KR20030056538A - 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TGF-β1 mRNA에 상보적인 폐쇄형 리본 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로서, 이를 이용하여 TGF-β1 mRNA의 발현을 저해함으로써 경화성 질환, 특히 신경화성 질환을 치료 및 예방할 수 있다. 또한, 본 발명은 HIV-1 Tat 단백질의 일부를 혼합됨으로써 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 세포내에 전달하는 방법을 포함한다.

Description

리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이 성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발{EFFECTIVE INHIBITION OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β1 BY A RIBBON-TYPE ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE}
형질전이 성장 인자-베타(Transforming Growth Factor-beta; TGF-β)는 세포내 신호전달에 중요한 역할을 하는 단백질로 모든 조직에서 찾을 수 있으나 주로 뼈, 허파, 신장과 태반 조직에 많이 분포한다. TGF-β는 조직의 상해에 반응하여 정상적인 세포외 기질을 축적시키지만, 경화성 질환을 유발하기도 한다[Branton MH, Kopp JB. TGF-bata and fibrosis. Microbes Infect; 1999 Dec;1(15):1349-1365]. TGF-β의 항상성은 조직 손상을 치유하는데 중요한 역할을 하지만, 과다한 TGF-β는 경화의 주요인이며 조직의 기능을 저해시킨다. 천식, 간경화, 폐경화, 만성비장염, 피부경화, 신경화같은 경화성 질환은 기관의 현저한 기능 저하 뿐만 아니라 환자의 생존율에도 영향을 미친다[Nakao A. Is TGF-betal the key to suppression of human asthma Trends Immunol. 2001 Mar;22(3):115-8; Bauer M, Schuppan D. TGF-betal in liver fibrosis: time to change paradigms FEBS Lett. 2001 Jul 27;502(1-2):1-3; Vogelmann R 등, Effects of fibrogenic mediators on the development of pancreatic fibrosis in a TGF-betal transgenic mouse model. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001 Jan;280(1):G164-72; Su SB 등,Expression of transforming growth factor-bata in spontaneous chronic pancreatitis in the WBN/Kob rat. Dig Dis Sic. 2000 Jan;45(1):151-9; Gruschwitz M 등, Transcription and expression of transforming growth factor type beta in the skin of progressive systemic sclerosis: a mediator of fibrosis J Invest Dermatol. 1990 Feb;94(2):197-203; Yokoi H 등, Role of connective tissue growth factor in profibrotic action of transforming growth factor-beta: a potential target for preventing renal fibrosis. Am J Kidney Dis. 2001 Oct;38(4 Suppl 1):S134-8]. 또한, 방사선 치료, 약물치료와 이식에서도 TGF-β는 경화유발에 중요한 역할을 한다[Herskind C 등, The role of cytokines in the development of normal-tissue reactions after radiotherapy, Strahlenther. Onkol. 174, 1998, 12-15; Ishimura T 등, Transforming growth factor-betal expression in early biopsy specimen predicts long-term graft function following pediatric renal transplantation. Clin Transplant. 2001 Jun;15(3):185-91]. 불행히도, 현재의 치료제는 제한적이고, 비특이적이며 비효율적이라는 많은 난점을 가지고 있다. 경화성 질환의 기작은 완전히 이해되지 않았으나, 면역반응과 사이토카인이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이외에도, TGF-β는 세포증식, 분화, 면역조절과도 밀접한 연관을 가진다[Sime PJ 등, Fibrosis of the lung and other tissues: new concepts in pathogenesis and treatment. Clin Immunol. 2001 Jun;99(3):308-19; Moses HL 등, TGF-beta stimulation and inhibition of cell proliferation: new mechanistic insights. Cell 63, 1990,245-247].
다양한 요인에 의해 발생하는 신기질 경화(renal tubulointerstitial fibrosis)는 신질환의 일반적인 특징중 하나이다. 단측 요관 결손(unilateral ureteric atrophy, UUO) 신장 모델은 튜블기질간 경화증, 튜블 고사, 튜블 위축을 보이나 혈압, 단백뇨, 고지방증을 보이지 않기 때문에 경화 발명에는 좋은 모델이다[Wright EJ 등, Chronic unilateral ureteral obstruction is associated with interstitial fibrosis and tubular expression of transforming growth factor-beta. Lab Invest. 1996 Feb;74(2):528-37; Klahr S. 등, New insights into the consequences and mechanisms of renal impairment in obstructive nephropathy. Am J Kidney Dis 18:689-699, 1991; 및 Klahr S 등, The parthophysiology of obstructive nephropathy. Am J Kideny Dis 23: 219-223. 1994].
UUO에서 경화의 원인은 주로 TGF-β의 과발현에 기인한다. UUO 신장에서 안지오텐신 II의 증가는 TGF-β1, TGF-α, PDGF, IGF-1, VCAM-1, NF-κB, ICAM-1, CD14 등의 표현을 증가시키며, 내부적인 신세포와 침윤된 대식세포에 의한 TGF-β1의 생산의 경화의 중요한 역할을 한다[Chung KH 등, Regulation of renal growth factors and clusterin by AT1 receptors during neonatal ureteral obstruction. Am J Physiol. 1995 Jun;268(6 Pt 2):F1117-23]. TGF-β는 주로 실질 세포 유형에 의해 생산되고, 침윤 세포(림프구, 단핵세포/대식세포, 혈소판)에 의해서도 생산된다.
안티센스 올리고뉴크레오티드(AS-올리고)를 이용한 유전자의 특이적인 발현억제는 유전자 기능 연구에 유용한 도구로 사용되어 왔으며, 암과 같은 질병의 분자 치료제 연구 및 개발에도 이용되어 왔다[Melani C 등, Inhibition of proliferation by c-myb antisense oligodeoxynucleotides in colon adenocarcinoma cell lines that express c-myb. Cancer Res 1991; 51:2897-2901; 및 Anfossi G 등, An oligomer complementary to c-myb encoded mRNA inhibits proliferation of human myeloid leukemia cell lines. Proc Natl Acad Sci USA 1989: 86: 3379-3383]. 안티센스 올리고뉴크레오티드 연구에 사용되는 합성 올리고는 왓슨-크릭 염기쌍에 의하여 목적 mRNA에 결합되도록 디자인된 것이다. AS-올리고에 의한 유전자 발현 억제는 RNase H 활성, 리보솜 복합체의 형성 및 진행 방해 또는 게놈 DNA와의 삼중 헬릭스 구조를 형성하여 유전자의 전사를 억제한다고 알려져 있다[Wagner RW. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature 1994: 372: 333-335]. AS-올리고를 활용하기 위해서는 뉴클레아제에 대한 안정성, 목적 염기 배열에 대한 특이적 결합 및 목표 조직과 세포내의 효율적 전달이 개선되어야 한다. 포스포디에스터 (PO)-올리고는 뉴클레아제에 불안정하기 때문에 포스포로티오에이트 (PS)-올리고, 메틸포스포네이트 (MP)-올리고, C-5 프로핀 피리미딘 올리고 등 변형된 올리고 유사체들이 발명되어 왔다[Akhter S 등, Stability of antisense DNA oligodexoynucleotides analogs in cellular extracts and sera. Life Sci 1991, 49, 1793-1801; 및 Wagner RW 등, Antisense gene inhibition by oligonucleotides containing C-5 propyne pyrimidines. Science 1993, 260, 1510-1513; 및 Gryaznov S 등, Oligonucleotide N3' -> P5'phosphoramidates as antisense agents. Nucleic Acids Res 1996: 24, 1508-1514]. 그러나, 이들은 목적 염기 서열에 대한 특이성 및 RNase H 활성에서 문제점을 나타내고 있다.
이러한 점을 개선하기 위하여 본 발명자들은 뉴클레아제 활성에 저항성을 가진 리본형 안티센스(RiAS)를 보고하였다[Moon IJ 등, Potent growth inhibition of leukemic cells by novel ribbon-type antisense oligonucleotides to c-myb. J Biol Chem. 2000 Feb 18;275(7):4647-53]. RiAS는 mRNA에서 2차 구조가 적은 영역을 AS-올리고의 목표지점으로 선별하여 상동성 분자의 결합에 의하여 만들어지며, 폐쇄형 구조의 안티센스 분자는 생체내의 뉴클레아제에 안정성을 가진다.
AS-올리고의 효율적인 전달을 위해서는 리포좀, 폴릭산-폴리라이신 담체, 전기천공 등 여러 가지 방법이 사용되었다[Capaccioli S 등, Cationic lipids improve antisense oligonucleotide uptake and prevent degradation in cultured cells and in human serum, Biochem Biophys Res Commun. 1993 Dec 15;197(2):818-25; 및 Ginobbi P 등, Folic acid-polylysine carrier improves efficacy of c-myc antisense oligodeoxynucleotide on human melanoma (M14) cells. Anticancer Res 1997, 17, 29-36; 및 Bergan R 등, Electroporation enhances c-myc antisense oligonucleotide efficacy. Nucleic Acid Res 1993, 21, 3567-3573]. 근년에는 양이온 리포좀을 이용한 전달 방법이 사용상의 간편함과 비교적 높은 세포내 전달 효율성으로 인하여 빈번히 사용되고 있다. 최근에는 폴리머를 이용하거나 펩티드를 이용하여 세포내 전달 효과를 높이려는 연구가 많이 진행되고 있다[Murphy EA 등,Development of an effective gene delivery system: a study of complexes composed of a peptide-based amphiphilic DNA compaction agent and phospholipid. Nucleic Acids Res. 2001 Sep 1;29(17):3964-704; 및 Schwartz SR 등, Peptide-mediated cellular delivery. Curr Opin Mol Ther. 2000 Apr;2(2):162-7].
펩티드를 이용한 유전자 전달(gene delivery)로서 사용하기 위해서는 바이러스성 벡터의 단점을 보완하면서 바이러스처럼 효율적으로 세포내 전달될 것을 요구한다. Schwarze SR 등은 HIV-1 Tat 단백질을 이용하여 거대 단백질을 세포내로 효과적으로 전달함을 보고하였다[Schwartz SR 등, Peptide-mediated cellular delivery. Curr Opin Mol Ther. 2000 Apr;2(2):162-7]. 특히, 생체내 실험에서 폐와 신장 및 관절등에도 우수한 전달효과를 보여 주었다. HIV-1 Tat 단백질은 86개의 아미노산 잔기를 가지고 있고 HIV-1 Tat 유전자는 두개의 엑손으로 구성된다. 아미노산 서열 1-72는 엑손 1에 의해 암호화되고 아미노산 서열 73-86은 엑손 2에 의해 암호화된다. HIV-1 Tat 단백질중 2개의 라이신과 6개의 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열 49-57이 핵내 배치화(nuclear localization)에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 대부분이 양이온 전하를 가지고 있어 대부분이 음이온인 지질막과 쉽게 결합되리라 생각된다.
경화성 질환에서 중요한 분자인 TGF-β1 mRNA를 효율적으로 감소시키기 위해서는 AS-올리고의 작용부위 선택이 매우 중요하다. 세포내에서 mRNA는 2차 혹은 3차 구조를 형성하여 자체적인 안정성을 높이는 것으로 알려져 있다. mRNA의 복합적 구조는 자체적 염기 결합과 RNA 결합성 단백질에 의해 이루어진다. 이러한 사실을 감안하여 AS-올리고의 작용 부위는 2차 구조가 최소화된 부위를 선택할때 안티센스 효과가 개선된다는 것이 보고된 바 있다. 포스포로티오에이트-올리고는 부분적으로 뉴클레아제에 대하여 안정성을 나타내나, 전사체에 대한 특이성 저하 및 생체내 실험시 부작용등의 문제점이 대두되면서 적용 범위의 한계를 보이고 있다.
따라서 본 발명은 이러한 문제점을 현저하게 개선시킨 리본형 TGF-β1 RiAS를 디자인 및 제작하였다
또한, 본 발명은 rTGF-β1 RiAS의 세포내 또는 생체내 전달 효율을 높이기 위하여 HIV-1 Tat 단백질의 일부 펩티드를 이용한 새로운 전달 방법을 시도하였다. 즉, 양이온 리포좀과 Tat 펩티드 복합체를 운반체로, TGF-β1 mRNA에 대한 새로운 구조의 RiAS를 사용하여 요관 결손 동물모델에서 TGF-β의 발현을 억제시키고자 하였다.
도 1. 쥐(rat) TGF-β1 리본형 안티센스 (TGF-β1RiAS)의 제작.
DNAsis 프로그램(Ver. 2.1, Hitach software, USA)을 사용하여 선정된 58 mer의 선형 안티센스 분자간의 결합을 통해 형성된 116 mer의 리본형 안티센스의 2차구조를 분석한 결과이다. TGF-β1 RiAS-올리고는 스템과 2개의 루프로 구성되어 있으며, 루프들은 쥐 TGF-β1 전사체 (mRNA)에 대한 안티센스의 역할을 수행한다.
도 2. 컬럼 크로마토그래피에 의한 TGF-β1 RiAS 올리고뉴클레오티드의 분리정제 및 순도 확인.
A. 10 미크론 디올계 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 미정제 TGF-βRiAS 올리고 분자의 프로필.
B. 10 미크론 디올계 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피한 후 정제된 TFG-βRiAS 올리고 분자의 프로필.
컬럼: Protein Pak 125TM(7.8 x 300 mm). 완충액: 20 mM Tris-Cl (pH 6.8) 함유 0.15 M NaCl. 유속: 0.5 ㎖/min (A), 1 ㎖/min (B).
도 3. TGF-β1 RiAS의 구조 분석, 안정성 확인과 WRT7/P2 세포에서의 TGF-β1 전사체의 효과적인 감소.
(A) 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 TGF-β1 RiAS의 분석 (레인 1과 2)과 엑소뉴클레아제 III 처리에 의한 안정성 확인(레인 3과 4). 레인 1; 선형 TGF-β1, 레인 2; TGF-β1RiAS, 폴리아크릴아미드 겔상에서 분자량의 차이로 인한 안티센스의 지연현상을 보이고 있다. 레인 3; 엑소뉴클레아제 III 처리한 선형 TGF-β1, 레인 4; 엑소뉴클레아제 III 처리한 TGF-β1RiAS.
선형 안티센스는 엑소뉴클레아제 III 처리로 인해 분해가 일어났으나, TGF-β1RiAS에서는 분해가 일어나지 않았다.
(B) WRT7/P2세포에서 TGF-β1 RiAS 처리에 의한 TGF-β1 mRNA의 발현의 감소. 레인 1, 비처리 세포. 레인 2, TGF-β1 RiAS의 0.1 ㎍ 처리 세포. 레인 3, TGF-β1 RiAS의 0.3 ㎍ 처리 세포. 레인 4, 스크램블 안티센스의 0.1 ㎍ 처리 세포. 레인 5, 스크램블 안티센스의 0.3 ㎍ 처리 세포
(C) 서던 블로팅. RT-PCR의 결과물인 DNA 밴드가 TGF-β1 전사체에 의한 것인지 확인하기 위하여, 유전자의 중간에 상응하는 내부 프라이머를 사용하여 서던 블로팅을 수행하였다. 상기 (B)의 결과와 동일하게 신호를 확인하였다.
도 4. 선형 안티센스 TGF-β1의 신장 세포내 전달. 신장 세포내 전달을 확인하기 위하여, FITC-선형 안티센스/tat 펩티드/리포좀의 혼합체를 요관을 통해 신장으로 주입하였다. 1일 경과 후 신장의 동결 절편을 광학 현미경(그림 A와 C)과 형광 현미경(그림 B와 D)에서 관찰하였다. 그림 A와 B, FITC-선형안티센스/tat 펩티드/리포좀 혼합체. 그림 C와 D, FITC-선형 안티센스 주입
도 5. 동일계 (in situ) RT-PCR. 요관 절제 수행과 동시에 요관을 통해 10 ㎍의 TGF-β1 RiAS를 주입한 신장내에서 TGF-β1 mRNA의 발현을 동일계 RT-PCR을 통해 확인 하였다. 갈색의 점들이 TGF-β1 전사체 (mRNA)를　나타낸다. 그림 A. 비처리 신장, 그림 B. 요관 절제 신장, 그림 C. 요관 절제와 PBS 주입, 그림 D. 요관 절제와 스크램블 안티센스 주입, 그림 E. 요관 절제와 TGF-β1 RiAS 주입.
도 6. TGF-β1에 대한 면역학적인 염색. 갈색의 점들이 TGF-β1 단백질을 나타낸다. 그림 A. 비처리 신장, 그림 B. 요관 결손 신장, 그림 C. 요관 결손과 PBS주입, 그림 D. 요관 결손과 스크램블 안티센스 주입, 그림 E. 요관 결손과 TGF-β1RiAS 주입.
도 7. TGF-β1 RiAS 주입된 요관 결손 신장의 형태학적인 변화. (A)(L, 요관결손 신장, C, 반대쪽 신장). 대조군에서는 신장의 현저한 증가를 보이나, TGF-β1 RiAS 주입 신장에서는 크기가 줄어든 것을 확인하였다. (B) 요관 결손 신장을 반으로 절단하여 내부적인 구조를 나타내고 있다. 대조군에서는 많은 부위가 손상된 것을 볼 수 있으나, TGF-β1 RiAS가 주입된 신장에서는 손상부위가 적거나 없는 것을 볼 수 있다. 그림 1. 요관 결손 신장, 그림 2. 요관 결손과 PBS 주입, 그림 3. 요관 결손과 스크램블 안티센스 주입, 그림 4. 요관 결손과 TGF-β1 RiAS 주입.
도 8. TGF-β1 RiAS 주입된 요관 결손 신장의 조직학적인 변화. PAS로 신장 절편을 염색하여 조직학적 변화를 살펴보았다. 전체 대조군에서는 튜블의 확장과 위축이 보이나, TGF-β1 RiAS 처리 신장에서는 튜블 확장의 감소와 위축이 감소되는 것을 관찰하였다. 그림 A. 비처리 신장, 그림 B. 요관 결손 신장, 그림 C. 요관 결손과 PBS 주입, 그림 D. 요관 결손과 스크램블 안티센스 주입, 그림 E. 요관 결손과 TGF-β1 RiAS 주입.
본 발명의 요약
본 발명은 TGF-β1 mRNA에 상보적으로 결합하는 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이며, 이를 사용하여 경화성 질환을 치료 및 억제할 수 있다. 상기 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드는 양 말단이 폐쇄형이며 뉴클레아제의 공격에 매우 안정적이다.
구체적으로 본 발명의 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드는 58-mer 단량체2개를 연결한 116-mer 이량체 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있다.
상기 58-mer 단량체는 GATCACGTCTGGCGTTGTTGCGTTAGATACTGTTTTGGTTTCTGTAGTGTGTGTACGT 이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드 복합체를 목적 세포내로 전달하는 방법에 관한 것으로서, 이를 위해 RiAS-Tat 펩티드-양이온 리포좀 복합체를 구성한다. 본 발명의 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드 복합체는 Tat 펩티드/RiAS 올리고뉴클레오티드/D-P 양이온 리포좀이 삼중혼합체로 혼합되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적 설명
AS-올리고를 이용한 유전자의 발현 억제가 효율적인 분자 치료제로서 임상실험에 의하여 부각되고 있다. 질병을 효과적으로 억제 또는 치유하는 방법은 질병 과정에서 중요한 물질을 효과적으로 차단하는 것이다. 이에 본 발명자들은 경화증에서 중요한 물질인 TGF-β1를 선택하였으며 TGF-β발현을 증가시키는 UUO 모델을 선택하였다[Kasuga H 등, Effects of anti-TGF-beta type II receptor antibody on experimental glomerulonephritis. Kidney Int. 2001 Nov;60(5):1745-55; 및 Border WA 등, Evidence that TGF-beta should be a therapeutic target in diabetic nephropathy. Kidney Int. 1998 Oct;54(4):1390-1; 및 Cohen AH 등, TGF-beta in renal allograft rejectio. Miner Electrolyte Metab. 1998;24(2-3):197-201; 및 Border WA, Noble NA. TGF-beta in kidney fibrosis: a target for gene therapy. Kidney Int. 1997 May;51(5):1388-93]. 물론, 질병을 유발하는 정확한 기전은 다르지만, TGF-β는 신장조직의 경화 이외에도 다른 조직의 경화성 질환에도 중요한 역할을 한다[Branton MH,상기 문헌 참조].
또한, 안티센스 분자에 안정성을 부여하기 위해 본 발명자들은 TGF-β1에 대한 리본형 안티센스 분자를 개발하였다. 본 발명자들은 이미 RiAS의 혈청내 안정성을 보고 하였다[Moon IJ 등, 상기 문헌 참조]. 본 발명의 TGF-β1 RiAS 또한 뉴클레아제에서 안정함을 보였다(도 1a).
또한 유전자의 전달 효율성을 증가시키기 위해 Tat 펩티드를 사용하였다. 실험결과, 세포주에서 Tat 펩티드/RiAS 올리고/D-P 양이온 리포좀의 복합체는 4 : 1 : 4 (w/w/w) 혼합 비율에서 우수한 효과를 보였으며, FITC-표지된 올리고 또는 플라스미드를 신장 요관을 통해 주입하였을 경우, Tat 펩티드의 혼합체는 좋은 결과를 나타냈다.
요관 결손 신장에서 튜블의 확장, 튜블기저막의 비후화와 축소(atrophy), 콜라겐의 침척, 대식세포의 침윤과 기질간 섬유아세포의 증식등이 이미 보고되었으며, UUO 쥐의 신장에서 병증의 시작은 하루이전에 시작이 되며 15일 이상 지속된다. 본 발명자들은 이러한 점을 참조하여 5일째를 조사일로 선택하였다. TGF-β1 RiAS는 카테터를 사용하여 요관을 통해 주입하였으며, 주입 후 요관절제를 수행하였다. 면역조직화학적 방법으로 TGF-β1 발현을 조사하였을때, 대조군에서의 신장 TGF-β1은 튜블 세포에서 전반적으로 강하게 발현이 되는 반면, TGF-β1 RiAS가 주입된 신장에서는 신장 TGF-β1 발현의 감소를 보였다. 또한 신장의 무게와 조직 검사에서도 정상적인 신장과 유사한 결과를 보였다. UUO후 5일째에 대조군 신장 무게의 증가를 확인하였으나, TGF-β1 RiAS가 주사된 쥐에서는 현저한 감소를 확인하였다. 또한 조직 관찰에서도 튜블의 확장이 감소된 것을 확인하였다. 신장의 기능을 확인하기 위해 혈청내 크레아티닌, 우레아, 콜레스테롤의 농도를 측정하였으나, 그 차이는 확인할 수 없었다. 이러한 결과는 이미 보고 된 바 있으며, 이것은 반대쪽 신장의 정상적인 작용으로 그 차이를 볼 수 없는 것으로 생각된다[Koff SA, Thrall JH. Diagnosis of obstruction in experimental hydroureteronephrosis. Urol 1981, 17, 570-7]. TGF-β는 주로 실질 세포 유형에 의해 생산되고, 침윤 세포(림프구, 단핵세포/대식세포, 혈소판)에 의해서도 생산된다. 상처나 염증에 따라, 이런 모든 세포는 TGF-β의 잠재적 원인으로 생각된다. TGF-β의 신호에 의한 콜라겐의 생산은 섬유아세포와 상해를 입은 튜블에서 생성된다. 요관을 통한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전달은 대부분 튜블세포내로 전달된 것으로 보인다. 또한 요관이외의 유전자의 전달 방법으로 혈관이나 조직내로 직접 주입하는 방법등은 연구가 되어야 할 사항이다.
이러한 결과들은 TGF-β1 RiAS가 요관결제 신장에서 TGF-β1을 효율적으로 저해한다는 것을 나타낸다. UUO 모델에서 TGF-β의 역할은 분명하지 않으나, TGF-β를 발현하는 세포는 신장 튜블세포 또는 대식세포라고 생각된다. 본 발명에서는 TGF-β1 발현을 튜블세포에서 확인하였다. 요약하면, 신장 상해의 중요 사이토카인 TGF-β1에 대한 RiAS 분자를 리포좀/Tat 펩티드와 혼합하여 UUO 신장의 요관을 통해 주입한 결과, TGF-β1의 조직내에서의 감소, 튜블의 확장 저해, 신장의 크기가 정상과 유사하게 유지되는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 혈청내에서 안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 유전자 치료를 가능하게 할 수 있을 것으로 생각되며, 신장이외의 다른 기관에서도 적용가능할 것으로 생각된다.
본 발명의 양태의 바람직한 특징은 필요한 변경을 가하여 다른 양태에 적용될 수 있다. 본 발명은 다음의 실시예를 참고로 서술할 것이며 이것은 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
1) 세포 배양
쥐의 단핵구 세포주인 WRT7/P2는 Dr. Yagita (Juntendo University, Japan) 실험실에서 분양받아 실험에 사용하였다. WRT7/P2는 RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) 배양액에 10% 열-불활성화 FBS (Hyclone, USA)와 100 유니트/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO2세포 배양기에서 배양하였다. 실험에 사용한 세포는 적정한 세포 농도를 유지하도록 유의하였으며 전날 신선한 배양액으로 교체한 후, 0.4% 트립판 블루로 생존성을 확인한 다음 사용하였다.
2) 폐쇄형 안티센스 올리고뉴클레오티드의 제작 및 분리정제
쥐의 TGF-β1 cDNA를 DNAsis 프로그램(Ver. 2.1, Hitach software, USA)을 사용하여 2차 구조 분석을 시행하였다. 선정된 안티센스 염기 배열 중 안티센스 효과가 있는 것으로 판명된 AS-올리고를 대상으로 폐쇄형 rTGF-β 1RiAS를 디자인하였다. rTGF-β1의 58 mer 단량체 올리고의 제작은 ExpediteTM8909 (Applied biosystems, USA)로 합성하였다. RiAS가 제작되었다(도 1). 합성시 5 프라임 말단에 인산화(ⓟ)된 58 mer의 올리고를 T4 DNA 리가아제(Takara, Japan)로 사용하여 양쪽 끝을 공유결합으로 연결시켰다. 85℃에서 2분간 열 처리한 AS-올리고를 상온에서 서서히 냉각시킨 후, T4 DNA 리가아제 (1 U 리가아제/㎍ 올리고)로 처리한 뒤 16 ℃에서 16 시간 반응시켜 결찰하였다. 결찰된 폐쇄형 올리고는 15% 변성 아크릴아미드 겔(PAGE)에서 이동이 지연된 밴드의 유무로 확인하였다. 같은 크기의 스크램블(scramble) 올리고(SC-올리고)를 동일한 방법으로 공유결합하여 대조군 실험에 사용하였다. 결찰에 의해서 생성된 116 mer의 rTGF-β1RiAS 올리고의 분리 및 정제는 10 미크론 디올계 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 다음과 같은 방법으로 분리 정제하였다. 실리카 수지를 이용한 Protein pak I-125TM컬럼(7.8 x 300 mm, Waters, USA)을 사용하였으며, 0.15 M NaCl이 포함된 20 mM Tris-Cl (pH 6.8) 완충액으로 균형화 및 용출시켰다. 분리 정제 및 순도 확인은 Prep. LC (Delta prep 4000 system, Water, USA)로 시행하였다. 선형 및 폐쇄형 AS-올리고의 뉴클레아제에 대한 안정성은 엑소뉴클레아제 III(Takara, Japan)를 처리하여 분해 정도를 조사하였다. 엑소뉴클레아제 III(160 U/㎍ 올리고)를 처리한 AS-올리고는 37℃에서 2시간 반응시킨 후 페놀과 클로로포름으로 추출하여 15% 변성 PAGE로 분석하였다.
즉, 본 발명자들은 쥐의 TGF-β1 cDNA를 다양한 조합으로 선상 배열한 후 2차 구조를 분석하고 자체적으로 2차 구조형성이 최소화 된 부위를 선택하였다 (표 1). 합성된 58 mer의 선상 AS-올리고 단량체는 5 프라임 말단이 인산화 되어있으며, 인산화된 올리고의 5 프라임 말단을 이용한 공유적 결찰을 통해 rTGF-β1RiAS이량체(116 mer)를 제작하였다. 116 mer의 rTGF-β1RiAS 분자는 디올계 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였다. 미정제 rTGF-β1RiAS 분자의 컬럼 크로마토그래피에서 두 분획의 주 피크로 분리되었다(도 2A). 두 분획중 피크 I이 116 mer의 rTGF-β1RiAS 분자이고 피크 II는 결찰되지 않은 58 mer 미만의 합성 올리고였다. 따라서 피크 I의 분획을 수집하여 에탄올 침전법으로 농축한 다음, 같은 컬럼으로 분리 정제된 rTGF-β1RiAS 분자의 순도를 확인하였다. 분리 정제된 rTGF-β1RiAS 분자는 하나의 주 피크로 나타나 비교적 고순도의 rTGF-β1RiAS 분자를 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다(도 2B).
116 mer의 rTGF-β1RiAS는 15% 변성 PAGE상에서 AS-올리고(58 mer) 단량체와 비교시 전기영동상에서 밴드의 지연 현상에 의하여 폐쇄형 이량체를 확인하였다(도 3A). rTGF-β1RiAS의 폐쇄성은 엑소뉴클레아제에 대한 안정성으로 재확인되었다. 엑소뉴클레아제 III를 처리하였을 때 전기영동상에서 지연된 올리고뉴클레오티드 밴드는 분해를 나타내지 않았다(레인 4). 반면 선형 올리고는 2시간만에 엑소뉴클레아제 III에 의해 완전히 분해되었다(레인 3). 엑소뉴클레아제 III에 안정한 rTGF-β1RiAS분자는 116 mer로 아크릴아미드 겔 상에서 나타났다. 이러한 결과에서rTGF-β1RiAS는 뉴클레아제에 대한 안정성이 선형 올리고보다 우수하다는 것을 알 수 있었다.
3) DOTAP-DOPE (D-P) 양이온 리포좀의 제작
D-P 양이온 리포좀은 CHCl3에 녹아 있는 DOTAP (N-1(-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄에틸 설페이트(Avanti?Polar Lipids, Inc. USA) 50 ㎎/㎖과 DOPE (디올레오일포스파티딜-에탄올아민, Avanti?Polar Lipids, Inc. USA) 지질 50 ㎎/㎖를 1:1로 혼합하여 증발기로 필름을 만든 후 건조과정을 거쳐 염수(0.15M) 10 ㎖에 녹여 리포좀이 형성되도록 하였다. 염수에 녹아 있는 리포좀은 교반과 초음파처리하여 100 ㎚의 미니-압출기(Avanti?Polar Lipids, Inc. USA, Alabaster)를 10회 통과시킨 후 D-P 리포좀으로 사용하였다.
4) rTGF-β1RiAS-Tat 펩티드-양이온 리포좀 복합체
Tat 펩티드 (RKKRRQRRRPPQC)는 Anygen (Korea)에서 주문 제작하여 사용하였다. Tat 펩티드와 rTGF-β1RiAS를 1:4 비율 (w/w)로 100 ㎕의 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA)에 혼합하여 10분 동안 반응시킨 뒤, 제작된 DOTAP-DOPE (D-P) 양이온 리포좀을 rTGF-β1RiAS의 양의 4배 양(w/w)으로 혼합하여 10분 동안 반응하여 복합체를 제조하였다. 실험 전날 신선한 RPMI-1640 배양액으로 교환해 준 WRT7/P2는 ORTI-MEM으로 두 번 세척하여 5×105cell/ml로 세포 농도를 조정한 후 48-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하였다. WRT7/P2에 40 ㎕ (0.1 또는 0.3 ㎍)의 rTGF-β1RiAS를 처리하고 37℃에서 5% CO2로 6시간 배양한 다음, 10% FBS가 포함된 OPTI-MEM을100 ㎕ 가하여 16시간 배양하였다.
5) 역전사효소-폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR)과 서던 블로팅
RNA 분리는 TripureTMIsolation Reagent (Roche, Germany)를 사용하여 제조 회사가 권장하는 방법으로 분리하였다. 요약하면, 각각의 웰에서 수집한 세포에 트리퓨어 시약(Tripure Reagent) 0.4 ml 와 클로로포름 80 ㎕ 을 가하여 총 RNA를 분리하고, 분리된 RNA는 RT-PCR에 사용되었다. RT-PCR은 AccessTMRT-PCR kit (promega, USA)을 사용하여 회사가 추천한 방법을 이용하여 다음과 같이 수행하였다. 0.5 ml PCR 튜브에 총 반응양을 50 ㎕로 하였다. 반응 튜브에 RNA와 TGF-β1 프라이머(상류 프라이머: 5'-CCTGCTGCTTTCTCCCTCAACC-3' 하류 프라이머: 5'-CTGGCACTGCTTCCCGAATGTC-3'를 넣고,AMV역전사효소(5 U/㎕),TflDNA 폴리머라아제(5 U/㎕), dNTP (10 mM, 1 ㎕)와 MgSO4 (25 mM, 2.5 ㎕)를 넣은 후, DNA 열 회전기(Perkin Elmer, USA)로 RT-PCR을 수행하였다. 제1 스트랜드 cDNA 합성은 48℃에서 45분 동안 실시하였으며, PCR 반응은 94℃에서 30초, 56℃에서 1분, 68℃에서 2분으로 25회 반복하였다. PCR 생성물은 1.2% 아가로스 겔에서 확인하였으며, 겔 도큐멘테이션 프로그램(AlphaImagerTM1220, USA)을 이용하여 증폭된 cDNA를 정량적으로 비교 및 분석하였다. 서던 혼성화는 ECL 키트(Amersham Life Science, UK)를 사용하였다. RT-PCR 생성물은 1.2% 아가로스 겔로 전기영동시킨 후 0.4N NaOH 용액상에서 니트로셀룰로스 막에 이전시켰다. 올리고뉴클레오티드 프로브 표지화는 TGF-β1에 대한 24 mer의 올리고뉴클레오티드(5'-GACCCCACCCCACCCCACAAGCCC-3' 100pmol에 플루오로세인-11-dUTP, 카코딜레이트 완충액, 말단 전이효소를 잘 섞은 후 37℃에서 70분간 반응시켜 표지화 프로브를 제작하였다. 혼성화는 니트로셀룰로스 막에 혼성화 완충액 (5X SSC, 0.02% SDS, 액체 블록) 6 ml로 60℃에서 40분간 처리한 다음 표지화 프로브를 6.25 ng/ml을 넣고 62℃로 1시간 반응시켰다. 막의 세척은 0.1% SDS가 포함된 5X SSC로 두번, 1X SSC로 58℃에서 15분간 두 번 실행하였다. 막 블로킹 과정을 거친 후, 항-플루오로세인 접합된 HRP 항체를 30분간 반응시킨 다음 기질 용액을 처리한 후, X-선 필름에 노출시키고 현상하였다.
rTGF-β1 RiAS의 세포내 또는 생체내 전달 효율을 높이기 위하여 DOTAP-DOPE (D-P) 양이온 리포좀과 Tat 펩티드를 사용하였다. TGF-β1 RiAS, DOTAP/DOPE, Tat 펩티드를 1:4:4의 비율로 혼합했을 때 가장 좋은 전달효과를 나타내었다. 다음으로, TGF-β1RiAS의 염기 서열에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 효과를 갖는지 조사하였다. TGF-β1RiAS의 0.3 ㎍을 WRT7/P2 세포에 형질감염시킨 후 SC-RiAS와 비교하였을 때 TGF-β mRNA 발현이 70% 이상 감소하였다. TGF-β1RiAS를 SC-RiAS 0.1 ㎍과 비교했을 때는 60% 이상 감소하였다(도 2B). 이러한 결과는 소량의 RiAS로도 세포주에서 우수한 안티센스 효과를 나타내는 것을 보여주고 있다. TGF-β1RiAS에 의한 TGF-β1 mRNA 감소의 진위를 분석하기 위해 RT-PCR 생성물을 서던 혼성화로 확인하였다(도 2C). RT-PCR 후 증폭된 특정 밴드에서 관찰한 것처럼 TGF-βRiAS를 처리했을때는 SC-RiAS와 비교해서 TGF-β1 mRNA의 감소가 현저함을 볼 수 있었다.
6) Tat 펩티드를 이용한 올리고의 생체내 전달
선형 올리고의 FITC(플루오로세인 이소티오시아네이트)결합은 마이너스 표지 ITTM플루오로세인 핵산 표지화 키트(Panvera, USA)을 사용하여 제작자가 제시한 방법에 따라 수행하였다. 10 ㎍의 FITC 접합된 rTGF-β선형 올리고, 40 ㎍의 DOTAP/DOPE와 40 ㎍의 Tat 펩티드 복합체를 요관을 통해 신장으로 주입한 후, 24시간째에 신장을 적출하였다. 신장은 냉동후 10 ㎛의 절편으로 자른 후, 형광 현미경하에서 관찰하였다.
생체내에서 RiAS-올리고/Tat 펩티드/D-P 양이온 리포좀 복합체의 전달 효과를 관찰하고자 하였다. rTGF-β1RiAS 분자는 폐쇄형 분자로 5' 말단을 FITC로 접합할 수가 없기 때문에, 58 mer의 선형 합성 올리고를 FITC로 접합하였다. FITC 접합된 TGF-β1 선형 올리고 10 ㎍, D-P 리포좀 40 ㎍과 Tat 펩티드 복합체 40 ㎍를 요관을 통해 신장으로 주입한 후, 24시간째에 신장을 적출하였다. 신장은 냉동후 10 ㎛의 절편으로 자른 후, 형광 현미경하에서 관찰하였다. 대조군으로는 FITC 접합된 선형 올리고만을 사용하였다. 대조군에의 신장 조직에서는 형광을 볼수 없었으나, 올리고-FICT/Tat 펩티드/D-P 리포좀 복합체는 신장 조직에서 형광을 확인하였다(도 3). 생체내에서 Tat 펩티드의 사용은 합성 올리고뿐만 아니라, 플라스미드의 전달과 유전자 발현도 증가시킴을 확인하였다.
7) 요관 절제 모델
스프라그-다울리(Sprague-Dawley:SD) 백서(200-250 g)를 SLC (Japan)로부터 주령 6주의 수컷을 공급받아 플라스틱 쥐 장에서 사육하였다. 실험 전기간동안 펠렛형 고형 사료로 사육하였고 물은 자유롭게 먹였다. 펜토바비탈(5 mg/100 g 체중)을 백서의 복강으로 주사하여 마취한 후에 복부를 절개하여 왼쪽 신장을 노출시켰다. 실험에 사용된 백서는 24 게이지 카테터를 사용하여 왼쪽 신장의 요관을 통해 10 ㎍의 TGF-β1RiAS 또는 대조군 시료를 주입한 후 4-0 실크를 사용하여 이중 봉합한 사이를 절단하였다. 백서는 5일후에 에테르 마취로 희생하였고, 신장을 분리하여 실험에 사용하였다. 각 그룹당 6마리로 구성된 백서는 (i) 비처리된 대조군, (ii) 요관 절제만을 수행한 대조군, (iii) 요관 절제와 PBS 주입 대조군, (iv) 요관 절제와 SC-RiAS 주입 대조군, (v) 요관 절제와 rTGF-β1RiAS를 처리한 군으로 배정되었다. 수술 5일 후, 신장을 적출하여 염수로 세척한 후 무게를 측정하였으며 전체 신장의 무게는 체중에 대한 퍼센트로 나타내었다.
생체내에서의 TGF-β1RiAS 효과를 확인하기 위해 요관 절제 모델을 선택하였다. 요관 절제 모델은 안지오텐신 II의 증가로 인해 TGF-β1, TGF-α, PDGF 등의 다양한 인자를 증가시키며, TGF-β1의 활성이 엔도세린(endothelin) 생산을 증가시켜 신장의 경화를 자극하게 된다. SD 백서를 사용하여 TGF-β1RiAS를 요관을 통해 전달함과 동시에 UUO를 실시하였다. 수술후 5일째의 신장을 적출하여 신장 무게를 측정하였다. 신장의 육안 관찰로 UUO 신장에서는 신장의 크기가 커짐을 볼수 있었으며, TGF-β1RiAS 처리군에서는 다른 군에 비해 상대적으로 신장 크기의 감소를 확인하였다(도 4a). 신장을 절반으로 절단하여 형태를 관찰하였을 때, 대조군의 신장 내부의 많은 부위가 결손된 것을 확인하였다. 반면, TGF-β1RiAS가 주입된 쥐의 신장에서는 대조군에 비해 결손이 완화된 것을 관찰하였다(도 4b). 신장무게는 전체 체중의 백분율로 나타내었다. 각각 대조군에서의 신장 무게는 비처리군에서 0.47%, 요관 절제군에서 0.99%, 요관 절제와 PBS 주입군에서 0.95%, 요관 절제와 SC-RiAS 주입군에서 1.07%를 보였으나, 요관 절제와 TGF-β1RiAS 주입군 (0.68%)에서는 현저한 무게의 감소를 보였다(p<0.005). 각 그룹간의 반대쪽 신장 무게의 차이는 없었으며, TGF-β1RiAS처리 신장에서는 0.46%를 나타내었다(표 2).
* UUO+PBS에 비교하여 P < 0.005
8) 조직학적 검사
적출한 신장 조직은 10% 완충된 포말린에 고정한 후 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 4 ㎛로 절단한 후, 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
9) TGF-β의 면역 조직화학적 염색
적출한 신장은 -80℃에서 급속냉동 후에 OCT 화합물로 포매하였고, 조직을 10 ㎛로 절단하여 Poly-PrepTM(Sigma) 슬라이드 글라스에 부착하였다. 조직은 Bouin's 고정액에 5분, 4℃ 아세톤 용액에 10분, -20℃ 메탄올에 15분, 2% 파라포름알데히드에서 2분, 4% 파라포름알데히드에서 4분, 70% 에탄올에서 10분 동안 반응한 후 재수화하였다. 이를 PBS 완충액으로 세척한 후, 내부적인 포옥시다아제 활성을 제거하기 위해 0.3% H2O2를 포함하는 메탄올에 30분동안 침지시켰다. PBS 세척후 10% FBS를 포함하는 PBS에서 30분 동안 배양하여 블로킹시킨 후, 0.5% BSA와 2% 태아 소 혈청을 포함하는 용액에 TGF-β항체(Santa Cruz, USA)를 10배 희석하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 슬라이드를 세척과 블로킹을 거친후 이차 항체(항-토끼 HRP 접합체, Sigma)를 1시간동안 실온에서 반응시켰다. PBS로 5차례 세척한 후 디아민 벤지딘(Sigma) 기질 용액에서 5분간 발색하였다. 슬라이드를 세척한 후, 10% 헤마톡실린(Sigma)으로 1분동안 대조염색하였고, 20개 부위에서 현미경 상(400배 배율)에서 전체 면적당 갈색이 차지하는 부위를 계산하였다.
즉, TGF-β1RiAS의 요관내로의 주입이 신장내 TGF-β 발현을 억제하는지 조사하기 위해서 면역조직화학적 실험을 하였다. 대조군의 요관 결손 신장에서는 신장 튜블에서 전반적으로 강한 양성 TGF-β1 염색을 보인 반면, TGF-β1RiAS 처리군에서는 신장 튜블에서 세포의 일부만이 약한 염색을 보였다 (도 5). TGF-β1이 차지하는 영역을 비교하기 위해 400 배 배율의 현미경상에서 20개의 중첩되지 않는 부분을 전체 영역에서 차지하는 비율로 나타내었을 때, TGF-βAS를 처리한 SD에서 현저한 TGF-β1의 감소를 확인하였다. 많은 신장 질환에서 기질간 경화는 일반적으로 관찰되는 현상이며, 특히 요관 결손 모델에서는 튜블의 확장, 튜블 기저막의 비후화와 축소가 존재한다. 이런 경화는 레닌-안지오텐신 시스템(RAS)이 활성화되면서 안지오텐신 수용체(AT1 또는 AT2)를 통해서 발생하며, 신장내의 TGF-β1, TGF-α등을 과발현하여 경화증을 유발하게 된다. 전체 대조군에서 튜블의 확장이 관찰된 반면, TGF-β1RiAS 주입군에서는 튜블의 확장과 축소가 감소된 것을 보였다.
10) 통계학적 조사
데이터는 평균 ± 표준편자 (SD)로 나타내었고,P< 0.05 일 때 유의성이 있는 것으로 평가하였다.
본 발명은 TGF-β1 mRNA에 상보적인 양 말단이 폐쇄된 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로서, 이를 이용하여 TGF-β1 mRNA의 발현을 억제함으로써 경화성 질환을 치료 및 예방할 수 있다. 또한, 본 발명은 HIV-1 Tat 단백질의 일부를 포함하는 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드 삼중 복합체 (Tri-complex) 혹은 여타의 효과적 비바이러스성 유전물질 전달체를 사용하여 세포내에 전달함으로써 그 효과를 최대화할 수 있다.

Claims (9)

  1. 형질전이성 성장 인자-β1 (TGF-β1) 전사체 (mRNA)에 상보적으로 결합하는 리본형 안티센스(RiAS) 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5'-GATCACGTCTGGCGTTGTTGCGTTAGATACTGTTTTGGTTTCTGTAGTGTGTGTACGT-3'의 염기 서열을 갖는 58-mer 단량체 2개를 결합시켜 이루어지는 것인 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이차구조에서 스템(5'-GATCACG-3'와 5'-CGT-3')을 형성하는 염기 서열을 제외한 부분에서 염기의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드는 TGF-β1의 과발현에 기인한 암, 천식, 간경화, 폐경화, 만성비장염, 피부경화, 신경화, 화상 또는 혈관재협착증의 질환을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 제3항에 있어서, 상기 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드는 TGF-β1의 과발현에 기인한 암, 천식, 간경화, 폐경화, 만성비장염, 피부경화, 신경화, 화상 또는 혈관재협착증의 질환을 치료하는데 사용하는 것을 특징으로 하는 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  6. 유전자를 세포내로 전달하는 방법으로서, Tat 펩티드/DNA/D-P 양이온 리포좀의 복합체로 유전자를 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 복합체는 Tat 펩티드/DNA/D-P 양이온 리포좀이 4:1:4로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 DNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100468316B1 (ko) 2002-01-29 2005-01-27 주식회사 웰진 Ｄｎａ의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드
PL1716235T3 (pl) 2004-02-09 2012-11-30 Ulrich Bogdahn Inhibitory przekazywania sygnałów TGF-R do leczenia zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego
JP5713377B2 (ja) 2005-12-28 2015-05-07 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 薬物標的としての天然アンチセンスおよび非コードｒｎａ転写物
WO2009055864A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Crc For Asthma And Airways Ltd Methods and compositions for regulating airway tissue remodelling
CN102239260B (zh) 2008-10-03 2017-04-12 库尔纳公司 通过抑制针对载脂蛋白‑a1的天然反义转录物治疗载脂蛋白‑a1相关疾病
ES2629630T3 (es) 2008-12-04 2017-08-11 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con eritropoyetina (EPO) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a EPO
ES2600781T3 (es) 2008-12-04 2017-02-10 Curna, Inc. Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibición de transcritos antisentido naturales de vegf
US20110294870A1 (en) 2008-12-04 2011-12-01 Opko Curna, Llc Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
ES2762610T3 (es) 2009-02-12 2020-05-25 Curna Inc Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) por inhibición de transcrito antisentido natural para BDNF
CN102482677B (zh) 2009-03-16 2017-10-17 库尔纳公司 通过抑制nrf2的天然反义转录物治疗核因子(红细胞衍生2)‑样2(nrf2)相关疾病
WO2010107740A2 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Curna, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
CN103223177B (zh) 2009-05-06 2016-08-10 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
ES2609655T3 (es) 2009-05-06 2017-04-21 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con tristetraprolina (TTP) mediante inhibición de transcrito antisentido natural para TTP
JP5931720B2 (ja) 2009-05-08 2016-06-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｄｍｄファミリーに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるジストロフィンファミリー関連疾患の治療
DK2432881T3 (en) 2009-05-18 2018-02-26 Curna Inc TREATMENT OF REPROGRAMMING FACTOR-RELATED DISEASES BY INHIBITING NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTS TO A REPROGRAMMING FACTOR
CA2762987A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Joseph Collard Treatment of transcription factor e3 (tfe3) and insulin receptor substrate 2 (irs2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tfe3
KR101704988B1 (ko) 2009-05-28 2017-02-08 큐알엔에이, 인크. 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 항바이러스 유전자 관련된 질환의 치료
US8951981B2 (en) 2009-06-16 2015-02-10 Curna, Inc. Treatment of paraoxonase 1 (PON1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PON1
WO2010148050A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Curna, Inc. Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
WO2010151671A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Curna, Inc. Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (tnfr2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tnfr2
EP2446037B1 (en) 2009-06-26 2016-04-20 CuRNA, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
CN102712925B (zh) 2009-07-24 2017-10-27 库尔纳公司 通过抑制sirtuin(sirt)的天然反义转录物来治疗sirtuin(sirt)相关性疾病
CN102762731B (zh) 2009-08-05 2018-06-22 库尔纳公司 通过抑制针对胰岛素基因(ins)的天然反义转录物来治疗胰岛素基因(ins)相关的疾病
CN104313027B (zh) 2009-08-11 2018-11-20 库尔纳公司 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病
KR101805213B1 (ko) 2009-08-21 2017-12-06 큐알엔에이, 인크. Ｃｈｉｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 “ｈｓｐ70-상호작용 단백질(ｃｈｉｐ)의 ｃ-말단” 관련된 질환의 치료
CA2771172C (en) 2009-08-25 2021-11-30 Opko Curna, Llc Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
US20120295952A1 (en) 2009-09-25 2012-11-22 Curna, Inc. Treatment of filaggrin (flg) related diseases by modulation of flg expression and activity
JP6025567B2 (ja) 2009-12-16 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ｍｂｔｐｓ１）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｍｂｔｐｓ１関連性疾患の治療
CN102869776B (zh) 2009-12-23 2017-06-23 库尔纳公司 通过抑制肝细胞生长因子(hgf)的天然反义转录物而治疗hgf相关疾病
RU2619185C2 (ru) 2009-12-23 2017-05-12 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с разобщающим белком 2 (ucp2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ucp2
EP2519633B1 (en) 2009-12-29 2017-10-25 CuRNA, Inc. Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
ES2585829T3 (es) 2009-12-29 2016-10-10 Curna, Inc. Tratamiento de las enfermedades relacionadas con la proteína tumoral 63 (p63) por inhibición de transcripción antisentido natural a p63
CA2785727C (en) 2009-12-31 2020-01-07 Curna, Inc. Treatment of insulin receptor substrate 2 (irs2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irs2 and transcription factor e3 (tfe3)
CA2785832A1 (en) 2010-01-04 2011-07-07 Curna, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (irf8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irf8
KR101853509B1 (ko) 2010-01-06 2018-04-30 큐알엔에이, 인크. 췌장 발달 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 췌장 발달 유전자와 관련된 질환의 치료
JP6027893B2 (ja) 2010-01-11 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 性ホルモン結合グロブリン（ｓｈｂｇ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害による性ホルモン結合グロブリン（ｓｈｂｇ）関連疾患の治療
EP2529015B1 (en) 2010-01-25 2017-11-15 CuRNA, Inc. Treatment of rnase h1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to rnase h1
CN102844435B (zh) 2010-02-22 2017-05-10 库尔纳公司 通过抑制吡咯啉‑5‑羧酸还原酶1(pycr1)的天然反义转录物而治疗pycr1相关疾病
RU2612884C2 (ru) 2010-04-02 2017-03-13 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с колониестимулирующим фактором 3 (csf3), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта k csf3
WO2011127337A2 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Opko Curna Llc Treatment of fibroblast growth factor 21 (fgf21) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fgf21
WO2011139387A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Opko Curna, Llc Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt)
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
US8895528B2 (en) 2010-05-26 2014-11-25 Curna, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (ATOH1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ATOH1
ES2664585T3 (es) 2010-05-26 2018-04-20 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con metionina sulfóxido reductasa (MSRA) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a MSRA
CN109112126B (zh) 2010-06-23 2024-06-14 库尔纳公司 通过抑制电压门控钠通道α亚基(SCNA)的天然反义转录物而治疗SCNA相关疾病
JP5998131B2 (ja) 2010-07-14 2016-09-28 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｄｉｓｃｓｌａｒｇｅｈｏｍｏｌｏｇ（ｄｌｇ）ｄｌｇ１への天然アンチセンス転写物の阻害によるｄｌｇ関連疾患の治療
JP2013541510A (ja) * 2010-08-31 2013-11-14 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 新規の単一の化学物質、およびオリゴヌクレオチドの送達方法
CN103210086B (zh) 2010-10-06 2017-06-09 库尔纳公司 通过抑制唾液酸酶4(neu4)的天然反义转录物而治疗neu4相关疾病
KR101865433B1 (ko) 2010-10-22 2018-07-13 큐알엔에이, 인크. 알파-l 이두로니다아제 (idua)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 idua 관련된 질환의 치료
US10000752B2 (en) 2010-11-18 2018-06-19 Curna, Inc. Antagonat compositions and methods of use
WO2012071238A2 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Opko Curna Llc Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog
WO2012137036A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
KR102043422B1 (ko) 2011-06-09 2019-11-11 큐알엔에이, 인크. 프라탁신 (fxn)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 프라탁신 (fxn) 관련된 질환의 치료
MX365525B (es) 2011-09-06 2019-06-06 Curna Inc Compuestos que regulan la expresión de subunidades alfa de canales de sodio regulados por voltaje en enfermedades relacionadas con epilepsia mioclónica severa de la infancia.
HK1210211A1 (en) 2012-03-15 2016-04-15 科纳公司 Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
EP2849762A4 (en) * 2012-05-16 2016-02-24 Aadigen Llc MULTI-TARGET MODULATION FOR TREATING FIBROSIS AND INFLAMMATORY DISORDERS
KR102270700B1 (ko) * 2019-11-01 2021-06-30 한국과학기술연구원 폐 섬유증의 예방 또는 치료를 위한 올리고뉴클레오티드 중합체와 생체 적합성 양이온성 펩타이드로 이루어지는 폐 특이적 약물 전달체 및 이의 이용

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994025588A2 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Biognostik Gesellschaft für Biomolekulare Diagnostik mbH ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF IMMUNOSUPPRESSIVE EFFECTS OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β (TGF-β)
WO2000061595A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-19 Park Jong Gu The novel antisense-oligos with better stability and antisense effect

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US7892730B2 (en) * 2000-12-22 2011-02-22 Sagres Discovery, Inc. Compositions and methods for cancer
KR100397275B1 (ko) * 2001-03-08 2003-09-17 주식회사 웰진 단방향성 안티센스 ｃＤＮＡ 라이브러리 구축을 통한 신규대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994025588A2 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Biognostik Gesellschaft für Biomolekulare Diagnostik mbH ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF IMMUNOSUPPRESSIVE EFFECTS OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β (TGF-β)
WO2000061595A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-19 Park Jong Gu The novel antisense-oligos with better stability and antisense effect

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Curr Opin Mol Ther. 2000 Apr;2(2):162-7 *
Gene. 1994 Nov 4;149(1):25-9 *
J Biol Chem. 2000 Feb 18;275(7):4647-53 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1622994A (zh) 2005-06-01
US7420050B2 (en) 2008-09-02
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