta, zatim se tretira toplotom na 42°C tokom 45 sekundi, ostavi da stoji na ledu još 5 minuta, i inokuliše na 2YT ploču koja sadrži 0.1 mg/ml ampicilina, što je praćeno kultivisanjem u statičnim uslovima preko noći na 37°C da bi se E. coli transformisala. Transformisana E. coli se kultiviše, i zatim se izvode miniprep i sekvenciona analiza da se konstruiše "pET 21b_HTRA1 (kat)". Operacija se izvodi u skladu sa postupkom opisanim u (1-1-1).
(2-1-2) Pripremanje HTRA1 (kat)
[0180] E. coli BL21 (DE3) (Novagen) se transformiše konstruisanim pET 21b_HTRA1 (kat) i kultiviše na 37°C uz korišćenje 2YT medijuma koji sadrži 0.1 mg/ml ampicilina. Zatim se tome doda IPTG (finalna koncentracija: 1 mM), i E. coli se kultiviše preko noći na 28°C. Posle sakupljanja, lizat se pripremi suspendovanjem u fosfatnom puferu (50 mM natrijum fosfat i 300 mM NaCl) koji sadrži 1 mg/ml lizozima i ultrasonifikuje, i željeni His oznaka-fuzioni protein se oporavi uz korišćenje TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Rezultat toga se podvrgne gelfiltracionoj hromatografiji (Superdex 20010/300 GL) da bi se prečistio HTRA1 (kat).
(2-2) Pripremanje HTRA1 pune dužine (HTRA1 (potpun))
(2-2-1) Konstruisanje pcDNA3.1_HTRA1 (potpun)_His
[0181] Željeni DNK fragment se amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 90 sec) × 30 ciklusa) sa sintetisanom humanom HTRA1 (Q92743) DNK (GeneArt) kao šablonom, uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 7: 5'-AAAAGAATTCGCCACCATGCAGATTCCTAGAGCCG-3' Prajmer 8: 5'-AAAACTCGAGTCAGTGGTGATGGTGGTGGTGGCCGG-3'
[0182] Amplifikovani fragment se podvrgne elektroforezi na agaroznom gelu. Zatim se željeni DNK fragment iseče sa gela, i DNK se pripremi korišćenjem QIAquick kompleta za ekstrakciju sa gela (Qiagen N.V.). Pripremljeni DNK fragment i pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.) se, svaki, tretira restrikcionim enzimima EcoRI (New England BioLabs Inc.) i XhoI (New England BioLabs Inc.) na 37°C, 1 sat ili duže. Posle elektroforeze na agaroznom gelu, željeni DNK fragmenti se iseku sa gela i prečiste korišćenjem QIAquick kompleta za prečišćavanje PCR proizvoda (Qiagen N.V.). Prečišćeni fragmenti reaguju preko noći na 16°C u reakciji ligacije, uz korišćenje T4 DNK ligaze (New England BioLabs Inc.). Rastvor za ligaciju se doda u E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), i smeša se ostavi da stoji na ledu 30 minuta, zatim se tretira toplotom na 42°C u trajanju od 45 sekundi, ostavi da stoji na ledu još 5 minuta, i inokuliše na 2YT ploču koja sadrži 0.1 mg/ml ampicilina, što je praćeno kultivisanjem u statičnim uslovima preko noći na 37°C da bi se E. coli transformisala. Transformisana E. coli se kultiviše, i zatim se izvode miniprep i sekvenciona analiza da se konstruiše "pcDNA3.1_HTRA1 (potpun)_His". Operacija se izvodi u skladu sa postupkom opisanim u (1-1-1).
(2-2-2) Konstruisanje pcDNA3.3_HTRA1 (potpun)_FLAG_His
[0183] Fragment A se amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 90 sec) × 30 ciklusa) sa pcDNA3.1_HTRA1 (potpun)_His konstruisanim u (2-2-1) kao šablonom uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus-(Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 7
Prajmer 9: 5'-CTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCGCCGGGGTCGATTTCCTC-3'
[0184] Zatim se fragment B amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 10 sec) × 30 ciklusa) uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus-(Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 10:
5'-GCGACTACAAGGACGATGACGACAAGCACCACCACCATCATCAC-3'
Prajmer 11: 5'-AAAAACTCGAGCTAGTGATGATGGTGGTGGTGCTTGTCGTC-3'
[0185] Željeni DNK fragment se amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 90 sec) × 30 ciklusa) sa fragmentom A i fragmentom B kao šablonima, uz korišćenje prajmera 7 i 11 i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.). Amplifikovani fragment se podvrgne elektroforezi na agaroznom gelu. Zatim se željeni DNK fragment iseče sa gela, i DNK se pripremi korišćenjem QIAquick kompleta za ekstrakciju sa gela (Qiagen N.V.). Pripremljeni DNK fragment i pcDNA3.3 (Thermo Fisher Scientific Inc.) se, svaki, tretira restrikcionim enzimima EcoRI (New England BioLabs Inc.) i XhoI (New England BioLabs Inc.) na 37°C, 1 sat ili duže. Posle elektroforeze na agaroznom gelu, željeni DNK fragmenti se iseku sa gela i prečiste korišćenjem QIAquick kompleta za prečišćavanje PCR proizvoda (Qiagen N.V.). Prečišćeni fragmenti reaguju preko noći na 16°C u reakciji ligacije, uz korišćenje T4 DNK ligaze (New England BioLabs Inc.). Rastvor za ligaciju se doda u E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), i smeša se ostavi da stoji na ledu 30 minuta, zatim se tretira toplotom na 42°C u trajanju od 45 sekundi, ostavi da stoji na ledu još 5 minuta, i inokuliše na 2YT ploču koja sadrži 0.1 mg/ml ampicilina, što je praćeno kultivisanjem u statičnim uslovima preko noći na 37°C da bi se E. coli transformisala. Transformisana E. coli se kultiviše, i zatim se izvode miniprep i sekvenciona analiza da se konstruiše "pcDNA3.3_HTRA1 (potpun)_FLAG_His". Operacija se izvodi u skladu sa postupkom opisanim u (1-1-1).
(2-2-3) Pripremanje HTRA1 (potpun)
[0186] FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) se transfektuje sa pcDNA3.3_HTRA1 (potpun)_FLAG_His konstruisanim u (2-2-2), uz korišćenje polietilenimin Max reagensa (Polyethylenimine Max, Polysciences, Inc.). Šest dana kasnije, supernatant kulture se oporavi. His oznaka-fuzioni protein se oporavi uz korišćenje HisTrap excel kolone (GE Healthcare), i HTRA1 (potpun) se dodatno prečišćava korišćenjem ANTI-FLAG M2 afinitetnog agaroznog gela (ANTI-FLAG M2 Affinity Agarose Gel, Sigma-Aldrich Co. LLC).
(2-3) Pripremanje inaktivnog HTRA1 mutanta HTRA1 (S328A)
(2-3-1) Konstruisanje pcDNA3.3_HTRA1(S328A)_FLAG_His
[0187] U cilju konstruisanja ekspresionog vektora neaktivnog HTRA1 mutanta HTRA1 (S328A), izvodi se PCR ((95°C u trajanju od 30 sec, 55°C u trajanju od 1 min, i 68°C u trajanju od 7 min) × 18 ciklusa) sa vektorom "pcDNA3.3_HTRA1 (potpun)_FLAG_His" konstruisanim u Primeru (2-2-2) kao šablonom, uz korišćenje sledećih prajmera i QuikChange II kompleta za usmerenu mutagenezu (QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kits, Agilent Technologies Japan, Ltd.).
Prajmer 21: 5'-CCATCATCAACTACGGCAACGCGGGCGGACCCCTCGTGAACC-3' (SEQ ID NO: 55: Slika 76)
Prajmer 22: 5'-GGTTCACGAGGGGTCCGCCCGCGTTGCCGTAGTTGATGATGG-3' (SEQ ID NO: 56: Slika 77)
[0188] Posle PCR reakcije, E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) se transformiše PCR reakcionim ratsvorom tretiranim sa DpnI prema protokolu koji je priložen uz komplet. Transformisana E. coli se kultiviše, i zaatim se izvode miniprep i sekvenciona analiza da se konstruiše "pcDNA3.3_HTRA1(S328A)_FLAG_His". Operacija se izvodi u skladu sa postupkom opisanim u (1-1-1).
(2-3-2) Pripremanje HTRA1 (S328A)
[0189] HTRA1 (S328A) se eksprimira korišćenjem FreeStyle 293F, u skladu sa postupkom opisanim u (2-2-3), i HTRA1 (S328A) se priprema afinitetnim prečišćavanjem.
Primer 3. Evaluiranje HTRA1-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida
(3-1) Evaluiranje HTRA1-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida uz korišćenje peptidnog supstrata
[0190] Supstratni peptid H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K) (Peptide Institute, Inc.: SEQ ID NO: 54, Slika 8) rastvori se do koncentracije od 10 mM u DMSO, razblaži ispitivanim puferom (50 mM borat i 150 mM NaCl, pH 8.5), i koristi u finalnoj koncentraciji od 10 µM. HTRA1 (HTRA1 (kat) ili HTRA1 (potpun)) i svaki od HTRA1-inhibirajućih peptida razblažen u ispitivanom puferu, pomeša se u količini od po 25 µL i reaguju na 37°C, 20 minuta. Zatim se tome doda 50 µL supstrata razblaženog ispitivanim puferom. Fluorescentni signal (ekscitacija na 328 nm/emisija na 393 nm) se meri korišćenjem Enspire (PerkinElmer, Inc.). Finalna koncentracija HTRA1 je 100 nM, i finalna koncentracija HTRA1-inhibirajućeg peptida je 1.875 do 1,000 nM. PROTEOSAVE(R) SS96F crna ploča (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) koristi se za reakciju i merenje.
[0191] Za svaku koncentraciju HTRA1-inhibirajućeg peptida izračunava se stopa razgradnje supstratnog peptida. Kada se stopa razgradnje pri koncentraciji inhibitora od 0 nM definiše kao 100%, procenjuje se aktivnost inhibicije HTRA1 (kat) i HTRA1 (potpun) svakog HTRA1-inhibirajućeg peptida (Slike 2 i 3). Kao rezultat izračunavanja 50% inhibitorne koncentracije (IC50) uz korišćenje GraphPad Prism (verzija 5.0; GraphPad Software Inc.), nađeno je da svi HTRA1-inhibirajući peptidi inhibiraju enzimsku aktivnost HTRA1 (kat) i HTRA1 (potpun) pri niskoj koncentraciji (Slike 2A do 2C i Slika 3). Divlji tip SPINK2 (wt) korišćen kao kontrola, nije pokazao HTRA1-inhibitornu aktivnost (Slika 2D).
HTRA1-inhibitorna aktivnost HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0192]
[Tabela 1]
ID IC50 (nM) za HTRA1 (kat) IC50 (nM) za HTRA1 (potpun) H218 72 55
H223 41 66
H228 71 38
H308 37 15
H321 48 29
H322 50 17
H308AT 49 31
H321AT 46 18
H322AT 45 25
M7 43 24
(3-2) Evaluacija HTRA1-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida uz korišćenje proteinskog supstrata
[0193] HTRA1-inhibitorna aktivnost HTRA1-inhibirajućeg peptida evaluira se u prisustvu humanog vitronektina kao proteinskog supstrata. HTRA1 (kat) i svaki od HTRA1-inhibirajućih peptida razblaženih ispitivanim puferom (50 mM Tris i 150 mM NaCl, pH 8.0) pomešaju se i reaguju na 37°C 1 sat. Zatim se tome doda humani vitronektin (BD Biosciences; 354238) razblažen ispitivanim puferom i reakcija se odvija na 37°C, 2 sata. Tome se doda SDS pufer za uzorak, i enzimska reakcija se okonča tretmanom na 99°C u trajanju od 5 minuta. Zatim se pomoću SDS-PAGE i western blot analize evaluira razgradnja humanog vitronektina. Finalna koncentracija HTRA1-inhibirajućeg peptida bila je 0 do 25 µM, finalna koncentracija HTRA1 (kat) bila je 1 µM, i finalna koncentracija humanog vitronektina bila je 1 µM. Za western blot analizu, antitelo na humani vitronektin (Human Vitronectin Antibody, R&D Systems, Inc.; MAB2349) koristi se kao primarno antitelo, i antimišji IgG, HRP-vezano celo antitelo ovce (Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep, GE Healthcare; NA931) koristi se kao sekundarno antitelo.
[0194] Kao u (3-1), HTRA1-inhibirajući peptidi takođe su snažno ispoljili inhibiciju HTRA1 (kat) kada je humani vitronektin korišćen kao supstrat (Slika 4).
(3-3) Evaluacija specifičnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0195] Specifičnost prema drugim proteazama evaluirana je korišćenjem sečenja supstratnog peptida kao indikatora. Na isti način kao kod postupka opisanog u (3-1), svaka proteaza i svaki uzorak (finalna koncentracija: 1 µM), razređeni ispitivanim puferom pomešaju se u količini od po 25 µL i reaguju na 37°C 20 minuta. Zatim se tome doda po 50 µL svakog supstrata razblaženog ispitivanim puferom. Fluorescentni signal (ekscitacija na 380 nm/emisija na 460 nm) meri se korišćenjem Enspire (PerkinElmer, Inc.). Isti pufer za test (50 mM borat i 150 mM NaCl, pH 8.5) kao u Primeru 2 korišćen je u evaluaciji aktivnosti HTRA2. Pufer za test (50 mM Tris i 150 mM NaCl, pH 8.0) korišćen je u evaluaciji proteazne aktivnosti različite od aktivnosti HTRA2. PROTEOSAVE(R) SS96F crna ploča (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) korišćena je u reakciji i merenju. Kombinacije proteaze i supstrata korišćene u evaluaciji specifičnosti bile su kako sledi.
Evaluacija aktivnosti inhibicije goveđeg tripsina; 5 nM (finalna koncentracija) tripsin (Pierce; 20233) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Boc-VPR-AMC fluorogeni peptidni supstrat (Boc-VPR-AMC Fluorogenic Peptide Substrate, R&D Systems, Inc.; ES011) Evaluacija aktivnosti inhibicije goveđeg α-himotripsina; 10 nM (finalna koncentracija) himotripsin (Worthington Biochemical Corporation; LS001434) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v)
Evaluacija aktivnosti inhibicije humane triptaze; 1 nM (finalna koncentracija) triptaza (Sigma-Aldrich Co. LLC; T7063) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3107-v) Evaluacija aktivnosti inhibicije humane himaze; 100 nM (finalna koncentracija) himaza (Sigma-Aldrich Co. LLC; C8118) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v) Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog plazmina; 50 nM (finalna koncentracija) plazmin (Sigma-Aldrich Co. LLC; P1867) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Boc-Val-Leu-Lys-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3104-v) Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog trombina; 1 nM (finalna koncentracija) trombin (Sigma-Aldrich Co. LLC; T6884) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Boc-VPR-AMC fluorogeni peptidni supstrat (R&D Systems, Inc.; ES011)
Evaluacija aktivnosti inhibicije humane matriptaze; 1 nM (finalna koncentracija) matriptaza (R&D Systems, Inc.; E3946-SE) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Boc-QAR-AMC fluorogeni peptidni supstrat (R&D Systems, Inc.; ES014) Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog proteina C; 100 nM (finalna koncentracija) protein C (Sigma-Aldrich Co. LLC; P2200) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3112-v) Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog tPA; 10 nM (finalna koncentracija) tPA (Sigma-Aldrich Co. LLC; T0831) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v)
Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog uPA; 10 nM (finalna koncentracija) uPA (Sigma-Aldrich Co. LLC; T0831) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v)
Evaluacija aktivnosti inhibicije kalikreina humane plazme; 0.125 µg/ml (finalna koncentracija) kalikrein plazme (Sigma-Aldrich Co. LLC; T0831) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Z-Phe-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3095-v) Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog HTRA2; 200 nM (finalna koncentracija) HTRA2 (R&D Systems, Inc.; 1458-HT) i 50 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid H2-Opt (Peptide Institute, Inc.)
[0196] Unakrsna reaktivnost sa proteazama različitim od HTRA1 evaluirana je korišćenjem razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora, na isti način kao u (3-2). Nijedan HTRA1-inhibirajući peptid nije suprimirao proteaznu aktivnost nijedne od proteaza u finalnoj inhibitornoj koncentraciji od 1 mikro M, što ukazuje na to da HTRA1-inhibirajući peptid ima HTRA1-specifičan inhibitorni efekat (Slika 5).
Primer 4. Analiza HTRA1-inhibirajućeg peptida uz korišćenje kristalne strukture dobijene X-zracima
(4-1) Pripremanje kompleksa HTRA1 (kat)/HTRA1-inhibirajući peptid
[0197] HTRA1 (kat) i HTRA1-inhibirajući peptid sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 3 pripremaju se, svaki, u skladu sa postupcima opisanim u (1-2) i (2-1). Zatim se pomešaju u prisustvu 20 mM Tris-HCl i 150 mM NaCl, pH 7.6. Kompleks se tada izoluje i prečišćava gel-filtracionom hromatografijom (Superdex 20010/300 GL).
(4-2) Kristalografija X-zracima
[0198] Rastvor kompleksa pripremljen u (4-1) koncentruje se do 18 mg/ml i zatim pomeša sa rastvorom rezervoara (1.0 M LiCl, 7.5% PEG6000, i 0.1 M Tris/HCl (pH 8.5)) u odnosu 1:1, i smeša se kristalizuje postupkom difuzije pare. Dobijeni kockasti monokristali urone se u rastvor rezervoara koji sadrži 20% etilen glikol i zatim zamrznu u tečnom azotu. Zamrznuti kristali se izlože X-zracima pod kriogenim protokom vazduha da bi se dobila difrakciona slika (photon factory BL5A: High Energy Accelerator Research Organization, Organizacija za proučavanje visokoenergetskih akceleratora). Skalirajući podaci sa maksimalnom rezolucijom od 2.6 Angstrema dobijeni su analizom uz korišćenje HKL2000. Faza je određena postupkom molekulske zamene uz korišćenje serinske proteaze HTRA1 (PDB ID: 3NZI) kao šablona. Posle dorađivanja strukture, kristalni kompleks HTRA1 (kat) i peptida određen je pri rezoluciji od 2.6 Angstrema. U jediničnoj ćeliji nalazio se po jedan molekul HTRA1 i SPINK2. Što se tiče molekula SPINK2, delimični model molekula koji sadrži mesto interakcije sa HTRA1 (kat) konstruisan je na osnovu informacija o sekvenci i zapažene gustine elektrona. Potvrđeno je da se HTRA1-inhibirajući peptid vezuje za region koji sadrži aktivni centar HTRA1 enzima (Slike 6 i 7).
[0199] Primer 5. Zaštitni efekat na retinu ostvaruje se inhibicijom HTRA1 u modelu oštećenja retine pacova indukovanog izlaganjem svetlosti
(5-1) Pripremanje modela oštećenja retine pacova indukovanog izlaganjem svetlosti
[0200] Modeli oštećenja retine pacova izazvanog izlaganjem svetlosti su modeli u kojima se ćelijska smrt fotoreceptorskih ćelija retine indukuje izlaganjem svetlosti i koriste se univerzalno kao animalni modeli degeneracije retine (Daniel T. Organisciak i sarad, (1996) Invest Ophthalmol Vis Sci. tom 37 (br.11): str.2243-2257). Rastvor za oči koji sadrži 0.5% (m/v) tropikamida-0.5% fenilefrin hidrohlorida ukapa se u oko u uslovima adaptacije na mrak tokom 72 sata. Zatim se pacovi izlože beloj svetlosti od 5500 Lux u trajanju od 3 sata. Tako izloženi pacovi se ponovo adaptiraju na mrak oko 24 sata i zatim drže 2 dana pod uslovima svetlo-dan kako je uobičajeno. Posle eutanazije, očne jabučice se iseku i fiksiraju uranjanjem u fiksativ koji sadrži 3.7% (m/v) formaldehida-0.5 do 1% (m/v) metanola-0.2% (m/v) pikrinske kiseline, tokom 24 sata ili duže. Posle kalupljenja u parafinu, pripremaju se tanki preseci tkiva. Preseci se boje hematoksilinomeozinom, i utvrđuje se broj nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju na poprečnim presecima retine da bi se evaluiralo oštećenje retine. Nađeno je da modeli oštećenja retine pacova indukovanog izlaganjem svetlosti imaju upadljivo smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju, usled izlaganja svetlosti.
(5-2) Potvrda eksprimiranja vanćelijskog HTRA1 u vreme oštećenja retine
[0201] Kako bi se u modelima oštećenja retine pacova izazvanog izlaganjem svetlosti ispitala uključenost HTRA1, staklasto telo se sakupi iz pacova koji su služili kao modeli pripremljeni u (5-1) i evaluira se u pogledu nivoa ekspresije HTRA1 pomoću western blot analize. Staklasto telo podvrgava se SDS-PAGE pod redukujućim uslovima. HTRA1 pacova detektuje se korišćenjem humanog HTRA1/PRSS11 antitela (R&D Systems, Inc.; AF2916) kao primarnog antitela i ovčjeg IgG antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (R&D Systems, Inc.; HAF016) kao sekundarnog antitela. Povećana količina HTRA1 u staklastom telu potvrđena je u grupi koja je bila izložena svetlosti, u poređenju sa grupom koja nije bila izložena, što sugeriše da u ovom modelu HTRA1 učestvuje u proces oštećenja retine uzrokovanog izlaganjem svetlosti (Slika 9).
(5-3) Zaštitni efekat HTRA1-inhibirajućeg peptida na retinu u modelu oštećenja retine pacova indukovanog izlaganjem svetlosti
[0202] Neposredno pre izlaganja pacova svetlosti, 5 µL HTRA1-inhibirajućeg peptida H308 u koncentraciji od 0.04 mg/mL ili 0.2 mg/mL primeni se intravitrealno pod anestezijom. n = 4 za grupu koja je primala normalni fiziološki rastvor i n = 5 za ostale grupe. Izlaganje svetlosti smanjilo je broj nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju na poprečnom preseku retine u grupi koja je primala normalni fiziološki rastvor, dok je efekat supresije smanjenja broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju potvrđen u grupi kod koje je primenjen HTRA1-inhibirajući peptid (Slika 10). Ovi rezultati su pokazali da HTRA1-inhibirajući peptid ispoljava medicinske efekte na oštećenje tkiva izazvano HTRA1.
Primer 6. Evaluacija derivata HTRA1-inhibirajućeg peptida
(6-1) Konstruisanje pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid H308_S16A_Kex2
[0203] Derivat S16A koji ima aminokiselinsku sekvencu u kojoj je 16Ser u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 9 (Slika 21) supstituisan sa Ala pripremljen je sa HTRA1-inhibirajućim peptidom H308 kao šablonom. Fragment C se amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 15 sec) × 30 ciklusa), uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 12: 5'-CCGCAGTTTGGTCTGTTTAGCAAATATCGTACCCCGAATTGT-3' Prajmer 13: 5'-GCCATACCAGCATGGTCCGCACAATTCGGGGTACGATATTTGC-3'
[0204] Zatim se fragment D amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 20 sec) × 30 ciklusa) sa HTRA1-inhibirajućim peptidom H308 kao šablonom, uz korišćenje sledećih prajmera i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.). Prajmer 14: 5'-GCGGACCATGCTGGTATGGCATGTGTTGCTCTGTATGAAC-3' Prajmer 15: 5'-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAA-3'
[0205] Željeni DNK fragment se amplifikuje pomoću PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 20 sec) × 30 ciklusa) uz korišćenje fragmenata C i D, sledećih prajmera, i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Prajmer 16: 5'-
AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Prajmer 15
[0206] Amplifikovani fragment se podvrgne elektroforezi na agaroznom gelu. Zatim se željeni DNK fragment iseče sa gela, i DNK se pripremi korišćenjem QIAquick kompleta za ekstrakciju sa gela (Qiagen N.V.). Pripremljeni DNK fragment i pET 32a (Novagen) se, svaki, tretira restrikcionim enzimima BamHI (New England BioLabs Inc.) i XhoI (New England BioLabs Inc.) na 37°C 1 sat ili duže. Posle elektroforeze na agaroznom gelu, željeni DNK fragmenti se iseku sa gela i prečiste korišćenjem QIAquick kompleta za prečišćavanje PCR proizvoda (Qiagen N.V.). Prečišćeni fragmenti reaguju preko noći na 16°C u reakciji ligacije, uz korišćenje T4 DNK ligaze (New England BioLabs Inc.). Rastvor za ligaciju se doda u E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), i smeša se ostavi da stoji na ledu 30 minuta, zatim se tretira toplotom na 42°C, 45 sekundi, ostavi se da stoji još 5 minuta na ledu, i inokuliše na 2YT ploču koja sadrži 0.1 mg/ml ampicilina, što je praćeno kultivisanjem u statičnim uslovima preko noći na 37°C da bi se E. coli transformisala. Transformisana E. coli se kultiviše, i zatim se izvode miniprep i analiza sekvence da se konstruiše "pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid H308_S16A_Kex2". Operacija se izvodi u skladu sa postupkom opisanim u (1-1-1).
(6-2) Pripremanje ekspresionog vektora za HTRA1-inhibirajući peptid_N-terminalni derivat
[0207] Da bi se pripremila četiri N-terminalna sekvenciona derivata (označena kao D1G, D1S, D1E, odnosno D1SLI) HTRA1-inhibirajućeg peptida koji ima aminokiselinsku sekvencu u kojoj je 1Asp u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 9 (Slika 21) supstituisan sa Gly, Ser, Glu ili Ser-Leu-Ile, ekspresioni vektori se konstruišu korišćenjem istog pristupa kao u (6-1). Četiri fragmenta od interesa se, svaki, amplifikuju korišćenjem PCR ((94°C u trajanju od 15 sec, 60°C u trajanju od 30 sec, i 68°C u trajanju od 20 sec) × 30 ciklusa) uz korišćenje fragmenata C i D, sledećih prajmera, i KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.).
Prajmeri za pripremanje D1G
Prajmer 17: 5'-
AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Prajmer 15
Prajmeri za pripremanje D1S
Prajmer 18: 5'-
AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Prajmer 15
Prajmeri za pripremanje D1E
Prajmer 19: 5'-
AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGAACCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Prajmer 15
Prajmeri za pripremanje D1SLI
Prajmer 20: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCTGATTCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3' Prajimer 15
[0208] Svaki od četiri amplifikovana fragmenta podvrgne se elektroforezi na agaroznom gelu. Zatim se željeni DNK fragment iseče sa gela, i DNK se pripremi korišćenjem QIAquick kompleta za ekstrakciju sa gela (Qiagen N.V.). Pripremljeni DNK fragment i pET 32a (Novagen) se, svaki, tretira restrikcionim enzimima BamHI (New England BioLabs Inc.) i XhoI (New England BioLabs Inc.) na 37°C, 1 sat ili duže. Posle elektroforeze na agaroznom gelu, željeni DNK fragmenti se iseku sa gela i prečiste korišćenjem QIAquick kompleta za prečišćavanje PCR proizvoda (Qiagen N.V.). Prečišćeni fragmenti reaguju preko noći na 16°C u reakciji ligacije uz korišćenje T4 DNK ligaze (New England BioLabs Inc.). Rastvor za ligaciju doda se u E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), i smeša se ostavi da stoji na ledu 30 minuta, zatim se tretira toplotom na 42°C u trajanju od 45 sekundi, ostavi da stoji na ledu još 5 minuta, i inokuliše na 2YT ploču koja sadrži 0.1 mg/ml ampicilina, što je praćeno kultivisanjem u statičnim uslovima preko noći na 37°C da bi se E. coli transformisala. Transformisana E. coli se kultiviše, i tada se izvode miniprep i sekvenciona analiza da se konstruiše "pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1G_S16A_Kex2", "pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1S_S16A_Kex2", "pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1E_S16A_Kex2", i "pET 32a_HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1SLI_S16A_Kex2". Operacija se izvodi u skladu sa postupkom opisanim u (1-1-1).
(6-3) Pripremanje derivata HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0209] E. coli Origami B (DE3) (Novagen) se transformiše svakim od pet vektora konstruisanih u (6-1) i (6-2), i kultiviše na 37°C uz korišćenje 2YT medijuma koji sadrži 0.1 mg/ml ampicilina. Tome se zatim doda IPTG (finalna koncentracija: 1 mM), i E. coli se kultiviše preko noći na 16°C. Sledećeg dana, posle sakupljanja centrifugiranjem (3,000 g, 20 min, 4°C), lizat se pripremi korišćenjem BugBuster Master smeše (Novagen), i His oznaka-fuzioni protein od interesa se prečisti korišćenjem TALON metal-afinitetne smole (Clontech Laboratories, Inc.). Zatim se tioredoksinska oznaka i željeni protein iseku korišćenjem Kex2 (pomenuto gore) i prečiste korišćenjem TALON. Rezultat toga se podvrgne hromatografskoj gel-filtraciji (Superdex 75 10/300 GL) ili reverzno faznoj hromatografiji (YMC-Pack ODS-AM) da se pripremi pet derivata HTRA1-inhibirajućeg peptida. Aminokiselinske sekvence derivata prikazane su u SEQ ID NO: 23 do 27 (Slike 35 do 39).
(6-4) Evaluacija derivata HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0210] Kao rezultat merenja HTRA1 (kat)-inhibitorne aktivnosti prema postupku opisanom u (3-1), svi derivati imali su inhibitornu aktivnost ekvivalentnu onoj H308 (Slika 11).
Primer 7. Evaluacija aktivnosti vezivanja HTRA1-inhibitornog peptida za HTRA1 (kat)
[0211] Aktivnost vezivanja evaluirana je postupkom imunoprecipitacije uz korišćenje tri HTRA1-inhibirajuća peptida (H308, H321AT, i H322AT) pripremljena u Primeru (1-2) i HTRA1 (kat) pripremljenog u (2-1). Po 2.5 µg svakog od HTRA1-inhibirajućih peptida i 10 µg HTRA1 (kat) reaguje na sobnoj temperaturi 30 minuta. Zatim se tome doda 10 µL TALON metal-afinitetne smole (Clontech Laboratories, Inc.). Posle dodatne reakcije u trajanju od 30 minuta, smola se preuzme kao imunoprecipitaciona (IP) frakcija i podvrgne SDS-PAGE da bi se evaluirala vezujuća aktivnost. U reakciji se koristi PBS kao pufer.
[0212] Kada svaki od tri HTRA1-inhibirajuća peptida ili HTRA1 (kat) reaguje sa TALON, traka samo His oznaka-fuzionisani HTRA1 (kat) detektuje se u ulaznoj liniji. Sa druge strane, traka svakog od inhibirajućih peptida i enzima detektuje se samo u IP liniji gde je inhibirajući peptid reagovao sa HTRA1 (kat). Prema tome, potvrđeno je da se svaki od tri HTRA1-inhibirajuća peptida vezuje za HTRA1 (kat).
Primer 8. Evaluacija HTRA1-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida
(8-1) Evaluacija HTRA1-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida korišćenjem peptidnog supstrata
[0213] Tri HTRA1-inhibitrajuća peptida (H308_D1G_S16A, H321AT_D1G_S16A, i H322AT_D1G_S16A) konstruisana u Primeru 6 evaluiraju se u pogledu HTRA1 (kat)- ili HTRA1 (potpun)-inhibitorne aktivnosti, uz korišćenje supstratnog peptida H2-Opt (n = 3). Supstratni peptid H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K) (Peptide Institute, Inc.: SEQ ID NO: 54, Slika 8) rastvori se u koncentraciji od 10 mM u DMSO, razblaži puferom za test (50 mM Tris, 150 mM NaCl, i 0.25% CHAPS, pH 8.0), i koristi u finalnoj koncentraciji od 10 µM. HTRA1 (HTRA1 (kat) ili HTRA1 (potpun); Primer 2) i svaki od HTRA1-inhibirajućih peptida razblaženih puferom za test pomešaju se u količini od po 25 µL i reaguju na 37°C 20 minuta. Zatim se tome doda 50 µL supstrata razblaženog puferom za test. Fluorescentni signal (ekscitacija na 328 nm/emisija na 393 nm) se meri korišćenjem Enspire (PerkinElmer, Inc.). Finalna koncentracija HTRA1 je 100 nM, i finalna koncentracija HTRA1-inhibirajućeg peptida je 1.875 do 1,000 nM. PROTEOSAVE(R) SS96F crna ploča (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) koristi se za reakciju i merenje.
[0214] Za svaku koncentraciju HTRA1-inhibirajućeg peptida izračuna se stopa razgradnje peptidnog supstrata. Kada se stopa razgradnje pri koncentraciji inhibitora od 0 nM definiše kao 100%, procenjuje se inhibitorna aktivnost svakog od HTRA-inhibirajućih peptida prema HTRA1 (kat) i HTRA1 (potpun).
[0215] Kao rezultat izračunavanja 50% inhibitorne koncnetracije (IC50) korišćenjem GraphPad Prism (verzija 5.0; GraphPad Software Inc.), nađeno je da svi HTRA1-inhibirajući peptidi inhibiraju enzimsku aktivnost HTRA1 (kat) i HTRA1 (potpun) pri niskoj koncentraciji (Slika 66).
HTRA1-inhibitorna aktivnost HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0216]
[Tabela 2]
IC50 (nM) za HTRA1 (kat) IC50 (nM) za HTRA1
(potpun) H308_D1G_S16A 7.9+1.3 9.1+1.4 H321AT_D1G_S16A 9.0+0.6 12.0±1.9 H322AT_D1G_S16A 12.9+0.2 12.2+2.2
(8-2) Evaluacija HTRA1-inhibitorne aktivnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida korišćenjem proteinskog supstrata
[0217] HTRA1-inhibitorna aktivnost HTRA1-inhibirajućeg peptida evaluirana je uz koriišćenje humanog vitronektina kao proteinskog supstrata. Operacija je pratila Primer (3-2).
[0218] Kao u (8-1), HTRA1-inhibirajući peptidi su snažno ispoljili inhibiciju HTRA1 (kat) kada je humani vitronektin upotrebljen kao supstrat (Slika 67).
(8-3) Evaluacija specifičnosti HTRA1-inhibirajućeg peptida
[0219] Specifičnost prema drugim proteazama evaluirana je korišćenjem sečenja supstratnog peptida kao indikatora. Postupak za goveđi tripsin, goveđi α-himotripsin, protein C, triptazu, himazu, trombin, plazmin, tPA, plazmin kalikrein, matriptazu, uPA, i HTRA2 pratio je postupak opisan u Primeru (3-3) (n = 3). Procedure merenja aktivnosti inhibicije drugih proteaza i kombinacije proteaza i supstrata bile su kako sledi.
[0220] PROTEOSAVE(R) SS96F crna ploča (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) korišćena je za reakciju i merenje. Svaka proteaza i svaki uzorak (finalna koncentracija: 1 µM) razblažen puferom za test pomešaju se u količini od po 25 µL i reaguju na 37°C 20 minuta. Zatim se tome doda 50 µL svakog supstrata razblaženog puferom za test. Fluorescentni signal se meri korišćenjem Enspire (PerkinElmer, Inc.).
[0221] Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog tripsina; 1 nM (finalna koncentracija) tripsin (Sigma-Aldrich Co. LLC; T6424) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Boc-VPR-AMC fluorogeni peptidni supstrat (R&D Systems, Inc.; ES011), fluorescentni signal: ekscitacija na 380 nm/emisija na 460 nm.
[0222] Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog himotripsina; 10 nM (finalna koncentracija) himotripsin (Sigma-Aldrich Co. LLC; C8946) i 10 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v), fluorescentni signal: ekscitacija na 380 nm/emisija na 460 nm.
[0223] Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog faktora XIIa; 100 nM (finalna koncentracija) faktor alfa-XIIa (Factor Alpha-XIIa, Enzyme Research Laboratories Inc.) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v), fluorescentni signal: ekscitacija na 380 nm/emisija na 460 nm.
[0224] Evaluacija aktivnosti inhibicije humane MMP-2; 1 nM (finalna koncentracija) triptaza (Calbiochem; PF023) i 100 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid MOCAx-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR (Peptide Institute, Inc.; 3226-v), fluorescentni signal: ekscitacija na 328 nm/emisija na 393 nm.
[0225] Evaluacija aktivnosti inhibicije humanog TPP1; 0.5 µg/mL (finalna koncentracija) TPP1 (Calbiochem; 2237-SE) i 200 µM (finalna koncentracija) supstratni peptid AAF-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3201-v), fluorescentni signal: ekscitacija na 380 nm/emisija na 460 nm.
[0226] Unakrsna reaktivnost sa proteazama različitim od HTRA1 evaluirana je korišćenjem razgradnje peptidnog supstrata kao indikatora. Nijedan HTRA1-inhibirajući peptid nije suprimirao proteaznu aktivnost neke od proteaza pri finalnoj koncentraciji od 1 µM, što je ukazalo da HTRA1-inhibirajući peptid ima HTRA1-specifičan inhibitorni efekat (Slika 68).
Primer 9. Evaluacija aktivnosti vezivanja HTRA1-inhibirajućeg peptida za HTRA1 (kat)
[0227] Vezujuća aktivnost evaluirana je postupkom imunoprecipitacije u skladu sa operacijom iz Primera 7, uz korišćenje tri HTRA1-inhibirajuća peptida pripremljena u Primeru 6 i HTRA1 (kat) pripremljenog u (2-1).
[0228] Kada je svaki od tri HTRA1-inhibirajuća peptida ili HTRA1 (kat) reagovao sa TALON, u ulaznoj liniji detektovana je samo traka His oznaka-fuzionisani HTRA1 (kat). Sa druge strane, traka svakog od inhibirajućeg peptida i enzima bila je detektovana samo u IP liniji gde je inhibirajući peptid reagovao sa HTRA1 (kat). Prema tome, potvrđeno je da se svaki od tri HTRA1-inhibirajuća enzima vezuje za HTRA1 (kat) (Slika 69).
[0229] Primer 10. Efekat zaštite retine ostvaruje se inhibicijom HTRA1 u modelu oštećenja retine pacova izazvanog izlaganjem svetlosti (deo 2)
[0230] Efekti zaštite retine tri HTRA1-inhibirajuća peptida pripremljena u Primeru 6 evaluirana su korišćenjem modela oštećenja retine pacova izazvanog izlaganjem svetlosti, konstruisanih u Primeru (5-1). Operacija je pratila Primer 5. n = 6 za sve grupe.
[0231] Rezultati patološkog evaluiranja retine prikazani su na Slici 70. Tri HTRA1-inhibirajuća peptida pokazala su upadljiv supresivni efekat na smanjenje broja nukleusa u spoljašnjem nukleusnom sloju, izazvano izlaganjem svetlosti.
[0232] Primer 11. Efekat zaštite ćelija pigmentnog epitela retine inhibicijom HTRA1 u modelu oštećenja retine kunića izazvanog ishranom sa visokim sadržajem masti, koja sadrži hidrohinon
(11-1) Pripremanje modela oštećenja retine kunića opterećenog ishranom sa visokim sadržajem masti, koja sadrži hidrohinon
[0233] Modeli oštećenja retine pripremljeni primenom ishrane sa visokim sadržajem masti (HFD) i hidrohinonom (HQ) su modeli u kojima se oksidativni stres indukuje prooksidansom da bi se iazazvalo oštećenje retine. Ovi modeli bili su prijavljeni samo za miševe (Diego G. Espinosa-Heidmann i sarad, (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci., tom 47 (br.2): str.729-737). Prema tome, 3 godine stari JW kunići hranjeni su 4 meseca RC4 ishranom (Oriental Yeast Co., Ltd.) koja sadrži 1.5% (m/v) kokosovog ulja-0.25% (m/v) holesterola-1.5% (m/v) ulja kikirikija-2.4% (m/v) hidrohinona (HFD-HQ) da bi se konstruisali modeli oštećenja retine kunića. Posle eutanazije, očne jabučice su izolovane, i prednji segment oka je uklonjen spoljnom incizijom od oko 5 mm od kornealnog limbusa. Zatim se izdvoji staklasto telo. Zatim se retina-horoidea-sklera fiksiraju uranjanjem u 4% (m/v) paraformaldehidni fiksativ, 24 sata ili duže. Posle fiksacije, horoidea se odvoji i imunooboji korišćenjem ZO-1 monoklonskog antitela (ZO-1 Monoclonal Antibody, ZO1-1A12) (Thermo Fisher Scientific Inc.; 33-9100) kao primarnog antitela i pilećeg antimišjeg IgG (H+L) unakrsno adsorbovanog sekundarnog antitela, Alexa Fluor 594 (Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594, Thermo Fisher Scientific Inc.; A-21201) kao sekundarnog antitela. Obojena horoidea se posmatra pod fluorescentnim mikroskopom (BZ-9000; Keyence Corp.). Određuje se površina obojenih ćelija pigmentnog epitela retine (RPE) da bi se evaluiralo oštećenje RPE ćelija.
[0234] Slika 71 prikazuje snimke obojenih RPE ćelija 12 nedelja starog kunića, 3 godine starog kunića i 3 godine starog kunića hranjenog HFD-HQ (Slika 71(A)) i grafikon prosečnih površina RPE ćelija (Slika 71(B)). Potvrđeno je da su RPE ćelije bile više hipertrofisane kod 3 godine starog kunića nego kod 12 nedelja starog kunića i da su dodatno hipertrofisane posle hranjenja sa HFD-HQ. Potvrđeno je da se oštećenje javlja u RPE ćelijama. Slične promene zapažene su i u očnim jabučicama pacijenata sa makularnom degeneracijom koja je u vezi sa starenjem (Ding JD i sarad, (2011) Proc Natl Acad Sci SAD., tom 108 (br.28): str.279-87).
(11-2) Porast nivoa ekspresije faktora C3 povezanog sa AMD u vreme oštećenja retine
[0235] Da bi se evaluirala ekspresija faktora koji je u vezi sa AMD, sakupljaju se tkiva retine i RPE/horoidee kunića koji su služili kao modeli oštećenja retine. iRNK se ekstrahuje korišćenjem RNeasy mini kompleta (RNeasy mini kit, Qiagen N.V.) i zatim podvrgne reakciji reverzne transkripcije uz korišćenje TaqMan master smeše za ekspresiju gena (TaqMan Gene Expression Master Mix, Thermo Fisher Scientific Inc.). Nivoi iRNK komponente 3 komplementa (C3) i βaktina kao unutrašnjeg standarda kvantitativno se analiziraju TaqMan testom ekspresije gena (TaqMan Gene Expression Assay, Oc03397832_g1 i Oc03824857_g1; Thermo Fisher Scientific Inc.) uz korišćenje 7900HT sistema za brzi PCR u realnom vremenu (7900HT Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems, Inc.). Analiza se obavlja sa n = 4 za kuniće stare 3 godine i n = 10 za kuniće stare 3 kodine hranjene sa HFD-HQ.
[0236] Nivoi ekspresije C3 u retini i u RPE ćelijama i horoidei prikazani su na Slici 71 (C) i (D). Za oba tkiva, potvrđeno je da se nivo ekspresije C3 povisio u grupi kunića kojima je davana HFD-HQ.
(11-3) Povišenje nivoa HTRA1 proteina u vreme oštećenja retine
[0237] Da bi se u modelima oštećenja retine kunića ispitala uključenost HTRA1, staklasto telo se sakupi iz modela kunića pripremljenih u (11-1), i enzimski digestira smešom tripsin/lizin-C (Trypsin/Lys-C Mix, Promega Corp.). Zatim se peptidni fragment HTRA1 kvantifikuje korišćenjem LC (EASY-nLC 1000; Thermo Fisher Scientific Inc.)-MS (TripleTOF 6600; AB Sciex Pte. Ltd). Nađeno je da je nivo HTRA1 proteina povišen u staklastom telu kunića kojima je davana HFD-HQ (Slika 71(E)). Na osnovu ovih rezultata potvrđene su hipertrofija RPE ćelija i povišena ekspresija faktora C3 povezanog sa AMD i HTRA1, što ukazuje da su modeli oštećenja retine pacova korisni u istraživanju bolesti retine povezanih sa starenjem.
(11-4) Zaštitini efekti HTRA1-inhibitora na retinu u modelu oštećenja retine kunića
[0238] Zaštitini efekat na retinu HTRA1-inhibirajućeg peptida H308 pripremljenog u Primeru 1 evaluiran je korišćenjem modela kunića. Dva meseca od početka hranjenja sa HFD-HQ, 50 µL H308 rastvora koncentracije 40 mg/mL primeni se intravitrealno u jedno oko, pod anestezijom. Normalni fiziološki rastvor se primeni intravitrealno u drugo oko. n = 5 za sve grupe.
[0239] Četiri meseca posle početka hranjenja, evaluira se hipertrofija RPE ćelija u modelživotinjama. Rezultati su prikazani na Slici 72. HTRA1 inhibitor ispoljio je supresivan efekat na hipertrofiju RPE ćelija, kako se vidi na osnovu oba indikatora, tj., prosečne površine RPE ćelija (Slika 72(A)) i broja hipertrofisanih RPE ćelija koje imaju površinu od 1500 µm<2>ili veću (Slika 72(B)). Kako je prikazano na Slici 71(E), porast HTRA1 potvrđen je u staklastom telu modela, što sugeriše uključenost HTRA1 u proces oštećenja RPE ćelija zbog unosa HFD-HQ. Prema tome, HTRA1-inhibirajući peptid je koristan kao sredstvo protiv makularne degeneracije povezane sa starenjem. Test je ukazao da je HTRA1-inhibirajući peptid koristan u prevenciji, posebno, suve makularne degeneracije povezane sa starenjem.
[0240] Prisustvo HTRA1-inhibirajućeg peptida potvrđeno je u retini normalnog kunića kojem je dat HTRA1-inhibirajući peptid, što ukazuje na visoko prodiranje HTRA1-inhibirajućeg peptida u tkivo.
[0241] Primer 12. Supresivni efekat HTRA1-inhibirajućeg peptida u testu indukcije VEGF iRNK uz korišćenje ćelija pigmentnog epitela retine čoveka, ARPE-19
[0242] ARPE-19 ćelije se kultivišu do konfluencije u 12 mm-skim Transwell sterilnim poliestarskim membranskim umecima sa porama od 0.4 µm (Pore Polyester Membrane Insert, Sterile, Corning Inc.) pod uslovima od 37°C i 5% CO2uz korišćenje DMEM/F-12 medijuma (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (FBS) i penicilinstreptomicin (Thermo Fisher Scientific Inc.). Zatim se ćelije kultivišu u DMEM/F-12 bez FBS, 5 dana. Gornjem i donjem sloju komore doda se H2O2(finalna koncentracija: 500 µM), i gornjem sloju komore doda se komplement normalnog humanog seruma (Quidel Corp.) (finalna koncentracija: 25%). U gornji i donji sloj komore dodaju se još i svaki od HTRA1 (Primer 2-2), inaktivni HTRA1 proteazni mutant HTRA1 (S328A) (Primer 2-3), ili HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1G_S16A (Primer 6), u finalnoj koncentraciji od 1 µM. Četiri sata kasnije, supernatant kulture se ukloni, i ćelije se isperu pomoću PBS. Zatim se iRNK ekstrahuje korišćenjem SuperPrep(TM) kompleta za lizu ćelija & RT za qPCR (SuperPrep(TM) Cell Lysis & RT Kit for qPCR, Toyobo Co., Ltd.) i podvrgne reakciji reverzne transkripcije. Nivo iRNK VEGF se kvantitativno analizira pomoću TaqMan testova za ekspresiju gena (Hs000900055_m1 i Hs02786624_g1; Thermo Fisher Scientific Inc.) korišćenjem 7900HT sistema za brzi PCR u realnom vremenu (Applied Biosystems, Inc.). GAPDH se koristi za korekciju nivoa iRNK.
[0243] Rezultati su prikazani na Slici 74. Dodavanje H2O2, komplementa normalnog humanog seruma i HTRA1 upadljivo povišava nivo iRNK za VEGF u poređenju sa uslovima koji uključuju dodavanje H2O2, komplementa normalnog humanog seruma i neaktivnog HTRA1 mutanta HTRA1 (S328A). Potvrđeno je da istovremeno dodavanje HTRA1-inhibirajućeg peptida H308_D1G_S16A suprimira ekspresiju VEGF. Indukcija VEGF u ćelijama pigmentnog epitela retine je, kako je saopšteno, važna za patogenezu vlažne makularne degeneracije povezane sa starenjem (Klettner A. i sarad, (2009) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol., tom 247: str. 1487-1492). Pored toga, smatra se da je takva morbidna indukcija VEGF uključena ne samo u patogenezu nego i u održavanje patološkog stanja. Prema tome, primena peptida predmetnog pronalaska kao što je HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1G_S16A efikasna je u prevenciji i lečenju vlažne makularne degeneracije povezane sa starenjem.
[0244] Primer 13. Supresivni efekat HTRA1-inhibirajućeg peptida H308_D1G_S16A na migraciju endotelskih ćelija umbilikalne vene čoveka (HUVEC).
(13-1) Test migracije HUVEC
[0245] HUVEC (Kurabo Industries Ltd.) kultivišu se 18 sati pod uslovima od 37°C i 5% CO2u medijumu (EGM bez seruma, koji sadrži 0.1% BSA) u kojem je osnovni EBM(TM)-2 medijum (Lonza Walkersville, Inc.) koji sadrži 0.1% BSA dopunjen sa EGM(TM)-2 SingleQuots(TM) setom dodatnih faktora, osim seruma i VEGF. Zatim se broj ćelija podesi na 4 × 10<5>ćelija/mL pomoću 0.1% BSA-sadržavajućeg EGM bez seruma.4 × 10<5>ćelija/mL HUVEC suspenzije doda se u količini od 50 µL/bunarčiću gornjem sloju komore Corning FluoroBlok HTS permeabilnim potpornim sistemom za 96 bunarčića sa 3.0 µm PET membranom visoke gustine (Corning FluoroBlok HTS 96 Well Multiwell Permeable Support System with a 3.0 µm High Density PET Membrane, Corning Inc.) pri čemu je membrana obložena želatinom. Zatim se svaki uzorak opisan u nastavku ovog teksta (medijum 1, 2 ili 3) doda u količini od 210 µL/bunarčiću donjem sloju komore (n = 3). EGM sa 0.1% BSA, bez seruma, doda se u količini od 50 µL/bunarčiću gornjem sloju komore, bez dodavanja HUVEC, i 0.1% EGM sa 0.1% BSA, bez seruma, doda se u količini od 210 µL/bunarčiću u donji sloj komore (n = 3).
Medijum 1; EGM koji sadrži 0.1% BSA, bez seruma
Medijum 2; EBM(TM)-2 medijum dopunjen svim EGM(TM)-2 SingleQuots(TM) dodatnim faktorima (EGM medijum za rast)
Medijum 3; EGM medijum za rast koji sadrži 300 nM H308_D1G_S16A
[0246] FluoroBlok HTS permeabilni potporni sistem za 96 bunarčića dopunjen ćelijama i uzorkom, inkubira se 2 sata pod uslovima od 37°C i 5% CO2. HUVEC koje su migrirale u donji sloj isperu se pomoću PBS i zatim boje 15 minuta korišćenjem 0.1% BSA-sadržavajućeg EGM bez seruma, koji sadrži 4 µg/mL Calcein-AM (Thermo Fisher Scientific Inc.). Zatim se medijum zameni sa PBS. Intenzitet fluorescencije (talasna dužina ekscitacije/talasna dužina fluorescencije: 485 nm/535 nm) svakog bunarčića meri se korišćenjem čitača ploča (ARVO-MX, PerkinElmer, Inc.), i ćelije koje su migrirale broje se za svaki bunarčić prema sledećem izrazu. Ćelije koje su migrirale = srednja vrednost intenziteta fluorescencije bunarčića koji sadrže HUVEC (n = 3) – srednja vrednost intenziteta fluorescencije bunarčića koji sadrže praznu probu (n = 3).
[0247] Rezultati su prikazani na Slici 75. Potvrđeno je da HTRA1-inhibirajući peptid H308_D1G_S16A ima supresivan efekat na migraciju HUVEC indukovanu u medijumu koji sadrži serum. Prema tome, nađeno je da peptid predmetnog pronalaska ispoljava supresivan efekat na angiogenezu, koja je odlika vlažne makularne degeneracije povezane sa starenjem.
Primer 14. Zaštitni efekat HTRA1-inhibirajućeg peptida na retinu u modelu oštećenja retine kunića (deo 2)
[0248] HTRA1-inhibirajući peptid H308 pripremljen u Primeru 1 ili jedan od tri HTRA1-inhibirajuća peptida pripremljena u Primeru 6 evaluiraju se u pogledu terapijskog efekta na oštećenje retine, korišćenjem modela oštećenja retine kunića pripremljenih i evaluiranih u Primerima (11-1) do (11-3).50 µL rastvora inhibirajućeg peptida koncentracije 40 mg/mL primeni se intravitrealno u jedno oko svake model-životinje pod anestezijom i životinja se gaji 2 meseca. Normalni fiziološki rastvor se intravitrealno primeni u drugo oko. n = 5 za sve grupe.
[0249] Povećanje površine RPE ćelija ili porast broja RPE ćelija trebalo bi da se utvrdi u grupi kod koje je primenjen normalni fiziološki rastvor, dok bi povećanje površine RPE ćelija ili porast broja RPE ćelija trebalo da bude suprimirano u grupi u kojoj je primenjen HTRA1-inhibirajući peptid. Prema tome, može se potvrditi da je HTRA1-inhibirajući peptid korisno sredstvo protiv makularne degeneracije povezane sa starenjem. U ovom Primeru, može se potvrditi da je HTRA1-inhibirajući peptid koristan u lečenju suve makularne degeneracije povezane sa starenjem, posebno.
Industrijska primenljivost
[0250] Peptid obezbeđen predmetnim pronalaskom, i farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid korisni su u lečenju ili prevenciji, itd. makularne degeneracije povezane sa starenjem i slično.
Slobodan tekst liste sekvenci
[0251]
SEQ ID NO: 1 – Aminokiselinska sekvenca humanog SPINK2 (Slika 13)
SEQ ID NO: 2 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu humanog SPINK2 (Slika 14)
SEQ ID NO: 3 - Aminokiselinska sekvenca peptida H218 (Slika 15)
SEQ ID NO: 4 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H218 (Slika 16)
SEQ ID NO: 5 - Aminokiselinska sekvenca peptida H223 (Slika 17)
SEQ ID NO: 6 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H223 (Slika 18)
SEQ ID NO: 7 - Aminokiselinska sekvenca peptida H228 (Slika 19)
SEQ ID NO: 8 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H228 (Slika 20)
SEQ ID NO: 9 - Aminokiselinska sekvenca peptida H308 (Slika 21)
SEQ ID NO: 10 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H308 (Slika 22)
SEQ ID NO: 11 - Aminokiselinska sekvenca peptida H321 (Slika 23)
SEQ ID NO: 12 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H321 (Slika 24)
SEQ ID NO: 13 - Aminokiselinska sekvenca peptida H322 (Slika 25)
SEQ ID NO: 14 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida H322 (Slika 26)
SEQ ID NO: 15 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H308AT (Slika 27) SEQ ID NO: 16 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptidnog derivata H308AT (Slika 28)
SEQ ID NO: 17 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H321AT (Slika 29) SEQ ID NO: 18 -Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptidnog derivata H321AT (Slika 30)
SEQ ID NO: 19 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H322AT (Slika 31) SEQ ID NO: 20 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptidnog derivata H322AT (Slika 32)
SEQ ID NO: 21 - Aminokiselinska sekvenca peptida M7 (Slika 33)
SEQ ID NO: 22 - Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu peptida M7 (Slika 34)
SEQ ID NO: 23 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H308_S16A (Slika 35) SEQ ID NO: 24 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H308_D1G_S16A (Slika 36)
SEQ ID NO: 25 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H308_D1S_S16A (Slika 37)
SEQ ID NO: 26 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H308_D1E_S16A (Slika 38)
SEQ ID NO: 27 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H308_D1SLI_S16A (Slika 39)
SEQ ID NO: 28 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H321AT_D1G_S16A (Slika 40)
SEQ ID NO: 29 - Aminokiselinska sekvenca peptidnog derivata H322AT_D1G_S16A (Slika 41)
SEQ ID NO: 30 – Opšta formula HTRA1-inhibirajućeg peptida (Slika 42)
SEQ ID NO: 31 - Aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od S oznake i linkera (Slika 43)
SEQ ID NO: 32 - Aminokiselinska sekvenca C-terminalnog heksamera (Slika 44)
SEQ ID NO: 33 - Nukleotidna sekvenca prajmera 1 (Slika 45)
SEQ ID NO: 34 - Nukleotidna sekvenca prajmera 2 (Slika 46)
SEQ ID NO: 35 - Nukleotidna sekvenca prajmera 3 (Slika 47)
SEQ ID NO: 36 - Nukleotidna sekvenca prajmera 4 (Slika 48)
SEQ ID NO: 37 - Nukleotidna sekvenca prajmera 5 (Slika 49)
SEQ ID NO: 38 - Nukleotidna sekvenca prajmera 6 (Slika 50)
SEQ ID NO: 39 - Nukleotidna sekvenca prajmera 7 (Slika 51)
SEQ ID NO: 40 - Nukleotidna sekvenca prajmera 8 (Slika 52)
SEQ ID NO: 41 - Nukleotidna sekvenca prajmera 9 (Slika 53)
SEQ ID NO: 42 - Nukleotidna sekvenca prajmera 10 (Slika 54)
SEQ ID NO: 43 - Nukleotidna sekvenca prajmera 11 (Slika 55)
SEQ ID NO: 44 - Nukleotidna sekvenca prajmera 12 (Slika 56)
SEQ ID NO: 45 - Nukleotidna sekvenca prajmera 13 (Slika 57)
SEQ ID NO: 46 - Nukleotidna sekvenca prajmera 14 (Slika 58)
SEQ ID NO: 47 - Nukleotidna sekvenca prajmera 15 (Slika 59)
SEQ ID NO: 48 - Nukleotidna sekvenca prajmera 16 (Slika 60)
SEQ ID NO: 49 - Nukleotidna sekvenca prajmera 17 (Slika 61)
SEQ ID NO: 50 - Nukleotidna sekvenca prajmera 18 (Slika 62)
SEQ ID NO: 51 - Nukleotidna sekvenca prajmera 19 (Slika 63)
SEQ ID NO: 52 - Nukleotidna sekvenca prajmera 20 (Slika 64)
SEQ ID NO: 53 - Aminokiselinska sekvenca humanog HTRA1 (potpun) (Slika 65) SEQ ID NO: 54 - Aminokiselinska sekvenca H2-Opt (Slika 8)
SEQ ID NO: 55 - Nukleotidna sekvenca prajmera 21 (Slika 76)
SEQ ID NO: 56 - Nukleotidna sekvenca prajmera 22 (Slika 77)

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. SPINK2 mutantni peptid koji inhibira proteaznu aktivnost humanog HTRA1 pri čemu peptid sadrži:
(a) aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kojoj od SEQ ID NO (SEK ID BROJEVI): 24, 23, 25 do 27, 9, 15, 3, 5, 7, 11, 13, 17, 19, 21, 28 i 29 (Slike 36, 35, 37 do 39, 21, 27, 15, 17, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 40 i 41); ili
(b) aminokiselinsku sekvencu koja je izvedena iz aminokiselinske sekvence (a) delecijom 1 do 15 amino-kiselina.
2. Polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu sadržanu u peptidu prema patentnom zahtevu 1.
3. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 2.
4. Ćelija koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 2 ili vektor prema patentnom zahtevu 3 ili koja proizvodi peptid prema patentnom zahtevu 1.
5. Postupak za proizvodnju SPINK2 mutantnog peptida koji inhibira proteaznu aktivnost HTRA1, koji uključuje sledeće korake (i) i (ii):
(i) kultivisanje ćelije prema patentnom zahtevu 4; i
(ii) preuzimanje SPINK2 mutantnog peptida iz kulture.
6. Konjugat koji sadrži peptid prema patentnom zahtevu 1 ili peptid proizveden prema patentnom zahtevu 5 spojen sa dodatnim segmentom.
7. Konjugat prema patentnom zahtevu 6, koji je polipeptid.
8. Postupak prema patentnom zahtevu 5, pri čemu preuzimanje SPINK2 mutantnog peptida uključuje afinitetno prečišćavanje uz upotrebu antitela, ili njegovog funkcionalnog fragmenta, koji se vezuje za peptid.
9. Kompozicija koja sadrži peptid prema patentnom zahtevu 1, peptid proizveden prema patentnom zahtevu 5, polinukleotid prema patentnom zahtevu 2, vektor prema patentnom zahtevu 3, ćeliju prema patentnom zahtevu 4, i/ili konjugat prema patentnom zahtevu 6 ili 7.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid prema patentnom zahtevu 1, peptid proizveden prema patentnom zahtevu 5, polinukleotid prema patentnom zahtevu 2, vektor prema patentnom zahtevu 3, ćeliju prema patentnom zahtevu 4, i/ili konjugat prema patentnom zahtevu 6 ili 7.
11. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, za primenu u lečenju ili prevenciji bolesti povezane sa HTRA1, pri čemu bolest povezana sa HTRA1 je jedna ili dve ili više bolesti odabranih iz grupe koja se sastoji od vlažne makularne degeneracije povezane sa starenjem, suve makularne degeneracije povezane sa starenjem, geografske atrofije, dijabetične retinopatije, retinopatije kod prevremeno rođenih, polipoidne horoidne vaskulopatije, reumatoidnog artritisa, i osteoartritisa.
12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 ili farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 11, koja sadrži jedan ili dva ili više dodatnih medikamenata.
13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 ili farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 11, koja se koristi u kombinaciji sa jednim ili dva ili više dodatnih medikamenata.
14. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 10, 12 ili 13, ili farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kojem od patentnih zahteva 11 do 13, koja je sredstvo za zaštitu retine.
RS20231250A 2016-12-22 2017-12-21 Peptid za lečenje makularne degeneracije povezane sa starenjem RS65011B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016249020 2016-12-22
PCT/JP2017/046044 WO2018117244A1 (ja) 2016-12-22 2017-12-21 加齢黄斑変性症治療用ペプチド
EP17884396.7A EP3561056B1 (en) 2016-12-22 2017-12-21 Peptide for treating age-related macular degeneration

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65011B1 true RS65011B1 (sr) 2024-01-31

Family

ID=62626691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231250A RS65011B1 (sr) 2016-12-22 2017-12-21 Peptid za lečenje makularne degeneracije povezane sa starenjem

Country Status (27)

Country Link
US (2) US20200377573A1 (sr)
EP (1) EP3561056B1 (sr)
JP (1) JP7019600B2 (sr)
KR (1) KR102591737B1 (sr)
CN (1) CN110234760B (sr)
AU (1) AU2017384348B2 (sr)
BR (1) BR112019012635A2 (sr)
CA (1) CA3047893C (sr)
CO (1) CO2019006443A2 (sr)
DK (1) DK3561056T5 (sr)
ES (1) ES2966319T3 (sr)
FI (1) FI3561056T3 (sr)
HR (1) HRP20231731T1 (sr)
HU (1) HUE065322T2 (sr)
IL (1) IL267569B2 (sr)
LT (1) LT3561056T (sr)
MX (1) MX2019007326A (sr)
MY (1) MY204884A (sr)
PH (1) PH12019501459A1 (sr)
PL (1) PL3561056T3 (sr)
PT (1) PT3561056T (sr)
RS (1) RS65011B1 (sr)
SI (1) SI3561056T1 (sr)
SM (1) SMT202400018T1 (sr)
TW (1) TWI774717B (sr)
WO (1) WO2018117244A1 (sr)
ZA (1) ZA201904051B (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3680335A4 (en) 2017-09-07 2021-12-08 Daiichi Sankyo Company, Limited PEPTIDES AS INHIBITORS OF KLK1, KLK4 OR KLK4 AND KLK8
TWI906202B (zh) * 2018-06-21 2025-12-01 日商第一三共股份有限公司 視網膜色素變性治療用胜肽之用途
WO2020095922A1 (ja) 2018-11-07 2020-05-14 第一三共株式会社 ペプチドの血中動態改善方法
JP6888175B2 (ja) * 2018-11-07 2021-06-16 第一三共株式会社 Ｋｌｋ５阻害ペプチド

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL152900A0 (en) * 2002-11-17 2003-06-24 Yeda Res & Dev Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses
US7745389B2 (en) * 2005-02-14 2010-06-29 University Of Iowa Research Foundation Methods for treatment of age-related macular degeneration
ES2391788T3 (es) * 2006-07-26 2012-11-29 Yale University, Inc. Diagnóstico y tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad
CN101173314B (zh) * 2006-10-18 2010-12-01 四川省医学科学院（四川省人民医院） 检测老年黄斑变性疾病的试剂盒
WO2009046405A2 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 University Of Utah Research Foundation Antibodies to htra1 and methods of using the same
CN101550451B (zh) * 2008-03-04 2011-08-31 四川省医学科学院（四川省人民医院） 检测老年黄斑变性疾病的试剂盒
JP6017317B2 (ja) 2011-02-02 2016-10-26 第一三共株式会社 ペプチド・ライブラリー
BR112013023724A2 (pt) * 2011-03-15 2019-09-24 Univ Utah Res Found métodos para tratar doença ou sintoma, detriagem para um agente ou uma combinação de agentes, e para determinar a eficácia de um agente e de um tratamento
BR112014008862A2 (pt) * 2011-10-14 2018-08-07 Genentech Inc anticorpo isolado que se liga à htra1, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, imunoconjugado, formulação farmacêutica, métodos e usos
US10550154B2 (en) * 2012-08-08 2020-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Peptide library and use thereof
EP2956096A1 (en) * 2013-02-15 2015-12-23 Allergan, Inc. Sustained drug delivery implant
HK1219654A1 (zh) * 2013-02-22 2017-04-13 University Of Southern California 用於治疗眼科疾病和病症的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110234760A (zh) 2019-09-13
CO2019006443A2 (es) 2019-06-28
TW201840589A (zh) 2018-11-16
IL267569A (sr) 2019-08-29
SMT202400018T1 (it) 2024-03-13
US20240294610A1 (en) 2024-09-05
EP3561056A4 (en) 2020-09-02
PT3561056T (pt) 2023-12-07
EP3561056A1 (en) 2019-10-30
JPWO2018117244A1 (ja) 2019-10-31
IL267569B1 (en) 2024-01-01
RU2019122837A3 (sr) 2021-11-01
JP7019600B2 (ja) 2022-02-15
SI3561056T1 (sl) 2024-02-29
IL267569B2 (en) 2024-05-01
RU2019122837A (ru) 2021-01-22
FI3561056T3 (fi) 2024-01-15
DK3561056T3 (da) 2024-01-22
BR112019012635A2 (pt) 2019-11-19
MY204884A (en) 2024-09-20
TWI774717B (zh) 2022-08-21
CN110234760B (zh) 2024-08-06
PL3561056T3 (pl) 2024-02-12
EP3561056B1 (en) 2023-10-25
HUE065322T2 (hu) 2024-05-28
DK3561056T5 (da) 2024-09-02
HRP20231731T1 (hr) 2024-05-10
LT3561056T (lt) 2023-12-11
CA3047893A1 (en) 2018-06-28
KR102591737B1 (ko) 2023-10-20
WO2018117244A1 (ja) 2018-06-28
KR20190095925A (ko) 2019-08-16
CA3047893C (en) 2022-11-15
AU2017384348B2 (en) 2024-03-07
ZA201904051B (en) 2022-12-21
US20200377573A1 (en) 2020-12-03
ES2966319T3 (es) 2024-04-19
AU2017384348A1 (en) 2019-07-04
PH12019501459A1 (en) 2020-02-10
MX2019007326A (es) 2019-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240294610A1 (en) Peptide for treating age-related macular degeneration
JP7394181B2 (ja) Ｋｌｋ５阻害剤及びその製造方法
CA2906775A1 (en) Bh4 stabilized peptides and uses thereof
US20240270803A1 (en) Peptide for treating retinitis pigmentosa
RU2788083C2 (ru) Пептид для лечения возрастной макулярной дегенерации
CA3104280C (en) Peptide for treating retinitis pigmentosa
HK40014718A (en) Peptide for treating age-related macular degeneration
HK40014718B (en) Peptide for treating age-related macular degeneration
HK40041621A (en) Peptide for treating retinitis pigmentosa