KR101613964B1 - 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 글라이코매크로펩타이드는 물론 합성 N-아세틸뉴라민산에 비해서도 현저히 우수한 헬리코박터 파이로리 억제 활성을 나타낸다.

Description

글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for prevention or treatment of Helicobacter pylori infection comprising enzyme hydrolysate of glycomacropeptide as active ingredient}
글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
헬리코박터 파이로리는 1983년에 호주의 마샬(Marshall)과 워렌(Warren)에 의해 발견되었으며, 위염 및 위궤양 환자의 위점막 생검조식으로부터 그람음성의 만곡형 간균으로 관찰되어, B형 만성위염과 위십이지장 궤양을 유발시키며 위암발생의 일차적 결정요인으로 알려져 있다.
헬리코박터 파이로리는 요소 분해효소인 우레아제(urease)를 분비하여 위액내의 요소 1 분자를 가수분해하여 2분자의 암모니아를 형성한다. 우레아제가 인체 위장관 표피 세포에 헬리코박터 파이로리를 감염시키고, 군락형성(colonization)을 돕는 것에 대한 밀접한 관련성이 보고되어 있다.
상기 헬리코박터 파이로리의 활성을 저해하기 위해 항생제 요법이 사용될 수 있으나, 항생제의 부작용, 내성 균주의 출현, 재감염율을 예방할 수 없다는 등의 효율성이 떨어지는 문제가 있다.
본 발명의 목적은 독성이 없는 천연 재료로부터 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 독성이 없는 천연 재료로부터 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물에는, 단백질 100 중량부에 대하여 5 내지 80 중량부의 N-아세틸뉴라민산이 함유되어 있는 것이 바람직하다.
상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물에는, N-아세틸뉴라민산이 5 내지 50 중량% 함유되어 있는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 글라이코매크로펩타이드 또는 N-아세틸뉴라민산 보다 현저히 우수한 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료 활성이 있으므로, 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실험예 1에서 글라이코매크로펩타이드(GMP), 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(G-NANA), 순도 98%의 N-아세틸뉴라민산(S-NANA)의 N-아세틸뉴라민산 함량 분석을 위한 고속액체크로마토그래피의 크로마토그램이다.
도 2는 실험예 2에서 글라이코매크로펩타이드(GMP)와 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(G-NANA 또는 G-NANA7)의 항-헬리코박터 파이로리 활성을 비교하기 위한 실험으로, A는 G-NANA 농도 0.05 내지 2 중량% 혼합 배양시의 균수를 나타낸 그래프, B는 G-NANA와 G-NANA7을 각각 0.1 및 0.5 중량%로 혼합 배양시의 균수를 나타낸 그래프, C는 GMP 농도 0.05 내지 2 중량% 혼합 배양시의 균수를 나타낸 그래프, D는 GMP 농도 0.2 내지 8 중량% 혼합 배양시의 균수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 3에서 순도 98%의 N-아세틸뉴라민산(S-NANA)와 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(G-NANA)의 항-헬리코박터 파이로리 활성을 비교하기 위한 실험으로, A는 G-NANA를 H. pylori P1WT와 혼합 배양했을 때의 배양시간에 따른 620 nm 흡광도 그래프, B는 S-NANA를 H. pylori P1WT와 혼합 배양했을 때의 배양시간에 따른 620 nm 흡광도 그래프, C는 G-NANA를 H. pylori SS1과 혼합 배양했을 때의 배양시간에 따른 620 nm 흡광도 그래프, D는 S-NANA를 H. pylori SS1과 혼합 배양했을 때의 배양시간에 따른 620 nm 흡광도 그래프, E는 G-NANA를 H. pylori felis와 혼합 배양했을 때의 배양시간에 따른 620 nm 흡광도 그래프, F는 S-NANA를 H. pylori felis와 혼합 배양했을 때의 배양시간에 따른 620 nm 흡광도 그래프이다.
도 4는 실험예 4에서 H. pylori felis 경구 감염에 대한 G-NANA의 감염 예방 효과를 확인하는 그래프이다.
도 5는 실험예 4에서 H. pylori felis 경구 감염 후 G-NANA에 의한 감염 치료 효과를 확인하는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물은 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 유효성분으로 한다.
상기 글라이코매크로펩타이드는 카파 카제인의 친수성 부분으로, 이를 분리하는 방법은 산업적으로 잘 확립되어 있다. 예를 들어 치즈의 제조를 위해 우유로부터 카제인 분획을 분리하거나 또는 우유를 응유효소, 예를 들어 송아지 키모신("레닛")과 배양시킨다. 키모신은 상기 카파-카제인의 Phe(105)-Met(106) 펩타이드 결합을 매우 선택적으로 절단하므로, 상기 효소 반응에 의해 상기 카파-카제인의 친수성 글라이코매크로펩타이드 부분을 절단하며 이에 의해 상기 카제인 분획이 즉시 응집되고 침전된다. 이때 카파 카제인의 글라이코매크로펩타이드 부분이 잘라짐에 따라, 친수성 글라이코매크로펩타이드는 용액 중에서 다양한 유청 단백질들과 함께 남아 소위 치즈 또는 스위트 유장을 형성한다. 상기 치즈 또는 스위트 유장의 다른 유청단백질로부터 글라이코매크로펩타이드가 분리될 수 있다.
상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 글라이코매크로펩타이드로부터 N-아세틸뉴라민산을 분리하는 뉴라미니다아제에 의한 효소분해물이다. 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물의 제조방법은 글라이코매크로펩타이드 3 내지 10 중량% 함유하는 기질 용액에 글라이코매크로펩타이드 단위 g 당 0.05 내지 0.5 U의 뉴라미니다아제를 투입하여 pH 4 내지 6에서 35 내지 55 ℃에서2 내지 10 시간 반응시킨 후 효소를 실활시켜 효소분해물을 제조한다.
상기 글라이코매크로펩타이드를 뉴라미니다아제로 처리한 효소분해물에는 단백질 100 중량부에 대하여 5 내지 15 중량부의 N-아세틸뉴라민산이 함유되고, 상기 효소분해물 고형분 전체 중량을 기준으로 약 5 내지 8 중량%의 N-아세틸뉴라민산이 포함된다.
또한 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물에 존재하는 단백질에 대한 N-아세틸뉴라민산 비율을 증대시킬 경우, 농축 및 정제에 추가 비용이 소요되지만 항-헬리코박터 파이로리 활성은 더욱 증진될 수 있다. 따라서 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물에 존재하는 단백질 및 N-아세틸뉴라민산의 조성비를 단백질 100 중량부에 대하여 20 내지 80 중량부의 N-아세틸뉴라민산이 함유되도록, 원심분리를 통한 수불용성 물질의 제거 단계, 에탄올 침전에 의한 에탄올 용해성 물질의 제거 단계, 또는 이들 두 단계 모두를 수행할 수 있다. 예를 들면 상기 뉴라미니다아제 반응 후 효소를 실활시킨 효소분해물 반응액을 2500 rpm 이상, 바람직하게는 3000 내지 5000 rpm에서 10 내지 60 분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고, 원심분리 상등액에 70 중량% 이상, 바람직하게는 75 내지 95 중량% 에탄올 또는 메탄올 수용액을 혼합하여 침전시킨 침전물로부터 상기 단백질 및 N-아세틸뉴라민산 함량을 가지는 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 제조할 수 있다.
상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물에는, N-아세틸뉴라민산이 10 내지 50 중량%, 바람직하게는 20 내지 50 중량% 함유되어 있다.
상기 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 효소분해되지 않은 글라이코매크로펩타이드 자체보다 현저히 항-헬리코박터 파이로리 활성이 증가되고, 또한 N-아세틸뉴라민산의 함량이 3 배 이상되는 합성 N-아세틸뉴라민산에 비해서도 항-헬리코박터 파이로리 활성이 훨씬 뛰어나다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물이 헬리코박터 파이로리 감염의 예방 또는 치료 효과를 나타내는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 헬리코박터 파이로리 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
음료를 제조하는 경우 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 글라이코매크로펩타이드 효소분해물의 제조
치즈 유청으로부터 얻은 글라이코매크로펩타이드(이하, 'GMP'라고도 함)를 7 중량%가 되도록 물에 넣고 용해하였다. 상기 글라이코매크로펩타이드 용액에 뉴라미니다아제를 1 중량%가 되도록 첨가하고 40 ℃에서 5 시간 반응시킨 후, 95 ℃에서 30 분 동안 효소를 실활시켰다.
상기 효소를 실활시킨 반응액의 일부는 동결건조하여 실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(이하, 'G-NANA7'이라고도 함)을 제조하였다.
상기 효소를 실활시킨 반응액의 나머지는 25 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상등액에 에탄올을 80 중량%가 되도록 첨가하고 교반한 후, 다시 25 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 침전물을 농축 및 건조하여 실시예 2의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(이하, 'G-NANA'라고도 함)을 제조하였다.
실험예 1: 글라이코매크로펩타이드 N-아세틸뉴라민산 분석
시료는 100 mg을 분취하여 1차 증류수 10 ㎖에 용해하고, 30분동안 초음파 처리한 후 에탄올로 5 배 희석하고, 원심분리 후 여과하여 고속액체크로마토그래피로 N-아세틸뉴라민산의 함량을 분석하였다. 순도 98 중량%의 N-아세틸뉴라민산 표준품(이하, 'S-NANA'라고도 함)을 사용하여 농도에 따른 표준 곡선을 작성하였고, 각각 상기 글라이코매크로펩타이드크로펩타이드(GMP), 실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(G-NANA7) 및 실시예 2의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(G-NANA)의 N-아세틸뉴라민산 함량을 측정하였다.
글라이코매크로펩타이드(GMP)에는 약 7-8 중량%의 N-아세틸뉴라민산이 함유된 것으로 알려져 있으나, 효소분해되지 않은 GMP에는 N-아세틸뉴라민산이 검출되지 않았고, 실시예 1의 G-NANA7에는 7.1 중량% N-아세틸뉴라민산, 실시예 2의 G-NANA에는 32.4 중량%의 N-아세틸뉴라민산을 함유하고 있는 것을 알 수 있었다(도 1의 A, B 및 C 참조).
또한 식품공전에 기재된 킬달법으로 측정한 단백질 함량은 GMP에서 76.43 중량%, 실시예 1의 G-NANA7에서 65.6 중량%, 실시예 2의 G-NANA에서 57.05 중량% 이었다.
따라서 단백질 100 중량부에 대한 N-아세틸뉴라민산의 중량부는 GMP가 0 중량부, 실시예 1이 10.8 중량부, 실시예 2가 56.8 중량부이었다.
실험예 2: GMP, G-NANA 및 S-NANA의 항-헬리코박터 파이로리 활성 비교
1) 실험방법
H. pylori P1WT, SS1은 페트리 디쉬에 브루셀라 브로쓰를 멸균하고 60 ℃이하로 식힌 후 항생제 vancomycin 10㎍/㎖, trimethoprim 5㎍/㎖, nystatin 1㎍/㎖와 10% FBS를 첨가한 브로쓰를 8 ㎖ 넣고 배양된 헬리코박터 파이로리를 1㎖ 넣어 37℃, 10% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다.
H. pylori felis는 필터가 있는 75T 플라스크에 브루셀라 브로쓰에 10% FBS를 첨가한 브로쓰 30 ㎖을 넣고 헬리코박터 파이로리 1㎖를 넣어주고 anaerobic jar에 CO2 gaspak을 넣은 후 37℃, 150rpm 진탕 배양기에서 48 시간 배양하였다.
GMP, G-NANA, S-NANA는 생체 외(in vitro) 실험 시 브로쓰에 용해하고, 생체 내(in vivo)실험 시 PBS로 농도에 맞게 용해한 후, pH를 7로 맞춘 후 사용하였다.
상기 배양한 헬리코박터 파이로리를 3000rpm, 20min, 4℃ 원심분리 후 상층액 브로쓰를 제거하고 PBS로 H. pylori 펠릿을 풀어준 후 96 웰 플레이트에 100㎕ 넣어 분관광도계를 이용하여 OD 600 nm에서 0.6을 맞춘 후 사용하였다.
헬리코박터 파이로리 균수(CFU)는 각각의 물질을 농도별로 희석하여 6 웰 플레이트에 2㎖씩 넣고 OD 600nm를 0.6으로 맞춘 헬리코박터 파이로리를 50㎕씩 넣고 37℃, 10% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 상기 배양 후 OD 600 nm에서 흡광도를 측정하고, 브루셀라 아가에 Brucella Agar에 50㎕씩 넣어 접종한 후 37℃, 10% CO2 배양기에서 4~5일간 배양 후 콜로니를 계수하였다.
2) GMP 및 G-NANA의 항-헬리코박터 파이로리 활성 비교
H. pylori P1WT 균주를 0.05 중량%부터 2 중량%까지 농도별로 처리된 G-NANA와 함께 24 시간 배양한 후 고형 배지에 다양한 희석배율로 접종하고 콜로니를 확인하여 균수를 측정하여 도 2의 A에 나타내었다. G-NANA는 0.1 중량% 첨가시부터 104 이상의 헬리코박터 파이로리가 억제됨을 확인할 수 있었고, 0.5 중량%부터는 헬리코박터 파이로리가 생육하지 못하도록 살균 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
G-NANA와 실시예 1의 G-NANA7을 비교한 결과를 도 2의 B에 나타내었다. G-NANA7은 0.1 중량%에서는 헬리코박터 파이로리 억제 활성이 미미하였으나, 0.5 중량%에서는 104 이상의 헬리코박터 파이로리가 억제됨을 확인할 수 있었다. G-NANA는 G-NANA7에 비해서 단백질에 대한 N-아세틸뉴라민산 비율이 5 배 이상 증가된 것으로 비슷한 N-아세틸뉴라민산 함량을 기준으로 G-NANA 0.1 중량%와 G-NANA7 0.5 중량%를 비교하면 G-NANA에서 더 높은 항-헬리코박터 파이로리 활성을 나타내었다.
상기 G-NANA의 농도와 동일한 농도로 GMP를 각각 첨가하고 H. pylori P1WT 균주와 함께 24 시간 배양한 후 고형 배지에 다양한 희석배율로 접종하고 콜로니를 확인하여 균수를 측정하여 도 2의 C에 나타내었다. GMP는 2 중량%까지 첨가하더라도 헬리코박터 파이로리의 억제 효과가 거의 없었다.
G-NANA에 약 32.4 중량%의 N-아세틸뉴라민산이 존재하고, GMP에서는 약 7 중량%의 분리되지 않은 N-아세틸뉴라민산이 함유되어 있으므로, N-아세틸뉴라민산 함량 기준으로 유사한 농도가 되도록 GMP를 G-NANA 사용량의 4 배씩 첨가하여 헬리코박터 파이로리 억제 효과를 확인하여 도 2의 D에 나타내었다. GMP는 8 중량% 사용하였을 때 약간의 헬리코박터 파이로리 억제 활성을 나타내었으나 G-NANA의 2 중량%와 비교했을 때 106 이상 균수에서 차이가 발생하였다.
3) S-NANA 및 G-NANA의 항-헬리코박터 파이로리 활성 비교
H. pylori P1WT, SS1 및 felis 세 가지 균주를 0.05 중량%부터 10 중량%까지 농도별로 처리하여, S-NANA 또는 G-NANA와 함께 배양하면서 12 시간 및 24 시간째 배양액의 흡광도를 측정하여 항-헬리코박터 파이로리 활성을 평가하여 도 3에 나타내었다.
G-NANA(N-아세틸뉴라민산 함량 32 중량%) 및 S-NANA(N-아세틸뉴라민산 함량 98 중량%)는 모두 농도 의존적으로 세 가지 균주에 대한 항-헬리코박터 파이로리 활성을 나타내었다. 그러나 N-아세틸뉴라민산 함량이 1/3밖에 되지 않는 G-NANA가 합성한 S-NANA 보다 탁월한 항균능력을 보였다.
상기 결과로부터 G-NANA의 항-헬리코박터 활성의 일부는 G-NANA에 포함된 N-아세틸뉴라민산으로부터 유래한 것일 수 있으나, 글라이코매크로펩타이드로부터 뉴라미니다아제로 효소분해된 효소분해물로부터 유래하는 것이 클 것으로 추정되었다.
실험예 3: 동물모델에서의 G-NANA의 헬리코박터 파이로리 감염 예방 효과 및 치료 효과
1) 예방 효과
C57/BL6 마우스에 1일부터 7일까지 G-NANA를 계속 먹이고 1, 3, 5일째 G-NANA와 H. pylori felis를 함께 먹인 후 마지막으로 먹인 7일부터 1주일 후 위 조직을 부검하고, 위 조직에서 H. pylori felis의 DNA를 분리하여 real-time PCR로 H. pylori felis 잔존 여부를 확인하였다. 상기 real-time PCR에서 FlaB GAPDH 포워드 프라이머는 5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3', 리버스 프라이머는 5'-TATTATGGGGGTCTGGGATGG-3'를 사용하고, FlaB 포워드 프라이머는 5'-TTCGATTGGTCCTACAGGCTCAGA-3', 리버스 프라이머는 5'-TTCTTGTTGATGACATTGACCAACGCA-3'를 사용하였다.
G-NANA를 투여하지 않은 군(H.felis)과 비교했을 때 G-NANA 투여군(G-NANA)은 헬리코박터 파이로리 감염 예방 효과가 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
2) 치료 효과
C57/BL6 마우스를 일주일에 이틀 간격으로 5 ㅧ108/㎖의 H. pylori felis를 200㎕씩 경구투여 한 후 마지막 균을 투여한 다음날 각각 0, 0.1, 0.5 및 1 중량% 농도의 G-NANA를 10일 및 20일 동안 각각 투여하고, 위 조직을 부검하고, 위 조직에서 H. pylori felis의 DNA를 분리하여 real-time PCR로 H. pylori felis 잔존 여부를 확인하였다.
G-NANA 농도가 증가할수록, 또한 투여 일수가 증가할수록 그에 따라 위 조직에 잔존하는 H. felis의 량이 줄어들어 H. felia에 감염 된 후 투여된 G-NANA는 위에 잔존하고 있는 H. felis를 사멸시키는 치료 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5 참조).
아래에 본 발명의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하기 위한 것이다.
<제제예 1> 약학적 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캅셀제의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 100 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.
제조예2: 건강기능식품(분말형)의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎎
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제조예 3: 건강기능식품(음료형)의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제조예 4: 건강기능식품(츄잉검)의 제조
껌베이스 20 %
설탕 76.36~76.76 %
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 0.24~0.64 %
후르츠향 1 %
물 2 %
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.
제조예 5: 건강기능식품(밀가루 식품)의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제조예 6: 건강기능식품(유제품)의 제조
실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

Claims (4)

  1. 글라이코매크로펩타이드의 뉴라미니다아제 효소분해물을 유효성분으로 하고, 상기 효소분해물에는 킬달법으로 측정한 상기 효소분해물의 단백질 함량 100 중량부에 대하여 5 내지 80 중량부의 N-아세틸뉴라민산이 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 글라이코매크로펩타이드의 뉴라미니다아제 효소분해물을 유효성분으로 하고, 상기 효소분해물에는 킬달법으로 측정한 상기 효소분해물의 단백질 함량 100 중량부에 대하여 5 내지 80 중량부의 N-아세틸뉴라민산이 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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