PL198772B1 - Biologicznie czysta kultura Bacillus subtilis, jej metabolit i supernatant z hodowli szczepu, kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, sposób ochrony lub leczenia roślin i owoców, agrastatyny, sposób izolowania supernatantu o aktywności owadobójczej

Info

Abstract

Description

Claims

PL198772B1

Publication number: PL198772B1
Application number: PL336716A
Authority: PL
Inventors: Sherry Darlene Heins; Denise Carol Manker; Desmond Rito Jimenez; Randy Jay Mccoy; Jimmy Ensio Orjala; Pamela G. Marrone
Original assignee: Agraquest
Priority date: 1997-05-09
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 2008-07-31
Also published as: NZ500506A; PT981540E; ES2268774T3; HUP0004555A3; SK149099A3; DE69835206D1; IL173027A0; DK0981540T3; CA2289916A1; US6291426B1; CA2702750A1; CN1255143A; CZ9903757A3; TR199902765T2; DE69835206T2; JP2003199558A; EP0981540B1; CZ302152B6; JP2001507237A; IL132533A0

1. Biologicznie czysta kultura Bacillus subti- lis, szczep AQ713 NRRL Nr B21661 i jego mu- tanty, które maj a wszystkie cechy identyfikacyj- ne tego szczepu. PL PL PL PL PL

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest biologicznie czysta kultura Bacillus subtilis, jej metabolit i supernatant z hodowli szczepu, kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, sposób ochrony lub leczenia roślin i owoców, agrastatyny, sposób izolowania supernatantu o aktywności owadobójczej.

Wynalazek niniejszy jest z dziedziny biopestycydów, a bardziej szczegółowo, dotyczy nowego szczepu Bacillus subtilis, AQ713, który może hamować choroby grzybowe i bakteryjne roślin i owoców w szerokim zakresie i jest także aktywny wobec zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej Diabrotica.

Wynalazek dotyczy także grzybobójczych, bakteriobójczych i owadobójczych kompozycji zawierających nowy szczep Bacillus i antybiotyki i metabolity wytwarzane przez ten szczep same lub w kombinacji z innymi chemicznymi i biologicznymi pestycydami.

Od wielu lat wiadomo, że różne mikroorganizmy wykazują aktywność biologiczną, w związku z czym są użyteczne do zwalczania chorób roś lin. Mimo postępu w dziedzinie identyfikacji i rozwijania biologicznych pestycydów do zwalczania różnych chorób roślin istotnych w rolnictwie i ogrodnictwie, większość stosowanych pestycydów nadal stanowią związki syntetyczne. Wiele z tych chemicznych środków grzybobójczych EPA uznało za rakotwórcze; ponadto są one toksyczne dla organizmów żywych występujących w naturze i innych niedocelowych gatunków. Poza tym, patogeny mogą uodpornić się na pestycydy chemiczne (patrz np. Schwinn i in., str. 246, ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY: PHYTOPHTHORA INFESTANS, THE CAUSE OF LATE BLIGHT OF POTATO (Academic Press, San Diego 1991)).

Co roku 250-300 milionów dolarów wydaje się na chemiczne pestycydy do zwalczania zakażeń kukurydzianą stonką korzeniową. Wiele z tych pestycydów jest toksycznych dla człowieka, organizmów żywych w naturze i innych niedocelowych gatunków. Znaleziono je także w wodzie gruntowej. Badanie nowych chemicznych środków owadobójczych kosztuje 100 milionów dolarów.

Biologiczny sposób zwalczania stanowi atrakcyjną alternatywę dla syntetycznych chemicznych środków grzybobójczych. Biopestycydy (organizmy żywe i naturalnie wytworzone przez nie związki) mogą być bezpieczniejsze, łatwiej ulegające degradacji biologicznej i mniej kosztowne w badaniach.

Programy skriningowe doprowadziły do zidentyfikowania pewnych szczepów Bacillus spp. (Bacillus spp. obejmuje B. subtilis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis), które wykazują aktywność przeciwgrzybiczą. (Patrz np. Stabb i in. (1990) Applied Environ. Microbiol. 60: 4404-4412). Wykazano, że szczepy te wytwarzają cwitermycynę-A i/lub kanozaminę (Milner i in. (1996) Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3066), dwa antybiotyki, które są skuteczne przeciwko chorobom rozwijającym się w glebie, w warunkach nadmiaru wilgoci, spowodowanym przez Phytophthora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum lub Sclerotinia minor (patrz Stabb i in., supra) Cwitermycyna-A jest rozpuszczalną w wodzie, stabilną wobec kwasu czą steczką liniowego aminopoliolu (patrz He i in. (1994) Tetra. Lett. 35 (16) 2499-2502.

W patencie USA nr 5049379, Handelsman i in. opisano jak cwitermycyna-A hamuje chorobę lucerny i soi. Gdy nasiona pokryto B. cereus ATCC 53522 patogenna aktywność grzyba niszczącego korzenie została zahamowana. Podobnie, nanoszenie środków opartych na sporach pewnych szczepów B. cereus na nasiona soi lub na glebę otaczającą nasiona, poprawia wydajność soi na polu. (Patrz. Osburne i in. (1995) Am. Phytopathol. Soc. 79(6): 551-556). Sposoby nanoszenia biopestycydów są dobrze znane w technice i obejmują np. stosowanie ich w takich formach użytkowych jak proszki zawiesinowe, sypkie, suche, mikrokapsułkowane skuteczne środki, ciekłe lub stałe środki frakcji antybiotykowych z odpowiednich hodowli (Patrz np. patent USA nr 5061495, Rosall lub patent USA nr 5049379, Handelsman),

Smith i in. (1993) w Plant Disease 77(2) 139-142 donoszą, że aktywność grzyba rozwijającego się w glebie, Pythium aphanidermatum, który powoduje wyciekanie miąższu ogórków, można zahamować stosując szczep B. cereus UW85 produkujący cwitermycynę. Leifert i in. (1995) J. Appl. Bacteriol. 87:97-108 donoszą, że dwa szczepy Bacillus, B. subtilis CL27 i B. pumilis CL45 produkują antybiotyki przeciw Botrytis i przeciw Alternaria. Kompletna brzeczka i przesącze wolne od komórek były aktywne przeciwko Botrytis i Alternaria w testach in vitro i były aktywne przeciwko Botrytis in vivo w testach do małych roś lin prowadzonych na Astilbe. Leifert i in. (1997) w patencie USA nr 5 597 565 opisują B. subtilis, B. pumilis i B. polymyxa, które są szczególnie skuteczne w hamowaniu grzybów powodujących choroby po zbiorach. Ujawniają też obecność antybiotyków produkowanych w przesączu z hodowli wolnym od komórek i ich aktywność przy różnych wartościach pH, ale nie identyfikują tych związków.

PL 198 772 B1

Rossall (1994) w patencie USA nr 5 344 647 ujawnia szczep Bacillus subtilis o szerokiej aktywności przeciwgrzybiczej. Sholberg i in. (1995) Can. J. Microbiol. 41: 247-252, Swinburne i in. (1975) Trans. Brit. Mycol. Soc. 65: 211-217, Singh i Deverall (1984) Trans. Br. Mycol. Soc. 83: 487-490 i Ferreira i in. (1991) Phytopathology 81: 283-287 ujawniają stosowanie Bacillus spp. i Bacillus subtilis jako biologicznych czynników zwalczających grzybowe patogeny roślin. Baker i in. (1983) w Phytopathology, 73: 1148-1152 donoszą także o przeciwgrzybiczym Bacillus subtilis stosowanym na patogeny roślin. Pusey i in. (1988) Plant Dis. 72: 622-626, Pusey i Robins (patent USA nr 5,047,239), i McKeen I in. (1986) Phytopathology 76: 136-139 ujawniają zwalczanie chorób owoców po zbiorach z uż yciem B. subtilis. McKeen i in., jak wyżej, wykazali, że w tej grzybobójczej aktywności B. subtilis mają udział antybiotyki podobne do cyklicznych polipeptydów o niskim ciężarze cząsteczkowym, ituryn.

Liu i in. (1995) w patencie USA nr 5403583 ujawniają Bacillus megaterium, ATCC 55000 i sposób zwalczania grzybowych patogenów roślin, Rhizoctonia solani. Islam i Nandi (1985) w Journal of Plant Diseases and Protection 92(3): 241-246 ujawniają Bacillus megaterium z antagonizmem wobec Drechslera oryzae, czynnika przyczynowego rdzy brunatnej ryżu. Ci sami autorzy w Journal of Plant Diseases and Protection 92 (3):233-240 ujawniają także antagonizm B. megaterium in vitro wobec Drechslera oryzae, Alternaria alternata i Fusarium roseum. Omawiają oni trzy składniki obecne w przesączu z hodowli. Najaktywniejszy antybiotyk był silnie rozpuszczalny w wodzie i metanolu i wykazywał w UV pik przy 255 nm i ramię przy 260 nm, co potwierdza, ż e jest lipopeptydem podobnym do polioksyny. Cook (1987) Proceedings Beltwide Cotton Production-Mechanization Research Conference, Cotton Council, Memphis, str. 43-45) ujawnia stosowanie zawiesiny Bacillus megaterium do zmniejszenia liczby roślin bawełny zniszczonych przez Phymatotrichum omnivorum, który powoduje hubę korzeniową bawełny.

Produkcję antybiotyku przez B. megaterium stwierdził również Berdy (CRC Handbook of Antibiotic Compounds, t.I-XIV (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL 1980-87)), który donosi o produkcji antybiotyków peptydowych o niskiej toksyczności dla ssaków, takich jak ansamitocyna-PDM-O, bacymetryna, megacyna, pentapeptyd, homopeptydy.

Wiadomo, że Bacilli wytwarzają wtórne metabolity przeciwgrzybicze i przeciwbakteryjne (Korzybski i in. (1978)). Naukowcy z University of Wisconsin and Cornell zidentyfikowali nowy grzybobójczy związek, cwitermycynę A, wytwarzaną przez Bacillus spp. (He i in. (1994) Tetra. Lett. 35(16): 2499-2502). Drugi metabolit grzybobójczy wytwarzany przez ten sam szczep zidentyfikowano ostatnio jako znany aminocukier, kanozaminę (Milner i in. (1996) Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3065).

Inną grupę opisanych wcześniej metabolitów Bacillus stanowią cykliczne lipopeptydy z klasy ituryn, z których niektóre są potencjalnymi czynnikami grzybobójczymi. Te czynniki obejmują cykliczny oktapeptyd z siedmioma α-aminokwasami i jednym β-aminokwasem z alifatycznym łańcuchem bocznym. Istnieje kilka grup ituryn, które różnią się kolejnością i zawartością sekwencji aminokwasowej.

Przedstawiono je w Tabeli 1 poniżej. Zwykle powstaje wiele pokrewnych cząsteczek o różnych długościach i różnych rozgałęzieniach alifatycznych reszt aminokwasowych. W badaniu na aktywność przeciwko Saccharomyces cerevisiae stwierdzono, że najbardziej aktywnym czynnikiem jest mykosubtylina (LC50 = 10 μg/ml), następnie ituryna-A i bacillomycyna L (obie mają LC50=30 μg/ml) (Beeson i in. (1979). J. Antibiotics 32 (8): 828-833). Sposób działania tych cyklicznych lipopetydów, jak donoszono, polega na interakcji z błonami grzybowymi i tworzeniem kanałów przezbłonowych, które pozwalają na uwolnienie jonów potrzebnych do życia (Latoud i in. (1986) Biochem. Biophys. Acta 856:526-535). Ituryna-C jest nieaktywna wobec grzybów, w tym Penicillium chrysogenum (Peypoux i in. (1978) Tetrahydron 34: 1147-1152).

T a b e l a 1

Struktury antybiotyków z rodziny ituryn

Antybiotyk	L-Asz(X1)	X4	X5	X6	X7
Ituryna A	L-Asn	L-Gln	L-Pro	D-Asn	L-Ser
Ituryna C	L-Asp	L-Gln	L-Pro	D-Asn	L-Ser
Bacillomycyna D	L-Asn	L-Pro	L-Glu	D-Ser	L-Thr
Bacillomycyna L	L-Asp	L-Ser	L-Gln	D-Ser	L-Thr
Bacillomycyna F	L-Asn	L-Gln	L-Pro	D-Asn	L-Thr
Mykosubstylina	L-Asn	L-Gln	L-Pro	D-Ser	L-Asn

PL 198 772 B1

R(CH₂) 8~i2CHCH₂CO—>X_x—>D-Tyr->D-Asn I 4NH <— X₇ <— Χθ <— χ₅ <— χ₄R = CH₃, CH(CH₃)₂, ch₃ch₂ch

I ch₃

Grupa naukowców przy USDA zbadała zależność struktura/aktywność ituryn przez zsyntetyzowanie kilku analogów różniących się długością łańcucha aminokwasowego. Donoszono, że aktywność ituryn wzrasta wraz z długością łańcucha kwasu tłuszczowego i końcowego rozgałęzienia w kolejności izo>normalny>anteizo (Bland i in. (1995) Proc. Plant Growth Regulation Soc. Am. 22-gi: 105-107). Naukowcy ci na podstawie prac z kilkoma szczepami Bacillus wytwarzającymi ituryny stwierdzili także, że „ilość ituryn otrzymanych w sposób naturalny jest nieadekwatna do handlowo dostępnych.

Inną grupą cyklicznych lipopetydów wyizolowanych z B. cereus są plipastatyny. Są to związki z rodziny acylowanych dekapeptydów, których struktura jest przedstawiona na Figurze 1 (Nishikiori i in. (1986) J. Antibiotics 39 (6) : 755-761). Związki te po raz pierwszy wyizolowano jako inhibitory fosfo-lipazy A2 ze świńskiej trzustki (Umezawa i in. (1986) J. Antibiotics 39(6) : 737-744), ale później stwierdzono, że hamują też pewne patogenne wobec roślin grzyby, w tym Botrytis, Pyricularia i Alternaria (Yamada i in. (1990) Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1):95-96). Także Yamada donosił o synergistycznym efekcie obserwowanym między ituryną A i plipastatynami, wszystkimi produkowanymi przez ten sam szczep B. subtilis.

Prowadzono prace nad ulepszeniami w fermentacji w celu zwiększenia produkcji ituryn zarówno z fermentacji ciekłej (Phae i Shoda (1991) J. Ferment. Bioeng. 71:118-121); Ohno i in. (1993) J. Ferment. Bioeng. 75:463-465), jak i w stanie stałym, Ohno i in. (1992) Biotech Lett. 14(9): 817-822; Ohno i in. (1995) J. Ferment. Bioeng. 5:517-519). Donoszono o synergizmie między blisko spokrewnionymi surfaktynami, które same są nieaktywne, i iturynami wytwarzanymi przez ten sam szczep B. subtilis (Hiraoka i in. (1992) J. Gen. Appl. Microbiol. 38:635-640). Opublikowano sekwencję nukleotydową genu, który reguluje biosyntezę ituryny A i surfaktyny równocześnie (Huang i in. (1993) J. Ferment. Bioeng. 76(6) : 445-450). Prace nad szczepami wytwarzającymi iturynę skoncentrowały się na traktowaniu gleby w celu zniszczenia Rhizoctonia (Asaka i Shoda (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:40814085) i donoszono o nanoszeniu ituryn na liście roślin na polu.

Innym cyklicznym lipopeptydem wytwarzanym przez B. subtilis jest surfaktyna, która ma wyjątkową aktywność powierzchniowo czynną (Kaninuma i in. (1969) Agric. Biol. Chem. 33:973-976). Surfaktyna zawiera kwas β-hydroksytłuszczowy C14 lub C15 związany przez pierścień laktonowy z resztą heptapeptydową zawierającą sekwencję LLDLLDL (Arima i in. (1968) Biochem. Biophys. Res. Commun. 31:488-494. Sandrin i in. ((1990) Biotechnol. Appl. Biochem. 12:370-375) znaleźli szczepy B. subtilis, które produkują surfaktynę i iturynę A, bacillomycyny F i L i mykosubtylinę.

Odkryty przez twórców nowy mikroorganizm AQ713, który uprzednio uważano za szczep Bacillus megaterium, a zidentyfikowany teraz jako szczep Bacillus subtilis, produkuje ituryny A, plipastatyny i surfaktyny. O produkcji takiej kombinacji lipopeptydów przez mikroorganizm wcześniej nie donoszono. Ponadto, twórcy stwierdzili, że AQ713 wytwarza także nowo opisaną grupę związków określonych jako „agrastatyny. Kombinacja wszystkich trzech powyższych znanych związków z nowymi agrastatynami jest także nowa.

Jednym z powszechnie stosowanych biopestycydów jest gram+ bakteria Bacillus thuringiensis. Wiadomo, że szkodnikobójcze szczepy B. thuringiensis wytwarzają podczas sporulacji krystaliczne białka, które są swoiście toksyczne wobec pewnych rzędów i gatunków owadów i nicieni (patrz np. patenty USA nr 4 999 192 i 5 208 017). Białkowe endotoksyny wytwarzane przez B. thuringiensis działają także jako środki owadobójcze przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej i innym chrząszczom (np. patent USA nr 5 187 091) T. J. Johnson i in. (1993), J. Economic Entomology 86:330-333). Endotoksyny B. thuringiensis są skuteczne w postaci czystych kryształów, przemytego osadu komórek i białek wytwarzanych przez ekspresję. Warren i in. (WO 96/10083) ujawniają białka, które nie są endotoksynami, które wytwarzane są przez Bacillus cereus i B. thuringiensis w stadium wegetatywnym. Te wegetatywne białka, oznaczone jako Vip1 i Vip2 mają silną aktywność przeciwko kukurydzianej

PL 198 772 B1 stonce korzeniowej (północnej i zachodniej) (Estruck i in. (1997), Nature Biotechnology 15:137-141 i Mullins i in. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63 (w druku).

Wykazano, że jeden z termostabilnych metabolitów B. thuringiensis, termostabilna betaegzotoksyna, ma własności szkodnikobójcze. Burgjeron i Biacke (1979), Entomophaga 11:279-284 donoszą o beta-egzotoksynie, która jest aktywna wobec chrząszcza ziemniaków Colorado (Leptinotarsa decemlineata) . Ponadto, znane beta-egzotoksyny B. thuringiensis wykazują nieswoistą aktywność szkodnikobójczą, zabijającą nie tylko nicienie, ale także muchy i szkodniki Cirphis (Leucania unipuncta) (ang. armyworm), roztocza i szkodniki Diabrotica. Sigma-egzotoksyna ma strukturę podobną do beta-egzotoksyny i jest aktywna wobec chrząszczy ziemniaków Colorado (Argauer i in. (1991) J. Entomol. Sci. 26:206-213). Alfa-egzotoksyna jest toksyczna przeciwko larwom Musca domestica (Cluthy (1980) FENS Microbiol. Lett. 8:1-7). Gamma-egzotoksyny stanowią różne enzymy proteolityczne, chitynazy i proteazy. Toksyczne działanie gamma-egzotoksyn objawia się tylko w kombinacji z beta-egzotoksyną lub delta-egzotoksyną . Fosberg i in. (1976) „Bacillus thuringiensis: Its effect in Environmental Quality, National Research Council of Canada. Stonard i in. (1994) ACS Symposium Series 551:25 donoszą o rozpuszczalnym w wodzie wtórnym metabolicie, aktywnym wobec kukurydzianej stonki korzeniowej, obecnym w supernatancie szczepu Bacillus cereus.

Nie istnieją żadne udokumentowane szczepy Bacillus, które mają aktywność grzybobójczą i przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej. Nie są znane metabolity wytwarzane przez Bacillus subtilis, które mają ciężar cząsteczkowy poniżej 10000 i mogą być ekstrahowane niepolarnym rozpuszczalnikiem.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego szczepu Bacillus subtilis, AQ713, w postaci biologicznie czystej kultury, wcześniej uważanego za Bacillus megaterium, i jego mutantów, które mają wszystkie cechy identyfikacyjne tego szczepu, o szerokiej aktywności przeciwgrzybiczej i przeciwbakteryjnej i nowej kombinacji aktywnoś ci przeciwgrzybiczej i aktywnoś ci przeciw kukurydzianej stonce korzeniowej. Ten nowy szczep jest oznaczony AQ713 i został zdeponowany w NRRL 7 marca 1997 r. w ramach Traktatu Budapeszteńskiego o Uznaniu Depozytu Mikroorganizmów dla Celów Procedury Patentowej pod nr dostępu B21661.

Wynalazek obejmuje też nowy metabolit wytworzony przez szczep Bacillus subtilis lub jego mutanty według wynalazku, który wykazuje aktywność przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej, jest ekstrahowalny rozpuszczalnikiem, i ma ciężar cząsteczkowy poniżej 10000 daltonów oraz supernatant otrzymany z hodowli szczepu AQ713 Bacillus subtilis lub jego mutantów według wynalazku, który wykazuje aktywność przeciwgrzybiczą i przeciwbakteryjną i aktywność przeciw kukurydzianej stonce korzeniowej. Supernatant można otrzymać sposobem dobrze znanym w technice, obejmującym wirowanie, sączenie, sedymentację, itp.

Wynalazek obejmuje też kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, które zawierają całą brzeczkę z hodowli określonych powyżej bakterii według wynalazku i chemiczny fungicyd albo całą brzeczkę i biologiczny lub chemiczny środek szkodnikobójczy i korzystnie jeszcze dodatkowo chemiczny fungicyd.

Wynalazek obejmuje też kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, które zawierają metabolit według wynalazku i chemiczny fungicyd albo metabolit i biologiczny lub chemiczny środek szkodnikobójczy i korzystnie jeszcze dodatkowo chemiczny fungicyd.

Wynalazek obejmuje też kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, które zawierają supernatant według wynalazku i chemiczny fungicyd albo supernatant i biologiczny lub chemiczny środek szkodnikobójczy i jeszcze dodatkowo chemiczny fungicyd.

Wynalazek obejmuje też sposoby ochrony lub leczenia roślin i owoców zakażonych grzybowymi i bakteryjnymi chorobami oraz poraż onych kukurydzianą stonką korzeniową , który polega na tym, ż e nanosi się na nie skuteczną ilość szczepu Bacillus subtilis lub metabolitu lub supernatantu według wynalazku lub kompozycji według wynalazku. Sposoby według wynalazku są korzystne do stosowania, gdy zakażenie jest spowodowane przez co najmniej jeden mikroorganizm wybrany z grupy obejmującej Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Alternaria brassicicola, Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola, Venturia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator i Peronospora parasitica.

W sposobach wedł ug wynalazku szczep Bacillus subtilis stosuje się jako całą brzeczkę z hodowli albo jako supernatant, korzystnie w postaci proszków zawiesinowych, granulek, substancji sypkiej lub mikrokapsułek i korzystnie traktuje się korzenie roślin lub ziemię dookoła korzeni.

PL 198 772 B1

W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja, która zawiera iturynę typu A, plipastatynę i surfaktynę otrzymane z bakterii według wynalazku, a korzystnie zawiera jeszcze agrastatynę otrzymaną z bakterii wedł ug wynalazku. Wynalazek obejmuje też sposób ochrony lub leczenia roś lin i owoców zakażonych szkodnikami owadami, który polega na tym, że nanosi się skuteczną ilość kompozycji zawierającej iturynę typu A, plipastatynę i surfaktynę według wynalazku i korzystnie nanosi się jeszcze skuteczną ilość agrastatyny otrzymanej z bakterii według wynalazku.

Wynalazek obejmuje również sposób izolowania supernatantu o aktywności owadobójczej, który polega na tym, że prowadzi się hodowlę kultury bakterii według wynalazku i izoluje się supernatant z hodowli.

Wynalazek obejmuje jeszcze nowe związki, agrastatyny, wytworzone przez nowy mikroorganizm. W zakres wynalazku wchodzi agrastatyna o wzorze (SEK Nr ID: 1):

Ri-CH-CH₂-CO-Glx-Orn-Tyr-Thr-Glx-Ala-Pro-Glx-Tyr-Val

I I or₂ ow którym R₁ oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alifatyczny C₈-C₂₀, R₂ oznacza octan lub pochodną estrową, a Glx oznaczą Gln lub Glu oraz agrastatyna A o wzorze (SEK Nr ID: 2) :

CH₃ (CH₂) 12-CH-CH₂-C0-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Val

OH O Definicje

Stosowany tu termin „zwalczanie biologiczne oznacza zwalczanie patogenów lub owadów przy użyciu drugiego organizmu. Znane mechanizmy kontroli biologicznej obejmują bakterie jelitowe, które zwalczają zgniliznę korzeniową przez wypchnięcie grzybów do obszaru na powierzchnie korzenia. Do zwalczania patogenów stosuje się bakteryjne toksyny, takie jak antybiotyki. Toksyny można wyizolować i stosować bezpośrednio na rośliny lub środki bakteryjne można podać tak, aby wytwarzały toksynę in situ.

Termin „grzyb lub „grzyby obejmuje szeroki zakres zarodkujących organizmów zawierających spory, które nie zawierają chlorofilu. Przykłady grzybów obejmują drożdże, pleśnie, mączniaki, rdze i grzyby wyższe.

Termin „bakterie obejmuje organizmy prokariotyczne, które nie mają wyodrębnionego jądra.

„Grzybobójczy oznacza zdolność substancji do zwiększenia śmiertelności lub zahamowania szybkości wzrostu grzybów.

„Antybiotyk obejmuje substancję, która jest zdolna do zabicia lub zahamowania mikroorganizmu. Antybiotyki mogą być wytwarzane przez mikroorganizm lub w procesie syntetycznym lub półsyntetycznym. Termin ten, zatem, obejmuje substancję, która hamuje lub zabija grzyby, np. cwitermycynę-A lub kanozaminę.

„Przeciwgrzybiczy obejmuje substancję, która jest zdolna do zabicia lub zahamowania wzrostu grzyba.

Termin „hodowanie dotyczy namnażania organizmów na lub w podłożu różnego rodzaju. „Pełna brzeczka z hodowli odnosi się do ciekłej hodowli zawierającej komórki i podłoże. „Supernatant oznacza ciekłą brzeczkę, z której wyhodowane komórki zostały usunięte przez odwirowanie, filtrację, sedymentację lub innymi sposobami dobrze znanymi w technice.

„Skuteczna ilość oznacza ilość wystarczającą, aby uzyskać korzystny lub żądany wynik. Skuteczną ilość można podać jednorazowo lub w kilku podaniach. W przypadku leczenia lub ochrony „skuteczna ilość jest ilością wystarczającą, aby złagodzić, stabilizować, odwrócić, spowolnić lub opóźnić postęp stanu choroby grzybowej lub bakteryjnej.

Stosowany tu termin „owady obejmuje wszystkie organizmy w klasie „Owadów. Termin „pre-dorosłe owady odnosi się do każdej formy organizmu przed osiągnięciem stanu dojrzałości, w tym np. jaja, larwy i nimfy. Termin „owadobójcze odnosi się do zdolności substancji do zwiększenia śmiertelności lub zahamowania szybkości wzrostu owadów. Termin „nicieniobójcze odnosi się do zdolności substancji do zwiększenia śmiertelności lub zahamowania szybkości wzrostu nicieni. Termin „szkodnikobójcze odnosi się do zdolności substancji do zwiększenia śmiertelności lub zahamowania szybkości wzrostu owadów, nicieni i roztoczy.

„Kontrola dodatnia oznacza związek, o którym wiadomo, że ma aktywność szkodnikobójczą. „Kontrola dodatnia obejmuje, ale nie wyłącznie, handlowo dostępne chemiczne środki szkodPL 198 772 B1 nikobójcze. „Kontrola ujemna oznacza związek, o którym wiadomo, że nie ma aktywności szkodnikobójczej. Przykładem kontroli ujemnej jest woda i octan etylu.

Termin „rozpuszczalnik obejmuje każdą ciecz, która utrzymuje inną substancję w roztworze. „Możliwy do ekstrakcji rozpuszczalnikiem, „ekstrahowalny oznacza związek, który rozpuszcza się w rozpuszczalniku i który następnie może być z niego wydzielony. Przykłady rozpuszczalników obejmują, ale nie wyłącznie, rozpuszczalniki organiczne, jak octan etylu.

Termin „metabolit odnosi się do każdego związku, substancji lub produktu ubocznego fermentacji mikroorganizmu, które mają aktywność szkodnikobójczą. Antybiotyk jak określono powyżej jest metabolitem o swoistej aktywności przeciwko mikroorganizmom.

Termin „agrastatyny odnosi się do grupy nowych związków o następującej strukturze:

Ri-CH-CH₂-CO-Glx-Orn-Tyr-Thr-Glx--X--Pro-Glx-Tyr-Val or₂ o-1 w której R₁ oznacza rozgałęziony lub prosty alifatyczny łańcuch boczny, C₈-C₂₀; X oznacza Ala lub

Val; R2 oznacza octan lub pochodną estrową; a Glx oznacza Gln lub Glu. Te związki wykazują aktywność przeciwbakteryjną, przeciwgrzybiczą oraz aktywność przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej.

Opisujemy nowy metabolit i szczep produkujący antybiotyk Bacillus subtilis wcześniej zidentyfikowany jako Bacillus megaterium, który ma szeroką aktywność przeciwgrzybiczą i przeciwbakteryjną i także zabija lub ogłusza larwy kukurydzianej stonki korzeniowej.

Kompozycje według wynalazku, które zawierają korzystnie całą brzeczkę, supernatant i/lub metabolit/antybiotyk stosuje się razem ze składnikami, które wspomagają dyspersję i przyleganie, w celu uzyskania dobrej dyspersji i przylegania. Odpowiednie środki są znane specjalistom.

Kompozycje według wynalazku można sporządzać w postaci proszków zawiesinowych, granulek itp. lub można je mikrokapsułkować w odpowiednim środowisku. Przykłady innych form użytkowych obejmują, ale nie wyłącznie, proszki rozpuszczalne, granulki zawiesinowe, proszki sypkie, suche, granulki do dyspergowania, koncentraty do emulsji i wodne zawiesiny. Inne odpowiednie formy są znane specjalistom.

Nowa grupa związków według wynalazku określanych jako „agrostatyny wykazuje oprócz aktywności przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej również aktywność przeciwbakteryjną i przeciwgrzybiczą.

Krótki opis rysunków

Na Fig. 1 przedstawiono strukturę antybiotyków plipastatyny.

Na Fig. 2 przedstawiono chromatogram HPLC metabolitów AQ713.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek, ale go nie ograniczają.

P r z y k ł a d 1

Charakterystyka szczepu AQ713

Izolat zidentyfikowano wykorzystując mikropłytkę Biolog (Biolog, Inc., Hayward, CA) jak to opisane zostało w publikacji Bichner (1989) Nature 339:157-158. Mikropłytka obejmuje studzienki wysuszone i wypełnione 95 różnymi węglowymi substratami odpowiednimi dla bakterii gram dodatnich i gram ujemnych. Izolat hodowano w ciekłym środowisku w 28°C i po 24 godzinach przemytą zawiesinę komórkową (0,85% solanka) wprowadzono do każdej studzienki płytki GP Microplate (Biolog. Inc.). Po 24 godzinach w 28°C oceniono zużycie węgla. Następnie profil wykorzystania substratu porównano z bazą danych Biolog Gram-Positive (wersja 3,50) i wyizolowano gatunki najbardziej podobne. Wyniki z tej próby dały indeks podobieństwa do Bacillus megaterium 0,883.

Dokładniejszą charakterystykę AQ713 przeprowadzono w American Type Culture Collection, Rockville, Md.

Izolat dostarczono jako: Nieznany szczep AQ713

Izolat zidentyfikowano wykorzystując dostępne dane fizjologiczne i biochemiczne stwierdzono, że szczep ten jest najbliższy Bacillus subtilis.

Morfologia komórkowa: Znaleziono pojedyncze ruchome komórki z jedną endosporą utworzoną w obszarze środkowym lub subkońcowym. Komórki barwią się jednorodnie jako Gram dodatnie.

Morfologia kolonii: Kolonie są przezroczyste i nieregularne z wypukłym wzniesieniem, z szorstką słabą powierzchnią i wyżłobionym brzegiem.

PL 198 772 B1

Charakterystyka szczepu AQ713:

Pręciki	+
Pręciki proste	+
Pręciki zakrzywione	-
Komórki pojedyncze	+
Łańcuchy komórek	-
Końce stożkowate	-
Końce zaokrąglone	+
Końce kwadratowe	-
Wytworzona endospora	+
Spęcznione sporangium	-
Jedna spora/komórka	+
Spora okrągła	-
Spora cylindryczna	+
Spora owalna	+
Spora centralna	+
Spora końcowa	-
Spora subkońcowa	+
Barwienie Grama	+
Gram dodatnie	+
Gram ujemne	-
Gram zmienne	-
Obecna wakuola	-
Kolonia przezroczysta	-
Kolonia przezroczysta	-
Komórki ruchome	+
Wzrost w 15°C	+
Wzrost w 20°C	+
Wzrost w 26°C	+
Wzrost w 30°C	+
Wzrost w 37°C	+
Wzrost w 45°C	+
Wzrost w 50°C	słaby
Wzrost w 55°C	-
Wzrost w 60°C	-
Wzrost w 65°C	-
Katalaza	+
Oksydaza	+
Hydroliza kazeiny	+
Upłynnienie żelatyny	+

Kolonia nieprzezroczysta	+
Kolonia cała	-
Kolonia wyżłobiona	+
Kolonia z płatkami	-
Kolonia okrągła	-
Kolonia nieregularna	+
Kolonia z kłączami	-
Kolonia z niską wypukłością	+
Kolonia z wysoką wypukłością	-
Kolonia płaska	-
Kolonia podniesiona	-
Kolonia lśniąca	-
Kolonia tępa	+
Kolonia sucha	-
Kolonia gładka	-
Kolonia szorstka	+
Rozpuszczalny pigment brązowy	-
Rozpuszczalny pigment czarny	-
Rozpuszczalny pigment żółty	-
Nierozpuszczalny pigment brązowy	-
Nierozpuszczalny pigment czarny	-
Nierozpuszczalny pigment żółty	-
Nierozpuszczalny pigment pomarańczowy	-
Nierozpuszczalny pigment czerwony	-
Kwas z laktozy	-
Gaz z laktozy	-
Kwas z mannitolu	-
Gaz z mannitolu	-
Kwas z mannozy	-
Gaz z mannozy	-
Kwas z sacharozy	słaby
Opóźnienie kwasu>14 dni	słaby
Gaz z sacharozy	-
Kwas z trehalozy	-
Gaz z trehalozy	-
Kwas z ksylozy	-
Gaz z ksylozy	-
Tlenowce	-
Fakultatywne	-

PL 198 772 B1

Hydroliza hipuranianu	-
Degradacja lecytynazy	-
Hydroliza skrobi	+
Hydroliza Tween 80	+
Rozkład tyrozyny	-
Wzrost w 2% NaCl	+
Wzrost w 5% NaCl	+
Wzrost w 7% NaCl	+
Wzrost w 10% NaCl	+
Wzrost w 0,2% azydku Na	V
Wzrost przy pH 4,5	+
Wzrost przy pH 6,0	+
Kwas z arabinozy	-
Gaz z arabinozy	-
Kwas z celebiozy	słabo
Opóźnienie kwasu >14 dni	słabo
Gaz z celebiozy	-
Kwas z fruktozy	+
Opóźnienie kwasu>14 dni	-
Gaz z fruktozy	+
Kwas z glukozy	+
Opóźnienie kwasu>14 dni	-
Gaz z glukozy	-

Wyniki charakterystyki klucza

Uwagi: Na podstawie dostępnych danych fizjologicznych i biochemicznych szczep ten najbardziej jest zbliżony do Bacillus subtilis.

Testy na charakterystykę	Szczep AQ71 3	Bacillus subtilis
Spęcznione sporangium	-	-
Wzrost beztlenowy	mikroaerofilowy	mikroaerofilowy
Reakcja VP	+	+
pH VP	7,0	5,0-8,0
Maksymalna temperatura wzrostu	55°C	45-55°C
Wzrost w 7% NaCl	+	+
Kwas z glukozy	+	+
Kwas z arabinozy	-	+
Kwas z ksylozy	-	+
Kwas z mannitolu	-	+
Rozkład kazeiny	+	+
Rozkład tyrozyny	-	-
Wykorzystanie cytrynianu	+	+
Wykorzystanie propronianu	-	-

Mikroaerofile	+
Beztlenowce	-
Gaz z azotanu pod zamknięciem	-
Gaz z glukozy pod zamknięciem	-
Indol	-
Azotan do azotynu	+
Azotan do gazu	-
Redukcja błękitu metylenowego	+
Red./utl. błękitu metylenowego	-
Zakwaszone mleczko lakmusowe	-
Skoagulowane mleczko lakmusowe	-
Zalkalizowane mleczko lakmusowe	+
Zredukowane mleczko lakmusowe	+
Peptonizowane mleczko lakmusowe	+
VP (5198) dodatnie	+
VP (5331) dodatnie	+
pH VP 5198 6,0 lub mniej	-
pH VP 5198 6,5-7,5	+
pH VP 5198 8,0 lub więcej	-
Wykorzystanie cytrynianu	+
Wykorzystanie propionianu	-
Wykorzystanie propionanu	-

PL 198 772 B1

Literatura:

Gordon, R.E., W.C. Haynes i C.H.N. Pang. 1973. The Genus Bacillus. Handbook No. 427. U.S.

Departament of Agriculture, Washington, D.C.

P r z y k ł a d 2

Aktywność AQ713 przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej

Próbki Bacillus hodowano w pożywce do hodowli Bacillus. Pożywka 2 zawierała 5% peptonu,

5% dekstrozy, 9% ekstraktu drożdżowego, 3% ekstraktu słodowego, 1,5% ekstraktu z nasion bawełny proflo (59% białka, 4,26% tłuszczu, 6,73% popiołu, 3,19% włókna i śladowe ilości gossypolu; woda w ilości uzupełniającej), 10% mączki sojowej i 0,5% MgSO₄7H₂O. Pożywka 3 zawierała te same składniki i oprócz tego 20% peptonu i 3,4% KH2PO4 i 4,3% K2HPO4. Do inokulacji 250 ml kolb z hamowanym wytrząsaniem użyto jednodniowych kultur. Kolby wytrząsano przy 200 obr./min. w 29°C przez 5 dni.

W celu dokonania oceny aktywności owadobójczej 35 ml brzeczki hodowlanej odwirowano przy 5200 obr./min. przez 20 minut i supernatant stosowano w mikropróbie opisanej poniżej.

Próby prowadzono na mikropłytkach z 96 studzienkami. Każda studzienka zawierała jako substrat stały agar, badany organizm i albo dodatnią kontrolę albo ujemną kontrolę albo supernatant otrzymany z nowego szczepu Bacillus jak opisano w przykładzie 1.

Do oceny aktywności owadobójczej substrat agarowy do studzienek mikropłytki przygotowano według Marrone i in. (1985), J. Econ. Eutomal. 78:290-299. Do oceny aktywności nicieniobójczej stosowano w studzienkach płaski agar (1,5%).

Jako kontrolę dodatnią stosowano 1 ppm roztworu Avid^® (awermektyna). Jako kontrolę ujemną stosowano wodę dejonizowaną. W każdym teście stosowano dwa powtórzenia badanej próbki lub kontroli. Do każdej studzienki wprowadzono 40 μl próbki supernatantu lub całej brzeczki z hodowli w pożywce 1, 2 lub 3. Następnie płytki umieszczono pod wyciągiem w celu ich wysuszenia na około 2-3 godziny aż do wyschnięcia agaru. Badano następujące organizmy: niedorosłe osobniki kukurydzianej stonki korzeniowej Diabrotica undecimpunctata, niedorosłe prusaki (Blatella germanica), niedorosłe chrząszcze buraczane (Spodoptera exigua), niedorosłe muchy (Drosphila melanogaster) lub szczep N2 nicienia Caenorhaboditis elegans. Organizmy badane rozcieńczono w 0,1% agarze i wprowadzano do każdej studzienki w stężeniu około 5 organizmów na 25 μl agaru.

Mikropłytkę pokryto substancją nieprzepuszczającą tlenu taką jak Mylar^® i każdą studzienkę przewietrzono stosując prasę igłową. Płytki inkubowano w 27°C do 7 dni.

Po inkubacji studzienki oceniono przez określenie śmiertelności lub stopnia rozwoju larw. Studzienki, w których wszystkie larwy były nieżywe lub karłowate, otrzymały ocenę 1, studzienki, w których część larw była nieżywa, a pozostałych rozwój był poważnie zahamowany, oceniono na 2, żywe lecz karłowate larwy otrzymały ocenę 3, a studzienki, w których w ogóle nie było zabitych larw, oceniono na 4. Oceny stanowiły średnią z powtórzeń dla każdej próbki. Wyniki przedstawiono w Tabelach 2 i 3.

T a b e l a 2

Ocena działania AQ713 w postaci całej brzeczki przeciwko szkodnikom owadom

	C. elegans	Diabrotica undecimpunctata	Chrząszcz burakowy	Muszka owocowa	Kontrola dodatnia	Kontrola ujemna
Pożywka 2	NT	1,0	4,0	4,0	1,0	4,0
Pożywka 3	NT	2,0	4,0	4,0	1,0	4,0

NT - nie testowany

T a b e l a 3

Ocena działania AQ713 w postaci supernatantu przeciwko szkodnikom owadom

	C. elegans	Diabrotica undecimpunctata	Chrząszcz burakowy	Muszka owocowa	Kontrola dodatnia	Kontrola ujemna
Pożywka 2	4,0	3,0	4,0	4,0	1,0	4,0
Pożywka 3	4,0	4,0	4,0	4,0	1,0	4,0

Testy te wykazują, że AQ713 był aktywny w obu pożywkach jako cała brzeczka z hodowli z największą aktywnością w pożywce 2. Supernatant był tylko aktywny, gdy AQ713 hodowano w pożywce 2.

PL 198 772 B1

P r z y k ł a d 3

Chemiczne własności metabolitów AQ713

Aktywność wobec Diabrotica undecimpunctata ml AQ713 hodowano w pożywce 2. Do każdej hodowli dodano 50 ml octanu etylu i mieszaninę wytrząsano w rozdzielaczu przez 2 minuty. Usunięto warstwę wodną, a warstwę organiczną zebrano do butelki zawierającej siarczan magnezu. Następnie organiczny roztwór przesączono do okrągłodennej kolby i usunięto rozpuszczalnik na wyparce obrotowej.

Dla celów biotestu wysuszony organiczny ekstrakt ponownie rozpuszczono w 2,5 ml acetonu. Pobrano 40 μl próbkę i rozcieńczono 800 μl 70% układu aceton/woda. Jest to stężenie organicznego ekstraktu oznaczone jako 10X. Przeprowadzono kolejne rozcieńczenie, aby uzyskać próbki do badań szkodnika Diabrotica undecimpunctata i określania śmiertelności larw (1 na studzienkę na mikropłytce przygotowanej jak opisano powyżej) po 7 dniach. Wyniki są przedstawione w Tabeli 4.

T a b e l a 4

Aktywność ekstraktów AQ713 w octanie etylu przeciwko Diabrotica undecimpunctata

Próbka AQ713:	Ekstrakt organiczny 10X	Procent śmiertelności 89
	Ekstrakt organiczny 5X	93
	Ekstrakt organiczny 1X	65
	Cała brzeczka	100
	70% aceton/woda	27
	Woda	59

Wyniki wykazują, że AQ713 wytwarza metabolit, który ekstrahuje się rozpuszczalnikiem i który zabija Diabrotica undecimpunctata.

W celu określenia zakresu ciężaru cząsteczkowego aktywnego metabolitu 50 ml hodowlę AQ713 prowadzono w pożywce 2.1 ml umieszczono w probówce do mikrowirowania i wirowano przy 12000 obr./min. przez 15 minut. Usunięto supernatant. 500 μl supernatantu umieszczono na górze filtra Centrieon 10000 daltonów. Wirowano zgodnie z instrukcją producenta (12000 obr./min. przez 35 minut).

Przesącz zebrano, a pozostałość odzyskano przez wirowanie i przemycie filtra. Próbki supernatantu, przesączu i substancji zatrzymanej (pozostałości) badano na obecność larw Diabrotica undecimpunctata (96 studzienkowa płytka z pokarmem dla owadów, Marrone i in. jak powyżej; 40 μl próbki na studzienkę i 8 studzienek na każdą próbkę, 1 larwa/studzienkę). Wyniki testu są przedstawione w Tabeli 5.

T a b e l a 5

Odcięty ciężar cząsteczkowy AQ713

AQ713	Procent śmiertelności Diabrotica undecimpunctata supernatant	43
	przesącz	63
	pozostałość	17

Wyniki wykazują, że supernatant i przesącz były aktywne. Zatem ciężar cząsteczkowy metabolitu jest mniejszy niż 10000 daltonów.

P r z y k ł a d 4

Chemiczne własności metabolitu AQ713 aktywnego wobec patogenów roślin ml AQ713 hodowano w pożywce 2. Do każdej hodowli doda no 50 ml octanu etylu i mieszaninę wytrząsano w rozdzielaczu przez 2 minuty. Usunięto warstwę wodną, a warstwę organiczną zebrano do butelki zawierającej siarczan magnezu. Następnie organiczny roztwór przesączono do okrągłodennej kolby i usunięto rozpuszczalnik na wyparce obrotowej.

Dla celów biotestu wysuszony organiczny ekstrakt ponownie rozpuszczono w 2,5 ml acetonu. Pobrano 40 μl próbkę i rozcieńczono 800 μl 70% układu aceton/woda. Jest to stężenie organicznego ekstraktu oznaczone jako 10X. Przeprowadzono próbę na patogeny roślin na 96-studzienkowej płytce z Pythium ultimum i Botrytis cinerea w celu określenia aktywności organicznego ekstraktu. Cała brzeczka dała 100% zwalczenia (ocena 1), ale ekstrakt organiczny 10X nie doprowadził w ogóle do zwalczenia tych dwóch patogenów (ocena 4). Wskazuje to, że aktywne antybiotyki, w przeciwieństwie do metabolitów wytwarzanych przez AQ713 aktywnych wobec Diabrotica undecimpunctata, nie ekstrahują się organicznym rozpuszczalnikiem, takim jak octan etylu.

PL 198 772 B1

Do dalszego badania wyizolowano nowy związek, agrastatynę A. Wytworzono butanolowy ekstrakt z brzeczki fermentacyjnej najpierw przez ekstrakcję brzeczki dwa razy równą objętością octanu etylu i rozdzielenie warstw. Następnie frakcję wodną ekstrahowano dwa razy równą objętością butanolu. Ekstrakty butanolowe połączono i usunięto rozpuszczalniki na wyparce obrotowej. Wytworzony ekstrakt poddano suszeniu rozpyłowemu i otrzymano proszek, który rozpuszczono w roztworze 80% acetonu w wodzie i poddano działaniu ultradźwięków. Roztwór naniesiono na ładunek do ekstrakcji w fazie stałej (SPE) C-18, który aktywowano metanolem i zrównoważono 80% roztworem acetonu w wodzie. Ładunek SPE eluowano 80% roztworem acetonu w wodzie, zebrano eluent i usunięto rozpuszczalnik. Dalej eluent oczyszczono metodą HPLC. Stosowano kolumnę do HPLC C-18 (1 cm x 25 cm) (detekcja UV przy 210 nm) z elucją gradientem rozpuszczalników acetonitryl + 0,05% TFA/woda+ 0,05% TFA w następujący sposób: 0-20 minut, 33% ACN; 20-30 minut, 40% ACM; 30-45 minut, 45-55% ACN i 45-63 minuty, 55% ACN.

Chromatogram HPLC AQ713 wykazuje obecność ituryn, związków podobnych do ituryn (plipastatyn i agrastatyn) i surfaktyn, patrz Fig. 1. Ituryny A2, A3, A4, A7 i A6 zidentyfikowano na podstawie łącznych danych NMR i spektroskopii mas LC oraz porównanie z wartościami literaturowymi. Surfaktyny zidentyfikowano przez porównanie z zakupionymi wzorcami surfaktyny metodą HPLC i spektrometrii mas LC.

Związki podobne do ituryn określono jako mieszaninę plipastatyn i nowych agrostatyn przez łączną analizę aminokwasów i spektrometrię mas LC. Dla jednego z nowych związków oznaczonego jako agrostatyna A (HPLC pik 20) zebrano szerokie dane NMR. Stwierdzono, że agrastatyna A zawiera następujące aminokwasy: Thr; 3Glu; Pro; Ala; Val; 2 Tyr i Orn. Różni się od plipastatyny A obecnością Val i brakiem Ile. Ciężar cząsteczkowy agrastatyny A oznaczono jako 1448, co odpowiada związkom o strukturze

CH₃ (CH₂) i2-CH-CH₂-CO-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Val

OH O Prostołańcuchowy charakter części, którą stanowi kwas tłuszczowy potwierdzono metodą ¹H NMR. Pozycję aminokwasów w cyklicznym peptydzie oznaczono przez szczegółową analizę baz danych TOCSY i ROESY.

Spektrometria mas i analiza aminokwasów agrastatyny B (pik HPLC 26) sugerują, że jej struktura jest podobna do plipastatyny B2, w której zamiast reszty A1a występuje Val. Struktura jest przedstawiona poniżej:

CH₃ (CH₂) CH (CH₂) ₁₀-CH-CH₂-CO-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr-Val

I I I ch₃ oh o P r z y k ł a d 5

Aktywność AQ713 przeciwko patogenom roślin w hodowli in vitro (96-studzienkowa płytka)

Przeprowadzono następujące doświadczenia w celu określenia skuteczności AQ713 przeciwko grzybom Pnytophtora infestans, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Alternaria solani. 96 studzienek płytki (płaskodenne o objętości 400 μl/studzienkę, Nunc) wypełniono pożywką agarową (agar, dekstroza ziemniaczana) (PDA, Difco). Hodowle Phytophthora infestans prowadzono przez 3 dni w ciekłej pożywce UPG-1 (0,4 g drożdży, 0,1% KH2PO, 0,5% MgSO4 x 7H2O, 1,5% glukozy). W przypadku innych grzybów spory zdrapano z powierzchni płytek Petriego i na agarze rozprowadzono 0,1-0,2 ml próbki dejonizowanej wody i zawiesiny sporów patogenu o stężeniu w przybliżeniu 2 x 10⁶ sporów/ml).

AQ713 hodowano przez 72 godziny w pożywce 2 lub 3 jak opisano w przykładzie 2. W celu otrzymania supernatantów całą brzeczkę z hodowli odwirowano przy 5200 obr./min. przez 20 minut. Grzybowe patogeny roślin odpipetowano na 96-studzienkowe płytki (8 studzienek/patogen). W każdej z 8 studzienek odnotowywano wzrost lub brak wzrostu grzybów. Do każdej studzienki dodano około 40 μl supernatantu AQ713 lub 20 μl całej brzeczki. Ocena „1 oznacza całkowite zahamowanie wzrostu grzybów. Ocena „4 oznacza brak zahamowania wzrostu grzybów. Wyniki przedstawione są w Tabeli 6.

PL 198 772 B1

T a b e l a 6

Zahamowanie wzrostu grzybów in vitro (96-studzienkowa płytka)

Supernatant AQ713	Pożywka 2 Ocena	Pożywka 3 Ocena
Phytophthora infestans	1	1
Pythium ultimum	1	1
Botrytis cinerea	1	1
Rhizoctonia solani	4	1
Alternaria solani	1	1
Cała brzeczka AQ713
Colletotrichum cocodes	1	NT
Alternaria brassicicola	1	NT
Botrytis cinerea	1	NT
Cladosporium cucumerinum	1	NT
Monilinia fructicola	1	NT
Venturia pyrina	1	NT
Rhizoctonia solani	1	NT
Alternaria solani	1	NT

NT - nie badano

Wyniki wykazują, że AQ713 ma szerokie spektrum grzybobójcze in vitro i że zarówno cała brzeczka jak i supernatant mają wysoką aktywność. Supernatant był aktywny wobec Rhizoctonia solani w pożywce 3, ale nie był aktywny w pożywce 2.

P r z y k ł a d 6

Aktywność AQ713 przeciwko patogenom roślin w hodowli in vitro (próba strefowa)

W celu określenia aktywności AQ713 w próbie dyfuzyjnej (strefowej) na agarze spory patogenu roślinnego rozprowadzono na powierzchni agaru z dekstrozą ziemniaczaną na 10 cm płytkach Petriego. W podłożu wykonano 7,0 mm studzienki przez usunięcie agaru i w studzience umieszczono 100 μl próbę supernatantu AQ713 hodowanego w pożywce 2. Supernatant otrzymano przez wirowanie przez 40 minut z prędkością 4200 obr./min. Następnie Supernatant znów wirowano z prędkością 4200 obr./min. przez dalsze 40 minut. Typowe wyniki obejmowały strefę bez wzrostu i/lub ze zmniejszonym wzrostem patogenu wokół studzienki. Zmierzono i odnotowano wielkość tej strefy w milimetrach. Wyniki są przedstawione w Tabeli 7.

T a b e l a 7

Zahamowanie wzrostu patogenu grzybowego roślin in vitro (próba strefowa)

Supernatant AQ713	Alternaria brassicicola	Botrytis cinerea	Monilinia fructicola
Wielkość strefy (mm)	16	23	14
Cała brzeczka AQ713	22	15	18

P r z y k ł a d 7

Aktywność AQ713 przeciwko bakteryjnym patogenom roślin Przeprowadzono standardową próbę dyfuzyjną na agarze jak w przykładzie 6. Powłokę każdego patogenu bakteryjnego rozprowadzono na powierzchni płytki Petriego. W każdej studzience umieszczono 100 μl całej brzeczki z hodowli AQ713 w pożywce 2. Wielkość strefy mierzono w milimetrach.

PL 198 772 B1

T a b e l a 8

Zahamowanie bakteryjnych patogenów roślin in vitro

Cała brzeczka AQ713	Strefa zahamowania (mm)
Acidovorax avenae subsp. citrulli	18
Pseudomonas syringae pv. tomato	11
Xanthomonas campestris pv. campestris	18
Erwinia carotovora subsp. carotovora	11
Clavibacter michiganese subsp. michiganese	22

AQ713 był aktywny wobec wszystkich gatunków bakteryjnych patogenów roślin in vitro.

P r z y k ł a d 8

Aktywność AQ713 wobec patogenów roślin w testach z roślinami

Aktywność AQ713 badano wobec szarej pleśni, Botrytis cinerea na fasoli i liściach geranium, Alternaria solani na siewkach pomidorów i przeciwko mączniakowi rzekomemu sałaty, Bremia lactucae.

W badaniu na A. solani siewki pomidorów w fazie 2-3 liś cia hodowane po 6, opryskano aż do ściekania całą brzeczką AQ713 (hodowli w pożywce 2). Po oprysku pozostawiono siewki do wyschnięcia (około 1,5 godziny). Następnie siewki opryskano 5x10⁴ sporów/ml. Przykryto je plastikowym kołpakiem i utrzymywano w 28°C w inkubatorze Percival. Jako ujemną kontrolę i dodatnią kontrolę na patogeny stosowano wodę bez AQ713, ze sporami patogenu i bez sporów. Po 4 dniach odczytano wyniki testu. W próbie kontrolnej z wodą na A. solani były jednorodne uszkodzenia na wszystkich liściach właściwych, a liścienie odpadły i były poważnie zakażone (ocena 5 = całkowite zakażenie, brak zwalczania). Rośliny potraktowane AQ713 miały drobne uszkodzenia na liściach właściwych. Liścienie były przytwierdzone, ale z małymi uszkodzeniami w niewielkiej ilości (ocena 1). Kontrola ujemna nie była zakażona.

Drugi test przeprowadzono stosując oderwane siewki pomidorów (łodygi oderwane od podłoża) umieszczone w słojach wypełnionych wodą i umieszczonych pod kołpakiem i przechowywanych jak wyżej. Rośliny opryskano jak powyżej, a objawy A. solani odnotowano po 4 dniach. Nie zaobserwowano żadnych objawów w próbie kontrolnej ujemnej. W próbie kontrolnej dodatniej na siewkach zaobserwowano jednorodne uszkodzenia. Działanie AQ713 doprowadziło do oceny 1 (kilka uszkodzeń lub brak uszkodzeń). Po 2 dniach rośliny w próbie kontrolnej dodatniej zostały zniszczone, ale siewki traktowane AQ713 były wizualnie czyste i wyglądały tak samo jak kontrole ujemne (rośliny opryskane wodą).

W teście na Botrytis cinerea pierwsze liście właś ciwe uszkodzono przez odciśnięcie na każdym liściu ujścia probówki hodowlanej z hodowlą 13X100.

Na każdym liściu wykonano 2 odciśnięcia. Liście opryskano całą brzeczką AQ713 (pożywka 2) lub samą wodą lub samym patogenem. Po wyschnięciu opryskano je sporami B. Cinerea (0,8x10⁶sporów/ml). Liście umieszczono w płaskim naczyniu, przykryto je kołpakiem i przechowywano w 18-20°C, w inkubatorze Percival. Po 5 dniach w kontroli dodatniej (sam patogen) zaobserwowano gnicie w obszarze o średnicy około 25 mm. W próbie kontrolnej ujemnej (sama woda) nie zaobserwowano gnicia. Liście opryskane AQ713 nie wykazywały żadnego zakażenia w 7 z 8 kółeczek na nich odciśniętych. Na jednym, zakażonym liściu było słabe zakażenie w dwóch miejscach dookoła kółeczek.

W teście na Bremia siewki sał aty hodowano w warstwie sterylizowanej mieszanki ziemi doniczkowej zawierającej torf, perlit i wermikulit w małych przezroczystych plastikowych pojemnikach o szerokości i wysokości około 8 cm. Po wykiełkowaniu sałaty (1 tydzień) siewki sałaty opryskano brzeczką lub supernatantem AQ713. Rośliny pozostawiono do wyschnięcia, po czym zawiesinę sporów mączniaka rzekomego z zakażonych siewek sałaty opryskano te siewki. Rośliny przykryto plastikową pokrywką i inkubowano w 18-20°C w inkubatorze Percival. Po tygodniu sprawdzono wyniki testu. AW713 nie zapobiegł rozwinięciu się mączniaka rzekomego z Bremia na siewkach sałaty.

P r z y k ł a d 9

Skuteczność AQ713 wobec chorób roślin (test szklarniowy)

Mączniak rzekomy winorośli

AQ713 hodowano na pożywce sojowej w 400 l fermentorze przez 48 godzin. Rośliny winorośli (Chardonnay) opryskano aż do ściekania całą brzeczką z 400 litrowej fermentacji, rozcieńczoną jałową wodą do stężeń 0,5X i 0,25X stosując ręczny opryskiwacz. Po wyschnięciu listowia rośliny opryskano po raz drugi. Po wyschnięciu rośliny zakażono patogenem wywołując mączniaka rzekomego winorośli, Plasmopara viticola. Dla każdej dawki użyto 3 roślin. Każdą roślinę oceniono określając % zwalczenia choroby

PL 198 772 B1 w skali od 0 do 100% zwalczenia. 100% zwalczenia otrzymuje roślina, na której nie ma widocznych uszkodzeń. Do porównania użyto chemicznego fungicydu, metalaksylu. Otrzymano następujące wyniki:

cała brzeczka AQ713 0,5X cała brzeczka AQ713 0,25X Metalaksyl 30 ppm Metalaksyl 10 ppm Metalaksyl 1 ppm

97,7% zwalczenia 100% zwalczenia 100% zwalczenia 98,3% zwalczenia 80% zwalczenia

Wyniki wykazują, że AQ713 skutecznie zwalcza mączniaka rzekomego winorośli, równie dobrze jak chemiczny fungicyd.

P r z y k ł a d 10

Skuteczność AQ713 przeciwko mączniakowi prawdziwemu dyni

AQ713 hodowano w pożywce sojowej w 400 I fermentorze przez 48 godzin. Rośliny dyni (Crookneck i Acorn) opryskano aż do ściekania pełną brzeczką z 400 l fermentacji, rozcieńczoną jałową wodą do stężenia 0,5X stosując ręczny opryskiwacz. Po wysuszeniu rośliny zaszczepiono patogenem, mączniakiem prawdziwym dyni, Sphaerotheca fuliginea. Każdą dawką traktowano 2 rośliny. Badano także wysuszony rozpyłowo proszek pełnej brzeczki. Brzeczkę z 400 l fermentacji suszono rozpyłowo w celu usunięcia wody. 10% i 2,5% roztworami proszków z suszenia rozpyłowego opryskano rośliny aż do ściekania jak to opisano powyżej. Występowanie mączniaka prawdziwego oceniano w skali od 0 do 5. „Ocena 5 oznacza 100% choroby, natomiast „0 oznacza brak choroby. Wyniki są przedstawione w Tabeli 9.

T a b e l a 9

Badana zawiesina	Roślina 1 Dynia Acorn	Roślina 2 Dynia Acorn	Roślina 1 Dynia Crookneck	Roślina 2 Dynia Crookneck
Cała brzeczka AQ713 1X	0	0	0	0
Cała brzeczka AQ713 0,5X	0	0	0	0
AQ713 10% Suszony rozpyłowo proszek	0	0	0	0
AQ713 2,5% Suszony rozpyłowo proszek	0	0	0,5	1

Pełna brzeczka AQ713 i suszony rozpyłowo proszek prawie całkowicie zwalczają mączniaka prawdziwego dyni

P r z y k ł a d 11

Skuteczność AQ713 wobec zarazy, szarej pleśni, mączniaka prawdziwego winorośli, mączniaka prawdziwego zbóż, zarazy pochwy liścia i zarazy ryżu w szklarni.

T a b e l a 11

	P. infestans	B. cinerea	E. graminis	U. necator	P. oryzae	R. solani
1	2	3	4	5	6	7
AQ713	70	100	84	100	100	100
Metalaksyl 30 ppm	100
Metalaksyl 10 ppm	77
Propikonazol 10 ppm		87
Propikonazol 5 ppm		57
Propikonazol 0,5 ppm			100
Propikonazol 0,2 ppm			54
Myklobutanil 30 ppm				100
Myklobutanil 10 ppm				100
Pencykuron 50 ppm					100

PL 198 772 B1 cd. tabeli 11

AQ713 wykazał aktywność równą aktywności chemicznych fungicydów wobec wszystkich badanych patogenów.

P r z y k ł a d 12

Skuteczność AQ713 wobec mączniaka rzekomego Brassica

Szczep AQ713 Bacillus hodowano w 10 l fermentorze w pożywce sojowej przez 48 godzin. Pełną brzeczką o stężeniu 1X opryskano 3-tygodniowe kalafiory i pędy brukselki w pełnej fazie liścieni stosując pneumatyczny pędzel malarski. Każde traktowanie prowadzono w trzech powtórzeniach stosując 15-25 siewek/doniczkę.

Rośliny opryskano także środkiem Quadris^TM, fungicydem azoksystrobiną z firmy Zeneca (trzy rośliny na jedno traktowanie) w ilości 250 ppm i 125 ppm. Po wyschnięciu oprysku AW713 i Quadris rośliny Brassica opryskano zawiesiną sporów mączniaka rzekomego, Peronospora parasitica, w ilości 1-5x10⁴ sporów/ml. Rośliny utrzymywano w 15-17°C przez 24 godziny w celu rozwinięcia się zakażenia, po czym siewki inkubowano przez 6 dni w 20-24°C. Następnie doniczki znów umieszczono na noc w 15-17°C i pozostawiono do sporulacji patogenu, po czym przeprowadzono ocenę testu. Każdą roślinę oceniano określając % zwalczenia choroby w skali od 0 do 100%. Zwalczenie w 100% oznacza roślinę bez ognisk sporulacji. Wyniki, które są średnimi z powtórzeń, przedstawiono w Tabeli 12.

T a b e l a 12

	Odczyt 23 grudnia	Odczyt 30 grudnia	Odczyt 6 stycznia
Cała brzeczka AQ713	100	90	75
Quadris 250 ppm	100	NT	NT
Quadris 125 ppm	NT	100	100
Kontrola z wodą	0	0	0

NT - nie badano

AQ713 zwalczał mączniaka rzekomego skutecznie przez 3 tygodnie.

P r z y k ł a d 13

Synergizm AQ713 i handlowego fungicydu

AQ713 hodowano w 10 l fermentorze na pożywce sojowej przez 72 godziny. Hodowlę bakterii rozcieńczono jałową wodą do stężeń 0,5X i 0,25X. Hodowlą o stężeniach 1X, 0,5X i 0,25X opryskano 3-tygodniowe rośliny papryki stosując pneumatyczny pędzel malarski napędzany sprężonym powietrzem. Na każde traktowanie stosowano 3 rośliny. Rośliny opryskano także środkiem Quadris^TM, azoksystrobiną-fungicydem z firmy Zeneca (3 rośliny na traktowanie) w stężeniach 500 ppm, 250 ppm i 125 ppm. Ponadto rośliny papryki (3 na traktowanie) opryskano kombinacją Quadrisu i całej brzeczki z hodowli AQ713 w stosunku 1:1. Wyniki ze środkiem Quadris i bez tego środka przedstawiono w Tabeli 13 poniżej. Po wysuszeniu roślin po oprysku AQ713 i Quadris opryskano je zawiesiną sporów Botrytis cinerea, szarej pleśni, w ilości 1 x 10⁶ sporów/ml. Rośliny utrzymywano w 20-22°C przez 3 dni, po czym przeprowadzono ocenę. Występowanie choroby oceniano w skali od 0 do 5. Ocena „5 oznacza 100% choroby, natomiast „0 wskazuje na brak choroby. Wyniki są przedstawione w Tabeli 13 poniżej.

PL 198 772 B1

T a b e l a 13

Traktowanie	Ocena Powtórzenie 1	Ocena Powtórzenie 2	Ocena Powtórzenie 3	Ocena średnia
AQ713 1X	0,5	0,5	1,5	0,8
AQ713 0,5X	2,0	2,5	2,0	2,2
AQ713 0,25X	3,0	3,0	2,0	2,7
Quadris 500 ppm	4,0	3,5	4,0	3,8
Quadris 250 ppm	2,5	3,5	3,0	3,0
AQ713 1X + Quadris 500 ppm	0,5	1,0	1,0	0,8
AQ713 IX + Quadris 250 ppm	1,0	1,0	0,5	0,8
AQ713 0,5X + Quadris 250 ppm	0,5	1,0	1,0	0,8
AQ713 0,25X + Quadris 250 ppm	0,5	1,0	2,5	1,3
Kontrola z wodą	4,0	5,0	5,0	4,7
Kontrola z wodą 2	5,0	5,0	5,0	5,0

Wyniki wyraźnie wykazują, że kombinacje środka Quadris i AQ713 zwalczają szarą pleśń znacznie lepiej niż sam Quadris i sam AQ713.

Pencykuron 10 ppm

Benomyl 100 ppm

Benomyl 40 ppm

Wskaźnik choroby (%)

1. Biologicznie czysta kultura Bacillus subtilis, szczep AQ713 NRRL Nr B21661 i jego mutanty, które mają wszystkie cechy identyfikacyjne tego szczepu.

2. Metabolit wytwarzany przez szczep Bacillus subtilis określony w zastrz. 1, który wykazuje aktywność przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej, jest ekstrahowalny rozpuszczalnikiem, i ma ciężar cząsteczkowy poniżej 10000.

3. Supernatant otrzymany z hodowli szczepu AQ713 Bacillus subtilis określonego w zastrz. 1, który wykazuje aktywność przeciwgrzybiczą i przeciwbakteryjną i aktywność przeciw kukurydzianej stonce korzeniowej.

4. Kompozycja do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, znamienna tym, że zawiera całą brzeczkę z hodowli szczepu AQ713 Bacillus subtilis określonego w zastrz. 1 i chemiczny fungicyd.

5. Kompozycja do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, znamienna tym, że zawiera całą brzeczkę z hodowli szczepu AQ713 Bacillus subtilis określonego w zastrz. 1 i biologiczny lub chemiczny środek szkodnikobójczy.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera dodatkowo chemiczny fungicyd.

7. Kompozycja do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, znamienna tym, że zawiera metabolit określony w zastrz. 2 i chemiczny fungicyd.

8. Kompozycja do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, znamienna tym, że zawiera metabolit określony zastrz. 2 i biologiczny lub chemiczny środek szkodnikobójczy.

9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera dodatkowo chemiczny fungicyd.

10. Kompozycja do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, znamienna tym, że zawiera supernatant określony w zastrz. 3 i chemiczny fungicyd.

11. Kompozycja do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, znamienna tym, że zawiera supernatant określony w zastrz. 3 i biologiczny lub chemiczny środek szkodnikobójczy.

12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera dodatkowo chemiczny fungicyd.

PL 198 772 B1

13. Sposób ochrony lub leczenia roślin i owoców zakażonych grzybowymi i bakteryjnymi chorobami oraz porażonych kukurydzianą stonką korzeniową, znamienny tym, że nanosi się na nie skuteczną ilość szczepu Bacillus subtilis określonego w zastrz. 1 lub metabolitu określonego w zastrz. 2 lub supernatantu określonego w zastrz. 3.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że zakażenie jest spowodowane przez co najmniej jeden mikroorganizm wybrany z grupy obejmującej Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Alternaria brassicicola, Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola, Venturia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator i Peronospora parasitica.

15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że szczep Bacillus subtilis stosuje się jako całą brzeczkę z hodowli.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że szczep Bacillus subtilis stosuje się w postaci proszków zawiesinowych, granulek, substancji sypkiej lub mikrokapsułek.

17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że szczep Bacillus subtilis stosuje się jako supernatant.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że szczep Bacillus subtilis stosuje się w postaci proszków zawiesinowych, granulek, substancji sypkiej lub mikrokapsułek.

19. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że traktuje się korzenie roślin lub ziemię dookoła korzeni.

20. Sposób ochrony lub leczenia roślin i owoców zakażonych grzybowymi i bakteryjnymi chorobami oraz porażonych kukurydzianą stonką korzeniową, znamienny tym, że nanosi się na nie skuteczną ilość kompozycji określonej w zastrz. 4, 5, 7, 8, 10 lub 11.

21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że zakażenie jest spowodowane przez co najmniej jeden mikroorganizm wybrany z grupy obejmującej Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Alternaria brassicicola, Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola, Venturia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator i Peronospora parasitica.

22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że traktuje się korzenie roślin lub ziemię dookoła korzeni.

23. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera iturynę typu A, plipastatynę i surfaktynę otrzymane z bakterii określonych w zastrz. 1.

24. Kompozycja według zastrz. 23, znamiena tym, że zawiera jeszcze agrastatynę, otrzymaną z bakterii określonych w zastrz. 1.

25. Agrastatyna o wzorze (SEK Nr ID: 1):

Ri-CH-CH₂-CO-Glx-Orn-Tyr-Thr-Glx-Ala-Pro-Glx-Tyr-Val

I I

OR₂ O w którym R₁ oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alifatyczny C₈-C₂₀, R₂ oznacza octan lub pochodną estrową, a Glx oznacza Gln lub Glu, otrzymana z bakterii określonych w zastrz. 1.

26. Agrastatyna A o wzorze (SEK Nr ID: 2):

CH₃ (CH₂) i₂-CH-CH₂-CO-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Val

OH O otrzymana z bakterii określonych w zastrz. 1.

27. Sposób ochrony lub leczenia roślin i owoców zakażonych szkodnikami owadami, znamienny tym, że nanosi się skuteczną ilość kompozycji zawierającej iturynę typu A, plipastatynę i surfaktynę, otrzymane z bakterii określonych w zastrz. 1.

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że nanosi się jeszcze skuteczną ilość agrastatyny otrzymanej z bakterii określonych w zastrz. 1.

29. Sposób izolowania supernatantu o aktywności owadobójczej, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę kultury określonej w zastrz. 1 i izoluje się supernatant z hodowli.