KR20250060305A - 인간화 항-il-1r3 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

서열번호 1의 항체 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, IL-1R3에 특이적으로 결합하는 항체. 상기 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 또한 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 상기 항체. 상기 질환 또는 장애는 자가면역 또는 자가염증성 질환 또는 장애일 수 있다.

Description

인간화 항-IL-1R3 항체 및 사용 방법
서열 목록
본 출원은 XML 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다.
기술분야
IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 1의 항체 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체. 또한 대상체에게 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
인터류킨-1(IL-1)은 선천성 면역 및 염증의 중심 매개체이다. 타입 1 IL-1 수용체(IL-1R1) 및 IL-1 수용체 보조 단백질(IL-1RAcP, IL-1R3으로도 알려짐)은 전부는 아니더라도 대부분의 IL-1 유도 효과를 매개하는 것으로 생각되는 기능성 IL-1 수용체 복합체를 형성한다. IL-1R1에 더하여, IL-1R3은 또한 이종이량체 IL-33 및 IL-36 수용체 복합체에 대한 수용체 소단위로서 역할을 한다. 따라서, IL-1R3은 IL-1 패밀리의 6개의 사이토카인(IL-1α, IL-36α, IL-33, IL-36β, IL-36γ 및 IL-1β)을 포함하는 3개의 신호전달 경로에서 역할을 한다. IL-1 패밀리 사이토카인은 광범위한 자극에 대한 국소 및 전신 면역 반응을 조정하는 역할을 하는 강력한 염증 매개체이다. 그러나 IL-1 패밀리 사이토카인 구성원에 의한 비정상적인 신호전달은 무수한 염증성 증후군, 자가면역 질환 및 암과 관련이 있다. 수용체 길항제, 미끼 수용체 및 신호전달 저해제를 통한 IL-1 패밀리 사이토카인 신호전달 경로의 엄격한 조절은 선천성 면역의 증폭과 통제되지 않는 염증 사이의 균형을 보장한다. IL-1 패밀리 신호전달 경로를 자가면역 질환에 관련시키는 인간 유전자 검증이 존재한다. IL-1R3의 저해가 3개의 신호전달 경로 모두를 저해할 수 있기 때문에, IL-1R3의 차단은 3개의 사이토카인 경로(IL-1, IL-33 및 IL-36)를 중화하고 단일 사이토카인 표적화로는 충분하지 않을 수 있는 적응증에서 효능을 부여하는 다중 표적화 전략이다. 따라서, 치료용 항-IL-1R3 항체의 개발이 필요하다. 수년 동안, 인간 IL-1R3에 대한 기능성 단클론성 항체(mAb)를 생성하려는 시도가 이루어졌다. 그러나, 개선된 항-IL-1R3 항체가 필요하다. 특히, 다른 세포 경로에 영향을 미치지 않고 3개의 신호전달 경로의 우수한 저해 측면에서 장점을 갖는 항-IL-1R3 항체가 필요하다.
제1 양태에서, 서열번호 1의 항체 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, IL-1R3에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
제2 양태에서, 제1 양태의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
제3 양태에서, 제1 양태의 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 제공된다.
제4 양태에서, 제3 양태의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
제5 양태에서, 제4 양태의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
제6 양태는 (i) 선택적으로, 제3 양태의 단리된 핵산 분자 또는 제4 양태의 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포에 형질주입하는 단계; (ii) 숙주 세포를 항체의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계; (iii) 항체를 회수하는 단계; 및 (iv) 선택적으로, 추가로 항체를 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계를 포함하는, 제1 양태의 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
제7 양태는 제6 양태에 따른 제조 방법에 의해서 생산된 항체에 관한 것이다.
제8 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제1 양태의 항체에 관한 것이며, 바람직하게는 질환 또는 장애는 자가면역 또는 자가염증성 질환 또는 장애이다.
제9 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제2 양태의 약제학적 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 질환 또는 장애는 자가면역 또는 자가염증성 질환 또는 장애이다.
제10 양태에서, 대상체에게 제1 양태의 항체 또는 제2 양태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
본 개시내용의 전술한 특징 및 이점과 기타 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 취해지는 예시적인 실시형태에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다.
도 1은 형질주입 후 50 nM 메토트렉세이트(MTX) 선택된 풀(pool)의 항-IL-1R3 항체 역가를 도시한다. 풀은 L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG1(IgG1-LALA) 또는 S228P, F234A, 및 L2345A 돌연변이를 갖는 IgG4(IgG4-P-FALA)의 Fc 영역을 포함하는 항-IL-1R3 항체를 발현한다.
도 2는 대조군(IgG1 항체)과 비교하여 IgG1-LALA 형식의 항-IL-1R3 항체가 FcγR III(도 2a 및 도 2b[V176F 돌연변이체]) 및 FcγRI(도 2c)에 대한 잔기 결합 활성을 갖지만 IgG4-P-FALA 형식의 동일한 항-IL-1R3 항체는 Fcγ 수용체 I 또는 III에 결합하지 않는다는 것을 입증한 표면 플라스몬 공명(SPR) 센서그램을 도시한다 도 2a, 도 2b 및 도 2c 모두에서, x축은 초(s) 단위의 시간을 도시하고, y축은 응답 단위(RU)의 반응을 도시하며, 여기서, 0은 포획 기준선을 의미한다.
도 3은 항체의 Fc 영역에 대한 효과기 세포의 결합을 결정하는 세포 기반 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 분석을 도시한다. IgG1-LALA 형식의 항-IL-1R3 항체(도 3a 및 도 3b[EFF-20-074-1])는 IgG1 형식(즉, WT)[FF-20-2050-1]과 비교하여 유의하게 감소된 ADCC 활성을 나타낸 반면, IgG4-P-FALA 형식[EFF-20-075-1]은 Fc 수용체에 대한 효과기 세포의 결합이 없는 완전한 침묵을 초래하였다.
인간 면역글로불린 G 아이소타입 4(IgG4) 항체(ABS)는 감소된 효과기 기능이 바람직할 때 면역요법에 대한 잠재적 후보이다.
IgG4 Ab의 Fc 영역에서의 특정 돌연변이는 효과기 기능을 추가로 감소시킬 수 있다. EU 인덱스에 따른 IgG4 잔기 234 및 235(Proc Natl Acad Sci US A. 1969, 63 (1), 78-85; Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition)는 234번 위치의 페닐알라닌이 알라닌(F234A)으로 변경되고 235번 위치의 류신이 알라닌(L235A)으로 변경되도록 돌연변이될 수 있다(Parekh et al. 2012 - 문헌 인용 부분 참조). 이러한 항체 돌연변이는 FALA 돌연변이라고 한다. 그러나, IgG4 Ab는 잠재적으로 감소된 치료 효능을 갖는 기능적으로 1가의 이중특이적 항체(bsAb)를 생성하는 Fab 아암 교환(FAE)을 겪을 수 있는 동적 분자이다. IgG4의 228번 위치의 아미노산 잔기 세린(S228) 및 409번 위치의 아르기닌은 FAE를 구동한다(Labrijn et al., 2011 - 문헌 인용 부분 참조). S228을 프롤린으로 치환(S228P)하면 IgG4 FAE를 예방하여 IgG4 Ab를 안정화하는 것으로 나타났다(Angal et al., 1993; Silva et al., 2015 - see Literature Cited section). 위에 언급된 FALA 돌연변이 및 S228P 돌연변이는 항체의 불변 영역 내로 동시에 도입될 수 있다. FALA 돌연변이를 갖는 IgG4 중쇄는 "IgG4 FALA" 유형 중쇄로 지칭되고, S228P 돌연변이를 갖는 IgG4 중쇄는 "IgG4-P" 유형 중쇄로 지칭되고, FALA 돌연변이 및 S228P 돌연변이 둘 다를 갖는 IgG4 중쇄는 "IgG4-P-FALA" Ab로 지칭된다.
WO 2017191325A1(Fischer et al., MAB Discovery GmbH)은 IL-1R3 또는 이의 단편 또는 유도체에 특이적으로 결합하고 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A("IgG1-LALA" 형식) 또는 인간 lgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E("IgG4-PE" 형식)에서의 치환을 구체적으로 기술하는 인간화 항체에 관한 것이다.
본 명세서의 배경 부분에 개략적으로 설명된 바와 같이, IL-1R3에 대해 높은 친화도, 높은 특이성 및 강력한 중화 활성을 갖는 mAb를 식별하는 것은 극도로 어렵다. 놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 항체를 개발하였고, 이 항체는 추가적인 장점을 갖는다. 본 개시내용은 강력한 IL-1R3 중화 활성, 감소된 효과기 기능 및 개선된 안정성으로 IL-1R3에 대해 높은 친화도 및 특이성을 갖는 인간화 IL-1R3 항체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 항체는 Fcγ-수용체 신호전달이 감소되거나 존재하지 않으며, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도하지 않는다. 놀랍게도, 본 명세서에 개시된 항체는 보다 일반적인 IgG1-LALA 형식과 비교하여 IgG4-P-FALA 형식에서 유의하게 더 높은 생산 수율을 갖는다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 항체가 산업적으로 유용하기 위해서는, 이는 유리한 특정 특징을 갖는 조성물에 혼입될 수 있어야 한다. 예를 들어, 조성물은 보존제가 항체에 대한 영향 없이 사용될 수 있다는 점에서 시간 경과에 따라 안정적이어야 한다. 조성물의 점도 및 유백광은 특정 파라미터 내에 유지되어야 하며, 예를 들어, 저장 동안 시간 경과에 따라 변화되지 않아야 한다. 항체의 3D 구조는 이의 기능 및 표적에 대한 결합에 중요하다. 따라서, 이는 조성물에서 응집(자가-회합)되지 않거나 최소한으로 응집되어야 하며, 조성물 중의 다른 부형제는 항체의 3D 구조의 변화를 유도하거나 자가-회합을 증가시켜서는 안 된다. 특히 중요한 것은 등전점 및 자가-회합 값이며, 둘 다 표준 희석 조성물의 항체뿐만 아니라 농축 조성물의 유백광 값이다. 항체가 상업적 규모로 사용하기 위해 제형화될 수 있도록 다양한 파라미터에 대해 벤치마크 내성 윈도우가 충족될 필요가 있다.
일반적으로, 더 높은 등전점은 더 높은 항체 안정성과 상관관계가 있고, 자가-회합에 대한 더 낮은 kD 값은 더 높은 친화도와 상관관계가 있으며, 따라서 자가-회합에 대한 가능성이 더 높고, 더 높은 탁도 값(NTU)은 투명한 용액이 중요하기 때문에 덜 바람직하다. IgG1 또는 IgG4 Fc 형식의 일련의 상이한 항체에 대한 중앙값(아래 표 1 참조)에 대해 이해될 수 있는 바와 같이, 후자의 형식은 제형성 파라미터에 대해 덜 바람직한 값을 초래하는 경향이 있다. 놀랍게도, 본 명세서에 개시된 항-IL-1R3-IgG4-P-FALA Ab는 값이 상업적 규모로 실행 가능하기에 중앙값에 충분히 근접하였다는 점에서 벤치마크 윈도우를 충족하였다.
당업계의 몇몇 항-IL-1R3 항체 및 다른 IL-1/IL-33/IL-36 수용체 슈퍼패밀리-표적화 항체가 본 개시내용의 IgG4-P-FALA Fc를 사용하지 않는 것이 주목할 만하다. 오히려, 이들 항체 중 다수는 IgG1-LALA Fc를 사용한다. 예를 들어, 항체 CAN04(미국 특허 제9796783호(Ågerstam 등)에 기재됨), 항체 CAN10(WO2022/136569 A1(Liberg 등)에 기재됨) 및 스페솔리맙(항-IL-36R, 문헌[Chenoweth et al. Immunol Cell Biol. 2020. 98(4): 287-304]에 기재됨) 모두는 IgG1-LALA Fc를 사용한다. 이는 WO2022/053715 A1(Macoin 등), WO2022/170008 A2(Bigwarfe 등) 및 WO2022/243536 A1(Urso 등)에 개시된 항-IL-1R3 항체에도 동일하게 적용되며, 이들 모두는 IgG1-LALA Fc를 사용한다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 항체가 항-IL-1R3 항체에 대해 일반적으로 사용되는 IgG1-LALA 형식과 비교하여 실질적으로 더 높은 생산 수율을 갖는다는 것을 발견하였다.
본 개시내용은 인간 IgG4 Fc 영역의 적어도 아미노산 치환 S228P, F234A 및 L235A를 포함하는 항-IL-1R3 항체를 기재한다. 특히, 본 개시내용은 IL-1R3에 특이적으로 결합하고 Fcγ-수용체 신호전달이 감소되거나 없는 서열번호 1의 항체 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 개시내용의 양태는 이하에서 더 상세히 기술된다.
I. 정의 및 제1 양태의 항체
달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질은 본 개시내용의 기술의 방법에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 공개 문헌들은 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있는 공개 문헌에 보고된 방법론, 시약 및 도구를 기술하고 설명할 목적으로 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 출원의 방법 및 기술은 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전반에서 인용되고 논의된 다양한 일반적인 참조 및 더 구체적인 참조에 기술된 대로 일반적으로 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌[Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. and Blackwell, C.C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R. and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed., Springer-Verlag]을 참조한다.
용어 "항체"는 달리 지시되지 않는 한, 전체 항체 및 이러한 항체의 항원-결합 단편을 지칭하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 이 용어는 4-쇄 IgG 분자 및 항체 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 전장 항체의 일부를 지칭하며, 하기에 더욱 상세히 후술한다.
자연 발생 면역 글로불린들은 공통 코어 구조를 가지며, 여기에서 2개의 동일한 경쇄(약 24 kDa) 및 2개의 동일한 중쇄(약 55 내지 70 kDa)가 사량체(tetramer)를 형성한다. 각각의 쇄의 아미노 말단부는 가변(V) 영역으로 알려져 있고, 각각의 쇄의 잔여부 중 보다 보존된 불변(C) 영역과 구별될 수 있다.
면역글로불린의 아미노산 서열 변형(variation) 대부분은 초가변 영역으로 알려진 V 영역 또는 항원 결합에 직접 관련되는 상보성 결정 영역(CDR) 각각에서 3개의 개별 위치로 제한된다. 아미노-말단에서 시작하여, 이들 영역을 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3라고 한다. CDR은 보다 보존된 프레임워크 영역(FR)에 대해 제자리에 위치한다. 아미노-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4라고 한다. 아미노-말단에서 시작하여, V 영역에 포함된 이들 조합된 영역은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4라고 한다. CDR 및 FR 영역의 위치 및 넘버링 체계는 Kabat 등(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991) 및 온라인에서 찾을 수 있는 이들의 업데이트)에 의해 정의되어 있다. 또한 CDR 영역 경계선은 IMGT 명명법에 의해 더 정의된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인간화 mAb"는 비인간 항체로부터 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이 이식된 인간 항체 프레임워크로 구성된 항체이다. 인간 수여자 프레임 워크 내에 변경이 또한 일어날 수 있다. 인간화 항체의 설계 및 생산에 대한 절차는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, US4816397(Boss 등); US4816567(Cabilly 등); US5225539(Winter, MRC); EP0120694A2(Boss 등); EP0125023A1(Cabilly 등); EP0194276B1(Neuberger 및 Rabbitts); EP0239400A2(Winter, MRC); EP0519596A1(Padlan 등); 및 WO1986001533(Neuberger 및 Rabbitts)에 기재되어 있다. 항체, 인간화 항체, 인간 조작된 항체 및 이의 제조 방법에 대한 추가 상세 사항은 문헌[Kontermann, R. and Dijbel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY]에서 찾아볼 수 있다. 위에 열거된 특허 및 특허 출원 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
불변 영역은 임의의 인간 항체 불변 영역에서 유래될 수 있다. 가변 영역 유전자는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위해 불변 영역 유전자와 함께 프레임내에서 발현 벡터내로 클로닝될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 항체 합성을 위해 숙주 세포를 생산하는 항체가 형질주입될 수 있다.
인간 항체 가변 영역 및 불변 영역은 서열 데이터베이스에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 서열은 IMGT/LIGM 데이터베이스(Giudicelli et al., [2006] Nucleic Acids Res. 34 [suppl. 1]: D781-D784) 또는 VBase 30(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)에서 입수 가능하다. 비글리코실화된 항체는 광범위하게 변형된 기능성을 가질 수 있다(문헌[Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318] 참조]. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "델타 AB" 또는 ΔAB 변형은 문헌[Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613-2624]에 기재된 바와 같은 Fc 변형이다.
결합 폴리펩티드의 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "안정적인", "안정성" 및 "안정화된"은 주어진 제조, 제법, 운송 및 저장 조건하에서 열적 및 화학적 분해 또는 단편화에 대한 결합 폴리펩티드의 저항성을 지칭한다. "안정적인" 조성물은 주어진 제조, 제법, 운송 및 저장 조건하에서 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 이상의 생물학적 활성을 보유한다. 결합 폴리펩티드의 안정성은, 예를 들어, 분해 또는 단편화 정도 또는 특정 단편 수준 또는 응집체의 유형 또는 크기와 측면에서 당업자에게 알려진 방법 및 측정을 사용하여 대조군과 비교하거나 출발 물질과 비교하여 평가될 수 있다. 이러한 방법 및 측정은 참조군과 비교하여 감소된 곡선하 면적(AUC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 고성능(또는 고압) 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC), 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS), 모세관 겔 전기영동(CGE), 및 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "핵산"은 본 명세서에 기재된 항체를 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 본 명세서에 기재된 항체를 암호화하는 바람직한 DNA 분자는 숙주 세포에서 항체 유전자를 발현하기에 적합한 발현 벡터이다. 항체 유전자 발현을 위한 발현 벡터 및 숙주 세포는 본 기술분야에서 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Morrow, K.J. Genetic Engineering & Biotechnology News (June 15, 2008) 28(12) 및 Backliwal, G. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15):e96-e96] 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다" 및 "치료"는 질환, 장애 또는 병태를 갖는 환자 또는 대상체의 치료를 지칭한다. 치료는 다음 중 임의의 하나 또는 임의의 조합에 관한 것이지만 이들로 제한되지 않는다: 질환, 장애 또는 병태의 치유; 질환, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 증상의 개선; 및/또는 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하거나 감소시키는 것을 목적으로 하는 예방적 또는 예방용 행위. 특정 실시형태에서, 치료는 질환, 장애 또는 병태의 치유; 또는 질환, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 증상의 개선에 관한 것일 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 마우스, 래트, 게르빌(gerbil), 햄스터, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말 및 영장류를 포함하는 임의의 포유동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간 이외의 포유동물이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 비인간 영장류이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
제1 양태는 서열번호 1의 항체 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, IL-1R3에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
적어도 하나의 실시형태에서, 항체는 인간화 mAb이다. 적어도 하나의 실시형태에서, 항체는 항-IL-1R3 항체이다.
인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)은 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 항체 불변 영역(예를 들어, 인간 IgG4 불변 영역)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 불변 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증성 반응을 자극하고 자가면역 과민증에도 관여할 수 있다. 또한, IgG4 항체는 세포상의 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 항체 Fc 영역상의 Fc 수용체 결합 자리를 갖는 Fc 영역을 통하여 다양한 세포 상의 수용체에 결합한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(항체-의존적 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC로 불림), 염증성 매개체의 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생산의 제어를 비롯한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
특정 실시형태에서, 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)은 하나 이상의 효과기 기능(예를 들어, ADCC 활성)을 유도할 수 없고/없거나 Fcγ(Fc 감마) 수용체에 결합할 수 없는 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 실시형태는 목적하는 생화학적 특징, 예컨대, 감소된 효과기 기능을 제공하도록 불변 영역 도메인 중 하나 이상에서 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나 달리 변경된 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)을 제공한다.
특정 다른 실시형태에서, 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)은 분자의 코어 힌지 영역 내에 인간 IgG4 분자 및 Ser228Pro(S228P) 돌연변이(EU 넘버링)로부터의 Fc 영역 또는 이의 부분을 포함한다.
특정 예시적인 실시형태에서, 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)의 Fc 부분은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 효과기 기능을 증가시키거나 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해)는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 개시내용과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시킴으로써 접합된 세포독소의 혈청 반감기 및 비특이적 회합을 감소시킬 수 있다. 이황화 연결 또는 올리고당 모이어티를 변형시키기 위해 불변 영역의 또 다른 변형이 사용될 수 있고 이는 증가된 항원 특이성 또는 유연성으로 인해 국재화를 향상시킬 수 있다. 변형의 결과적인 생리학적 프로파일, 생체이용성, 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 종양 국소화, 생체분포, 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 잘 알려진 면역학적 기법을 사용하여 쉽게 측정되고 정량화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)에 사용되는 Fc 도메인은 Fc 변이체이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 변이체"는 상기 Fc 도메인이 유래된 야생형 Fc 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인을 지칭한다.
Fc 변이체의 아미노산 치환(들)은 Fc 도메인 내의 임의의 위치(즉, 임의의 EU 관례 아미노산 위치)에 위치할 수 있다. 일 실시형태에서, Fc 변이체는 힌지 도메인 또는 이의 부분에 위치한 아미노산 위치에 치환을 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 변이체는 CH2 도메인 또는 이의 부분에 위치한 아미노산 위치에 치환을 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 변이체는 CH3 도메인 또는 이의 부분에 위치한 아미노산 위치에 치환을 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 변이체는 CH4 도메인 또는 이의 부분에 위치한 아미노산 위치에 치환을 포함한다.
P-FALA Fc 돌연변이 이외에, 본 명세서에 기재된 항체는 효과기 기능 및/또는 FcR 결합을 개선(예를 들어, 감소)하는 것으로 알려진 임의의 다른 당분야에 인식된 Fc 변이체를 채용할 수 있다. 상기 Fc 변이체는 예를 들어, 각각 참조로서 본 명세서에 포함된 국제 PCT 공개 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 및 WO06/085967A2 또는 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 및 제7,083,784호에 개시된 아미노산 치환 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)은 항체의 항원 독립적 효과기 기능, 특히 항체의 순환 반감기를 변경하는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 이러한 치환이 결여된 항체에 비교하여 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 증가하거나 감소된 결합을 나타내며, 따라서, 혈청 내에서 각각 증가하거나 감소된 반감기를 가진다. FcRn에 대한 개선된 친화도를 갖는 Fc 변이체는 더 긴 혈청 반감기를 가지는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 투여되는 항체의 반감기가 긴 것이 바람직한 포유동물의 치료, 예컨대, 만성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법에 유용하게 적용된다. 반대로, 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 Fc 변이체는 더 짧은 반감기를 가지는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 또한, 예를 들어, 단축된 순환 시간이 유리할 수 있는 포유동물에 대한 투여, 예컨대, 생체내 진단 영상화 또는 출발 항체가 연장된 기간 동안 순환계에 존재하는 경우 독성 부작용을 가지는 상황에 유용하다. FcRn에 결합 친화성이 감소된 Fc 변이체는 태반을 가로지를 가능성도 적으므로, 임산부의 질환 또는 장애를 치료하는 데에도 유용하다. 추가로, 감소된 FcRn 결합 친화도가 바람직할 수 있는 다른 적용예는 뇌, 신장 및/또는 간으로의 국소화가 바람직한 적용예를 포함한다.
제1 양태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 1의 항체 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체가 제공된다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 3의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 4의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 항체 중쇄 가변(VH) 도메인, 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며,
VH 도메인은
SYDMS(서열번호 5) 또는 GFSLSSYD(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열;
TIYIGGTTAYASWPKG(서열번호 7) 또는 IYIGGTT(서열번호 8)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열; 및
LQGANYYNSLAL(서열번호 9) 또는 ARLQGANYYNSLAL(서열번호 10)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고;
VL 도메인은
QASQSIYSFLS(서열번호 11) 또는 QSIYSF(서열번호 12)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열;
ASDLES(서열번호 13) 또는 AAS(서열번호 14)의 아미노산 서열의 CDR-L2 서열; 및
QSNYIIDYGA(서열번호 15 또는 서열번호 16)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하고; IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환 및 L235A 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 항체 중쇄 가변(VH) 도메인, 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며,
VH 도메인은
SYDMS(서열번호 5) 또는 GFSLSSYD(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열;
TIYIGGTTAYASWPKG(서열번호 7) 또는 IYIGGTT(서열번호 8)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열; 및
LQGANYYNSLAL(서열번호 9) 또는 ARLQGANYYNSLAL(서열번호 10)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고;
VL 도메인은
QASQSIYSFLS(서열번호 11) 또는 QSIYSF(서열번호 12)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열;
ASDLES(서열번호 13) 또는 AAS(서열번호 14)의 아미노산 서열의 CDR-L2 서열; 및
QSNYIIDYGA(서열번호 15 또는 서열번호 16)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하고; IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 24의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 29의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 25의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 30의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 25의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 31의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 25의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 32의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 26의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 30의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 26의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 31의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 26의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 32의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 27의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 30의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 27의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 31의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 27의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 32의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 28의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 30의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 28의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 31의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 28의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 32의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 33의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 34의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 35의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 36의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 37의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 44의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 38의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 45의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 39의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 46의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 40의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 47의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 41의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 48의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 42의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 49의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, IL-1R3에 특이적으로 결합하고 서열번호 43의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열, 서열번호 50의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항체가 제공되며, IgG4 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, F234A 치환, L235A 치환 및 S228P 치환을 포함한다.
II. 항체 생산 및 이와 관련된 추가 양태
항체 생산은 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 항체는 화학적 합성에 의해서 또는 숙주 세포, 예를 들어, 세포주, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주 또는 인간 배아 신장(HEK) 세포주에서 항체를 암호화하는 유전자의 발현에 의해 생산될 수 있다.
제3 양태는 제1 양태의 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 제1 양태의 항체에 대한 추가 상세사항에 대해서는 위 부분 I의 개시내용을 참조한다.
제4 양태는 제3 양태의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
제5 양태는 제4 양태의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 제1 양태의 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이고, 바람직하게는 숙주 세포는 CHO DXB11 세포이다.
제6 양태는 (i) 선택적으로 제3 양태의 단리된 핵산 분자 또는 제4 양태의 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포에 형질주입하는 단계; (ii) 숙주 세포를 항체의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계; (iii) 항체를 회수하는 단계; 및 (iv) 선택적으로 추가로 항체를 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계를 포함하는 제1 양태의 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 제조 방법은
(i) 제3 양태의 단리된 핵산 분자 또는 제4 양태의 발현 벡터를 사용하여 중국 햄스터 난소 CHO) 세포인 숙주 세포에 형질주입하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 숙주 세포는 CHO DXB11 세포이다.
제조 방법의 일 실시형태에서, 항체의 발현 수준은 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항-IL-1R3 항체의 발현 수준보다 더 높고, 바람직하게는 상기 인간 IgG1 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 제조 방법의 일 실시형태에서, 항체의 발현 수준은 서열번호 18의 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-1R3 항체의 발현 수준보다 더 높다. 제조 방법의 일 실시형태에서, 항체의 발현 수준은
- 서열번호 18의 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 및
- 서열번호 4의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-1R3 항체의 발현 수준보다 더 높다.
제조 방법의 일 실시형태에서, 항체의 발현 수준은
- 서열번호 18의 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 및
- 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-1R3 항체의 발현 수준보다 더 높다.
일 실시형태에서, 제조 방법은
(iv) 추가로 항체를 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 실시형태에서, 제형화하는 단계는 항체를 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 배합하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 단계 (iv)는 제2 양태에 따른 약제학적 조성물을 초래한다.
일 실시형태에서, 제조 방법은 제1 양태에 따른 항체를 생산한다. 제조 방법의 일 실시형태에서, 항체의 발현 수준은 중쇄가 EU 넘버링에 따른, 아미노산 치환 L234A 및 L235A을 갖는 인간 IgG1 Fc 영역이라는 것만 상이한 동일한 항-IL-1R3 항체의 발현 수준보다 더 높다.
제7 양태는 제6 양태에 따른 제조 방법에 의해서 생산된 항체에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 생산된 항체는 제1 양태에 따른다.
인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 단리되고, 숙주 세포에서의 추가 전파 또는 발현을 위해서 복제 가능한 작제물 또는 벡터, 예컨대, 플라스미드에 삽입된다. 기재된 실시형태에 따른 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)의 발현에 적합한 작제물 또는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 당업계에서 이용 가능하다. 다양한 벡터가 이용 가능하고, 숙주 세포에서 단일의 카피 또는 다중 카피로 유지되거나 숙주 세포의 염색체(들) 내로 통합되게 되는 벡터를 포함한다. 작제물 또는 벡터는 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있고, 인간화 면역글로불린을 발현하는 세포는 생산되어 배양에서 유지될 수 있다. 단일 벡터 또는 다중 벡터를 인간화 면역글로불린을 발현시키기 위해 사용할 수 있다.
인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 종래의 절차(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브)를 사용하여 쉽게 단리되고 서열결정된다. 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포존, 미니크로모좀을 포함할 수 있으며, 이중 플라스미드가 통상적인 실시형태이다. 일반적으로 이러한 벡터는 발현을 촉진하기위해 추가적으로 경쇄 및/또는 중쇄 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되는 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 동시에 또는 순차적으로 동일한 숙주 세포 내로 (예를 들어, 형질전환, 형질주입, 전기천공 또는 형질도입에 의해) 도입될 수 있으며, 바람직한 경우, 이러한 도입 이전에 중쇄 및 경쇄 모두가 동일한 벡터 내로 삽입될 수 있다.
프로모터는 적절한 숙주 세포에서의 발현을 위하여 제공될 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 예컨대, 프로모터는 인간화 면역글로불린 또는 면역글로불린 쇄를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결되어, 이것은 암호화된 폴리펩티드의 발현을 지시할 수 있다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주를 위해 다양하고 적절한 프로모터가 이용 가능하다. 원핵 프로모터는 이. 콜라이(E. coli)를 위한 lac, tac, T3, T7 프로모터; 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프락토키나제, 글루코스 6 포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 및 글루코키나제를 포함한다. 진핵 프로모터는 유도성 효모 프로모터, 예컨대, 알코올 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 메탈로티오네인 및 질소 대사 또는 말토스/갈락토스 이용에 필요한 효소; 폴리오마(polyoma), 계두(fowlpox) 및 아데노바이러스(예를 들어, 아데노 바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 사코마 바이러스, 시토메갈로 바이러스(특히, 즉시 조기 유전자 프로모터), 레트로 바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터 및 조기 또는 지연 시미안 바이러스 40와 같은 바이러스 프로모터 및 EF-1 알파와 같은 비-바이러스 프로모터를 포함하는 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 포함한다(Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322). 본 발명의 당업자는 인간화 항체 또는 그 일부의 발현을 위한 적합한 프로모터를 선택할 수 있다.
적절한 경우, 예컨대 더 고도의 진핵 세포에서의 발현을 위해 전술한 프로모터에 위치한 것 대신 또는 함께 추가적인 인핸서 요소가 포함될 수 있다. 적절한 포유동물 인핸서 서열은 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 태아단백질, 메탈로티오네인 및 인슐린 유래 인핸서 요소를 포함한다. 또는 SV40 인핸서, 시토메갈로 바이러스 조기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 바큘로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 유전자좌 같은 진핵 세포 바이러스에서 유래한 인핸서 요소를 사용할 수 있다(WO2004009823(Kallmeier 및 Gay) 참조). 이러한 인핸서는 종종 프로모터에 대해 상부 위치에서 벡터상에 위치되지만, 다른 장소, 예컨대, 미번역 영역내 또는 폴리아데닐화 신호의 하류에 위치될 수 있다. 인핸서의 선택 및 위치 선정은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 친화성에 기초할 수 있다.
또는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 벡터를 운반하는 숙주 세포의 선택을 위한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 벡터의 경우에, 복제 기원을 포함할 수 있다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 암호화하는 유전자는 통상의 선택 가능한 마커이고 원핵(예를 들어, f3-락타마제 유전자(암피실린 내성), tet 유전자(테트라사이클린 내성) 및 진핵 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(마이코페놀산), 암피실린 또는 하이그로마이신 5 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디하이드로폴레이트 리덕타제 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트로 선택할 수 있다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 암호화하는 유전자(예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)는 종종 효모에서 선택 가능한 마커로서 사용된다. 바이러스(예를 들어, 바큐로바이러스) 또는 파지 벡터 및 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있는 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터의 사용이 또한 고려된다.
진핵 시스템에서, 폴리아데닐화 및 말단 신호는 본 명세서에 기재된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 신호는 전형적으로 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 3'에 위치된다. 포유동물 시스템에서, 폴리아데닐화/종결 신호의 비제한적인 예는 성장 호르몬, 신장 인자-1 알파 및 바이러스(예를 들어, SV40) 유전자 또는 레트로바이러스 긴 말단 반복부에서 유래된 것을 포함한다. 이스트 시스템에서, 폴리아데닐화/종결 신호의 비제한적인 예는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 및 알코올 데하이드로게나제 1(ADH) 유전자에서 유래된 것을 포함한다. 원핵생물 시스템에서, 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 요구되지 않고, 대신에 더 짧고 더 한정된 종결 서열을 채택하는 것이 일반적이다. 폴리아데닐화/종결 서열의 선택은 발현에 사용되는 숙주 세포와의 친화성에 기초할 수 있다. 전술한 것 이외에도, 수율을 상승시키기 위해 채용될 수 있는 다른 특징은 크로마틴 리모델링 요소, 인트론 및 숙주 세포 특이적 코돈 변경을 포함한다. 본 명세서에 기재된 항체의 코돈 용법은 숙주 세포의 코돈 바이어스(codon bias)를 수용하도록 변경되어 전사 및/또는 제조 수율을 증대시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoekema, A. et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7(8):2914-24]). 코돈의 선택은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포와의 친화성에 기초할 수 있다.
따라서 본 개시내용은 인간화 면역글로불린 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 면역 글로불린의 항원 결합 부분 및 이의 쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자와 관련된다.
인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)은 예를 들어, 적합한 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포주에서 항체를 암호화하는 하나 이상의 재조합 핵산의 발현에 의해서 생산될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 적합한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 발현 작제물(예를 들어, 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 포유동물 세포 발현 벡터)을 적절한 숙주 세포로 도입시킬 수 있고, 생성된 세포를 작제물(들) 또는 벡터(들)의 발현에 적절한 조건하에(예를 들어, 배양에서) 유지할 수 있다. 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대, 이. 콜라이(예를 들어, 균주 DH5α™)(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), PerC6(Crucell, 미국 네덜란드 레이던 소재), 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및/또는 다른 적합한 박테리아를 비롯한 원핵 세포; 진핵 세포, 예컨대, 고등 진핵생물의 세포, 예컨대, 포유동물로부터의 세포(예를 들어, COS 세포, 예컨대, COS-1(ATCC 수탁번호 CRL-1650) 및 COS-7(ATCC 수탁번호 CRL-1651), CHO(예를 들어, ATCC 수탁번호 CRL-9096), CHO DG44(Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220), 293(ATCC 수탁번호 CRL-1573), HEK, HeLa(ATCC 수탁번호 CCL-2), CVI(ATCC 수탁번호 CCL-70), WOP(Dailey, L., et al. (1985) J. Virol., 54:739-749), 3T3, 293T(Pear, W.S., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396), NS0 세포, SP2/0 세포, HuT 78 세포 등 또는 식물(예를 들어, 담배, 부평초(lemna)(개구리밥(duckweed)) 및 조류(algae))일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 다세포 유기체의 일부가 아니고, 예를 들어, 단리된 숙주 세포이거나, 세포 배양물의 일부이다.
숙주 세포는 스피너 플라스크, 진탕 플라스크, 롤러병(roller bottle), 웨이브 반응기(예를 들어, wavebiotech.com의 System 1000) 또는 중공 파이버 시스템에서 배양될 수 있으나, 대량 제조를 위해 바람직하게 교반 탱크 반응기 또는 백(bag) 반응기(예를 들어, Wave Biotech, 미국 뉴저지주 서머셋 소재)가 특히 현탁 배양을 위해 사용된다. 교반 탱크 반응기는 예컨대 스파져, 배플 또는 저전단 임펠러를 사용하여 에어레이션을 위해 개작될 수 있다. 버블 칼럼 및 에어 리프트 반응기를 위해, 공기 또는 산소 방울을 사용하는 직접 에어레이션이 사용될 수 있다. 숙주 세포가 무혈청 배양 배지에서 배양되는 경우, 배지는 에어레이션에 의해 초래되는 세포 손상을 방지하기 위해 플루로닉 F-68과 같은 세포 보호제로 보충될 수 있다. 숙주 세포의 특성에 따라서, 마이크로캐리어가 고정 의존성 세포주(anchorage dependent cell line)를 위한 성장 기재로서 사용될 수 있거나, 세포가 현탁 배양으로 조정될 수 있다. 숙주 세포, 특히 척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 공정 모드, 예컨대, 회분식, 유가식, 반복 회분식 공정(문헌[Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15:103-109] 참조), 연장 회분식 공정 또는 살포 배양 등을 사용할 수 있다. 재조합적으로 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 우태아 혈청(FCS)을 포함하는 배지와 같은 혈청 함유 배지에서 배양될 수 있지만, 바람직하게는 이러한 숙주 세포는 문헌[Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 개시된 바와 같은 무혈청 배지 또는 필요한 경우 글루코스와 같은 에너지 공급원 및 재조합 인슐린과 같은 합성 성장인자로 보충된 ProCHO™ 또는 UltraCHO™(Cambrex, 미국 뉴저지주 소재)와 같은 상업적으로 입수 가능한 배지에서 배양된다. 숙주 세포를 무혈청으로 배양하는 것은 이들 세포가 무혈청 조건에서 성장하는 데 적응할 것이 요구된다. 하나의 적응 접근법은, 숙주 세포가 무혈청 조건에서 적응하는 것을 학습할 수 있도록, 숙주 세포를 혈청 함유 배지에서 배양하고 반복적으로 80%의 배양 배지를 무혈청 배지로 교환하는 것이다(예를 들어, 문헌[Scharfenberg, K. et al. (1995) Animal Cell Technology: Developments Towards the 21st Century (Beuvery, E.C. et al., eds), pp.619-623, Kluwer Academic publishers] 참조).
기재된 실시형태에 따른 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)은 배지 내로 분비될 수 있으며, 다양한 기술을 사용하여 이를 회수 및 정제시켜 의도되는 사용에 적합한 정제 정도를 제공할 수 있다. 예를 들어, 인간 대상체의 치료를 위한 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)의 사용은 이러한 이 치료용 항체를 포함하는 배양 배지와 비교할 때, 일반적으로 환원 SDS-PAGE로 측정하여 적어도 95%의 순도, 보다 일반적으로는 98% 또는 99%의 순도를 요구한다. 제1 경우에, 배양 배지의 세포 잔해는 일반적으로 원심분리를 이용하여 제거되고, 이어서 예를 들어 미세여과, 한외여과 및/또는 심층 여과를 사용하여 상청액의 정제 단계가 실시될 수 있다. 대안적으로, 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)은 사전 원심분리 없이 미세연과, 한외여과 또는 심층 여과에 의해 수거될 수 있다. 다양한 다른 기술, 예를 들어, 투석 및 겔 전기영동법 및 크로마토그래피 기술, 예를 들어, 하이드록시아파타이트(HA), 친화성 크로마토그래피(선택적으로 친화성 태깅 시스템, 예를 들어, 폴리히스티딘을 포함함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)(미국 특허 제5,429,746호 참조)을 이용할 수 있다. 일 실시형태에서, 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)은 다양한 정화 단계 후에 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피를 이용하여 포집되고 이어서 추가 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전이 이루어진다. 다양한 바이러스 제거 단계(예를 들어, DV-20 필터 등을 사용한 나노여과)가 사용될 수 있다. 이러한 다양한 단계에 후속하여, 적어도 10 mg/mL 또는 그 이상, 예컨대 100 mg/mL 이상의 본 명세서에 기재된 항체를 포함하는 정제된 제제가 제공되며, 따라서 본 명세서에 개재된 다른 실시형태를 형성한다. 100 mg/mL 이상의 농도는 초원심분리로 생성될 수 있다. 이러한 제제에는 실질적으로 항체의 응집된 형태가 존재하지 않는다.
박테리아 시스템이 항체 단편의 발현에 특히 적합하다. 이러한 단편은 세포간(intracellularly)에 또는 주변세포질 내에 위치한다. 불용성 주변세포질 단백질은 당업자에 알려진 방법(문헌[Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72:13-20; Cupit, P.M. et al. (1999) Lett. Appl. Microbiol. 29:273-277] 참조)에 따라 추출되어 다시 접혀 활성 단백질을 형성할 수 있다.
제5 양태는 제4 양태의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 핵산, 예를 들어, 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 포함하는 세포(숙주 세포)에 관한 것이다. 예를 들어, 기재된 실시형태에 따른 인간화 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산(즉, 하나 이상의 핵산) 또는 이러한 핵산(들)을 포함하는 작제물(즉, 하나 이상의 작제물, 예컨대, 하나 이상의 벡터)은 선택된 숙주 세포에 적절한 방법(예를 들어, 형질전환, 형질주입, 전기천공, 감염)으로, 하나 이상의 발현 제어 요소(예를 들어, 벡터에서, 세포에서 가공에 의해 형성된 작제물, 숙주 세포 게놈에 통합됨)과 작동 가능하게 결합하거나, 발현 제어 요소가 되거나 또는 발현 제어 요소인 핵산(들)과 함께 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포는 발현에 적합한 조건하에(예를 들어, 유도인자(inducer), 적합한 염, 성장 인자, 항생제, 영양보조물 등이 보충된 적절한 배지의 존재하에) 유지될 수 있으며, 이에 의해 암호화된 폴리펩티드(들)가 생산된다. 목적하는 경우, 암호화된 인간화 항체는 예를 들어, 숙주 세포, 배양 배지 또는 우유에서 단리될 수 있다. 이 과정은 트랜스제닉 동물 또는 식물(예를 들어, 담배)의 숙주 세포(예를 들어, 유선 세포)에서의 발현을 포함한다(예를 들어, WO1992003918(Lonberg 및 Kay) 참조).
배취 일관성 및 비교 가능성은 재조합 mAb 및 관련 생성물의 성공적인 의약 개발과 매우 관련이 있다. 작은 구조적 변형은 크기, 전하 또는 소수성이 상이한 변이체(또는 단백질형태)를 초래할 수 있다. 이러한 변형은 재조합 mAb의 안정성, 약동학 및 효능에 영향을 미칠 수 있거나 영향을 미치지 않을 수 있다. 내인성 면역글로불린 G(IgG)에서 발견되는 것과 동일한 유형의 변형의 존재는 mAb의 안전성 위험을 실질적으로 낮출 수 있다.
다음의 번역 후 및 물리화학적 변형은 재조합 mAb에서 발생할 수 있으며, 사용되는 발현 시스템의 기능이다: N-말단 변형(N-말단 피로글루타메이트, 신호 펩티드의 불완전한 제거, 절단); 아스파라긴 탈아미드화; 아스파르테이트 이성질체화; 석신이미드의 존재; 아미노산 잔기(특히, 메티오닌 및 트립토판)의 분해/산화; 시스테인 관련 변형(유리 시스테인 잔기, 대안적인 디설피드 결합 연결(스크램블링), 트리설피드 결합, 티오에테르의 형성, 시스테인 라세미화); 글리코실화; 당화; C-말단 변형(C-말단 리신의 클리핑, 아미드화, 전사 또는 번역의 내재적 오류로 인한 서열 변형); 및 희귀 화학적 변형(예컨대, 산화성 카르보닐화, 히스티딘-히스티딘 가교결합, 티로신 황산화, 말레우르산에 의한 중쇄 N-말단의 변형, 시트르산 또는 이의 분해 생성물에 의한 N-말단 1차 아민 또는 리신 측쇄의 변형 및 세린 잔기의 O-푸코실화).
III. 항-IL-1R3 항체의 약제학적 조성물 및 이의 투여 방법
제2 양태는 제1 양태의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편)을 포함하는 약제학적 조성물이 제공되거나 본 개시내용의 이전 양태에 정의된 바와 같은 검정 방법에 의해서 식별 가능한 리간드 또는 리간드들이 제공된다. 리간드는 본 명세서에 논의된 바와 같은 면역 글로불린들, 펩티드, 핵산 또는 소분자일 수 있다. 이들은 다음 논의에서 "화합물"이라고 지칭된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 활성 성분으로서 T 세포 활성을 조절할 수 있는 화합물 또는 화합물들을 포함하는 대상 조성물이다. 화합물은 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염 형태일 수 있거나, 예를 들어, 적절한 경우, 아날로그, 유리 염기 형태, 호변이성질체, 거울상이성질체, 라세미체 또는 이들의 조합의 형태이다. 본 명세서에 기재된 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 활성 성분은 예를 들어, 특정 경우에 의존하는 양으로 투여되었을 때, 이식편대숙주병의 치료에 치료 활성을 나타내는 것으로 고려된다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 인간화 mAb 또는 인간화 mAb 단편(예를 들어, 항-IL-1R3 항체 또는 이의 단편) 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 적어도 하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 수성 조성물이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용에 기재된 하나 이상의 화합물은 상기에 언급된 질환 중 임의의 질환의 치료에서 특정 증상을 치료하는 데 적절한 것으로 알려진 임의의 당업계에 인식된 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 편리한 단일 조성물이 대상체에게 투여될 수 있도록, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 화합물은 상기 적응증을 치료하는 데 적합한 것으로 알려진 하나 이상의 당업계에 인식된 화합물과 조합될 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
예를 들어, 몇몇 분할된 용량이 매일 투여될 수 있거나, 치료 상황의 급박함에 의해 지시되는 바에 비례하여 용량이 감소될 수 있다.
활성 성분은 편리한 방식으로, 예를 들어, 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비강내, 피부내 또는 좌약 경로 또는 이식(예를 들어, 서방형 분자를 이용함)으로 투여될 수 있다. 이식의 경우, 활성 성분은 또한 이식 전에 환자에게 이식되는 세포, 조직 또는 기관을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 이식편대숙주병의 증상을 예방하거나, 이의 가능성을 감소시키거나, 이의 증상을 감소시키기 위해 수행될 수 있다.
투여 경로에 따라서, 활성 성분은 효소, 산 및 상기 성분을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터 상기 성분을 보호하기 위해서 물질로 코팅되는 것이 요구될 수 있다.
활성 성분을 비경구 투여 이외의 수단으로 투여하기 위해, 불활성화를 방지하는 물질과 함께, 또는 그러한 물질로 코팅된다. 예를 들어, 활성 성분은 보조제 내에서, 효소 저해제와 공동 투여되거나 리포좀 내에서 투여될 수 있다. 보조제는 가장 넓은 의미에서 사용될 수 있고, 임의의 면역 자극 화합물, 예컨대, 인터페론을 포함한다. 본 명세서에 설명된 보조제는 레소르시놀, 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르를 포함한다. 효소 저해제는 췌장 트립신을 포함한다.
리포좀은 종래의 리포좀뿐만 아니라 수중유중수(water-in-oil-in-water) CGF 에멀션을 포함한다.
활성 성분은 또한 비경구로 또는 복강내로 투여될 수 있다.
분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 보존제를 함유한다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 이러한 형태는 멸균되어야 하고 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하고 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 폴리프로필렌 글리콜 및 액체 폴리프로필렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 초래될 수 있다. 특정 경우에, 등장제(isotonic agent), 예를 들어 당, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 초래될 수 있다.
멸균성 주사용 용액은 필요에 따라 위에 열거된 몇몇 기타 성분과 함께, 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 성분을 도입한 후, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 배지 및 위에 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 멸균된 활성 성분을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
다양한 기타 물질이 코팅제로 또는 투여 단위의 물리적 형태를 달리 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 물론 임의의 투여 단위 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수하여야 하며 실질적으로 사용되는 양에서 비독성이어야 한다. 또한 활성 성분이 지속 방출 제제 및 제형에 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제"는 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 특정 실시형태에서 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 수성 유체이다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해서 비경구 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 투여량 단위 형태는 치료될 포유동물 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적인 개별 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 생성하기 위해서 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 명세서에 기재된 신규한 투여량 단위 형태에 대한 상세 설명은 (a) 활성 물질의 고유한 특성 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 (b) 신체 건강이 손상되어 질환 또는 병태를 갖는 살아있는 대상체에서 질환의 치료를 위한 활성 물질과 같은 컴파운딩 기술에 내재하는 제한에 의해서 그리고 직접 이들에 따라서 기술된다. 주요 활성 성분은 투여량 단위 형태에서 적절하고 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 유효량으로 편리하고 효과적으로 투여하기 위해서 컴파운딩된다. 보충 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우에는 상기 성분의 통상적인 용량 및 투여 방식을 참조하여 투여량이 결정된다.
항체를 포함하는, 펩티드 화합물의 세포로의 전달을 용이하게 하기 위해서, 펩티드는 세포막을 가로지르는 이의 능력을 개선시키기 위해서 변형될 수 있다. 예를 들어, US5149782에서 Chang 등은 융해성(fusogenic) 펩티드, 이온-채널 형성 펩티드, 막 펩티드, 장쇄 지방산 및 다른 막 혼합제를 사용하여 세포막을 가로지르는 단백질 수송을 증가시키는 것을 개시한다. 이들 및 다른 방법은 또한 본 명세서에 참조에 의해 포함된 Wallach 등의 WO1997037016 및 Low 등의 US5108921에 기재되어 있다.
추가 양상에서, 특정 적응증을 치료하기에 적합한 것으로 알려진 당업계에 인식된 화합물과 조합하여 또는 단독으로 질환의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 활성 성분이 제공된다. 결론적으로, 이상 면역 반응과 관련된 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 활성 성분의 용도가 제공된다.
더욱이, 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이상 면역 반응과 관련된 질환의 치료 방법이 제공된다.
IV: 질환 또는 장애의 치료 방법
제8 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제1 양태의 항체에 관한 것이며, 바람직하게는 질환 또는 장애는 자가면역 또는 자가염증성 질환 또는 장애이다.
제9 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제2 양태의 약제학적 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 질환 또는 장애는 자가면역 또는 자가염증성 질환 또는 장애이다.
제10 양태는 대상체에게 제1 양태의 항체 또는 제2 양태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1 양태의 항체 또는 제2 양태의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 제1 양태의 항체 또는 제2 양태의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
제시된 증거에 비추어, 당업자는 본 개시내용의 항체가 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 신호전달을 저해하는 능력으로 인해 염증성 및/또는 섬유성 및/또는 신생물 질환 장애를 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단하고 이에 의해서 여러 IL-의존성 경로를 동시에 표적으로 하기 위해서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시형태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제1 양태의 항체 또는 제2 양태의 약제학적 조성물에 관한 것이며, 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애, 바람직하게는 염증성 피부 질환이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애이고, 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애는 류마티스 관절염, 모든 유형의 관절염, 건선성 관절염, 모든 유형의 소아 관절염, 예컨대, 전신 발병 소아 특발성 관절염(systemic onset juvenile idiopathic arthritis, SOJIA), 골관절염, 가족성 한랭 자가염증성 증후군(familial cold auto-inflammatory syndrome, FCAS), 머클 웰스병, 신생아 발병 다기관 염증성 질환(neonatal onset multi-system inflammatory disease, NOMID), 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever, FMF), 화농성 관절염, 괴저성 농피증 및 여드름(pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum and acne, PAPA) 증후군, 성인 발병 스틸병, 고 IgD 증후군, 2형 당뇨병, 대식 세포 활성화 증후군, TNF 수용체 관련 주기 증후군, 블라우병(Blau disease), 강직성 척추염, 스위트병(Sweets disease), 루푸스 관절염, 알츠하이머병, 건선, 천식, 알레르기, 동맥경화증, 육아종증, 아토피성 피부염, 전신성 홍반 루푸스, 수포성 천포창, I형 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 헬리코박터 파일로리 위염, 염증성 장 질환(궤양성 대장염 포함), 간염, C형 간염, 허혈-재관류 손상, 다발성 경화증, 나이세리아 또는 폐렴구균성 수막염, 결핵, 베체트 증후군, 패혈성 쇼크, 이식편대숙주병, 성인 T 세포 백혈병, 다발성 골수종, 치주염, 비만 및 비만 관련 질환(예를 들어, 대사 증후군, 심장비대, 울혈성 심부전, 심근 경색, 정맥류, 다낭성 난소 증후군, 위식도 역류 질환(gastroesophageal reflux disease, GERD), 지방간 질환, 결장직장암, 유방암, 자궁암, 만성 신부전, 뇌졸중 및 고요산혈증), 추간판 질환, 과민성 대장 증후군, 슈니츨러 증후군(Schnitzler syndrome), 알레르기/아토피성 피부염, 전위 여드름(acne inversa)(화농성 한선염), 심장 섬유증, 심혈관 질환, 크리오피린 관련 주기 증후군(cryopyrin-associated periodic syndrome), 낭포성 섬유증, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증(lung fibrosis, pulmonary fibrosis), 피부 섬유증(진피 섬유증), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 길랭-바레 증후군, 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증(폐 섬유증), 피부 섬유증(진피 섬유증), 심근염, 자가면역성 근염, 장기 이식과 관련된 장기 기능 장애, 췌장염, 복막염, 포도막염, 혈관염, 폐렴, 폐 고혈압, 경화피부성 만성 이식편대숙주병, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 타카야스 동맥염 및 통풍으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 염증성 병태, 예컨대, 고요산혈증과 관련된 대사성 류마티스 장애이다. 대사성 류마티스 장애는 통풍, 가성 통풍, 약물-유도 통풍 및 만성 활성(불응성) 통풍으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 IL-1-의존성 염증성 질환이다. 예를 들어, 질환은 전신 또는 국소 염증성 질환일 수 있다. 적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 슈니츨러 증후군, 베체트병, 2차 아밀로이드증, 헤노크-숄레인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 특발성 재발성 심막염, 전신 발병 청소년 특발성 관절염, 성인 발병 스틸병(AOSD), 대식세포 활성화 증후군, 스위트 증후군(Sweet's syndrome)/호중구 피부증(급성 열성 호중구 피부증), 호중구성 지방층염, 에드하임 체스트병(Erdheim-Chester disease)(조직구증), SAPHO 증후군(활막염, 여드름, 농포증, 골비대증, 골염), PFAPA(주기성 발열, 아프타성 구내염, 인두염, 선염), 다중심성 캐슬만병, 제스너 칸노프병(Jessner-Kanof disease), 원발성 쇼크렌 증후군(피로), 가와사키병, 만성 육아종성 질환의 대장염, 화농성 한선염(전위 여드름), 자가면역 내이 질환 및 중증 외상성 뇌손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 유전성 전신 염증, 예컨대, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever, FMF), 크리오피린 관련 주기 증후군(cryopyrin associated periodic syndrome, CAPS), 종양 괴사 인자(tumour necrosis factor, TNF) 수용체 1 관련 주기 증후군(TRAPSa), 고 IgD 증후군(HIDS), PAPA(화농성 관절염, 괴저성 농피증 및 여드름) 증후군, PASH(괴저성 농피증, 여드름 및 화농성 한선염(suppurative hidradenitis)) 증후군, PAPASH(화농성 관절염, 여드름, 괴저성 농피증 및 화농성 한선염) 증후군, 인터류킨 1 수용체 길항제(deficiency of interleukin 1 receptor antagonist, DIRA) 결핍, 블라우 증후군/육아종성 관절염, 메발론산 키나제 결핍, 마지드 증후군 및 NLRP12(뉴클레오티드 결합 류신 풍부한 반복부 함유 수용체 12) 자가염증성 증후군이다.
특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 아토피성 피부염, 전위 여드름(화농성 한선염), 농피증 증후군(pyoderma syndrome), 괴저성 농피증, 농포성 건선(pustular psoriasis), 천식, 특발성 폐섬유증, 복막염, 류마티스 관절염, 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 농피증 증후군이다. 적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 괴저성 농피증이다.
적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 천식이다. 적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 특발성 폐섬유증이다. 특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 화농성 한선염(전위 여드름) 및 COPD, 바람직하게는 화농성 한선염(전위 여드름)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 아토피성 피부염이다. 특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 호흡기 질환이다. 특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 염증성 피부 질환이다.
일 실시형태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제1 양태의 항체 또는 제2 양태의 약제학적 조성물에 관한 것이며, 질환 또는 장애는 신생물 질환 또는 장애이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 신생물 질환 또는 장애이고, 신생물 질환 또는 장애는 혈액 질환 또는 장애 또는 고형 종양이다. 일부 실시형태에서, 상기 신생물 질환 또는 장애는 혈액 질환이며, 신생물 혈액 질환 또는 장애는 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 골수증식성 장애(myeloproliferative disorder, MPD), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome, MDS), 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL) 및 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 신생물 질환 또는 장애는 고형 종양이며, 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장암, 결장직장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 요로 장기암, 담도암(담관암이라고도 함), 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암(두경부 편평 세포 암종), 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 육종, 피부암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 신생물 질환 또는 장애는 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 간암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 위암(stomach cancer, gastric cancer), 에스트로겐-수용체 양성 유방암, 두경부 편평 세포 암종, 중피종, 담낭암, 난소암, 방광암, 전립선암, 갑상선암, 호지킨병, 맥아 림프종, 침샘암, 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 양태는 대상체의 치료 방법에 관한 것이며, 대상체는 하나 이상의 세포독성제, 세포증식저해제(cytostatic agent) 또는 표적 항암제를 사용한 치료에 대해 저항성을 갖거나 불충분한 반응을 나타내는 것을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 제1 양태의 항체는 하나 이상의 세포독성제, 세포증식저해제 또는 표적 항암제와 병용하여 투여된다. 일 실시형태에서, 제1 양태의 항체는 하나 이상의 세포독성제, 세포증식저해제 또는 표적 항암제와 동시에 투여된다. 일 실시형태에서, 제1 양태의 항체는 하나 이상의 세포독성제, 세포증식저해제 또는 표적 항암제와 순차적으로 투여된다. 후자의 경우, 제1 양태의 항체는 하나 이상의 세포독성제, 세포증식저해제 또는 표적 항암제로의 치료 후에 투여되는 것이 바람직하다. 세포독성 또는 세포증식억제 항암제는 탁산, 안트라사이클린, 알킬화제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 토포이소머라제 저해제일 수 있고, 키나제 저해제, 뉴클레오티드 유사체, 펩티드 항생제, 및 백금-기반 작용제일 수 있다.
적어도 하나의 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암 관련 만성 염증이다.
추가 양태는 미용 목적을 위한 제1 양태의 항체 또는 제2 양태의 약제학적 조성물의 비치료용 용도에 관한 것이다.
하기에 제공된 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 항-IL-1R3 IgG4-P-FALA 항체의 생성
항-IL-1R3 mAb를 재조합 DNA 기술을 사용한 CDR 이식에 의해 인간화하였다. 인간 IgG 골격은 Fc 영역에 P-FALA(S228P, F234A, L235A) 돌연변이를 함유하는 IgG4 또는 Fc 영역에 LALA(L234A, L235A) 돌연변이를 함유하는 IgG1 골격이었다. 생성된 벡터는 인간화 항체 항-IL-1R3-IgG4-P-FALA 또는 항-IL-1R3-IgG1-LALA의 중쇄 및 경쇄를 암호화하였다.
실시예 2: CHO 세포주에서 항-IL-1R3 IgG4-P-FALA 항체를 발현하는 CHO 세포주 클론의 선택
CHO DXB11 숙주주는 결국 CHO DXB11 세포주를 상업적인 동물 성분이 없는 화학적으로 규정된 배지(CD DG44)에 적응시킨 후 서브클로닝시킴으로써 CHO DXB11 세포주(문헌[Urlaub and Chasin, 1980, Proc Natl Acad Sci USA])로부터 직접 유래되었다. 숙주 마스터 세포 뱅크를 생성하고, 이 세포 뱅크를 사용하여 숙주 작업 세포 뱅크(WCB)를 생성하였다. 항-IL-1R3 발현 세포주의 생성을 위한 세포 공급원으로서 WCB를 사용하였다.
숙주 세포주를 4 mM L-글루타민 및 0.18%(v/v) 폴록사머 188(Pluronic F68, ThermoFisher Scientific)이 보충된 상업적인 배지(CD DG44, ThermoFisher Scientific)에서 증식시킨다. 세포를 현탁 배양물로서 37℃ 5% CO2, 80% 상대 습도에서 성장시킨다. 숙주 세포주를 동결보호제로서 7%(v/v) 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하여 이러한 CD DG44 성장 배지(CD DG44, 4 mM L-글루타민, 0.18%(v/v) 폴록사머 188)에서 동결보존한다.
항-ILR13 항체의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 발현 카세트/벡터의 DNA 서열을 표 4에 나타낸다. 항-IL-1R3 IgG4-P-FALA Ab(AIL-1R3-IgG4) 또는 항-IL-1R3 IgG1 LALA Ab(AIL-1R3-IgG1)의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 선택을 사용하여 5개의 복제 풀에서 CHO DXB11 세포주 내로 전기천공하였다. 중쇄를 운반하는 벡터는 또한 CD52 리포터를 함유하였다. 전기천공된 세포를 각각 5 nM 메토트렉세이트(MTX) 및 50 nM MTX를 함유하는 성장 배지에서 2회 라운드의 선택을 거치게 하였다. 항체 역가를 제2 라운드의 후 5개 풀 모두에서 측정하였다.
도 1은 "50 mM MTX 선택 풀 - 7일 배취 역가"로 명명되고, AIL-1R3-IgG1 또는 AIL-1R3-IgG4 Ab를 발현하는 풀에 대한 MTX 선택의 제2 라운드 후에 선택된 5개의 풀 각각에 대한 풀 수 및 상응하는 항체 역가를 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이, AIL-1R3-IgG1 항체를 발현하는 5개의 선택된 풀 모두는 0.1 g/L 미만의 항체 역가를 생성하였다. AIL-1R3-IgG4 항체를 발현하는 선택된 5개의 풀 중 4개의 풀인 1, 2, 3 및 4는 더 높은 역가의 항체를 생성하였고, 따라서 클론 단리에 대해 생존 가능하였다.
AIL-1R3-IgG4를 발현하는 풀 2 및 4를 클론 선택 도구를 사용하여 클론 선택에 사용하였다. 클론을 클론성에 대해 검토하고, 검증된 클론을 AMBR(세포주 스크리닝 소프트웨어)에 대한 평가를 위해 확장시켰다. 상위 21개의 클론을 세포 성장, 역가, 대사산물 및 생성물 품질에 대해 평가하였다. 항체 역가에 기초하여 선택된 리드인 6개의 클론은 A136, A155, A101, A61 및 B21이었다. "A" 클론은 풀 2로부터 유래되었고, "B" 클론은 풀 4로부터 유래되었다. 리드 6 클론은 또한 선택된 모든 클론 중에서 가장 높은 항체 생산성을 나타내었다.
실시예 3: 피부 유래 암종 A-431 세포에 의한 IL-1α/β, IL33 및 IL-36α/β/γ 유도 IL-8 방출의 저해
여러 사이토카인 활성을 방해하는 항-IL-1R3 항체의 시험관내 효력을 IL8 사이토카인 방출에 대한 A-431 안정 세포주에서 시험하였다.
A-431 세포를 20 μl DMEM, 10% 열 불활성화 FCS 배지 중 20,000개 세포/웰의 세포 밀도로 384웰 검은색, 편평 바닥, 조직 배양 처리된 마이크로플레이트(Corning #3764)에 시딩하였다. DMEM, 1% 열 불활성화 FCS에 연속 희석된 항체를 즉시 5 μl의 부피로 첨가하고, 플레이트를 37°C/5% CO2에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 DMEM, 1%의 열 불활성화 FCS로 제조된 각각의 재조합 인간 IL-1α/1β, IL33 또는 IL-36α/36β /36γ(R&D Systems) 단백질 5 μl를 5 μl 배지에서 3 ng/ml(IL-1α/β), 125 ng/ml(IL-33) 또는 30 ng/ml(IL-36A/γ/β)의 최종 농도로 첨가하였다. 플레이트를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 각각의 조건을 기술적 3회 반복하여 시험하였다. 상청액 중의 분비된 인간 IL-8 수준을 제조업체 설명서에 따라서 CisBio HTRF IL8 검출 키트(카탈로그 번호 62HIL08PEG)를 사용하여 측정하였다. 피팅 곡선 및 EC50 계산은 XLfit 피팅을 사용하여 수행하였다. 결과를 아래 표 5에 요약한다. 항-IL-1R3-IgG4-P-FALA 항체를 항-IL-1R3-IgG1-LALA 항체와 비교하였다. 두 항체 모두 세 가지 경로에 대해 강력한 활성을 나타내었다.
실시예 4: IgG1-LALA 및 IgG4-P-FALA 형식에서 항-IL-1R3 항체의 Fcγ 수용체 결합 활성.
인간 Fcγ-수용체를 R&D 시스템으로부터 수득하였다. Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결합 연구를 수행하였다. 0.1 μg/ml의 수용체 농도를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 항-His 포집 항체를 사용하여 CM5 센서 칩상에 Fcγ 수용체를 포획하였다. 항체를 각각 300초(Fcγ RI) 및 420초(Fcγ RIII) 동안 3.0 μM에서 이렇게 포획된 수용체 위로 이동시켰다. 그 후, 완충액을 항체 수용체 복합체의 해리를 모니터링하기 위해 칩 표면 위로 이동시켰다.
도 2a는 항-IL-1R3-IgG1-LALA가 인간 FcγRIIIa에 대한 잔류 결합을 나타내었다는 것을 나타내고, 도 2b는 인간 FcγRIIIa V176F 돌연변이체를 나타낸 반면, 항-IL-1R3-IgG4-P-FALA는 결합을 나타내지 않았다.
도 2c는 항-IL-1R3-IgG1-LALA가 인간 Fcγ RI(CD64)에 대한 잔류 결합을 나타낸 반면, 항-IL-1R3-IgG4-P-FALA는 결합을 나타내지 않았음을 나타낸다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c 모두에서, x축은 초(s) 단위의 시간을 도시하고, y축은 응답 단위(RU)의 응답을 도시하며, 여기서, 0은 포획 기준선을 의미한다.
시노몰거스 수용체의 경우, 동일한 경향이 관찰되었다(데이터는 제시되지 않음).
마우스 Fcγ 수용체의 경우, 항-IL-1R3-IgG1-LALA 또는 항-IL-1R3-IgG4-P-FALA에 대해 결합이 검출되지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 5: IgG1-LALA 및 IgG4-P-FALA 형식의 항-IL-1R3 항체의 세포 기반 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC).
항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)에서, 효과기 세포는 특이적 항체에 의해 결합된 표적 세포를 능동적으로 용해시킨다. 이 과정은 표적 세포의 표면에 대한 항체의 결합에 의해 시작된다. 효과기 세포는 세포 표면에서 발견되는 Fc 수용체를 사용하여 항체의 Fc 영역을 인식하고 이에 결합한다. 결합 시, 효과기 세포는 궁극적으로 표적 세포를 사멸시키는 세포독성 인자를 방출한다.
IgG1-LALA 및 IgG4-P-FALA 형식의 항-IL-1R3 항체를 리포터 유전자 검정(iLite ADCC Bioassay #BM5001, SVAR Life Sciences, )을 사용하여 임의의 ADCC 활성에 대해 시험하였다. 이 검정은 일정한 높은 수준에서 특이적 항원을 발현하는 표적 세포(즉, CHO IL1R3 표적 세포)와 함께 사용되는 리포터 유전자 운반 효과기 세포(Jurkat 세포 발현 Fc감마RIIa(V158))를 사용한다. 표적 세포에 대한 항체의 결합 및 항체의 Fc 수용체에 대한 효과기 세포의 결합은 효과기 세포에서 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 초래한다. 효과기 세포에서 반딧불이 루시퍼라제의 프로모터는 NFkB, AP1, NFAT, Cre 및 STAT에 대한 결합 부위를 포함하며, 이에 따라 FcγRIII 신호 전달 경로의 5가지 주요 전사 인자를 포함한다. 효과기 세포는 정규화 목적을 위한 레닐라 루시퍼라제를 추가로 포함한다.
도 3a는 원시 데이터를 도시하고, 도 3b는 IgG1-LALA 및 IgG4-P-FALA 형식에서의 본 발명의 항-IL-1R3 항체와 IgG1 대조군 항체의 비교의 정규화된 데이터를 나타낸다. 양성 대조군으로 사용되는 IgG1 대조군 항체는 ADCC를 나타내는 강한 리포터 유전자 신호를 나타내는 반면, IgG1-LALA 형식은 리포터 신호를 유의하게 감소시킨다. 놀랍게도 IgG4-P-FALA 형식은 리포터 유전자 신호를 완전히 없애는데, 이는 Fcγ 수용체 신호전달의 완전한 부재를 나타낸다.
인용 문헌
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Claims (15)

  1. 서열번호 1의 항체 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, IL-1R3에 특이적으로 결합하는, 항체.
  2. 제1항의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항의 항체를 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  4. 제3항의 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  5. 제4항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포이되, 바람직하게는 CHO DXB11 세포인, 숙주 세포.
  7. 제1항의 항체를 제조하는 방법으로서,
    (i) 선택적으로, 제3항의 단리된 핵산 분자 또는 제4항의 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포에 형질주입하는 단계;
    (ii) 상기 숙주 세포를 상기 항체의 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계;
    (iii) 상기 항체를 회수하는 단계; 및
    (iv) 선택적으로, 추가로 상기 항체를 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법은
    (i) 제3항의 단리된 핵산 분자 또는 제4항의 발현 벡터를 사용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 숙주 세포에 형질주입하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 상기 숙주 세포는 CHO DXB11 세포인, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 방법은
    (iv) 추가로 상기 항체를 정제 및/또는 변형 및/또는 제형화하는 단계를 포함하고,
    상기 제형화하는 단계는 상기 항체를 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 배합하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 발현 수준은 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항-IL-1R3 항체의 발현 수준보다 더 높고, 바람직하게는 상기 인간 IgG1 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함하는, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해서 생산된 항체.
  12. 제1항에 있어서, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 항체로서, 바람직하게는 상기 질환 또는 장애는 자가면역 또는 자가염증성 질환 또는 장애인, 항체.
  13. 제2항에 있어서, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 바람직하게는 상기 질환 또는 장애는 자가면역 또는 자가염증성 질환 또는 장애인, 약제학적 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 항체 또는 약제학적 조성물로서, 상기 질환 또는 장애는 신생물 질환 또는 장애인, 항체 또는 약제학적 조성물.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 항체 또는 약제학적 조성물로서, 상기 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애, 바람직하게는 염증성 피부 질환인, 항체 또는 약제학적 조성물.
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