PL198427B1 - Zastosowanie chelerytryny - Google Patents

Abstract

Zastosowanie chelerytryny do wytwarzania leku do leczenia jednej lub wi ekszej liczby chorób wybranych z grupy obejmuj acej marsko sc w atroby, w lókniej ace zapalenie trzustki, w lóknienie p luc, przewlek le zapalenie oskrzeli, w lóknienie po napromienianiu, twardzin e skóry i mukowiscydoz e. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie chelerytryny. Chelerytryna jest inhibitorem ludzkiej kinazy h-sgk regulowanej objętością komórki.

Kinazę h-sgk i sposoby jej wytwarzania opisano w EP 0861896.

Definicje pojęć stosowanych w dalszej części niniejszego opisu są następujące:

h-sgk: ludzką kinaza zależna od surowicy i glukokortykoidów (kinaza serynowo-treoninowa)

ENaC: nabłonkowy kanał Na+

MDEG: degeneryna ssacza (Waldmann R., Lazduński M. (1998) Current Opinion in Neurobiology 8: 418-424); synonimem dla tego określenia jest „BNC (mózgowy kanał Na⁺)

TGF-βι: czynnik wzrostu nowotworów ^NKCC: ^ko-trans^porter ^Na+^{, 2Cl}

HEPES: kwas [4-(2-hydroksyetylo)piperazyno]etanosulfonowy

SEM: standardowy błąd średniej trans-dominująca kinaza hamująca: h-sgk zmodyfikowana mutacją: lizyna w pozycji 127 jest zastąpiona argininą (K127R); mutacja zlokalizowana jest w regionie katalitycznym i hamuje katalityczne działanie kinazy.

Zwiększona ekspresja h-sgk występuje często w cukrzycy, stwardnieniu tętnic, chorobie Alzheimera, marskości wątroby, chorobie Crohna, włókniejącym zapaleniu trzustki i przewlekłym zapaleniu oskrzeli. Nasilone wytwarzanie h-sgk wyjaśnić można stymulacją ekspresji TGF-β 1 (fig. 1). Choroby przebiegające ze zwłóknieniem powodowane są nasilonym wytwarzaniem i zmniejszonym rozpadem białek macierzy. Oba te efekty są skutkiem działania TGF-β) Zwiększoną ekspresję białek macierzy w fibroblastach można obniżyć poprzez hamowanie NKCC furosemidem (fig. 2). Do tej pory nie było jasne, czy zwiększona ekspresja h-sgk stanowi jedynie konsekwencję, czy też jest przyczyną zaburzenia.

Nieoczekiwane odkrycia potwierdzają obecnie, że h-sgk aktywuje wspólny transport Na+, K+ i 2Cl (fig. 3). Można stąd wyciągnąć wniosek, że ta stymulacja NKCC przez h-sgk indukuje włókniede. ^poza ws^póln^ym ^trans^portem ^Na+^{, K}+ ^{i 2Cl h}-s^gk a^ktywuje równie^{ż EN}aC (^fig. ^{4 i} 5) ^{i MDEG}.

Stymulujące działanie h-sgk na ENaC można zmniejszyć działaniem inhibitorów kinazy, np. staurosporyny (Sigma, D-82041 Deisenhofen) lub chelerytryny (Sigma, tamże) (fig. 4). Ponadto działanie h-sgk na ENaC można zmniejszyć np. z użyciem trans-dominującej kinazy hamującej (fig. 5). Inhibitory h-sgk można zatem stosować w leczeniu wyżej wymienionych zaburzeń. Ogólnie odpowiednie w tym celu są wszystkie znane inhibitory kinaz. Inhibitory kinaz są również w wielu przypadkach dostępne na rynku, np. w Calbiochem-Novabiochem GmbH, Listweg 1, D-65812 Bad Soden (patrz „1998 General Catalog”). Inne inhibitory kinaz otrzymać można z innych źródeł handlowych lub niehandlowych znanych fachowcom.

Ekspresja h-sgk rośnie w napadzie padaczkowym. Obecnie uzyskane dane czynnościowe wskazują, że ten efekt wpływa na zmniejszanie wzbudzenia neuronów ponieważ aktywacja NKCC prowadzi do zmniejszenia zewnątrzkomórkowego stężenia K+, po którym następuje hiperpolaryzacja, a zatem hamowanie aktywności neuronów. Ponadto hamowanie MDEG powinno hamować wzbudzenie neuronów. Tak więc aktywatory kinazy przenikające przez barierę krew-mózg można skutecznie stosować w napadach padaczkowych. Z kolei hamowanie kinazy lekami przenikającymi przez barierę krew-mózg może nasilać uważność i zdolności do uczenia się. Aktywatory kinazy, wśród których najbardziej interesujące są aktywatory kinazy C, są znane fachowcom od dawna (patrz np. Calbiochem-Novobiochem 1998 General Catalog). Inne inhibitory kinazy można otrzymać ze źródeł handlowych i niehandlowych, znanych fachowcom.

Ponieważ wspólny transport Na+, K+, 2Cl oraz kanał Na+ są kluczowe dla procesów absorpcji Na+ w nerkach, a z absorpcją Na+ w nerkach wiąże się nadciśnienie, należy założyć, że zwiększona ekspresja kinazy prowadzi do nadciśnienia, a zmniejszona jej ekspresja do niedociśnienia.

Zatem wynalazek dotyczy zastosowania chelerytryny do wytwarzania leku do leczenia jednej lub większej liczby chorób wybranych z grupy obejmującej marskość wątroby, włókniejące zapalenie trzustki, włóknienie płuc, przewlekłe zapalenie oskrzeli, włóknienie po napromienianiu, twardzinę skóry i mukowiscydozę.

Leki zawierające inhibitory h-sgk można dodatkowo stosować dla regulacji pobudliwości neuronów.

Wyniki

Nerka cukrzycowa':

PL 198 427 B1

Ekspresja h-sgk w prawidłowej nerce jest niska. Wyraźną ekspresję h-sgk wykazują niektóre komórki kłębuszka oraz końcowych fragmentów kanalika proksymalnego i kanalika dystalnego. Natomiast w nerce cukrzycowej występują komórki z nasiloną ekspresją h-sgk.

Stwardnienie tętnic:

Komórki z bardzo nasiloną ekspresją h-sgk znajduje się często w ścianach naczyń miażdżycowych.

Choroba Alzheimera:

W prawidłowym mózgu jedynie niewiele komórek wykazuje ekspresję h-sgk. Komórkami tymi są prawdopodobnie komórki oligodendrytyczne. Liczba komórek, w których ekspresji ulega h-sgk istotnie wzrasta w mózgu osób z chorobą Alzheimera.

Marskość wątroby:

W prawidłowej wątrobie ekspresja h-sgk zachodzi wyłącznie w komórkach miedziowych. Jednakże w przebiegu marskości tkanka usiana jest komórkami, w których ulega ekspresji h-sgk.

Choroba Crohna:

W prawidłowej tkance jelitowej do ekspresji h-sgk dochodzi wyłącznie w enterocytach. Natomiast w chorobie Crohna kinaza znajduje się również w tkance łącznej.

Włókniejące zapalenie trzustki:

W prawidłowej trzustce h-sgk znajduje się wyłącznie w komórkach groniastych i przewodowych. Wokół przewodów trzustkowych znajduje się kilka komórek jednojądrzastych z ekspresją h-sgk. We włókniejącym zapaleniu trzustki dochodzi do znacznego nasilenia ekspresji kinazy.

Zwłóknienie płucne oraz przewlekłe zapalenie oskrzeli:

W zwłóknieniu płucnym oraz przewlekłym zapaleniu oskrzeli obserwuje się nasiloną ekspresję h-sgk.

Stymulacja ekspresji h-sgk przez TGF-βι:

Ekspresja h-sgk stymulowana jest przez TGF-β-ι (fig. 1).

Ponieważ TGF-β-ι wytwarzany jest w tkance włókniejącej/objętej procesem zapalnym, odkrycie to wyjaśnia nasiloną ekspresję h-sgk w tkance objętej procesem zapalnym.

TGF-βι stymuluje ekspresję białka macierzy, zwanego biglikanem, które to działanie hamuje inhibitor NKCC, furosemid.

TGF-βι stymuluje ekspresję biglikanu. W obecności inhibitora NKCC, furosemidu, wpływ TGF-βna ekspresję biglikanu jest całkowicie zahamowany. Zatem aktywacja NKCC jest warunkiem wstępnym dla zwłókniającego działania TGF-βι (fig. 2).

Stymulacja NKCC przez h-sgk:

Znaczenie zwiększonej ekspresji kinazy w tkance objętej włóknieniem może być wielostronne i nie wiązać się przyczynowo ze zwłóknieniem. Niemniej jednak doświadczenia, w których zastosowano technikę zacisku napięciowego z dwoma elektrodami („two-electrode voltage clamp”) wykazały, że h-sgk intensywnie nasila aktywność NKCC (fig. 3). W świetle wrażliwości furosemidu na syntezę biglikanu, odkrycie to jednoznacznie wykazuje przyczynową rolę h-sgk w zwłóknieniu.

Stymulacja ENaC przez h-sgk:

Działanie to można zmniejszyć działaniem inhibitorów kinazy staurosporyny i chelerytryny. Jak pokazano na fig. 4, poprzez wspólną ekspresję z h-sgk dochodzi do znacznego wzrostu prądu z ENaC. Tak więc kinaza stymuluje ENaC. Inhibitory kinazy staurosporyna i chelerytryna są zdolne do całkowitego zahamowania aktywacji ENaC przez h-sgk.

Stymulację nabłonkowych ENaC przez h-sgk odwrócić można poprzez wspólną ekspresję trans-dominującej hamującej kinazy h-sgk:

Jak to przedstawiono na fig. 5, stymulujące działanie wspólnej ekspresji h-sgk na mediowany ENaC prąd Na+ można zmniejszyć przez wspólną ekspresję trans-dominującej hamującej kinazy. Trans-dominująca kinaza hamująca (por. „definicje stosowanych pojęć) jest zmodyfikowana w jednostce katalitycznej w taki sposób, że zostaje pozbawiona swojej funkcji. Jednakże z uwagi na fakt, że wiąże się ona z substratem, zastępuje aktywną kinazę i w ten sposób hamuje jej działanie. Transdominująca kinaza hamująca nie tylko nasila aktywność ENaC powodowaną egzogenną h-sgk, lecz również najwyraźniej hamuje stymulację endogenną h-sgk.

Wspólna ekspresja z h-sgk całkowicie blokuje MDEG:

Jak to przedstawiono na fig. 6, ekspresja MDEG w oocytach indukuje silny prąd Na+, aktywowany zmniejszającym się pH zewnątrzkomórkowym. Kanał zostaje całkowicie zablokowany poprzez wspólną ekspresję z h-sgk. Należy stąd wyciągnąć wniosek, że h-sgk hamuje pobudliwość neuronów.

PL 198 427 B1

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Hybrydyzacja in situ

Tkanki pochodzące z prawidłowej trzustki, wątroby, naczyń, mózgu, płuca, nerki i jelita, oraz tkanki uzyskane od chorych na nefropatię cukrzycową, stwardnienie tętnic, chorobę Alzheimera, marskość wątroby, chorobę Crohna, włókniejące zapalenie trzustki oraz zwłóknienie płuc zatapiano w parafinie w 4% paraformaldehydzie/0,1 M buforze, fosforanie sodowym (pH 7,2) na 4 godziny. Skrawki tkankowe oczyszczano z wosku i hybrydyzowano znanym sposobem (Kandolf R., D. Ameis, P. Kirschner, A. Canu, P.H. Hofschneider, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6272-6276, 1987; Hohenadl C., K. Klingel, J. Mertsching, P. H. Hofschneider, R. Kandolf, Mol. Cell. Probes 5: 11-20, 1991; Klingel K., C. Hohenadl, A. Canu, M. Albrecht, M. Seemann, G. Mall, R. Kandolf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 314-318, 1992).

Mieszanina hybrydyzacyjna zawierała znakowany ³⁵S sensowny RNA kodujący h-sgk lub znakowany ³⁵S anty-sensowny RNA, komplementarny do niego (500 ng/ml każdego) w 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50% (stosunek objętościowo-objętościowy) dejonizowanego formamidu; 600 mM NaCl, 1 mM EDTA; 0,02% poliwinylopirolidonu; 0,02% Ficoll; 0,05% płodowej albuminy surowicy cielęcej; 10% siarczanu dekstranu; 10 mM ditiotreitolu; 200 ng/ml denaturowanego i sonifikowanego DNA spermy łososia oraz 100 ng/ml RNA wątroby szczura.

Hybrydyzację z próbkami RNA prowadzono w temperaturze 42°C przez 18 godzin. Skrawki płukano zgodnie z wcześniejszym opisem (Hohenadl i wsp., 1991; Klingel i wsp., 1992), a następnie inkubowano w 2x standardowym cytrynianie sodowym w temperaturze 55°C przez 1 godzinę. Niehybrydyzowane jednoniciowe próbki RNA trawiono RNA-zą A (20 ng/ml) w 10 mM Tris-HCI, pH 8,0/0,5 M NaCl w temperaturze 37°C przez 30 min. Próbki tkankowe następnie poddawano autoradiografii przez trzy tygodnie (Klingel i wsp., 1992) i barwiono hematoksyliną/eozyną.

P r z y k ł a d 2: Transkrypcyjna regulacja biglikanu i h-sgk

Komórki hodowano w RPMI/5% CO2/10 mM glukozy w temperaturze 37°C, pH 7,4 z dodatkiem 10% (stosunek objętościowo-objętościowy) płodowej surowicy cielęcej (FCS). Komórki hodowano do ⁹⁰% konfiuencjr a nas^tępnto ^homo^gemzowano w ^TRIZOL (^GIBC^O/B^RL) (okoto Ο,ΜΟ⁶ na ^pr^óbkę). Całkowite RNA wytwarzano zgodnie z instrukcjami producenta. Bloty Northern frakcjonowano przy pomocy elektroforezy na żelu agarozowym 10 g/l z 15 lub 20 ng całkowitego RNA z oddzielną kontrolą w obecności 2,4 mol/l formaldehydu. RNA przenoszono przy pomocy podciśnienia (Appligene Oncor Trans DNA Express Vacuum Blotter, Appligine, Heidelberg, Niemcy) na naładowane dodatnio błony nylonowe (Boehringer Mannheim, Niemcy) i tworzono wiązania krzyżowe pod światłem ultrafioletowym (UV Stratalinker 2400, Stratagene, Heidelberg, Niemcy). Hybrydyzację prowadzono przez noc z DIG-Easy-Hyb (Boehringer Mannheim) w stężeniu próbki 25 μ-g/l w temperaturze 50°C. Znakowane digoksygeniną (DIG) próbki wytwarzano przy pomocy PCR, w sposób szczegółowo opisany w literaturze (Waldegger i wsp. (1997) PNAS 94: 4440-4445). Dla autoradiografii filtry eksponowano na kliszy rentgenowskiej (Kodak) przez średnio 5 min.

P r z y k ł a d 3: Doświadczenia z zastosowaniem techniki zacisku napięciowego z dwoma elektrodami i przepływu znacznika

Sekcję Xenopus laevis oraz pozyskanie i obróbkę oocytów opisano w literaturze (Busch i wsp., 1992). Do każdego oocytu wstrzykiwano 1 ng cRNA NKCC, ENaC lub MDEG, z równoczesnym wstrzyknięciem h-sgk lub bez. W 2-8 dni po iniekcji można było wykonać pomiary napięcia i natężenia metodą zacisku napięciowego z dwoma elektrodami. Napływ Na+, który można było zahamować furosemidem, mierzono poprzez wychwyt 22_Na+ przez oocyty, mierzony licznikiem scyntylacyjnym. Prądy Na+ (ENaC) filtrowano przy 10 Hz i rejestrowano na rejestratorze. Doświadczenia wykonywano zazwyczaj drugiego dnia po wstrzyknięciu cRNA. Roztwór, w jakim zanurzone były oocyty zawierał: 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCh, 1 mM MgCh oraz 5 mM HEPES, pH 7,5, a potencjał wyjściowy wynosił -50 mV. pH dostosowywano poprzez miareczkowanie HCl lub NaOH we wszystkich doświadczeniach. Szybkość przepływu płynu, w którym były zanurzone oocyty ustawiono na 20 ml/min, co zapewniało pełną wymianę roztworu w komorze, w której wykonywano pomiary w czasie 10-15 sek. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie arytmetyczne ± SEM.

Opis figur: ·

Figura 1: Stymulacja ekspresji h-sgk przez TGF-β-ι:

Ekspresja h-sgk jest stymulowana TGF-β-ι, pokazano wpływ TGF-β-ι po 0,5-6 godz. (góra). Ester forbolu PDD (12,13-didekanian 4-a-forbolu; stymuluje kinazę białkową C) oraz jonofor Ca++ inomycyna (Sigma, powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca++ również stymulują ekspresję h-sgk (poniżej).

PL 198 427 B1

Figura 2: Stymulacja ekspresji biglikanu przez TGF-β-:

Ekspresja biglikanu (B) stymulowana jest obrzękiem osmotycznym komórek (hypo = h, na górze po lewej stronie) oraz przez TGF-β- (na górze po prawej). Wpływ TGF-β- na ekspresję biglikanu jest niemal całkowicie zahamowany w obecności inhibitora NKCC, bumetanidu (b) (kontrola = c).

Figura 3: Stymulacja NKCC przez h-sgk:

Wychwyt 22_Na+ w oocytach, w których ekspresji ulega NKCC i który można zahamować furosemidem [wychwyt (nmol/20 min/oocyt) = u] jest silnie stymulowany h-sgk. W oocytach, do których wstrzyknięto NKCC nie występuje wyższy napływ Na⁺ niż w oocytach, w których nie wstrzyknięto Na⁺ (n.i.). Ten napływ Na+ nie jest hamowany inhibitorem Na+, furosemidem (=F) (góra). Sama ekspresja h-sgk nie prowadzi do stymulacji napływu Na+. Wspólna ekspresja h-sgk z NKCC prowadzi do znacznego wzrostu napływu Na+, a wzrost ten jest całkowicie zahamowany przez furosemid (poniżej).

Figura 4: Stymulacja ENaC przez h-sgk:

Prąd płynący przez ENaC (I) silnie wzrasta wskutek wspólnej ekspresji h-sgk. Traktowanie oocytów inhibitorami kinazy - staurosporyną (S) lub chelerytryną (C) - hamuje aktywację kanału Na+, zachodzącą na skutek h-sgk.

Figura 5: Stymulację ENaC przez h-sgk można odwrócić poprzez wspólną ekspresję transdominującej kinazy hamującej:

Oocyty, w których występuje równoczesna ekspresja ENaC i h-sgk, wykazują znacznie wyższe prądy (I) niż oocyty, w których ekspresji ulega jedynie ENaC. Równoczesna ekspresja transdominującej kinazy hamującej zmniejsza stymulację ENaC przez h-sgk.

Figura 6: Hamowanie MDEG przez h-sgk:

Prąd przez MDEG (I) wzrasta wraz z wydłużaniem inkubacji (dzień (T) --4). Prąd zostaje całkowicie zahamowany poprzez wspólną ekspresję h-sgk (szczyt = p, plateau = pl).

Claims (1)

1. Zastosowanie chelerytryny do wytwarzania leku do leczenia jednej lub większej liczby chorób wybranych z grupy obejmującej marskość wątroby, włókniejące zapalenie trzustki, włóknienie płuc, przewlekłe zapalenie oskrzeli, włóknienie po napromienianiu, twardzinę skóry i mukowiscydozę.