KR20210006331A

KR20210006331A - 조직으로부터 관심 영역의 단리 및 발현 분석을 위한 방법, 조성물, 및 장치

Info

Publication number: KR20210006331A
Application number: KR1020207028287A
Authority: KR
Inventors: 존 버틀러; 비드한 초더리
Original assignee: 퀀텀사이트, 인크.
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2021-01-18
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: KR102828396B1; AU2019228081A1; EP3759213A1; TW201938797A; US20250236904A1; EP3759213B1; CN112119151B; CN121006394A; WO2019169407A1; MX2025014322A; US20210222229A1; SG11202008266SA; KR20250099416A; MX2020009148A; CA3092482A1; CN120425022A; JP7573444B2; JP2021515900A; JP2023166500A; EP3759213A4

Abstract

평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

조직으로부터 관심 영역의 단리 및 발현 분석을 위한 방법, 조성물, 및 장치

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 3월 2일에 출원된 "조직 박편으로부터 관심 영역의 단리 및 발현 분석을 위한 방법, 조성물, 및 장치"라는 명칭의 미국 가출원 제62/637,998호, 및 2018년 6월 28일에 출원된 "조직 박편으로부터 관심 영역의 단리 및 발현 분석을 위한 방법, 조성물, 및 장치"라는 명칭의 미국 가출원 제62/691,559호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 전체는 본원에 참조로 포함된다.

조직 샘플로부터의 유전자 및 단백질 발현의 종래의 임상 분석은 박편(예컨대, 조직의 생검)으로부터 핵산 및 단백질을 추출하는 것을 포함한다. 선택 메커니즘이 없으면, 이러한 박편에 기초한 분석은 조직 내의 다양한 세포 유형(예컨대, 상피, 결합, 및 면역)의 발현 프로파일 및 DNA/RNA 서열 데이터의 복합물을 나타낸다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 (a) 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 정의된 관심 영역을 중합체로 둘러싸서 비물리적 유체 장벽을 형성하는 단계로서, 관심 영역은 직경이 1 mm 미만인 것인 단계; 및 (b) 적어도 하나의 정의된 관심 영역 내의 원위치(in situ) 세포를 선택적으로 파괴시키는 단계를 포함하는, 시퀀싱 또는 분석을 위해 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 화학적 마스크를 평면 조직 박편에 적용하는 단계로서, 화학적 마스크는 적어도 하나의 관심 영역 내의 세포의 선택적 파괴에 적합한 장벽을 형성하고, 화학적 마스크는 물리적 유체 장벽이 아닌 것인 단계를 포함하는, 시퀀싱 또는 분석을 위해 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 관심 영역 내의 세포의 파괴에 적합한 용매를 분배하여 해방된 세포 성분을 함유하는 액적을 형성하는 단계로서, 액적은 물리적 장벽 없이 관심 영역 외부의 조직으로부터 유체 연통으로부터 단리되는 것인 단계를 포함하는, 시퀀싱 또는 분석을 위해 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 조직 박편에 소수성 마스크를 적용하여 평면 조직 박편 내의 적어도 1000개의 관심 영역이 물리적 장벽 없이 서로 유체 연통으로부터 단리되도록 하는 단계 및 적어도 1000개의 관심 영역 내의 세포로부터 원위치에서 해방된 복수의 단백질 또는 핵산을 검출하여, 단백질 또는 핵산의 공간적 위치 정보가 유지되도록 하는 단계를 포함하는, 조직 박편 내의 복수의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리 및 검출하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 직경이 약 100 마이크론 이하인 관심 영역을 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 조직 박편은 FFPE 조직 박편이다. 일부 구현예에서, 방법은 세포로부터 원위치에서 해방된 복수의 단백질 또는 핵산을 검출하는 단계를 포함하고, 검출은 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 시퀀싱은 원위치에서 해방된 핵산을 관심 영역의 위치를 식별하는 바코드(barcode)로 태깅하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드는 표면에 연결되지 않는다. 일부 구현예에서, 태깅은 원위치에서 해방된 RNA를 태깅하는 단계를 포함하고, (a) 고유한 핵산 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 적어도 1000개의 관심 영역에 적용하는 단계; 및 (b) 관심 영역이 서로 단리되도록 적어도 1000개의 관심 영역 상에서 1번째 및 2번째 가닥 cDNA 합성을 수행하는 단계를 포함한다. 본 방법의 일부 구현예에서, 관심 영역으로부터 합성된 cDNA 분자 사이에 고유한 핵산 서열의 교차 오염이 감소된다. 일부 구현예에서, 1번째 가닥 cDNA 합성은 원위치에서 수행된다. 일부 구현예에서, 1번째 및 2번째 가닥 cDNA 합성은 원위치에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 것은 mRNA 및 게놈 DNA 모두를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 것은 mRNA를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA를 시퀀싱하는 것은 mRNA로부터 생성된 cDNA 상에서 수행된 전증폭(pre-amplification) 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 전증폭 단계는 LM-PCR, 랜덤 헥사머 프라이머를 사용한 PCR, 폴리-A 특이적 프라이머를 사용한 PCR, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 것은 게놈 DNA를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA를 시퀀싱하는 것은 게놈 DNA 상에서 수행된 전체 게놈 증폭(whole genome amplification; WGA) 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, WGA 단계는 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 프라이밍된(DOP) PCR, 다중 변위 증폭(multiple displacement amplification, MDA), 다중 어닐링 및 루핑 기반 증폭 사이클(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles; MALBAC), 피코플렉스(PicoPlex), 자가 축퇴성 프라이머를 사용한 등온 증폭, 또는 이의 조합이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 물리적 장벽 없이 서로 유체 연통으로부터 단리된 적어도 1000개의 수성 액적을 그 위에 포함하는 조직 박편을 제공한다. 일부 구현예에서, 조직 박편은 서로 유체 연통으로부터 1000개의 수성 액적을 단리하는 소수성 마스크를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 1000개의 수성 액적은 적어도 1000개의 고유한 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 마스크는 적어도 시아노아크릴레이트 중합체의 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 마스크는 적어도 비실릴화된 플루오로알킬 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 비실릴화된 플루오로알킬 층은 플루오로아크릴레이트 또는 비실릴화된 퍼플루오로알칸 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직 박편은 적어도 퍼플루오로알킬실란 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 퍼플루오로알킬실란 층은 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로트리스(디메틸아미노)실란을 포함한다. 일부 구현예에서, 퍼플루오로알킬트리클로로실란은 FOTS((트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란)이다. 일부 구현예에서, 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란은 PF10TAS(퍼플루오로데실트리스(디메틸아미노)실란)이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 표면에 연결되지 않는다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 (a) 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 화학적 마스크를 평면 조직 박편에 적용하는 단계; 및 (b) 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 관심 영역 상에 분배하여 적어도 하나의 관심 영역 내의 세포 성분을 가용화시켜, 적어도 하나의 관심 영역 내에 둘러싸인 세포를 선택적으로 용해시키는 단계를 포함하는, 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 용액을 관심 영역 상에 분배하는 것은 (a) 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 제2 고체 기질의 표면에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 포함하는 제제 전달 장치 상에 분배하는 단계; (b) 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 평면 조직 박편에 접촉시켜, 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소가 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역에 공간적으로 상응하도록 하는 단계로서, 접촉은 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역에 전달시켜, 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액에서 적어도 하나의 관심 영역 내의 세포 성분을 가용화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 적어도 하나의 가용화된 세포 성분을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 관심 영역으로부터 가용화된 세포 성분 중에서 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 관심 영역으로부터 가용화된 세포 성분 중에서 단백질에 대해 탠덤 질량 분석법(tandem mass spectrometry)을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, (b)에서의 용액은 가용성 태그를 추가로 포함하고, 가용성 태그는 적어도 하나의 관심 영역에 상응한다. 일부 구현예에서, 가용성 태그는 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 관심 영역에 상응하는 샘플 인덱스 서열(sample index sequence) 및, 선택적으로, 고유한 분자 식별자 서열(unique molecular identifier sequence)을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 관심 영역에 상응하는 전하 태그(charge tag)를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 비드에 접합된다. 일부 구현예에서, 가용성 태그는 탠덤 질량 태그(Tandem Mass Tag)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추출제는 하나 이상의 계면활성제, 프로테아제, 등장성 조절제, 카오트로프(chaotrope), 뉴클레아제, 완충제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 또는 뉴클레아제 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크는 60-155도의 접촉각을 갖는다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크는 플루오로알칸 또는 플루오로아크릴릭 중합체를 포함하는 소수성 마스크 용액을 통해 적용된다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크 용액은 아크릴레이트 또는 시아노-아크릴레이트를 포함하는 용액을 통해 적용된다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크 용액은 용매를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 프로필렌 글리콜 유도체, 플루오로탄소, 또는 알코올이다. 일부 구현예에서, 용매는 퍼플루오로옥탄, 퍼플루오로-2-메틸펜탄, 퍼플루오로-1,3-디메틸사이클로헥산, 퍼플루오로데칼린, 또는 1,3-디플루오로프로판이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 관심 영역은 원형이고, 관심 영역의 직경은 1 mm 이하, 500 마이크론 이하, 250 마이크론 이하, 125 마이크론 이하, 100 마이크론 이하, 80 마이크론 이하, 50 마이크론 이하, 25 마이크론 이하, 또는 15 마이크론 이하이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 관심 영역은 면적이 약 7.8x10⁵ 제곱 마이크론 미만이다. 일부 구현예에서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 소수성 영역에 의해 둘러싸인 적어도 하나의 친수성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 용액 10,000 피코리터 이하, 1,000 피코리터 이하, 500 피코리터 이하, 250 피코리터 이하, 100 피코리터 이하, 50 피코리터 이하, 10 피코리터 이하, 또는 2 피코리터 이하의 부피를 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 친수성 영역을 둘러싸는 소수성 영역은 60-155도의 접촉각을 갖는다. 일부 구현예에서, 방법은 평면 조직 박편 내의 하나 초과의 관심 영역으로부터 세포 성분을 가용화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 평면 조직 박편 내의 적어도 10개, 적어도 100개, 적어도 1000개, 또는 적어도 10,000개의 관심 영역으로부터 세포 성분을 가용화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 소수성 마스크는 격자(grid) 패턴을 포함한다. 일부 구현예에서, 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 소수성 마스크는 타원을 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 소수성 마스크는 압전 잉크젯 전달 장치(piezoelectric ink-jet device)를 사용하여 평면 조직 박편에 적용된다. 일부 구현예에서, 평면 조직 박편은 약 2 내지 약 50 μm 두께이다. 일부 구현예에서, 평면 조직 박편은 약 1 내지 약 15 μm 두께이다. 일부 구현예에서, 평면 조직 박편은 포르말린 고정된 파라핀 포매된(FFPE) 조직 박편이다. 일부 구현예에서, 평면 조직 박편은 고정되지 않은 조직 박편이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 (a) 소수성 마스크로 둘러싸인 적어도 하나의 관심 영역을 포함하는 제1 고체 지지체 상의 평면 조직 박편; (b) 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역과 정렬하도록 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 포함하는 제2 고체 지지체로서, 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 포함하는 것인 제2 고체 지지체; 및 (c) 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 포함하는 고체 지지체에 결합되고 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소가 소수성 마스크로 둘러싸인 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역과 접촉할 수 있도록 고체 지지체를 옮길 수 있는 전동식 스테이지(motorized stage)를 포함하는, 제1 고체 지지체 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하기 위한 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 시스템은 제2 고체 기질 상의 표면에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소가 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역과 접촉하도록 전동식 스테이지의 위치를 제어하도록 구성된 컴퓨터 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 마스크 용액은 (i) 소수성 마스크 용액을 고체 지지체 상의 조직 박편에 전달할 수 있는 압전 잉크젯 전달 장치 및 (ii) 소수성 마스크를 생성하기 위해 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 소수성 마스크 용액으로 둘러싸는 압전 잉크젯 전달 장치를 제어하도록 구성된 컴퓨터 시스템을 포함하는 시스템에 의해 적용된다. 일부 구현예에서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 소수성 영역에 의해 둘러싸인 적어도 하나의 친수성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 마스크 용액은 C7F15CH2OCOC(CH3)=CH2, FC-722, 퍼플루오로코트(PerFluoroCoat), 또는 플루오로펠(FluoroPel) 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 마스크 용액은 아크릴레이트 또는 시아노아크릴레이트 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 용액 10,000 피코리터 이하, 1,000 피코리터 이하, 500 피코리터 이하, 250 피코리터 이하, 100 피코리터 이하, 50 피코리터 이하, 10 피코리터 이하, 또는 2 피코리터 이하의 부피를 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 친수성 영역을 둘러싸는 소수성 영역의 접촉각은 60-155도이다. 일부 구현예에서, 소수성 마스크 용액 적용을 위한 시스템은 평면 조직 박편에 적용 후 상기 소수성 마스크 용액을 중합할 수 있는 UV 광원을 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 마스크 용액 적용을 위한 시스템은 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬실란의 화학 기상 증착을 위한 장치를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 방법, 시스템, 또는 조직 박편의 구현예의 양태 중 임의의 요소를 포함하는, 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하기 위한 키트를 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 하부로부터 상부까지 적어도 하나의 시아노아크릴레이트 층에 이어 적어도 하나의 퍼플루오로알킬실란 층을 그 위에 포함하는, 조직 박편을 제공한다. 일부 구현예에서, 퍼플루오로알킬실란 층은 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란을 포함한다. 일부 구현예에서, 퍼플루오로알킬트리클로로실란은 FOTS이다. 일부 구현예에서, 조직 박편은 적어도 하나의 시아노아크릴레이트 층 아래에 적어도 하나의 비실릴화된 플루오로알킬 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 비실릴화된 플루오로알킬 층은 플루오로아크릴레이트 또는 비실릴화된 퍼플루오로알칸 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 퍼플루오로알킬트리클로로실란은 FOTS((트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란)이다. 일부 구현예에서, 조직 박편은 시아노아크릴레이트 층을 보유하는 영역에 의해 둘러싸인 시아노아크릴레이트 층이 없는 적어도 하나의 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 영역은 실질적으로 타원형, 다각형, 또는 자유형이다. 일부 구현예에서, 세제의 수용액을 조직 박편에 적용하는 것은 영역 내의 세포를 가용화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 영역은 약 1 mm 미만의 크기이다. 일부 구현예에서, 영역은 약 100 마이크론 미만의 크기이다.

참조에 의한 포함

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 및 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 새로운 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 (상부) 임의의 추가 처리가 없는 FFPE 간세포 암종 박편(좌측), 및 본원에 기재된 바와 같은 소수성 마스킹을 사용한 FFPE 간세포 암종 박편(우측)의 헤마톡실린/에오신 염색의 사진을 나타내고; (하부) 염색된 마이크로톰(microtome) 간 박편(좌측) 및 패턴화 후에 염색된 소수성 마스크 패턴화된 마이크로톰 간 박편(우측)을 나타낸다.
도 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 및 2F는 본원에 기재된 소수성 마스킹 기술의 적용에 의해 FFPE 인간 간 마이크로톰 박편으로부터 단리된 다양한 크기(~25 마이크론, ~100 마이크론, ~250 마이크론, 500 마이크론, 및 1 mm 직경) 및 모양(정사각형 또는 원형)의 관심 영역을 보여주는 명시야 현미경 이미지(2A, 2B, 2C, 및 2D는 10x이고, 2E는 4X 배율임)를 나타낸다.
도 3은 제제 전달 어레이 장치(B)가 어떻게 용액을 표면 장력 접촉(C)에 의해 조직 박편(A) 상의 관심 영역에 전달하는 데 사용될 수 있는지에 관한 개략도를 나타낸다.
도 4는 소수성 마스킹 과정이 어떻게 미세유체공학 또는 레이저와 같은 특수 장비 없이 조직 박편으로부터 관심 영역의 단리 및 태깅을 허용하는지 보여주는 개략도를 나타낸다.
도 5는 소수성 마스킹 과정이 어떻게 조직 박편 내의 사용자 정의 관심 영역의 윤곽표시(delineation)를 허용하는지 보여주는 예시를 나타낸다.
도 6은 현미경 분석 및 공간 인식 태깅(spatially aware tagging)과 조합된 본 개시내용의 소수성 마스킹 과정의 적용이 어떻게 유전자 발현 및/또는 서열 데이터와 조직 박편 내의 특정 세포 유형과의 연관성을 허용할 수 있는지 예시하는 예시적인 가설 데이터를 나타낸다.
도 7은 암성 및 정상 조직 영역을 함유하는 FFPE 유방암 조직 박편(Biomax, huCAT299)의 2개의 염색된 z-슬라이스를 도시한다. 좌측은 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 박편을 나타내고; 우측은 암 마커 HER2에 대한 면역조직화학(IHC)을 사용하여 염색된 동일한 종양 샘플의 또 다른 슬라이스를 나타낸다.
도 8은 도 7에 도시된 동일한 FFPE 유방암 샘플의 다양한 연속 박편에 적용된 본원에 기재된 화학적 마스킹 과정을 도시한다. 좌측 이미지는 모두 동일한 이미지에 적용된 다양한 마스킹 패턴을 도시하는 반면, 우측 이미지는 선택된 조직의 영역을 보여주는, 화학적 마스크의 적용 후의 박편을 도시한다.
도 9는 도 8에 나타내고 실시예 8에 기재된 바와 같이 추출된 샘플에 수행된 qPCR 분석의 결과를 도시한다.
도 10A 및 10B는 실시예 5에 기재된 소수성 마스킹 과정을 예시하는 흐름도를 도시한다.

조직 내의 희귀하고/거나 다양한 세포 유형의 검출에 기초한 임상 분석은 어렵다. 예를 들어, 전암성 조직은 단지 적은 비율의 비정상적인 세포를 포함할 수 있어, 주변 정상 세포가 신호를 희석시키고 암의 조기 검출을 방해하게 할 수 있다. 대조적으로, 말기 종양은 높은 비율의 비정상 세포를 가질 수 있지만 화학요법 전략에 상이하게 반응하는 상이한 유전자형을 갖는 다양한 세포를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 형태학적으로 비정상적인 세포를 선택적으로 단리하고 분석하는 능력은 질병 병리생리학의 진단 및 이해를 개선하는 데 도움이 될 것이다.

그러나, 조직 샘플 내의 선택된 세포의 작은 집단의 기존의 단리 및 분석 방법은 힘들고, 비용이 많이 들며, 조직의 진정한 고처리량 다중 분석(예컨대, 많은 양의 수동 조작 및 고가의 기계를 필요로 하는 레이저 캡처 미세해부)에 적합하지 않다.

따라서, 조직 샘플 내의 영역의 다중 단리 및 분석을 위한 간단하고 저렴한 고처리량 방법이 필요하다.

정의

용어 "조직"은 세포, 및, 선택적으로, 세포간 물질(예컨대, ECM)의 집합체를 지칭한다. 전형적으로 조직 내의 세포는 자유롭게 유동하지 않으며 서로 부착되어 다세포 구조를 형성한다. 조직 유형은, 비제한적으로, 근육, 신경, 표피 및 결합 조직을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 조직은 비제한적으로, 포유동물, 예컨대 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 기니어 피그, 유제류(ungulate), 말, 양, 돼지, 염소, 소, 고양이, 개, 영장류(즉, 인간 또는 비인간 영장류); 식물, 예컨대 애기장대(Arabidopsis thaliana), 옥수수, 수수, 귀리, 밀, 쌀, 카놀라, 또는 대두; 해조류, 예컨대 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii); 선충류, 예컨대 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans); 곤충, 예컨대 노랑초파리(Drosophila melanogaster), 모기, 초파리, 꿀벌 또는 거미; 어류, 예컨대 제브라피쉬; 파충류; 또는 양서류, 예컨대 개구리 또는 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)를 포함하는 다양한 유기체로부터 유래될 수 있다.

용어 "접촉각(contact angle)"은 고체 표면 상에 놓인 액체 액적의 모양을 지칭한다. 공기 중에 고체 면 상에 액체가 있다는 가정하에, 용어 "접촉각"은 액체, 고체 면, 및 공기의 접점에서의 액체의 접선과 고체 면의 접선 사이의 각도를 지칭한다.

용어 "소수성"은 물에 젖기 어려운 표면 또는 코팅을 지칭한다. 표면은 적어도 60°의 후진 물 접촉각(receding water contact angle)을 나타내면 소수성으로 간주되고, 적어도 110°의 접촉각을 나타내면 매우 소수성으로 간주되며, 적어도 120°의 후진 물 접촉각을 나타내면 극히 소수성으로 간주될 것이다.

용어 "초소수성"은 물에 극히 젖기 어려운 표면 또는 코팅을 지칭한다. 초소수성 표면 또는 코팅은 일반적으로 140° 초과, 및 종종 150° 초과의 접촉각을 가질 것이다.

용어 "친수성"은 수성 유체에 의해 젖을 수 있는 표면을 지칭하기 위해 사용된다. 유체가 개별 액적을 형성하는 것이 아니라 표면을 가로질러 자발적으로 퍼지는 경향이 있는 경우 표면은 유체에 의해 젖는다고 한다(친수성). 표면이 약 50도 미만의 접촉각을 나타낸 경우, 그것은 친수성으로 간주될 것이다.

"잉크젯 전달(Inkjet delivery)"은 액체의 1-100 피코리터(pl) 액적을 2차원 및 3차원 구조로 가공할 수 있는 비접촉 접근법이다. 이 접근법은 잉크를 형성하기 위해 액체 내의 관심 물질을 용해 또는 분산시키는 것을 포함한다. 잉크젯 전달을 위해 사용되는 가장 일반적인 방법은 DOD(Droplet-on-Demand) 방법이며, 여기서 방울은 (a) 액체를 끓는 온도보다 높은 온도로 가열하여(열 DOD) 노즐로부터 액적의 방출을 자극하는 증기 거품을 생성하거나 또는 (b) 전압을 압전 변환기에 적용하여, 물질의 진동 및 노즐로부터 액적의 방출을 유도함으로써(압전 DOD) 마이크로미터 규모의 노즐로부터 분출된다.

개요

고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 원위치(in situ)이며, 조직으로부터 영역을 정의하기 위해 고정화된 뉴클레오타이드 어레이의 사전 준비가 필요하지 않다. 오히려, 방법은 관심 영역을 단리하기 위해 조직 박편 상에 소수성 마스크를 원위치 준비한 후, 소수성 마스크에 의해 둘러싸인 특정 관심 영역으로부터 추출 및/또는 분석 시약을 첨가 및/또는 제거하기 위해 표면 장력 어레이를 선택적으로 사용하는 것을 포함한다. 표면 장력 어레이의 사용은 예컨대, 소수성 마스크에 의해 단리된 영역이 많은 경우(예컨대, 10개 초과, 100개 초과, 1000개 초과) 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 방법은 (a) 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 소수성 마스크를 평면 조직 박편에 적용하는 단계; (b) 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 포함하는 제제 전달 장치 상에 분배하는 단계; 및 (c) 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 평면 조직 박편에 접촉시켜, 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소가 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역에 공간적으로 상응하도록 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 접촉은 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역에 전달시켜, 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액에서 적어도 하나의 관심 영역 내의 세포 성분을 가용화시킨다.

하나 이상의 추출제를 포함하는 용액은 핵산 또는 단백질을 표지하는 데 적합한 하나 이상의 태그 또는 표지를 포함할 수 있다. 이러한 태그 또는 표지는 바코드를 포함할 수 있거나 또는 추출된 핵산 또는 단백질로부터 유래된 핵산 시퀀싱 데이터 또는 질량 분석법 데이터가 후속적으로 이들이 단리된 관심 영역과 연관될 수 있도록 공간적으로 주소를 지정할 수 있다. 이와 같이, 본원의 방법은 또한 조직 박편으로부터 핵산 또는 단백질을 공간적으로 태깅하기 위한 체계를 제공한다.

조직 박편

방법에 이용되는 조직 박편은 면역조직화학 제조에 일반적으로 사용되는 임의의 표준 방법에 의해 제조될 수 있고, 고정되거나 고정되지 않을 수 있다(예컨대, 새롭게 절제되거나, 또는 동결과 같은 비고정 조직 제조 방법에 의해 제조됨). 세포 또는 조직의 고정은 포름알데히드, 글루타르알데히드 등과 같은 가교제의 사용을 포함할 수 있다.

고정된 조직은 파라핀 왁스 또는 하이드로겔(예컨대, 폴리아크릴아미드 지지체 매트릭스)에 추가로 포매될 수 있다. 일반적인 조직 제조 방법은 FFPE(포르말린 고정된 파라핀 포매된)이며, 이는 조직 조각을 포르말린 용액에서 고정시키고, 조직을 순차적으로 더 높은 농도의 알코올에서 탈수시키고, 조직을 자일렌으로 청소하고, 조직에 왁스(전형적으로 파라핀, 다양한 상이한 융점으로 수득될 수 있는 20 내지 40의 탄소 사슬 길이를 갖는 직쇄 또는 n-알칸의 혼합물)를 침투시킨 다음, 조직을 왁스 블록에 포매시키는 것을 포함한다. 그리고 나서, FFPE 조직은 마이크로톰을 사용하여 조직 박편으로 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, FFPE에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 약 1 마이크론 내지 약 50 마이크론이다. 일부 구현예에서, FFPE에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 적어도 약 1 마이크론이다. 일부 구현예에서, FFPE에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 최대 약 50 마이크론이다. 일부 구현예에서, FFPE에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 약 1 마이크론 내지 약 3 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 5 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 10 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 5 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 10 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 10 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 10 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 10 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 10 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 10 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 10 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 20 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 20 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 20 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 30 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 30 마이크론 내지 약 50 마이크론, 또는 약 40 마이크론 내지 약 50 마이크론이다. 일부 구현예에서, FFPE에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 약 1 마이크론, 약 3 마이크론, 약 5 마이크론, 약 10 마이크론, 약 15 마이크론, 약 20 마이크론, 약 30 마이크론, 약 40 마이크론, 또는 약 50 마이크론이다.

포매된 조직 박편은 추가 처리(예컨대, 본원에 추가로 기재된 소수성 화학 및 샘플 추출 기술을 이용한 처리) 전에 탈파라핀화(de-paraffinization)될 수 있다. 탈파라핀화는, 예컨대, 박편을 자일렌 배스(bath)에서 인큐베이션한 다음, 자일렌/에탄올 배스에서 인큐베이션한 다음, 순차적으로 더 낮은 에탄올 농도(100%-50%)의 배스에서 인큐베이션한 다음, 건조시키거나 물에서 헹굼으로써 수행될 수 있다.

일부 구현예에서, 고정되지 않거나 고정된 조직은 동결박편법(cryosectioning)에 의해 박편으로 제조될 수 있다. 고정되지 않은 조직의 경우, 조직은 먼저 동결된 조직 매트릭스(예컨대, OCT 또는 Cryomatrix)에 침지되고, 액체 질소와 접촉하는 이소펜탄 및/또는 2-메틸부탄 배스에서 동결되고, 저온유지장치(cryostat)에서 박편화된다. 고정된 조직의 경우, 조직은 조직 매트릭스에서 포매/동결하기 전에 수크로스에서 동결보호될 수 있고, 이는 순차적으로 더 높은 농도 수크로스 배스(최대 30%)에서의 인큐베이션을 포함한다. 그리고 나서, 동결보호된 고정된 조직은 동결된 조직 매트릭스(예컨대, OCT 또는 Cryomatrix)에 침지될 수 있고, a) 액체 질소와 접촉하는 이소펜탄 배스, 또는 b) 대안적인 더 느린 동결 방법(예컨대, 분말 드라이 아이스 또는 드라이 아이스 메탄올/에탄올 슬러리)에서 동결될 수 있다. 그리고 나서, 동결보호된 동결된 고정된 조직은 저온유지장치에서 박편화될 수 있다.

일부 구현예에서, 동결박편법에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 약 5 마이크론 내지 약 50 마이크론일 수 있다. 일부 구현예에서, 동결박편법에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 적어도 약 5 마이크론일 수 있다. 일부 구현예에서, 동결박편법에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 최대 약 50 마이크론일 수 있다. 일부 구현예에서, 동결박편법에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 약 5 마이크론 내지 약 7 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 9 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 11 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 13 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 9 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 11 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 13 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 7 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 9 마이크론 내지 약 11 마이크론, 약 9 마이크론 내지 약 13 마이크론, 약 9 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 9 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 9 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 9 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 9 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 11 마이크론 내지 약 13 마이크론, 약 11 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 11 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 11 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 11 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 11 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 13 마이크론 내지 약 15 마이크론, 약 13 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 13 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 13 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 13 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 15 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 20 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 20 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 20 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 30 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 30 마이크론 내지 약 50 마이크론, 또는 약 40 마이크론 내지 약 50 마이크론일 수 있다. 일부 구현예에서, 동결박편법에 의해 제조된 조직 박편의 두께는 약 5 마이크론, 약 7 마이크론, 약 9 마이크론, 약 11 마이크론, 약 13 마이크론, 약 15 마이크론, 약 20 마이크론, 약 30 마이크론, 약 40 마이크론, 또는 약 50 마이크론일 수 있다.

화학적 마스크

A. 조성물/적용

일부 구현예에서, 본원에 포함된 방법은 조직 박편(예컨대, 신선 동결된, 고정된 동결된, 및/또는 탈파라핀화된 FFPE 조직 박편) 내의 관심 영역을 둘러싸고 단리하기 위해 화학적 마스크의 증착을 포함한다. 화학적 마스크는 주변 영역의 성분에 의한 오염 없이 관심 영역으로부터의 세포 성분의 선택적 수성 추출/재수화를 허용한다(관심 영역 이외의 샘플 영역이 세포를 파괴/추출/재수화하는 데 필요한 용액을 접근하지 못하게 하기 때문). 이와 같이, 화학적 마스크 용액은 소수성이다(예컨대, 적어도 60도의 후진 물 접촉각을 가짐).

일부 구현예에서, 화학적 마스크의 접촉각은 약 60도 내지 약 150도일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크의 접촉각은 적어도 약 60도일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크의 접촉각은 최대 약 150도일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크의 접촉각은 약 60도 내지 약 100도, 약 60도 내지 약 110도, 약 60도 내지 약 140도, 약 60도 내지 약 150도, 약 100도 내지 약 110도, 약 100도 내지 약 140도, 약 100도 내지 약 150도, 약 110도 내지 약 140도, 약 110도 내지 약 150도, 또는 약 140도 내지 약 150도일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크의 접촉각은 약 60도, 약 100도, 약 110도, 약 140도, 또는 약 150도일 수 있다.

적어도 60도의 표면 후진 물 접촉각을 생성하는 데 사용될 수 있고 따라서 본원에 기재된 바와 같은 화학적 마스크를 생성하는 데 사용하기 적합한 광범위한 표면 코팅 중합체 및 공중합체가 기술되었다.

이러한 제제의 중요한 부류는 플루오로탄소, 특히 적어도 하나의 말단 트리플루오로메틸기를 함유하는 플루오르화 탄소 단량체이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 말단 트리플루오로메틸기를 함유하는 플루오르화 탄소 단량체는 약 3 내지 약 20개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 이러한 플루오로탄소는 실질적으로 비분지형 플루오로알킬 또는 퍼플루오로알킬 에틸렌계 불포화 단량체이다. 일부 구현예에서, 에틸렌계 불포화 단량체는 아크릴레이트, 예컨대 메타크릴레이트이다. 일부 구현예에서, 에틸렌계 불포화 단량체는 시아노아크릴레이트이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 말단 트리플루오로메틸기를 함유하는 플루오르화 탄소 단량체는 플루오르화 또는 퍼플루오르화된 아크릴레이트, 실리콘, 에폭시, 우레탄, 또는 옥심, 또는 이의 임의의 조합이다. 이러한 제제는 플루오로아크릴레이트(또는 이의 용액) 또는 퍼플루오로알킬실란을 포함한다. 플루오로아크릴레이트 또는 이의 용액은, 비제한적으로, 플루오로알킬 메타크릴레이트 단량체 C7F15CH2OCOC(CH3)=CH2, FC-722(3M으로부터 이용가능함), 퍼플루오로코트(PerFluoroCoat, Cytonix), 및 플루오로펠(FluoroPel, Cytonix, 비제한적으로 플루오로펠 800 및 800M 제품 포함)을 포함한다. 용액은 최대 강도로 사용될 수 있지만 저농도의 코팅 중합체 또는 플루오로알칸을 형성하기 위해 용매(예컨대, 플루오로용매, 알코올, 에탄올)로 희석될 수 있다. 본 발명의 코팅을 제조하는 데 사용되는 중합체 용액은 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 50 중량%의 코팅 중합체 함량을 갖는다. 퍼플루오로알킬실란은 퍼플루오로알킬트리클로로실란 및 퍼플루오로트리스(디메틸아미노)실란(예컨대, PF10TAS)을 포함한다. 퍼플루오로알킬트리클로로실란은 다양한 길이 및 이성질(isomerism)의 퍼플루오르화된 알킬기(예컨대, C₁-C₂₀ 퍼플루오로알킬기, 예컨대 퍼플루오로메틸, 퍼플루오로에틸, 퍼플루오로프로필, 퍼플루오로부틸, 퍼플루오로-터트부틸, 퍼플루오로펜틸, 퍼플루오로헥실, 퍼플루오로옥틸, 퍼플루오로노닐, 퍼플루오로데실)에 부착된 트리클로로실릴기를 포함하는 유기 분자이다. 퍼플루오로알킬트리클로로실란의 예는, 비제한적으로 FOTS(트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란), 트리클로로((1H,1H,2H,2H-퍼플루오로데실 트리클로로실란, 및 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로도데실트리클로로실란을 포함한다. 퍼플루오로트리스(디메틸아미노)실란은 다양한 길이 및 이성질의 퍼플루오르화된 알킬기(예컨대, C₁-C₂₀ 퍼플루오로알킬기, 예컨대 퍼플루오로메틸, 퍼플루오로에틸, 퍼플루오로프로필, 퍼플루오로부틸, 퍼플루오로-터트부틸, 퍼플루오로펜틸, 퍼플루오로헥실, 퍼플루오로옥틸, 퍼플루오로노닐, 퍼플루오로데실)에 부착된 트리스(디메틸아미노)실릴기를 포함하는 유기 분자이다. 퍼플루오로알킬실란, 퍼플루오로트리스(디메틸아미노)실란 또는 퍼플루오로알킬트리클로로실란은 직접적으로(예컨대, 침지, 분무) 또는 간접적으로(예컨대, 화학 기상 증착, CVD) 적용될 수 있다.

일부 구현예에서, 플루오로탄소는 중합체로서(제외되기를 원하는 영역에 선택적으로, 또는 전체 조직 면적에 비특이적으로) 조직 박편에 직접 적용되어 마스크를 생성한다(예컨대, 플루오로아크릴레이트와 같은 플루오르화 탄소 단량체가 광개시제와 함께 조직 박편에 첨가됨). 일부 구현예에서, 플루오로탄소는 조직 박편에 적용된다(예컨대, 광개시제와 함께 비플루오르화 아크릴레이트 또는 시아노아크릴레이트를, 예를 들어 잉크젯 프린팅에 의해, 조직 박편에 초기 적용 후). 일부 구현예에서, 하나 초과의 플루오로탄소가 공중합체로서 조직 박편에 적용된다(예컨대, 플루오로아크릴레이트와 같은 플루오로탄소를 조직 박편에 초기 적용한 다음, 광개시제와 함께 비플루오르화 아크릴레이트 또는 시아노아크릴레이트를 그 위에 적용한 다음, 퍼플루오로알킬실란과 같은 동일한 플루오로탄소 또는 상이한 플루오로탄소를 그 위에 적용).

일부 구현예에서, 플루오로탄소는 중합체로서 조직 박편의 상부에 위치한 소수성 물질의 층에 적용되어 마스크를 생성한다(예컨대, 시아노아크릴레이트와 같은 소수성 중합체를, 예를 들어 분무 또는 침지에 의해, 조직 박편에 초기 적용 후). 일부 구현예에서, 플루오로탄소는 소수성 물질의 층과 동일하거나 상이한 패턴으로 소수성 물질의 층에 적용되어, 플루오로탄소 및 소수성 물질이 이들이 만나는 곳에서 공중합체 마스크를 형성하도록 한다.

일부 구현예에서, 소수성 물질의 층이 중합체로서 화학적 마스크에 적용된다(예컨대, 중합체 또는 공중합체로서 마스크 물질을 조직 박편에 초기 적용 후). 일부 구현예에서, 소수성 물질은 플루오로탄소이다. 일부 구현예에서 소수성 물질은 퍼플루오로알킬실란, 예컨대 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란((트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란)을 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 물질은 플루오로탄소를 포함한다. 일부 구현예에서 소수성 물질은 퍼플루오로알킬트리클로로실란, 예컨대 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란을 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 물질은 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란, 예컨대 PF10TAS를 포함한다.

화학적 마스크를 생성하기 위해 적용될 수 있는 다른 부류의 제제는 광촉매로 또는 광촉매 없이 광경화가능한(UV로 경화될 수 있는) 아크릴레이트 및 시아노아크릴레이트를 포함한다.

화학적 마스크를 구성하는 단량체는 적합한 용매(예컨대, 알코올, 예컨대 에탄올, 프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트, 메틸 에틸 케톤, 또는 실온보다 높은 끓는점을 갖는 적합한 플루오로탄소, 예컨대 퍼플루오로옥탄, 퍼플루오로-2-메틸펜탄, 퍼플루오로-1,3-디메틸사이클로헥산, 퍼플루오로데칼린, 1,3-디플루오로프로판 등)에 현탁된 단량체를 사용하여 비제한적으로 잉크젯 프린팅(예컨대, DOD 또는 압전 잉크젯 프린팅 방법)을 포함하는 다양한 접근법에 의해 조직 박편에 적용될 수 있다.

화학적 마스크는 하나 이상의 단량체 또는 중합체 층을 포함할 수 있다. 하나 이상의 단량체 또는 중합체 층은 동일하거나 상이한 단량체 또는 중합체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 단량체 또는 중합체 층은 공중합체를 형성할 수 있다. 하나 이상의 단량체 또는 중합체 층은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 중합체 층, 또는 그 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크는 시아노아크릴레이트의 층에 이어 퍼플루오로알킬실란(예컨대, 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란)의 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크는 시아노아크릴레이트의 다중 층에 이어 퍼플루오로알킬실란(예컨대, 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란)을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크는 플루오로아크릴레이트 또는 비실릴화된 플루오로알칸의 층에 이어 시아노아크릴레이트의 층에 이어, 퍼플루오로알킬실란(예컨대, 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란)의 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학적 마스크는 플루오로아크릴레이트 또는 비실릴화된 플루오로알칸의 다중 층에 이어 시아노아크릴레이트에 이어 퍼플루오로알킬실란(예컨대, 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란)을 포함한다.

B. 둘러싸인 관심 영역 포맷(모양, 크기, #, 분리, 어레이, 미리 선택된 ROI, 이전 이미지와의 연관성)

화학적 마스크는 후속 단리를 위해 조직 박편 상의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 데 사용될 수 있고, 이는 다양한 모양 및 크기일 수 있다. 관심 영역은 다양한 모양, 예컨대 정사각형, 원형, 타원형, 삼각형, 사다리꼴, 오각형, 육각형, 또는 n-다각형일 수 있다. 관심 영역은 약 176 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 적어도 약 176 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 최대 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 약 176 제곱 마이크론 내지 약 12,000 제곱 마이크론, 약 176 제곱 마이크론 내지 약 49,000 제곱 마이크론, 약 176 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 176 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 49,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 또는 약 190,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 약 176 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론, 약 190,000 제곱 마이크론, 또는 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 약 490 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 적어도 약 490 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 최대 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 약 490 제곱 마이크론 내지 약 12,000 제곱 마이크론, 약 490 제곱 마이크론 내지 약 49,000 제곱 마이크론, 약 490 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 490 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 49,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 또는 약 190,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 관심 영역은 약 490 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론, 약 190,000 제곱 마이크론, 또는 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다.

원형 관심 영역은 약 15 마이크론 직경 내지 약 10,000 제곱 마이크론 직경일 수 있다. 원형 관심 영역은 적어도 약 15 마이크론 직경일 수 있다. 원형 관심 영역은 적어도 약 25 마이크론 직경일 수 있다. 원형 관심 영역은 최대 약 1,000 마이크론 직경일 수 있다. 원형 관심 영역은 약 15 마이크론 직경 내지 약 50 마이크론 직경, 약 15 마이크론 직경 내지 약 125 마이크론 직경, 약 15 마이크론 직경 내지 약 250 마이크론 직경, 약 15 마이크론 직경 내지 약 500 마이크론 직경, 약 15 마이크론 직경 내지 약 750 마이크론 직경, 약 15 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 마이크론 직경, 약 15 마이크론 직경 내지 약 125 마이크론 직경, 약 50 마이크론 직경 내지 약 250 마이크론 직경, 약 50 마이크론 직경 내지 약 500 마이크론 직경, 약 50 마이크론 직경 내지 약 750 마이크론 직경, 약 50 마이크론 직경 내지 약 1,000 마이크론 직경, 약 125 마이크론 직경 내지 약 250 마이크론 직경, 약 125 마이크론 직경 내지 약 500 마이크론 직경, 약 125 마이크론 직경 내지 약 750 마이크론 직경, 약 125 마이크론 직경 내지 약 1,000 마이크론 직경, 약 250 마이크론 직경 내지 약 500 마이크론 직경, 약 250 마이크론 직경 내지 약 750 마이크론 직경, 약 250 마이크론 직경 내지 약 1,000 마이크론 직경, 약 500 마이크론 직경 내지 약 750 마이크론 직경, 약 500 마이크론 직경 내지 약 10,000 마이크론 직경, 또는 약 750 마이크론 직경 내지 약 1,000 마이크론 직경일 수 있다. 원형 관심 영역은 약 15 마이크론 직경, 약 25 마이크론 직경, 약 50 마이크론 직경, 약 125 마이크론 직경, 약 250 마이크론 직경, 약 500 마이크론 직경, 약 750 마이크론 직경, 약 1,000 마이크론 직경, 약 2,000 마이크론 직경, 약 3,000 마이크론 직경, 약 4,000 마이크론 직경, 약 5,000 마이크론 직경, 약 6,000 마이크론 직경, 약 7,000 마이크론 직경, 약 8,000 마이크론 직경, 약 9,000 마이크론 직경, 또는 약 10,000 마이크론 직경일 수 있다. 원형 관심 영역은 약 15 마이크론 이하의 직경, 약 25 마이크론 이하의 직경, 약 50 마이크론 이하의 직경, 약 125 마이크론 이하의 직경, 약 250 마이크론 이하의 직경, 약 500 마이크론 이하의 직경, 약 750 마이크론 이하의 직경, 약 1,000 마이크론 이하의 직경, 약 2,000 마이크론 이하의 직경, 약 3,000 마이크론 이하의 직경, 약 4,000 마이크론 이하의 직경, 약 5,000 마이크론 이하의 직경, 약 6,000 마이크론 이하의 직경, 약 7,000 마이크론 이하의 직경, 약 8,000 마이크론 이하의 직경, 약 9,000 마이크론 이하의 직경, 또는 약 10,000 마이크론 이하의 직경일 수 있다.

일부 구현예에서, 관심 영역이 격자를 형성하도록 하나를 초과하는 관심 영역은 조직 샘플에서 둘러싸인다. 일부 구현예에서, 격자는 약 10개의 관심 영역 내지 약 10,000개의 관심 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 적어도 약 10개의 관심 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 최대 약 10,000개의 관심 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 약 10개의 관심 영역 내지 약 100개의 관심 영역, 약 10개의 관심 영역 내지 약 1,000개의 관심 영역, 약 10개의 관심 영역 내지 약 10,000개의 관심 영역, 약 100개의 관심 영역 내지 약 1,000개의 관심 영역, 약 100개의 관심 영역 내지 약 10,000개의 관심 영역, 또는 약 1,000개의 관심 영역 내지 약 10,000개의 관심 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 약 10개의 관심 영역, 약 100개의 관심 영역, 약 1,000개의 관심 영역, 또는 약 10,000개의 관심 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 관심 영역(들)의 크기, 모양, 및/또는 패턴은 사용자 정의될 수 있다. 이러한 사용자 정의된 패턴은 적합한 시각화 기술(예컨대, 헤마톡실린/에오신 염색, 면역형광, 면역조직화학)에 의해 조직 블록 내의 더 높거나 더 낮은 수직 위치로부터 상응하는 조직 박편을 먼저 염색/영상화하고, 컴퓨터 시스템에서 조직 이미지 상에 관심 영역을 정의하고, 잉크젯 프린팅 및 컴퓨터 시스템의 지침을 사용하여 원하는 패턴을 새로운 처리되지 않은 상응하는 조직 박편에 전달함으로써 달성될 수 있다.

추출

A. 용액

화학적 마스크의 적용을 통해 조직 박편 상에 하나 이상의 관심 영역을 정의한 후, 관심 영역으로부터 핵산 및/또는 단백질을 단리하기 위해 추출 용액이 하나 이상의 관심 영역에 전달될 수 있다. 추출 용액은 하나 이상의 이온성 또는 비이온성 계면활성제(예컨대, 베타-옥틸글루코시드, 트리톤-X-100, SDS, 트윈-20, CHAPS), 프로테아제(예컨대, 프로테이나제-K, 트립신, 키모트립신, Lys-C, Asp-N, 콜라게나제), 등장성 조절제(예컨대, 덱스트로스, 글리세롤, 만니톨, 염화칼륨, 염화나트륨), 카오트로프(예컨대, 우레아, 티오우레아, 염화구아니디늄), 뉴클레아제(DNAse, RNAse), 완충제(예컨대, 트리스(Tris), 트리즈마(Trizma), MOPS, 인산나트륨, 바이카보네이트, 비신(Bicine), CAPS, CAPSO, 트리신(Tricine), HEPES, MOPSO), 프로테아제 억제제(예컨대, AEBSF·HCl, 아프로테닌(Aprotenin), 베스타틴(Bestatin), E-64d, 루펩틴(Leupeptin), 펩스타틴(Pepstatin), EDTA, PMSF), 포스파타제 억제제(예컨대, 플루오르화 나트륨, 나트륨 오르토바나데이트, 베타-글리세로포스파제, 나트륨 오르토포스페이트), 또는 뉴클레아제 억제제(예컨대, EDTA, EGTA, DEPC, RNaisin)를 포함할 수 있다. 동결된 고정되지 않은 조직 박편의 경우, 배양된 포유동물 세포로부터 핵산 또는 단백질의 단리를 위한 표준 조성물이 사용될 수 있다(예컨대, 완충제, 염, 및 계면활성제를 함유하는 용액). FFPE 조직 박편으로부터 단백질 또는 DNA의 회수를 위해, 예시적인 프로토콜은, 예를 들어, 문헌[Pikor et al. J Vis Exp. 2011;(49): 2763 또는 Paulo et al. JOP. 2013 Jul; 14(4): 405-414]에서 발견될 수 있다.

i. 가용성 태그

일부 구현예에서, 추출 용액은 관심 영역에 공간적으로 상응하는 가용성 태그를 추가로 포함할 수 있으므로, 다운스트림 다중 시퀀싱 또는 질량 분석법 데이터가 관심 영역에 할당될 수 있다.

관심 영역으로부터 유래된 핵산(예컨대, mRNA, cDNA, 게놈 DNA)의 다중 시퀀싱(예컨대, NGS 시퀀싱)을 위해, 적합한 가용성 태그는 합성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 위치적 서열(예컨대, 관심 영역에 상응하는 비랜덤 서열) 및, 선택적으로, 다운스트림 시퀀싱에서 각각의 개별 역전사된 cDNA 분자의 계수를 허용하는 고유한 분자 식별자(unique molecular identifier, UMI)를 포함한다. UMI 서열은 랜덤 서열 생성을 사용하여 생성될 수 있다. UMI 서열은 모든 공통 참조 종의 게놈에 대한 매핑에 의해 그리고 바코드 서열이 조직 샘플로부터의 핵산, 예컨대 RNA의 캡처를 방해하지 않고 어렵지 않게 서로 구별할 수 있을 것임을 보장하기 위해 미리 설정된 Tm 간격, GC 함량 및 다른 바코드 서열과의 정의된 거리 차이를 사용하여 엄격한 필터링이 이어질 수 있다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 단지 5' 또는 3' 말단 표지 또는 역전사된 cDNA의 5' 및 3' 말단 표지 모두의 태깅을 위해 위치적 및/또는 UMI 서열을 포함할 수 있다.

이러한 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 각각의 관심 영역으로부터 단리된 핵산(예컨대, RNA)의 태깅은 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 위치적/UMI 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥이고(선택적으로 헤어핀 또는 Y 모양이고/거나, 선택적으로 예컨대, 문헌[Wei et al. Genetics. 2016 Jan; 202(1): 37-44]에서와 같이 3' 말단 T-오버행을 포함함), A-테일링 후 결찰(ligation)에 의해 올리고-dT 유니버설 프라이머를 사용하여 1차 역전사효소 합성으로부터 생성된 cDNA의 어느 한 말단에 부착된다. 일부 구현예에서, 합성 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥이고 올리고-dT 서열을 추가로 포함하여, 위치적/UMI 서열이 1차 역전사 동안 cDNA 내로 포함된다. cDNA 라이브러리 태깅을 위한 다른 예시적인 프라이머 설계 및 프로토콜은, 예컨대, 문헌[Hashimshony et al. Genome Biology(2016) 17:77, Hashimony et al. Cell Rep. 2012 Sep 27;2(3):666-73, 및 Head et al. Biotechniques. 2014; 56(2): 61-여러 곳]에서 발견될 수 있다.

하나 이상의 관심 영역으로부터 유래된 단백질의 다중 질량 분석법(예컨대, LC-MS/MS)을 위해, 적합한 가용성 태그는 써모 사이엔티픽(Thermo Scientific)으로부터 이용가능한 탠덤 질량 태그(예컨대, Duplex TMT, Simplex TMT, 10plex TMT, 11plex TMT) 및 제WO2016196994A1호에 기재된 것을 포함한다. 이들은 다수의 개별 샘플로부터 유래한 트립틱 펩타이드가 MS/MS 스펙트럼 상에서 쉽게 구별될 수 있도록 분자량에 약간의 차이가 있는 관심 영역으로부터의 단백질로부터 생성된 트립틱 펩타이드에 접합하는 데 적합한 아민 반응성 태그이다(TMT 구성 및 검출의 추가 세부사항의 경우, 제WO2016196994A1호 및 Zhang et al. Methods Mol Biol. 2017; 1550:185-198 참고).

B. 제제 전달 장치

일부 구현예에서, 마스크 처리된 조직 박편 상의 관심 영역에 또는 관심 영역으로부터 추출 용액 또는 다른 성분을 전달하는 것은 하나 이상의 제제 전달 장치의 사용을 포함한다. 제제 전달 장치는 마스킹된 조직 박편 상의 관심 영역에 공간적으로 상응하는 복수의 친수성 영역(제제 전달 어레이 요소)을 포함하는 어레이를 포함한다. 소수성 경계 친수성 영역은 "표면 장력 어레이"를 나타내며, 여기서 친수성 영역에 첨가된 수용액은 경계 소수성 영역에 의해 포함되며, 제제 전달 어레이 요소의 최대 용액 부피는 친수성 영역의 면적/직경(특징부에 추가될 수 있는 용액의 "폭"을 제어함), 및 친수성 영역 및 소수성 영역의 접촉각의 차이(특징부에 첨가될 수 있는 용액의 "높이"를 제어함)을 변형함으로써 제어될 수 있다. 도 3은 추출 용액(검정색)이 충전된 제제 전달 어레이 B가 어떻게 B의 액체 돔을 조직 박편에 접촉시키고 표면 장력이 액체 메니커스(meniscus)를 조직 박편(C)에 끌어당길 수 있도록 하여 슬라이드 A 상의 관심 영역으로 용액을 전달하는 데 사용될 수 있는지 보여준다.

이러한 제제 전달 장치는 다양한 기질 상에 다양한 상이한 소수성/친수성 화학을 사용하여 생성될 수 있다. 한 가지 편리한 과정은 유리를 친수성 화합물로 유도체화한 후, 친수성 특징부를 플루오로탄소를 사용하는 코팅과 함께 포지티브 포토레지스트(positive photoresist)로 보호하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 친수성 제제 전달 어레이 특징부를 함유하는 어레이는 정량적으로 깨끗한 유리 슬라이드를 단일작용성(실란화를 위한 하나의 부착 부위) 유기실란, 예컨대 3-아미노프로필디메틸에톡시실란(APDMS)으로 유도체화한 후 제제 전달 어레이 요소/친수성 영역을 포지티브 포토레지스트로 보호하고 퍼플루오로알킬트리클로로실란, 예컨대 (트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란 또는 또 다른 적합한 마찰 방지(anti-stiction) 코팅(예컨대, 디메틸디클로로실란 DDMS, 퍼플루오로데실트리스(디메틸아미노)실란 PF10TAS, 퍼플루오로데칸산 PFDA, 또는 다양한 길이 및 이성질의 퍼플루오로알킬 사슬을 갖는 이의 변형; 예컨대, 문헌[Ashurst et al. IEEE Transactions on Device and Materials Relatability. 3(4):173-178(2003) 참고)으로 처리함으로써 생성된다. 친수성 및 소수성 영역을 갖는 유리 슬라이드의 유도체화의 추가 화학적 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Butler et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8887-8894 및 제US20150268233호 A1]에서 발견될 수 있다.

제제 전달 장치 상의 친수성 영역/제제 전달 어레이 요소의 치수는 조직 샘플 상에 마스킹된 관심 영역의 치수에 상응한다. 제제 전달 어레이 요소는 다양한 모양, 예컨대 정사각형, 원형, 타원형, 삼각형, 사다리꼴, 오각형, 육각형, 또는 n-다각형일 수 있다. 제제 전달 어레이 요소는 약 490 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 제제 전달 어레이 요소는 적어도 약 490 제곱 마이크론일 수 있다. 제제 전달 어레이 요소는 최대 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 제제 전달 어레이 요소는 약 490 제곱 마이크론 내지 약 12,000 제곱 마이크론, 약 490 제곱 마이크론 내지 약 49,000 제곱 마이크론, 약 490 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 490 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 49,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론 내지 약 190,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론, 또는 약 190,000 제곱 마이크론 내지 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 제제 전달 어레이 요소는 약 490 제곱 마이크론, 약 12,000 제곱 마이크론, 약 49,000 제곱 마이크론, 약 190,000 제곱 마이크론, 또는 약 780,000 제곱 마이크론일 수 있다. 원형 제제 전달 어레이 요소는 약 25 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 제곱 마이크론 직경일 수 있다. 원형 제제 전달 어레이 요소는 적어도 약 25 제곱 마이크론 직경일 수 있다. 원형 제제 전달 어레이 요소는 최대 약 1,000 제곱 마이크론 직경일 수 있다. 원형 제제 전달 어레이 요소는 약 25 제곱 마이크론 직경 내지 약 50 제곱 마이크론 직경, 약 25 제곱 마이크론 직경 내지 약 125 제곱 마이크론 직경, 약 25 제곱 마이크론 직경 내지 약 250 제곱 마이크론 직경, 약 25 제곱 마이크론 직경 내지 약 500 제곱 마이크론 직경, 약 25 제곱 마이크론 직경 내지 약 750 제곱 마이크론 직경, 약 25 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 제곱 마이크론 직경, 약 50 제곱 마이크론 직경 내지 약 125 제곱 마이크론 직경, 약 50 제곱 마이크론 직경 내지 약 250 제곱 마이크론 직경, 약 50 제곱 마이크론 직경 내지 약 500 제곱 마이크론 직경, 약 50 제곱 마이크론 직경 내지 약 750 제곱 마이크론 직경, 약 50 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 제곱 마이크론 직경, 약 125 제곱 마이크론 직경 내지 약 250 제곱 마이크론 직경, 약 125 제곱 마이크론 직경 내지 약 500 제곱 마이크론 직경, 약 125 제곱 마이크론 직경 내지 약 750 제곱 마이크론 직경, 약 125 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 제곱 마이크론 직경, 약 250 제곱 마이크론 직경 내지 약 500 제곱 마이크론 직경, 약 250 제곱 마이크론 직경 내지 약 750 제곱 마이크론 직경, 약 250 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 제곱 마이크론 직경, 약 500 제곱 마이크론 직경 내지 약 750 제곱 마이크론 직경, 약 500 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 제곱 마이크론 직경, 또는 약 750 제곱 마이크론 직경 내지 약 1,000 제곱 마이크론 직경일 수 있다. 원형 제제 전달 어레이 요소는 약 25 제곱 마이크론 직경, 약 50 제곱 마이크론 직경, 약 125 제곱 마이크론 직경, 약 250 제곱 마이크론 직경, 약 500 제곱 마이크론 직경, 약 750 제곱 마이크론 직경, 또는 약 1,000 제곱 마이크론 직경일 수 있다.

일부 구현예에서, 제제 전달 어레이 요소가 격자를 형성하도록 하나 초과의 제제 전달 어레이 요소는 제제 전달 장치 상에 프린팅된다. 일부 구현예에서, 격자는 약 10개의 제제 전달 어레이 요소 내지 약 10,000개의 제제 전달 어레이 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 적어도 약 10개의 제제 전달 어레이 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 최대 약 10,000개의 제제 전달 어레이 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 약 10개의 제제 전달 어레이 요소 내지 약 100개의 제제 전달 어레이 요소, 약 10개의 제제 전달 어레이 요소 내지 약 1,000개의 제제 전달 어레이 요소, 약 10개의 제제 전달 어레이 요소 내지 약 10,000개의 제제 전달 어레이 요소, 약 100개의 제제 전달 어레이 요소 내지 약 1,000개의 제제 전달 어레이 요소, 약 100개의 제제 전달 어레이 요소 내지 약 10,000개의 제제 전달 어레이 요소, 또는 약 1,000개의 제제 전달 어레이 요소 내지 약 10,000개의 제제 전달 어레이 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 격자는 약 10개의 제제 전달 어레이 요소, 약 100개의 제제 전달 어레이 요소, 약 1,000개의 제제 전달 어레이 요소, 또는 약 10,000개의 제제 전달 어레이 요소를 포함한다.

제제 전달 어레이 요소는 광범위한 부피를 수용하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제 전달 어레이 요소의 최대 부피는 약 2 피코리터 내지 약 10,000 피코리터이다. 일부 구현예에서, 제제 전달 어레이 요소의 최대 부피는 적어도 약 2 피코리터이다. 일부 구현예에서, 제제 전달 어레이 요소의 최대 부피는 최대 약 10,000 피코리터이다. 일부 구현예에서, 제제 전달 어레이 요소의 최대 부피는 약 2 피코리터 내지 약 10 피코리터, 약 2 피코리터 내지 약 50 피코리터, 약 2 피코리터 내지 약 100 피코리터, 약 2 피코리터 내지 약 250 피코리터, 약 2 피코리터 내지 약 500 피코리터, 약 2 피코리터 내지 약 1,000 피코리터, 약 2 피코리터 내지 약 10,000 피코리터, 약 10 피코리터 내지 약 50 피코리터, 약 10 피코리터 내지 약 100 피코리터, 약 10 피코리터 내지 약 250 피코리터, 약 10 피코리터 내지 약 500 피코리터, 약 10 피코리터 내지 약 1,000 피코리터, 약 10 피코리터 내지 약 10,000 피코리터, 약 50 피코리터 내지 약 100 피코리터, 약 50 피코리터 내지 약 250 피코리터, 약 50 피코리터 내지 약 500 피코리터, 약 50 피코리터 내지 약 1,000 피코리터, 약 50 피코리터 내지 약 10,000 피코리터, 약 100 피코리터 내지 약 250 피코리터, 약 100 피코리터 내지 약 500 피코리터, 약 100 피코리터 내지 약 1,000 피코리터, 약 100 피코리터 내지 약 10,000 피코리터, 약 250 피코리터 내지 약 500 피코리터, 약 250 피코리터 내지 약 1,000 피코리터, 약 250 피코리터 내지 약 10,000 피코리터, 약 500 피코리터 내지 약 1,000 피코리터, 약 500 피코리터 내지 약 10,000 피코리터, 또는 약 1,000 피코리터 내지 약 10,000 피코리터이다. 일부 구현예에서, 제제 전달 어레이 요소의 최대 부피는 약 2 피코리터, 약 10 피코리터, 약 50 피코리터, 약 100 피코리터, 약 250 피코리터, 약 500 피코리터, 약 1,000 피코리터, 또는 약 10,000 피코리터이다.

C. 검출 기술

이후, 적어도 하나의 관심 영역으로부터 추출된 생체분자는 관심 영역 내의 세포의 생체분자 발현 프로파일, 또는 관심 영역 내의 세포의 게놈 DNA 조성을 분석하기 위해 검출된다(예컨대, 암성 세포를 함유하는 조직 세포의 경우, 조직 박편 내의 세포의 게놈 DNA는 돌연변이, 결실, 및/또는 전좌로 인해 이질적일 수 있음). 따라서, 본원에 함유된 방법, 장치, 및 조성물은 관심 영역 내의 세포의 유전적 및 후성유전적 특징 모두를 분석하는 데 사용될 수 있다.

일부 방법에서, 적어도 하나의 관심 영역 내의 생체분자(예컨대, mRNA, 또는 역전사에 의해 mRNA로부터 유래된 cDNA, 또는 게놈 DNA)의 발현 수준은 시퀀싱에 의해 결정된다. 시퀀싱 방법은 차세대 시퀀싱, 고처리량 시퀀싱, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 고전적인 생거 시퀀싱 방법, 결찰에 의한 시퀀싱(sequencing-by-ligation), 합성에 의한 시퀀싱, 혼성화에 의한 시퀀싱, RNA-Seq(Illumina), 디지털 PCR, 디지털 유전자 발현(Helicos), 차세대 시퀀싱, 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱(SMSS)(Helicos), 이온 토렌트 시퀀싱 기계(Life Technologies/Thermo-Fisher), 대규모 병렬 시퀀싱, 클론 단일 분자 어레이(Solexa), 샷건 시퀀싱, 막심-길버트 시퀀싱, 및 프라이머 워킹(primer walking)을 포함할 수 있다.

일부 방법에서, 적어도 하나의 관심 영역 내의 생체분자(예컨대, mRNA, 또는 역전사에 의해 mRNA로부터 유래된 cDNA)의 발현 수준은 정량적 PCR(qPCR) 또는 Taqman으로도 알려진 소위 "실시간 증폭" 방법에 의해 결정된다(예컨대, 미국 특허 제5,210,015호, Gelfand, 제5,538,848호, Livak, et al., 및 제5,863,736호, Haaland, 뿐만 아니라 Heid, C.A., et al., Genome Research, 6:986-994(1996); Gibson, U.E.M, et al., Genome Research 6:995-1001(1996); Holland, P. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280,(1991); 및 Livak, K.J., et al., PCR Methods and Applications 357-362(1995) 참고). 증폭 산물의 형성을 모니터링하는 이 방법의 기초는 이중 표지된 형광발생 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 PCR 산물 축적을 지속적으로 측정하는 것이다. 이러한 분석에 사용되는 프로브는 전형적으로 2개의 상이한 형광 염료로 표지된 짧은(약 20-25개의 염기) 폴리뉴클레오타이드이다. 프로브의 5' 말단은 전형적으로 리포터 염료에 부착되고 3' 말단은 ??칭 염료에 부착된다. 프로브는 유래된 표적 mRNA 또는 핵산 상의 부위와 적어도 실질적인 서열 상보성을 갖도록 설계된다. 유전자좌의 측면 영역에 결합하는 업스트림 및 다운스트림 PCR 프라이머가 또한 반응 혼합물에 추가된다. 프로브가 온전한 상태이면, 2개의 형광단 사이의 에너지 전달이 발생하고 ??처가 리포터로부터 발광을 소멸시킨다. PCR의 연장 단계 동안, 프로브는 Taq 중합효소와 같은 핵산 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단되어, 폴리뉴클레오타이드-??처로부터 리포터를 방출하고 적절한 검출기에 의해 측정될 수 있는 리포터 발광 강도의 증가를 초래한다. 그리고 나서, 기록된 값은 정규화된 리포터 발광 강도의 증가를 연속적인 방식으로 계산하고 궁극적으로 증폭될 mRNA의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, qPCR 또는 Taqman 검출을 위해, RT-PCR 단계가 먼저 수행되어 세포 RNA로부터 cDNA를 생성한다. RT-PCR에 의한 이러한 증폭은 일반적(예컨대, 부분/완전 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 증폭)이거나 표적화(예컨대, 이후 단계에서 분석될 특정 유전자에 대한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 증폭)될 수 있다.

일부 구현예에서, qPCR 또는 Taqman은 단리된 세포 mRNA 상에서 수행된 역전사효소 반응 직후에 사용되며; 이 종류는 qPCR 동안 개별 mRNA의 수준을 정량화하는 역할을 한다.

qPCR 또는 Taqman의 경우, 특정 유전자의 수준은 동일한 검출 방법을 사용하여 동일한 샘플로부터 측정된 하나 이상의 내부 대조 유전자와 비교하여 표현될 수 있다. 내부 대조 유전자는 소위 "하우스키핑(housekeeping)" 유전자(예컨대, ACTB, B2M, UBC, GAPD 및 HPRT1)를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, qPCR 또는 Taqman 검출 또는 RNA 시퀀싱을 위해, 세포 RNA로부터 전사된 cDNA 상에서 "전증폭(pre-amplification)" 단계가 먼저 수행된다. 이는 검출될 RNA/cDNA의 자연 수준이 매우 낮은 조건에서 신호를 증가시키는 역할을 한다. 전증폭을 위한 적합한 방법은 비제한적으로 LM-PCR, 랜덤 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR(예컨대, 랜덤 헥사머 PCR), 폴리-A 특이적 프라이머를 사용한 PCR, 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 전증폭은 전술한 역전사 반응과 동일한 방식으로 일반적이거나 표적화될 수 있다.

mRNA 수준은 또한, 예를 들어 Panomics로부터의 QuantiGene® 시약 시스템과 같은 분지형 핵산 프로브를 사용하여, 프로브에의 혼성화에 의해 증폭 없이 측정될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 적어도 하나의 관심 영역으로부터의 유전자의 발현 수준은 단백질 수준에서 결정될 수 있으며, 이는 상기 논의된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준이 측정된다는 것을 의미한다. 예컨대, 미국 특허 제6,143,576호; 제6,113,855호; 제6,019,944호; 제5,985,579호; 제5,947,124호; 제5,939,272호; 제5,922,615호; 제5,885,527호; 제5,851,776호; 제5,824,799호; 제5,679,526호; 제5,525,524호; 및 제5,480,792호에 기재된 바와 같은 면역분석을 포함하는 단백질의 수준을 결정하기 위한 몇 가지 방법 및 장치가 널리 알려져 있다. 이들 분석은 관심 단백질 분석물의 존재 또는 양과 관련된 신호를 생성하기 위한 다양한 샌드위치, 경쟁적, 또는 비경쟁적 분석 포맷을 포함한다. 임의의 적합한 면역분석, 예를 들어, 측면 유동(lateral flow), 효소 결합 면역분석(ELISA), 방사선면역분석(RIAs), 경쟁적 결합 분석 등이 이용될 수 있다. 항체 어레이를 위한 수많은 포맷이 항체를 이용하는 것으로 제안되었다. 이러한 어레이는 전형적으로 검출하고자 하는 상이한 단백질에 대해 특이성을 갖는 상이한 항체를 포함한다. 예를 들어, 일반적으로 적어도 100개의 상이한 항체가 100개의 상이한 단백질 표적을 검출하는 데 사용되며, 각 항체는 하나의 표적에 대해 특이적이다. 제WO/2008/048970호에 개시된 합성 항체와 같이 특정 단백질 표적에 대해 특이성을 갖는 다른 리간드가 또한 사용될 수 있다. 원하는 결합 특이성을 갖는 다른 화합물이 펩타이드 또는 소분자의 랜덤 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 미국 특허 제5,922,615호는 어레이 내의 다중 표적 항원을 검출하기 위해 막 상의 고정화된 항체의 다수의 개별 구역을 이용하는 장치를 기술한다. 미국 특허 제5,458,852호, 제6,019,944호, 제6,143,576호. 마이크로타이터 플레이트(microtiter plater) 또는 자동화는 많은 수의 상이한 단백질의 검출을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 단백질 수준은 또한 질량 분석법(예컨대, 탠덤 LC/MS/MS)에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 영역으로부터 단리된 게놈 DNA는 분석된다(예컨대, 상기 언급된 시퀀싱 기술 중 어느 것에 의해, 또는 qPCR에 의해). 이러한 분석은 비제한적으로 유전자 내부 및 주위의 뉴클레오타이드 서열에서의 변이, SNP의 존재, 삽입, 결실, 및/또는 카피수 변이를 포함하는 게놈 변이를 검출하는 역할을 할 수 있다. 이 구현예의 일부 변형에서, 단리된 DNA는 제한된 샘플로부터 DNA 서열에 대한 능력을 개선하기 위해 전체 게놈 증폭(WGA) 기술에 의해 먼저 증폭된다.

일부 구현예에서, WGA 기술은 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 프라이밍된(DOP) PCR로서 알려진 2단계 기술이다. 1단계에서, DOP-PCR은 a) 이들의 3' 말단 상에 무작위의 6개의 뉴클레오타이드 서열, 및 b) PCR 증폭을 위한 최적 T_m을 갖는 고정된 어댑터(adapter) 서열(선택적으로 샘플 인덱스 및/또는 고유한 분자 식별자를 포함하는 바코드를 함유함)을 함유하는 프라이머를 사용하며; 랜덤 프라이머는 낮은 어닐링 온도에서 샘플에 혼성화된 후 더 높은 온도에서 중합효소를 사용하여 가닥 연장된다. 2단계에서, 1단계 프라이머의 5' 고정된 어댑터 서열(및 선택적으로 그들의 5' 말단 상에 샘플 인덱스 및/또는 고유한 분자 식별자를 포함하는 바코드를 포함함)에 상보적인 3' 말단을 함유하는 프라이머는 1단계보다 더 높은 온도에서의 PCR 어닐링을 사용하여 1단계로부터의 산물을 증폭시킨다.

일부 구현예에서, WGA 기술은 다중 변위 증폭(MDA)으로 알려진 1단계 등온 기술이다. MDA는 DOP-PCR의 1단계와 유사한 프라이머, 예컨대, a) 이들의 3' 말단 상에 무작위의 6개의 뉴클레오타이드 서열, 및 b) 고정된 어댑터 서열(선택적으로 샘플 인덱스 및/또는 고유한 분자 식별자를 포함하는 바코드를 함유함)을 함유하는 프라이머를 사용할 수 있다. 그러나, Taq와 같은 종래의 PCR DNA 중합효소 대신에, MDA는 φ29 DNA 중합효소와 같은 가닥 치환 중합효소를 사용한다. 단리된 DNA는 등온 조건하에 사이클링하지 않고 프라이머 및 φ29 DNA 중합효소를 사용하여 증폭된다.

일부 구현예에서, WGA 기술은 다중 어닐링 및 루핑 기반 증폭 사이클(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles; MALBAC)로 알려진 유사 선형(quasi-linear) 증폭 기술이다. 1단계에서, MALBAC는 5' 말단에 공통 27개 뉴클레오타이드 서열(예컨대, GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG) 및 3' 말단에 8개의 무작위 뉴클레오타이드를 갖는 특수 설계된 프라이머를 사용하며; 먼저 낮은 온도(예컨대, 15-20℃)에서 어닐링한 다음 더 높은 온도(예컨대, 70-75℃)에서 가닥 치환 중합효소(예컨대, Bst DNA 중합효소)를 사용하여 연장함으로써 이들 프라이머를 사용하여 반-앰플리콘(semi-amplicon)이 생산된다. 프라이머를 템플레이트로부터 멜팅한 후(예컨대, 95℃ 이상), 저온(예컨대, 15-20℃), 고온(예컨대, 70-75℃), 변성 온도(예컨대, 95℃ 이상) 및 헤어핀 형성(예컨대, 58℃)의 반복된 사이클(예컨대, 10+ 사이클)이 반-앰플리콘을 전체 앰플리콘으로 추가 증폭하는 데 사용된다. 전체 앰플리콘은 동일한 5' 27-뉴클레오타이드 서열(예컨대, GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG)을 함유하기 때문에, 헤어핀 형성 단계는 이들이 제조되면 증폭의 이후 사이클에 더 참여하지 않도록 이들을 제거한다. 이것은 원래의 DNA로부터 카피의 카피의 카피가 만들어지지 않기 때문에 보다 선형인 증폭을 보장한다.

일부 구현예에서, WGA 기술은 Pico-Plex^TM(Takara Bio)의 파생물이고/거나 미국 특허 제8,206,913호에 기재되어 있다. 이들 기술 및 파생물은 전체 게놈의 완전 랜덤 프라이머 증폭과 관련된 일부 문제(예컨대, 특정 영역의 과소 표시)를 바로잡고자 시도한다. 일부 구현예에서, 자기 불활성(예컨대, 비자기 프라이밍) 축퇴성 프라이머는 등온 증폭 단계이거나 ~15-20℃에서 초기 어닐링 단계 후 ~75℃에서 연장 단계(예컨대, 중온성 DNA 중합효소 이용)일 수 있는 이 방법의 1단계에서 사용된다. 일부 구현예에서, 이들 프라이머는 a) 5' 고정된 영역, b) 3' 가변 영역을 포함하며, 프라이머가 교차 혼성화 또는 자가 혼성화하지 않도록 설계된다. 일부 구현예에서, 가변 영역은 부분 축퇴성 서열(예컨대, 모두 Ys, Rs, Ks, 또는 Ms일 수 있는 10nt 길이, Y = 무작위 C 또는 T; R = 무작위 A 또는 G; M = 무작위 A 또는 C; K = 무작위 G 또는 T) 및 완전 축퇴성 서열(예컨대, 2 nt 길이, Ns, 무작위 A/C/T/G)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 불활성 축퇴성 프라이머의 불변 및 가변 영역은 본질적으로 아데닌 및 구아닌; 아데닌 및 시토신; 구아닌 및 티미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 유형의 비상보적 뉴클레오타이드만으로 구성된다. 일부 구현예에서, 등온 증폭 단계에 사용되는 자기 비활성 축퇴성 프라이머는 하기 표 1의 서열번호 1-8 중 어느 것에 따른다.

표 1: 예시적인 프라이머 서열

일부 구현예에서, 열안정성 DNA 중합효소를 사용한 추가의 증폭 단계가 상기 증폭된 DNA 상에서 수행된다. 추가의 증폭 단계는 등온 증폭 단계에서 사용되는 프라이머로부터의 5' 고정된 영역만으로 구성된 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 프라이머는 표 1의 서열번호 8-12 중 어느 것이다. 추가 증폭 단계는 열안정성 DNA 중합효소를 사용하는 정상 PCR 사이클링(예컨대, 변성, 어닐링, 연장)의 >10 사이클을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클링 조건은 상기 MALBAC의 방법과 유사한 헤어핀 DNA의 형성을 촉진하기 위해 연장 단계 후에 추가적인 저온 단계를 포함한다.

실시예

실시예 1A. - 조직 박편에 소수성 마스크를 적용하기 위한 프로토콜

컴퓨터 지원 잉크젯 시스템을 사용하여 조직 샘플에 코팅의 격자 패턴을 적용하여 복수의 일정한 간격의 비코팅된 영역이 생성되도록 한다. 코팅은 알코올 또는 케톤 용매 및 광개시제 내에 본원에 기재된 바와 같은 플루오로알킬 아크릴레이트 단량체와 혼합된 비플루오르화 아크릴레이트 또는 시아노아크릴레이트를 포함한다. 이후, 박편을 UV 광에 잠깐 노출시켜 코팅을 경화시킨다.

실시예 1B. - 조직 박편에 소수성 마스크를 적용하기 위한 대안적인 프로토콜

컴퓨터 지원 잉크젯 시스템을 사용하여 조직 샘플에 제1 코팅의 격자 패턴을 적용하여 복수의 일정한 간격의 비코팅된 영역이 생성되도록 한다. 제1 코팅은 비플루오르화 아크릴레이트 또는 시아노아크릴레이트 및 광개시제를 포함한다. 제1 코팅을 UV 광에 잠깐 노출시켜 경화시킨다. 그 다음, 컴퓨터 지원 잉크젯 시스템을 또한 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 플루오로알킬 아크릴레이트 단량체 및 광개시제를 포함하는 제2 코팅을 제1 코팅 위에 첨가한다. 그리고 나서, 제2 코팅을 UV 광에 잠깐 노출시켜 경화시킨다.

실시예 2. - 소수성 화학을 사용하여 조직 샘플 내의 관심 영역의 단리

FFPE 간세포 암종 조직 박편을 탈파라핀화하거나 하지 않고 그리고 플루오로알킬 아크릴레이트 단량체를 사용하여 관심 영역을 소수성 마스킹하거나 하지 않고 헤마톡실린/에오신 염색하였다. 생성된 슬라이드의 사진이 도 1에 제시되어 있다. FFPE 조직 박편의 탈파라핀화 후 실시예 1의 소수성 화학 처리는 마스킹된 관심 영역의 효과적인 수성 단리를 유발하여, 이들의 헤마톡실린/에오신 염색을 방지하였다.

실시예 3. - FFPE 마우스 간 박편에서 다양한 크기의 영역의 단리

FFPE 마우스 간 박편을 탈파라핀화 및 마스킹하여 다양한 크기(100, 250, 500, 1000 마이크론 직경) 및 모양(정사각형 및 원형)의 영역을 분리하고, 헤마톡실린/에오신으로 염색하여 관심 영역의 친수성 접근성(및 주변 소수성 마스크의 접근불가능성), 뿐만 아니라 마스크의 잉크젯 적용의 정확성/정밀도를 입증하였다. 도 2A는 ~160 또는 ~550 마이크론 직경의 영역이 화학적 마스크의 잉크젯 프린팅을 사용하여 명확하게 정의될 수 있음을 보여준다. 도 2B는 ~300 또는 ~1000 마이크론 직경의 영역이 화학적 마스크의 잉크젯 프린팅을 사용하여 명확하게 정의될 수 있음을 보여준다. 도 2C는 원형 및 다각형 모양 모두가 박편으로부터 단리될 수 있음을 입증한다. 도 2E는 직경 2 mm의 영역이 박편 상에서 명확히 정의될 수 있음을 보여준다. 도 2D는 다양한 직경(100, 250, 500, 1 mm) 및 모양(정사각형 및 원형)의 영역이 단일 조직 박편 상에서 명확하게 정의된 격자로 프린팅될 수 있음을 보여준다.

실시예 4. - 소수성 마스킹은 마스킹된 영역으로부터 핵산의 추출을 차단한다

FFPE 조직 박편을 실시예 1A 또는 실시예 1B의 방법에 따라 마스킹하여 다양한 크기를 갖는 관심 영역을 생성하였다.

슬라이드를 55-60℃ 오븐에서 1시간 동안 베이킹하고, 자일렌에서 3분 동안 2회 침지하고, 100% 에탄올에서 3분 동안 2회 침지함으로써 탈파라핀화하였다. 슬라이드를 선택적으로 최대 1개월 동안 에탄올에서 저장하였다.

추가 분석을 위해, 슬라이드를 공기 건조시켜 에탄올을 제거하고, 조직을 용해시켰다. 접착 챔버를 조직 영역을 둘러싸는 슬라이드에 부착하고, Qiagen 조직 용해 완충제 ATL을 함유하는 600 마이크로리터의 프로테이나제-K를 첨가하고, 챔버를 접착 필름으로 밀봉하고, 슬라이드를 56℃에서 1시간 동안 열 블록 상에서 인큐베이션하였다. 액체(~450 마이크로리터)를 원심분리 튜브에서 슬라이드 챔버로부터 수집한 다음, 원심분리 튜브를 90℃에서 1시간 동안 가열하였다. 그리고 나서, 원심분리 튜브를 원심분리하여 불용성 물질을 펠렛화하고, 상층액을 새 튜브로 제거하고, 45 마이크로리터의 RNAse A(100 mg/ml)로 처리한 다음 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 동일한 부피의 Qiagen 완충제 AL(~500 마이크로리터)을 상층액에 첨가하고, 샘플을 볼텍싱에 의해 혼합하였다. 볼텍싱 후, 동일한 양의 100% 에탄올(~500 마이크로리터)을 상층액에 첨가하고, 전체 용액을 Qiagen min-elute 컬럼으로 옮겼다. 컬럼을 제조사의 지침에 따라 완충제 AW1 및 AW2를 사용하여 세척하였고, 핵산을 Qiagen 완충제 ATE에서 용리시켰다. 그리고 나서, 각 샘플로부터의 핵산을 Qubit 분광광도계 상에서 정량화하였다. 관심 영역의 크기 및 추출된 DNA 사이의 관계가 표 2에 제시되어 있다. DNA 수율 대 코팅되지 않은 표면적에 대한 데이터는 DNA 수율이 커버된 면적에 비례한다는 것을 나타내며, 이는 DNA가 소수성 코팅에 의해 커버된 조직 박편의 추출된 면적이 아님을 시사한다.

표 2: 소수성 코팅된 슬라이드에 대한 코팅되지 않은 표면적 대 DNA 수율

실시예 5. - 최적화된 소수성 코팅 절차:

A) 작은 특징부(< 1 mm 직경 )를 위한 절차

조직 샘플이 FFPE 샘플인 경우, 조직 샘플을 먼저 표준 절차(예컨대, 오븐에서 대략 60도에서 1시간 동안 베이킹한 다음, 자일렌에서 3분 동안, 자일렌에서 3분 동안, 100% EtOH에서 3분 동안, 100% EtOH에서 3분 동안 인큐베이션하고, 5분 동안 공기 건조)에 의해 탈파라핀화한다. 조직 표면을 플루오로아크릴레이트 또는 마이크론 크기의 플루오로입자를 함유하는 알코올 용액에서 분무 또는 침지함으로써 초기 소수성 코팅으로 코팅하고; 예는 비제한적으로 플루오로-펠 800 또는 800M을 포함한다. 그리고 나서, 슬라이드를 공기 건조시킨다(이 초기 처리는 다음의 시아노아크릴레이트 프린팅 단계에 의해 작은 특징부의 정의를 개선한다).

광개시제를 함유하는 시아노아크릴레이트의 용액을 조직 샘플 상에 잉크젯 프린팅하여 제외하고자 하는 면적, 또는 원하는 특징부를 분리하는 면적 위에 마스크를 형성한다. 프린팅 동안, 시아노아크릴레이트는 증착 후 최소 1초 동안 UV 광(예컨대, ~ 400 mJ/cm2에서 395 nm)에의 노출을 통해 고정된다. 그리고 나서, 슬라이드를 프린팅 장치로부터 제거하고, 즉시 연장된 UV 경화(예컨대, 약 5분 동안 ~400 mJ/cm2에서 395 nm)에 적용한다.

UV 경화 후, 전체 슬라이드를 퍼플루오로알킬트리클로로실란(예컨대, FOTS, 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란))의 진공 보조 기상 증착에 적용한다. 이 기술의 적용은 25 마이크론 정도로 작은 직경을 갖는 FFPE 인간 간 조직 박편 상에 원형 관심 영역의 생성을 허용하였다.

B) 큰 특징부(대략 약 1 mm 이상)를 위한 절차

조직 샘플이 FFPE 샘플인 경우, 조직 샘플을 먼저 표준 절차(예컨대, 오븐에서 대략 60도에서 1시간 동안 베이킹한 다음, 자일렌에서 3분 동안, 자일렌에서 3분 동안, 100% EtOH에서 3분 동안, 100% EtOH에서 3분 동안 인큐베이션하고, 5분 동안 공기 건조)에 의해 탈파라핀화한다. 더 큰 특징부는 초기 플루오로알킬 코팅을 포기할 수 있다. 광개시제를 함유하는 시아노아크릴레이트의 용액을 제외하고자 하는 면적, 또는 원하는 특징부를 분리하는 면적에서 조직 샘플 상에 잉크젯 프린팅한다. 프린팅 동안, 시아노아크릴레이트는 증착 후 최소 1초 동안 UV 광(예컨대, ~ 400 mJ/cm2에서 395 nm)에 노출을 통해 고정된다. 그리고 나서, 슬라이드를 프린팅 장치로부터 제거하고, 즉시 연장된 UV 경화(예컨대, 약 5분 동안 ~400 mJ/cm2에서 395 nm)에 적용한다.

UV 경화 후, 전체 슬라이드를 퍼플루오로알킬실란(예컨대, 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란)의 진공 보조 기상 증착에 적용한다.

실시예 6. - 소수성 분리된 영역의 용해 및 단리

상기 조직 샘플에 적용된 마스크의 제외되지 않은 면적에 상응하는 친수성 특징부를 갖는 표면 장력 어레이를 문헌[US20150268233 A1 또는 Butler et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8887-8894]에서와 같이 제조한다. 이 유도체화 절차는 정량적으로 깨끗한 유리 슬라이드를 3-아미노프로필디메틸에톡시실란(APDMS)과 같은 단일작용성(실란화를 위한 하나의 부착 부위) 유기실란으로 코팅한 다음 제외되지 않은 면적/친수성 영역을 포지티브 포토레지스트로 보호하고 퍼플루오로알킬실란(예컨대, (트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란)과 같은 마찰 방지(anti-stiction) 코팅으로 처리하는 것을 포함한다.

세제를 함유하는 적합한 용해 완충제를 표면 장력 어레이의 친수성 특징부에 적용한다. 용해 완충제를 갖는 친수성 영역을 함유하는 표면 장력 어레이를 실시예 1A, 1B, 또는 5에서와 같이 제조된 조직 샘플에 접촉시킨다. 세포 용해를 허용하기 위한 적합한 시간 동안 접촉시킨다. 표면 장력 어레이(용해된 세포 성분을 포함하는 용해 완충제를 함유함)를 조직 박편과의 접촉으로부터 제거하고, 표면 장력 어레이 상의 개별 스팟을 원하는 특성(예컨대, 단백질 또는 핵산 풍부, 서열, 또는 둘 모두)에 대해 조사한다.

실시예 7. - 코팅된 표면 상에서 접촉각 측정.

FFPE 조직 박편 또는 유리 슬라이드를 실시예 5B에 제시된 코팅 절차의 상이한 단계에 적용하였고, FOTS((트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란)를 갖는 상이한 길이의 증기상 코팅에 적용하였다. 접촉각 측정을 망원경-측각기(Telescope-Goniometer)에 의한 직접 측정을 사용하여 수행하였다(예컨대, Bracco and Holst. Surface Science Techniques. 2013. ISBN 978-3-642-34243-1. pp.3-34. 참고). 데이터는 조직 박편의 상부에 시아노아크릴레이트를 첨가하는 것이 FOTS에 의한 코팅을 향상시키고, 둘의 조합이 조합된 FOTS/시아노아크릴레이트 조직 표면의 접촉각을 매우 소수성인(110을 초과하는 접촉각) 범위로 증가시킨다는 것을 입증한다.

표 3: 다양한 코팅을 갖는 조직 또는 유리에 대한 접촉각 측정

실시예 8. - 소수성 마스킹된 FFPE 조직 박편으로부터 단리된 RNA의 qPCR

동일한 FFPE 유방암 조직 샘플(Biomax, huCAT299)로부터의 다양한 연속 박편을 실시예 5의 최적화된 코팅 절차에 적용하여 비암성 조직, 이행 조직(예컨대, 일부 비암성 및 일부 암성 조직), 및 암성 조직을 포함하는 다양한 상이한 관심 영역을 선택하였다(도 7 및 8 참고, 도 8의 좌측은 다양한 조직 층/박편에 적용된 상이한 마스크 패턴을 보여주고, 우측은 마스킹 후 단리된 다양한 조직 관심 영역을 보여줌). 코팅 후, 슬라이드에 세제 함유 용해 완충제 및 프로테이나제 K를 적용하여 관심 영역을 용해시켰다(용해 완충제를 또한 대조군으로서 코팅 영역에 적용하였음). 용해 완충제를 직접 영역 상에 두고 56℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 도 8에 나타낸 샘플로부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 NucleoSpin totalRNA FFPE XS 키트(Takara Bio)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제하였고, 샘플로부터의 RNA 양을 Qubit 형광 분석에 의해 정량화하였다. qPCR 분석 패널을 샘플로부터 추출된 RNA 상에서 수행하여 유방암에서 풍부한 것으로 알려진 유전자를 검출하였다(샘플로부터의 각각의 알려진 종양 풍부 유전자의 qPCR Ct 값을 도시하는 도 9 참고). 분석은 예상대로 종양 샘플에서 qPCR에 의해 검출된 유전자의 수준이 건강한 조직보다 암성 조직에서 더 특징적이라는 것을 나타내었고, 이는 마스크가 선택적 용해를 위해 조직 영역을 단리하는 데 효과적이라는 것과 소수성 코팅 절차가 정의된 관심 영역으로부터 해방된 핵산의 다운스트림 증폭을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.

전술한 마스킹 절차에 의해 단리된 RNA 샘플을 동일한 샘플(도 9 패널 B에서 "튜브"로 표시됨) 상에서 수행된 통상적인 수동 공간 단리 기술과 비교하였다. qPCR Ct 수를 하우스키핑 유전자 GAPDH에 비교하여 계산하였고, 데이터를 그래프화하였다(도 9). 두 가지 방법을 통한 유전자의 발현 수준은 높은 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌고, 이는 소수성 마스킹 절차가 수동 단리 워크플로우와 동등하다는 것을 나타낸다.

추가로, 예시적인 마스킹된 조직 영역에 대해, 마스킹되거나 마스킹되지 않은 영역에 적용된 용해 완충제에 의해 해방된 핵산의 양을 비교하였다(도 9 패널 C). 분석은 극적으로 적은 핵산이 커버된 영역으로부터 단리되었다는 것을 입증하며, 이는 소수성 마스크가 절차에서 원하는 않는 조직을 용해로부터 제외하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.

추가로, 유방암에서 선택적으로 발현되는 유전자를 검출하기 위해 설계된 177개의 qPCR 분석의 세트를 마스킹된 종양 샘플로부터 단리된 RNA에서 수행하였다. 177개의 고유한 발현된 qPCR 산물이 마스킹 절차에 의해 암성 샘플로부터 해방된 RNA 내에서 검출되었으며, 이는 발현된 게놈의 광범위한 부분이 마스킹 절차에 의해 단리된 암성 세포로부터 단리되었음을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 당업자에게 수많은 변형, 변경, 및 대체가 일어날 것이다. 본원에 기재된 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 내의 방법 및 구조 및 이들의 균등물이 이에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> QUANTUMCYTE, INC. <120> METHODS, COMPOSITIONS, AND DEVICES FOR ISOLATION AND EXPRESSION ANALYSIS OF REGIONS OF INTEREST FROM A TISSUE <130> 44424-704.601 <140> PCT/US2019/020610 <141> 2019-03-04 <150> 62/691,559 <151> 2018-06-28 <150> 62/637,998 <151> 2018-03-02 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, c, t, or g <400> 1 cctttctctc ccttctctyy yyyyyyyynn 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, c, t, or g <400> 2 agagaaggga gagaaaggrr rrrrrrrrnn 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, c, t, or g <400> 3 ccaaacacac ccaacacamm mmmmmmmmnn 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (29)..(30) <223> a, c, t, or g <400> 4 tgtgttgggt gtgtttggkk kkkkkkkknn 30 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 cctttctctc ccttctctyy yyyyyyyy 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 agagaaggga gagaaaggrr rrrrrrrr 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ccaaacacac ccaacacamm mmmmmmmm 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 tgtgttgggt gtgtttggkk kkkkkkkk 28 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 cctttctctc ccttctct 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 agagaaggga gagaaagg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 ccaaacacac ccaacaca 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 tgtgttgggt gtgtttgg 18 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 gtgagtgatg gttgaggtag tgtggag 27

Claims

(a) 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 정의된 관심 영역을 중합체로 둘러싸서 비물리적 유체 장벽을 형성하는 단계로서, 관심 영역은 직경이 1 mm 미만인 것인 단계; 및
(b) 적어도 하나의 정의된 관심 영역 내의 원위치(in situ) 세포를 선택적으로 파괴시키는 단계
를 포함하는, 시퀀싱 또는 분석을 위해 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리하는 방법.
고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 화학적 마스크를 평면 조직 박편에 적용하는 단계로서,
화학적 마스크는 적어도 하나의 관심 영역 내의 세포의 선택적 파괴에 적합한 장벽을 형성하고, 화학적 마스크는 물리적 유체 장벽이 아닌 것인 단계
를 포함하는, 시퀀싱 또는 분석을 위해 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리하는 방법.
고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 관심 영역 내의 세포의 파괴에 적합한 용매를 분배하여 해방된 세포 성분을 함유하는 액적을 형성하는 단계로서,
액적은 물리적 장벽 없이 관심 영역 외부의 조직으로부터 유체 연통으로부터 단리되는 것인 단계
를 포함하는, 시퀀싱 또는 분석을 위해 고체 기질 상의 평면 조직 박편 상의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리하는 방법.
조직 박편에 소수성 마스크를 적용하여 평면 조직 박편 내의 적어도 1000개의 관심 영역이 물리적 장벽 없이 서로 유체 연통으로부터 단리되도록 하는 단계 및
적어도 1000개의 관심 영역 내의 세포로부터 원위치에서 해방된 복수의 단백질 또는 핵산을 검출하여, 단백질 또는 핵산의 공간적 위치 정보가 유지되도록 하는 단계
를 포함하는, 조직 박편 내의 복수의 관심 영역으로부터 생체분자를 단리 및 검출하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 직경이 약 100 마이크론 이하인 관심 영역을 단리할 수 있는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 박편은 FFPE 조직 박편인 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 영역 내의 세포로부터 원위치에서 해방된 복수의 단백질 또는 핵산을 검출하는 단계를 포함하고, 검출은 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 시퀀싱은 원위치에서 해방된 핵산을 관심 영역의 위치를 식별하는 바코드(barcode)로 태깅하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 바코드는 표면에 연결되지 않는 것인 방법.
제8항에 있어서, 태깅은 원위치에서 해방된 RNA를 태깅하는 단계를 포함하고,
(a) 고유한 핵산 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 적어도 1000개의 관심 영역에 적용하는 단계; 및
(b) 관심 영역이 서로 단리되도록 적어도 1000개의 관심 영역 상에서 1번째 및 2번째 가닥 cDNA 합성을 수행하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 관심 영역으로부터 합성된 cDNA 분자 사이에 고유한 핵산 서열의 교차 오염이 감소되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 1번째 가닥 cDNA 합성은 원위치에서 수행되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 1번째 및 2번째 가닥 cDNA 합성은 원위치에서 수행되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 것은 mRNA 및 게놈 DNA 모두를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 것은 mRNA를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, mRNA를 시퀀싱하는 것은 mRNA로부터 생성된 cDNA 상에서 수행된 전증폭(pre-amplification) 단계를 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 전증폭 단계는 LM-PCR, 랜덤 헥사머 프라이머를 사용한 PCR, 폴리-A 특이적 프라이머를 사용한 PCR, 또는 이의 임의의 조합인 것인 방법.
제14항에 있어서, 세포로부터 원위치에서 해방된 핵산을 시퀀싱하는 것은 게놈 DNA를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 게놈 DNA를 시퀀싱하는 것은 게놈 DNA 상에서 수행된 전체 게놈 증폭(whole genome amplification; WGA) 단계를 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, WGA 단계는 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 프라이밍된(DOP) PCR, 다중 변위 증폭(multiple displacement amplification, MDA), 다중 어닐링 및 루핑 기반 증폭 사이클(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles; MALBAC), 피코플렉스(PicoPlex), 자가 축퇴성 프라이머를 사용한 등온 증폭, 또는 이의 조합인 것인 방법.
물리적 장벽 없이 서로 유체 연통으로부터 단리된 적어도 1000개의 수성 액적을 그 위에 포함하는 조직 박편.
제21항에 있어서, 서로 유체 연통으로부터 1000개의 수성 액적을 단리하는 소수성 마스크를 포함하는 것인 조직 박편.
제21항 또는 제22항에 있어서, 적어도 1000개의 수성 액적은 적어도 1000개의 고유한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 조직 박편.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 마스크는 적어도 시아노아크릴레이트 중합체의 층을 포함하는 것인 조직 박편.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 마스크는 적어도 비실릴화된 플루오로알킬 층을 포함하는 것인 조직 박편.
제24항에 있어서, 비실릴화된 플루오로알킬 층은 플루오로아크릴레이트 또는 비실릴화된 퍼플루오로알칸 화합물을 포함하는 것인 조직 박편.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 퍼플루오로알킬실란 층을 포함하는 것인 조직 박편.
제27항에 있어서, 퍼플루오로알킬실란 층은 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로트리스(디메틸아미노)실란을 포함하는 것인 조직 박편.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 표면에 연결되지 않는 것인 조직 박편.
(a) 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 화학적 마스크를 평면 조직 박편에 적용하는 단계; 및
(b) 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 관심 영역 상에 분배하여 적어도 하나의 관심 영역 내의 세포 성분을 가용화시켜, 적어도 하나의 관심 영역 내에 둘러싸인 세포를 선택적으로 용해시키는 단계
를 포함하는, 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하는 방법.
제30항에 있어서, 용액을 관심 영역 상에 분배하는 것은
(a) 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 제2 고체 기질의 표면에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 포함하는 제제 전달 장치 상에 분배하는 단계;
(b) 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소가 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역에 공간적으로 상응하도록, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 평면 조직 박편에 접촉시키는 단계로서, 접촉은 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역에 전달시켜, 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액 내의 적어도 하나의 관심 영역 내의 세포 성분을 가용화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 적어도 하나의 가용화된 세포 성분을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 관심 영역으로부터 가용화된 세포 성분 중에서 핵산을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 관심 영역으로부터 가용화된 세포 성분 중에서 단백질에 대해 탠덤 질량 분석법(tandem mass spectrometry)을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, (b)에서의 용액은 가용성 태그를 추가로 포함하고, 가용성 태그는 적어도 하나의 관심 영역에 상응하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 가용성 태그는 올리고뉴클레오타이드인 것인 방법.
제36항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 관심 영역에 상응하는 샘플 인덱스 서열(sample index sequence) 및, 선택적으로, 고유한 분자 식별자 서열(unique molecular identifier sequence)을 포함하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 관심 영역에 상응하는 전하 태그(charge tag)를 포함하는 것인 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥인 것인 방법.
제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 비드에 접합되는 것인 방법.
제35항에 있어서, 가용성 태그는 탠덤 질량 태그(Tandem Mass Tag)인 것인 방법.
제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추출제는 하나 이상의 계면활성제, 프로테아제, 등장성 조절제, 카오트로프(chaotrope), 뉴클레아제, 완충제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 또는 뉴클레아제 억제제를 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 마스크는 60-155도의 접촉각을 갖는 것인 방법.
제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 마스크는 플루오로중합체 또는 플루오로아크릴릭 중합체를 포함하는 소수성 마스크 용액을 통해 적용되는 것인 방법.
제44항에 있어서, 화학적 마스크 용액은 아크릴레이트 또는 시아노-아크릴레이트를 포함하는 용액을 통해 적용되는 것인 방법.
제45항에 있어서, 화학적 마스크 용액은 용매를 추가로 포함하는 것인 방법.
제46항에 있어서, 용매는 프로필렌 글리콜 유도체, 플루오로탄소, 또는 알코올인 것인 방법.
제46항에 있어서, 용매는 퍼플루오로옥탄, 퍼플루오로-2-메틸펜탄, 퍼플루오로-1,3-디메틸사이클로헥산, 퍼플루오로데칼린, 또는 1,3-디플루오로프로판인 것인 방법.
제30항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 관심 영역은 원형이고, 관심 영역의 직경은 1 mm 이하, 500 마이크론 이하, 250 마이크론 이하, 125 마이크론 이하, 100 마이크론 이하, 80 마이크론 이하, 50 마이크론 이하, 25 마이크론 이하, 또는 15 마이크론 이하인 것인 방법.
제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 관심 영역은 약 7.8x10⁵ 제곱 마이크론 면적 미만인 것인 방법.
제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 소수성 영역에 의해 둘러싸인 적어도 하나의 친수성 영역을 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 용액 10,000 피코리터 이하, 1,000 피코리터 이하, 500 피코리터 이하, 250 피코리터 이하, 100 피코리터 이하, 50 피코리터 이하, 10 피코리터 이하, 또는 2 피코리터 이하의 부피를 전달할 수 있는 것인 방법.
제51항에 있어서, 적어도 하나의 친수성 영역을 둘러싸는 소수성 영역은 60-155도의 접촉각을 갖는 것인 방법.
제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편 내의 하나 초과의 관심 영역으로부터 세포 성분을 가용화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편 내의 적어도 10개, 적어도 100개, 적어도 1000개, 또는 적어도 10,000개의 관심 영역으로부터 세포 성분을 가용화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 소수성 마스크는 격자(grid) 패턴을 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 소수성 마스크는 원형을 포함하는 것인 방법.
제30항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 기질 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 둘러싸는 소수성 마스크는 압전 잉크젯 전달 장치(piezoelectric ink-jet device)를 사용하여 평면 조직 박편에 적용되는 것인 방법.
제30항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편은 약 2 내지 약 50 μm 두께인 것인 방법.
제30항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편은 약 1 내지 약 15 μm 두께인 것인 방법.
제30항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편은 포르말린 고정된 파라핀 포매된(FFPE) 조직 박편인 것인 방법.
제30항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 평면 조직 박편은 고정되지 않은 조직 박편인 것인 방법.
(a) 소수성 마스크로 둘러싸인 적어도 하나의 관심 영역을 포함하는 제1 고체 지지체 상의 평면 조직 박편;
(b) 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역과 정렬하도록 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 포함하는 제2 고체 지지체로서, 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 하나 이상의 추출제를 포함하는 용액을 포함하는 것인 제2 고체 지지체; 및
(c) 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소를 포함하는 고체 지지체에 결합되고, 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소가 소수성 마스크로 둘러싸인 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역과 접촉할 수 있도록 고체 지지체를 옮길 수 있는 전동식 스테이지(motorized stage)
를 포함하는, 제1 고체 지지체 상의 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하기 위한 시스템.
제63항에 있어서, (i) 제2 고체 기질 상의 표면에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소가 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역과 접촉하도록 전동식 스테이지의 위치를 제어하도록 구성된 컴퓨터 시스템을 추가로 포함하는 것인 시스템.
제63항 또는 제64항에 있어서, 소수성 마스크 용액은
(i) 소수성 마스크 용액을 고체 지지체 상의 조직 박편에 전달할 수 있는 압전 잉크젯 전달 장치 및
(ii) 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역을 소수성 마스크 용액으로 둘러싸서 소수성 마스크를 생성하도록 압전 잉크젯 전달 장치를 제어하게 구성된 컴퓨터 시스템
을 포함하는 시스템에 의해 적용되는 것인 시스템.
제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 소수성 영역에 의해 둘러싸인 적어도 하나의 친수성 영역을 포함하는 것인 시스템.
제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 마스크 용액은 C7F15CH2OCOC(CH3)=CH2, FC-722, 퍼플루오로코트(PerFluoroCoat), 또는 플루오로펠(FluoroPel) 중 적어도 하나를 포함하는 것인 시스템.
제58항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 마스크 용액은 아크릴레이트 또는 시아노아크릴레이트 중 적어도 하나를 포함하는 것인 시스템.
제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 고체 기질의 표면 상에 위치한 적어도 하나의 제제 전달 어레이 요소는 용액 10,000 피코리터 이하, 1,000 피코리터 이하, 500 피코리터 이하, 250 피코리터 이하, 100 피코리터 이하, 50 피코리터 이하, 10 피코리터 이하, 또는 2 피코리터 이하의 부피를 전달할 수 있는 것인 시스템.
제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 친수성 영역을 둘러싸는 소수성 영역의 접촉각은 60-155도인 것인 시스템.
제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 마스크 용액 적용을 위한 시스템은 평면 조직 박편에 적용 후 상기 소수성 마스크 용액을 중합할 수 있는 UV 광원을 포함하는 것인 시스템.
제65항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 마스크 용액 적용을 위한 시스템은 퍼플루오로알킬실란의 화학 기상 증착을 위한 장치를 포함하는 것인 시스템.
제63항 내지 제72항 중 어느 한 항의 요소 중 어느 것을 포함하는, 평면 조직 박편 내의 적어도 하나의 관심 영역으로부터 세포 성분을 단리하기 위한 키트.
하부로부터 상부까지 적어도 하나의 시아노아크릴레이트 층에 이어 적어도 하나의 퍼플루오로알킬실란 층을 그 위에 포함하는 조직 박편.
제74항에 있어서, 적어도 하나의 시아노아크릴레이트 층 아래에 적어도 하나의 비실릴화된 플루오로알킬 층을 포함하는 것인 조직 박편.
제75항에 있어서, 비실릴화된 플루오로알킬 층은 플루오로아크릴레이트 또는 비실릴화된 퍼플루오로알칸 화합물을 포함하는 것인 조직 박편.
제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 퍼플루오로알킬실란 층은 퍼플루오로알킬트리클로로실란 또는 퍼플루오로알킬트리스(디메틸아미노)실란을 포함하는 것인 조직 박편.
제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 시아노아크릴레이트 층을 보유하는 영역에 의해 둘러싸인 시아노아크릴레이트 층이 없는 적어도 하나의 영역을 포함하는 것인 조직 박편.
제78항에 있어서, 영역은 실질적으로 타원형, 다각형, 또는 자유형인 것인 조직 박편.
제78항 또는 제79항에 있어서, 세제의 수용액을 조직 박편에 적용하는 것이 영역 내의 세포를 가용화시킬 수 있는 것인 조직 박편.
제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 영역은 약 1 mm 미만의 크기인 것인 조직 박편.
제81항에 있어서, 영역은 약 100 마이크론 미만의 크기인 것인 조직 박편.
제74항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 박편은 포르말린 고정된 파라핀 포매된(FFPE) 조직 박편인 것인 조직 박편.
제83항에 있어서, 조직 박편은 탈파라핀화된 FFPE 조직 박편인 것인 조직 박편.