RS57837B1 - Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama - Google Patents

Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama

Info

Publication number
RS57837B1
RS57837B1 RS20181302A RSP20181302A RS57837B1 RS 57837 B1 RS57837 B1 RS 57837B1 RS 20181302 A RS20181302 A RS 20181302A RS P20181302 A RSP20181302 A RS P20181302A RS 57837 B1 RS57837 B1 RS 57837B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dna
polymorphisms
fetal
sequence
sample
Prior art date
Application number
RS20181302A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard P Rava
Brian K Rhees
John P Burke
Original Assignee
Verinata Health Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46001809&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57837(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Verinata Health Inc filed Critical Verinata Health Inc
Publication of RS57837B1 publication Critical patent/RS57837B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B45/00—ICT specially adapted for bioinformatics-related data visualisation, e.g. displaying of maps or networks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Algebra (AREA)

Description

Opis pronalaska
STANJE TEHNIKE
[0001] Otkriće fetalne DNK koja slobodno pluta u krvi majke (ponekada označene kao "DNK oslobođena od ćelija" ili "cfDNK") dozvoljava mogućnost detekcije hromozomske abnormalnosti, aneuploidije i aberacije iz uzoraka krvi. Frakciona zastupljenost fetalne DNK u plazmi krvi majke nije konstantna i varira u zavisnosti od raznih faktora uključujući način rukovanja uzorcima i doba gestacije.
[0002] Kada se za identifikaciju hromozomskih aberacija ili genetskih defekata upotrebljava sekvenciranje DNK, važno je znati relativnu zastupljenost fetalne DNK u ukupnoj populaciji DNK. Na primer, kada je fetalna frakcija poznata, snaga statističke analize (verovatnoća identifikacije anomalnih slučajeva ili senzitivnost) može biti izračunata permutacijama ili putem integracije linearnih kombinacija ili konvolucije necentriranih F distribucija od alfa do beskonačnosti, pri čemu alfa kao kritični nivo ukazuje na značajnost (najveću verovatnoću pogrešnog imenovanja anomalije) populacije rezultata uz postavljenu nultu hipotezu da nema aberacije.
[0003] Patentni spis US 7,332,277 obezbeđuje postupak detekcije prisustva ili odsustva fetalne hromozomske abnormalnosti kvantifikacijom odnosa relativnih količina alela heterozigotnog lokusa od interesa.
[0004] Nedostatak postojećih postupaka za detekciju fetalne frakcije je što se oni oslanjaju na merenja zastupljenosti polih hromozoma (koje se mogu upotrebljavati samo za pouzadno merenje relativne zastupljenosti muške embrionalne DNK) ili iRNK sekvenci gena za koje je poznato da se različito eksprimiraju u tkivu trudne individue i embrionalnom tkivu (gena čija ekspresija varira u zavisnosti od doba gestacije ili drugih faktora).
[0005] Procena fetalne frakcije može biti tegobna zbog nekoliko ometajućih faktora, uklјučujući: parametre etničkih diferencijalnih populacionih genetika roditelja i grešaka u sekvenciranju. Stoga, poželјno je imati na raspolaganju postupke koji su robusni, odnosno uzimaju u obzir prisustvo navedenih ili drugih ometajućih faktora koji se uobičajeno javljaju.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0006] Pronalazak obezbeđuje postupak procenjivanja frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue, postupak koji obuhvata:
(a) mapiranje segmenata DNK dobijenih iz telesne tečnosti trudne individue na osnovu mnoštva polimorfizama sekvenci, pri čemu je DNK sekvencirana pod uslovima koji identifikuju mnoštvo polimorfizama sekvenci;
(b) određivanje učestalosti alela mapiranih nukleinskih kiselina za svaki od mnoštva polimorfizama sekvenci; i
(c) primenu učestalosti alela u model verovatnoće distribucije u mešavini da bi se procenila frakcija fetalne DNK u DNK dobijenoj iz krvi individue koja nosi fetus,
pri čemu se (b)-(c) obavlјaju u okviru jednog ili više procesora koji rade po programskim uputstvima za određivanje i primenu.
[0007] Određeni prijavljeni primeri izvođenja se odnose na računske postupke pouzdanog merenja relativne zastupljenosti fetalne DNK koja slobodno pluta sekvenciranjem uzorka krvi majke.
[0008] U specifičnim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupke pouzdanog procenjivanja fetalne frakcije na osnovu polimorfizama kao što su male varijacije u tipu baza ili insercije/delecije, postupke koji su robusni u odnosu na etničku pripradnost roditelja, pol embriona, doba gestacije i druge sredinske faktore. Mnogi primeri koji su ovde prijavljeni upotrebljavaju SNP-ove kao relevantne polimorfizme. Pronalazak se može primeniti kao deo osmišljenog, prethodno dizajniranog istraživanja resekvenciranja usmerenog ka identifikaciji poznatih polimorfizama ili može biti upotrebljen u retrospektivnoj analizi varijacija koje su utvrđene po principu slučajnosti u preklapajućim sekvencama dobijenim iz plazme majke (ili u okviru bilo koje druge postavke u kojoj je prisutna mešavina DNK iz nekoliko lјudi).
[0009] Predmetni dokument predstavlјa tehnike procenjivanja frakcione zastupljenosti fetalne DNK u uzorcima krvi majke. Određene tehnike koje su opisane upotrebljavaju uočene učestalosti alela sa SNP-ovima koji su utvrđeni po principu slučajnosti ili se nalaze u panelima prethodno poznatih SNP-ova konstruisanih u svrhu procene fetalne frakcije.
[0010] Iako pronalazak koji je ovde okarakterisan patentnim zahtevima uzima u obzir procenjivanje frakcije fetalne nukleinske kiseline u uzorku, prijava nije time ograničena. Tehnike i aparati koji su ovde opisani se mogu upotrebiti u mnogim slučajevima procene frakcije nukleinske kiseline iz jednog genoma u mešavini dva genoma koji mogu ili ne moraju biti u odnosu kao što su to genomi roditelja i deteta.
[0011] Određeni aspekti prijave se odnose na postupke procenjivanja frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue. Navedene postupke mogu karakterisati sledeći operativni postupci: (a) primanje uzorka telesne tečnosti; (b) ekstrakcija DNK iz uzorka pod uslovima kojima se ekstrahuju DNK i genoma majke i fetalnog genoma koji su prisutni u telesnoj tečnosti; (c) sekvenciranje ekstrahovane DNK upotrebom sekvencera nukleinskih kiselina u uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenata u kojima su prisutni jedan ili više polimorfizama; (d) mapiranje sekvenci DNK segmenta sa jednim ili sa više određenih polimorfizama, izvedenih iz sekvenciranja DNK u telesnoj tečnosti, na referentnoj sekvenci; (e) određivanje učetalosti alela mapiranih sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od naznačenih polimorfizama; (f) klasifikacija najmanje jednog naznačenog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa; i (g) procenjivanje frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz trudne individue upotrebom učestalosti alela utvrđenih u (e) i kombinacije zigotnosti iz (f).
[0012] Mapiranje se može obaviti upotrebom računarskog uređaja programiranog da mapira sekvence nukleinskih kiselina na osnovu jednog ili više naznačenih polimorfizama. U principu, bilo koja od operacija (d)-(g) može biti sprovedena u okviru jednog ili više procesora koji rade po programskim uputstvima.
[0013] U određenim primerima izvođenja, DNK dobijena iz telesne tečnosti trudne individue je DNK oslobođena od ćelija koja je dobijena iz plazme trudne individue. Uobičajeno je da se sekvenciranje sprovodi bez selektivne amplifikacije bilo kog od jednog ili više određenih polimorfizama.
[0014] U određenim primerima izvođenja, mapiranje DNK segmenata dobijenih iz krvi individue koja nosi fetus obuhvata računarsko mapiranje segmenata upotrebom baze podataka polimorfizama. U određenim primerima izvođenja, klasifikacija u okviru postupka (f) klasifikuje najmanje jedan određeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotan, (ii) trudna individua je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudna individua je heterozigotna i fetus je homozigotan i (iv) trudna individua je heterozigotna i fetus je heterozigotan.
[0015] Mogu biti upotrebljene razne operacije filtriranja podataka. One uklјučuju, na primer, uklanjanje iz razmatranja bilo kog polimorfizma koji je klasifikovan kao kombinacija (i) ili kombinacija (iv). U drugom primeru, postupci dalјe uklјučuju filtriranje najmanje jednog naznačenog polimorfizma kako bi se iz razmatranja uklonio bilo koji polimorfizam koji ima učestalost ređeg alela veću od definisanog praga. U još jednom primeru, postupci uklјučuju filtriranje najmanje jednog naznačenog polimorfizma kako bi se iz razmatranja uklonio bilo koji polimorfizam koji ima učestalost ređeg alela manju od definisanog praga.
[0016] Operacija klasifikacije može biti primenjena na razne načine. Na primer, može uklјučivati postavljanje praga za učestalost alela koja je utvrđena u (e). U drugom primeru, operacija klasifikacije podrazumeva primenu podataka o učestalosti alela iz (e) koji su dobijeni za mnoštvo polimorfizama u model verovatnoće distribucije u mešavini. U jednom primeru primene, model distribucije u mešavini koristi faktorske momente.
[0017] Fetalna frakcija koja je utvrđena kao što je ovde opisano, može biti upotrebljena za razne primene. U pojedinim primerima, postupci koji su ovde opisani uklјučuju rad jednog ili više procesora po uputstvima izvršnog programa kako bi se frakcija fetalne DNK koja je utvrđena u (g) automatski snimila u medicinski karton trudne individue i sačuvala na medijumu koji može biti očitan od strane kompjutera. Medicinsku dokumetaciju pacijenta mogu voditi laboratorija, kancelarija ordinirajućeg lekara, bolnica, zdravstvena organizacija, osiguravajuće drušvo ili služba internet stranice za lične medicinske kartone. U drugoj primeni, procena frakcije fetalne DNK se upotrebljava da bi se propisao, započeo i/ili promenio tretman humanog subjekta iz koga je uzet uzorak majke za ispitivanje. U sledećoj primeni, procena frakcije fetalne DNK se upotrebljava za naručivanje i/ili izvođenje jednog ili više dodatnih testova.
[0018] Naredni aspekt prijave se odnosi na aparaturu za procenu frakcije fetalne DNK u DNK koja je dobijena iz telesne tečnosti trudne individue. Navedenu aparaturu mogu karakterisati sledeći uređaji: (a) sekvencer konfigurisan da (i) prima DNK ekstrahovanu iz uzorka telesne tečnosti koja sadrži DNK i genoma majke i fetalnog genoma, i (ii) sekvencira ekstrahovanu DNK pod uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenta u kojima je prisutan jedan ili više naznačenih polimorfizama; i (b) računarski uređaj konfigurisan tako da (npr. programiran tako da) šalje uputstva na jedan ili više procesora za izvođenje raznih operacija kao što su one koje su ovde opisane, a putem dva ili više operativnih postupaka. U pojedinim primerima izvođenja, računarski uređaj je konfigurisan da (i) mapira sekvence nukleinskih kiselina upotrebom jednog ili više naznačenih polimorfizama referentne sekvence, (ii) utvrđuje učestalosti alela mapiranih sekvenci DNK segmenata sa najmanje jednim od naznačenih polimorfizama, (iii) klasifikuje najmanje jedan naznačeni polimorfizam na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa i (iv) procenjuje frakciju fetalne DNK u DNK dobijenoj iz trudne individue upotrebom učestalosti alela i kombinacije zigotnosti.
[0019] U određenim primerima izvođenja, aparatura takođe sadrži opremu za ekstrakciju DNK iz uzorka pod uslovima pod kojim se ekstrakuju DNK i genoma majke i fetalnog genoma. U pojedinim primerima izvođenja, aparatura uključuje modul konfigurisan da ekstrahuje DNK oslobođenu od ćelija koja se dobija iz plazme trudne individue radi sekvenciranja u sekvenceru.
[0020] U pojedinim primerima, aparatura uključuje bazu podataka polimorfizama. Računarski aparat može dalјe biti konfigurisan tako da šalje uputstva na jedan ili više procesora da bi se mapirali segmenti DNK dobijeni iz krvi osobe koji nosi fetus, računskim mapiranjem segmenata u bazi podataka polimorfizama. Sekvence u bazi podataka su primer referentne sekvence. Drugi primeri referentnih sekvenci su predstavlјeni u nastavku teksta.
[0021] U određenim primerima izvođenja, računarski uređaj je dalјe konfigurisan tako da šalje uputstva na jedan ili više procesora da bi se klasifikovao najmanje jedan naznačeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotan, (ii) trudna individua je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudna individua je heterozigotna i fetus je homozigotan i (iv) trudna individua je heterozigotna i fetus je heterozigotan. U pojedinim primerima izvođenja, računarski uređaj je dalјe konfigurisan tako da šalje uputstva na jedan ili više procesora kako bi se iz razmatranja uklonio bilo koji polimorfizam klasifikovan u kombinaciju (i) ili kombinaciju (iv).
[0022] U određenim primerima izvođenja, računarski uređaj je dalјe konfigurisan da šalje uputstva na jedan ili više procesora da bi se iz razmatranja uklonio bilo koji polimorfizam sa učestalošću ređeg alela većom od definisanog praga. U pojedinim primerima izvođenja, računarski uređaj je dalјe konfigurisan da šalje uputstva na jedan ili više procesora zarad filtriranja jednog ili više naznačenih polimorfizama da bi se iz razmatranja uklonio bilo koji polimorfizam sa učestalošću ređeg alela manjom od definisanog praga. U određenim primerima izvođenja, računarski uređaj je dalje konfigurisan da šalje uputstva na jedan ili više procesora zarad klasifikacije najmanje jednog određenog polimorfizma upotrebom praga za učestalost alela.
[0023] U određenim primerima izvođenja, računarski uređaj je dalјe konfigurisan da šalje uputstva na jedan ili više procesora zarad klasifikacije najmanje jednog naznačenog polimorfizma, primenom podataka o učestalosti alela koji su dobijeni za mnoštva polimorfizama, a u model verovatnoće distribucije u mešavini. Model verovatnoće distribucije u mešavini može koristiti faktorske momente.
[0024] U određenim primerima izvođenja, računarski uređaj je dalјe konfigurisan tako da šalje uputstva na jedan ili više procesora radi automatskog snimanja frakcije fetalne DNK u medicinski karton trudne individue, kao i radi skladištenja podatka na medijumu koji može biti očitan od strane kompjutera. Medicinsku dokumetaciju pacijenta mogu voditi laboratorija, kancelarija ordinirajućeg lekara, bolnica, zdravstvena organizacija, osiguravajuće drušvo ili služba internet stranice ličnih medicinskih kartona.
[0025] Sledeći aspekt prijave se odnosi na postupke procenjivanja frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne osobe praćenjem sledećih operativnih postupaka: (a) mapiranje segmenata DNK dobijenih iz telesne tečnosti trudne individue na osnovu mnoštva polimorfizama sekvenci, pri čemu se DNK sekvencira pod uslovima koji identifikuju mnoštvo sekvenci polimorfizma; (b) određivanje učestalosti alela mapiranih nukleinskih kiselina za svaki od mnoštva polimorfizama sekvenci; i (c) primenu učestalosti alela u modelu verovatnoće distribucije u mešavini kako bi se dobila procena frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz krvi osobe koja nosi fetus. Bilo koja od jedne ili više operacija (a)-(c) može biti sprovedena u okviru jednog ili više procesora koji rade po uputstvima kompjuterskog programa. U određenim primerima izvođenja, operacija (c) uključuje izvršne instrukcije za jedan ili više procesora zarad rešavanja serije jednačina za faktorske momente podataka o učestalosti alela za svaki od mnoštva polimorfizama sekvenci. U pojedinim primerima izvođenja, model verovatnoće distribucije u mešavini uračunava grešku sekvenciranja.
[0026] U određenim primerima izvođenja, postupci dodatno uklјučuju računsko uklanjanje učestalosti alela za polimorfizme identifikovane kao heterozigotne i kod fetusa i kod trudne individue. U pojedinim primenama, pre postupka (c), postupci uklјučuju operativnu funkciju računskog uklanjanja učestalosti alela za polimorfizme koji su identifikovani kao homozigotni i kod fetusa i kod trudne individue. U pojedinim primenama, pre postupka (c), postupci uklјučuju operativnu funkciju računskog uklanjanja učestalosti alela za polimorfizme koji su identifikovani kao heterozigotni kod trudne individue.
[0027] DNK dobijena iz telesne tečnosti trudne individue može biti DNK oslobođena od ćelija koja je dobijena iz plazme trudne individue. Mapiranje nukleinskih kiselina dobijenih iz telesne tečnosti može biti urađeno mapiranjem segmenata u bazi podataka polimorfizama.
[0028] Postupci navedenog aspekta prijave dalje mogu uključivati sekvenciranje DNK iz telesne tečnosti trudne individue upotrebom sekvencera nukleinskih kiselina pod uslovima koji proizvode sekvence segmenata DNK u kojima su prisutni polimorfizmi sekvenci.
[0029] U pojedinim primenama, mapiranje u (a) obuhvata identifikaciju mnoštva bialelalnih polimorfizama sekvenci. U drugim primerima izvođenja, mapiranje u (a) obuhvata mapiranje segmenata DNK upotrebom mnoštva unapred definisanih polimorfizama sekvenci.
[0030] U pojedinim primerima izvođenja, postupci navedenog aspekta dodatno uključuju izvršna programska uputstva za jedan ili na više procesora zarad automatskog snimanja frakcije fetusne DNK koja je utvrđena kao što je navedeno pod (c) u medicinski karton trudne individue, kao i čuvanje podataka na medijumu koji se može očitati od strane kompjutera. Medicinska dokumetacija pacijenta može biti vođena od strane laboratorije, kancelarije ordinirajućeg lekara, bolnice, zdravstvene organizacije, osiguravajućeg društva ili službe internet stranice ličnih medicinskih kartona.
[0031] Na osnovu procene frakcije fetalne DNK, postupci navedenog aspekta mogu dalјe uklјučivati propisivanje, započinjanje i/ili promenu tretmana humanog subjekta iz koga je uzet uzorak majke za ispitivanje. Na osnovu procene frakcije fetalne DNK, postupci ovog aspekta mogu dalјe uklјučivati naručivanje i/ili izvođenje jednog ili više dodatnih ispitivanja.
[0032] U skladu sa još jednim aspektom prijave, obezbeđeni su postupci za procenjivanje frakcije DNK fetusa u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue upotrebom sledećih operativnih postupaka: (a) primanja uzorka telesne tečnosti; (b) ekstrakcije DNK iz uzorka pod uslovima koji ekstrahuju DNK i genoma majke i fetalnog genoma koji su prisutni u telesnoj tečnosti; (c) sekvenciranje ekstrahovane DNK upotrebom sekvencera nukleinskih kiselina u uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenata; (d) upoređivanje sekvenci DNK segmenta dobijenih iz telesne tečnosti i iz poređenja koja identifikuju jedan ili više bialelalskih polimorfizama; (e) utvrđivanje učestalosti alela za sekvence DNK segmenta sa najmanje jednim od identifikovanih polimorfizama; (f) klasifikacija najmanje jednog identifikovanog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa; i (g) procenjivanje frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz trudne individue upotrebom učestalosti alela utvrđenih u (e) i kombinacije zigotnosti iz (f).
[0033] Mapiranje može biti obavljeno upotrebom računskog uređaja programiranog da mapira sekvence nukleinskih kiselina na osnovu jednog ili više naznačenih polimorfizama. U principu, bilo koji od operativnih postupaka (d)-(g) može biti izveden upotrebom jednog ili na više procesora koji rade po programskim uputstvima.
[0034] U određenim primenama navedenog aspekta, sekvence DNK segmenata su dužine između približno 20 baznih parova i približno 300 baznih parova.
[0035] U određenim primerima izvođenja navedenog aspekta, klasifikacija u (f) klasifikuje najmanje jedan identifikovani polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotan, (ii) trudna individua je homozigotna, dok je fetus heterozigotan, (iii) trudna individua je heterozigotna, a fetus je homozigotan (iv) trudna individua je heterozigotna i fetus je heterozigotan. Postupci dalje mogu uključivati uklanjanje iz razmatranja bilo kog polimorfizma koji je klasifikovan kao kombinacija (i) ili kombinacija (iv).
[0036] U skladu sa različitim primerima izvođenja, postupci ovog aspekta mogu uklјučivati postupke filtriranja i/ili klasifikacije koji su ovde opisani i koji su u sprezi sa drugim aspektima. Na primer, postupci navedenog aspekta mogu uključivati filtriranje jednog ili više identifikovanih polimorfizama kako bi se iz razmatranja uklonio bilo koji polimorfizam sa učestalošću ređeg alela većom od definisanog praga. U pojedinim slučajevima, klasifikacija najmanje jednog identifikovanog polimorfizma podrazumeva primenu praga učestalosti alela koja je utvrđena u (e). Upotreba modela verovatnoće distribucije u mešavini koji su ovde opisani može biti upotrebljena za klasifikaciju identifikovanih polimorfizama.
[0037] Naredni aspekt prijave se odnosi na aparaturu za procenjivanje frakcije fetalne DNK koja uklјučuje sledeće elemente: (a) sekvencer konfigurisan da (i) prima DNK ekstrahovanu iz uzorka telesne tečnosti koja sadrži DNK i majčinog genoma i genoma fetusa i (ii) sekvencira ekstrahovanu DNK da bi se proizvele sekvence DNK segmenata; i (b) računarski uređaj konfigurisan za slanje uputstava na jedan ili na više procesora da bi se (i) mapirale sekvence DNK segmenata dobijene iz telesne tečnosti trudne individue identifikacijom mnoštva polimorfizama sekvenci, (ii) odredila učestalost alela za svaki od mnoštva polimorfizama sekvenci na osnovu mapiranih sekvenci segmenata DNK i (iii) primenila učestalosti alela u model verovatnoće distribucije u mešavini i time dobila procena frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz krvi osobe koja nosi fetus.
[0038] Još jedna aparatura za procenjivanje frakcije fetalne DNK uklјučuje sledeće elemente: (a) sekvencer konfigurisan da (i) prima DNK ekstrahovanu iz uzorka telesne tečnosti koja sadrži DNK i majčinog genoma i genoma fetusa i (ii) sekvencira ekstrahovanu DNK da bi se proizvela sekvence DNK segmenata; i (b) računarski uređaj konfigurisan da šalje uputstava na jedan ili na više procesora da bi se (i) uporedile sekvence DNK segmenata izvedenih iz telesne tečnosti i iz poređenja kojim se identifikuju jedan ili više bialelnih polimorfizama, (ii) odredile učestalosti alela sekvence DNK segmenta sa najmanje jednim od identifikovanih polimorfizama, (iii) klasifikovao najmanje jedan identifikovani polimorfizam na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa i (iii) procenila frakcija fetalne DNK u DNK dobijenoj iz trudne individue upotrebom učestalosti alela i kombinacije zigotnosti.
[0039] Uputstva i/ili hardver koji se upotreblјavaju u aspektima razmatranja uređaja koji su ovde opisani, mogu obezbediti izvršavanje bilo kog jednog ili više od računskih ili algoritamskih operativnih postupaka čiji su aspekti ovde prijavljeni, bez obzira da li su navedeni postupci prethodno eksplicitno navedeni.
[0040] Ove i druge karakteristike i prednosti prijavljenih primera izvođenja će biti detalјnije opisani u tekstu koji sledi uz pozivanje na pridružene nacrte.
KRATAK OPIS NACRTA
[0041]
Slika 1 je blok dijagram koji prikazuje klasifikaciju stanja zigotnosti fetusa i majke za datu genomsku poziciju.
Slika 2 je primer toka procesa primene pojedinih od opisanih primera izvođenja.
Slika 3 prikazuje procene veličine greške, upotrebom podataka o poziciji sekvencirane baze koji su dobijeni na preko 30 traka IlluminaGA2 aparata i njihovim poravnavanjem sa humanim genomom HG18 korišćemjem Eland kompjuterskog parametra sa uobičajenim podešavanjem parametara.
Slika 4 je grafikon odnosa broja kopija ređeg alela A i prepokrivenosti D (uz pretpostavku da nema greške) za slučajeve heterozigotnosti od 1 do 4.
Slika 5 prikazuje transformaciju podataka Slučaja 3 u Slučaj 2.
Slika 6 prikazuje podatke nakon rotacije, pri čemu je D1 izabran tako da se Slučaj 1 i Slučajevi 2, 3 ne preklapaju. E1 predstavlјa gornju granicu gornjeg intervala pouzdanosti od 99. procenta za podatake Slučaja 1.
Slika 7 pokazuje poređenje rezultata upotrebom modela verovatnoće distribucije u mešavini, kao i poznate fetalne frakcije i procenjene fetalne frakcije.
Slika 8 pokazuje da upotreba stope greške aparata kao poznatog parametra smanjuje pozitivnu pristrasnost za jedan podeok.
Na slici 9 je pokazano da simulirani podaci dobijeni uračunavanjem stope greške aparata kao poznatog parametra, pobolјšavaju modele grešaka za slučajeve 1 i 2 i time značajno smanjuju pozitivnu pristrasnost do vrednosti od podeoka, za fetalnu frakciju do ispod 0,2.
Slika 10 je šematski prikaz kompjuterskog sistema koji, kada je adekvatno konfigurisan (npr. programiran) ili projektovan, može poslužiti kao uređaj za analizu prijavljenih primera izvođenja.
Slike 11A i B prikazuju histogram brojnih zabeleženih varijacija (učestalosti) procenta ređeg alela (A/D) za hromozom hromozome 1 (A) i hromozom 7 koji su dobijeni kao što je navedeno u primeru.
Slike 12A i B pokazuju distribuciju učestalosti alela duž hromozoma 1 (A) i hromozoma 7.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Uvod i pregled
[0042] Određeni primeri izvođenja koji su opisani uključuju analizu DNK uzete iz krvi trudne ženke i upotrebu analize za procenu frakcije DNK koja potiče od fetusa. Fetalna frakcija DNK može zatim biti upotrebljena za izračunavanje nivoa pouzanosti za drugu metričku osobinu ili karakterizaciju fetusa dobijenu nezavisnom analizom DNK uzete iz krvi majke. Na primer, fetalni uzorak DNK uzet iz krvi majke može biti posebno analiziran da bi se detektovala aneuploidija kod fetusa koga nosi trudna individua. Određivanje aneuploidije utvrđeno navedenom nezavisnom analizom može biti dato sa nivoom statistički zasnovane pouzdanosti izračunatom na osnovu frakcione količine fetalne DNK prisutne u DNK uzetoj iz krvi majke. Relativno niske frakcije fetalne DNK u ukupnom komplementu DNK ukazuju na nizak nivo pouzdanosti bilo koje karakterizacije zasnovane na fetalnoj DNK.
[0043] Uobičajeno je, iako nije neophodno, da analizirana DNK u krvi majke predstavlja DNK oslobođenu od ćelija, mada u pojedinim primerima izvođenja ona može predstavljati DNK vezanu za ćelije. DNK oslobođena od ćelija se uzima iz plazme majke. Količina fetalne DNK u sadržaju DNK oslobođene od ćelija koja je uzeta iz trudne žensk individue široko varira u zavisnosti od raznih faktora, uklјučujući gestacionu starost fetusa. Kod uobičajene trudnoće, trenutno se pretpostavlja da približno 5-20% DNK oslobođene od ćelija predstavlja fetalna DNK. Ipak, nije neuobičajeno da fetalna frakcija bude značajno niža (npr. približno 1% ili niže). U takvim slučajevima, svaka zasebna karakterizacija fetalne DNK može biti inherentno sumnjiva. Sa druge strane, pojedini istraživači su prijavili uzorke DNK majke oslobođene od ćelija sa fetalnom frakcijom DNK visokom čak do 40% ili 50%.
[0044] U određenim primerima primene koji su ovde opisani, određivanje fetalne frakcije u DNK majke se oslanja na višestruka očitavanjia DNK sekvenci uzimajući u obzir mesta na sekvencama za koja je poznato da su u njima prisutni jedan ili više polimorfizama. Uobičajeno je, iako nije neophodno, da su navedeni polimorfizmi tipa pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (SNP). Druge vrste pogodnih polimorfizama uklјučuju delecije, STR poliformizne (polimorfizam kratkih tandemskih ponovaka), insercije, indele (uklјučujući mikroindele) itd. Dalji primeri su predstavlјeni u nastavku teksta. U određenim primerima izvođenja, polimorfna mesta se nalaze u "referentnoj sekvenci" kao što je opisano u nastavku teksta. U pojedinim primerima izvođenja, mesta polimorfizama se otkrivaju prilikom poravnjavanja marker sekvenci (tag-sekvenci) jednih sa drugima i/ili sa referentnom sekvencom.
[0045] Određeni postupci koji su prijavljeni iškorišćavaju činjenicu da sekvence fetalne DNK na mestima polimorfizama koja se razmatraju mogu da ne odgovaraju onima koje su prisutni kod majke fetusa. Na primer, DNK majke na mestu određenog SNP može biti homozigotna, dok će verzija SNP kod fetusa biti heterozigotna. Stoga, kolekcija uzoraka sekvenci dobijena analizom na dati SNP će biti heterogena, sa većinom sekvenci koje sadrže učestaliji (engl. major) alel i preostalom frakcijom koja sadrži ređe zastupljen (engl. minor) alel. Relativne količine češćih i ređih alela se određuju na osnovu frakcije fetalne DNK u uzorku.
[0046] Treba napomenuti da u homozigotnom uzorku obe kopije datog SNP ili drugog polimorfizma podrazumevaju isti alel, dok heterozigotni SNP ili drugi polimorfizam podrazumeva jednu kopiju učestalijeg alela i jednu kopiju ređe zastupljenog alela. Poznato je, naime, da DNK uzeta isklјučivo iz heterozigotne osobe treba da sadrži 50% učestalijeg alela i 50% manje učestalog alela. Navedena činjenica se može upotrebiti pri razjašnjavanju frakcije fetalne DNK kao što je to navedeno u glavnim crtama u tekstu koji sledi. Kao što je u nastavku teksta potpunije objašnjeno, razni postupci koji su ovde prijavljeni razmatraju samo polimorfizme koje karakteriše postojanje samo dva alela u ukupnoj DNK, tj. onoj koja istovremeno sadrži DNK i majke i fetusa.
[0047] U pojedinim primenama, DNK uzeta iz krvi majke se očitava mnogo puta, a ukupan broj očitavanja koja mapiraju jedno određeno mesto polimorfizma se dalje označava kao "pokrivenost" polimorfizma (ukupan broj kopija), dok se broj očitavanja koja mapiraju ređi alel za navedeni polimorfizam označava kao broj kopija ređeg alela. Odnos broja kopija ređeg alela i ukupnog broja očitavanja (prepokrivenosti) je važan za razne primene.
[0048] Određeni postupci koji su ovde prijavljeni, identifikuju i karakterišu četiri slučaja polimorfizama u uzorcima DNK koji sadrže DNK i iz majke i iz fetusa. Slika 1 (prikazana ispod) opisuje navedena četiri slučaja. Preciznije, u prvom slučaju, koji je prilično nezanimlјiv, i majka i fetus su homozigotni za određeni polimorfizam koji se razmatra. U tom slučaju, svaka sekvenca u uzorku DNK koja sadrži polimorfizam koji se razmatra, sadržavaće isti alel, tako da se ne mogu prikupiti informacije o relativnim količinama DNK majke i fetusa. Treba napomenuti, međutim, da ovaj slučaj može biti zanimlјiv zbog činjenice da omogućava istraživaču ili tehničaru da stekne neku predstavu o relativnoj stopi greške uređaja za sekvenciranje DNK koji se upotrebljava za generisanje podataka o sekvencama koje se razmatraju.
[0049] Drugi slučaj koji se susreće prikom analize, jeste polimorfizam u kome je trudna individua homozigotna, a fetus heterozigotan. U ovom slučaju, relativno mala, ali ipak značajna frakcija detektovanih sekvenci će sadržavati ređi alel. Preciznije, u ovom drugom slučaju, učestalost ređeg alela je nominalno data frakcijom fetalne DNK u krvotoku majke podelјenom sa dva.
[0050] U trećem slučaju, polimorfizam koji se razmatra podrazumeva heterozigotnost u DNK majke i homozigotnost u DNK fetusa. U ovoj situaciji, učestalost ređeg alela je nominalno data kao 0,5 minus jedna polovina frakcije fetalne DNK u uzorku DNK.
[0051] Konačno, u četvrtom slučaju, razmatrani polimorfizam podrazumeva heterozigotnost i kod majke i kod fetusa. U ovom slučaju, očekuje se da će učestalost učestalijeg i manje učestalog alela biti 0,5. Kao i u prvom slučaju, četvrti slučaj je relativno neinteresantan za određivanje fetalne frakcije DNK.
[0052] Ukoliko je istraživač, tehničar ili kompjuterski program zadužen za određivanje frakcije fetalne DNK u uzorku upoznat kojoj od navedene četiri klase pripada određeni polimorfizam, onda frakcija fetalne DNK može biti direktno procenjena, pretpostavljajući da polimorfizam koji se razmatra podpada bilo pod slučaj dva ili slučaj tri. U praksi, međutim, navedeno nikada nije poznato a priori. Stoga je potreban računarski uređaj za obavlјanje operativnih postupaka koji su ovde opisani.
[0053] U određenim primerima izvođenja, opisanim ovde u drugim delovima teksta, za klasifikaciju polimorfizma pojedinačnog nukleotida u jedan od četiri slučaja se upotrebljava tehnika određivanja praga. Jednom kada je polimorfizam tako klasifikovan i kada je ustanovljeno da on pripada bilo slučaju 2 ili 3, može biti utvrđena fetalna frakcija. U drugim primerima izvođenja, tehnika razmatra višestruke polimorfizme raspoređene duž celog ili dela genoma. Kao što je ilustrovano u specifičnim primerima, za ovu svrhu se mogu koristiti višestruki različiti SNP-ovi duž genoma.
[0054] U posebnim primerima izvođenja, učestalost alela se određuje za niz različitih polimorfizama u uzorku DNK koji je uzet iz uzorka krvi majke. Za navedeno mnoštvo polimorfizama, neka od frakcija će odgovarati zigotnosti slučaja 1, druga frakcija će odgovarati slučaju 2, treća frakcija će odgovarati slučaju 3, dok će finalna frakcija odgovarati slučaju 4. Suma ovih frakcija ima vrednost 1. Model verovatnoće distribucije u mešavini ili srodna tehnika može biti upotrebljena za izdvajanje jednog ili više statističkih parametara polimorfizama u slučaju svake od ove četiri kategorije. Preciznije, model verovatnoće distribucije u mešavini može biti upotrebljen za određivanje srednje vrednosti i opciono varijanse za svaki od četiri slučaja koji se sreću u uzorku DNK koji se uzima iz krvi trudne individue. U specifičnim primerima izvođenja, to podrazumeva upotrebu srednje vrednosti i varijanse učestalosti ređeg alela koja je izračunata u odnosu na ukupan broj kopija polimorfizma koji se razmatra (pokrivenost). Kao što je ovde izloženo u drugim delovima opisa, srednje vrednosti za svaku od ove četiri kategorije, ili barem za drugu i treću kategoriju, direktno su proporcionalne fetalnoj frakciji u DNK koja je uzeta iz krvi majke.
[0055] U specifičnoj primeni u kojoj se upotrebljavaju modeli verovatnoće distribucije u mešavini, izračunavaju se jedan ili više faktorijalnih momenata za svaku poziciju u kojoj se razmatra polimorfizam. Na primer, faktorijalni momenat (ili skup faktorijalnih momenata) se izračunava upotrebom višestrukih SNP pozicija koje se razmatraju u DNK sekvenci. Kao što je prikazano u jednačini 4 ispod, svaki od raznih faktorskih momenata predstavlja zbir odnosa učestalosti ređeg alela i pokrivenosti za svaku od raznih SNP pozicija koje se razmatraju. Kao što je prikazano u jednačini 5 ispod, ovi faktorski momenti takođe odražavaju parametre distribujije koji su utvrđeni za bilo koji od četiri slučaja zigotnosti koji su prethodno opisani. Preciznije, oni se odnose na verovatnoću pojave svakog od slučajeva, kao i na relativne količine svakog od četiri slučaja u kolekciji polimorfizama koji se razmatraju. Kao što je prethodno objašnjeno, verovatnoća je funkcija frakcije fetalne DNK u DNK oslobođenoj od ćelija u krvi majke. Kao što je potpunije objašnjeno u nastavku teksta, izračunavanjem dovolјnog broja ovih faktorskih momenata (koji su prikazani u jednačini 4), postupak obezbeđuje dovolјan broj izraza za rešavanje svih nepoznatih. Nepoznate u ovom slučaju bi predstavljale relativne količine svakog od četiri slučaja u populaciji polimorfizama koji se razmatraju, kao i verovatnoće (a time i frakcije fetalne DNK) asocirane sa svakim od ova četiri slučaja. Pogledati jednačinu 5. Slični rezultati se mogu dobiti upotrebom drugih verzija modela verovatnoće distribucije u mešavini kao što su modeli prikazani u nastavku teksta, u jednačinama 7-12. Ove posebne verzije upotrebljavaju samo polimorfizme koji pripadaju slučajevima 1 i 2, dok se polimorfizmi za slučajeve 3 i 4 uklanjaju postupkom filtriranja primenom tehnike praga.
[0056] Dakle, faktorijalni momenti mogu biti upotrebljeni kao deo modela verovatnoće distribucije u mešavini da bi se identifikovale verovatnoće bilo koje kombinacije od četiri slučaja zigotnosti. Kao što je i pomenuto, navedene verovatnoće, ili barem one za drugi i treći slučaj, direktno su proporcionalne frakciji fetalne DNK u ukupnoj DNK oslobođenoj od ćelija u krvi majke.
[0057] Takođe treba napomenuti da se greška sekvenciranja može upotrebiti za smanjenja kompleksnosti sistema jednačina faktorskih momentnih koje moraju biti rešene. U tom pogledu, treba napomenuti da greška sekvenciranja zapravo može predstavljati bilo koji od četiri rezultata (koji odgovaraju svakoj od četiri moguće baze na bilo kojoj datoj poziciji polimorfizma).
[0058] U određenim primerima izvođenja, marker sekvence su poravnate sa referentnim hromozomom ili genomom i identifikovani su bialelni polimorfizmi. Navedeni polimorfizmi nisu prethodno definisani ili na drugi način identifikovani pre poravnavanja. Oni se jednostavno identifikuju tokom poravnavanja, a zatim se polimorfizmi karakterišu na osnovu njihovih zigotnosti i broja kopija ređeg alela kao što je ovde opisano. Navedeni podatak se upotrebljava za procenu frakcija genoma kao što je ovde opisano.
[0059] Dužine marker sekvenci (tagova) upotrebljenih u primerima izvođenja koji su ovde opisani, u principu će biti određene postupcima sekvenciranja upotrebljenim za generisanje marker sekvenci. Postupci su robusni duž širokog opsega dužina marker sekvenci. U određenim primenama, marker sekvence su dužine od između približno 20 i 300 baznih parova (ili približno 30 i 100 baznih parova).
[0060] Primer toka procesa za primenu pojedinih od prijavljenih primera izvođenja je prikazan na Nacrtu 2. Kao što je prikazano, proces počinje blokom 201, odnosno prikuplјanjem DNK (oslobođene od ćelija ili vezane za ćelije) iz krvi majke ili druge telesne tečnosti. Iz ove DNK mnoštvo sekvenci mapira na jednom ili na više polimorfizama u referentnoj sekvenci. Navedeno mapiranje obezbeđuje učestalost alela za svaki od polimorfizama. Pogledati blok 203.
[0061] Preciznije, proces u okviru bloka 203 može uklјučivati očitavanje sekvenci prikuplјene DNK na lokacijama višestrukih polimorfizama. U pojedinim slučajevima, očitavanja mogu biti generisana kao deo procesa za određivanje ploidnosti ili drugih određivanja koja se sprovode za fetalnu DNK. Prema tome, u pojedinim primerima izvođenja, nije potrebno generisanje zasebnih sekvenci. Očitane sekvence se poravnavaju sa referentnom sekvencom da bi se maksimizovala poravnatost upotrebom BLAST ili sličnog programa.
[0062] Referentna sekvenca može biti obezbeđena u vidu baze podataka polimorfizama. U pojedinim slučajevima, ona predstavlja referentni set za pretraživanje alela dobijen kombinatornom ekspanzijom svih definicija polimorfizama (npr. u slučaju gde su polimorfizmi SNP-ovi, svih sekvenci sa SNP-ovima). Pogledati dodatni materijal kao primer. U specifičnom primeru, sekvence su dužina od približno 100 do 150 baznih parova.
[0063] Vraćajući se na Sliku 2, postupak određuje kombinaciju zigotnosti majke/fetusa za jedan ili više polimorfizama koji se razmatraju u operativnom postupku bloka 203. Pogledati blok 205. U ovu svrhu, u pojedinim primerima izvođenja može biti upotrebljen model verovatnoće distribucije u mešavini. Kao što je pomenuto, kombinacije su sledeće: M i F homozigotni, M homozigotna i F heterozigotan, M heterozigotna i F homozigotan i M i F heterozigotni.
[0064] Konačno, kao što je ilustrovano u okviru bloka 207, postupak upotrebljava kombinaciju slučaja zigotnosti i učestalosti alela za jedan ili za više polimorfizama radi procene frakcione količine fetalne komponente u DNK iz uzorka majke.
Definicije
[0065] Definicije koje slede su obezbeđene kao ispomoć u razumevanju određenih aspekata i prednosti prijavljenih primera izvođenja.
[0066] Termin "očitavanje" se odnosi na očitavanje sekvence iz dela uzorka nukleinske kiseline. Uobičajeno je, iako nije neophodno, da očitavanje predstavlјa kratku sekvencu susednih baznih parova u uzorku. Očitavanje može biti predstavljeno simbolično, sekvencom baznih parova (kao ATCG) dela uzorka. Očitavnje može biti sačuvano na uređaju za čuvanje memorije i potom obrađeno na odgovarajući način da bi se odredilo da li se očitavanje poklapa sa referentnom sekvencom ili ispunjava druge kriterijume. Očitavanje može biti dobijeno direktno iz uređaja za sekvenciranje ili indirektno, iz sačuvanih informacija o sekvenci koje se tiče uzorka.
[0067] Termin "marker sekvenca (tag)" se takođe odnosi na kratke sekvence iz uzorka nukleinske kiseline. Uobičajeno je da marker sekvenca sadrži pridružene informacije, kao što je lokacija sekvence u genomu. Za pojedine svrhe, termini očitavanje i marker sekvenca se ovde naizmenično upotrebljavaju. Uobičajeno je ipak da se očitavanja sekvenci poravnavaju u odnosu na referentnu sekvencu, a da se očitavanja koja mapiraju samo jedno mesto u referentom genomu označavuju kao marker sekvence. "Segment sekvence" se ovde ponekad koristi naizmenično sa terminom "marker sekvenca".
[0068] "Očitavanja" se u tekstu često opisuju kao sekvence nukleinskih kiselina koje su dužine 36 baznih parova (36-omeri). Naravno, prijavljena izvođenja nisu ograničena na navedenu veličinu. Manja i veća očitavanja su pogodna u mnogim primenama. Za primene u kojima se očitavanja poravnavaju sa humanim genomom, očitavanja veličine 30 baznih parova ili više se generalno smatraju dovolјnim za mapiranje uzorka na pojedinačnom hromozomu. Mnogo duže marker sekvence/očitavanja su pogodni za neke primene. Za sekvenciranje celokupnog genoma mogu tako biti upotrebljena očitavanja reda veličine 1000 baznih parova ili više. U određenim primerima izvođenja, očitavanja mogu biti dužine između približno 20 i 10,000 baznih parova ili između približno 30 i 1000 baznih parova ili pakk između približno 30 i 50 baznih parova.
[0069] "Referentna sekvenca" je sekvenca biološkog molekula koji često označava nukleinsku kiselinu kao što je hromozom ili genom. Uobičajena višestruka očitavanja predstavljaju članove date referentne sekvence. U određenim primerima izvođenja, očitavanje ili marker sekvence se upoređuju sa referentnom sekvencom da bi se utvrdilo da li referentna sekvenca sadrži očitanu sekvencu. Ovaj proces se ponekad označava kao poravnavanje.
[0070] U različitim primerima izvođenja, referentna sekvenca je značajno veća od očitavanja koja su sa njom poravnata. Na primer, ona može biti najmanje približno 100 puta veća ili najmanje približno 1000 puta veća ili najmanje približno 10.000 puta veća ili najmanje približno 10<5>puta veća ili najmanje približno 10<6>puta veća ili najmanje približno 10<7>puta veća.
[0071] U jednom primeru, referentna sekvenca je ona koja predstavlja humani genom pune dužine. Navedene sekvence mogu biti označene kao genomske referentne sekvence. U drugom primeru, referentna sekvenca je ograničena na specifičan humani hromozom kao što je hromozom 13. Takve sekvence mogu biti označene kao hromozomske referentne sekvence. Drugi primeri referentnih sekvenci uklјučuju genome drugih vrsta, kao i hromozome, subhromozomske regione (kao što su lanci) itd. bilo koje vrste.
[0072] U različitim primerima izvođenja, referentna sekvenca je konsenzusna sekvenca ili druga kombinacija izvedena iz više osoba. Međutim, u određenim primenama, referentna sekvenca može biti uzeta iz određene individue.
[0073] Pojam "poravnavanje" se odnosi na proces upoređivanja očitavanja ili marker sekvence sa referentnom sekvencom i time određivanje da li referentna sekvenca sadrži očitanu sekvencu. Ukoliko referentna sekvenca sadrži očitavanje, očitavanje može biti mapirano u referentnoj sekvenci ili, u određenim primerima izvođenja, na određenoj lokaciji referentne sekvence. U pojedinim slučajevima, poravnavanje jednostavno govori da li je očitavanje član određene referentne sekvence ili to nije (tj. da li je očitavanje prisutno ili odsutno u okviru referentne sekvence). Na primer, poravnavanje očitavanja sa referentnom sekvencom za humani hromozom 13 će pokazati da li je očitavanje prisutno u referentnoj sekvenci za hromozom 13. Alat koji obezbeđuje ovu informaciju se može označiti kao postupak za ispitivanje pripadnosti setu podataka. U pojedinim slučajevima, poravnavanje dodatno ukazuje na lokaciju u referentnoj sekvenci gde očitavanje ili marker sekvenca mapiraju. Na primer, ukoliko referentna sekvenca predstavlja sekvencu celokupnog humanog genoma, poravnavanje može ukazati da je očitavanje prisutno na hromozomu 13, a dalјe može ukazati i na to da je očitavanje na specifičnom lancu hromozoma 13.
[0074] "Mesto" je jedinstveni lokus/pozicija u referentnoj sekvenci koja odgovara očitavanju ili marker sekvenci. U određenim primerima izvođenja, mesto precizira identitet hromozoma (npr. hromozom 13), lanac hromozoma i tačnu poziciju u hromozomu.
[0075] "Polimorfno mesto" je lokus u kome se javlјa divergencija nukleotidne sekvence. Lokus može biti toliko mali da označava jedan bazni par. Ilustrativni markeri imaju najmanje dva alela, pri čemu se svaki javlja sa učestalošću većom od 1% i više, a uobičajeno sa učestalošću većom od 10% ili 20% u izabranoj populaciji. Polimorfno mesto može biti toliko malo da predstavlja jedan bazni par. Termini "polimorfni lokus" i "polimorfno mesto" se ovde upotrebljavaju naizmenično.
[0076] "Polimorfna sekvenca" se ovde odnosi na sekvencu nukleinske kiseline, npr. sekvencu DNK, koja sadrži jedno ili više polimorfnih mesta, npr. jedan SNP ili tandem SNP-ova. Polimorfne sekvence se, shodno postojećoj tehnologiji, mogu upotrebiti za specifično razlikovanje između alela koji su i nisu od majke u uzorku majke koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina fetusa i majke.
Detalјni primeri izvođenja
[0077] Uobičajeno je da procesi koji su ovde opisani upotrebljavaju referentnu sekvencu koja sadrži jedan ili više polimorfizama i asocirana je sa DNK koja se uzorkuje. Referentna sekvenca može biti, na primer, genom čoveka, hromozom ili region hromozoma. Može biti preciziran jedan ili više polimorfizama u svrhu procene frakcije fetalne DNK. Polimorfizmi precizirani za određivanje fetalne frakcije su polimorfizmi koji su unapred poznati. Na primer, sveobuhvatan spisak referenci, činjenica i podataka o sekvencama prethodno poznatih STR polimorfizama, kao i srodni podaci o učestalosti u populacijama su sadržani u tzv. STRBase, bazi podataka kojoj se može pristupiti preko internet adrese ibm4.carb.nist.gov:8800/dna/home.htm. Informacije o sekvenci iz GenBank® baze podataka (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/genbank) za najčešće korišćene STR lokuse su takođe dostupne u STRBase. Informacijama prethodno poznatih SNP-ova se može pristupiti putem javno dostupnih baza podataka, uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na, Bazu humnih SNP-ova na internet adresi wi.mit.edu, početnu stranicu NCBI dbSNP baze na internet adresi ncbi.nlm.nih.gov, bazu na internet adresi lifesciences.perkinelmer.com firme Applied Biosystems, Life Technologies™ (Carlsbad, Kalifornija) sa internet adresom appliedbiosystems.com, Celera bazu humanih SNP-ova na internet adresi celera.com, SNP bazu podataka Grupe za analizu gena (GAN) na internet adresi gan.iarc.fr. U jednom primeru izvođenja, SNP-ovi koji su naznačeni za određivanje fetalne frakcije, izabrani su iz grupe koju čini 92 pojedinačna identifikaciona SNP-a (IISNPs) opisana od strane Pakstisa i saradnika (Pakstis i saradnici, Hum Genet 127: 315-324 [2010]), a za koje je pokazano da su sa veoma malom varijacijom učestalosti u okviru populacija (Fst<0,06) i da su visoko informativni širom sveta, pri čemu prosečna heterozigotnost iznosi ≥0,4. SNP-ovi koje su obuhvaćeni postupkom pronalaska uklјučuju međusovno povezane i nepovezane SNP-ove. Da bi se odredile odgovarajuće tandemske SNP sekvence, moguća je pretraga međunarodne baze podataka HapMap konzorcijuma (The International HapMap Project, Nature 426:789-796 [2003]). Baza podataka je dostupna na internet adresi hapmap.org.
[0078] Polimorfizmi upotrebljeni na navedeni način mogu predstavljati panele prethodno poznatih polimorfizama konstruisanih za određivanje fetalne DNK frakcije ili onih koji su utvrđeni po principu slučajnosti prilikom analize DNK majke u druge svrhe, a kao što je mapiranje marker sekvenci DNK uzorka na hromozomima.
[0079] U određenim primerima izvođenja, postupak podrazumeva sekvenciranje DNK u uzorku upotrebom mešavine genoma, npr. uzorka majke koji sadrži fetalnu i DNK majke koje su oslobođene od ćelija, da bi se obezbedilo mnoštvo marker sekvenci koje mapiraju na sekvencama koje sadrže prethodno poznata polimorfna mesta u referentnom genomu i da bi se, upotrebom marker sekvenci koje mapiraju na prethodno poznata mesta, utvrdila fetalna frakcija kao što je detaljno opisano u nastavku teksta. Alternativno, nakon sekvenciranja DNK, marker sekvence dobijene tehnologijom sekvenciranja, npr. sa NGS-om, se mapiraju referentnim genomom. npr. u hg19, nakon čega se marker sekvence koji mapiraju na mesta na kojima se polimorfizmi javljaju po principu slučajnosti tj. koja nisu prethodno poznata, upotrebljavaju za određivanje fetalne frakcije.
[0080] Referentna sekvenca koja se upotrebljava za mapiranje marker sekvenci na prethodno poznata polimorfna mesta, može označavati publikovan referentni genom ili može prestavljati veštački kreiranu bazu podataka ili drugu unapred definisanu kolekciju sekvenci za polimorfizme koji se razmatraju. Svaka od baza podataka sekvenci obuhvataće jedan ili više nukleotida koji su asocirani sa polimorfizmom. Kao jedan primer, pogledajte spisak polimorfizma sekvenci koji su predstavljeni u nastavku teksta, u "Dopunskom materijalu 1."
[0081] U raznim primerima izvođenja, broj polimorfizama koji se upotrebljava za procenu frakcije fetalne DNK iznosi najmanje 2 polimorfizma, a preciznije, upotrebljavaju se podaci za svaki od najmanje oko 10 polimorfizama i još prioritetnije, za svaki od najmanje oko 100 polimorfizama.
[0082] U jednom primeru, pokrivenost SNP-ovima i učestalost alela se određuju poravnavanjem generisanih sekvenci sa referentnim genomom konstrituisanim kombinatornom ekspanzijom definicija SNP. Baza podataka amplikona sadrži podatke o bialelnim varijacijama mesta koja su okružena sa npr. najmanje oko 50 baza bočne sekvence. Na primer, amplikon sa podatkom o varijacije za niz "[g/c]" (što predstavlјaju alternativne alele "g" i "c" može izgledati kao:
atcg ..... accg[g/c]ccgt ....
[0083] U pojedinim slučajevima, procedura za unos baze podataka amplikona i generisanihi sekvenci, kao i izlaz podataka o broju kopija SNP/alela je sledeći.
1. Kreiranje seta referentanih podataka za pretragu alela na osnovu kombinatorne ekspanzije SNP definicija. Za svaku sekvencu u bazi amplikona, za svaki alel u nizu podataka o varijaciji, kreira se alelska sekvenca zamenom alela u skladu sa nizom podataka o varijaciji.
a. Na primer, razmatrajući prethodni primer sekvence amplikona, trebalo bi kreirati dve sekvence: 1) atcg ..... accgGccgt .... i 2) atcg ..... accgCccgt ....
b. Primer kompletnog seta referentanih podataka za pretragu alela se može naći u okviru Liste baze podataka za pretraživanje alela.
2. Mapiranje sekvenci na osnovu seta referentnih sekvenci za pretraživanje alela uz zadržavanje samo onih mapiranja koja se poklapaju sa samo jednom sekvencom u skupu sekvenci koji se pretražuje.
3. Broj kopija alela se određuje prebrojavnjem sekvenci koje se poklapaju sa njegovom alelskom sekvencom.
[0084] Postupci koji su ovde prijavljeni pretpostavlјaju "normalnu" trudnoću, tj. trudnoću u kojoj majka nosi samo jedan fetus, a ne blizance, trojke itd. Stručnjacima će biti od značaja modifikacije koje uračunavaju trudnoće koje odstupaju od normalnih, posebno one u kojima je poznat broj fetusa.
[0085] Kao što je prethodno naznačeno, kada se određuje fetalna frakcija, postupak podrazumeva sekvenciranje DNK u uzorku iz krvi majke i prebrojavanje marker sekvenci koji mapiraju na svaki od razmatranh polimorfizama sekvenci. Za svaki polimorfizam, postupak označava ukupan broj očitavanja koja je mapiran datom sekvencom (pokrivenost) i brojeve marker sekvenci koje su asocirani sa svakim alelom (broj kopija alela). U jednostavnom primeru, polimorfizam sa pokrivenošću od 5, može sadržavati 3 očitavnja alela B i 2 očitavnja alela A. U ovom primeru, alel A se smatra ređim alelom, a alel B se razmatra kao učestaliji alel.
[0086] U pojedinim primerima izvođenja, navedeni operativni postupak upotrebljava veoma brze alate za sekvenciranje, kao što su alati za uporedno sekvenciranje DNK velikog obima. Primeri takvih alata su detalјnije opisani u nastavku teksta. U pojedinim slučajevima, za jedan uzorak se očitava više hilјada ili miliona marker sekvenci. Prioritetno, sekvenciranje se vrši na način koji omogućava brzu i direktnu karakterizaciju sekvencirane DNK u odnosu na određene unapred definisane sekvence u kojima su prisutni polimorfizmi koja se razmatraju. U principu, za navedenu svrhu je dovoljno informacija obezbeđeno marker sekvencama veličine 30 baznih parova ili više. Marker sekvence ove veličine mogu biti upotrebljene za nedvosmisleno mapiranje sekvenci od interesa. U specifičnim primerima izvođenja, marker sekvence koji se upotrebljavaju u procesu su dužine 36 baznih parova.
[0087] Marker sekvence mapiraju u referentnom genomu ili u sekvencama iz baze podataka alelskih sekvenci (npr. pogledati Dopunski material 1, a kao što je prethodno pomenuto), a na osnovu toga se dalje određuje broj marker sekvenci koje su tako mapirane. Navedeno će obezbediti i prekrivenost i broj kopija ređeg alela za svaki polimorfizam koji se razmatra. U pojedinim slučajevima, ovo može biti urađeno istovremeno sa mapiranjem svake marker sekvence na jedan od 23 humana hromozoma i određivanjem broja mapiranih marker sekvenci po hromozomu.
[0088] Kao što je već pomenuto, pokrivenost predstavlja ukupan broj očitanih sekvenci koji su mapirane određenim polimorfizam u referentnoj sekvenci. Broj kopija alela je ukupan broj očitanih sekvenci koje su mapirane polimorfizmom koga karakteriše postojanje alela. Suma svih brojeva kopija alela mora biti jednak pokrivenosti. Alel sa najvećim brojem kopija predstavlja učestaliji alel, dok je alel sa najnižim brojem kopija ređi alel. U određenim primerima izvođenja, jedina informacija potrebna za procenu frakcije fetalne DNK je pokrivenost i broj kopija ređeg alela za svaki od mnoštva polimorfizama. U pojedinim primerima izvođenja, upotrebljava se stopa greške imenovanja baze od strane uređaja za sekvenciranje DNK.
[0089] Korisno je uzeti u obzir matematičke ili simboličke osnove određenih postupaka koji su ovde opisani. Kao što je pomenuto u raznim primerima, sekvence dobijene iz krvi majke se poravnavaju (preklapaju tako da identične baze budu maksimalno poklopljene) sa referentnim genomom ili drugom sekvencom nukleinske kiseline. Uzimajući u obzir položaj u genomu, j, kao i skup sekvenci koje su poravnate sa refentnom sekvencom, broj pojavljivanja svake od četiri baze DNK ("a", "t", "g" i "c", takođe nazvanih "aleli") u okviru poravnatih sekvenci može biti označen kao w(j,1), w(j,2), w(j,3), w(j,4), tim redom. Zarad potreba ovakvog razmatranja, može se takođe pretpostaviti, a bez gubitka uopštavanja, da su sve varijacije bialelne. Stoga, mogu biti upotrebljene sledeće vrste označavanja:
Broj kopija učestalijeg alela na genomskom položaju j je i statististička je odlika prvog reda za broj kopija na poziciji j (učestaliji alel, b, predstavlja odgovarajući argmax. Indeksi se upotrebljavaju kada se razmatra više od jednog SNP-a),
Broj kopija ređeg alela na poziciji j je i satatistička je odlika drugog reda za broj kopija (tj. drugi najviši broj kopija alela) na poziciji j, Pokrivenost na poziciji j je D ≡ Dj= {d¡} = Aj+ Bj, a
Stopa greške uređaja za sekvenciranje se označava kao e.
[0090] Kada je kontekst jasan, zarad pogodnosti, označavanja se upotrebljavaju naizmenično; na primer, A, Ai ili {ai} se mogu naizmenično koristiti za označavanje ređeg alela illi broja kopija ređeg alela. Indeksi se mogu ili ne moraju upotrebljavati, u zavisnosti od toga da li se razmatra više od jednog SNP-a. (SNP-ovi se upotrebljavaju samo za potrebe primera. Druge vrste polimorfizma mogu biti upotrebljene kao što je ovde opisano u drugim delovima teksta).
[0091] Na Slici 1, prikazana je osnova za četiri stanja zigotnosti polimorfizma. Kao što je ilustrovano, majka može biti homo ili heterozigotna za dati polimorfizam. Slično tome, beba može biti ili heterozigotna ili homozigotna na istoj poziciji. Kao što je ilustrovano, slučajevi 1 i 2 su slučajevi polimorfizma u kojima je majka homozigotna. Ukoliko su i beba i majka homozigotni, polimorfizam označava polimorfizam slučaja 1. Kao što je prethodno navedeno, ova situacija obično nije posebno zanimlјiva. Ukoliko je majka homozigotna a beba je heterozigotna, fetalna frakcija, f, se nominalno dobija množenjem odnosa ređeg alela i pokrivenosti sa dva. U slučaju polimorfizma gde je majka heterozigotna, a beba je homozigotna (slučaj 3 na Slici 1), fetalna frakcija je nominalno predstavlja razliku broja jedan i odnosa ređeg alela i prekrivenosti koji je pomnožen sa dva. Konačno, u slučaju kada su i majka i fetus heterozigotni, frakcija ređeg alela bi uvek trebala da bude 0,5 i da isključuje grešku. Fetalna frakcija se ne može izvesti za polimorfizme koji potpadaju pod slučaj 4.
[0092] Četiri navedeva slučaja će dalje biti detaljno izložena.
Slučaj1: Majka i beba su homozigoti
[0093]
● U ovom slučaju, utrvrđuje se greška u sekvenciranju ili kontaminacija i ne bi trebalo da se uoče razlike.
● E (minimalna učestalost alela) = E(A) = 0.
● U praksi, A ~ (je tipa distribucije kao što je) Binomna raspodela koja aproksimira dobro sa Poasonovom raspodelom za niske np. Parametar stope distribucije u Binomnoj ili Poasonovoj distribuciji asocira sa stopom greške sekvenciranja, e i sa pokrivenošću D. Nacrt 3 prikazuje razmimoilaženje učestalosti generistanih 36-mernih sekvenci poravnatih u odnosu na Humani referentni genom.
● Ovaj slučaj ne sadrži podatke o fetalnoj frakciji.
[0094] Nacrt 3 prikazuje procene grešaka u poziciji sekvenciranih baza dobijenih na osnovu poravnavanja podataka iz analize na preko 30 traka Illumina GA2 aparata i humanog geoma HG18, upotrebom programa Eland sa uobičajenom postavkom parametara.
Slučaj 2: Majka je homozigot, a beba je heterozigot
[0095]
● U ovom slučaju, za male fetalne frakcije (f), uočene učestalosti alela će biti znatno drugačije.
Učestaliji alel se obično javlja sa učestalošću koja je nekoliko puta veća od učestalosti ređeg alela.
● Isključivanje greške, uzimajući u obzir jednu SNP poziciju (D,A), E(A) = Df/2 i nepristrasna procena za f je 2A/D
● Isključivanje greške, A ~ Binomna raspodela (f/2, D). Srednja vrednost Df/2, Varijansa (1-f/2)Df/2. [Slično normalnoj raspodeli ukoliko je D> 15].
Slučaj 3: Majka je heterozigot, a beba je homozigot
[0096]
● U ovom slučaju posmatrane učestalosti učestalijih i ređih alela su bliske i A/D je nešto ispod 0,5.
● Isključivanje greške, E(A) = D(1-f)/2 i E(1 - (2A/D)) = f
● Isključivanje greške, A ~ Binomna raspodela ((1-f)/2, D). Srednja vrednost D((1-f)/2), Varijansa D/4(1-f^2).
Slučaj 4: Majka je heterozigot i beba je heterozigot
[0097] Zapaziti da, uz isključivanje greške, postoje dve potklase u navedenom slučaju.
Slučaj 4.1: Alel od oca se razlikuje od majčinih alela
[0098] Navedno bi uvelo treći alel koji bi predstavljao ređi alel sa E(A) = Df/2. Ovi slučajevi ne bi trebali da imaju uticaj na procene za f pošto će procedura za raspodelu sekvenci po amplikonima izdvojiti ove slučajeve kada su referentni SNP-ovi bialelni.
Slučaj 4.2: Alel od oca se poklapa sa jednim od majčinih alela
[0099]
● U ovom slučaju, uz isključivanje greske, dva alela bi se pojavila sa odnosom 1:1, tako da ovaj slučaj nije koristan za procenu fetalne frakcije.
● Isključivanje greške, E(A) = 0.5, i A ~ Binomna raspodela(0.5, D) skraćena na 0.5.
[0100] Na Slici je 4 prikazan grafikon broja kopija ređeg alela A nasuprot pokrivenosti D (uz pretpostavku da nema greške) za slučajeve heterozigotnosti od 1 do 4.
[0101] U raznim primerima izvođenja, postupak široko razmatra analizu učestalosti alela za jedan ili više SNP-ova (ili za druge polimorfizme) kako bi se polimorfizmi klasifikovali kao oni koji pripadaju slučaju 2 i/ili slučaju 3. Upotrebom učestalost alela i udruživanjem podataka sa klasifikacijom, postupak može proceniti fetalnu frakciju.
[0102] U pojedinim slučajevima, navedni broj kopija alela A i pokrivenost D, preciznije rečeno (D,A), za pojedinačnu SNP poziciju omogućavaju da se postupcima utvrdi procena u vidu jedne tačka. Na primer, određeni postupci klasifikuju SNP sa brojem kopija alela (D,A) u jedan slučaj i izvode procenu fetalne frakcije na sledeći način:
ES1.1 Jednostavni pragovi za određivanje tipa slučaja
[0103] Imajući u vidu pojedinačnu poziciju (SNP), može se
1. Odlučiti da je u pitanju slučaj 1, ukoliko je funkcija odluke tipa 2A/D <e ili kada je definisana kritična vrednost Binomne (e,D) ili Poasonove raspodele (De). Upotreba alternativne distribucije je takođe predmet ovog pronalaska. Nema procene fetalne frakcije (f).
2. Odlučiti da je u pitanju slučaj 4, ukoliko je 2A/D > (0.5-e) ili kada je kritična vrednost Binomne raspodele (0.5, D) (ili druge pogodne aproksimativne raspodele). Ne koristiti poziciju za procenu f.
3. U suprotnom, odlučiti da je u pitanju slučaj 2 ukoliko je 2A/D < 0,25 (ili ukoliko je manualno postavljena ili automatski procenjena vrednost praga). Fetalna frakcija f se procenjuje kao 2A/D
4. Sve preostalo predstavlja slučaj 3. Upotrebiti procenu fetalne frakcije f = (1-2A/D).
[0104] Tačnost se može dobiti kombinovanjem informacija o broju kopija alela iz nekoliko SNP-ova da bi se procenila fetalna frakcija.
Postupak EM1: Kombinovanje više SNP-ova putem usrednjavanja.
[0105] Uzeti srednju vrednost, medijanu, drugi centralni parametar (na primer: dvostuku težinu iz Tuki testa, m-ocenu itd...). Može takođe biti upotrebljen ponderisan prosek. Za primer kako ocene težine mogu biti definisane pogledati EM2.4 ispod. Mogu biti upotrebljene i dodatne robusne mere centralne tendencije.
Postupak EM2: Istovremena procena iz slučaja 2 i slučaja 3 transformacijom
[0106] Za slučajeve gde je f manje od X%, vrednosti (D,A) slučaja 3 mogu biti transformisane tako da se poklope sa vrednostima slučaja 2. Iz ove linije može biti izračunat običan nagib, regresionom analizom kroz koordinatni početak (pogledati Sliku 5).
[0107] Jedan od teorijskih nedostataka postupaka zasnovanih na transformaciji jeste što će binomna raspodela za slučajeve 2 i 3 imati različit oblik. Pri uobičajenim nivoima fetalne frakcije (<10%) podaci slučaja 2 će imati distribuciju blisku Poasonovoj raspodeli izmesteoj na desno, dok će slučaj 3 biti sa distribucijom koja je bliska normalnoj.
[0108] Nacrt 5 prikazuje transformaciju podataka slučaja 3 na slučaj 2. Jedna regresiona analiza tako može proceniti f na osnovu oba slučaja istovremeno.
Postupak izračunavanja EM2.3:
Korak 1: Izbacivanje podataka slučaja 4
[0109] Ukoliko je A > (0.5D-T1), za svaki podatak (D,A) isklјučiti (D,A) iz dalјe analize. T1(D,A) je funkcija realnih brojeva.
Korak 2: Transformacija podataka slučaja 3
[0110] Pogledati Sliku 6. Ukoliko je A > T2*D, za svaki podatak (D,A) za koji nije utvrđeno da iznosi 4, transformisanti tačke u nove koordinate (D1,A1). T2(D,A) je funkcija realnih brojeva.
Korak 3: Uspostavljanje praga DT da bi se redukovala kontaminacija iz podataka slučaja 1
[0111] Zanemariti sve tačke podataka ispod T2(D,A) funkcije realnih brojeva.
Korak 4: Procena regresije za preostale transformisane podatke slučaja 2 i 3.
[0112] Primeniti regresionu analizu tipa kroz koordinatni početak na preostale tačake. Procena fetalne frakcije je dvostruka vrednost nagiba regresione krive.
[0113] Zapaža se da mnoge klase transformacija mogu biti konstruisane da bi se postigla ista raspodela podataka slučaja 2 i 3. Primeri uklјučuju trigonometrijsku, transformacionu ili upotrebu matrica rotacija. Namera je da navedena odstupanja budu uključena u predmet ove prijave. Pored toga, mogu biti upotrebljene mnoge klase regresione analaize (L2, L1, ....) ili optimizacije. Zamena algoritma za optimizaciju je trivijalna promena i predmet je ove prijave.
[0114] Nacrt 6 prikazuje podatke nakon rotacije. Izban je D1 tako da se slučaj 1 i slučajevi 2 i 3 ne preklapaju. E1 predstavlјa gornju granicu intervala poverenja od 99 procenata za podatke slučaja 1.
Postupak EM3: Ponderisanje najmanjih kvadrata
[0115] Regresioni postupak iz EM2.3 pretpostavlјa da sve prevedene tačke podataka imaju jednaku varijansu. Ispravnije je da se uračunava heteroskedastičnost različitih izvora podataka i čak tačaka iz istog obrazca heterozigoznosti.
Koraci od 1 do 3 su identični sa EM2.3.
Korak 4: Regresija
[0116] U regresiji iz EM2.3, tačke podataka iz slučaja 2 će imati varijansu v2(f,D) = [0,5*Df -0,25*Df^2], a tačke iz podataka 3 slučaja će imati varijansu v3(f,D) = [0,25D(1-f^2)]. Pod pretpostavkom da svaku tačku odredimo drugačiju težinu, w, kao u EM2.3, težimo da se minimizuje
Jednačina 1
[0117] Postavlјanje prvih derivata na nulu i rešavanje za s:
Jednačina 2
[0118] Navedeni ponderisani postupak je sa inverznom varijansom svake tačke, procenjenom kao v2(2A/D,D) ili v3(2A/D, D) po potrebi. Procena fetalne frakcije je 2*s.
[0119] U određenim primerima izvođenja, model verovatnoće distribucije u mešavini može biti upotrebljen za klasifikaciju kolekcije polimorfizama u dva ili više slučaja zigotnosti i istovremenu procenu frakcije fetalne DNK na osnovu srednje vrednosti učestalosti alela za svaki od ovih slučajeva. Generalno, model mešavine pretpostavlјa da se određena kolekcija podataka sastoji od mešavine različitih vrsta podataka, od kojih svaka ima svoju očekivanu distribuciju (npr. normalnu distribuciju). Proces pokušava da pronađe srednju vrednost i eventualno druge karakteristike za svaku vrstu podataka. U primerima izvođenja koji su ovde opisani, postoje do četiri različita tipa podataka (slučajevi zigotnosti) koji koriguju podatke učestalosti ređih alelea za polimorfizme koji se razmatraju.
[0120] Jedna primena modela verovatnoće distribucije u mešavini je predstavlјena u sledećem paragrafu. U ovom primeru izvođenja, učestalost ređeg alela A predstavlja zbir četiri pojma kao što je prikazano u jednačini 3. Svaki od pojmova odgovara jednom od četiri slučaja zigotnosti. Svaki pojam je proizvod frakcije polimorfizma α i binomske raspodele učestalosti ređeg alela. Frakcije polimorfizama koji pripadaju svakom od četiri slučaja su označene sa α. Svaka binominalna distribucija ima pridruženu verovatnoću, p, i pokrivenost, d. Verovatnoća ređeg alela za slučaj 2, na primer, data je sa f/2.
[0121] Primeri izvođenja koji su prijavljeni upotrebljavaju "faktorske momente" za podatke o učestalosti alela koji se razmatraju. Kao što je poznato, srednja vrednost predstavlja prvi momenat. To je očekivana vrednost učestalosti ređeg alela. Varijansa je drugi momenat. Ona se izračunava kao kvadrat očekivane vrednosti učestalosti alela.
[0122] Podaci o frekvenciji alela za sve polimorfizmima mogu biti upotrebljeni za izračunavanje faktorskih momenta (prvi faktorski momenat, drugi faktorski momenat itd.) kao što je prikazano u jednačini 4. Kao što ove jednačine ukazuju, faktorski momenti predatvaljau zbir pojmova iznad i, pojedinačnih polimorfizama u skupu podataka, gde postoji n takvih polimorfizama u skupu podataka. Izrazi koji se sumiraju su funkcije brojeva kopija ređih alela, ai, i pokrivenosti di.
[0123] Korisno je što faktorijalni momenti imaju odnos sa vrednostima (αii pikao što je ilustrovano u jednačini 5. Iz verovatnoća, pi, se može odrediti fetalna frakcija, f. Na primer, p2= f/2 i p3je 1-f/2. Stoga, logičkim operacijama se rešiti sistem jednačina za dobijanje relacija nepoznatih α i p sa faktorskim momentom ekspresija frakcije ređeg alel duž višestrukih polimorfizama koji se razmatraju. Naravno, predmet pronalaska si i druge tehnike za rešavanje modela verovatnoće distribucije u mešavini.
[0124] Korisno je dalјe razmotriti matematičke ili simboličke osnove primera izvođenja modela verovatnoće distribucije u mešavni koji je ovde opisan. Četiri slučaja heterozigoznosti koji su prethodno opisani sugerišu sledeći binomni model verovanoće distribuciji u mešavini za sve ai u tačkama (ai,di):
Jednačina 3
[0125] Razni modeli relacija pisa fetalnom frakcijom i stopama grešaka u sekvenciranju su opisane u nastavku teksta. Parametri αise odnose na parametre specifične za populaciju i sposobnost da ove "float" vrednosti daju navednim postupcima dodatnu robusnost u odnosu na faktore kao što su etnička pripadnost i potomstvo roditelјa.
[0126] Za različite slučajeve heterozigotnosti gornja jednačina može biti rešena da bi se odredila fetalna frakcija. Možda je najlakši način rešavanja fetalne frakcije postupkom faktorskih momenata u kome se parametri mešavine mogu izraziti kroz momente koji se lako mogu proceniti na osnovu posmatranih podataka.
[0127] Imajući u vidu n SNP pozicija, faktorski momenti su definisani na sledeći način:
Jednačina 4
[0128] Faktorski momenti mogu biti dovedni u relaciju sa {αi, pi} sa
Jednačina 5
[0129] Rešenje može biti identifikovano rešavanjem za {αi, stri} u sistemu jednačina izvedenih iz prethodno navedenog odnosa Jednačine 5 kada je n > 2*(broj parametara koji treba proceniti). Očigledno, problem postaje matematički mnogo teži za visoki g pošto je potrebno proceniti više {αi, stri}.
[0130] Obično nije moguće precizno diskriminisati podatke slučaja 1 i 2 (ili slučaja 3 i 4), jednostavnim postavljanje pragova u slučaju niskih fetalnih frakcija. Na sreću, za upotrebu modela sa redukovanim brojem slučajeva, podaci slučaja 1/2 se lako razdvajaju od podataka slučaja 3⁄4, diskriminacijom u tački (2A/D) = T. Utvrđeno je da je upotreba T = 0,5 zadovolјavjuća.
[0131] Potrebno je napomenuti da postupak modeliranja verovatnoće distribucije u mešavini koji koristi jednačine 4 i 5 upotrebljava podatke za sve polimorfizme ali ne uračunava posebno grešku sekvenciranja. Pogodni postuci koji razdvajaju podataka prvog i drugog slučaja od podataka za treći i četvrti slučaj mogu uračunavati grešku u sekvenciranju.
[0132] U dalјim primerima, skup podataka koji se primenjuje u model mešavine sadrži podatke samo za polimorfizme slučaja 1 i slučaja 2. Ovo su polimorfizmi za koje je majka homozigotna. Tehnika praga može biti upotrebljena za polimorfizama slučaja 3 i 4. Na primer, polimorfizmi sa učestačošću ređeg alela većom od određenog praga se eliminišu pre upotrebe modela mešavine. Upotrebom adekvatno filtriranih podataka i faktorskih momenata koji su redukovani jednačinama 7 i 8, može se izračunati fetalna frakcija, f, kao što je prikazano u jednačini 9. Potrebno je napomenuti da jednačina 7 predstavlja korigovanu jednačinu 3 zarad primene u modelu verovatnoće distribucije u mešavini. Potrebno je takođe napomenuti da u ovom konkretnom primeru, greška sekvenciranja koja se javlja pri očitavanjima aparata nije poznata. Kao posledica toga, sistem jednačina mora posebno rešavati grešku, e.
[0133] Na slici 7 je prikazano poređenje rezultata dobijenih upotrebom ovog modela mešavine, kao i poznate fetalne frakcije (x osa) i procenjene fetalne frakcije. Da je model mešavine savršeno predvideo fetalnu frakciju, plotovani rezultati bi sledili isprekidanu liniju. Ipak, procenjene frakcije su izuzetno dobre, naročito imajući u vidu da je veliki deo podataka eliminisan pre primene modela mešavine.
[0134] Da bi se detalјnije razmotrila situacija, treba napomenuti da je dostupno nekoliko drugih postupaka za procenu parametara modela iz jednačine 3. U pojedinim slučajevima, do rešenje koja se može prilagoditi se može doći postavljanjem derivata statističke analize najmanjih kvadrata na nulu. U slučajevima kada se ne može lako naći rešenje direktnom diferencijacijom, serije ekspanzija binomnog PDF po Tejloru ili drugi aproksimativni polinomi mogu biti efikasni. Minimalni estimatori metode najmanjih kvadrata su dobro poznati kao efikasni.
Jednačina 6
[0135] Pi je broj tačaka broja kopija i. Alternativni postupak iz publikacije Le Cam-a ["On the Asymptotic Theory of Estimation and Testing Hypotheses" Proceedings of the Third Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability, vol. 1 Berkeley CA: University of CA Press, 1956, str. 129-156] koristi Ralf-Njutonovu iteraciju funkcije verovatnoće. Postupak rešenja momenata iz Jednačine 5 može biti upotrebljen kao polazna tačka za iteraciju.
[0136] U drugoj primeni postupka za razrešavanje modela smeše koji uključuje postupke maksimizacije očekivanja, diskutuje se rad na mešavinama sa aproksimativnim Beta distribucijama.
Model slučajeva (1 2), greška sekvenciranja nepoznata
[0137] Potrebno je razmotriti redukovani model koji uzima u obzir samo slučajeve heterozigotnosti 1 i 2. U ovom slučaju distribucija mešavine može biti napisana kao
Jednačina 7
a sistem
Jednačina 8
se rešava za e (stopa greške sekvenciranja), alfa (vrednost proporcionalnosti slučaja 1) i f (fetalna frakcija). Fi je definisan kao prethodno, u jednačini 4. Algebarsko rešenje za fetalnu frakciju je izabrano da bude stvarno rešenje
Jednačina 9
koje je između 0 i 1.
[0138] Da bi se ocenile performanse estimatora, konstruisan je simulirani skup podataka tačaka (ai, di) po Hardi-Vajnbergovom principu ravnoteže, pri čemu je dizajn bio da fetalna frakcija bude {1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20% i 25%}, a konstanta stope greške sekvenciranja 1%. Stopa greške od 1% je trenutno prihvaćena stopa za aparate za sekvenciranje i protokole koje koristimo i usklađen je sa grafikom podataka sa instrumenta Illumina Genome analyzer II koji su prikazani na slici 3 iznad. Jednačina 9 je primenjena na podatke i utvrđeno je, sa izuzetkom pozitivne pristrasnosti za četiri tačke, generalno slaganje sa "poznatom" fetalnom frakcijom. Zanimlјivo je da je stopa greške sekvenciranja, e, procenjena na nešto iznad 1%.
[0139] U sledećem primeru modela mešavine, tehnika postavljanja praga ili druga tehnika filtriranja je ponovo upotrebljena da bi se uklonili podaci za polimorfizme koji pripadaju slučajevima 3 i 4. Međutim, u ovom slučaju je poznata greška sekvenciranja. Navedeno pojednostavlјuje rezultujući izraz za frakciju fetalne DNK, f, što je prikazano u jednačinama 10. Slika 8 pokazuje da je ova verzija modela mešavine obezbedila poboljšane rezultate u odnosu na pristup koji upotrebljava jednačinu 9.
[0140] Sličan pristup je prikazan u jednačinama 11 i 12. Ovaj pristup prepoznaje da samo neke greške sekvenciranja pridodaju broj kopija ređeg alela. Umesto toga, svaka četvrta greška sekvenciranja bi trebala da poveća broj kopija ređeg alela. Slika 9 pokazuje izuzetno dobro slaganje između stvarnih i procenjenih fetalnih frakcija upotrebom ove tehnike.
Model slučajeva (1 2), poznata greška sekvenciranja
[0141] Pošto je stopa greške sekvenciranja aparata koji je upotrebljen poznata u velikoj meri, pristrasnost i složenost izračunavanja može biti redukovana eliminisanjem e kao varijable koju je potrebno rešiti. Stoga, dobijamo sistem jednačina
Jednačina 10
za fetalnu frakciju f da bi se dobilo rešenje:
[0142] Slika 8 pokazuje da upotreba stope greške aparata kao poznatog parametra redukuje pristrasnost za jedan podeok.
Model slučajeva (1 2), poznata greška sekvenciranja, pobolјšani modeli grešaka
[0143] Da bismo pobolјšali pristrasnost u modelu, proširili smo model greške prethodno navedenih jednačina da bi se uračunala činjenica da svaki događaj greške prilikom sekvenciranja ne doprinosi povećanju broja kopija ređeg alela A=ai u slučaju heterozigotnosti slučaja 1. Nadalje, u obzir je uzeta činjenica da događaji greške sekvenciranja mogu doprineti povećanju heterozigotnosti broja kopija slučaja 2. Otuda je fetalna frakcija F određena rešavanjem sledećeg sistema relacija faktorijalnih momenata:
Jednačina 11
što daje rešenje
Jednačina 12
[0144] Na slici 9 je pokazano da simulirani podaci, upotrebom stope greške aparata kao poznatog parametra, pobolјšavaju model grešaka slučajeva 1 i 2 i time značajno redukuju pozitivnu pristrasnost do ispod podeoka, za fetalnu frakciju do ispod 0,2.
Mogućnosti primene
UZORCI
[0145] Uzorci koji se upotrebljavaju u primerima izvođenja koji su ovde prijavljeni obuhvataju genomsku DNK koja je ćelijska ili oslobođena od ćelija. Ćelijska DNK je izolovana iz celih ćelija ručno ili mehaničkom ekstrakcijom genomske DNK iz celih ćelija istog ili različitog genetskog sastava. Ćelijska DNK se može dobiti, na primer, iz celih ćelija istog genetskog sastava koje su dobijene iz jednog subjekta, iz mešavine celih ćelija različitih subjekata ili iz mešavine celih ćelija jednog subjekta koje se razlikuju po genetskom sastavu. Postupci za ekstrahovanje genomske DNK iz celih ćelija su poznati u stanju tehnike i razlikuju se po vrsti izvora iz koga se ekstrahuje DNK.
[0146] U pojedinim slučajevima, prednost može imati fragmentacija ćelijske genomske DNK. Fragmentacija može biti nasumična ili može biti specifična, što se postiže, na primer, upotrebom digestije restrikcionim endonukleazama. Postupci nasumične fragmentacije su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, na primer, ograničenu digestiju DNazom, alkalni tretman i fizičko cepanje DNK. U određenim primerima izvođenja, uzorak nukleinskih kiselina se podvrgava fragmentaciji u fragmente dužine od približno 500 ili više baznih parova, na koje se zatim lako može primeniti tzv. sekvenciranje sledeće generacije (NGS). U jednom primeru izvođenja, uzorci nukleinskih kiselina se dobijaju kao cfDNK koja se dalje ne podvrava fragmentaciji.
[0147] DNK oslobođena od ćelija predstavlja genomsku DNK koja se u prirodi javlјa kao mešavina genomskih fragmenata, obično u biološkim tečnostima, npr. krvi subjekta. Genomska mešavina može biti izolovana iz ćelija koje prirodnim putem, biološkim procesom, oslobađaju svoj genomski sadržaj, npr. putem apoptoze. Uzorak cfDNK može sadržavati cfDNK dobijenu iz mešavine ćelija različitih subjekata iste vrste, iz mešavine ćelija jednog subjekta koje se razlikuju po genetskom sastavu ili iz mešavine ćelija iz različitih vrsta, npr. subjekata.
[0148] Nukleinske kiseline oslobođena od ćelija, uklјučujući DNK oslobođenu od ćelija, mogu biti dobijene raznim postupcima koji su poznati u stanju tehnike, iz bioloških uzoraka, uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na, plazmu, serum i urin (Fan i saradnici, ProcNatlAcadSci 105:16266-16271 [2008]; Koide i saradnici, Prenatal Diagnosis 25:604-607 [2005]; Chen i saradnici, Nature Med.
2:1033-1035 [1996]; Lo i saradnici, Lancet 350:485-487 [1997]; Botezatu i saradnici, Clin Chem.
46:1078-1084, 2000; i Su i saradnici, J Mol. Diagn.6:101-107 [2004]). Za razdvajanje cfDNK od ćelija, mogu biti upotrebljeni postupci frakcionisanja, centrifugiranja (npr. centrifugiranje na gradijentu gustine), precipitacije DNK ili sortiranja i/ili razdvajanja ćelija velikog obima. Dostupni su i komercijalni kompleti za manualno i automatsko razdvajanje cfDNK (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, Qiagen, Valencia, CA, Macherey-Nagel, Duren, DE).
[0149] Uzorak koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina na koju se primenjuju postupci koji su ovde opisani, može predstavljati biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uzorak biološke tečnosti ili uzorak ćelija. U pojedinim primerima izvođenja, mešavina nukleinskih kiselina se prečišćava ili izoluje iz biološkog uzorka, bilo kojim od poznatih postupaka. Uzorak može biti i prečišćen ili izolovan polinukleotid. Primeri bioloških tečnosti uklјučuju, ali nisu ograničeni samo na, krv, plazmu, serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, sekret ušiju, limfu, plјuvačku, cerebrospinalnu tečnost, tečnost dobijenu ispiranjem (lavažu), suspenziju kosne srži, vaginalni sekret, transcervikalnu lavažu, tečnost mozga, ascite, mleko, sekrete respiratornog, intestinalnog i genitourinarnog trakta, amnionsku tečnost i uzorke leukoforeze. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak je uzorak koji se lako dobija neinvazivnim procedurama iz npr. krvi, plazme, seruma, znoja, suza, sputuma, urina, sputuma, sekreta ušiju, plјuvačke ili fecesa. Prioritetno, biološki uzorak je uzorak periferne krvi ili frakcija plazme i seruma. U drugim primerima izvođenja, biološki uzorak je bris ili razmaz, uzorak biopsije ili kultura ćelija. U sledećem primeru izvođenja, uzorak je mešavina dva ili više bioloških uzoraka, npr. biološki uzorak može sadržavati dva ili više uzorka biološke tečnosti, uzorak tkiva i uzorak kulture ćelija. U tekstu pronalaska, pojmovi "krv", "plazma" i "serum" izričito označavaju i njihove frakcije ili obrađene delove. Slično tome, kada se uzorak uzima iz biopsije, sa brisa itd, "uzorak" obavezno podrazumeva i obrađenu frakciju ili deo materijala koji je dobijen iz biopsije, sa brisa, razmaza itd.
[0150] U pojedinim primerima izvođenja, uzorci se mogu dobiti iz različitih izvora, uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na, različite individue, različite razvojne faze istih ili različitih individua, različitie obolele individue (npr. individue obolele od kancera ili one za koje se sumnja da imaju genetski poremećaj), normalne individue, kao i uzorke dobijene u različitim stadijumima bolesti kod individue, uzorke dobijene iz individua koje su podvrgavane različitim tretmanima oboljenja, uzorke individua izloženih različitim sredinskim faktorima ili individua koje imaju predispoziciju ka patologiji, ili pak individua koje su bile izložene agensima koji dovode do infektivnih oboljenja (npr. HIV-u).
[0151] U jednom primeru izvođenja, uzorak predstavlja uzorak majke koji je dobijen iz trudne individue, na primer, trudne žene. U ovom slučaju, uzorak može biti analiziran upotrebom postupaka koji su ovde opisani da bi se obezbedila prenatalna dijagnoza potencijalnih hromozomskih abnormalnosti kod fetusa. Uzorak majke može biti uzorak tkiva, uzorak biološke tečnosti ili uzorak ćelija. Primeri biološke tečnosti uklјučuju, ali nisu ograničeni samo na, krv, plazmu, serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, sekret ušiju, limfu, plјuvačku, cerebrospinalnu tečnost, lavažu, suspenziju kosne srži, vaginalni sekret, transcervikalnu lavažu, tečnost mozga, ascite, mleko, sekrete respiratornog, intestinalnog i genitourinarnog trakta, amnionsku tečnost i uzorke leukoforeze. U drugom primeru izvođenja, uzorak majke je mešavina dva ili više bioloških uzoraka, npr. biološki uzorak može sadržavati dva ili više uzorka biološke tečnosti, uzorak tkiva i uzorak kulture ćelija. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak je uzorak koji se lako može dobiti neinvazivnim procedurama iz npr. krvi, plazme, seruma, znoja, suza, sputuma, urina, sputuma, sekreta ušiju, plјuvačke ili fecesa. U pojedinim primerima izvođenja, biološki uzorak je uzorak periferne krvi ili frakcija plazme i seruma. U drugim primerima izvođenja, biološki uzorak je bris ili razmaz, uzorak biopsije ili kulture ćelija.
[0152] Uzorci takođe mogu biti dobijeni iz in vitro kultura tkiva, ćelija ili drugih izvora koji sadrže polinukleotide. Uzorci kultura mogu biti uzeti iz izvora koji uključuju, ali nisu ograničeni samo na, kulture (npr. tkiva ili ćelija) koje se održavaju u različitim medijumima i u različitim uslovima (npr. pri različitom pH, pritisku ili temperaturi), kulture (npr. tkiva ili ćelija) koje se gaje različit vremenski period, kulture (npr. tkiva ili ćelija) tretirane različitim faktorima ili reagensima (npr. kandidatima za lekove ili modulatorima) ili kulture različitih vrsta tkiva ili ćelija. Postupci izolovanja nukleinskih kiselina iz bioloških izvora su dobro poznati i razlikovaće se u zavisnosti od prirode izvora, a kao što je prethodno objašnjeno.
POLIMORFIZMI ZA UPOTREBU U IDENTIFIKACIJI GENOMSKE FRAKCIJE
[0153] Kao što je objašnjeno, polimorfizmi mogu biti upotrebljeni za određivanje fetalne frakcije. Za određivanje frakcije se upotrebljavaju frakcija alela i zigotnost jednog ili više polimorfizama. Primeri korisnih polimorfizma uklјučuju, bez ograničavanja, polimorfizme pojedinačnih nukleotida (SNP), tandemske SNP-ove, delecije ili insercije višestrukih baza malog obima označene kao IN-DELS (označene i kao polimorfizmi delecije/insercije ili DIP), multinukleotidne polimorfizme (MNP), polimorfizme kratkih tandemskih ponovaka (STR), polimorfizme u dužini restrikcionih fragmenata (RFLP), delecije, uklјučujući mikrodelecije, insercije, uklјučujući mikroinsercije, duplikacije, inverzije, translokacije, multiplikacije, kompleksne višestruke varijacije mesta polimorfizama, varijacije broja kopija (CNV) i polimorfizme koji obuhvataju bilo koju drugačiju promene sekvence u hromozomu.
[0154] U pojedinim primerima izvođenja, polimorfizmi koji se upotrebljavaju u prijavljenim postupcima, uključuju SNP i/ili STR polimorfizme. SNP polimorfizmi mogu biti tipa pojedinačnih i tandemskih SNP-ova. Pojedinačni SNP-ovi uklјučuju individualne SNP-ove i SNP-ove marker sekvenci, odnosno SNP-ove prisutne u haplotipu i/ili haplotipnom bloku. U pojedinim primerima izvođenja, upotrebljavaju se kombinacije polimorfizama. Na primer, razlike u broju kopija mogu biti detektovane poređenjem kombinacije polimorfnih sekvenci koja sadrži jedan ili više SNP-ova i jedan ili više STR polimorfizama.
[0155] U principu, svako polimorfno mesto koje može biti obuhvaćeno očitavanjima generisanim postupcima sekvenciranja koji su ovde opisani, može biti upotrebljeno za identifikaciju genomske frakcije u uzorcima koji sadrže DNK različitih genoma. Polimorfne sekvence korisne za sprovođenje postupaka pronalaska su dostupne u različitim javno dostupnim bazama podataka koje se i kontinuirano proširuju. Na primer, korisne baze podataka uklјučuju, bez ograničavanja, Bazu humnih SNP-ova na internet adresi wi.mit.edu, početnu stranicu NCBI dbSNP baze na internet adresi ncbi.nlm.nih.gov, bazu na internet adresi lifesciences.perkinelmer.com, Celera bazu humanih SNP-ova na internet adresi celera.com, SNP bazu podataka Grupe za analizu gena (GAN) na internet adresi gan.iarc.fr, ATCC bazu podataka za kratke tandemske ponovke (STR) na internet adresi atcc.org. i HapMap bazu podataka na internet aresi hapmap.org.
[0156] Broj polimorfizama koji mogu biti upotrebljeni prilikom utvrđivanja fetalne frakcije može iznosti najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ili više. Na primer, procenjuje se da lјudski genom sadrži najmanje oko 10 miliona SNP-ova. Stoga, broj raspoloživih polimorfizama koji mogu biti genotipizovani u uzorku iz humanog subjekta može iznositi najmanje oko 10 miliona SNP, ali se mogu upotrebiti i mnogi drugi tipovi polimorfizama prisutni u svakom humanom genomu. U pojedinim primerima izvođenja, identifikacija jednog ili više polimorfizama u prvom genomu uzorka koji sadrži mešavinu DNK, npr. cfDNK prvog i drugog genoma, može biti obavljena sekvenciranjem celokupnog genoma, upotrebom NGS postupka, a kao što je ovde opisano. U pojedinim primerima izvođenja, postupak sekvenciranja celokupnog genoma podrazumeva NGS postupak koji identifikuje polimorfne sekvence masovnim paralelnim sekvenciranjem molekula klonalno amplifikovanih nukleinskih kiselina ili masovnim paralelnim sekvenciranjem molekula jedne nukleinske kiseline, tj. sekvenciranjem pojedinačnog molekula.
PRIMENE
[0157] Frakcija nukleinske kiseline koja potiče iz svakog od dva različita genomska izvora u uzorku može biti upotrebljena u različite svrhe. U raznim primerima izvođenja koji su ovde opisani, frakcija fetalne DNK u materijalu uzorka sa DNK oslobođenom od ćelija se upotrebljava za lakše postavljanje prenatalnih dijagnoza i za pomoć u donošenju odluka vezanih za lečenje tokom trudnoća. U drugim primerima izvođenja, genomi koji se razmatraju ne predstavljaju genome majke i fetusa. Razni primeri izvora genoma u kojima se utvrđuje prisustvo frakcionog genoma su predstavlјeni u nastavku teksta.
[0158] Fetalne DNK i RNK oslobođene od ćelija koje cirkulišu u krvi majke, mogu biti upotrebljene za ranu neinvazivnu prenatalnu dijagnostiku (NIPD) sve većeg broja genetskih stanja, kako radi kontrole toka trudnoće, tako i zarad pomoći pri donošenju odluka vezanih za reprodukciju. Male količine cirkulišuće fetalne DNK su prisutne u krvotoku majke tokom trudnoće (Lo i saradnici, Lancet 350: 485-487 [1997]). Iako se smatralo da DNK potiče od umirujućih ćelija placente, pokazano je da se DNK oslobođena od ćelija sastoji od kratkih fragmenata koji su uobičajeno dužine manje od 200 bp (Chan i saradnici, ClinChem 50: 88-92 [2004]) i da se njihovo prisutvo u krvi majke može utvrditi veoma rano, već u 4. nedelјi trudnoće (Illanes i saradnici, Early Human Dev 83: 563-566 [2007]). Poznato je takođe da se njihovo prisustvo u cirkulacije majke gubi u roku od nekoliko sati nakon porođaja (Lo i saradnici, Am J Hum Genet 64: 218-224 [1999]). Pored cfDNK, u krvotoku majke je utvrđeno prisustvo fragmenta fetalne RNK oslobođene od ćelija (cfRNK) koja potiče od gena koji se prepisuju u fetusu ili placenti. Ekstrakcija i potonja analiza ovih fetalnih genetskih elemenata iz uzorka krvi majke nudi nove mogućnosti za NIPD.
[0159] Kao što je objašnjeno, postupci koji su ovde prijavljeni služe za određivanje frakcije drugog genoma u biološkom uzorku. Postupci opciono mogu poslužiti za utvrđivanje prisustva ili odsustva brojnih poremećaja, upotrebom uzorka krvi koji sadrži mešavinu DNK (kao što je cfDNK) prvog i drugog genoma. U pojedinim primerima izvođenja, određivanje fetalne frakcije može obuhvatati (a) sekvenciranje genoma najmanje jednog dela mešavine cfDNK, da bi se dobilo mnoštvo marker sekvenci; (b) utvrđivanje prisustva ili odsustva višestrukih polimorfizama u mnoštvu marker sekvenci, i (c) utvrđivanje asocijacije višestrukih polimorfizama sa prvim i/ili drugim genomom u mešavini. U prioritetnim primerima izvođenja, mešavina nije bogata višestrukim polimorfizmima. Identifikacija višestrukih polimorfizama u mešavini DNK se vrši upoređivanjem sekvence mapiranih marker sekvenci dobijenih postupkom sekvenciranja celokupnog genoma sa referentnim sekvencama koje sadrže višestruke polimorfizme, a kao što je ovde opisano.
[0160] U primerima izvođenja koji su prethodno prijavljeni, prvi genom označava genom fetusa, dok drugi genom predstavlja genom majke. U drugom primeru izvođenja, prvi genom je genom neizmenjene ćelije, a drugi genom je genom iz izmenjene ćelije, npr. ćelija kancera. U pojedinim primerima izvođenja, izmenjene i neizmenjene ćelije se dobijaju iz istog subjekta. Na primer, izmenjena ćelija može biti ćelija čiji je genom izmenjen poremećajem. U pojedinim primerima izvođenja, poremećaj označava monogenski poremećaj. U drugim primerima izvođenja, poremećaj je poligenski poremećaj. Poremećaji mogu biti identifikovani jednim polimorfizmom, npr. SNP-om marker sekvence ili višestrukim polimorfizmima prisutnim u haplotipu. U pojedinim primerima izvođenja, višestruki polimorfizmi identifikovani postupkom pronalaska su prisutni u haplotipnom bloku.
[0161] Poremećaji koji mogu biti identifikovani upotrebom predmetnog postupka predstavljaju genetske poremećaje, odnosno oboljenja uzrokovana, barem delom, abnormalnostima u genima ili hromozomima. Poznavanje fetalne frakcije u uzorku može pomoći u identifikaciji navedenih poremećaja u kontekstu prenatalne dijagnostike. Poremećaji identifikovani predmetnim postupkom uključuju monogenske tj. poremećaje jednog gena, kao i poligene, tj. složene poremećaje. Poremećaji jednog gena obuhvataju autozomno-dominantne, autozomno-recesivne, X-vezane dominantne, X-vezane recesivne i Y-vezane poremećaje.
[0162] U autozomno-dominantnim poremećajima je potrebna samo jedna mutirana kopija gena da bi kod individue došlo do pojave poremećaja. Uobičajeno je da individua sa poremećajem ima jednog roditelja sa poremećajem i da šansa da će potomstvo naslediti mutirani gen iznosi 50%. Stanja koji su autozomno-dominantna ponekada imaju smanjenu penetrabilnost, što znači da iako je potrebna samo jedna mutirana kopija, do razvijanja bolesti ne dolazi kod svih individua koje su tu mutaciju nasledile. Primeri autozomno-dominantnih poremećaja koji mogu biti identifikovani predmetnim postupkom uključuju, bez ograničavanja samo na njih, familijarnu hiperholesterolemiju, naslednu sferocitozu, Marfanov sindrom, neurofibromatozu tipa 1, nasledni nepolipni kolorektalni karcinom, nasledne višestruke egzostoze i Huntingtonovu bolest.
[0163] Autozomno-recesivni poremećaji koji mogu biti detektovani upotrebom predmetnog postupka uključuju srpastu anemiju, cističnu fibrozu, Taj-Sahovu bolest, Taj-Sahovu bolest, mukopolisaharidozu, bolesti skladištenja glikogena i galaktozemiju. X-vezani poremećaji detektabilni predmetnim postupkom uključuju Dišenovu mišićnu distrofiju i hemofiliju. U autotozomnorecesivnim poremećajima, dve kopije gena moraju biti mutirane da bi subjekat oboleo od autotozomno-recesivnog poremećaja. Individue sa poremećajem obično imaju roditelјe koji nemaju poremećaj, pri čemu svaki od roditelja nosi jednu kopiju mutiranog gena (i označava se kao nosilac).
Dvoje ljudi koji nisu oboleli, a od kojih svaki nosi jednu kopiju mutiranog gena, imaju šansu od 25% da nakon svake trudnoće dobiju dete sa poremećajem. Primeri ovakvih vrsta poremećaja koji mogu biti identifikovan predmetnim postupkom uključuju: cističnu fibrozu, srpastu anemiju, Taj-Sahovu bolest, Njuman-Pikovu bolest, spinalnu mišićnu atrofiju i Robertov sindrom. Pojedini drugi fenotipovi, kao što su vlažan nasuprot suvog voska u ušima, takođe su determinisani na autozomnorecesivan način. Uzrok X-vezanih dominantnih poremećaja su mutacije u genima na X hromozomu. Samo nekoliko poremećaja ima ovakav obrazac nasleđivanja, a najvažniji primer je X-vezani hipofosfatemični rahitis. Od ovog poremećaja oboljevaju i muškarci i žene, pri čemu muškarci obično više oboljevaju od žena. Pojedina X-vezana dominantna stanja kao što su Retov sindrom, inkontinencija pigmenti tipa 2 i Ajkardi sindrom su obično fatalna kod muškaraca i stoga se pretežno sreću kod žena. Izuzeci od ovog nalaza su izuzetno retki slučajevi u kojima dečaci s Klinefelterovim sindromom (47, XXY) takođe nasleđuju X-vezano dominantno stanje i ispoljavaju simptome koji su po ozbilјnosti slični onima koji se javljaju kod žena. Šanse za prenošenje X-veznanog dominantnog poremećaja se razlikuju između muškaraca i žena. Sinovi čoveka sa X-vezanim dominantnim poremećajem neće biti sa poremećajem (budući da dobijaju Y hromozom oca), dok će njegove ćerke naslediti stanje. Žena sa X-vezanim dominantnim poremećajem ima šansu od 50% da u svakoj trudnoći fetus bude sa poremećajem, iako treba napomenuti da su u principu, u slučajevima kao što je inkontinencija pigmenti, samo ženski potomci vijabilni. Pored toga, iako navedena stanja ne menjaju plodnost sama po sebi, individue sa Retovim sindromom ili Ajkardi sindromom se retko razmnožavaju.
[0164] Predmetni postupak takođe može olakšati identifikaciju polimorfizama koji asociraju sa X-vezanim poremećajima. Uzrok X-vezanih recesivnih stanja su takođe mutacije u genima na X hromozomu. Muškarci su češće pogođeni od žena, a šanse da se prenese poremećaj se razlikuju između muškaraca i žena. Sinovi čoveka sa X-vezanim recesivnim poremećajem neće biti sa poremećajem, dok će njegove ćerke nositi jednu kopiju mutiranog gena. Žena koja je nosilac X-vezanog recesivnog poremećaja (X<R>X<r>) ima šansu od 50% da dobije sinove koji su sa poremećajem i 50% šanse da ima ćerke koji nose jednu kopiju mutiranog gena i koje su time nosioci. X-vezana recesivna stanja uklјučuju, bez ograničavanja, ozbilјne bolesti poput hemofilije A, Dišenove mišićne distrofije i Leš-Nihanovog sindroma, kao i uobičajena i manje ozbilјna stanja kao što su muška ćelavosti i slepilo za crvenu i zelenu boju. X-vezana recesivna stanja se ponekad mogu manifestovati kod žena usled izmenjene inaktivacije X hromozoma ili X-monozomije (Tarnerovog sindroma).
[0165] Y-vezani poremećaji nastaju usled mutacija na Y hromozomu. Pošto muškarci nasledjuju Y hromozom od svojih očeva, svaki sin oca sa poremećajem će takođe imati poremećaj. Žene od očeva nasleđuju X hromozom, tako da kod ženskog potomstva nikada ne dolazi od pojave poremećaja. Kako je Y hromozom relativno mali i sadrži vrlo mali broj gena, relativno je mali broj Y-vezanih poremećaja. Simptomi često uklјučuju neplodnost koja se može zaobići upotrebom pojedinih postupaka lečenja steriliteta. Primeri su muška neplodnost i hipertrihoza pinnae.
[0166] Kao što je objašnjeno, prijavljeni postupci za detekciju genomskih frakcija u uzorku mogu biti upotrebljeni za olakšavanje detekcije aneuploidije iz materijala uzoraka. U pojedinim primerima izvođenja, aneuploidija je tipa potpune hromozomske trizomije ili monozomije, ili je pak tipa delimične trizomije ili monozomije. Delimične aneuploidije nastaju gubitkom ili dobijanjem dela hromozoma i podrazumevaju gubitak hromozomske ravnoteže usled neuravnoteženih translokacija, inverzija, delecija i insercija. Do sada, najčešća poznata aneuploidija koja je kompatibilna sa životom je trizomija 21, tj. Daunov sindrom (DS) koji nastaje usled prisutva dela ili čitavog hromozoma 21. Retko, uzrok DS može biti nasledni ili sporadični defekt u kome dodatna kopija celog ili dela hromozoma 21 postaje vezana za drugi hromozom (obično hromozom 14) usled čega se formira jedan aberantan hromozom. DS karkaterišu oštećenja intelektualnih sposobnosti, izražene teškoće u učenju i povećan mortalitet usled dugotrajnih zdravstvenih problema kao što je oboljenje srca. Druge aneuploidije sa poznatim kliničkim značajem uklјučuju Edvardov sindrom (trizomija 18) i Patauov sindrom (trizomija 13) koji su često fatalni u prvih nekoliko meseci života. Abnormalnosti koje asociraju sa brojem polnih hromozoma takođe su poznate i uklјučuju monozomiju X, npr. Tarnerov sindrom (XO), kao i sindrom trizomije X hromozoma (XXX) kod ženskih potomaka i Klinefelterov sindrom (XXY) i XYY sindrom kod muških potomaka. Svaki od ovih poremećaja asocira sa raznim fenotipovima, uklјučujući sterilnost i smanjenje intelektualnih sposobnosti. Monozomija X [45,X] je uobičajeni uzrok gubitka rane trudnoće kod približno 7% spontanih abortusa. Na osnovu učestalosti živorođenih kod 45,X (označenog i kao Tarnerov sindrom) od 1-2/10,000, procenjeno je da će manje od 1% 45,X zametaka preživeti do termina. Približno 30% pacijenata sa Tarnerovim sindromom ispoljava mozaicizam, odnosno prisustvo i 45,X i 46,XX ćelijskih linija ili pak prisustvo jedne linije koja sadrži rearanžiran X hromozom (Hook i Warburton 1983). Fenotip živorođenog deteta je relativno blag uzimajući u obzir visoku smrtnost embriona, tako da je postavljena hipoteza da verovatno svi živorođeni ženski potomci sa Tarnerovim sindromom nose liniju ćelija koja sadrži dva polna hromozoma. Monozomija X se može javiti kod ženskih individua kao 45,X ili 45,X/46,XX, a kod muških kao 45,X/46XY. U principu, pretpostavlja se da su autozomne monozomije kod ljudi nekompatibilne sa životom; ipak, postoji priličan broj citogenetskih izveštaja koji opisuju potpunu monozomiju jednog hromozoma 21 kod živorođene dece (VosranovaI i saradnici, Molecular Citogen.
1:13 [2008]; Joosten i saradnici, Prenatal Diagn. 17: 271-5 [1997]. Postupak pronalaska može biti upotrebljen za lakše postavljanje prenatalne dijagnoze ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti.
[0167] Prema pojedinim primerima izvođenja, fetalna frakcija može biti korisna za određivanje prisustva ili odsustva hromozomskih trizomija bilo kog od hromozoma 1-22, X i Y. Primeri hromozomskih trizomija koji mogu biti detektovani predmetnim postupkom uklјučuju, bez ograničavanja samo na njih, trizomiju 21 (T21; Daunov sindrom), trizomiju 18 (T18; Edvardov sindrom), trizomiju 16 (T16), trizomiju 20 (T20), trizomiju 22 (T22; sindrom mačijeg oka), trizomiju 15 (T15; Prader-Vilijev sindrom), trizomiju 13 (T13; Patau sindrom), trizomiju 8 (T8; Varkani sindrom), trizomiju 9 i trizomije tipa XXY (Klinefelterov sindrom), XYY ili XXX. Kompletna trizomija drugih autozoma u stanjima u kojima nije prisutan mozaicizam je smrtonosna, ali ista može biti kompatibilna sa životom ukoliko je mozaicizam prisutan. Važno je napomenuti da razne potpune trizomije, bez obzira da li je prisutan ili odsutan mozaicizam, kao i parcijalne trizomije, mogu biti određene u fetalnoj cfDNK upotrebom znanja koja su ovde izložena.
[0168] Neograničavajući primeri parcijalnih trizomija koji mogu biti određeni predmetnim postupkom uključuju, bez ograničavanja, parcijalnu trizomiju 1q32-44, trizomiju 9 p, mozaicizam trizomije 4, trizomiju 17p, parcijalnu trizomiju 4q26-qter, parcijalnu 2p trizomiju, parcijalnu trizomiju 1q i/ili parcijalnu trizomiju 6p/monozomiju 6q.
[0169] Postupci koji su ovde prijavljeni takođe mogu biti upotrebljeni kao ispomoć pri određivanju hromozomske monozomije X, hromozomske monozomije 21 i parcijalnih monozomija kao što su monozomija 13, monozomija 15, monozomija 16, monozomija 21 i monozomija 22, a za koje je poznato da imaju ulogu u spontanim pobačajima. Delimične monozomije hromozoma koja su uobičajeno uključene u potpune aneuploidije takođe može biti određene postupkom koji je ovde prijavljen. Neograničavajući primeri delecionih sindroma koji mogu biti određeni predmetnim postupkom uključuju sindrome čiji je uzrok delimična delecija hromozoma. Primeri delimičnih delecija koji mogu biti određeni predmetnim postupkom uklјučuju, bez ograničavanja, parcijalne delecije hromozoma 1, 4, 5, 7, 11, 18, 15, 13, 17, 22 i 10 koje su opisane u nastavku teksta.
[0170] Sindromi delecije 1q21.1 ili (rekurentne) mikrodelecije 1q21.1 su retka aberacija hromozoma 1. Pored sindroma delecije, postoji i sindrom duplikacije 1q21.1. Dok delecioni sindrom podrazumeva nedostatak dela DNK na određenom mestu, sindrom duplikacije karakteriše prisustvo dve ili tri kopije sličnog dela DNK na istom mestu. Literatura razmatra i delecije i duplikacije ovog tipa kao varijacije broja kopija (CNV) za 1q21.1. Delecija 1q21.1 može biti udružena sa TAR sindromom (trombocitopenija sa odsustvom radijusa).
[0171] Volf-Hiršhornov sindrom (WHS) (OMIN #194190) je sindrom delecije susednih gena asociran sa hemizigotnom delecijom hromozoma 4p16.3. Volf-Hiršhornov sindrom predstavalja kongenitalni malformacijski sindrom koga karakterišu pre- i postnatalni deficit rasta, poremećaj u razvoju varijabilnog stepena i dalje specifične kraniofacijalne karakteristike (pojava grbe na nosu tipa od “šlema grčkog ratnika”, visoko čelo, izražena glabela, razmaknute očne jabučice, obrve visoko postavljene na očnim lukovima, ispupčene oči sa epikantalnim naborima, kratki usni nabor, karakterističan oblik usta sa uglovima okrenutim nadole i uvučena brada), kao i pojava epiletičnih poremećaja.
[0172] Delimična delecija hromozoma 5, poznata i kao 5p- ili 5p minus koja se označava kao “sindrom mačijeg plača” (OMIN # 123450), nastaje usled delecije kratkog kraka (p kraka) hromozoma 5 (5p15.3-p15.2). Decu sa ovim stanjem često karakteriše plač prodornog zvuka koji liči na zvuk koji ispuštaju mačeka. Poremećaj prate intelektualni poremećaji i kašnjenje u razvoju, mala veličina glave (mikrocefalija), niska telesna težina na rođenju i slab tonus mišića (hipotonija) u detinjstvu, kao i pojava specifičnih facijalnih karakteristika i eventualno poremećaja u radu srca.
[0173] Viliams-Beurenov sindrom, poznat i kao sindrom delecije hromozoma 7q11.23 (OMIN 194050), je sindrom delecije susednih gena koji dovodi do multisistemskog poremećaja usled hemizigotne delecije regiona veličine od 1,5 do 1,8 Mb na hromozomu 7q11.23 u okviru koga se nalazi približno 28 gena.
[0174] Jakobsenov sindrom, poznat i kao delecioni poremećaj 11q, je redak urođeni poremećaj koji nastaje zbog delecije terminalnog regiona hromozoma 11 koja uključuje region 11q24.1. Poremećaj karakterišu intelektualni poremećaji, poseban izgleda lica i razni fizički problemi, uklјučujući oštećenja srca i poremećaj krvarenja.
[0175] Delimična monozomija hromozoma 18, poznata kao monozomija 18p, je redak hromozomski poremećaj u kome dolazi do delecije celog ili dela kraćeg kraka (p) hromozoma 18 (monozomno). Poremećaj obično karakterišu nizak rast, varjabilni stepen mentalne retardacije, kašnjenje govora, malformacija lobanje i regiona lica (kranofacijalne malformacije) i/ili dodatne fizičke abnormalnosti. Karakteristični kraniofacijalni defekti mogu značajno varirati u opsegu i ozbiljnosti od slučaja do slučaja.
[0176] Stanja koja nastaju usled promena u strukturi ili broju kopija hromozoma 15 uklјučuju Angelmanov sindrom i Prader-Vili sindrom, koji podrazumevaju gubitak aktivnosti gena u istom delu hromozoma 15, regionu 15q11-q13. Potrebno je napomenuti da nekoliko translokacija i mikrodelecija može biti asimptomatično kod roditelja nosioca, ali da iste mogu izazvati značajno genetsko oboljenje kod potomstva. Na primer, zdrava majka sa 15q11-q13 mikrodelecijom može roditi dete s Angelmanovim sindromom, teškim neurodegenerativnim poremećajem. Prema tome, postupak koji je ovde prijavljen može biti upotrebljen za identifikaciju navedene delimične delecije i drugih delecija kod fetusa.
[0177] Delimična monozomija 13q je redak hromozomski poremećaj koji se javlja usled nedostatka dela dugog kraka (q) hromozoma 13 (monozomalno). Deca rođena sa parcijalnom monozomijom 13q mogu ispoljiti nisku težinu na rođenju, malformacije glave i lica (kraniofacijalne regije), abnormalnosti skeleta (naročito ruku i stopala) i druge fizičke abnormalnosti. Mentalna retardacija je karakteristična za ovo stanje. Stopa mortaliteta među osobama rođenim sa ovim poremećajem je visoka tokom detinjstva. Skoro svi slučajevi parcijalne monozomije 13q se javljaju nasumično, bez jasnog razloga (sporadično).
[0178] Smit-Magenisov sindrom (SMS - OMIM #182290) nastaje zbog delecije ili gubitka genetskog materijala na jednoj kopiji hromozoma 17. Ovaj dobro poznati sindrom karakterišu kašnjenje u razvoju, mentalna retardacija, urođene anomalije kao što su oštećenja srca i bubrega, kao i neurobihejvioralne abnormalnosti poput teškog poremećaja spavanja i samopovređujućeg ponašanja. Smit-Magenisov sindrom (SMS) je u većini slučajeva (90%) izazvan intersticijskom delecijom veličine 3,7 Mb u okviru hromozomskog regiona 17p11.2.
[0179] Sindrom delecije 22q11.2, poznat i kao Di-Georgov sindrom, je sindrom izazvan delecijom malog dela hromozoma 22. Delecija (22q11.2) se javlјa u blizini sredine hromozoma na dugom kraku jednog od parova hromozoma. Karakteristike ovog sindroma široko variraju, čak i među članovima iste porodice, a pogađeni su mnogi delove tela. Karakteristični znaci i simptomi mogu uklјučivati defekte na rođenju kao što su urođene bolesti srca, defekti nepca koje najčešće prati neuromuskulaturni problem u zatvaranju usta (velo-faringealna insuficijencija), a nadalje se javljaju i teškoće u učenju, blago izmenjen izgled lica i sklonost ponovljenim infekcijama. Mikrodelecije u hromozomskom regionu 22q11,2 asociraju sa povećanim rizikom ka šizofreniji, za 20 do 30 puta.
[0180] Delecije u okviru kratkog kraka hromozoma 10 prati fenotip sličan feotipu Di-Georgovog sindroma. Delimična monozomija hromozoma 10p je retka, ali je primećena kod dela pacijenata sa karakteristikama Di-Georgovog sindroma.
[0181] U jednom primeru izvođenja, postupak pronalaska se koristi za lakše određivanje parcijalnih monozomija uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, parcijalnu monozomiju hromozoma 1, 4, 5, 7, 11, 18, 15, 13, 17, 22 i 10, npr. parcijalnu monozomiju 1q21.11, parcijalnu monozomiju 4p16.3, parcijalnu monozomiju 5p15.3-p15.2, parcijalnu monozomiju 7q11.23, parcijalnu monozomiju 11q24.1, parcijalnu monozomiju 18p, parcijalnu monozomiju hromozoma 15 (15q11-q13), parcijalnu monozomiju 13q, parcijalnu monozomiju 17p11.2, parcijalnu monozomiju hromozoma 22 (22q11.2). Parcijalna monozomija 10p se takođe može odrediti upotrebom predmetnog postupka.
[0182] Druge parcijalne monozomije koje mogu biti određene postupkom koji je ovde opisan uključuju nebalansiranu translokaciju t(8;11) (p23.2;p15.5); mikrodeleciju 11q23; deleciju 17p11.2; deleciju 22q13.3; mikrodeleciju Xp22.3; deleciju 10p14; mikrodeleciju 20p, [del(22)(q11.2q11.23)]; delecije 7q11.23 i 7q36; deleciju 1p36; mikrodeleciju 2p; neurofibromatozu tipa 1 (17q11.2 mikrodeleciju) ; deleciju Yq; mikrodeleciju 4p16.3; mikrodeleciju 1p36.2; deleciju 11q14; mikrodeleciju 19q13.2; Rubinštajn-Taibi sindrom (mikrodelecija 16p13.3); mikrodeleciju 7p21; Miler-Dajkerov sindrom (17p13.3) i mikrodeleciju 2q37. Delimične delecije mogu biti male delecije dela hromozoma ili mogu biti mikrodelecije hromozoma u kojima može doći do delecije jednog gena.
[0183] Identifikovano je nekoliko sindroma duplikacije koji nastaju zbog duplikacije dela kraka hromozma (pogledati OMIN bazu podataka [Online Mendelian Inheritance in Man, dostupnu na internet adresi ncbi.nlm.nih.gov/omim]). U jednom primeru izvođenja, predmetni postupak može biti upotrebljen za određivanje prisustva ili odsustva duplikacija i/ili multiplikacija segmenata bilo kog od hromozoma 1-22, X i Y. Neograničavajući primeri sindroma duplikacija koji mogu biti određeni predmetnim postupkom uklјučuju duplikacije dela hromozoma 8, 15, 12 i 17 koji su opisani u nastavku teksta.
[0184] Sindrom duplikacije 8p23.1 je redak genetski poremećaj koji nastaje duplikacijom regiona iz humanog hromozoma 8. Ovaj sindrom duplikacije je sa procenjenom prevalencom od 1 u 64,000 novorođenih i recipročan je sindromu delecije 8p23.1. Duplikaciju 8p23.1 prati pojava varjabilnih fenotipova koji uklјučuju jedan ili više od simptoma poput kašnjenja u govoru, kašnjenje u razvoju, blagog dismorfizma sa istaknutim čelom i visoko podignutim obrvama, kao i pojava urođenih srčaniih obolјenja (CHD).
[0185] Sindrom duplikacije hromozoma 15q (Dup15q) je klinički prepoznatlјiv sindrom koji nastaje usled duplikacije hromozoma 15q11-13.1. Bebe sa Dup15q uobičajeno karakteriše hipotonija (slab tonus mišića) i retardacija rasta; one se mogu roditi sa rascepljenom usnom i/ili nepcem, kao i sa malformacijama srca, bubrega ili drugih organa; deca ispoljavaju određeni stepen kognitivnog kašnjenja/poremećaja (mentalna retardacija), kašnjenje u govoru i jezičkom izražavanju, kao i poremećaje obrade senzornih nadražaja.
[0186] Palister-Kilijanov sindrom nastaje kao posledica prisustva dodatnog hromozomskog materijala na #12. Obično je prisutna mešavina ćelija (mozaicizam), onih sa dodatnim #12 materijalom i ćelija koje su normalne (sadrže 46 hromozoma bez dodatnog materijala #12). Bebe sa ovim sindromom imaju mnogo problema, uklјučujući i ozbilјnu mentalnu retardaciju, slab tonus mišića, "grub" izgled lica i izraženo čelo. Kod obolelih se uočava tendencija prisustva veoma tanke gornje usne, zadebljale donje usne i kratkog nosa. Ostali zdravstveni problemi podrazumevaju epileptične napade, poremećaj ishrane, krute zglobove, kataraktu u odraslom dobu, gubitak sluha i defekte srca. Osobe sa Palister-Kilijanovim sindromom su skraćenog životnog veka.
[0187] Individue sa genetskim stanjim označenim kao dup(17)(p11.2p11.2) ili dup 17p nose dodatne genske informacije (poznate kao duplikacije) na kratkom kraku hromozoma 17. Duplikacije hromozoma 17p11.2 su u osnovi Potocki-Lupski sindroma (PTLS) koji je skoro prepoznat kao genetičko stanje iako je samo nekoliko desetina slučajeva prijavlјeno u medicinskoj literaturi. Pacijenti sa ovom duplikacijom često imaju nizak tonus mišića, probleme u ishrani, kao i probleme u razvoju tokom detinjstva tipa kašnjenja u motornom i verbalnom razvoju. Mnoge individue sa PTLS-om imaju poteškoće u artikulaciji i obradi jezičkih podataka. Pored toga, pacijenti mogu imati karakteristike ponašanja slične onima koje se uočavaju kod individua sa autizmom ili poremećajima iz spektra autizma. Individue sa PTLS-om mogu imati srčane deficite i skloni su apnei tokom spavanja.
Poznato je da duplikacije velikog velikog regiona u hromozomu 17p12 koji uklјučuje gen PMP22 dovode do pojave Šarko-Mari Tut oboljenja.
[0188] Pokazana je asociranost CNV sa pojavom mrtvorođenčadi. Ipak, zbog karakterističnih ograničenja konvencionalne citogenetike, smatra se da je doprinos CNV pojavi mrtvorođenih potcenjen (Harris i saradnici, PrenatalDiagn 31:932-944 [2011]). Predmetni postupci su korisni kao ispomoć prilikom utvrđivanja prisustva delimičnih aneuploidija npr. delecija i multiplikacija segmenata hromozoma, a mogu se upotrebiti i da bi se potpomogla identifikacija i utvrđivanje prisustva ili odsustva CNV asociranih sa pojavom mrtvorođenčadi.
[0189] Predmetni postupak takođe može pomoći u identifikaciji polimorfizama asociranih sa genetskim poremećajima koji su složeni, multifaktorijalni ili poligeni, što znači da oni verovatno podrazumevaju kombinaciju efekata više gena sa načinom života i faktorima životne sredine. Multifaktorijalni poremećaji uklјučuju, na primer, bolesti srca i dijabetes. Iako se složeni poremećaji često javljaju u okviru porodice, oni nemaju jasan obrazac nasleđivanja. Ispitivanja porodičnog stabla ukazuju da poligene bolesti imaju trend "pojave u porodicama", ali tip nasleđivanja nije tako jednostavan kao što je to slučaj sa bolestima koje se nasleđuju po Mendelovom principu. Snažan uticaj komponenti životne sredine asocira sa mnogim složenim poremećajima, na primer, sa krvnim pritiskom. Predmetni postupak može stoga biti upotrebljen za identifikaciju polimorfizama koji asociraju sa poligenim poremećajima, uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na, astmu, autoimune bolesti kao što je multipla skleroza, ili kao što su kanceri, ciliopatije, rascep nepca, dijabetes, oboljenje srca, hipertenzija, inflamatorna bolest creva, mentalna retardacija, poremećaj raspoloženja, gojaznost, refrakciona greška kao poremećaj u funkciji oka i sterilitet. U pojedinim primerima izvođenja, polimorfizmi su SNP tipa. U drugim primerima izvođenja, polimorfizmi su STR tipa. U još drugim primerima izvođenja, polimorfizmi predstavljaju kombinaciju SNP-ova i STR polimorfizama.
[0190] U jednom primeru izvođenja, identifikacija polimorfnih sekvenci koje asociraju sa poremećajima obuhvata sekvenciranje barem dela ćelijskog genoma koji odgovara drugom genomu u mešavini cfDNK. Identifikacija polimorfnih sekvenci koje predstavljaju doprinog prvog genoma se izvodi detekcijom više polimorfnih mesta u sekvenci iz prvog uzorka koji sadrži DNK molekule suštinski dobijene samo iz drugog genoma, i zatim karakterizacijom odgovarajućih višestrukih polimorfnih mesta u sekvenci drugog uzorka koji sadrži mešavinu molekula DNK dobijenih iz prvog i drugog genoma, nakon čega sledi upoređivanje polimorfnih sekvenci koje su utvrđene u oba uzorka čime se zapravo identifikuju višestruki polimorfizmi u prvom genomu uzorka koji sadrži mešavinu dva genoma. Na primer, identifikacija polimorfnih sekvenci koje predstavljaju doprinos fetalnog genoma, tj. prvog genoma, se vrši karakterizacijom višestrukih polimorfnih mesta u sekvenci iz uzorka interfaze plazme majke tj. u uzorku koji sadrži molekule DNK suštinski dobijene samo iz drugog genoma, zatim karakterizaciju odgovarajućih višestrukih polimorfnih mesta u sekvenci iz prečišćenog uzorka plazme tj. iz drugog uzorka koji sadrži mešavinu cfDNK molekula dobijenih iz genoma fetusa i genoma majke, nakon čega sledi upoređivanje polimorfnih sekvenci koje su utvrđene u oba uzorka da bi se identifikovali višestruki polimorfizmi. U jednom primeru izvođenja, prvi genom je fetalni genom, a drugi genom je genom majke. U drugom primeru izvođenja, prvi genom je genom neizmenjene ćelije, dok je drugi genom iz ćelije koja je izmenjenja. U pojedinim primerima izvođenja, izmenjene i neizmenjene ćelije potiču iz istog subjekta. Na primer, izmenjena ćelija može biti ćelija čiji je genotip promenjen poremećajem.
[0191] U jednom primeru izvođenja, prijavljeni postupci procene genomske frakcije mogu pomoći u otkrivanju kancera kod pacijenta. U raznim primerima, kancer se detektuje postupkom koji obuhvata: obezbeđivanje uzorka iz pacijenta, uzorka koji sadrži mešavinu genoma poreklom iz normalne, tj. neizmenjene i kancerske, tj. izmenjene ćelije; kao i identifikaciju višestrukih polimorfizama koji asociraju sa kancerom. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak se bira iz grupe koju čine krv, plazma, serum i urin. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak je uzorak plazme. U drugim primerima izvođenja, uzorak je uzorak urina.
[0192] U jednom primeru izvođenja, identifikacija višestrukih polimorfizama koji asociraju sa kancerom uključuje obogaćivanje DNK u uzorku sa polimorfnim cilјnim sekvencama. U drugim primerima izvođenja nije izvršeno obogaćivanje uzorka sa polimorfnim cilјnim sekvencama. U pojedinim primerima izvođenja, identifikacija višestrukih polimorfizama koji asociraju sa kancerom obuhvata kvantifikaciju broja kopija polimorfne sekvence.
[0193] Kanceri koji mogu biti identifikovani i/ili praćeni postupkom prijave uključuju solidne tumore, kao i hematološke tumore i/ili malignitete. Razni kanceri koji mogu biti uzeti u obzir uklјučuju sarkome, karcinome i adenokarcinome koji nisu ograničeni na kancer dojke, kancer pluća, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer jajnika, kancer prostate, renalni karcinom, hepatom, kancer mozga, melanom, multipli mijelom, limfom, Hočkinov limfom, ne-Hočkinov limfom, limfome kod dece i limfome limfocitnog i kutanog porekla, leukemiju, leukemiju kod dece, triholeukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu mijelocitnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, leukemiju mastocitnih ćelija, mijeloidne neoplazme, neoplazme mastocitnih ćelija, hematološki tumor i limfoidni tumor, uklјučujući metastatske lezije u drugim tkivima ili organima udalјenim od primarnog mesta tumora.
[0194] Postupci koji su ovde prijavljeni su korisni, na primer, u postavljanju dijagnoze ili određivanju prognoze kod bolesnih stanja koja su asocirna sa specifičnim haplotipom/haplotipovima, kao i za utvrđivanje novih haplotipova i povezanosti haplotipova sa odgovorom na farmaceutike. Asocijacija višestrukih polimorfnih sekvenci sa višestrukim poremećajima može biti određena na osnovu identiteta pojedinačne polimorfne sekvence za svaki od višestrukih poremećaja. Alternativno, asocijacija višestrukih polimorfnih sekvenci sa višestrukim poremećajima se može odrediti na osnovu identiteta višestrukih polimorfnih sekvenci za svaki od višestrukih poremećaja.
[0195] Konvencionalne tehnike genotipizacije su bile ograničene na identifikaciju polimorfizama u kratkim genomskim regionima od nekoliko kilobaza, a identifikacija haplotipova se oslanjala na podatke iz porodice i statističku procenu upotrebom računarskih algoritama. Sekvenciranje celokupnog genoma omogućava identifikaciju haplotipova direktnom identifikacijom polimorfizama u genomu. Identifikacija haplotipova u skladu sa raznim primerima izvođenja nije ograničena interventnim rastojanjem između polimorfizama. U pojedinim primerima izvođenja, postupak obuhvata sekvenciranje celokupnog genoma ćelijske DNK majke. Ćelijska DNK majke može biti dobijena iz biološkog uzorka lišenog fetalne genomske DNK. Na primer, DNK majke može biti dobijena iz interfaze plazme krvi majke. Moguće je odredititi haplotipove sa mnoštvom polimorfnih sekvenci koji se prostiru duž čitavog hromozoma. U jednom primeru izvođenja, fetalni haplotipovi se upoređuju sa poznatim haplotipovima koji asociraju sa poremećajem, a međusobno preklapanje fetalnog haplotipa sa bilo kojim od poznatih haplotipova asociranih sa poremećajem ukazuje da fetus ima poremećaj ili da je fetus sklon poremećaju. Fetalni haplotipi mogu takođe biti upoređeni sa haplotipovima asociranim sa pojavom ili odsustvom odgovora specifičnih polimorfizama na tretman. Upoređivanje identifikovanih fetalnih haplotipova sa poznatim bazama podataka haplotipova omogućava postavljanje dijagnoze i/ili prognoze poremećaja. Bilo koji biološki uzorak koji sadrži mešavinu fetalne i cfDNK majke može biti upotrebljen za utvrđivanje prisustva ili odsustva poremećaja fetusa. Prioritetno, biološki uzorak se bira iz grupe koju čine krv ili njene frakcije, uklјučujući plazmu, i urin. U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je uzorak krvi. U drugom primeru izvođenja, biološki uzorak je uzorak plazme. U još jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je uzorak urina.
[0196] U jednom primeru izvođenja, prijavljen je postupak za određivanje prisustva ili odsustva višestrukih poremećaja kod fetusa koji obuhvata (a) dobijanje uzorka krvi majke koji sadrži mešavinu fetalne i DNK majke oslobođenih od ćelija, (b) sekvenciranje celokupnog genoma iz najmanje dela mešavine fetalne i DNK majke koje su oslobođene od ćelija, čime se dobija mnoštvo marker sekvenci; (c) određivanje višestrukih fetalnih polimorfizama u marker sekvencama, i (d) određivanje prisustva ili odsustva višestrukih poremećaja fetusa. Primeri višestrukih fetalnih poremećaja koji se mogu identifikovati predmetnim postupkom uklјučuju monogenske i poligenske poremećaje koji su ovde opisani.
[0197] U jednom primeru izvođenja, prijavljen je postupak za utvrđivanje prisustva ili odsustva višestrukih fetalnih poremećaja koji obuhvata identifikaciju višestrukih fetalnih polimorfizama koji asociraju sa haplotipovima vezanim za višestruke poremećaje. U pojedinim primerima izvođenja, svaki od haplotipova sadrži najmanje najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje deset ili najmanje petnaest različitih polimorfizama marker sekvenci. Polimorfizmi marker sekvenci koji su prisutni u haplotipu mogu biti istog tipa polimorfizma, npr. sve mogu biti SNP polimorfizmi marker sekvenci, ili to može biti kombinacija polimorfizama marker sekvenci, npr. polimorfizama SNP tipa i delecija. U jednom primeru izvođenja, polimorfizmi marker sekvenci su SNP tipa. U još jednom primeru izvođenja, polimorfizmi marker sekvenci su STR tipa. U još jednom primeru izvođenja, polimorfizmi marker sekvenci predstavljaju kombinaciju SNP i STR polimorfizama. Polimorfizmi marker sekvenci mogu biti u kodirajućim i/ili nekodirajućim regionima genoma. Identifikacija polimorfizama se sprovodi sekvenciranjem celokupnog genoma upotrebom NGS tehnologije kao što je ovde opisano.
[0198] Ovde je prijavljen i postupak za identifikaciju varijacija u broju kopija (CNV) kao vrste polimorfizma sekvence od interesa u uzorku koji se ispituje i koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina dobijenih iz dva različita genoma, a za koje je poznato ili se pretpostavlja da se razlikuju u količini jedne ili više sekvenci od interesa. Varijacije u broju kopija utvrđene postupkom koji je ovde prijavljen obuhvataju dodavanja ili gubitke celokupnih hromozoma, izmene koje uklјučuju veoma velike segmente hromozoma koji su mikroskopski vidlјivi, kao i brojne varijacije u broju kopija DNK segmenata koje se ne mogu videti pod mikroskopom, sa rasponom veličina od nekoliko kilobaza (kb) do nekoliko megabaza (Mb).
[0199] CNV u lјudskom genomu značajno utiče na raznolikost kod ljudi, kao i na njihovu sklonost ka oboljenju (Redon i saradnici, Nature 23:444-454 [2006], Shaikhet i saradnici, Genome Res 19:1682-1690 [2009]). Poznato je da CNV doprinose genetskim oboljenima putem različitih mehanizama koji dovode, u većini slučajeva, bilo do remećenja balansa u dozi gena ili do remećenja samog gena. Pored njihove direktne korelacije sa genetskim poremećajima, poznato je da CNV posreduju u fenotipskim promenama koje mogu biti štetne. Nedavno je nekoliko studija prijavilo povećanje opterećenja retkih ili de novo nastalih CNV u kompleksnim poremećajima kao što su autizam, ADHD i šizofrenija, a na osnovu poređenja sa normalnim kontrolama, što je naglasilo potencijalnu patogenost retkih ili jedinstvenih CNV-ova (Sebat i saradnici, 316:445-449 [2007]; Valsh i saradnici, Science 320: 539-543 [2008]). CNV nastaju usled rearanžmana genoma, prvenstveno zahvalјujući delecijama, duplikacijama, insercijama i događajima neuravnoteženih translokacija.
[0200] Primeri izvođenja prijave obezbeđuju postupak utvrđivanja varijacija u broju kopija sekvence od interesa, npr. klinički relevantne sekvence, u uzorku koji se ispituje i koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina dobijenih iz dva različita genoma, za koje je poznato ili se pretpostavlja da se razlikuju u količini jedne ili više sekvenci od interesa. Mešavina nukleinskih kiselina je dobijena iz dve ili više vrsta ćelija. U jednom primeru izvođenja, mešavina nukleinskih kiselina je dobijena iz normalnih i kanceroznih ćelija dobijenih iz subjekta koji boluje od medicinskog stanja, npr. kancera.
[0201] Smatra se da mnogi čvrsti tumori, kao što je kancer dojke, napreduju od inicijacije do metastaze putem akumulacije nekoliko genskih aberacija. [Sato i saradnici, Cancer Res., 50:7184-7189 [1990]; Jongsma i saradnici, J ClinPathol: Mol Path 55:305-309 [2002])]. Takve genske aberacije, dok se akumuliraju, mogu doprineti sposobnosti proliferacije, genetskoj nestabilnosti i pratećoj sposobnosti brzog razvoja rezistencije na lekove, kao i povećanju sposobnosti angiogeneze, proteolize i metastaze. Genetske aberacije mogu uticati bilo na recesivne "gene koji su supresori tumora" ili onkogene sa dominantnim efektom. Smatra se takođe da delecije i rekombinacije koje vode gubitku heterozigotnosti (LOH) imaju glavnu ulogu u progresiji tumora usled mogućnosti ekspresije mutiranih alela gena sa funkcijom u supresiji tumora.
[0202] CfDNK je pronađena u cirkulaciji pacijenata sa dijagnostifikovanim malignitetima, uklјučujući, ali bez ograničavanja samo na, kancer pluća (Pathak i saradnici, ClinChem 52:1833-1842 [2006]), kancer prostate (Schwartzenbach i saradnici, Clin Cancer Res 15:1032-8 [2009]) i kancer dojke (Schwartzenbach i saradnici, dostupno na internet adresi breast-cancerresearch.com/content/11/5/R71 [2009]). Identifikacija genomskih nestabilnosti povezanih sa kancerom koja može biti određena u cfDNK iz cirkulacije pacijenata sa kancerom, potencijalni je dijagnostički i prognostički parametar. U jednom primeru izvođenja, postupak koji je ovde prijavljen utvrđuje CNV sekvenci od interesa u uzorku koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina izvedenih iz subjekta za koga se sumnja ili je poznato da ima kancer, npr. karcinom, sarkom, limfom, leukemiju, tumore germinativnih ćelija i blastom. U jednom primeru izvođenja, uzorak je uzorak plazme dobijen iz periferne krvi koji sadrži mešavinu cfDNK koje potiču iz normalnih i kancerskih ćelija. U drugom primeru izvođenja, biološki uzorak koji je potreban da bi se utvrdilo da li je CNV prisutan se dobija iz mešavine kancerskih i nekancerskih ćelija u drugim biološkim tečnostima, uklјučujući, ali bez ograničavanja samo na, serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, sekret ušiju, limfu, plјuvačku, cerebrospinalnu tečnost, lavažu, suspenziju kosne srži, vaginalni sekret, transcervikalnu lavažu, tečnost mozga, ascite, mleko, sekrete respiratornog, intestinalnog i genitourinarnog trakta i uzorke leukoforeze, kao i u uzorcima dobijenim nakon biopsija tkiva, sa briseva ili razmaza.
[0203] Sekvenca od interesa je sekvenca nukleinske kiseline koja je poznata ili za koju se sumnja da ima ulogu u razvoju i/ili progresiji kancera. Primeri sekvence od interesa uklјučuju sekvence nukleinskih kiselina koje su amplifikovane ili deletirane u ćelijama kancera kao što je opisano u tekstu koji sledi.
[0204] Geni sa dominantnim efektom koji asociraju sa solidnim tumorima kod ljudi, uobičajeno ispoljavaju prekomernu eksresiju ili izmenjenu ekspresiju. Amplifikacija gena predstavaja uobičajen mehanizam koji vodi povećanju ekspresije gena. Dokazi iz citogenetskih studija ukazuju da se značajna amplifikacija javlja u preko 50% humanin kancera dojke. Najzapaženija je amplifikacija proto-onkogena za receptor humanog epidermalnog faktora rasta tipa 2 (HER2) koji se nalazi na hromozomu 17 (17(17q21-q22)), a koja dovodi do prekomerne ekspresije HER2 receptora na površini ćelije i dalje do prekomerne i poremećene regulacije signalizacije u ćelijama kancer dojke i drugim humanim malignitetima (Park i saradnici, Clinical Breast Cancer 8:392-401 [2008]). Utvrđeno je da se razni onkogeni amplifikuju u drugim humanim malignitetima. Primeri amplifikacije ćelijskih onkogena u tumorima kod ljudi uključuju amplifikacije: c-myc u ćelijskoj liniji HL60 promijelocitne leukemije i u ćelijskim linijama sitnoćelijskog karcinoma pluća, N-myc u primarnim neuroblastomima (faze III i IV), ćelijskim linijama neuroblastoma, retinoblastoma i primarnim tumorima, kao i u linijama i tumorima sitnoćelijskog karcinoma pluća, L-myc u ćelijskim linijama i tumorima sitnoćelijskog karcinoma pluća, c-myb u akutnoj mijeloidnoj leukemiji i ćelijskim linijama karcinoma kolona, c-erbb u ćelijama epidermoidnog karcinoma i primarnim gliomima, c-K-ras-2 u primarnim karcinomima pluća, debelog creva, bešike i rektuma, N-ras u ćelijskoj liniji mamilarnog karcinoma (Varmus H., Ann Rev Genetics 18:553-612 (1984) [citirano u Watson i saradnici, Molecular Biology of the Gene (4. izd., Benjamin/Cummings Publishing Co.1987)].
[0205] Hromozomske delecije koje uklјučuju tumor-supresorske gene mogu imati važnu ulogu u razvoju i progresiji solidnih tumora. Tumor supresorski gen retinoblastoma (Rb-1), lociran na hromozomu 13q14, je najobimnije okarakterisan tumor-supresorski gen. Genski proizvod Rb-1, jedarni fosfoprotein do 105 kDa, očigledno ima važnu ulogu u regulaciji ćelijskog ciklusa (Howe i saradnici, ProcNatlAcadSci (USA) 87:5883-5887 [1990]). Promena ili gubitak ekspresije Rb proteina je prouzrokovana inaktivacijom oba genska alela bilo putem tačkaste mutacije ili delecije hromozoma. Utvrđeno je da su promene Rb-i gena prisutne ne samo kod retinoblastoma, već i u drugim malignitetima kao što su osteosarkomi, sitnoćelijski kancer pluća (Rygaard i saradnici, Cancer Res 50:5312-5317 [1990)]) i kancer dojke. Studije polimorfizama u dužini restrikcionih fragmenta (RFLP) su ukazale da navedene tipove tumora često karakteriše gubitak heterozigotnost na 13q, što dalje sugeriše da je jedan od Rl-1 genskih alela izgublјen usled obimne hromozomske delecije (Bowcock i saradnici, Am J Hum Genet, 46:12 [1990]). Abnormalnosti hormozoma 1, kao i duplikacije, delecije i neuravnotežene translokacije koje uključuju hromozom 6 i druge partnerske hromozome, ukazuju da regioni hromozoma 1, posebno 1q21-1q32 i 1p11-13, mogu sadržavati onkogene ili tumorsupresorske gene koji su patogenetski relevantni i za hronične i napredne faze mijeloproliferativnih neoplazmi (Caramazza i saradnici, Eur J Hematol84:191-200 [2010]). Mijeloproliferativne neoplazme su takođe povezane sa delecijama hromozoma 5. Kompletna gubitak ili intersticijska delecija hromozoma 5 su najčešća kariotipska abnormalnost kod mijelodisplastičnih sindroma (MDS). Izolovana del(5q)/5q kod MDS pacijenata je sa najpovoljnijom pronozom u odnosu na one sa dodatnim defektima kariotipa koje dalje karakteriše tendencija razvoja mijeloproliferativnih neoplazmi (MPN) i akutne mijeloidne leukemije. Učestalost neuravnoteženih delecija na hromozomu 5 je dovela do ideje da se u okviru 5q nalaze jedan ili više tumor-supresorskih gena koji imaju osnovnu ulogu u kontroli rasta hematopoetskih stem/progenitorskih ćelija (HSC/HPC). Citogenetsko mapiranje uobičajeno deletiranih regiona (CDR) centriranih na 5q31 i 5q32 je identifikovalo kandidate za tumor-supresorske gene, uključujući ribozomalnu subjedinicu RPS14, transkripcioni faktor Egr1/Krox20 i protein remodelovanja citoskeleta, alfa-katenin (Eisenmann i saradnici, Oncogene 28:3429-3441 [2009]). Citogenetske i alelotipske studije sveže izolovanih tumora i tumorskih ćelijskih linija su pokazale da su gubici alela iz nekoliko izdvojenih regiona hromozoma 3p, uklјučujući 3p25, 3p21-22, 3p21.3, 3p12-13 i 3p14, najranije i najčešće genomske abnormalnosti koje su uklјučene u široki spektar glavnih epitelnih kancera pluća, dojke, bubrega, glave i vrata, jajnika, grlića materice, debelog creva, pankreasa, jednjaka, bešike i drugih organa. Nekoliko tumorsupresorskih gena je mapirano u regionu 3p hromozoma i smatra se da intersticijalne delecije ili hipermetilacija promotora prethodi gubitku 3p ili čitavog hromozoma 3 tokom razvoja karcinoma (Angeloni D., Briefings Functional Genomics 6:19-39 [2007]).
[0206] Novorođenčad i deca sa Daunovim sindromom (DS) često razvijaju urođene tranzientne leukemije i imaju povećan rizik pojave akutne mijeloidne leukemije i akutne limfoblastne leukemije. Hromozom 21, koji sadrži približno 300 gena, može biti uklјučen u brojne strukturne aberacije, npr. translokacije, delecije i amplifikacije kod leukemija, limfoma i solidnih tumora. Štaviše, identifikovano je da geni koji se nalaze na hromozomu 21 imaju važnu ulogu u tumorogenezi. Somatske numeričke, kao i strukturne aberacije hromozoma 21 su povezane sa leukemijama, a specifični geni uklјučujući RUNX1, TMPRSS2 i TFF koji se nalaze u 21q, imaju ulogu u tumorogenezi (Fonatsch C, Gene Chromozomes Cancer 49:497-508 [2010]).
[0207] U jednom primeru izvođenja, prijava obezbeđuje sredstvo za procenu asociranosti amplifikacije gena i stepena evolucije tumora. Korelacija između amplifikacije i/ili delecije i stadijuma ili gradusa kancera može biti prognostički važna, pošto takve informacije mogu doprineti definisanju genetski baziranog gradusa tumora kojim bi se bolje mogao predvideti budući tok bolesti, s time da najuznapredovaniji tumori imaju najgoru prognozu. Pored toga, informacije o ranim događajima amplifikacije i/ili delecije mogu biti korisne u uspostavljanju veze tih događaja kao prediktora sa naknadnom progresijom bolesti. Amplifikacija i delecije gena koje se identifikuju postupkom, mogu asocirati sa drugim poznatim parametrima kao što su gradus tumora, histologija, indeks obeležavanja sa Brd/Urd, hormonski status, zahvaćenost limfnih čvorova, veličina tumora, period preživlјavanja i druga svojstva tumora koja su dostupna u okviru epidemioloških i biostatističkih studija. Na primer, tumor čija će DNK biti ispitana postupkom, može obuhvatati atipičnu hiperplaziju, in situ duktalni karcinom, kancer stadijuma I-III i metastatske limfne čvorove, čime se zapravo omogućava identifikacija asocijacije između amplifikacija i delecija i stadijuma. Utvrđene asocijacije mogu omogućiti terapijsku intervenciju koja je delotvorna. Na primer, konzistentno amplifikovani regioni mogu sadržavati prekomerno eksprimiran gen čiji proizvod može biti meta terapije (na primer, tirozin kinazni receptor faktora rasta, p185<HER2>).
[0208] Postupak može biti upotrebljen za identifikaciju događaja amplifikacije i/ili delecije koji su povezani sa rezistencijom na lekove i to određivanjem varijacija u broju kopija nukleinskih kiselina primarnih kancera u onim ćelijama koje su metastazirale na druge lokacije. Ukoliko amplifikacija gena i/ili delecija predstavlja manifestaciju kariotipske nestabilnosti koja omogućava brz razvoj rezistencije na lekove, očekuje se više amplifikacije i/ili delecija u primarnim tumorima kod hemiorezistentnih pacijenata nego u tumorima kod hemiosenzitivnih pacijenata. Na primer, ukoliko je amplifikacija specifičnih gena odgovorna za razvoj rezistencije na lekove, očekuje se da su regioni koji okružuju te gene konzistentno amplifikovani u tumorskim ćelijama iz pleuralnih efuzija hemiorezistentnih pacijenata, ali ne i u primarnim tumorima. Otkriće povezanosti između amplifikacije i/ili delecije gena i razvoja rezistencije na lekove može omogućiti identifikaciju pacijenata koji će ili neće imati koristi od adjuvansne terapije.
[0209] U drugim primerima izvođenja, predmetni postupak može biti upotrebljen za identifikaciju polimorfizama asociranih sa poremećajima trinukleotidnih ponovaka koji predstavljaju skup genetskih poremećaja uzrokovanih ekspanzijom trinukleotidnih ponovaka. Trinukleotidne ekspanzije su podskup nestabilnih mikrosatelitskih ponovaka koji se javljaju duž svih genomskih sekvenci. Ukoliko su ponovci prisutni u zdravim genima, dinamičke mutacije mogu povećati broj ponovaka i dovesti do obrazovanja defektnog gena. U jednom primeru izvođenja, postupak može biti upotrebljen za identifikaciju trinukleotidnih ponavaka koji asociraju sa fragilnim X sindromom. Dugi krak X hromozoma pacijenata koji boluje od fragilnog X sindroma može sadržavati od 230 do 4000 CGG, a što je bitno različito u odnosu na 60 do 230 ponavaka koji se javljaju kod nosioca i 5 do 54 ponavka prisutnih kod normalnih individua. Hromozomsku nestabilnost koja proizilazi iz ove trinukleotidne ekspanzije klinički karakterišu mentalna retardacija, karakteristične osobine lica i makroorhidizam kod muškaraca. Drugo, srodno oboljenje sa trinukleotidnim ponovcima u DNK, fragilni X-E sindrom, takođe je identifikovan na X hromozomu, ali je utvrđeno da je ovo oboljenje rezultat ekspanzije CCG ponovaka. Predmetni postupak može identifikovati i trinukleotidne ponovke koji asociraju sa drugim poremećajima sa ekspanzijama ponovaka, uključujući poremećaje iz Kategorija I, II i III. Poremećaji kategorije I uklјučuju Hantingtonovu bolest (HD) i spinocerebelarne ataksije koji nastaju usled ekspanzija CAG ponovaka u kodirajućim regionima specifičnih gena. Ekspanzije kategorije II imaju tendenciju da budu više fenotipski raznovrsne i sa heterogenim su ekspanzijama koje su uglavnom male po svoj veličini, ali su iste pronađene i u egzonima gena. Kategorija III uklјučuje fragilni X sindrom, miotoničnu distrofiju, dve od spinocerebelarnih ataksija, juvenilnu miokloničnu epilepsiju i Fridrihovu ataksiju. Navedene bolesti obično karakterišu mnogo veće ekspanzije ponovaka nego što je to slučaj sa prve dve grupe, a ponavci su locirani van kodirajućih regiona gena.
[0210] U sledećim primerima izvođenja, predmetni postupak može identifikovati CAG trinukleotidne ponovke koji su povezani sa najmanje deset neuroloških poremećaja za koje je poznato da nastaju uled povećanog broja CAG ponavaka, obično u kodirajućim regionima drugačiije nesrodnih proteina. Tokom sinteze proteina, ekspandirani CAG ponovci se prevode u neprekinutu seriju ostataka glutamina čime se obrazuje ono što je poznato kao poliglutaminski niz ("polyQ"). Takvi poliglutaminski nizovi mogu biti predmet povećane agregacije. Navedene poremećaje karakteriše autozomno-dominantni način nasleđivanja (sa izuzetkom spino-bulbarne mišićne atrofije koju karakteriše X-vezano nasleđivanje), početak bolesti u srednjem životnom dobu, progresivan tok bolesti i korelacija broja CAG ponovaka sa ozbiljnošću oboljenja i starošću pacijenta na početku bolesti. Uzročni geni su široko eksprimirani u svim poznatim poliglutaminskim obolјenjima. Uobičajen simptom PoliQ oboljenja je progresivna degeneracija nernih ćelija koja utiče na pacijente u kasnijoj životnoj dobi. Iako ove bolesti karakterišu isti ponovci kodona (CAG) i pojedini simptomi, ponovci se u različitim poliglutaminskim oboljenjima javljaju na različitim hromozomima. Primeri poliQ poremećaja koji mogu biti identifikovani predmetnim postupkom uključuju, bez ograničavanja, DRPLA (DentatorubropalidoLuisovu atrofiju), HD (Huntingtonovu bolest), SBMA (Spinobulbarnu mišićnu atrofiju ili Kenedijevu bolest), SCA1 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 1), SCA2 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 2), SCA3 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 3 ili Makado-Džozefovu bolest), SCA6 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 6), SCA7 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 7), SCA17 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 17). Primeri poremećaja koji nisu poliQ tipa, a koji mogu biti identifikovani predmetnim postupkom uklјučuju FRAXA (Fragilni X sindrom), FXTAS (Sindrom fragilnog-X-a udružen sa tremorom/ataksijom), FRAXE (Fragilni XE sindrom sa mentalnom retardacijom), FRDA (Fridrihovu ataksiju), DM (Miotoničnu distrofiju), SCA8 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 8), SCA12 (Spinocerebelarnu ataksiju tipa 12).
[0211] Pored uloge CNV u kanceru, pokazana je veza CNV sa rastućim brojem uobičajenih kompleksnih oboljenja, uklјučujući oboljenje indukovano virusom humane imunodeficijencije (HIV), autoimuna oboljenja i spektar neuropsihijatrijskih poremećaja.
[0212] Do sada je nekoliko studija prijavilo vezu CNV u genima uklјučenim u inflamaciju i imunološki odgovor sa HIV infekcijom, astmom, Kronovom bolešću i drugim autoimunim poremećajima (Fanciulli i saradnici, Clin Genet 77:201-213 [2010]). Na primer, pokazano je da je CNV u CCL3L1 uklјučen u podložnost HIV infekciji/SIDI (CCL3L1, delecija 17q11.2), reumatoidnom artritisu (CCL3L1, delecija 17q11.2) i Kavasaki bolesti (CCL3L1, duplikacija 17q11.2); CNV u HBD-2 je prijavlјen da povećeva podložnost Kronovoj bolesti kolona (HDB-2, delecija 8p23.1) i psorijazi (HDB-2, delecija 8p23.1); za CNV u FCGR3B je pokazano da povećava predispoziciju za glomerulonefritis u sistemskom eritemtoidnom lupusu (FCGR3B, delecija 1q23, duplikacija 1q23), vaskularitis asociran sa antineutrofilnim citoplazmitskim antitelom (ANCA) (FCGR3B, delecija 1q23) i da povećava rizik razvoja reumatoidnog artritisa. Postoje najmanje dva inflamatorna ili autoimuna oboljenja za koja je pokazano da asociraju sa CNV u različitim genskim lokusima. Na primer, Kronova bolest asocira sa niskim brojem kopija HDB-2, ali i sa uobičajenim polimorfizmon tipa delecije uzvodno od IGRM gena koji kodira p47 člana familije GTPaza bitnih za imunitet. Pored asocijacije sa brojem kopija FCGR3B, takođe je prijavlјeno da je značajno povećana podložnost na SLE među subjektima sa nižim brojem kopija komponente komplementa C4.
[0213] Veze genomskih delecija u GSTM1 (GSTM1, delecija 1q23) i GSTT1 (GSTT1, delecija 22q11.2) lokusima sa povećanim rizikom za atopijsku astmu su prijavlјene u nekoliko nezavisnih studija. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni postupak može biti upotrebljen za utvrđivanje prisustva ili odsustva CNV koji su povezni sa inflamacijom i/ili autoimunim obolјenjima. Na primer, predmetni postupak može biti upotrebljen za utvrđivanje prisustva CNV kod pacijenta za koga se sumnja da boluje od HIV infekcije, astme ili Kronove bolesti. Primeri CNV-ova koji asociraju sa takvim obolјenjima uklјučuju, bez ograničenja, delecije na 17q11.2, 8p23.1, 1q23 i 22q11.2, kao i duplikacije na 17q11.2 i 1q23. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni postupak može biti upotrebljen za određivanje prisustva CNV u genima, uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na, CCL3L1, HBD-2, FCGR3B, GSTM, GSTT1, C4 i IRGM.
[0214] Veze de novo i nasledniih CNV sa nekoliko čestih neuroloških i psihijatrijskih oboljenja su prijavlјene kod autizma, šizofrenije i epilepsije, kao i kod nekih slučajeva neurodegenerativnih bolesti kao što su Parkinsonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza (ALS) i autozomno-dominantna Alchajmerova bolest (Fanciulli i saradnici, Clin Genet 77: 201-213 [2010]). Citogenetske abnormalnosti uočene kod pacijenata sa autizmom i poremećajima iz spektra autizma (ASD) predstavljaju duplikacije u 15q11-q13. Prema konzorcijumu projekta za analizu genoma kod autizma (Autism Genome project), sa ASD se preklapa 154 CNV, uklјučujući nekoliko ponavljajućih (rekurentnih) CNV-ova, bilo na hromozomu 15q11-q13 ili na novim genomskim lokacijama koje podrazumevaju hromozome 2p16, 1q21, kao i 17p12 u regionu koji je povezan sa Smit-Magenisovim sindromom. Rekurentne mikrodelecije ili mikroduplikacije na hromozomu 16p11.2 su naglasile ono što je uočeno, da su de novo CNV-ovi detektovani u lokusima za gene kao što su SHANK3 (delecija 22q13.3), neureksin 1 (NRXN1, delecija 2p16.3) i neuroglini (NLGN4, delecija Xp22.33), za koje je poznato da regulišu sinaptičku diferencijaciju i oslobađanje glutamina kao neurotransmitera. Šizofrenija takođe asocira sa višestrukim de novo CNV-ovima. Mikrodelecije i mikroduplikacije koje asociraju sa šizofrenijom pogađaju prekomerno zastuplјene gene koji pripadaju putevima razvoja nervnog sisitema i glutamatergičkih sistema, što zapravo ukazuje da višestruki CNV koji deluju na ove gene mogu direktno doprineti patogenezi šizofrenije. Navedeni geni su npr. ERBB4, delecija 2q34, SLC1A3, delecija 5p13.3; RAPEGF4, delecija 2q31.1; CIT, delecija 12.24; i višestruki geni sa de novo CNV-ovima. CNV-ovi su takođe povezani sa drugim neurološkim poremećajima, uklјučujući epilepsiju (CHRNK7, delecija 15q13.3), Parkinsonovu bolest (SNCA, duplikacija 4q22) i ALS (SMN1, delecija 5q12.2-q13.3; i delecija SMN2). U pojedinim primerima izvođenja, predmetni postupak može biti upotrebljen za određivanje prisustva ili odsustva CNV asociranog sa bolestima nervnog sistema. Na primer, predmetni postupak može biti upotrebljen za utvrđivanje prisustva CNV kod pacijenta za koje se sumnja da boluju od autizma, šizofrenije, epilepsije, neurodegenerativnih bolesti kao što su Parkinsonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza (ALS) ili autozomno-dominantna Alchajmerova bolest. Predmetni postupak može biti upotrebljen za određivanje CNV gena povezanih sa drugim bolestima nervnog sistema, uklјučujući, bez ograničavanja, bilo koji od poremećaja iz spektra autizma (ASD), kao i šizofreniju i epilepsiju ili pak CNV gena koji su povezani sa neurodegenerativnim poremećajima kao što je Parkinsonova bolest. Primeri CNV koji asociraju sa navedenim obolјenjima uklјučuju, bez ograničavanja, duplikacije na 15q11-q13, 2p16, 1q21, 17p12, 16p11.2 i 4q22, kao i delecije na 22q13.3, 2p16.3, Xp22.33, 2q34, 5p13.3, 2q31.1, 12.24, 15q13.3 i 5q12.2. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni postupak može biti upotrebljen za određivanje prisustva CNV u genima koji uključuju, bez ograničavanja samo na njih, SHANK3, NLGN4, NRXN1, ERBB4, SLC1A3, RAPGEF4, CIT, CHRNK7, SNCA, SMN1 i SMN2.
[0215] Povezanosti metaboličkih i kardiovaskularnih osobina, kao što su one u familijarnoj hiperholesterolemiji (FH), aterosklerozi i bolesti koronarnih arterija sa CNV-ovima prijavlјene su u brojnim studijama (Fanciulli i saradnici, Clin Genet 77: 201-213 [2010]). Na primer, rearanžmani u germinativnim ćelijama, uglavnom delecije, uočene su u LDLR genu (LDLR, delecija/duplikacija 19p13.2) kod nekih bolesnika sa FH koji su bez drugih mutacija u LDLR. Drugi primer je LPA gen koji kodira apolipoprotein(e) (apo(a)) čija koncentracija u plazmi asocira sa rizikom za obolјenja koronarne arterije, infarkt miokarda (MI) i moždani udar. Koncentracije apo(a) u plazmi koje sadrži lipoprotein Lp(a) variraju preko 1000 puta između pojedinaca, a 90% ovih varijabilnosti je genetski determinisana LPA lokusom, pri čemu su koncentracija u plazmi i veličina Lp(a) izoforme proporcionalani visoko varjabilnom broju 'kringle 4' ponavljajućih sekvenci (opseg 5-50). Ovi podaci ukazuju da CNV u najmanje dva gena može asocirati sa kardiovaskularnim rizikom. Predmetni postupak može biti upotrebljen u velikim studijama za specifično pretraživanje povezanosti CNV sa kardiovaskularnim poremećajima. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni postupak može biti upotrebljen za utvrđivanje prisustva ili odsustva CNV-ova koji asociraju sa metaboličkim ili kardiovaskularnim oboljenjem. Na primer, predmetni postupak može biti upotrebljen za određivanje prisustva CNV kod pacijenta za koji se sumnja da boluje od familijarne hiperholesterolemije. Predmetni postupak može biti upotrebljen za određivanje CNV u genima koji asociraju sa metaboličkim ili kardiovaskularnim oboljenjem, npr. hiperholesterolemijom. Primeri CNV-ova koji asociraju sa takvim bolestima uklјučuju, bez ograničavanja samo na njih, deleciju/duplikaciju LDLR gena u 19p13.2 i multiplikacije u LPA genu.
SEKVENCIRANJE
[0216] U različitim primerima izvođenja, postupak koji je ovde opisan upotrebljava tehnologiju sekvenciranja sledeće generacije (NGS) u kojoj se klonalno amplifikovane DNK matrice ili pojedinačni molekuli DNK sekvenciraju u velikim količinama i istovremeno unutar protočne ćelije (npr. kao što je opisano u Volkerding i saradnici, ClinChem 55:641-658 [2009]; Metzker M, Nature Rev 11:31-46 [2010]). Pored velikog obima informacija o sekvencama, NGS obezbeđuje digitalne kvantitativne podatke u kojima je svako očitavanje sekvence predstavljeno kao brojiva “marker sekvenca” koja je zapravo predstavnik pojedinačne klonalne DNK matrice ili jednog molekul DNK. Tehnologije NGS sekvenciranja uklјučuju pirosekvenciranje, “sekvenciranje-po-sintezi”, upotrebom reverzibilno obojenih markera krajeva, “sekvenciranje-po-ligaciji oligonukleotidnih proba” i sekvenciranje u realnom vremenu.
[0217] U različitim primerima izvođenja, mogu se analizirati uzorci koji nisu amplifikovani ili su samo delimično amplifikovani (cilјana amplifikacija). U pojedinim slučajevima, postupci utvrđivanja fetalne frakcije mogu biti postignuti bez potrebe za bilo kakvom vrstom cilјane amplifikacije.
[0218] Amplifikacija celokupnog genoma koja se javlјa kao deo procesa sekvenciranja obezbeđuje dovolјno kopija putem povećanja broja ciklusa sekvenciranja, a da bi se obezbedila bolјa pokrivenost.
[0219] U prioritetnim primerima izvođenja, uzorak koji sadrži mešavinu molekula DNK dobijenih iz dva različita genoma nije specifično obogaćen materijalom za sekvenciranje celokupne sekvence genoma pre sekvenciranja celokupnog genoma, tj. amplifikacija čitavog genoma se vrši pre sekvenciranja.
[0220] Nespecifično obogaćivanje uzorka DNK se može odnositi na amplifikaciju celokupnog genoma za genomske DNK fragmene uzorka koji dalje mogu biti upotrebljeni da bi se povećao nivo uzorka DNK pre identifikacije polimorfizama sekvenciranjem. Nespecifično obogaćivanje može predstavljati selektivno obogaćivanje jednog od dva genoma prisutnih u uzorku. Na primer, nespecifično obogaćivanje može biti selektivno za fetalni genom u uzorku majke, a koje se može sprovesti poznatim postupcima za povećanje relativne proporcije fetalne u odnosu na DNK majke u uzorku. Alternativno, nespecifično obogaćivanje može biti tipa neselektivne amplifikacije oba genoma koji su prisutni u uzorku. Na primer, nespecifična amplifikacija može označavati amplifikaciju fetalne i DNK majke u uzorku koji sadrži mešavinu DNK genoma fetusa i majke. Postupci za amplifikaciju čitavog genoma su poznati u stanju tehnike. Degenerativni PCR sa oligonukleoitidnim probama (DOP), PCR tehnike ekstenzije prajmera (PEP) i višestruka amplifikacija izmeštanjem (MDA) su primeri postupaka amplifikacije celokupnog genoma. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak koji sadrži mešavinu cfDNK iz različitih genoma nije obogaćen sa cfDNK onih genoma koji su prisutni u mešavini. U drugim primerima izvođenja, uzorak koji sadrži mešavinu cfDNK iz različitih genoma je nespecifično obogaćen sa bilo kojim od genoma koji su prisutni u uzorku.
[0221] U drugim primerima izvođenja, cfDNK u uzorku je specifično obogaćena. Specifično obogaćivanje se odnosi na obogaćivanje genomskog uzorka specifičnim sekvencama, npr. polimorfnom ciljnom sekvencom, pri čemu se sekvence biraju za amplifikaciju pre sekvenciranja uzorka DNK. Međutim, prednost prijavljeni primera izvođenja je u tome što cilјana amplifikacija nije potrebna. Polimorfna
[0222] Pojedine od tehnologija sekvenciranja su komercijalno dostupne, kao što je platforma za sekvenciranje-po-hibridizaciji kompanije Affymetrix Inc. (Sunnivale, CA), platforme za sekvenciranjepo-sintezi firmi 454 Life Sciences (Bradford, CT), Illumina/Solexa (Hayward, CA) i Helicos Biosciences (Cambridge, MA) i platforma za sekvenciranje-po-ligaciji firme Applied Biosistems (Foster City, CA), a kao što je opisano u nastavku teksta. Pored sekvenciranja pojedinačnog molekula koje se obavlja sekvenciranjem-po-sintezi na platform firme Helicos Biosciences, druge tehnologije sekvenciranja pojedinačnih molekula su obuhvaćene prijavljenim postupkom i uklјučuju SMRT™ tehnologiju firme Pacific Biosciences, Ion Torrent™ tehnologiju i sekvenciranje na nanoporama koje je razvijeno do strane, na primer, firme Oxford Nanopore Technologies.
[0223] Iako se automatizovani Sangerov postupak smatra tehnologijom "prve generacije", sekvenciranje po Sanger-u, uklјučujući automatizovano sekvenciranje po Sanger-u, takođe može biti upotrebljeno u okviru prijavljenog postupka. Dodatni postupci sekvenciranja koji obuhvataju upotrebu tehnologija snimanja nukleinskih kiselina i koji se još razvijaju, npr. mikroskopija atomskom silom (AFM) ili transmisiona elektronska mikroskopija (TEM), takođe su obuhvaćeni prijavljenim postupkom. Primeri tehnologija sekvenciranja su opisani u nastavku teksta.
[0224] U jednom primeru izvođenja, tehnologija DNK sekvenciranja koja se koristi u prijavljenom postupku je tipa Helicos True sekvenciranja pojedinačnog molekula (tSMS) (npr. kao što je opisano u Harris T.D. i saradnici, Science 320:106-109 [2008]). U tSMS tehnici, uzorak DNK se cepa na lance dužine od približno 100 do 200 nukleotida, nakon čega se na 3' kraj svakog DNK lanca dodaje poliA sekvenca. Svaki lanac se obleležava dodavanjem fluorescentno obeleženog adenozinskog nukleotida. DNK lanci potom hibridizuju u protočnoj ćeliji uređaja koja sadrži milione mesta na svojoj površini za koje je vezana oligo-T proba. Matrice mogu biti sa gustinom od približno 100 miliona matrica/cm<2>. Protočna ćelija se zatim stavlja unutar instrumenta, npr. HeliScope™ sekvencera, gde laser osvetlјava površinu protočne ćelije čime se utvrđuje pozicija svake matrice. CCD kamera može mapirati položaj matrice na površini protočne ćelije. Fluorescentni obeleživač na matrici se zatim skida sa matrice i uklanja ispiranjem. Reakcija sekvenciranja počinje uvođenjem DNK polimeraze i fluorescentno obeleženih nukleotida. Nukleinska kiselina oligo-T služi kao prajmer. Polimeraza ugrađuje obeležene nukleotide u nastavku prajmera shodno matrici. Zatim se uklanjaju polimeraza i neugrađeni nukleotidi. Matrice koje su usmeravala redosleda ugrađivanja fluorescentno obeleženih nukleotida bivaju detektovane kroz snimanje površine protočne ćelije. Nakon snimanja, fluorescentni obeleživač se uklanja korakom cepanja, a proces se ponavlja sa drugim fluorescentno obeleženim nukleotidima dok se ne postigne željena dužina očitavanja. Podaci o sekvenci se prikupljaju za svaki korak dodavanja nukleotida. Sekvenciranje celokupnog genoma tehnologijom sekvenciranja pojedinačnog molekula isključuje amlifikaciju zasnovanu na PCR-u u pripremi biblioteka za sekvenciranje, a direktna priprema uzorka omogućava direktno merenje uzorka, a ne merenje kopija tog uzorka.
[0225] U jednom primeru izvođenja, tehnologija DNK sekvenciranja koja se upotrebljava u prijavljenim postupcima je sekvenciranje tipa 454 (Roche) (npr. kao što je opisano u publikaciji Margulies M. i saradnici, Nature 437:376-380 (2005)).454 sekvenciranje podrazumeva dva koraka. U prvom koraku, DNK se cepa na fragmente dužine od po približno 300-800 baznih parova, a fragmenti su ravnih krajeva. Oligonukleotidni adapteri se zatim ligiraju na krajeve fragmenata. Adapteri služe kao prajmeri za amplifikaciju i sekvenciranje fragmenata. Fragmenti mogu biti zatim pričvršćeni za zrnca koja hvataju DNK, npr. zrnca obložena streptavidinom, upotrebom, na primer, Adaptera B koji sadrži 5'-biotin kao obeleživač. Fragmenti vezani za zrnca se dalje amplifikuju upotrebom PCR-a, unutar kaplјica emulzije ulјa i vode. Rezultat je više kopija klonalno amplifikovanih fragmenata DNK na svakom zrncetu. U drugom koraku, zrnca se zadržavaju u bunarićima (pikolitarske zapremine). Pirosekvenciranje se vrši paralelno na svakom fragmentu DNK. Dodavanje jednog ili više nukleotida generiše svetlosni signal koji se snima pomoću CCD kamere u instrument za sekvenciranje. Jačina signala je proporcionalna broju ugrađenih nukleotida. Pirosekvenciranje upotrebljava pirofosfat (PPi) koji se oslobađa nakon dodavanja nukleotida. PPi se prevodi u ATP dejstvom ATP sulfurilaze u prisustvu adenozin 5' fosfosulfata. Luciferaza koristi ATP za prevođenje luciferina u oksilciferin, a ova reakcija generiše svetlost koja se prepoznaje i analizira.
[0226] U jednom primeru izvođenja, tehnologija DNK sekvenciranja koja se upotrebljava u postupku koji je prijavljen je SOLiD™ tehnologija (Applied Biosystems). U SOLiD™ platformi za “sekvenciranjepo-ligaciji”, genomska DNK se kida na fragmente, pa se na 5' i 3' krajeve fragmenta vezuju adapteri kako bi se generisala biblioteka fragmenta. Alternativno, mogu biti uvedeni interni adapteri, ligacijom za 5' i 3' krajeve fragmenata, nakon čega dolazi do cirkularizacije fragmenata i digestije kružnog fragmenta, a time i do proizvodnje internog adapetra. Adapter se dalje vezuje na 5' i 3' krajeve dobijenih fragmente da bi se dobila biblioteka uparenih fragmenata. Potom se priprema populacija klonalnih zrnaca u mikroreaktorima. Mikroreaktori sadrže zrnca, prajmere, matrice i PCR komponente. Nakon PCR-a, matarice se denaturišu i zrnca se obogaćuju da bi se izdvojila zrnca sa matricama koje su produžene. Matrice na selektovanim zrncima se potom podvrgavaju modifikacijama 3' krajeva koje omogućavaju vezivanje za staklenu ploču. Sekvenca može biti određena sekvencijalnom hibridizacijom i ligacijom delimično slučajnih oligonukleotida sa centralno determinisanom bazom (ili parom baza) koji se identifikuje specifičnim fluoroforom. Nakon snimanja boje, vezani oligonukleotid se odvaja i uklanja, nakon čega se proces ponavlja.
[0227] U jednom primeru izvođenja, tehnologija DNK sekvenciranja koja se koristi u prijavljenim postupcima je tehnologija sekvenciranja pojedinačnog molekula u realnom vremenu (SMRT™) firme Pacific Biosciences. U SMRT sekvenciranju, kontinualno ugrađivanje nukleotida koji su obeleženi bojom se snima tokom sinteze DNK. Pojedinačni molekuli DNK polimeraze su pričvršćeni na donju površinu pojedinačnih identifikatora talasnih dužina u nultom operativnom načinu rada (ZMW identifikatori), a koji dobijaju informacije o sekvenci dok se nukleotidi za koje je vezana fosforna grupa ugrađuju u rastuči lanac prajmera. ZMW je zatvorena struktura koja omogućava uočavanja ugradnje pojedinačnog nukleotida od strane DNK polimeraze naspram pozadinskog signala fluorescentnih nukleotida koji brzo difunduju u i van ZMW (u mikrosekundama). Potrebno je nekoliko milisekundi da se nukleotid ugradi u rastući lanac. Tokom ovog vremena, fluorescentni obeleživač se ekscitira i proizvodi fluorescentni signal, a nakon čega se fluorescentni obeleživač odvaja. Identifikacija odgovarajuće fluorescencije boje ukazuje na bazu koja je ugrađena. Proces se ponavlјa.
[0228] U jednom primeru izvođenja, tehnologija DNK sekvenciranja koja se upotrebljava u prijavljenom postupku je sekvenciranje na nanoporama (npr. kao što je opisano u Soni GV i Meller A., ClinChem 53:1996-2001 [2007]). Tehnike analize sekvenciranja DNK na nanoporama su industrijski razvijene od strane brojnih kompanija, uklјučujući Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Velika Britanija). Sekvenciranje na nanoporama je tehnologija sekvenciranja pojedinačnog molekula pri čemu je pojedinačni molekul DNK sekvencira direktno prilikom prolaska kroz nanopore. Nanopore predstavljaju male rupe, prečnika reda veličine 1 nanometra. Uranjanje nanopore u provodlјivu tečnost i primena potencijala (napona) duž tečnosti, dovodi do stvaranja slabe električne struje zbog provođenja jona kroz nanopore. Količina struje koja prolazi je osetlјiva na veličinu i oblik nanopore. Kako molekul DNK prolazi kroz nanopore, svaki nukleotid na molekulu DNK menja veličinu nanopore u različitom stepenu, čime se menja i veličina struje koja prolazi kroz nanopore u različitim stepenima. Ova promena u struji prilikom prolaska molekula DNK kroz nanopore predstavlјa očitavanje DNK sekvence.
[0229] U jednom primeru izvođenja, tehnologija DNK sekvenciranja koja se upotrebljava u prijavljenom postupku podrazumeva ploču sa efektom tranzistora hemijski osetljivog polja (chemFET) (npr. kao što je opisano u U.S. patentnoj publikaciji br. 2009/0026082, podnetoj 17. decembra 2007. godine). U jednom primeru tehnike, molekuli DNK mogu biti postavlјeni u reakcione komore, a molekuli matrice mogu biti hibridizovani sa prajmerima sekvenciranja vezanim za polimerazu. Ugradnja jednog ili više trifosfata u novi lanac nukleinske kiseline na 3' kraju prajmera za sekvenciranje može biti prepoznato usled promene struje u chemFET. Ploča može imati više chemFET senzora. U drugom primeru, pojedinačne nukleinske kiseline mogu biti pričvršćene za zrnca na kojima nukleinske kiseline mogu biti i amplifikovane, nakon čega pojedinačna zrnca mogu biti prebačena u pojedinačne reakcione komore na chemFET ploči, a DNK sekvencirana, pri čemu svaka komora ima chemFET senzor.
[0230] U jednom primeru izvođenja, tehnologija DNK sekvenciranja koja se upotrebljava u prijavljenom postupku je Halcyon-ov molkularni postupak koji upotrebljava transmisionu elektronsku mikroskopiju (TEM). Postupak, nazvan “Brzi nanotransfer pozicije individualnog molekula” (IMPRNT od engl. Individual Molecule Placement Rapid Nano Transfer), obuhvata upotrebu rezolucije na nivou pojedinačnog atoma prilikom snimanja DNK sa velikom molekulskom težinom (150kb ili veću) obeleženu atomima velike težine kao markerima, na transmisionom elektronskom mikroskopu i raspoređivanjem ovih molekula u okviru ultra tankih filmova sa ultra gustim paralelno postavljenim pločama sa konzistentnim razmakom između baza (3nm razmak među lancima). Elektronski mikroskop se koristi za slikanje molekula na filmovima, da bi se odredila pozicija teškog atoma i da bi se dobila informacija o sekvenci baza u okviru DNK. Postupak je dalјe opisan u PCT patentnoj publikaciji WO 2009/046445. Postupak dozvolјava sekvenciranje kompletnih lјudskih genoma za manje od deset minuta.
[0231] U jednom primeru izvođenja, tehnologija sekvenciranja DNK je tipa Jon Torrent sekvenciranja pojedinačnih molekula koja uparuje tehnologiju poluprovodnika sa hemijskim tipom sekvenciranja uzorka da bi se hemijski kodirana informacija (A, C, G, T) direktno prevela u digitalnu informaciju (0, 1) u okviru poluprovodničkog čipa. U prirodi, kada se nukleotid ugrađuje u lanac DNK dejstvom polimeraze, oslobađa se jon vodonika kao nusprodukt. Jon Torrent tehnologija upotrebljava ploče visoke gustine bunarića koji funkcionišu kao mikro mašine, a da bi se sproveo navedeni biohemijski process u velikom obimu i paralelno. Svaki bunarič sadrži različite DNK molekule. Ispod bunarića se nalazi sloj osetljiv na dejstvo jona, a ispod njega se nalazi jonski senzor. Kada se nukleotid, na primer C, ugradi u DNK matricu i dalje ugradi u lanac DNK, oslobađa se jon vodonika. Naelektrisanje datog jona menja pH rastvora, što se može identifikovati pomoću jonskog senzora tipa Jon Torrent. Sekvencer - u suštini najmanji pHmetar na svetu – imenuje bazu i time direktno prevodi hemijsku informaciju u digitalnu. Sekvencer tipa tzv. jonske personalne genomske mašine (PGM™) dalje sekvencijalno preliva čip jednim za drugim nukleotidom. Ukoliko sledeći nukleotid koji poplavi čip ne bude ugrađen pošto nema par, neće biti snimljena promena u voltaži i baza neće biti imenovana.
Ukoliko postoje dve identične baze u DNK, napon će se udvostručiti i čip će snimiti i imenovati dve identične baze. Direktna identifikacija omogućava snimanje ugradnje nukleotida u sekundama.
[0232] U pojedinim primerima izvođenja, postupkci koriste PCR ili srodnu tehniku za amplifikaciju uzoraka nukleotidnih sekvenci pre nego identifikacije ili mapiranja. Međutim, algoritamske tehnike koje su ovde prijavljene uglavnom ne zahtevaju amplifikaciju, posebno cilјanu amplifikaciju polimorfizama koji se dalje upotrebljavaju za procenu frakcije genoma.
[0233] Određeni primeri izvođenja koriste digitalni PCR i sekvenciranje po hibridizaciji. Digitalna lančana reakcija polimeraze (digitalni PCR ili dPCR) može biti upotrebljen za direktno identifikovanje i kvantifikovanje nukleinskih kiselina u uzorku. Digitalni PCR može biti urađen u emulziji. Pojedinačne nukleinske kiseline se razdvajaju, npr. u mikrofluidnom komornom uređaju, a svaka nukleinska kiselina se pojedinačno amplifikuje PCR-om. Nukleinske kiseline mogu biti razdvojene tako da je u proseku približno 0,5 nukleinskih kiselina/bunariću ili ne više od jedne nukleinske kiseline/bunariću. Različite probe mogu biti upotrebljene da bi se razlikovali fetalni aleli i allele od majke. Aleli mogu biti numerisani da bi se odredio broj kopija. U “sekvenciranju-po-hibridizaciji”, hibridizacija podrazumeva dovođenje u kontakt mnoštva polinukleotidnih sekvenci sa mnoštvom polinukleotidnih proba, pri čemu svaka od mnoštva polinukleotidnih proba može opciono biti vezana za podlogu. Podloga može biti ravna površina koja sadrži niz poznatih nukleotidnih sekvenci na ploči. Obrazac hibridizacije u okviru ploče može biti upotrebljen za utvrđivanje polinukleotidnih sekvenci prisutnih u uzorku. U drugim primerima izvođenja, svaka proba je vezana za kuglicu, npr. namagnetisano zrnce ili slično. Hibridizacija za kuglice može biti identifikovana i upotrebljena za identifikaciju mnoštva polinukleotidnih sekvenci unutar uzorka.
[0234] U jednom primeru izvođenja, postupaka upotrebljava masivno, paralelno sekvenciranje miliona fragmenata DNK, upotrebom hemije za “sekvenciranje-po-sintezi” i “sekvenciranje zanovano na reverzibilnom vezivanju obeleživača krajeva” firme Illumina (npr. kao što je opisano u Bentley i saradnici, Nature 6:53-59 [2009]). DNK matrica može predstavljati genomsku DNK, npr. cfDNK. U pojedinim primerima izvođenja, kao matrica se koristi genomska DNK iz izolovanih ćelija koja se fragmentacijom cepa na fragmente dužine od nekoliko stotina baznih parova. U drugim primerima izvođenja, kao matrica se upotrebljava cfDNK, a fragmentacija nije potrebna pošto cfDNK i postoji u vidu kratkih fragmenata. Na primer, fetalna cfDNK cirkuliše u krvotoku u vidu fragmenata <300 bp, a procenjuje se da se cfDNK majke u cirkulaciji nalazi u vidu fragmenata veličine između približno 0,5 i 1 Kb (Li i saradnici, ClinChem, 50: 1002-1011 (2004)). Illumina tehnologija sekvenciranja se oslanja se na vezivanje fragmentisane genomske DNK na planarnu, optički providnu površinu za kojoj su vezane strukture za usidravanje oligonukleotida. Krajevi DNK matrica se zatim “popravlјaju” kako bi se generisali tupi krajevi koji su 5'-fosforilisani, nakon čega se upotrebljava polimerazna aktivnost Klenovog fragmenta za dodavanje jedne A baze na 3' kraj zaravnjenih, fosforilisanih DNK fragmenata. Ovakavo dodavanje priprema fragmente DNK za ligaciju oligonukleotidnih adaptera koji imaju jednu T bazu viška na svom 3' kraju da bi se povećala efikasnost ligacije. Adapterni oligonukleotidi su komplementarni mestima usidravanja protočne ćelije. U uslovima ograničenog razblaženja, u protočnu ćeliju se dodaju jednolančane matrice DNK modifikovane sa adapterima koje zatim postaju imobilisane usled vezivanja za mesta usidravanja. Vezani DNK fragmenti se produžavaju i dalje amplifikuju u okviru tzv. stuktura mosta da bi se dobila protočna ćelija gusto napakovana stotinama miliona klastera (klastera) sekvenci, od kojih svaki sadrži -1.000 kopija iste matrice. U jednom primeru izvođenja, nasumično fragmentisana genomska DNK npr. cfDNK, se amplifikuje PCR-om pre nego što se podvrgava amplifikaciji u okviru klastera. Alternativno se upotrebljava preparat genomske biblioteke bez amplifikacije, a nasumično fragmentisana genomska DNK, npr. cfDNK se obogaćuje amplifikacijom samo u okviru klastera (Kozarewa i saradnici, Nature Methods 6:291-295 [2009]). Matrice se sekvenciraju uptrebom robusne tehnologije “sekvenciranja-po-sintezi” DNK u četiri boje, koja zapravo koristi reverzibilno vezivanje proba sa fluorescentnim bojama za krajeve, pri čemu se boje mogu lako ukloniti. Identifikacija fluorescencije velike osetlјivosti se postiže upotrebom laserske ekscitacije i ukupne interne optičke refleksije. Kratka očitavanja sekvenci od približno 20-40 bp, npr. 36 bp, se poravnavaju sa referentnim genomom u kome su maskirani ponovci i genetske razlike se imenuju upotrebom posebno razvijenih kompjuterskih programa za analizu podataka. Nakon završetka prvog očitavanja, matrice mogu biti regenerisane in situ da bi se omogućilo drugo očitavanje sa suprotnih krajeva fragmenata. Prema tome, u postupku se upotrebljava bilo sekvenciranje jednog kraja ili uparenih krajeva DNK fragmenata. Dalje se sprovodi delimično sekvenciranje fragmenta DNK koji su prisutni u uzorku, a marker sekvence obuhvataju očitavanja unapred određene dužine, npr.36 bp, koja mapiraju u poznati referentni genom.
[0235] Dužina očitavanja sekvence zavisi od određene tehnologije sekvenciranja. NGS postupci obezbeđuju očitavanja sekvence koje variraju u veličini od desetina do stotina baznih parova. U pojedinim primerima izvođenja postupka koji je ovde opisan, očitavanja sekvence su približno 20bp, približno 25bp, približno 30bp, približno 35bp, približno 40bp, približno 45bp, približno 50bp, približno 55bp, približno 60bp, približno 65bp, približno 70bp, približno 75 bp, približno 80bp, približno 85bp, približno 90bp, približno 95bp, približno 100bp, približno 110bp, približno 120bp, približno 130, približno 140bp, približno 150bp, približno 200bp, približno 250bp, približno 300bp, približno 350bp, približno 400bp, približno 450bp ili približno 500bp. Očekuje se da će tehnološki napredak omogućiti da očitavanja sa jednog kraja budu veća od 500bp što bi dalje omogućilo da očitavanje budu veća od 1000bp prilikom očitavanja sparenih krajeva. U jednom primeru izvođenja, očitavanje sekvence iznosi 36bp. Drugi postupci sekvenciranja koji se mogu koristiti upotrebom prijavljenih postupaka uklјučuju postupke pojedinačnog molekulskog sekvenciranja koji mogu sekvencirati molekule nukleinskih kiselina >5000 bp. Količina sekvenci velikog obima koja se dobija kao rezultat, prenosi se zatim kroz poseban kanal za analizu koji transformiše primarno očitavanje slike u okviru sekvencera u nizove baze. Paket integrisanih algoritama vrši osnovne primarne korake transformacije podataka: analizu slike, procenu intenziteta, imenovanje baza i poravnavanje.
MAPIRANJE
[0236] Razni računarski postupci mogu biti upotrebljeni za mapiranje svake identifikovane sekvence u bin kao podskup za analizu, npr. identifikacijom svih sekvenci u uzorku koji mapiraju u okviru određenog gena, hromozoma, alela ili druge strukture. Za poravnavanje sekvenci postoje brojni kompjuterski algoritmi, uključujući, bez ograničavanja, BLAST (Altschul i saradnici, 1990), BLITZ (MPsrch) (Sturrock i Collins, 1993), FASTA (Person i Lipman, 1988), BOWTIE (Langmead i saradnici, Genome Biology 10:R25.1-R25.10 [2009]) ili ELAND (Illumina, Inc., San Dijego, Kalifornija, SAD). U pojedinim primerima izvođenja sekvence binova se pronalaze u bazama podataka nukleinskih kiselina koje su poznate u stanju tehnike, uklјučujući bez ograničenja GenBank, dbEST, dbSTS, EMBL (the European Molecular Biology Laboratory) i DDBJ (DNK baza podataka Japana). BLAST ili slični alati mogu biti upotrebljeni za pretraživanje identifikovanih sekvenci u odnosu na baze podataka sekvenci, a pogoci pretrage mogu biti upotrebljeni za sortiranje identifikovanih sekvenci u odgovarajuće binove.
APARATURA
[0237] Analiza podataka sekvenciranja i dijagnoze koje se time dobijaju, uobičajeno se obavljaju upotrebom računarskog hardvera koji funkcioniše u skladu sa definisanim algoritmima i programima. Prema tome, u određenim primerima izvođenja se upotrebljavaju procesi koji uklјučuju podatke koji se čuvaju ili prenose u okviru jednog ili više računarskih sistema ili drugih sistema obrade. Primeri izvođenja se takođe odnose na uređaje koji izvode ove operativne postupke. Navedeni uređaj može biti posebno konstruisan za potrebnu namenu ili može predstavljati računar opšte namene (ili grupu računara) koji se selektivno aktivira ili rekonfiguriše kompjuterskim programom i/ili strukturom podataka koji se čuvaju na računaru. U pojedinim primerima izvođenja, grupa procesora obavlјa neke ili sve deklamovane analitičke operacije zajednički (npr. računski rad preko mreže ili klauda) i/ili paralelno. Procesor ili grupa procesora za obavljanje postupaka koji su ovde opisani, mogu biti raznih tipova, uklјučujući mikrokontrolere i mikroprocesore kao što su programabilni uređaji (npr. CPLD i FPGA) i drugi uređaji poput ASIC integralnih kola, procesora digitalnog signala i/ili mikroprocesora opšte namene.
[0238] Pored navedenog, određeni primeri izvođenja se odnose na prenosne i/ili neprenosne medijume koji mogu biti očitani od strane komjutera ili pak produkte kompjuterskih programa koji uključuju programska uputstva i/ili podatke (uklјučujući strukture podataka) za obavlјanje raznih operativnih postupaka koji se mogu primeniti na računarima. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni samo na, poluprovodničke memorijske uređaje, magnetne medijume koji mogu biti očitani od strane kompjutera kao što su disk jedinice, magnetna traka, optički medijumi kao što su CD-ovi, magnetnooptički medijumi i hardverski uređaji koji su posebno konfigurisani da čuvaju i obavljaju programskih uputstava. Tu pripadaju uređaji za trajnu memoriju (ROM) i radnu memoriju (RAM). Medijumi koji mogu biti očitani od strane kompjutera mogu biti direktno kontrolisani od strane krajnjeg korisnika ili mogu biti indirektno kontrolisani od strane krajnjeg korisnika. Primeri direktno kontrolisanih medijuma uklјučuju medijume locirane na korisničkom postrojenju i/ili medijume koji se ne dele sa drugim entitetima. Primeri indirektno kontrolisanih medijuma su medijumi koji su indirektno dostupni korisniku putem mreže interneta i/ili preko servisa koji pruža zajedničke resurse kao što je "klaud". Primeri programskih uputstava uklјučuju i mašinski kod, kao što je onaj proizveden od strane kompajlera, i datoteke koje sadrže viši nivo koda koji računar može iskoristiti upotrebom programa za tumačenje.
[0239] U jednom primeru izvođenja, prijavljen je kompjuterski programski proizvod za generisanje izlaznih podataka koji ukazuju na frakciju nukleinske kiseline dobijene iz definisanog genoma (kao što je fetalni) i opciono druge informacije poput prisustva ili odsustva fetalne aneuploidije u uzorku koji se ispituje. Kompjuterski proizvod može sadržavati uputstva za obavlјanje bilo kog ili više od prethodno opisanih postupaka, tj. za određivanje frakcije nukleinskih kiselina iz određenog organizma. Kao što je već objašnjeno, kompjuterski proizvod može podrazumevati neprenosivi i/ili prenosivi medijum koji može biti očitan od strane računara, a na kome su snimljeni izvršne ili kompilibilne logičke operacije za kompjuter (npr. uputstva), što zapravo omogućava procesoru da utvrdi frakciju genoma i postavi dijagnozu fetalne aneuproidije, postupak koji obuhvata: primanje procedure za primanje podataka sekvenciranja najmanje dela molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka majke, gde navedeni podaci sekvenciranja sadrže sekvence lokusa sa jednim ili sa više polimorfizama; komjuterski asistirane logičke operativne postupke za analizu sekvenci da bi se utvrdio broj kopija alela za jedan ili više polimorfizama, i određivanje fetalne frakcije nukleinskih kiselina u biološkom uzorku majke, ali i izlaznu proceduru za generisanje izlaznih podataka koji ukazuje na fetalnu frakciju nukleinskih kiselina u uzorku.
[0240] Informacije o sekvencama iz uzorka koji se razmatra, mogu biti mapirane na osnovu polimorfizma referentnih sekvenci kao što je to opisano. Dalјe, informacije o mapiranim sekvencama mogu biti upotrebljene za dobijanje broja kopija alela i/ili određivanje slučaja zigotnosti za polimorfizme. Takve informacije se dalje mogu koristiti za određivanje fetalne frakcije. U različitim primerima primene, polimorfizam referentnih sekvenci se čuva u bazi podataka kao što je, na primer, relacijska ili objektna baza podataka. Potrebno je napomenuti da nije praktično, ili u većini slučajeva čak moguće, da neovlašćena osoba obavlja bilo koju jednu ili sve od ovih računskih operacija. Na primer, mapiranje jednog očitavanja od 30 bp iz uzorka u bazi podataka referentnih sekvenci polimorfizma će potencijalno trajati pretežno dug period bez pomoći računarskog uređaja. Naravno, problem je složen, pošto pouzdana imenovanja često zahtevaju mapiranje hilјada (npr. najmanje približno 10.000) ili čak milion očitavanja na jedan ili više hromozoma.
[0241] U određenim primerima izvođenja, prijavljeni postupci koriste sačuvani spisak ili drugu organizovanu kolekciju podataka koja se odnosi na referentne polimorfizme za organizam iz koga su dobijeni proizvodi sekvence nukleinske kiseline za analizu. Kao što je već objašnjeno, sekvence iz uzorka koji se razmatra mogu biti poravnate ili na drugi način mapirane u odnosu na uskladištene polimorfizme. Pojedinačni polimorfizmi uobičajeno predstavljaju sekvence dužine dovolјne da se nedvosmisleno mapiraju sekvence identifikovane u uzorku nukleinske kiseline. U raznim primerima izvođenja, referentni polimorfizmi se skladište u bazi podataka koja pored njihovih sekvenci sadrži i karakteristike polimorfizma. Ovakva kolekcija informacija o polimorfizmima može biti, na primer, uskladištena u relacionoj ili objektnoj bazi podataka.
[0242] Slika 10 ilustruje uobičajen računarski sistem koji, kada je adekvatno konfigurisan ili projektovan, može poslužiti kao aparat za analizu predmetne prijave. Računarski sistem 200 obuhvata bilo koji broj procesora 202 (takođe označenih i kao centralne procesne jedinice ili CPU-ovi) koji su spojene sa uređajima za skladištenje uklјučujući primarnu memoriju 206 (obično radna memorija ili RAM), primarnu memoriju 204 (obično trajna memorija ili ROM). CPU 202 može biti različitih tipova, uklјučujući mikrokontrolere i mikroprocesore kao što su programabilni uređaji (npr. CPLD i FPGA) i neprogramabilni uređaje poput ASIC integralnih kola ili mikroprocesora opšte namene. Kao što je dobro poznato u ovoj oblasti, primarna memorija 204 radi na prenošenju podataka i uputstava na CPU, a primarna memorija 206 se obično upotrebljava za prenos podataka i instrukcija na dvosmerni način. Oba ova primarna uređaja za skladištenje mogu uklјučivati bilo koji prikladan kompjuterski čitlјiv medijum kao što je prethodno opisano. Uređaj 208 za skladištenje velikog obima takođe je dvosmerno povezan na CPU 202 i obezbeđuje dodatni kapacitet za skladištenje podataka, a može sadržavati i bilo koji od medijuma koji može biti očitan od strane kompjutera i prethodno je opisan. Uređaj 208 za skladištenja većeg obima može biti upotrebljen za čuvanje programa, podataka i sličnog, a uobičajeno je da on predstavlja sekundarni medijum za skladištenje podataka kao što je tvdi disk. Potrebno je napomenuti da informacije koje se zadržavaju unutar uređaja za skladištenje 208 mogu u odgovarajućim slučajevima biti inkorporisane na standardni način, kao deo primarne memorije 206, u vidu virtuelna memorije. Specifičaj uređaj za skladištenja velikog obima, kao što je CD-ROM 214, može takođe jednosmerno preneti podatke na CPU.
[0243] CPU 202 je takođe povezan sa interfejsom 210 koji se povezuje sa jednim ili sa više ulazno/izlaznih uređaja kao što su video monitori, miševi, tastature, mikrofoni, ekrani osjetlјivi na dodir, čitači kartice, tableti, uređaji za snimanje, prepoznavanje glasa ili rukopisa, ili drugi dobro poznati uređaji za unos, kao što su, naravno, drugi kompjuteri. Konačno, CPU 202 opciono može biti spojen sa spolјnim uređajem, kao što je baza podataka ili računarska ili telekomunikaciona mreža koja koristi spolјnu vezu, a što je prikazano uopšteno sa 212. Sa takvom vezom, pretpostavlјa se da CPU može primati informacije iz mreže, ili da može slati informacije na mrežu tokom obavlјanja koraka postupka koji je ovde opisan.
[0244] Sekvenca ili drugi podaci mogu direknto ili indirektno biti uneti u komjuter od strane koristnika. U jednom primeru izvođenja, računarski sistem 200 je direktno povezan sa uređajem za sekvenciranje koji čita i/ili analizira sekvence amplifikovanih nukleinskih kiselina. Sekvence ili druge informacije iz takvih uređaja se tako obezbeđuju, preko interfejsa 212, za analizu od strane sistema 200. Alternativno, sekvence koje obrađuje sistem 200 bivaju obezbeđene iz izvora skladištenja sekvence kao što je baza podataka ili drugi vid repozitorijuma. Jednom kada se poveže sa uređajem za obradu 200, memorijski uređaj kao što je primarna memorija 206 ili memorijski uređaj 208, puferiše ili barem privremeno pamti sekvence nukleinskih kiselina. Pored toga, memorijski uređaj može sačuvati brojeve marker sekvenci raznih hromozoma ili gena, izračunati broj kopija itd. Memorija takođe može služiti za skladištenje raznih rutinskih postupaka rutine i/ili programa za analizu prezentacije sekvence ili mapiranih podataka. Navedeni programi/rutine mogu uklјučivati programe za obavlјanje statističkih analiza itd.
[0245] U jednom primeru, korisnik pohranjuje uzorak u uređaj za sekvenciranje. Podaci se prikuplјaju i/ili analiziraju aparatom za sekvenciranje koji je povezan sa računarom. Kompjuterski program na računaru omogućava prikuplјanje podataka i/ili analizu. Podaci mogu biti sačuvani, prikazani (preko monitora ili sličnog uređaja) i/ili poslati na drugu lokaciju. Kao što je navedeno, računar može biti povezan na internet koji se koristi za prenos podataka na ručni uređaj koji koristi udalјeni korisnik (npr. lekar, naučnik ili analitičar). Podrazumeva se da se podaci mogu sačuvati i/ili analizirati pre prenosa. U pojedinim primerima izvođenja, neobrađeni podaci se prikuplјaju i šalјu udalјenom korisniku (ili aparatu) koji će analizirati i/ili čuvati podatke. Prenos se može odvijati putem interneta, ali se može obaviti i putem satelita ili druge veze. Alternativno, podaci mogu biti sačuvani na medijumu koji može biti očitan od strane kompjutera (npr. na CD-u ili poluprovodničkom memorijskom uređaju), nakon čega medijum može biti isporučen krajnjem korisniku (npr. poštom). Udaljeni korisnik može biti na istoj ili drugačijoj geografskoj pozciji uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na, zgradu, grad, državu, zemlјu ili kontinent.
[0246] U pojedinim primerima izvođenja, ovde opisani postupci dalјe obuhvataju prikuplјanje podataka u vezi sa mnoštvom polinukleotidnih sekvenci i slanje podataka na računar. Na primer, računar može biti povezan sa laboratorijskom opremom, npr. sa aparatom za prikuplјanje uzorka, aparatom za nukleotidnu amplifikaciju, aparatom za sekvenciranje nukleotida ili aparatom za hibridizaciju. Računar može zatim prikupiti primenlјive podatke prikuplјene od strane laboratorijskog uređaja. Podaci mogu biti sačuvani na računaru u bilo kom koraku, npr. dok se podaci prikuplјaju u realnom vremenu, pre slanja, tokom ili u vezi sa slanjem ili nakon slanja. Podaci mogu biti sačuvani na medijumu koji može biti očitan od strane komjutera i koji se potom može izvući iz računara. Podaci koji se prikuplјaju ili čuvaju mogu biti preneti sa računara na udalјenu lokaciju, npr. putem lokalne mreže ili široke mreže kao što je internet.
[0247] Prema jednom aspektu, prijava dalјe obezbeđuje sistem sposoban za obavljanje kvantitativne analize nukleotidnog sekvenciranja sa preciznošću od najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili najmanje 99%. Nukleotidno sekvenciranje može podrazumevati sekvenciranje po Sanger-u, paralelno sekvenciranje velikog obima, hibridizaciju ili druge tehnike, a kao što je ovde opisano. Sistem može da sadrži različite komponente, na primer, laboratorijsku opremu i računarske sisteme, a može biti i konfigurisan tako da obavlja postupke koji su ovde prijavljeni.
[0248] U pojedinim primerima izvođenja, uređaji i/ili instrukcije za programiranje mogu dalјe sadržavati uputstva za automatsko snimanje informacija relevantnih za postupak kao što je fetalna DNK frakcija i, opciono, prisustvo ili odsustvo fetalne hromozomske aneuploidije, u medicinski karton pacijenta koji je zapravo humani subjekat koji obzbeđuje uzorak majke koji se ispituje. Zdravstveni karton pacijenta može voditi, na primer, laboratorija, kancelarija ordinirajućeg lekara, bolnica, zdravstvena organizacija, osiguravajuće društvo ili služba internet stranice za lične zdravstvene kartone. Nadalje, na osnovu rezultata analize koja je primenjena od strane procesora, postupak može uklјučivati propisivanje, započinjanje i/ili promenu tretmana humanog subjekta od koga je uzet uzorak majke za ispitivanje. Navedeno može uklјučivati obavljanje jedne ili više dodatnih ispitivanja ili analiza na dodatnim uzorcima uzetim od subjekta.
Primer
Fetalna frakcija predviđena na osnovu varijacija dobijenih sekvenciranjem: Slučaj 2
[0249] Da bi se prikazalo da predmetni postupak može biti upotrebljen za pouzdanu procenu fetalnu frakcije u uzorku majke, kreiran je veštački uzorak "majke", a varijacije baza su identifikovane u svim lokusima hromozoma 1 i 7 kako bi se predvidela frakcija genoma koji je manjeg doprinosa.
[0250] cfDNK koja je izolovana iz trudne žene predstavlja mešavinu cfDNK majke i fetusa, sa nivoom fetalne cfDNK koji odgovara medijani od 10% ukupne cfDNK (Lo i saradnici, 2010, "Maternal Plasma DNA seqeucning reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus", Prenatal Diagnosis, 2, 1-12). Da bi se napravio veštački uzorak majke, za kreiranje uzorka mešavine genoma je upotrebljena genomska DNK (gDNK) dobijena od majke i njenog sina (DNK majke i sina označenih kao NA10924 i NA10925, tim redom, Institute for Medical Research, Camden, NJ). Pet mikrograma svake gDNK, i majke i sina, je podvrgnuta fragmentaciji do fragmente od približno 200 bp, a zatim je određena koncentracija svakog od njih. Veštački uzorak koji sadrži 10% DNK sina i 90% DNK iz majke je pripremljen kao imitacija uzorka krvi majke za koju se pretpostavlja da obično sadrži 2-40% fetalne cfDNK u zavisnosti od doba gestacije fetusa [Lun i saradnici, 2008, "Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma", Clinical Chemistry, 54, 1664-1672]. Sekvenciona biblioteka je pripremlјena upotrebom DNK veštačkog uzorka koji je dalje podvrgnut sekvenciranju u 50 ciklusa, upotrebom protočne ćelije sa 4 trake i IlluminaHiSeq 2000 aparata. Generisano je približno 800 miliona 49-mernih očitavanja sekvenci.
[0251] Navedenih 800 miliona očitavanja je poravnato sa humanim referentnim genomom u kome su maskirani ponovci (hg19 build) upotrebom GSNAP algoritma (http://researchpub.gene.com/gmap/) koji omogućava jedno nepreklapanje i isljučivanje insercija i delecija. Sekvence koje su mapirale na više lokacija u genomu su isključene iz razmatranja. Sva ostala mapirana očitavanja su prebrojana kao marker sekvence i samo su lokusi na koje je mapiralo 40 i 100 marker sekvence dalje razmatrano u analizi, tj. razmatrane su samo baze čija je pokrivenosti iznosila 40 i 100 marker sekvenci.
[0252] Za svaku poziciju baze, broj marker sekvenci koje su mapirale svaku od četiri baze je izbrojan. Lokusi sa više od dve moguće baze su eliminisani i samo su marker sekvence koje mapiraju monoalaske i bialelske lokuse upotrebljene za predikciju veštački kreirane fetalne frakcije. Ukupan broj marker sekvenci koje su mapirale svaku bazu lokusa označio je pokrivenost (D) datog lokusa. U ovako simuliranom uzorku majke, očekuje se da će doprinos češćeg alela majke (B) biti odraz 90% delova marker sekvenci, a da će doprinos ređeg alela sina (A) biti odraz 10% delova marker sekvenci.
[0253] Na Slikama 11A i B su prikazani histogrami broja zableženih varijacija baza (učestalosti) na hromozomima 1 i 7, redom, u vidu procenata ređih alela (A/D) za hromozome 1 i 7. Procenat ređeg alela je predstavljen kao procenat od ukupnog broja alela na datom lokusu. Na primer, za dati lokus za koji je zabeleženo 8 kopija ređe zastupljenog alela A i 56 kopija češćeg alela B, procenat ređeg alela je 8%. Podaci pokazuju da se najveći broj kopija (učestalosti) ređeg alela uočava kada je ređi alel prisutan sa 5%, što predstavlјa polovinu fetalne frakcije. Shodno tome, podaci su predvideli da uzorak sadrži fetalnu frakciju od 10%, što odgovara onome što je upotrebljeno za kreiranje veštačkog uzorka majke.
[0254] Slike 12A i B pokazuju distribuciju učestalosti alela duž hromozoma 1 i 7, tim redom. Oba grafika prikazuju da se maksimalan broj varijatni alela duž hromozoma javlja pri učestalosti ređeg alela od 5% i učestalosti češćeg alela od 95%. Neke od preostalih tačaka podataka predstavlјaju bialelne lokuse koji su prisutni u genomu majke, dok drugi predstavlјaju šum same metodologije sekvenciranja. Centralni deo svakog grafika u kome varijatne alela nisu prikazane preklapa se sa centromerama homozoma za koje je poznato da su regioni hromozoma bogati ponovcima i u kojima marker sekvence mapiraju više od jednog lokusa zbog čega su isklјučene iz analize. U drugim regionima, na primer, regionima koji okružuju centromere i regione koji odgovaraju telomerama, varijatne allele su prekomerno zastuplјene. Prekomerna zastuplјenost ovih regija se može pripisati metodologiji sekvenciranja, pri čemu se neki regioni sekvenciraju sa većom dubinom od drugih.
[0255] Stoga, predmetni postupak može biti upotrebljen za predviđanje fetalne frakcije. Postupak je posebno koristan pošto ne zahteva identifikaciju cilјnih sekvenci, npr. SNP-ova, a svaka varijacija na bilo kojoj poziciji u okviru bilo kog hromozoma može poslužiti da se predvidi procenat fetalne frakcije.
Ostali primeri izvođenja
[0256] Iako je prethodno navedni tekst u principu opisao specifične procese i aparate, premetnu prijavu karakteriše mnogo širi spektar primenjivosti. Preciznije, predmetna prijava je opisana u svrhu detekcije fetalne DNK u uzorku DNK uzetom iz trudne individue, ali nije tako ograničena, pošto koncepti i postupci koji su ovde predstavljeni mogu takođe biti primenjeni za druge kontekste kao što je detekcija relativnih količina tipova DNK u uzorku sa DNK koja potiče iz dva ili više različitih genoma. Naravno, stručnjaci će uvideti druge varijacije, modifikacije i alternative.
[0257] Na primer, iako većina primera i primena koje su ovde opisane razmatraju frakcije fetalne DNK u uzorku DNK uzetog od osobe koja nosi fetus, prijava nije toliko ograničena. U opštem slučaju, razni primeri izvođenja prijavljuju postupke za procenu relativnih količina nukleusa iz dva različita genoma u ispitivanom uzorku koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina iz dva različita genoma, a za koje je poznato ili se sumnja da se razlikuju u količini jedne ili više sekvenci od interesa. Mešavina nukleinskih kiselina je dobijena iz dve ili više vrsta ćelija.
[0258] Nadalje, iako se većina primera koji su ovde predstavlјeni odnosi na uzorke uzete od trudne žene, prijava nije tako ograničena. Na primer, individua iz koje je obezbeđen uzorak koji će biti ispitan može biti organizam koji sadrži polinukleotidne sekvence, npr. bilјka, insekt kao što je mušica ili životinja. U pojedinim primerima izvođenja, subjekt je sisar, npr. miš, pacov, pas, majmun ili čovek. Kao što je naznačeno, subjekat može biti trudna individua. Subjekat može biti i individua sa oboljenjem kao što je kancer ili može biti individua inficirana stranim telom kao što je mikroorganizam, npr. virus. Uzorak može sadržavati telesnu tečnost subjekta, npr. krv, plazmu, serum, sputum, plјuvačku, urin, izlučevine, limfu, sluz i slično. Na primer, uzorak može biti uzorak plazme majke koji sadrži mešavinu DNK majke i fetusa oslobođenu od ćelija. U principu, prijavljeni postupci mogu uključivati sekvenciranje DNK iz uzorka; mapiranje očitavanja sekvence na polimorfizme; klasifikaciju polimorfizama na osnovu zigotnosti; i procenu frakcije DNK iz sekundarnog izvora u uzorku.
Dopunski materijal 1 - Lista sekvenci baze podataka za pretraživanje alela
[0259]

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Postupak procene frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue, postupak koji obuhvata:
(a) mapiranje segmenata DNK dobijenih iz telesne tečnosti trudne individue na osnovu mnoštva polimorfizama sekvenci, pri čemu je DNK sekvencirana pod uslovima koji identifikuju mnoštvo polimorfizama sekvenci;
(b) određivanje učestalosti alela mapiranih nukleinskih kiselina za svaki od mnogobrojnih polimorfizama sekvenci; i
(c) primena učestalosti alela u modelu verovatnoće distribucije u mešavini da bi se dobila procena frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz krvi osobe koja nosi fetus,
pri čemu se postupci (b)-(c) obavlјaju u okviru jednog ili više procesora koji rade po programskim uputstvima za određivanje i primenu.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu (c) obuhvata izvršavanje instrukcija od strane jednog ili više procesora zarad rešavanja serija jednačina za faktorske momente podataka o učestalosti alela za svaki od mnoštva polimorfizama sekvenci.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalјe obuhvata, pre postupka (c), računsko uklanjanje učestalosti alela za polimorfizme koji su identifikovani kao heterozigotni i kod fetusa i kod trudne individue.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalјe obuhvata, pre postupka (c), računsko uklanjanje učestalosti alela za polimorfizme koji su identifikovani kao homozigotni i kod fetusa i kod trudne individue.
5. Postupak prema patentnim zahtevima 1, koji dalјe obuhvata, pre postupka (c), računsko uklanjanje učestalosti alela za polimorfizme koji su identifikovani kao heterozigotni kod trudne individue.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde model verovatnoće distribucije u mešavini uračunava grešku sekvenciranja.
7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde DNK dobijena iz telesne tečnosti trudne individue predstavlja DNK oslobođenu od ćelija koja je dobijena iz plazme trudne individue.
8. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde mapiranje nukleinskih kiselina dobijenih iz telesne tečnosti trudne individue podrazumeva mapiranje navedenih segmenata u bazu podataka polimorfizama.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalјe obuhvata dobijanje uzorka telesne tečnosti trudne individue.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalјe obuhvata sekvenciranje DNK iz telesne tečnosti trudne individue upotrebom sekvencera nukleinskih kiselina pod uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenata u kojima je prisutan polimorfizam sekvenci.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde mapiranje u (a) podrazumeva identifikovanje mnoštva bialelalnih polimorfizama sekvenci.
12. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde mapiranje u (a) podrazumeva mapiranje segmenata DNK na osnovu mnoštva unapred definisanih polimorfizama sekvenci.
13. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalјe obuhvata izvršavanje programskih uputstava u okviru jednog ili više procesora zarad automatskog snimanja frakcije fetusa DNK koja je procenjena postupkom (c) u medicinski karton trudne individue, kao i skladištenje podatka na medijumu koji može biti očitan od strane računara.
14. Postupak prema patentnom zahtevu 13, pri čemu medicinsku dokumentaciju pacijenta vodi laboratorija, kancelarija ordinirajućeg lekara, bolnica, zdravstvena organizacija, osiguravajuće drušvo ili služba internet stranice za lične zdravstvene kartone.
15. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalјe podrazumeva, na osnovu procene frakcije DNK fetusa, naručivanje i/ili sprovođenje jednog ili više dodatnih testova.
RS20181302A 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama RS57837B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161474362P 2011-04-12 2011-04-12
EP16158103.8A EP3078752B1 (en) 2011-04-12 2012-04-12 Resolving genome fractions using polymorphism counts

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57837B1 true RS57837B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=46001809

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181302A RS57837B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
RS20200985A RS60710B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
RS20220224A RS63008B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200985A RS60710B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
RS20220224A RS63008B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma

Country Status (20)

Country Link
US (4) US9447453B2 (sr)
EP (5) EP3456844B1 (sr)
JP (3) JP5863946B2 (sr)
CN (2) CN106319047B (sr)
AU (1) AU2012242698C1 (sr)
CA (1) CA2832468C (sr)
CY (4) CY1117574T1 (sr)
DK (4) DK3567124T3 (sr)
ES (4) ES2907069T3 (sr)
HR (3) HRP20220296T1 (sr)
HU (3) HUE041411T2 (sr)
IL (1) IL228843A (sr)
LT (3) LT3456844T (sr)
PL (4) PL3078752T3 (sr)
PT (3) PT3567124T (sr)
RS (3) RS57837B1 (sr)
SI (3) SI3456844T1 (sr)
SM (3) SMT202200090T1 (sr)
TR (1) TR201816062T4 (sr)
WO (1) WO2012142334A2 (sr)

Families Citing this family (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
EP2321642B1 (en) 2008-08-04 2017-01-11 Natera, Inc. Methods for allele calling and ploidy calling
WO2011041485A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Gene Security Network, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP2513341B1 (en) 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
EP2370599B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Method for determining copy number variations
US20120010085A1 (en) 2010-01-19 2012-01-12 Rava Richard P Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
WO2011091063A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
WO2011146632A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 Gene Security Network Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US12545960B2 (en) 2010-05-18 2026-02-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US12221653B2 (en) 2010-05-18 2025-02-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US12152275B2 (en) 2010-05-18 2024-11-26 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US20130040375A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
CN103608466B (zh) 2010-12-22 2020-09-18 纳特拉公司 非侵入性产前亲子鉴定方法
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
RU2671980C2 (ru) 2011-02-09 2018-11-08 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления плоидности
CA2827873C (en) 2011-02-24 2022-08-16 The Chinese University Of Hong Kong Molecular testing of multiple pregnancies
RS57837B1 (sr) 2011-04-12 2018-12-31 Verinata Health Inc Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
WO2014014498A1 (en) 2012-07-20 2014-01-23 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation in a fetal genome
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
EP2768978B1 (en) 2011-10-18 2017-11-22 Multiplicom NV Fetal chromosomal aneuploidy diagnosis
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
EP2875156A4 (en) 2012-07-19 2016-02-24 Ariosa Diagnostics Inc SEQUENTIAL LIGATION-BASED MULTIPLEX DETECTION OF GENETIC VARIANTS
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN111254500B (zh) 2012-12-10 2024-01-23 分析生物科学有限公司 靶向基因组分析的方法
GB201304810D0 (en) * 2013-03-15 2013-05-01 Isis Innovation Assay
WO2014151117A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
KR102665592B1 (ko) 2013-05-24 2024-05-21 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
WO2015026967A1 (en) * 2013-08-20 2015-02-26 Natera, Inc. Methods of using low fetal fraction detection
US20170132364A1 (en) * 2013-09-03 2017-05-11 Welgene Biotech Co., Ltd. Non-invasive prenatal testing method based on genome-wide normalized score
US9499870B2 (en) 2013-09-27 2016-11-22 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
WO2015042649A1 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 Murdoch Children's Research Institute A quantitative assay for target dna in a mixed sample comprising target and non-target dna
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
RU2543155C1 (ru) * 2014-02-03 2015-02-27 Закрытое акционерное общество "Геноаналитика" Способ неинвазивной диагностики анеуплоидий плода методом секвенирования
WO2015148776A1 (en) * 2014-03-27 2015-10-01 The Scripps Research Institute Systems and methods for genomic annotation and distributed variant interpretation
US12492429B2 (en) * 2014-04-21 2025-12-09 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
CA2945962C (en) 2014-04-21 2023-08-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
US20180173846A1 (en) 2014-06-05 2018-06-21 Natera, Inc. Systems and Methods for Detection of Aneuploidy
EP3169803B1 (en) * 2014-07-18 2019-11-20 Illumina, Inc. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular dna and cell free dna
US11783911B2 (en) 2014-07-30 2023-10-10 Sequenom, Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20160053301A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Clearfork Bioscience, Inc. Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna
JP7441584B6 (ja) * 2014-08-22 2024-03-15 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド 無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の定量的遺伝子解析のための方法
US9857328B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same
CA2971589C (en) 2014-12-18 2021-09-28 Edico Genome Corporation Chemically-sensitive field effect transistor
US9859394B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10020300B2 (en) 2014-12-18 2018-07-10 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10006910B2 (en) 2014-12-18 2018-06-26 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same
US9618474B2 (en) 2014-12-18 2017-04-11 Edico Genome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
AU2016281193B2 (en) * 2015-06-15 2022-06-16 Murdoch Childrens Research Institute Method of measuring chimerism
BE1023274A9 (nl) * 2015-07-17 2017-03-17 Multiplicom Nv Schattingswerkwijze en -systeem voor het schatten van een foetale fractie
CN115035949A (zh) * 2015-09-22 2022-09-09 香港中文大学 通过母亲血浆dna的浅深度测序准确定量胎儿dna分数
BE1022771B1 (nl) * 2015-10-14 2016-08-31 Multiplicom Nv Werkwijze en systeem om te bepalen of een vrouw zwanger is op basis van een bloedstaal
JP6913089B2 (ja) 2015-11-11 2021-08-04 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｄｎａライブラリーの高効率構築
CA3016077A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 Counsyl, Inc. Combinatorial dna screening
RU2760913C2 (ru) 2016-04-15 2021-12-01 Натера, Инк. Способы выявления рака легкого
WO2017201081A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Agilome, Inc. Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US11319594B2 (en) 2016-08-25 2022-05-03 Resolution Bioscience, Inc. Methods for the detection of genomic copy changes in DNA samples
WO2018064486A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Counsyl, Inc. Noninvasive prenatal screening using dynamic iterative depth optimization
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
GB201618485D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence
IL266346B2 (en) * 2016-11-18 2024-07-01 Univ Hong Kong Chinese Universal haplotype-based noninvasive prenatal testing for single gene diseases
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
GB2559319B (en) 2016-12-23 2019-01-16 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for the analysis of linked nucleic acids
CA3207879A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
RU2636618C1 (ru) * 2017-02-14 2017-11-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ и тест-система для определения доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины с помощью методов высокопроизводительного секвенирования
US12006533B2 (en) * 2017-02-17 2024-06-11 Grail, Llc Detecting cross-contamination in sequencing data using regression techniques
WO2018156418A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
JP7370862B2 (ja) * 2017-03-17 2023-10-30 セクエノム， インコーポレイテッド 遺伝子モザイク症のための方法およびプロセス
KR102145417B1 (ko) * 2017-05-24 2020-08-19 지니너스 주식회사 무세포 핵산으로부터 수득된 서열 분석 데이터에 대한 배경 대립인자의 빈도 분포를 생성하는 방법 및 이를 이용하여 무세포 핵산으로부터 변이를 검출하는 방법
CA3067419A1 (en) * 2017-06-20 2018-12-27 Illumina, Inc. Methods and systems for decomposition and quantification of dna mixtures from multiple contributors of known or unknown genotypes
CN110770839B (zh) * 2017-06-20 2024-12-06 伊鲁米那股份有限公司 来自未知基因型贡献者的dna混合物的精确计算分解的方法
WO2019005877A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Grail, Inc. CROSS CONTAMINATION DETECTION IN SEQUENCING DATA
CN108220451B (zh) * 2017-12-08 2020-10-27 北京科迅生物技术有限公司 胎儿游离核酸浓度的检测方法及试剂盒
US12084720B2 (en) 2017-12-14 2024-09-10 Natera, Inc. Assessing graft suitability for transplantation
US12398389B2 (en) 2018-02-15 2025-08-26 Natera, Inc. Methods for isolating nucleic acids with size selection
US12024738B2 (en) 2018-04-14 2024-07-02 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring
GB201810571D0 (en) 2018-06-27 2018-08-15 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for the analysis of circulating microparticles
US12234509B2 (en) 2018-07-03 2025-02-25 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
ES2738176B2 (es) * 2018-07-20 2021-01-11 Bioarray S L Metodo para el estudio de mutaciones en embriones en procesos de reproduccion in vitro
CA3107467A1 (en) * 2018-09-07 2020-03-12 Sequenom, Inc. Methods, and systems to detect transplant rejection
CN109378037B (zh) * 2018-10-31 2023-04-14 中国石油大学(华东) 基于遗传学规律的等位基因准确推断方法
WO2020172164A1 (en) * 2019-02-19 2020-08-27 Sequenom, Inc. Compositions, methods, and systems to detect hematopoietic stem cell transplantation status
US20200381079A1 (en) * 2019-06-03 2020-12-03 Illumina, Inc. Methods for determining sub-genic copy numbers of a target gene with close homologs using beadarray
US12305235B2 (en) 2019-06-06 2025-05-20 Natera, Inc. Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system
GB201909325D0 (en) 2019-06-28 2019-08-14 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for analysis for microparticles
CN110438220A (zh) * 2019-08-16 2019-11-12 深圳市人民医院 纤毛不动综合症基因面板试剂盒及其应用
US12305242B2 (en) 2020-04-24 2025-05-20 The Johns Hopkins University Methods and related aspects for quantitative polymerase chain reaction to determine fractional abundance
US11946104B2 (en) 2020-07-07 2024-04-02 Billiontoone, Inc. Non-invasive prenatal testing at early stage of pregnancy
EP4266315A4 (en) * 2020-12-16 2024-11-20 Seedna Inc. METHOD FOR CALCULATING THE RELIABILITY VALUE OF A POLYMORPHISM LOCUS SIGNAL
CN113345515B (zh) * 2021-06-17 2024-05-31 苏州贝康医疗器械有限公司 新发平衡易位家系中胚胎遗传性检测方法及装置
CN113667734B (zh) * 2021-07-16 2022-05-24 四川大学华西医院 Shank3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途
EP4381099A1 (en) 2021-08-02 2024-06-12 Natera, Inc. Methods for detecting neoplasm in pregnant women
CA3223315A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Michael Mehan Minimizing fetal fraction bias in maternal polygenic risk score estimation
CN115035950B (zh) * 2022-06-28 2025-08-12 广州燃石医学检验所有限公司 基因型检测方法、样本污染检测方法、装置、设备及介质
JP2025043574A (ja) * 2023-09-19 2025-04-01 株式会社東芝 試料識別方法及びバイオマーカー

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6270961B1 (en) 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5976790A (en) 1992-03-04 1999-11-02 The Regents Of The University Of California Comparative Genomic Hybridization (CGH)
WO1994003638A1 (en) 1992-07-30 1994-02-17 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting aneuploidy by amplified short tandem repeats
US5776737A (en) 1994-12-22 1998-07-07 Visible Genetics Inc. Method and composition for internal identification of samples
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
AU735272B2 (en) 1996-10-04 2001-07-05 Intronn Llc Sample collection devices and methods using markers and the use of such markers as controls in sample validation, laboratory evaluation and/or accreditation
GB9704444D0 (en) 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
JP2002503954A (ja) 1997-04-01 2002-02-05 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸増幅法
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
US20020142324A1 (en) 2000-09-22 2002-10-03 Xun Wang Fungal target genes and methods to identify those genes
US6691042B2 (en) 2001-07-02 2004-02-10 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for generating differential profiles by combining data obtained in separate measurements
US7226732B2 (en) 2001-07-16 2007-06-05 Cepheid Methods, apparatus, and computer programs for verifying the integrity of a probe
US6927028B2 (en) * 2001-08-31 2005-08-09 Chinese University Of Hong Kong Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA
US7893248B2 (en) 2002-02-20 2011-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
IL163600A0 (en) 2002-03-01 2005-12-18 Ravgen Inc Methods for detection of genetic disorders
US6977162B2 (en) * 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
US7727720B2 (en) * 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
EP2359689B1 (en) 2002-09-27 2015-08-26 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and use thereof
US10229244B2 (en) 2002-11-11 2019-03-12 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes using hidden markov model based estimations
US20040224331A1 (en) 2003-01-17 2004-11-11 The Trustees Of Boston University Haplotype analysis
EP1599608A4 (en) 2003-03-05 2007-07-18 Genetic Technologies Ltd Identification of fetal DNA and fetal cell marker in maternal plasma or serum
US20040209299A1 (en) 2003-03-07 2004-10-21 Rubicon Genomics, Inc. In vitro DNA immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented DNA
WO2005023091A2 (en) 2003-09-05 2005-03-17 The Trustees Of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
US20050221341A1 (en) 2003-10-22 2005-10-06 Shimkets Richard A Sequence-based karyotyping
US20050114205A1 (en) * 2003-11-21 2005-05-26 Kenneth Nelson Multi-media digital cartridge storage and playback units
WO2005072133A2 (en) 2004-01-27 2005-08-11 Zoragen, Inc. Nucleic acid detection
US20100216151A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US20100216153A1 (en) * 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US20060046258A1 (en) 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
WO2005116257A2 (en) 2004-05-17 2005-12-08 The Ohio State University Research Foundation Unique short tandem repeats and methods of their use
DE102004036285A1 (de) 2004-07-27 2006-02-16 Advalytix Ag Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
JP2007327743A (ja) 2004-09-07 2007-12-20 Univ Of Tokyo 遺伝子コピーの解析方法及び装置
TW200624106A (en) 2004-09-07 2006-07-16 Uni Charm Corp Warming article
US20060286566A1 (en) * 2005-02-03 2006-12-21 Helicos Biosciences Corporation Detecting apparent mutations in nucleic acid sequences
US20060178835A1 (en) 2005-02-10 2006-08-10 Applera Corporation Normalization methods for genotyping analysis
US7645576B2 (en) 2005-03-18 2010-01-12 The Chinese University Of Hong Kong Method for the detection of chromosomal aneuploidies
AU2006256374A1 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Compugen Ltd. Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis
US20060286558A1 (en) 2005-06-15 2006-12-21 Natalia Novoradovskaya Normalization of samples for amplification reactions
US8532930B2 (en) 2005-11-26 2013-09-10 Natera, Inc. Method for determining the number of copies of a chromosome in the genome of a target individual using genetic data from genetically related individuals
DE102005057988A1 (de) 2005-08-04 2007-02-08 Bosch Rexroth Ag Axialkolbenmaschine
EP3591068A1 (en) 2006-02-02 2020-01-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
US20100184043A1 (en) * 2006-02-28 2010-07-22 University Of Louisville Research Foundation Detecting Genetic Abnormalities
EP2351858B1 (en) 2006-02-28 2014-12-31 University of Louisville Research Foundation Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
US20080064098A1 (en) 2006-06-05 2008-03-13 Cryo-Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of maternal placental cells
WO2007147079A2 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Living Microsystems, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
US9328378B2 (en) 2006-07-31 2016-05-03 Illumina Cambridge Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
AU2008213634B2 (en) 2007-02-08 2013-09-05 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for RhD typing, gender determination and nucleic acid quantification
US12180549B2 (en) 2007-07-23 2024-12-31 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing
PL2557520T3 (pl) 2007-07-23 2021-10-11 The Chinese University Of Hong Kong Określanie zaburzenia równowagi sekwencji kwasu nukleinowego
CN101889074A (zh) 2007-10-04 2010-11-17 哈尔西恩莫尔丘勒公司 采用电子显微镜对核酸聚合物测序
EP2271772B1 (en) * 2008-03-11 2014-07-16 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US20090307180A1 (en) 2008-03-19 2009-12-10 Brandon Colby Genetic analysis
WO2009120808A2 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
US20090270601A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Steven Albert Benner Differential detection of single nucleotide polymorphisms
EP2853601B1 (en) 2008-07-18 2016-09-21 TrovaGene, Inc. Methods for PCR-based detection of "ultra short" nucleic acid sequences
CA3069082C (en) 2008-09-20 2022-03-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
US20100285537A1 (en) 2009-04-02 2010-11-11 Fluidigm Corporation Selective tagging of short nucleic acid fragments and selective protection of target sequences from degradation
AU2010311535B2 (en) 2009-10-26 2015-05-21 Lifecodexx Ag Means and methods for non-invasive diagnosis of chromosomal aneuploidy
EP3783110B1 (en) * 2009-11-05 2022-11-23 The Chinese University Of Hong Kong Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
CN102597272A (zh) 2009-11-12 2012-07-18 艾索特里克斯遗传实验室有限责任公司 基因座的拷贝数分析
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US20120237928A1 (en) 2010-10-26 2012-09-20 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
EP2370599B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Method for determining copy number variations
WO2011091063A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
EP2513341B1 (en) * 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US20120010085A1 (en) 2010-01-19 2012-01-12 Rava Richard P Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
WO2012012037A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 New England Biolabs, Inc. Oligonucleotide adaptors: compositions and methods of use
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
CN105243295B (zh) 2010-11-30 2018-08-17 香港中文大学 与癌症相关的遗传或分子畸变的检测
CN103620055A (zh) * 2010-12-07 2014-03-05 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 在全基因组规模非侵入性确定亲本单倍型的胎儿遗传
WO2012088348A2 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Sequenom, Inc. Fetal genetic variation detection
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
RU2671980C2 (ru) * 2011-02-09 2018-11-08 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления плоидности
RS57837B1 (sr) 2011-04-12 2018-12-31 Verinata Health Inc Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
AU2011373694A1 (en) 2011-07-26 2013-05-02 Verinata Health, Inc. Method for determining the presence or absence of different aneuploidies in a sample

Also Published As

Publication number Publication date
CY1117574T1 (el) 2017-04-26
WO2012142334A2 (en) 2012-10-18
SI3078752T1 (sl) 2018-12-31
SMT202000403T1 (it) 2020-09-10
PT3456844T (pt) 2020-08-25
EP3567124B1 (en) 2021-12-15
JP2018061514A (ja) 2018-04-19
CA2832468A1 (en) 2012-10-18
JP6760917B2 (ja) 2020-09-23
US20200251180A1 (en) 2020-08-06
AU2012242698B2 (en) 2014-09-04
HRP20181770T1 (hr) 2018-12-28
PT3567124T (pt) 2022-02-01
PL3456844T3 (pl) 2020-11-16
HRP20220296T1 (hr) 2022-05-13
HRP20201249T1 (hr) 2020-11-13
PL3078752T3 (pl) 2019-02-28
DK3456844T3 (da) 2020-06-29
HK1195103A1 (zh) 2014-10-31
SI3456844T1 (sl) 2020-10-30
PL2697392T3 (pl) 2016-08-31
US9447453B2 (en) 2016-09-20
SI3567124T1 (sl) 2022-05-31
JP6268153B2 (ja) 2018-01-24
JP2014512817A (ja) 2014-05-29
EP2697392B1 (en) 2016-03-02
EP3567124A1 (en) 2019-11-13
ES2692333T3 (es) 2018-12-03
AU2012242698A1 (en) 2013-05-09
CA2832468C (en) 2023-10-31
EP3078752B1 (en) 2018-08-01
LT3456844T (lt) 2020-08-25
SMT201800558T1 (it) 2018-11-09
CN106319047B (zh) 2020-02-18
US20120264121A1 (en) 2012-10-18
US10658070B2 (en) 2020-05-19
CN106319047A (zh) 2017-01-11
SMT202200090T1 (it) 2022-03-21
ES2907069T3 (es) 2022-04-21
DK2697392T3 (en) 2016-03-29
DK3078752T3 (en) 2018-11-12
TR201816062T4 (tr) 2018-11-21
HUE041411T2 (hu) 2019-05-28
JP2016101168A (ja) 2016-06-02
RS60710B1 (sr) 2020-09-30
ES2806728T3 (es) 2021-02-18
CN103797129A (zh) 2014-05-14
EP3456844B1 (en) 2020-06-10
EP3456844A1 (en) 2019-03-20
IL228843A0 (en) 2013-12-31
IL228843A (en) 2016-07-31
CY1125362T1 (el) 2024-02-16
US20170039318A1 (en) 2017-02-09
DK3567124T3 (da) 2022-03-07
JP5863946B2 (ja) 2016-02-17
EP3078752A1 (en) 2016-10-12
CY1123287T1 (el) 2021-12-31
ES2572912T3 (es) 2016-06-03
LT3567124T (lt) 2022-04-11
PT3078752T (pt) 2018-11-22
AU2012242698C1 (en) 2015-06-04
LT3078752T (lt) 2018-11-26
RS63008B1 (sr) 2022-03-31
HUE050032T2 (hu) 2020-11-30
EP4039820A1 (en) 2022-08-10
CY1120851T1 (el) 2019-12-11
PL3567124T3 (pl) 2022-04-19
EP2697392A2 (en) 2014-02-19
HUE057424T2 (hu) 2022-05-28
US20260038632A1 (en) 2026-02-05
CN103797129B (zh) 2016-08-17
WO2012142334A3 (en) 2013-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20260038632A1 (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
KR102184868B1 (ko) 카피수 변이를 판정하기 위한 dna 단편 크기의 사용
CN110800063A (zh) 使用无细胞dna片段大小检测肿瘤相关变体
HK40072002A (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40016329A (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40016329B (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40006382A (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40006382B (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK1233311B (zh) 使用多态计数来解析基因组分数
HK1195103B (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK1233311A1 (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts