JPH085635A

JPH085635A - 免疫学的検出方法

Info

Publication number: JPH085635A
Application number: JP16331794A
Authority: JP
Inventors: Hirokazu Suzuki; 宏和鈴木; Yoshitami Ohashi; 良民大橋; Ritsuko Mochida; 立子持田; Masahiko Wakasugi; 昌彦若杉; Makoto Maeda; 孚前田
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 1996-01-12

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】被検体中に存在する複数の免疫学的に対応する
物質を同時に検出する方法を提供する。【構成】検出目的に適う少なくとも２種類以上の色調の
異なる着色ラテックス粒子を、あらかじめ少なくとも２
種類以上の免疫学的に反応する能力のある物質に各々標
識せしめ、一方、同一支持体上の異なる位置に少なくと
も２種類以上からなる免疫学的に反応する能力のある物
質をあらかじめ固相化し、ついで２種類以上からなる標
識着色ラテックス粒子の混合物と被検液中の未知の少な
くとも１種類以上の免疫学的物質と反応せしめ、ついで
免疫学的に形成させた複合体−着色ラテックス粒子の混
合物を被検液を媒体として展開・移動せしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫学的に異なる検出目
的に適う少なくとも２種類以上の物質を同一支持体上で
各々別々の位置で検出する手段を提供することによっ
て、広範囲の産業上の利用分野に応用が可能である。医
療用分野にあっては、体外診断薬を中心として、例えば
特定の疾患に対する複数の関連マーカーを検出すること
によって、より信頼性の高い診断を、また、複数の疾患
に対する複数のマーカーを用いることによって、未知の
疾患の診断予測が可能である。

【０００２】食品分野にあっては、汚染微生物の特定や
有害物質の検出にも応用が可能である。一方、環境分野
にあっては、環境汚染源が免疫学的な反応に関与しうる
物質もしくは生物体の一部を構成し免疫学的な反応を応
用しうる物質であれば、それらの物質を特定することも
可能である。

【０００３】

【従来の技術】従来、微粒子を用いたイムノクロマトグ
ラフ法にはコロイド状金属粒子、コロイド状金属酸化物
粒子、さらにはコロイド状非金属粒子が標識粒子として
広く用いられており、特開昭６４−３２１６９に記載さ
れているごとくすでに公知である。

【０００４】また、近年、合成高分子化学分野の発展と
共に染色された合成高分子ラテックス粒子の技術開発に
はめざましいものがあり、この微粒子を用いるイムノク
ロマトグラフ法も開発され、特開平５−１０９５０に記
載されているごとくすでに公知の方法である。

【０００５】本法を利用した製品には妊娠診断薬（クリ
アブル−ワンステップ（登録商標）ユニパス社製、プレ
ディクター（登録商標）アルロンシェファロ社製）によ
って代表される。しかしながら、イムノクロマトグラフ
法を利用した検出方法においては、上述の妊娠診断薬で
見られるように１種類の抗原または抗体の検出方法でも
って、所期目的を達成するものであり、本発明の最も重
要な特許構成要件である「検出目的に適う複数の免疫学
的に異なる物質を検出するにあたり、イムノクロマトグ
ラフ法によりクロマトグラフ支持体上において、同時
に、別々な位置で、さらには各々単一の色調で検出す
る」という方法は未だ開示された例がない。

【０００６】ここに云う検出目的に適う少なくとも２種
以上の物質とは、例えば実施例２に示すごとく、腎疾患
に対しては、尿中の微量アルブミン、β₂−ミクログロ
ブリン、レチノール結合タンパク質など関連するマーカ
ーを挙げることができる。また、血液検査より悪性腫瘍
の関連マーカーとして、癌胎児性抗原、フェリチン、免
疫抑制酸性蛋白、ＣＡ１５−３（乳癌）、α−フェトプ
ロテイン（肝癌）、ＣＡ１９−９（膵癌）、などを挙げ
ることができる。

【０００７】自己免疫疾患に代表される全身エリテマト
−デスでみられる抗核抗体あるいは慢性関節リウマチで
みられる変性ＩｇＧ抗体などの抗体検索にも対応する複
数の抗原をそれぞれ関連マーカーとして挙げることがで
きる。一方、感染症における起炎菌の特定として、例え
ばStaphylococcus aureus,Streptococcus pyogenes
などのグラム陽性菌やPseudomonas aeruginosa，Ne
isseria gonorrhoeae などのグラム陰性菌、さらには
真菌類の Candida albicans ，Aspergillus fumiga
tus ，病原ウィルスなど特定な表層抗原を関連マーカー
として挙げることができる。このように、検出目的に適
うあらゆる抗原もしくはあらゆる抗体を表わす。

【０００８】

【発明が解決すべき課題】従来、イムノクロマトグラフ
法を用いた体外診断薬分野への応用として、現在市販さ
れている妊娠診断薬（クリアブル−ワンステップ（登録
商標）ユニパス社製）にみられるように、妊娠の重要な
マーカーとして、尿中のヒトゴナドトロピンペプチド
ホルモンの検出でもって妊娠の有無を判定もしくは診断
の一助とする方法は体外診断薬の分野では操作が簡単、
迅速、かつ、正確な情報が得られる点で画期的な製品で
ある。

【０００９】本発明者らは検出目的に適う複数のマーカ
ーをイムノクロマトグラフ法を用い同時に検出すること
によって、例えば診断薬分野においては、今までの診断
薬の概念を進展・拡大させることを目的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】以下、本発明の完成に至
った経緯および課題を解決するための手段について詳細
に述べる。近年、抗原−抗体反応を利用して、目的とす
る免疫学的能力を有する物質の検出は医療分野をはじめ
食品分野あるいは環境分野に応用されすばらしい進歩を
遂げている。

【００１１】そもそも、抗原−抗体反応そのものは生体
内あるいは自然界で必然性に応じて反応が生じているも
のであり、その原理・仕組みを人類が解明しつつあるこ
とによって多大な恩恵を受けている。特に医療分野では
診断の予測あるいは診断の一助として大きな意義をもっ
ており、血液、尿、糞便、体液などを被検液として用い
るため、患者への苦痛を与えることなく検査できる点が
利点である。

【００１２】本来、抗原−抗体反応とは「錠前と鍵穴」
の関係にたとえられるごとく、免疫学的な反応に授かる
物質と対応する物質との結合によって特異的な結合体を
形成するものであって、その大部分は共有結合のような
強い結合ではなく、極く弱い結合を保持し成立してい
る。このことから人為的に抗原−抗体反応複合体より抗
原あるいは抗体それぞれ単独に回収することができる。

【００１３】したがって、抗原−抗体反応系には、丁
度、酵素に対する基質の関係と同様にアフィニティー
（親和性）の概念が成立する訳である。すなわち、目的
とする酵素を単離・精製したいときは、目的とする酵素
の基質をあらかじめ樹脂（担体）に固定しておき、目的
とする酵素のみが基質と結合するので、水洗後溶離液で
溶出することによって一挙に高純度の酵素が回収でき
る。このような単離・精製手段をアフィニティークロマ
トグラフィーと命名している。

【００１４】本法の検出手段として用いるイムノクロマ
トグラフィーは、クロマトグラフィーの体系からみる
と、まさしくアフィニティークロマトグラフィーに包括
されるべきものであって、一般にクロマトグラフィーの
名称で述べられている溶質と溶媒との分配係数の差でも
って物質を分離・精製するという手段とは異なるもので
ある。

【００１５】すなわち、あらかじめ支持体上に固相化し
た抗原もしくは抗体が存在し、支持体の下端に着色した
標識微粒子が水などの溶媒を媒体として支持体のもつ毛
細管現象の作用で順次拡散・移動し、その際、免疫的に
形成せしめた複合体−着色標識粒子によって、先の抗原
もしくは抗体を固相化しておいた位置にその複合体−微
粒子が到達し、その場所で特異的に抗原−抗体反応を生
じ、着色シグナルとして目視的に観察することができる
ものである。以上のようなアフィニティークロマトグラ
フィーの原理に基づいて、本法をさらに発展せしめ鋭意
研究を重ねた結果、以下、本発明の完成に至った。

【００１６】本特許記載のイムノクロマトグラフィーに
用いる微粒子には色調の異なる別々のコロイド状金属粒
子、あるいは色調の異なる別々のコロイド状金属酸化物
粒子、さらには色調の異なる別々のコロイド状非金属粒
子を用いることができるが、色調の多様性やイムノクロ
マトグラフィー展開後の鮮明さを考慮すると合成高分子
ラテックス粒子が好ましい。

【００１７】イムノクロマトグラフィーに用いる市販の
合成高分子ラテックス粒子は当業者が本クロマトグラフ
ィーを最適な条件で実施できるように設計されており、
また現在の高分子化学の合成技術水準からみても、高い
水準の技術を駆使した高品質の製品である。

【００１８】ちなみに、本発明者らの本特許記載の実施
例における使用実績からみても、抗原もしくは抗体によ
る標識粒子の調製、標識後の乾燥工程による安定性さら
には支持体上での拡散・移動性および固相化位置におけ
る着色の鮮明性などに何ら問題を生じるものではない。
このような高品質のラテックス粒子は当業者が容易に入
手することができる。

【００１９】例えばブルーラテックス粒子分散液および
レッドラテックス粒子分散液の色調の異なったラテック
ス粒子はポリマーラボラトリー社より容易に入手するこ
とができる。その他、ローヌプーラン社、セラダイン
社、インターナショナルダイナミクスコーポレーション
社および積水化学工業株式会社などからも入手が可能で
ある。

【００２０】また、イムノクロマトグラフ用のラテック
ス粒子の大きさは０．０５〜５μｍの範囲で市販されて
おり、この範囲内の任意の大きさで使用も可能である
が、好ましくは標識する抗原もしくは抗体によって、適
宜粒子の大きさを選択することも感度・精度の上からも
重要であり通常０．４５μｍの大きさが適している。

【００２１】次に本発明に用いるイムノクロマトグラフ
ィーに使用する支持体について説明する。本発明に有用
なイムノクロマトグラフィーに使用する支持体は毛細管
現象を起こす作用を有し、かつ、合成高分子標識ラテッ
クス粒子と検出しようとする物質との複合体がイムノク
ロマトグラフ用展開剤、例えば水や緩衝液などですみや
かに拡散・移動できるような支持体であれば良い。

【００２２】一般にイムノクロマトグラフィーに使用す
る担体としてガラス繊維状のシート、濾紙、あるいはナ
イロンシート、ニトロセルロースシートなどが使用でき
るが、本発明に好適なシートとしてはニトロセルロース
シートである。ニトロセルロースシートはＢＡＳ−８５
（Schleicher＆Schuell 社製）、ＨＡＨＹ（Millipore
社製）として市販されており、当業者は容易に入手する
ことができる。

【００２３】次に支持体上へ検出目的に適う複数の抗原
もしくは抗体の固相化方法について説明する。本発明の
完成に有用な支持体としてニトロセルロースシートを選
ぶことができ、本支持体へ検出目的に適う複数の抗原も
しくは抗体を固相化するに当たっては、実施例に記載し
た態様を例にあげて具体的に説明すれば良く理解するこ
とができる。

【００２４】すなわち、通常イムノクロマトグラフィー
を行なうのに適した任意の大きさに整えたニトロセルロ
ース支持体をあらかじめ準備し、本支持体の任意に選ん
だ一定のゾーンに第１の抗原もしくは抗体（実施例１で
は抗ヒトアルブミンモノクロナール抗体）を塗布または
スプレーで散布し、上記以外のゾーンに第２の抗原もし
くは抗体（実施例１では抗ヒトヘモグロビン抗体）を塗
布またはスプレーで散布するなどして固相化する。また
第３、第４、第５などの検出目的に適う抗原もしくは抗
体の固相化も同様に為し得る。

【００２５】なお、ここで支持体に固相化した抗原もし
くは抗体は後のイムノクロマトグラフィーの展開によっ
て、それぞれ位置の異なる固相化したゾーンで抗原−抗
体反応を生じ着色する訳であるから、あらかじめ着色の
形状を設定しておくことが望ましい。

【００２６】しかしながら、本発明においてはそれぞれ
のゾーンで色調の異なる着色を示すので着色の形状が
●、−、＋、◎、×、△、…などのいかなる表示方法で
あっても許容できる。好ましくは、スポット状（●）ま
たはストリーク状（−）の表示が簡単、明瞭である。

【００２７】次に、乾燥工程について説明する。通常の
乾燥は室温放置で良いが、必要があれば３０〜５０℃の
熱風による乾燥あるいは真空乾燥などの方法を適宜行っ
ても差支えはない。乾燥後、ニトロセルロース支持体上
の第１および第２あるいは第３、第４、第５などの検出
目的に適う抗原もしくは抗体の固相化したゾーン以外の
領域を不活化するために、別なタンパク質でもってマス
キングすることが通常行われている。

【００２８】一般にマスキング剤としては生理食塩水に
０．２％溶解したカゼイン溶液あるいは１％スキムミル
ク（DIFCO 社製）、４％ブロックエース（登録商標）
（明治乳業社製）などを用いるが、使用する抗原または
抗体あるいは支持体の性質によって、その都度適切なマ
スキング剤を選択する必要がある。

【００２９】次に、合成高分子標識ラテックス粒子の調
製法ならびに装着方法について説明する。各々の色調を
有する別々のラテックス粒子にそれぞれ検出目的に適う
複数の抗原もしくは抗体を標識するにあたっては、例え
ば、赤色のラテックス粒子には第１抗原もしくは抗体、
青色のラテックス粒子には第２の抗原もしくは抗体、さ
らに黄色、あるいは緑色のラテックス粒子には第３、第
４の抗原もしくは抗体をそれぞれ個別に標識しておく。

【００３０】標識方法は通常行われている方法であれば
特に限定はしないが、一般にはラテックス粒子と標識す
る物質を室温約１時間位混和することによって達成でき
る。その後、各々標識した着色ラテックス粒子を個別に
遠心分離などの方法またはミリポアフィルターによる吸
引口過法によって集め、通常使用されている緩衝液例え
ばリン酸緩衝液などでよく洗浄後、マスキング剤で各々
の標識ラテックス粒子を個別にマスキングしておく。マ
スキング剤は先きの支持体で抗原もしくは抗体の固相化
後に用いたマスキング剤と同様なもので良い。

【００３１】しかしながら、マスキング剤の選択は標識
に使用した抗原または抗体および支持体の性質によっ
て、その都度適格か否かを判断する必要がある。このよ
うにして各々、個別に標識し得た着色ラテックス粒子を
保存液に貯えておく。各々の標識着色ラテックス粒子を
保存した液より一定量ずつ取り出しよく混和後、よく洗
浄して不織布などの多孔性ポリマーに含浸させて凍結乾
燥を行う。これを支持体の一定の場所に装着することに
よって本発明の検出する装置が完成する。なお、標識ラ
テックス粒子の支持体への装着については特に限定する
ものではなく、標識ラテックス粒子を直接支持体へ塗布
する方法等も利用することができる。

【００３２】装着位置についてはイムノクロマトグラフ
ィーの展開方法によって定まるもので、例えば展開が上
昇法の場合には下端部に、下降法の場合には上端部に、
水平方式の場合には両端部のどちらか一方に、円形方式
の場合には同心円の中心部分に装着することになる。

【００３３】本発明においては展開方法を特に限定する
ものではないが、通常、一般に行われている上昇法が望
ましい。この場合、試験者は装着した支持体部分に後述
する被検液浸漬用担体を重ね合せた部分を被検液に浸す
のみで展開できるので有利である。

【００３４】次に、検査具について説明する。（図１参
照）イムノクロマトグラフィーに関する検査具（反応装置）
については、すでに数多くの発明が開示されているので
特に、本発明で詳細に言及する必要はない。しかしなが
ら、本発明の方法が確実にまた正確に当事者によって容
易に実施できる「証」としてその１例を記す。

【００３５】実施例に検査具として示した反応装置はニ
トロセルロースなど、使用しやすさなどを考慮して任意
の長方形の大きさに裁断し支持体を作製する。支持体の
下端部分を被検液に浸して毛細管現象により水などの溶
媒を媒体として微量に溶けている抗原もしくは抗体を吸
い上げ、ニトロセルロース支持体上部へ移動せしめる不
活性材質（被検液浸漬用担体をいう）から選ばれる部分
を装着する。本不活性な材質には一般に濾紙、ガラス繊
維シート、メンブランフィルターシートなどが用いられ
る。

【００３６】ニトロセルロース支持体の下端部分には先
に説明した不織布上に載せた標識混合着色ラテックス粒
子の凍乾物（着色ラテックス粒子標識抗体凍乾担体）を
一定の大きさに裁断したものを例えば、両面テープなど
で軽く固定しておくか、最終的に検査具として組み終え
た段階でセロテープなどで圧着固定しても差支えがな
い。また、図１に示したごとく、ニトロセルロース上の
それぞれ異なった位置にあらかじめ検出目的に適う複数
の抗原もしくは抗体を固相化しておく。

【００３７】一方、ニトロセルロース支持体の上端部分
には、図１に示すごとく吸水性の担体を装着することに
よって、イムノクロマトグラフィーの展開が正確に、ま
た迅速に為し得るため、さらには展開し終えた後の液漏
れなどを防ぐ目的で本担体を装着しておくことが望まし
い。

【００３８】このような吸水性担体はアドバンテック東
洋社製の濾紙Ｎｏ．５２６やワットマン社製の１７Ｃ
ｒ，３ＭＭなどが市販されており容易に入手することが
できる。以上、このような簡単な検査具で本発明の方法
を検証または実施することができる。

【００３９】本明細書において記載の都合上、検出すべ
き物質が抗原である場合には例えば、ニトロセルロース
支持体上に検出すべき物質の一定部位を認識できる抗体
を固相化し、一方、合成高分子ラテックス粒子への標識
には先きの抗体とは別な個所の抗原分子を認識できる抗
体であれば本発明の方法は達成できる。

【００４０】また、本発明は上述とは逆に抗体の検出の
場合には、固相化抗原−検出すべき抗体−検出すべき物
質の抗体からなる系でもって実施できることは当業者に
は容易に理解されよう。したがって、本発明は検出すべ
き物質が抗原である場合だけに限定されず、抗体をも包
含するものであり、表現としては「抗原もしくは抗体」
として記してあるが、どちらか一方が定まればおのずか
ら対応する他方が定まることになり、「抗原」および
「抗体」なる文字を適宜使い分けることにより、本発明
の方法を実施することができる。

【００４１】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をより詳細に、
具体的に説明するが、本発明の方法はこの実施例によっ
て何ら限定されるものではない。

【００４２】実施例１尿中のヘモグロビン、アルブミ
ンの同時検出、測定（１）抗体固相化支持体の作製ニトロセルロースシート（ＢＡＳ−８５，Schleicher＆
Schuell 社製）を５ｍｍ×３０ｍｍに裁断し、その下端
より１０ｍｍの位置に抗ヒトヘモグロビンモノクロナー
ル抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（日本バイオテスト社
製），２０ｍｍの位置に抗ヒトアルブミンモノクロナー
ル抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（日本バイオテスト社製）
を各々エアーブラシ（オリンポス社製）を用いて塗布
し、抗ヒトヘモグロビン抗体および抗ヒトアルブミン抗
体のラインを作製した。室温で２時間乾燥後、１％スキ
ムミルク（DIFCO 社製）−０．１％ツィーン２０を含む
ＰＢＳ（リン酸生理食塩液）に３７℃、２時間浸漬し充
分マスキングを行った。その後、充分に乾燥し抗体固相
化支持体を作製した。

【００４３】（２）着色ラテックス粒子標識抗体の調製ａ．ブルーラテックス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体ブルーラテックス粒子分散液（PL-Latex, １０％，４５
０ｎｍ，Polymer Laboratories社製) ３００μｌにＰＢ
Ｓ１．２ｍｌを加え、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠
心分離を行った。沈査に抗ヒトヘモグロビンモノクロナ
ール抗体溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）（日本バイオテスト
社製）１ｍｌを加え、充分混和して、室温１時間反応を
行った。未反応の抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗
体を除去するため、１３，０００ｒｐｍ、５分間遠心分
離を行い、沈査をＰＢＳ１．５ｍｌで懸濁させ再度遠
心分離を行った。４％ブロックエース（明治乳業社製）
１ｍｌを加え、室温６０分間反応させてマスキングを行
った。その後、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠心分離を
行い、沈査を１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナト
リウムを含むＰＢＳ１．５ｍｌに懸濁させ冷蔵保存し
た。ｂ．レッドラテックス粒子標識抗ヒトアルブミン抗体レッドラテックス粒子分散液（PL-Latex, １０％，４５
０ｎｍ，Polymer Laboratories社製) および抗ヒトアル
ブミンモノクロナール抗体（０．０５ｍｇ／ｍｌ）（日
本バイオテスト社製）を用いて上記と同様な操作で調製
した。ｃ．着色ラテックス粒子標識抗体凍乾担体各々の着色ラテックス粒子標識抗体を等量混和し、ベン
リーゼ（登録商標）不織布（旭化成社製）５ｍｍ×５ｍ
ｍに１０μｌ含浸させ凍結乾燥して調製した。

【００４４】（３）検査具の作製抗体固相化支持体の下端から２．５ｍｍの位置まで着色
ラテックス粒子標識抗体凍乾担体を重ねた。さらに、着
色ラテックス粒子標識抗体凍乾担体上に被検液浸漬用担
体の下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体
固相化支持体の上端から５ｍｍの位置まで吸水性担体５
ｍｍ×２０ｍｍ（Ｎｏ．５２６，アドバンテック東洋社
製）を重ねた。最後に透明なテープを上部に貼り固定し
て検査具とした。（図１）

【００４５】（４）標準液を用いた反応性試験ヒトアルブミン（結晶，生化学工業社製）、ヒトヘモグ
ロビン（２回結晶、Sigma 社製）を３０μｇ／ｍｌ，
０．１５μｇ／ｍｌになるように各々ＰＢＳで溶解し２
種の標準液を調製した。標準液２００μｌを検査具の被
検液浸漬用担体に滴加してのち展開した。５分後、あら
かじめ固相化したライン部分の着色の有無により判定を
行った。図２に示すように２種の標準液を展開した場合
には赤色のライン（ヒトアルブミン）と青色のライン
（ヒトヘモグロビン）の両者が検出された。また、ヒト
アルブミン標準液では赤色のラインのみ、ヒトヘモグロ
ビン標準液では青色のラインのみが検出され、対照（Ｐ
ＢＳ）では着色ラインは見られず非特異発色はなかっ
た。

【００４６】（５）尿検体を用いた反応性試験糖尿病と診断された患者の尿１０例を用いて反応性試験
を行なった。なお、対照として尿潜血は『ヘマコンビス
ティックス（登録商標）』（マイルス三共社製），ヒト
アルブミンの検出は尿中微量アルブミン検出試薬『アル
ブシュア（登録商標）』（森永乳業社製）を用いて測定
し、両法の比較を行った。その結果、本法においては１
０例中ヒトアルブミン陽性−ヒトヘモグロビン陽性が２
例、ヒトアルブミン陽性−ヒトヘモグロビン陰性が４
例、ヒトアルブミン陰性−ヒトヘモグロビン陰性が４例
であった。検体Ｎｏ．４の尿潜血反応の結果を除き本法
と別法は完全に一致した。

【００４７】

【表１】

【００４８】実施例２尿中β₂−ミクログロブリン、
アルブミン、ヒトレチノール結合タンパクの同時検出、
測定（１）抗体固相化支持体の作製ニトロセルロースシート（ＢＡＳ−８５）を５ｍｍ×５
０ｍｍに裁断し、その下端より１０ｍｍの位置に抗ヒト
β₂−ミクログロブリンモノクロナール抗体溶液０．５
ｍｇ／ｍｌ（コスモ・バイオ社製）、２０ｍｍの位置に
抗ヒトレチノール結合タンパクモノクロナール抗体溶液
０．５ｍｇ／ｍｌ（ケミコン社製）、４０ｍｍの位置に
抗ヒトアルブミンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／
ｍｌ（日本バイオテスト社製）をそれぞれ細字用毛筆で
塗布し、抗ヒトβ₂−ミクログロブリン抗体、抗ヒトア
ルブミン抗体および抗ヒトレチノール結合タンパク抗体
のラインを作製した。室温で２時間乾燥後、１％スキム
ミルク（DIFCO 社製）−０．１％ツィーン２０を含むＰ
ＢＳに３７℃、２時間浸漬しマスキングを行った。その
後、充分に乾燥し抗体固相化支持体を作製した。

【００４９】（２）着色ラテックス粒子標識抗体の調製ａ．ブルーラテックス粒子抗ヒトβ₂−ミクログロブリ
ン抗体ブルーラテックス粒子分散液（PL-Latex, １０％，４５
０ｎｍ，Polymer Laboratories社製）１００μｌにＰＢ
Ｓ１．２ｍｌを加え、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠
心分離を行った。沈査に抗ヒトβ₂−ミクログロブリン
モノクロナール抗体溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）（ケミコ
ン社製）０．３ｍｌを加え、充分混和して室温１時間反
応した。未反応の抗ヒトβ₂−ミクログロブリンモノク
ロナール抗体を除去するため、１３，０００ｒｐｍ、５
分間遠心分離を行い、沈査をＰＢＳ１．５ｍｌに懸濁
させ再度遠心分離を行った。沈査に４％ブロックエース
１ｍｌを加え、室温６０分間反応させてマスキングを行
った。その後、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠心分離を
行い、沈査を１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナト
リウムを含むＰＢＳ０．５ｍｌに懸濁させ冷蔵保存し
た。ｂ．レッドラテックス粒子標識抗ヒトアルブミン抗体先に実施例１で調製したレッドラテックス粒子標識抗ヒ
トアルブミンモノクロナール抗体を使用。ｃ．グリーンラテックス粒子標識抗レチノール結合タン
パク抗体グリーンラテックス粒子分散液（PL-Latex, １０％，４
５０ｎｍ，Polymer Laboratories社製) および抗ヒトレ
チノール結合タンパクモノクロナール抗体（０．５ｍｇ
／ｍｌ）（ケミコン社製）を用いて上記と同様な操作で
調製した。ｄ．着色ラテックス粒子標識抗体凍乾担体各々の着色ラテックス粒子標識抗体を等量混和し、ベン
リーゼ（登録商標）不織布（旭化成社製）５ｍｍ×５ｍ
ｍに１０μｌ含浸させ凍結乾燥して調製した。

【００５０】（３）検査具の作製実施例１と同様な方法で作製した。

【００５１】（４）標準液を用いた反応性試験 β₂−ミクログロブリン（日本バイオテスト社製）、ヒ
トアルブミン（結晶、生化学工業社製）、レチノール結
合タンパク（バインディングサイト社製）を各々０．３
μｇ／ｍｌ，３０μｇ／ｍｌ，０．３μｇ／ｍｌになる
ようにＰＢＳで溶解し、標準液を調製した。３種混合標
準液を展開した場合には青色のライン（ヒトβ₂−ミク
ログロブリン）、赤色のライン（ヒトアルブミン）、緑
色のライン（ヒトレチノール結合タンパク）が検出され
た。また、ヒトβ₂−ミクログロブリンとヒトアルブミ
ンの標準液では青色および赤色の２本のライン、ヒトア
ルブミンとヒトレチノール結合タンパクでは赤色と緑色
のライン、ヒトβ₂−ミクログロブリンとヒトレチノー
ル結合タンパクでは青色と緑色のラインが検出された。
なおＰＢＳだけを展開したものでは着色ラインは見られ
ず非特異発色はなかった。

【００５２】（５）尿検体を用いた反応性試験健常者尿２例、糖尿病と診断された患者の尿５例を用い
て反応性試験を行った。なお、対照としてβ₂−ミクロ
グロブリンはMESACUP β₂−MICRO テスト（登録商標）
（ＭＢＬ社製）、ヒトアルブミンはアルブシュア（登録
商標）（森永乳業社製）、ヒトレチノール結合タンパク
はLCパルチゲンRBP （登録商標）（ヘキスト社製）を用
いて測定した。表２に結果を示したが健常者２例につい
ては本法３項目および別法ともすべて陰性であった。糖
尿病患者においては本法３項目について全項目陽性２
例、全項目陰性２例、β₂−ミクログロブリン陽性−ア
ルブミン陽性−レチノール結合タンパク陰性が１例であ
った。また別法と比較したところ３項目ともすべて一致
した。

【００５３】

【表２】

【００５４】実施例３血清中ミオグロビン、ミオシン
Ｌ鎖、クレアチンキナーゼーＭＢの同時検出、測定（１）抗体固相化支持体の作製ニトロセルロースシート（ＢＡＳ−８５）を５ｍｍ×３
０ｍｍに裁断し、その下端より、１０ｍｍの位置に抗ヒ
トミオシンＬ鎖モノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍ
ｌ（ROUGER BIO・TECH社製）１５ｍｍの位置に抗ヒトク
レアチンキナーゼーＭＢモノクロナール抗体溶液０．５
ｍｇ／ｍｌ（ケミコン社製）、２０ｍｍの位置に抗ヒト
ミオグロビンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ
（日本バイオテスト社製）を細字用毛筆で塗布し、抗ヒ
トミオシンＬ鎖抗体、抗ヒトクレアチンキナーゼーＭＢ
抗体および抗ヒトミオグロビン抗体のラインを作製し
た。室温で２時間乾燥後、１％ＢＳＡ−０．１％ツィー
ン２０を含むＰＢＳに３７℃、２時間浸漬し、マスキン
グを行った。その後、充分に乾燥し抗体固相化支持体を
作製した。

【００５５】（２）着色ラテックス粒子標識抗体の調製ａ．ブルーラテックス粒子標識抗ヒトミオシンＬ鎖抗体ブルーラテックス粒子分散液（PL-Latex, １０％，４５
０ｎｍ，Polymer Laboratories社製）１００μｌにＰＢ
Ｓ１．２ｍｌを加え、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠
心分離を行った。沈査に抗ヒトミオシンＬ鎖抗体溶液
（０．５ｍｇ／ｍｌ）（ROUGER BIO・TECH社製）０．３
ｍｌを加え、充分混和後、室温１時間反応を行った。未
反応の抗ヒトミオシンＬ鎖抗体を除去するため、１３，
０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈査をＰＢＳ
１．５ｍｌに懸濁させ再度遠心分離を行った。沈査に４
％ブロックエース１ｍｌを加え、室温６０分間反応させ
てマスキングを行った。その後、１３，０００ｒｐｍ，
５分間遠心分離を行い、沈査を１％ＢＳＡ−０．０１％
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ０．５ｍｌに懸濁させ
冷蔵保存した。ｂ．レッドラテックス粒子標識抗ヒトクレアチンキナー
ゼーＭＢ抗体レッドラテックス粒子分散液および抗ヒトクレアチンキ
ナーゼーＭＢモノクロナール抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ）
（ROUGER BIO・TECH社製）を用いてａ．と同様な操作を
行って調製した。ｃ．グリーンラテックス粒子標識抗ヒトミオグロビン抗
体グリーンラテックス粒子分散液および抗ヒトミオグロビ
ンモノクロナール抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ）（日本バイ
オテスト社製）を用いてａ．と同様な操作を行って調製
した。ｄ．３種着色ラテックス粒子標識抗体凍乾担体各々の着色ラテックス粒子標識抗体を等量混和し、ベン
リーゼ（登録商標）不織布５ｍｍ×５ｍｍに１０μｌ含
浸させ凍結乾燥して調製した。

【００５６】（３）検査具の作製実施例１と同様な方法で作製した。

【００５７】（４）標準液を用いた反応性試験ヒトミオシンＬ鎖（オーイーエムコンセプト社製）、ヒ
トクレアチンキナーゼーＭＢ（ターナー社製）、ヒトミ
オグロビン（DAKO社製）を各々１０ｎｇ／ｍｌ，１０ｎ
ｇ／ｍｌ，８０ｎｇ／ｍｌになるように０．１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳで溶解し、標準液を調製した。３種混合標
準液を展開した場合には青色のうっすらとしたライン
（ヒトミオシンＬ鎖）、赤色のうっすらしたライン（ク
レアチンキナーゼーＭＢ）、緑色の比較的濃いライン
（ヒトミオグロビン）として検出された。また、ヒトミ
オシンＬ鎖とヒトクレアチンキナーゼーＭＢの標準液で
は青色および赤色のうっすらとした２本のライン、ヒト
クレアチンキナーゼーＭＢとヒトミオグロビンでは淡赤
色と緑色のライン、ヒトミオグロビンとヒトミオシンＬ
鎖では淡青色と緑色のラインが検出された。なお、０．
１％ＢＳＡを含むＰＢＳのみを展開した系ではラインは
検出されず非特異発色もみられなかった。

【００５８】（５）血清を用いた反応性試験健常者血清２例、急性心筋梗塞と診断された患者の血清
３例を用いて反応性試験を行った。健常者の血清２例は
ミオシンＬ鎖、クレアチンキナーゼーＭＢ、ミオグロビ
ンともに陰性であった。また急性心筋梗塞の患者の血清
では全項目陽性が１例、ミオシンＬ鎖陰性−クレアチン
キナーゼーＭＢ陽性−ミオグロビン陽性が２例であっ
た。（表３）

【００５９】

【表３】

【００６０】実施例４糞便中のヘモグロビン、トラン
スフェリンの同時検出、測定（１）抗体固相化支持体の作製ニトロセルロースシート（ＢＡＳ−８５）を５ｍｍ×３
０ｍｍに裁断し、その下端より、１０ｍｍの位置に抗ヒ
トトランスフェリンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ
／ｍｌ（ケミコン社製）、２０ｍｍの位置に抗ヒトヘモ
グロビンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（日
本バイオテスト社製）を各々細字用毛筆を用い塗布し、
抗ヒトトランスフェリン抗体および抗ヒトヘモグロビン
抗体のラインを作製した。室温で２時間乾燥後、１％ス
キムミルク（DIFCO 社製）−０．１％ツィーン２０を含
むＰＢＳに３７℃、２時間浸漬しマスキングを行った。
その後、充分に乾燥し抗体固相化支持体とした。

【００６１】（２）着色ラテックス粒子標識抗体の調製ａ．レッドラテックス粒子標識抗ヒトトランスフェリン
抗体レッドラテックス粒子分散液（PL-Latex, １０％，４５
０ｎｍ，Polymer Laboratories社製）１００μｌにＰＢ
Ｓ１．２ｍｌを加え、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠
心分離を行った。沈査に抗ヒトトランスフェリンモノク
ロナール抗体溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）（アドバンスイ
ムノケミカル社製）１ｍｌを加え、混和後、室温１時間
反応を行った。未反応の抗ヒトトランスフェリンモノク
ロナール抗体を除去するために、１３，０００ｒｐｍ、
５分間遠心分離し、沈査をＰＢＳ１．５ｍｌに懸濁させ
再度遠心分離を行った。沈査に４％ブロックエース１ｍ
ｌを加え、室温６０分間反応させてマスキングを行っ
た。反応後、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠心分離し、
沈査を１％ＢＳＡ−０．０１％アジ化ナトリウムを含む
ＰＢＳ０．５ｍｌに懸濁させ冷蔵保存した。ｂ．ブルーラテックス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体実施例１で調製したものを使用した。ｃ．着色ラテックス粒子標識抗体凍乾担体各々の着色ラテックス粒子標識抗体を等量混和し、ベン
リーゼ（登録商標）不織布５ｍｍ×５ｍｍに１０μｌ含
浸させ凍結乾燥して調製した。

【００６２】（３）検査具の作製実施例１と同様な方法で作製した。

【００６３】（４）標準液を用いた反応性試験ヒトトランスフェリン（ケミコン社製）、ヒトヘモグロ
ビン（２回結晶、Sigma 社製）を各々１００μｇ／ｍｌ
になるように０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで溶解し、２
種の標準液を調製した。標準液２００μｌを検査具の被
検液浸漬用担体に滴加してのち展開した。５分後、ライ
ンの着色の有無により判定を行った。２種の標準液を展
開した場合には赤色のライン（ヒトトランスフェリン）
と青色のライン（ヒトヘモグロビン）が検出された。ま
たヒトトランスフェリン標準液では赤色のラインのみ、
ヒトヘモグロビン標準液では青色ののみが検出され、対
照（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）ではラインは見られ
ず非特異発色はなかった。

【００６４】（５）患者便を用いた反応性試験便中のヘモグロビン、トランスフェリンの安定性を調べ
る目的で大腸ガンと診断された患者の便を室温に放置
し、１日目、３日目、７日目にそれぞれサンプリングを
行った。糞便１０ｍｇを採取して０．００５％ツィーン
２０−０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ２ｍｌに懸濁させよ
く混和後、３，０００ｒｐｍ，１０分間遠心分離を行
い、便懸濁液とした。便懸濁液２００μｌを被検液浸漬
用担体に滴加してのち展開した。なお、健常者の便につ
いても同様の測定を行った。また、別法として便中のヘ
モグロビン測定試薬『ＯＣ−ヘモディア（登録商標）』
（栄研化学社製）を用いた。本法において大腸がん患者
の便については保存開始時ではヒトヘモグロビン、ヒト
トランスフェリンともに陽性を示したが、ヒトヘモグロ
ビンについては１日目で疑陽性になり、３日目から７日
目には陰性になった。一方、ヒトトランスフェリンにつ
いては３日目まで陽性を示したが、７日目では疑陽性に
なった。また、別法のＯＣ−ヘモディア（登録商標）で
はヘモグロビンの検出について１日目で疑陽性となり、
３日目以降は陰性であった。さらに、健常者便では本法
およびＯＣ−ヘモディア（登録商標）とも陰性であり非
特異反応は起こらなかった。

【００６５】

【表４】

【００６６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、免疫学的に異な
る検出目的に適う物質を検出するに当たり、色調の異な
る標識ラテックス粒子を用いたイムノクロマトグラフィ
ーによって、複数の物質を目視的に同時に検出すること
ができる。この方法によって、例えば特定の疾患に対す
る関連のマーカーを同時に検出することができるので、
臨床家にとってより迅速で、より信頼性の高い診断を下
すことも可能であり、また、複数の疾患に対する関連マ
ーカーを用いれば、未知の疾患に対する総合所見からの
診断の有力な証拠になりうる。一方、産業界における有
害物質や発癌物質の検出、食品中の有害汚染物質もしく
は、有害微生物の検出にも応用することができる。この
ように本特許のもつ意義はすべての産業界において抗原
−抗体反応を基本とするすべての物質の検出が可能であ
り、複数の関連マーカーを同時に使用することによっ
て、より確かな証拠が得られ、従来法に較べて新規性と
進歩性が飛躍的に期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の検査具の１態様を示したものであり、
該検査具上部図および断面図である。

【符号の説明】１吸水性担体２抗体固相化支持体３着色ラテックス粒子標識抗体凍乾担体４被検液浸漬用担体５第２抗体固相化ゾーン６第１抗体固相化ゾーン

【図２】本発明の方法を用いた測定結果の１態様を示し
たものであり、尿中のヒトヘモグロビンおよびヒトアル
ブミンを同時に検出、測定した結果である。

【符号の説明】

１ヒトアルブミン標準液とヒトヘモグロビン標準液
の混合液を展開したクロマトグラム２ヒトアルブミン標準液を展開したクロマトグラム３ヒトヘモグロビン標準液を展開したクロマトグラ
ム４対照（ＰＢＳ）を展開したクロマトグラム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者若杉昌彦東京都中央区日本橋室町１−５−３わかもと製薬株式会社内 (72)発明者前田孚東京都中央区日本橋室町１−５−３わかもと製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検出目的に適う少なくとも２種類以上の
免疫学的に異なる物質を同時に確認できる免疫学的検出
方法であって、ａ．少なくとも２種類以上の色調の異なる着色ラテック
ス粒子を、あらかじめ検出目的に適う少なくとも２種類
以上の免疫学的に反応する能力のある物質に各々標識せ
しめ、ｂ．一方、同一支持体上の異なる位置に少なくとも２種
類以上からなる免疫学的に反応する能力のある物質を、
あらかじめ固相化し、ｃ．ついで、２種類以上からなる標識着色ラテックス粒
子の混合物と被検液中の未知の少なくとも１種類以上の
免疫学的物質と反応せしめ、ｄ．ついで、免疫学的に形成させた複合体−着色ラテッ
クス粒子の混合物を被検液を媒体として、展開・移動せ
しめ、ｅ．検出目的に適う少なくとも２種類以上の免疫学的に
反応する能力を有する物質をあらかじめ固相化しておい
た複数の位置に、それぞれ対応する免疫学的に形成させ
た複合体−着色ラテックス粒子で着色することを特徴と
する免疫学的検出方法。
【請求項２】検出しようとする物質が検出目的に適う
抗原である請求項１の方法。
【請求項３】検出しようとする物質が検出目的に適う
抗体である請求項１の方法。
【請求項４】検出しようとする物質がヘモグロビン及
びアルブミンである請求項２の方法。
【請求項５】検出しようとする物質がβ₂−ミクログ
ロブリン、アルブミン及びヒトレチノール結合タンパク
である請求項２の方法。
【請求項６】検出しようとする物質がミオグロビン、
ミオシンＬ鎖及びクレアチンキナーゼＭＢである請求項
２の方法。
【請求項７】検出しようとする物質がヘモグロビン及
びトランスフェリンである請求項２の方法。