KR20180048731A

KR20180048731A - 재조합 폴리펩티드를 제조하기 위한 fkpa의 정제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20180048731A
Application number: KR1020187007920A
Authority: KR
Inventors: 크리스 비. 퐁; 아지프 라디왈라; 패트릭 에이. 맥케이
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2018-05-10
Also published as: US20180327446A1; IL257400A; BR112018003127A2; CA2995385A1; JP2022062046A; CN108473558A; JP2018533355A; TW201718623A; WO2017031476A3; AU2016308383A1; JP7091238B2; IL288205A; EP3337819A2; EP3337819B1; EP3337819C0; HK1259368A1; WO2017031476A2; MX2018002068A

Abstract

본 발명은 FKBP-유형 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소 (FkpA) 폴리펩티드를 매우 높은 수준의 순도에서 생산하기 위한 방법을 제공한다. 초고순도 FkpA, 그리고 예로서, 세균에서 생산된 생물제제로부터 FkpA의 제거를 증명하기 위한 면역검정에서 이용을 위해 이를 이용하는 방법 역시 제공된다. 이에 더하여, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 샤프롱을 과다발현하는 세균에서 생산된 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)를 정제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 친화성 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 일부 양상에서, 본 발명은 산물 특이적 불순물이 본질적으로 없는 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)의 조성물을 제공한다.

Description

FKPA의 정제 및 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위한 이의 용도

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2015년 8월 20일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/207,908; 2015년 8월 20일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/207,910; 및 2015년 8월 26일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/210,378에 우선권을 주장한다; 이들 발명 각각의 개시는 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

ASCII 텍스트 파일 형태에서 서열 목록의 제출

ASCII 텍스트 파일 형태에서 제출된 다음의 내용은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다: 서열 목록 (파일 명칭: 146392033640_Sequence_Listing.txt, 기록된 일자: 2016년 8월 19일, 크기: 58 KB)의 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF).

발명의 분야

본 발명은 FKBP-유형 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소 (FkpA) 폴리펩티드를 매우 높은 수준의 순도에서 생산하기 위한 방법을 제공한다. 초고순도 FkpA, 그리고 예로서, 세균에서 생산된 생물제제로부터 FkpA의 제거 또는 감소를 증명하기 위한 면역검정에서 이용을 위해 이를 이용하는 방법 역시 제공된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체) 및 최소한 하나의 불순물을 포함하는 조성물로부터 이들 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법, 그리고 이들 방법에 의해 정제된 산물을 포함하는 제제를 제공한다. 일부 구체예에서, 불순물은 산물-특이적 불순물; 예를 들면, 다중특이적 항체의 전구체, 응집체 및/또는 변이체이다.

발명의 배경

발효 조건 하에 세균 숙주 세포에서 발현에 의해 대량으로 생산된 진핵 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질은 분비된 이형다합체성 단백질 (가령, 항체)의 적절한 조립 및 접힘을 향상시키기 위해 종종 변형된다. 샤프롱 단백질, 예를 들면, FKBP-유형 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소 (FkpA)의 과다발현은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질, 예를 들면, 항체의 적절한 접힘 및 용해도를 조장한다. FkpA는 올리고펩티드에서 프롤린 이미드 펩티드 결합의 시스-트랜스 이성화를 촉매작용한다 (Missiakas, D. et al., Molecular Microbiology (1996) 21(4), 871-884).

재조합 생물약제학적 단백질이 인간 환자에 투여를 위해 허용되려면, 제조 및 정제 과정으로부터 발생하는 잔여 불순물이 최종 생물학적 산물로부터 제거되거나 또는 상기 산물에서 미량으로 감소되는 것이 중요하다. 이들 과정 성분은 배양 배지 단백질, 면역글로불린 친화성 리간드, 바이러스, 내독소, DNA, 그리고 숙주 세포 단백질을 포함한다. 이들 숙주 세포 불순물은 과정-특이적 숙주 세포 단백질 (HCPs)을 포함하는데, 이들은 재조합 DNA 기술로부터 유래된 생물학적 산물, 예를 들면, 과다발현되면 단백질 접힘을 조장하는 샤프롱, 예를 들면, FkpA, DsbA 및 DsbC에서 과정-관련된 불순물이다. HCPs가 전형적으로 최종 약물 물질 내에 소량으로 (백만분율 또는 밀리그램당 나노그램의 의도된 재조합 폴리펩티드로) 존재하긴 하지만, HCPs는 바람직하지 않고 그들의 양이 최소화되어야 하는 것으로 인식된다. 가령, 미국 식품의약국 (FDA)은 생체내 인간용으로 의도된 생물약제에 가능한 한 외래 불순물이 없도록 요구하고, 그리고 잠재적 불순물, 예를 들면, HCPs의 검출 및 정량을 위한 시험을 요구한다. 이에 더하여, the International Conference on Harmonization (ICH)는 생물공학적/생물학적 산물에 대한 시험 절차 및 용인 규준에 관한 지침을 제공한다. 이들 지침은 HCPs의 경우에, 넓은 범위의 단백질 불순물을 검출할 수 있는 민감한 면역검정이 활용되어야 한다고 제안한다. 면역글로불린, DNA, 내독소, 바이러스 및 전체 HCPs, 예를 들면, 전체 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP) 또는 전체 CHO 단백질 (CHOP)을 검출하는 검정 및 시약이 개발되었지만, 이런 검정 및 시약은 보조 단백질 불순물, 예를 들면, FkpA를 정확하게 검출할 수 없다. 세균에서 전형적으로 높은 수준으로 발현되지 않지만, 재조합 세균 숙주 세포에서 과다발현되어 생물학적 산물의 접힘 및 분비를 조장할 수 있는 단백질, 예를 들면, FkpA의 검출 및 정량을 위한 충분한 특이성 및 감수성의 상업적인 시약 또는 분석법은 현재 없다.

FkpA의 검출을 위한 시약, 방법 및 키트가 특히 필요하지만, 충분한 일관성, 감수성, 특이성 또는 효율의 현존하는 검정 및 시약은 없다. 본원에서 설명된 발명은 일정한 전술한 요구에 부합하고 다른 유익성을 제공한다. 이에 더하여, 다중특이적 항체의 제조는 독특한 산물-특이적 불순물, 예를 들면, 비-대합된 항체 팔 및 오조립된 항체를 갖는다. 따라서, 이들 산물-특이적 불순물을 제거하는, 다중특이적 항체에 대한 정제 계획을 개발하는 것이 요구된다.

특허 출원 및 간행물을 비롯하여, 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 전체적으로 참조로서 편입된다.

짧은 요약

본 발명은 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 세포 용해물로부터 FkpA 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 세포 용해물을 원심분리에 의해 투명하게 하고, b) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 투명해진 세포 용해물을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, c) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 FkpA 폴리펩티드를 용리하여 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 양이온 교환 용출물을 산출하고, d) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 양이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 물질에 적용하고, e) HIC 물질로부터 FkpA 폴리펩티드를 용리하여 HIC 용출물을 산출하고, f) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 HIC 용출물을 크기 배제 크로마토그래피 물질에 적용하고, g) 정제된 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 크기 배제 크로마토그래피로부터 분획물을 수집하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드를 포함하는 용해물은 약 pH 6.0이다.

일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 강한 양이온 교환체이다. 일부 구체예에서, 강한 양이온 교환체는 술포프로필 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 술포프로필 기는 교차연결된 아가로오스에 연결된다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 용리에 앞서 25 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES)에서 세척된다. 일부 구체예에서, FkpA는 염 구배를 이용하여 양이온 크로마토그래피 물질로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 염 구배는 선형 구배이다. 일부 구체예에서, 염 구배는 9 칼럼 용적에 걸쳐 약 25 mM MES, 300 mM NaCl로부터 25 mM MES 300 mM NaCl까지 0-30% 구배이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 용출물은 분획물에서 수집된다. 일부 구체예에서, 분획물은 소수성 상호작용 크로마토그래피크기에 앞서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석된다. 일부 구체예에서, 최소한 약 25% FkpA를 포함하는 분획물이 추가 정제를 위해 선별된다.

본 발명의 일부 구체예에서, HIC 물질은 부틸 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 부틸 모이어티는 교차연결된 아가로오스에 연결된다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 용출물은 HIC 전, 약 0.6 M 황산나트륨 및 약 50 mM PO₄, 약 pH 7을 포함하도록 조건화된다. 일부 구체예에서, FkpA-결합된 HIC 물질은 용리에 앞서 40 mM 인산염, 300 mM 황산나트륨, pH 7.0으로 세척된다. 일부 구체예에서, FkpA는 물을 이용하여 HIC 물질로부터 용리된다. 일부 구체예에서, HIC 용출물은 분획물에서 수집된다. 일부 구체예에서, FkpA를 포함하는 분획물은 모아진다. 일부 구체예에서, 최소한 약 25% FkpA를 포함하는 분획물이 모아진다.

본 발명의 일부 구체예에서, 크기 배제 크로마토그래피 물질은 교차연결된 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합을 포함한다. 일부 구체예에서, 크기 배제 관류물이 분획물에서 수집된다. 일부 구체예에서, HIC 용출물은 크기 배제 크로마토그래피에 앞서 농축된다. 일부 구체예에서, HIC 용출물은 크기 배제 크로마토그래피에 앞서 약 6-배 내지 약 10-배 농축된다. 일부 구체예에서, FkpA를 포함하는 크기 배제 분획물은 모아진다.

상기 구체예의 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드는 대장균 (Escherichia coli) FkpA 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호:1의 아미노산 서열과 최소한 약 80% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA는 세포에서 발현된다. 일부 구체예에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 대장균 (E. coli) 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 FkpA의 내인성 발현보다 큰 수준에서 FkpA를 발현하도록 가공된다. 일부 구체예에서, 세포는 미세유동화기를 이용하여 용해된다.

일부 양상에서, 본 발명은 본원에서 설명된 방법에 의해 정제된 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 98% FkpA 폴리펩티드 (가령, 98% 단위체성 FkpA 폴리펩티드; 예로서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 계측될 때)를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 2%보다 적은 저분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5% 이내의 고분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 2%보다 적은 고분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드 (가령, 단위체성 FkpA)의 백분율은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출된다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%보다 적은 불순물을 포함하거나 또는 불순물이 실제적으로 없다. 일부 구체예에서, 불순물은 FkpA에 비하여 고분자량 및/또는 저분자량 폴리펩티드 종류이다. 일부 구체예에서, 불순물은 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP), FkpA의 응집체, FkpA의 단편, 핵산 또는 세포 배양 배지 성분 중에서 한 가지 또는 그 이상이다.

상기 조성물의 일부 구체예에서, 정제된 FkpA는 하나 또는 그 이상의 동결 해동 주기에 안정된다. 일부 구체예에서, FkpA는 3회 동결 해동 주기에 안정된다. 일부 구체예에서, 조성물은 동결 해동 후 최소한 약 70% FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 동결 해동 후 최소한 약 80% FkpA를 포함한다.

상기 조성물의 일부 구체예에서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 크로마토그래피, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 또는 웨스턴 블롯 분석 중에서 하나 또는 그 이상에 의해 계측된다. 일부 구체예에서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)에 의해 계측된다. 일부 구체예에서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계측된다. 일부 구체예에서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 형광 영상화 또는 은 염색을 이용한 SDS 겔 전기이동에 의해 계측된다. 일부 구체예에서, 조성물 내에 비-FkpA 폴리펩티드의 존재는 웨스턴 블롯 분석에 의해 보여 지는 바와 같이, 항-FkpA 항체와 면역반응성이 아닌 겔 전기이동에 의해 확인된 종류의 존재에 의해 확인된다. 일부 구체예에서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 응집체의 존재는 웨스턴 블롯 분석에 의해 선천적 FkpA보다 큰 분자량을 갖는 종류의 존재에 의해 확인된다.

일부 양상에서, 본 발명은 본원에서 설명된 방법에 의해 정제된 FkpA를 포함하는 조성물에 동물을 노출시키거나 또는 면역화하는 것을 포함하는, FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 산출하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 산출하기 위한 방법은 본원에서 설명된 바와 같은 FkpA의 조성물에 동물을 노출시키거나 또는 면역화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 동물로부터 혈청을 수집하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 상기 혈청은 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 혈청은 FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체를 포함한다. 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단일클론 항체가 혈청으로부터 단리된다. 일부 구체예에서, 동물은 염소, 토끼, 생쥐, 기니 피그, 햄스터, 쥐, 당나귀 또는 닭이다.

일부 양상에서, 본 발명은 FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 다중클론 항체는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 정제된 FkpA를 포함하는 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출된다. 일부 구체예에서, 다중클론 항체는 본원에서 설명된 바와 같은 정제된 FkpA 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출된다. 일부 구체예에서, 다중클론 항체는 동물의 혈청으로부터 수집된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 FkpA에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공하고, 여기서 상기 단일클론 항체는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 정제된 FkpA를 포함하는 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출된다. 일부 구체예에서, 단일클론 항체는 본원에서 설명된 바와 같은 정제된 FkpA 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출된다. 일부 구체예에서, 동물은 염소, 토끼, 생쥐, 기니 피그, 햄스터, 쥐, 당나귀 또는 닭이다.

일부 양상에서, 본 발명은 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 항-FkpA 항체를 포함하는 조성물을 약 60%의 황산암모늄의 최종 농도까지 황산암모늄과 접촉시키고, 용액을 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 그리고 펠렛을 인산염 완충액에 용해시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인산염 완충액은 약 pH 7.0에서 약 50 mM 인산나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 정제하기 위한 방법은 a) 항-FkpA 항체를 포함하는 조성물을 약 60%의 황산암모늄의 최종 농도까지 황산암모늄과 접촉시키고, 용액을 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 그리고 펠렛을 인산염 완충액에 용해시켜 항-FkpA 항체 용액을 산출하고; b) 항-FkpA 항체 용액을 친화성 크로마토그래피 물질에 적용하고, c) 친화성 물질로부터 항체를 용리하여 항-FkpA 항체를 포함하는 친화성 용출물을 산출하고; 그리고 d) 친화성 용출물을 크기 배제 크로마토그래피에 종속시키는 것을 포함하고, 여기서 정제된 항체를 포함하는 분획물은 크기 배제 크로마토그래피로부터 수집된다. 일부 구체예에서, 인산염 완충액은 약 pH 7.0에서 약 50 mM 인산나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 배지에 연결된 정제된 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 크로마토그래피 배지는 교차연결된 덱스트란이다. 일부 구체예에서, FkpA는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, FkpA는 본원에서 설명된 조성물 중에서 한 가지로부터 유래된다. 일부 구체예에서, FkpA는 크로마토그래피 배지에 공유 연결된다. 일부 구체예에서, FkpA는 글리세릴 제어된 다공성 유리 (글리세릴-CPG)를 이용하여 크로마토그래피 배지에 연결된다. 일부 구체예에서, 항-FkpA 항체는 약 pH 2.0에서 인산염 완충된 식염수를 이용한 친화성 칼럼으로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 용리 풀은 약 1 M Tris, 약 pH 8.0 내로 수집된다. 일부 구체예에서, 크기 배제 크로마토그래피 물질은 교차연결된 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합을 포함한다. 일부 구체예에서, 교차연결된 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합은 10,000 달톤 및 600,000 달톤 사이에 분자량을 갖는 분자에 대한 분리 범위를 갖는다. 일부 구체예에서, 크기 배제 관류물이 분획물에서 수집된다. 일부 구체예에서, 항-FkpA 항체를 포함하는 크기 배제 분획물은 모아진다. 일부 구체예에서, 항체는 다중클론 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 따라 제조된다. 일부 구체예에서, 약 1%보다 적은 항체가 비-FkpA 화합물에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 정제된 단리된 항-FkpA 항체를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 표본 내에 FkpA를 정량하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 검출 시스템을 이용하여 표본 내에 FkpA를 검출하고, 그리고 표본 내에서 검출된 FkpA의 양을 초고순도 FkpA 참고 표준의 하나 또는 그 이상의 농도의 검출과 비교하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 최소한 약 95%, 약 96%, 약 97%, 또는 약 98% 단위체성 FkpA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 제조되거나 또는 본원에서 설명된 FkpA 조성물 중에서 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 시스템은 면역검정이다. 일부 구체예에서, 면역검정은 초고순도 FkpA 참고 표준에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA의 존재 및/또는 양에 대해 재조합 폴리펩티드 표본을 분석하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 면역검정을 이용하여 표본 내에 FkpA를 검출하고, 그리고 표본 내에서 검출된 FkpA의 양을 초고순도 FkpA 참고 표준의 하나 또는 그 이상의 농도의 검출과 비교하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 최소한 약 98% 단위체성 FkpA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 제조된다. 일부 구체예에서, 면역검정은 초고순도 FkpA 참고 표준에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 다중클론 항체이다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 면역검정에서 포획 항체로서 이용된다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 검출 항체로서 이용된다. 일부 구체예에서, 검출 항체는 검출 작용제에 접합된다. 일부 구체예에서, 검출 작용제는 양고추냉이 과산화효소이다. 일부 구체예에서, FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 따라 제조된다. 일부 구체예에서, FkpA는 대장균 (E. coli) FkpA이다. 일부 구체예에서, 표본은 숙주 세포에서 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 대장균 (E. coli) 세포이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 FkpA를 과다발현한다. 일부 구체예에서, 표본은 세포 용해물이다. 일부 구체예에서, 표본은 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 그리고 여기서 재조합 폴리펩티드 제조물은 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 정제 단계에 종속되었다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드 제조물은 최종 정제된 산물이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드 표본에서 내포된 재조합 폴리펩티드는 항체 또는 면역접합체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 표본 내에서 FkpA를 검출하기 위한 면역검정 방법을 제공하고, 여기서 상기 표본은 숙주 세포주로부터 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 이들 방법은 (a) FkpA에 결합하는 포획 항체를 상기 표본과 접촉시키고, 따라서 표본-포획 항체 조합 물질을 산출하고; (b) FkpA에 결합하는 검출 항체를 표본-포획 항체 조합 물질과 접촉시키고; 그리고 (c) 표본-포획 항체 조합 물질에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역검정은 표준 적정 곡선을 이용하여, 결합된 검출 항체의 수준을 정량하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 면역검정은 결합된 검출 항체의 수준에 근거하여, 표본 내에 존재하는 FkpA의 양을 계산하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 표본 내에 존재하는 FkpA의 양은 표준 적정 곡선을 초고순도 FkpA 조성물로 산출된 표준 적정 곡선과 비교함으로써 결정된다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA 조성물은 최소한 약 98% FkpA 폴리펩티드 (가령, 단위체성 FkpA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물 내에 초고순도 FkpA는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 제조된다. 일부 구체예에서, 포획 항체는 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 검출 항체는 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 다중클론 항체이다. 일부 구체예에서, FkpA에 결합하는 두 번째 검출 항체는 양고추냉이 과산화효소에 접합된다. 일부 구체예에서, 다중클론 항체는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 따라 산출된다. 일부 구체예에서, 면역검정은 샌드위치 검정이다. 일부 구체예에서, 샌드위치 검정은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)이다. 일부 구체예에서, FkpA는 대장균 (E. coli) FkpA이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드 제조물 또는 숙주 세포주는 대장균 (E. coli)으로부터 획득된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포주는 외인성 FkpA를 발현한다. 일부 구체예에서, 표본은 세포 용해물이다. 일부 구체예에서, 표본은 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 그리고 여기서 재조합 폴리펩티드 제조물은 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 정제 단계에 종속되었다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드 제조물은 최종 정제된 산물이다.

일부 구체예에서, 면역검정이 항체 또는 면역접합체의 제조물을 분석하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 일부 구체예에서, 항체는 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인 및 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 구체예에서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, IL17은 인간 IL17이다. 일부 구체예에서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합한다. 일부 구체예에서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 세균 세포로부터 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물에 대한 품질 검정을 제공하고, 상기 품질 검정은 제약학적 조성물에서 FkpA의 존재 또는 양을 검출하기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 면역검정에 제약학적 조성물의 표본을 종속시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물에서 검출된 FkpA의 양은 면역검정에 의해 결정될 때, 약 30 ppm, 약 25 ppm, 약 20 ppm, 약 15 ppm, 약 14 ppm, 약 13 ppm, 약 12 ppm, 약 11 ppm, 약 10 ppm, 약 9 ppm, 약 8 ppm, 약 7 ppm, 약 6 ppm, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내이다. 일부 구체예에서, 세균 세포는 대장균 (E. coli) 세포이다. 일부 구체예에서, 세균 세포는 외인성 FkpA를 발현한다. 일부 구체예에서, 표본은 세포 용해물이다. 일부 구체예에서, 표본은 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 그리고 여기서 재조합 폴리펩티드 제조물은 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 정제 단계에 종속되었다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드 제조물은 최종 정제된 산물이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 항체 또는 면역접합체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인 및 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 대한 품질 검정을 제공한다. 일부 구체예에서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, IL17은 인간 IL17이다. 일부 구체예에서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합한다. 일부 구체예에서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 검정은 제약학적 조성물에서 DsbA 및/또는 DsbC의 양을 검출하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, DsbA의 양은 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내이다. 일부 구체예에서, DsbC의 양은 면역검정에 의해 결정될 때, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 세균 세포로부터 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물에서 FkpA의 검출을 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 제조된 항-FkpA 항체 또는 본원에서 설명된 항-FkpA 항체의 조성물 중에서 한 가지를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 표본 내에서 FkpA를 정량하기 위한 표준 곡선을 산출할 때 참고 표준으로서 이용을 위한 및/또는 양성 대조로서 이용을 위한 초고순도 FkpA를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA는 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 따라 제조된다.

일부 양상에서, 본 발명은 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 재조합 폴리펩티드는 내인성 FkpA를 발현하는 숙주 세포에서 생산되었고, 여기서 상기 조성물은 약 6 ppm, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내의 농도에서 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA의 농도는 면역검정에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, FkpA의 농도는 본원에서 설명된 면역검정 중에서 한 가지에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 외인성 FkpA를 발현하도록 가공되는 숙주 세포에서 생산되었고, 여기서 상기 조성물은 약 15 ppm FkpA, 약 6 ppm, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 0.1 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 외인성 FkpA를 발현하고, 여기서 상기 조성물은 약 13 ppm 이내를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 외인성 FkpA를 발현하고, 여기서 상기 조성물은 약 0.7 ppm 이내를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 외인성 FkpA를 발현하고, 여기서 상기 조성물은 약 6 ppm 이내를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 이중특이적 항체는 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인 및 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, IL17은 인간 IL17이다. 일부 구체예에서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합한다. 일부 구체예에서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, DsbA의 양은 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내이다. 일부 구체예에서, DsbA의 양은 면역검정에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, DsbC의 양은 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내이다. 일부 구체예에서, DsbC의 양은 면역검정에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA가 실제적으로 없다. 일부 구체예에서, 조성물은 DsbA가 실제적으로 없다. 일부 구체예에서, 조성물은 DsbC가 실제적으로 없다.

일부 구체예에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 재조합 폴리펩티드는 a) i) 첫 번째 중쇄 및 첫 번째 경쇄를 인코딩하는 핵산, 여기서 첫 번째 중쇄 및 첫 번째 경쇄는 첫 번째 항원 결합 도메인을 형성하고; ii) 두 번째 중쇄 및 두 번째 경쇄를 인코딩하는 핵산, 여기서 두 번째 중쇄 및 두 번째 경쇄는 두 번째 항원 결합 도메인을 형성하고; iii) FkpA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하고; 여기서 첫 번째 중쇄 및 두 번째 중쇄는 Fc 도메인을 형성하고; 그리고 b) 상기 항체를 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산되었고, 여기서 상기 조성물은 약 5 ppm보다 적은 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 이중특이적 항체는 a) i) 첫 번째 중쇄 및 첫 번째 경쇄를 인코딩하는 핵산, 여기서 첫 번째 중쇄 및 첫 번째 경쇄는 첫 번째 항원 결합 도메인을 형성하고; ii) FkpA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 첫 번째 숙주 세포에 도입하고; b) i) 두 번째 중쇄 및 두 번째 경쇄를 인코딩하는 핵산, 여기서 두 번째 중쇄 및 두 번째 경쇄는 두 번째 항원 결합 도메인을 형성하고; ii) FkpA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 두 번째 숙주 세포에 도입하고; b) 첫 번째 항원 결합 도메인 및 두 번째 결합 도메인을 단리하고; c) 첫 번째 항원 결합 도메인 및 두 번째 항원 결합 도메인이 조립되어 이중특이적 항체를 형성하는 조건 하에 첫 번째 항원 결합 도메인 및 두 번째 항원 결합 도메인을 합동하고; 그리고 b) 이중특이적 항체를 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산되었고, 여기서 상기 조성물은 약 5 ppm보다 적은 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 1 ppm보다 적은 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이다. 일부 구체예에서, 첫 번째 숙주 세포 및 두 번째 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 그람 음성균이다. 일부 구체예에서, 그람 음성균은 대장균 (E. coli)이다. 일부 구체예에서, FkpA는 대장균 (E. coli) FkpA이다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인 및 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, IL17은 인간 IL17이다. 일부 구체예에서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합한다. 일부 구체예에서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 15 ppm 이내의 DsbA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5 ppm 이내의 DsbA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 15 ppm 이내의 DsbC를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5 ppm 이내의 DsbC를 포함한다. 일부 구체예에서, DsbA는 면역검정에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, DsbC는 면역검정에 의해 계측된다.

본 발명은 다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 조성물을 친화성 크로마토그래피에 종속시켜 친화성 용출물을 생산하고, b) 친화성 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 c) 혼합 방식 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, HIC는 관류 방식으로 실행된다.

본 발명은 다중특이적 항체 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 상기 방법은 a) 조성물을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 단백질 A 용출물을 생산하고, b) 단백질 A 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 c) 혼합 방식 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, HIC는 관류 방식으로 실행된다.

일부 양상에서, 본 발명은 다중특이적 항체 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 다중특이적 항체의 각 팔은 별개로 생산되고, 상기 방법은 a) 다중특이적 항체의 각 팔을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 다중특이적 항체의 각 팔에 대한 단백질 A 용출물을 생산하고, b) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 생산하는데 충분한 조건 하에 다중특이적 항체의 각 팔의 단백질 A 용출물을 포함하는 혼합물을 형성하고, c) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 d) 혼합 방식 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 용출물은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 앞서 음이온 교환 크로마토그래피에 종속된다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다.

상기 양상의 일부 구체예에서, 이들 방법은 다중특이적 항체를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 분획물을 양이온 교환 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다.

일부 양상에서, 본 발명은 폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 조성물을 친화성 크로마토그래피에 종속시켜 친화성 용출물을 생산하고, b) 친화성 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고, d) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다.

일부 양상에서, 본 발명은 다중특이적 항체 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 상기 방법은 a) 조성물을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 단백질 A 용출물을 생산하고, b) 단백질 A 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고, d) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다.

일부 양상에서, 본 발명은 다중특이적 항체 및 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 다중특이적 항체의 각 팔은 별개로 생산되고, 상기 방법은 a) 다중특이적 항체의 각 팔을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 다중특이적 항체의 각 팔에 대한 단백질 A 용출물을 생산하고, b) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 생산하는데 충분한 조건 하에 다중특이적 항체의 각 팔의 단백질 A 용출물을 포함하는 혼합물을 형성하고, c) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 d) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고, e) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고, 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하고, 그리고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다.

상기 양상의 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 다중특이적 항체를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 분획물을 양이온 교환 크로마토그래피에 종속시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 다중특이적 항체를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 분획물을 한외여과에 종속시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 다중특이적 항체를 포함하는 양이온 교환 분획물을 한외여과에 종속시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 한외여과는 첫 번째 한외여과, 정용여과 및 두 번째 한외여과를 순차적으로 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 조성물을 친화성 크로마토그래피에 종속시켜 친화성 용출물을 생산하고, b) 친화성 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고, d) 음이온 교환 용출물을 수산화인회석 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 것을 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명은 다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 상기 방법은 a) 조성물을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 단백질 A 용출물을 생산하고, b) 단백질 A 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고, d) 음이온 교환 용출물을 수산화인회석 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명은 다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 다중특이적 항체의 각 팔은 별개로 생산되고, 상기 방법은 a) 다중특이적 항체의 각 팔을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 다중특이적 항체의 각 팔에 대한 단백질 A 용출물을 생산하고, b) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 생산하는데 충분한 조건 하에 다중특이적 항체의 각 팔의 단백질 A 용출물을 포함하는 혼합물을 형성하고, c) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고 d) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고, e) 음이온 교환 용출물을 수산화인회석 크로마토그래피에 종속시키고, 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하고, 그리고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행된다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 단백질 A 크로마토그래피는 아가로오스에 연결된 단백질 A를 포함한다. 일부 구체예에서, 단백질 A 크로마토그래피는 MabSelect™, MabSelect SuRe™ 및 MabSelect SuRe™ LX, ProSep^®-vA, ProSep^® Ultra Plus, 단백질 A Sepharose^® 패스트 플로우, 또는 Toyopearl^® AF-rProtein A 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 단백질 A 크로마토그래피는 단백질 A 평형화 완충액, 단백질 A 부하 완충액 또는 단백질 A 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 평형화 완충액, 부하 완충액 및/또는 세척 완충액은 약 pH 7 및 약 pH 8 사이이다. 일부 구체예에서, 단백질 A 평형화 완충액은 약 pH 7.7이다. 일부 구체예에서, 단백질 A 평형화 완충액은 약 25 mM Tris 및 약 25 mM NaCl을 포함한다. 일부 구체예에서, 단백질 A 크로마토그래피는 부하 이후에 평형화 완충액으로 세척된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 pH 구배에 의해 단백질 A 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 낮은 pH를 갖는 단백질 A 용리 완충액을 단백질 A 크로마토그래피에 적용함으로써 단백질 A로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 단백질 A 용리 완충액은 약 150 mM 아세트산, 약 pH 2.9를 포함한다. 일부 구체예에서, 단백질 A 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD280은 약 0.5보다 크다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 사차 아민 및 소수성 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 고도로 교차연결된 아가로오스에 연결된 사차 아민 및 소수성 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 N-벤질-n-메틸 에탄올아민을 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 Capto™ 부착 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 전평형화 완충액, 혼합 방식 평형화 완충액, 혼합 방식 부하 완충액 또는 혼합 방식 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 혼합 방식 전평형화 완충액, 혼합 방식 평형화 완충액 및/또는 혼합 방식 세척 완충액은 약 pH 6 및 약 pH 7 사이이다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 전평형화 완충액, 혼합 방식 평형화 완충액 및/또는 혼합 방식 세척 완충액은 약 pH 6.5이다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 전평형화 완충액은 약 500 mM 아세트산염을 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 평형화 완충액은 약 50 mM 아세트산염을 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 부하 이후에 세척 완충액으로 세척된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 pH 구배에 의해 혼합 방식 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 낮은 pH를 갖는 혼합 방식 용리 완충액을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피에 적용함으로써 혼합 방식 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 용리 완충액은 약 25 mM 아세트산염, 약 pH 5.2를 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD280은 약 0.5 내지 약 1.0보다 크다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 소수성 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 소수성 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 페닐 모이어티 또는 부틸 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 Sepharose^® 크로마토그래피 또는 부틸 Sepharose^® 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 교환 크로마토그래피는 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 또는 HIC 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 및/또는 HIC 세척 완충액은 약 pH 5 및 약 pH 6 사이이다. 일부 구체예에서, HIC 평형화 완충액, 부하 완충액 및/또는 세척 완충액은 약 pH 5.5이다. 일부 구체예에서, HIC 평형화 완충액 및 세척 완충액은 약 170 mM 아세트산염을 포함한다. 일부 구체예에서, HIC 부하 완충액은 50 mM Tris, 100 mM 아세트산나트륨, pH 약 5.5이다.

일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 헥실 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 히드록실화된 메타크릴산 중합체에 연결된 소수성 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 히드록실화된 메타크릴산 중합체에 연결된 헥실 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 TOYOPEARL^® 헥실 650C이다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 교환 크로마토그래피는 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 또는 HIC 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 및/또는 HIC 세척 완충액은 약 pH 6 및 약 pH 8 사이이다. 일부 구체예에서, HIC 평형화 완충액, 부하 완충액 및/또는 세척 완충액은 약 pH 7.0이다. 일부 구체예에서, HIC 평형화 완충액 및 세척 완충액은 약 50 mM 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS) 및 125 mM 아세트산염을 포함한다.

일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부하 이후에 HIC 세척 완충액으로 세척된다. 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD280은 약 0.5 내지 약 1.0 보다 크다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 사차 아민을 포함한다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 사차 아민을 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피는 Q Sepharose^® 패스트 플로우 (QSFF) 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 전평형화 완충액, 음이온 교환 평형화 완충액 또는 음이온 교환 부하 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 음이온 교환 전평형화 완충액, 음이온 교환 평형화 완충액 및/또는 음이온 교환 부하 완충액은 약 pH 8 및 약 pH 9 사이이다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 전평형화 완충액, 음이온 교환 평형화 완충액 및/또는 음이온 교환 부하 완충액은 약 pH 8.5이다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 전평형화 완충액은 약 50 mM Tris, 500 mM 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 평형화 완충액은 약 50 mM Tris를 포함한다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 부하 이후에 음이온 교환 평형화 완충액으로 세척된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 염 구배에 의해 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 증가된 염 농도를 갖는 음이온 교환 용리 완충액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용함으로써 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 용리 완충액은 약 pH 8.5에서 약 50 mM Tris, 100 mM 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD280은 약 0.5 내지 약 1.0보다 크다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피는 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피는 CHT 유형 I 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피는 수산화인회석 완충액 A 또는 수산화인회석 완충액 B 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 수산화인회석 완충액 B는 수산화인회석 완충액 A와 비교하여 더욱 높은 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 완충액 A는 약 pH 6.8에서 약 10 mM 인산나트륨을 포함하는 평형화 완충액이다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 완충액 B는 약 pH 6.8에서 약 10 mM 인산나트륨 및 약 1 M 염화나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 수산화인회석 완충액 A에서 수산화인회석 완충액 B의 구배를 이용하여 수산화인회석 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 구배는 선형 구배이다. 일부 구체예에서, 구배는 약 0% 수산화인회석 완충액 B으로부터 약 100% 수산화인회석 완충액 B로 증가한다. 일부 구체예에서, 구배는 약 20 칼럼 용적에서 0% 수산화인회석 완충액 B로부터 100% 수산화인회석 완충액 B로 증가한다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD₂₈₀은 약 0.5 내지 약 1.0보다 크다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 카르복실산 모이어티 또는 술폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 카르복실산 모이어티 또는 술폰산 모이어티는 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실 모이어티이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 카르복실산 모이어티 또는 술폰산 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 POROS^® HS 50, POROS^® HS 20, SO₃ 모놀리스, S 세라믹 HyperD^®, 술포프로필-Sepharose^® 패스트 플로우 (SPSFF), SP-Sepharose^® XL (SPXL), CM Sepharose^® 패스트 플로우, Capto^TM S, Fractogel^® EMD Se Hicap, Fractogel^® EMD SO₃ ^-, 또는 Fractogel^® EMD COO^-이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 부하 밀도는 약 20 g/L보다 적다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 전평형화 완충액, 양이온 교환 평형화 완충액, 양이온 교환 부하 완충액 또는 양이온 교환 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 양이온 교환 전평형화 완충액, 양이온 교환 평형화 완충액, 양이온 교환 부하 완충액 및/또는 양이온 교환 세척 완충액은 약 pH 5.0 및 약 pH 6.0 사이이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 양이온 교환 평형화 완충액, 양이온 교환 부하 완충액 및/또는 양이온 교환 세척 완충액은 약 pH 5.5이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 평형화 완충액은 50 mM 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 세척 완충액은 50 mM 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 부하 이후에 평형화 완충액으로 세척된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 염 구배에 의해 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 증가된 염 농도를 갖는 양이온 교환 용리 완충액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용함으로써 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 용리 완충액은 500 mM 아세트산나트륨, pH 5.8을 포함한다. 일부 구체예에서, 용리는 10% 내지 100% 양이온 교환 용리 완충액의 구배 용리이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD280은 약 0.5 내지 약 1.0보다 크다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 팔은 세포에서 생산된다. 일부 구체예에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 구체예에서, 원핵 세포는 대장균 (E. coli) 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 샤프롱을 발현하도록 가공된다. 일부 구체예에서, 샤프롱은 FkpA, DsbA 또는 DsbC 중에서 하나 또는 그 이상이다. 일부 구체예에서, 샤프롱은 대장균 (E. coli) 샤프롱이다. 일부 구체예에서, 세포는 단백질 A 크로마토그래피에 앞서, 용해되어 다중특이적 항체 또는 다중특이적 항체의 팔을 포함하는 세포 용해물을 산출한다. 일부 구체예에서, 세포는 미세유동화기를 이용하여 용해된다. 일부 구체예에서, 폴리에틸렌이민 (PEI)이 크로마토그래피에 앞서 세포 용해물에 첨가된다. 일부 구체예에서, PEI는 약 0.4%의 최종 농도로 용해물에 첨가된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 원심분리에 의해 투명해진다.

상기 양상 및 구체예의 일부 구체예에서, 산물 특이적 불순물은 비-대합된 항체 팔, 항체 동종이합체, 응집체, 고분자량 종류 (HMW), 저분자량 종류 (LMW), 산성 변이체, 또는 염기성 변이체 중에서 하나 또는 그 이상이다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 조성물 내에 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP), FkpA, DsbA, DsbC, 침출된 단백질 A, 핵산, 세포 배양 배지 성분, 또는 바이러스 불순물 중에서 한 가지의 양을 감소시킨다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 IL13에 결합한다. 일부 구체예에서, IL13은 인간 IL13이다. 일부 구체예에서, IL13은 서열 번호:1 또는 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체의 두 번째 팔은 IL17에 결합한다. 일부 구체예에서, IL17은 인간 IL17이다. 일부 구체예에서, IL17은 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5 또는 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 의해 정제된 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 조성물은 약 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내의 산물 특이적 불순물을 포함한다. 일부 구체예에서, 산물 특이적 불순물은 비-대합된 항체 팔, 항체 동종이합체, 응집체, 고분자량 종류 (HMW), 저분자량 종류 (LMW), 산성 변이체, 또는 염기성 변이체 중에서 하나 또는 그 이상이다. 일부 구체예에서, 조성물은 조성물 내에 약 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내의 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP), FkpA, DsbA, DsbC, 침출된 단백질 A, 핵산, 세포 배양 배지 성분, 또는 바이러스 불순물 중에서 한 가지를 포함한다.

도면의 간단한 설명
도면 1은 FkpA의 정제를 위한 강한 양이온-교환 배지 SP Sepharose^® 패스트 플로우 (GE)로 충전된 중력-유동 칼럼으로부터 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 오른쪽에 표시된다.
도면 2는 FkpA의 정제를 위한 단계 용리를 이용한 SP Sepharose^® 패스트 플로우 (GE) 크로마토그래피로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 3a 및 3b는 FkpA의 정제를 위한 단계 용리를 이용한 SP Sepharose^® 패스트 플로우 (GE) 크로마토그래피로부터 분획물 3-13 (도면 3a) 및 14-23 (도면 3b)의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 오른쪽에 표시된다.
도면 4는 FkpA의 정제를 위한 구배 용리를 이용한 SP Sepharose^® 패스트 플로우 (GE) 크로마토그래피로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 5는 FkpA의 정제를 위한 음이온-교환 크로마토그래피 배지 Q Sepharose^® 패스트 플로우 (GE) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 배지 페닐 Sepharose^® 패스트 플로우 (낮은 치환) (GE)로 충전된 중력-유동 칼럼으로부터 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 아래쪽에 표시된다.
도면 6은 FkpA의 정제를 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 배지 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 (GE)로 충전된 중력-유동 칼럼으로부터 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 아래쪽에 표시된다.
도면 7a 및 7b는 FkpA의 정제를 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 배지 부틸 Sepharose^® 4 패스트 플로우 (GE)로 충전된 중력-유동 칼럼으로부터 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 오른쪽에 표시된다.
도면 8은 FkpA의 정제를 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 배지 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 (GE)로 충전된 중력-유동 칼럼으로부터 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 아래쪽에 표시된다.
도면 9는 FkpA의 정제를 위한 부틸-S Sepharose^® 패스트 플로우 (GE) 크로마토그래피로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 10a는 FkpA의 정제를 위한 부틸-S Sepharose^® 물질로 충전된 중력-유동 칼럼으로부터 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 표시된다. 도면 10b는 FkpA의 정제를 위한 부틸-S Sepharose^® 물질로 충전된 중력-유동 칼럼으로부터 분획물의 SYPRO Ruby로 영상화된 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 1-블랭크, 레인 2-정밀도 표준, 레인 3-블랭크, 레인 4-SP fr. 22-50 10 μL 표본, 레인 5-블랭크, 레인 6-F-T/W 20 10 μL 표본, 레인 7-블랭크, 레인 8-PW 용출물 20 μL 표본, 레인 9-블랭크, 레인 10-포스트 풀 20 μL 표본.
도면 11은 FkpA의 부틸-S Sepharose^® 정제로부터 모아진 분획물의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 크로마토그램을 보여준다.
도면 12는 FkpA의 정제를 위한 슈퍼덱스 200 (GE) 크로마토그래피의 실행 1로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 13a는 FkpA의 정제를 위한 슈퍼덱스 200 실행 1로부터 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 도면 13b는 FkpA의 정제를 위한 슈퍼덱스 200 실행 1로부터 분획물의 SYPRO Ruby로 영상화된 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 도면 13b의 아래쪽에 표시된다.
도면 14는 FkpA의 정제를 위한 슈퍼덱스 200 실행 1로부터 분획물 37의 SYPRO Ruby 및 웨스턴 블롯으로 영상화된 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 표시된다.
도면 15는 FkpA의 정제를 위한 슈퍼덱스 200의 실행 2로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 16은 FkpA의 정제를 위한 슈퍼덱스 200 실행 2로부터 모아진 분획물 37-44의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 17은 FkpA의 정제를 위한 슈퍼덱스 200 실행 1로부터 35-40 및 슈퍼덱스 200 실행 2-4로부터 37-44로부터 모아진 분획물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 표시된다.
도면 18은 0-3회 동결 해동 후, 초고순도 FkpA의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 표시된다.
도면 19a는 0회 동결 해동 후, 초고순도 FkpA의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로부터 크로마토그램을 보여준다. 도면 19b는 3회 동결 해동 후, 초고순도 FkpA의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 20은 토끼 A, B 및 C의 면역화전 혈청 및 항혈청을 이용한 직접적인 결합 ELISA의 결과를 보여준다. 열린 원은 토끼 A로부터 면역화전 혈청을 나타내고, 열린 사각형은 토끼 B로부터 면역화전 혈청을 나타내고, 열린 삼각형은 토끼 C로부터 면역화전 혈청을 나타내고, 열린 다이아몬드는 토끼 A로부터 항혈청을 나타내고, 닫힌 원은 토끼 B로부터 항혈청을 나타내고, 닫힌 사각형은 토끼 C로부터 항혈청을 나타낸다.
도면 21은 ASP 항-FkpA 항체의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 표시된다.
도면 22는 ASP 항-FkpA 항체를 이용한 직접적인 결합 ELISA의 결과를 보여준다.
도면 23은 ASP 항-FkpA 항체를 이용한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여준다. 열린 원은 1:60까지 희석된 검출 항체를 나타내고, 열린 사각형은 1:80까지 희석된 검출 항체를 나타내고, 열린 삼각형은 1:100까지 희석된 검출 항체를 나타내고, 열린 다이아몬드는 1:110까지 희석된 검출 항체를 나타낸다.
도면 24는 ASP 항-FkpA 항체의 친화성 정제로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 25는 AF-정제된 항-FkpA 항체의 슈퍼덱스 200 정제로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 26a는 AF-정제된 항-FkpA 항체의 슈퍼덱스 200 정제의 분획물 41-63의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 크로마토그램을 보여준다. 도면 26b는 AF-정제된 항-FkpA 항체의 슈퍼덱스 200 정제의 분획물 64-86의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 크로마토그램을 보여준다.
도면 27은 AF 항-FkpA 항체를 이용한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여준다. 열린 원은 1:2000까지 희석된 검출 항체를 나타내고, 열린 사각형은 1:4000까지 희석된 검출 항체를 나타내고, 열린 삼각형은 1:6000까지 희석된 검출 항체를 나타내고, 열린 다이아몬드는 1:8000까지 희석된 검출 항체를 나타낸다.
도면 28a는 ASP 항-FkpA 항체를 이용한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여준다. 도면 28b는 AF 항-FkpA 항체를 이용한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여준다.
도면 29는 AF 항-FkpA 항체의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 30은 0-3회 동결 해동 후, AF-정제된 항-FkpA 항체의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 보여준다. 레인 마커는 표시된다.
도면 31a는 0회 동결 해동 후, AF-정제된 항-FkpA 항체의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로부터 크로마토그램을 보여준다. 도면 31b는 3회 동결 해동 후, AF-정제된 항-FkpA 항체의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC) 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로부터 크로마토그램을 보여준다.
도면 32는 AF 항-FkpA 항체의 동결 해동 안정성 표본의 기능 검사를 보여준다.
도면 33은 토끼 A, B 및 C의 차후 출혈로부터 ASP 항-FkpA 항체를 이용한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여준다. 열린 원은 친화성 정제된 코트 항체를 나타내고, 열린 사각형은 비-용해된 코트 항체를 나타내고, 열린 삼각형은 용해된 코트 항체를 나타낸다.
도면 34는 -70 ℃ 및 2-8 ℃에서 초고순도 FkpA에 대한 시간의 추이에서 제어 안정성의 모니터링을 보여준다.
도면 35a는 0.2% 어류 젤라틴, 1 mg/mL 아포맙, 또는 완충액 C에서 3 ng/mL까지 희석될 때 초고순도 FkpA에 대한 시간의 추이에서 제어 안정성의 모니터링을 보여준다. 도면 35b는 0.2% 어류 젤라틴, 1 mg/mL 아포맙 또는 완충액 C에서 15 ng/mL까지 희석될 때 초고순도 FkpA에 대한 시간의 추이에서 제어 안정성의 모니터링을 보여준다.
도면 36은 상이한 FkpA 표준을 이용한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여준다. 열린 원은 초고순도 FkpA 표준을 나타내고, 열린 사각형은 MyBioSource FkpA 표준 카탈로그 번호 MBS1037402를 나타내고, 열린 삼각형은 MyBioSource FkpA 표준 카탈로그 번호 MBS1182120을 나타낸다.
도면 37a 및 37b는 혼합 방식 음이온 교환 (Capto™ Adhere, 도면 37b) 및 전통적인 이온-교환 (QSFF, 도면 37a) 수지에서 산물-관련된 불순물의 분해능에 대한 고처리량 선별검사를 보여준다.
도면 38a 및 38b는 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에서 아세트산나트륨에서 산물 결합능에 대한 고처리량 선별검사 결과를 보여준다.
도면 39는 아세트산나트륨의 존재에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에서 관류에서 FkpA 수준에 대한 고처리량 선별검사 결과를 보여준다. 준최적 소실로 인해, WP HI-프로필, Toyopearl^® PPG-600M, Toyopearl^® 페닐-650M, Toyopearl^® 에테르-650M에 대한 완전한 시험은 수행되지 않았다.
도면 40a, 40b, 40c 및 40d는 이중특이적 항체 생산 과정 1, 2, 3, 및 4 각각의 흐름 도표를 보여준다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 FkpA의 초고순도 조성물을 산출하는 방법을 제공한다. 이런 조성물은 FkpA에 고도로 특이적이고 민감한 항체를 산출하는데 이용된다. 이들 항체는 차례로, FkpA가 발현되어 재조합 폴리펩티드 접힘 및 조립을 조장하는 세균 발효 배양액에서 제조된 재조합 폴리펩티드에서 FkpA의 검출에 유용하다. 가령, 이들 항체는 재조합 폴리펩티드, 예를 들면, 다중특이적 항체를 비롯한 항체의 제약학적 제제의 개발 동안 방출 검정에서 유용할 수 있다.

일부 양상에서, 본 발명은 외인성 FkpA를 발현하는 숙주 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드의 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 약 10 ppm, 약 9 ppm, 약 8 ppm, 약 7 ppm, 약 6 ppm, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 또는 약 1 ppm 이내의 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 IL13 및 IL17에 결합하는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다.

일부 양상에서, 본 발명은 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 a) 단백질 A 크로마토그래피, b) 혼합 방식 크로마토그래피 및 c) 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키는 순차적 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 본 발명은 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 다중특이적 항체의 개별 팔은 별개의 배양액에서 생산되고 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된다. 정제된 항체 팔은 이후, 조립되어 다중특이적 항체가 생산된다. 조립된 다중특이적 항체는 이후, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피, 그 이후에 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 산물 특이적 불순물, 예를 들면, 비대칭 항체 팔, 동종이합체, 응집체, 저분자량 종류, 산성 및 염기성 변이체가 본질적으로 없는 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물은 과정 특이적 불순물, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 단백질 및 DNA, 그리고 FkpA, DsbA 및 DsbC를 비롯한 샤프롱이 본질적으로 없다.

I.정의

본원에서 용어 "검출하는"은 표적 분자의 정성적 및 정량적 계측 둘 모두를 포함하도록 가장 넓은 의미에서 이용된다. 검출하는 것은 표본 내에서 표적 분자의 존재를 단순히 확인하는 것뿐만 아니라 표적 분자가 표본 내에 검출가능한 수준으로 존재하는 지를 결정하는 것을 포함한다.

용어 "폴리펩티드 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 중합체는 선형이거나 또는 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 비-아미노산이 끼어들 수 있다. 이들 용어는 또한, 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들면, 표지화 성분으로 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의 내에는 예로서, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예로서, 비자연적인 아미노산 등 포함)뿐만 아니라 당분야에서 공지된 다른 변형을 내포하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 항체를 특이적으로 포괄한다.

"정제된" 폴리펩티드 (가령, 항체 또는 면역접합체 등)는 폴리펩티드가 이의 자연 환경에서 존재하는 것보다 더욱 순수한 형태로 존재하도록 및/또는 초기에 합성되고 및/또는 실험실 조건 하에 증폭될 때 순도가 증가되었다는 것을 의미한다. 순도는 상대적 용어이고 반드시 절대 순도를 의미하는 것은 아니다.

본원에서 이용된 바와 같이, "초고순도 FkpA"는 조성물 내에 단백질 중에서 최소한 약 95%가 원하는 단백질, FkpA인 FkpA 조성물을 지칭한다. 일부 실례에서, 초고순도 FkpA는 최소한 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA 순도는 SEC에 의해 결정된다.

폴리펩티드에 관하여 이용될 때, "FkpA" 단백질은 세균 FKBP-유형 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소를 지칭한다. FkpA는 시스/트랜스 펩티딜-프로릴 이성화효소 (PPIase) 및 샤프롱 활성 둘 모두를 전시하는 주변세포질 단백질 이황화물 이성화효소 I이다.

본원에서 이용된 바와 같이, "FkpA"는 또한, FKBP-유형 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소 (FkpA) 주변세포질 단백질 이황화물 이성화효소 I로서 알려져 있을 수 있다. 예시적인 FkpA 단백질은 대장균 (E. coli) FkpA이다. 대장균 (E. coli) FkpA의 아미노산 서열은 서열 번호:1 또는 서열 번호:2에 의해 제공된다. 대장균 (E. coli) FkbA 유전자의 핵산 서열은 (서열 번호:3)에 의해 제공된다. 일부 구체예에서, 대장균 (E. coli) FkpA는 EcoGene 수탁 번호 EG12900에 의해 설명된 fkpA 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭한다. 일부 구체예에서, 대장균 (E. coli) FkpA는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_417806에 의해 설명된 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. 다른 FkpA 단백질은 당해 분야에서 공지된다. FkpA 단백질의 실례는 제한 없이, 시겔라 보이디이 (S. boydii) 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq 번호 WP_000838252), 시트로박터 요운가에 (C. youngae) 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq 번호 WP_006687366), 클렙시엘라 옥시토카 (K. oxytoca) 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq 번호 WP_004125943), 살모넬라 엔테리카 (S. enterica) 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq 번호 WP_000838233), 클렙시엘라 뉴모니아 (K. pneumoniae) 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq 번호 WP_019704642), 사카로미세스 세레비지애 (S. cerevisiae) FPR3p (NCBI RefSeq 번호 NP_013637), 무스 무스쿨루스 (M. musculus) Fkpb1a (NCBI RefSeq 번호 NP_032045), 무스 무스쿨루스 (M. musculus) Fkpb2 (NCBI RefSeq 번호 NP_032046), 호모 사피엔스 (H. sapiens) FKBP2 (NCBI RefSeq 번호 NP_001128680), 그리고 노랑초파리 (D. melanogaster) CG14715 (NCBI RefSeq 번호 NP_650101)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 FkpA 단백질은 대장균 (E. coli) FkpA에 최소한 약 80%, 최소한 약 81%, 최소한 약 82%, 최소한 약 83%, 최소한 약 84%, 최소한 약 85%, 최소한 약 86%, 최소한 약 87%, 최소한 약 88%, 최소한 약 89%, 최소한 약 90%, 최소한 약 91%, 최소한 약 92%, 최소한 약 93%, 최소한 약 94%, 최소한 약 95%, 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99% 동일성을 갖는다. 일정한 구체예에서, 대장균 (E. coli) FkpA는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함한다.

폴리펩티드에 관하여 이용될 때, "Dsb" 단백질은 세균 이황화물 산화환원 효소를 지칭한다. 세균 이황화물 산화환원 효소는 효소의 이황화 결합 패밀리의 구성원이다. Dsb 패밀리의 구성원은 DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및 DsbG를 포함한다. DsbA는 펩티드가 세포의 주변세포질 내로 출현할 때 사슬내 이황화 결합을 형성하고, 그리고 DsbC는 세포의 주변세포질에서 산화 단백질-접힘 동안 이황화 결합 이성화효소로서 역할을 한다.

본원에서 이용된 바와 같이, "DsbA"는 또한, 주변세포질 단백질 이황화물 이성화효소 I로서 알려져 있을 수 있다. 예시적인 DsbA 단백질은 대장균 (E. coli) DsbA이다. 대장균 (E. coli) DsbA의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_418297에 의해 제공되고, 그리고 대장균 (E. coli) dsbA 유전자의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NC_000913.3 또는 EcoGene:EG11297에 의해 제공된다.

본원에서 이용된 바와 같이, "DsbC"는 또한, 주변세포질 단백질 이황화물 이성화효소 II로서 알려져 있을 수 있다. 예시적인 DsbC 단백질은 대장균 (E. coli) DsbC이다. 대장균 (E. coli) DsbC의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_417369.1에 의해 제공되고, 그리고 대장균 (E. coli) dsbC 유전자의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NC_000913.3 또는 EcoGene:EG11070에 의해 제공된다.

"표본"은 더욱 큰 양의 물질의 작은 부분을 지칭한다. 일반적으로, 본원에서 설명된 방법에 따른 시험이 표본에서 수행된다. 표본은 전형적으로, 예로서, 본원에서 "산물 세포주"로서 또한 지칭되는 배양된 재조합 폴리펩티드-발현 세포주로부터, 또는 배양된 숙주 세포로부터 획득된 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득된다. 본원에서 이용된 바와 같이, "숙주 세포"는 관심되는 재조합 폴리펩티드 또는 산물의 발현을 위한 유전자를 내포하지 않는다. 표본은 예로서 하지만 제한 없이, 수확된 세포 배양 유체로부터, 정제 과정 동안 일정한 단계에서 과정중 풀로부터, 또는 최종 정제된 산물로부터 획득될 수 있다.

"포획 항체"는 표본 내에서 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 일정한 조건 하에, 포획 항체는 항체-표적 분자 복합체가 표본의 나머지 부분으로부터 분리될 수 있도록, 표적 분자와 복합체를 형성한다. 일정한 구체예에서, 이런 분리는 포획 항체에 결합하지 않은, 표본 내에 물질 또는 재료를 씻어내는 것을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 포획 항체는 고체 지지체 표면, 예를 들면, 예로서 하지만 제한 없이, 평판 또는 비드에 부착될 수 있다.

"검출 항체"는 표본 내에서 또는 표본-포획 항체 조합 물질 내에서 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 일정한 조건 하에, 검출 항체는 표적 분자 또는 표적 분자-포획 항체 복합체와 복합체를 형성한다. 검출 항체는 증폭될 수 있는 표지를 통해 직접적으로, 또는 예로서, 표지화되고 검출 항체에 결합하는 다른 항체의 이용을 통해 간접적으로 검출될 수 있다. 직접적인 표지화의 경우에, 검출 항체는 전형적으로, 일부 수단, 예를 들면, 비오틴 또는 루테늄을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 수단에 의해 검출가능한 모이어티에 접합된다.

용어 "표지" 또는 "검출가능한 표지"는 검출되거나 또는 정량되는 물질, 예를 들면, 항체에 연결될 수 있는 임의의 화학적 기 또는 모이어티를 지칭한다. 전형적으로, 표지는 물질의 민감한 검출 또는 정량에 적합한 검출가능한 표지이다. 검출가능한 표지의 실례는 발광 표지, 예를 들면, 형광, 인광성, 화학발광, 생물발광 및 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소, 입자, 자성 물질, 전기활성 종류 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 대안으로, 검출가능한 표지는 특이적 결합 반응에 참여함으로써 자신의 존재를 신호할 수도 있다. 이런 표지의 실례는 합텐, 항체, 비오틴, 스트렙타비딘, His-태그, 니트릴로트리아세트산, 글루타티온 S-전달효소, 글루타티온 등을 포함한다.

용어 "검출 수단"은 신호 리포팅을 통해 검출가능한 항체의 존재를 검출하는데 이용된 모이어티 또는 기술을 지칭하고, 상기 리포팅은 이후, 검정에서 판독된다. 전형적으로, 검출 수단은 고정된 표지, 예를 들면, 마이크로역가 평판 위에 포획된 표지를 증폭하는 시약, 예를 들면, 아비딘 또는 스트렙타비딘-HRP를 이용한다.

"광발광"은 임의의 물질이 상기 물질에 의한 광의 흡수 다음에 발광하는 과정을 지칭한다 (대안으로, 전자파 방사로 명명됨). 형광 및 인광은 광발광의 2가지 상이한 유형이다.

"화학발광" 과정은 화학 반응에 의한 발광 종류의 창출을 수반한다. "전기화학발광" 또는 "ECL"은 임의의 종류, 예를 들면, 항체가 적절한 주변 화학적 환경에서 전기화학적 에너지에 노출 시에 발광하는 과정이다.

관심되는 항원, 예를 들면, 숙주 세포 단백질에 "결합하는" 항체는 상기 항체가 검정 시약으로서, 예를 들면, 포획 항체로서 또는 검출 항체로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 항원에 결합하는 항체이다. 전형적으로, 이런 항체는 다른 폴리펩티드와 유의미하게 교차반응하지 않는다.

표적 분자에 폴리펩티드의 결합에 대하여, 특정 폴리펩티드 표적 상에서 특정 폴리펩티드 또는 에피토프에 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적이다"는 비특이적 상호작용과 계측가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예로서, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 표적 분자의 결합을 결정함으로써 계측될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체의 제조물을 제공한다. 가령, 다중클론 항체 제조물 내에 항체 중에서 최소한 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%가 원하는 폴리펩티드 (가령, FkpA)에 결합한다.

"친화성"은 분자 (가령, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 상대 (가령, 항원) 사이에 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (가령, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다.

본원에서 "활성적" 또는 "활성"은 선천적 또는 자연발생 폴리펩티드의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 유지하는 폴리펩티드의 형태(들)를 지칭하는데, 여기서 "생물학적" 활성은 선천적 또는 자연발생 폴리펩티드에 의해 소유된 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력 이외에 선천적 또는 자연발생 폴리펩티드에 의해 유발된 생물학적 기능 (저해성 또는 자극성)을 지칭하고, 그리고 "면역학적" 활성은 선천적 또는 자연발생 폴리펩티드에 의해 소유된 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력을 지칭한다.

용어 "길항제"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 선천적 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 저해하거나, 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "효현제"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 선천적 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효현제 또는 길항제 분자는 효현제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 선천적 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체 등을 특정적으로 포함한다. 폴리펩티드의 효현제 또는 길항제를 확인하기 위한 방법은 폴리펩티드를 후보 효현제 또는 길항제 분자와 접촉시키고, 그리고 폴리펩티드와 정상적으로 연관된 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 계측하는 것을 포함할 수 있다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 원하는 생물학적 활성을 전시하기만 하면, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 절반-항체, 최소한 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편을 특정적으로 커버한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 교체가능하게 이용된다.

항체는 면역글로불린 접힘에 전적으로 근거하여, 변하는 구조를 갖는 자연발생 면역글로불린 분자이다. 가령, IgG 항체는 2개의 "중쇄" 및 2개의 "경쇄"를 갖는데, 이들은 이황화-결합되어 기능적 항체를 형성한다. 다른 실례로서, 하나 또는 그 이상의 이황화 결합에 의해 연결된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄는 기능적 절반-항체를 형성한다. 각 중쇄와 경쇄는 그 자체로 "불변" (C) 및 "가변" (V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 반면 C 영역은 구조적 뒷받침 및 면역 작동체와의 비-항원 특이적 상호작용에서 기능을 제공한다. 항체 또는 항체의 항원 결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력이다.

항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적 특징에 의해 결정된다. 가변성은 가변 도메인의 110-아미노산 스팬에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 그 대신에, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리는 극도로 가변성의 더욱 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 불변 스트레치로 구성된다. 선천적 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 그리고 일부 경우에, β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하여 결합되고, 그리고 다른 사슬로부터 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)를 참조한다). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예를 들면, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 전시한다.

각 V 영역은 전형적으로, 3개의 상보성 결정 영역 ("CDRs", 이들은 각각 "초가변 루프"를 내포한다) 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 특정한 원하는 항원에 실제적인 친화성으로 결합하는데 필요한 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 이런 이유로, 3개의 CDRs, 그리고 이들 CDRs를 적절한 입체형태에서 유지하고 제시하기 위해 이들 사이에 산재된 최소한 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 전형적으로 포함할 것이다. 고전적 4개 사슬 항체는 V_H 및 V_L 도메인의 협력에 의해 규정되는 항원 결합 부위를 갖는다. 일정한 항체, 예를 들면, 낙타 및 상어 항체는 경쇄를 결여하고, 그리고 중쇄 단독에 의해 형성된 결합 부위에 의존한다. 단일 도메인 가공된 면역글로불린이 제조될 수 있는데, 여기서 결합 부위는 V_H 및 V_L 사이에 협력의 부재에서, 중쇄 또는 경쇄 단독에 의해 형성된다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 일정한 부분이 항체 사이에 서열에서 광범위하게 상이하고, 그리고 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 이용된다는 사실을 지칭한다. 하지만, 가변성은 항체의 가변 도메인의 전역에서 균등하게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역으로 불리는 3개의 분절에서 집중된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FRs)으로 불린다. 선천적 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 그리고 일부 경우에, β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하여 결합되고, 그리고 다른 사슬로부터 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)를 참조한다). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예를 들면, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 전시한다.

본원에서 이용될 때, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 아미노산 잔기 (가령, V_L에서 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 그리고 V_H에서 대략 잔기 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터 잔기 (가령, V_L에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 그리고 V_H에서 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외에 가변 도메인 잔기이다.

항체 또는 절반 항체의 맥락에서 "힌지 영역"은 일반적으로, 인간 IgG1의 Glu216에서부터 Pro230까지 뻗어있는 것으로 규정된다 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역이 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째와 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치 내에 배치함으로써 IgG1 서열과 함께 정렬될 수 있다.

Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 힌지 영역의 즉시 C 말단인 잔기의 스트레치, 다시 말하면, Fc 영역의 잔기 233 내지 239로서 통상적으로 규정된다. 본 발명에 앞서, FcγR 결합은 일반적으로, IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역에서 아미노산 잔기에 기인하였다.

인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로, IgG의 대략 잔기 231로부터 대략 340으로 연장된다. CH2 도메인은 이것이 다른 도메인과 가깝게 대합되지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 사슬이 무손상 선천적 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 상기 탄수화물은 도메인-도메인 대합을 위한 대체재를 제공하고 CH2 도메인을 안정시키는데 도움을 줄 수 있는 것으로 추측되었다. (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)).

"CH3 도메인"은 Fc 영역 내에 CH2 도메인의 C 말단에 잔기의 스트레치 (다시 말하면, IgG의 대략 아미노산 잔기 341로부터 대략 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 포함한다, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체 (가령, U.S. 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); 외팔 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일 사슬 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (가령, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 디-scFv, 비-scFv, 또는 탠덤 (디,트리)-scFv를 포함하지만 이들에 한정되지 않음); 그리고 이중특이적 T-세포 인게이저 (BiTEs)를 포함한다.

항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH), 그리고 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)과 함께, 전체 L 사슬로 구성된다. 항체의 펩신 처리는 이가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 거의 상응하고 항원에 여전히 교차연결할 수 있는 단일 큰 F(ab')₂ 단편을 산출한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 추가의 소수 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 Fab' 단편의 쌍으로서 최초 생산되었는데, 이들은 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다. 항체 단편의 다른 화학적 연계 역시 알려져 있다.

"Fv"는 완전 항원-인식 및 항원-결합 부위를 내포하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단한, 비공유 연관에서 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인의 이합체로 구성된다. 이러한 형상에서 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 V_H-V_L 이합체의 표면 상에서 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개 초가변 영역은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특정한 단지 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 또한, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)을 내포한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 소수 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 최소한 하나의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 Fab' 단편의 쌍으로서 최초 생산되었는데, 이들은 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다. 항체 단편의 다른 화학적 연계 역시 알려져 있다.

임의의 척추동물 종으로부터 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 (κ)와 람다 (λ)로 불리는 2가지 명확하게 상이한 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류에 배정될 수 있다. 무손상 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 그리고 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ, 그리고 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 이들 아단위 구조 및 3차원 형상은 널리 알려져 있다.

"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H와 V_L 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에서 존재한다. 일부 구체예에서, Fv 폴리펩티드는 V_H와 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv의 재고를 위해, Pl

ckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (V_H-V_L) 내에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 너무 짧아 동일한 사슬 상에서 두 도메인 사이에 대합을 허용하지 않는 링커를 이용함으로써, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 대합을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 창출하도록 강제된다. 디아바디는 예로서, EP 404,097; WO 93/11161; 그리고 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에서 더욱 충분히 설명된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "절반-항체" 또는 "헤미머"는 일가 항원 결합 폴리펩티드를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 절반 항체 또는 헤미머는 VH/VL 단위 및 임의선택적으로, 면역글로불린 불변 도메인 중에서 최소한 일부를 포함한다. 일정한 구체예에서, 절반 항체 또는 헤미머는 하나의 면역글로불린 경쇄와 연관된 하나의 면역글로불린 중쇄, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일정한 구체예에서, 절반 항체 또는 헤미머는 단일특이적이다, 다시 말하면, 단일 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일정한 이런 구체예에서, 절반 항체는 IL-13에 결합하고 IL-17에 결합하지 않는다. 일정한 다른 구체예에서, 절반 항체는 IL-17에 결합하고 IL-13에 결합하지 않는다. 당업자는 절반-항체가 단일 가변 도메인으로 구성되는, 예를 들면, 낙타로부터 유래하는 항원 결합 도메인을 가질 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다.

용어 "VH/VL 단위"는 최소한 하나의 VH HVR 및 최소한 하나의 VL HVR을 포함하는 항체의 항원 결합 영역을 지칭한다. 일정한 구체예에서, VH/VL 단위는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개 VH HVRs 모두 및 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개 VL HVRs 모두를 포함한다. 일정한 구체예에서, VH/VL 단위는 프레임워크 영역 (FR) 중에서 최소한 일부를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, VH/VL 단위는 3개의 VH HVRs 및 3개의 VL HVRs를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, VH/VL 단위는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개 또는 4개의 VH FRs 모두 및 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개 또는 4개의 VL FRs 모두를 포함한다.

용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 폴리에피토프 특이성을 갖는 (다시 말하면, 하나의 생물학적 분자 상에서 2개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 2개 또는 그 이상의 상이한 생물학적 분자 상에서 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 특정적으로 커버한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)의 항원 결합 도메인은 2개의 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 첫 번째 VH/VL 단위는 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하고 두 번째 VH/VL 단위는 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 각 VH/VL 단위는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 이런 다중특이적 항체는 전장 항체, 2개 또는 그 이상의 VL과 VH 도메인을 갖는 항체, 항체 단편, 예를 들면, Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디와 트리아바디, 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 항체 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 중쇄 불변 영역의 최소한 일부 및/또는 경쇄 불변 영역의 최소한 일부를 더욱 포함하는 VH/VL 단위는 "헤미머" 또는 "절반 항체"로서 또한 지칭될 수 있다. 일부 구체예에서, 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역의 최소한 일부 및 단일 경쇄 가변 영역의 최소한 일부를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 2개의 절반 항체를 포함하고 2개의 항원에 결합하는 이중특이적 항체는 첫 번째 항원 또는 첫 번째 에피토프에 결합하지만 두 번째 항원 또는 두 번째 에피토프에 결합하지 않는 첫 번째 절반 항체 및 두 번째 항원 또는 두 번째 에피토프에 결합하지만 첫 번째 항원 또는 첫 번째 에피토프에 결합하지 않는 두 번째 절반 항체를 포함한다. 일부 구체예에 따라, 다중특이적 항체는 각 항원 또는 에피토프에 5 M 내지 0.001 pM, 3 M 내지 0.001 pM, 1 M 내지 0.001 pM, 0.5 M 내지 0.001 pM, 또는 0.1 M 내지 0.001 pM의 친화성으로 결합하는 IgG 항체이다. 일부 구체예에서, 헤미머는 분자내 이황화 결합이 두 번째 헤미머와 형성되도록 허용하는 중쇄 가변 영역의 충분한 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 헤미머는 예로서, 상보성 홀 돌연변이 또는 노브 돌연변이를 포함하는 두 번째 헤미머 또는 절반 항체와의 이형이합체화를 허용하는 노브 돌연변이 또는 홀 돌연변이를 포함한다. 노브 돌연변이 및 홀 돌연변이는 아래에 더욱 논의된다.

"이중특이적 항체"는 하나의 생물학적 분자 상에서 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 2개의 상이한 생물학적 분자 상에서 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 또한, 본원에서 "이중 특이성"을 갖거나 또는 "이중 특이적"인 것으로서 지칭될 수 있다. 달리 지시되지 않으면, 이중특이적 항체에 의해 결합된 항원이 이중특이적 항체 명칭에서 열거되는 순서는 임의적이다. 다시 말하면, 일부 구체예에서, 용어 "항-IL-13/IL-17 이중특이적 항체" 및 "항-IL-17/IL-13 이중특이적 항체"는 교체가능하게 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하는데, 여기서 각 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 임의선택적으로 중쇄 불변 영역의 최소한 일부, 그리고 단일 경쇄 가변 영역 및 임의선택적으로 경쇄 불변 영역의 최소한 일부를 포함한다. 일정한 구체예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하는데, 여기서 각 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 단일 경쇄 가변 영역을 포함하고, 하나 이상의 단일 중쇄 가변 영역을 포함하지 않고, 그리고 하나 이상의 단일 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하는데, 여기서 각 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 단일 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그리고 여기서 첫 번째 절반 항체는 첫 번째 항원에 결합하지만 두 번째 항원에 결합하지 않고 두 번째 절반 항체는 두 번째 항원에 결합하지만 첫 번째 항원에 결합하지 않는다.

본원에서 이용된 바와 같이 용어 "노브-인투-홀" 또는 "KnH" 기술은 2개의 폴리펩티드가 상호작용하는 인터페이스에서 융기 (노브)를 한쪽 폴리펩티드 내로, 그리고 공동 (홀)을 다른 폴리펩티드 내로 도입함으로써, 시험관내에서 또는 생체내에서 함께 이들의 대합을 주동하는 기술을 지칭한다. 가령, KnHs는 항체의 Fc:Fc 결합 인터페이스, CL:CH1 인터페이스 또는 VH/VL 인터페이스에서 도입되었다 (가령, US 2011/0287009, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, 그리고 Zhu et al., 1997, Protein Science 6:781-788을 참조한다). 일부 구체예에서, KnHs는 다중특이적 항체의 제조 동안 함께 2개의 상이한 중쇄의 대합을 주동한다. 가령, 그들의 Fc 영역 내에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 더욱 포함할 수 있거나, 또는 유사한 또는 상이한 경쇄 가변 도메인과 대합을 이루는 상이한 중쇄 가변 도메인을 더욱 포함할 수 있다. KnH 기술은 또한, 함께 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인의 대합 또는 상이한 표적 인식 서열을 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 서열 (가령, 어피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합 포함)의 대합을 이루는데 이용될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이 용어 "노브 돌연변이"는 한 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 상호작용하는 인터페이스에서, 융기 (노브)를 전자 폴리펩티드 내로 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구체예에서, 다른 폴리펩티드는 홀 돌연변이를 갖는다 (가령, 각각 본원에 전체적으로 참조로서 편입되는 US 5,731,168, US 5,807,706, US 5,821,333, US 7,695,936, US 8,216,805, WO2011/133886, WO2013055958을 참조한다).

본원에서 이용된 바와 같이 용어 "홀 돌연변이"는 한 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 상호작용하는 인터페이스에서, 공동 (홀)을 전자 폴리펩티드 내로 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구체예에서, 다른 폴리펩티드는 노브 돌연변이를 갖는다 (가령, 각각 본원에 전체적으로 참조로서 편입되는 US 5,731,168, US 5,807,706, US 5,821,333, US 7,695,936, US 8,216,805를 참조한다).

표현 "단일 도메인 항체" (sdAbs) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로, 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 다시 말하면, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없다. 단일 도메인 항체의 실례는 낙타 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (가령, 수염 상어)로부터 유래된 것들, 그리고 인간 및 생쥐 항체로부터 재조합 방법으로부터 유래된 것들을 포함한다 (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; FEBS Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).

본원에서 이용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 단일클론 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합하고, 이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다. 상이한 결정인자 (에피토프)를 향해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 단일클론 항체는 그들의 특이성에 더하여, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 가령, 본원에서 제공된 방법에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 최초 설명된 하이브리도마 방법을 이용하여 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (가령, U.S. 특허 번호 4,816,567을 참조한다)에 의해 만들어질 수 있다. "단일클론 항체"는 또한, 예로서 Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에서 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원에서 단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열과 상동하고, 반면 사슬(들)의 나머지 부분이 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열에 상동한 "키메라" 항체뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 전시하기만 하면, 이런 항체의 단편을 특정적으로 포함한다 (U.S. 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 관심되는 키메라 항체는 비인간 영장류 (가령, 긴꼬리원숭이, 예를 들면, 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (US 특허 번호 5,693,780).

비인간 (가령, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 내포하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는, 비인간 종 (공여자 항체), 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 정밀화하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 최소한 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 전술한 바와 같은 FR 치환(들)을 제외하고, 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 임의선택적으로 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 것이다. 추가 상세를 위해, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 그리고 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참조한다.

본원에서, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 선천적 서열 불변 도메인 (가령, 인간 선천적 서열 불변 도메인) 또는 이들의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 또는 그 이상의 작동체 기능을 갖는다.

"선천적 항체"는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로사합체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 이황화 연쇄의 숫자는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 변한다. 각 중쇄와 경쇄는 또한, 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 다리를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 단부에서 가변 도메인 (V_H), 그 이후에 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 단부에서 가변 도메인 (VL) 및 다른 단부에서 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 함께 정렬되고, 그리고 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 생각된다.

"나신 항체"는 이종성 분자, 예를 들면, 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체 (본원에서 규정된 바와 같음)이다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 이종성 단백질 ("부착소")의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 작동체 기능과 합동하는 분자를 명명한다. 구조적으로, 면역접합체는 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열의 융합을 포함하는데, 상기 아미노산 서열은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아니고 (다시 말하면, 항체의 불변 영역과 비교하여 "이종성"이다), 그리고 면역글로불린 불변 도메인 서열 (가령, IgG의 CH2 및/또는 CH3 서열)이다. 예시적인 부착소 서열은 관심되는 단백질에 결합하는 수용체 또는 리간드의 부분을 포함하는 인접한 아미노산 서열을 포함한다. 부착소 서열은 또한, 관심되는 단백질에 결합하지만, 수용체 또는 리간드 서열 (가령, 펩티바디에서 부착소 서열)이 아닌 서열일 수 있다. 이런 폴리펩티드 서열은 파지 전시 기술 및 고처리량 분류 방법을 비롯한 다양한 방법에 의해 선별되거나 또는 확인될 수 있다. 면역접합체 내에 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들면, IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 아형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 획득될 수 있다.

일부 구체예에서, 항체 "작동체 기능"은 항체의 Fc 영역 (선천적 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하고, 그리고 항체 아이소타입에 따라 변한다. 항체 작동체 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향조절.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재에서 표적을 용해하는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동계 항원과 복합화된 분자 (가령, 폴리펩티드 (가령, 항체))에 보체계 (C1q)의 첫 번째 성분의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 사정하기 위해, 예로서 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)에서 설명된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.

"항체 의존성 세포 매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcRs)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (가령, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고 표적 세포의 용해를 차후에 유발하는 세포 매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 464 페이지 상에 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들면, US 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에서 설명된 것이 수행될 수 있다. 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예를 들면, Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다.

"인간 작동체 세포"는 하나 또는 그 이상의 FcR을 발현하고 작동체 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 최소한 FcγRIII을 발현하고 ADCC 작동체 기능을 실행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 실례는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 그리고 호중구를 포함한다; PBMC와 NK 세포가 바람직하다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하는데 이용된다. 일부 구체예에서, FcR은 선천적 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고, 그리고 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체뿐만 아니라 이들 수용체의 대립형질 변이체와 대안으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")를 포함하는데, 이들은 주로 세포질 도메인에서 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)를 내포한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기초된 저해 모티프 (ITIM)를 내포한다 (Da

ron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)를 참조한다). FcRs은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 그리고 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)에서 리뷰된다. 장래에 확인될 것들을 비롯한 다른 FcR은 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포괄된다. 상기 용어는 또한, 신생아 수용체, FcRn을 포함하는데, 이것은 모성 IgG의 태아로의 전달을 책임진다 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전히 동일하지 않고, 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에서 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 여기에 포함된다.

본원에서 이용된 바와 같이 용어 "불순물"은 원하는 폴리펩티드 산물과 상이한 물질 또는 재료를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드 산물은 이중특이적 항체를 비롯한 항체를 포함한다. 불순물은 제한 없이 다음을 포함한다: 숙주 세포 물질, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 숙주 세포 단백질 (ECP); 침출된 단백질 A; 핵산; 원하는 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스; 세포 배양 배지 성분 등. 일부 실례에서, 불순물은 예로서 하지만 제한 없이, 세균 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 세포 (가령, ECP), 진핵 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다. 일부 구체예에서, 불순물은 잘라진 FkpA 및/또는 FkpA의 응집체일 수 있다. 일부 구체예에서, 불순물은 다중특이적 항체의 발현, 접힘 또는 조립을 용이하게 하는데 이용된 보조 단백질; 예로서, 샤프롱, 예를 들면, FkpA, DsbA 및 DsbC를 지칭할 수 있다. 일부 구체예에서, 불순물은 산물-특이적 폴리펩티드, 예를 들면, 외팔 항체 및 오조립딘 항체, 염기성 변이체 및 산성 변이체를 비롯한 항체 변이체, 그리고 응집체를 지칭할 수 있다.

"단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

참고 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최고 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참고 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일정한 구체예에서, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 공급원 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087 하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California로부터 공개적으로 가용하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체계에서 이용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변하지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이것은 대안으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대해 일정한 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 아래와 같이 계산된다:

100 곱하기 분율 X/Y

여기서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해, 상기 프로그램의 A와 B의 정렬에서 동일한 정합으로서 채점된 아미노산 잔기의 숫자이고, 그리고 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것으로 인지될 것이다. 달리 특정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 직전 단락에서 설명된 바와 같이 획득된다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs) 및 3개의 초가변 영역 (HVRs)을 포함한다. (가령, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 페이지 91 (2007)을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 가령, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)을 참조한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 함입된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.

크로마토그래피에 대하여 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "순차적"은 첫 번째 크로마토그래피 단계, 그 이후에 두 번째 크로마토그래피 단계를 갖는 것을 지칭한다. 일부 구체예에서, 용어 "순차적"은 첫 번째 크로마토그래피 단계가 하나 이상의 추가 단계에 의해 이어지는 맥락에서 이용된다. 일부 실례에서, 크로마토그래피에 대하여 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "순차적"은 특정한 순서에서 크로마토그래피 단계를 지칭한다; 가령, 첫 번째 크로마토그래피 단계, 그 이후에 두 번째 크로마토그래피 단계, 그 이후에 세 번째 크로마토그래피 단계 등. 비-크로마토그래피 단계 (가령, pH 및/또는 전도도 조정, 여과, 농축)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 추가 단계가 첫 번째 크로마토그래피 단계 및 추가 크로마토그래피 단계 사이에 포함될 수 있다.

크로마토그래피에 대하여 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "연속적"은 첫 번째 크로마토그래피 물질 및 두 번째 크로마토그래피 물질이 직접적으로, 또는 2개의 크로마토그래피 물질 사이에 연속적 유동을 허용하는 일부 다른 기전에 의해 연결된 것을 지칭한다.

"부하 밀도"는 크로마토그래피 물질의 용적, 예를 들면, 리터와 접촉된 조성물의 질량 양, 예를 들면, 그램을 지칭한다. 일부 실례에서, 부하 밀도는 g/L로 표현된다.

본원에서 값 또는 파라미터에서 "약"에 대한 언급은 그 자체로 상기 값 또는 파라미터에 관계하는 변이를 포함한다 (및 설명한다). 가령, "약 X"를 지칭하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 본원에서 설명된 발명의 양상 및 변이는 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는" 양상 및 변이를 포함하는 것으로 이해된다.

II. FkpA의 정제 방법

FkpA의 초고순도 제조물을 산출하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 중에서 한 가지보다 많은 순수한 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 99% 순수한 FkpA인 제조물은 제조물 내에 1% 이내의 물질이 FkpA의 생산 동안 존재하는 세포 또는 세포 용해물 내에 존재하는 물질 (가령, 단백질, 핵산, 지질 등)이라는 것을 지시한다. FkpA의 99% 순수한 제조물은 FkpA의 정제 또는 조제에서 이용된 완충액, 염 또는 다른 부형제를 내포할 수 있다.

일부 양상에서, 본 발명은 FkpA의 초고순도 제조물을 산출하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, FkpA는 세균 발효 배양액, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 배양액에서 FkpA를 과다발현함으로써 생산된다. 일부 구체예에서, 세균 발효 배양액, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 배양액은 내인성 FkpA에 더하여, 외인성 FkpA를 발현한다. 일부 구체예에서, FkpA는 세균 발효 배양액, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 배양액에서 외인성 FkpA를 발현함으로써 생산된다. 따라서, 일정한 구체예에서, 상기 방법은 외인성 FkpA의 발현을 허용하는 조건 하에 대장균 (E. coli) 배양액을 배양하는 단계를 더욱 포함한다. 발효 이후에, 세균 세포는 수집되고 원심분리된다. 결과의 세포 페이스트는 용해 완충액 (가령, 25 mM MES pH 6.0)에서 재현탁되고 용해된다 (가령, 미세유동화기를 이용함으로써). 일부 구체예에서, 세포 용해물은 폴리에틸렌이민 (PEI)으로 조건화된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1.0% 중에서 한 가지보다 많은 최종 농도에서 PEI로 조건화된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 약 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 20 시간, 또는 24 시간 중에서 한 가지보다 많은 시간 동안 PEI로 조건화된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 약 0 ℃, 4 ℃, 또는 21 ℃ 중에서 한 가지보다 많은 온도에서 PEI로 조건화된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 주위 온도 (~21 ℃)에서 PEI로 조건화된다. 일부 구체예에서, PEI-조건화 용해물은 미립자를 제거하기 위해 원심분리된다. 일부 구체예에서, PEI-조건화 용해물은 크로마토그래피에 앞서 여과된다. 일부 구체예에서, PEI-조건화 용해물은 크로마토그래피에 앞서 22 μm 필터를 통해 여과된다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 FkpA 폴리펩티드 및 불순물을 포함하는 세포 용해물로부터 FkpA 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 b) 세포 용해물을 원심분리에 의해 투명하게 하고, c) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 투명해진 세포 용해물을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고, d) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 FkpA 폴리펩티드를 용리하여 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 양이온 교환 용출물을 산출하고, e) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 양이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 물질에 적용하고, f) HIC 물질로부터 FkpA 폴리펩티드를 용리하여 HIC 용출물을 산출하고, g) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 HIC 용출물을 크기 배제 크로마토그래피에 적용하고, h) 정제된 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 크기 배제 크로마토그래피로부터 분획물을 수집하는 것을 포함한다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 음성으로 하전된 기 ("리간드")를 내포하는 고체상이고, 그리고 고체상 위에서 또는 고체상을 통해 통과된 수성 용액에서 양이온으로 교환을 위한 유리 양이온을 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 막, 모놀리스, 또는 수지일 수 있다. 한 구체예에서, 양이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 막이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 전통적인 크로마토그래피 물질 또는 대류적 크로마토그래피 물질을 활용할 수 있다. 전통적인 크로마토그래피 물질은 예로서, 살포성 물질 (가령, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지) 및 확산성 물질 (가령, 교차연결된 아가로오스 수지)을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리 (스티렌-디비닐벤젠) 수지는 POROS^® 수지일 수 있다. 일부 구체예에서, 교차연결된 아가로오스 수지는 술포프로필-Sepharose^® 패스트 플로우 ("SPSFF") 수지일 수 있다. 대류적 크로마토그래피 물질은 막 (가령, 폴리에테르술폰) 또는 모놀리스 물질 (가령, 교차연결된 중합체)일 수 있다. 폴리에테르술폰 막은 무스탕일 수 있다. 교차연결된 중합체 모놀리스 물질은 교차연결된 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-코-에틸렌 디메타크릴레이트)일 수 있다.

이들 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 카르복실산 기능기 또는 술폰산 기능기를 포함한다. 일부 구체예에서, 기능기는 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 막, 모놀리스, 또는 수지 입자이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 수지이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 무스탕 S, 사르토바인드 S, SO3 모놀리스, S 세라믹 HyperD, POROS^® HS50, POROS^® HS20, 술포프로필-Sepharose^® 패스트 플로우 (SPSFF), SP-Sepharose^® XL (SPXL), CM Sepharose^® 패스트 플로우, Capto™ S, 프락토겔 Se HiCap, 프락토겔 SO3, 또는 프락토겔 COO이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 POROS^® HS50이다. 음이온 교환 물질의 실례는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 POROS^® HQ 50, POROS^® PI 50, POROS^® D, 무스탕 Q, Q Sepharose^® FF (QSFF), 그리고 DEAE Sepharose^® 또는 이의 등가물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 물질은 약한 음이온 교환 물질; 예를 들면, DEAE이다. 다른 구체예에서, 음이온 교환 물질은 강한 음이온 교환 물질; 예를 들면, QSFF이다. 일부 구체예에서, FkpA의 정제에 이용된 음이온 교환 물질은 약한 음이온 교환 물질이다. 일부 구체예에서, 약한 음이온 교환 물질은 사차 아민을 포함한다. 일부 구체예에서, 사차 아민은 교차연결된 아가로오스에 연결된다. 일부 구체예에서, FkpA의 정제에 이용된 음이온 교환 물질은 DEAE Sepharose^®이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 소수성에 따라 생체분자를 분리하는 액체 크로마토그래피 기술이다. HIC 물질의 실례는 Toyopearl^® 헥실 650, Toyopearl^® 부틸 650, Toyopearl^® 페닐 650, Toyopearl^® 에테르 650, Source, Resource, Sepharose^® Hi-Trap, 부틸 Sepharose^®, 옥틸 Sepharose^®, 페닐 Sepharose^®를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 상기 중에서 일부 구체예에서, HIC 물질은 HIC 칼럼이다. 상기 중에서 일부 구체예에서, HIC 물질은 HIC 막이다. 일부 구체예에서, HIC 물질은 부틸 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 부틸 모이어티는 교차연결된 아가로오스에 연결된다. 일부 구체예에서, FkpA의 정제에 이용된 HIC 물질은 부틸 Sepharose^®이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 그들의 크기 및 모양에 따라 생체분자를 분리하는 액체 크로마토그래피 기술이다. 크기 배제 크로마토그래피 물질은 특정 중량 범위의 분자의 효율적인 분리를 위한 상이한 구멍 크기를 갖는다. 크기 배제 크로마토그래피 물질의 실례는 덱스트란, 다공성 아가로오스 입자, 교차연결된 아가로오스, 교차연결된 아가로오스 및 덱스트란, 그리고 교차연결된 아크릴아미드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 크기 배제 크로마토그래피 물질의 실례는 세파덱스, 슈퍼덱스, 세파크릴, TSKgel 및 Bio-Gel을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 슈퍼덱스 75 크기 배제 크로마토그래피가 FkpA의 정제에서 이용된다.

크로마토그래피 물질 상에서 FkpA를 포함하는 조성물의 부하는 불순물로부터 FkpA 산물의 분리를 위해 최적화될 수 있다. 일부 구체예에서, 크로마토그래피 물질 위에 조성물의 부하는 크로마토그래피 물질에 불순물의 결합을 위해 최적화된다. 가령, 조성물은 부하 완충액의 전도도는 일정하지만, 다수의 상이한 pH 값에서 부하 완충액에서 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼 위에 부하될 수 있다. 대안으로, 조성물은 부하 완충액의 pH는 일정하지만, 다수의 상이한 전도도에서 부하 완충액에서 크로마토그래피 물질 위에 부하될 수 있다. 크로마토그래피 물질 상에 조성물 부하의 완결 및 풀 분획물 내로 크로마토그래피 물질로부터 산물의 추후 용리 시에, 풀 분획물 내에 불순물의 양은 소정의 pH 또는 전도도에서 불순물로부터 산물의 분리에 관한 정보를 제공한다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, FkpA를 포함하는 조성물은 약 10 mg/mL, 9 mg/mL, 8 mg/mL, 7 mg/mL, 6 mg/mL, 5 mg/mL, 4 mg/mL, 3 mg/mL, 2 mg/mL, 또는 1 mg/mL 중에서 한 가지보다 적거나 또는 이와 동등한 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 상기 폴리펩티드의 부하 밀도에서 양이온 교환 크로마토그래피 물질 위에 부하된다. 상기 조성물은 약 1 mg/mL 및 2 mg/mL, 2 mg/mL 및 3 mg/mL, 3 mg/mL 및 4 mg/mL, 4 mg/mL 및 5 mg/mL, 5 mg/mL 및 6 mg/mL, 6 mg/mL 및 7 mg/mL, 7 mg/mL 및 8 mg/mL, 8 mg/mL 및 9 mg/mL, 또는 9 mg/mL 및 10 mg/mL 중에서 한 가지 사이의 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 상기 폴리펩티드의 부하 밀도에서 양이온 크로마토그래피 물질 위에 부하될 수 있다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 아가로오스; 예를 들면, SP Sepharose^®에 교차연결된 술포프로필 기이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, FkpA를 포함하는 조성물은 약 10 mg/mL, 9 mg/mL, 8 mg/mL, 7 mg/mL, 6 mg/mL, 5 mg/mL, 4 mg/mL, 3 mg/mL, 2 mg/mL, 또는 1 mg/mL 중에서 한 가지보다 적거나 또는 이와 동등한 HIC 물질의 상기 폴리펩티드의 부하 밀도에서 HIC 물질 위에 부하된다. 상기 조성물은 약 1 mg/mL 및 2 mg/mL, 2 mg/mL 및 3 mg/mL, 3 mg/mL 및 4 mg/mL, 4 mg/mL 및 5 mg/mL, 5 mg/mL 및 6 mg/mL, 6 mg/mL 및 7 mg/mL, 7 mg/mL 및 8 mg/mL, 8 mg/mL 및 9 mg/mL, 또는 9 mg/mL 및 10 mg/mL 중에서 한 가지 사이의 HIC 물질의 상기 폴리펩티드의 부하 밀도에서 HIC 물질 위에 부하될 수 있다. 일부 구체예에서, HIC 물질은 교차연결된 아가로오스; 예를 들면, 부틸 Sepharose^®에 교차연결된 부틸 모이어티이다.

크로마토그래피 물질로부터 FkpA의 용리는 최소 불순물과 함께 및 최소 풀 용적에서 FkpA의 수율을 위해 최적화될 수 있다. 가령, 조성물은 부하 완충액에서 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼 위에 부하될 수 있다. 부하의 완결 시에, 크로마토그래피 물질은 초기에 세척되고, 그리고 이후, 용리 완충액의 전도도는 일정하지만, 다수의 상이한 pH에서 완충액으로 용리된다. 대안으로, 산물은 용리 완충액의 pH는 일정하지만, 다수의 상이한 전도도에서 용리 완충액에서 크로마토그래피 물질로부터 용리될 수 있다. 크로마토그래피 물질로부터 산물의 용리의 완결 시에, 풀 분획물 내에 불순물의 양은 소정의 pH 또는 전도도에서 불순물로부터 산물의 분리에 관한 정보를 제공한다. 높은 숫자의 분획물 (가령, 8개 칼럼 용적)에서 산물의 용리는 용리 프로필의 "테일링"을 나타낸다. 본 발명의 일부 구체예에서, 용리의 테일링이 최소화된다.

예로서, 완충액의 원하는 pH, 완충액의 원하는 전도도, 관심되는 단백질의 특징, 그리고 정제 방법에 따라, 다양한 완충액이 이용될 수 있다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 이들 방법은 완충액을 이용하는 것을 포함한다. 완충액은 부하 완충액, 평형화 완충액, 또는 세척 완충액일 수 있다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상은 동일하다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액은 상이하다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 완충액은 염을 포함한다. 부하 완충액은 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 부하 완충액은 염화나트륨 완충액이다. 일부 구체예에서, 부하 완충액은 아세트산나트륨 완충액이다.

본원에서 이용된 바와 같이, 부하는 크로마토그래피 물질 위에 부하된 조성물이다. 부하 완충액은 FkpA를 포함하는 조성물을 크로마토그래피 물질 위에 부하하는데 이용되는 완충액이다. 크로마토그래피 물질은 정제되는 조성물을 부하하기에 앞서, 평형화 완충액으로 평형화될 수 있다. 일부 실례에서, 세척 완충액은 조성물을 크로마토그래피 물질 위에 부하한 후 및 고체상으로부터 관심되는 폴리펩티드의 용리 전에 이용된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용리는 크로마토그래피 물질로부터 산물, 예를 들면, FkpA의 제거이다. 용리 완충액은 크로마토그래피 물질로부터 관심되는 폴리펩티드 또는 다른 산물을 용리하는데 이용되는 완충액이다. 많은 경우에, 용리 완충액은 부하 완충액과 상이한 물리적 특징을 갖는다. 가령, 용리 완충액은 부하 완충액과 상이한 전도도 또는 부하 완충액과 상이한 pH를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 낮은 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 높은 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 낮은 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 높은 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액과 상이한 전도도 및 상이한 pH를 갖는다. 용리 완충액은 더욱 높은 또는 더욱 낮은 전도도 및 더욱 높은 또는 더욱 낮은 pH의 임의의 조합을 가질 수 있다.

전도도는 2개 전극 사이에 전류를 전도하는 수성 용액의 능력을 지칭한다. 용해 상태에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 이런 이유로, 수성 용액 내에 존재하는 이온의 양이 증가하면, 용액은 더욱 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도에 대한 계측의 기본 단위는 Siemen (또는 mho), mho (mS/cm)이고, 그리고 전도도 미터, 예를 들면, Orion 전도도 미터의 다양한 모델을 이용하여 계측될 수 있다. 전기분해 전도도가 전류를 운반하는 용액 내에 이온의 능력이기 때문에, 용액의 전도도는 그 안에 이온의 농도를 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 가령, 용액 내에 완충제의 농도 및/또는 염 (가령, 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 염화칼륨)의 농도가 원하는 전도도를 달성하기 위해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액의 염 농도는 원하는 전도도를 달성하도록 변형된다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 부하 완충액은 약 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 또는 10 mS/cm 중에서 한 가지보다 큰 전도도를 갖는다. 전도도는 약 4 mS/cm 및 17 mS/cm, 4 mS/cm 및 10 mS/cm, 4 mS/cm 및 7 mS/cm, 5 mS/cm 및 17 mS/cm, 5 mS/cm 및 10 mS/cm, 또는 5 mS/cm 및 7 mS/cm 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 전도도는 약 4 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 또는 10 mS/cm 중에서 한 가지이다. 한 양상에서, 전도도는 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액의 전도도이다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상의 전도도는 동일하다. 일부 구체예에서, 부하 완충액의 전도도는 세척 완충액 및/또는 평형화 완충액의 전도도와 상이하다.

일부 구체예에서, 양이온 교환 용리 완충액은 부하 완충액의 전도도보다 큰 전도도를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 용리 완충액은 약 5 mS/cm, 10 mS/cm, 15 mS/cm, 20 mS/cm, 25 mS/cm, 30 mS/cm, 35 mS/cm, 40 mS/cm, 45 mS/cm, 50 mS/cm, 55 mS/cm, 60 mS/cm, 65 mS/cm, 70 mS/cm, 75 mS/cm, 80 mS/cm, 85 mS/cm, 90 mS/cm, 95 mS/cm, 또는 100 mS/cm 중에서 한 가지보다 큰 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액의 전도도는 용리 완충액의 염 농도를 변경함으로써 변경된다.

일부 구체예에서, HIC 부하 완충액은 용리 완충액의 전도도보다 큰 전도도를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, HIC 부하 완충액은 약 5 mS/cm, 10 mS/cm, 15 mS/cm, 20 mS/cm, 25 mS/cm, 30 mS/cm, 35 mS/cm, 40 mS/cm, 45 mS/cm, 50 mS/cm, 55 mS/cm, 60 mS/cm, 65 mS/cm, 70 mS/cm, 75 mS/cm, 80 mS/cm, 85 mS/cm, 90 mS/cm, 95 mS/cm, 또는 100 mS/cm 중에서 한 가지보다 큰 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액의 전도도는 용리 완충액의 염 농도를 변경함으로써 변경된다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, HIC 용리 완충액은 약 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 또는 10 mS/cm 중에서 한 가지보다 작은 전도도를 갖는다.

상기 구체예 중에서 한 가지의 일부 양상에서, 용리 완충액의 전도도는 단계 구배에 의해 또는 선형 구배에 의해 부하 및/또는 세척 완충액으로부터 등용매성으로 변하였다.

일부 구체예에서, FkpA는 9 칼럼 용적에서 약 0%에서 약 60% 10 mM MES 및 300 mM NaCl의 염 구배로 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용리된다.

일부 구체예에서, FkpA는 FkpA가 HIC 물질로부터 용리할 때까지, 정제수를 이용하여 HIC 물질로부터 용리된다.

FkpA의 계산된 등전점은 상기 단백질의 아미노산 함량에 근거하여 약 7.01이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 부하 완충액은 약 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 중에서 한 가지보다 적은 pH를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 부하 완충액은 약 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 중에서 한 가지보다 큰 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상의 pH는 동일하다. 일부 구체예에서, 부하 완충액의 pH는 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액의 pH와 상이하다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피를 위한 부하 완충액의 pH는 약 pH 6.0이다.

일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액의 pH보다 적은 pH를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 용리 완충액은 약 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 중에서 한 가지보다 적은 pH를 갖는다. 용리 완충액의 pH는 약 4 및 9, 4 및 8, 4 및 7, 4 및 6, 4 및 5, 5 및 9, 5 및 8, 5 및 7, 5 및 6, 6 및 9, 6 및 8, 6 및 7 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 용리 완충액의 pH는 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0 중에서 한 가지이다. 일부 구체예에서, FkpA를 포함하는 조성물은 pH 8에서 부하 완충액에서 음이온 교환 물질 위에 부하되고, 그리고 pH 약 7.0 또는 7.1에서 용리 완충액에서 음이온 교환 물질로부터 용리된다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, HIC 부하 완충액은 약 6.0, 7.0, 또는 8.0 중에서 한 가지보다 적은 pH를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 상기 부하 완충액은 약 6.0, 7.0, 또는 8.0 중에서 한 가지보다 큰 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상의 pH는 동일하다. 일부 구체예에서, 부하 완충액의 pH는 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액의 pH와 상이하다.

일부 구체예에서, 크기 배제 크로마토그래피는 관류 방식 또는 차별적 분할 방식으로 이용된다. 일부 구체예에서, 크기 배제 크로마토그래피에 이용된 완충액은 PBS pH 7.5 ±0.4이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 유속은 약 50 CV/시간, 40 CV/시간, 또는 30 CV/시간 중에서 한 가지보다 적다. 유속은 약 5 CV/시간 및 50 CV/시간, 10 CV/시간 및 40 CV/시간, 또는 18 CV/시간 및 36 CV/시간 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 유속은 약 9 CV/시간, 18 CV/시간, 25 CV/시간, 30 CV/시간, 36 CV/시간, 또는 40 CV/시간 중에서 한 가지이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 유속은 약 200 cm/시간, 150 cm/시간, 100 cm/시간, 75 cm/시간, 또는 50 cm/시간 중에서 한 가지보다 적다. 유속은 약 25 cm/시간 및 200 cm/시간, 25 cm/시간 및 175 cm/시간, 25 cm/시간 및 150 cm/시간, 25 cm/시간 및 100 cm/시간, 50 cm/시간 및 100 cm/시간, 또는 65 cm/시간 및 85 cm/시간 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 유속은 약 0.1 mL/분, 0.25 mL/분, 0.5 mL/분, 0.75 mL/분, 1 mL/분, 2 mL/분, 3 mL/분, 4 mL/분, 5 mL/분, 6 mL/분, 7 mL/분, 8 mL/분, 9 mL/분, 10 mL/분, 11 mL/분, 12 mL/분, 13 mL/분, 14 mL/분, 15 mL/분, 20 mL/분, 25 mL/분, 및 50 mL/분보다 크다. 일부 구체예에서, 유속은 약 0.1 mL/분 및 1 mL/분, 1 mL/분 및 5 mL/분, 1 mL/분 및 10 mL/분, 5 mL/분 및 10 mL/분, 10 mL/분 및 15 mL/분, 10 mL/분 및 25 mL/분, 그리고 15 mL/분 및 25 mL/분 사이이다. 일부 구체예에서, FkpA의 음이온 교환 크로마토그래피에 대한 유속은 약 13.3 ml/분이다. 일부 구체예에서, FkpA의 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대한 유속은 약 13.2 ml/분이다. 일부 구체예에서, FkpA의 크기 배제 크로마토그래피에 대한 유속은 약 1 ml/분이다.

베드 높이는 이용된 크로마토그래피 물질의 높이이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 베드 높이는 약 3 cm, 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 30 cm, 35 cm, 40 cm, 45 cm, 50 cm, 60 cm, 70 cm, 80 cm, 90 cm 또는 100 cm 중에서 한 가지보다 크다. 베드 높이는 약 3 cm 및 50 cm, 5 cm 및 35 cm, 3 cm 및 35 cm, 또는 5 cm 및 50 cm 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 베드 높이는 부하 내에 폴리펩티드 또는 불순물의 양에 근거하여 결정된다.

일부 구체예에서, 크로마토그래피는 약 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 또는 200 mL보다 큰 용적을 갖는 도관의 칼럼에 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 분획물은 크로마토그래피로부터 수집된다. 일부 구체예에서, 수집된 분획물은 약 0.01 CV, 0.02 CV, 0.03 CV, 0.04 CV, 0.05 CV, 0.06 CV, 0.07 CV, 0.08 CV, 0.09 CV, 0.1 CV, 0.2 CV, 0.3 CV, 0.4 CV, 0.5 CV, 0.6 CV, 0.7 CV, 0.8 CV, 0.9 CV, 1.0 CV, 2.0 CV, 3.0 CV, 4.0 CV, 5.0 CV, 6.0 CV, 7.0 CV, 8.0 CV, 9.0 CV, 또는 10.0 CV보다 크다. 일부 구체예에서, 산물, 예를 들면, 폴리펩티드를 내포하는 분획물은 모아진다. 일부 구체예에서, 부하 분획물로부터 및 용리 분획물로부터 폴리펩티드를 내포하는 분획물은 모아진다. 분획물 내에 폴리펩티드의 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다; 예로서, 분획물 내에 폴리펩티드의 양은 UV 분광법에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 검출가능한 폴리펩티드 단편을 내포하는 분획물은 모아진다. 일부 구체예에서, 분획물 내에 FkpA의 존재 및 순도는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된다.

예시적인 구체예

일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA의 초고순도 제조물을 생산하기 위한 다음의 예시적인, 하지만 무제한적 방법을 제공한다. FkpA는 대장균 (E. coli)에서 발현된다. 세포 페이스트는 10 용적 25 mM MES pH 6.0 (용해 완충액)에서 현탁되고, 그리고 현탁액이 균질할 때까지 혼합된다. 세포 용해는 미세유동화기 HC-8000을 이용하여, 집 압력 (6000-8000 psi)에서 4회 통과로 수행된다. 현탁액은 15,000 rpm에서 SS-34 회전자를 이용한 RC6 원심분리기에서 30 분 동안 원심분리된다.

다른 구체예에서, 세포 페이스트는 50 mM MES pH 6.0에서 현탁되고 (50 g 세포 페이스트/1 L), 그리고 현탁액이 균질할 때까지 혼합된다. 세포 용해는 미세유동화기 110F를 이용하여, 집 압력 (~7000 psi)에서 3회 통과로 수행된다. 균질액은 0.1% PEI (10% PEI 원액을 이용)에 조건화되고 주위 온도 (~21℃)에서 30 분 동안 혼합된다. 현탁액은 8500 rpm에서 "GSA" 회전자를 이용한 Sorval RC-5B+ 원심분리기에서 30 분 동안 원심분리된다. 센트레이트는 수집되고 0.22 um Durapore 필터를 통해 여과된다.

(a) SP Sepharose^® 패스트 플로우

투명해진 센트레이트 (1.5 M Tris 염기로 pH 8.0까지 조건화됨)는 SP Sepharose^® 패스트 플로우 (GE Healthcare)를 내포하는 칼럼에 결합 및 용리 방식으로 부하된다. 상기 칼럼은 다음의 성질을 갖는다: 칼럼은 27.0 cm (높이) x 2.6 cm (직경), 용적 145 mL, 단백질 수용량 ≤50 mg/mL 수지. 칼럼은 3 CV 250 mM MES pH 6.0으로 전평형화되고 25 mM MES, pH 6.0으로 평형화된다. 부하의 종결점에서, 칼럼은 3 CV의 평형화 완충액으로 세척된다. FkpA는 0 - 30% 완충액 B (25 mM MES, 300 mM NaCl)의 9 CV 구배를 이용하여 용리된다. 분획물은 SDS-PAGE에 의해 분석된다.

(b) 부틸-S Sepharose^®

모아진 SP 분획물은 이후, 부틸-S Sepharose^® 크로마토그래피 물질에 결합 및 용리 방식으로 적용된다. 상기 칼럼은 다음의 성질을 갖는다: 칼럼 치수는 9.4 cm (높이) x 2.6 cm (직경), 용적 50 mL, 단백질 수용량 ≤20 mg/mL 수지이었다. 칼럼은 300 mM 황산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0으로 평형화된다. SP 풀은 부틸-S Sepharose^® 칼럼 위에 부하하기에 앞서, 동등한 용적의 50 mM 인산염, 0.6 M 황산나트륨, pH 7.0의 첨가에 의해 조건화되었다. 칼럼은 이후, 3 CV의 50 mM 인산염, 300 mM 황산나트륨, pH 7.0으로 세척된다. FkpA는 정제수로 칼럼으로부터 용리된다. 분획물은 수집되고 칼럼 분획물의 SDS-PAGE 분석에 의해 분석된다.

(c) 슈퍼덱스 200

모아진 부틸 Sepharose^® 분획물은 이후, 슈퍼덱스 200을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 종속된다. 이러한 단계는 임의의 남아있는 높은 MW 및 낮은 MW 종류를 제거하고 FkpA를 공식화하는데 이용된다. 슈퍼덱스 200은 10 및 600 kDal 사이의 분자량을 갖는 분자에 대한 분별 범위를 갖고, 그리고 FkpA와 같은 단백질에 적합하다. 칼럼은 슈퍼덱스 200이고 다음의 성질을 갖는다: 칼럼은 60 cm x 2.6 cm 직경, 용적 320 mL, 부하 용적 ≤16mL이었다. HIC 풀 (분획물 7-11)은 원심 필터를 이용하여 ≤ 16 mL (≤ 5%의 SEC CV)의 용적까지 농축된다. 이들 단위는 표적 용적이 도달될 때까지, 3000 rpm에서 에펜도르프 임상적 원심분리기를 이용하여 20 분 간격 동안 원심분리된다. 슈퍼덱스 200 크기 배제 칼럼은 3 CV PBS, pH 7.5 ± 0.4로 평형화된다. 부틸 Sepharose^® 분획물은 칼럼 위에 부하되고 1 mL/분의 유속에서 PBS, pH 7.5 ± 0.4로 용리된다.

FkpA의 순도를 결정하는 방법

FkpA의 제조물의 순도를 결정하는 방법은 당해 분야에서 공지된다. 일부 구체예에서, 제조물에서 FkpA의 순도는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 제조물에서 FkpA의 순도는 고성능 액체크로마토그래피 크기 배제 크로마토그래피 (HPLC SEC)에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 제조물에서 FkpA의 순도는 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (SDS-PAGE)에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, SDS PAGE 겔 상에서 단백질은 형광 단백질 영상화를 이용하여 확인된다. 일부 구체예에서, SDS PAGE는 Sypro^®Ruby를 이용하여 영상화된다. 일부 구체예에서, SDS-PAGE 상에서 단백질은 Heukeshoven 은 염색을 이용하여 가시화된다. 다른 구체예에서, FkpA 분자의 정체는 N 말단 서열 분석, 펩티드 질량 지문확인 (PMF), CHIP TOF에 의한 무손상/감소된 질량, 그리고 웨스턴 블롯 분석을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 특징화 검정을 이용하여 확증된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA의 초고순도 제조물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 FpkA의 제조물을 제공하는데, 여기서 FkpA는 제조물의 최소한 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 중에서 한 가지를 구성한다. 일부 구체예에서, FkpA는 제조물의 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및/또는 99.5% 중에서 한 가지이다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 중에서 한 가지보다 적은 불순물을 포함한다. 불순물은 숙주 세포 단백질, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 숙주 세포 단백질, 핵산, 바이러스, 세포 배양 성분, 예를 들면, 세포 배양 배지 성분뿐만 아니라 FkpA 또는 FkpA의 단편 (가령, FkpA의 비기능적 단편)의 응집체를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 2%, 1.5%, 또는 1% 중에서 한 가지보다 적은 저분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 1%, 0.5%, 또는 0.1%보다 적은 고분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, 고분자량 종류는 검출할 수 없다. 일부 구체예에서, FkpA, 저분자량 종류 및/또는 고분자량 종류의 존재는 SEC에 의해 검출된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA의 초고순도 제조물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA의 제조물을 제공하는데, 여기서 FkpA는 제조물의 최소한 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 중에서 한 가지를 구성한다. 일부 구체예에서, FkpA는 제조물의 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및/또는 99.5% 중에서 한 가지이다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 중에서 한 가지보다 적은 불순물을 포함한다. 불순물은 숙주 세포 단백질, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 숙주 세포 단백질, 핵산, 바이러스, 세포 배양 성분, 예를 들면, 세포 배양 배지 성분뿐만 아니라 FkpA 또는 FkpA의 단편 (가령, FkpA의 비기능적 단편)의 응집체를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 1%, 0.5%, 또는 0.1% 중에서 한 가지보다 적은 저분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 1%, 0.5%, 또는 0.1%보다 적은 고분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA, 저분자량 종류 및/또는 고분자량 종류의 존재는 SEC에 의해 검출된다.

DNA, 예를 들면, 숙주 세포 DNA를 계측하는 방법은 당해 분야에서 공지되고 실시예 섹션에서 설명된다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. DNA의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. DNA의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 중에서 한 가지에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 DNA의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 DNA의 양과 비교함으로써 결정된다.

세포 배양 배지 성분은 세포 배양 배지 내에 존재하는 성분을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포를 수확하는 시점에서 세포 배양 배지일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지 성분은 젠타마이신이다. 젠타마이신의 양은 ELISA에 의해 계측될 수 있다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지 성분의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 98% 중에서 한 가지에서 감소된다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 세포 배양 배지 성분의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 세포 배양 배지 성분의 양과 비교함으로써 결정된다.

III. 폴리펩티드-FkpA

본 발명은 FkpA의 초고순도 제조물을 산출하는 방법을 제공한다. 용어, "FkpA" 단백질은 세균 FKBP-유형 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소를 지칭한다. FkpA는 시스/트랜스 펩티딜-프로릴 이성화효소 (PPIase) 및 샤프롱 활성 둘 모두를 전시하는 주변세포질 단백질 이황화물 이성화효소 I이다. FkpA는 펩티드가 세포의 주변세포질에 나타날 때, 폴리펩티드 접힘을 보조할 수 있다. 일부 구체예에서, FkpA는 세균으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드는 대장균 (E. coli) FkpA 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, FkpA 폴리펩티드는 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 아조아르쿠스 (Azoarcus), 살모넬라 (Salmonella), 부크네라 (Buchnera), 잔트모나스 (Xanthmonas), 캄필로박터 (Campylobacter), 시겔라 (Shigella), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예르시나 (Yersina), 에르위니아 (Erwinia) 및 나이세리아 (Neisseria)의 임의의 종으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드는 서열 번호:1 또는 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드는 서열 번호:1 또는 서열 번호:2의 아미노산 서열에 최소한 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성 중에서 한 가지를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본원에서 설명된 방법을 이용하여 정제되는 FkpA 폴리펩티드는 일반적으로, 재조합 기술을 이용하여 생산된다. 세균에서 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지된다. 재조합 기술을 이용할 때, 폴리펩티드는 세포내에서 생산되거나, 원형질막주위 공간에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 일부 구체예에서, FkpA를 인코딩하는 핵산이 상기 폴리펩티드의 과다발현을 위해 숙주 세포에 도입된다. 일정한 구체예에서, FkpA를 과다발현하도록 가공된 숙주 세포는 유전자 공학이 없는 숙주 세포에 의해 산출된 수준보다 큰 수준에서 FkpA를 발현한다. 일부 구체예에서, FkpA를 인코딩하는 핵산은 발현 벡터; 예를 들면, 플라스미드로부터 발현된다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 서열 번호:3의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FkpA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호:3의 핵산 서열에 최소한 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성 중에서 한 가지를 갖는 핵산 서열을 포함한다.

이들 폴리펩티드는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 폴리펩티드의 발현에서 이용된 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들면, 동결 해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 붕괴, 또는 세포 용해 작용제에 의해 파열될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되면, 첫 번째 단계로서, 미립자 조직파편 (숙주 세포 또는 용해된 단편)이 예로서, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)은 대장균 (E. coli)의 원형질막주위 공간으로 분비되는 폴리펩티드를 단리하기 위한 절차를 설명한다. 간단히 말하면, 세포 페이스트는 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐 플루오르화물 (PMSF)의 존재에서 약 30 분에 걸쳐 해동된다. 세포 조직파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우에, 이런 발현 시스템으로부터 상층액은 일반적으로 먼저, 상업적으로 가용한 폴리펩티드 농축 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 농축된다. 단백질분해효소 저해제, 예를 들면, PMSF가 단백질분해를 저해하기 위해 임의의 전술한 단계에 포함될 수 있고, 그리고 항생제가 우발적인 오염체의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.

IV. FkpA가 생산에 이용될 수 있는 폴리펩티드.

단백질 접힘 및 조립이 FkpA (가령, 외인성 FkpA)의 발현에 의해 보조될 수 있는 세균 (가령, 대장균 (E. coli))에서 생산될 수 있는 폴리펩티드의 실례는 면역글로불린, 면역접합체, 항체, 절반-항체, 항체 단편, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-내포 단백질, 면역접합체, 사이토킨 및 인터류킨을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리펩티드의 실례는 포유류 단백질, 예를 들면, 예로서 레닌; 호르몬; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들면, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예를 들면, 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예를 들면, 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화 시에 정상 T-세포 발현 및 분비 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들면, 인간 혈청 알부민; 뮤에레리안-저해 물질; 렐락신 A-사슬; 렐락신 B-사슬; 프로렐락신; 생쥐 성선자극호르몬-연관된 펩티드; 효소; 미생물 단백질, 예를 들면, 베타 락타마아제; DNA분해효소; IgE; 세포독성 T-림프구 연관된 항원 (CTLA), 예를 들면, CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스양 인자; 신경영양 인자, 예를 들면, 뼈-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF-b; 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예를 들면, aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들면, TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBPs); 사이토킨; CD 단백질, 예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 융합 폴리펩티드, 다시 말하면, 2개 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드 또는 이들의 단편으로 구성되고 재조합 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드; Fc-내포 폴리펩티드, 예를 들면, 두 번째 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질; 면역접합체; 뼈 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들면, 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (ILs), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10, IL13, IL17; 초과산화물 디스뮤타아제; T 세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들면, 예로서 AIDS 외피의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들면, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관된 항원, 예를 들면, CA125 (난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 면역접합체; 그리고 상기-열거된 단백질 중에서 한 가지의 단편 및/또는 변이체뿐만 아니라 예로서, 상기-열거된 단백질 중에서 한 가지를 비롯한 단백질에 결합하는 항체 및 항체 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 검정 방법 중에서 한 가지에서 이용을 위한 폴리펩티드 제조물은 관심되는 항체를 내포한다, 다시 말하면, 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드는 항체이다.

이런 항체에 대한 분자 표적은 CD 단백질 및 이들의 리간드, 예를 들면, 하지만 제한 없이: (i) CD3, CD4, CD13, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a) 및 CD79β (CD79b); (ii) ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예를 들면, EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iii) 세포 부착 분자, 예를 들면, LFA-1, Mac1, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (이의 알파 또는 베타 아단위 포함) (가령, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (iv) 성장 인자, 예를 들면, VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; 그리고 (v) 세포 표면 및 막경유 종양-연관된 항원 (TAA), 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,521,541에서 설명된 것들을 포함한다.

다른 예시적인 항체는 제한 없이, 항에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-Lewis X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노소체 항체, 항-전립선 특이 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항-Tn-항원 항체에서 선택되는 것들을 포함한다.

단일클론 항체

일부 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 단일클론 항체는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 단일클론 항체의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합하고, 이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 구별된 또는 다중클론 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 지시한다.

가령, 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 최초 설명된 하이브리도마 방법을 이용하여 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (U.S. 특허 번호 4,816,567)에 의해 만들어질 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 이용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 이끌어내기 위해 위에서 설명된 바와 같이 면역화된다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 림프구는 이후, 하이브리도마 세포를 형성하기 위해, 적합한 융합 작용제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는, 융합되지 않은, 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 또는 그 이상의 물질을 내포하는 적합한 배양 배지에서 파종되고 성장된다. 가령, 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것인데, 이들 물질은 HGPRT-결함성 세포의 성장을 예방한다.

일부 구체예에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정된 높은-수준 생산을 뒷받침하고, 그리고 배지, 예를 들면, HAT 배지에 민감한 것들이다. 이들 중에서, 일부 구체예에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 라인, 예를 들면, Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA로부터 가용한 MOPC-21 및 MPC-11 생쥐 종양, 그리고 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA로부터 가용한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것들이다. 또한, 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다 (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원을 향해 지향된 단일클론 항체의 생산에 대해 검정된다. 일부 구체예에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된다.

단일클론 항체의 결합 친화성은 예로서, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.

원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 하위클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이런 목적으로 적합한 배양 배지는 예로서, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 이에 더하여, 하이브리도마 세포는 동물 내에 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.

하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 전통적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 예로서, 폴리펩티드 A-Sepharose^®, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.

단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 전통적인 절차를 이용하여 (가령, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되거나 또는 염기서열결정된다. 일부 구체예에서, 하이브리도마 세포는 이런 DNA의 공급원으로서 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이들은 이후, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 획득하기 위해, 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 면역글로불린 폴리펩티드를 달리 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염된다. 항체를 인코딩하는 DNA의 세균에서 재조합 발현에 관한 리뷰 논문은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 Pl

ckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)을 포함한다.

추가 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에서 설명된 기술을 이용하여 산출된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)은 각각, 파지 라이브러리를 이용한 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명한다. 차후 간행물은 사슬 뒤섞음에 의한 높은 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))을 설명한다. 따라서, 이들 기술은 단일클론 항체의 단리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.

DNA는 또한, 예로서 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (U.S. 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)), 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 중에서 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결함으로써 변형될 수 있다.

전형적으로, 이런 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 또는 이들은 항체의 한쪽 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 한 항원에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 이가 항체를 창출한다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 단일클론 항체이다.

항체 단편

일부 구체예에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 도출되었다 (가령, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)을 참조한다). 하지만, 이들 단편은 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 가령, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편은 대장균 (E. coli)으로부터 직접적으로 회수되고 화학적으로 연계되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구체예에서, 선택되는 항체는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; US 특허 번호 5,571,894; 및 US 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한, 예로서 US 특허 5,641,870에서 설명된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이런 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체의 단편이 제공된다. 일부 구체예에서, 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv 및 디아바디로 구성된 군에서 선택된다.

폴리펩티드 변이체 및 변형

일정한 구체예에서, 본원에서 단백질의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 가령, 단백질의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 단백질의 아미노산 서열 변이체는 상기 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 예로서, 단백질의 아미노산 서열 내에 잔기로부터 결실 및/또는 잔기 내로 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특징을 소유한다면, 최종 구조체에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.

변이체 폴리펩티드

"폴리펩티드 변이체"는 폴리펩티드의 전장 선천적 서열, 신호 펩티드를 결여하는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 또는 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인과 최소한 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에서 규정된 바와 같은 폴리펩티드, 예를 들면, 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이런 폴리펩티드 변이체는 예로서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 전장 선천적 아미노산 서열의 N 또는 C 말단에서 부가되거나 또는 결실되는 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 폴리펩티드 변이체는 전장 선천적 서열 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드를 결여하는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 또는 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인에 최소한 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안으로 최소한 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성 중에서 한 가지를 가질 것이다. 임의선택적으로, 변이체 폴리펩티드는 선천적 폴리펩티드 서열과 비교하여 단지 하나의 보존성 아미노산 치환, 대안으로 선천적 폴리펩티드 서열과 비교하여 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 중에서 한 가지 이내의 보존성 아미노산 치환을 가질 것이다.

변이체 폴리펩티드는 N 말단 또는 C 말단에서 절두될 수 있거나, 또는 예로서, 전장 선천적 폴리펩티드와 비교할 때 내부 잔기를 결여할 수 있다. 일정한 변이체 폴리펩티드는 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기를 결여할 수 있다. 절두, 결실 및 삽입을 갖는 이들 변이체 폴리펩티드는 다수의 전통적인 기술 중에서 한 가지에 의해 제조될 수 있다. 원하는 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 다른 적합한 기술은 원하는 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 단편을 단리하고 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭하는 것을 수반한다. 핵산 단편의 원하는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오티드가 PCR 동안 5' 및 3' 프라이머에서 이용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 본원에서 개시된 선천적 폴리펩티드와 최소한 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 또는 그 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노- 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C 말단에 융합을 포함한다.

가령, 폴리펩티드의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이런 변형은 예로서, 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에 잔기로부터 결실 및/또는 잔기 내로 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특징을 소유한다면, 최종 구조체에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어진다. 아미노산 변화는 또한, 폴리펩티드 (가령, 항체)의 번역후 과정을 변경할 수 있다, 예를 들면, 글리코실화 부위의 숫자 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

어떤 아미노산 잔기가 원하는 활성에 부정적으로 영향을 주지 않으면서 삽입되거나, 치환되거나 또는 결실될 수 있는 지를 결정하는데 있어서 보도는 폴리펩티드의 서열을 상동한 공지된 폴리펩티드 분자의 서열과 비교하고, 그리고 높은 상동성의 영역에서 만들어진 아미노산 서열 변화의 숫자를 최소화함으로써 발견될 수 있다.

돌연변이유발을 위한 선호되는 위치인 폴리펩티드 (가령, 항체)의 일정한 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기에서, 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 주기 위해, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 확인되고 (가령, 하전된 잔기, 예를 들면, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu), 그리고 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 이후, 치환의 부위에서 또는 치환의 부위에 대해 추가 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정밀화된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되는 반면, 돌연변이 그 자체의 성격은 미리 결정될 필요가 없다. 가령, 소정의 부위에서 돌연변이의 성과를 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 그리고 발현된 항체 변이체가 원하는 활성에 대해 선별검사된다.

변이체의 다른 유형은 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자 내에 최소한 하나의 아미노산 잔기가 상이한 잔기에 의해 대체된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경 역시 예기된다. 이런 치환이 생물학적 활성에서 변화를 유발하면, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 표시되거나, 또는 아미노산 부류에 관하여 아래에 더욱 설명된 바와 같은 더욱 실제적인 변화가 도입되고, 그리고 산물이 선별검사될 수 있다.

표 1.

본래 잔기	예시적인 치환	보존성 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

폴리펩티드의 생물학적 성질에서 실제적인 변형은 (a) 예로서, 시트 또는 나선형 입체형태로서 치환의 구역에서 폴리펩티드 중추의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 효과에서 유의미하게 상이한 치환을 선별함으로써 달성된다. 아미노산은 그들의 측쇄의 성질에서 유사성에 따라 군화될 수 있다 (A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)에서):

(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 하전되지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)

대안으로, 자연발생 잔기는 공통 측쇄 성질에 근거하여 군으로 나눠질 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향정위에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.

항체의 적절한 입체형태를 유지하는데 관련되지 않는 임의의 시스테인 잔기 역시, 분자의 산화 안정성을 향상시키고 일탈적 교차연결을 예방하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 폴리펩티드의 안정성 (특히, 항체가 항체 단편, 예를 들면, Fv 단편인 경우에)을 향상시키기 위해 폴리펩티드에 부가될 수 있다.

치환 변이체의 한 가지 실례는 부모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다 (가령, 인간화 항체). 일반적으로, 추가 개발을 위해 선별된 결과의 변이체(들)는 이들이 산출되는 부모 항체에 비하여 향상된 생물학적 성질을 가질 것이다. 이런 치환 변이체를 산출하기 위한 편의한 방식은 파지 전시를 이용한 친화성 성숙을 수반한다. 간단히 말하면, 여러 초가변 영역 부위 (가령, 6-7개 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 산출하도록 돌연변이된다. 이렇게 산출된 항체 변이체는 각 입자 내에 포장된 M13의 유전자 III 산물에 융합으로서 실모양 파지 입자로부터 일가 방식으로 전시된다. 파지 전시 변이체는 이후, 본원에서 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (가령, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의미하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하기 위한 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 수행될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항원 항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체 및 표적 사이에 접촉 포인트를 확인하는 것이 유익할 수 있다. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 본원에서 상술된 기술에 따른 치환의 후보이다. 일단 이런 변이체가 산출되면, 변이체의 패널은 본원에서 설명된 바와 같은 선별검사에 종속되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 유관한 검정에서 우수한 성질을 갖는 항체는 추가 개발을 위해 선별될 수 있다.

폴리펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변경한다. 폴리펩티드는 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 가령, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 이런 글리코실화는 숙주 세포 또는 숙주 생명체 내에서 폴리펩티드의 발현 동안 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 인간 개입으로부터 발생하는 의도적인 변형일 수 있다. 변경한다는 것은 폴리펩티드에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고 및/또는 폴리펩티드에서 존재하지 않는 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 부가한다는 것으로 의미된다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로, N-연결되거나 또는 O-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 삼중펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이들 삼중펩티드 서열 중에서 어느 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 창출한다. O-연결된 글리코실화는 비록 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록실리신이 또한 이용될 수 있긴 하지만, 히드록시아미노산, 가장 흔히 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로오스 중에서 한 가지의 부착을 지칭한다.

폴리펩티드에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 상기-설명된 삼중펩티드 서열 중에서 하나 또는 그 이상을 내포하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한, 본래 항체의 서열에 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 치환에 의해 만들어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화를 위한 표적으로서 역할을 하는 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 개열은 다양한 엔도-와 엑소-글리코시다아제의 이용에 의해 달성될 수 있다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 γ-아미노 기의 메틸화, N 말단 아민의 아세틸화, 그리고 임의의 C 말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.

키메라 폴리펩티드

본원에서 설명된 폴리펩티드는 다른, 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 키메라 분자는 항-태그 항체가 선별적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로, 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실 말단에서 배치된다. 폴리펩티드의 이런 에피토프-태깅된 형태의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 폴리펩티드가 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 유형의 친화성 매트릭스를 이용한 친화성 정제에 의해 쉽게 정제될 수 있게 한다.

다중특이적 항체

일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 일정한 구체예에서, 다중특이적 항체는 최소한 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일정한 구체예에서, 결합 특이성 중에서 한 가지는 한 항원에 대한 것이고, 그리고 다른 결합 특이성은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일정한 구체예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한, 세포독성 작용제를 특정 항원을 발현하는 세포에 국부화하는데 이용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이고, 여기서 한쪽 팔은 IL13에 결합하고 한쪽 팔은 IL17에 결합한다.

다중특이적 항체를 만들기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)를 참조한다), 그리고 "노브-인투-홀 (knob-into-hole)" 가공 (가령, U.S. 특허 번호 5,731,168을 참조한다), 그리고 이에 더하여, 이중특이적 항체의 한쪽 절반의 항원 결합 단편 (Fab) 내에서 하나 또는 그 이상의 중쇄 및 경쇄 도메인을 교환하는 것 (CrossMab, WO2009/080251, WO2009/080252, WO2009/080253 및 WO2009/080254를 참조한다)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이형이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 가공하고 (WO 2009/089004A1); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편을 교차연결하고 (가령, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)을 참조한다); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용하고 (가령, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)을 참조한다); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용하고 (가령, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조한다); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이합체를 이용하고 (가령, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조한다); 그리고 예로서, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다. 아래에 논의된 바와 같이, 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 세포 (가령, FkpA를 발현하는 대장균 (E. coli) 세포)에서 절반 항체를 산출하고, 절반 항체를 단리하고, 그리고 절반 항체를 이중특이적 항체로 조립함으로써 제조된다.

"문어 항체"를 비롯하여, 3개 또는 그 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 역시 본원에서 포함된다 (가령, US 2006/0025576A1을 참조한다).

본원에서 항체 또는 단편은 또한, 한쪽 항원뿐만 아니라 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (가령, US 2008/0069820을 참조한다).

이중특이적 항체를 만들기 위한 방법은 당해 분야에서 공지된다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 근거되는데, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 조합 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하는데, 이들 중에서 단지 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 행위되는 정확한 분자의 정제는 상당히 번거롭고, 그리고 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일자 공개된 WO 93/08829에서, 그리고 Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)에서 개시된다.

상이한 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 최소한 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 이들 융합 중에서 최소한 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 내포하는 첫 번째 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및 원하는 경우에, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 그리고 적합한 숙주 생명체 내로 동시형질감염된다. 이것은 작제에서 이용된 3개 폴리펩티드 사슬의 부동 비율이 최적 수율을 제공하는 구체예에서 이들 3개 폴리펩티드 단편의 상호간의 비율을 조정하는데 상당한 유연성을 제공한다. 하지만, 동등한 비율에서 최소한 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율을 유발하거나 또는 이들 비율이 특별한 의미가 없을 때, 2개 폴리펩티드 사슬 또는 3개 폴리펩티드 사슬 전부에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.

이러한 접근법의 한 구체예에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔에서 첫 번째 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 그리고 다른 팔에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (두 번째 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 이중특이적 분자의 단지 한쪽 절반에서만 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 손쉬운 방식을 제공하기 때문이다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에서 개시된다. 이중특이적 항체를 산출하는 것에 관한 추가 상세를 위해, 예로서 Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)을 참조한다.

다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이에 인터페이스는 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이형이합체의 백분율을 최대화하도록 가공될 수 있다. 바람직한 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 최소한 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 첫 번째 항체 분자의 인터페이스로부터 하나 또는 그 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더욱 큰 측쇄 (가령, 티로신 또는 트립토판) (노브 또는 융기)로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 "공동" (홀)은 큰 아미노산 측쇄를 더욱 작은 아미노산 측쇄 (가령, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 두 번째 항체 분자의 인터페이스에서 창출된다. 이것은 다른 원치 않는 최종 산물, 예를 들면, 동종이합체에 비하여 이형이합체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다. 노브 및 홀은 본원에서 더욱 설명된다.

노브 인 홀

다중특이적 항체 및/또는 외팔 항체 및/또는 면역접합체를 생산하는 방법으로서 노브 인투 홀의 이용은 당해 분야에서 널리 공지된다. 1998년 3월 24일자 허여된 US 특허 번호 5,731,168을 참조한다 (Genentech에 배정됨). 다중특이적 항체를 산출하는 방법을 설명하는 다른 참고문헌은 2009년 7월 16일자 공개된 PCT 공개 번호 WO2009089004 (Amgen에 배정됨), 그리고 2009년 7월 16일자 공개된 US 특허 공개 번호 20090182127 (Novo Nordisk A/S에 배정됨)을 포함한다. 또한, Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658 및 Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1-9를 참조한다. 짧은 논의가 여기에서 제공된다.

"융기"는 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스로부터 돌출하고, 그리고 이런 이유로, 이형다합체를 안정시키고, 그리고 따라서 예로서, 동종다합체 형성에 비하여 이형다합체 형성을 유리하게 하는, 인접한 인터페이스 (다시 말하면, 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스) 내에 보상성 공동에서 위치가능한 최소한 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 융기는 본래 인터페이스에서 존재할 수 있거나 또는 합성적으로 도입될 수 있다 (가령, 상기 인터페이스를 인코딩하는 핵산을 변경함으로써). 정상적으로, 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스를 인코딩하는 핵산은 융기를 인코딩하도록 변경된다. 이것을 달성하기 위해, 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스에서 최소한 하나의 "본래" 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산은 본래 아미노산 잔기보다 큰 측쇄 용적을 갖는 최소한 하나의 "외래" 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산으로 대체된다. 하나 이상의 본래 잔기 및 상응하는 외래 잔기가 있을 수 있는 것으로 인지될 것이다. 대체되는 본래 잔기의 숫자에 대한 상한선은 첫 번째 폴리펩티드의 인터페이스 내에 잔기의 총수이다. 다양한 아미노 잔기의 측쇄 용적이 다음의 표에서 도시된다.

표 2. 아미노산의 성질

아미노산	1 문자 약어	질량^a (달톤)	용적^b (옹스트롬³)	접근가능한 표면 구역^c (옹스트롬²)
알라닌 (Ala)	A	71.08	88.6	115
아르기닌 (Arg)	R	156.20	173.4	225
아스파라긴 (Asn)	N	114.11	117.7	160
아스파르트산 (Asp)	D	115.09	111.1	150
시스테인 (Cys)	C	103.14	108.5	135
글루타민 (Gln)	Q	128.14	143.9	180
글루타민산 (Glu)	E	129.12	138.4	190
글리신 (Gly)	G	57.06	60.1	75
히스티딘 (His)	H	137.15	153.2	195
이소류신 (Ile)	I	113.17	166.7	175
류신 (Leu)	L	113.17	166.7	170
리신 (Lys)	K	128.18	168.6	200
메티오닌 (Met)	M	131.21	162.9	185
페닐알라닌 (Phe)	F	147.18	189.9	210
프롤린 (Pro)	P	97.12	122.7	145
세린 (Ser)	S	87.08	89.0	115
트레오닌 (Thr)	T	101.11	116.1	140
트립토판 (Trp)	W	186.21	227.8	255
티로신 (Tyr)	Y	163.18	193.6	230
발린 (Val)	V	99.14	140.0	155

^a물의 분자량을 제외한 분자량 아미노산. Handbook of Chemistry and Physics, 43rd ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961로부터 값.

^bA.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972로부터 값.

^cC. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975로부터 값. 접근가능한 표면 구역은 상기 참고문헌의 도면 6-20에서 규정된다.

융기의 형성을 위한 바람직한 외래 잔기는 일반적으로, 자연발생 아미노산 잔기이고, 그리고 바람직하게는, 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)에서 선택된다. 가장 바람직하게는 트립토판 및 티로신이다. 한 구체예에서, 융기의 형성을 위한 본래 잔기, 예를 들면, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린은 작은 측쇄 용적을 갖는다. 융기를 형성하기 위한 CH3 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 제한 없이, T366W 치환을 포함한다.

"공동"은 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스로부터 함몰되고, 그리고 이런 이유로, 첫 번째 폴리펩티드의 인접한 인터페이스 상에서 상응하는 융기를 수용하는 최소한 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 공동은 본래 인터페이스에서 존재할 수 있거나 또는 합성적으로 도입될 수 있다 (가령, 상기 인터페이스를 인코딩하는 핵산을 변경함으로써). 정상적으로, 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스를 인코딩하는 핵산은 공동을 인코딩하도록 변경된다. 이것을 달성하기 위해, 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스에서 최소한 하나의 "본래" 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산은 본래 아미노산 잔기보다 작은 측쇄 용적을 갖는 최소한 하나의 "외래" 아미노산 잔기를 인코딩하는 DNA로 대체된다. 하나 이상의 본래 잔기 및 상응하는 외래 잔기가 있을 수 있는 것으로 인지될 것이다. 대체되는 본래 잔기의 숫자에 대한 상한선은 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스에서 잔기의 총수이다. 다양한 아미노 잔기의 측쇄 용적은 상기 표 2에서 도시된다. 공동의 형성을 위한 바람직한 외래 잔기는 통상적으로 자연발생 아미노산 잔기이고, 그리고 바람직하게는, 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 및 발린 (V)에서 선택된다. 가장 바람직하게는 세린, 알라닌 또는 트레오닌이다. 한 구체예에서, 공동의 형성을 위한 본래 잔기, 예를 들면, 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판은 큰 측쇄 용적을 갖는다. 공동을 산출하기 위한 CH3 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 제한 없이, T366S, L368A 및 Y407A 치환을 포함한다.

"본래" 아미노산 잔기는 본래 잔기보다 더욱 작은 또는 더욱 큰 측쇄 용적을 가질 수 있는 "외래" 잔기에 의해 대체되는 것이다. 외래 아미노산 잔기는 자연발생 또는 비자연발생 아미노산 잔기일 수 있지만, 바람직하게는 전자이다. "자연발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩되고 상기 표 2에서 열거된 잔기이다. "비자연발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩되지 않지만, 폴리펩티드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는 잔기인 것으로 의미된다. 비자연발생 아미노산 잔기의 실례는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예를 들면, 예로서 Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)에서 설명된 것들이다. 이런 비자연발생 아미노산 잔기를 산출하기 위해, Noren et al. Science 244: 182 (1989) 및 Ellman et al., 위와 같음의 절차가 이용될 수 있다. 간단히 말하면, 이것은 억제인자 tRNA를 비자연발생 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화, 그 이후에 상기 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다. 본 발명의 방법은 최소한 하나의 본래 아미노산 잔기를 대체하는 것을 수반하지만, 하나 이상의 본래 잔기가 대체될 수 있다. 정상적으로, 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스에서 전체 이내의 잔기가 대체되는 본래 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 전형적으로, 대체를 위한 본래 잔기는 "매몰"된다. "매몰된"은 잔기가 본질적으로 용매에 접근불가능하다는 것으로 의미된다. 일반적으로, 외래 잔기는 가능한 산화 또는 이황화 결합의 오대합을 예방하기 위해 시스테인이 아니다.

융기는 공동에서 "위치가능"한데, 이것은 첫 번째 폴리펩티드와 두 번째 폴리펩티드 각각의 인터페이스 상에서 융기와 공동의 공간적 위치 및 융기와 공동의 크기는 융기가 인터페이스에서 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드의 정상적인 연관을 유의미하게 섭동하지 않으면서 공동에서 위치될 수 있도록 하는 정도라는 것을 의미한다. 융기, 예를 들면, Tyr, Phe 및 Trp가 전형적으로 인터페이스의 축으로부터 직각으로 연장되지 않고 바람직한 입체형태를 갖지 않기 때문에, 융기의 상응하는 공동과의 정렬은 예로서, X선 결정학 또는 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 획득된 3차원 구조에 근거하여 융기/공동 쌍을 모형화하는 것에 의존한다. 이것은 당해 분야에서 폭넓게 인정되는 기술을 이용하여 달성될 수 있다.

"본래 또는 주형 핵산"은 융기 또는 공동을 인코딩하도록 "변경"될 수 있는 (다시 말하면, 유전적으로 가공되거나 또는 돌연변이될 수 있는), 관심되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산인 것으로 의미된다. 본래 또는 시작 핵산은 자연발생 핵산일 수 있거나, 또는 이전 변경에 종속되었던 핵산 (가령, 인간화 항체 단편)을 포함할 수 있다. 핵산을 "변경"한다는 것은 본래 핵산이 관심되는 아미노산 잔기를 인코딩하는 최소한 하나의 코돈을 삽입하거나, 결실시키거나 또는 대체함으로써 돌연변이된다는 것으로 의미된다. 정상적으로, 본래 잔기를 인코딩하는 코돈은 외래 잔기를 인코딩하는 코돈에 의해 대체된다. DNA를 이러한 방식으로 유전적으로 변형하기 위한 기술은 Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)에서 리뷰되었고, 그리고 예로서, 특정 부위 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이유발을 포함한다. 본래/주형 핵산을 돌연변이시킴으로써, 본래/주형 핵산에 의해 인코딩되는 본래/주형 폴리펩티드가 따라서 상응하게 변경된다.

융기 또는 공동은 합성 수단에 의해, 예를 들면, 재조합 기술, 시험관내 펩티드 합성, 앞서 설명된 비자연발생 아미노산 잔기를 도입하기 위한 기술에 의해, 펩티드의 효소적 또는 화학적 연계에 의해 또는 이들 기술의 일부 조합에 의해 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드의 인터페이스 내로 도입될 수 있다. 따라서, "도입"되는 융기 또는 공동은 "비자연발생" 또는 "비선천적"인데, 이것은 융기 또는 공동이 자연에서 또는 본래 폴리펩티드 (가령, 인간화 단일클론 항체)에서 존재하지 않는다는 것을 의미한다.

일반적으로, 융기를 형성하기 위한 외래 아미노산 잔기는 상대적으로 적은 숫자의 "회전이성질체" (가령, 약 3-6개)를 갖는다. "회전이성질체"는 아미노산 측쇄의 활동적으로 우호적인 입체형태이다. 다양한 아미노산 잔기의 회전이성질체의 숫자는 Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)에서 리뷰된다.

한 구체예에서, 첫 번째 Fc 폴리펩티드 및 두 번째 Fc 폴리펩티드는 인터페이스에서 만나고/상호작용한다. 첫 번째와 두 번째 Fc 폴리펩티드가 인터페이스에서 만나는 일부 구체예에서, 두 번째 Fc 폴리펩티드 (서열)의 인터페이스는 첫 번째 Fc 폴리펩티드 (서열)의 인터페이스 내에 공동 (또한 "홀"로 명명됨)에서 위치가능한 융기 (또한 "노브"로 명명됨)를 포함한다. 한 구체예에서, 첫 번째 Fc 폴리펩티드가 공동을 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되거나, 또는 두 번째 Fc 폴리펩티드가 융기를 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되거나, 또는 둘 모두이었다. 한 구체예에서, 첫 번째 Fc 폴리펩티드가 공동을 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되었고, 그리고 두 번째 Fc 폴리펩티드가 융기를 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되었다. 한 구체예에서, 두 번째 Fc 폴리펩티드의 인터페이스는 첫 번째 Fc 폴리펩티드의 인터페이스 내에 공동에서 위치가능한 융기를 포함하고, 여기서 공동 또는 융기, 또는 둘 모두 각각, 첫 번째와 두 번째 Fc 폴리펩티드의 인터페이스 내로 도입되었다. 첫 번째와 두 번째 Fc 폴리펩티드가 인터페이스에서 만나는 일부 구체예에서, 첫 번째 Fc 폴리펩티드 (서열)의 인터페이스는 두 번째 Fc 폴리펩티드 (서열)의 인터페이스 내에 공동에서 위치가능한 융기를 포함한다. 한 구체예에서, 두 번째 Fc 폴리펩티드가 공동을 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되거나, 또는 첫 번째 Fc 폴리펩티드가 융기를 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되거나, 또는 둘 모두이었다. 한 구체예에서, 두 번째 Fc 폴리펩티드가 공동을 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되었고, 그리고 첫 번째 Fc 폴리펩티드가 융기를 인코딩하도록 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되었다. 한 구체예에서, 첫 번째 Fc 폴리펩티드의 인터페이스는 두 번째 Fc 폴리펩티드의 인터페이스 내에 공동에서 위치가능한 융기를 포함하는데, 여기서 융기 또는 공동, 또는 둘 모두 각각, 첫 번째와 두 번째 Fc 폴리펩티드의 인터페이스 내로 도입되었다.

한 구체예에서, 융기 및 공동은 각각, 자연발생 아미노산 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 융기를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 주형/본래 폴리펩티드의 인터페이스로부터 본래 잔기를 본래 잔기보다 큰 측쇄 용적을 갖는 외래 잔기로 대체함으로써 산출된다. 한 구체예에서, 융기를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 인터페이스로부터 본래 잔기를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본래 잔기보다 큰 측쇄 용적을 갖는 외래 잔기를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 대체되는 단계를 포함하는 방법에 의해 산출된다. 한 구체예에서, 본래 잔기는 트레오닌이다. 한 구체예에서, 본래 잔기는 T366이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 아르기닌 (R)이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 페닐알라닌 (F)이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 티로신 (Y)이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 트립토판 (W)이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 R, F, Y 또는 W이다. 한 구체예에서, 융기는 주형/본래 폴리펩티드에서 2개 또는 그 이상의 잔기를 대체함으로써 산출된다. 한 구체예에서, 융기를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, MD)에서 pp. 688-696)의 EU 넘버링 기법에 따른 아미노산 넘버링으로, 위치 366에서 트레오닌의 트립토판으로의 대체를 포함한다.

일부 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 주형/본래 폴리펩티드의 인터페이스에서 본래 잔기를 본래 잔기보다 작은 측쇄 용적을 갖는 외래 잔기로 대체함으로써 산출된다. 가령, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 인터페이스로부터 본래 잔기를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본래 잔기보다 작은 측쇄 용적을 갖는 외래 잔기를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 대체되는 단계를 포함하는 방법에 의해 산출될 수 있다. 한 구체예에서, 본래 잔기는 트레오닌이다. 한 구체예에서, 본래 잔기는 류신이다. 한 구체예에서, 본래 잔기는 티로신이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 시스테인 (C)이 아니다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 알라닌 (A)이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 세린 (S)이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 트레오닌 (T)이다. 한 구체예에서, 외래 잔기는 발린 (V)이다. 공동은 주형/본래 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 본래 잔기를 대체함으로써 산출될 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 트레오닌, 류신 및 티로신으로 구성된 군에서 선택되는 2개 또는 그 이상의 본래 아미노산의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택되는 2개 또는 그 이상의 외래 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 트레오닌, 류신 및 티로신으로 구성된 군에서 선택되는 2개 또는 그 이상의 본래 아미노산의 대체를 포함하고, 그리고 여기서 상기 본래 아미노산은 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택되는 외래 잔기로 대체된다. 일부 구체예에서, 대체되는 본래 아미노산은 T366, L368 및/또는 Y407이다. 한 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 Kabat et al. 위와 같음의 EU 넘버링 기법에 따른 아미노산 넘버링으로, 위치 366에서 트레오닌의 세린으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 Kabat et al. 위와 같음의 EU 넘버링 기법에 따른 아미노산 넘버링으로, 위치 368에서 류신의 알라닌으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 Kabat et al. 위와 같음의 EU 넘버링 기법에 따른 아미노산 넘버링으로, 위치 407에서 티로신의 발린으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 Kabat et al. 위와 같음의 EU 넘버링 기법에 따른 아미노산 넘버링으로, T366S, L368A 및 Y407V로 구성된 군에서 선택되는 2개 또는 그 이상의 아미노산 대체를 포함한다. 이들 항체 단편의 일부 구체예에서, 융기를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 Kabat et al. 위와 같음의 EU 넘버링 기법에 따른 아미노산 넘버링으로, 위치 366에서 트레오닌의 트립토판으로의 대체를 포함한다.

한 구체예에서, 항체는 WO2005/063816에서 설명된 바와 같이, "노브" 및 "홀"을 구성하는 Fc 돌연변이를 포함한다. 가령, 홀 돌연변이는 Fc 폴리펩티드에서 T366S, L368A 및/또는 Y407V 중에서 하나 또는 그 이상일 수 있고, 그리고 노브 돌연변이는 T366W일 수 있다.

본 발명의 한 양상에서, 다중특이적 항체는 정제되는데, 여기서 이들 항체는 첫 번째 절반 항체 및 두 번째 절반 항체를 포함하고, 여기서 첫 번째 절반-항체는 IL-17에 결합하는 첫 번째 VH/VL 단위를 포함하고 두 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하는 두 번째 VH/VL 단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하지 않고, 그리고 여기서 두 번째 절반 항체는 IL-17에 결합하지 않는다.

IL-17 패밀리에는 6개 구성원, IL-17A, B, C, D, E 및 F가 있다. IL-17 패밀리의 구성원은 동종이합체를 형성하고, 그리고 IL-17A 및 IL-17F는 이형이합체를 더욱 형성한다. 가령, Gaffen, S. L., 2009, Nature Review 9:556-567; Hymowitz et al., 2001, EMBO J. 20:5332-41 및 WO2005/010044를 참조한다. IL-17은 때때로, 당해 분야에서 IL-17 패밀리 구성원의 기본형, IL-17A를 지칭하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 다중특이적 항체는 IL-13 및 IL-17AA에 결합하고 이들의 활성을 저해한다.

일정한 특정한 구체예에서, 본원에서 제공된 다중특이적 항체는 IL-17AA, IL-17AF 및 IL-17FF에 결합하고, IL-17AA-, IL-17AF- 및 IL-17FF-유도된 활성을 저해하고, 그리고 IL-13-유도된 활성을 저해한다. 일정한 구체예에서, 항-IL-13/IL-17 이중특이적 항체는 항-IL-13/IL-17AA, FF 및 AF 항체를 지칭한다. 일정한 이런 구체예에서, 항-IL-13/IL-17AA, AF 및 FF 이중특이적 항체는 IL-17A 또는 IL-17F 단독에 의해 유도된 활성과는 대조적으로, IL-17A 및 F 사이토킨 모두에 의해 유도된 활성을 유리하게 차단한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 다중특이적 항체는 IL-17AA, IL-17AF 및 IL-17FF에 결합한다. 일부 구체예에서, IL-17AA-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-17AA-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 구체예에서, IL-17AF-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-17AF-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 이런 구체예에서, IL-17FF-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-17FF-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 구체예에서, IL-13-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-13-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 다중특이적 항체는 IL-13Rα1에 대한 IL-13의 결합을 저해하지 않는다.

일부 구체예에서, 항-IL13/IL17AA AF FF 이중특이적 항체는 첫 번째 절반 항체 및 두 번째 절반 항체를 포함하고, 여기서 첫 번째 절반-항체는 IL-17AA, AF 및 FF에 결합하는 첫 번째 VH/VL 단위를 포함하고 두 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하는 두 번째 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 첫 번째 VH/VL 단위는 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하고, 그리고 여기서 두 번째 VH/VL 단위는 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하지 않고, 그리고 두 번째 절반 항체는 IL-17에 결합하지 않는다.

일부 구체예에서, 첫 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:18의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함하고, 그리고 여기서 두 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:7의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체가 제공되는데, 여기서 첫 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:18의 아미노산 서열을 갖는 VH 서열 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 VL 서열을 포함하고, 그리고 여기서 두 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 갖는 VH 서열 및 서열 번호:8의 아미노산 서열을 갖는 VL 서열을 포함한다.

일정한 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL17AA AF 및 FF에 결합하고, 그리고 두 번째 절반 항체는 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL13에 결합한다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL17AA AF 및 FF에 결합하고, 그리고 두 번째 절반 항체는 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL13에 결합한다. 항-IL13/항-IL17 항체에 관련된 서열은 표 3에서 제시된다. PCT/US2015/01716 (WO2015/127405)을 참조하는데, 이것은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

표 3

V. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

FkpA를 이용한 이종성 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)의 재조합 생산을 위해, 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)를 인코딩하는 핵산은 단리되고 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)를 인코딩하는 DNA는 전통적인 절차를 이용하여 (가령, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 염기서열결정된다. 많은 벡터가 가용하다. 벡터의 선택은 이용되는 숙주 세포에 부분적으로 의존한다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵 기원이다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 비롯하여, 임의의 아이소타입의 불변 영역이 이러한 목적에 이용될 수 있고, 그리고 이런 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종류로부터 획득될 수 있는 것으로 인지될 것이다.

A. 원핵 숙주 세포를 이용하여 항체 산출

i. 벡터 작제

본 발명의 다중특이적 항체의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생산 세포, 예를 들면, 하이브리도마 세포로부터 단리되고 염기서열결정될 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성장치 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 획득되면, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 당해 분야에서 가용하고 공지된 많은 벡터가 본 발명의 목적에 이용될 수 있다. 적절한 벡터의 선별은 벡터 내로 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 각 벡터는 기능 (이종성 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 이것이 체류하는 특정 숙주 세포와의 양립성에 따라 다양한 성분을 내포한다. 벡터 성분은 일반적으로, 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 복제 기점, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열.

일반적으로, 숙주 세포와 양립성인 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 이용된다. 벡터는 통상적으로, 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 표지 서열을 보유한다. 가령, 대장균 (E. coli)은 전형적으로, 대장균 (E. coli) 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 인코딩하는 유전자를 내포하고, 그리고 따라서, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 쉬운 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한, 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 생물체에 의해 이용될 수 있는 프로모터를 내포하거나, 또는 내포하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현에 이용되는 pBR322 유도체의 실례는 Carter et al., U.S. 특허 번호 5,648,237에서 상세하게 설명된다.

이에 더하여, 숙주 미생물과 양립하는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 파지 벡터는 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 이용될 수 있다. 가령, 박테리오파지, 예를 들면, GEM™-11은 감수성 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) LE392를 변환하는데 이용될 수 있는 재조합 벡터를 만드는데 활용될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 2개 또는 그 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조정하는 시스트론의 상류 (5')에 위치된 번역되지 않는 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로, 2가지 부류, 유도성 및 구조성에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들면, 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도에서 변화에 대한 응답으로 자신의 제어 하에 증가된 수준의 시스트론의 전사를 개시하는 프로모터이다.

다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 알려져 있다. 선별된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 선천적 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터 둘 모두 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 주동하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이종성 프로모터가 활용되는데, 그 이유는 이들이 일반적으로, 선천적 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여, 발현된 표적 유전자의 더욱 큰 전사 및 더욱 높은 수율을 허용하기 때문이다.

원핵 숙주에서 이용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, -락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들면, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 하지만, 세균에서 기능적인 다른 프로모터 (가령, 다른 공지된 세균 또는 파지 프로모터) 역시 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되었고, 따라서 당업자가 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위해 링커 또는 어댑터를 이용하여, 표적 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 시스트론에 이들을 작동가능하게 결찰하는 것을 실시가능하게 한다 (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269).

번역 개시 영역 (TIR)은 단백질의 전반적인 번역 수준의 주요 결정인자이다. TIR은 신호 서열을 인코딩하고, 그리고 Shine-Delgarno 서열의 즉시 상류로부터 개시 코돈의 하류에 거의 20개 뉴클레오티드까지 연장되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로, 벡터는 당해 분야에서 공지된 TIR, 복수 TIR 및 변이체 TIR을 포함할 것이고, 그리고 TIR을 산출하기 위한 방법은 당해 분야에서 알려져 있다. 일련의 핵산 서열 변이체는 다양한 번역 강도로 창출되고, 따라서 많은 상이한 폴리펩티드의 최적 분비를 위해 이러한 인자를 조정하는 편의한 수단을 제공할 수 있다. 이들 변이체에 융합된 리포터 유전자, 예를 들면, PhoA의 이용은 상이한 번역 개시 영역의 상대적 번역 강도를 정량하는 방법을 제공한다. 변이체 또는 돌연변이체 TIR은 성숙 폴리펩티드의 최대 발현을 위한 번역 강도의 최적 범위를 확립하기 위해, 플라스미드 벡터의 배경에서 제공되고, 따라서 관심되는 유전자가 삽입되고 이의 발현이 계측될 수 있는 한 세트의 플라스미드를 제공할 수 있다. 변이체 TIR은 USP 8,241,901에서 개시된다.

본 발명의 한 양상에서, 재조합 벡터 내에 각 시스트론은 막을 교차하여, 발현된 폴리펩티드의 전위를 주동하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 이것은 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부분일 수 있다. 본 발명을 위해 선별된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (다시 말하면, 신호 펩티드분해효소에 의해 개열되는) 것이어야 한다. 이종성 폴리펩티드에 선천적인 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열은 예로서, 본 발명의 신호 폴리펩티드에서 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 이에 더하여, 벡터는 알칼리 인산분해효소, 페니실린분해효소, Lpp, 또는 열저항 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 구성된 군에서 선택되는 신호 서열을 포함할 수 있다.

한 양상에서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 (가령, 발현 벡터)는 항체를 집합적으로 인코딩한다. 한 구체예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 항체의 경쇄를 인코딩하고, 그리고 별개의 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 인코딩한다. 한 구체예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 (가령, 발현 벡터)는 외팔 항체를 집합적으로 인코딩한다. 한 구체예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 (a) 외팔 항체의 경쇄와 중쇄, 그리고 (b) Fc 폴리펩티드를 인코딩한다. 한 구체예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 외팔 항체의 경쇄와 중쇄를 인코딩하고, 그리고 별개의 폴리뉴클레오티드는 Fc 폴리펩티드를 인코딩한다. 한 구체예에서, 별개의 폴리뉴클레오티드는 외팔 항체의 경쇄 성분, 외팔 항체의 중쇄 성분 및 Fc 폴리펩티드를 각각 인코딩한다. 외팔 항체의 생산은 예로서, WO2005063816에서 설명된다.

본 발명의 항체를 발현하는데 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 (Archaebacteria) 및 진정세균 (Eubacteria), 예를 들면, 그람 음성 또는 그람 양성 생물체를 포함한다. 유용한 세균의 실례는 에셰리키아 (Escherichia) (가령, 대장균 (E. coli)), 바실루스 (가령, 바실루스 서브틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (가령, 녹농균 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오스실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코쿠스 (Paracoccus)를 포함한다. 한 구체예에서, 그람 음성 세포가 이용된다. 한 구체예에서, 대장균 (E. coli) 세포가 본 발명을 위한 숙주로서 이용된다. 대장균 (E. coli) 균주의 실례는 균주 W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 기탁 번호 27,325), 그리고 유전자형 W3110 △fhuA (△tonA) ptr3 lac Iq lacL8 △ompT△ (nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3 (U.S. 특허 번호 5,639,635) 및 균주 63C1과 64B4를 비롯한 이의 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, 대장균 (E. coli) 균주는 62A7 (△fhuA (△tonA) ptr3, lacIq, lacL8, ompT△(nmpc-fepE) △degP ilvG 수복됨)으로 명명된 W3110 유도체이다. 다른 균주 및 이들의 유도체, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 294 (ATCC 31,446), 대장균 (E. coli) B, 대장균 (E. coli) λ 1776 (ATCC 31,537) 및 대장균 (E. coli) RV308 (ATCC 31,608) 또한 적합하다. 이들 실례는 제한하기 보다는 예시이다. 규정된 유전자형을 갖는 전술한 세균 중에서 한 가지의 유도체를 구축하기 위한 방법은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 예로서, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)에서 설명된다. 세균의 세포에서 레플리콘의 복제가능성을 고려하여, 적절한 세균을 선별하는 것이 일반적으로 필요하다. 가령, 널리 공지된 플라스미드, 예를 들면, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 레플리콘을 공급하는데 이용될 때, 대장균 (E. coli), 세라티아 (Serratia), 또는 살모넬라 (Salmonella) 종이 숙주로서 적절하게 이용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해효소를 분비해야 하고, 그리고 추가 단백질분해효소 저해제가 바람직하게는 세포 배양액에 통합될 수 있다.

세균 배양액에서 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 향상시키기 위해, 세균 세포는 변형될 수 있다. 가령, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 접힘을 향상시키기 위해, 세균 숙주 세포는 숙주 원핵 세포를 공동-형질전환하는데 이용될 수 있는, 샤프롱 단백질, 예를 들면, FkpA 및 Dsb 단백질 (DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG)을 발현하는 추가 벡터를 포함할 수 있다. 샤프롱 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질의 적절한 접힘 및 용해도를 조장하는 것으로 증명되었다.

ii. 항체 생산

숙주 세포는 전술한 발현 벡터로 형질전환되고, 그리고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하는데 타당하면 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양된다.

형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성 부분에 의해 복제가능하도록, DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 이용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이런 세포에 타당한 표준 기술을 이용하여 행위된다. 염화칼슘을 이용한 칼슘 처리가 실제적인 세포-벽 장벽을 내포하는 세균 세포에 일반적으로 이용된다. 형질전환을 위한 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 이용한다. 이용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.

본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 이용되는 원핵 세포는 당해 분야에서 공지되고 선별된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장된다. 적합한 배지의 실례는 루리아 액체배지 (LB) + 필요한 영양소 보충물을 포함한다. 일부 구체예에서, 배지는 또한, 발현 벡터를 내포하는 원핵 세포의 성장을 선별적으로 허용하기 위해, 발현 벡터의 구성에 근거하여 선택된 선별 작용제를 내포한다. 가령, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.

탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외에 임의의 필요한 보충물은 또한, 단독으로 또는 다른 보충물 또는 배지, 예를 들면, 복합 질소원과의 혼합물로서 도입된 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 임의선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 환원제를 내포할 수 있다.

원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 대장균 (E. coli) 성장을 위해, 예로서, 바람직한 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃, 더욱 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 이보다 더욱 바람직하게는 약 30℃의 범위에 있다. 배지의 pH는 주로 숙주 생명체에 따라서, 약 5 내지 약 9의 범위에서 변하는 임의의 pH일 수 있다. 대장균 (E. coli)의 경우에, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 그리고 더욱 바람직하게는 약 7.0이다.

유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에서 이용되면, 단백질 발현은 상기 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에 유도된다. 본 발명의 한 양상에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 제어하는데 이용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위한 인산염-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 인산염-제한 배지는 C.R.A.P 배지 (가령, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147을 참조한다) 또는 WO2002/061090에서 설명된 배지이다. 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 이용된 벡터 구조체에 따라, 다양한 다른 유도인자가 이용될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변세포질 내로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 미생물을 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 파괴하는 것을 수반한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 조직파편 또는 전체 세포가 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은 예로서, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 대안으로, 단백질은 배양 배지 내로 수송되고 그 안에서 단리될 수 있다. 세포는 배양액으로부터 제거될 수 있고, 그리고 배양 상층액이 생산된 단백질의 추가 정제를 위해 여과되고 농축될 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 더욱 단리되고, 그리고 통상적으로 공지된 방법, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 확인될 수 있다.

본 발명의 한 양상에서, 항체 생산은 발효 과정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차가 재조합 폴리펩티드의 생산에 가용하다. 대규모 발효는 최소한 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양소, 특히 글루코오스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배하기 위해 혼합기 임펠러를 이용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 체적 용량에서 거의 100 리터 이내이고, 그리고 약 1 리터 내지 약 100 리터의 범위에서 변할 수 있는 발효기에서 발효를 지칭한다.

발효 과정 동안, 단백질 발현의 유도는 전형적으로, 세포가 적합한 조건 하에 원하는 밀도, 예를 들면, 약 180-220의 OD550까지 성장된 후 시작되는데, 이 시기에 세포는 초기 정지기에 있다. 당해 분야에서 공지되고 앞서 설명된 바와 같이, 이용된 벡터 구조체에 따라, 다양한 유도인자가 이용될 수 있다. 세포는 유도에 앞서 더욱 짧은 기간 동안 성장될 수 있다. 세포는 비록 더욱 긴 또는 더욱 짧은 유도 시간이 이용될 수 있긴 하지만, 통상적으로 약 12-50 시간 동안 유도된다.

본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 향상시키기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 가령, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 접힘을 향상시키기 위해, 샤프롱 단백질, 예를 들면, FkpA, DsbA 및/또는 DsbC를 발현하는 추가 벡터가 숙주 원핵 세포를 공동-형질전환하는데 이용될 수 있다. 샤프롱 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질의 적절한 접힘 및 용해도를 조장하는 것으로 증명되었다. 일부 구체예에서, FkpA, DsbA 및/또는 DsbC는 세균 숙주 세포에서 발현된다.

발현된 이종성 단백질 (특히, 단백질분해적으로 민감한 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해효소에 결함성인 일정한 숙주 균주가 본 발명에 이용될 수 있다. 가령, 숙주 세포 균주는 공지된 세균 프로테아제, 예를 들면, 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합을 인코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 달성하기 위해 변형될 수 있다. 일부 대장균 (E. coli) 프로테아제-결함성 균주가 가용하고, 그리고 예로서, Joly et al. (1998), 위와 같음; Georgiou et al., U.S. 특허 번호 5,264,365; Georgiou et al., U.S. 특허 번호 5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)에서 설명된다.

한 구체예에서, 단백질분해효소에 대해 결함성이고 하나 또는 그 이상의 샤프롱 단백질을 발현하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 (E. coli) 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 이용된다.

B. 항체 정제

당해 분야에서 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 다음의 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들면, SP 또는 음이온 교환 수지, 예를 들면, DEAE에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 그리고 예로서, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과.

한 양상에서, 고체상 위에 고정된 단백질 A가 본 발명의 항체 산물의 면역친화성 정제에 이용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 높은 친화성으로 결합하는, 황색포도상구균 (Staphylococcus aureas)으로부터 41kD 세포 벽 단백질이다. Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. 단백질 A가 고정되는 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 더욱 바람직하게는 제어된 다공성 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 일부 적용에서, 칼럼은 불순물의 비특이적 부착을 예방하기 위한 시도에서, 시약, 예를 들면, 글리세롤로 코팅되었다.

정제의 첫 번째 단계로서, 앞서 설명된 바와 같이 세포 배양액으로부터 유래된 제조물은 단백질 A에 대한 관심되는 항체의 특이적 결합을 허용하기 위해 단백질 A 고정된 고체상 위에 적용된다. 고체상은 이후, 고체상에 비특이적으로 결합된 불순물을 제거하기 위해 세척된다. 최종적으로, 관심되는 항체는 용리에 의해 고체상으로부터 회수된다.

본 발명의 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 정제 단계로부터 유래된 분획물은 FkpA의 제거에 대해 분석된다. 일부 구체예에서, FkpA의 제거는 면역검정에 의해; 예를 들면, 본원에서 설명된 면역검정에 의해 결정된다.

본 발명은 또한, 예로서 세포독성 작용제, 예를 들면, 화학요법 작용제, 약물, 성장 저해제, 독소 (가령, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사접합체)에 접합된 본원에서 설명된 임의의 항체를 포함하는 면역접합체 ("항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 교체 가능하게 명명됨)를 제공한다.

본 발명의 이중특이적 항체에 대한 정제 계획이 아래에 설명된다.

VI. FkpA의 조성물

일부 양상에서, 본 발명은 초고순도 FkpA를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 포함하고, 여기서 상기 FkpA는 약 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 또는 99.5% FkpA 중에서 한 가지보다 많다. 일부 구체예에서, 95% FkpA를 포함하는 조성물은 제조물에서 5%보다 적은 물질이 FkpA의 생산 동안 세포 또는 세포 용해물 (가령, 단백질, 핵산, 지질 등)에서 존재하였던 다른 물질인 조성물이다. 일부 구체예에서, FkpA 폴리펩티드의 백분율은 크기 배제 크로마토그래피 (가령, HPLC-SEC)에 의해 계측된다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA를 포함하는 조성물은 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 중에서 한 가지보다 적은 저분자량 종류 (가령, SEC 또는 SDS-PAGE에 의해 계측될 때 FkpA보다 적은 분자량을 갖는 종류)를 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA를 포함하는 조성물은 약 2%보다 적은 저분자량 종류를 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA를 포함하는 조성물은 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 중에서 한 가지보다 적은 고분자량 종류 (가령, SEC 또는 SDS-PAGE에 의해 계측될 때 FkpA보다 큰 분자량을 갖는 종류)를 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA를 포함하는 조성물은 약 1%보다 적은 고분자량 종류를 포함한다.

일부 구체예에서, 높은 정제된 FkpA를 포함하는 조성물이 이용을 위해 조제된다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA를 포함하는 조성물은 예로서, 면역 반응의 산출을 조장하는 어쥬번트를 첨가함으로써, 동물을 면역화하여 FkpA에 대한 항체를 산출하기 위해 조제된다. 다른 구체예에서, 초고순도 FkpA를 포함하는 조성물은 면역검정에서 예로서, 양성 대조로서 또는 표준 곡선으로서 이용을 위해 조제된다.

VII. FkpA에 대한 항체의 산출

일정한 양상에서, 본 발명은 FkpA의 존재에 대해 재조합 폴리펩티드 표본을 분석하기 위한 면역검정에서 이용을 위해, 항체 (가령, 다중클론 항체 및/또는 단일클론 항체)를 산출하기 위한 면역원으로서 초고순도 FkpA의 용도를 제공한다. 가령, 항체는 재조합 폴리펩티드 표본에서 FkpA를 검출하고 및/또는 정량하기 위한 면역검정에서 이용될 수 있는데, 여기서 재조합 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)는 외인성 FkpA를 발현하는 세균 세포에서 생산되었다. 일부 구체예에서, 본 발명은 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 다중클론 항체는 FkpA의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하고, 그리고 이런 이유로, FkpA 단편, 변이체, 오접힘된 단백질 등을 검출하는데 유용성을 제공한다. 면역검정에서 계측되는 표본 내에 FkpA 수준의 과다정량 또는 과다추정을 유발할지도 모르는 숙주 세포 단백질 불순물에 대한 토끼 항체의 산출을 최소화하기 위해, 동물 (가령, 토끼)은 초고순도 FkpA로 면역화된다.

본 발명은 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 항체는 다중클론 항체이다. 다중클론 항체는 바람직하게는, 유관한 항원 및 어쥬번트의 복수 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 조성된다. 이것은 이중기능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R과 R1은 상이한 알킬 기이다)를 이용하여, 면역화되는 종에서 면역원성인 폴리펩티드, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 콩 트립신 저해제에 유관한 항원을 접합하는데 유용할 수 있다.

동물은 100 μg 또는 5 μg의 폴리펩티드 또는 접합체 (각각, 토끼 또는 생쥐의 경우)를 3 용적의 프로인드 완전 어쥬번트와 합동하고 용액을 복수 부위에서 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대항하여 면역화된다. 1 개월 후, 이들 동물은 복수 부위에서 피하 주사에 의해 프로인드 완전 어쥬번트에서 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 부양된다. 7 내지 14 일 후, 이들 동물은 채혈되고, 그리고 혈청이 항체 역가에 대해 검정된다. 동물은 역가가 안정 상태를 유지할 때까지 부양된다. 일부 구체예에서, 동물은 동일한 항원의 접합체로 부양되지만, 상이한 폴리펩티드에 및/또는 상이한 교차연결 시약을 통해 접합된다. 접합체는 또한, 재조합 세포 배양 동안 폴리펩티드 융합체로서 만들어질 수 있다. 또한, 응집 작용제, 예를 들면, 백반이 면역 반응을 증강하는데 적절하게 이용된다.

일부 구체예에서, FkpA로 면역화된 동물은 염소, 양, 토끼, 생쥐, 기니 피그, 햄스터, 쥐, 당나귀 또는 닭이다.

일부 구체예에서, FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 단일클론 항체이다. 단일클론 항체는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 단일클론 항체의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합하고, 이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 구별된 또는 다중클론 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 지시한다. 앞서 설명된 바와 같이, 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 최초 설명된 하이브리도마 방법을 이용하여 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (U.S. 특허 번호 4,816,567)에 의해 만들어질 수 있다.

일부 양상에서, 본 발명은 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 이들 방법은 항-FkpA 항체를 포함하는 조성물을 지지체 물질에 부착된 초고순도 FkpA를 포함하는 크로마토그래피 물질에 접촉시키고, 크로마토그래피 물질을 세척하여 결합되지 않은 화합물을 제거하고, 그리고 항-FkpA 항체를 용리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 지지체 물질에 부착되는 초고순도 FkpA는 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 중에서 한 가지보다 적은 불순물을 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA는 본원에서 설명된 방법에 의해 제조된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 중에서 한 가지보다 적은 다중클론 항체가 비-FkpA 화합물에 특이적으로 결합한다.

일부 구체예에서, 항-FkpA 항체는 이들 항체를 크로마토그래피 물질 (가령, 활성화된 글리세릴-제어된 다공성 유리에 고정된 초고순도 FkpA) 위에 고정된 초고순도 FkpA에 접촉시킴으로써 정제된다. 일부 구체예에서, 항체는 고정된 FkpA와의 접촉에 앞서, 예로서 황산암모늄 침전에 의해 농축된다. 일부 구체예에서, 항체는 고정된 FkpA에 결합되고, 그리고 이후, 고정된 FkpA-항체 복합체는 비-결합된 불순물을 제거하기 위해 세척된다. 추가 구체예에서, 항체는 부하 완충액으로서 상이한 pH에서 완충액으로 용리함으로써, 고정된 FkpA로부터 용리된다; 예로서, 항체는 중성 pH (가령, pH 7.2)에서 고정된 FkpA에 결합되고 산성 pH (가령, pH 2.0)에서 용리된다. 일부 추가의 구체예에서, 항-FkpA 항체는 추가 크로마토그래피; 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 종속된다. 일부 구체예에서, 정제된 항-FkpA 항체 (가령, 다중클론 항체)는 각각, 초고순도 FkpA에 대한 그들의 결합에 대해 검정된다.

VIII. FkpA에 대한 항체를 이용한 면역검정

일부 구체예에서, 본 발명은 FkpA의 존재 및/또는 양에 대해 재조합 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체) 표본을 분석하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 면역검정을 이용하여 표본 내에 FkpA를 검출하고, 그리고 표본 내에서 검출된 FkpA의 양을 초고순도 FkpA 참고 표준의 하나 또는 그 이상의 농도의 검출과 비교하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제조물은 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 중에서 한 가지보다 적은 불순물을 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 본원에서 설명된 방법에 의해 제조된다. 일부 구체예에서, 면역검정은 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 중에서 한 가지보다 적은 비-FkpA 화합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 다중클론 항체이다. 다른 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 면역검정에서 포획 항체로서 이용된다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 검출 항체로서 이용된다. 일부 구체예에서, 검출 항체는 검출 작용제 (가령, 양고추냉이 과산화효소)에 접합된다. 일부 구체예에서, FkpA는 대장균 (E. coli) FkpA이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 숙주 세포 (가령, 대장균 (E. coli) 숙주 세포)에서 제조된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 FkpA를 과다발현한다 (가령, FkpA를 과다발현한 대장균 (E. coli) 숙주 세포). 일부 구체예에서, 숙주 세포는 외인성 FkpA를 발현한다 (가령, 외인성 FkpA를 발현한 대장균 (E. coli) 숙주 세포). 일부 구체예에서, 표본은 세포 용해물이거나 또는 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 그리고 여기서 재조합 폴리펩티드 제조물은 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 정제 단계에 종속되었다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드 제조물은 최종 정제된 산물이다. 일부 구체예에서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 면역검정에서 약 50 ng/mL, 25 ng/mL, 15 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mL, 2.5 ng/mL 및/또는 1.5 ng/mL보다 적은 및/또는 이들 중에서 한 가지보다 적은 FkpA를 검출할 수 있다.

일부 양상에서, 본 발명은 FkpA의 검출 및 정량을 위한 면역검정 방법을 제공한다. 이런 방법은 숙주 세포, 예를 들면, FkpA가 발현되어 폴리펩티드 접힘 및 조립을 조장하는 대장균 (E. coli)에서 생산된 재조합 폴리펩티드 제조물에서 FkpA의 검출 및 정량에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역검정 방법은 본원에서 설명된 포획 및 검출 항-FkpA 항체를 이용한다. 일부 구체예에서, 항체는 샌드위치 검정, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 검정, 전기화학적 검정 (ECL) 검정, 자성 면역검정을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 당해 분야에서 공지된 임의의 면역검정 방법에서 이용된다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 재조합 폴리펩티드 제조물의 표본을 FkpA에 대한 항-FkpA 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 본원에서 설명된 바와 같은 항-FkpA 항체와 접촉시키고, 그리고 복합체가 항-FkpA 항체 및 FkpA 사이에 형성되는 지를 검출하는 것을 포함한다.

일정한 구체예에서, 표지화된 항-FkpA 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (가령, 형광, 색소생산, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라 예로서, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 표지는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예를 들면, HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들면, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들면, 개똥벌레 루시페라아제 및 세균 루시페라아제 (U.S. 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예를 들면, 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일정한 구체예에서, 포획 항-FkpA 항체는 고체상 위에 고정된다. 일부 구체예에서, 고정에 이용된 고체상은 예로서, 표면, 입자, 다공성 매트릭스, 비드 등의 형태에서 지지체를 비롯하여, 본질적으로 수불용성이고 면역계측 검정에서 유용한 임의의 비활성 지지체 또는 담체이다. 통상적으로 이용되는 지지체의 실례는 작은 시트, SEPHADEX^®, 겔, 폴리염화비닐, 플라스틱 비드, 그리고 96-웰 마이크로역가 평판을 비롯하여, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로부터 제조된 검정 평판 또는 시험관뿐만 아니라 미립자 물질, 예를 들면, 필터 페이퍼, 아가로오스, 교차연결된 덱스트란 및 다른 다당류를 포함한다. 대안으로, 반응성 수불용성 매트릭스, 예를 들면, 시아노겐-브롬화물-활성화된 탄수화물 및 U.S. 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440에서 설명된 반응성 기질이 포획-시약 고정에 적절하게 이용된다. 일부 구체예에서, 고정된 포획 시약은 여러 표본을 한꺼번에 분석하는데 이용될 수 있는 마이크로역가 평판 위에 코팅된다. 예시적인 마이크로역가 평판은 MICROTEST^®, MAXISORP^®, NUNC MAXISORB^® 및 IMMULON^®을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 고체상은 상기 규정된 바와 같은 포획 시약으로 코팅되는데, 이들은 필요에 따라 비공유 또는 공유 상호작용 또는 물리적 연쇄에 의해 연결될 수 있다. 부착을 위한 기술은 U.S. 특허 번호 4,376,110 및 그 안에 인용된 참고문헌에서 설명된 것들을 포함한다. 공유이면, 평판 또는 다른 고체상은 당해 분야에서 널리 공지된 조건 하에, 예를 들면, 실온에서 1 시간 동안 포획 시약과 함께 교차연결 작용제와 함께 배양된다. 일부 구체예에서, 평판은 검정 그 자체에 앞서 적층되고 코팅되고, 그리고 이후, 검정이 수동, 반자동, 또는 자동 방식으로, 예를 들면, 로봇공학을 이용함으로써 여러 표본에서 동시에 실행된다.

일부 구체예에서, 코팅된 평판은 결합 부위에 비특이적으로 결합하고 이들을 포화시켜, 평판의 웰 상에서 과잉 부위에 유리 리간드의 원치 않는 결합을 예방하는 차단제로 처리된다. 이런 목적으로 적절한 차단제의 실례는 예로서, 젤라틴, 소 혈청 알부민, 난알부민, 카제인 및 탈지우유를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 차단 처리는 전형적으로, 약 1-4 시간의 기간 동안 주위 온도의 조건 하에 전형적으로 진행된다.

일부 구체예에서, 코팅 및 차단 후, 적절하게 희석된 분석되는 표본이 고정된 상에 첨가된다. 이런 목적으로 희석에 이용될 수 있는 예시적인 완충액은 (a) 0.5% BSA, 0.05% TWEEN 20^® 세정제 (P20), 0.05% PROCLIN^® 300 항균제, 5 mM EDTA, 0.25% 3-((3-콜아미도프로필)디메틸암모늄)-1-프로판술포네이트 (CHAPS) 계면활성제, 0.2% 베타-감마 글로불린 및 0.35M NaCl을 내포하는 인산염 완충된 식염수 (PBS); (b) 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.05% P20 및 0.05% PROCLIN^® 300, pH 7을 내포하는 PBS; (c) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN^® 300, 5 mM EDTA 및 0.35 M NaCl, pH 6.35를 내포하는 PBS; (d) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN^® 300, 5 mM EDTA, 0.2% 베타-감마 글로불린 및 0.35 M NaCl을 내포하는 PBS; 그리고 (e) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% PROCLIN^® 300, 5 mM EDTA, 0.25% CHAPS 및 0.35 M NaCl을 내포하는 PBS를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

표본 및 고정된 포획 시약의 배양 조건은 검정의 민감성을 최대화하고, 분리를 최소화하고, 그리고 표본 내에 존재하는 관심되는 임의의 피분석물 (가령, FkpA)이 고정된 포획 시약에 결합하는 것을 담보하도록 선택된다. 임의선택적으로, 표본은 포획되지 않은 물질을 제거하기 위해, 고정된 포획 시약으로부터 분리된다 (예로서, 세척함으로써). 세척에 이용되는 용액은 일반적으로 완충액 (가령, "세척 완충액")이다. 관심되는 포획된 물질이 차후 단계에서 얼마간 분리될 수 있다는 우려가 있으면, 관심되는 현재-결합된 물질 (가령, FkpA)이 포획 시약에 공유 부착되도록 허용하기 위한 교차연결 작용제 또는 다른 적합한 작용제 또한 이러한 시기에 첨가될 수 있다.

존재하는 관심되는 임의의 결합된 물질과 함께 고정된 포획 시약은 검출 항-FkpA 항체와 접촉된다. 일부 구체예에서, 검출 항체는 비오틴화된다. 일부 구체예에서, 비오틴화된 표지에 대한 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-HRP이다. 일부 구체예에서, 검출 수단의 판독은 형광측정 또는 비색이다.

현재 포획 시약에 결합된, 표본으로부터 관심되는 임의의 유리 물질 (가령, FkpA)의 수준은 검출 항체에 대한 검출 수단을 이용하여 계측되거나 또는 정량된다. 일부 구체예에서, 계측하거나 또는 정량하는 것은 상기 단계의 결과로서 발생하는 반응을 표준 곡선과 비교하여, 공지된 양에 비하여 관심되는 물질 (가령, FkpA)의 수준을 결정하는 것을 포함한다.

고정된 포획 시약에 첨가된 항체는 직접적으로 표지화되거나, 또는 과잉 첫 번째 항체의 세척 후, 첫 번째 항체의 동물 종의 IgG를 향해 지향된 몰 과잉의 두 번째, 표지화된 항체의 첨가에 의해 간접적으로 검출될 것이다. 후자, 간접적인 검정에서, 첫 번째 항체에 대한 표지화된 항혈청이 원지에서 표지화된 항체를 생산하기 위해 표본에 첨가된다.

첫 번째 또는 두 번째 항체에 대해 이용된 표지는 첫 번째 또는 두 번째 항체에 관심되는 유리 물질 (가령, FkpA)의 결합을 간섭하지 않는 임의의 검출가능한 기능성이다. 적합한 표지의 실례는 면역검정에서 이용되는 것으로 알려진 것들, 예를 들면, 상기 열거된 것들을 포함한다.

이들 표지를 단백질 또는 폴리펩티드에 공유적으로 결합시키는데 전통적인 방법이 가용하다. 가령, 연계 작용제, 예를 들면, 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화된 벤지딘 등이 항체를 전술한 형광, 화학발광 및 효소 표지로 태깅하는데 이용될 수 있다. 가령, U.S. 특허 번호 3,940,475 (형광측정법) 및 U.S. 특허 번호 3,645,090 (효소); Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); 그리고 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982)를 참조한다.

IX. 제제 및 방법에서 이용을 위한 다중특이적 항체 획득

본원에서 설명된 정제 방법에서 이용된 다중특이적 항체는 재조합 방법을 비롯하여, 당해 분야에서 널리 공지된 방법을 이용하여 획득될 수 있다. 다음의 섹션은 이들 방법에 관한 보도를 제공한다.

(A) 폴리뉴클레오티드

폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 mRNA를 소유하고 이것을 검출가능한 수준에서 발현하는 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 공급원으로부터 획득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편의하게 획득될 수 있다. 폴리펩티드-인코딩 유전자는 또한, 유전체 라이브러리로부터 또는 공지된 합성 절차 (가령, 자동화된 핵산 합성)에 의해 획득될 수 있다.

가령, 폴리뉴클레오티드는 전체 면역글로불린 분자 사슬, 예를 들면, 경쇄 또는 중쇄를 인코딩할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (V_H)뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (C_H)을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 불변 도메인: C_H1, C_H2 및 C_H3; 및 "힌지 영역"을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재가 바람직하다.

폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원 결합 항체 단편, 예를 들면, 단일 도메인 항체 ("dAbs"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')₂ 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 (전형적으로) C_H1 및 C_K 또는 C_L 도메인이 절제된 이가 항체 단편이다. 미니바디가 전통적인 항체보다 작기 때문에, 이들은 임상적/진단적 용도에서 더욱 우수한 조직 침투를 달성하지만, 이가이면 이들은 일가 항체 단편, 예를 들면, dAbs보다 더욱 높은 결합 친화성을 유지할 것이다. 따라서, 맥락에서 달리 지시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원 결합 항체 단편을 포괄한다. 바람직하게는, 인코딩된 폴리펩티드 내에 존재하는 각 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크에 비하여 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예로서, 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역에 비하여 총 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

적절하게는, 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드는 단리되고 및/또는 정제될 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 상기 분자가 이의 정상적인 또는 자연 환경으로부터 이전 또는 분리되거나, 또는 이것이 이의 정상적인 또는 자연 환경에서 존재하지 않도록 하는 방식으로 생산되었다는 것을 지시하는 것으로 의도된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 정제된 폴리뉴클레오티드이다. 용어 "정제된"은 최소한 일부 오염 분자 또는 물질이 제거되었다는 것을 지시하는 것으로 의도된다.

적절하게는, 폴리뉴클레오티드는 유관한 폴리뉴클레오티드가 조성물 내에 존재하는 지배적인 (다시 말하면, 가장 풍부한) 폴리뉴클레오티드를 구성하도록, 실제적으로 정제된다.

(B) 폴리뉴클레오티드의 발현

아래의 설명은 폴리펩티드-인코딩 폴리뉴클레오티드를 내포하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 폴리펩티드의 생산에 일차적으로 관련된다. 당연히, 당해 분야에서 널리 공지된 대안적 방법이 폴리펩티드를 제조하는데 이용될 수 있는 것으로 예기된다. 가령, 적절한 아미노산 서열, 또는 이의 부분은 고체상 기술을 이용한 직접적인 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다 (가령, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)를 참조한다). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 이용하여 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은 예로서, 제조업체의 사용설명서에 따라 Applied Biosystems 펩티드 합성장치 (Foster City, Calif.)를 이용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 다양한 부분이 원하는 폴리펩티드를 생산하는 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 별개로 및 합동으로 화학적으로 합성될 수 있다.

본원에서 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 생산을 위해 발현 벡터(들) 내로 삽입된다. 용어 "제어 서열"은 특정 숙주 생명체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 제어 서열은 프로모터 (가령, 자연적으로-연관된 또는 이종성 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에서 배치될 때 "작동가능하게 연결된다". 가령, 프리서열 또는 분비성 리더에 대한 핵산이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되면, 이것은 폴리펩티드에 대한 핵산에 작동가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하기 위해 배치되면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 핵산 서열이 인접하고, 그리고, 분비성 리더의 경우에, 인접하고 판독 시기에 있다는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편의한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 만약 이런 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 전통적인 관례에 따라서 이용된다.

항체의 경우에, 경쇄와 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 핵산 분절은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 담보하는 발현 벡터(들)에서 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.

폴리뉴클레오티드 서열 (가령, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 인코딩 서열 및 임의선택적 발현 제어 서열)을 내포하는 벡터는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 이전될 수 있고, 이들 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 변한다. 가령, 염화칼슘 형질감염은 원핵 세포에 대해 통상적으로 활용되고, 반면 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱 또는 바이러스-기초된 형질감염은 다른 세포 숙주에 이용될 수 있다. (일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989를 참조한다). 포유류 세포를 형질전환하는데 이용되는 다른 방법은 폴리브렌의 이용, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공 및 미량주사를 포함한다. 유전자도입 동물의 생산을 위해, 도입유전자는 수정된 난모세포 내로 미량주사될 수 있거나, 또는 배아 줄기 세포의 유전체 내로 통합될 수 있고, 그리고 이런 세포의 핵은 적출된 난모세포 내로 이전된다.

벡터

용어 "벡터"는 발현 벡터 및 형질전환 벡터 및 셔틀 벡터를 포함한다.

용어 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내 발현을 할 수 있는 구조체를 의미한다.

용어 "형질전환 벡터"는 한 실체로부터 다른 실체로 - 이것은 동일한 종일 수 있거나 또는 상이한 종일 수 있다 - 이전될 수 있는 구조체를 의미한다. 구조체가 한 가지 종으로부터 다른 종으로 - 예를 들면, 대장균 (Escherichia coli) 플라스미드로부터 세균, 예를 들면, 바실루스 (Bacillus) 속의 세균으로 이전될 수 있으면, 형질전환 벡터는 때때로 "셔틀 벡터"로 불린다. 이것은 심지어, 대장균 (E. coli) 플라스미드로부터 아그로박테리움 (Agrobacterium)으로부터 식물로 이전될 수 있는 구조체일 수 있다.

벡터는 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 아래에 설명된 바와 같이 적합한 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 가용하다. 벡터는 예로서, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당해 분야에서 공지된 기술을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 이들 성분 중에서 하나 또는 그 이상을 내포하는 적합한 벡터의 작제는 당업자에게 알려져 있는 표준 결찰 기술을 이용한다.

벡터는 예로서, 복제 기점, 임의선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의선택적으로 프로모터의 조절인자가 제공된 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 당해 분야에서 널리 공지된 하나 또는 그 이상의 선별가능 마커 유전자를 내포할 수 있다.

이들 발현 벡터는 전형적으로, 숙주 생명체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 복제가능하다.

숙주 세포

숙주 세포는 예로서, 세균, 효모 또는 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 포유류 세포일 수 있다.

유전적으로 조작된 유전자도입 다세포 숙주 생명체가 폴리펩티드를 생산하는데 이용될 수 있다. 생물체는 예로서, 유전자도입 포유류 생물체 (가령, 유전자도입 염소 또는 생쥐 라인)일 수 있다.

적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들면, 그람 음성 또는 그람 양성 생물체, 예를 들면, 장내세균 (Enterobacteriaceae), 예를 들면, 대장균 (E. coli)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다양한 대장균 (E. coli) 균주, 예를 들면, 대장균 (E. coli) K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 대장균 (E. coli) X1776 (ATCC 31,537); 대장균 (E. coli) 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 가용하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 장내세균 (Enterobacteriaceae), 예를 들면, 에셰리키아 (Escherichia), 예를 들면, 대장균 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella)뿐만 아니라 바실루스 (Bacilli), 예를 들면, 바실루스 서브틸리스 (B. subtilis) 및 바실루스 리체니포르미스 (B. licheniformis) (가령, 바실루스 리체니포르미스 (B. licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 녹농균 (P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이들 실례는 제한하기 보다는 예시이다. 균주 W3110이 특히 바람직한 숙주 또는 부모 숙주인데, 그 이유는 이것이 재조합 폴리뉴클레오티드 산물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해효소를 분비한다. 가령, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이를 달성하기 위해 변형될 수 있는데, 이런 숙주의 실례는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 대장균 (E. coli) W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 대장균 (E. coli) W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan'을 갖는 대장균 (E. coli) W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan'을 갖는 대장균 (E. coli) W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성인 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 대장균 (E. coli) W3110 균주 40B4; 그리고 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 대장균 (E. coli) 균주를 포함한다. 대안으로, 클로닝의 시험관내 방법, 예를 들면, PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다. 일부 구체예에서, 원핵 숙주 세포 (가령, 대장균 (E. coli) 숙주 세포)는 항체의 접힘 및 조립을 조장하는 하나 또는 그 이상의 샤프롱을 발현한다. 일부 구체예에서, 샤프롱은 FkpA, DsbA 또는 DsbC 중에서 하나 또는 그 이상이다. 일부 구체예에서, 샤프롱은 내인성 샤프롱 유전자로부터 발현된다. 일부 구체예에서, 샤프롱은 외인성 샤프롱 유전자로부터 발현된다. 일부 구체예에서, 샤프롱 유전자는 대장균 (E. coli) 샤프롱 유전자 (가령, 대장균 (E. coli) FkpA 유전자, 대장균 (E. coli) DsbA 유전자 및/또는 대장균 (E. coli) DsbC 유전자)이다.

이들 원핵 숙주에서, 숙주 세포와 양립성인 발현 제어 서열 (가령, 복제 기점)을 전형적으로 내포하는 발현 벡터 역시 만들어질 수 있다. 이에 더하여, 수많은 다양한 널리 공지된 프로모터, 예를 들면, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타 락타마아제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 전형적으로, 프로모터는 임의선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 그리고 전사 및 번역을 개시하고 완결하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.

진핵 미생물이 발현에 이용될 수 있다. 진핵 미생물, 예를 들면, 실모양 균류 또는 효모는 폴리펩티드-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 이용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 것들은 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면, 예로서 클루이베로미세스 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574), 클루이베로미세스 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로미세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로미세스 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로미세스 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로미세스 드라소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루이베로미세스 써모톨레란스 (K. Thermotolerans) 및 클루이베로미세스 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris); 칸디다 (Candida); 트리코더마 레시아 (Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬반니오미세스 (Schwanniomyces), 예를 들면, 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 그리고 실모양 균류, 예를 들면, 예로서 네우로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들면, 아스페르길루스 니둘란스 (A. nidulans) 및 아스페르길루스 니게르 (A. niger)를 포함한다. 메틸영양성 효모가 본원에서 적합하고, 그리고 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로에케라 (Kloeckera), 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 구성되는 속에서 선택되는, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 사카로미세스 (Saccharomyces)가 바람직한 효모 숙주인데, 적합한 벡터는 필요에 따라 발현 제어 서열 (가령, 프로모터), 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세린산 키나아제 및 다른 해당효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 그 중에서도 특히, 알코올 탈수소효소, 이소시토크롬 C, 그리고 말토오스와 갈락토오스 활용을 책임지는 효소로부터 프로모터를 포함한다.

미생물에 더하여, 포유류 조직 세포 배양액 역시 본원에서 설명된 바와 같은 폴리펩티드를 발현하고 생산하는데 이용될 수 있고, 그리고 일부 경우에 선호된다 (Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)를 참조한다. 일부 구체예의 경우에, 진핵 세포가 바람직할 수 있는데, 그 이유는 이종성 폴리펩티드 (가령, 무손상 면역글로불린)를 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당해 분야에서 개발되었고, 그리고 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는, 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함하기 때문이다. 일부 구체예에서, 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다.

일부 구체예에서, 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포이다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양에서 성장을 위해 하위클로닝된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR 또는 CHO-DP-12 라인); 생쥐 세르톨리 세포; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 라인 (Hep G2)이다.

X. 절반-항체의 다중특이적 항체-조립의 생산

일부 구체예에서, 본 발명은 다중특이적 항체를 생산하기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 절반-항체를 별개로 생산함으로써 생산되고, 각 절반 항체는 특정한 에피토프에 결합하는 VH/VL 단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 각 절반-항체는 숙주 세포에서 별개로 생산된다. 일부 구체예에서, 각 절반-항체는 동일한 숙주 세포에서 함께 생산된다. 절반-항체는 혼합되고, 그리고 다중특이적 항체로 조립되도록 허용된다. 일부 구체예에서, 각 절반-항체는 동일한 숙주 세포에서 함께 생산된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 절반-항체의 접힘을 조장하는 샤프롱, 예를 들면, FkpA, DsbA 및/또는 DsbC를 발현한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 IL13에 결합하는 절반-항체 및 IL17에 결합하는 절반-항체로부터 조립된다.

각 절반-항체는 U.S. 특허 번호 7,642,228에서 설명된 바와 같이 중쇄로 가공된 노브 (융기) 또는 홀 (공동)을 가질 수 있다. 간단히 말하면, CH3 노브 돌연변이체가 먼저 산출될 수 있다. CH3 홀 돌연변이체의 라이브러리는 이후, 상대 CH3 도메인 상에서 노브에 근접하는 잔기 366, 368 및 407을 무작위화함으로써 창출될 수 있다. 일정한 구체예에서, 노브 돌연변이는 T366W를 포함하고, 그리고 홀 돌연변이는 IgG1 또는 IgG4 중추 내에 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 다른 면역글로불린 아이소타입에서 동등한 돌연변이가 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 게다가, 당업자는 이중특이적 항체에 대해 이용된 2개의 절반-항체는 동일한 아이소타입인 것이 바람직하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.

일부 구체예에서, 노브 또는 홀 돌연변이를 내포하는 절반-항체는 세균 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli)에서 중쇄와 경쇄 구조체를 발현함으로써 별개의 배양액에서 산출된다. 각 절반-항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 별개로 정제될 수 있다. 노브 및 홀 절반-항체로부터 투명해진 세포 추출물은 HiTrap^® MaBSelect^TM SuRe^TM 칼럼에 의해 정제될 수 있다. 상이한 특이성을 갖는 단백질 A 정제된 절반 항체는 조립되어, 환원제의 존재에서 시험관내에서 산화환원 반응에서 이중특이적 항체를 형성할 수 있다.

일부 구체예에서, 노브 또는 홀 돌연변이를 내포하는 절반-항체는 동일한 세균 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli)에서 중쇄와 경쇄 구조체를 발현함으로써 동일한 배양액에서 산출된다. 절반-항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 노브 및 홀 절반-항체로부터 투명해진 세포 추출물은 HiTrap^® MaBSelect^TM SuRe^TM 칼럼에 의해 정제될 수 있다. 상이한 특이성을 갖는 단백질 A 정제된 절반 항체는 조립되어, 환원제의 존재에서 시험관내에서 산화환원 반응에서 이중특이적 항체를 형성할 수 있다.

임의의 적합한 방법이 원하는 환원 조건을 준비하는데 이용될 수 있다. 가령, 원하는 환원 조건은 반응물 (가령, 본 발명의 조립 혼합물)에 환원제/환원 작용제를 첨가함으로써 준비될 수 있다. 적합한 환원제는 제한 없이, 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 티오글리콜산, 아스코르빈산, 티올 아세트산, 글루타티온 (GSH), 베타-메르캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, GSH/글루타티온 이황화물 (GSSG), 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인 및 베타-메르캅토에탄올, 바람직하게는 GSH를 포함한다. 일정한 특정한 구체예에서, 환원제는 제한 없이, GSH, 베타-메르캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인 및 베타-메르캅토에탄올, 바람직하게는 GSH를 포함하는 약한 환원제이다. 일정한 바람직한 구체예에서, 환원제는 GSH이다. 일정한 구체예에서, 환원제는 DTT가 아니다. 반응물에서 원하는 환원 조건을 달성하는 적합한 농도에서 및 적합한 실험적 조건 하에 적합한 환원제를 선별하는 것은 당업자의 능력 범위 안에 있다. 가령, 20 ℃에서 10g/L의 이중특이적 항체 단백질 농도를 갖는 용액에서 10 mM L-환원된 글루타티온은 약 - 400mV의 시작 산화환원 전위를 유발할 것이다. 가령, 조립 혼합물에 첨가된 글루타티온은 노브-인투-홀 이중특이적 조립에 유리한 약한 환원 조건을 창출한다. 유사한 부류, 예를 들면, BMEA (베타-메르캅토에틸아민)에서 다른 환원제가 유사한 효과를 가질 수 있다. 본원에 전체적으로 참조로서 편입된 WO2013/055958을 참조한다. 반응의 환원 조건은 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 추정되고 계측될 수 있다. 가령, 환원 조건은 레자주린 지표 (환원 조건에서 청색으로부터 무색으로 탈색화)를 이용하여 계측될 수 있다. 더욱 정밀한 계측을 위해, 산화환원 전위 미터 (가령, BROADLEY JAMES^®에 의해 만들어진 ORP Electrode)가 이용될 수 있다.

일정한 특정한 구체예에서, 환원 조건은 약한 환원 조건이다. 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "약한 환원제" 또는 "약한 환원 조건"은 25℃에서 음성 산화 전위를 갖는 환원제 또는 상기 환원제에 의해 준비된 환원 조건을 지칭한다. 환원제의 산화 전위는 pH가 7 및 9 사이이고, 그리고 온도가 15℃ 및 39℃ 사이일 때, 바람직하게는 -50 내지 -600 mV, -100 내지 -600 mV, -200 내지 -600 mV, -100 내지 -500 mV, -150 내지 -300 mV 사이, 더욱 바람직하게는 약 -300 내지 -500 mV 사이, 가장 바람직하게는 약 -400mV이다. 당업자는 원하는 환원 조건을 준비하기 위한 적합한 환원제를 선별할 수 있을 것이다. 숙련된 연구자는 강한 환원제, 다시 말하면, 동일한 농도, pH 및 온도에서 전술한 환원제보다 더욱 큰 음성 산화 전위를 갖는 환원제가 더욱 낮은 농도에서 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바람직한 구체예에서, 단백질은 상기-언급된 조건 하에 배양될 때 환원제의 존재에서 이황화 결합을 형성할 수 있을 것이다. 약한 환원제의 실례는 제한 없이, 글루타티온, 베타-메르캅토에틸아민, 시스틴/시스테인, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글리실시스테인 및 베타-메르캅토에탄올을 포함한다. 일정한 구체예에서, 200X 몰 비율의 GSH:항체의 것과 유사한 산화 전위가 다른 환원제를 이용한 효율적인 조립이 예상될 수 있는 약한 환원 조건에 대한 참조 포인트로서 이용될 수 있다.

글루타티온 농도는 조립 혼합물 내에 존재하는 절반-항체의 양에 대하여 몰 농도의 면에서 또는 몰 비율 또는 몰 과잉의 면에서 표현될 수 있다. 목표 몰 비율의 환원제를 이용하는 것은 조립 혼합물에서 단백질 농도를 제어한다; 이것은 가변적 단백질 농도의 결과로서 과다 환원 또는 과소 환원을 예방한다. 일정한 다른 구체예에서, 환원제는 절반 항체의 총량에 대하여 2-600X, 2-200X, 2-300X, 2-400X, 2-500X, 2-20X, 2-8X, 20-50X, 50-600X, 50-200X, 또는 100-300X 몰 과잉, 바람직하게는 50-400X, 더욱 바람직하게는 100-300X, 그리고 가장 바람직하게는 200X 몰 과잉으로 조립 혼합물에 첨가된다. 일정한 구체예에서, 조립 혼합물은 7 및 9 사이의 pH, 바람직하게는 pH 8.5를 갖는다.

XI. 다중특이적 항체를 포함하는 폴리펩티드의 정제

샤프롱 (가령, FkpA, Dsba 및/또는 DsbC)을 이용하여 대장균 (E. coli)에서 산출된 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)를 정제하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 일부 양상에서, 다중특이적 항체의 정제는 친화성 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 순차적 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 친화성 크로마토그래피 이전에 조립된다. 다른 양상에서, 다중특이적 항체는 친화성 크로마토그래피 이후에 조립된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이고, 여기서 상기 항체의 한쪽 팔 (다시 말하면, 한쪽 VH/VL 단위)은 IL13에 결합하고 상기 항체의 다른 팔은 IL17에 결합한다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 2개 또는 그 이상의 항체 팔로 구성되고, 여기서 상이한 항체 팔은 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 팔은 VH/VL 단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 팔은 절반-항체로서 또한 알려져 있는 헤미머를 포함한다. 조립을 조장하기 위해, 일부 구체예에서, 첫 번째 중쇄의 노브가 두 번째 중쇄의 홀로 적합되도록, 한쪽 항체 팔의 중쇄는 "노브"를 포함하도록 변형되고 다른 항체 팔의 중쇄는 "홀"을 포함한다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 각 팔은 별개의 세포 배양액에서 생산된다. 숙주 세포에서 항체 팔의 발현 이후에, 전체 세포 액체배지가 수집되고 균질화되고, 그리고 항체 팔이 추출된다. 일부 구체예에서, 폴리에틸렌이민 (PEI)이 크로마토그래피에 앞서 세포 용해물에 첨가된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 크로마토그래피에 앞서 원심분리된다. 다중특이적 항체의 각 팔은 이후, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 이러한 포인트에서, 정제된 항체 팔은 예로서, SDS-PAGE SEC 크로마토그래피, 질량 분광분석법 등에 의해 분석될 수 있다. 다중특이적 항체의 정제된 팔은 이후, 합동되고, 그리고 본원에서 설명된 방법에 의해 조립되도록 허용된다.

다른 구체예에서, 다중특이적 항체의 각 팔은 별개의 세포 배양액에서 생산된다. 숙주 세포에서 항체 팔의 발현 이후에, 전체 세포 액체배지가 수집되고 균질화된다. 각 배양액으로부터 세포 균질액은 이후, 혼합되고, 그리고 합동된 항체 팔이 추출된다. 일부 구체예에서, 폴리에틸렌이민 (PEI)이 크로마토그래피에 앞서 세포 용해물에 첨가된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 크로마토그래피에 앞서 원심분리된다. 다중특이적 항체의 합동된 팔은 이후, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 이러한 포인트에서, 정제된 항체 팔은 예로서, SDS-PAGE SEC 크로마토그래피, 질량 분광분석법 등에 의해 분석될 수 있다. 다중특이적 항체의 정제된 팔은 이후, 합동되고, 그리고 본원에서 설명된 방법에 의해 조립되도록 허용된다.

다른 구체예에서, 다중특이적 항체의 각 팔은 동일한 세포 배양액에서 생산된다. 숙주 세포에서 항체 팔의 발현 이후에, 전체 세포 액체배지가 수집되고 균질화되고, 그리고 항체 팔이 추출된다. 일부 구체예에서, 폴리에틸렌이민 (PEI)이 크로마토그래피에 앞서 세포 용해물에 첨가된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 크로마토그래피에 앞서 원심분리된다. 다중특이적 항체의 팔은 이후, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 이러한 포인트에서, 정제된 항체 팔은 예로서, SDS-PAGE SEC 크로마토그래피, 질량 분광분석법 등에 의해 분석될 수 있다. 다중특이적 항체의 정제된 팔은 이후, 본원에서 설명된 방법에 의해 조립되도록 허용된다.

일부 구체예에서, 세포 용해물에서 PEI의 최종 농도는 최소한 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 또는 5.0 중에서 한 가지이다. 일부 구체예에서, 세포 용해물에서 PEI의 최종 농도는 약 0.1% 및 5%, 0.1% 및 1%, 0.1% 및 0.5%, 0.5% 및 5%, 0.5% 및 1%, 또는 1% 및 5% 중에서 한 가지 사이이다. 일부 구체예에서, PEI를 포함하는 세포 용해물은 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 12 시간, 14 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 또는 24 시간 중에서 한 가지보다 많은 시간 동안 유지된다. 일부 구체예에서, PEI를 포함하는 세포 용해물은 약 1 시간 및 24 시간, 1 시간 및 6 시간, 6 시간 및 12 시간, 12 시간 및 18 시간, 18 시간 및 24 시간 중에서 한 가지 사이의 시간 동안 유지된다. 일부 구체예에서, PEI를 포함하는 세포 용해물은 약 10 시간 및 14 시간 중에서 한 가지 사이의 시간 동안 유지된다. 일부 구체예에서, PEI를 포함하는 세포 용해물은 약 4 ℃ 및 37 ℃ 사이의 온도에서 유지된다. 일부 구체예에서, PEI를 포함하는 세포 용해물은 약 주위 온도에서 유지된다.

일부 구체예에서, 세포 용해물은 크로마토그래피에 앞서 원심분리에 의해 투명해진다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 크로마토그래피에 앞서 여과된다. 일부 구체예에서, 세포 용해물은 크로마토그래피에 앞서 0.22 μm 필터를 통해 여과된다.

친화성 크로마토그래피의 실례는 단백질 A 또는 단백질 G로 유도체화된 크로마토그래피를 이용하는 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 친화성 크로마토그래피 물질의 실례는 ProSep^®-vA, ProSep^® Ultra Plus, 단백질 A Sepharose^® 패스트 플로우, Toyopearl^® AF-rProtein A, MabSelect™, MabSelect SuRe™ 및 MabSelect SuRe™ LX를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피 물질은 막이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 단백질 A 크로마토그래피는 MabSelect SuRe™ 크로마토그래피이다.

일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피 단계로부터 용출물은 혼합 방식 크로마토그래피에 차후 적용된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 물질은 다음의 기능성 중에서 하나 또는 그 이상을 할 수 있는 기능기를 포함한다: 음이온성 교환, 양이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호작용. 일부 구체예에서, 혼합 방식 물질은 음이온성 교환 및 소수성 상호작용을 할 수 있는 기능기를 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 물질은 양이온성 교환 및 소수성 상호작용을 할 수 있는 기능기를 포함한다. 혼합 방식 물질은 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 4-메르캅토-에틸-피리딘, 헥실아민, 또는 페닐프로필아민을 리간드로서 내포하거나 또는 교차연결된 폴리알릴아민을 내포할 수 있다. 혼합 방식 물질의 실례는 Capto™ 부착 수지, Accell™ 플러스 사차 메틸 아민 (QMA) 수지, Capto^TM MMC 수지, MEP HyperCel^TM 수지, HEA HyperCel^TM 수지, PPA HyperCel^TM 수지, 또는 ChromaSorb^TM 막 또는 사르토바인드 STIC^®를 포함한다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 물질은 Capto^TM 부착 수지이다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되고, 여기서 다중특이적 항체는 혼합 방식 크로마토그래피 물질에 결합하고, 그리고 이후, 혼합 방식 크로마토그래피 물질로부터 용리된다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 혼합 방식 물질은 칼럼 내에 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 혼합 방식 물질은 막 내에 있다.

일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피 단계로부터 용출물은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 크로마토그래피에 차후 적용된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피 단계로부터 용출물은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 앞서 음이온 교환 크로마토그래피에 적용된다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 소수성에 따라 생체분자를 분리하는 액체 크로마토그래피 기술이다. HIC 크로마토그래피 물질의 실례는 Toyopearl^® 헥실-650, Toyopearl^® 헥실-650C, Toyopearl^® 부틸-650, Toyopearl^® 페닐-650, Toyopearl^® 에테르-650, HiTrap^® 세파로오스, 옥틸 Sepharose^®, 페닐 Sepharose^® 또는 부틸 Sepharose^®를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피 물질은 페닐 Sepharose^®를 포함한다. 다른 구체예에서, HIC 크로마토그래피 물질은 부틸 Sepharose^®를 포함한다. 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행되는데, 여기서 다중특이적 항체는 HIC 크로마토그래피를 관류한다. 상기 중에서 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피 물질은 막 내에 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피 용출물은 HIC 크로마토그래피에 앞서 음이온 교환 크로마토그래피에 적용된다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 양성으로 하전되고, 그리고 고체상 위에 또는 고체상을 통해 통과된 수성 용액에서 음이온과의 교환을 위한 유리 음이온을 갖는 고체상이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 음이온 교환 물질은 막, 모놀리스, 또는 수지일 수 있다. 한 구체예에서, 음이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 물질은 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민 또는 사차 암모늄 이온 기능기, 폴리아민 기능기, 또는 디에틸아미노에틸 기능기를 포함할 수 있다. 음이온 교환 물질의 실례는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 POROS^® HQ 50, POROS^® PI 50, POROS^® D, Mustang^® Q, Q Sepharose^® 패스트 플로우 (QSFF) 및 DEAE-Sepharose^®를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 QSFF 크로마토그래피 물질이다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 막 내에 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피로부터 다중특이적 항체를 포함하는 분획물은 양이온 교환 크로마토그래피에 적용된다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양성으로 하전되고, 그리고 고체상 위에 또는 고체상을 통해 통과된 수성 용액에서 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체상이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 막, 모놀리스, 또는 수지일 수 있다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 양이온 교환 물질은 카르복실산 기능기 또는 술폰산 기능기, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 술폰산염, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸, 또는 오르토인산염을 포함할 수 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 막이다. 양이온 교환 물질의 실례는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 Mustang^® S, Sartobind^® S, SO₃ 모놀리스, CIM^®, CIMmultus^® 및 CIMac^® SO3, S 세라믹 HyperD^®, POROS^® XS, POROS^® HS 50, POROS^® HS 20, 술포프로필-Sepharose^® 패스트 플로우 (SPSFF), SP-Sepharose^® XL (SPXL), CM Sepharose^® 패스트 플로우, Capto^TM S, Fractogel^® EMD Se Hicap, Fractogel^® EMD SO₃ ^-, 또는 Fractogel^® EMD COO^-를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 POROS^® HS 50이다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 막 내에 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피로부터 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)를 포함하는 분획물은 수산화인회석 크로마토그래피에 적용된다. 일부 구체예에서, 수산화인회석은 (Ca₅(PO₄)₃OH)₂를 포함한다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피 물질은 고체상 크로마토그래피이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 수산화인회석 물질은 막, 모놀리스, 또는 수지일 수 있다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 일부 구체예에서, 수지는 세라믹이다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피는 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피는 CHT 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피이다. 수산화인회석 물질의 실례는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 CHT 세라믹 수산화인회석, 유형 I 및 유형 II를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행된다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 있다. 상기 중에서 일부 구체예에서, 수산화인회석 크로마토그래피 물질은 막 내에 있다.

본원에서 설명된 크로마토그래피 물질 중에서 한 가지 위에 다중특이적 항체를 포함하는 용액의 부하는 불순물로부터 다중특이적 항체의 분리를 위해 최적화될 수 있다. 일부 구체예에서, 크로마토그래피 물질 위에 다중특이적 항체를 포함하는 용액의 부하는 결합 및 용리 방식 (가령, 본원에서 지정된 친화성 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피)으로 이용될 때 크로마토그래피 물질에 대한 다중특이적 항체의 결합을 위해 최적화된다. 가령, 다중특이적 항체를 포함하는 용액은 부하 완충액의 전도도는 일정하지만, 다수의 상이한 pH에서 부하 완충액에서 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼 위에 부하될 수 있다. 대안으로, 다중특이적 항체를 포함하는 용액은 부하 완충액의 pH는 일정하지만, 다수의 상이한 전도도에서 부하 완충액에서 크로마토그래피 물질 위에 부하될 수 있다. 크로마토그래피 물질 위에 다중특이적 항체를 포함하는 용액의 부하 및 크로마토그래피 물질로부터 다중특이적 항체의 풀 분획물 내로의 용리의 완결 시에, 풀 분획물 내에 오염체의 양은 소정의 pH 또는 전도도에서 오염체로부터 산물의 분리에 관한 정보를 제공한다. 유사하게, 다중특이적 항체가 크로마토그래피 물질 (가령, HIC)을 관류하는 크로마토그래피의 경우에, 부하 완충액은 다중특이적 항체는 크로마토그래피를 관류하는 반면, 불순물은 크로마토그래피 물질에 의해 유지되거나 또는 다중특이적 항체와 상이한 비율에서 크로마토그래피 물질을 관류하도록 pH 및 전도도에 대해 최적화된다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체 또는 항체 팔을 포함하는 용액의 부하 밀도는 약 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 또는 150 g/L 중에서 한 가지의 친화성 크로마토그래피 물질 (가령, 단백질 A 크로마토그래피 물질)보다 크다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체 또는 항체 팔을 포함하는 용액의 부하 밀도는 약 10 g/L 및 20 g/L, 20 g/L 및 30 g/L, 30 g/L 및 40 g/L, 40 g/L 및 50 g/L, 50 g/L 및 60 g/L, 60 g/L 및 70 g/L, 70 g/L 및 80 g/L, 80 g/L 및 90 g/L, 90 g/L 및 100 g/L 중에서 한 가지의 친화성 크로마토그래피 물질 (가령, 단백질 A 크로마토그래피 물질) 사이이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피의 용출물은 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 또는 150 g/L 중에서 한 가지의 혼합 방식 크로마토그래피 물질 (가령, Capto^TM 부착 크로마토그래피 물질)보다 큰 폴리펩티드의 부하 밀도에서 혼합 방식 크로마토그래피 물질 위에 부하된다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피 용출물의 부하 밀도는 약 10 g/L 및 20 g/L, 20 g/L 및 30 g/L, 30 g/L 및 40 g/L, 40 g/L 및 50 g/L, 50 g/L 및 60 g/L, 60 g/L 및 70 g/L, 70 g/L 및 80 g/L, 80 g/L 및 90 g/L, 90 g/L 및 100 g/L 중에서 한 가지의 혼합 방식 크로마토그래피 물질 (가령, Capto^TM 부착 크로마토그래피 물질) 사이이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피의 용출물은 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 또는 150 g/L 중에서 한 가지의 HIC 크로마토그래피 물질 (가령, 페닐 Sepharose^® 또는 부틸 Sepharose^® 크로마토그래피 물질)보다 큰 폴리펩티드의 부하 밀도에서 HIC 크로마토그래피 물질 위에 부하된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피의 용출물의 부하 밀도는 약 10 g/L 및 20 g/L, 20 g/L 및 30 g/L, 30 g/L 및 40 g/L, 40 g/L 및 50 g/L, 50 g/L 및 60 g/L, 60 g/L 및 70 g/L, 70 g/L 및 80 g/L, 80 g/L 및 90 g/L, 90 g/L 및 100 g/L 중에서 한 가지의 혼합 방식 크로마토그래피 물질 (가령, 페닐 Sepharose^® 또는 부틸 Sepharose^® 크로마토그래피 물질) 사이이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피의 용출물은 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 또는 150 g/L 중에서 한 가지의 음이온 교환 크로마토그래피 물질 (가령, QSFF 크로마토그래피 물질)보다 큰 폴리펩티드의 부하 밀도에서 음이온 교환 크로마토그래피 물질 위에 부하된다. 일부 구체예에서, 혼합 방식 크로마토그래피의 용출물의 부하 밀도는 약 10 g/L 및 20 g/L, 20 g/L 및 30 g/L, 30 g/L 및 40 g/L, 40 g/L 및 50 g/L, 50 g/L 및 60 g/L, 60 g/L 및 70 g/L, 70 g/L 및 80 g/L, 80 g/L 및 90 g/L, 90 g/L 및 100 g/L 중에서 한 가지의 음이온 교환 크로마토그래피 물질 (가령, QSFF 크로마토그래피 물질) 사이이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피로부터 다중특이적 항체를 포함하는 분획물은 약 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 또는 150 g/L 중에서 한 가지의 양이온 교환 크로마토그래피 물질 (가령, POROS^® HS 50 크로마토그래피 물질)보다 큰 폴리펩티드의 부하 밀도에서 양이온 교환 크로마토그래피 물질 위에 부하된다. 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피로부터 다중특이적 항체를 포함하는 분획물의 부하 밀도는 약 10 g/L 및 20 g/L, 20 g/L 및 30 g/L, 30 g/L 및 40 g/L, 40 g/L 및 50 g/L, 50 g/L 및 60 g/L, 60 g/L 및 70 g/L, 70 g/L 및 80 g/L, 80 g/L 및 90 g/L, 90 g/L 및 100 g/L 중에서 한 가지의 양이온 교환 크로마토그래피 물질 (가령, POROS^® HS 50 크로마토그래피 물질) 사이이다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피로부터 다중특이적 항체를 포함하는 분획물은 약 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 또는 150 g/L의 수산화인회석 크로마토그래피 물질 (가령, CHT 유형 I 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피 물질) 중에서 한 가지보다 적은 폴리펩티드의 부하 밀도에서 수산화인회석 크로마토그래피 물질 위에 부하된다. 일부 구체예에서, HIC 크로마토그래피로부터 다중특이적 항체를 포함하는 분획물의 부하 밀도는 약 5 g/L 및 10 g/L, 10 g/L 및 15 g/L, 15 g/L 및 20 g/L, 20 g/L 및 25 g/L, 25 g/L 및 30 g/L, 30 g/L 및 50 g/L, 50 g/L 및 100 g/L, 그리고 100 g/L 및 150 g/L 중에서 한 가지의 수산화인회석 크로마토그래피 물질 (가령, CHT 유형 I 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피 물질) 사이이다.

크로마토그래피 물질로부터 다중특이적 항체의 용리는 최소 불순물과 함께 및 최소 풀 용적에서 산물의 수율을 위해 최적화될 수 있다. 가령, 다중특이적 항체 또는 항체 팔을 내포하는 용액은 부하 완충액에서 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼 위에 부하될 수 있다. 부하의 완결 시에, 다중특이적 항체 또는 항체 팔은 용리 완충액의 전도도는 일정하지만, 다수의 상이한 pH에서 완충액으로 용리된다. 대안으로, 다중특이적 항체 또는 항체 팔은 용리 완충액의 pH는 일정하지만, 다수의 상이한 전도도에서 용리 완충액에서 크로마토그래피 물질로부터 용리될 수 있다. 크로마토그래피 물질로부터 다중특이적 항체 또는 항체 팔의 용리의 완결 시에, 풀 분획물 내에 불순물의 양은 소정의 pH 또는 전도도에서 불순물로부터 다중특이적 항체 또는 항체 팔의 분리에 관한 정보를 제공한다. 높은 숫자의 분획물 (가령, 8개 칼럼 용적)에서 다중특이적 항체 또는 항체 팔의 용리는 용리 프로필의 "테일링"을 나타낸다. 본 발명의 일부 구체예에서, 용리의 테일링이 최소화된다.

예로서, 완충액의 원하는 pH, 완충액의 원하는 전도도, 관심되는 단백질의 특징, 그리고 정제 방법에 따라, 다양한 완충액이 이용될 수 있다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 이들 방법은 완충액을 이용하는 것을 포함한다. 완충액은 부하 완충액, 평형화 완충액, 또는 세척 완충액일 수 있다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상은 동일하다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액은 상이하다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 완충액은 염을 포함한다. 부하 완충액은 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 부하 완충액은 염화나트륨 완충액이다. 일부 구체예에서, 부하 완충액은 아세트산나트륨 완충액이다. 일부 구체예에서, 완충액은 Tris를 포함한다. 일부 구체예에서, 완충액은 아르기닌을 포함한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 부하는 크로마토그래피 물질 위에 부하된 조성물이다. 부하 완충액은 다중특이적 항체 또는 항체 팔을 포함하는 용액을 크로마토그래피 물질 위에 부하하는데 이용되는 완충액이다. 크로마토그래피 물질은 정제되는 용액을 부하하기에 앞서, 평형화 완충액으로 평형화될 수 있다. 일부 실례에서, 세척 완충액은 크로마토그래피 물질 위에 용액의 부하 후 및 고체상으로부터 다중특이적 항체 또는 항체 팔의 용리 전에 이용된다. 하지만, 관심되는 산물 중에서 일부, 예를 들면, 다중특이적 항체는 세척 완충액에 의해 크로마토그래피 물질로부터 제거될 수 있다 (가령, HIC의 경우에 관류 방식).

본원에서 이용된 바와 같이, 용리는 크로마토그래피 물질로부터 산물, 예를 들면, 다중특이적 항체 또는 항체 팔의 제거이다. 용리 완충액은 크로마토그래피 물질로부터 관심되는 다중특이적 항체 또는 다른 산물을 용리하는데 이용되는 완충액이다. 많은 경우에, 용리 완충액은 부하 완충액과 상이한 물리적 특징을 갖는다. 가령, 용리 완충액은 부하 완충액과 상이한 전도도 또는 부하 완충액과 상이한 pH를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 낮은 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 높은 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 낮은 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액보다 높은 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액과 상이한 전도도 및 상이한 pH를 갖는다. 용리 완충액은 더욱 높은 또는 더욱 낮은 전도도 및 더욱 높은 또는 더욱 낮은 pH의 임의의 조합을 가질 수 있다.

전도도는 2개의 전극 사이에 전류를 전도하는 수성 용액의 능력을 지칭한다. 용해 상태에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 이런 이유로, 수성 용액 내에 존재하는 이온의 양이 증가하면, 용액은 더욱 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도에 대한 계측의 기본 단위는 Siemen (또는 mho), mho (mS/cm)이고, 그리고 전도도 미터, 예를 들면, Orion 전도도 미터의 다양한 모델을 이용하여 계측될 수 있다. 전기분해 전도도가 전류를 운반하는 용액 내에 이온의 능력이기 때문에, 용액의 전도도는 그 안에 이온의 농도를 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 가령, 용액 내에 완충제의 농도 및/또는 염 (가령, 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 염화칼륨)의 농도가 원하는 전도도를 달성하기 위해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액의 염 농도는 원하는 전도도를 달성하도록 변형된다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 부하 완충액은 약 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm 또는 20 mS/cm 중에서 한 가지보다 큰 전도도를 갖는다. 전도도는 약 1 mS/cm 및 20 mS/cm, 4 mS/cm 및 10 mS/cm, 4 mS/cm 및 7 mS/cm, 5 mS/cm 및 17 mS/cm, 5 mS/cm 및 10 mS/cm, 또는 5 mS/cm 및 7 mS/cm 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 전도도는 약 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm 또는 20 mS/cm 중에서 한 가지이다. 한 양상에서, 전도도는 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액의 전도도이다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상의 전도도는 동일하다. 일부 구체예에서, 부하 완충액의 전도도는 세척 완충액 및/또는 평형화 완충액의 전도도와 상이하다.

일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액의 전도도보다 작은 전도도를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 용리 완충액은 약 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 또는 7.0 mS/cm 중에서 한 가지보다 작은 전도도를 갖는다. 전도도는 약 0 mS/cm 및 7 mS/cm, 1 mS/cm 및 7 mS/cm, 2 mS/cm 및 7 mS/cm, 3 mS/cm 및 7 mS/cm, 또는 4 mS/cm 및 7 mS/cm, 0 mS/cm 및 5.0 mS/cm, 1 mS/cm 및 5 mS/cm, 2 mS/cm 및 5 mS/cm, 3 mS/cm 및 5 mS/cm, 또는 4 mS/cm 및 5 mS/cm 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 용리 완충액의 전도도는 약 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 또는 7.0 mS/cm 중에서 한 가지이다.

일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액의 전도도보다 큰 전도도를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 용리 완충액은 약 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 20.0 mS/cm, 21.0 mS/cm, 22.0 mS/cm, 23.0 mS/cm, 24.0 mS/cm, 25.0 mS/cm, 26.0 mS/cm, 27.0 mS/cm, 28.0 mS/cm, 29.0 mS/cm, 또는 30.0 mS/cm 중에서 한 가지보다 큰 전도도를 갖는다. 전도도는 약 5.5 mS/cm 및 30 mS/cm, 6.0 mS/cm 및 30 mS/cm, 7 mS/cm 및 30 mS/cm, 8 mS/cm 및 30 mS/cm, 9 mS/cm 및 30 mS/cm, 또는 10 mS/cm 및 30 mS/cm 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 용리 완충액의 전도도는 약 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 20.0 mS/cm, 21.0 mS/cm, 22.0 mS/cm, 23.0 mS/cm, 24.0 mS/cm, 25.0 mS/cm, 26.0 mS/cm, 27.0 mS/cm, 28.0 mS/cm, 29.0 mS/cm, 또는 30.0 mS/cm 중에서 한 가지이다. 상기 구체예 중에서 한 가지의 일부 양상에서, 용리 완충액의 전도도는 단계 구배에 의해 또는 선형 구배에 의해 부하 및/또는 세척 완충액으로부터 변하였다.

본 발명의 일부 구체예에서, 다중특이적 항체를 포함하는 용액은 약 <6.5 mS/cm의 전도도를 갖는 완충액에서 혼합 방식 크로마토그래피 물질 위에 부하되고, 그리고 상기 폴리펩티드는 약 1.5 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충액에서 크로마토그래피 물질로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 부하 완충액은 약 6.5 mS/cm의 전도도를 갖고, 그리고 용리 완충액은 약 3 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 부하 완충액은 약 5.5 mS/cm의 전도도를 갖고, 그리고 용리 완충액은 약 2 mS/cm의 전도도를 갖는다. 일부 구체예에서, 부하 완충액은 약 5.5 mS/cm의 전도도를 갖고, 그리고 용리 완충액은 약 1 mS/cm의 전도도를 갖는다. 상기 구체예의 추가 구체예에서, 크로마토그래피 물질은 Capto^TM 부착 수지이다.

상기 구체예 중에서 한 가지의 일부 양상에서, 용리 완충액의 전도도는 단계 구배에 의해 또는 선형 구배에 의해 부하 및/또는 세척 완충액으로부터 변하였다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체를 포함하는 조성물은 <6.5 mS/cm에서 혼합 방식 크로마토그래피 (가령, Capto^TM 부착 크로마토그래피) 위에 부하되고, 그리고 다중특이적 항체는 약 1.5 mS/cm까지 단계 전도도 구배에 의해 혼합 방식 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체를 포함하는 조성물은 <2.5 mS/cm에서 음이온 교환 크로마토그래피 (가령, QSFF 크로마토그래피) 위에 부하되고, 그리고 다중특이적 항체는 약 8.6 mS/cm까지 단계 전도도 구배에 의해 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체를 포함하는 조성물은 약 5.0 mS/cm에서 양이온 교환 크로마토그래피 (가령, POROS^® HS 50 크로마토그래피) 위에 부하되고, 그리고 다중특이적 항체는 약 27.5 mS/cm까지 단계 전도도 구배에 의해 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체를 포함하는 조성물은 수산화인회석 크로마토그래피 (가령, CHT 유형 I 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피) 위에 부하되고, 그리고 다중특이적 항체는 선형 전도도 구배에 의해 수산화인회석 크로마토그래피로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 약 10 mM 인산나트륨을 포함하는 수산화인회석 완충액 A에서 수산화인회석 크로마토그래피 위에 부하된다. 일부 구체예에서, 선형 구배는 약 10 mM 인산나트륨, 약 1 M 염화나트륨을 포함하는 수산화인회석 완충액 B를 점진적으로 첨가함으로써 형성된다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 완충액 A 및/또는 B는 약 pH 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 중에서 한 가지이다. 일부 구체예에서, 수산화인회석 완충액 A 및/또는 B는 약 pH 6.8이다. 일부 구체예에서, 용리 완충액은 구배에 걸쳐 수산화인회석 완충액 B 함량이 증가한다. 일부 구체예에서, 선형 구배는 약 0% 수산화인회석 완충액 B에서 시작하고 약 100% 수산화인회석 완충액 B에서 끝난다. 일부 구체예에서, 선형 구배는 약 10, 15, 20, 25 또는 30 칼럼 용적 (CV) 중에서 한 가지에 걸쳐 약 0% 수산화인회석 완충액 B에서 시작하고 약 100% 수산화인회석 완충액 B에서 끝난다. 일부 구체예에서, 선형 구배는 약 20 칼럼 용적 (CV)에 걸쳐 약 0% 수산화인회석 완충액 B에서 시작하고 약 100% 수산화인회석 완충액 B에서 끝난다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 부하 완충액은 약 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 중에서 한 가지보다 적은 pH를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 부하 완충액은 약 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 중에서 한 가지보다 큰 pH를 갖는다. 부하 완충액은 약 4 및 9, 4 및 8, 4 및 7, 5 및 9, 5 및 8, 5 및 7, 5 및 6 중에서 한 가지 사이의 pH를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 부하 완충액의 pH는 약 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 또는 8 중에서 한 가지이다. pH는 부하 완충액, 평형화 완충액, 또는 세척 완충액의 pH일 수 있다. 일부 구체예에서, 부하 완충액, 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상의 pH는 동일하다. 일부 구체예에서, 부하 완충액의 pH는 평형화 완충액 및/또는 세척 완충액의 pH와 상이하다.

일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액의 pH보다 적은 pH를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 용리 완충액은 약 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 중에서 한 가지보다 적은 pH를 갖는다. 용리 완충액의 pH는 약 4 및 9, 4 및 8, 4 및 7, 4 및 6, 4 및 5, 5 및 9, 5 및 8, 5 및 7, 5 및 6, 6 및 9, 6 및 8, 6 및 7 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 용리 완충액의 pH는 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0 중에서 한 가지이다.

일부 구체예에서, 용리 완충액은 부하 완충액의 pH보다 큰 pH를 갖는다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 용리 완충액은 약 5, 6, 7, 8, 또는 9 중에서 한 가지보다 큰 pH를 갖는다. 용리 완충액의 pH는 4 및 9, 5 및 9, 6 및 9, 7 및 9, 8 및 9, 4 및 8, 5 및 8, 6 및 8, 7 및 8, 4 및 7, 5 및 7, 그리고 6 및 7 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 용리 완충액의 pH는 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0 중에서 한 가지이다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체 또는 항체 팔을 포함하는 용액은 약 pH 7.7에서 친화성 크로마토그래피 (가령, 단백질 A 크로마토그래피) 위에 부하되고, 그리고 다중특이적 항체 또는 항체 팔은 약 2.9의 pH까지 단계 구배에 의해 친화성 크로마토그래피로부터 용리된다.

상기 구체예 중에서 한 가지의 일부 양상에서, 용리 완충액의 pH는 단계 구배에 의해 또는 선형 구배에 의해 부하 및/또는 세척 완충액으로부터 변하였다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 유속은 약 50 CV/시간, 40 CV/시간, 또는 30 CV/시간 중에서 한 가지보다 적다. 유속은 약 5 CV/시간 및 50 CV/시간, 10 CV/시간 및 40 CV/시간, 또는 18 CV/시간 및 36 CV/시간 중에서 한 가지 사이일 수 있다. 일부 구체예에서, 유속은 약 9 CV/시간, 18 CV/시간, 25 CV/시간, 30 CV/시간, 36 CV/시간, 또는 40 CV/시간 중에서 한 가지이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 유속은 약 100 cm/시간, 75 cm/시간, 또는 50 cm/시간 중에서 한 가지보다 적다. 유속은 약 25 cm/시간 및 150 cm/시간, 25 cm/시간 및 100 cm/시간, 50 cm/시간 및 100 cm/시간, 또는 65 cm/시간 및 85 cm/시간 중에서 한 가지 사이일 수 있다.

베드 높이는 이용된 크로마토그래피 물질의 높이이다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 베드 높이는 약 5 cm, 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 30 cm, 35 cm, 40 cm, 45 cm, 또는 50 cm 중에서 한 가지보다 크다. 일부 구체예에서, 베드 높이는 약 5 cm 및 50 cm 사이이다. 일부 구체예에서, 베드 높이는 부하 내에 폴리펩티드 또는 오염체의 양에 근거하여 결정된다.

일부 구체예에서, 크로마토그래피는 약 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1 L, 2 L, 3 L, 4 L, 5 L, 6 L, 7 L, 8 L, 9 L, 10 L, 25 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 400 L, 500 L, 600 L, 700 L, 800 L, 900 L 또는 100 L보다 큰 용적을 갖는 도관의 칼럼에 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 분획물은 크로마토그래피로부터 수집된다. 일부 구체예에서, 수집된 분획물은 약 0.01 CV, 0.02 CV, 0.03 CV, 0.04 CV, 0.05 CV, 0.06 CV, 0.07 CV, 0.08 CV, 0.09 CV, 0.1 CV, 0.2 CV, 0.3 CV, 0.4 CV, 0.5 CV, 0.6 CV, 0.7 CV, 0.8 CV, 0.9 CV, 1.0 CV, 2.0 CV, 3.0 CV, 4.0 CV, 5.0 CV, 6.0 CV, 7.0 CV, 8.0 CV, 9.0 CV, 또는 10.0 CV보다 크다. 일부 구체예에서, 산물, 예를 들면, 다중특이적 항체 또는 항체 팔을 내포하는 분획물은 모아진다. 분획물 내에 폴리펩티드의 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다; 예로서, 분획물 내에 폴리펩티드의 양은 UV 분광법에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 분획물은 OD₂₈₀이 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 및 1.0 중에서 한 가지보다 클 때 수집된다. 일부 구체예에서, 분획물은 OD₂₈₀이 약 0.5 및 1.0, 0.6 및 1.0, 0.7 및 1.0, 0.8 및 1.0, 또는 0.9 및 1.0 중에서 한 가지 사이일 때 수집된다. 일부 구체예에서, 검출가능한 다중특이적 항체 또는 항체 팔을 내포하는 분획물은 모아진다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 불순물은 산물 특이적 불순물이다. 산물 특이적 불순물의 실례는 비대칭 절반-항체, 비대칭 항체 사슬, 항체 단편, 동종이합체, 응집체, 고분자량 종류, 매우 높은 분자량 종류, 저분자량 종류, 그리고 항체의 전하 변이체, 예를 들면, 산성 변이체 및 염기성 변이체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 이들 방법은 비대칭 절반-항체 및/또는 동종이합체 (가령, 동일한 결합 도메인을 포함하는 대합된 절반-이합체)의 감소 또는 제거를 제공한다. 비대칭 절반-항체 및 동종이합체의 존재를 계측하는 방법은 당해 분야에서 공지된다; 예로서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체크로마토그래피 (HIC-HPLC)를 비롯한 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 절반-항체 및/또는 동종이합체의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. 절반-항체 및/또는 동종이합체의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 절반-항체 및/또는 동종이합체의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 절반-항체 및/또는 동종이합체의 양과 비교함으로써 결정된다.

응집된 폴리펩티드 (가령, 응집된 다중특이적 항체 또는 응집된 항체 팔)는 고분자량 (HMW) 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 응집된 폴리펩티드는 관심되는 폴리펩티드의 다합체이다. HMW 단백질은 이합체, 최대 8x 단위체, 또는 관심되는 더욱 큰 폴리펩티드일 수 있다. 응집된 단백질 (가령, HMW 단백질)을 계측하는 방법은 당해 분야에서 공지되고 실시예 섹션에서 설명된다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. 응집된 단백질의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. 응집된 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 응집된 단백질 (가령, HMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 응집된 단백질 (가령, HMW 단백질)의 양과 비교함으로써 결정된다.

단편 폴리펩티드는 저분자량 (LMW) 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 단편화된 폴리펩티드는 관심되는 다중특이적 항체 또는 항체 팔의 단편이다. LMW 단백질의 실례는 관심되는 항체의 Fab (단편 항원 결합), Fc (단편, 결정가능) 영역, 또는 양쪽 또는 임의의 무작위 단편화된 부분의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 단편화된 단백질 (가령, LMW 단백질)을 계측하는 방법은 당해 분야에서 공지되고 실시예 섹션에서 설명된다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. LMW 단백질의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. LMW 단백질의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 단편화된 단백질 (가령, LMW 단백질)의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 단편화된 단백질 (가령, LMW 단백질)의 양과 비교함으로써 결정된다.

항체의 산성 변이체는 항체의 pI가 선천적 무손상 항체의 pI보다 작은 변이체이다. 항체의 염기성 변이체는 항체의 pI가 선천적 무손상 항체의 pI보다 큰 변이체이다. 전하 변이체 (가령, 산성 및 염기성 변이체)는 항체의 자연 과정, 예를 들면, 산화, 탈아미드화, 리신 잔기의 C 말단 처리, N 말단 피로글루타메이트 형성 및 당화반응의 결과일 수 있다. 전하 변이체를 계측하는 방법은 당해 분야에서 공지된다; 예로서, 영상화 모세관 등전위 초점 (cIEF). 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 전하 변이체 (산성 및/또는 염기성 변이체)의 양은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. 전하 변이체 (산성 및/또는 염기성 변이체)의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 전하 변이체 (산성 및/또는 염기성 변이체)의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 전하 변이체의 양과 비교함으로써 결정된다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 불순물은 과정 특이적 불순물이다. 가령, 불순물은 숙주 세포 물질 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상일 수 있다; 샤프롱, 예를 들면, FkpA, DsbA 및 DspC; 침출된 단백질 A; 핵산; 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염체; 세포 배양 배지 성분, 카르복시펩티드분해효소 B, 젠타마이신 등. 일부 실례에서, 오염체는 예로서 하지만 제한 없이, 세균 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 세포, 곤충 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.

숙주 세포 단백질 (HCP)은 폴리펩티드가 생산된 세포로부터 단백질이다. 가령, ECP는 숙주 세포로부터 단백질, 다시 말하면, 대장균 (E. coli) 단백질이다. CHOP의 양은 효소 결합 면역흡착 검정 ("ELISA")에 의해 계측될 수 있다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, HCP (가령, ECP)의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. HCP의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, HCP의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 중에서 한 가지에서 감소된다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 HCP의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 HCP의 양과 비교함으로써 결정된다.

샤프롱 단백질, 예를 들면, FkpA, DsbA 및/또는 DsbC는 항체의 접힘 및 조립을 조장하기 위해 세포에서 항체의 생산에 종종 이용된다. 샤프롱은 FkpA, DsbA 또는 DsbC에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 ELISA에 의해 검출될 수 있다. 가령, 항체는 FkpA, DsbA 또는 DsbC의 초고순도 조성물에 대하여 산출될 수 있다. 일부 구체예에서, FkpA, DsbA 및/또는 DsbC는 질량 분광분석법에 의해 결정된다.

침출된 단백질 A는 이것이 결합되는 고체상으로부터 분리되거나 또는 세척된 단백질 A이다. 가령, 침출된 단백질 A는 단백질 A 크로마토그래피 칼럼으로부터 침출될 수 있다. 단백질 A의 양은 예로서, ELISA에 의해 계측될 수 있다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 중에서 한 가지보다 크게 감소된다. 침출된 단백질 A의 양은 약 10% 및 99%, 30% 및 95%, 30% 및 99%, 50% 및 95%, 50% 및 99%, 75% 및 99%, 또는 85% 및 99% 중에서 한 가지 사이에서 감소될 수 있다. 일부 구체예에서, 침출된 단백질 A의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 중에서 한 가지에서 감소된다. 일부 구체예에서, 감소는 정제 단계(들)로부터 회수된 조성물 내에 침출된 단백질 A의 양을 정제 단계(들) 전 조성물 내에 침출된 단백질 A의 양과 비교함으로써 결정된다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 바이러스 여과에 의해 더욱 정제된다. 바이러스 여과는 폴리펩티드 정제 피드스트림에서 바이러스 오염체의 제거이다. 바이러스 여과의 실례는 한외여과 및 미세여과를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 파보바이러스 필터를 이용하여 정제된다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 크로마토그래피 후 (가령, HIC 크로마토그래피 후 또는 양이온 교환 크로마토그래피 후) 농축된다. 농축 방법의 실례는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 한외여과 및 정용여과를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 첫 번째 한외여과, 정용여과 및 두 번째 한외여과에 의해 농축된다. 일부 구체예에서, 한외여과 및/또는 정용여과는 약 5 kDal, 10 kDal, 15 kDal, 20 kDal, 또는 25 kDal 중에서 한 가지보다 적은 컷오프를 갖는 필터를 이용한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 한외여과의 농축물은 제약학적 제제 내로 정용여과된다.

본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지의 일부 구체예에서, 이들 방법은 정제 방법의 정제된 폴리펩티드를 제약학적으로 허용되는 담체와 합동하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 한외여과/정용여과에 의해 제약학적 제제로 조제된다.

일부 구체예에서, 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체)의 농도는 약 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL, 또는 300 mg/mL 중에서 한 가지보다 크다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체의 농도는 약 10 mg/mL 및 20 mg/mL, 20 mg/mL 및 30 mg/mL, 30 mg/mL 및 40 mg/mL, 40 mg/mL 및 50 mg/mL, 50 mg/mL 및 60 mg/mL, 60 mg/mL 및 70 mg/mL, 70 mg/mL 및 80 mg/mL, 80 mg/mL 및 90 mg/mL, 90 mg/mL 및 100 mg/mL, 100 mg/mL 및 110 mg/mL, 110 mg/mL 및 120 mg/mL, 120 mg/mL 및 130 mg/mL, 130 mg/mL 및 140 mg/mL, 140 mg/mL 및 150 mg/mL, 150 mg/mL 및 160 mg/mL, 160 mg/mL 및 170 mg/mL, 170 mg/mL 및 180 mg/mL, 180 mg/mL 및 190 mg/mL, 190 mg/mL 및 200 mg/mL, 200 mg/mL 및 300 mg/mL 중에서 한 가지 사이이다.

XII. 제제 및 이들 제제를 만드는 방법

본원에서 설명된 방법에 의해 정제된 다중특이적 항체를 포함하는 제제 및 이들 제제를 만드는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 가령, 정제된 폴리펩티드는 제약학적으로 허용되는 담체와 합동될 수 있다.

일부 구체예에서 폴리펩티드 제제는 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩티드를 임의선택적 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).

본원에서 이용된 바와 같이, "담체"는 이용된 용량 및 농도에서 거기에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충된 용액이다.

허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 이용된 용량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 그리고 완충액, 예를 들면, 인산염, 구연산염 및 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (가령, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물, 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개보다 적은 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 그리고 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (가령, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

일부 구체예에서, 폴리펩티드 제제 내에 폴리펩티드는 기능적 활성을 유지한다.

생체내 투여에 이용되는 제제는 무균이어야 한다. 이것은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

본원에서 제제는 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 부정적인 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 또한 내포할 수 있다. 가령, 폴리펩티드에 더하여, 한 제제 내에 추가 폴리펩티드 (가령, 항체)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 조성물은 화학요법 작용제, 세포독성 작용제, 사이토킨, 성장 저해제, 항-호르몬 작용제 및/또는 심장보호제를 더욱 포함할 수 있다. 이런 분자는 의도된 목적에 효과적인 양에서 합동으로 적절히 존재한다.

XIII. FkpA를 발현하는 세포에서 생산된 폴리펩티드의 조성물

일부 양상에서, 본 발명은 FkpA를 발현하는 숙주 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물에서 재조합 폴리펩티드는 FkpA를 포함하는 숙주 세포 단백질로부터 정제되었다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는 숙주 세포에서 생산된 재조합 폴리펩티드 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적거나 또는 이내의 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.2 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.1 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지의 농도에서 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 FkpA의 농도에서 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.2 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.1 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5 mg/ml 및 약 100 mg/ml, 약 50 mg/ml 및 약 150 mg/ml, 약 100 mg/ml 및 약 200 mg/ml, 약 150 mg/ml 및 약 250 mg/ml, 약 200 mg/ml 및 약 300 mg/ml 사이에; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 FkpA의 농도에서 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.2 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.1 ppm FkpA를 포함한다.

일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적거나 또는 이내의 DsbA 및/또는 DsbC를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지의 농도에서 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 DsbA 및/또는 DsbC의 농도에서 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5 mg/ml 및 약 100 mg/ml, 약 50 mg/ml 및 약 150 mg/ml, 약 100 mg/ml 및 약 200 mg/ml, 약 150 mg/ml 및 약 250 mg/ml, 약 200 mg/ml 및 약 300 mg/ml 사이에; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 DsbA 및/또는 DsbC의 농도에서 재조합 폴리펩티드를 포함한다. DsbA 및 DsbC를 검출하는 시약 및 방법은 본원에 전체적으로 참조로서 편입되는 U.S. 가출원 번호 62/129,701에 의해 제공된다.

일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 다중특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 이중특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는; 예를 들면, 외인성 FkpA를 발현하는 세포에서 생산된 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는 세포에서 생산된 다중특이적 항체를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 FkpA가 본질적으로 없다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는 세포에서 생산된 다중특이적 항체를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm보다 적은 FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.2 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.1 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지의 농도에서 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 FkpA의 농도에서 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.2 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.1 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5 mg/ml 및 약 100 mg/ml, 약 50 mg/ml 및 약 150 mg/ml, 약 100 mg/ml 및 약 200 mg/ml, 약 150 mg/ml 및 약 250 mg/ml, 약 200 mg/ml 및 약 300 mg/ml 사이에; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 FkpA의 농도에서 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.2 ppm FkpA를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 0.1 ppm FkpA를 포함한다.

일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는; 예를 들면, 외인성 FkpA, DsbA 및/또는 DsbC를 발현하는 세포에서 생산된 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는 세포에서 생산된 다중특이적 항체를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 FkpA가 본질적으로 없다. 일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는 세포에서 생산된 다중특이적 항체를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm보다 적은 DsbA 및/또는 DsbC를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지의 농도에서 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 최소한 약 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml 중에서 한 가지; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 DsbA 및/또는 DsbC의 농도에서 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5 mg/ml 및 약 100 mg/ml, 약 50 mg/ml 및 약 150 mg/ml, 약 100 mg/ml 및 약 200 mg/ml, 약 150 mg/ml 및 약 250 mg/ml, 약 200 mg/ml 및 약 300 mg/ml 사이에; 그리고 약 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 9 ppm, 8 ppm, 7 ppm, 6 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 또는 0.1 ppm 중에서 한 가지보다 적은 DsbA 및/또는 DsbC의 농도에서 다중특이적 항체를 포함한다.

일부 구체예에서, 조성물은 FkpA를 발현하는 세포에서 생산된 이중특이적 항체를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 FkpA가 본질적으로 없다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 첫 번째 절반 항체 및 두 번째 절반 항체를 포함하고, 여기서 첫 번째 절반-항체는 IL-17에 결합하는 첫 번째 VH/VL 단위를 포함하고 두 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하는 두 번째 VH/VL 단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하지 않고, 그리고 여기서 두 번째 절반 항체는 IL-17에 결합하지 않는다. 일정한 특정한 구체예에서, 본원에서 제공된 다중특이적 항체는 IL-17AA, IL-17AF 및 IL-17FF에 결합하고, IL-17AA-, IL-17AF- 및 IL-17FF-유도된 활성을 저해하고, 그리고 IL-13-유도된 활성을 저해한다. 일정한 이런 구체예에서, 항-IL-13/IL-17AA, AF 및 FF 이중특이적 항체는 IL-17A 또는 IL-17F 단독에 의해 유도된 활성과는 대조적으로, IL-17A 및 F 사이토킨 모두에 의해 유도된 활성을 유리하게 차단한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 다중특이적 항체는 IL-17AA, IL-17AF 및 IL-17FF에 결합한다. 일부 구체예에서, IL-17AA-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-17AA-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 구체예에서, IL-17AF-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-17AF-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 이런 구체예에서, IL-17FF-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-17FF-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 구체예에서, IL-13-유도된 활성은 생체내에서 또는 시험관내에서 세포의 IL-13-유도된 유전자 발현 및/또는 증식이다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 다중특이적 항체는 IL-13Rα1에 대한 IL-13의 결합을 저해하지 않는다.

일부 구체예에서, 조성물에서 항-IL13/IL17AA AF FF 이중특이적 항체는 첫 번째 절반 항체 및 두 번째 절반 항체를 포함하고, 여기서 첫 번째 절반-항체는 IL-17AA, AF 및 FF에 결합하는 첫 번째 VH/VL 단위를 포함하고 두 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하는 두 번째 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 첫 번째 VH/VL 단위는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하고, 그리고 여기서 두 번째 VH/VL 단위는 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 IL-13에 결합하지 않고, 그리고 두 번째 절반 항체는 IL-17에 결합하지 않는다.

일부 구체예에서, 첫 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:21의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열 번호: 22의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함하고, 그리고 여기서 두 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:10의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열에 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체가 제공되는데, 여기서 첫 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:21의 아미노산 서열을 갖는 VH 서열 및 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 VL 서열을 포함하고, 그리고 여기서 두 번째 VH/VL 단위는 서열 번호:10의 아미노산 서열을 갖는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 갖는 VL 서열을 포함한다.

일정한 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL17AA AF 및 FF에 결합하고, 그리고 두 번째 절반 항체는 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL13에 결합한다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 절반 항체는 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL17AA AF 및 FF에 결합하고, 그리고 두 번째 절반 항체는 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 IL13에 결합한다.

일부 구체예에서, 다중특이적 항체는 절반-항체를 본원에서 설명된 바와 같이 조립함으로써 제조된다. 절반-항체는 이들 절반-항체의 2개의 사슬을 발현하도록 숙주 세포를 배양함으로써 원핵 숙주 세포에서 생산되고, 여기서 발현 시에 이들 2개의 사슬은 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적으로 절반 항체를 형성한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 대장균 (E. coli) 숙주 세포이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 폴리펩티드의 첫 번째 사슬을 인코딩하는 첫 번째 번역 단위, 폴리펩티드의 두 번째 사슬을 인코딩하는 두 번째 번역 단위; 그리고 펩티딜-프로릴 이성화효소 (가령, FkpA), 단백질 이황화물 산화환원 효소 (가령, DsbA 및 DsbC)로 구성된 군에서 선택되는 최소한 하나의 샤프롱 단백질을 인코딩하는 번역 단위를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 번역 단위는 동일한 폴리펩티드 분자 또는 상이한 폴리펩티드 분자, 또는 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 가령, 첫 번째와 두 번째 번역 단위는 첫 번째 폴리펩티드 분자 상에 있을 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 샤프롱 단백질을 인코딩하는 번역 단위는 두 번째 폴리펩티드 분자 상에 있을 수 있다. 숙주 세포는 성장 온도 및 성장 교반 비율을 포함하는 성장기, 그리고 생산 온도 및 생산 교반 비율을 포함하는 생산기를 포함하는 조건 하에 배양 배지에서 배양된다. 일부 구체예에서, 성장 온도는 생산 온도보다 2 내지 10℃ 높고, 그리고 성장 교반 비율은 생산 교반 비율보다 50 내지 250 rpm 높다. 절반-항체는 세포로부터 회수되고 앞서 설명된 바와 같이 조립된다. 일부 구체예에서, 절반-항체는 조립에 앞서 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된다. 본원에 전체적으로 참조로서 편입된 US 가출원 번호 62/075,792를 참조한다.

조립된 다중특이적 항체는 예로서, FkpA를 비롯한 불순물을 제거하기 위해 더욱 정제된다. 일부 구체예에서, 조립된 다중특이적 항체는 혼합 방식 크로마토그래피 (가령, 음이온 교환 혼합 방식 크로마토그래피), 그 이후에 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, 조립된 다중특이적 항체는 혼합 방식 크로마토그래피 (가령, 음이온 교환 혼합 방식 크로마토그래피), 그 이후에 음이온 교환 크로마토그래피, 그 이후에 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, 조립된 다중특이적 항체는 혼합 방식 크로마토그래피 (가령, 음이온 교환 혼합 방식 크로마토그래피), 그 이후에 음이온 교환 크로마토그래피, 그 이후에 소수성 상호작용 크로마토그래피, 그 이후에 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, 정제된 다중특이적 항체는 본원에서 설명된 검정을 이용하여 FkpA의 제거에 대해 분석된다.

XIV. 제조 물품 및 키트

본원에서 설명된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 (가령, 다중특이적 항체) 및/또는 본원에서 설명된 방법에 의해 정제된 폴리펩티드를 포함하는 제제는 제조 물품 내에 내포될 수 있다. 일부 구체예에서, 제조 물품은 본원에서 설명된 초고순도 FkpA 폴리펩티드를 이용하여 산출된 항체를 포함한다. 제조 물품은 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 내포하는 용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제조 물품은 (a) 용기 내에 본원에서 설명된 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 용기; 및 (b) 제제를 개체에 투여하기 위한 사용설명서가 있는 포장 삽입물을 포함한다.

제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 이들 용기는 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 제제를 유지하거나 또는 내포하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (가령, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물에서 최소한 하나의 활성제는 폴리펩티드이다. 표지 또는 포장 삽입물은 제공되는 폴리펩티드 및 임의의 다른 약물의 투약 양 및 간격에 관한 특정한 보도와 함께 개체에서 조성물의 이용을 지시한다. 제조 물품은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 용기는 주사기이다. 일부 구체예에서, 주사기는 주사 장치 내에 더욱 내포된다. 일부 구체예에서, 주사 장치는 자기주사기이다.

"포장 삽입물"은 치료적 산물의 이용과 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 금기, 포장된 산물과 합동되는 다른 치료적 산물 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포하는, 이런 치료적 산물의 상업적인 포장에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는데 이용된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 세균 세포로부터 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물에서 FkpA의 검출을 위한 키트를 제공하는데, 여기서 상기 키트는 본원에서 설명된 바와 같은 항-FkpA 항체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 세균 세포로부터 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물에서 FkpA의 검출을 위한 키트를 제공하고, 여기서 이들 키트는 본원에서 설명된 바와 같은 항-FkpA 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 세균 세포로부터 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물에서 FkpA의 검출을 위한 키트를 제공하고, 여기서 상기 세균 세포 (가령, 대장균 (E. coli) 세포)는 FkpA를 발현한다. 일부 구체예에서, 키트는 사용설명서를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 표본 내에서 FkpA를 정량하기 위한 표준 곡선을 산출할 때 참고 표준으로서 이용을 위한 초고순도 FkpA를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 표본 내에 FkpA를 검출하는 검정에서 양성 대조로서 이용을 위한 초고순도 FkpA를 더욱 포함한다.

본 명세서에서 개시된 모든 특질은 임의의 조합에서 합동될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 각 특질은 동일한, 동등한, 또는 유사한 목적에 이바지하는 대안 특질에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않으면, 개시된 각 특질은 동등한 또는 유사한 특질의 포괄적 계열의 단지 실례일 뿐이다.

본 발명의 추가 상세는 다음의 무제한적 실례에 의해 예시된다. 본 명세서에서 모든 참고문헌의 개시는 명시적으로 본원에 참조로서 편입된다.

실시예

아래의 실시예는 본 발명의 순수한 예시인 것으로 의도되고, 그리고 이런 이유로, 본 발명을 어떤 방식으로도 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 다음 실시예 및 상세한 설명은 제한이 아닌 예시의 방식에 의하여 제공된다.

실시예 1. 대장균 ( E. coli ) 단백질에 대한 검정은 FkpA를 적절하게 계측하지 못한다.

FkpA는 전형적으로 높은 수준에서 발현되지 않는 대장균 (E. coli)에서 샤프롱 단백질이지만, FkpA를 과다발현하는 대장균 (E. coli)은 항체를 비롯한 이형다합체성 진핵 단백질의 적절한 조립 및 접힘을 향상시키는데 이용되었다 (Zhang et al., 2003, BioTechniques, 35:1032-1042).

대장균 (E. coli) 단백질 (ECP)에 대한 검정이 FkpA의 존재를 적절하게 검출하고 정량할 수 있는 지를 결정하기 위해, 초정제된 FkpA의 표본 (실시예 2를 참조한다)이 상이한 농도에서 검정 희석제 (0.15M NaCl/0.1 M NaPO4/0.1% 어류 젤라틴/0.05% 폴리소르베이트 20/0.05% 프로클린 300)에 첨가되고 ECP 검정에서 시험되었다 (Zhu-Shimoni, J. et al., 2014, Biotech and Bioeng. 111:2367-2379). 소 혈청 알부민은 대장균 (E. coli) 단백질에 대한 검정이 이러한 포유류 단백질을 검출하지 못할 것이기 때문에, 음성 대조로서 이용되었다. 결과는 표 4에서 도시된다.

표 4. ECP 검정 검출.

FkpA			소 혈청 알부민
이론적 (μg/mL)	관찰된 (μg/mL)	% 회수	이론적 (μg/mL)	관찰된 (μg/mL)	% 회수
1000.0	15.9	1.6	2000.0	LTR	ND
500.0	8.6	1.7	1000.0	LTR	ND
250.0	4.5	1.8	500.0	LTR	ND
125.0	2.0	1.6	250.0	LTR	ND
62.5	0.8	1.3	125.0	LTR	ND
31.3	0.1	0.3	62.5	LTR	ND
15.6	LTR	ND	31.3	LTR	ND
7.8	LTR	ND	15.6	LTR	ND

LTR = 범위보다 적음, ND = 검출되지 않음

이들 결과는 ECP 검정이 FkpA를 적절하게 검출하고 정량하지 못한다는 것을 보여준다. 게다가, 대장균 (E. coli)에서 제조된 치료적 단백질에 대한 방출 검정의 일부로서 대장균 (E. coli) 잔존물 (가령, 대장균 (E. coli) 단백질 및 핵산)을 검출하는 상업적인 검정은 FkpA를 특이적으로 확인하지 못한다. 따라서, FkpA 검출 검정을 간섭할 수 있는 다른 대장균 (E. coli) 단백질 및/또는 핵산에 최소 반응성으로, FkpA에 고도로 특이적인 다중클론 항체를 산출하는 것이 요구된다. 이에 더하여, FkpA의 초고순도 제조물은 치료적 폴리펩티드 제조물에서 FkpA의 정확한 검출을 위한 FkpA 표준의 산출에서 및 연구와 상업용 폴리펩티드 생산을 위한 검정 품질을 담보하기 위한 FkpA 양성 대조의 산출에서 유용하다.

실시예 2. 초고순도 FkpA의 제조

재료와 방법

추출 단계

FkpA는 대장균 (E. coli) (66F8로 명명된 W3110 유도체: △fhuA △phoA ilvG2096 (Valr) △prc spr43H1 △degP △manA lacIQ △ompT △menE)에서 발현되었다. 그렇게 하기 위해, EP1356 052 (가령, 실시예 9-10, 특히 단락 [0207]을 참조한다)에서 설명된 바와 같이, FkpA에 대한 ORF를 내포하는 양립성 플라스미드 (pACYC, Novagen, Madison, WI)가 작제되었다. 0.5 mL의 동결된 보존 배양액 (10-15% DMSO를 내포)은 해동되고, 그리고 2 mL의 카나마이신 용액 (5 mg/mL) 및 2.5 mL 1 M 인산나트륨 용액으로 보충된 500 mL의 콩 LB 배지를 내포하는 2L 진탕 플라스크를 접종하는데 이용되었다. 배양액은 대규모 배양액으로 확대되었다. 200 mM IPTG의 50 mL 일시 주사 첨가가 200의 근사 OD에서 발효물에 첨가되었다. IPTG는 FkpA 개방 해독틀 (ORF)의 발현을 제어하는데 이용된 tacII 프로모터를 유도하는데 이용되었다. 발효 실행 지속 기간은 50 시간이었다.

모든 세포 용해 및 원심분리 단계는 달리 언급되지 않으면, 2-8℃에서 실행되었다.

10 L 대장균 (E. coli) 발효물로부터 회수된 304 g 분취량의 세포 페이스트는 하룻밤 동안 해동되었다. 세포 페이스트는 10 용적의 25 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), pH 6.0 (용해 완충액)에서 현탁되고 60 분 동안 혼합되어 균일한 현탁액이 산출되었다. 온도 제어 장치 (≤ 5℃의 초기 설정값)가 구비된 미세유동화기 HC-8000 균질기 (Microfluidics Corporation)가 세포 용해에 이용되었다. 미세유동화기는 세포 현탁액의 도입에 앞서 1 L의 냉각된 용해 완충액으로 헹굼되었다. 세포 현탁액은 미세유동화기로 이전되었고, 그리고 집 압력 (6 - 8 K psi) 하에 총 4회 통과가 실행되었다. 잔여 현탁액은 냉각된 용해 완충액을 이용하여 미세유동화기로부터 추적되었다. 용해된 세포 현탁액의 200 mL 분취량이 원심분리 및 차후 정제를 위해 채취되었다. 나머지 ~ 3.2 L의 균질액은 ≤ -60℃에서 보관되었다.

200 mL 분취량은 6개의 동등한 용적으로 나눠지고 50 mL 원심분리기 튜브 내로 이전되었다. 이들 튜브는 20℃의 온도에서 30 분 동안 15,000 rpm의 속도에서, SS-34 회전자 (Thermo Corporation)가 구비된 RC6 플러스 원심분리기를 이용하여 원심분리되었다. FkpA를 내포하는 상층액은 2-8℃의 온도에서 보관되었고, 그리고 펠렛은 폐기되었다.

SP Sepharose^® 유동 양이온-교환 크로마토그래피의 분석적 평가

FkpA의 계산된 등전점 (pI) (성숙 단백질의 아미노산 서열에 근거됨)은 7.01이다. pH 6.0에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피는 표적 단백질의 우수한 결합을 야기할 것이고, 반면 대다수의 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP) 불순물 (3-6의 pI 값을 가짐)은 칼럼을 관류할 것이다.

이러한 잠재적 첫 번째 크로마토그래피 단계의 분석적 평가는 강한 양이온-교환 배지 SP Sepharose^® 패스트 플로우 (GE Healthcare)로 충전된 1 mL 중력-유동 칼럼을 이용하여 수행되었다.

칼럼은 3 칼럼 용적 (CV)의 50 mM MES, 1.0 M NaCl, pH 6.0 (용리 완충액)으로 전평형화되고, 그리고 이후, 3 CV의 50 mM MES, pH 6.0 (평형화 완충액)으로 평형화되었다. 1.0 mL 분취량의 용해물 상층액, 그 이후에 평형화 완충액과 함께 5 CV 세척액이 칼럼에 부하되었다. 칼럼은 100 mM로부터 1000 mM으로 증가하는 NaCl 농도 (평형화 및 용리 완충액을 혼합함으로써 만들어짐)를 이용하여 단계 용리되었다.

이황화 결합 환원이 없는 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (SDS-PAGE)이 칼럼 분획물에서 FkpA의 상대적 순도를 결정하는데 이용되었다. 결과는 FkpA가 이들 조건 하에 양이온 교환 배지에 완전하게 결합된다는 것을 증명한다 (관류 및 세척 분획물에서 FkpA의 결여에 의해 증거된 바와 같이) (도면 1, 레인 2 및 3). FkpA는 100 mM NaCl 단계에 의해 칼럼으로부터 완전하게 용리되었는데, 이것은 FkpA가 양이온-교환 배지에 약하게 결합된다는 것을 지시하고, 그리고 대다수의 ECPs가 칼럼을 관류한다는 가설을 확증한다. 결과의 FkpA-내포 풀은 매우 깨끗하고, 단지 미량의 잔여 ECPs만 존재한다 (도면 1, 레인 4).

SP Sepharose ^® 유동 양이온-교환 크로마토그래피의 단계 용리 평가

SP Sepharose^® 패스트 플로우 양이온-교환 크로마토그래피를 이용한 FkpA 정제의 예비 평가는

KTA Explorer 100 (GE Healthcare)에서 행위되었다. 2.6 cm (너비) x 27.3 cm (길이) 칼럼 (1 CV = 145 mL)이 이러한 작업에 이용되었다. 모든 단계는 8.85 mL/분 (100 cm/시간)의 유속에서 실행되었다. 칼럼은 3 CV의 용리 완충액 (25 mM MES, 1.0 M NaCl, pH 6.0)으로 전평형화되고, 그리고 이후, 3 CV의 평형화 완충액 (25 mM MES, pH 6.0)으로 평형화되었다. 용해물 상층액은 칼럼에 부하되고 20 mL의 평형화 완충액으로 추적되었다. 칼럼은 5 CV의 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, 50 mM MES, 100 mM NaCl, pH 6.0으로 단계 용리되었다. 단계 용리 이후에, 칼럼은 3 CV의 용리 완충액으로 스트리핑되었다.

크로마토그램은 도면 2에서 도시된다. 칼럼 분획물의 SDS-PAGE 분석 (도면 3a 및 3b)은 FkpA가 주요 용리 피크와 연관되고, 그리고 분획물 11-17에서 일차적으로 발견된다는 것을 보여준다. 또한, 분획물 18-23에서 미량의 FkpA가 존재한다.

SP Sepharose^® 유동 양이온-교환 크로마토그래피의 구배 용리 평가

잔여 ECPs를 제거하는 SP Sepharose^® 패스트 플로우의 잠재력을 더욱 평가하기 위해, 첫 번째 예비 평가로부터 분획물 11-18의 재-크로마토그래피가 실행되었다.

분획물 11-18은 모아지고, 그리고 Sephadex^® G-25를 이용하여 SP Sepharose^® 패스트 플로우 평형화 완충액 내로 역으로 완충액-교환되었다.

완충액-교환된 분획물은 동일한 부하 및 세척 파라미터에 따라서, 앞선 예비 실행에서 이용된 동일한 SP Sepharose^® 패스트 플로우 칼럼에서 재-크로마토그래프되었다. 용리는 9 CV에 걸쳐 0 - 30% 구배 (0 - 300 mM NaCl)를 이용하여 실행되었는데, 이것은 FkpA의 본래 단계 용리에 필요한 상대적 염 양을 고려한 것이다.

크로마토그램 (도면 4)은 상대적으로 낮은 (5-11 mS/cm) 이온 강도 조건 하에 용리하는 큰 주요 피크를 보여준다. 구배 프로필은 더욱 작은 프리피크의 부재 (이들 분획물은 재-크로마토그래피를 위해 선택된 것들에 포함되지 않았다)로, 단계 용리 프로필에 강한 유사성을 보여준다 (도면 2).

용리 프로필의 SDS-PAGE 분석. FkpA에 비하여 ECP 띠의 검사는 이들 불순물 중에서 일부의 단지 부분적인 분해능만 선형 구배를 이용함으로써 달성된다는 것을 보여준다 (데이터 제시되지 않음). 이것은 아마도, 이들 ECP가 FkpA에 필적하는 pI 값을 가질 수 있거나, 또는 상호작용의 일부 다른 방식(들)이 이들의 공동정제를 책임질 수 있다는 것을 지시한다.

잠재적 두 번째 정제 단계의 분석적 평가: Q Sepharose^® 패스트 플로우 및 페닐 Sepharose^®의 비교

Q Sepharose ^® 패스트 플로우

이러한 잠재적 두 번째 크로마토그래피 단계의 분석적 평가는 강한 음이온-교환 배지 Q Sepharose^® 패스트 플로우 (QSFF) (GE Healthcare)로 충전된 1 mL 중력-유동 칼럼을 이용하여 수행되었다.

칼럼은 5 mL의 50 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH 8.0 (QSFF 용리 완충액)으로 전평형화되고, 그리고 이후, 5 mL의 50 mM Tris, pH 8.0 (QSFF 평형화 완충액)으로 평형화되었다. 앞서 설명된 SP Sepharose^®의 구배 평가로부터 분획물 22-50의 미니-풀의 2.5 mL 분취량은 PD-10 칼럼 (GE Healthcare)을 이용하여 3.5 mL의 QSFF 평형화 완충액 내로 완충액-교환되고 칼럼에 부하되었다. 칼럼은 3.5 mL QSFF 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 차후에, 3.0 mL의 QSFF 용리 완충액으로 용리되었다.

QSFF 및 페닐 Sepharose^®의 평가로부터 칼럼 분획물 (아래에 설명됨)은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다 (도면 5). Q Sepharose^® 칼럼은 FkpA에 결합하지 않지만, 칼럼에 결합된 더욱 높은 분자량 (MW) 종류 중에서 3가지를 제거할 수 있었다. 하지만, ~ 35 kDa, ~ 40 kDa 및 ~ 26 kDa에서 띠는 칼럼 관류에서 FkpA와 함께 여전히 검출될 수 있다. 회수 데이터는 표 5 및 6에서 요약된다. Q Sepharose^® 패스트 플로우 겔은 우수한 전반적인 회수 (95%)를 제공하였다.

표 5. QSFF 및 페닐 Sepharose^® 칼럼 분획물로부터 분광측량 데이터

표본	희석 인자	FkpA (mg/mL)	Abs <280 nm>	Abs <320 nm>
PW 블랭크	1.0	1.1656E-3	-8.3447E-5	-7.1287E-4
SP 풀	1.0	1.51360	0.82628	8.9335E-3
Q F-T/세척	1.0	0.46137	0.24948	3.4523E-4
Q 스트립	1.0	0.12278	6.5184E-2	-1.1196E-3
Ph F-T/W	1.0	6.8952E-2	3.2589E-2	-4.6453E-3
Ph 0.5 M W	1.0	1.8189E-2	7.5068E-3	-2.3150E-3
Ph 0.4 M W	1.0	2.3830E-2	1.1497E-2	-1.3714E-3
Ph 0.3 M W	1.0	2.0948E-2	8.4639E-3	-2.8481E-3
Ph 0.2 M W	1.0	1.8924E-2	9.6922E-3	-5.2691E-4
Ph 0.1 M W	1.0	3.4419E-2	2.0305E-2	1.7190E-3
Ph 0 M W	1.0	0.14326	8.2129E-2	4.7674E-3
Ph PW 스트립	1.0	0.20207	0.11301	3.8896E-3

FkpA (mg/mL)=(Abs(280 nm) - Abs (320 nm))/0.54

표 6. Q Sepharose^® 패스트 플로우 회수 데이터

분획물	용적 (mL)	농도 (mg/mL)	mg	% 회수
SP 미니-풀 분획물. 22-50	2.5	1.51	3.8	100%
F-T/세척	7.0	0.46	3.2	85%
1 M NaCl 스트립	3.0	0.12	0.4	10%
질량 균형			3.6	95%

페닐 Sepharose ^®

이러한 잠재적 두 번째 크로마토그래피 단계의 분석적 평가는 소수성 반복 배지 페닐 Sepharose^® 패스트 플로우 (낮은 치환) (GE Healthcare)로 충전된 1 mL 중력-유동 칼럼을 이용하여 수행되었다.

칼럼은 5 mL의 50 mM 인산염, pH 7.0 (페닐 용리 완충액)으로 전평형화되고, 그리고 이후, 5 mL의 0.6 M 황산나트륨, 50 mM 인산염, pH 7.0 (페닐 평형화 완충액)으로 평형화되었다. 2.5 mL의 1.2 M 황산나트륨이 앞서 설명된 SP Sepharose^®의 구배 평가로부터 분획물 22-50의 미니-풀의 2.5 mL 분취량에 첨가되었다. 미니-풀은 온건하게 혼합되고, 그리고 실온에서 30 분 동안 그 상태로 유지되도록 허용되고, 그리고 이후, 칼럼에 부하되었다. 칼럼은 3.0 mL 페닐 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 차후에, 페닐 용리 완충액에서 3.0 mL 용적의 감소하는 황산나트륨 (0.5 M, 0.4 M, 0.3 M, 0.2 M, 0.1 M 및 0 M)으로 단계 용리되었다. 마지막으로, 칼럼은 3.0 mL의 정제수 (PW)를 이용하여 스트리핑되었다.

페닐 Sepharose^® (낮은 치환) 겔은 Q Sepharose^® 패스트 플로우와 반대의 행동을 보여주었다: QSFF에 결합된 불순물은 페닐 Sepharose^® (낮은 치환) 칼럼을 관류할 수 있다. QSFF에서 FkpA와 공동정제된 ~ 35 kDa 띠 역시 페닐 Sepharose^® 칼럼을 관류한다. FkpA는 감소하는 염 프로필에서, 0 M 황산나트륨에서 뿐만 아니라 PW 스트립에서 매우 늦게 용리되는데, 이러한 결과는 이것이 매우 소수성이라는 것을 지시한다. FkpA-내포 분획물은 SP Sepharose^® 패스트 플로우 풀에서 존재하였던 ECP 불순물을 결여하는 것으로 보인다. 회수 데이터는 표 5 및 6에서 요약된다. 페닐 Sepharose^® 패스트 플로우 (낮은 치환) 겔은 단지 51%만 회수할 수 있었다. 나머지 단백질은 아마도, 칼럼에 결합되는데, 이것은 페닐 Sepharose^® (낮은 치환) 겔이 FkpA에 너무 밀착하여 결합한다는 것을 지시한다. 페닐 Sepharose^® 패스트 플로우 (낮은 치환)는 잔여 ECP를 성공적으로 제거할 수 있긴 했지만, 회수가 더욱 낮았다.

표 6. 페닐 Sepharose^® (낮은 치환) 회수 데이터

잠재적 두 번째 정제 단계의 분석적 평가: 페닐 Sepharose ^® , 부틸 Sepharose ^® 및 옥틸 Sepharose ^® 의 비교

정제의 두 번째 단계를 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)의 잠재력이 증명되었기 때문에; 상이한 소수성을 갖는 3가지 HIC 배지를 비교하는 두 번째 평가가 수행되었다: 페닐 Sepharose^® (낮은 치환), 옥틸 Sepharose^® 패스트 플로우, 그리고 부틸 Sepharose^® 4 패스트 플로우 (GE Healthcare).

크로마토그래피는 추가 단계와 함께 페닐 Sepharose^®에 대해 앞서 설명된 바와 같이 각 칼럼에서 수행되었는데, 상기 추가 단계에서 3.0 mL의 정제수 (PW)를 이용한 칼럼의 스트리핑 이후에, 각 칼럼이 3 mL의 2% 수산화나트륨을 이용하여 재생되었다.

각 칼럼으로부터 칼럼 재생 분획물은 비교되었다 (표 7 및 8). 상이한 칼럼은 FkpA에 대하여 증가하는 소수성의 순서로 표 7 및 8에서 열거된다. 부틸 Sepharose^® 4 패스트 플로우 겔은 3개 중에서 가장 낮은 재생 값 (15%)을 갖고, 반면 옥틸 Sepharose^® 패스트 플로우 및 페닐 Sepharose^® 패스트 플로우 (낮은 치환)는 각각, 45 및 56% 회수를 보여준다. 이런 이유로, 옥틸 Sepharose^® 패스트 플로우 및 페닐 Sepharose^® 패스트 플로우 (낮은 치환) 겔은 두 번째 크로마토그래피 단계로서 이용하기에는 너무 소수성이다.

표 7. 칼럼 재생 분획물로부터 분광측량 데이터

표본	희석 인자	FkpA (mg/mL)	Abs <280 nm>	Abs <320 nm>
PW 블랭크	1.0	-5.6867E-4	6.1989E-5	3.6907E-4
부틸 재생	1.0	0.18870	0.10798	6.0782E-3
옥틸 재생	1.0	0.56642	0.31557	9.7098E-3
페닐 재생	1.0	0.70106	0.38781	9.2392E-3

FkpA (mg/mL)=(Abs(280 nm) - Abs (320 nm))/0.54

표 8. HIC Gel 재생

분획물	용적 (mL)	농도 (mg/mL)	mg	% 회수
SP 미니 22-50	2.5	1.51	3.8	100%
부틸 재생	3.0	0.19	0.6	15%
옥틸 재생	3.0	0.57	1.7	45%
페닐 재생	3.0	0.70	2.1	56%

잠재적 두 번째 정제 단계의 분석적 평가: 부틸-S Sepharose ^® 6 패스트 플로우

변하는 소수성을 갖는 3가지 HIC 배지의 비교 이후에; 추가 HIC 겔이 평가되었다: 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 (GE Healthcare). 이러한 겔은 평가된 HIC 겔의 크로마토그래피 배지에서 가장 약한 HIC 리간드를 갖는다.

1 mL 중력-유동 칼럼은 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 (GE Healthcare)로 충전되었다. 칼럼은 5 mL의 50 mM 인산염, pH 7.0 (부틸-S 용리 완충액)으로 전평형화되고, 그리고 이후, 5 mL의 0.6 M 황산나트륨, 50 mM 인산염, pH 7.0 (부틸-S 평형화 완충액)으로 평형화되었다. 2.5 mL의 1.2 M 황산나트륨이 앞서 설명된 SP Sepharose^®의 구배 평가로부터 분획물 22-50의 미니-풀의 2.5 mL 분취량에 첨가되었다. 미니-풀은 온건하게 혼합되고, 그리고 실온에서 30 분 동안 그 상태로 유지되도록 허용되고, 그리고 이후, 칼럼에 부하되었다. 칼럼은 3.0 mL 부틸-S 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 차후에, 부틸-S 용리 완충액에서 3.0 mL 용적의 감소하는 황산나트륨 (0.5 M, 0.4 M, 0.3 M, 0.2 M, 0.1 M 및 0 M)으로 단계 용리되었다. 칼럼은 3.0 mL의 정제수 (PW)를 이용하여 2회 스트리핑되고, 그리고 이후, 3 mL의 2% 수산화나트륨을 이용하여 재생되었다.

부틸-S의 평가로부터 칼럼 분획물은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다 (도면 6). SP Sepharose^® 패스트 플로우 미니-풀로부터 ECPs는 평형화 조건 (0.6 M 황산나트륨) 하에 칼럼에 의해 포획되지 않는다. 이에 더하여, NaOH 재생 분획물에는 극히 적은 FkpA가 존재하는 것으로 보이는데, 이것은 이러한 크로마토그래피 배지가 큰 회수 상실을 지속하지 않으면서, SP Sepharose^® 패스트 플로우 풀로부터 잔여 ECPs를 제거할 수도 있다는 것을 지시한다.

잠재적 두 번째 정제 단계의 분석적 평가: 부틸 Sepharose^® 4 패스트 플로우 및 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우의 비교

부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 또는 부틸 Sepharose^® 4 패스트 플로우를 내포하는 1 mL 중력 유동 칼럼은 직접적으로 비교되었다. 절차는 칼럼이 2 x 3 mL PW보다는 6.0 mL의 PW를 이용하여 1회 스트리핑된 점을 제외하고, 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우에 대해 앞서 설명된 바와 같았다.

부틸 Sepharose^® 4 패스트 플로우 및 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우로부터 칼럼 분획물의 SDS-PAGE 분석은 각각, 도면 7a 및 7b에서 도시된다. 부틸 Sepharose^® 4 패스트 플로우 표본의 경우에, FkpA는 매우 늦게 용리한다 (50 mM 인산염, 그 이후에 PW). 상기 재생 분획물에는 뚜렷한 양의 FkpA 및 더욱 적은 MW 불순물이 있다. 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 표본의 경우에, FkpA는 여러 세척 농도의 코스에 걸쳐 용리하는데, 대부분은 PW 스트립 단계에 앞서 용리한다. 상기 재생 분획물은 일부 더욱 적은 MW 불순물 및 미량의 FkpA를 여전히 내포한다. 본 실험의 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 팔에 대한 회수 데이터는 표 9 및 10에서 도시된다. 질량 균형은 정량적이고, 그리고 전체 단백질 중에서 단지 6%만 재생 분획물에서 발견된다. 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 겔은 SP Sepharose^® 패스트 플로우 풀로부터 잔여 ECPs의 탁월한 소실뿐만 아니라 매우 높은 회수를 제공한다.

표 9. 분광측량 일자: 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우

표본	희석 인자	FkpA (mg/mL)	Abs <280 nm>	Abs <320 nm>
PW 블랭크	1.0	-1.0596E-4	-1.0586E-4	-4.8637E-5
F-T/세척	1.0	9.4522E-2	4.9919E-2	-1.1234E-3
0.5 M 세척	1.0	2.1272E-2	7.1135E-3	-4.3736E-3
0.4 M 세척	1.0	1.9341E-2	9.2669E-3	-1.1773E-3
0.3 M 세척	1.0	4.0865E-2	2.0347E-2	-1.7200E-3
0.2 M 세척	1.0	0.17278	9.4492E-2	1.1907E-3
0.1 M 세척	1.0	0.31258	0.17033	1.5364E-3
0 M 세척	1.0	0.27013	0.14822	2.3418E-3
PW 용리	1.0	6.1637E-2	3.2298E-2	-9.8085E-4
2% NaOH 재생	1.0	7.7314E-2	4.6334E-2	4.5843E-3

FkpA (mg/mL)=(Abs(280 nm) - Abs (320 nm))/0.54

표 10. 부틸-S Sepharose^® 회수 데이터

분획물	용적 (mL)	농도 (mg/mL)	mg	% 회수
SP 미니 22-50	2.5	1.51	3.8	100%
부틸-S F-T/세척	8.0	0.09	0.8	20%
0.5 M 세척	3.0	0.02	0.1	2%
0.4 M 세척	3.0	0.02	0.1	2%
0.3 M 세척	3.0	0.04	0.1	3%
0.2 M 세척	3.0	0.17	0.5	14%
0.1 M 세척	3.0	0.31	0.9	25%
0 M 세척	3.0	0.27	0.8	21%
PW 스트립	6.0	0.06	0.4	10%
2% NaOH 재생	3.0	0.08	0.2	6%
질량 균형			3.9	102%

부틸-S Sepharose ^® 6 패스트 플로우 최적화

본 실험의 목적은 칼럼의 중간 0.3 M 황산나트륨 세척이 필적하는 정제 (회수 및 순도)를 잠재적인 감소하는 황산나트륨 구배에 제공할 것인지를 평가하는 것이었다.

1 mL 중력-유동 칼럼은 부틸-S Sepharose^® 6 패스트 플로우 (GE Healthcare)로 충전되었다. 칼럼은 5 mL의 50 mM 인산염, pH 7.0 (부틸-S 용리 완충액)으로 전평형화되고, 그리고 이후, 5 mL의 0.6 M 황산나트륨, 50 mM 인산염, pH 7.0 (부틸-S 평형화 완충액)으로 평형화되었다. 2.5 mL의 0.6 M 황산나트륨이 앞서 설명된 SP Sepharose^®의 구배 평가로부터 분획물 22-50의 미니-풀의 2.5 mL 분취량에 첨가되었다. 미니-풀은 온건하게 혼합되고, 그리고 실온에서 30 분 동안 그 상태로 유지되도록 허용되고, 그리고 이후, 칼럼에 부하되었다. 칼럼은 5.0 mL의 0.3 M 황산나트륨, 50 nM 인산염, pH 7.0으로 세척되고, 그리고 차후에, 5.0 mL 정제수 (PW)로 용리되었고, 그리고 이후, 3 mL의 2% 수산화나트륨을 이용하여 재생되었다.

SDS-PAGE에 의한 칼럼 분획물의 분석 (도면 8)은 SP Sepharose^® 패스트 플로우 풀에서 더욱 높은 MW 불순물이 환원된 황산나트륨 조건 하에 부틸-S Sepharose^® 칼럼을 관류하고, 매우 깨끗한 용리 풀이 남겨진다는 것을 보여준다. 부하 레인에서 소수의 낮은 MW 띠가 칼럼에 결합하였고 재생을 통해 제거되었다 (앞선 겔에서 목격되는 바와 같이; 도면 3).

회수 데이터는 표 11 및 12에서 도시된다. F-T/세척 풀에서 회수는 이전 실험으로부터 회수 값보다 약 5% 높다. PW 용리 회수는 약간 더 낮다. 추가 PW 용리는 증가된 수율을 가질 수 있다. 또한, 재생 단계는 단계 용리보다 약간 더 높은데, 이것은 재생에 앞서 더욱 긴 용리 단계에 대한 가능한 요구와 일치한다.

표 11. 부틸-S Sepharose^® 패스트 플로우 회수 데이터

표본	희석 인자	FkpA (mg/mL)	Abs <280 nm>	Abs <320 nm>
PW 블랭크	1.0	-1.8632E-4	-2.6512E-4	-1.6451E-4
F-T/세척	1.0	0.11878	6.3139E-2	-1.0047E-3
PW 용리	1.0	0.45328	0.24602	1.2512E-3
2% NaOH 재생	1.0	0.12895	7.2400E-2	2.7652E-3

FkpA (mg/mL)=(Abs(280 nm) - Abs (320 nm))/0.54

표 12. 부틸-S Sepharose^® 패스트 플로우 회수 데이터

분획물	용적 (mL)	농도 (mg/mL)	mg	% 회수
SP 미니 22-50	2.5	1.51	3.8	100%
부틸-S F-T/세척	10.0	0.12	1.2	31%
PW 용리	5.0	0.45	2.3	60%
2% NaOH 재생	3.0	0.13	0.4	10%
질량 균형			3.8	102%

부틸-S Sepharose^® HIC 배지는 FkpA의 매우 우수한 회수로, SP Sepharose^® 패스트 플로우 풀로부터 ECPs의 탁월한 분리를 보여준다. 이들 분석적 평가로부터 데이터에 근거하여, 이것은 정률증가되고 FkpA 정제 과정에서 두 번째 회수 단계로서 이용될 것이다.

부틸-S Sepharose ^® 패스트 플로우 단계의 정률증가

부틸-S Sepharose^® 크로마토그래피 단계는 회수 및 순도를 분석적 부틸-S Sepharose^® 크로마토그래피 단계와 비교하기 위해 정률증가되었다. 일련의 발달 실행이 상기 단계를 최적화하기 위해 실행되었다. 분석적 HIC 실행은 FkpA가 부틸-S Sepharose^® 겔에 상대적으로 밀착 결합된다는 것을 보여주었다. 연장된 용리 단계는 FkpA 회수에서 증가가 획득될 수 있는 지를 확인하기 위해 평가되었다.

완충액 및 용액

조건화 완충액: 0.6 M 황산나트륨, 50 mM 인산염, pH 7.0

평형화 완충액: 0.3 M 황산나트륨, 50 mM 인산염, pH 7.0 (A11)

용리 용액: 정제수 (PW, A12)

재생 용액: 2% NaOH

칼럼 제조

2.6 cm x 9.4 cm (50 mL) 칼럼이 이러한 평가를 위해 제조되었다. 상기 칼럼은 3 CV의 평형화 완충액으로 평형화되었다.

부하 조건화

140 mL의 조건화 완충액은 첨가 내내 온건하게 혼합하면서, 140 mL의 SP Sepharose^® FF 풀에 점진적으로 첨가되었다. 혼합은 모든 조건화 완충액이 첨가된 후 30 분 동안 실온에서 지속되었다.

크로마토그래피

크로마토그램은 도면 9에서 도시된다. 미량의 돌파구 OD가 관찰되었는데, 이것은 분석적 평가에 근거하여 예상되었다. 용리 피크는 확연한 테일링을 갖고, 그리고 약 6 CV의 용리 후 10 mAUFS에 도달한다. 포스트-풀은 별개의 분획물로서 수집되었다. 칼럼 재생은 2% (0.5 M) 수산화나트륨을 재생 용액으로서 이용하여 실행되었다. UV-Vis 분광측량 분석 칼럼 분획물은 표 13에서 도시된다. 질량 균형은 분석적 실행에서보다 높았지만, 데이터는 이전 분석적 실행으로부터 산출된 것과 유사하다. 정률증가 실행은 FkpA의 순도 및 회수에 대하여 유사한 칼럼 성과를 보여준다. 두 번째 칼럼 실행은 필적하는 칼럼 프로필을 보여주었다.

표 13. 부틸-S Sepharose^® 회수

분획물	용적 (mL)	농도 (mg/mL)	mg	% 회수
SP FF 분획물 22-50	140	1.48	207	100%
F-T/세척	450	0.12	53	26%
프리-풀	54	0.03	1	1%
풀	232	0.60	140	67%
포스트-풀	232	0.03	8	4%
2% NaOH 재생	150	0.16	23	11%
질량 균형			225	109%

SDS-PAGE

SDS-PAGE에 의한 칼럼 분획물의 분석 (도면 10a)은 정제 단계가 분석적 평가에 필적한다는 것을 보여주고, 이러한 HIC 단계의 정률증가가 SP Sepharose^® 패스트 플로우 풀 내에 존재하는 숙주 세포 단백질 불순물의 제거를 모사할 수 있었다는 것을 증명한다. 더욱 높은 MW 불순물은 칼럼을 관류하였고, 그리고 더욱 낮은 MW 불순물은 칼럼에 밀착 결합되었다 (앞선 겔에 의해 증거된 바와 같이). 용리 풀은 매우 깨끗하였고, 매우 적은 양의 FkpA가 포스트 풀에서 관찰되었다. 동일한 겔은 염색 용액에서 하룻밤 동안 항온처리 후 SYPRO Ruby 시약 (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 영상화되었다. SYPRO Ruby 영상화는 단백질-내포 표본의 분석을 위한 더욱 민감한 검출 방법이다. SYPRO Ruby 영상화 (도면 10b)는 정제된 FkpA의 분획물이 숙주 세포 단백질 불순물 및/또는 FkpA의 잘라진 형태일 수 있는 다수의 더욱 낮은 MW 띠를 여전히 갖는다는 것을 보여준다.

결론

부틸-S Sepharose^® 크로마토그래피 단계의 정률증가는 상이한 HIC 배지의 분석적 평가에서 선택되는 파라미터로부터 선형이었다. 부틸-S Sepharose^®는 이러한 두 번째 정제 단계에서 평가된 HIC 배지의 가장 약한 리간드를 갖기 때문에, FkpA의 최고 회수를 제공한다. 분자 순도는 이러한 단위 작업에 의해 크게 증강되었는데, 주요 불순물 띠는 SDS-PAGE 분석에 근거하여, 관류 내에 존재하거나 또는 더욱 고도로 유지되었다.

HPLC-SEC 분석적 평가

일차 서열에 근거하여, FkpA는 ~26 kDa의 몰 질량을 갖는다. FkpA에 관한 이전에 공개된 정보는 상기 분자가 비공유 연관을 통해 더욱 높은 MW에서 움직인다는 것을 암시한다. 분석적 평가는 FkpA가 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 상에서 어디로 이주하는 지를 결정하기 위해 FkpA를 내포하는 부틸-S Sepharose^® 풀과 함께 단백질 참조를 이용하여 실행되었다.

재료와 방법

TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC 칼럼 (7.8 mm x 30 cm; Tosoh Bioscience)이 평가에 이용되었다. 이동상은 0.25 M KCl, 0.2 M 인산칼륨, pH 6.2이었다. 칼럼 유속은 0.5 mL/분이었다. FkpA는 단백질 표준과 비교되었다: 항체 (~150 kDa), 소 혈청 알부민 (~66.5 kDa) 및 Nutropin^® (~22 kDa).

크로마토그래피

HPLC-SEC 결과는 도면 11에서 도시된다. FkpA는 항체 및 BSA 사이에 체류 시간을 갖는데, 이것은 FkpA가 이의 일차 서열로부터 예측된 것보다 훨씬 큰 용액 몰 질량을 갖는다는 기존 문헌 참조를 확증한다 (표 14).

표 14. FkpA 및 표준의 HPLC-SEC

	예측된 MW	체류 시간 (분)
		13.420
항체	~150 kDa	14.733
		15.577
BSA	~66.5 kDa	17.787
뉴트로핀	~22 kDa	20.730
FkpA	~26 kDa	14.430
		16.100

슈퍼덱스 200 크기 배제 크로마토그래피

슈퍼덱스 200 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 잔여 더욱 높은 MW 종류 및 더욱 낮은 MW 종류를 FkpA로부터 분리할 뿐만 아니라 상기 단백질을 공식화하기 위해 선택되었다.

실행 1: 1.6 cm x 60 cm 슈퍼덱스 200 칼럼을 이용한 파일럿 방법

초기 슈퍼덱스 200 실행은 120 mL 칼럼에서 수행되었다. 칼럼 분획물은 최종 공식화된 벌크의 산출을 위해 슈퍼덱스 200 SEC 단계를 정률증가하기에 앞서 순도에 대해 특징되었다.

재료와 방법

1.6 cm x 60 cm (1 CV = 120 mL) 슈퍼덱스 200 칼럼 (GE Healthcare)이 이러한 파일럿 실행에 이용되었다. 상기 칼럼은 1 CV의 0.1 M NaOH로 청소되고, 그리고 이후, 3 CV의 인산염 완충된 식염수 (PBS), pH 7.5 (평형화 완충액)로 평형화되었다.

표본 준비

30 mL의 부틸-S Sepharose^® 풀은 한 쌍의 Amicon Ultra 10 kDa 단위 (Millipore Corporation)를 이용하여 농축되었다. Amicon 단위는 농축물 용적이 ≤ 6 mL (1 CV의 ≤ 5%)때까지 20 분 주기를 이용하여 3000 rpm에서 에펜도르프 5810 R 원심분리기에서 원심분리되었다.

크로마토그래피

슈퍼덱스 200 크로마토그래피 단계에 대한 크로마토그램은 도면 12에서 도시된다. 상기 프로필은 TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC 칼럼이 더욱 높은 MW 종류의 더욱 우수한 분해능을 산출했다는 점을 제외하고, TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC 칼럼을 이용한 HPLC-SEC 프로필과 실제적으로 상이한 것으로 보이지 않는다.

SDS-PAGE

칼럼 분획물 32-42는 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 표본은 실온에서 1 시간 동안 SDS 표본 완충액과 함께 항온처리에 의해 전기이동에 대해 준비되었다 (가열 없음). 상용의 표본 준비에 대한 이러한 변형은 표본을 가열하는 것이 더욱 낮은 MW 종류의 존재를 책임지는 지를 확인하기 위해 행위되었다.

염색-없는 이미지 (도면 13a) 및 동일한 겔의 SYPRO Ruby 영상화 (도면 13b)는 무손상 단백질과 공동이주하는 더욱 낮은 MW 띠의 존재를 보여준다. 85℃에서 5 분 동안 가열하는 전통적인 표본 준비는 더욱 낮은 MW 띠의 존재에 책임을 지지 않는 것으로 결론될 수 있는데, 그 이유는 이들이 가열되지 않은 표본 내에 존재하기 때문이다.

웨스턴 블롯 분석

물질이 토끼를 면역화시키는데 이용될 만큼 충분히 순수한 지 또는 추가 정제 작업이 행위될 필요가 있는 지를 결정하기 위해 웨스턴 블롯 분석이 실행되었다. 이러한 분석을 위해, 슈퍼덱스 200 칼럼으로부터 분획물 37 (피크 분획물; 도면 12)이 이용되었다.

겔 및 웨스턴 블롯 결과는 도면 14에서 도시된다. 웨스턴 블롯에 대한 항체는 항-ECP이었다. 단백질은 PVDF 시트 위에 이전되고, 그리고 각 PVDF 시트는 염소 항-ECP와 함께 배양된다. 양고추냉이 과산화효소에 접합된 토끼 항염소 항체로 두 번째 배양이 뒤따른다. PVDF 시트는 이후, 양고추냉이 과산화효소와의 반응에 의해 발광하는 증강된 화학발광 기질과 함께 배양된다. 분자량 마커 또한, StrepTactin 및 양고추냉이 과산화효소 접합체 시스템으로 발광한다. 항-ECP와 함께 배양된 면역블롯은 표본 내에 ECP를 드러낸다. 겔 결과는 이전에 산출된 SYPRO Ruby 영상화 결과를 확증한다 (도면 13b). 웨스턴 블롯은 Sypro Ruby 영상화에서 목격되지 않는 37 kDa 및 50 kDa 사이에 희미한 띠를 보여준다.

질량 분광계 분석

상기 단백질은 트립신으로 절단되고, 그리고 1) 물질 내에 존재하는 FkpA 펩티드 서열을 결정하고, 그리고 2) 표본 내에 어떤 다른 단백질 불순물도 존재하지 않는다는 것을 결정하기 위해 UPLC-MS/MS에 의해 분석되었다. 분석은 MS 조사 스캔을 수집하는 고해상 사중극-비행 시간 질량분광계 내로 직접적으로 분무된 0-40% 아세토니트릴의 45 분 UPLC 구배, 그 이후에 크로마토그래피 분리 동안 각 연속적인 MS 스캔으로부터 상위 20개의 가장 풍부한 전구체 이온의 MS/MS로 구성되었다. LC-MS/MS 미가공 데이터 파일은 Uniprot 대장균 (E. coli) 정준 및 동종형 데이터베이스에 대해 검색되고, 356FkpA 펩티드가 확인되었다 (다수는 높은 MS/MS 표본추출률로 인해 동일한 펩티드의 복수 사례이었다). 2 β-갈락토시다아제 펩티드 역시 발견되었는데, 이들은 질량분광계의 보정에 이용된 내부 표준으로부터 기원하고, 그리고 따라서, FkpA 표본에서 내포되지 않는다. 질량 분광분석법이 FkpA를 더욱 특징짓는데 이용되었고, 그리고 베타-갈락토시다아제가 내부 대조로서 이용되었다.

결과는 표 15에서 도시된다. 질량 분광분석법 분석은 FkpA 서열의 ~91% 적용범위를 보여주었는데, 신호 서열이 예상된 바와 같이, FkpA 펩티드 적용범위에서 부재하는 9%를 나타낸다. 다른 단백질로부터 다른 펩티드는 전혀 관찰되지 않았는데, 이것은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰된 더욱 낮은 MW 띠가 FkpA-관련된 것이라는 결론을 야기하였다. 다른 불순물이 만약 존재한다면, 이들의 수준은 질량분광계의 검출 한계의 수준 미만이고 및/또는 이들의 조성은 결과가 비교된 데이터베이스에서 존재하지 않는다.

표 15. 질량 분광계 분석의 결과

% 적용범위	수탁 #	명칭	종류	펩티드 (95%)
90.7	tr\|E2QFK2\|E2QFK2_ECOLX	펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성화효소 OS= 대장균 (Escherichia coli) GN=fkpA PE=4 SV=1	ECOLX	356
4.1	tr\|E2QGA4\|E2QGA4_ECOLX	베타-갈락토시다아제 OS=대장균 (Escherichia coli) GN=lacZ PE=3 SV=1	ECOLX	2

슈퍼덱스 200 실행 2-4

초기 파일럿 실행 이후에, 차후 실행 2-4가 최종 공식화된 벌크의 산출을 위해 320 mL 칼럼에서 수행되었다.

칼럼 제조

2.6 cm x 60 cm 칼럼 (320 mL 베드 용적)은 1 CV의 0.1 M NaOH로 청소되었고, 그리고 이후, 3 CV의 PBS, pH 7.5 (평형화 완충액)로 평형화되었다.

표본 준비

60 mg - 95 mg의 분취량이 실행 2-4에 이용되었다. 실행 1에 이용된 동일한 절차가 SEC를 위한 분취량을 준비하는데 이용되었다. 표적화된 최종 용적은 ≤ 16.0 mL (베드 용적의 ≤ 5%)이었다. 도면 15는 실행 2 동안 획득된 크로마토그램을 보여준다. 분획물 37-44는 모아지고, 그리고 TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC 칼럼을 이용하여 재분석되었다. 도면 16은 실행 2 분획물 37-44의 TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC 크로마토그램을 보여준다. 약 2% 응집이 목격될 수 있다. 응집의 이러한 양은 이들 응집체에 대하여 산출된 항체를 갖기 위해 바람직하다. 결과는 실행 3 및 4에서 유사하였다.

SDS-PAGE

실행 1로부터 칼럼 분획물 35-40 및 실행 2-4로부터 37-44는 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 도면 17 (각각, 레인 2-5)을 참조한다. 실행 1로부터 물질은 분해된 것으로 보이고, 그리고 차후 실험에 이용되지 않았다.

한외여과 및 여과

슈퍼덱스 200 풀은 Amicon Ultra 10 kDa 단위를 이용하여 2.0 mg/mL의 표적 단백질 농도로 농축되었다. 실행 1 물질의 분해의 예측하지 못한 미지의 원인으로 인해, 실행 2-4로부터 물질만 최종 벌크에 포함되었다.

2개의 Amicon Ultra 10 kDa 단위가 이용되었다. 실행 2-4로부터 13 mL의 합동된 분획물 (각 실행으로부터 분획물 37-44)은 각 단위로 이전되었다. 표본은 앞서 설명된 바와 같이 원심분리되었다. 여과액은 흘러 버려졌고, 그리고 UF 농축물은 합동된 분획물로부터 추가 물질과 혼합되었다 (이들 단위에서 더욱 높은 단백질 농도를 최소화하기 위해). 상기 과정은 단백질 농도가 2.0 mg/mL의 목표를 약간 초과할 때까지 반복되었다. 농축된 표본은 0.2 μ 필터를 통해 여과되고 5 mL의 UF 여과액으로 추적되었다. 표적 단백질 농도에서 FkpA의 회수는 표 16에서 보여 지는 바와 같이 사실상 정량적이었다.

표 16. 한외여과 및 여과 단계로부터 회수

분획물	용적 (mL)	농도 (mg/mL)	mg	% 회수
슈퍼덱스 풀	154	1.49	228	100%
UF 여과액	44	0.00	0	0%
포름. 풀	110	2.02	223	98%

초고순도 FkpA의 동결 해동 안정성

동결 해동 안정성 시험의 목적은 상기 시약이 전기영동 또는 SEC 프로필에서 활성의 상실 또는 변화 없이 최대 3회 동결 해동 동안 안정되도록 담보하는 것이다.

재료와 방법

초고순도 FkpA의 75 μL 분취량이 연구에 이용되었다. 한 분취량은 냉장실에서 유지되었고, 그리고 나머지 3개는 ≤ -80℃ 냉동기에서 배치되었다. 1 시간 후, 3개 동결된 분취량은 해동되고 온건하게 혼합되었다. 한 분취량 ("1회 동결 해동")은 냉장실에서 배치되었고, 그리고 다른 2개는 냉동기 내로 다시 넣어졌다. 상기 과정은 나머지 2개 표본에 대해 반복되었는데, 두 번째 동결 해동 표본은 냉장실로 이전되고 세 번째 동결 해동 표본은 ≤ -80℃ 냉동기에서 하룻밤 동안 유지되었다. 세 번째 표본은 다음 날 해동되었다.

SDS-PAGE

동결 해동 표본 각각의 10 μg 분취량이 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 겔 결과 (도면 18)는 4개 표본 각각 사이에 비교가능성을 보여준다.

HPLC-SEC

동결 해동 표본 각각의 100 μg 분취량이 HPLC-SEC에 의해 분석되었다. 크기산정 결과 (도면 19a와 19b 및 표 17)는 4개 표본 사이에 비교가능성을 보여준다. 더욱 높은 MW 종류 및 단위체에서 매우 작은 차이는 아마도, 피크의 수동 통합에 기인한다. 슈퍼덱스 200 실행 2-4로부터 초고순도 FkpA 벌크는 단백질에서 명백한 변화 없이 3회 동결 해동에서 안정된다. 상기 시약은 토끼에서 항체를 조성할 뿐만 아니라 ELISA 검정을 위한 참조로서 역할을 하는 면역원으로서, 그리고 토끼 항혈청으로부터 항-FkpA를 정제하는 친화성 칼럼을 구축하기 위한 리간드로서 이용하기 적합한 것으로 간주되었다.

표 17. FkpA의 동결 해동 검정의 HPLC-SEC 분석

동결/해동	피크 ID	분	mAU ^* 분	mAU	%
0	1	14.377	2.3194	3.972	2.06
	2	16.070	110.5102	241.565	97.94
	총합:		112.8296	245.537	100.00
1	1	14.367	2.4097	4.303	2.13
	2	16.053	110.5952	239.389	97.87
	총합:		113.0049	243.691	100.00
2	1	14.380	2.3730	4.255	2.10
	2	16.067	110.5798	241.087	97.90
	총합:		112.9529	245.342	100.00
3	1	14.373	2.4747	4.286	2.20
	2	16.067	110.2633	238.686	97.80
	총합:		112.738	242.972	100.00

최종 산물은 SDS-PAGE (도면 14), HPLC-SEC (표 17), N 말단 서열 분석, 그리고 펩티드 질량 지문확인 (표 15)에 의해 특징되었다. 농도는 FkpA에 대한 흡광 계수를 이용하여 분광광도법적으로 결정된 바와 같이 2.02 mg/mL이었고 100 μg/mL로 희석되었다. 희석된 용액은 표준 스톡 I로서 지정되고 -70 ℃ 또는 그 이하의 온도에서 보관되었다.

실시예 3. 항-FkpA 항체의 산출 및 정제

다중클론 항체는 치료적 폴리펩티드의 제조에서 FkpA의 제거를 계측하기 위한 검정에서 이용을 위해 초고순도 FkpA에 대하여 산출되었다. 다음의 실시예는 다중클론 FkpA 항체를 산출하는데 이용된 정제 방법을 설명한다. 이들 시약은 FkpA 면역원과 함께, 특정한 FkpA ELISA의 개발을 위해 필요하였다.

3마리 토끼는 초고순도 FkpA로 면역화되었다. 42 일자에, 혈액은 개별 토끼로부터 뽑혀졌고, 그리고 FkpA 항혈청이 항-FkpA 항체의 정제에 이용되었다. 토끼 A, B, 및 C로부터 항혈청 및 면역화전 혈청은 직접적인 결합 ELISA에 의해 검정되었다. 초고순도 FkpA는 탄산염 완충액, pH 9.6에서 4 μg/mL로 희석되고, Costar 96-웰 평판 (카탈로그 #9018) 위에 직접적으로 코팅되고, 그리고 2-8℃에서 12 내지 72 시간 동안 배양되었다. 각 웰은 세척되고, 평판세척기를 이용하여 거의 400 μL의 세척 완충액 (인산염 완충된 식염수 (PBS) 및 0.05% 폴리소르베이트 20)으로 3 회 흡인되고, 그리고 철저하게 블롯팅되었다. 용액은 평판을 폐기물 저장소 위에서 반전시킴으로써 웰로부터 제거되지 않았다. 거의 200 μL의 검정 희석제가 각 웰에 첨가되고, 그리고 교반하면서 주위 온도에서 1 내지 2 시간 동안 배양되었다. 세척 단계는 반복되었다. 표본은 검정 희석제 (0.15 M NaCl, 0.1M NaPO4 pH 7.2, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.1% 어류 젤라틴; 0.05% 프로클린 300)에서 1:500 희석되고, 그리고 이후, 4 내지 12 회 계열 희석되고 상응하는 웰에 첨가되었다. 평판은 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액으로 세척되고, 그리고 검정 희석제에서 희석된 염소 항토끼-HRP가 각 웰에 첨가되고 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액으로 세척되고, 그리고 SureBlue Reserve™ TMB 마이크로웰 페록시다아제 기질 (Kirkegaard & Perry Labs [KPL], 카탈로그 # 53-00-00) (기질 용액)이 평판에 첨가되고 컬러가 실온에서 거의 20 분 동안 현색하도록 허용되었다. 반응은 0.6N 황산으로 중지되었다. OD는 450 nm의 파장에서 판독되었고, 그리고 데이터는 Softmax Pro 데이터 축소 소프트웨어를 이용하여 분석되었다. FkpA에 대한 토끼 A, B, 및 C로부터 항혈청의 면역반응성은 필적하였고 (도면 20), 이런 이유로 이들 표본은 모아졌다.

FkpA 항체의 정제

60% 황산암모늄 침전 (ASP) 단계가 모아진 항혈청에서 수행되었다. 52.7 mL 황산암모늄 용액 (3.8 M 황산암모늄, 50 mM 인산염, pH 7.0)이 첨가 내내 온건하게 교반하면서 73.0 mL 항-FkpA 토끼 항혈청에 천천히 첨가되었다. 일단 첨가가 완결되면, 용액은 냉장실로 이전되고 하룻밤 동안 온건하게 혼합되었다.

황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (SDS-PAGE)이 이후, ASP 항-FkpA 항체의 상대적 순도를 결정할 뿐만 아니라 단백질의 몰 질량을 확증하는데 이용되었다. 2 x 10 μL 분취량의 AS 현탁액이 별개의 에펜도르프 튜브 내로 이전되었다. 90 μL의 PBS, pH 7.2가 각 표본에 첨가되고 현탁액을 용해시키기 위해 온건하게 혼합되었다. 100 μL 표본이 에펜도르프 튜브로 이전되었다. 표본은 5 분 동안 최고 속도에서 마이크로퓨지되었다. 상층액은 뽑혀지고 별개의 에펜도르프 튜브로 이전되었다. 나머지 펠렛은 100 μL의 PBS, pH 7.2에서 재구성되었다. 2 x 10 μL 분취량의 상층액이 별개의 에펜도르프 튜브 내로 이전되었다. 90 μL의 PBS, pH 7.2가 각 상층액 표본에 첨가되고 온건하게 혼합되었다.

각 조건으로부터 10 μL의 표본은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 전기이동은 항체의 공유 응집을 사정하기 위해 이황화 결합 환원과 함께 및 이것 없이 수행되었다. SDS-PAGE는 Bio-Rad Criterion™ 4-20% TGX (Tris-Glycine eXtended) Stain-Free™ 겔을 이용하여 수행되고 Bio-Rad Criterion Stain Free™ 영상장치 (Bio-Rad Laboratories)로 영상화되었다. 겔 결과는 도면 21에서 도시된다. 60% 분별 단계는 화살표에 의해 표시된 바와 같은 상층액에서 항체의 부재에 의해 증거된 바와 같이, 모든 토끼 항체의 항혈청을 성공적으로 고갈시켰다.

SDS-PAGE에 의한 분석 이후에, 나머지 황산암모늄 현탁액은 2-8℃의 온도에서 30 분 동안 Sorvall RC 6 플러스 원심분리기에서 11,000 rpm에서 원심분리되었다. 상층액은 제거되었고, 그리고 펠렛은 -80℃에서 보관되었다.

펠렛은 이후, 인산염 완충액에서 용해되었다. ASP 항-FkpA 항체의 농도는 UV 분광광도법에 의해 6.69 mg/mL인 것으로 결정되었다.

ASP 항-FkpA 항체는 앞서 설명된 바와 같이 직접적인 결합 ELISA에 의해 검정되었다. 초고순도 FkpA는 탄산염 완충액, pH 9.6에서 4 μg/mL로 희석되고 Costar 96-웰 평판 (카탈로그 #9018) 위에 직접적으로 코팅되었다. 표본은 검정 희석제에서 1:500 희석되고, 그리고 이후, 2 내지 12 회 계열 희석되었다. 염소 항토끼-HRP가 결합을 검출하는데 이용되었다. ASP 항-FkpA 항체는 1:256,000의 희석에서 시작하여 초고순도 FkpA에 대한 선형 용량 반응을 보여준다 (도면 22). 이들 결과는 ELISA 샌드위치 검정의 추종을 촉발하였다.

ASP 항-FkpA 항체로 ELISA 샌드위치 검정의 개발

1 mg의 ASP 항-FkpA 항체가 제조업체의 사용설명서에 따라서, Pierce Kit EZ-Link 페록시다아제 (cat#31489)를 이용하여 HRP에 접합되었다. HRP 접합된 ASP 항-FkpA 항체는 검정 희석제에서 추가로 1/20 희석되고 ASP HRP 접합체 스톡 I로서 지정되었다. ASP 항-FkpA 항체는 분취되고 ASP 코트 공급원으로서 지정되었다. ASP 코트 공급원은 이후, PBS에서 1 mg/mL로 희석되고 ASP 코트 스톡 I로서 지정되었다.

ASP 코트 스톡 I은 탄산염 완충액, pH 9.6에서 4 μg/mL로 희석되고 Costar 96-웰 평판 (카탈로그 #9018) 위에 직접적으로 코팅되었다. FkpA는 0.78-100 ng/mL 범위에서 변하는 다양한 농도로 희석되고 각각 상응하는 웰에 첨가되었다. ASP HRP 접합체 스톡 I은 1:60, 1:80, 1:100 및 1:110으로 희석되고 각각 상응하는 웰에 첨가되었다. 100 μL의 희석된 ASP 코트 스톡 I은 마이크로역가 평판의 각 웰 내로 피펫팅되고 2-8℃에서 12 내지 72 시간 동안 배양되었다. 각 웰은 세척되고, 평판세척기를 이용하여 거의 400 μL의 세척 완충액으로 3 회 흡인되고, 그리고 철저하게 블롯팅되었다. 용액은 평판을 폐기물 저장소 위에서 반전시킴으로써 웰로부터 제거되지 않았다. 거의 200 μL의 검정 희석제가 각 웰에 첨가되고, 그리고 교반하면서 주위 온도에서 1 내지 2 시간 동안 배양되었다. 세척 단계는 반복되었다. 웰마다 100 μL의 희석된 표준 (이중으로), 대조 (이중으로) 및 표본이 적절한 웰 내로 피펫팅되었다. 평판은 교반하면서 주위 온도에서 2 시간 ± 10 분 동안 배양되었다. 웰은 상기와 같이 세척되었고, 평판은 회전되었고, 그리고 세척 단계는 반복되었다. ASP HRP-접합체 스톡 I은 1.5 - 2.0 OD의 최대 OD 값을 목표로 하여, 가장 높은 표준 및 가장 낮은 표준 사이에 유의미한 OD 범위를 산출하기 위해 검정 희석제로 희석되었다. 100 μL의 희석된 HRP-접합체 스톡 I은 각 웰로 피펫팅되고 교반하면서 주위 온도에서 2 시간 ± 10 분 동안 배양되었다. 웰은 상기와 같이 세척되었고, 평판은 회전되었고, 그리고 세척 단계는 반복되었다. 웰마다 100 μL의 기질 용액이 웰로 피펫팅되고, 그리고 최적 표준 곡선 발색 현상을 허용하기 위해 어둠 하에 주위 온도에서 충분한 시간 동안 배양되었다. 100 μL의 0.6 N 황산이 각 웰 내로 피펫팅되었다. ODs는 2개 필터, 검출 흡광도를 위한 450 nm 및 참고 흡광도를 위한 620-630 nm (참고 파장은 임의선택적이다)를 이용한 평판판독기를 이용하여 판독되었다. 표본 농도는 최소 4-파라미터 로지스틱 곡선-적합 프로그램을 갖는 데이터-처리 소프트웨어를 이용함으로써 결정되었다. 결과는 도면 23에서 도시된다. 표준 곡선은 ~25 ng/mL에서 안정 상태를 유지하는 것으로 보인다. 작업 범위는 ~0.156-20 ng/mL인 것으로 결정되었고, 그리고 최적 ASP HRP 접합체 스톡 I 희석은 ~1.7의 예상된 최대 OD에 의해 결정될 때 1:90이었다.

ASP 항-FkpA 항체로 ELISA 샌드위치 검정의 이용

ELISA 샌드위치 검정은 실시예 6에서 설명된 바와 같이 산출된 항-IL13/IL17 이중특이적 항체 표본에서 FkpA의 양을 검정하기 위해 수행되었다. ASP HRP 접합체 스톡 I은 1:90 희석되었다. 결과는 비선형성을 보여준다 (표 18); 이런 이유로, 추가 항체 정제가 바람직할 수 있다는 것을 암시한다.

표 18. ASP ELISA 샌드위치 검정

각 단계에서 αIL13 및/또는 αIL17의 농도 (mg/mL)
αIL13			αIL17		조립		Capto™	QSFF	PHS F/T
10.26			9.01		8.26		4.8	5.31	4.37

각 단계에서 FkpA의 농도 (ng/mL)
희석		αIL13		αIL17		조립		Capto™	QSFF	PHS F/T
10		GTR		GTR		GTR		GTR	28.505^*	1.437
40		GTR		GTR		GTR		GTR	11.554	LTR
160		GTR		GTR		GTR		GTR	LTR	LTR
640		GTR		30.962		30.725		82.828^*	LTR	LTR
2560		20.783		8.694		7.616		15.317	LTR	LTR
10240		4.555		2.301		1.743		3.700	LTR	LTR
40960		1.163		LTR		LTR		0.857	LTR	LTR
163840		LTR		LTR		LTR		LTR	LTR	LTR

FkpA의 농도/αIL13 및/또는 αIL17의 농도 (ng/mg)
희석		αIL13		αIL17		조립	Capto™	QSFF	PHS F/T
10								53.7^*	3.3
40								87.0
160								109.7
640				2199.3		2380.6	11043.7^*	126.1
2560		5185.6		2470.2		2360.4	8167.1
10240		4546.1		2615.1		2160.8	7893.3
40960		4642.9					7313.1
163840

평균	4791.6			2428.2		2300.6		7791.8	107.6	3.3
표준편차	344.7			211.1		121.5		436.9	19.6	N/A
CV	7			9		5		6	18	N/A

^*=계산에 포함되지 않은 데이터, N/A=해당 없음, GTR=범위보다 큼, LTR=범위보다 작음

FkpA 항체의 친화성 정제

ELISA 샌드위치 검정의 선형성을 향상시키기 위해, ASP 항-FkpA 항체의 분취량은 친화성 (AF) 정제 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 더욱 정제되었다. 친화성 칼럼은 표적 항-FkpA 항체를 비-FkpA 항체로부터 분리하기 위해, 활성화된 글리세릴 CPG에 공유적으로 연계된 초고순도 FkpA를 이용하여 구축되었다.

글리세릴 제어된 다공성 유리에 연계하기 위한 초고순도 FkpA의 제조

2.02 mg/mL 초고순도 FkpA의 20 x 1 mL 바이알은 2-8℃에서 하룻밤 동안 해동되었고, 그리고 내용물은 모아졌다. 125 mL 세파덱스 G-25 칼럼 (GE Healthcare)이 FkpA를 연계 완충액 (0.1 M 중탄산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 8.3) 내로 완충액 교환하는데 이용되었다. 칼럼은 1 CV의 0.1 M NaOH로 청소되고, 그리고 이후, 3 CV의 연계 완충액으로 평형화되었다.

연계 절차

높은 유속 특징 및 용리 시기 동안 낮은 pH 조건을 견뎌내는 능력으로 인해, 글리세릴-CPG (Millipore Corporation)가 친화성 칼럼의 구축을 위한 지지체로서 선택되었다. 상기 지지체의 글리세릴 모이어티는 아미노 화학 연계에 앞서 알데히드로 산화되는 알코올 기능기를 갖는다. 모든 연계 단계는 실온에서 행위되었다.

건성 글리세릴-CPG가 증기 후드에서 적절한 양의 정제수에 첨가되었다 (1 그램의 글리세릴-CPG는 약 3 mL의 수화된 겔을 생산할 것이다). 글리세릴-CPG는 겔을 완전히 수화시키기 위해 물과 온건하게 혼합되었다. 수화된 겔은 15-30 분 동안 가라앉도록 허용되었다. 가라앉은 용적 중에서 10 - 12 mL의 용적이 수화된 겔에 대해 목표되었다.

액체 층 (미세분 내포)은 제거되었고, 그리고 정제수가 가라앉은 겔에 첨가되었다. 겔은 온건하게 혼합되고 그리고 이후, 15-30 분 동안 가라앉았다. 액체 층은 제거되었고, 그리고 미세분이 액체 층에서 관찰되지 않을 때까지, 상기 단계가 필요에 따라 반복되었다.

나트륨 메타과요오드산염 (NaIO4)이 글리세릴-CPG 겔 상에 히드록실 기를 알데히드로 산화시키기 위해 선택되었다. 동등한 용적의 새로 제조된 1% (m/v) 나트륨 메타과요오드산염이 수화된 글리세릴-CPG에 첨가되고, 그리고 이후, 적절하게 크기산정된 용기로 이전되었다. 용기는 궤도 회전기에 고정되고 30 분 동안 온건하게 혼합되었다. 산화 단계의 종결점에서, 용기는 회전기로부터 제거되었고, 그리고 겔이 가라앉도록 허용되었다.

액체는 제거되었고, 그리고 3-4 용적의 인산염 완충된 식염수 (PBS), pH 7.2가 겔에 첨가되었다. 겔은 온건하게 현탁되고, 그리고 이후, 15 분 동안 가라앉도록 허용되었다. 액체는 제거되었고, 그리고 PBS가 연계되는 단백질의 첨가에 앞서 잔여 나트륨 메타과요오드산염을 제거하기 위해 추가로 3회 반복되었다. 최종적으로, 3-4 용적의 0.1 M 중탄산나트륨, 0.5 M NaCl, pH 8.3 (연계 완충액)이 가라앉은 겔에 첨가되고, 온건하게 혼합되고, 그리고 15 분 동안 가라앉도록 허용되었다. 액체는 연계 단계에 앞서 제거되었다.

완충액-교환된 FkpA (세파덱스 G-25 단계로부터)가 산화된 글리세릴-CPG에 첨가되었다. 나트륨 시아노브롬하이드리드 (NaBH3CN)가 중간 쉬프 염기를 환원시키고 FkpA 및 지지체 사이에 안정된 공유 결합을 형성하는데 이용되었다. NaBH3CN은 가라앉은 글리세릴-CPG의 mL당 ~ 1 mg의 나트륨 시아노브롬하이드리드에서 반응 혼합물서 첨가되었다. 반응 혼합물은 밀봉된 용기 내로 이전되고, 궤도 회전기에 고정되고, 그리고 실온에서 하룻밤 동안 온건하게 혼합되었다.

연계된 겔은 회전기로부터 제거되고 15-30 분 동안 가라앉도록 허용되었다. 침전 후, 상층액의 2 mL 분취량이 제거되고 한 쌍의 1 mL 에펜도르프 튜브로 이전되었다. 이들 튜브는 임의의 잔여 고체를 제거하기 위해 2 분 동안 최고 속도에서 마이크로퓨지되었다. 상층액은 연계 효율을 결정하기 위해 잔여 단백질에 대해 계측되었다. 산화된 글리세릴-CPG에 FkpA의 결합은 정량적이고, 단백질의 상층액을 고갈시킬 것이다. 상층액에서 단백질 농도는 잔여 FkpA의 징후를 전혀 보여주지 않았는데, 이것은 연계 효율이 100%이었음을 지시한다 (데이터 제시되지 않음).

FkpA-CPG 겔은 NaIO4를 제거하기 위해 앞서 설명된 바와 같이 잔여 NaBH3CN을 제거하기 위해 세척되었다.

동등한 용적의 1.0 M Tris, pH 8.0이 FkpA-CPG 겔에 첨가되었다. FkpA의 연계가 친화성 지지체로서 겔의 이용에 앞서, 임의의 남아있는 반응성 부위를 차단하기 위해 추가 아민 기를 도입하는데 이용되었다.

FkpA-CGP는 앞서 설명된 바와 같이 다시 한 번 세척되었다.

친화성 칼럼 제조

친화성 겔은 1.6 cm XK 칼럼 (GE Healthcare)에서 포장되었다. 최종 치수는 1.6 cm x 6.3 cm (CV = 12.6 mL)이었다. 칼럼은 5 CV의 PBS, 0.02% 아지드화나트륨, pH 7.2로 세척되고, 그리고 이후, 이용 때까지 냉장실에서 보관되었다.

FkpA-CPG 친화성 크로마토그래피

실행 1: FkpA-CPG 친화성 겔의 초기 평가

친화성 칼럼 성과의 초기 평가는 25%의 60% 황산암모늄 펠렛을 이용하여 실행되었다. 펠렛은 ≤ -60℃ 보관으로부터 해동되고 실온으로 가온되었다. 120 mL의 3.8 M 황산암모늄, 50 mM 인산나트륨, pH 7.0이 펠렛에 첨가되었고, 그리고 펠렛은 이것을 현탁하기 위해 온건하게 혼합되었다. 현탁액은 4개의 SS-34 원심분리기 튜브 사이에 분할되고 Sorvall RC 6 플러스 원심분리기에서 30 분 동안 15 K rpm에서 원심분리되었다. 상층액은 폐기되었고, 그리고 4개의 원심분리기 튜브 중에서 3개가 추후 일자에서 정제를 위해 ≤ -60℃ 냉동기 내로 되돌려 이전되었다.

30 mL의 50 mM 인산나트륨, pH 7.0이 나머지 원심분리기 튜브에 첨가되었다. 상기 튜브는 실험실 회전기에 고정되고, 그리고 펠렛 내에 단백질을 완전하게 가용화시키기 위해 실온에서 1 시간 동안 온건하게 혼합되었다.

표본은 15 K rpm에서 15 분 동안 원심분리되고, 그리고 이후, 0.2 μ 필터를 통해 여과되었다. 여과된 표본은 친화성 칼럼에 부하되는 공급원료를 산출하기 위해, 30 mL의 PBS, 0.02% 아지드화나트륨, pH 7.5 (친화성 칼럼에 대한 평형화 완충액)로 추적되었다.

표본은 칼럼에 부하되고 20 mL의 평형화 완충액으로 추적되었다. 세척한 후, 용리 풀은 풀의 수집 내내 온건하게 혼합하면서 17 mL의 1.0 M Tris, pH 8.0을 내포하는 비커 내로 수집되었다. 크로마토그램은 도면 24에서 도시된다.

pH-조정된 풀은 0.2 μ 필터를 이용하여 여과되고, 그리고 풀에서 단백질 농도 및 회수를 계측하기에 앞서 5.0 mL의 평형화 완충액으로 추적되었다. 농도는 UV-VIS 분광광도법에 의해 0.058 mg/mL인 것으로 결정되었다. pH-조정된 풀은 2-8℃에서 보관되었다.

슈퍼덱스 200 크로마토그래피

SEC는 응집체를 제거하고 pH-조정된 친화성 풀을 공식화하기 위해 슈퍼덱스 200 칼럼 (GE)을 이용하여 수행되었다.

1.6 cm x 60 cm (1 CV = 120 mL) 슈퍼덱스 200 칼럼 (GE Healthcare)은 1 CV의 0.1 M NaOH로 청소되고, 그리고 이후, 3 CV의 PBS, pH 7.5 (평형화 완충액)으로 평형화되었다.

실행 1: FkpA-CPG 실행 1의 크로마토그래피

FkpA-CPG 실행 1로부터 83 mL pH-조정된 풀은 2개의 Amicon Ultra 10 kDa 단위를 이용하여 ≤ 6.0 mL (1 CV의 ≤ 5%)의 용적으로 농축되었다. 13 mL의 pH-조정된 풀은 각 단위 내로 이전되었다. 농축기는 에펜도르프 원심분리기에서 30 분 동안 3 K rpm에서 회전되었다. 여과액은 제거되고 pH-조정된 풀로 보충되었다. 상기 과정은 UF 농축물의 목표 표적 용적 (UF 농축물 용적 = 3.8 mL)이 달성될 때까지 반복되었다.

UF 농축물은 칼럼에 부하되고 PBS, pH 7.5로 추적되었다. 크로마토그램 (도면 25)은 표적 단위체성 종류로부터 분리되는 다수의 더욱 높은 MW 종류를 보여준다.

더욱 높은 MW 종류를 내포하는 분획물 (분획물 41-63) 및 주요 피크를 포함하는 분획물 (분획물 64-86)은 HPLC-SEC에 의해 분석되었다. 검정 결과 (도면 26a 및 26b)는 주요 피크가 크기 배제 크로마토그래피 단계의 이용에 의해 크게 증강된 ~ 96% 단위체성 종류를 내포한다는 것을 보여준다.

슈퍼덱스 200 분획물은 모아지고 Amicon Ultra 농축 단위 (Millipore)를 이용하여 농축되었다. 농도는 UV 분광광도법에 의해 3.1 mg/mL인 것으로 결정되었다.

1 mg의 친화성 정제된 항-FkpA 항체는 제조업체의 사용설명서에 따라서 Pierce Kit EZ-Link 페록시다아제 (cat#31489)를 이용하여 HRP에 접합되었다. HRP 접합된 친화성 정제된 항-FkpA 항체는 검정 희석제에서 추가로 1/20 희석되고 AF HRP 접합체 스톡 I로서 지정되었다. 친화성 정제된 항-FkpA 항체는 분취되고 AF 코트 공급원으로서 지정되었다. AF 코트 공급원은 PBS에서 1 mg/mL로 희석되고 AF 코트 스톡 I로서 지정되었다.

AF 코트 스톡 I은 탄산염 완충액, pH 9.6에서 4 μg/mL로 희석되고 Costar 96-웰 평판 (카탈로그 #9018) 위에 직접적으로 코팅되었다. FkpA는 0.78-100 ng/mL 범위에서 변하는 다양한 농도로 희석되고 각각 상응하는 웰에 첨가되었다. AF HRP 접합체 스톡 I은 1:2000, 1:4000, 1:6000 및 1:8000으로 희석되고 각각 상응하는 웰에 첨가되었다. 검정은 앞서 설명된 바와 같이 수행되었다. 결과는 도면 27에서 도시된다. 작업 범위는 0.78-100 ng/mL인 것으로 결정되었고, 그리고 최적 AF HRP 접합체 스톡 I 희석은 최대 OD가 ~1.7일 때 1:6000이었다.

ASP 및 친화성 정제된 항-FkpA 항체의 비교

5.31 mg/mL 항-IL13/IL17을 내포하는 실시예 6에서 설명된 바와 같이 준비된 항-IL13/IL17 이중특이적 항체 표본에서 FkpA의 양을 검정하는 ASP 및 친화성 정제된 항-FkpA 항체의 능력을 비교하기 위해 ELISA 샌드위치 검정이 수행되었다. 검정 파라미터는 표 19에서 도시된다. ASP 및 AF 항-FkpA 항체에 대한 결과의 표준 곡선은 도면 28a 및 28b에서 도시된다. 도면 28a, 28b 및 표 19와 20에서 보여 지는 바와 같이, 친화성 정제된 항체는 0.78ng/mL-100ng/mL의 역동적 범위를 가졌고, 향상된 선형성을 가졌고, 그리고 더욱 적은 HRP 검출 항체를 필요로 하였다.

표 19. ASP 및 AF 항-FkpA 항체의 비교에서 이용된 파라미터

파라미터	ASP-FkpA	AF-FkpA
코트	4 ug/mL	4 ug/mL
접합체 희석	1/90	1/6000
블랭크 OD	0.092	0.054
0.156 또는 0.78 ng/mL에서 OD	0.137	0.087
표준 곡선 범위	0.156-20 ng/mL	0.78-100ng/mL
최대 OD	1.537	1.753

표 20. ASP 및 AF 항-FkpA 항체 결과

	미가공 결과 (ng/mL)		희석 교정된 결과 (ng/mL)
희석	AF-FkpA	AS-FkpA	AF-FkpA	AS-FkpA
1/20	48.014	20.016	960	400
1/40	22.798	11.344	912	454
1/80	11.180	6.357	894	509
1/160	5.444	3.528	871	564
1/320	2.562	1.864	820	596
1/640	1.234	0.937	790	600
평균			875	521
표준편차			62	81
CV			7	16
FkpA/aIL13/aIL17 (ng/mg)			165	98

나머지 ASP 항체의 친화성 정제

앞서 설명된 나란히 비교에 근거하여, 나머지 ASP 항체는 친화성 크로마토그래피, 그 이후에 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다. 분획물 33-46은 ~98% 단위체를 내포한다 (도면 29). 농도는 UV 분광광도법에 의해 0.386 mg/mL인 것으로 결정되었다. 슈퍼덱스 200 실행 2 분획물 33-46은 합동되고, 그리고 앞서 설명된 바와 같이, 단일 Amicon Ultra 10 kDa 단위를 이용하여 농축되었다. 농도는 UV 분광광도법에 의해 1.2 mg/mL인 것으로 결정되었고, 그리고 표본은 AF 코트 스톡 II로서 지정되었다.

AF 항체의 동결 해동 안정성

동결 해동 안정성 시험의 목적은 상기 시약이 전기영동 또는 SEC 프로필에서 활성의 상실 또는 변화 없이 최대 3회 동결 해동 동안 안정되도록 담보하는 것이다. AF 코트 스톡 II의 100 μL 분취량이 이러한 실험에 이용되었다. 한 분취량은 냉장실에서 유지되었고, 그리고 나머지 3개는 ≤ -60℃ 냉동기에서 배치되었다. 1 시간 후, 3개의 동결된 분취량은 해동되고 온건하게 혼합되었다. 한 분취량 ("1회 동결 해동")은 냉장실에서 배치되었고, 그리고 다른 2개는 냉동기 내로 다시 넣어졌다. 상기 과정은 나머지 2개 표본에 대해 반복되었는데, 두 번째 동결 해동 표본은 냉장실로 이전되고 세 번째 동결 해동 표본은 ≤ -60℃ 냉동기에서 하룻밤 동안 유지되었다. 세 번째 표본은 다음 날 해동되었다.

동결 해동 표본 각각의 10 μg 분취량이 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 겔 결과는 도면 30에서 도시된다. 동결 해동 표본은 겔의 양측에서 동결 해동 사이에 필적하는 것으로 보인다. 감소된 측면은 각 표본에서 일부 매우 높은 MW 띠를 나타낸다. 이들 띠는 감소 단계와 연관된 겔 인공물일 수 있다.

4개의 동결 해동 표본은 HPLC-SEC에 의해 분석되었다. 50 μg 분취량이 각 표본에 이용되었다. 검정 결과는 도면 31a와 31b 및 표 21에서 도시된다. 프로필이 상당히 유사하긴 하지만, 동결 해동이 증가함에 따라서 더욱 높은 MW 종류가 증가하는 약간의 경향을 보여준다. 이들 표본의 기능 검사는 더욱 높은 MW 종류의 증가가 상기 시약의 이용에 거의 충격을 주지 않는다는 것을 드러냈다 (도면 32). SDS-PAGE 및 HPLC-SEC 분석에 근거하여, 최대 3회 동결 해동 동안 단백질 순도 및/또는 조성에서 유의미한 차이는 없다.

표 21. AF 정제된 항체의 동결 해동 검정의 HPLC-SEC 분석

동결 해동의 #	피크 #	분	mAU ^* 분	mAU	%
0	1	11.050	0.3134	1.199	0.26
	2	13.963	2.6242	2.278	2.18
	3	16.160	117.2764	132.181	97.56
	총합:		120.2140	135.658	100.00
1	1	11.050	0.3102	1.178	0.26
	2	13.973	2.6683	2.295	2.22
	3	16.163	117.1783	131.670	97.52
	총합:		120.1567	135.143	100.00
2	1	11.047	0.3140	1.208	0.26
	2	13.960	2.7041	2.287	2.26
	3	16.163	116.6066	131.513	97.48
	총합:		119.6248	135.008	100.00
3	1	11.050	0.3583	1.243	0.30
	2	13.967	3.0928	2.338	2.59
	3	16.163	116.0707	131.455	97.11
	총합:		119.5217	135.036	100.00

AF 코트 스톡 II는 분취되었고, 그리고 AF 항-FkpA 항체의 안정성이 복수 동결/해동 사건에 걸쳐 사정되었다.

AF 코트 스톡 I 및 II의 샌드위치 ELISA 비교

AF 코트 스톡 I 및 II는 탄산염 완충액, pH 9.6에서 3 μg/mL로 희석되고, Costar 96-웰 평판 (카탈로그 #9018) 위에 직접적으로 코팅되고, 그리고 2-8 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액 (인산염 완충된 식염수 (PBS)/0.05% 폴리소르베이트 20)으로 세척되고, 교반하면서 실온에서 1-2 시간 동안 검정 희석제 (0.15M 염화나트륨 [NaCl]/0.1M 인산나트륨 [NaPO4]/0.1% 어류 젤라틴/0.05% 폴리소르베이트 20/0.05% 프로클린 300)로 차단되고, 그리고 이후, ELISA 세척 완충액으로 다시 한 번 세척되었다. 표준 곡선 (100-1.56 ng/mL0 및 블랭크가 평판에 첨가되고 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액으로 세척되고, 그리고 AF HRP 접합체 스톡 I이 검정 희석제와 함께 1:6000 희석에서 평판에 첨가되고 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액으로 세척되었고, 그리고 SureBlue Reserve™ TMB 마이크로웰 페록시다아제 기질 (Kirkegaard & Perry Labs [KPL], 카탈로그 # 53-00-00)이 평판에 첨가되었고, 그리고 컬러가 실온에서 거의 20 분 동안 현색하도록 허용되었다. 반응은 0.6N 황산으로 중지되었다. OD는 450 nm의 파장에서 판독되었고, 그리고 데이터는 Softmax Pro 데이터 축소 소프트웨어를 이용하여 분석되었다. AF 코트 스톡 I 및 II로부터 산출된 표준 곡선은 거의 겹침가능하였다. 코트 농도, 검출 항체 희석, 그리고 배양 시간은 선별검사되고 최적화되었다. 3 ug/mL의 코트 농도 및 1/6000에서 AF HRP 접합체의 희석은 정확하고 견실한 것으로 결정되었다. 코트 배양 시간은 최대 3 일까지 견실하였다.

차후 혈액으로부터 항체의 정제 및 분석

토끼 A, B 및 C의 차후 혈액은 적혈구의 용혈이 일어났는지에 기초하여 모아졌는데, 용해된 물질 및 비-용해된 물질이 별개로 정제되었다. 양쪽 풀은 앞서 설명된 바와 같이, 60% ASP, 그 이후에 친화성 크로마토그래피 및 SEC에 의해 정제되었다. SEC-HPLC 데이터에 근거하여, 용해된 풀 (로트 B로서 지정됨) 및 비-용해된 풀 (로트 C로서 지정됨) 사이에 유의미한 차이는 없다. 분획물 35-38은 AF 코트 스톡 II (로트 A로서 지정됨) 물질과 가장 가깝게 유사하고, 따라서 로트 B 분획물 35-38이 함께 모아졌다 (표 22).

표 22. 로트 A 및 B의 HPLC-SEC 비교

분획물	피크 #	분	mAU^*분	mAU	%
로트 B 분획물 34-38	1	11.080	1.7297	2.458	0.69
	2	14.767	7.0641	4.538	2.82
	3	16.277	242.0951	246.183	96.49
	총합:		250.8889	253.178	100.00

분획물	피크 #	분	mAU^*분	mAU	%
로트 B 분획물 35-38	1	11.080	1.3904	1.896	0.50
	2	14.867	5.2068	3.500	1.89
	3	16.280	269.3863	275.811	97.61
	총합:		275.9836	281.206	100.00

분획물	피크 #	분	mAU^*분	mAU	%
로트 A	1	11.050	0.3134	1.199	0.26
	2	13.963	2.6242	2.278	2.18
	3	16.160	117.2764	134.181	97.56
	총합:		120.2140	135.658	100.00

로트 A, B 및 C는 샌드위치 ELISA에서 코트 항체로서 비교되었다. 코트 항체는 3 μg/mL로 희석되었다. AF HRP 접합체 스톡 I은 1:6000의 희석에서 검출 항체로서 이용되었다. 이들 3개 항체의 결과는 필적하였다 (도면 33). 로트 B의 농도는 UV 분광광도법에 의해 2.13 mg/mL인 것으로 결정되었다.

1 mg의 로트 B 항체는 제조업체의 사용설명서에 따라서 Pierce Kit EZ-Link 페록시다아제 (cat#31489)를 이용하여 HRP에 접합되었다. 로트 B HRP 접합된 항체는 추가로 1/10 희석되고 로트 B HRP 접합체 스톡 I로서 지정되었다. 로트 B는 부분 분취되고 로트 B 코트 스톡 I로서 지정되었다.

검정 견고성

검정 조건을 선별검사하고 견고성을 증명하기 위한 실험의 설계가 수행되었다. 검정 파라미터, 예를 들면, 코트 농도, 접합된 희석 및 TMB 기질 배양 시간이 변화되었다. 이들 파라미터에서 경미한 변이는 검정 결과에 영향을 주지 않았다. 최적 조건은 표 23에서 도시된다.

표 23.

Y154 파라미터
표준 곡선 범위	1.56-100 ng/mL
AF 코트 스톡 II	3ug/mL
접합체 스톡 I	1/20,000
기질 배양 시간	20 분

실시예 4. 초고순도 FkpA의 안정성

-70 ℃에서 보관된 초고순도 FkpA의 안정성

초고순도 FkpA의 안정성을 검정 대조로서 시험하기 위해, 실시예 2에서 설명된 표준 스톡 I은 검정 희석제에서 3 (낮은), 15 (중간), 75 (높은) ng/mL로 희석되고, 분취되고, -70 ℃에서 보관되었다. 낮은, 중간 및 높은 분취량의 농도는 동결에 앞서 표준 곡선을 이용하여 ELISA에 의해 계측되었다. 낮은, 중간 및 높은 초고순도 FkpA 대조의 안정성은 분취량을 해동하고 FkpA의 농도를 결정함으로써 총 18 일 동안 모니터링되었다. 낮은 대조는 -70 ℃에서 보관될 때 불안정하였다. 중간 대조는 유사한 불안정을 보여주지만, 높은 대조는 -70 ℃에서 보관될 때 안정된 것으로 보였다.

-70 ℃와 비교하여 2-8 ℃에서 보관된 초고순도 FkpA의 안정성

두 번째 시험은 총 8 일 동안 절반이 -70 ℃에서 보관되고 다른 절반이 2-8 ℃에서 보관되는 새로운 세트의 낮은 및 중간 대조에서 수행되었다. 농도는 동결에 앞서 계측되지 않았다. 이전 실험에서처럼, 동결된 대조의 농도는 1 일자에 계산된 목표 농도로부터 30% 하락하기 시작하였다. 2-8 ℃에서 보관된 대조의 농도는 -70 ℃에서 보관된 대조보다 더욱 느린 비율로 하락하긴 하지만, 이러한 하락은 허용되는 범위를 여전히 벗어나 있는 것으로 고려되었다 (도면 34).

변하는 양의 폴리소르베이트에서 제조된 초고순도 FkpA의 안정성

표준 스톡 I은 검정 대조에서 이용을 위해 검정 희석제에서 변하는 양의 폴리소르베이트에서 3 (낮은), 15 (중간), 또는 75 (높은) ng/mL로 희석되었다. 검정 희석제는 0.05% 폴리소르베이트를 내포하고, 따라서 이것이 -70 ℃에서 동결된 대조의 안정성을 향상시키는 지를 확인하기 위해 0.1, 0.25, 0.5 및 1%의 폴리소르베이트 농도가 시험되었다. FkpA의 다양한 용액이 동결에 앞서 (T=0) 시험되고 앞서 설명된 바와 같이 전체 15 일 동안 모니터링되었다. 3 ng/mL로 희석된 모든 표본의 경우에, 0.5% 폴리소르베이트를 내포하는 표본만 총 15 일 동안 T=0와 비교할 때 농도에서 20%보다 적은 하락을 갖는 것으로 보인다. 다른 3 ng/mL 조건의 경우에 더욱 큰 가변성이 관찰되었다 (표 24). 15 ng/mL 용액의 경우에, 어떤 조건도 목표 농도보다 30% 이상 낮은 농도를 갖지 않았다. 0.5% 또는 0.25% 폴리소르베이트를 내포하는 농도는 전체 15 일 동안 목표의 20% 이내에 머물렀다 (표 24). 0.5% 폴리소르베이트는 시험된 모든 대조 중에서 최고 회수를 산출하였다. 목표 농도 및 0 일자 둘 모두로부터 퍼센트 차이 (%차이)는 1-13% 사이이고, 그리고 %CV는 1-10%이다. 0.10% 폴리소르베이트에서 희석된 대조는 20%보다 적은 %차이를 갖지 않았지만, 낮은 대조의 경우에 20%의 %CV로 더욱 가변적이었다. 전반적으로, 증가된 양의 폴리소르베이트는 초고순도 FkpA 불안정을 예방하는데 적합한 것으로 간주되지 않았다.

표 24. 상이한 농도의 폴리소르베이트의 비교

	0.05% 폴리소르베이트			0.10% 폴리소르베이트			0.25% 폴리소르베이트
	낮음	중간	높음	낮음	중간	높음	낮음	중간	높음
평균	2.334	12.482	69.327	2.625	12.499	70.272	2.403	13.256	70.126
Std	0.200	0.725	4.418	0.518	0.542	6.009	0.443	0.650	4.723
%CV	9%	6%	6%	20%	4%	9%	18%	5%	7%
T=0 (신규)으로부터 %차이	-7%	1%	-1%	-8%	-4%	-10%	-15%	2%	-8%
목표로부터 %차이	-22%	-17%	-8%	-12%	-17%	-6%	-20%	-12%	-6%
	0.5% 폴리소르베이트			1.0% 폴리소르베이트
	낮음	중간	높음	낮음	중간	높음
평균	2.709	12.991	70.301	2.394	12.518	67.780
Std	0.082	0.730	5.665	0.343	0.399	8.412
%CV	3%	6%	8%	14%	3%	12%
T=0 (신규)으로부터 %차이	-2%	-1%	-10%	-11%	-1%	-9%
목표로부터 %차이	-10%	-13%	-6%	-20%	-17%	-10%

어류 젤라틴, 아포맙 및 완충액 C에서 제조된 초고순도 FkpA의 안정성

0.2% 어류 젤라틴, 1 mg/mL 아포맙 (아슈케나지, A, 2008, Nature Reviews Drug Discovery, 7:1001-1012) 또는 완충액 C (20 mM 히스티딘 아세트산염, 240 mM 수크로오스, 0.02 % 폴리소르베이트 20, pH 5.5)에서 3 (낮은), 15 (중간), 또는 75 (높은) ng/mL로 희석될 때 -70 ℃에서 초고순도 FkpA의 안정성이 결정되었다. (도면 35a 및 35b). 결과는 여러 상이한 조성물 및 대조에서 FkpA의 안정성이 완충액 C에서 보관될 때 모든 사례에서 -70 ℃에서 안정된 상태로 남아있다는 것을 증명한다. 실례로서, 완충액 C에서 대조 회수의 견고성이 이러한 검정을 16 회 반복함으로써 증명되었다 (표 25). 가변성은 허용되는 범위 내에 있었다.

표 25. FkpA의 검출을 위한 ELISA

	낮은 대조 회수 (ng/mL)	중간 대조 회수 (ng/mL)	높은 대조 회수 (ng/mL)
평균	2.897	13.584	74.535
표준편차	0.224	0.441	3.131
CV	8%	3%	4%
N	16	16	16

실시예 5. 상업적인 FkpA 시약과 초고순도 FkpA의 비교

상이한 FkpA 표준을 검출하는 실시예 3에서 설명된 샌드위치 ELISA 검정의 능력이 결정되었다. 다양한 표준은 표준 스톡 I (실시예 2에서 설명됨), BioSource FkpA 표준 카탈로그 번호 MBS1037402 및 BioSource FkpA 표준 카탈로그 번호 MBS1182120를 포함하였다. 이용된 표준은 1.56 내지 100 ng/mL이었다. BioSource FkpA 표준 카탈로그 번호 MBS1037402 및 MBS1182120은 표준 스톡 I보다 더욱 낮은 신호를 갖는 표준 곡선을 산출하였다 (도면 36).

실시예 6. 항-IL13/항-IL17 IgG4 이중특이적 항체의 산출

대장균 (E. coli)에서 2개의 상이한 경쇄를 갖는 인간 IgG1 이중특이적 항체를 산출하는 기술 (Yu et al., 2011, Sci Transl Med 3, 84ra44). 상기 방법은 면역글로불린 중쇄의 이형이합체를 증진하기 위해 노브-인투-홀 기술을 활용한다 (Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9, 617-621; Atwell et al., 1997, J Mol Biol 270, 26-35). 경쇄 오대합 없이 2개의 상이한 경쇄의 이용을 할 수 있게 하기 위해, 각 팔은 별개의 대장균 (E. coli) 세포에서 헤미머 또는 절반 항체로서 배양되었다. 이러한 접근법은 항-IL17 및 항-IL13 부모 항체를, 인간 IgG4 홀로서 항-IL17 팔의 발현 및 인간 IgG4 노브로서 항-IL13 팔의 발현을 허용하는 벡터 내로 하위클로닝함으로써 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체를 산출하는데 이용되었다. IgG4 노브 중쇄 불변 영역의 서열은 서열 번호:15 또는 16에서 도시되고, 그리고 IgG4 홀 중쇄 불변 영역의 서열은 서열 번호:26 또는 27에서 도시된다.

초기 항체 발현을 위해, 단지 내인성 FkpA만을 발현하는 대장균 (E. coli) 균주 64B4가 이용되었다. 초기 사정 동안, 우리는 형성된 항-IL-17 절반-항체가 7보다 높은 pH에서 침전된다는 것을 발견하였다. 절반-항체는 포획되고, 그리고 이후, 낮은 pH에서 단백질 A 칼럼으로부터 용리되고, 그리고 용출물은 산화환원 반응에서 이중특이적 항체의 조립을 실행하기 위해 pH 8.5로 조정되었다. 항-IL-17 절반 항체 용출물 중에서 약 20%가 pH 조정 후 침전으로 상실되었다. 항-IL-13 절반 항체와 대합을 이루는 가용한 항-IL-17 절반 항체의 감소는 이들 두 절반 항체의 비율 사이에 불균형을 야기하고 항-IL-13/IL-17 이중특이적 항체의 수율을 감소시켰다. 차후에, 절반 항체는 외인성 FkpA, DsbA 및 DsbC를 과다발현하는 상이한 대장균 (E. coli) 균주에서 생산되었다. 대장균 (E. coli) 균주 67A6 (유전자형: W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096 (IlvG+; Valr) Δprc spr43H1 ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE742 degPS210A)은 항-IL13 또는 항-IL17 절반 Ab의 LC 및 HC, 그리고 샤프롱 FkpA, DsbA 및 DsbC를 인코딩하는 TIR (번역 개시 영역) 2,2 단일 플라스미드로 형질전환되었다. 양쪽 플라스미드에서, FkpA의 발현은 phoA 프로모터의 제어 하에 있었고, 그리고 DsbA 및 DsbC의 발현은 폴리시스트론성 방식으로 tacII 프로모터의 제어 하에 있었다. LC 및 HC 둘 모두 독립된 phoA 프로모터의 제어 하에 있었다. 이들 플라스미드는 67A6를 형질전환하는데 이용되었다. 발현된 FkpA는 선천적 신호 펩티드를 내포한다.

절반-항체 항-IL13.노브 및 항-IL17.홀은 상기 설명된 67A6 대장균 (E. coli) 세포의 배양액에서 각각 성장되었다. 항-IL13.노브에 대한 대규모 배양액은 pH 6.7 ± 0.2에서 유지되었고, 그리고 항-IL17.홀의 대규모 배양액은 pH 7.0 ± 0.2에서 유지되었다. 배양액은 배양액의 OD가 150에 도달할 때까지 34 ℃에서 220 rpm에서 성장되었다. 배양액은 이후, 25 ℃ 160 rpm으로 이동되었다. 전체 발효는 72 시간이었다.

각 절반 항체에 대한 전체 액체배지는 미소유체공학을 통해 별개로 균질화되었다. 각 균질액 풀은 이후, 물로 희석되고, PEI로 조건화되고, 실온에서 배양되었다. 이러한 조건화 균질액 풀은 차후에, 고체를 분리하기 위해 원심분리되고, 그 이후에 일련의 필터를 통해 센트레이트를 내포하는 절반-항체가 여과되었다.

각 절반 항체의 역가는 FkpA, DsbA 및 DsbC의 외인성 발현 없이 대장균 (E. coli) 균주 64B4에 의해 생산된 역가보다 약 10 내지 20 배 높았다 (데이터 제시되지 않음). 따라서, FkpA, DsbA 및 DsbC의 외인성 발현이 항-IL13/IL17 항체를 제조하기 위해 채택되었다.

각 절반 항체는 이후, MabSelect SuRe™ 수지 (GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 칼럼 위에 별개로 포획되었다. 칼럼 평형화 후, 센트레이트는 칼럼 위에 부하되고 평형화 완충액 및 두 번째 세척 완충액으로 세척되었다. 절반 항체는 산성 조건 (pH 2.8) 하에 칼럼으로부터 용리되었다.

항-IL13/항-IL17 항체의 조립

친화성-정제된 항-IL13 및 항-IL17 절반 항체는 1:1 질량비에서 합동되고, 그 이후에 pH 8.5로 적정되었다. 조립 과정으로부터 예상된 이중특이적 항체의 이론적 최대량에 대하여 100x 과잉 몰 비율의 L-글루타티온, 환원된 (GSH)가 혼합물에 첨가되었고, 그리고 온도가 실온으로부터 35℃로 조정되었다. 2개의 절반 항체는 산화환원 반응 동안 시험관내에서 조립되어 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체를 형성하였다. 산화환원 반응은 35℃에서 12 - 24 시간 동안 지속되었다. 조립 반응은 pH를 6.5로 조정함으로써 퀀칭되었고, 그리고 풀은 아래에 설명된 정제 과정에 종속되기 전에 물로 희석되었다.

초기 MabSelect SuRe™ 정제 및 조립 이후에, 이중특이적 항체의 정제의 여러 순차적 단계가 수행되었다. 조립된 항체는 먼저, CAPTO^TM ADHERE 수지 (GE Healthcare Life Sciences)를 이용한 결합-및-용리 방식으로 작동된 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 정제되었다. 칼럼 평형화 (50 mM 아세트산염, pH 6.5) 후, 조정된 조립 풀은 칼럼 위에 부하되고, 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, 두 번째 세척 완충액 (200 mM 아세트산염, pH 6.5)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (25 mM 아세트산염, pH 5.2)의 pH를 낮춤으로써 용리되었다.

CAPTO^TM ADHERE 크로마토그래피 이후에, SEC-HPLC에 의해 계측될 때, 이중특이적 항체 산물의 농도는 약 80-85%로부터 ≥ 92%로 증가하였고, 그리고 고분자량 종류 농도는 약 12-15%로부터 약 ≤4%로 감소하였다. 이에 더하여, 제조물에서 ECP는 약 2 로그 감소하였고, DsbA는 약 1 로그 감소하였고, 그리고 FkpA는 0.75 로그 감소하였다.

풀은 Q SEPHAROSE^® 패스트 플로우 수지 (GE Healthcare Life Sciences)를 이용한 결합-및-용리 방식으로 작동된 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 걸쳐 더욱 정제되었다. pH 8.5로 조정된 Capto^TM 부착 용출물 풀은 평형화된 Q Sepharose^® 패스트 플로우 칼럼 위에 부하되고 평형화 완충액 (50 mM Tris, pH 8.5)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (50 mM Tris, 100 mM 아세트산나트륨, pH 8.5)의 전도도를 증가시킴으로써 칼럼으로부터 용리되었다.

QSFF 크로마토그래피 이후에, SEC-HPLC에 의해 계측될 때, 이중특이적 항체 산물의 농도는 약 ≥ 92%로부터 ≥ 94%로 증가하였고, 고분자량 종류 농도는 ≤4%로부터 약 ≤2.5%로 감소하였고, 그리고 매우 높은 분자량 종류의 양은 검출될 수 없었다. 이에 더하여, 제조물에서 DsbC는 약 4 배 감소하였고, 그리고 FkpA는 4-5 배 감소하였다.

QSFF 용출물 풀은 pH 5.5로 조정되고, 그리고 페닐 SEPHAROSE^® 6 패스트 플로우 (높은 치환) 수지 (GE Healthcare Life Sciences)를 이용하고 관류 방식으로 작동된 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼에서 더욱 정제되었다. 칼럼은 평형화되었고 (170 mM 아세트산염, pH 5.5), 그리고 조정된 QSFF 풀이 칼럼 위에 부하되었다. 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체는 관류하였고, 그리고 칼럼은 차후에, 평형화 완충액으로 세척되었다. 산물 풀 수집은 OD₂₈₀에 근거하여 시작되고 종결되었는데, 풀링이 0.5 내지 1 OD 사이에서 또는 최대 10 CV의 칼럼 세척 용적에서 발생하였다. 풀은 이후, 농축되고 한외여과/정용여과 (UF/DF)를 이용하여 완충액 교환되었다.

수행된 두 번째 실행에서 유사한 결과가 획득되었다.

실시예 7. 항-IL13/항-IL17 항체의 제조에서 불순물의 검출

항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체의 2개 로트는 비-대합된 절반 항체, 동종이합체, 저분자량 종류 (LMWS), 고분자량 종류 (HMWS), 매우 높은 분자량 종류 (vHMWS), 산성 변이체, 염기성 변이체, FkpA, DsbA, DsbC, ECP, 침출된 단백질 A, 대장균 (E. coli) DNA, 그리고 내독소를 비롯한 불순물의 존재에 대해 분석되었다. 산물 품질은 표 26에서 제시된다.

표 26. 산물 품질

산물 품질 속성	검정	산물 품질 목표	실행 1	실행 2
이중특이적 (%)	HIC-HPLC	≥90%	97.2	97.3
aIL17 종류 (%)		≤5%	1.3	1.0
aIL13 ½ mAb (%)		≤5%	1.1	1.2
aIL13 동종이합체 (%)		≤5%	0.5	0.5
주요 (%)	NR CE-SDS	≥85%	94.0	95.5
LMW (%)			3.8	3.7
LMW (%)	SEC-HPLC		<LOQ	<LOQ
주요 (%)		≥95%	98.5	98.8
HMWS (%)		≤5%	1.5	1.2
vHMWS (%)		<LOQ	<LOQ	<LOQ
산성 (%)	icIEF		21.0	21.0
주요 (%)			75.8	76.4
염기성 (%)			3.2	2.6
ECP (ppm)	ELISA	<100 ppm	19	20
대장균 (E. coli) 샤프롱 (ppm)	ELISA 또는 LC-M/MS	≤ 10 ppm (각각)	DsbA=0.5 DsbC=0.7 FkpA=11 (LC-MS/MS)	DsbA=0.4 DsbC=0.2 FkpA=10 (LC-MS/MS)
침출된 단백질 A (ppm)	ELISA	≤50	<2 ppm	<2 ppm
대장균 (E. coli) DNA (ppb)	qPCR	≤8.3	<0.1 ppb	<0.1 ppb
내독소 (EU/mL)	LAL	≤4	0.3	0.2

정제된 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체에서 FkpA의 검출

FkpA의 농도는 초고순도 FkpA에 대한 항체뿐만 아니라 표준 및 대조를 위한 초고순도 FkpA를 이용한 ELISA에 의해 결정되었다. 표본은 또한, 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체의 각 생산 시기 후, LC-MS/MS (액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법)에 의해 FkpA의 존재에 대해 분석되었다.

ELISA 및 LC-MS/MS에 의한 검출 FkpA는 아래에 설명된다. 결과는 표 27에서 도시된다.

표 27 항-IL13/항-IL17 표본에서 FkpA 농도

과정 단계	실행 1			실행 2
	LC-MS/MS (ppm)	ELISA (ppm)	단백질 농도 (mg/mL)	LC-MS/MS (ppm)	ELISA (ppm)	단백질 농도 (mg/mL)
αIL13 센트레이트	시험되지 않음	1449419	1.71	시험되지 않음	1202344	1.90
αIL17 센트레이트	시험되지 않음	2588278	0.96	시험되지 않음	2483876	0.97
αIL13 MabSelect SuRe^TM	3380	2859	16.7	3840	2677	14.9
αIL17 MabSelect SuRe^TM	2330	1990	19.6	2510	1870	19.3
조립	3070	2447	13.6	3260	2294	13.0
Capto^TM 부착	820	447	5.1	744	593	7.3
QSFF	243	116	9.9	160	117	9.6
페닐 HS (높은 치환)	13	6	6.2	10	7	6.0
UF/DF	11	6	191.7	11	6	178.7

ELISA에 의한 FkpA의 검출

초고순도 FkpA를 향해 지향된 다중클론 혈청은 탄산염 완충액, pH 9.6에서 3 μg/mL로 희석되고, Costar 96-웰 평판 (카탈로그 #9018) 위에 직접적으로 코팅되고, 그리고 2-8 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액 (인산염 완충된 식염수 (PBS)/0.05% 폴리소르베이트 20)으로 세척되고, 교반하면서 실온에서 1-2 시간 동안 검정 희석제 (0.15M 염화나트륨 /0.1M 인산나트륨/0.1% 어류 젤라틴/0.05% 폴리소르베이트 20/0.05% 프로클린 300)로 차단되고, 그리고 이후, ELISA 세척 완충액으로 다시 한 번 세척되었다. 초고순도 FkpA의 표준 곡선 (100-1.56 ng/mL) 및 블랭크가 평판에 첨가되고 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액으로 세척되고, 그리고 친화성 정제된 항-FkpA HRP 접합체 스톡이 검정 희석제와 함께 1:6000 희석에서 평판에 첨가되고 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 ELISA 세척 완충액으로 세척되었고, 그리고 SureBlue Reserve™ TMB 마이크로웰 페록시다아제 기질 (Kirkegaard & Perry Labs, 카탈로그 # 53-00-00)이 평판에 첨가되었고, 그리고 컬러가 실온에서 거의 20 분 동안 현색하도록 허용되었다. 반응은 0.6N 황산으로 중지되었다. OD는 450 nm의 파장에서 판독되었고, 그리고 데이터는 Softmax Pro 데이터 축소 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.

LC-MS/MS에 의한 FkpA의 검출

0.5 mg 아포맙에서 1, 5, 10, 25 및 50 ppm FkpA의 FkpA 표준. 0.5 mg의 각 항체 표본 및 표준은 정제수로 5 mg/mL의 최종 농도까지 희석되었다. 400 μL 변성 완충액 (7.2 M 구아니딘 염산염, 0.3 M 아세트산나트륨, pH 5.0) 및 10 μL 0.5 M 결합-파괴자 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 중성 pH (Pierce)가 100 μL의 희석된 표본에 첨가되었고, 그리고 표본은 37 ℃에서 15 분 동안 항온처리되었다.

NAP-5 탈염 칼럼은 ~10 mL의 탈염 완충액 (1 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM TCEP, pH 5.0)으로 평형화되었다. 표본은 부하되고 800 μL의 탈염 완충액으로 용리되었다. 100 μL의 0.5 M MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산, 4-모르폴린프로판-술폰산)가 각 표본에 첨가되었다.

20 μL의 0.5 mg/mL 트립신이 각 표본에 첨가되었고, 그리고 표본은 37 ℃에서 60 분 동안 항온처리되었다. 트립신은 30 μL의 10% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 첨가함으로써 비활성화되었다.

100 μL의 각 소화된 표본이 복수 반응 모니터링 (MRM)에 의한 LC-MS/MS 분석을 위해 주입되었다. LC는 2.1 mm x 150 mm, 1.7 μm Waters CSH C18 UPLC 칼럼을 갖는 Waters Acquity H-Class Bio UPLC에서 수행되었다. 칼럼 온도는 60 ℃이었고, 유속은 0.3 mL/분이었고, 그리고 완충액 A (0.1% 포름산을 포함하는 물) 및 완충액 B (0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴)가 45 분 동안 0-40% B의 구배로서 이용되었다.

MS/MS는 Sciex 6500Qtrap 질량분광계로 수행되었다. MRM은 FkpA 펩티드 SAYALGASLGR (서열 번호: 45) 펩티드의 +2 전구체 이온의 y6 단편 이온으로의 이행을 모니터링한다. 충돌 에너지는 28.1 V이었고, 디클러스터링 전위 = 70 V이었고, 그리고 체류 시간은 100 ms이었다. 전구체의 경우 Q1 질량=533.3, y6 단편 이온의 경우 Q3 질량=560.3. FkpA 표준 곡선이 항-IL13/항-IL17 표본에서 FkpA 농도를 결정하는데 이용되었다.

실시예 8. 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체의 5-칼럼 정제

항-IL13/항-IL17 항체에서 FkpA의 농도를 더욱 감소시키기 위해, 추가 정제 단계가 앞서 설명된 4-칼럼 절차에 추가되었다. POROS^® 50HS 양이온 교환 크로마토그래피가 평가되었다. pH 5.0으로 조정된 페닐 SEPHAROSE^® 6 패스트 플로우 (높은 치환) 용출물 풀의 표본이 POROS^® HS 50 (Applied Biosystems^TM) 양이온 교환 칼럼에 적용되고 결합-및-용리 방식으로 정제되었다. 이중특이적 항체는 선형 염 구배 (22 CV에 걸쳐 0 내지 500 mM 아세트산염, pH 5.8)를 이용하여 용리되었다. 표본은 이후, 불순물의 제거에 대해 검정되었다. 결과는 표 28에서 제시된다.

표 28. 예비적 POROS^® HS 50 다섯 번째 크로마토그래피 단계의 결과

부하 물질	풀			부하 밀도 (g/L)		회수 (%)		ELISA					LC-MS/MS
								FkpA (ppm)		ECP (ppm)		DsbA (ppm)		DsbC (ppm)		FkpA (ppm)
실행 1	부하			20		75		7		24		<LOQ		<LOQ		13
	POROS^® HS 50							1		9		n.t.		n.t.		1
실행 2	부하			20		79		6		22		<LOQ		<LOQ		10
	POROS^® HS 50							2		15		n.t.		n.t.		3

부하 물질		풀	풀 용적 (CV)		SEC		RPLC		HIC-HPLC		NR CE-SDS		icIEF
					HMWS (%)		주요 피크 (%)		BsAb (%)		BsAb (%)		순도 (%)		산성 (%)	주요 (%)	염기성 (%)
실행 1		부하	2.5		1.6		96.6		95.8		97.0		95.0		21.4	74.9	3.8
		POROS^® HS 50			0.4		98.6		98.0		98.4		97.6		20.5	77.1	2.4
실행 2		부하	2.5		0.8		98.2		96.7		97.6		95.5		21.3	76.0	2.7
		POROS^® HS 50			0.7		98.1		97.1		n.t.		n.t.		n.t.	n.t.	n.t.

n.t.: 시험되지 않음

BsAb = 이중특이적 항체

이들 결과에 근거하여, POROS^® HS 50 칼럼은 항-IL13/항-IL17의 정제 계획 내로 통합되었다. 절반-항체는 MabSelect SuRe™ 칼럼에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되고 실시예 6에서 설명된 바와 같이 조립되었다. 조립된 항-IL13/항-IL17 항체는 실시예 6에서 설명된 바와 같이 CAPTO^TM ADHERE, Q SEPHAROSE^® 패스트 플로우 및 페닐 SEPHAROSE^® 6 패스트 플로우 (높은 치환) 크로마토그래피 단계에 의해 더욱 정제되었다.

UF/DF 단계에 앞서, 페닐 SEPHAROSE^® 6 패스트 플로우 칼럼으로부터 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체 풀은 결합-및-용리 방식으로 작동된 POROS^® HS 50 칼럼에서 정제되었다. 칼럼은 평형화되었고 (50 mM 아세트산염, pH 5.5), 그리고 희석된 페닐 SEPHAROSE^® 6 패스트 플로우 (높은 치환) 관류 풀이 칼럼 위에 부하되었다. 칼럼은 평형화 완충액, 그 이후에 두 번째 세척 완충액 (50 mM 아세트산염, pH 5.8)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 22 CV에 걸쳐 10-100%B의 선형 염 구배를 이용하여 칼럼으로부터 용리되었다 (A: 물, B: 500 mM 아세트산염, pH 5.8). 용출물 수집은 OD₂₈₀에 근거하여 시작되고 종결되었는데, 풀링이 0.5 내지 1 사이에서 발생하였다.

차후에, POROS^® HS 50 풀의 농축 및 완충액 교환이 한외여과/정용여과 (UF/DF)를 이용하여 수행되었다.

상기 과정은 αIL13 및 αIL17의 4가지 상이한 발효로 반복되었다.

최종 산물의 표본뿐만 아니라 정제 과정의 상이한 단계 후 표본이 산물 특이적 불순물에 대해 분석되었다. 표본 내에 고분자량 종류 (HMWS)의 분석의 결과는 표 29에서 제시된다. 간단히 말하면, 조립된 이중특이적 항체 시작 물질은 약 91-94% 산물 및 약 6.0-7.5% HMWS를 내포하였다. Capto^TM 부착 혼합 방식 크로마토그래피 이후에, 표본은 약 95-98% 산물 및 약 2.2% HMWS를 내포하고 표본 내에 HMWS 불순물의 양에서 감소를 보여주었다. 음이온 교환, HIC 및 양이온 교환 이후에, 표본은 98-99.6% 산물 및 0.2-1.5% HMWS를 내포하였다.

표 29. 분석적 SEC-HPLC 결과

과정 단계	실행 1		실행 2		실행 3		실행 4
	주요 피크 (%)	HMWS (%)	주요 피크 (%)	HMWS (%)	주요 피크 (%)	HMWS (%)	주요 피크 (%)	HMWS (%)
조립	91.8	7.5	93.2	6.1	93.6	5.8	93.3	3.4
Capto^TM 부착	97.6	2.2	96.1	2.2	95.4	2.1	95.2	2.3
QSFF	98.7	1.1	97.2	1.4	96.6	1.5	96.4	1.9
페닐 HS	99.3	0.5	99.2	0.7	97.7	0.8	97.3	1.7
POROS^® HS 50	99.6	0.2	99.6	0.3	98.4	0.3	98.0	1.5

5-칼럼 과정 풀의 표본은 초고순도 FkpA에 대한 항체를 이용하여 실시예 4에서 제시된 ELISA를 이용함으로써 FkpA의 존재에 대해 분석되었다. 표 30 및 31에서 보여 지는 바와 같이, 5-칼럼 과정은 이중특이적 항체 제제로부터 FkpA를 제거하는데 효과적이었다.

따라서, 본원에서 설명된 정제 과정은 외인성 FkpA를 과다발현하는 대장균 (E. coli) 세포에 의해 생산된 절반 항체로부터 조립된 예시적인 이중특이적 항체, 다시 말하면, 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체의 표본에서 ELISA 검정에 의해 분석될 때, FkpA 수준을 실제적으로 제거하거나 또는 6 ppm 이내로 감소시켰다. 비교로서, FkpA의 수준은 내인성 FkpA만을 발현하는 대장균 (E. coli) 세포 (가령, 외인성 FkpA 또는 다른 샤프롱 단백질을 발현하는 플라스미드를 품지 않는 균주 64B4)에 의해 생산되고 ProPac^TM HIC-10 칼럼에 의해 정제된 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체의 표본에서 동일한 ELISA 검정에 의해 결정될 때 7 ppm 상태로 남아있다 (데이터 제시되지 않음).

표 30. ELISA에 의해 결정된 항-IL13/항-IL17 표본에서 FkpA 농도

과정 단계	실행 1	실행 2	실행 3	실행 4
αIL13 센트레이트	1248255	532393	1782250	1621115
αIL17 센트레이트	1923183	786910	2511409	2381039
αIL13 MabSelect SuRe™	2138	2064	2411	2214
αIL17 MabSelect SuRe™	1425	1608	2003	1780
조립	2173	2073	2376	2131
Capto™ Adhere	277	283	404	354
QSFF	109	100	166	109
페닐 HS	2	3	6	4
POROS^® 50HS	0.2	0.4	0.7	0.5
UF/DF	<0.3	0.6	0.9	0.5

표 31 항-IL13/항-IL17 표본에서 단백질 농도 (mg/mL)

과정 단계	실행 1	실행 2	실행 3	실행 4
αIL13 센트레이트	1.2692	1.2200	1.2124	1.3013
αIL17 센트레이트	0.8394	0.8485	0.8143	0.8099
αIL13 MabSelect SuRe™	13.83	13.78	14.04	13.49
αIL17 MabSelect SuRe^TM	18.33	16.88	17.13	16.63
조립	12.30	10.52	10.89	11.78
Capto^TM 부착	5.77	8.44	6.27	6.29
QSFF	5.86	11.25	11.64	11.97
페닐 HS	2.78	5.64	5.86	6.01
POROS^® HS 50	4.36	4.64	5.64	5.68
UF/DF	159.05	176.38	174.73	179.70

실시예 9. FkpA를 외인성으로 발현하는 대장균 ( E. coli )에서 생산된 폴리펩티드를 정제하기 위한 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피의 평가

고처리량 선별검사는 전통적인 음이온 교환 크로마토그래피 (가령, QSFF 크로마토그래피)와 비교하여 혼합 방식 음이온-교환 크로마토그래피에서 산물-관련된 불순물의 증강된 분해능을 지시하였다 (도면 37). 항-IL17 단위체는 QSFF 크로마토그래피에 의해 거의 또는 전혀 분리되지 않았지만, 혼합 방식 크로마토그래피에서 항-IL13 단위체 및 항-IL17 이합체 종류의 향상된 분리가 관찰되었다.

이중특이적 항체의 정제에서 혼합 방식 크로마토그래피의 이용이 평가되었다. 평가의 유력 부분에서, IL13 또는 IL17에 결합하는 절반-항체는 세균 배양액에서 별개로 제조되었다. IL13 또는 IL17에 결합하는 절반-항체는 이후, 단백질 A 크로마토그래피를 이용한 친화성 크로마토그래피 (MabSelect SuRe™ 크로마토그래피)에 종속되었다. 부분적으로 정제된 항체는 이후, 조립되어 앞서 설명된 바와 같이 IL13 및 IL17에 결합하는 이중특이적 항체를 형성하였다. 조립된 이중특이적 항체는 QSFF 음이온 교환 크로마토그래피, 그리고 이후, Capto™ Adhere 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 (훈련 1)에 종속되거나, 또는 Capto™ Adhere 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피, 그리고 이후, QSFF 음이온 교환 크로마토그래피 (훈련 2)에 종속되었다. 결과는 표 32에서 제시된다.

표 32. 산물 품질

단계	A280 수율 (%)		BsAb 수율 (%)		SEC-전체 HMWS (%)		RPLC-BsAb 순도 (%)
	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2
αIL13 MSS	90		3.6		--		--
αIL17 MSS	80		9.1				--
조립	100		86		7.8		85.6
칼럼 2	71	72	76	80	1.4	1.6	92.8	94.6
칼럼 3	77	97	80	98	0.6	0.7	96.7	96.2
전체	39	50	53	67
단계	CE-SDS BsAb 순도 (%)		iCIEF-산성 (%)		iCIEF-주요 (%)		iCIEF-염기성 (%)
	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2
αIL13 MSS	--		--		--		--
αIL17 MSS	--		--		--		--
조립	84.2		36.6		60.5		2.9
칼럼 2	92.0	94.2	38.1	28.9	58.3	67.3	3.6	3.8
칼럼 3	96.3	95.9	28.5	31.3	68.5	65.2	3.1	3.5

조립된 이중특이적 항체를 음이온 교환 크로마토그래피 전에 혼합 방식 음이온 크로마토그래피에 종속시키는 것은 일반적으로, 향상된 산물 변이체 제거를 유발하였다.

과정-관련된 불순물의 소실은 표 33에서 제시된다.

표 33. 과정-관련된 불순물

단계	ECP (%)		DsbA (ppm)		DsbC (ppm)
	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2	훈련 1	훈련 2
αIL13 MSS	1451		39		144
αIL17 MSS	3060		64		350
조립	972		38		156
칼럼 2	239	56	49	3	149	39
칼럼 3	87	8	2	2	37	26

훈련 2를 이용하여 정제된 물질에서 불순물의 더욱 적은 양에 의해 보여 지는 바와 같이, 혼합 방식이 음이온 교환 크로마토그래피에 선행할 때, 향상된 불순물 소실이 관찰되었다.

결합 및 용리 QSFF 음이온 교환 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 50 mM Tris, pH 8.5로 평형화되었다. pH 8.5 및 ≤ 1.8 mS/cm로 조정된 조립 풀 (훈련 1) 또는 Capto™ Adhere 용리 풀 (훈련 2)이 충전된 수지의 L당 ≤ 20 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고, 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, 두 번째 세척 완충액 (pH 8.5에서 5 mM 아세트산나트륨과 함께 50 mM Tris)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (pH 8.5에서 139 mM 아세트산나트륨과 함께 50 mM Tris)의 전도도를 증가시킴으로써 용리되었다. 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

결합 및 용리 Capto™ Adhere 혼합 방식 음이온 교환 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 50 mM 아세트산염, pH 6.5로 평형화되었다. pH 6.5 및 ≤ 7.0 mS/cm로 조정된 QSFF 용리 풀 (훈련 1) 또는 조립 풀 (훈련 2)이 충전된 수지의 L당 ≤ 24 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고, 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, 두 번째 세척 완충액 (200 mM 아세트산염, pH 6.5)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (25 mM 아세트산염, pH 5.2)의 pH를 낮춤으로써 용리되었다. 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

실시예 10. HIC 수지를 FkpA 감소에 대해 선별검사

다수의 HIC 수지가 폴리펩티드 산물, 예를 들면, 이중특이적 항체 산물에서 FkpA의 감소에 대해 선별검사되었다. 수지는 Bakerbond™ WP Hi-프로필, Capto™ 옥틸, Capto™ 부틸, Toyopearl^® 헥실-650C, Toyopearl^® PPG-600M, Toyopearl^® 페닐-650M, Toyopearl^® 부틸-650M, 그리고 Toyopearl^® 에테르-650M을 포함하였다. 헥실 650C는 가장 낮은 FkpA 수준을 관류 방식으로 산출하였고, Capto^® 부틸이 그 뒤를 이었다 (도면 38 및 39). 변하는 염 유형과 농도 및 pH 조건 하에 이들 수지에 산물 및 FkpA의 배치 결합을 평가하기 위해 로봇 고처리량 선별검사가 수행되었다. 3가지 상이한 코스모트로픽 염이 선택성에 대한 염 유형의 효과를 결정하기 위해 조사되었다. 시험된 염 및 농도 범위는 다음과 같았다: 100 - 800 mM 아세트산나트륨, 100 - 400 mM 황산나트륨, 500 - 2000 mM 염화나트륨. 이에 더하여, 5.0 - 7.0의 pH 범위가 평가되었다. 96-웰 막-바닥 평판은 각 웰에서 거의 50 μL의 수지로 충전되고 각 실험을 위한 적절한 결합 조건 (염 유형, 염 농도, pH)에서 평형화되었다. 상응하는 결합 조건에 맞게 조정된 FkpA를 내포하는 부분적으로 정제된 산물 풀 (다시 말하면, 시작 부하 물질/공급원료)이 수지의 μL당 50 μg의 산물의 부하 밀도를 목포로 하여 각 웰에 적용되었다. 평형을 달성하기 위한 혼합 및 항온처리 이후에, 상층액은 수집되고, 그리고 시작 부하 물질/공급원료에 비하여 획득된 산물의 농축을 사정하기 위해 상대적 산물 및 FkpA 함량에 대해 분석되었다. 헥실 650C는 가장 낮은 FkpA 수준을 관류 방식으로 산출하였고, Capto™ 부틸이 그 뒤를 이었다.

실시예 11. 과정 버전

다수의 과정 버전이 평가되었다. 과정의 첫 번째 실례에서, 절반 항체는 대장균 (E. coli)에서 생산되었다. 도면 40a를 참조한다. 각 절반 항체에 대한 대장균 (E. coli) 전체 세포 액체배지는 미소유체공학을 통해 균질화되었다. 각 균질액 풀은 물로 희석되고, PEI로 조건화되고, 실온에서 배양되었다. 조건화 균질액 풀은 차후에, 고체를 분리하기 위해 원심분리되고, 그 이후에 일련의 필터를 통해 센트레이트를 내포하는 절반-항체가 여과되었다. 절반 항체는 이후, 단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 이용한 친화성 정제 (MabSelect SuRe™)에 종속되었다. 이중특이적 항체는 이후, 앞서 설명된 바와 같이 친화성 정제된 절반 항체를 합동함으로써 조립되었다. 이러한 첫 번째 과정 (과정 1)의 경우에, 조립된 이중특이적 항체는 결합 및 용리 방식으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 (Capto™ Adhere), 이후 결합 및 용리 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피 (Q Sepharose^® 패스트 플로우)에 종속되었다. 회수된 분획물은 이후, 관류 방식으로 HIC (페닐 Sepharose^® 6 패스트 플로우, 높은 치환)에 종속되었다. 최종적으로, 이중특이적 항체는 이중특이적 항체를 공식화하기 위해 한외여과 및 정용여과에 종속되었다. 과정의 다른 실례, 과정 2 (도면 40b)에서, 조립된 이중특이적 항체는 앞서 설명된 바와 같이 제조되고, 결합 및 용리 방식으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 (Capto™ Adhere), 이후 음이온 교환 크로마토그래피 (Q Sepharose^®패스트 플로우)에 종속되었다. 회수된 분획물은 이후, 관류 방식으로 HIC (페닐 Sepharose^® 6 패스트 플로우, 높은 치환) 및 결합 및 용리 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피 (POROS^® 50 HS)에 종속되었다. 최종적으로, 이중특이적 항체는 이중특이적 항체를 공식화하기 위해 한외여과 및 정용여과에 종속되었다.

세 번째 과정 (과정 3, 도면 40c)에서, 이중특이적 항체는 앞서 설명된 바와 같이 조립되고, 그리고 이후, 결합 및 용리 방식으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 (Capto™ Adhere)에 종속되고, 이후 음이온 교환 크로마토그래피 (Q Sepharose^® 패스트 플로우) 및 관류 방식으로 HIC (헥실 650C)에 종속되었다. 최종적으로, 이중특이적 항체는 이중특이적 항체를 공식화하기 위해 한외여과 및 정용여과에 종속되었다.

네 번째 과정 (과정 4, 도면 40d)에서, 이중특이적 항체는 앞서 설명된 바와 같이 조립되고, 그리고 이후, 결합 및 용리 방식으로 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피 (Capto™ Adhere)에 종속되고, 이후 결합 및 용리 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피 (Q Sepharose^® 패스트 플로우) 및 결합 및 용리 방식으로 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피 (CHT 유형 I, 80μm)에 종속되었다.

최종적으로, 과정 1-3의 경우에, 이중특이적 항체는 이중특이적 항체를 공식화하기 위해 한외여과 및 정용여과에 종속되었다.

Capto™ Adhere 과정:

결합 및 용리 Capto™ Adhere 혼합 방식 음이온 교환 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 50 mM 아세트산염, pH 6.5로 평형화되었다. pH 6.5 및 6.5 mS/cm로 조정된 조립 풀은 충전된 수지의 L당 ≤ 20 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고, 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, 두 번째 세척 완충액 (200 mM 아세트산염, pH 6.5)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (25 mM 아세트산염, pH 5.2)의 pH를 낮춤으로써 용리되었다. 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

Q Sepharose^® FF 과정:

결합 및 용리 QSFF 음이온 교환 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 50 mM Tris, pH 8.5로 평형화되었다. pH 8.5로 조정된 Capto™ Adhere 용리 풀은 충전된 수지의 L당 ≤ 50 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고 평형화 완충액으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (pH 8.5에서 100 mM 아세트산나트륨과 함께 50 mM Tris)의 전도도를 증가시킴으로써 용리되었다. 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

페닐 Sepharose^® 과정:

관류 페닐 Sepharose^® 6 패스트 플로우 (높은 치환) HIC 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 170 mM 아세트산염, pH 5.5로 평형화되었다. pH 5.5에서 조정된 QSFF 용리 풀은 칼럼 위에 부하되었다. 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체는 관류하였고, 그리고 칼럼은 차후에, 평형화 완충액으로 세척되었다. 산물 풀 수집은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

POROS^® HS 50 과정:

결합 및 용리 POROS^® HS 50 양이온 교환 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 50 mM 아세트산염, pH 5.5로 평형화되었다. 5.0 mS/cm로 조정된 페닐 Sepharose^® 관류 풀은 충전된 수지의 L당 ≤ 20 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고, 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, 두 번째 세척 완충액 (50 mM 아세트산염, pH 5.8)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 22 칼럼 용적 (CV)에서 10-100%B의 선형 구배에서 전도도를 증가시킴으로써 용리되었다 (A: WFI, B: 500 mM 아세트산염, pH 5.8). 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

헥실-650C 과정:

관류 헥실-650C HIC 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 pH 7.0에서 125 mM 아세트산나트륨과 함께 50 mM MOPS로 평형화되었다. pH 7.0에서 조정된 QSFF 용리 풀이 칼럼 위에 부하되었다. 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체는 관류하였고, 그리고 칼럼은 차후에, 평형화 완충액으로 세척되었다. 산물 풀 수집은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

CHT 유형 I 과정:

결합 및 용리 CHT 유형 I 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 10 mM 인산나트륨, pH 6.8로 평형화되었다. pH 6.8에서 10 mM 인산나트륨을 내포하도록 조건화된 QSFF 용리 풀은 충전된 수지의 L당 ≤ 25 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고 평형화 완충액으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 20 칼럼 용적 (CV)에서 0-100%B의 선형 구배에서 전도도를 증가시킴으로써 용리되었다 (A: 평형화 완충액, B: pH 6.8에서 1 M 염화나트륨을 내포하는 10 mM 인산나트륨). 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

이들 예시적인 과정 (과정 1-4) 각각에 대한 최종 칼럼 풀에서 총괄 수율 및 산물 품질 데이터는 아래의 표 34에서 도시된다:

표 34. 산물 품질

속성	검정	과정 1	과정 2	과정 3	과정 4
		(N = 2)	(N = 4)	(N = 2)	(N = 2)
총괄 수율	--	44 - 45	31 - 34	44 - 46	44 - 48
HMWS (%)	SEC	0.6 - 0.8	0.2 - 0.4	0.6, 0.6	0.4 - 0.5
주요 (%)		99.0 - 99.3	99.5 - 99.6	99.4 - 99.5	99.0 - 99.2
산성 (%)	iCIEF	21.3 - 21.4	17.0 - 23.0	24.2^*	n.a.
주요 (%)		74.9 - 76.0	74.1 - 80.5	72.1^*	n.a.
염기성 (%)		2.7 - 3.8	2.5 - 2.9	3.7^*	n.a.
순도 - 150 kDa 종류 (%)	CE-SDS (NR)	95.0 - 95.5	97.2 - 97.6	95.2 - 95.3	n.a.
순도 - BsAb (%)	RPLC	95.3 - 95.6	96.7 - 97.8	96.5 - 96.9	95.7 - 96.1
순도 - BsAb (%)	HIC-HPLC	97.0 - 97.6	97.3 - 97.9	97.5^*	n.a.
ECP (ppm)	ELISAs	20 - 21	7 - 17	18 - 20	6, 6
FkpA (ppm)		6 - 8	0.2 - 0.7	1, 1	1, 1
DsbA (ppm)		0.4	< 0.6	0.4 - 0.5	< 0.7
DsbC (ppm)		< 0.4 - 0.4	< 0.6	0.4 - 0.7	< 1.0 - 1.4

^*: N=분석된 1 실행

n.a.: 데이터 가용하지 않음

실시예 12. αA/αB의 정제

2개의 항원, A 및 B에 결합하는 이중특이적 항체가 조립되고 정제되었다. 항-A 및 항-B 절반 항체는 항-IL13/항-IL17 이중특이적 항체에 대해 앞서 설명된 바와 같이 FkpA, DsbA 및 DsbC를 과다발현하는 대장균 (E. coli)에서 생산되었다 (실시예 6을 참조한다). 항-A 절반 항체는 Fc 영역에서 "노브" 아미노산 치환을 포함하였고, 그리고 항-B 절반 항체는 "홀" 아미노산 치환을 포함하였다.

각 절반 항체는 이후, MabSelect SuRe™ 수지 (GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 칼럼 위에 별개로 포획되었다. 칼럼 평형화 후, 센트레이트는 칼럼 위에 부하되고 평형화 완충액 및 두 번째 세척 완충액으로 세척되었다. 절반 항체는 산성 조건 (pH 2.8<3) 하에 칼럼으로부터 용리되었다.

이중특이적 항체는 동등한 질량의 각 절반 항체를 합동함으로써 조립되었다. 표본은 pH 8.4까지 적정되었다. 조립 과정으로부터 예상된 이중특이적 항체의 이론적 최대량에 대하여 100x 과잉 몰 비율의 L-글루타티온, 환원된 (GSH)가 혼합물에 첨가되었고, 그리고 온도가 실온으로부터 35℃로 조정되었다. 2개의 절반 항체는 산화환원 반응 동안 시험관내에서 조립되어 이중특이적 항체를 형성하였다. 산화환원 반응은 35℃에서 20 시간 동안 지속되었다. 조립 반응은 pH를 6.5로 조정함으로써 퀀칭되었고, 그리고 풀은 아래에 설명된 정제 과정에 종속되기 전에 물로 희석되었다.

조립된 이중특이적 항체는 이후, Capto™ Adhere 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피에 종속되었다. 결합 및 용리 Capto™ Adhere 혼합 방식 음이온 교환 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 50 mM 아세트산나트륨, pH 6.5를 내포하는 2 mM MES로 평형화되었다. pH 6.5 및 6.5 mS/cm로 조정된 조립 풀은 충전된 수지의 L당 ≤ 20 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고, 평형화 완충액으로 세척되고, 그리고 이후, 두 번째 세척 완충액 (150 mM 아세트산염, pH 6.5를 내포하는 6 mM MES)으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (25 mM 아세트산염, pH 5.0)의 pH를 낮춤으로써 용리되었다. 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

모아진 Capto™ Adhere 용출물은 pH 8.5로 조정되고 결합 및 용리 방식으로 QSFF 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼 위에서 정제되었다. 결합 및 용리 QSFF 음이온 교환 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 50 mM Tris, pH 8.5로 평형화되었다. 조정된 Capto™ Adhere 용리 풀은 충전된 수지의 L당 41 g의 단백질의 부하 밀도로 칼럼 위에 부하되고 평형화 완충액으로 세척되었다. 이중특이적 항체는 완충액 (pH 8.5에서 100 mM 아세트산나트륨과 함께 50 mM Tris)의 전도도를 증가시킴으로써 용리되었다. 풀링은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다.

pH 5.5로 조정된 QSFF 용출물은 이후, 관류 방식으로 페닐 Sepharose^® HS 크로마토그래피에 종속되었다. 관류 페닐 Sepharose^® 6 패스트 플로우 (높은 치환) HIC 조건은 다음과 같았다: 상기 칼럼은 170 mM 아세트산염, pH 5.5로 평형화되었다. 조정된 QSFF 용리 풀이 상기 칼럼 위에 부하되었다. 이중특이적 항체는 관류하였고, 그리고 칼럼은 차후에, 평형화 완충액으로 세척되었다. 산물 풀 수집은 280 nm에서 흡광도에 근거하여 시작되고 종결되었다. 페닐 Sepharose^® 풀은 이후, 농축되고 한외여과/정용여과 (UF/DF)를 이용하여 완충액 교환되었다. 항-A/항-B 이중특이적 항체는 비-대합된 절반 항체, 동종이합체, 저분자량 종류 (LMWS), 고분자량 종류 (HMWS), 매우 높은 분자량 종류 (vHMWS), 산성 변이체, 염기성 변이체, FkpA, DsbA, DsbC, ECP, 침출된 단백질 A, 대장균 (E. coli) DNA, 그리고 내독소를 비롯한 불순물의 존재에 대해 분석되었다. 산물 품질 및 과정 성과 (% 수율에 의해 보여 지는 바와 같이)는 표 35에서 상술된다.

표 35. 항-A/항-B 산물 품질 및 과정 성과

단계	αA MSS	αB MSS	조립	Capto™ Adhere	QSFF	페닐 Sepharose ^®	UFDF
수율 (%)	77	75	85	77	85	84	80
ECP (ppm)	11817	10996	3447	94	44	26	16
FkpA (ppm)	3331	2751	1841	1265	216	8	8
DsbA (ppm)	59	29	28	5	1	1	0.3
DsbC (ppm)	94	144	122	4	9	2	0.1
SEC-총 HMWS (%)	4.2	12.0	14.4	7.4	1.4	0.2	0.7
SEC-주요 (%)	18.1	29.4	85.1	92.6	98.5	99.8	99.3
SEC- LMWS (%)	77.3	58.5	0.5	0	0.09	0	0
순도, NR-CE-SDS (%)	83.5	71.1	86.9	92.6	96.4	97	97

서열

달리 지정되지 않으면, 아미노산 서열은 N 말단에서 C 말단으로 제시되고, 그리고 핵산 서열은 5'에서 3'로 제시된다.

대장균 (E. coli) FkpA

아미노산 서열 - 리더 서열 없음

AFADKSKLSDQEIEQTLQAFEARVKSSAQAKMEKDAADNEAKGKEYREKFAKEKGVKTSSTGLVYQVVEAGKGEAPKDSDTVVVNYKGTLIDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGLKNIKKGGKIKLVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTLVFDVELLDVKPAPKADAKPEADAKAADSAKK

(서열 번호:1).

아미노산 서열 - 전체 서열

MKSLFKVTLLATTMAVALHAPITFAAEAAKPATTADSKAAFKNDDQKSAYALGASLGRYMENSLKEQEKLGIKLDKDQLIAGVQDAFADKSKLSDQEIEQTLQAFEARVKSSAQAKMEKDAADNEAKGKEYREKFAKEKGVKTSSTGLVYQVVEAGKGEAPKDSDTVVVNYKGTLIDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGLKNIKKGGKIKLVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTXVFDVELLDVKPAPKADAKPEADAKAADSAKK

(서열 번호:2).

핵산 서열

atgaaatcactgtttaaagtaacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgcatgcaccaatcacttttgctgctgaagctgcaaaacctgctacagctgctgacagcaaagcagcgttcaaaaatgacgatcagaaatcagcttatgcactgggtgcctcgctgggtcgttacatggaaaactctctaaaagaacaagaaaaactgggcatcaaactggataaagatcagctgatcgctggtgttcaggatgcatttgctgataagagcaaactctccgaccaagagatcgaacagactctacaagcattcgaagctcgcgtgaagtcttctgctcaggcgaagatggaaaaagacgcggctgataacgaagcaaaaggtaaagagtaccgcgagaaatttgccaaagagaaaggtgtgaaaacctcttcaactggtctggtttatcaggtagtagaagccggtaaaggcgaagcaccgaaagacagcgatactgttgtagtgaactacaaaggtacgctgatcgacggtaaagagttcgacaactcttacacccgtggtgaaccgctttctttccgtctggacggtgttatcccgggttggacagaaggtctgaagaacatcaagaaaggcggtaagatcaaactggttattccaccagaactggcttacggcaaagcgggtgttccggggatcccaccgaattctaccctggtgtttgacgtagagctgctggatgtgaaaccagcgccgaaggctgatgcaaagccggaagctgatgcgaaagccgcagattctgctaaaaaataa

(서열 번호:3)

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL LADIWALA, Asif MCKAY, Patrick A. FONG, Chris B. <120> PURIFICATION OF FKPA AND USES THEREOF FOR PRODUCING RECOMBINANT POLYPEPTIDES <130> P32953-WO <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/210,378 <151> 2015-08-26 <150> 62/207,910 <151> 2015-08-20 <150> 62/207,908 <151> 2015-08-20 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Ala Phe Ala Asp Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gln Glu Ile Glu Gln Thr 1 5 10 15 Leu Gln Ala Phe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser Ala Gln Ala Lys Met 20 25 30 Glu Lys Asp Ala Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly Lys Glu Tyr Arg Glu 35 40 45 Lys Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Thr Ser Ser Thr Gly Leu Val 50 55 60 Tyr Gln Val Val Glu Ala Gly Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp Ser Asp 65 70 75 80 Thr Val Val Val Asn Tyr Lys Gly Thr Leu Ile Asp Gly Lys Glu Phe 85 90 95 Asp Asn Ser Tyr Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser Phe Arg Leu Asp Gly 100 105 110 Val Ile Pro Gly Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn Ile Lys Lys Gly Gly 115 120 125 Lys Ile Lys Leu Val Ile Pro Pro Glu Leu Ala Tyr Gly Lys Ala Gly 130 135 140 Val Pro Gly Ile Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu 145 150 155 160 Leu Asp Val Lys Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Pro Glu Ala Asp 165 170 175 Ala Lys Ala Ala Asp Ser Ala Lys Lys 180 185 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> MOD_RES <222> (239)..(239) <223> Any amino acid <400> 2 Met Lys Ser Leu Phe Lys Val Thr Leu Leu Ala Thr Thr Met Ala Val 1 5 10 15 Ala Leu His Ala Pro Ile Thr Phe Ala Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Ala Asp Ser Lys Ala Ala Phe Lys Asn Asp Asp Gln Lys Ser 35 40 45 Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Gly Arg Tyr Met Glu Asn Ser Leu 50 55 60 Lys Glu Gln Glu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Asp Lys Asp Gln Leu Ile 65 70 75 80 Ala Gly Val Gln Asp Ala Phe Ala Asp Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gln 85 90 95 Glu Ile Glu Gln Thr Leu Gln Ala Phe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser 100 105 110 Ala Gln Ala Lys Met Glu Lys Asp Ala Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly 115 120 125 Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Thr Ser 130 135 140 Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gln Val Val Glu Ala Gly Lys Gly Glu Ala 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val Val Asn Tyr Lys Gly Thr Leu Ile 165 170 175 Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser Tyr Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser 180 185 190 Phe Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro Gly Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn 195 200 205 Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Lys Leu Val Ile Pro Pro Glu Leu Ala 210 215 220 Tyr Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly Ile Pro Pro Asn Ser Thr Xaa Val 225 230 235 240 Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val Lys Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala 245 250 255 Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala Ala Asp Ser Ala Lys Lys 260 265 270 <210> 3 <211> 813 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgaaatcac tgtttaaagt aacgctgctg gcgaccacaa tggccgttgc cctgcatgca 60 ccaatcactt ttgctgctga agctgcaaaa cctgctacag ctgctgacag caaagcagcg 120 ttcaaaaatg acgatcagaa atcagcttat gcactgggtg cctcgctggg tcgttacatg 180 gaaaactctc taaaagaaca agaaaaactg ggcatcaaac tggataaaga tcagctgatc 240 gctggtgttc aggatgcatt tgctgataag 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atgaccaaga accaggtcag cctgagctgc gctgtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctcgtt agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320 cagaagagcc tctccctgtc tctgggt 1347 <210> 43 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 43 gaagttcagc tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtcgtag cctgcgtctg 60 agctgtgcag caagcggttt tacctttgat gattatgcca tgcattgggt tcgtcaggca 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggttagcggt attaattgga gcagcggtgg tattggttat 180 gcagatagcg ttaaaggtcg ttttaccatt agccgtgata atgccaaaaa tagcctgtac 240 ctgcagatga atagtctgcg tgcagaagat accgcactgt attattgtgc acgtgatatt 300 ggtggttttg gcgaattcta ttggaatttt ggtctgtggg gtcgtggcac cctggttacc 360 gttagcagcg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctg ctcccgcagt 420 acttctgagt ccacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg tgccctctag cagcttgggc 600 accaagacct acacgtgcaa cgtggatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaaacgc 660 gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccatgcccag cacctgagtt cctgggggga 720 ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840 tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 1080 atgaccaaga accaggtcag cctgagctgc gctgtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctcgtt agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320 cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa taa 1353 <210> 44 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 44 gaaattgttc tgacccagag tccggcaacc ctgagcctga gtccgggtga acgtgccacc 60 ctgagctgtc gtgcaagcca gagcgttcgt agctatctgg catggtatca gcagaaaccg 120 ggtcaggcac cgcgtctgct gatttatgat gcaagcaatc gtgcaaccgg tattccggca 180 cgttttagcg gtagcggtag tggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg 240 gaagattttg cagtgtatta ttgtcagcag cgtagcaatt ggccaccggc aacctttggt 300 ggtggcacca aagttgaaat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcttctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatccccgtg aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttaa 648 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 45 Ser Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Gly Arg 1 5 10

Claims

FkpA 폴리펩티드를 포함하는 세포 용해물로부터 FkpA 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 세포 용해물을 원심분리에 의해 투명하게 하고,
b) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 투명해진 세포 용해물을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고,
c) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 FkpA 폴리펩티드를 용리하여 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 양이온 교환 용출물을 산출하고,
d) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 양이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 물질에 적용하고,
e) HIC 물질로부터 FkpA 폴리펩티드를 용리하여 HIC 용출물을 산출하고,
f) FkpA 폴리펩티드를 포함하는 HIC 용출물을 크기 배제 크로마토그래피에 적용하고,
g) 크기 배제 크로마토그래피로부터 FkpA 폴리펩티드를 용리함.
청구항 1에 있어서, FkpA 폴리펩티드를 포함하는 용해물은 약 pH 6.0인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 강한 양이온 교환체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 3에 있어서, 강한 양이온 교환체는 술포프로필 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서, 술포프로필 기는 교차연결된 아가로오스에 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 물질은 용리에 앞서 25 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES)에서 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 6 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 염 구배를 이용하여 양이온 크로마토그래피 물질로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 7에 있어서, 염 구배는 선형 구배인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서, 염 구배는 9 칼럼 용적에 걸쳐 약 25 mM MES, 300 mM NaCl로부터 25 mM MES 300 mM NaCl까지 0-30% 구배인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 9 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 용출물은 분획물에서 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 10에 있어서, 분획물은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 앞서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서, 최소한 약 25% FkpA를 포함하는 분획물은 추가 정제를 위해 선별되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 12 중에서 어느 한 항에 있어서, HIC 물질은 부틸 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13에 있어서, 부틸 모이어티는 교차연결된 아가로오스에 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 14 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 용출물은 HIC 전에, 약 0.6 M 황산나트륨 및 약 50 mM PO₄, 약 pH 7을 내포하도록 조건화되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 15 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA-결합된 HIC 물질은 용리에 앞서 40 mM 인산염, 300 mM 황산나트륨, pH 7.0으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 16 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 물을 이용하여 HIC 물질로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 16 중에서 어느 한 항에 있어서, HIC 용출물은 분획물에서 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 18에 있어서, FkpA를 포함하는 분획물은 모아지는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 19에 있어서, 최소한 약 25% FkpA를 포함하는 분획물은 모아지는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 20 중에서 어느 한 항에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피 물질은 교차연결된 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 21 중에서 어느 한 항에 있어서, 크기 배제 관류는 분획물에서 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 22 중에서 어느 한 항에 있어서, HIC 용출물은 크기 배제 크로마토그래피에 앞서 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 23에 있어서, HIC 용출물은 크기 배제 크로마토그래피에 앞서 약 6-배 내지 약 10-배 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 22 내지 24 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA를 포함하는 크기 배제 분획물은 모아지는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 25 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA 폴리펩티드는 대장균 (Escherichia coli) FkpA 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 26에 있어서, FkpA 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 27에 있어서, FkpA 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호:1의 아미노산 서열에 최소한 약 80% 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 28 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 29에 있어서, 세포는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 29 또는 30에 있어서, 세포는 대장균 (E. coli) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 29 내지 31 중에서 어느 한 항에 있어서, 세포는 FkpA의 내인성 발현보다 큰 수준에서 FkpA를 발현하도록 가공된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 32 중에서 어느 한 항에 있어서, 세포는 미세유동화기를 이용하여 용해된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 정제된 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
정제된 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 최소한 약 98% 단위체성 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 35에 있어서, 조성물은 약 2%보다 적은 저분자량 종류를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 35 또는 36에 있어서, 조성물은 약 5% 이내의 고분자량 종류를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 35 내지 37 중에서 어느 한 항에 있어서, 단위체성 FkpA 폴리펩티드의 백분율은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 38에 있어서, 조성물은 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%보다 적은 불순물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 39에 있어서, 불순물은 FkpA에 비하여 고분자량 및/또는 저분자량 폴리펩티드 종류인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 39 또는 40에 있어서, 불순물은 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP), FkpA의 응집체, FkpA의 단편, 핵산 또는 세포 배양 배지 성분 중에서 한 가지 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 34 내지 41 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 하나 또는 그 이상의 동결 해동 주기에 안정된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 42에 있어서, FkpA는 3회 동결 해동 주기에 안정된 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 34 내지 43 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 크로마토그래피, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 또는 웨스턴 블롯 분석 중에서 하나 또는 그 이상에 의해 계측되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 34 내지 44 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)에 의해 계측되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 34 내지 45 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계측되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 34 내지 44 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 순도는 형광 영상화 또는 은 염색을 이용한 SDS 겔 전기이동에 의해 계측되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 47에 있어서, 조성물 내에 비-FkpA 폴리펩티드의 존재는 웨스턴 블롯 분석에 의해 보여 지는 바와 같이, 항-FkpA 항체와 면역반응성이 아닌 겔 전기이동에 의해 확인된 종류의 존재에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 48에 있어서, 조성물 내에 FkpA 폴리펩티드의 응집체의 존재는 웨스턴 블롯 분석에 의해 선천적 FkpA보다 큰 분자량을 갖는 종류의 존재에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는 조성물.
FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 산출하기 위한 방법에 있어서, 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 정제된 FkpA를 포함하는 조성물에 동물을 노출시키거나 또는 면역화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 산출하기 위한 방법에 있어서, 청구항 34 내지 49 중에서 어느 한 항의 조성물을 동물을 노출시키거나 또는 면역화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 50 또는 51에 있어서, 동물로부터 혈청을 수집하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 상기 혈청은 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 52에 있어서, 혈청은 FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 52 또는 53에 있어서, 하나 또는 그 이상의 단일클론 항체는 혈청으로부터 단리된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 50 내지 54 중에서 어느 한 항에 있어서, 동물은 염소, 토끼, 생쥐, 기니 피그, 햄스터, 쥐, 당나귀 또는 닭인 것을 특징으로 하는 방법.
FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 다중클론 항체는 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 정제된 FkpA를 포함하는 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
FkpA에 특이적으로 결합하는 다중클론 항체를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 다중클론 항체는 청구항 34 내지 49 중에서 어느 한 항의 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 56 또는 57에 있어서, 다중클론 항체는 동물의 혈청으로부터 수집되는 것을 특징으로 하는 조성물.
FkpA에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 단일클론 항체는 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 정제된 FkpA를 포함하는 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
FkpA에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 단일클론 항체는 청구항 34 내지 49 중에서 어느 한 항의 조성물에 동물을 면역화함으로써 산출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 56 내지 60 중에서 어느 한 항에 있어서, 동물은 염소, 토끼, 생쥐, 기니 피그, 햄스터, 쥐, 당나귀 또는 닭인 것을 특징으로 하는 조성물.
FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 항-FkpA 항체를 포함하는 청구항 56 내지 61 중에서 어느 한 항의 조성물을 약 60%의 황산암모늄의 최종 농도까지 황산암모늄과 접촉시키고, 용액을 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 그리고 펠렛을 인산염 완충액에 용해시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 62에 있어서, 인산염 완충액은 약 pH 7.0에서 약 50 mM 인산나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 정제하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 항-FkpA 항체를 포함하는 청구항 56 내지 61 중에서 어느 한 항의 조성물을 약 60%의 황산암모늄의 최종 농도까지 황산암모늄과 접촉시키고, 용액을 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 그리고 펠렛을 인산염 완충액에 용해시켜 항-FkpA 항체 용액을 산출하고;
b) 항-FkpA 항체 용액을 친화성 크로마토그래피 물질에 적용하고,
c) 친화성 물질로부터 항체를 용리하여 항-FkpA 항체를 포함하는 친화성 용출물을 산출하고; 그리고
d) 황산암모늄 상층액을 크기 배제 크로마토그래피에 종속시키고, 그리고
e) 정제된 항체를 포함하는 크기 배제 크로마토그래피로부터 분획물을 수집함.
청구항 64에 있어서, 인산염 완충액은 약 pH 7.0에서 약 50 mM 인산나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 64 또는 65에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 배지에 연결된 FkpA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66에 있어서, 크로마토그래피 배지는 교차연결된 덱스트란인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66 또는 67에 있어서, FkpA는 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66 또는 67에 있어서, FkpA는 청구항 34 내지 49 중에서 어느 한 항의 조성물로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66 내지 69 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 크로마토그래피 배지에 공유 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 66 내지 70 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 글리세릴-제어된 다공성 유리 (글리세릴-CPG)를 이용하여 크로마토그래피 배지에 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 64 내지 71 중에서 어느 한 항에 있어서, 항-FkpA 항체는 친화성 칼럼으로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 64 내지 72 중에서 어느 한 항에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피 물질은 교차연결된 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 73에 있어서, 교차연결된 아가로오스 및 덱스트란의 구형 복합은 10,000 달톤 및 600,000 달톤 사이에 분자량을 갖는 분자에 대한 분리 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 64 내지 74 중에서 어느 한 항에 있어서, 크기 배제 관류는 분획물에서 수집되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 75에 있어서, 항-FkpA 항체를 포함하는 크기 배제 분획물은 모아지는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 64 내지 76 중에서 어느 한 항에 있어서, 항체는 다중클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 64 내지 77 중에서 어느 한 항에 있어서, 항체는 청구항 50 내지 55 중에서 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 64 내지 78 중에서 어느 한 항에 있어서, 약 1%보다 적은 항체가 비-FkpA 화합물에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 62 내지 79 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 정제된 단리된 항-FkpA 항체.
표본 내에 FkpA를 정량하기 위한 방법에 있어서, 검출 시스템을 이용하여 표본 내에 FkpA를 검출하고, 그리고 표본 내에서 검출된 FkpA의 양을 초고순도 FkpA 참고 표준의 하나 또는 그 이상의 농도의 검출과 비교하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81에 있어서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 최소한 약 95%, 약 96%, 약 97%, 또는 약 98% 단위체성 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81 또는 82에 있어서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 제조되거나 또는 청구항 34 내지 49 중에서 어느 한 항의 FkpA 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81 내지 83 중에서 어느 한 항에 있어서, 검출 시스템은 면역검정인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 84에 있어서, 면역검정은 초고순도 FkpA 참고 표준에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
FkpA의 존재 및/또는 양에 대해 재조합 폴리펩티드 표본을 분석하기 위한 방법에 있어서, 면역검정을 이용하여 표본 내에 FkpA를 검출하고, 그리고 표본 내에서 검출된 FkpA의 양을 초고순도 FkpA 참고 표준의 하나 또는 그 이상의 농도의 검출과 비교하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 86에 있어서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 최소한 약 98% 단위체성 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 86 또는 87에 있어서, 초고순도 FkpA 참고 표준은 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 84 내지 88 중에서 어느 한 항에 있어서, 면역검정은 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 89에 있어서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 다중클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 89 또는 90에 있어서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 면역검정에서 포획 항체로서 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 89 내지 91 중에서 어느 한 항에 있어서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 검출 항체로서 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 92에 있어서, 검출 항체는 검출 작용제에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 89 내지 93 중에서 어느 한 항에 있어서, 검출 작용제는 양고추냉이 과산화효소인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 89 내지 94 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 청구항 56 내지 61 중에서 어느 한 항의 조성물 내에 포함되거나 또는 청구항 50 내지 55 중에서 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81 내지 95 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 대장균 (E. coli) FkpA인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81 내지 96 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 숙주 세포에서 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 97에 있어서, 숙주 세포는 대장균 (E. coli) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 97 또는 98에 있어서, 숙주 세포는 FkpA를 과다발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81 내지 99 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 세포 용해물인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81 내지 100 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 그리고 여기서 재조합 폴리펩티드 제조물은 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 정제 단계에 종속된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 101에 있어서, 재조합 폴리펩티드 제조물은 최종 정제된 산물인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 81 내지 102 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드 표본에서 내포된 재조합 폴리펩티드는 항체 또는 면역접합체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 103에 있어서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 103 또는 104에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 방법.
표본 내에 FkpA를 검출하기 위한 면역검정 방법에 있어서, 상기 표본은 숙주 세포주로부터 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 상기 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) FkpA에 결합하는 포획 항체를 상기 표본과 접촉시키고, 따라서 표본-포획 항체 조합 물질을 산출하고;
(b) FkpA에 결합하는 검출 항체를 표본-포획 항체 조합 물질과 접촉시키고; 그리고
(c) 표본-포획 항체 조합 물질에 결합된 항체를 검출함.
청구항 106에 있어서, 표준 적정 곡선을 이용하여, 결합된 검출 항체의 수준을 정량하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 107에 있어서, 결합된 검출 항체의 수준에 근거하여, 표본 내에 존재하는 FkpA의 양을 계산하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 108에 있어서, 표본 내에 존재하는 FkpA의 양은 표준 적정 곡선을 초고순도 FkpA 조성물로 산출된 표준 적정 곡선과 비교함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 109에 있어서, 초고순도 FkpA 조성물은 최소한 약 98% 단위체성 FkpA 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 109 또는 110에 있어서, 조성물 내에 초고순도 FkpA는 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 111 중에서 어느 한 항에 있어서, 포획 항체는 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 112 중에서 어느 한 항에 있어서, 검출 항체는 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 112 또는 113에 있어서, 초고순도 FkpA에 특이적으로 결합하는 항체는 다중클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 114 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA에 결합하는 두 번째 검출 항체는 양고추냉이 과산화효소에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 115 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중클론 항체는 청구항 50 내지 55 중에서 어느 한 항의 방법에 따라 산출되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 116 중에서 어느 한 항에 있어서, 면역검정은 샌드위치 검정인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 117에 있어서, 샌드위치 검정은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 118 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 대장균 (E. coli) FkpA인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 119 중에서 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포주로부터 재조합 폴리펩티드 제조물은 대장균 (E. coli)으로부터 획득된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 120에 있어서, 숙주 세포주는 외인성 FkpA를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 121 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 세포 용해물인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 122 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 그리고 여기서 재조합 폴리펩티드 제조물은 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 정제 단계에 종속된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 123에 있어서, 재조합 폴리펩티드 제조물은 최종 정제된 산물인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106 내지 124 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드 제조물에서 내포된 재조합 폴리펩티드는 항체 또는 면역접합체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 125에 있어서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 125 또는 126에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 125에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인 및 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128에 있어서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 또는 129에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 130 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 131 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 132 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 133 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 134 중에서 어느 한 항에 있어서, IL17은 인간 IL17인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 135 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 136 중에서 어느 한 항에 있어서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 137 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 138 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 139 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 140 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 128 내지 141 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
세균 세포로부터 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물에 대한 품질 검정에 있어서, 상기 품질 검정은 제약학적 조성물에서 FkpA의 존재 또는 양을 검출하기 위한 청구항 106 내지 142 중에서 어느 한 항의 면역검정 방법에 제약학적 조성물의 표본을 종속시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 143에 있어서, 제약학적 조성물에서 FkpA의 양은 약 30 ppm, 약 25 ppm, 약 20 ppm, 약 15 ppm, 약 14 ppm, 약 13 ppm, 약 12 ppm, 약 11 ppm, 약 10 ppm, 약 9 ppm, 약 8 ppm, 약 7 ppm, 약 6 ppm, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 143 또는 144 중에서 어느 한 항에 있어서, 세균 세포는 대장균 (E. coli) 세포인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 143 내지 145 중에서 어느 한 항에 있어서, 세균 세포는 외인성 FkpA를 발현하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 143 내지 146 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 세포 용해물인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 143 내지 147 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 재조합 폴리펩티드 제조물로부터 획득되고, 그리고 여기서 재조합 폴리펩티드 제조물은 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 정제 단계에 종속된 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 148에 있어서, 재조합 폴리펩티드 제조물은 최종 정제된 산물인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 143 내지 149 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 항체 또는 면역접합체인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 150에 있어서, 항체는 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 절반 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 151에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 151에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인 및 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153에 있어서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 또는 154에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 155 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 156 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 157 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 158 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 159 중에서 어느 한 항에 있어서, IL17은 인간 IL17인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 159 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 161 중에서 어느 한 항에 있어서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 162 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 163 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 164 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 165 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 166 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 153 내지 167 중에서 어느 한 항에 있어서, 제약학적 조성물에서 DsbA 및/또는 DsbC의 양을 검출하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 168에 있어서, DsbA의 양은 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 168 또는 169에 있어서, DsbC의 양은 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내인 것을 특징으로 하는 품질 검정.
청구항 168 내지 170 중에서 어느 한 항에 있어서, DsbA 및/또는 DsbC의 양은 면역검정에 의해 계측되는 것을 특징으로 하는 품질 검정.
세균 세포로부터 제조된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물에서 FkpA의 검출을 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 청구항 50 내지 55 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항-FkpA 항체 또는 청구항 56 내지 61 중에서 어느 한 항의 항-FkpA 항체의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
청구항 172에 있어서, 키트는 표본 내에서 FkpA를 정량하기 위한 표준 곡선을 산출할 때 참고 표준으로서 이용을 위한 및/또는 양성 대조로서 이용을 위한 초고순도 FkpA를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
청구항 172에 있어서, 초고순도 FkpA는 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 키트.
재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 내인성 FkpA를 발현하는 숙주 세포에서 생산되었고, 여기서 상기 조성물은 약 6 ppm, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내의 농도에서 FkpA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175에 있어서, 조성물 내에 FkpA의 양은 면역검정에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175에 있어서, 조성물 내에 FkpA의 양은 청구항 106 내지 124 중에서 어느 한 항의 면역검정에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 조성물.
재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 외인성 FkpA를 발현하도록 가공되는 숙주 세포에서 생산되었고, 여기서 상기 조성물은 약 15 ppm, 약 14 ppm, 약 13 ppm, 약 12 ppm, 약 11 ppm, 약 10 ppm, 약 9 ppm, 약 8 ppm, 약 7 ppm, 약 6 ppm, 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내의 농도에서 FkpA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 178 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 179에 있어서, 항체는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 180 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 최소한 약 0.2 ppm FkpA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 181 중에서 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 외인성 FkpA를 발현하고, 여기서 상기 조성물은 약 13 ppm 이내를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 182 중에서 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 외인성 FkpA를 발현하고, 여기서 상기 조성물은 약 0.7 ppm 이내를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 183 중에서 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 외인성 FkpA를 발현하고, 여기서 상기 조성물은 약 6 ppm 이내를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 184 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 이중특이적 항체이고, 여기서 이중특이적 항체는 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인 및 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185에 있어서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 또는 186에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 187 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 188 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 189 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 190 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 191 중에서 어느 한 항에 있어서, IL17은 인간 IL17인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 192 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 193에 있어서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 194 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 195 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 196 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 196 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 198 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 199 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내의 농도에서 DsbA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 200에 있어서, 조성물 내에 DsbA의 농도는 면역검정에 의해 계측되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 185 내지 201 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 5 ppm, 약 4 ppm, 약 3 ppm, 약 2 ppm, 약 1 ppm, 약 0.9 ppm, 약 0.8 ppm, 약 0.7 ppm, 약 0.6 ppm, 약 0.5 ppm, 약 0.4 ppm, 약 0.3 ppm, 약 0.2 ppm, 또는 약 0.1 ppm 이내의 농도에서 DsbC를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 202에 있어서, 조성물 내에 DsbC의 농도는 면역검정에 의해 계측되는 것을 특징으로 하는 조성물.
이중특이적 항체를 포함하는 조성물에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 다음을 포함하는 방법에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 조성물:
a)
i) 첫 번째 중쇄 및 첫 번째 경쇄를 인코딩하는 핵산, 여기서 첫 번째 중쇄 및 첫 번째 경쇄는 첫 번째 항원 결합 도메인을 형성하고;
ii) 두 번째 중쇄 및 두 번째 경쇄를 인코딩하는 핵산, 여기서 두 번째 중쇄 및 두 번째 경쇄는 첫 번째 항원 결합 도메인을 형성하고;
iii) FkpA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하고;
여기서 첫 번째 중쇄 및 두 번째 중쇄는 Fc 도메인을 형성하고; 그리고
b) 상기 항체를 정제하고,
여기서 상기 조성물은 약 5 ppm보다 적은 FkpA를 포함함.
청구항 204에 있어서, 조성물은 약 1 ppm보다 적은 FkpA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 205 중에서 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 숙주 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 206에 있어서, 숙주 세포는 그람 음성균인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 207에 있어서, 그람 음성균은 대장균 (E. coli)인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 208 중에서 어느 한 항에 있어서, FkpA는 대장균 (E. coli) FkpA인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 209 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 정제되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 210 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 IL13에 결합하는 첫 번째 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 211 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 IL17에 결합하는 두 번째 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 또는 212에 있어서, IL13은 서열 번호:4 또는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 내지 213 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 내지 215 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 내지 215 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 내지 217 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 첫 번째 결합 도메인은 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 내지 218 중에서 어느 한 항에 있어서, IL17은 인간 IL17인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 211 내지 219 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 결합 도메인은 인간 IL17AA, IL17FF 및 IL17AF에 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 220에 있어서, IL17A는 서열 번호:6 또는 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IL17F는 서열 번호:8 또는 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 219 내지 221 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 219 내지 222 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 219 내지 223 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 219 내지 223 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 219 내지 225 중에서 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체의 두 번째 결합 도메인은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 226 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 15 ppm 이내의 DsbA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 227 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 5 ppm 이내의 DsbA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 228 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 15 ppm 이내의 DsbC를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 175 내지 229 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 5 ppm 이내의 DsbC를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 조성물을 친화성 크로마토그래피에 종속시켜 친화성 용출물을 생산하고,
b) 친화성 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시킴.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 상기 방법은
a) 조성물을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 단백질 A 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 또는 232에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 232 또는 233에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 235 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 236 중에서 어느 한 항에 있어서, HIC는 관류 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 다중특이적 항체의 각 팔은 별개로 생산되고, 상기 방법은
a) 다중특이적 항체의 각 팔을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 다중특이적 항체의 각 팔에 대한 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 생산하는데 충분한 조건 하에 다중특이적 항체의 각 팔의 단백질 A 용출물을 포함하는 혼합물을 형성하고,
c) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
d) 혼합 방식 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 238에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 238 또는 239에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 238 내지 240 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 238 내지 241 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 242 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 용출물은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 앞서 음이온 교환 크로마토그래피에 종속되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 243에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 244 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 분획물을 양이온 교환 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 245에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법에 있어서,
a) 조성물을 친화성 크로마토그래피에 종속시켜 친화성 용출물을 생산하고,
b) 친화성 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
d) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 것을 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 상기 방법은
a) 조성물을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 단백질 A 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
d) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 다중특이적 항체의 각 팔은 별개로 생산되고, 상기 방법은
a) 다중특이적 항체의 각 팔을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 다중특이적 항체의 각 팔에 대한 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 생산하는데 충분한 조건 하에 다중특이적 항체의 각 팔의 단백질 A 용출물을 포함하는 혼합물을 형성하고,
c) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
d) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
e) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고, 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하고, 그리고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물-특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 247 내지 249 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 247에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 248 내지 250 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 247 내지 252 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 247 내지 253 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 247 내지 254 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 247 내지 255 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 분획물을 양이온 교환 크로마토그래피에 종속시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 247 내지 256 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법에 있어서,
a) 조성물을 친화성 크로마토그래피에 종속시켜 친화성 용출물을 생산하고,
b) 친화성 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
d) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하고,
e) 소수성 상호작용 용출물을 양이온 교환 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 것을 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물 특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 상기 방법은
a) 조성물을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 단백질 A 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
d) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하고,
e) 소수성 상호작용 용출물을 양이온 교환 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물 특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 다중특이적 항체의 각 팔은 별개로 생산되고, 상기 방법은
a) 다중특이적 항체의 각 팔을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 다중특이적 항체의 각 팔에 대한 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 생산하는데 충분한 조건 하에 다중특이적 항체의 각 팔의 단백질 A 용출물을 포함하는 혼합물을 형성하고
c) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
d) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
e) 음이온 교환 용출물을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 종속시키고, 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하고, 그리고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하고,
f) 소수성 상호작용 용출물을 양이온 교환 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물 특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 258 내지 260 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 258에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 259 내지 261 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 258 내지 263 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 258 내지 264 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 258 내지 265 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 258 내지 266 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
a) 조성물을 친화성 크로마토그래피에 종속시켜 친화성 용출물을 생산하고,
b) 친화성 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
d) 음이온 교환 용출물을 수산화인회석 크로마토그래피에 종속시키고 폴리펩티드를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물 특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 상기 방법은
a) 조성물을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 단백질 A 용출물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
c) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
d) 음이온 교환 용출물을 수산화인회석 크로마토그래피에 종속시키고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물 특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
다중특이적 항체 및 하나 또는 그 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 다중특이적 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서, 다중특이적 항체는 복수 팔을 포함하고, 각 팔은 VH/VL 단위를 포함하고, 여기서 다중특이적 항체의 각 팔은 별개로 생산되고, 상기 방법은
a) 다중특이적 항체의 각 팔을 단백질 A 크로마토그래피에 종속시켜 다중특이적 항체의 각 팔에 대한 단백질 A 용출물을 생산하고,
b) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 생산하는데 충분한 조건 하에 다중특이적 항체의 각 팔의 단백질 A 용출물을 포함하는 혼합물을 형성하고
c) 다중특이적 항체를 포함하는 조성물을 혼합 방식 크로마토그래피에 종속시켜 혼합 방식 용출물을 산출하고, 그리고
d) 혼합 방식 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피에 종속시켜 음이온 교환 용출물을 산출하고,
e) 음이온 교환 용출물을 수산화인회석 크로마토그래피에 종속시키고, 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하고, 그리고 다중특이적 항체를 포함하는 분획물을 수집하는 순차적 단계를 포함하고,
여기서 상기 방법은 조성물로부터 산물 특이적 불순물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 268 내지 270 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 271에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 269 내지 272 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 268 내지 273 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 268 내지 274 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 결합 및 용리 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 268 내지 275 중에서 어느 한 항에 있어서, 수산화인회석 크로마토그래피는 관류 방식으로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 245, 또는 256 내지 267 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 수산화인회석 상호작용 크로마토그래피 분획물을 한외여과에 종속시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 245 내지 246 또는 256 내지 267 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 양이온 교환 분획물을 한외여과에 종속시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 267 내지 276 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 수산화인회석 크로마토그래피 분획물을 한외여과에 종속시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 277 내지 279 중에서 어느 한 항에 있어서, 한외여과는 첫 번째 한외여과, 정용여과 및 두 번째 한외여과를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 232 내지 233, 235 내지 246, 248 내지 250, 252 내지 257, 259 내지 261, 263 내지 270, 또는 269 내지 276 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 아가로오스에 연결된 단백질 A를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 281에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 MAbSelect™, MAbSelect™ SuRe 및 MAbSelect™ SuRe LX, Prosep-VA, Prosep-VA Ultra Plus, 단백질 A Sepharose^® 패스트 플로우, 또는 Tyopearl 단백질 A 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 281 또는 282에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 단백질 A 평형화 완충액, 단백질 A 부하 완충액 또는 단백질 A 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 평형화 완충액, 부하 완충액 및/또는 세척 완충액은 약 pH 7 및 약 pH 8 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 283에 있어서, 단백질 A 평형화 완충액은 약 pH 7.7인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 283 또는 284에 있어서, 단백질 A 평형화 완충액은 약 25 mM Tris 및 약 25 mM NaCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 283 내지 285 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피는 부하 이후에 평형화 완충액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 286에 있어서, 두 번째 세척액 및 세 번째 세척액을 더욱 포함하고, 여기서 두 번째 세척액은 1 M 아르기닌이고 세 번째 세척액은 평형화 완충액인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 283 내지 287 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체는 pH 구배에 의해 단백질 A 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 283 내지 288 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체는 낮은 pH를 갖는 단백질 A 용리 완충액을 단백질 A 크로마토그래피에 적용함으로써 단백질 A로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 289에 있어서, 단백질 A 용리 완충액은 약 150 mM 아세트산, 약 pH 2.8 또는 약 pH 2.9를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 283 내지 290 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD₂₈₀은 약 0.5보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 291 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 사차 아민 및 소수성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 292 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 고도로 교차연결된 아가로오스에 연결된 사차 아민 및 소수성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 293 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 N-벤질-n-메틸 에탄올아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 294에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 Capto™ 부착 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 295 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 혼합 방식 전평형화 완충액, 혼합 방식 평형화 완충액, 혼합 방식 부하 완충액 또는 혼합 방식 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 혼합 방식 전평형화 완충액, 혼합 방식 평형화 완충액 및/또는 혼합 방식 세척 완충액은 약 pH 6 및 약 pH 7 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 296에 있어서, 혼합 방식 전평형화 완충액, 혼합 방식 평형화 완충액 및/또는 혼합 방식 세척 완충액은 약 pH 6.5인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 296 또는 297에 있어서, 혼합 방식 전평형화 완충액은 약 200 mM 아세트산염 또는 약 500 mM 아세트산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 296 내지 298 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 평형화 완충액은 약 50 mM 아세트산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 296 내지 299 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 크로마토그래피는 부하 이후에 세척 완충액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 300에 있어서, 세척 완충액은 약 50 mM 아세트산염 및 약 pH 6.5 또는 약 200 mM 아세트산염 및 약 pH 6.5인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 301 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 pH 구배에 의해 혼합 방식 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 302 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 낮은 pH를 갖는 혼합 방식 용리 완충액을 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피에 적용함으로써 혼합 방식 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 303에 있어서, 혼합 방식 용리 완충액은 약 25 mM 아세트산염 및 약 pH 5.2 또는 약 pH 5.0을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 304 중에서 어느 한 항에 있어서, 혼합 방식 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD₂₈₀은 약 0.5 내지 약 1.0보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 267 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 소수성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 306에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 306 또는 307에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 소수성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 306 내지 308 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 페닐 모이어티 또는 부틸 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 309에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 페닐 Sepharose^® 크로마토그래피 또는 부틸 Sepharose^® 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 306 내지 310 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 교환 크로마토그래피는 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 또는 HIC 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 및/또는 HIC 세척 완충액은 약 pH 5 및 약 pH 6 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 311에 있어서, HIC 평형화 완충액, 부하 완충액 및/또는 세척 완충액은 약 pH 5.5인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 311 또는 312에 있어서, HIC 평형화 완충액 및 세척 완충액은 약 170 mM 아세트산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 311 내지 313 중에서 어느 한 항에 있어서, HIC 부하 완충액은 50 mM Tris, 100 mM 아세트산나트륨, pH 약 5.5인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 311 내지 314 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부하 이후에 HIC 세척 완충액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 306 내지 315 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 헥실 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 306에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 히드록실화된 메타크릴산 중합체에 연결된 소수성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 316 또는 317에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 히드록실화된 메타크릴산 중합체에 연결된 헥실 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 318에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 TOYOPEARL^® 헥실 650C인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 316 내지 319 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 교환 크로마토그래피는 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 또는 HIC 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 HIC 평형화 완충액, HIC 부하 완충액 및/또는 HIC 세척 완충액은 약 pH 6 및 약 pH 8 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 320에 있어서, HIC 평형화 완충액, 부하 완충액 및/또는 세척 완충액은 약 pH 7.0인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 320 또는 321에 있어서, HIC 평형화 완충액 및 세척 완충액은 약 50 mM 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS) 및 125 mM 아세트산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 316 내지 322 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부하 이후에 HIC 세척 완충액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 306 내지 323 중에서 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD₂₈₀은 약 0.5 내지 약 1.0보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 243, 244, 또는 247 내지 324 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 사차 아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 325에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 사차 아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 326에 있어서, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피는 QSFF 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 325 내지 327 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 전평형화 완충액, 음이온 교환 평형화 완충액 또는 음이온 교환 부하 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 음이온 교환 전평형화 완충액, 음이온 교환 평형화 완충액 및/또는 음이온 교환 부하 완충액은 약 pH 8 및 약 pH 9 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 328에 있어서, 음이온 교환 전평형화 완충액, 음이온 교환 평형화 완충액 및/또는 음이온 교환 부하 완충액은 약 pH 8.5인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 328 또는 329에 있어서, 음이온 교환 전평형화 완충액은 약 50 mM Tris 및 약 500 mM 아세트산나트륨 또는 약 100 mM 아세트산나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 328 내지 330 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 평형화 완충액은 약 50 mM Tris를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 328 내지 331 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 부하 이후에 음이온 교환 평형화 완충액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 328 내지 332 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 염 구배에 의해 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 328 내지 333 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 증가된 염 농도를 갖는 음이온 교환 용리 완충액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용함으로써 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 334에 있어서, 음이온 교환 용리 완충액은 약 pH 8.5에서 약 50 mM Tris 및 약 100 mM 아세트산나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 328 내지 335 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD₂₈₀은 약 0.5 내지 약 1.0보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 267 내지 280 중에서 어느 한 항에 있어서, 수산화인회석 크로마토그래피는 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 337에 있어서, 수산화인회석 크로마토그래피는 CHT 유형 I 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 337 또는 338에 있어서, 수산화인회석 크로마토그래피는 수산화인회석 완충액 A 또는 수산화인회석 완충액 B 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 수산화인회석 완충액 B는 수산화인회석 완충액 A와 비교하여 더욱 높은 전도도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 339에 있어서, 수산화인회석 완충액 A는 약 pH 6.8에서 약 10 mM 인산나트륨을 포함하는 평형화 완충액인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 339 또는 340에 있어서, 수산화인회석 완충액 B는 약 pH 6.8에서 약 10 mM 인산나트륨 및 약 1 M 염화나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 339 내지 341 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 수산화인회석 완충액 A에서 수산화인회석 완충액 B의 구배를 이용하여 수산화인회석 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 342에 있어서, 구배는 선형 구배인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 342 또는 343에 있어서, 구배는 0% 수산화인회석 완충액 B로부터 100% 수산화인회석 완충액 B로 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 342 내지 344 중에서 어느 한 항에 있어서, 구배는 약 20 칼럼 용적에서 0% 수산화인회석 완충액 B로부터 100% 수산화인회석 완충액 B로 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 337 내지 345 중에서 어느 한 항에 있어서, 수산화인회석 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD₂₈₀은 약 0.5 내지 약 1.0보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 245 내지 246 또는 256 내지 326 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 카르복실산 모이어티 또는 술폰산 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 347에 있어서, 카르복실산 모이어티 또는 술폰산 모이어티는 술포프로필, 술포에틸, 술포이소부틸, 또는 카르복실 모이어티인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 347 또는 348에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 교차연결된 아가로오스에 연결된 카르복실산 모이어티 또는 술폰산 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 348 또는 349에 있어서, 양이온 교환 물질은 POROS^® HS50, POROS^® HS20, SO3 모놀리스, S 세라믹 HyperD, 술포프로필-Sepharose^® 패스트 플로우 (SPSFF), SP-Sepharose^® XL (SPXL), CM Sepharose^® 패스트 플로우, Capto™ S, 프락토겔 Se HiCap, 프락토겔 SO3, 또는 프락토겔 COO인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 347 내지 350 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 부하 밀도는 약 20 g/L보다 적은 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 347 내지 351 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 전평형화 완충액, 양이온 교환 평형화 완충액, 양이온 교환 부하 완충액 또는 양이온 교환 세척 완충액 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하고, 여기서 양이온 교환 전평형화 완충액, 양이온 교환 평형화 완충액, 양이온 교환 부하 완충액 및/또는 양이온 교환 세척 완충액은 약 pH 5.0 및 약 pH 6.0 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 352에 있어서, 양이온 교환 양이온 교환 평형화 완충액, 양이온 교환 부하 완충액 및/또는 양이온 교환 세척 완충액은 약 pH 5.5 또는 약 pH 5.8인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 352 또는 353에 있어서, 양이온 교환 평형화 완충액은 50 mM 아세트산나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 352 내지 354 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 세척 완충액은 50 mM 아세트산나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 352 내지 355 중에서 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 부하 이후에 평형화 완충액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 352 내지 356 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 염 구배에 의해 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 352 내지 357 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 증가된 염 농도를 갖는 양이온 교환 용리 완충액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용함으로써 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 358에 있어서, 양이온 교환 용리 완충액은 500 mM 아세트산나트륨, pH 5.8을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 359에 있어서, 용리는 10% 내지 100% 양이온 교환 용리 완충액의 구배 용리인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 352 내지 360 중에서 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 용출물은 모아지고, 여기서 상기 용출물의 OD₂₈₀은 약 0.5 내지 약 1.0보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 251 내지 361 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체는 세포에서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 361에 있어서, 다중특이적 항체의 팔은 세포에서 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 362 또는 363에 있어서, 세포는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 364에 있어서, 원핵 세포는 대장균 (E. coli) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 364 또는 365에 있어서, 세포는 하나 또는 그 이상의 샤프롱을 발현하도록 가공된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 366에 있어서, 샤프롱은 FkpA, DsbA 또는 DsbC 중에서 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 366 또는 367에 있어서, 샤프롱은 대장균 (E. coli) 샤프롱인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 362 내지 368 중에서 어느 한 항에 있어서, 세포는 용해되어 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 세포 용해물을 산출하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 369에 있어서, 세포는 단백질 A 크로마토그래피에 앞서, 용해되어 다중특이적 항체 또는 다중특이적 항체의 팔을 포함하는 세포 용해물을 산출하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 369 또는 370에 있어서, 세포는 미세유동화기를 이용하여 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 369 내지 371 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌이민 (PEI)은 크로마토그래피에 앞서 세포 용해물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 372에 있어서, PEI는 약 0.4%의 최종 농도로 용해물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 369 내지 373 중에서 어느 한 항에 있어서, 세포 용해물은 원심분리에 의해 투명해지는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 251 내지 373 중에서 어느 한 항에 있어서, 산물 특이적 불순물은 비-대합된 항체 팔, 항체 동종이합체, 응집체, 고분자량 종류 (HMW), 저분자량 종류 (LMW), 산성 변이체, 또는 염기성 변이체 중에서 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 251 내지 375 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물 내에 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP), FkpA, DsbA, DsbC, 침출된 단백질 A, 핵산, 세포 배양 배지 성분, 또는 바이러스 불순물 중에서 한 가지의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 232 내지 245, 247 내지 257, 259 내지 267, 또는 269 내지 376 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 377에 있어서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 IL13에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378에 있어서, IL13은 인간 IL13인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378 또는 379에 있어서, IL13은 서열 번호:1 또는 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378 내지 380 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378 내지 381 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378 내지 382 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378 내지 383 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378 내지 384 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 첫 번째 팔은 서열 번호:17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 378 내지 385 중에서 어느 한 항에 있어서, 항체의 두 번째 팔은 IL17에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 386에 있어서, IL17은 인간 IL17인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 386 또는 387에 있어서, IL17은 서열 번호:3, 서열 번호:4, 서열 번호:5 또는 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 386 내지 388 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호:20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 그리고 서열 번호:23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 386 내지 389 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 386 내지 390 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 386 내지 391 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 386 내지 393 중에서 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체의 두 번째 팔은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 231 내지 393 중에서 어느 한 항의 방법에 의해 정제된 폴리펩티드 또는 다중특이적 항체를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내의 산물 특이적 불순물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 394에 있어서, 산물 특이적 불순물은 비-대합된 항체 팔, 항체 동종이합체, 응집체, 고분자량 종류 (HMW), 저분자량 종류 (LMW), 산성 변이체, 또는 염기성 변이체 중에서 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 394 또는 395에 있어서, 조성물은 조성물 내에 약 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내의 대장균 (E. coli) 단백질 (ECP), FkpA, DsbA, DsbC, 침출된 단백질 A, 핵산, 세포 배양 배지 성분, 또는 바이러스 불순물 중에서 한 가지를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.