KR100632851B1 - 전분화능 줄기세포의 분화를 억제하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의해 전분화능 줄기세포의 분화를 억제하면서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.

Description

전분화능 줄기세포의 분화를 억제하는 방법{Method for inhibiting differentiation of pluripotent stem cell}
도 1은 전분화능 줄기세포주(SnuhES3)에 분화를 유도(레티노산 처리, 리튬 처리, 또는 피더세포의 제거)한 후의 위상차 현미경 사진과 베타-카테닌의 면역세포염색사진이다.
도 2는 전분화능 줄기세포주(MizhES1) 에 레티노산을 처리한 뒤 4 일 후의 베타-카테닌, SSEA-4, 및 BrdU에 대한 면역 염색사진이다.
도 3은 전분화능 줄기세포주(SnuhES3)에 분화를 유도(레티노산 처리, 리튬 처리, 또는 피더세포의 제거)한 후에 전분화능의 표지자인 Oct-3/4와 Nanog의 전사 RNA의 발현 유무를 역전사 PCR로 확인한 결과이다.
도 4 는 전분화능 줄기세포주에 분화를 유도(레티노산을 10-6 M 처리, 리튬을 10 mM 처리)하고 4 일 후 Wnt 전사 RNA의 발현 유무 및 변화, Frizzled-4 전사 RNA의 발현 유무 및 변화를 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)로 확인한 결과이다.
도 5 는 전분화능 줄기세포주에 분화를 유도(레티노산을 10-6 M 처리, 리튬을 10 mM 처리)하고 4 일 후 세포 밖에서 Wnt의 기능을 차단하는 저해제(Wnt antagonist)인 sFRP-1, sFRP-2, WIF-1의 전사 RNA의 발현 유무 및 변화를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
본 발명은 Wnt/베타-카테닌 신호전달에 의하여 분화가 유도되는 세포의 분화를 억제하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의해 세포의 분화를 억제하는 방법에 관한 것이다.
1981 년 처음으로 생쥐의 배아 줄기세포가 시험관에서 배양이 가능해졌고, 1988 년에는 생쥐배아줄기세포의 시험관 배양 기술이 유전자 적중 기술과 융합, 최초로 유전자 적중 생쥐가 만들어지게 되었다. 유전자 적중 생쥐 기술은 이후 유전자의 기능 연구 및 인간의 질환 모델을 수립하는 데에 없어서는 안 될 중요한 기술로서 생명과학/의학의 발달에 견인차 역할을 해왔다(Smith AG, Annu Rev Cell Dev Biol 17:435-62, 2001). 인간 배아 줄기세포의 시험관 배양이 가능해진 것은 생쥐에 비하여 17 년이나 늦은 1998 년으로, 위스콘신대학의 톰슨박사가 인간 배아줄기세포주를 처음으로 수립하였다(Thomson JA, Science 282(5391): 1145-7, 1998). 생쥐 배아 줄기세포에 비하여 인간 배아 줄기세포는 시험관 배양이 더욱 어렵고 조작이 불편하여 세포를 대량 배양하여 유전자 조작 혹은 시험관 조작하여 세포 치료제로 이용하는 데에 많은 기술적 어려움을 안고 있다.
현재 전분화능 줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 대량 배양이 가능하고 원하는 세포로 분화를 조절할 수 있는 기술력의 수립이 매우 절실하다. 전 분화능 줄기세포의 대량 배양을 위해서는 분화를 완전히 억제하여 분화로 인하여 전분화능을 잃어버리는 세포가 없어야 한다.
배아줄기세포의 전분화능을 유지하는 데에 가장 중요한 것으로 알려진 전사인자로는 Oct-3/4와 Nanog가 있다. 이 중 Nanog는 2003 년 5 월에야 유전자가 클로닝되었다(Chambers I et al, Cell 113(5):643-55, 2003, Mitsui K et al, Cell 113(5): 631-42, 2003). Oct-3/4와 Nanog가 전분화능을 유지하는 기전에 관해서는 아직 연구가 더욱 필요하고 전분화능 유지의 기전은 이제 그 연구가 시작 단계에 있다.
전분화능 줄기세포 배양 조건에서 전분화능 유지를 위해 외부에서 제공해 줄 수 있는 인자로는 LIF(Leukemia inhibitory factor)와 BMP(Bone morphogenic factor) 등이 알려져 있으나 이들은 생쥐의 경우이고 인간 배아줄기세포에서는 효과가 없거나(LIF) 보고가 없다(BMP)(Ying QL et al, Cell 115: 281-92, 2003).
최근 BIO(6-bromoindirubins)라는 약물에 의하여 Wnt 신호 전달을 강제적으로 유발한 결과 Oct-3/4의 발현이 유지된다는 보고가 2004 년 1 월에 있었다(Sato N et al, Nature Medicine 10(1): 55-63). 그러나 이들의 실험 과정을 엄밀히 살펴보면, BIO 처리 시간에 대한 언급이 없고, 실험의 정황으로 미루어 처리 2-5 일의 결과로 이해된다. 그러나 실제 전분화능 줄기세포의 자연 분화 유도의 한 방법인 배상체(Embryoid body) 형성 5 일 후 까지도 Oct-3/4의 발현이 유지되는 것으로 보고 되고 있어 2-5 일의 처리 후 Oct-3/4를 잃지 않는 것으로 전분화능 유지를 주장하는 데에는 무리가 있다. 몇 계대에 걸쳐 BIO를 처리하면서 세포의 전분화능이 유 지되는 것을 입증하지 않고는 BIO에 의한 Wnt 신호 전달이 세포의 분화를 억제할 수 있다는 결론을 내릴 수 없다. 같은 보고에서 Wnt 신호 전달을 유발하는 다른 약물인 리튬의 경우 다른 결과를 보이는 것은 이 약물의 효력이 정확히 Wnt 신호 전달에 의한 것인지 혹은 다른 작용에 의한 것인지에 대한 증거를 요구한다. 또한 같은 보고에 따르면, BIO처리 후 (2-5 일) 배아 세포가 외배엽, 중배엽, 내배엽의 모든 세포로 분화하는 것으로 보아 전분화능을 유지한다고 주장하고 있으나 역시 짧은 처리 시간으로 이를 전분화능이 유지된 것이라 결론 내리기에는 무리가 있다.
Wnt 신호 전달을 유발하는 최초 물질인 Wnt는 분비성 당단백질로 19 종류가 알려져 있다. 이들 Wnt 단백질은 세포표면의 Firizzled 라는 수용체에 결합하면서 신호 전달을 개시한다. Frizzled는 약 700 여 개의 아미노산으로 구성되며 Wnt와 결합하는 부분인 CRD(cysteine-rich domain)가 세포 밖에 위치하고 7 개의 단백질 도메인(7 TM domain)이 세포막을 관통하여 위치한다. 세포 밖으로 분비되는 Frizzled가 밝혀졌는데 이들은 Frizzled의 단백질 서열 중 Wnt와 결합하는 CRD 만을 가지고 있고 TM domain은 가지고 있지 않다. 이들을 sFRP(secreted Frizzled-related protein)라고 부르며, Wnt와 결합하여 Wnt의 신호전달을 차단하는 역할을 한다. Frizzled나 sFRP 외에도 CRD 부위를 가지고 있는 다른 단백질로는 콜라겐 18(XVIII)(Rhen M and Pihlajaniemi T, J Biol Chem 270(9): 4705-11, 1995), 엔도스타틴(Hanai J et al, J Cell Biol 156(3): 529-39, 2002), 카르복시펩티다아제 Z(Song L and Fricker LD, J Biol Chem 272(16): 10543-50, 1997), 수용체 티로신 키나아제(Xu YK, Nusse R, Curr Biol 8(12): R405-6, 1998, Masiakowski, P and Yancopoulos GD, 8(12): R407, 1998), 막관통 효소 Corin(Yan W et al, J Biol Chem 274(21): 14926-35, 1999)이 있으며, 이들도 Wnt와 결합하며 이 때 Wnt/베타-카테닌 신호 전달이 억제된다고 알려져 있다. 이외에도 WIF-1(Hsieh JC et al, Nature 398(6726): 431-6, 1999), Cerberus(Picolo et al, Nature 397:707-10), Dickkopf-1(Tian et al, N Engl J Med: 349(26): 2483-94, 2003) 등도 세포 밖에서 Wnt 신호 전달을 차단하는 역할을 한다고 보고 되었다. 이들은 세포 밖에서 Wnt와 결합함으로서 세포막의 Frizzled에 Wnt가 결합하는 것을 저해하여 Wnt 신호 전달을 차단하게 된다.
Wnt가 Frizzled와 결합하면 세포 내의 GSK(glycogen synthase kinase-3)라는 효소가 불활성화(인산화) 되는데, 결과적으로 불활성화된 GSK-3는 더 이상 베타-카테닌을 분해시킬 수 없게 되어 세포질 내에 베타-카테닌이 축적된다. 축적된 베타-카테닌은 핵 내로 이동하여 Lef/TCF라는 전사인자와 함께 여러 가지 유전자의 전사를 유도하는데 이 과정을 Wnt/베타-카테닌 신호 전달이라 부른다. 따라서 Wnt/베타-카테닌 신호 전달의 가장 유용한 표지자는 핵내에서 발견되는 베타-카테닌의 존재이다. Wnt/베타-카테닌 신호 전달은 Wnt 외에도 리튬, 레티노산, BIO(6-bromoindirubins)라는 약물 등으로도 유발할 수 있는데, 이들 약물이 GSK-3를 직접 불활성화시키기 때문이다.
배아 줄기세포에서 Wnt/베타-카테닌 신호 전달의 효과가 보고된 바로는, 생쥐 배아 줄기세포의 신경 분화 유도(Lyu J et al, J Biol Chem 278(15): 13487-95, 2003)와 오히려 신경 분화를 억제하므로 Wnt 신호 전달을 차단해야 신경 분화가 유 도(Ying QL et al, Nat Biotechnol 21(2): 183-6, 2003)된다는 서로 엇갈린 보고가 있다. Wnt/베타-카테닌 신호 전달은 이외에도 발생/분화/줄기세포와 관련해서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 조직의 종류, 세포의 분화 정도에 따라 분화를 촉진하기도 억제하기도 하는 것으로 알려져 있다. 조혈조직 줄기세포의 미분화 상태 유지(Eaves CJ, Nat Immunol 4(6): 511-2, 2003), 위장관 상피 줄기세포의 분열(Kuhnert F et al, PNASU 101(1): 266-71, 2004), 신경 줄기세포의 분화 유도(Muroyama Y etal, Biochem Biophys Res Commun, 313(4): 915-21, 2004), 근조직의 분화(Polesskaya A et al, Cell 113(7): 841-52, 2003) 및 재생(Seale P et al, Cell Cycle 2(5): 418-9, 2003), 모낭의 분화(Alonso L and Fuchs E, Genes Dev 17(10): 1189-200, 2003), 렌즈상피세포의 분화 유도(Ryu et al, 대한생화학회지 겨울학회 초록, 2003) 등이 보고 되었고, 배발생 과정의 몸축(body axis)의 형성 과정에서 등(Dorso)보다는 배(Ventral)의 형성을 유도하는 것으로 보고되고 있다(Kofron M et al, Dev Biol 237(1): 183-210, 2001).
그러나, 상기와 같이 많은 연구가 활발히 이루어지고 있으나 현재까지 세포의 분화를 억제함으로써 전분화능을 유지하면서 줄기세포를 배양하는 방법에 대한 연구 보고가 없는 상태이다. 이에 본 발명자들은 Wnt/베타-카테닌 신호전달계와 전분화능 줄기세포의 분화에 대하여 연구한 결과, 놀랍게도 그 관계를 규명함으로써 전분화능을 유지하면서 세포를 배양하는 방법을 도출할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 전분화능 줄기세포의 분화를 억제하는 방법을 제 공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전분화능을 유지하면서, 이후 필요한 경우의 세포 분화에는 영향을 미치지 않아 세포 치료제로서 이용이 가능한 새로운 배아 줄기세포의 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 전분화능 줄기세포 이외에 Wnt/베타-카테닌 신호 전달에 의하여 분화되는 세포를 세포분화를 억제하면서 배양 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 전분화능 줄기세포의 Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의해 세포의 분화를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의해 전분화능 줄기세포의 분화를 억제하면서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 전분화능 줄기세포는 대부분 배아로부터 유래되며, 성인으로부터 유래될 수도 있다.
상기 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하는 방법으로는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위하여, 전분화능 줄기세포의 배양액에 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질을 첨가할 수 있다. 또는, 세포 배양액에 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질의 유전자를 이입한 세포의 배양액을 세포 배양액에 혼합할 수도 있다. 또 다른 방법으로는, 세포 배양액에 Wnt/베타-카테닌 신 호전달 억제물질을 생산하는 세포의 배양액을 세포 배양액에 혼합하는 방법이 있다. 또한, Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질의 유전자를 이입한 세포를 세포 배양의 피더세포로 이용할 수도 있다. 또한, Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질을 생산하는 세포를 세포 배양의 피더세포로 이용할 수도 있다. 또한, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질의 유전자를 배양될 세포에 이입할 수도 있다. 그 이외에도, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질을 세포의 배양용기, 배양구슬, 지지체, 또는 이들의 조합에 코팅할 수도 있다.
상기 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질의 예로는 sFRP, 콜라겐XⅧ, 엔도스타틴, 카르복시펩티다아제 Z, 수용체 티로신 키나제, 막관통 효소 Corin, WIF-1, 세레부스(Cerebus), Dickkopf-1, 또는 이들의 조합이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하는 방법 또는 이를 이용한 세포의 배양방법은 전분화능 줄기 세포 이외에도 Wnt/베타-카테닌 신호전달에 의해 분화되는 세포에도 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다.
본 발명에서 제공하는 전분화능 줄기 세포의 분화를 억제하는 방법은 Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의한다. 이러한 억제방법을 적용함으로써, 세포분화의 억제에 의해 전분화능을 유지하면서 줄기세포를 배양할 수 있다.
Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제는 본 발명에서 제공하는 세포의 분화를 억 제하는 방법의 핵심 수단이며, 본 발명자는 여러 실험결과를 토대로 Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의해 분화를 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 활성시켰을 경우와 그렇지 않았을 경우의 세포의 분화 여부를 관찰하였다.
줄기세포의 분화 상태에서 Wnt/베타-카테닌 신호 전달의 활성은 베타-카테닌의 핵 내 발현으로 확인하였다. Wnt/베타-카테닌 신호 전달이 활성되어 있지 않을 경우에는, 인간 배아 줄기세포는 베타-카테닌을 세포막에 가지고 있는 반면(Wnt/베타-카테닌 신호 전달 불활성화), Wnt/베타-카테닌 신호 전달이 활성화 되어 있는 경우에는, 베타-카테닌이 핵 내로 이동한다.
한편, 줄기세포의 분화 여부는 SSEA-4, BrdU, Oct-3/4, Nanog의 발현 여부로 확인하였다. 줄기세포가 분화될 경우에는 SSEA-4가 소실되고, BrdU가 현저히 감소하고, Oct-3/4 및 Nanog가 소실된다.
본 발명자들이 줄기세포 배양 시 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 촉진시키기 위해 리튬(LiCl)으로 처리한 결과, 줄기세포에서 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 입증하는 베타-카테닌의 핵 내에서의 존재가 관찰되었으며, 동시에 SSEA-4가 소실되고, BrdU가 현저히 감소하고, Oct-3/4 및 Nanog가 소실되었다. 이 때 Wnt 신호 전달 억제 인자인 sFRP-1, sFRP-2 및 WIF-1의 mRNA 발현이 완전히 억제되었다. 또한, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 촉진시키지 않은 대조군의 경우에는 상기와 같은 분화의 증거가 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 Wnt/베타-카테닌 신호전달 촉진에 의해 줄기세포의 분화가 이루어짐이 입증되었으며, 이로부터 Wnt/베타-카테닌 신호 전달을 억제함으로써 줄기세포의 분화를 억제하면서 배양할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 본 발명자들이 줄기세포 배양 시 가장 보편적인 분화 유도 인자로 알려진 레티노산(all-trans-retinoic acid)을 가하거나 피더세포를 제거한 결과, SSEA-4가 소실되고, BrdU가 현저히 감소하고, Oct-3/4 및 Nanog가 소실됨으로서 분화 유도를 확인하였고, 이 때 또한 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 입증하는 베타-카테닌의 핵 내에서의 존재도 관찰할 수 있었다. 이 때 역시 Wnt 신호 전달 억제 인자인 sFRP-1, sFRP-2 및 WIF-1의 mRNA 발현이 완전히 억제되었다. 또한, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 촉진시키지 않은 대조군의 경우에는 상기와 같은 분화의 증거가 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터 Wnt/베타-카테닌 신호전달에 세포 분화가 줄기세포 분화의 보편적인 현상임을 확인하였으며, 이로부터 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제함으로써 줄기세포의 분화를 억제하면서 배양할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이하, 본 발명을 실험예를 들어 보다 상세하게 설명하고자 한다. 이 실험예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
실험예 1: 세포 배양 및 분화 유도
인간 배아 줄기세포(SnuhES3-63 계대, 서울대학병원 산부인과, MizhES1-163 계대, 미즈메디 병원)를 분양 받은 후 19 계대에서 실험을 수행하였다. 매 5 계대 마다 미분화 표지자인 SSEA-4, 알칼린 포스파타제의 발현, Oct-3/4의 발현을 확인하여 세포의 미분화 상태의 성질이 변하지 않음을 확인하였다. 방사선을 조사하여 성장이 억제된 생쥐 배아섬유아세포인 STO 세포주(ATCC, CRL-1503)를 먼저 배양 접시에 접종하고(피더 세포), 하루 지난 후 상기 인간 배아 줄기세포 덩어리를 피더 세포 위에 접종하였다.
세포 분화 유도는 인간 배아 세포가 자리를 잡고 콜로니를 형성하기 시작하는 접종 3 일후부터 시행하였다. 레티노산 처리, 리튬 처리, 또는 피더세포의 제거에 의해 분화를 유도하였다.
레티노산(all-trans-retinoic acid)의 경우 DMSO 용액에 녹여 두 가지의 농도, 즉 각각 최종농도가 10-6 M 와 10-7이 되도록 배지에 혼합하였고 이 후 4 일 동안 매일 처리하였다.
리튬은 물에 녹이고 최종 농도가 10 mM이 되도록 배지에 혼합하여 단 회 처리 후 더 이상 처리하지 않으며 4 일 동안 매일 신선한 배지로 배지 교환을 시행하였다.
피더 제거에 의하여 분화를 유도하는 경우에는 접종 후 3 일째부터 피더 세포를 마이크로 피펫을 이용하여 거의 완전히 제거하였다.
상기와 같은 분화 유도군의 경우에는 실험이 진행되는 동안 배지 교환은 매일 시행하였다.
대조군은 7 일 동안 배지 교환을 매일 시행하면서 아무런 처리도 하지 않았다.
실험예 2: 면역염색(Immunostaining)
실험예 1에서 얻어진 각각의 대조군과 분화 유도군(레티노산 처리군, 리튬 처리군, 피더세포 제거군)의 인간 배아 줄기세포를 실험이 종결되는 7 일 째에 포 르말린 4 % 용액으로 실온에서 30 분 간 고정시켰다.
Wnt/베타-카테닌 신호 전달 활성을 확인하기 위하여 고정된 세포를 베타-카테닌 항체로 염색하였다(도 1, 2, 발명의 효과 1 참조).
또한, 미분화 상태를 잘 유지하는지 확인하기 위하여 고정된 세포를 미분화 세포 표지자인 SSEA-4 항체로 염색하였고(도 2, 발명의 효과 1 참조), 세포 분열능력을 확인하기 위하여 고정된 세포를 BrdU 항체로 염색하였다(도 2, 발명의 효과 1 참조).
항체는 베타-카테닌(Chemicon), SSEA-4 (Davor Solter), BrdU(Roche)에 대한 마우스 모노클론 항체를 사용하였다. 초기화 항체로 냉장 상태에서 밤새 반응시킨 후에 표준 염색용 ABC 키트(Vector Laboratories)를 이용하여 염색하였다.
실험예 3: Oct-3/4, Nanog, Wnts, Frizzled, sFRP, WIF-1의 전사 RNA 발현 확인을 위한 역전사 중합효소 연쇄반응 시행
실험예 1에서의 각각의 실험군으로부터 인간 배아 줄기세포를 떼어낸 후 인산완충용액으로 먼저 세척하고 원심분리기에서 3,000 rpm으로 5 분간 원심 분리한 후 상등액은 버리고 세포 덩어리를 RNeasy kit (Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 약 500 ng의 RNA를 랜덤 헥사머(random hexamer)를 프라이머로 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 시행하기 위하여 수퍼스크립트 2(superscript II first-strand synthesis system for RT-PCR)(Invitrogen, Rockville, MD)을 이용하였다. 만들어진 cDNA 100-200 ng을 센스 프라이머와 안티센스 프라이머, 퍼펙트 프리믹스(Perfect Premix, Takara), 물을 혼합하여 30-40 회의 PCR 증폭을 시행하 였다. PCR 산물 5-10 ㎕를 1.2 - 2 % 아가로오스겔 상에서 전기 영동하여 결과를 분석하였다(도 3, 4, 5, 발명의 효과 1, 3 참조).
1. 세포 분화율
전분화능 줄기세포주(SnuhES3)에 분화를 유도(레티노산 처리, 리튬 처리, 또는 피더세포의 제거)한 후 전분화능의 표지자인 Oct-3/4와 Nanog 의 전사 RNA의 발현 유무를 역전사 PCR(RT-PCR)로 확인한 결과 Oct-3/4, Nanog가 소실되었음을 확인하였다. cDNA 양은 조건에 관계없이 발현양이 일정한 GAPDH 양에 맞추었다. 대조군에 비하여 분화를 유도시킨 군 모두에서 Oct-3/4와 Nanog의 발현이 소실되었다(도 3).
전분화능 줄기세포주에 분화를 유도한 경우에 위상차 현미경으로 세포를 관찰한 결과, 대조군에서는 핵의 세포질에 대한 비율이 높고 조밀한 모양을 나타내어 미분화 상태 세포 특유의 모양을 나타냈는데 비하여, 레티노산 처리군, 리튬 처리군, 피더세포 제거군의 세포는 핵이 덜 조밀하고 세포질이 커진 전형적인 분화 세포의 특징을 나타내었다(도 1).
전분화능 줄기세포주(MizhES1)에 레티노산을 10-7 M과 10-6 M로 처리하고 4 일 후 관찰한 결과, 미분화 상태의 세포 표지자인 SSEA-4는 대조군인 미분화 전분화능 줄기세포주 콜로니 전체에서 발현되는 데에 비하여 레티노산 농도 10-7 M 처리군에서는 부분적으로, 레티노산 농도 10-6 M 처리군에서는 전혀 발현하지 않는 것으로 나타났다(도 2).
대조군인 미분화 상태의 전분화능 줄기세포주 콜로니 내에서는 거의 모든 세포가 BrdU를 발현하는 데에 비하여, 레티노산 처리군에서는 농도에 따라 10-7 M에서는 분화가 콜로니 내에서 부분적으로 진행됨에 따라 BrdU 발현도 같은 양상을 띄어 BrdU 양성인 세포 비율이 높은 영역과 낮은 영역이 혼재되어 있는 반면, 레티노산 농도 10-6 M에서는 분화가 콜로니 전체에서 고르게 진행됨에 따라 BrdU 발현도 전체적으로 BrdU 양성인 세포 비율이 낮은 세포들로 이루어져 있다. 이는 레티노산 처리에 의하여 세포 분화가 진행될 때 세포 분열능력이 저하됨을 보여주는 예이다.
2. Wnt/베타-카테닌 신호 전달의 활성화
전분화능 줄기세포주에 분화를 유도(레티노산 처리, 리튬 처리, 또는 피더세포의 제거)한 후, 미분화 상태에서 베타-카테닌(갈색 부위)은 세포막 부위에 세포와 세포간의 경계를 그어 놓은 것처럼 관찰되는 데에 비하여 분화 유도 후에는 세포 핵 부위로 이동한 것을 관찰할 수 있다(도 1, 2).
레티노산 농도에 따라 10-7 M에서는 분화가 콜로니 내에서 부분적으로 진행됨에 따라 베타-카테닌의 핵 내 이동도 같은 양상을 띄어 부분적으로 관찰되는 반면, 레티노산 농도 10-6 M에서는 분화가 콜로니 전체에서 고르게 진행됨에 따라 베타-카테닌의 핵 내 이동도 같은 양상을 띄어 전체적으로 관찰되었다. 이는 세포 분화가 진행될 때 Wnt/베타-카테닌 신호 전달의 활성화가 같이 일어남을 보여주는 예이다.
3. 분화에 따른 Wnts, Wnt 저해제, 및 Frizzled 수용체 발현의 변화
전분화능 줄기세포주에 분화가 진행됨에 따라 Wnts의 발현은 다양하게 변화하였다(도 4). 분화 유도 후 발현이 증가한 Wnts (Wnt-1, 2)와 분화 유도 후 발현이 감소한 Wnts (Wnt-3, 3a, 5a, 5b)가 관찰되었다.
세포 밖에서 Wnt의 기능을 차단하는 Wnt 저해제(Wnt antagonist)인 sFRP-1, sFRP-2와 WIF-1는 미분화 상태에서 매우 많이 발현되다가 분화가 유도되면서 발현이 완전히 억제되었다(도 5).
Wnt 수용체인 Frizzled-4 전사 RNA도 미분화 상태에서는 발현되지 않다가 분화 유도 되면서 발현이 유도되었다(도 4 (가)).
따라서 전분화능 줄기세포는 Wnt 수용체의 발현 유도 혹은 Wnt 저해제의 발현 억제를 통하여 Wnt/베타-카테닌 신호를 활성화하여 세포 분화를 유도하는 것으로 사료된다.

Claims (13)

  1. Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의해 세포의 분화를 억제하는 방법.
  2. Wnt/베타-카테닌 신호전달의 억제에 의해 세포의 분화를 억제하면서 세포를 배양하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 전분화능 줄기세포인 것을 특 징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 전분화능 줄기세포는 배아로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 전분화능 줄기세포는 성인으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 세포 배양액에 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 세포 배양액에 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질의 유전자를 이입한 세포의 배양액을 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 2 항에 있어서, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 세포 배양액에 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질을 생산하는 세포의 배양액을 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 2 항에 있어서, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 Wnt/베타-카 테닌 신호전달 억제물질의 유전자를 이입한 세포를 세포 배양의 피더세포로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 2 항에 있어서, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질을 생산하는 세포를 세포 배양의 피더세포로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질의 유전자를 배양될 세포에 이입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 2 항에 있어서, Wnt/베타-카테닌 신호전달을 억제하기 위해 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질을 세포의 배양용기, 배양구슬, 지지체, 또는 이들의 조합에 코팅하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt/베타-카테닌 신호전달 억제물질은 sFRP, 콜라겐XⅧ, 엔도스타틴, 카르복시펩티다아제 Z, 수용체 티로신 키나제, 막관통 효소 Corin, WIF-1, 세레부스(Cerebus), Dickkopf-1, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
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