KR20090101193A - 바실러스 종 １９５ 의 알파-아밀라아제 폴리펩티드에 대한 조성물 및 용도 - Google Patents

Abstract

본원에 기재되는 것은 바실러스 종 제 195 번으로부터 수득된 알파-아밀라아제 효소를 포함하는 조성물, 및 표면 및 직물을 세정하기 위한 상기 효소를 포함하는 방법이다. 또한 기재되는 것은 상이한 신호 서열을 갖는 효소의 변이체이다.

Description

바실러스 종 １９５ 의 알파-아밀라아제 폴리펩티드에 대한 조성물 및 용도 {COMPOSITIONS AND USES FOR AN ALPHA-AMYLASE POLYPEPTIDE OF BACILLUS SPECIES 195}

바실러스 종 (Bacillus sp.) 195 로부터 수득된 α-아밀라아제 효소를 사용하는 조성물 및 방법이 본원에 기재되어 있다.

전분은 아밀로오스 (15-30% w/w) 와 아밀로펙틴 (70-85% w/w) 의 혼합물로 이루어진다. 아밀로오스는 분자량 (MW) 이 약 60,000 내지 약 800,000 인 α-1,4-연결 글루코오스 단위의 선형 사슬로 이루어진다. 아밀로펙틴은 매 24 내지 30 개의 글루코오스 단위마다 α-1,6 분지점을 함유하는 분지 중합체이고; 이의 MW 는 10⁸ 정도로 클 수 있다.

농축된 덱스트로오스 시럽 형태의, 전분으로부터의 당은 현재 (1) α-아밀라아제로 고체 전분의 약 7 - 10 의 평균 중합도를 갖는 덱스트린으로의 액화 (또는 점도 감소), 및 (2) 수득된 액화 전분 (즉, 전분 가수분해물) 의 아밀로글루코시다아제 (또한 글루코아밀라아제 또는 GA 로 불림) 로의 당화를 포함하는 효소 촉매 방법에 의해 생성된다. 수득된 시럽은 글루코오스 함량이 높다. 시판되는 대부분의 글루코오스 시럽은 그 후에 이소시럽 (isosyrup) 으로 알려진 덱스트로오스/프룩토오스 혼합물과 효소적으로 이성화된다.

α-아밀라아제 (EC 3.2.1.1) 는 내부 α-1,4-글루코시드 결합을 랜덤하게 분할하여 전분, 글리코겐, 및 관련 다당류를 가수분해한다. 상기 효소는 예를 들어 당, 양조, 알코올 및 직물 산업에서 다수의 중요한 상업적 적용을 갖는다. α-아밀라아제는 다양한 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 공급원으로부터 단리된다. 산업적으로는, 많은 중요한 α-아밀라아제는 바실리 (Bacilli) 로부터 단리된 것이다.

수 년동안, α-아밀라아제 효소는 전분 액화, 직물 발호 (desizing), 종이 및 펄프 산업에서의 전분 변형, 및 양조를 비롯한 다양한 상이한 목적에 사용되어 왔다. 또한 이들 효소는 식기세정 및 세탁 동안 녹말성 오염물을 제거하는데 사용될 수 있다.

서열분석된 하나의 바실러스 α-아밀라아제는 바실러스 종 제 195 번 (BAA) 으로부터의 것이다. 이것은 2 개의 도메인: 동물 α-아밀라아제와 유사한 촉매 도메인 및 2 개의 전분 결합 모티프를 함유하는 도메인으로 이루어진다. [J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. no. 195 α-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484 (2000)] 참조. [Sumitani et al., (2000)] 에서, 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 의 배양 상청액에서는 3 가지 활성 형태의 유전자 생성물 이 발견되었으며, 여기서 바실러스 종 제 195 번 유전자 생성물은 이종 발현되었다. 3 가지 생성물은 69 kDa 형태, 60 kDa 형태, 및 50 kDa 형태였다. 69 kDa 형태는 전장 유전자의 뉴클레오티드 서열에 근거해 계산한 것에 상응하는 분자량을 갖는 전체 크기 성숙 단백질인 것으로 보인다. 60 kDa 형태는 바실러스 종 제 195 번의 천연 효소와 동일한 것으로 보였고, C-말단에 위치한 2 개의 전분 결합 모티프 사이의 단백질 가수분해 공정에 의해 발생되는 것으로 가정하였다. 상기 형태는 69 kDa 형태에 비해 생 전분 결합 및 분해에 대한 활성이 낮다. 50 kD 형태는 불용성 전분에 결합하거나 이를 분해하지 못한다.

아밀라아제는 직물 가공, 세탁 및 세정 조성물, 발호 조성물, 및 베이킹, 전분 액화 및 가공에 사용되어 왔다. 그러므로, 감소된 비용으로 생성하고, 비용 이윤을 증가시키고, 장비 수용력을 절약하고, 및 활성 생산물을 더 많이 생성하기에 더욱 용이한 α-아밀라아제를 확인하고자 하는 지속적인 필요가 있다.

요약

따라서, 하나의 양상은 증가된 양을 좀더 낮은 비용으로 생성할 수 있을 뿐 아니라, 산업 상 다른 필요를 충족할 수 있는 바실러스 종 195 로부터의 α-아밀라아제에 관한 것이다. 이들 변이체는 α-아밀라아제를 사용하는 다양한 조성물 및 방법에 사용할 수 있다.

목표는 도 2 에 묘사된 핵산, 하나의 대안에서는 최적화된 핵산 (SEQ ID NO: 2) 을 제공하는 것이다. 또다른 양상은 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) α-아밀라아제의 신호 펩티드 또는 그의 절단된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 α-아밀라아제 유전자를 제공한다.

도 4 에 묘사된 폴리펩티드의 절단된 형태를 코딩하는 핵산을 제공하는 것이 또다른 양상이고, 여기서 절단은 아미노산 491 뒤의 임의의 잔기 (예를 들어, 아미노산 492, 494, 504, 509, 임의의 전분 결합 도메인 뒤 등) 에서 일어날 수 있다.

또다른 양상은 도 4 의 전장 폴리펩티드 또는 잔기 491 뒤의 임의의 카르복시-말단 절단된 생성물을 제공한다.

추가 구현예는 전술한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터를 제공한다.

또다른 추가의 양상은 상기 핵산 중 임의의 것 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 가진 단리된 숙주 세포를 포함한다. 단리된 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 단리된 숙주 세포는 박테리아 (예를 들어, B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써쿨란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), S. 뮤리너스 (S. murinus), 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)) 일 수 있다.

또다른 양상은 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 세제 첨가제를 포함하고, 여기서 세제 첨가제는 임의로 비분진 과립, 마이크로과립, 안정화된 액체, 젤 또는 보호된 효소의 형태이다. 세제 첨가제 중의 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같은 절단된 폴리펩티드일 수 있다. 세제 첨가제는 세제 첨가제 1 그램 당 폴리펩티드 약 0.02 mg 내지 약 200 mg 을 함유할 수 있다. 세제 첨가제는 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 녹말가수분해 효소, 셀룰라아제, 폴리에스테라아제, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 양상은 기재된 세제 첨가제 중 임의의 것을 포함하는 세제 조성물을 포함한다. 세제 조성물은 계면활성제, 표백 시스템 또는 표백제, 세제 강화제, 중합체, 안정화제, 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제 (suds suppressor), 항부식제, 염료, 향수, 오염 현탁화제, 퇴색 억제제, 형광 증백제, 또는 살균제 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다. 세제 조성물은 부가적인 효소를 포함할 수 있거나 추가로 포함하며, 여기서 효소는 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 녹말가수분해 효소, 셀룰라아제, 폴리에스테라아제, 또는 이의 임의의 조합이다.

또다른 양상은 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 설겆이 또는 식기세척기 세제 조성물을 포함한다.

또다른 추가의 양상은 본원에 기재된 설겆이 또는 식기세정용 세제를 이를 필요로 하는 식기에 적용하는 것을 포함하는 식기 세정 방법을 포함한다. 식기 세정 방법은 세정액이 본원에 기재된 폴리펩티드를 약 0.01 ppm 내지 약 4 ppm 의 양으로 함유하는 양으로 식기세정 세제를 첨가하는 것을 포함한다.

또다른 양상은 본원에 기재된 세제 첨가제를 포함하는 세탁 세제 조성물을 포함한다. 또다른 추가의 양상은 본원에 기재된 세제 조성물로 용액 중에서 오염된 직물을 세정하는 것을 포함하는 세탁 방법을 포함한다. 상기 방법은 본원에 기재된 폴리펩티드를 용액 중에 약 0.01 내지 약 2 ppm 의 용액 중 양으로 추가로 포함한다.

도 1A-B. 바실러스 종 195 α-아밀라아제 (Accession No. AB006823) 의 뉴클레오티드 코딩 서열. amy195 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 밑줄쳐있다. 중지-코돈은 굵은 글씨체로 표시된다. SEQ ID NO: 1.

도 2. 코돈 최적화 후의 바실러스 종 195 α-아밀라아제의 뉴클레오티드 코딩 서열. 성숙 amy195 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 (LAT) 의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 2) 에 앞선다. LAT 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 밑줄쳐있다. 중지-코돈은 굵은 글씨체로 표시된다. 아미노산 코돈 최적화는 GeneArt® (GeneArt GmbH, Germany) 에 의해 수행되었다.

도 3. Amy195 의 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 3). 신호 서열은 잔기 1-46 이다 (밑줄쳐짐). 성숙 Amy195 는 잔기 47 에서 시작한다. 굵은 글씨체의, 밑줄쳐진 잔기를 코딩하는 코돈은 중지 코돈으로 대체되어 유전적으로 절단된 형태를 발생시켰다. 그러므로, 도 3 의 넘버링을 사용하는 Y511, K521 및 V526 은 유전적으로 절단된 형태의 마지막 아미노산 잔기이다.

도 4. LAT 신호 서열을 가진 이종 융합 단백질로서 묘사되는 Amy195 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 4). 카르복시 말단의 소문자는 CBD-25 족에 속하는 전분 결합 도메인을 형성한다. 아미노 말단의 소문자 (잔기 1-29) 는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 로부터 수득된 아밀라아제 신호 서열을 나타낸다. 대문자는 서브도메인 A 에 대해서는 대략 잔기 30 내지 105 및 208 내지 300; 서브도메인 B 에 대해서는 대략 잔기 106 내지 207; 및 서브도메인 C 에 대해서는 대략 301 내지 492 에 걸쳐있는 것으로 예상되는, 서브도메인 A, B, 및 C 를 비롯한 효소의 촉매 도메인을 묘사한다. Val492 는 단백질 가수분해로 절단된 형태의 마지막 아미노산 잔기이다 (도 4 에서의 넘버링을 사용함). 서브도메인 A 가 폴리펩티드의 선형 서열에서 불연속적이라는 것을 주시한다.

도 5. 바실러스 종 195 의 α-아밀라아제를 코딩하는 핵산을 pHPLT 벡터 중의 LAT 신호 서열을 코딩하는 핵산 및 LAT 종결자 서열에 연결하는 개요. pHPLT 플라스미드는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,871,550 호, 및 6,562,612, 및 미국 특허 공개 20060014265 참조). pHPLT 벡터를 9 개의 프로테아제가 결실된 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 (US20050202535A1 참조) 내에 도입하고, 여기에서 amy195 유전자를 발현시켰다.

도 6. pH 와 단백질 농도의 함수로서, Amy195 효소에 대한 성능 검정법에 대한 결과를 묘사함. 검정되는 분획은 도 10 에 "e-pool" 로 표시된 것이다. 검정법을 96 웰 플레이트 검정법으로 수행하였다. 착색된 쌀 전분으로 오염된 ¼ 인치 직물 천조각 (Testfabrics Inc., 쌀 전분으로 착색된 CS28) 을 각 웰에 넣었다. 완충액: 25 mM HEPES pH 8.0 또는 25 mM CAPS pH 10.3 을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 40℃ 에서 예비인큐베이션하였다. Amy195 효소를 최종 농도 0 ppm 내지 2 ppm 으로 첨가하여 반응을 시작하였다. 플레이트를 Eppendorf Thermomix 장치로, 750 rpm 에서 교반하면서 40℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후, 상청액을 신규 96 웰 플레이트로 옮기고, 488 nm 에서의 흡광도를 Molecular Devices 플레이트 판독기, 모델 Spectra Max 190 에서 판독하였다. Erithicus 소프트웨어의 소프트웨어 패키지 GRAFIT 로 데이터 곡선을 작성하였다. 데이터 지점을 Langmuir 등온 맞춤 알고리즘으로 곡선을 작성하였다 (이는 소프트웨어로 이용가능한, Michaelis-Menten 맞춤 알고리즘과 동일한 형태를 택함). 발현되는 모든 Amy195 단백질은 LAT 로부터의 신호 펩티드를 함유하나, 이것은 분비 과정 동안 절단되고, 성숙 Amy195 단백질로는 존재하지 않는다.

도 7. 도 10 에 제시되는 바와 같은 모든 단백질 가수분해 분절의 성능 검정법. 검정법은 실시예 3 및 pH 8 에서의 도 6 의 설명에 기재된 바와 같이 수행 및 작성되었다. 데이터는 모든 분획이 OxAm (Genencor International, Inc.) 과 동일 또는 이보다 양호하게 성능한다는 것을 보여준다.

도 8. SDS 폴리아크릴아미드 젤을 진행시키고 유전적으로 절단된 Amy195 분자의 발현을 보여준다. 제시된 절단은 도 4 의 넘버링을 사용하여 잔기 494, 504, 및 509 의 C-말단에서 발생한다. 발현 배양물은 실시예 2 에 기재된 바와 같이 수행하였고, 밀도 표준으로서 사용된 OxAm 으로 농도를 추정하였다.

도 9. 유전적으로 절단된 Amy195 아밀라아제 변이체의 적용 성능. 추가 정제 없이 배양 상청액을 사용하여 성능 검정법을 수행하였다. 검정법 절차 및 데이터 곡선 작성은 실시예 3 및 pH 8 에서의 도 6 의 설명에 기재되어 있다. 데이터는 모든 절단된 분자가 OxAm 보다 양호하게 수행되었음을 나타낸다.

도 10. Amy195 단백질 가수분해 분절에 함유된, β-시클로덱스트린 컬럼으로부터의 분획의 분석. 분획은 "w1" (25 mM 비스-트리스 프로판, pH 8.5, 2 mM CaCl₂ 로 컬럼으로부터 용리된 "세정 1"); "w2" ("세정 2" 는 동일한 완충액의 추가 분취액으로 용리하였다); 및 "e-pool" (동일한 완충액 중의 50 mM β-시클로덱스트린으로 용리되고 3 가지 상이한 농도로 젤에 로딩된 분획) 로 표시된다. β-시클로덱스트린 컬럼용 매트릭스를 β-시클로덱스트린 (Sigma Aldrich Cat. No. c4767) 및 에폭시-활성화-Sepharose-6B (GE Healthcare, N.J. Cat. No. 17-0480-01) 로부터 표준 프로토콜에 의해 조직 내에서 (in-house) 합성하였다.

상세한 설명

본 출원은 바실러스 종 제 195 번 α-아밀라아제를 포함하는 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 또한 기재된 것은 α-아밀라아제의 제조 방법에 대한 변형 및 성숙 α-아밀라아제의 폴리펩티드 서열의 개질에 의한 이종 형태이다.

세탁 및 식기 오염물은 조성이 크게 다양하여, 또한 제거되는 능력도 다양하다. 시장에서는 비교적 적은 수의 아밀라아제만이 세탁 및 식기 적용 모두에 사용될 수 있다. 바실러스 종 195 로부터 수득된 α-아밀라아제는 통상 사용되는 임의의 박테리아 아밀라아제와 높은 일치성을 보이지 않는다. 그러므로, 하나의 양상은 예를 들어, Ca²⁺ 의존성 감소, LAS 안정성 개선, pH 범위 개선, 온도 범위 개선, 향상된 특이적 활성, 등에 의한 식기 및 세탁용으로 향상된 특성을 갖는 변이체를 확인하기 위해 백본으로서 야생형 단백질을 사용하는 것이다.

1. 정의 및 머릿글자

본 상세한 설명에 따르면, 하기 약어 및 정의를 적용한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 단일형에는 문맥상 다르게 명확하게 제시되지 않는 경우 복수형 참조가 포함되는 것으로 유념해야만 한다. 그러므로, 예를 들어, "효소" 에 대한 참조에는 다수의 이러한 효소가 포함되며, "투여량" 에 대한 참조에는 당업자에게 공지된 하나 이상의 투여량 및 이의 등가물, 등에 대한 참조가 포함된다. 다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학적 용어는 당업자에게 통상 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 이하에 제공된다.

1.1 머릿글자

하기 머릿글자는 명세서에 논의된 문맥에서 다르게 정의되지 않는 경우 관련 의미를 갖는다.

AE 알코올 에톡실레이트

AEO 알코올 에톡실레이트

AEOS 알코올 에톡시술페이트

AES 알코올 에톡시술페이트

Amy195 바실러스 종 제 195 번으로부터의 α-아밀라아제

AOS α-올레핀술포네이트

AS 알킬 술페이트

CBD-25 카르보히드레이트 결합 도메인 단백질 족 25

cDNA 상보성 DNA

CMC 카르복시메틸셀룰로오스

DNA 데옥시리보핵산

DTMPA 디에틸렌트리아민펜타아세트산

EC 효소 분류

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

EMPA 스위스 연방 재료 검사 및 연구소 [Eidgenossische Materialprufungs- und Forschungs Anstalt: (Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research)]

EO 에틸렌 옥시드 (중합체 분절 분절)

F&HC 섬유 & 생활 캐어 (fabric & household care)

GA 글루코아밀라아제

IPTG 이소프로필 β-D-티오갈락토시드

kDa 킬로 달톤

LAS 선형 알킬벤젠술포네이트

LAT B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 아밀라아제에 속함 (예를 들어, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 아밀라아제 신호 서열 또는 종결자)

MW 분자량

MWU 변형된 볼게무트 (Wohlgemuth) 단위; 1.6x10^-5 mg/MWU = 활성 단위

NOBS 노나노일옥시벤젠술포네이트

NTA 니트릴로아세트산

OxAm Purastar HPAM 5000L (Genencor International, Inc.)

PEG 폴리에틸렌글리콜

pI 등전위점

PVA 폴리(비닐 알코올)

PVP 폴리(비닐피롤리돈)

RNA 리보핵산

SAS 알칸술포네이트

SDS PAGE 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동

sp. 종

TAED 테트라아세틸에틸렌디아민

w/v 중량/부피

w/w 중량/중량

1.2 정의

용어 "아밀라아제" 또는 "녹말가수분해 효소" 는 임의의 아밀라아제, 예컨대 글루코아밀라아제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 및 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 와 같은 바실러스 종의 야생형 α-아밀라아제가 포함되는 것을 의미한다. "아밀라아제" 는 그 중에서도 전분의 분해를 촉매화할 수 있는 효소를 의미할 것이다. 아밀라아제는 전분 내의 α-D-(1→4) O-글리코시드 연결을 분할하는 가수분해효소이다. 일반적으로, α-아밀라아제 (EC 3.2.1.1; α-D-(1→4)-글루칸 글루카노히드롤라아제) 는 전분 분자 내의 α-D-(1→4) O-글리코시드 연결을 랜덤하게 분할하는 내부-작용 효소로서 정의된다. 대조적으로, 외부-작용 녹말가수분해 효소, 예컨대 β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2; α-D-(1→4)-글루칸 말토히드롤라아제) 및 말토오스 생성 α-아밀라아제 (EC 3.2.1.133) 와 같은 일부 생성물-특이적 아밀라아제는 기질의 비-환원 말단으로부터 전분 분자를 분할한다. β-아밀라아제, α-글루코시다아제 (EC 3.2.1.20; α-D-글루코시드 글루코히드롤라아제), 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3; α-D-(1→4)-글루칸 글루코히드롤라아제), 및 생성물-특이적 아밀라아제는 전분으로부터 특정 길이의 말토-올리고당을 생성할 수 있다.

"아밀라아제 변이체", "α-아밀라아제 변이체", "α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드", 및 "변이체 효소" 는 예를 들어 또다른 α-아밀라아제의 신호 서열을 사 용하여 개질되고 서열 최적화된 바실러스 종 제 195 번의 α-아밀라아제 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "모 효소," "모 서열", "모 폴리펩티드", "야생형 α-아밀라아제 단백질", 및 "모 폴리펩티드" 는 α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드가 유래된 효소 및 폴리펩티드를 의미할 것이다. 모 효소는 야생형 효소 또는 재조합적으로 조작된 α-아밀라아제일 수 있다. 그러므로, α-아밀라아제 폴리펩티드는 재조합적으로 조작된 효소일 수 있다. α-아밀라아제 변이체는 또한 이종 α-아밀라아제 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, α-아밀라아제 단백질은 또다른 바실러스 α-아밀라아제의 성숙 단백질에 연결된 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 (LAT) 의 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 용어 "변이체" 는 용어 "돌연변이체" 와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변이체에는 폴리펩티드 뿐 아니라 핵산이 포함될 수 있다. 변이체에는 삽입이 포함될 수 있고; 이들 변이체는 하나 이상의 위치에서, 부가적인 치환, 삽입, 전환, 절단 및/또는 역위를 추가로 함유한다. 변이체에는 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열이 포함될 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건하에서 (예를 들어, 50℃ 및 0.2X SSC {1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃ 시트레이트, pH 7.0}) 혼성화할 수 있는 서열과 상보적이다. 용어 변이체는 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 높은 엄격함 조건하에서 (예를 들어, 65℃ 및 0.1X SSC {1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃ 시트레이트, pH 7.0}) 혼성 화할 수 있는 서열과 상보적인 서열을 추가로 포함할 수 있다.

"바실러스 종 195 의 α-아밀라아제," "Amy195 α-아밀라아제", 또는 "Amy195" 는 도 3 의 단백질을 코딩하는 핵산 (도 1) 또는 또한 도 4 의 단백질을 코딩하는, 도 2 의 합성 핵산 서열을 의미한다. 이것에는 또한 임의의 절단된 형태 (즉, 자연적으로, 재조합적으로 또는 합성적으로 잔기 492 뒤에서 절단됨, 신호 서열이 없는 효소 형태, 또는 이종 신호 서열을 가진 형태 및 카르복시 말단에서 절단됨) 가 포함될 수 있다. 또한, 상기 용어에는 도 3 의 임의의 유도 서열 및 자연에서 발견되지 않는 N- 또는 C-말단에서 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 아미노산 확장을 함유하는 기본적 (underlying) DNA 서열이 포함될 수 있다.

"단리된" 은 서열이 자연적으로 관련되고 자연에서 발견되는 하나 이상의 다른 성분이 서열에 적어도 실질적으로 없는 것을 말한다.

"정제된" 은 물질이 비교적 순수한 상태, 예를 들어, 약 90% 이상의 순수, 또는 약 95% 이상의 순수, 또는 약 98% 이상의 순수한 상태인 것을 의미한다.

"열안정성" 은 승온에 노출 후 활성을 보유하는 효소의 능력을 의미한다. α-아밀라아제와 같은 효소의 열안정성은 반감기에 의해 측정된다. 반감기 (t_½) 는 효소 활성의 반이 정의된 조건하에 상실되는 시간 (분), (시간), 또는 (일) 이다. 반감기 값은 잔류 α-아밀라아제 활성을 측정하여 계산한다.

"pH 범위" 는 5 이상의 pH 단위 범위의 산성에서 염기성 조건으로부터 촉매 활성을 나타내기 위한 효소의 능력을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같은, "pH 안정한" 은 넓은 범위의 pH 에 걸쳐 활성을 보유하기 위한 효소의 능력에 관한 것이다.

본원에 사용되는 바와 같은, "아미노산 서열" 은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질" 과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "펩티드" 와 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "효소" 와 동의어이다.

본원에 사용되는 바와 같은, "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열" 은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 변이체, 상동, 분절 및 유도체 (예컨대 이의 일부) 를 말한다. 뉴클레오티드 서열은 게놈성 또는 합성 또는 재조합 기원일 수 있고, 센스 또는 안티-센스 가닥을 나타내는 지의 여부와는 관계없이 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, 용어 뉴클레오티드 서열에는 게놈성 DNA, cDNA, 합성 DNA, 및 RNA 가 포함된다.

"상동" 은 대상 아미노산 서열 및 대상 뉴클레오티드 서열과 특정 정도의 일치성을 갖는 실재 (entity) 를 의미할 것이다. 상동 서열은 대상 서열과 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상 일치하는, 또는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 일치하는 아미노산 서열이 포함되는 것으로 여겨진다. 전형적으로, 상동은 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위를 포함할 것이다.

본원에 사용되는 바와 같은, "혼성화" 에는 핵산 가닥을 염기 짝짓기를 통해 상보성 가닥과 연결시키는 방법 뿐 아니라, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 기술로 수행되는 바와 같은 증폭 방법이 포함될 것이다. α-아밀라아제 변이체 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, RNA/DNA 이종이량체 (heteroduplex) 또는 RNA/DNA 공중합체로 존재할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, "공중합체" 는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 모두 포함하는 단일 핵산 가닥을 말한다. α-아밀라아제 핵산은 심지어 발현을 추가로 증가시키기 위해 최적화된 코돈일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, "합성" 은 시험관 내 화학 또는 효소 합성에 의해 제조되는 것을 말할 것이다. 이것에는 비제한적으로 피치아 (Pichia), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei), 및 한세눌라 (Hansenula) 와 같은 숙주 유기체에 대한 최적 코돈을 사용하여 제조된 α-아밀라아제 변이체 핵산이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용되는 바와 같은, "변형된 세포" 에는 재조합 DNA 기술을 사용하여 유전적으로 변형된 세포가 포함될 것이다. 형질전환은 전형적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 세포 내에 삽입하여 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열일 수 있다 (즉, 변형되는 세포에 대해 자연적이지 않은 서열, 예컨대 융합 단백질을 코딩하는 서열임).

본원에 사용되는 바와 같은, "작동가능하게 연결된" 은 기재된 성분이 의도되는 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 것을 의미할 것이다. 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 상용성인 조건하에서 달성되는 방식으로 연결된다.

본원에 사용되는 바와 같은, "생물학적으로 활성인" 은 자연 발생적 서열의 유사한 구조 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님), 및/또는 유사한 조절 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님) 및/또는 유사한 생화학적 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님) 을 갖는 서열을 말할 것이다.

2. 핵산 및 그에 의해 코딩된 폴리펩티드

바실러스 종 제 195 번의 핵산 서열은 벡터 내의 다양한 프로모터 및 조절자에 작동가능하게 연결되며, 다양한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 2,103 개의 잔기 핵산 서열은 GenBank Accession No. AB006823 (참조, 도 1A-B) 에 기재되어 있다. 2,103 개의 잔기 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열은 GenBank Accession No. BAA22082.1 에 기재되어 있고, 길이는 700 개의 아미노산이다 (도 3). 첫번째 46 개의 아미노산은 신호 펩티드를 형성한다. 분할은 잔기 46 (Ala46) 뒤에서 일어난다. B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에서 발현되는 경우, 3 가지의 단백질 가수분해 처리된 형태의 단백질이 젤에 제시된다. 이들 형태는 모두 동일한 아미노 말단을 가지나, 카르복시 말단이 상이하다. 49.5 kDa 형태는 잔기 Val492 (도 4 중의 서열) 로 종결되며, 즉, 단백질 가수분해 절단은 잔기 492 뒤에 일어난다. 2 개의 좀더 긴 형태, 69 kDa 및 60 kDa 는 각각 [Sumitani et al., (2000)] 에서 논의된 바와 같은 1 개 및 2 개의 전분 결합 도메인을 함유한다. 유전적으로 C-말단 절단된 형태는 Tyr494, Lys504, 및 Val509 의 C-말단 잔기를 갖는 생성물로 제작된다. 이러한 재조합적으로 생성된 절단 생성물은 모두 도 8 에 제시된 바와 같이 LAT 프로모터 및 신호 서열 조절 하에서 9 개의 프로테아제가 결실된 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 (참조 US20050202535A1) 에서 높은 수준으로 발현되었다.

2.1 융합 단백질 및 재조합 단백질

하나의 양상은 효모 또는 기타 박테리아와 같은 기타 미생물로부터의 아밀라아제의 신호 서열이 사용되는, 바실러스 종 제 195 번의 성숙 단백질에 부착된 융합 단백질을 포함한다. 즉, 도 3 의 신호 서열을 형성하는 첫번째 46 개의 아미노산이 제거되고 또다른 미생물로부터의 신호 서열 또는 기타 미생물로부터 다양한 신호 서열로 변경될 수 있다. 예를 들어, LAT 서열 (밑줄쳐지고 소문자로 표시됨) 은 도 4 에서 제시되는 바와 같은 첫번째 46 개의 아미노산에 대해 치환될 수 있다.

기타 예에는 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에서의 발현을 위한 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 아밀라아제 (amyE) 신호 서열, B. 서브틸리스 (B. subtilis) aprE 프로모터 및 또한 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에서의 발현을 위한 신호 서열이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 게다가, CelA 로부터의 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 프로모터 및 신호 서열을 사용하여 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종에서의 발현을 시험하는 것이 계획된다.

3. 단백질 제조 및 정제 방법

바실러스로부터 배양 배지 내에 분비되는 단백질의 제조 및 정제 방법 뿐 아니라, α-아밀라아제의 제조를 위한 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있다. α-아밀라아제의 예시적 제조 방법은 하기에 기재된다.

3.1 α-아밀라아제의 제조를 위한 물질 및 방법

본원에 기재된 방법에 의해, 또는 당업계에 공지된 임의의 대안적인 방법에 의해 생성되는 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체를 코딩하는 DNA 서열은, 적합한 프로모터, 작동자, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호를 코딩하는 조절 서열, 및 임의로, 억제자 유전자 또는 다양한 활성자 유전자가 전형적으로 포함되는 발현 벡터를 사용하여 효소 형태로 발현될 수 있다.

예를 들어, 바실러스 종 제 195 번은 [T. Kawaguchi et al., "Purification and some properties of a Haim-sensitive α-amylase from newly isolated Bacillus sp. No. 195," Biosc. Biotechnol. Biochem. 56: 1792-1796 (1992)] 에 기재된 바와 같이 30℃ 에서 성장할 수 있다. 대안적으로는, 벡터에 작동가능하게 연결된 α-아밀라아제를 코딩하는 유전자는 스트렙토마이세스 리비단 (Streptomyces lividans) TK-24 와 같은 또다른 유기체에 트랜스펙션될 수 있고 [J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. no. 195 α-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484 (2000)] 에 기재된 바와 같은 적합한 조건하에서 배양될 수 있다.

Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체를 코팅하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 종종 벡터가 도입되게 되는 숙주 세포에 따라 다를 것이다. 그러므로, 벡터는 자발적 복제 벡터, 즉, 염색체외부 존재로서 존재하는 벡터일 수 있고, 이의 복제는 염색체 복제와는 독립적이다 (예를 들어, 플라스미드, 박테 리오파지 또는 염색체외부 요소, 미니-염색체 또는 인공 염색체). 대안적으로는, 벡터는 단리된 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포 게놈에 통합되고 통합된 염색체(들) 과 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 통합된 유전자는 또한 항생제 선별 또는 기타 선별압에 의해 제작된 증폭가능 구축물, 예컨대 필수 조절 유전자의 사용 또는 필수 대사 경로 유전자의 용량 효과를 통한 상보성에 의해 염색체에서 유전자의 다중 카피를 제작하기 위해 증폭될 수 있다.

벡터에서, DNA 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포에 상동 또는 이종인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체를 코딩하는 DNA 서열의 전사를, 특히 박테리아 숙주에서 지시하기 위한 예시적 프로모터는, E. 콜라이 (E. coli) 의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자 dagA 또는 celA 프로모터, 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) α-아밀라아제 유전자 (amyL) 의 프로모터, 바실러스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus) 말토오스 생성 아밀라아제 유전자 (amyM) 의 프로모터, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) α-아밀라아제 (amyQ) 의 프로모터, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 등이다. 진균류 숙주에서의 전사를 위해, 유용한 프로모터의 예는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나아제, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 중성 α-아밀라아제, A. 니게르 (A. niger) 산 적합성 α-아밀라아제, A. 니게르 (A. niger) 글루코아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제, A. 오리자에 (A. oryzae) 알칼리성 프로테아제, A. 오리자에 (A. oryzae) 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 또는 A. 니둘란스 (A. nidulans) 아세타미다아제를 코딩하는 유전자로부터 유래된 것들이다. α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 E. 콜라이 (E. coli) 와 같은 박테리아 종에서 발현되는 경우, 적합한 프로모터, 예를 들어 T7 프로모터 및 파지 람다 프로모터를 비롯한 박테리오파지 프로모터로부터 선택될 수 있다. 효모에서의 발현에 적합한 프로모터의 예에는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 에서의 발현을 위해, CBHII (셀로바이오히드롤라아제: cellobiohydrolase II) 프로모터가 사용될 수 있다.

또한 발현 벡터는 적합한 전사 종결자 및, 진핵생물에서는 Amy195 α-아밀라아제를 코딩하는 DNA 서열 또는 그의 변이체에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 적합하게는 프로모터와 동일한 공급원으로부터 적합하게는 유래될 수 있다.

벡터는 숙주 세포에서 벡터를 복제시킬 수 있는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUBHO, pE194, pAMBl, 및 pIJ702 의 복제 기원이다.

또한 벡터는 선별가능 마커, 예를 들어, 단리된 숙주 세포에서 결점을 보완하는 생성물을 생성하는 유전자, 예컨대 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 또는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 로부터의 dal 유전자, 또는 항생제 내성 예컨대, 예를 들어, 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 게다가, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 xxsC 와 같은 아스페리길루스 (Aspergillus) 선별 마커를 포함할 수 잇으며, 마커는 하이그로마이신 내성을 부여하거나, 선별은 당업계에 공지된 바와 같은 공동-형질전환에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 출원 WO 91/17243 참조.

세포내 발현 또는 고체 상태 발효가 일부 양상에서 유리할 수 있으나 (예를 들어, 숙주 세포로서 특정 박테리아 또는 진균을 사용하는 경우), 하나의 양상은 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체의 배양 배지 내로의 발현을 포함한다. 일반적으로, α-아밀라아제는 배양 배지 내로의 분비를 가능하게 하는 아미노 말단에 신호 서열을 포함한다. 원하는 경우, 상기 신호 펩티드는 각 신호 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 치환에 의해 편리하게 달성되는, 상이한 서열에 의해 대체될 수 있다. α-아밀라아제의 신호 서열은 전형적으로는 3 개의 도메인, N-말단 도메인, H-도메인, 및 C-말단 도메인을 갖는 것을 특징으로 하고, 전형적으로는 길이가 18 내지 35 개의 잔기 범위이나, Amy195 신호 서열을 예로 든 정도로 좀더 길 수 있다.

발현 벡터에는 전형적으로 클로닝 벡터의 성분, 예컨대, 예를 들어, 선택된 숙주 유기체 내에서 벡터의 자발적 복제를 가능하게 하는 요소 및 선별 목적을 위한 하나 이상의 표현형으로 검출가능한 마커가 포함된다. 발현 벡터는 정상적으로 조절 뉴클레오티드 서열, 예컨대 프로모터, 조절자, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 임의로, 억제자 유전자 또는 하나 이상의 활성자 유전자를 포함한다. 부가적으로는, 발현 벡터는 α-아밀라아제 변이체를 숙주 세포 기관, 예컨대 페록시좀, 또는 특정 숙주 세포 구획에 표적화시킬 수 있는 아미노산 서열에 대한코딩 서열을 포함할 수 있다. 이러한 표적 서열에는 서열 SKL 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 조절 서열의 지시하에 발현을 위해, α-아밀라아제 변이체의 핵산 서열은 발현과 관련해 적합한 방식으로 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부의 예시적 벡터가 도 5 에 묘사되어 있다.

α-아밀라아제 변이체, 프로모터, 종결자 및 기타 요소를 각각 코딩하는 DNA 구축물을 연결하고, 이들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터 내에 삽입하는데 사용되는 절차는, 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, 및 3^rd ed., 2001 참조).

DNA 구축물 또는 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포는, 유리하게는 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체의 재조합 생성에 숙주 세포로서 사용된다. 세포는 편리하게는 숙주 염색체 내에 DNA 구축물 (하나 이상의 카피) 을 통합하여, 효소를 코딩하는 DNA 구축물로 형질전환될 수 있다. 상기 통합은 일반적으로는 DNA 서열이 세포내에 안정적으로 유지되는 것 같다면 유리한 것으로 고려된다. 숙주 염색체 내로의 DNA 구축물의 통합은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 상동 또는 이종 재조합에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로는, 세포는 상이한 유형의 숙주 세포와 관련해 상기 기재된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.

적합한 박테리아 숙주 유기체의 예는 그람 양성 박테리아 종, 예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스 (Bacillus lautus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 및 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 를 비롯한 바실라세아에 (Bacillaceae); 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종, 예컨대 스트렙토마이세스 뮤리너스 (Streptomyces murinus); 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis) 와 같은 락토코쿠스 종 (Lactococcus spp.) 을 비롯한 락트산 박테리아 종; 락토바실러스 류테리 (Lactobacillus reuteri) 를 비롯한 락토바실러스 종 (Lactobacillus spp.); 류코노스토크 종 (Leuconostoc spp.); 페디오코쿠스 종 (Pediococcus spp.); 및 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus spp.) 이다. 대안적으로는, E. 콜라이 (E. coli) 를 비롯한 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 또는 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae) 에 속하는 그람 음성 박테리아 종의 균주가 숙주 유기체로서 선택될 수 있다.

적합한 효모 숙주 유기체는 효모 종, 예컨대 피샤 종 (Pichia sp.), 한세눌라 종 (Hansenula sp.), 또는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위니아 (Yarrowinia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 종 또는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 를 비롯한 사카로마이세스 (Saccharomyces) 의 종 또는 예를 들어, S. 폼베 (S. pombe) 종과 같은 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 에 속하는 종과 같으나 이에 제한되지 않는 생물공학적으로 관련된 효모 종으로부터 선택될 수 있다. 메틸영양 효모 종의 균주 피샤 파스토리스 (Pichia pastoris) 는 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 대안적으로는, 숙주 유기체는 한세눌라 (Hansenula) 종일 수 있다. 사상 진균 중 적합한 숙주 유기체에는 아스페르길루스 (Aspergillus) 의 종, 예를 들어, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 투비겐시스 (Aspergillus tubigensis), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 또는 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 가 포함된다. 대안적으로는, 푸사리움 (Fusarium) 종, 예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 또는 리조무코르 (Rhizomucor) 종, 예컨대 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 의 균주가 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 기타 적합한 균주에는 테르모마이세스 (Thermomyces) 및 무코르 (Mucor) 종이 포함된다. 게다가, 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 는 숙주로서 사용될 수 있다. 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주 세포의 형질 전환에 적합한 절차에는 예를 들어 EP 238023 에 기재된 것이 포함된다.

또다른 추가의 양상에서, α-아밀라아제 Amy195 또는 이의 변이체의 제조 방법은 효소의 생성에 도움이 되는 조건하에서 상기 기재된 숙주 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 효소를 회수하는 것을 포함하여 제공된다.

세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주 세포를 성장시키고 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체의 발현을 수득하는데 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지 및 배지 성분은 시판 공급처에서 입수가 가능하거나, 공개된 처방에 따라 (예를 들어, American Type Culture Collection 의 카달로그에 기재된 바와 같이) 제조할 수 있다.

하나의 양상에서, 숙주 세포로부터 분비된 효소는 전체 브로스 제조에 사용된다. 본 발명의 방법에서, 재조합 미생물의 소비된 전체 발효 브로스의 제조는 α-아밀라아제의 발현을 가져오는 당업계에 공지된 임의의 배양 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 그러므로 발효는 적합한 배지에서 그리고 아밀라아제를 발현 또는 단리되도록 하는 조건하에서 수행되는 실험실 또는 산업적 배양기에서의 진탕 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 발효 (지속적인, 배치, 공급-배치, 또는 고체 상태 발효를 포함) 를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 용어 "소비된 전체 발효 브로스" 는 배양 배지, 세포외 단백질 (예를 들어, 효소), 및 세포 바이오매스를 포함하는 발효 물질의 미분획된 내용물로 본원에 정의된다. 용어 "소비된 전체 발효 브로스" 는 또한 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 용리되거나 투과되는 세포 바이오매스를 포함하는 것으로 이해된다.

숙주 세포로부터 분비된 효소는 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하고, 암모늄 술페이트와 같은 염에 의해 배지의 단백질 성분을 침전시킨 후, 크로마토그래피 절차, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 등을 사용하는 것을 포함하는, 잘 공지된 절차에 의해 세포 배지로부터 편리하게 회수될 수 있다.

하나의 양상은 벡터 중의 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 의해 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것을 포함하는, 즉, 벡터는 발현 벡터이다. 조절 서열은 예를 들어 추가의 전사 조절 요소의 첨가에 의해 조절 서열에 의해 지시되는 전사 수준을 전사 조절자에 더욱 민감하도록 변형할 수 있다. 조절 서열은 특히 프로모터를 포함할 수 있다.

숙주 세포는 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 효소의 발현은 지속적으로 생성되거나, 발현 개시에 대한 자극을 필요로하는 유도성인 식으로 구조적일 수 있다. 유도성 발현의 경우, 단백질 생성은 예를 들어, 배양 배지에 유도자 성분을 (예를 들어 덱사메타손 또는 IPTG 또는 Sepharose) 첨가하여 필요할 때 개시될 수 있다. 또한 폴리펩티드는 TnT™ (Promega) 토끼 망상적혈구 시스템과 같은, 시험관 내 무세포 시스템에서 재조합적으로 생성될 수 있다.

Amy195 α-아밀라아제, 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주는 또한 호기성 조건 하에서, 숙주에 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 숙주의 요구 및 바람직한 α-아밀라아제 변이체의 생성에 따라, 숙주에 적합한 온도, 예를 들어 약 25℃ 내 지 약 75℃ (예를 들어, 30℃ 내지 45℃) 에서 생성되며, 교반 또는 진탕과 통기의 조합이 제공될 수 있다. 배양은 약 12 내지 약 100 시간 이상 (및 그 사이의 임의의 시간 값, 예를 들어, 24 내지 72 시간) 에서 일어날 수 있다. 전형적으로는, 배양 브로스의 pH 는 약 5.5 내지 약 8.0 이며, 또한 α-아밀라아제 변이체의 제조에 관해 숙주가 필요로 하는 배양 조건에 따라 다를 수 있다.

3.2 단백질 정제를 위한 물질 및 방법

발효, 분리 및 농축 기술이 당업계에 잘 알려져 있으며, 농축된 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체 함유 용액을 제조하기 위해 통상적인 방법이 사용될 수 있다.

발효 후, 발효 브로스를 수득하고, 잔류 생 발효 물질을 비롯한 미생물 세포 및 다양한 현탁 고체를 아밀라아제 용액을 수득하기 위해 통상적인 분리 기술에 의해 제거한다. 여과, 원심분리, 초여과, 회전 진공 드럼 여과, 초여과, 원심분리 후 초여과, 추출 또는 크로마토그래피, 등이 일반적으로 사용된다.

회수를 최적화하기 위해 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체 함유 용액을 농축하는 것이 바람직하다. 미농축 용액의 사용은 정제된 효소 침전물을 수집하기 위해 인큐베이션 시간을 증가시켜야 할 필요가 있다.

효소 함유 용액은 원하는 효소 수준이 달성될 때까지 통상적인 농축 기술을 사용하여 농축된다. 효소 함유 용액의 농축은 본원에 논의된 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 정제 방법에는 회전 진공 여과 및/또는 초여과가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

효소 용액은 농축된 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체 함유 용액의 효소 활성이 약 4 g/L 이상 (예를 들어, 약 4.8 g/L 이상, 또는 5.6 g/L 이상, 또는 심지어 그 이상) 이 될 때까지 농축 효소 용액으로 농축한다. 상기 농도는 특정 적용 하에서 약 25 g/L 정도로 증가될 수 있다.

정제를 목적으로 하는 "침전제" 는 그의 성분이 고체 형태의 효소 용액으로부터 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체를 침전시키는데 유효한 화합물을 의미한다 (즉 결정질, 비결정질 또는 둘의 혼화물일 수 있는지의 여부와는 관계없다).

침전은 예를 들어, 금속 할라이드 침전제를 사용하여 수행될 수 있다. 금속 할라이드 침전제에는 알칼리 금속 클로라이드, 알칼리 금속 브로마이드 및 상기 금속 할라이드의 2 가지 이상의 혼화물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 금속 할라이드에는 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨 및 상기 금속 할라이드의 2 가지 이상의 혼화물이 포함된다. 금속 할라이드 침전제인, 염화나트륨은 또한 방부제로서 사용될 수 있다.

금속 할라이드 침전제는 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체를 침전시키는데 유효한 양으로 사용된다. 효소의 침전에 유효한 금속 할라이드의 적어도 유효한 양 및 최적 양 뿐 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및 효소의 농도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 통상의 시험 후에 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.

일반적으로, 약 5% w/v (중량/부피) 이상 내지 약 25% w/v 의 금속 할라이드 를 농축 효소 용액에 첨가한다 (통상 8% w/v 이상임). 일반적으로, 약 25% w/v 이하의 금속 할라이드를 농축 효소 용액에 첨가한다 (통상 약 20% w/v 이하임). 금속 할라이드 침전제의 최적 농도는 그 중에서도, 특이적 Amy195 α-아밀라아제 변이체의 특성 및 농축 효소 용액에서의 그의 농도에 따라 다를 것이다.

효소의 침전에 영향을 주는 또다른 대안은 유기 화합물을 사용하는 것이다. 예시적 유기 화합물 침전제에는 4-히드록시벤조산, 4-히드록시벤조산의 알칼리 금속 염, 4-히드록시벤조산의 알킬 에스테르, 및 2 가지 이상의 상기 유기 화합물의 혼화물이 포함된다. 상기 유기 화합물 침전제의 첨가는 금속 할라이드 침전제의 첨가 전, 이와 동시에 또는 그 후에 일어날 수 있고, 두 가지 침전제인 유기 화합물 및 금속 할라이드의 첨가는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.

추가의 기재를 위해 예를 들어, 미국 특허 제 5,281,526 호를 참조한다. 일반적으로, 유기 침전제는 4-히드록시벤조산의 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨염, 및 4-히드록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 12 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유기 화합물 침전제는 예를 들어 4-히드록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 10 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물일 수 있다. 예시적 유기 화합물은 4-히드록시벤조산의 선형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 6 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물이다. 4-히드록시벤조산의 메틸 에스테르, 4-히드록시벤조산의 프로필 에스테르, 4-히드록시벤조산의 부틸 에 스테르, 4-히드록시벤조산의 에틸 에스테르 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물이 또한 사용될 수 있다. 부가적인 유기 화합물에는 또한 4-히드록시벤조산 메틸 에스테르 (메틸 파라벤 (PARABEN) 으로 불림), 4-히드록시벤조산 프로필 에스테르 (프로필 파라벤 (PARABEN) 으로 불림) (또한 둘다 아밀라아제 방부제임) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

유기 화합물 침전제의 첨가는 pH, 온도, Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체 농도, 침전제 농도, 및 인큐베이션 시간에 대해 침전 조건의 높은 융통성의 장점을 제공한다.

유기 화합물 침전제는 금속 할라이드 침전제에 의해 효소의 침전을 개선하기에 유효한 양으로 사용된다. 유기 화합물 침전제의 적어도 유효한 양 및 최적 양 뿐 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및 효소의 농도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 통상의 시험 후에 본 명세서의 견지에서, 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.

일반적으로, 약 0.01% w/v 이상의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 0.02% w/v 이상임). 일반적으로, 약 0.3% w/v 이하의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 0.2% w/v 이하임).

금속 할라이드 침전제, 및 유기 화합물 침전제를 함유하는 농축 효소 용액은, 필요한 경우 정제되는 효소에 따라 pH 를 조정할 수 있다. 일반적으로, pH 는 아밀라아제의 등전위점 근처의 수준으로 조정된다. pH 는 등전위점 (pI) 약 2.5 pH 단위 미만 내지 등전위점 약 2.5 pH 단위 초과의 범위의 pH 로 조정될 수 있다.

정제된 효소 침전물을 수득하기에 필요한 인큐베이션 시간은 특이적 효소의 특성, 효소의 농도, 및 특이적 침전제(들) 및 그의 농도에 따라 다르다. 일반적으로, 효소를 침전시키는데 유효한 시간은 약 1 내지 약 30 시간이고; 통상 이것은 약 25 시간을 초과하지 않는다. 유기 화합물 침전제의 존재하에서, 인큐베이션 시간은 여전히 약 10 시간 미만으로, 대부분의 경우는 심지어 약 6 시간으로 감소될 수 있다.

일반적으로, 인큐베이션 동안의 온도는 약 4℃ 내지 약 50℃ 이다. 통상, 상기 방법은 약 10℃ 내지 약 45 ℃ (예를 들어, 약 20℃ 내지 약 40℃) 의 온도에서 수행된다. 침전 유도를 위한 최적 온도는 사용되는 용액 조건 및 효소 또는 침전제(들) 에 따라 다르다.

정제 효소 침전물의 전체적인 회수 및, 방법이 수행되는 효율은 효소, 첨가된 금속 할라이드 및 첨가된 유기 화합물을 포함하는 용액을 진탕하여 향상된다. 진탕 단계는 금속 할라이드와 유기 화합물의 첨가 동안, 및 연이은 인큐베이션 기간 동안에 수행된다. 적합한 진탕법에는 기계적 교반 또는 쉐이킹, 강한 진탕 또는 임의의 유사한 기술이 포함된다.

인큐베이션 기간 후, 그 다음 정제된 효소를 분리된 안료 및 기타 불순물로부터 분리하고, 통상의 분리 기술, 예컨대 여과, 원심분리, 정밀여과, 회전 진공 여과, 초여과, 압축 여과, 십자 막 정밀여과, 십자 흐름 막 정밀여과, 등에 의해 수집한다. 정제된 효소 침전물의 추가 정제는 침전물을 물로 세정하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 정제된 효소 침전물을 금속 할라이드 침전제를 함유하는 물, 또는 금속 할라이드와 유기 화합물 침전제를 함유하는 물로 세정한다.

발효 동안, Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체가 배양 브로스에 축적된다. 바람직한 α-아밀라아제 변이체의 단리 및 정제를 위해, 배양 브로스를 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거하고, 산출된 무세포 액체는 효소 정제에 사용된다. 하나의 구현예에서, 무세포 브로스를 약 70% 포화 암모늄 술페이트를 사용하여 염석 (salting out) 에 적용하고; 그 다음 70% 포화-침전 분획을 완충액에 용해하고, Sephadex G-100 컬럼과 같은 컬럼에 적용하고, 용리하여 효소-활성 분획을 회수한다. 추가 정제를 위해, 통상의 절차, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

정제된 효소는 세탁 및 세정 적용에 유용하다. 예를 들어, 이들은 세탁 세제 및 오염 제거제에 사용될 수 있다. 이들은 액체 (용액, 슬러리) 또는 고체 (과립, 분말) 인 최종 생성물로 제조될 수 있다.

정제의 좀더 구체적인 예는, [J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. no. 195 α-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484 (2000)] 에 기재되어 있고, 본원에 간략하게 요약된다. 4 리터의 스트렙토마이세스 리비단 (Streptomyces lividans) TK24 배양 상청액으로부터 수득된 효소를 80% 포화 (NH₄)₂SO₄ 로 처리하였다. 침전물을 10,000 x g (20 분 및 4℃) 에서 원심분리에 의해 회수하고, 5 mM CaCl₂ 를 함유하는 20 mM Tris/HCl 완충액 (pH 7.0) 에 재용해하였다. 그 다음 가용화된 침전물을 동일한 완충액에 대해 투석하였다. 그 다음 투석된 샘플을 20 mM Tris/HCl 완충액, (pH 7.0), 5 mM CaCl₂ 로 미리 평형화되고, 동일한 완충액으로 7 cm/hr 의 선형 유속으로 용리된, Sephacryl S-200 컬럼에 적용하였다. 컬럼으로부터 분획을 수집하고, 효소 검정법 및 SDS-PAGE 에 의해 판단되는 바와 같이 활성을 평가하였다. 단백질을 하기와 같이 추가 정제하였다. Toyopearl HW55 컬럼 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA; Cat. No. 19812) 을 5 mM CaCl₂ 및 1.5 M (NH₄)₂SO₄ 를 함유하는 20 mM Tris/HCl 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화시켰다. 효소를 5 mM CaCl₂ 를 함유하는 20 mM Tris/HCL 완충액, pH 7.0 중의 1.5 → 0 M (NH₄)₂SO₄ 의 선형 구배로 용리하였다. 활성 분획을 수집하고, 효소를 80% 포화 (NH₄)₂SO₄ 로 침전시켰다. 상기 기재된 바와 같이 침전물을 회수하고, 재용해하고, 투석하였다. 그 다음 투석된 샘플을 60 mL/hr 의 유속에서, 5 mM CaCl₂ 를 함유하는 20 mM Tris/HCl 완충액 (pH 7.0) 로 미리 평형화된, Mono Q HR5/5 컬럼 (Amersham Pharmacia; Cat. No. 17-5167-01) 에 적용하였다. 활성 분획을 수집하고, 1.5 M (NH₄)₂SO₄ 용액에 첨가하였다. 활성 효소 분획을 상기 와 같이 Toyopearl HW55 컬럼에 재-크로마토그래피하여, 이전과 같이 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바와 같이 균질 효소를 산출하였다. 방법의 일반적인 논의 및 그의 변형을 위해 [J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. no. 195 α-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484 (2000)] 를 참조한다.

생산 규모 회수를 위해, 효소를 중합체로의 응집을 통해 세포를 제거하여 상기 일반적으로 기재된 바와 같이 부분적으로 정제할 수 있다. 대안적으로는, 효소는 시판되는 막 및 장비를 사용하여 정밀여과 후 초여과에 의한 농축에 의해 정제될 수 있다. 그러나, 일부 적용을 위해서는, 효소는 정제될 필요는 없고, 전체 브로스 배양물을 용리하고 추가 처리 없이 사용할 수 있다. 그 다음 효소는 예를 들어, 과립으로 가공될 수 있다.

4. 세정 조성물

Amy195 α-아밀라아제 및 이의 변이체(들) 은 다양한 산업적 적용을 가능하게하는 유용한 특성을 갖는다. 이러한 효소는 세정, 식기세정 및 바닥·타일 세정 세제 조성물 중의 성분으로서 사용될 수 있다. 이들은 세제 첨가제의 일부로서, 세제 조성물의 일부로서, 식기세척기 또는 설겆이 세정 조성물의 일부 등으로서 제형화될 수 있다. Amy195 α-아밀라아제 및 이의 변이체(들) 은 세제에 통상적으로 사용되는 농도로 도입될 수 있다. 현재, 세제 조성물 중에 α-아밀라아제는 세정/식기세정액 1 리터 당 α-아밀라아제 0.00001 내지 1 mg (순수 효소 단백질로서 계산됨) 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다고 고려된다. 예시적 제형이 본원에 제공된다.

4.1 세탁 세제 조성물

따라서, Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체는 전형적으로, 오직 효소만으로 또는 기타 녹말가수분해 효소를 비롯한 다른 효소와 함께 세제 조성물의 성분일 수 있다. 이처럼, 이것은 비분진 과립, 안정화된 액체, 또는 보호된 효소의 형태로 세제 조성물에 포함될 수 있다. 비분진 과립은 미국 특허 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호에 기재되는 바와 같이 제조될 수 있고, 임의로 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 왁스성 코팅 물질의 예는 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 폴리(에틸렌 옥시드) 생성물 (폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 에톡실화 지방 알코올 (여기서 알코올의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 있음); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드이다. 유동층 기술에 의해 적용하기에 적합한 막형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 특허 번호 1483591 에 제시된다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 수립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화될 수 있다. 기타 효소 안정화제는 당업계에 잘 알려져 있다. 보호된 효소는 예를 들어 EP 238,216 에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 폴리올은 단백질의 안정화제 뿐 아니라, 단백질 가용성 개선용으로서 인지되어 왔다. 예를 들어, [J. K. Kaushik et al., "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer?" J. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003)] 및 여기에 언급된 참조; 및 [Monica Conti et al., "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility," J. Chromatography A 757: 237-245 (1997)] 를 참조한다.

세제 조성물은 임의의 유용한 형태, 예를 들어 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는, 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있다. 또한 약 30% 물만을 함유하는 컴팩트 젤 유형의 형태일 수 있다.

세제 조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 이들 각각은 음이온성, 비이온성, 양이온성 또는 양쪽이온성일 수 있다. 세제는 통상 0% 내지 약 50% 의 음이온성 계면활성제, 예컨대 선형 알킬벤젠술포네이트 술포네이트 (LAS); α-올레핀술포네이트 (AOS); 알킬 술페이트 (지방 알코올 술페이트) (AS); 알코올 에톡시술페이트 (AEOS 또는 AES); 2차 알칸술포네이트 (SAS); α-술포 지방산 메틸 에스테르; 알킬- 또는 알케닐숙신산; 또는 비누를 함유할 것이다. 조성물은 또한 0% 내지 약 40% 의 비이온성 계면활성제, 예컨대 알코올 에톡실레이트 (AEO 또는 AE), 카르복실화 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 또는 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 (예를 들어 WO 92/06154 에 기재된 바와 같음) 를 함유할 수 있다.

세제 조성물은 부가적으로는 하나 이상의 기타 효소, 예컨대 리파아제, 또다 른 녹말가수분해 효소, 큐티나아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 및/또는 락카아제를 임의의 조합으로 포함할 수 있다.

세제는 약 1% 내지 약 65% 의 세제 강화제 또는 복합제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층 실리케이트 (예를 들어, SKS-6, Hoechst 사 제조) 를 함유할 수 있다. 세제는 또한 미강화 (unbuilt), 즉 본질적으로 세제 강화제가 없는 것일 수 있다. 효소는 효소의 안정성과 상용성인 임의의 조성물로 사용될 수 있다. 효소는 일반적으로 공지된 형태의 캡슐화, 예를 들어, 히드로겔 내에 과립화 또는 격리에 의해 유해한 성분에 대해 보호될 수 있다. 효소, 및 구체적으로 α-아밀라아제, 예컨대 amy195 분자는 전분 결합 도메인의 유무와 관계없이, 세탁 및 식기세정 적용, 타일·바닥 세척제를 비롯한 다양한 조성물 뿐 아니라, 전분 또는 바이오매스로부터의 에탄올 생성을 위한 조성물에 사용될 수 있다.

세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예에는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리카르복실레이트, 예컨대 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 포함된다.

세제는 과산 (peracid)-형성 표백 활성화제, 예컨대 테트라아세틸에틸렌디아민 (TAED) 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트 (NOBS) 와 조합될 수 있는, 퍼보레이 트 또는 퍼카르보네이트와 같은 H₂O₂ 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 대안적으로는, 표백 시스템은 퍼옥시산 (예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산) 을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 효소 표백 시스템, 예를 들어, 퍼히드롤라아제, 예컨대 국제 PCT 출원 WO 2005/056783 에 기재된 것일 수 있다.

세제 조성물의 효소는 통상의 안정화제, 예를 들어 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤; 당 또는 당 알코올; 락트산; 붕산 또는 붕산 유도체, 예컨대, 예를 들어, 방향족 보레이트 에스테르를 사용하여 안정화될 수 있고; 조성물은 예를 들어, WO 92/19709 호 및 WO 92/19708 호에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.

또한 세제는 기타 통상의 세제 성분, 예컨대 예를 들어, 점토를 비롯한 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 변색 억제제, 형광 증백제, 또는 향수를 함유할 수 있다.

pH (사용 농도로 수용액에서 측정됨) 는 중성 내지 알칼리성, 예를 들어 pH 약 7.0 내지 약 11.0 이다.

Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체를 포함하는 세제 조성물의 특정 형태는 하기를 비롯해 제형화될 수 있다:

1) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로서 계산됨) 약 7% 내지 약 12%; 알 코올 에톡시술페이트 (예, C_12-18 알코올, 1-2 에틸렌 옥시드 (EO)) 또는 알킬 술페이트 (예, C_16-18) 약 1% 내지 약 4%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_14-15 알코올, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 14% 내지 약 20%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 2 내지 약 6%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 15% 내지 약 22%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 6%; 나트륨 시트레이트/시트르산 (예, C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇) 약 0% 내지 약 15%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 11% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 6%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 및 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소로서 계산됨) 0.0001-0.1% 단백질; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제, 광표백제) 0-5%.

2) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 11%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C_12-18 알코올, 1-2 EO) 또는 알킬 술페이트 (예, C_16-18) 약 1% 내지 약 3%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_14-15 알코올, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 15% 내지 약 21%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 24% 내지 약 34%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 4% 내지 약 10%; 나트륨 시트레이트/시트르산 (예, C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇) 0% 내지 약 15%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-6%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

3) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 5% 내지 약 9%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_12-15 알코올, 7 EO) 약 7% 내지 약 14%; 지방산으로서 비누 (예, C_16-22 지방산) 약 1 내지 약 3%; 나트륨 카르보네이트 (Na₂CO₃ 으로서) 약 10% 내지 약 17%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 3% 내지 약 9%; 제올라이트 (NaAlSiO₄ 로서) 약 23% 내지 약 33%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 4%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 8% 내지 약 16%; TAED 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 (예, EDTMPA) 0% 내지 약 1%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

4) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 12%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_12-15 알코올, 7 EO) 약 10% 내지 약 25%; 나트륨 카르보네이트 (Na₂CO₃ 으로서) 약 14% 내지 약 22%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 25% 내지 약 35%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 10%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

5) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_12-15 알코올, 7 EO 또는 C_12-15 알코올, 5 EO) 약 12% 내지 약 18%; 지방산으로서 비누 (예, 올레산) 약 3% 내지 약 13%; 알케닐숙신산 (C_12-14) 0% 내지 약 13%; 아미노에탄올 약 8% 내지 약 18%; 시트르산 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 0% 내지 약 3%; 중합체 (예, PVP, PEG) 0% 내지 약 3%; 보레이트 (예, B₄O₇) 0% 내지 약 2%; 에탄올 0% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 8% 내지 약 14%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 분산제, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

6) 하기를 포함하는 수성 구성 액체 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_12-15 알코올, 7 EO, 또는 C_12-15 알코올, 5 EO) 3-9%; 지방산으로서 비누 (예, 올레산) 약 3% 내지 약 10%; 제올라이트 (NaAl SiO₄ 로서) 약 14% 내지 약 22%; 칼륨 시트레이트 약 9% 내지 약 18%; 보레이트 (예, B₄O₇) 0% 내지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, PEG, PVP) 0% 내지 약 3%; 부착 중합체, 예를 들어, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체; 몰비 25:1, MW 3800) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 분산제, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

7) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 지방 알코올 술페이트 약 5% 내지 약 10%; 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서 비누 0-3%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 5% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAl SiO₄) 약 20% 내지 약 40%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 2% 내지 약 8%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 12% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 7%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

8) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 14%; 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드 약 5% 내지 약 11%; 지방산으로서 비누 0% 내지 약 3%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 4% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 (Na₂O, 2SiO₂) 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 30% 내지 약 50%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 3% 내지 약 11%; 나트륨 시트레이트 (예, C₆H₅Na₃O₇) 약 5% 내지 약 12%; 중합체 (예, PVP, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.

9) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 12%; 비이온성 계면활성제 약 1% 내지 약 4%; 지방산으로서 비누 약 2% 내지 약 6%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 14% 내지 약 22%; 제올라이트 (예, NaAl SiO₄) 약 18% 내지 약 32%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 약 5% 내지 약 20%; 나트륨 시트레이트 (예, C₆H₅Na₃O₇) 약 3% 내지 약 8%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃H₂O) 약 4% 내지 약 9%; 표백 활성화제 (예, NOBS 또는 TAED) 약 1% 내지 약 5%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 폴리카르복실레이트 또는 PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 향수) 0-5%.

10) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 23%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C_12-15 알코올, 2-3 EO) 약 8% 내지 약 15%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_12-15 알코올, 7 EO, 또는 C_12-15 알코올, 5 EO) 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서 비누 (예, 라우르산) 0% 내지 약 3%; 아미노에탄올 약 1% 내지 약 5%; 나트륨 시트레이트 약 5% 내지 약 10%; 하이드로트롭 (예, 나트륨 톨루엔술포네이트) 약 2% 내지 약 6%; 보레이트 (예, B₄O₇) 0% 내 지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 0% 내지 약 1%; 에탄올 약 1% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 2% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 중합체, 분산제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

11) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 20% 내지 약 32%; 알코올 에톡실레이트 (예, C_12-15 알코올, 7 EO, 또는 C_12-15 알코올, 5 EO) 6-12%; 아미노에탄올 약 2% 내지 약 6%; 시트르산 약 8% 내지 약 14%; 보레이트 (예, B₄O₇) 약 1% 내지 약 3%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, 부착 중합체, 예를 들어, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 약 3% 내지 약 8%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 하이드로트롭, 분산제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.

12) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 음이온성 계면활성제 (선형 알킬벤젠술포네이트, 알킬 술페이트, α-올레핀술포네이트, α-술포 지방산 메틸 에스테르, 알칸술포네이트, 비누) 약 25% 내지 약 40%; 비이온성 계면활성제 (예, 알코올 에톡실레이트) 약 1% 내지 약 10%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 8% 내지 약 25%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 약 5% 내지 약 15%; 나트륨 술페이트 (예, Na₂SO₄) 0% 내지 약 5%; 제올라이트 (NaAl SiO₄) 약 15% 내지 약 28%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO₃·4H₂O) 0% 내지 약 20%; 표백 활성화제 (TAED 또는 NOBS) 약 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 향수, 형광 증백제) 0-3%.

13) 상기 조성물 1)- 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (여기서 선형 알킬벤젠술포네이트 모두 또는 이의 일부는 (C₁₂-C₁₈) 알킬 술페이트로 대체됨).

14) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C₁₂-C₁₈) 알킬 술페이트 약 9% 내지 약 15%; 알코올 에톡실레이트 약 3% 내지 약 6%; 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예, NaAlSiO₄) 약 10% 내지 약 20%; 층화 디실리케이트 (예, SK56, Hoechst 사 제조) 약 10% 내지 약 20%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na₂CO₃) 약 3% 내지 약 12%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 0% 내지 약 6%; 나트륨 시트레이트 약 4% 내지 약 8%; 나트륨 퍼카르보네이트 약 13% 내지 약 22%; TAED 약 3% 내지 약 8%; 중합체 (예, 폴리카르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 광표백제, 향수, 비누거품 억제제) 0-5%.

15) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C₁₂-C₁₈) 알킬 술페이트 약 4% 내지 약 8%; 알코올 에톡실레이트 약 11% 내지 약 15%; 비누 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 MAP 또는 제올라이트 A 약 35% 내지 약 45%; 나트륨 카르보네이트 (Na₂CO₃ 으로서) 약 2% 내지 약 8%; 가용성 실리케이트 (예, Na₂O, 2SiO₂) 0% 내지 약 4%; 나트륨 퍼카르보네이트 약 13% 내지 약 22%; TAED 1-8%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 3%; 중합체 (예, 폴리카르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 포스포네이트, 향수) 0-3%.

16) 상기 1) - 15) 에 기재된 바와 같은 세제 제형 (이것은 안정화되거나 캡슐화된 과산을 부가적인 성분 또는 이미 구체화된 표백계에 대한 치환제로서 함유함).

17) 상기 1), 3), 7), 9), 및 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (여기서 퍼보레이트는 퍼카르보네이트로 대체됨).

18) 상기 1), 3), 7), 9), 12), 14), 및 15) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (이것은 부가적으로 망간 촉매를 함유함). 망간 촉매는 예를 들어 ["Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching," Nature 369: 637-639 (1994)] 에 기재된 화합물 중 하나이다.

19) 선형 알콕실화 1차 알코올과 같은 액체 비이온성 계면활성제, 강화제계 (예, 포스페이트), 효소(들), 및 알칼리를 포함하는 비-수성 세제 액체로서 제형화된 세제 조성물. 또한 세제는 음이온성 계면활성제 및/또는 표백계를 포함할 수 있다.

Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체는 세제에 통상적으로 사용되는 농도로 도입될 수 있다. 현재, 세제 조성물 중에 효소는 세정액 1 리터 당 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체 0.00001-1.0 mg (순수 효소 단백질로서 계산됨) 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다고 고려된다.

또다른 구현예에서, 기타 효소, 예컨대 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제는, Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체를 포함하는 세제 조성물에 도입될 수 있고, 가정용 및/또는 산업용 직물/세탁물에 존재하는 바이오필름을 제거/세정하는데 사용될 수 있다.

세제 조성물은 예를 들어 오염된 섬유의 예비 처리에 적합한 세탁 첨가 조성물 및 린스가 첨가된 섬유 유연제 조성물을 비롯한 손세탁 또는 세탁기 세탁 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 일반적인 가정용 바닥·타일 세정 작업에 사용하기 위한 세제 조성물로서 제형화되거나, 설겆이 또는 식기세척기 작업을 위해 제형화될 수 있다.

특정 양상에서, 세제 조성물은 Amy195 α-아밀라아제 또는 이의 변이체 외에도 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제, 및 하나 이상의 기타 세정 효소, 예컨대 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 카르보히드라아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 만난나아제, 아라비나아제, 갈락타나아제, 또다른 녹말가수분해 효소, 자일라나아제, 옥시다아제, 락카아제, 및/또는 퍼옥시다아제, 및/또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

일반적으로 선택된 효소의 특성은 선택되는 세제와 상용성이어야만 하고 (예, pH-최적화, 기타 효소 및 비-효소 성분과의 상용성, 등), 효소는 효과적인 양으로 존재해야만 한다.

프로테아제: 적합한 프로테아제에는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 가공된 돌연변이체 뿐 아니라 자연적으로 가공된 단백질이 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로 테아제, 예컨대 알칼리성 미생물 프로테아제, 트립신-유사 프로테아제, 또는 키모트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 바실러스로 유래된 것들, 예를 들어, 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 168 (예를 들어, WO 89/06279 참조) 이다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신 (예, 돼지 또는 소 기원), 및 Fusarium 프로테아제 (예를 들어, WO 89/06270 및 WO 94/25583 참조) 이다. 유용한 프로테아제의 예에는 또한 WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, 및 WO 98/34946 에 기재된 변이체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 시판되는 프로테아제 효소에는 하기가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: Alcalase®, Savinase®, Primase™, Duralase™, Esperase®, 및 Kannase™(Novo Nordisk A/S); Maxatase®, Maxacal™, Maxapem™, Properase®, Purafect®, Purafect OxP™, FN2™, 및 FN3™ (Genencor International, Inc.).

리파아제: 적합한 리파아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질된, 단백질 가수분해로 개질된, 또는 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 리파아제의 예에는 휴미콜라 (Humicola) (동의어 테르모마이세스 (Thermomyces)), 예를 들어, H. 라누기노사 (H. lanuginosa) (T. 라누기노수스 (T. lanuginosus)) (예를 들어, EP 258068 및 EP 305216 참조), H. 인솔렌스 (H. insolens) (예를 들어, WO 96/13580 참조) 로부터의 리파아제; 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파아제 (예, P. 알칼리세네스 (P. alcaligenes) 또는 P. 슈도알칼리게네스 (P. pseudoalcaligenes); 예를 들어, EP 218 272 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) (예를 들어, EP 331 376 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) (예를 들어, GB 1,372,034 참조), P. 플루오레센스 (P. fluorescens), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 균주 SD 705 (예를 들어, WO 95/06720 및 WO 96/27002 참조), P. 위스콘시넨시스 (P. wisconsinensis) (예를 들어, WO 96/12012 참조); 바실러스 리파아제 (예, B. 서브틸리스 (B. subtilis); 예를 들어, Dartois et al. Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993) 참조), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) (예를 들어, JP 64/744992 참조), 또는 B. 푸밀러스 (B. pumilus) (예를 들어, WO 91/16422 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 제형에 사용하기 위해 고려되는 부가적인 리파아제 변이체에는 예를 들어: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, 및 EP 260105 에 기재된 것들이 포함된다. 일부 시판되는 리파아제 효소에는 Lipolase® 및 Lipolase Ultra™ (Novo Nordisk A/S) 가 포함된다.

폴리에스테라아제: 적합한 폴리에스테라아제가 조성물에 포함될 수 있고 예컨대, 예를 들어, WO 01/34899 및 WO 01/14629 에 기재된 것들이다.

아밀라아제: 조성물은 기타 아밀라아제, 예컨대 비-생성 향상 α-아밀라아제와 조합될 수 있다. 이들에는 시판 아밀라아제, 예컨대 Duramyl®, Termamyl®, Fungamyl® 및 BAN™ (Novo Nordisk A/S); Rapidase® 및 Purastar® (Genencor International, Inc.) 가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

셀룰라아제: 셀룰라아제가 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 셀룰라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 적합한 셀룰라아제에는 바실러스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 휴미콜라 (Humicola), 푸사리움 (Fusarium), 티에라비아 (Thielavia), 아크레모니움 (Acremonium) 속으로부터의 셀룰라아제, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,435,307 호; 제 5,648,263 호; 제 5,691,178 호; 제 5,776,757 호; 및 WO 89/09259 에 기재된 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila) 및 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 으로부터 생성된 진균 셀룰라아제가 포함된다. 사용하기 위해 고려되는 예시적인 셀룰라아제는 직물에 대한 색조 관리 이점을 갖는 것들이다. 이러한 셀룰라아제의 예는 예를 들어 EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, 및 WO 98/08940 에 기재된 셀룰라아제이다. 기타 예는 셀룰라아제 변이체, 예컨대 WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; 미국 특허 번호 5,457,046; 5,686,593; 및 5,763,254 에 기재된 것들이다. 시판되는 셀룰라아제에는 Celluzyme® 및 Carezyme® (Novo Nordisk A/S); Clazinase® 및 Puradax HA® (Genencor International, Inc.); 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 가 포함된다.

퍼옥시다아제/옥시다아제: 본 조성물에 사용하기 위해 고려되는 적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제에는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다 아제의 예에는 코프리누스 (Coprinus), 예를 들어, C. 시네레우스 (C. cinereus) 로부터의 퍼옥시다아제, 및 이의 변이체와 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257 에 기재된 것이 포함된다. 시판되는 퍼옥시다아제에는 예를 들어 Guardzyme ™ (Novo Nordisk A/S) 가 포함된다.

세제 효소(들) 은 하나 이상의 효소를 함유하는 별도의 첨가제를 첨가하거나, 이들 효소 모두를 포함하는 조합 첨가제를 첨가하여 세제 조성물에 포함될 수 있다. 세제 첨가제, 즉, 별도의 첨가제 또는 조합 첨가제는 예를 들어 과립, 액체, 슬러리 등으로 제형화될 수 있다. 예시적인 세제 첨가제 제형에는 과립, 특히 비분진 과립, 액체, 특히 안정화된 액체 또는 슬러리가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

비분진 과립은 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호에 기재된 것들로서 제조될 수 있고, 당업계에 공지된 방법에 의해 임의로 코팅될 수 있다. 왁스성 코팅 물질의 예는 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 폴리(에틸렌 옥시드) 생성물 (예, 폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 에톡실화 지방 알코올 (여기서 알코올의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 있음); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드이다. 유동층 기술에 의해 적용하기에 적합한 막형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 1483591 에 제시된다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 수립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238,216 에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어, 바, 정제, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있다. 또한 약 30% 물만을 함유하는 컴팩트 젤 유형의 형태일 수 있다. 세제 조성물은 반-극성 (semi-polar) 및/또는 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 양쪽이온성을 비롯한 비-이온성일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 임의로 포함할 수 있다. 계면활성제는 약 0.1 중량% 내지 약 60 중량% 로 넓은 범위로 존재할 수 있다.

포함되는 경우 세제는 전형적으로 약 1% 내지 약 40% 의 음이온성 계면활성제, 예컨대 선형 알킬벤젠술포네이트, α-올레핀술포네이트, 알킬 술페이트 (지방 알코올 술페이트), 알코올 에톡시술페이트, 2차 알칸술포네이트, α-술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙신산, 또는 비누를 함유할 것이다.

포함되는 경우 세제는 통상 약 0.2% 내지 약 40% 의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실-N-알킬 유도체 ("글루카미드") 를 함유할 것이다.

세제는 0% 내지 약 65% 의 세제 강화제 또는 복합제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층 실리케이트 (예를 들어, SKS-6, Hoechst 사 제조) 를 함유할 수 있다.

세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예시적인 중합체에는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피리딘-N-옥시드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리카르복실레이트, 예를 들어 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 포함된다.

세제 조성물의 효소는 통상적인 안정화제, 예를 들어, 폴리올 (예, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤), 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산, 또는 붕산 유도체 (예, 방향족 보레이트 에스테르), 또는 페닐 붕산 유도체 (예, 4-포르밀페닐 붕산) 를 사용하여 안정화될 수 있다. 조성물은 WO 92/19709 및 WO 92/19708 에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.

현재 세제 조성물, 특히 효소 변이체가 세정액 1 리터 당 효소 단백질 약 0.01 내지 약 100 mg (예, 세정액 1 리터 당 효소 단백질 약 0.05 내지 약 5.0 mg 또는 세정액 1 리터 당 효소 단백질 0.1 내지 약 1.0 mg) 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다는 것이 고려된다.

4.2 세정 조성물

세제 적용에서, Amyl95 α-아밀라아제 및/또는 이의 변이체는 프로필렌 글리콜을 함유하는 액체 조성물에 일반적으로 사용된다. 효소는 예를 들어 10% 염화칼슘을 함유하는 25% 부피/부피 프로필렌 글리콜 용액에 혼합하여 프로필렌 글리 콜에 가용화된다.

본원에 논의된 Amy195 α-아밀라아제 및/또는 이의 변이체는 식기 세정에 사용하기 위한 세제 조성물 또는 기타 세정 조성물로 제형화될 수 있다. 이들은 분말, 젤 또는 액체일 수 있다. 조성물은 효소를 단독으로 포함하거나, 기타 녹말가수분해 효소 및/또는 기타 세정 효소 또는 표백 활성제, 및 세정 조성물에 통상적인 기타 성분을 포함할 수 있다.

그러므로, 식기세정 세제 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성, 비이온성, 양이온성, 양쪽이온성 또는 이러한 유형의 혼합물일 수 있다. 세제는 0 중량% 내지 약 90 중량% 의 비이온성 계면활성제, 예컨대 저 ~ 비-포말 에톡실화 프로폭실화 직쇄 알코올을 함유할 수 있다.

세제 조성물은 무기 및/또는 유기 유형의 세제 강화제 염을 함유할 수 있다. 세제 강화제는 인-함유 및 비-인-함유 유형으로 세분될 수 있다. 세제 조성물은 통상 약 1% 내지 약 90% 의 세제 강화제를 함유한다. 존재하는 경우 인-함유 무기 알칼리 세제 강화제의 예에는 수성염, 특히 알칼리 금속 피로포스페이트, 오르토포스페이트 및 폴리포스페이트가 포함된다. 존재하는 경우 인-함유 유기 알칼리 세제 강화제의 예에는 포스포네이트의 수성염이 포함된다. 존재하는 경우 비-인-함유 무기 강화제의 예에는 수용성 알칼리 금속 카르보네이트, 보레이트, 및 실리케이트 뿐 아니라 다양한 유형의 수불용성 결정질 또는 비결정질 알루미노 실리케이트가 포함되며, 이중에서 제올라이트가 잘 알려진 대표물이다.

적합한 유기 강화제의 예에는 알칼리 금속; 암모늄 및 치환 암모늄; 시트레 이트; 숙시네이트; 말로네이트; 지방산 술포네이트; 카르복시메톡시 숙시네이트; 암모늄 폴리아세테이트; 카르복실레이트; 폴리카르복실레이트; 아미노폴리카르복실레이트; 폴리아세틸 카르복실레이트; 및 폴리히드록시술포네이트가 포함된다.

기타 적합한 유기 강화제에는 강화제 특성을 갖는 것으로 알려진 고 분자량 중합체 및 공중합체, 예를 들어 적합한 폴리아크릴산, 폴리말레산 및 폴리아크릴산/폴리말레산 공중합체, 및 그의 염이 포함된다.

세정 조성물은 염소/브롬-유형 또는 산소-유형의 표백제를 함유할 수 있다. 무기 염소/브롬-유형 표백제의 예는 리튬, 나트륨 또는 칼슘 하이포클로라이트 및 하이포브로마이트 뿐 아니라, 염소화 트리나트륨 포스페이트이다. 유기 염소/브롬-유형 표백제의 예는 헤테로시클릭 N-브로모-및 N-클로로-이미드, 예컨대 트리클로로이소시아누르산, 트리브로모이소시아누르산, 디브로모이소시아누르산 및 디클로로이소시아누르산, 및 이의 칼륨 및 나트륨과 같은 수용화 양이온과의 염이다. 히단토인 화합물이 또한 적합하다.

세정 조성물은 산소 표백제를 예를 들어 임의로 표백제 전구체와 함께 무기 과산의 형태로, 또는 퍼옥시 산 화합물로서 함유할 수 있다. 적합한 퍼옥시 표백 화합물의 전형적인 예는 알칼리 금속 퍼보레이트, 테트라히드레이트 및 모노히드레이트 둘다, 알칼리 금속 퍼카르보네이트, 퍼실리케이트, 및 퍼포스페이트이다. 예시적인 활성제 물질은 TAED, 및 글리세롤 트리아세테이트이다. 효소적 표백 활성 시스템은 또한, 예를 들어 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트, 글리세롤 트리아세테이트 및 퍼히드롤라아제 (예를 들어, WO 2005/056783 참조) 와 같은 제형 으로 존재할 수 있다.

세정 조성물은 효소에 대한 통상적인 안정화제, 예를 들어, 폴리올, 예컨대, 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산, 또는 붕산 유도체 (예, 방향족 보레이트 에스테르) 를 사용하여 안정화시킬 수 있다.

세정 조성물은 또한 기타 통상의 세제 성분, 예를 들어, 탈응집제 (deflocculant) 물질, 충전 물질, 거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 격리제, 오염 재침착 방지제, 탈수제, 염료, 살균제, 형광물질, 증점제, 및 향수를 함유할 수 있다.

본 출원이 하기 상세한 사항을 참조로 하여 기재되고는 있지만, 다양한 변형이 일어날 수 있다는 것을 이해할 것이다.

4.3 세제 조성물 평가 방법

수많은 α-아밀라아제 세정 검정법이 존재한다. 세정 시험의 예시적인 설명에는 하기가 포함된다.

"천조각" 은 오염물이 적용되는 섬유와 같은 물질의 조각이다. 물질은 예를 들어, 면, 폴리에스테르 또는 천연 및 합성 섬유의 혼합물로 만들어진 섬유일 수 있다. 천조각은 또한 여과지 또는 니트로셀룰로오스와 같은 종이, 또는 도자기, 금속 또는 유리와 같은 경질 물질 조각일 수 있다. 아밀라아제에 있어, 오염물은 전분 기재이지만, 혈액, 우유, 잉크, 풀, 차, 와인, 시금치, 초콜렛, 달걀, 치즈, 점토, 안료, 오일, 또는 이들 화합물의 혼합물이 포함될 수 있다.

"소형 천조각" 은 단일 구멍 펀치 장치로 절단되거나, 주문 제작된 96 개 구 멍 펀치 장치로 절단된 천조각의 한 구획으로, 여기서 다수개의 구멍 펀치의 패턴은 표준 96 웰 마이크로역가 플레이트에 매칭되고, 그렇지 않으면 구획은 천조각으로부터 제거된다. 천조각은 직물, 종이, 금속, 또는 기타 적합한 물질의 것일 수 있다. 소형 천조각에는 24, 48 또는 96 웰 마이크로역가 플레이트의 웰에 두기 전 또는 둔 후 오염물을 고정시킬 수 있다. "소형 천조각" 은 또한 작은 조각의 물질에 오염물을 적용시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 소형 천조각은 직경이 5/8" 또는 0.25" 인 오염된 섬유 조각일 수 있다. 주문 제작된 펀치는 96 개의 천조각을 96 웰 플레이트의 모든 웰에 동시에 전달하는 방법으로 고안된다. 상기 장치는 단순히 동일한 96 웰 플레이트를 여러번 적재하여 웰 당 1 개 초과의 천조각을 전달할 수 있다. 다수개의 구멍 펀치 장치는 천조각을 24 웰, 48 웰, 및 96 웰 플레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 포맷 플레이트에 동시에 전달할 것으로 생각될 수 있다. 또다른 고려되는 방법에서, 오염된 시험 플랫폼은 오염 성분으로 코팅되는 금속, 플라스틱, 유리 도자기 또는 기타 적합한 물질로 제조된 비드일 수 있다. 그 다음 하나 이상의 코팅된 비드를 적합한 완충액 및 효소를 함유하는 96, 48, 또는 24 웰 플레이트 또는 더 큰 포맷의 웰에 넣는다. 이 경우, 상청액을 직접 흡광도 측정에 의해 또는 2 차 색 전개 반응 후 방출된 오염물에 대해 시험할 수 있다. 방출된 오염물의 분석은 또한 질량 분석에 의해 수행될 수 있을 것이다. 추가의 마이크로스크리닝 검정법은 천조각, 예를 들어 인디고 색으로 염색된 청바지를 다수개의 웰 플레이트의 웰에 전달 및 확보하고, 모래와 같은 입자 또는 더 큰 입자, 예를 들어 입자 6 내지 8, 또는 9 규격을 포함하도록 체질된 가넷을 첨가하고, 플레이트를 진탕하여 첨가된 입자에 의해 천조각을 마모시키는 것일 수 있다. 본 검정법은 스톤 워싱 적용에서 셀룰라아제의 평가에서의 용도를 발견한다. 효소의 유효성은 반응 완충액으로의 색조 방출 (예, 방출된 인디고 색상을 디메틸술폭시드에 용해하고, A₆₀₀ nm 에서의 흡광도를 측정한다) 또는 침식된 천조각의 반사도 측정에 의해 평가될 수 있다.

예를 들어, 미처리된 BMI (혈액/우유/잉크: blood/milk/ink) 천조각을 표백제 없이 세제에서 세정하는 경우, 대부분의 잉크는 심지어 프로테아제의 도움 없이도 방출된다. 프로테아제를 첨가하면 잉크 방출이 조금 증가하고, 이것은 큰 배경에 비해 정량화하기는 어려울 수 있다. 본 발명은 오염물의 고정화도를 조절할 수 있게 하는 처리 프로토콜을 제공한다. 그 결과, 예를 들어, 시험되는 효소의 부재하에 세정되는 경우 오염물의 양을 달리 방출하는 천조각을 제조하는 것이 가능하다. 고정된 천조각의 사용은 세정 검정법에서 신호-대-잡음 (signal-to-noise) 비의 현저한 개선을 가져온다. 게다가, 고정화도를 다르게 함으로써, 다양한 세정 조건하에서 최적 결과를 산출하는 오염물을 발생시킬 수 있다.

다양한 유형의 물질에 대해 공지된 "강도" 의 오염물을 갖는 천조각이 시판되고/되거나 (EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk--Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; 또는 Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands), 당업자에 의해 제조될 수 있다 (Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280 286 (1982)). 기타 시험 천조각에는 면-함유 섬유 상의 혈액/우유/잉크 (BMI) 오염물(들), 면-함유 섬유 상의 시금치 오염물, 또는 면-함유 섬유 상의 풀, 및 면-함유 섬유 상의 초콜렛/우유/그을음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. BMI 오염물은 면에 0.0003% 내지 0.3% 과산화수소로 고정될 수 있다. 기타 조합에는 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 풀 또는 시금치, 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 젤라틴 및 코마시 오염물, 또는 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 초콜렛, 우유 및 그을음이 포함된다.

천조각은 또한 효소 및/또는 세제 제형으로의 인큐베이션 동안 진탕될 수 있다. 세정력 데이터는 웰, 특히 96 웰 플레이트 내 천조각의 배향 (수평 대 수직) 에 따라 다르다. 이것은 혼합이 인큐베이션 기간 동안 불충분하였다는 것을 나타낼 것이다. 인큐베이션 동안 충분한 진탕을 확보하기 위해 다수의 방법이 있다 하더라도, 마이크로역가 플레이트가 2 개의 알루미늄 플레이트 사이에 샌드위치된 플레이트 홀더가 구축될 수 있다. 이것은 예를 들어, 접착 플레이트 봉합제를 웰에 둔 다음, 2 개의 알루미늄 플레이트를 임의의 유형의 적합한, 시판되는 집게로 96 웰 플레이트에 집는 정도로 간단할 수 있다. 그 다음 이것은 시판 인큐베이터 쉐이터에서 고정시킬 수 있다. 쉐이커를 약 400 rpm 로 설정하면 매우 효과적으로 혼합되면서, 이 동안 누출 또는 교차-오염이 홀더에 의해 효과적으로 방지된다.

트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 이 세정액 중의 아미노기의 농도를 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 천조각으로부터 제거되었던 단백질 양의 측정으 로서 담당할 수 있다 (예를 들어, Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997) 참조). 그러나, 세제 또는 효소 샘플이 통상적이지 않게 소형 펩티드 분절을 형성하는 경우 (예를 들어, 샘플 중의 펩티다아제의 존재로부터), 더 큰 TNBS 신호, 즉, 더 큰 "잡음" 을 수득할 것이다.

혈액/우유/잉크 또는 기타 오염물의 세정 성능 측정을 위한 또다른 수단은 잉크 방출에 근거한다. 천조각에 대한 단백질의 단백질 가수분해는 세정액의 흡광도를 측정하여 정량될 수 있는 잉크 입자의 방출을 야기한다. 흡광도는 350 내지 800 nm 의 임의의 파장에서 측정될 수 있다. 흡광도는 410 nm 또는 620 nm 에서 측정된다. 세정액은 또한 풀, 시금치, 젤라틴 또는 코마시 오염물을 함유하는 오염물에 대한 세정 성능을 측정하기 위해 시험될 수 있다. 이러한 오염물에 대한 예시적 파장에는 시금치 또는 풀에 대해서는 670 nm 및 젤라틴 또는 코마시에 대해서는 620 nm 가 포함된다. 예를 들어, 세정액의 분취물 (예를 들어, 전형적으로 96 웰 마이크로플레이트로부터 100-150 μL) 을 제거하고, 큐벳 또는 다수개의 웰 마이크로플레이트에 넣는다. 그 다음 이것을 분광광도계에 넣고, 적합한 파장에서 흡광도를 판독한다.

또한 시스템은 예를 들어, 옷감, 플라스틱 또는 도자기와 같은 적합한 물질 상에 혈액/우유/잉크 오염물을 사용하는 식기 세정을 위한 향상된 효소 및/또는 세제 조성물을 측정하는데 사용될 수 있다.

하나의 양상에서, BMI/면 천조각에 30 분 동안 25℃ 에서 0.3% 과산화수소를 적용하거나 BMI/면 천조각에 30 분 동안 60℃ 에서 0.03% 과산화수소를 적용하여, 면에 BMI 오염물을 고정하였다. BMI/면 천조각으로부터 대략 0.25" 의 소형 천조각을 절단하고, 96 웰 마이크로역가 플레이트의 웰에 넣었다. 각 웰 내에, 세제 조성물과 변이체 단백질과 같은 효소의 공지된 혼합물을 넣는다. 접착 플레이트 봉합제를 마이크로역가 플레이트의 상부에 둔 후, 마이크로역가 플레이트에 알루미늄 플레이트를 집어놓고 대략 250 rpm 에서 약 10 내지 60 분 동안 오비탈 쉐이커에서 진탕한다. 마지막에, 상청액을 신규 마이크로역가 플레이트 중의 웰로 옮기고, 620 nm 에서의 잉크의 흡광도를 측정한다. 이것은 0.01% 글루타르알데하이드를 시금치/면 천조각 또는 풀/면 천조각에 30 분 동안 25℃ 에서 적용하여 면에 고정된 시금치 오염물 또는 풀 오염물로 유사하게 시험할 수 있다. 초콜렛, 우유, 및/또는 그을음 오염물로 동일한 시험을 수행할 수 있다.

실시예 1

B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에서의 발현

도 5 에 묘사된 구축물을 9 개의 프로테아제가 결실된 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 균주 (degU^Hy32,oppA,ΔspoII3501,amyE::xylRPxylAcomK- ermC, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB) (참조 US20050202535A1) 내로 형질전환시켰다. 상기 균주의 배양물을 하기 배지 (1 리터 당) 에서 성장시켰다: 10 g 소이톤, 75 g 글루코오스, 7.2 g 우레아, 40 mM MOPS, 4 mM 트리신, 3 mM 2염기 칼륨 포스페이트, 21.4 mM KOH, 50 mM NaCl, 276 μM 칼륨 술페이트, 528 μM 염화마그네슘, 50 μM 트리나트륨 시트레이트 디히드레이트, 100 μM 염화칼슘 디히드레이트, 14 μM 철 술페이트 헵타히드레이트, 5.9 μM 망간 술페이트 디히드레이트, 5.7 μM 아연 술페이트 모노히드레이트, 2.9 μM 염화제2구리 디히드레이트, 4.2 μM 코발트 헥사히드레이트, 4.5 μM 나트륨 몰리브데이트 디히드레이트. 1 L 부피에 대해, 소이톤을 제외한 모든 성분을 500 mL 에 혼합하고, 멸균 여과하고, 오토클레이브에 의해 멸균된 동일 부의 2X 소이톤에 첨가하였다. 미량 금속 및 시트레이트를 100X 또는 1000X 저장 용액으로 제조할 수 있다. 완충액, 수산화칼륨, 염화나트륨, 칼륨 술페이트, 및 염화망간 및 미량 금속을 1OX 저장 용액으로 제조할 수 있다. 모든 성분을 혼합한 후, pH 를 7.3 으로 조정하였다. 사용 전 상기 배지에 20 mM 염화칼슘을 보충하였다. 배양물은 다양하게 가공된 형태의 효소를 발현하였다. 명백하게 성숙된 형태 (신호 서열 없이) 를 10% SDS-PAGE 젤의 69 kDa 마커에서 관찰하였다. 2 개의 더 짧은 형태가 또한 존재하였다.

브로스를 β-시클로덱스트린-Sepharose 친화성 수지로 처리하고, 수지를 수집하고, 2 mM 염화칼슘 (CaCl₂) 을 함유하는 25 mM 비스-트리스 프로판 완충액 (pH 8.5) 으로 세정하고, 50 mM β-시클로덱스트린이 보충된 동일한 완충액으로 세정된 수지를 용리하여 배양 브로스로부터 Amy195 α-아밀라아제 활성을 분획화하였다. 배양 브로스를 β-시클로덱스트린 수지로 처리하는 효과는 브로스로부터 60 kDa 종류 (약 50% 까지) 의 부분적인 제거 및 69 kDa 종류의 완벽한 제거였다. 수 지의 완충액 세정은 60 kDa 크기의 거의 순수한 단백질을 제공하였고; β-시클로덱스트린을 함유하는 완충액으로의 용리는 60 kDa 단백질 약 25% 가 오염된 69 kDa 단백질을 제공하였다. 이러한 성분 추정은 SDS-PAGE 에 의해 측정되었고, 도 10 에 묘사된다. 분획의 효소 함량을 단백질 표준으로서 담당하는 OxAm 아밀라아제 (Genencor International, Inc.) 로의 겔 밀도분석에 의해 추정하였다. 도 10 의 "w1" 이라고 표시된 레인의 가장 어두운 밴드의 N-말단 분석은 "AAPGPKD ATA" (SEQ ID NO: 5) 의 서열을 제공하였다. 상기 N-말단 서열으로의 질량 분석은 단백질이 도 4 의 소문자에 제시된 서열을 갖는 것으로 확인되었다 (즉, 전분 결합 모티프를 나타내는 신호 서열 및 C-말단 확장이 없음). 상기 분석은 상기 분자 분절이 α-아밀라아제 도메인 A, B & C 으로 이루어져 있음을 보여준다.

실시예 2

유전적으로 절단된 Amy195 촉매 도메인의 발현

Amy195 에 대한 유전자는 절단된 형태의 발현을 시험하고 세정 성능을 시험할 수 있도록 3 개의 상이한 부위를 절단시켰다. 도 4 의 서열의 폴리펩티드 넘버링을 사용하여 아미노산 잔기 번호 494, 504, 및 509 에 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 절단을 달성시켰다. 절단된 유전자를 함유하는 플라스미드를 9 개의 프로테아제가 결실된 바실러스 서브틸리스 균주 (degU^Hy32,oppA, ΔspoII3501, amyE::xylRPxylAcomK- ermC, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB) 내로 형질전환시켰다. 세포를 10 또는 30 mM CaCl₂ 이 보충된 50 mL 의 풍부 배지를 함유하는 250 mL 배플 (baffle) 플라스크에서 64 시간 동안 37℃ 에서 250 rpm 에서 진탕하면서 배양하였다. 배양 상청액을 SDS PAGE 로 분석하고, 아밀라아제 함량을 젤 밀도분석에 의해 추정하였다.

절단된 유전자로부터 아밀라아제의 발현은 전장 야생형 유전자로부터 동일한 도메인의 발현보다 약 2 배를 넘는 것으로 밝혀였다. 이러한 결과는 도 8 에 제시되고, 절단된 유전자가 단백질 발현에 유리하다는 것을 나타낸다.

실시예 3

세정 검정법

젤에 나타난 모든 분획을 96 웰 CS28 오렌지색 염색된 쌀 전분 오염 천조각 적용 검정법에 의해 추가로 분석하였다. 상기 검정법은 25 mM HEPES (pH 8.0) 뿐 아니라 in 25 mM CAPS (pH 10.3) 완충액에서 수행되었다.

실시예 1 에서 단리된 모든 Amy195 종류의 세정 성능을 아밀라아제 농도의 함수로 시뮬레이션 세탁 검정법에서 시험하였다. 도 10 의 분획 "e-pool" 에 대한 결과는 도 6 에 제시된다. 성능은 현탁액 내로 방출되고 488 nm 에서 분광광도계를 사용하여 측정된 색조의 양에 의해 판단하였다. 검정법에 대한 부가적인 정보를 위해서는, 미국 특허 번호 7,122,334 를 참조한다. 효소는 pH 8.0 에서 매우 효과적이었을 뿐 아니라, pH 10.3 에서도 놀라운 오염물 제거를 보여주었다. 단백질 젤 (도 10) 의 각 레인의 모든 주요 단백질 밴드는 레인 "wl" 의 밴드로의 세정이 최고 성능을 나타냄을 보여주었다. 모든 세정 활성은 pH 8.0 조건 하에서 도 7 에 제시한다. 도 4 의 아미노산 잔기 492 로 끝나는 절단된 형태는 하나의 전분 결합 도메인을 보유하는 형태 (도 7 참조, "□") 보다 더 양호한 성능 (도 7 참조, "●") 을 나타내었다. 상기 검정법으로부터의 결과는 Amy195 α-아밀라아제가 직물 천조각으로부터 오염물 제거에 더욱 효과적이라는 것을 보여준다.

실시예 4

유전적으로 절단된 유전자 생성물의 세정 성능

상기 실시예 2 에서 수득된 절단된 유전자 생성물을 상기 실시예 3 에서 단백질 가수분해 분절에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 세정 성능에 대해 시험하였다. CS28 쌀 천조각을 다양한 Amy195 촉매 분절 농도로 인큐베이션하였다. 세정 성능을 현탁액 내로 방출되고 488 nm 에서 분광광도계를 사용하여 측정된 색조에 의해 판단하였다. 모든 3 개의 유전적으로 절단된 유전자 분절은 도 9 에 제시된 바와 같이 양호한 세정 성능을 보였다.

상기 천조각 검정법은 상이한 목적을 위해 여러 방식으로 변형될 수 있다. 96 웰 검정법은 천조각과 함께 효소의 인큐베이션 후 상청액을 측정함에 의한 고처리량 세정 검정법으로 매우 적합하고, 예를 들어, 웰에 내에 맞춰진 천조각이 있는 24 웰 플레이트는 더 큰 천조각을 세정하는데 사용될 수 있고, 이를 위해 반사도는 당업계에 공지된 바와 같이 측정될 수 있다. 2 개의 측정치, 상청액 흡광도 및 천조각 반사도는 거의 완벽한 상관관계를 보여주었다.

세정된 천조각의 반사도와 상청액의 흡광도의 상관관계는 높았다; 측정 계수, r2 는 0.99 의 값을 가졌다. 원칙적으로 검정법은 384 웰 플레이트에 기준 화될 수 있다. 검정법은 임의의 오염된 천조각으로 수행할 수 있고, 실시예 3 에 기재된 측정 효율을 나타내기 위해 CS28 천조각 외에도, CS26, CS27, 및 CS29 천조각을 (예, 옥수수 전분, 감자 전분, 타피오카 전분, 각각; Testfabrics, Inc., West Pittiston, PA) 또한 시험할 수 있다. 또한 검정법은 세제 조성물로 사용될 수 있고, 상이한 온도 및 상이한 pH 값에서 수행될 수 있다. 이러한 검정법은 미국 특허 번호 7,122,334 로부터 채택되었다.

상기 언급된 모든 참조는 본원에 모든 목적을 위해 전체가 참조로서 인용된다.

<110> Danisco US, Inc., Genencor Division Amin, Neelam S. Estabrook, Melodie Jones, Brian E. Kolkman, Marc Mitchinson, Colin Vroemen, Casper Weyler, Walter <120> Compositions and Uses for an Alpha-Amylase Polypeptide of Bacillus Species 195 <130> 30948-PCT <140> PCT/US2007/024959 <141> 2007-12-06 <150> US 60/876,241 <151> 2006-12-21 <150> US 60/880,236 <151> 2007-01-12 <160> 5 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2103 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 1 atgccagccc tctaccaggg cgtcattgcc gacgtccgag caaagagaaa acgcttgcaa 60 gttttggcca agatggtcct catcgccctc cttggcacgc tgctttcggc caccgctttc 120 gccgccccgg cgagcgccgc agcccccggc cccaaggacg ccaccgccgt catgttctcc 180 tggacatgga acgcgatcgc ccgtgaatgc accgagaacc tcggccccgc cggctacggc 240 tacgtgcaga cctcgcctcc ccaggaacac atccaaggcg ccgcgtggtg gacccattac 300 cagcccgtca gctacaagat cgagtcccgc ttcggcaccc gggcggagtt caaggccatg 360 gtggacacct gccacgccgc aggcgtgaag gtgatcgcgg acgccgtcat caaccacatg 420 accggccaga gcgccggcgg caccggctgg gccggttcca ccttccagca ctacgactac 480 ccgggcatct accagtccca ggacttccac tcctgccgcc gcaacatcgc caactaccag 540 gaccgctggg aggtacagga gtgcaacctc gtgaacctcg cggacctgaa cacttcctcg 600 tcctacgtcc aaggaaagat tgcggcatac ctgaacgatc tcgtctcgct cggcgtcgac 660 ggcctccgca ttgacgccgt caagcacatc gcggcgagcg acatgcaggg catcctgtcc 720 aaggtgaacg accgcgcccg cctctacatc gtccaggaag tcatccgcgc caacgagccc 780 atccagcccg aggaatacac cagcaacggt gacatccacg agttcgcctt cgcccgtaag 840 ctcaaggaag ccttcaacgg cggcaccatc aactggctga ccaccggcaa cggaatcggc 900 cccacctggg ccggcttcct gccgaacgcc aacgccgcag tgttcgtgga caaccacgac 960 accgagcgca acggtgaaac cctcacctac aaggacggag ccaactacga cctcgcccag 1020 atcttcaccc tcgcctggaa ctacggctcg ccgtccatcc actcgggcta ttccttctcg 1080 aacaacgacg ccggcccggc actcgccgga aacggcgaag tgattgatcc ggtatgcggc 1140 cagaacggct ggacctgcaa gcacgcccag acgggcatcg agaacatggt gggcttccgc 1200 acccagacgt acggcaccgc cgtcgtgaac aaatgggaca acggctccag cgccatcgcg 1260 ttcggccggg gagacaaggg ctacgtggcg ataaaccgcg gcagcgccct cacccgcacc 1320 ttccagacct ccctgcccgc gggcaactac tgcaacgtga tcgtcggcct gcccaactcc 1380 accggctgct cggccggcgg cgtggtgacg gttgacgccg cgggcacctt cacggccacc 1440 gtggaccaga actccgcgtt cgcactgcac gtcggcgcga aggccggaac gcagcagccc 1500 ggaccgggcg cgggcgacat gaaggtgtac tactcgacgt cgaagggctg gagcgactac 1560 aagatccact accgcgtggg taccggcgcc tggaccaccg ctcccggtgc cggcatgacg 1620 gccgcctgcg ccggctgggt ctcgtacacc gtcccggccg gctccaccgg agccaccgcc 1680 gccttcaaca acggcagcgg cacctgggac aacaacaaca ccagcaacta cgcactcagc 1740 ggcgcggtca gcacagtgaa cggcggcgtc gtggggcata cggacccctg caccgaaagc 1800 gcgcccgccc cggccgacac agccgtggtg ttctactcca ccaacaaggg ctggtccgcc 1860 tacaacatcc actaccgcgt gggtacgggc gcctggacca ccgcgccggg cagcgccatg 1920 acggccgcgt gcaccggctg gatgaccgcc tccatccccc tgggcggagc ctccggaatc 1980 accgctgcct tcaacaatgg cgcgggcacc tgggataaca acgccggcgc cgattacagc 2040 gttggcagcg gttaccggca ggtgaaggac ggcgtggtca gcacgggaaa cccctgcgcc 2100 tga 2103 <210> 2 <211> 2052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic optimized coding sequence <400> 2 atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60 ttgctgcctc attctgcagc ttcagcagca gcaccgggac cgaaagatgc tacagcggtc 120 atgtttagct ggacgtggaa tgccattgcc agagaatgca cggaaaatct tggcccggca 180 ggctatggat atgtccaaac gtcaccgccg caagaacata ttcaaggcgc cgcttggtgg 240 acacattatc agccggtcag ctataaaatc gaaagccgct ttggcacacg ggcagaattt 300 aaagcgatgg tcgacacatg ccatgctgct ggagtcaaag tcatcgccga tgccgtcatc 360 aatcatatga caggccaatc agcaggcgga acaggatggg caggaagcac gtttcagcat 420 tatgactatc cgggcatcta tcagagccag gactttcata gctgccggag aaacatcgcc 480 aactatcagg atagatggga agtccaagaa tgcaacctgg tcaatctggc ggatctgaat 540 acgagcagca gctatgtcca aggaaaaatc gccgcctatc tgaatgatct ggtcagcctt 600 ggagtcgatg gactgagaat cgatgccgtc aaacatatcg ccgccagcga tatgcaagga 660 atcctgagca aagtcaacga tagagcccgc ctgtatatcg tccaagaagt catcagagcg 720 aacgaaccga ttcagccgga agaatatacg agcaacggcg acatccatga atttgccttt 780 gcccggaaac tgaaagaagc gtttaacggc ggcacaatca attggctgac gacgggaaat 840 ggaattggac cgacatgggc aggatttctg ccgaatgcca atgctgctgt ctttgtcgat 900 aaccatgaca cggaaagaaa tggcgaaacg ctgacgtata aagacggcgc caattatgac 960 ctggcccaga tctttacact ggcgtggaat tatggaagcc cgagcatcca tagcggatat 1020 agctttagca acaacgatgc tggaccggca ttggcaggaa atggcgaagt catcgatccg 1080 gtctgcggac aaaatggctg gacatgcaaa catgcccaaa cgggcatcga aaacatggtc 1140 ggctttcgga cacaaacata tggaacggcg gtcgttaata aatgggataa cggcagcagc 1200 gctatcgctt ttggcagagg cgataaagga tatgtcgcca tcaatagagg aagcgccctg 1260 acgagaacgt ttcaaacaag ccttccggca ggcaattatt gcaatgtcat cgtcggactg 1320 ccgaatagca caggatgcag cgcaggagga gtcgttacag ttgacgccgc tggaacattt 1380 acagcgacgg tcgatcaaaa tagcgccttt gcccttcatg ttggagcgaa agcgggaaca 1440 caacaaccgg gaccgggagc aggagatatg aaagtctatt atagcacgag caaaggatgg 1500 tccgactaca aaatccatta tcgggtcgga acaggagcat ggacaacagc acctggagct 1560 ggaatgacag cagcatgcgc aggatgggtc tcatatacag ttccggcggg atcaacagga 1620 gcaacagcgg cgttcaataa tggcagcggc acgtgggata acaacaacac gagcaactat 1680 gctcttagcg gagcagtcag cacagttaat ggaggagtcg tcggacatac agatccgtgc 1740 acagaatcag caccggcacc ggcagataca gcagtcgtct tttattcaac gaacaaaggc 1800 tggtcagcgt ataacattca ttatagagtc ggcacaggcg cttggacgac ggctccggga 1860 tcagcaatga cagcggcttg cacaggctgg atgacagcat caattccgct tggaggagca 1920 tcaggaatca cggcggcgtt taacaacgga gcaggaacat gggataataa cgccggagcg 1980 gattattcag tcggcagcgg ctatagacaa gtcaaagatg gcgtcgtcag cacaggcaat 2040 ccgtgcgcat ga 2052 <210> 3 <211> 700 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 3 Met Pro Ala Leu Tyr Gln Gly Val Ile Ala Asp Val Arg Ala Lys Arg 1 5 10 15 Lys Arg Leu Gln Val Leu Ala Lys Met Val Leu Ile Ala Leu Leu Gly 20 25 30 Thr Leu Leu Ser Ala Thr Ala Phe Ala Ala Pro Ala Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Pro Gly Pro Lys Asp Ala Thr Ala Val Met Phe Ser Trp Thr Trp Asn 50 55 60 Ala Ile Ala Arg Glu Cys Thr Glu Asn Leu Gly Pro Ala Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Tyr Val Gln Thr Ser Pro Pro Gln Glu His Ile Gln Gly Ala Ala Trp 85 90 95 Trp Thr His Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Lys Ile Glu Ser Arg Phe Gly 100 105 110 Thr Arg Ala Glu Phe Lys Ala Met Val Asp Thr Cys His Ala Ala Gly 115 120 125 Val Lys Val Ile Ala Asp Ala Val Ile Asn His Met Thr Gly Gln Ser 130 135 140 Ala Gly Gly Thr Gly Trp Ala Gly Ser Thr Phe Gln His Tyr Asp Tyr 145 150 155 160 Pro Gly Ile Tyr Gln Ser Gln Asp Phe His Ser Cys Arg Arg Asn Ile 165 170 175 Ala Asn Tyr Gln Asp Arg Trp Glu Val Gln Glu Cys Asn Leu Val Asn 180 185 190 Leu Ala Asp Leu Asn Thr Ser Ser Ser Tyr Val Gln Gly Lys Ile Ala 195 200 205 Ala Tyr Leu Asn Asp Leu Val Ser Leu Gly Val Asp Gly Leu Arg Ile 210 215 220 Asp Ala Val Lys His Ile Ala Ala Ser Asp Met Gln Gly Ile Leu Ser 225 230 235 240 Lys Val Asn Asp Arg Ala Arg Leu Tyr Ile Val Gln Glu Val Ile Arg 245 250 255 Ala Asn Glu Pro Ile Gln Pro Glu Glu Tyr Thr Ser Asn Gly Asp Ile 260 265 270 His Glu Phe Ala Phe Ala Arg Lys Leu Lys Glu Ala Phe Asn Gly Gly 275 280 285 Thr Ile Asn Trp Leu Thr Thr Gly Asn Gly Ile Gly Pro Thr Trp Ala 290 295 300 Gly Phe Leu Pro Asn Ala Asn Ala Ala Val Phe Val Asp Asn His Asp 305 310 315 320 Thr Glu Arg Asn Gly Glu Thr Leu Thr Tyr Lys Asp Gly Ala Asn Tyr 325 330 335 Asp Leu Ala Gln Ile Phe Thr Leu Ala Trp Asn Tyr Gly Ser Pro Ser 340 345 350 Ile His Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Asn Asp Ala Gly Pro Ala Leu 355 360 365 Ala Gly Asn Gly Glu Val Ile Asp Pro Val Cys Gly Gln Asn Gly Trp 370 375 380 Thr Cys Lys His Ala Gln Thr Gly Ile Glu Asn Met Val Gly Phe Arg 385 390 395 400 Thr Gln Thr Tyr Gly Thr Ala Val Val Asn Lys Trp Asp Asn Gly Ser 405 410 415 Ser Ala Ile Ala Phe Gly Arg Gly Asp Lys Gly Tyr Val Ala Ile Asn 420 425 430 Arg Gly Ser Ala Leu Thr Arg Thr Phe Gln Thr Ser Leu Pro Ala Gly 435 440 445 Asn Tyr Cys Asn Val Ile Val Gly Leu Pro Asn Ser Thr Gly Cys Ser 450 455 460 Ala Gly Gly Val Val Thr Val Asp Ala Ala Gly Thr Phe Thr Ala Thr 465 470 475 480 Val Asp Gln Asn Ser Ala Phe Ala Leu His Val Gly Ala Lys Ala Gly 485 490 495 Thr Gln Gln Pro Gly Pro Gly Ala Gly Asp Met Lys Val Tyr Tyr Ser 500 505 510 Thr Ser Lys Gly Trp Ser Asp Tyr Lys Ile His Tyr Arg Val Gly Thr 515 520 525 Gly Ala Trp Thr Thr Ala Pro Gly Ala Gly Met Thr Ala Ala Cys Ala 530 535 540 Gly Trp Val Ser Tyr Thr Val Pro Ala Gly Ser Thr Gly Ala Thr Ala 545 550 555 560 Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Thr Trp Asp Asn Asn Asn Thr Ser Asn 565 570 575 Tyr Ala Leu Ser Gly Ala Val Ser Thr Val Asn Gly Gly Val Val Gly 580 585 590 His Thr Asp Pro Cys Thr Glu Ser Ala Pro Ala Pro Ala Asp Thr Ala 595 600 605 Val Val Phe Tyr Ser Thr Asn Lys Gly Trp Ser Ala Tyr Asn Ile His 610 615 620 Tyr Arg Val Gly Thr Gly Ala Trp Thr Thr Ala Pro Gly Ser Ala Met 625 630 635 640 Thr Ala Ala Cys Thr Gly Trp Met Thr Ala Ser Ile Pro Leu Gly Gly 645 650 655 Ala Ser Gly Ile Thr Ala Ala Phe Asn Asn Gly Ala Gly Thr Trp Asp 660 665 670 Asn Asn Ala Gly Ala Asp Tyr Ser Val Gly Ser Gly Tyr Arg Gln Val 675 680 685 Lys Asp Gly Val Val Ser Thr Gly Asn Pro Cys Ala 690 695 700 <210> 4 <211> 683 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic fusion protein <400> 4 Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe 1 5 10 15 Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala Pro 20 25 30 Gly Pro Lys Asp Ala Thr Ala Val Met Phe Ser Trp Thr Trp Asn Ala 35 40 45 Ile Ala Arg Glu Cys Thr Glu Asn Leu Gly Pro Ala Gly Tyr Gly Tyr 50 55 60 Val Gln Thr Ser Pro Pro Gln Glu His Ile Gln Gly Ala Ala Trp Trp 65 70 75 80 Thr His Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Lys Ile Glu Ser Arg Phe Gly Thr 85 90 95 Arg Ala Glu Phe Lys Ala Met Val Asp Thr Cys His Ala Ala Gly Val 100 105 110 Lys Val Ile Ala Asp Ala Val Ile Asn His Met Thr Gly Gln Ser Ala 115 120 125 Gly Gly Thr Gly Trp Ala Gly Ser Thr Phe Gln His Tyr Asp Tyr Pro 130 135 140 Gly Ile Tyr Gln Ser Gln Asp Phe His Ser Cys Arg Arg Asn Ile Ala 145 150 155 160 Asn Tyr Gln Asp Arg Trp Glu Val Gln Glu Cys Asn Leu Val Asn Leu 165 170 175 Ala Asp Leu Asn Thr Ser Ser Ser Tyr Val Gln Gly Lys Ile Ala Ala 180 185 190 Tyr Leu Asn Asp Leu Val Ser Leu Gly Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp 195 200 205 Ala Val Lys His Ile Ala Ala Ser Asp Met Gln Gly Ile Leu Ser Lys 210 215 220 Val Asn Asp Arg Ala Arg Leu Tyr Ile Val Gln Glu Val Ile Arg Ala 225 230 235 240 Asn Glu Pro Ile Gln Pro Glu Glu Tyr Thr Ser Asn Gly Asp Ile His 245 250 255 Glu Phe Ala Phe Ala Arg Lys Leu Lys Glu Ala Phe Asn Gly Gly Thr 260 265 270 Ile Asn Trp Leu Thr Thr Gly Asn Gly Ile Gly Pro Thr Trp Ala Gly 275 280 285 Phe Leu Pro Asn Ala Asn Ala Ala Val Phe Val Asp Asn His Asp Thr 290 295 300 Glu Arg Asn Gly Glu Thr Leu Thr Tyr Lys Asp Gly Ala Asn Tyr Asp 305 310 315 320 Leu Ala Gln Ile Phe Thr Leu Ala Trp Asn Tyr Gly Ser Pro Ser Ile 325 330 335 His Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Asn Asp Ala Gly Pro Ala Leu Ala 340 345 350 Gly Asn Gly Glu Val Ile Asp Pro Val Cys Gly Gln Asn Gly Trp Thr 355 360 365 Cys Lys His Ala Gln Thr Gly Ile Glu Asn Met Val Gly Phe Arg Thr 370 375 380 Gln Thr Tyr Gly Thr Ala Val Val Asn Lys Trp Asp Asn Gly Ser Ser 385 390 395 400 Ala Ile Ala Phe Gly Arg Gly Asp Lys Gly Tyr Val Ala Ile Asn Arg 405 410 415 Gly Ser Ala Leu Thr Arg Thr Phe Gln Thr Ser Leu Pro Ala Gly Asn 420 425 430 Tyr Cys Asn Val Ile Val Gly Leu Pro Asn Ser Thr Gly Cys Ser Ala 435 440 445 Gly Gly Val Val Thr Val Asp Ala Ala Gly Thr Phe Thr Ala Thr Val 450 455 460 Asp Gln Asn Ser Ala Phe Ala Leu His Val Gly Ala Lys Ala Gly Thr 465 470 475 480 Gln Gln Pro Gly Pro Gly Ala Gly Asp Met Lys Val Tyr Tyr Ser Thr 485 490 495 Ser Lys Gly Trp Ser Asp Tyr Lys Ile His Tyr Arg Val Gly Thr Gly 500 505 510 Ala Trp Thr Thr Ala Pro Gly Ala Gly Met Thr Ala Ala Cys Ala Gly 515 520 525 Trp Val Ser Tyr Thr Val Pro Ala Gly Ser Thr Gly Ala Thr Ala Ala 530 535 540 Phe Asn Asn Gly Ser Gly Thr Trp Asp Asn Asn Asn Thr Ser Asn Tyr 545 550 555 560 Ala Leu Ser Gly Ala Val Ser Thr Val Asn Gly Gly Val Val Gly His 565 570 575 Thr Asp Pro Cys Thr Glu Ser Ala Pro Ala Pro Ala Asp Thr Ala Val 580 585 590 Val Phe Tyr Ser Thr Asn Lys Gly Trp Ser Ala Tyr Asn Ile His Tyr 595 600 605 Arg Val Gly Thr Gly Ala Trp Thr Thr Ala Pro Gly Ser Ala Met Thr 610 615 620 Ala Ala Cys Thr Gly Trp Met Thr Ala Ser Ile Pro Leu Gly Gly Ala 625 630 635 640 Ser Gly Ile Thr Ala Ala Phe Asn Asn Gly Ala Gly Thr Trp Asp Asn 645 650 655 Asn Ala Gly Ala Asp Tyr Ser Val Gly Ser Gly Tyr Arg Gln Val Lys 660 665 670 Asp Gly Val Val Ser Thr Gly Asn Pro Cys Ala 675 680 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 5 Ala Ala Pro Gly Pro Lys Asp Ala Thr Ala 1 5 10

Claims (20)

1. 도 2 의 잔기 88-2052 를 포함하는 핵산 서열 (SEQ ID NO:2).
2. 제 1 항에 있어서, 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) α-아밀라아제의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열.
3. SEQ ID NO:3 의 잔기 30 - 683 를 포함하는 폴리펩티드의 절단된 형태를 코딩하는 핵산 (도 3) 으로, 상기 절단된 형태가 SEQ ID NO:3 의 잔기 492, 504, 또는 509 에서 종결되는 핵산.
4. 제 1 항 또는 제 3 항의 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 절단된 형태가 SEQ ID NO:3 의 잔기 492, 504, 또는 509 에서 카르복시 말단을 갖는 폴리펩티드 (도 4).
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포.
8. 제 6 항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
9. 제 8 항에 있어서, 숙주 세포가 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써쿨란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), S. 뮤리너스 (S. murinus), 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 로부터 선택되는 박테리아인 단리된 숙주 세포.
10. 임의로 비분진 과립, 마이크로과립, 안정화된 액체, 젤, 또는 보호된 효소의 형태의, 제 4 항의 폴리펩티드를 포함하는 세제 첨가제.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 절단된 형태가 10% SDS-PAGE 젤 상에서의 분자량이 대략 49 kDa 내지 대략 69 kDa 인 세제 첨가제.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 세제 첨가제가 세제 첨가제 1 그램 당 폴리펩티드 약 0.02 mg 내지 약 200 mg 을 함유하는 세제 첨가제.
13. 제 10 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 녹말가수분해 효소, 셀룰라아제, 폴리에스테라아제, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함하는 세제 첨가제.
14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 세제 첨가제를 포함하는 세제 조성물.
15. 세제 조성물이 계면활성제, 표백 시스템 또는 표백제, 세제 강화제, 중합체, 안정화제, 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 염료, 향수, 오염 현탁화제, 퇴색 억제제, 형광 증백제, 또는 살균제 중 하나 이상을 임의로 포함하는, 제 4 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 포함하는 세제 조성물.
16. 제 15 항에 있어서, 프로테아제, 리파아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 녹말가수분해 효소, 셀룰라아제, 폴리에스테라아제, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함하는 세제 조성물.
17. 제 4 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 포함하는 설겆이 또는 식기세척기 세제 조성물.
18. 제 17 항의 설겆이 또는 식기세척기 세제를 이를 필요로 하는 식기에 적용하는 것을 포함하는 식기 세정 방법.
19. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 세제 첨가제를 포함하는 세탁 세제 조성물.
20. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 세제 조성물로 용액 중에서 오염된 직물을 세정하는 것을 포함하는 세탁 방법.

Images