KR101933621B1 - 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법 - Google Patents

소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법 Download PDF

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Abstract

양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 포함하는 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 시료 중 소포를 분리하는 방법을 이용하면, 생체 시료 내 비특이적 단백질의 흡착을 억제할 수 있고, 소포의 선택적 분리 및 분리 효율을 향상시킬 수 있으며, 소포, 그것의 단백질, 당단백질, 지질, 또는 핵산을 분석하는데 이용할 수 있다.

Description

소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법{Compositions and kits for isolating a vesicle, and methods for isolating the vesicle using the same}
소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법에 관한 것이다.
생체 내 마이크로베지클은 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 (ⅰ)엑소좀: 식균 기원의 직경 30 내지 100 ㎚의 막성 소포, (ⅱ)엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함): 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1000 ㎚의 큰 막성 소포, (ⅲ) 세포자살성 수포(apoptotic blebs): 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5000 ㎚의 소포를 포함한다.
그 중 엑소좀 (exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100nm일 수 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소포들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 엑소좀은 정상 상태, 병적 상태, 또는 이 두 상태하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다.
또한, 엑소좀은 마이크로 RNA (microRNA, miRNA)를 포함할 수 있다. miRNA는 그를 포함하는 세포 또는 개체의 상태를 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 상태는 질병, 예를 들면 암, 유전병, 심장병, 또는 정신분열과 같은 신경성 질환일 수 있다.
기존 마이크로베지클을 분리하는 방법은 마이크로베지클과 항체를 결합시켜 마이크로베지클을 면역-캡쳐하여 분리하는 방법이다. 이러한 방법은 단백질 구조 변화 등에 의한 항체 인식 부위의 마스킹(masking), 마이크로베지클 이질성(heterogeneity), 단백질 상호 작용 등에 의해 분리 또는 검출 타겟에 따라 편향(bias)이 발생할 수 있다. 분리 또는 검출을 위해 복잡한 프로세스나 고가의 장비가 필요할 수 있고, 시료의 소모량이 높을 수 있다.
따라서, 적은 양의 시료로부터 타겟에 비의존적으로 마이크로베지클을 효율적으로 분리하는 것이 필요하다.
소포를 분리하기 위한 조성물을 제공한다.
소포를 분리하기 위한 키트를 제공한다.
소포를 분리하는 방법을 제공한다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 포함하는 소포를 분리하기 위한 조성물이 제공된다.
양쪽성 이온(zwitterion, amphoteric ion 또는 ampholite ion)은 산성기와 염기성기를 가진 분자에서 양쪽의 기가 동시에 이온화 상태이며 음양(plus and minus) 두 전하를 갖고 있는 이온을 말한다. 양전하와 음전하가 균형을 이루고 있기 때문에 분자 전체로서의 전하는 0이지만, 큰 쌍극자 모멘토를 갖는다. 예를 들면, 양쪽성 이온은 하기의 식을 가질 수 있다.
Figure 112012079748114-pat00001
상기 식에서 A1 및 A2는 양전하 또는 음전하를 갖고 A1과 A2는 서로 반대되는 전하를 갖는 작용기일 수 있다. A1은 양전하를 갖는 작용기일 수 있고, A2는 음전하를 갖는 작용기일 수 있다. A1은 음전하를 갖는 작용기일 수 있고, A2는 양전하를 갖는 작용기일 수 있다. 예를 들면, 양전하를 갖는 작용기는 암모늄, 술포늄, 또는 포스포늄일 수 있다. 예를 들면, 음전하를 갖는 작용기는 카르복실산, 인산, 또는 포스폰산일 수 있다.
상기 식에서 R1은 지방족 탄화수소, 또는 고리모양 탄화수소일 수 있다. 지방족 탄화수소(aliphatic hydrocarbon)는 탄소 원자와 수소 원자만으로 구성하고 있는 화합물 중 탄소원자가 사슬모양으로 결합하고 있는 것을 말한다. 예를 들면, C1-8 알칸, C1 -8 알켄 또는 C1 -8 알킨일 수 있다. 예를 들면, 아크릴산의 중합체인 폴리아크릴산일 수 있다. 고리모양 탄화수소는 예를 들면 방향족 탄화수소(aromatic hydrocarbon)일 수 있다. 방향족 탄화수소는 고리모양의 탄화수소 중 벤젠고리 및 그의 유도체를 포함한 탄화수소의 계열을 말한다. 방향족 탄화수소는 예를 들면, C6-10의 방향족 탄화수소일 수 있다.
상기 식에서 R2는 예를 들면 아민, 카르복실 또는 히드록실 기일 수 있다.
상기 식에서 n은 1 내지 100일 수 있다. 예를 들면, n은 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5일 수 있다.
상기 식에서 m은 1 내지 100일 수 있다. 예를 들면, m은 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티는 예를 들면, 술포베타인(sulfobetaine; SB), 카르복시베타인(carboxybetaine), 포스포릴콜린(phosphorylcholine) 또는 이들의 조합일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머가 접합된 것일 수 있다. 상기 폴리머는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 폴리머는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리스티렌 또는 이들의 조합일 수 있다. 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머의 접합은 당업계에 알려진 방법으로 접합된 것일 수 있다. 예를 들면, EDC/NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) 가교를 통해 접합된 것일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 플레이트, 폴리스티렌 비드, 유리 비드, 셀룰로오스 비드 또는 이들의 조합일 수 있다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 포함하는 소포를 분리하기 위한 키트가 제공된다.
양쪽성 이온(zwitterion, amphoteric ion 또는 ampholite ion)은 산성기와 염기성기를 가진 분자에서 양쪽의 기가 동시에 이온화 상태이며 음양(plus and minus) 두 전하를 갖고 있는 이온을 말한다. 양전하와 음전하가 균형을 이루고 있기 때문에 분자 전체로서의 전하는 0이지만, 큰 쌍극자 모멘토를 갖는다. 예를 들면, 양쪽성 이온은 하기의 식을 가질 수 있다.
Figure 112012079748114-pat00002
상기 식에서 A1 및 A2는 양전하 또는 음전하를 갖고 A1과 A2는 서로 반대되는 전하를 갖는 작용기일 수 있다. A1은 양전하를 갖는 작용기일 수 있고, A2는 음전하를 갖는 작용기일 수 있다. A1은 음전하를 갖는 작용기일 수 있고, A2는 양전하를 갖는 작용기일 수 있다. 예를 들면, 양전하를 갖는 작용기는 암모늄, 술포늄, 또는 포스포늄일 수 있다. 예를 들면, 음전하를 갖는 작용기는 카르복실산, 인산, 또는 포스폰산일 수 있다.
상기 식에서 R1은 지방족 탄화수소, 또는 고리모양 탄화수소일 수 있다. 지방족 탄화수소(aliphatic hydrocarbon)는 탄소 원자와 수소 원자만으로 구성하고 있는 화합물 중 탄소원자가 사슬모양으로 결합하고 있는 것을 말한다. 예를 들면, C1-8 알칸, C1-8 알켄 또는 C1-8 알킨일 수 있다. 예를 들면, 아크릴산의 중합체인 폴리아크릴산일 수 있다. 고리모양 탄화수소는 예를 들면 방향족 탄화수소(aromatic hydrocarbon)일 수 있다. 방향족 탄화수소는 고리모양의 탄화수소 중 벤젠고리 및 그의 유도체를 포함한 탄화수소의 계열을 말한다. 방향족 탄화수소는 예를 들면, C6-10의 방향족 탄화수소일 수 있다.
상기 식에서 R2는 예를 들면 아민, 카르복실 또는 히드록실 기일 수 있다.
상기 식에서 n은 1 내지 100일 수 있다. 예를 들면, n은 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5일 수 있다.
상기 식에서 m은 1 내지 100일 수 있다. 예를 들면, m은 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티는 예를 들면, 술포베타인(sulfobetaine; SB), 카르복시베타인(carboxybetaine), 포스포릴콜린(phosphorylcholine) 또는 이들의 조합일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머가 접합된 것일 수 있다. 상기 폴리머는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 폴리머는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리스티렌 또는 이들의 조합일 수 있다. 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머의 접합은 당업계에 알려진 방법으로 접합된 것일 수 있다. 예를 들면, EDC/NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) 가교를 통해 접합된 것일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 플레이트, 폴리스티렌 비드, 유리 비드, 셀룰로오스 비드 또는 이들의 조합일 수 있다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 소포를 포함하는 시료와 인큐베이션 하여 상기 화합물을 소포에 결합시키는 단계; 및
반응 혼합물로부터 소포를 분리하는 단계를 포함하는 시료 중 소포를 분리하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 소포를 포함하는 시료와 인큐베이션 하여 상기 화합물을 소포에 결합시키는 단계를 포함한다.
양쪽성 이온(zwitterion, amphoteric ion 또는 ampholite ion)은 산성기와 염기성기를 가진 분자에서 양쪽의 기가 동시에 이온화 상태이며 음양(plus and minus) 두 전하를 갖고 있는 이온을 말한다. 양전하와 음전하가 균형을 이루고 있기 때문에 분자 전체로서의 전하는 0이지만, 큰 쌍극자 모멘토를 갖는다. 예를 들면, 양쪽성 이온은 하기의 식을 가질 수 있다.
Figure 112012079748114-pat00003
상기 식에서 A1 및 A2는 양전하 또는 음전하를 갖고 A1과 A2는 서로 반대되는 전하를 갖는 작용기일 수 있다. A1은 양전하를 갖는 작용기일 수 있고, A2는 음전하를 갖는 작용기일 수 있다. A1은 음전하를 갖는 작용기일 수 있고, A2는 양전하를 갖는 작용기일 수 있다. 예를 들면, 양전하를 갖는 작용기는 암모늄, 술포늄, 또는 포스포늄일 수 있다. 예를 들면, 음전하를 갖는 작용기는 카르복실산, 인산, 또는 포스폰산일 수 있다.
상기 식에서 R1은 지방족 탄화수소, 또는 고리모양 탄화수소일 수 있다. 지방족 탄화수소(aliphatic hydrocarbon)는 탄소 원자와 수소 원자만으로 구성하고 있는 화합물 중 탄소원자가 사슬모양으로 결합하고 있는 것을 말한다. 예를 들면, C1-8 알칸, C1 -8 알켄 또는 C1 -8 알킨일 수 있다. 예를 들면, 아크릴산의 중합체인 폴리아크릴산일 수 있다. 고리모양 탄화수소는 예를 들면 방향족 탄화수소(aromatic hydrocarbon)일 수 있다. 방향족 탄화수소는 고리모양의 탄화수소 중 벤젠고리 및 그의 유도체를 포함한 탄화수소의 계열을 말한다. 방향족 탄화수소는 예를 들면, C6-10의 방향족 탄화수소일 수 있다.
상기 식에서 R2는 예를 들면 아민, 카르복실 또는 히드록실 기일 수 있다.
상기 식에서 n은 1 내지 100일 수 있다. 예를 들면, n은 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5일 수 있다.
상기 식에서 m은 1 내지 100일 수 있다. 예를 들면, m은 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 40, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티는 예를 들면, 술포베타인(sulfobetaine; SB), 카르복시베타인(carboxybetaine), 포스포릴콜린(phosphorylcholine) 또는 이들의 조합일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머가 접합된 것일 수 있다. 상기 폴리머는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 폴리머는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리스티렌 또는 이들의 조합일 수 있다. 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머의 접합은 당업계에 알려진 방법으로 접합된 것일 수 있다. 예를 들면, EDC/NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) 가교를 통해 접합된 것일 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 플레이트, 폴리스티렌 비드, 유리 비드, 셀룰로오스 비드 또는 이들의 조합일 수 있다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
시료는 체액 또는 세포 배양액일 수 있다. 체액은 예를 들면, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합일 수 있다.
시료는 세포 또는 세포 잔해가 제거된 시료일 수 있다. 세포는 온전한 세포 또는 죽은 세포일 수 있다. 세포 또는 세포의 잔해를 제거하는 방법은 당업계에 알려진 방법일 수 있다. 예를 들면, 시료는 고체 지지체 또는 원심력을 이용한 분리, 밀도구배법, 초원심분리, 여과, 투석, 항체를 이용한 면역친화성컬럼, 자유유동전기이동법 또는 이들을 혼합한 방법을 수행하여 전처리된 것일 수 있다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 소포일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 소포일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상온에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 인큐베이션은 반응물을 혼합하면서 수행될 수 있다.
상기 방법은 반응 혼합물로부터 소포를 분리하는 단계를 포함한다.
분리하는 단계는 예를 들면, 반응 혼합물의 제거, 세척 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 분리하는 단계는 고체 지지체에 고정된 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물로부터 소포를 분리하는 것일 수 있다.
상기 방법은 분리된 소포를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 검출은 당업계에 알려진 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 소포를 염색하거나, 전자현미경으로 확인하거나, 또는 형광 물질이 접합된 리간드를 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 형광 물질이 형광 단백질(fluorescent protein)일 경우, 자외선을 조사하여 발생하는 형광광도를 형광광독계(fluorophotometer)를 사용하여 검출할 수 있다.
상기 방법은 분리된 소포를 용해시켜 소포로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 분리된 핵산을 증폭하여 소포의 핵산을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 소포의 용해는 예를 들면, 카오트로픽 염(chaotropic salt), 유기 용매 또는 계면 활성제를 포함하는 용매의 존재 하에 수행될 수 있다. 소포의 용해는 예를 들면, 가열, 교반, 회전, 볼텍싱 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 핵산(nucleic acid)은 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기와, 당 및 인산으로 이루어진 고분자 물질을 말한다. 핵산은 예를 들면, mRNA(messenger RNA) 또는 마이크로RNA(microRNA, miRNA)일 수 있다. 예를 들면, 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse-transcription polymerase chain reaction)으로 핵산을 증폭할 수 있다. 증폭된 핵산을 분석함으로써 소포의 핵산을 분석할 수 있다.
양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 포함하는 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 시료 중 소포를 분리하는 방법을 이용하면, 생체 시료 내 비특이적 단백질의 흡착을 억제할 수 있고, 소포의 선택적 분리 및 분리 효율을 향상시킬 수 있으며, 소포, 그것의 단백질, 당단백질, 지질, 또는 핵산을 분석하는데 이용할 수 있다.
도 1a는 단백질 G 비드 또는 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드와 인간 혈청의 친화도를 전기영동으로 확인한 결과를 보여준다(1; 단백질 G 비드, 2; 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드). 도 1b는 전기영동한 겔을 웨스턴 블로팅한 결과를 보여준다.
도 2는 마이크로베지클이 제거된 혈청과 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드의 친화도를 전기영동 및 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 보여준다(0: 비드에 술포베타인 모이어티를 포함하지 않는 것, 100: 비드에 100%(원래 사용량)의 술포베타인 모이어티가 포함 된 것).
도 3은 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드에 결합한 마이크로베지클을 SEM으로 관찰한 결과를 보여준다.
도 4는 혈청의 양에 따른 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드의 검출 한계 확인한 결과를 보여준다.
도 5는 양성 종양 환자의 혈청과 악성 종양 환자의 혈청으로부터 마이크로베지클의 분리한 결과를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드의 제조
1-1. 자성 비드 표면에 카르복실산을 갖는 폴리머 커플링
100 ㎕의 Dynabeads® M-270 Amine (Invitrogen)을 0.1 M MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), 0.5 M NaCl, pH 6.0의 완충용액 200 ㎕로 2회 세척한 다음, 100 ㎕의 완충용액에 재현탁하였다. 35% w/v 폴리아크릴산(Aldrich), 1/10 희석 용액 48 ㎕, 완충용액 340 ㎕를 섞은 다음, 비드에 가하고 잘 섞었다. 반응 혼합물에 75 mg/ml의 (증류수 중) EDC (3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide) 용액 54 ㎕, 75 mg/ml의 (증류수 중) NHS (N-hydroxysuccinimide) 용액 54 ㎕을 첨가하고 1 시간 동안 회전시켰다. 이후 400 ㎕의 완충용액으로 2회 세척한 다음, 400 ㎕의 완충용액에 재현탁시켰다.
1-2. 자성 비드 표면에 양쪽성 이온 모이어티를 이용한 표면 처리
실시예 1-1에서 준비된 비드 용액을 0.025 M MES, pH 6.0의 완충용액 400 ㎕로 2회 세척하였다.
75 mg/ml의 (0.025 M MES, pH 6.0 중) EDC 용액 54 ㎕, 75 mg/ml의 (0.025 M MES, pH 6.0 중) NHS (N-hydroxysuccinimide) 용액 54 ㎕, 완충용액 380 ㎕를 첨가하고 30분 동안 회전시켰다. 400 ㎕의 완충용액으로 2회 세척한 다음, 400 ㎕의 완충용액에 재현탁시켰다. 그 다음에, 100 ug/ul의 (증류수 중) 양쪽성 이온 모이어티를 첨가하고 2 시간 동안 회전시킨 다음, 400 ㎕의 완충용액으로 2회 세척하였다.
1-3. 합성된 비드의 분석
ToF-SIMS(Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)(Nano TOF TRIFT V, UlvacPHI, Kanagawa, Japan)를 이용하여 합성된 비드 내 황 원자의 함량을 확인하였다. 또한, 제타 전위 분석기(zeta potential analyzer)(Malvern Instruments, Malvern, U.K.)를 이용하여 합성된 비드의 표면 전하량을 측정하였다.
실시예 2. 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드와 인간 혈청의 친화도 측정
실시예 1-2에서 준비된 비드 30 ㎕에 300 ㎕의 인간 혈청(임상 시료)를 첨가하고 4 시간 동안 회전시켰다. 상층액을 제거하고 300 ㎕의 1x PBS로 1회 세척하였다. 그 후 300 ㎕의 1x PBS를 첨가하고 3 시간 동안 회전시킨 후, 상층액을 제거하고 300 ㎕의 1x PBS로 1회 세척하였다. 상층액을 제거하고 10 ㎕의 변성 용액(Invitrogen)를 첨가하였다. 100℃에서 10 분 동안 가열하여 비드에 결합한 단백질을 분리하였다.
분리된 단백질로 전기영동하고, 전기영동된 겔을 쿠마시 블루(Invitrogen)로 염색하여 비드와 단백질간의 비특이적 흡착을 확인였다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 단백질 G 비드(Invitrogen)는 비특이적 흡착이 매우 많으나, 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드는 비특이적 흡착이 적음을 확인하였다.
전기영동된 겔을 엑소좀의 마커로 알려진 인테그린 β, CD9, 및 플로틸린에 대한 항-인테그린 β 항체(Abcam), 항-CD9 항체(Novus Biological), 항-플로틸린 항체(BD Bioscience)으로 웨스턴 블로팅하였다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 단백질 G 비드로 분리한 경우에는 엑소좀의 마커가 전혀 검출되지 않았으나, 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드로 분리한 경우에는 인테그린 β, CD9, 플로틸린이 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드와 마이크로베지클을 제거한 혈청의 친화도 측정
실시예 2의 결과를 확인하기 위하여, 초원심분리(110,000 g) 방법으로 마이크로베지클을 제거한 혈청과 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드를 결합시켰다.
도 2에 나타난 바와 같이, 마이크로베지클을 제거한 혈청과 비드를 결합시킨 경우에는 인테그린 β 및 CD9이 검출되지 않았다. 따라서, 실시예 2에서 검출된 인테그린 β, CD9, 및 플로틸린은 마이크로베티클로부터 유래한 것임을 확인하였다.
실시예 4. 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드와 마이크로베지클간의 결합의 관찰
실시예 1에서 준비된 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드와 인간 혈청을 결합시켰다. 그 후 SEM(Scanning Electron Microscope)(S-5500, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 마이크로베지클을 직접 관찰하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드 위에 결합한 마이크로베지클을 관찰할 수 있었다.
실시예 5. 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드의 검출 한계 확인
인간 혈청의 양을 달리하여 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드의 검출 한계를 확인하였다. 100 ㎕, 200 ㎕, 및 300 ㎕의 혈청을 각각 100 ㎕의 비드와 결합시키고, 전기영동 및 웨스턴 블로팅하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 혈청의 양이 감소함에 따라 인테그린 β 및 CD9의 양도 선형으로 감소함을 확인하였다 (▨; 인테그린 β, ▧; CD9). 또한, 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드를 이용하면 100 ㎕의 매우 적은 양의 혈청에서도 마이크로베지클을 분리할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 양성 종양 환자의 혈청과 악성 종양 환자의 혈청으로부터 마이크 로베지클의 분리
술포베타인 모이어티를 포함하는 비드를 이용하여 양성 종양 또는 악성 종양을 갖는 환자의 혈청으로부터 마이크로베지클을 분리하였다. 그 후 전기영동 및 웨스턴 블로팅으로 인테그린 β, CD9, 및 플로틸린을 검출하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 나타나는 바와 같이, 술포베타인 모이어티를 포함하는 비드를 이용하여 실제 환자 샘플에서 엑소좀 검출을 통해 분자 진단에도 이용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있다.
실시예 7. 마이크로베지클로부터 핵산의 검출
악성 종양을 갖는 환자의 혈청과 술포베타인 비드를 결합시켜 마이크로베지클을 분리하였다. 분리된 마이크로베지클을 700mM NaCl을 포함하는 1X PBS 중 0.5% Triton X-100를 20 ㎕ 첨가하고 20분 동안 인큐베이션하여 용해시켰다. mercury LNA™ Universal RT microRNA PCR 키트(Exiqon)를 사용하여 용해된 마이크로베지클로부터 마이크로RNA(miRNA)를 검출하였다. 구체적으로 42℃에서 1 시간, 95℃에서 5 분 동안 역전사 반응을 시켰다. 또한, 95℃에서 10 분 동안 인큐베이션시킨 후, 95℃에서 10 초 및 60℃에서 1 분을 45 사이클 반복하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다.
miRNA Cp 값
miR-19b 27.92
miR-20a 29.19
miR-126 27.49
miR-24 28.55
miR-223 25.47
표 1에 나타난 바와 같이, 분리된 마이크로베지클로부터 5 종류의 miRNA를 검출하였다.

Claims (20)

  1. 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 포함하는 소포를 분리하기 위한 조성물로서,
    상기 양쪽성 이온 모이어티는 하기의 식을 갖고,
    Figure 112018080491139-pat00012

    상기 식에서 A1 및 A2는 양전하 또는 음전하를 갖고 A1과 A2는 서로 반대되는 전하를 갖는 작용기이고;
    R1은 지방족 탄화수소, 또는 방향족 탄화수소이고;
    R2는 아민, 카르복실, 또는 히드록실 작용기이고;
    n은 1 내지 100이고;
    m은 1 내지 100인 것인 조성물.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 양쪽성 이온 모이어티는 술포베타인(sulfobetaine; SB), 카르복시베타인(Carboxybetaine), 포스포릴콜린(phosphorylcholine) 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머가 접합된 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 고체 지지체에 고정된 것인 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 고체 지지체는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 플레이트, 폴리스티렌 비드, 유리 비드, 셀룰로오스 비드 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 조성물.
  8. 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 포함하는 소포를 분리하기 위한 키트로서,
    상기 양쪽성 이온 모이어티는 하기의 식을 갖고,
    Figure 112018080491139-pat00013

    상기 식에서 A1 및 A2는 양전하 또는 음전하를 갖고 A1과 A2는 서로 반대되는 전하를 갖는 작용기이고;
    R1은 지방족 탄화수소, 또는 방향족 탄화수소이고;
    R2는 아민, 카르복실, 또는 히드록실 작용기이고;
    n은 1 내지 100이고;
    m은 1 내지 100인 것인 키트.
  9. 삭제
  10. 청구항 8에 있어서, 양쪽성 이온 모이어티는 술포베타인(sulfobetaine; SB), 카르복시베타인(carboxybetaine), 포스포릴콜린(phosphorylcholine) 또는 이들의 조합인 것인 키트.
  11. 청구항 8에 있어서, 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 양쪽성 이온 모이어티와 폴리머가 접합된 것인 키트.
  12. 청구항 8에 있어서, 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 고체 지지체에 고정된 것인 키트.
  13. 청구항 12에 있어서, 고체 지지체는 자성 비드, 실리카 비드, 폴리스티렌 플레이트, 폴리스티렌 비드, 유리 비드, 셀룰로오스 비드 또는 이들의 조합인 것인 키트.
  14. 청구항 8에 있어서, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 키트.
  15. 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물을 소포를 포함하는 시료와 인큐베이션 하여 상기 화합물을 소포에 결합시키는 단계로서,
    상기 양쪽성 이온 모이어티는 하기의 식을 갖고,
    Figure 112018080491139-pat00014

    상기 식에서 A1 및 A2는 양전하 또는 음전하를 갖고 A1과 A2는 서로 반대되는 전하를 갖는 작용기이고;
    R1은 지방족 탄화수소, 또는 방향족 탄화수소이고;
    R2는 아민, 카르복실, 또는 히드록실 작용기이고;
    n은 1 내지 100이고;
    m은 1 내지 100인 것인 단계; 및
    반응 혼합물로부터 소포를 분리하는 단계를 포함하는 시료 중 소포를 분리하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 시료는 체액 또는 세포 배양액인 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 체액은 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합인 것인 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 시료는 세포 또는 세포 잔해가 제거된 것인 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, 양쪽성 이온 모이어티를 포함하는 화합물은 고체 지지체에 고정된 것인 방법.
  20. 청구항 15에 있어서, 분리된 소포를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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