JP6957355B2 - 血清型交差反応性デング熱中和抗体及びその使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

この出願は、参照によりその全体に亘る内容があらゆる目的で本明細書に援用される、２０１５年３月１７日に出願されたシンガポール特許出願第１０２０１５０２０６８Ｖ号の優先権の利益を主張する。

本発明は、医療目的の製剤又は製剤の特定の治療活性に関連する。特に、本発明は、デングウイルス（又はＤＥＮＶ）に結合する抗体及び他の薬剤、並びに疾患の処置のための抗体又は他の薬剤の使用の方法に関連する。

デング熱は、世界で最も一般的な節足動物媒介性ウイルス疾患である。デング熱を引き起こすウイルス（即ち、ＤＥＮＶ）は、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４のような４つの異なる感染性の血清型に分類することができる。デング熱感染症の症状は、熱、筋肉痛、頭痛、低血小板数及び低白血球数、凝血障害、デング熱ショック症候群を引き起こす出血及び血管漏出を含む。前のデング熱感染の後、人がデングウイルスに曝露されると、抗ウイルス抗体が宿主細胞へのウイルスの取り込みを促進し得、罹患体が重症型又はデング熱を発症する危険性が高まる。しかしながら、デング熱の重症型は、最初の感染の間にも起こり得る。

今日まで、最も一般的な節足動物媒介性ウイルス性疾患であるが、デング熱のための医薬品はない。デング熱に関する取り組みは、主に感染の予防及び／又は症状を緩和するための処置に向けられてきた。

したがって、少なくとも１つのデング熱の血清型を中和及び／又はそれらに結合することのできる薬剤を提供する必要がある。

１つの側面において、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗体は、（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１配列、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又は配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２配列、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又は配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つの重鎖アミノ酸配列、或いは抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。

他の側面において、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗体は、（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又は配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１配列、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又は配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２配列、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又は配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つの軽鎖アミノ酸配列、或いは抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。

更に他の側面において、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗体は、（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つの重鎖アミノ酸配列、及び／又は（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、少なくとも１つの軽鎖アミノ酸配列、或いはデングウイルス粒子全体を認識する抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。

更に他の側面において、本明細書に記載される、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物が提供される。

更に他の側面において、本明細書に記載される単離された抗体を含むキットが提供される。

更に他の側面において、本明細書に記載される単離された抗体、又は本明細書に記載される組成物、又は本明細書に記載されるキットを含む、デングウイルスの血清型の少なくとも１つに対する受動ワクチンが提供される。

更に他の側面において、本明細書に記載される単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント、又は本明細書に記載される組成物、又は本明細書に記載されるワクチンの有効量を治療対象体に投与することを含む、治療対象体におけるデングウイルス感染症を処置する方法が提供される。

更に他の側面において、治療対象体におけるデングウイルス感染症を処置するための医薬品の製造における、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合フラグメント、又は本明細書に記載される組成物、又は本明細書に記載されるキット、又は本明細書に記載されるワクチンの使用が提供される。

更に他の側面において、試料における少なくとも１つのデングウイルスの血清型を検出するための方法が提供される。１つの例において、方法は、（ａ）本明細書に記載される単離された抗体又は本明細書に記載されるキットの少なくとも１つとともに試料をインキュベートすること、及び（ｂ）抗体−デングウイルス複合体を検出することを含み、ここで複合体の有無は、試料におけるデングウイルスの有無を意味する。

更に他の側面において、（ａ）本明細書に記載される単離された抗体、又はその抗原フラグメントをコードする核酸配列、（ｂ）配列番号１及び２に示される核酸配列、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列の何れかひとつに相補的な核酸、及び（ｄ）厳しい条件下で（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）とハイブリダイズすることができる核酸配列からなる群から選択される、単離された核酸分子が提供される。

更に他の側面において、本明細書に記載される核酸配列を含むベクターが提供される。

更に他の側面において、本明細書に記載されるベクターで形質転換された宿主が提供される。

更に他の側面において、本明細書に記載される宿主からの抗体を得る工程を含む、本明細書に記載される抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法が提供される。

本発明は、以下の非限定的な例及び添付の図面を併せて考慮すれば、詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。

図１は、ＵＶ不活性化ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、及びＤＥＮＶ−４でのｍＡｂの最初のスクリーニングの棒グラフを示す。３Ｃ−Ｈ５Ｌ１抗体クローン（矢印でポイントされている）は、血清型に関わらず、不活性化されたデングウイルス粒子に対して低い結合性を示した（ｘ軸に接する一番下のバー）。ＩｇＧ１のｎｇ／ｍｌにおける総濃度（右のｙ軸）から分かるように、３Ｃ−Ｈ５Ｌ１抗体の発現レベルは、高かった（灰色のバー−一番上のバー）。ゆえに、図１は、３Ｃ−Ｈ５Ｌ１抗体の最初の特徴を示す。 図２は、ＥＬＩＳＡによって評価された、生きたウイルス粒子における種々の抗体クローンの結合能を示す棒グラフを示す。異なるウイルス粒子を降順で記載し、ここにおいて２６４１Ｙ０８（一番上のバー）は、ＤＥＮＶ−４ウイルス粒子であり、４１４１（一番上から２番目のバー）は、ＤＥＮＶ−３ウイルス粒子であり、ＴＳＶ０１（一番上から３番目のバー）は、ＤＥＮＶ−２ウイルス粒子であり、１６７（一番下のバー）は、ＤＥＮＶ−１ウイルス粒子である。３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の結合プロファイルを、矢印で強調した。従って、図２は、ウイルスが不活性化されていない場合、３Ｃ Ｈ５Ｌ１は、デングウイルスの４つの血清型全てに結合することを示す。 図３は、ＥＬＩＳＡによって評価された、組み換えＥタンパク質に対する種々の抗体クローンの結合能を示す棒グラフを示す。下に向いた矢印で強調したように、４つのＤＥＮＶ血清型全ての組み換えＥタンパク質に対する３Ｃ Ｈ５Ｌ１の結合は、非常に弱かった。従って、図３は（並びに図１及び図２）は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体のエピトープは、特に生きている場合、ウイルス粒子全体に、より顕著に提示されることを示す。 図４は、ＢＨＫ−２１細胞（即ち、線維芽細胞）での３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体のプラーク減少中和アッセイ／試験（ＰＲＮＴ）の結果を示す折線グラフを示す。使用したウイルス株は、ＤＥＮＶ−１ １６７、ＤＥＮＶ−２ ＴＳＶ０１、ＤＥＮＶ−３ ＶＮ３２／９６及びＤＥＮＶ−４ ２６４１Ｙ０８である。図４は、４つの血清型全てに対する強力なインビトロ中和能を示し、ＤＥＮＶ２を０．００１μｇ／ｍｌのＥＣ_５０において中和し、続いてＤＥＮＶ１、４、及び３をそれぞれ、０．６μｇ／ｍｌ、０．０７μｇ／ｍｌ、及び０．５μｇ／ｍｌで中和した。従って、図４は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体がＤＥＮＶの４つの血清型全てを中和することができることを示す。 図５は、ウイルス及びＦｃ−修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体（ＬＡＬＡ変異を有する３Ｃ Ｈ５Ｌ１、図５において３Ｃ ＬＡＬＡと称する）の付着前及び付着後中和アッセイの結果を示す折線グラフを示す。付着前中和アッセイに関しては、ウイルス及び修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体を混合した後、混合物を、感染のためにＵ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ（即ち、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する単球様ヒト細胞株Ｕ９３７）細胞に添加した。付着後中和アッセイに関しては、ウイルスをまず細胞とともに４℃でインキュベートした（ウイルスの融合及び内部移行を避けるため）。ウイルスをその後洗い流し、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体を添加した後、細胞を３７℃でインキュベートし、感染を開始した。０８Ｋ３１２６（即ち、ＤＥＮＶ−１ウイルス）及びＴＳＶ０１（即ち、ＤＥＮＶ−２ウイルス）をアッセイに用いた。従って、図５は、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体が、感染の前又は後に存在する場合、ＤＥＮＶ−１及びＤＥＮＶ−２血清型の両方を中和することができることを示す。 図６は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体及び比較のためのＥタンパク質特異手にヒトモノクローナル抗体にで染色したＢＨＫ−２１細胞（即ち、線維芽細胞）の免疫組織化学画像を示す。ＢＨＫ−２１細胞を２４時間に亘り感染させ、固定した後、それぞれの抗体で染色した。暗い免疫組織化学画像によって表されている通り、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体は、ＤＥＮＶ−１、２及び３に対して弱い染色を示し、ＤＥＮＶ−４に対しては染色を示さながった。感染した細胞は、小胞体（ＥＲ）において大量のＥタンパク質を産生し、そのために、Ｅタンパク質に特異的な抗体は非常に明るい染色を生じる（Ｅタンパク質に結合するコントロールの抗体の染色を示す下段のパネル参照のこと）。３Ｃ Ｈ５Ｌ１は、Ｅタンパク質に弱く結合するだけであるため、観察された明るい染色は、おそらく細胞表面に結合したウイルス粒子全体の検出であるか、又は細胞の内部で新しく産生され、放出される前のウイルス粒子の検出の結果である。グラフにおけるスケールバーは、１００μｍを示す。従って、図６は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体がインタクトなウイルス粒子に優先的に結合し、Ｅタンパク質には弱く結合するのみであることを確かにしている。 図７は、融合阻害アッセイにおける細胞の一連の共焦点顕微鏡画像を示す。１０μｇ／ｍｌ抗体（修飾（３Ｃ−ＬＡＬＡ）−一番上の右のパネル；野生型（ＷＴ）−真ん中の右のパネル；及びコントロールの抗体−一番下の右のパネル）を、感染したＣ６／３６細胞（即ち、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）クローン）に添加した。融合は、酸性緩衝液を添加することによって開始された。ウイルスを除去した後、細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、すぐに共焦点顕微鏡を用いて画像化した。ＰＩは、融合細胞及び個別の死細胞を染色した。ＰＩで染色された核の集団は、融合された細胞の集団を表している。細胞の白色視野画像を、顕微鏡視野内の実際の細胞数の基準として示す。１０ｘ倍率対物レンズを用いた。一番上の左のパネルは、非感染細胞における非常に少ないヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色（即ち、非常に僅かな明るいスポット）を示す。対照的に、ＤＥＮＶ−２に感染させた細胞を示す一番下の左のパネルは、ヨウ化プロピジウムでポジティブに染色された（即ち、明るいスポット）有意な数の細胞を示す。図７の右のパネル（３Ｃ−ＬＡＬＡ及び３Ｃ−ＷＴと標識されている）は、僅かなヨウ化プロピジウム染色を示した。対照的に、図７の一番下の右のパネル（コントロールの抗体ＨＡ４と標識されている）は、多くの細胞がヨウ化プロピジウムでポジティブに染色されたことを示す。グラフにおけるスケールバーは、１００μｍを示す。従って、図７は、修飾したもの及び野生型（即ち、それぞれ３Ｃ−ＬＡＬＡ及び３Ｃ−ＷＴ）の両方の３Ｃ抗体が、ＤＥＮＶ−２の細胞への融合を有意に阻害することが可能であることを示す。 図８は、種々の濃度の修飾３Ｃ抗体を用いた融合阻害アッセイにおける一連の細胞の共焦点顕微鏡写真を示す。アッセイにおいては、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌの修飾３Ｃ抗体（即ち、３Ｃ−ＬＡＬＡ）を用いた。一番上のパネルは、濃度及び細胞における融合の阻害の間の直接的な関係の傾向を示し、１０μｇ／ｍｌで処置した細胞は、非常に僅かなヨウ化プロピジウム陽性細胞を有し、１μｇ／ｍｌではより多くのヨウ化プロピジウム陽性細胞（１０μｇ／ｍｌと比較して）を有し、０．１μｇ／ｍｌでは更に多くのヨウ化プロピジウム陽性細胞（１μｇ／ｍｌと比較して）を有する。２０ｘの倍率の対物レンズを用いた。グラフにおけるスケールバーは、１００μｍを意味する。従って、図８は、修飾３Ｃ抗体がデングウイルスの融合を有意に阻害することができることを示す。 図９は、ＡＧ１２９又はＩＦＮＡＲマウスモデルのどちらかにおけるインビボ有効性試験における実験計画の模式図を示す。予防モデル及び治療モデルにおける抗体移入及びウイルス接種の時点を接種前又は後の日数に関連して描写した。抗体を静脈内に注射し、一方で、ウイルスは腹腔内に注射した。 図１０は、マウスにおける、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の感染前（即ち、予防）処置の結果を表すドットプロットを示す。１００μｇ又は１０μｇの３Ｃ Ｈ５Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、或いは１００μｇのコントロールヒトｍＡｂ ＨＡ４をＡＧ１２９マウスに静脈注射（ｉ．ｖ．）した。２４時間後、マウスに５×１０^６ｐｆｕのＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２又はＤＥＮＶ−３を感染させた。ウイルス血症のピークである感染の３日後、血液をマウスから採取し、ウイルスをｑＲＴ−ＰＣＲで検出し、リアルタイムＰＣＲにおいて既知のｐｆｕ／ｍｌでウイルスストックを含めることによって、ｐｆｕ当量／ｍｌ血清として標準化した。プラーク形成単位（ｐｆｕ）は、感染したウイルス粒子に相当し、プラークアッセイにおいて決定される。特に、Ａ）は、ｍＡｂ移入後にＤＥＮＶ−２株ＴＳＶ０１で感染させたマウスにおいて検出された感染のドットプロット（ｐｆｕ当量／ｍｌ血清で測定された）を示し、Ｂ）は、ｍＡｂ移入後にＤＥＮＶ−２株Ｄ２Ｙ９８Ｐ又はＤＥＮＶ−１株０８Ｋ３１２６で感染させたマウスにおいて検出された感染のドットプロット（ｐｆｕ当量／ｍｌ血清で測定された）をそれぞれ示し、Ｃ）は、ＤＥＮＶ−３（ＶＮ３２／９６株）で感染させたマウスの検出された感染のドットプロット（ｐｆｕ当量／ｍｌ血清で測定された）を示す。１００μｇの３Ｃ Ｈ５Ｌ１モノクローナル抗体を処置したマウスにおいては、感染後３日目において、いかなるウイルス血症も検出されなかった（Ｎ．Ｄ．）（図１０のＣ、ｘ軸における最も左のものを参照のこと）。従って、図１０は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１モノクローナル抗体が少なくともＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２及びＤＥＮＶ−３血清型によって引き起こされるデングウイルス感染症からマウスを保護することができることを示す。 図１１は、感染後少なくとも３０日目までのマウスの生存曲線を示す。マウスは、１×１０^７ｐｆｕのＤＥＮＶ−２株Ｄ２Ｙ９８Ｐによる感染（腹腔内注射した）の２４時間前に３Ｃ Ｈ５Ｌ１（即ち、３Ｃ）抗体又はコントロールＨＡ４（即ち、ＨＡ）抗体のどちらかを受け、その生存をモニタリングした。図１１は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１を受けた（種々の濃度で）全てのマウスが感染から生き延びたことを示す。対照的に、コントロールの抗体を受けたマウスは、何れも感染から生き延びなかった。従って、図１１は、３Ｃ抗体がデングウイルス感染症によって引き起こされる死からマウスを保護することができることを示す。 図１２は、マウスの修飾３Ｃ抗体（即ち、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体のＬＡＬＡ変異）による感染前（予防）処置の結果を示す。特に、図１２は、デング熱感染症の抗体依存性増強（ＡＤＥ）の予防における修飾３Ｃ抗体の有効性の検証を示す。Ｋ５６２細胞を、非修飾形態（即ち、ＩｇＧ１）又はＦｃガンマ−受容体結合に干渉する（即ち、ＬＡＬＡ変異を有する）変異の形態の、異なる量の３Ｃ Ｈ５Ｌ１の存在下で感染させた。図１２は、非修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１で処置した細胞で測定したｐｆｕにおける急な山の形で表されたＡＤＥ（囲みの中）を示す。対照的に、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１で処置した細胞は、測定したｐｆｕにおいて急な山の形を示さなかった。従って、図１２は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体へのＬＡＬＡ変異の導入は、インビトロでＡＤＥを阻止することを示す。 図１３は、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体（即ち、ＬＡＬＡ変異を有する）のインビボ検証試験の結果を示す。特に、Ａ）は、１×１０^７ｐｆｕのＤＥＮＶ−２株Ｄ２Ｙ９８Ｐに（腹腔内注射で）感染させられ、ＤＥＮＶ２ウイルスに感染する２４時間前に、非修飾（野生型）の３Ｃ Ｈ５Ｌ１又は修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１（即ち、ＬＡＬＡ変異を有する）又はＨＡ４ コントロール抗体のうち１つで処置したマウスのウイルス力価を示す。血液におけるウイルス力価を、感染後３日目に分析した。１μｇの３Ｃ Ｈ５Ｌ１を注射した後に観察された抗体依存性増強（ＡＤＥ）（図１０も参照のこと）は、１μｇの修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１（即ち、３Ｃ Ｈ５Ｌ１ ＬＡＬＡ）を用いたときに逆転した。Ｂ）は、Ａ）に記載したように処置したマウスの生存曲線を示し、ここでは、１μｇの修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１（即ち、３Ｃ Ｈ５Ｌ１ ＬＡＬＡ）で処置したマウスは、１μｇの非修飾／野生型３Ｃ Ｈ５Ｌ１で処置したマウスに対して、わずかな生存優位性を有する。この検証試験において、ＡＧ１２９マウスを感染させるために用いたＤＥＮＶ−２ウイルスは、非常に侵攻性な株であったことを留意されたい。従って、マウスは、１０μｇの３Ｃ Ｈ５Ｌ１又はそれ以上のものを処置したときでしか生存することができなかった（図１１参照のこと）。従って、図１３は、修飾及び非修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の両方が、用量依存的にマウスを保護することを示す。 図１４は、抗体による前処置を行った又は行っていないＩＦＮＡＲマウスにおけるウイルス力価を表すドットプロットグラフを示す。１０μｇ抗体をマウスごとに注射した。５×１０^５ｐｆｕのＤＥＮＶ−１株０８Ｋ３１２６及び１０^７ｐｆｕのＤＥＮＶ−２株Ｄ２Ｙ９８Ｐを接種に用いた。マウスを、ＰＢＳコントロール、ビステラ（Ｖｉｓｔｅｒｒａ）からの修飾抗体５１３ （即ち、ＬＡＬＡ変異を有する）又は修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体（即ち、ＬＡＬＡ変異を有する）の何れかで処置した。図１４のＡ）は、ＤＥＮＶ１に感染したＩＦＮＡＲマウスにおけるウイルス力価を示し、Ｂ）は、ＤＥＮＶ２に感染したＩＦＮＡＲマウスにおけるウイルス力価を示す。ウイルス血症は、感染後３日目に試験した。従って、図１４は、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体で処置したマウスが、ＰＢＳコントロール又は５１３ビステラ抗体（ＬＡＬＡ変異で修飾した）で処置したマウスと比較して、有意に低い血清ウイルス力価を有することを示す。従って、図１４は、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体が、コントロールの抗体よりも良好に、マウスにおける血清ウイルス力価を減らすことができることを示す。 図１５は、抗体による前処置を行った又は行っていないＡＧ１２９マウスにおけるウイルス力価を表すドットプロットグラフを示す。１００μｇの抗体をマウス毎に注射した。１．５×１０^６ｐｆｕのＤＥＮＶ−３株ＶＮ３２／９６及び１０^８ｐｆｕのＤＥＮＶ−４株ＴＶＰ３６０を接種に用いた。マウスを、ＰＢＳコントロール、ビステラからの修飾抗体５１３（即ち、ＬＡＬＡ変異を有する）、又は修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体（即ち、ＬＡＬＡ変異を有する）の何れかで処置した。図１５のＡ）は、ＤＥＮＶ３に感染したＡＧ１２９マウスにおけるウイルス力価を示し、Ｂ）は、ＤＥＮＶ４に感染したＡＧ１２９マウスにおけるウイルス力価を示す。ウイルス血症を感染後４日目に試験した。図１５は、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体で処置したマウスが、ＰＢＳコントロール又は５１３ビステラ抗体（ＬＡＬＡ変異で修飾した）で処置したマウスと比較して低い血清ウイルス力価を有することを示す。従って、図１５は、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体が、コントロールの抗体よりも良好に、マウスにおける血清ウイルス力価を減らすことができることを示す。 図１６は、マウスにおける３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体による感染後処置の分析の結果を示す。マウスに、１×１０^７ｐｆｕのＤＥＮＶ−２株Ｄ２Ｙ９８Ｐを腹腔内（ｉ．ｐ．）で感染させた。感染の４８時間後に１００μｇの３Ｃ−Ｈ５Ｌ１又はコントロールＡｂを静脈内（ｉ．ｖ．）で移入した。図１６のＡ）は、抗体処置２４時間後（感染の７２時間後）に測定したウイルス力価（又はウイルス血症）を表すドットプロットを示す。図１６のＢ）は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体又はコントロールの抗体で処置したＡＧ１２９マウスの生存曲線を示す。図１６は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１がデングウイルス感染後の治療抗体として用いることが可能であることを示す。 図１７は、致死量のＤＥＮＶ−２ Ｄ２Ｙ９８Ｐの接種の感染前処置（予防モデル）又は感染後処置（治療モデル）のどちらかを受けたマウスの生存曲線を示す。Ａ）において、ＡＧ１２９マウスに、ＤＥＮＶ−２ Ｄ２Ｙ９８Ｐの致死量の接種前に、１０μｇ又は１００μｇの３Ｃ抗体のどちらかを処置し、Ｂ）において、ＩＦＮＡＲマウスをまず感染させ、２日後に１００μｇの３Ｃ抗体又はコントロール抗体で処置した。図１７は、３Ｃ抗体を感染前又は感染後に受けたマウスが、デングウイルスの致死量の接種において生存できることを示した。治療的な処置をされたＡＧ１２９マウスは、感染後２０日目及び３５日目の間に死に（図１６）、一方で、ＩＦＮＡＲマウスは、 少なくとも３２日目まで生存した（図１７のＢ）ことに留意されたい。これは、インターフェロンアルファ／ベータ受容体の欠如と組み合わされたＡＧ１２９マウスにおけるインターフェロンガンマ受容体の欠如によって、インターフェロンアルファ／ベータ受容体のみを欠いているＩＦＮＡＲマウスと比較して、感染に対してより感受性であることを示す。 図１８は、ＡＧ１２９マウスにおけるインビボでのＤＥＮＶ−２の予防における３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の修飾の効果の研究の結果を示す。ＡＧ１２９マウスに、静脈内（ｉ．ｖ．）で、５μｇの３Ｃ（非修飾／ 野生型）：Ｆｃ変異なし、３Ｃ（修飾／ＬＡＬＡ）：Ｆｃ部位におけるＬＡＬＡ変異、又はアイソタイプ（ｗｔ）：Ｆｃ変異なしのアイソタイプコントロールを処置した。１日後のマウスに、ＤＥＮＶ−２ Ｄ２Ｙ９８Ｐを腹腔内（ｉ．ｐ．）で感染させた。ウイルス血症を感染後３日目に測定した。図１８は、低い投与量では、修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１は、ＡＧ１２９マウスにおけるウイルス力価の減少において少なくとも非修飾３Ｃ Ｈ５Ｌ１と同じくらい有効であることを示す。 図１９は、ＩＦＮＡＲ又はＡＧ１２９マウスにおけるインビボでのＤＥＮＶ−２感染症の処置における、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の修飾の有効性の研究の結果を示す。ＩＦＮＡＲ又はＡＧ１２９マウスに、腹腔内（ｉ．ｐ．）で注射されたＤＥＮＶ−２ Ｄ２Ｙ９８Ｐによる感染後２日目に、静脈内（ｉ．ｖ．）で１００μｇの３Ｃ（非修飾／ 野生型）：Ｆｃ変異なし、３Ｃ（修飾／ＬＡＬＡ）：Ｆｃ部位におけるＬＡＬＡ変異、又はアイソタイプ（ｗｔ）：Ｆｃ変異なしのアイソタイプコントロールを処置した。ウイルス血症を感染後３日目に測定した。図１９は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１のＬＡＬＡ修飾は、ＡＧ１２９又はＩＦＮＡＲマウスで、ウイルス力価を減少させる効果に違いがないことを示す。 図２０は、３Ｃ抗体によって認識されるエピトープに関する研究の結果を示す。図２０のＡにおいて、３Ｃ Ｈ５Ｌ１のＥタンパク変異への相対的な結合をＸ軸に示す。野生型タンパク質（ｗｔ Ｅタンパク質）への結合は、変異型への結合を標準化するために使用した。ＨＥＫ細胞方式を用いて観察された結合を灰色のバーで示し、一方で、ＥＬＩＳＡで観察した結合を黒いバーで示した。Ｋ６４Ａ、Ｇ１００Ａ、Ｆ１０８Ａ、Ｑ１６７Ａ、Ｓ２７４Ａについては、ＥＬＩＳＡのみ行った。Ｋ１２２Ａ、Ｉ１６２Ａ、Ｑ２００Ａ、Ｅ２０２Ａ、Ｋ３１０Ａ、Ｗ３９１Ａ及びＦ３９２Ａについては、ＨＥＫ細胞発現アッセイのみ行った。破線は、変異による結合の喪失のためのカットオフとして任意に選択されたｗｔ Ｅタンパク質と比較して、７５％の結合の減少を示す。 図２０のＢ）において、エピトープマッピングアッセイにおいて同定された残基を、公的に利用可能なＥタンパク質ダイマー構造（ＰＤＢ登録番号１ＯＡＮ）で示した。同定した８つのアミノ酸（表１を参照のこと）を１つのＥタンパク質単量体（上の明るい灰色のタンパク質）における白い点及び２つ目のＥタンパク質単量体（下の暗い灰色のタンパク質）の灰色の点で強調した。２つ目のＥタンパク質単量体における残基Ｆ３９２は、イラストレーションの中に隠れており、そのため灰色の点は８個まで加算されないことに留意されたい。 図２１は、抗体３Ｃ Ｈ５Ｌ１のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。 図２２は、ＬＡＬＡ変異を有する抗体３Ｃ Ｈ５Ｌ１重鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。変異は、アミノ酸配列の中の太字で示す。

発明の詳細な説明

デングウイルスは、世界の熱帯及び亜熱帯地域で一般的な健康問題である。デングウイルス（又は本明細書では「ＤＥＮＶ」と称する）は、フラビウイルス属、フラビウイルス科の約１１ｋｂゲノムのプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。フラビウイルスは、宿主及びウイルスプロテアーゼによって処置され、３つの構造タンパク質、即ち、キャプシド（Ｃ）タンパク質、前駆膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質、並びに７つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５）を産生する単一ポリタンパク質をコードする。 抗体はＤＥＮＶに対する防御において重要な役割を果たす。

本開示において、本発明の発明者は、ＤＥＮＶに結合することができる代替抗体（当該分野で公知の用語として用いられる）を見出した。従って、１つの側面において、単離抗体、又はその抗原結合フラグメントが提供される。１つの例において、抗体は、（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１配列、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又は配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２配列、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又は配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つの重鎖アミノ酸配列、或いは抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。

本明細書に用いられる用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」と互換可能に用いることができ、本技術分野で知られた普通の用語をいい、特定の抗原に特異的に結合する免疫グロブリンをいう。この用語は、抗原に反応する生物によって生成されるという点において自然に産生される免疫グロブリン、及び合成的に産生又は改変されたものを包含する。１つの例において、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。１つの例において、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。１つの例において、抗体という用語は、所望の生物学的活性を示す限り、インタクトな抗体、抗体フラグメント、及び抗原結合フラグメントを含むように大まかに解釈され得る。

典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、本技術分野で理解される通り、四量体を含むことが知られている。各四量体は、二つの同一の対のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識の主な要因である約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）は、それぞれそのような軽鎖及び重鎖をいう。各可変領域は、更に超可変性（ＨＶ）及びフレームワーク（ＦＲ）領域にサブ分類される。超可変領域は、ベータシート構造を形成しＨＶ領域を定位置に保持する足場として働く４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ２及びＦＲ４）によって分離される、相補性決定領域と呼ばれる超可変性配列の３つの領域（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。重鎖及び軽鎖の各々のＣ末端は、軽鎖に対して１つ（ＣＬ）、及び重鎖に対して３つ（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる定常領域を規定する。１つの例において、抗体は、使用時に、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、自然に産生された抗体で起こるようなジスルフィド結合によって任意に会合された抗体をいう、全長の抗体を含み得る。

１つの例において、本明細書に記載される抗体は、細胞において産生され得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、化学合成によって産生され得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、哺乳類に由来し得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、限定されないが、マウス、ラット、ウマ、ブタ又はヤギのような動物由来であり得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、組み換え細胞培養系を用いて産生され得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、精製された抗体であり得る（例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって）。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体であり得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、ヒト化抗体（ヒトにおいて自然に産生される抗体変異との類似性を増加させるために、そのタンパク質配列が修飾された、非ヒト種由来の抗体）であり得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、キメラ抗体（例えば、マウス、ラット、ウマ又はブタ等の非ヒト起源の遺伝物質を、ヒト由来の遺伝物質と組み合わせることによって製造された抗体）であり得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、多重特異性抗体であり得る。
本明細書に用いられる用語「単離された」は、最初に、産生されるか（自然にか、及び／又は実験的な設定においてかに関わらず）、及び／又は人の手によって産生されるか、調製されるか、及び／又は製造される際、混ざっていた少なくとも幾つかの成分から分離された物質及び／又は実体をいう。単離された物質及び／又は実体は、最初にそれらに混ざっていた約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％を超える他の成分から分離され得る。１つの例において、単離された抗体は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％を超えて純粋であり得る。本明細書で用いられる場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で用いられる場合、単離された物質及び／又は実体の純度の計算には、賦形剤（例えば、緩衝剤、溶剤、水等）を含めない。

同時に、語句「抗原結合フラグメント」は、本明細書で用いられる場合、例えば、抗体の抗原結合又は可変領域のような、インタクトな抗原の一部分を含む。例えば、抗原結合フラグメントは、限定されるものではないが、抗体フラグメントから生成したＦａｂフラグメント、Ｆａｂ１フラグメント、F（ａｂ’）フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、一本鎖抗体分子、三重特異性抗体、四重特異性抗体、線状抗体、及び多重特異性抗体を含み得る。例えば、抗体フラグメントは、単離されたフラグメント、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによってつながれている組み換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、及び超可変領域をミミックしたアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。１つの例において、本明細書に記載される抗原結合フラグメントは、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合するフラグメントである、親抗体の十分な配列を含む。１つの例において、本明細書に記載される抗原結合フラグメントは、親抗体の親和性と同等の親和性で抗原に結合するか、及び／又は抗原への結合について親抗体と競合する。抗体の抗原結合フラグメントの例は、限定されるものではないが、Ｆａｂフラグメント、Fａｂ’フラグメント、F（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖ二重特異性抗体、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、何れかの方法によって産生することができる。例えば、抗体の抗原結合フラグメントは、酵素的に又は化学的にインタクトな抗体の断片化によって産生され得、及び／又は組み換えによって抗体の配列の一部分をコードする遺伝子から産生され得る。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合フラグメントは、その全体又は一部が、合成的に製造され得る。抗体の抗原結合フラグメントは、任意に、一本鎖抗体フラグメントを含み得る。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によってつなげられて一体となった複数の鎖を含み得る。抗体の抗原結合フラグメントは、任意に、多分子複合体を含み得る。機能的抗体フラグメントは、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。

本明細書に記載される抗体は、限定されるものではないが、本技術分野で知られるクラスの何れか、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤを含む何れかの免疫グロブリンのクラスの１つであり得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ抗体であり得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、限定されるものではないが、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体等を含むＩｇＧ抗体の何れか１つであり得る。１つの例において、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ１抗体であり得る。

本明細書に用いられる場合、１つ以上の関心のある値に本明細書で用いられる用語「約」は、記載された参照値に類似する値をいう。幾つかの例において、用語「約」は、別段明記されていない限り又は文脈から明らかでない限り、記載された参照値の、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下の、どちらかの方向（より多いか又はより少ないか）における範囲に含まれる値の範囲をいう（そのような数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）。

１つの例において、配列番号３は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の重鎖ＣＤＲ１をコードし、ＧＹＴＦＴＳＮＹ（配列番号３）を含む。１つの例において、配列番号４は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の重鎖ＣＤＲ２をコードし、ＩＮＰＲＧＧＳＴ（配列番号４）を含む。１つの例において、配列番号５は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の重鎖ＣＤＲ３をコードし、ＡＲＧＧＲＡＬＦＹＤＳＹＴＴＰＲＤＧＧＳＷＷＦＤＰ（配列番号５）を含む。本明細書に記載された配列識別子は、図２１に記載の配列をいう。

１つの例において、単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであり、抗体は、（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又は配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１配列、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又は配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２配列、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又は配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つの軽鎖アミノ酸配列、或いは抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。

１つの例において、配列番号６は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の軽鎖ＣＤＲ１をコードし、ＱＤＩＲＫＹ（配列番号６）を含む。１つの例において、配列番号７は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の軽鎖ＣＤＲ２をコードし、ＤＡＳ（配列番号７）を含む。１つの例において、配列番号８は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体の軽鎖ＣＤＲ３をコードし、ＱＱＦＤＤＬＰＩＴ（配列番号８）を含む。本明細書に記載された配列識別子は、図２１に記載の配列をいう。

１つの例において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１配列、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又は配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２配列、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又は配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つの重鎖アミノ酸配列、並びに（ｄ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又は配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１配列、（ｅ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又は配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２配列、（ｆ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又は配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つの軽鎖アミノ酸配列、或いは、デングウイルス粒子全体を認識する抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。

１つの例において、本明細書に記載された抗体、又は抗体結合フラグメントは、本明細書に記載されるＣＤＲを含む、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全ての重鎖アミノ酸配列を含み得る。１つの例において、本明細書に記載された抗体、又は抗体結合フラグメントは、本明細書に記載されるＣＤＲを含む、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全ての軽鎖アミノ酸配列を含み得る。

本明細書に用いられる用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、抗体又はその抗体結合フラグメントの１つ以上の構造要素についてコードするアミノ酸配列をいう。１つの例において、 抗体、又はその抗体結合フラグメントは、ポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、参照された抗体に見られるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／又は 少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含む、ポリペプチドを含み得る。１つの例において、抗体、又はその抗体結合フラグメントは、含まれるＣＤＲは、配列において同一であるか、或いは参照されたＣＤＲと比較して１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つのアミノ酸の置換を含むという点において、参照されるＣＤＲと実質的に同一であり得る。１つの例において、含まれるＣＤＲは、参照されるＣＤＲと少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８１％、又は少なくとも８２％、又は少なくとも８３％、又は少なくとも８４％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示すという点において、参照されるＣＤＲと実質的に同一であり得る。１つの例において、含まれるＣＤＲは参照されるＣＤＲと少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示すという点において、参照されるＣＤＲと実質的に同一であり得る。１つの例において、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１つ、又は少なくとも２つのアミノ酸が、参照されるＣＤＲと比較して、欠失、付加または置換されているが、含まれるＣＤＲは参照されるＣＤＲのアミノ酸配列と他の点で同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照されるＣＤＲと実質的に同一であり得る。１つの例において、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲの中の１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つのアミノ酸が、参照されるＣＤＲと比較して、欠失、付加または置換されているが、含まれるＣＤＲは、参照されるＣＤＲのアミノ酸配列と他の点で同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照されるＣＤＲと実質的に同一であり得る。１つの例において、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲの中の少なくとも１つのアミノ酸が、参照されるＣＤＲと比較して置換されているが、含まれるＣＤＲは、参照されるＣＤＲのアミノ酸配列と他の点で同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照されるＣＤＲと実質的に同一であり得る。１つの例において、本明細書に記載された抗体、又は抗体結合フラグメントは、ポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、当業者によって免疫グロブリン可変ドメインとして認識される構造要素を含むポリペプチドを含み得る。１つの例において、本明細書に記載された抗体、又は抗体結合フラグメントは、免疫グロブリン−結合ドメインのホモログであるか、又はほぼホモログである結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質であり得る。当業者には理解されるように、抗体は、各々が可変領域及び定常領域を含む二つの軽鎖及び二つの重鎖からなる。軽鎖可変領域は、フレームワーク領域に隣接している、本明細書においてＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と規定される３つのＣＤＲを含む。重鎖可変領域は、フレームワーク領域に隣接している、本明細書においてＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と規定される３つのＣＤＲを含む 。

本明細書に用いられる用語「実質的に」は、関心のある特徴若しくは特性の全体若しくはほぼ全体の範囲又は度合を示す定性的条件をいう。生物学的技術における当業者であれば、生物学的及び化学的現象が、完全に終了すること及び／又は完全性に向けて進行すること、或いは、絶対的な結果を達成若しくは回避することは、仮にあるとしても、めったにないことを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の、完全性の潜在的な欠如を捕捉するために、本明細書において使用される。

１つの例において、本明細書において記載される単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１配列、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又は配列番号４に対して少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２配列、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又は配列番号５に対して少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、１つ、又は２つ或いは全ての重鎖アミノ酸配列、及び／又は（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又は配列番号６に対して少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１配列、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又は配列番号７に対して少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２配列、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又は配列番号８に対して少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、少なくとも１つ、又は２つ或いは全ての軽鎖アミノ酸配列、或いはデングウイルス粒子全体を認識する抗体、又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含み得る。

１つの例において、本明細書に記載される単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、少なくとも１つの重鎖アミノ酸配列、及び／又は（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、少なくとも１つの軽鎖アミノ酸配列、或いはデングウイルス粒子全体を認識する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。

１つの例において、本明細書に記載される単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、少なくとも１つ、又は２つ、又は全ての重鎖アミノ酸配列、及び／又は（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、少なくとも１つ、又は２つ、又は全ての軽鎖アミノ酸配列、或いはデングウイルス粒子全体を認識する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。

１つの側面において、単離抗体、又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗体は、デングウイルス粒子全体を認識する（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、及び（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む重鎖アミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

他の側面において、単離抗体、又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗体は、デングウイルス粒子全体を認識する（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

更に他の側面において、単離抗体、又はその抗原結合フラグメントが提供され、抗体は、デングウイルス粒子全体を認識する（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む重鎖アミノ酸配列、及び（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。

図２、図３及び図６に例示される実験の節に記載されるように、発明者は、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントが、デングウイルス粒子全体に結合することができることを見出した。例えば、図３は、本明細書に記載される抗体が、４ＤＥＮＶ血清型の組み換えＥタンパク質の何れにも効率的に結合することができないことを示す。対照的に、図２及び図６に示されるように、本明細書に記載される抗体は、４つのＤＥＮＶウイルス粒子全てに結合する。従って、１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、（組み換え溶解性単量体）デングウイルス表面の糖タンパク質への結合よりも、デングウイルス粒子全体により結合することができる。１つの例において、本明細書に記載された抗体、又は抗体結合フラグメントは、単量体デングウイルス表面糖タンパク質、即ち、Ｅタンパク質に、あまり結合しない可能性がある。
本技術分野で知られているように、デングウイルス（又はＤＥＮＶ）は、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４と指定される、遺伝的及び抗原的に関連する４つのウイルス血清型を有する。本開示の発明者は、本明細書に記載される抗体、又は抗原結合フラグメントは、驚くべきことに複数のデングウイルス血清型に結合し、かつ中和することを見出した。例えば、図２において、本明細書に記載される抗体は、４つのＤＥＮＶ血清型全てに結合することができる。従って、１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、少なくとも１つ デングウイルス粒子に結合し、及び／又は中和することができる。１つの例において、 デングウイルス粒子は、ＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮＶ−１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮＶ−２）、ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮＶ−３）、及びＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮＶ−４）からなる群から選択される、少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は全てのデングウイルスであり得る。１つの例において、デングウイルス粒子は、ＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮＶ−１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮＶ−２）及びＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮＶ−３）からなる群から選択される、少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は全てのデングウイルスであり得る。１つの例において、デングウイルス粒子は、ＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮＶ−１）及びＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮＶ−２）からなる群から選択される、少なくとも１つ、又は両方のデングウイルスであり得る。ＤＥＮＶ血清型の中で、抗体は、ＤＥＮＶ−２血清型を最も効率的に中和することが見いだされた。従って、１つの例において、デングウイルスは、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮＶ−２）であり得る。一般に、「血清型」は、細菌又はウイルスの種、或いは異なる個体の免疫細胞間における明確な変異をいう。

１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号１と、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされた重鎖可変領域を含むか、又はそれからなる。１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされた重鎖可変領域を含むか、又はそれからなる。１つの例において、配列番号１は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり、以下の配列を含む。

GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGCCTGACGTCGAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCAACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGGTAATCAACCCTAGGGGTGGTAGCACAGCCAGCGCACAGAAATTCCAGGGAAGAATCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTTTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGAAGGGCCCTTTTCTATGATAGTTACACGACCCCCCGAGACGGAGGGTCGTGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAAGCCTGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号１）
１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号２と、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含むか、又はそれからなる。

１つの例において、 本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含むか、又はそれからなる。１つの例において、配列番号２は、３Ｃ Ｈ５Ｌ１軽鎖をコードするヌクレオチド配列であり、以下の配列を含む。

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCTTCACTTGCCAGGCGAGCCAGGACATTAGGAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTAATCTACGATGCATCCAATTTGAAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATACTACTGTCAACAGTTTGATGATCTCCCGATCACCTTCGGCCAGGGGACACGACTGCAGATTAAACGA（配列番号２）
１つの例において、 本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされた重鎖可変領域及び配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖可変領域を含むか、又はそれらからなる。

１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。１つの例において、重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖可変領域を含む。

EVQLVQSGPDVEKPGASVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPRGGSTASAQKFQGRITMTRDTSTSTVYMELSSLRSDDTAVYYCARGGRALFYDSYTTPRDGGSWWFDPWGQGSLVTVSS（配列番号９）
１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％、又は少なくとも８６％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖可変領域を含む。１つの例において、軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を含む。

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTFTCQASQDIRKYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLKTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDVATYYCQQFDDLＰＩTFGQGTRLQIK（配列番号１０）
１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖可変領域を含む又はそれからなる。

本明細書に記載される実験の節に記載される通り、ＤＥＮＶウイルスに対する抗体は、 ウイルスを中和し、ウイルスが細胞に取り込まれることを阻害し（即ち、ウイルスが標的の細胞と融合することを阻害し）、及びＤＥＮＶ感染症に対する予防的な保護を提供することができる（中和アッセイについては図４及び図５、融合阻害アッセイについては図７及び図８、インビボにおける予防アッセイについては、図９から図１１までの例を参照のこと）。しかしながら、本技術分野で知られているように、幾つかの抗体（本技術分野で知られた）は、ＤＥＮＶ感染症の重大な臨床症状の原因となる可能性がある。例えば、本技術分野で知られる抗体は、ウイルス感染の効率の望ましくない増加を表す抗体依存性増強（ＡＤＥ）の原因として知られている。抗体依存性増強は、非中和又はサブ中和濃度の、本技術分野で知られるＤＥＮＶ血清型交差反応性抗体の存在下において、デング熱感染症が生じた際に起こることが知られている。抗体依存性増強現象において、抗体−ウイルス複合体は、樹状細胞、マクロファージ及び単球を含む循環抗原提示細胞上のＦｃ受容体に付着し、そのことは、ＤＥＮＶがＦｃ受容体保有細胞中で複製し、抗体と複合化していないＤＥＮＶと比較して高い全体の力価を達成することを許容する。全ての結果が、デング熱のより重大な症状の可能性を引き起こす。

抗体依存性増強を回避するために、抗体のＦｃ受容体への潜在的な結合を阻止する修飾が提供され得る。１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、修飾ＩｇＧ１抗体、又は修飾ＩｇＧ２抗体、又は修飾ＩｇＧ３抗体、又は修飾ＩｇＧ４抗体であり得る。１つの例において、修飾は、インビボにおける抗体の安定性を高め得る。１つの例において、 本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、抗体のＦｃ−ガンマ−受容体（ＦｃγＲ）への結合を阻止する修飾を有し得る。理論に拘束されることを望むものではないが、ＦｃＲへの低減された結合が、ＦｃＲとの相互作用によって主に媒介されると考えられる感染のＡＤＥ（抗体依存性増強）の現象を防ぎ得るために、抗体のＦｃ−ガンマ−受容体への結合を阻止する修飾は、有効であり得る。１つの例において、ＬＡＬＡ変異は、可変領域の外側に導入され得る。１つの例において、ＬＡＬＡ変異は、Ｆｃ結合ドメインに導入され得る。ＬＡＬＡ変異を有する例示的な修飾抗体の非可変（定常）領域を、図２２に示す。１つの例において、ＬＡＬＡ変異は、図２２に描かれた非可変重鎖領域にあり得る。１つの例において、ＬＡＬＡ変異を有する修飾抗体は、配列番号１１のヌクレオチド配列又は配列番号１２のアミノ酸配列にコードされた非可変重鎖領域を有し得る。
１つの例において、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、限定されるものではないが、グリコシル化、置換、変異、及びタンパク質配列修飾を含む修飾を有し得る。１つの例において、修飾は、当分野で先に記載されたＬＡＬＡ変異であり得る。ＬＡＬＡ変異を含むように抗体を修飾する方法が本技術分野において知られており、当業者は本明細書に記載される抗体に対するそのような修飾を含むように十分に意見をかわされるであろうことが理解されよう。１つの例において、ＬＡＬＡ変異は、先に、ＷＯ２０１２１３０８３１Ａ１に記載されている。

図１２のインビトロ分析に示される通り、本明細書に記載される修飾抗体は、予想通り、抗体依存性増強において通常観察されるウイルス力価における急な山の形を阻止する。図１３に示すように、抗体がマウスにおいて低濃度で試験される場合、本明細書に記載される抗体に対する修飾は、マウスにおいてウイルス力価を幾らか低減するのみであるが（使用されるウイルスの量が少ないと予想される）、重要なことに、Ｆｃ修飾のない抗体において観察されるようにウイルス血症の増加を引き起こさない（図１３のＡ）。Ｆｃ修飾のある抗体は、本明細書に記載されるコントロール非修飾抗体と比較した場合、マウスの生存をわずかに改善する（図１３のＢ）。予防的な感染前処置として与えられる場合、本明細書に記載される抗体は、ウイルス力価を有意に減少させる（図１４及び図１５を参照のこと）。治療的な処置として与えられる場合（即ち、抗体が感染後処置として与えられる場合）、本明細書に記載される抗体は、デングウイルスの致死量の接種の後であったとしても（図１７のＢ）、有意にウイルス力価を減少させ、マウスの生存を改善することができる（図１６）。興味深いことに、修飾抗体は、非修飾抗体と比較したとき、マウスにおけるウイルス力価の減少における有効性の変化を示さなかった（図１８、及び図１９）。従って、まとめると、結果は、修飾を有する又は有さない本明細書に記載される抗体は、マウスの生存率を向上させることができることを示す。非常に濃度の低い非修飾抗体（即ち、ウイルスの中和を達成するのに必要な最低濃度より低い）はＡＤＥを引き起こし、Ｆｃ修飾は、インビトロ及びマウスにおける増強効果を阻止することができる。

従って、他の側面において、本発明は、治療における使用のための本明細書に記載される単離抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。本明細書に記載される抗体が、１つの例において、望まれない抗体依存性増強を引き起こすことなしにデングウイルスを中和できると考えられるために、本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメントは、ウイルスによる最初の感染の間であっても又はウイルスによる再感染の間であっても、少なくとも１つのデングウイルス血清型によって引き起こされるデング熱に罹患している治療対象体を、処置するために用いられ得る。

１つの例において、本明細書において記載される単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントは、限定されるものではないが、抗ウイルス剤、免疫アドヒージョン分子、造影剤、治療剤等を含む薬剤を更に含み得る。

更に他の側面において、本明細書において記載される単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントを含む組成物が提供される。１つの例において、組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含み得る。

更に他の側面において、本明細書に記載される単離された抗体を含むキットが提供される。１つの例において、キットは、限定されるものではないが、抗ウイルス剤、免疫アドヒージョン分子、造影剤、治療剤等を含む薬剤を更に含み得る。１つの例において、キットは、治療対象体におけるデングウイルス感染症を処置するために用いられ得る。

１つの例において、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識及びビオチンからなる群から選択され得る。
１つの例において、本明細書に記載された抗体、又は抗体結合フラグメントは、デングウイルス粒子内にあるエピトープに特異的である。１つの例において、本明細書に記載された抗体、又は抗体結合フラグメントは、限定されるものではないが、Ｋ１２２、Ｉ１６２、及びＳ２７４（図２０に示されるエピトープマッピングに用いられるＤＥＮＶ−２のもの）を含むアミノ酸の少なくとも１つを含むエピトープに特異的であるか、又は認識するか、又は結合するか、又は結合することができる。１つの例において、抗体は、デングウイルスペプチドの、Ｋ１２２、Ｉ１６２、及びＳ２７４からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、又は全てを認識するか、結合するか、又は結合することができるか、又は特異的であり得る。１つの例において、抗体、又はその抗体結合フラグメントであり、ここで、エピトープがＫ１２２、Ｉ１６２、及びＳ２７４からなる群から選択されるデングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は全てを含むとき、エピトープは、Ｇ１００、Ｗ１０１、Ｋ３１０、Ｗ３９１、及びＦ３９２からなる群から選択されるデングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも１つを更に含み得る。１つの例において、抗体、又はその抗体結合フラグメントであって、ここで、エピトープは、Ｇ１００、Ｗ１０１、Ｋ１２２、Ｉ１６２、Ｓ２７４、Ｋ３１０、Ｗ３９１及びＦ３９２からなる群から選択されるデングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、又は全てを含む。１つの例において、 抗体、又はその抗体結合フラグメントは、デングウイルス糖タンパク質のＧ１００、Ｗ１０１、Ｋ１２２、Ｉ１６２、Ｓ２７４、Ｋ３１０、Ｗ３９１及びＦ３９２を含むか又はそれらからなるエピトープに特異的である。１つの例において、 抗体、又はその抗体結合フラグメントは、ＤＥＮＶ２から得られるデングウイルス糖タンパク質のＧ１００、Ｗ１０１、Ｋ１２２、Ｉ１６２、Ｓ２７４、Ｋ３１０、Ｗ３９１及びＦ３９２を含むか又はそれらからなるエピトープに特異的である。

本明細書に用いられる場合、用語「エピトープ」本技術分野で理解されているのと同じ意味を有する。抗原決定基としても知られるエピトープは、免疫系、特に、抗原、Ｂ細胞、又はＴ細胞によって認識される抗原の分子領域であることは、当業者に理解されるであろう。更に、エピトープは、糖、脂質又はアミノ酸から構成され得ることが理解されるであろう。タンパク質抗原のエピトープは、その構造及びパラトープ（エピトープを認識する抗体の一部）の相互作用に基づいて、立体配座エピトープ及び線状エピトープの２つのカテゴリーに分けられる。立体配座エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続部分から構成され、それらのエピトープは抗原の３−Ｄ表面特性、及び形状又は三次構造に基づいてパラトープと相互作用する。線状エピトープは、その一次構造に基づいてパラトープと相互作用し、また線状エピトープは抗原由来のアミノ酸の連続した配列によって形成される。１つの例において、本明細書に記載される抗体の結合部位として規定されるアミノ酸は、本技術分野においてその慣用の略語で記載される。例えば、Ｇは、グリシンを意味し、Ｇに続く数値は、ＰＤＢ登録番号１ＯＡＮ（ＲＣＳＢ ＰＤＢ（タンパク質データバンク）ＩＤ：１ＯＡＮ；ＤＯＩ：１０．２２１０／ｐｄｂ１ｏａｎ／ｐｄｂ）の構造において表した２つの同一の単量体からなる二量体Ｅタンパク質複合体の一部である、デングウイルスタンパク質単量体の当初と比較した、アミノ酸の相対的な位置を意味する。本技術分野で認識されるであろうように、Ｗはトリプトファンを意味し、Ｋはリシンを意味し、Ｉはイソロイシンを意味し、Ｓはセリンを意味し、Ｆはフェニルアラニンを意味する。エピトープは、複数のＥタンパク質二量体がウイルス粒子上に構築されるとき、 その複数のＥタンパク質二量体に亘って広がっていてもよい。

図７、図８、図１４、図１５、及び図１８に示されるように、本明細書に記載される抗体、又は抗原結合フラグメントは、予防的な処置に用いられ得る。従って、本発明は、更に他の側面において、受動ワクチンを提供する。１つの例において、デングウイルス血清型の少なくとも１つに対する受動ワクチンは、本明細書に記載される単離された抗体又は本明細書に記載される組成物又は本明細書に記載されるキットを含み得る。用語「ワクチン」は、本明細書で用いられる場合、例えば病原体に対する、免疫防御を提供することを意図した組成物をいう。１つの例において、ワクチンは、病原体（例えばデングウイルス）に曝露される前、間、及び／又は後に投与され得る。 本明細書に用いられる用語「受動ワクチン」は、「受動免疫」と互換可能に用いられ得、抗体を治療対象体に投与する免疫をいう。

図１６、図１７のＢ、及び図１９に示されるように、本明細書に記載される抗体、又は抗原結合フラグメントは、ウイルス感染後の治療的な処置において用いられ得る。従って、更に他の側面において、治療対象体におけるデングウイルス感染症の治療方法が提供される。１つの例において、方法は、有効量の本明細書において記載される単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント、又は本明細書に記載される組成物、又は本明細書に記載されるワクチンを治療対象体に投与することを含む。１つの例において、方法は、少なくとも１つの追加の治療の投与を更に含む。１つの例において、少なくとも１つの追加の治療は、抗ウイルス治療及び／又は抗炎症剤であり得る。更に他の例において、追加の治療は、単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントと一緒に又はそれとは別々に罹患体に投与され得る。

本明細書で本開示を通して用いられる用語「治療対象体」は、用語「罹患体」と互換可能に用いられ得、本明細書に記載される、提供された組成物、又は抗体、又は抗原結合フラグメントを投与する何れかの生物をいう。例えば、投与は、実験的、診断的、予防的、化粧的、及び／又は治療的な目的のためのものであり得る。典型的な罹患体は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／又はヒトのような哺乳類）を含む。１つの例において、治療対象体は、哺乳類であり得る。１つの例において、哺乳類は、ヒトであり得る。

本明細書に用いられる用語「処置」（「処置する」又は「処置すること」も同様に）は、特定の疾患、障害及び／又は状態（例えばデング熱のような）の１つ以上の症状、特徴、及び／又は原因の発生を、部分的又は完全に軽減し、改善し、緩和し、阻害し、発症を遅らせ、重症度を軽減し、及び／又は減らす物質（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合フラグメント又は組成物）の何れかの投与をいう。このような処置は、関連する疾患、障害及び／又は状態の兆候を示していない治療対象体、及び／又は疾患、障害及び／又は状態の初期兆候のみを示す治療対象体へのものであってもよい。代わりに又は加えて、そのような処置は、関連する疾患、障害及び／又は状態の１つ以上の確立された兆候を示す治療対象体へのものであってもよい。幾つかの例において、処置は、関連する疾患、障害及び／又は状態に起因する苦痛であると診断された療対象体へのものであってもよい。幾つかの例において、処置は、関連する疾患、障害及び／又は状態の発症の危険性の増加と統計的に関連した１つ以上の感受性因子を有することが知られた治療対象体へのものであってもよい。

更に他の側面において、治療対象体におけるデングウイルス感染症を処置するための医薬品の製造における本明細書に記載された抗体、又はその抗体結合フラグメント又は本明細書に記載される組成物、又は本明細書に記載されるキット、又は本明細書に記載されるワクチンの使用が提供される。１つの例において、医薬品は、少なくとも１つ追加の治療とともに投与され得る。１つの例において、少なくとも１つ追加の治療は、抗ウイルス治療であり得る。
本明細書で本開示に亘って用いられる用語「抗ウイルス治療」は、特に、ウイルス粒子を阻害し、不活性化し、又は破壊することによって、ウイルス感染症を処置するために用いられる医薬品又は治療の分類をいう。１つの例において、抗ウイルス剤は、何れかの化学的分類（例えば、低分子、金属、核酸、ポリペプチド、脂質及び／又は炭水化物）の化合物であるか、又はそれを含み得る。１つの例において、抗ウイルス治療又は剤は、抗体又は抗体ミミックであるか、又はそれを含み得る。１つの例において、抗ウイルス剤又は治療は、核酸剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）又はそのミミックであるか、又はそれを含み得る。１つの例において、抗ウイルス治療又は剤は、天然に存在する化合物（例えば、低分子）であるか、又はそれを含み得る。１つの例において、抗ウイルス治療又は剤は、人工的に生成された及び／又は修飾された化学構造であるか、又はそれを有し得る。

更に他の例において、追加の治療は、単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントと一緒に又は別々に罹患体に投与され得る。

図４に示されるように、本明細書に記載される抗体は、デングウイルス血清型の少なくとも１つに結合させて用いられ得る。従って、更に他の側面において、試料におけるデングウイルス血清型の少なくとも１つを検出する方法が提供される。１つの例において、方法は、試料を本明細書に記載される単離された抗体、又は本明細書に記載されるキットの少なくとも１つとともにインキュベーションする工程、及び、抗体−デングウイルス複合体を検出することを含み、ここで、複合体の存否は、試料におけるデングウイルスの存否を意味する。試料におけるデングウイルス血清型の検出の方法の詳細は、本技術分野で知られており、当業者は、追加の実験の負担なしに方法を実施することができるであろう。

更に他の側面において、限定されるものではないが、（ａ）本明細書に記載される単離された抗体、又はその抗体フラグメントをコードする核酸配列、（ｂ）配列番号１及び２に示される核酸配列、（ｃ）本明細書に記載される配列（即ち、（ａ）又は（ｂ））の何れか１つに相補的な核酸、（ｄ）厳しい条件下で（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）とハイブリダイズすることができる核酸配列等を含む単離された核酸分子が提供される。

本明細書に用いられる、用語「核酸」は、最も広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれた又は組み込まれ得る何れかの化合物及び／又は物質をいう。１つの例において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれた又は組み込まれ得る化合物及び／又は物質であり得る。１つの例において、用語「核酸」は、個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）をいう。１つの例において、用語「核酸」は、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖をいう。本明細書に用いられる用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、互換可能に用いられ得る。１つの例において、「核酸」は、ＲＮＡ、並びに一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡ及び／又はＣＤＮＡを包含する。更に、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」及び／又は同様の用語は、核酸類似体、即ち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。

本明細書に用いられる用語「厳しい条件」は、これらの条件をいう。重鎖及び軽鎖プラスミドにおける抗体可変領域が、ベクターの非可変部（５’ＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧ（配列番号１３）及び５’ＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＧ（配列番号１４））に結合するプライマーとともにＰＣＲによって増幅され、得られたＰＣＲ産物を、サンガーシーケンスを用いて配列決定し、配列番号１及び配列番号２に規定される正確な配列を確認する。

更に他の側面において、本明細書に記載される核酸配列を含むベクターが提供される。本明細書に用いられる用語「ベクター」は、関連する別の核酸を運ぶことができる核酸分子をいう。１つの例において、ベクターは、真核及び／又は原核細胞のような宿主細胞において、それらに連結している核酸の染色体外複製及び／又は発現を行うことができるものである。作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができるベクターを、本明細書において「発現ベクター」という。

更に他の側面において、本明細書に記載されるベクターによって形質転換された宿主が提供される。１つの例において、宿主は細胞である。１つの例において、宿主は細胞であり得、細胞は、限定されるものではないが、本明細書に記載される抗体、又はその抗原結合フラグメントを産生することができることが知られている、ヒトの、細菌の、動物の、真菌の、両生類の又は植物の細胞等を含み得る。１つの例において、 細胞は、細胞株である。

１つの例において、細胞株は、本技術分野で知られる細胞から産生され得、例えば、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ＣＨＯ、２９３、２９３ｅ、植物細胞及び昆虫細胞等である。

当業者は、抗体又はその抗原結合フラグメントの生成は、動物において行われ得ることを理解するであろう。従って、１つの例において、宿主は、非ヒトトランスジェニック動物であり得る。
他の側面において、本明細書に記載される宿主から抗体を得る工程を含む、本明細書に記載される抗体、又は抗原結合フラグメントを製造するプロセスが提供される。

本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない何れかの要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）または要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、限定（ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）又は限定（ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）が存在しない場合に適切に実施することができる。それゆえ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、広範かつ制限なしに読まれるものとする。さらに、本明細書で使用される用語および表現は、説明のための用語であって限定のためではなく、示された及び説明された特徴又はその一部の何れもの均等物を除外するようなそのような用語及び表現の使用は意図されておらず、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内で種々の変更が可能であることを理解されたい。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された本明細書に具体化された本発明の修正及び変換は、当業者によって再分類されてもよく、そのような変更及び変換は本発明の範囲内にあると考えられる。

本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。包括的な開示内に含まれるより狭い種及び亜属のグループの各々も、本発明の一部を形成する。このことは、除去した物質が本明細書に具体的に列挙されているか否かにかかわらず、何れかの対象物質を属から除去した条件又は負の制限を伴う本発明の包括的な説明を含む。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例の範囲内にある。更に、本発明の特徴又は側面がマーカッシュグループで記載されている場合、当業者は、本発明は、マーカッシュグループの個々のメンバー又はサブグループのメンバー何れにおいても記載されることを理解することができるであろう。

実験の節
材料
Ａｂ ３Ｃ Ｈ５Ｌ１の配列を、シュー（Ｘｕ）及びハディノト（Ｈａｄｉｎｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１２、Ｄｅｃ １５；１８９（１２）：５８７７−８５．Ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１２０１６８８（この内容は参照により本明細書に援用される）に記載の、急性デング熱感染症の罹患体由来の形質芽細胞から単離した。単一のＣＤ１９^＋ＣＤ２０⁻ＣＤ３８^ｈｉｇｈＣＤ２７^ｈｉｇｈ形質芽細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａによってトリス緩衝液及びＲＮＡｓｅ阻害剤を含む９６ウェルプレートに分け、すぐに冷凍した。解凍後、ヒトＩｇＧ重及びカッパ軽鎖のｍＲＮＡを、（スミスら、２００９．ワクチン接種抗原に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体の迅速な生成。Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４：３７２−３８４、この内容は参照により本明細書に援用される）から公開されたプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲによって単一のＢ細胞から個別に増幅した。重及び軽鎖の可変領域を、ＩｇＧ１発現プラスミド（国家研究会議バイオテクノロジー研究所、カナダ からライセンスを受けた）にクローニングした。重及び軽鎖プラスミドを、抗体の一過性発現のたにめに、２９３ｆｅｃｔｉｎを用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に同時に導入した。選択したＩｇＧ１抗体をプロテインＡビーズを用いて培養上清から精製した。

方法
抗体をＨＥＫ２９３ｅ細胞において、組み換え技術によって発現させ、ＥＬＩＳＡ、中和アッセイ、免疫蛍光及びマウスにおけるインビボにおいて試験した。

ウイルス
使用した全てのウイルスは、Ｃ６／３６蚊細胞（ＡＴＣＣ）において産生した。以下の罹患体単離デングウイルス株を用いた。ＤＥＮＶ１−０５Ｋ２９１６；「１６７」（ＥＵ０８１２３４）とも称する、ＤＥＮＶ−１−０８Ｋ３１２６（環境保健研究所、シンガポールによって単離された）、ＤＥＮＶ２−ＴＳＶ０１（ＡＹ０３７１１６．１）、ＤＥＮＶ−２ Ｄ２Ｙ９８Ｐ（ＪＦ３２７３９２．１）、ＤＥＮＶ３−ＶＮ３２／９６（EU４８２４５９）、ＤＥＮＶ４−２６４１Ｙ０８（環境保健研究所、シンガポールによって単離された）、及びＤＥＮＶ−４ ＴＶＰ３６０（ＷＨＯ参考株）。

ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）
ＤＥＮＶ−特異的ＥＬＩＳＡ（図１）については、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）をＰＥＧ沈殿した熱不活性化ＤＥＮＶ血清型１〜４でコーティングした。プレートをＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）及び３％のスキムミルクでブロッキングした。Ａｂ−発現ＨＥＫ細胞からの上清を、ウイルスでコーティングしたプレート上で、ＲＴで１時間インキュベーションした後、ＰＢＳＴで洗浄し、二次抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ）でウイルス−結合抗体を検出した。ＩｇＧの絶対的な濃度を、既知の濃度のＩｇＧ標準を含むＩｇＧ−特異的ＥＬＩＳＡで決定した。図２において、ＥＬＩＳＡプレートを、４Ｇ２抗体（４つの血清型全てのＥタンパク質に結合する。ＡＴＣＣから）によってコーティングし、カゼインでブロッキングした。次いで、プレートを生きたウイルス粒子とともにインキュベートし、洗浄した後、抗体を添加した。Ｅタンパク質−特異的抗体を、（ウマシャンカー（Ｕｍａｓｈａｎｋａｒ）ら、２００８、クラスＩＩ融合タンパク質による異なるコレステロール結合が膜融合特性を決定する。Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：９２４５−９２５３、この内容は参照により本明細書に援用される）に記載されたＳ２細胞において産生されたＤＥＮＶ−１、−２、−３又は−４の１５０ｎｇ／ウェルのＥタンパク質でコーティングされたプレート上で測定した。２９３ＨＥＫ細胞の上清又は精製された抗体をスクリーニングのために用いた。幾つかのデング熱免疫健常ドナーからのプール血清をポジティブコントロールとして使用した。３，３，５，５−テトラメチルベンジジンＨＲＰ基質溶液（ＴＭＢ、シグマ）を全てのＥＬＩＳＡの基質として用いた。バックグラウンドよりも２倍高いＯＤ値を陽性信号と規定した。

プラーク減少中和アッセイ
ＢＨＫ−２１細胞（１×１０^５／ウェル）を、２４−ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。無血清培地内の異なる濃度に希釈した（３０μｇ〜０．３μｇ／ｍｌ）抗体３Ｃを、同じ体積のＤＥＮＶと混合し、室温で２時間インキュベーションした。ウイルス−抗体混合物（１００μｌ）を２４ウェルプレートに移し、３７℃で１時間インキュベーションした後、１０％のＦＣＳ及び０．８％のメチルセルロースを含む同じ体積のＲＰＭＩを添加した。４．５日後、細胞を３．７％のホルマリンで固定した。上を覆っているものを捨て、細胞を、０．８％のＰＦＡを含むクリスタルバイオレットで染色した。プラークを目視によって数え、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおける３パラメータ非線形曲線適合を用いてＰＲＮＴ５０値を算出した。

免疫組織化学
ＢＨＫ−２１細胞を９６−ウェルプレートに播種し、ＭＯＩ１のＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４に、３７℃で１時間感染させた。ウイルスを除去した後、５％のＦＣＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩを細胞に添加し、細胞を３７℃でインキュベーションした。感染から４８時間後に、細胞を４％のＰＦＡによって室温（ＲＴ）で２０分間固定した。全ての洗浄は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１０分間行った。細胞を１×ＰＢＳ＋０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００によってＲＴで１５分間透過化し、ついでＲＴで１時間ブロッキングした（１×ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ）。細胞を抗体３Ｃ（１μｇ／ｍｌ）とともにＲＴで１時間インキュベーションし、洗浄し、抗−ヒトＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８とともにＲＴで１時間インキュベーションした。２回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２をＲＴで５分間添加した。抗体結合をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８特異的吸収フィルタ及び励起フィルタを備えるオリンパス共焦点顕微鏡を用いて可視化した。

中和のメカニズム：付着前及び付着後中和アッセイ
３Ｃ抗体が、目的の細胞に既に一度結合したウイルス粒子を中和できるか否かを評価するために、付着前及び付着後中和アッセイを行った。アッセイは、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を用いて行った。プロトコールは、マシューら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００９：６４９４−６５０７（この内容は参照により本明細書に援用される）及びクリルら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００１：７７６９−７７７３（この内容は参照により本明細書に援用される）から適用した。付着前中和アッセイついては、細胞を予め冷蔵した。一定の量のウイルスを１０〜０．００１μｇ／ｍｌ最終濃度の抗体と混合し、４℃で１時間インキュベーションした。抗体−ウイルス−混合物を、予め冷蔵した細胞に添加し、４℃で１時間インキュベーションした。細胞を３回洗浄し、次いで、３７℃で４８時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、固定し、Ｅタンパク質及びＮＳ１タンパク質に結合する抗体で細胞内染色し、フローサイトメトリーで分析した。Ａｂ濃度当たりの感染細胞の割合を、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを用いてＥＣ５０の計算のためにプロットした。付着後中和アッセイについては、細胞を予め冷蔵した。ウイルスを添加し（上記と同じ量）、４℃で１時間インキュベーションした。細胞を３回洗浄した。抗体を１０〜０．００１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、４℃で１時間インキュベーションした。細胞を３回洗浄し、次いで、３７℃で４８時間インキュベーションした。細胞の染色は、付着前アッセイと同様に行った。

図５に記載したように、中和効果が細胞へのウイルスの付着前及び付着後の両方において観察された。しかしながら、付着前の実験ではより効率的な中和の傾向がある。

中和のメカニズム：融合阻害
成功する感染に不可欠な工程は、デングウイルス粒子の宿主細胞との融合である。一度ウイルスが宿主の膜に融合すると、ウイルスＲＮＡが細胞内に放出されて翻訳され得、ウイルスの複製が始まる。ウイルスが細胞に取り込まれた後、融合事象がエンドソームにおいて起こり、これはこの細胞コンパートメントにおける低いｐＨによって引き起こされる。幾つかのデング熱抗体は、この融合事象を阻害することができることが知られている。これをインビトロにおいて試験する方法は、ヒトエンドソームのような細胞膜組成物を有するＣ６／３６細胞を用いる。インビトロでｐＨを低下させると、感染した細胞は融合する。このような融合体は透過性であり、核はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色される。この方法は、ラジャマノマニ（Ｒａｊａｍａｎｏｎｍａｎｉ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００９（９０）７９９−８０９（この内容は参照により本明細書に援用される）に詳細に記載されている。手短には、１ウェルあたり５００，０００個のＣ６／３６細胞をＭＯＩ０．０１のＤＥＮＶ−２ ＴＳＶ０１と混合し、９６ウェルプレートにおいて２８℃で７２時間インキュベーションした。異なる濃度の抗体を、次いで、細胞に添加し、２８℃で１時間インキュベーションした。０．５ＭのＭＥＳバッファーｐＨ５（最終濃度０．０１２５Ｍ）を、シンシチウム形成を誘導するために添加した（３７℃で１時間）。培地を除去し、ＲＰＭＩ溶液中の０．０２５ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を細胞に添加し、２８℃で３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をすぐに共焦点顕微鏡を用いて画像化した。

抗体依存性増強（ＡＤＥ） アッセイ
同一の体積の一定量のウイルス及び減少する量の抗体３Ｃ（３０μｇ／ｍｌから始めた）を、３７℃で１時間インキュベーションした。これらのウイルス−抗体混合物を、次いで、丸底９６ウェルプレートにあらかじめ分注されたＫ５６２細胞に移し、３７℃で１時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＣＳとともにＲＰＭＩ培地で７２時間インキュベーションした。感染したＫ５６２細胞の上清のウイルスを、プラーク減少中和アッセイで説明したプラークアッセイ及びクリスタルバイオレット染色に基づいてＢＨＫ−２１細胞を用いて決定した。

マウスモデル
Ｓｖ１２９バックグラウンド（ＡＧ１２９）マウスのインターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ−受容体ノックアウトマウス（Ｕ＆Ｋユニバーサル、ＵＫ）及びＣ５７ＢＬ−６バックグラウンド（ＩＦＮＡＲ）マウスのインターフェロンアルファ／ベータ−受容体ノックアウトマウス（Ｐｒｏｆ．Ｍｉｃｈｅｌ Ａｇｕｅｔ、ＥＰＦＬ、スイス 起源のもの）をシンガポールの生物資源センター（ＢＲＣ）においてＳＰＦ条件下で飼育した。動物実験は、シンガポールの農産物・家畜庁（ＡＶＡ）及び動物実験研究のための国家アドバイザリー委員会（ＮＡＣＬＡＲ）の規則及びガイドラインに従って行った。実験は、シンガポールの生物資源センターの治験審査委員会によって調査され、承認された。

以下のウイルス株を、感染に用いた。ＤＥＮＶ−１ ０８ Ｋ３１２６、ＤＥＮＶ−２ ＴＳＶ０１又はＤ２Ｙ９８Ｐ、ＤＥＮＶ−３ ＶＮ３２／９６、ＤＥＮＶ−４ ＴＶＰ３６０。

インビボアッセイ−感染前処置（予防的）
１００μｌのＰＢＳ中のＡｂを、後眼窩洞を介して静脈内に注射した。マウスを、ＲＰＭＩ培地中のＤＥＮＶに２４時間、腹腔内経路で感染させた。感染後３日目にマウスの眼窩後洞から採血し、抗凝固剤として２０μｌのクエン酸ナトリウムを含むチューブに入れた。血液チューブを１０００ｇで５分間遠心分離し、血漿を回収し、後の分析のために凍結させた。

インビボアッセイ−感染後処置（治療的）
マウスをＲＰＭＩ培地中のＤＥＮＶに、腹腔内経路で感染させた。感染の４８時間後に、Ａｂ ３Ｃ Ｈ５Ｌ１を、後眼窩洞を介して静脈内に注射した。２４時間後（感染後３日目）に、後眼窩洞を介して採血し、抗凝固剤として２０μｌのクエン酸ナトリウムを含むチューブに入れた。血液チューブを１０００ｇで５分間遠心分離し、血漿を回収し、後の分析のために凍結させた。

予防モデルにおける４つのＤＥＮＶ血清型全てに対する有効性及び Ａｂ ３Ｃの公開された治療的デング熱抗体との比較
図１４及び図１５において、ＡＧ１２９マウス又はＩＦＮＡＲマウスを、ＤＥＮＶ−１、−２、−３及び−４に対する抗体の予防的保護を評価するために用いた。ウイルス血症を感染後３又は４日目に試験した。ＡＧ１２９及びＩＦＮＡＲマウスにおける有効性は、非常に似ていた（図１９のＡ及びＢを比較のこと）。ＩＦＮ−ガンマ受容体は、少なくとも感染の早い段階では、有効性には影響を与えないようである。マウスを「インビボアッセイ−感染前処置（予防的）」に説明したように抗体で処置した。同じ実験において、抗体３Ｃの効力を、ビステラからの抗体５１３（配列を記載した特許が公開されている）の効力と比較した。両方の抗体集団が、中外製薬によって同時に産生され、両方の抗体がＦｃ部位にＬＡＬＡ変異を含む。マウスを、「インビボアッセイ−感染前処置（予防的）」において説明したように抗体で処置した。ＤＥＮＶ−１及びＤＥＮＶ−２について抗体あたり１０μｇを用い、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４について抗体あたり１００μｇを用いた。結果は、４つのＤＥＮＶ血清型全てに関して、３Ｃは、Ａｂ ５１３よりも効率的にウイルス血症を低減させたことを示す。
治療モデルにおけるＤＥＮＶ−２に対する有効性
ＤＥＮＶ−２ Ｄ２Ｙ９８Ｐは死を引き起こすため、ＤＥＮＶ−２モデルをＡｂ ３Ｃの保護能力を評価するために用いた。

３Ｃのエピトープ
大量のＤＥＮＶ−２の全長Ｅタンパク質変異型がＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現され、そのような形質導入されたＨＥＫ細胞への３Ｃへの結合をフローサイトメトリーによって試験した。

加えて、Ｅタンパク質の可溶性の部位がＳ２細胞においても発現された。ＤＥＮＶ−２（株ＴＳＶ０１）から種々の変異型及び野生型が発現され、精製され、ＥＬＩＳＡに用いられた。Ｅタンパク質は、Ｖ５タグを含み、プレートを抗Ｖ５抗体でコーティングし、次いで個別のＥタンパク質を添加した。このサンドイッチアプローチによって、おそらくＥタンパク質の多量体化のために、Ｅタンパク質がプレートに直接コーティングされているＥＬＩＳＡと比較して３Ｃの結合が増加した。

変異型をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（アジレントゲノミクス）を用いて導入した。ＨＥＫ２９３細胞を１００，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、一晩インキュベーションした。細胞を、次いで、製造者のプロトコールに従って２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを用いて、ＤＥＮＶ−２ ＴＳＶ０１のｐｒＭ及びＥタンパク質を含む、１μｇのｐｃＤＮＡ３．１で形質導入した。感染から７２時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析した：形質導入したＨＥＫ細胞を３Ｃ抗体とともにインキュベーションし、次いで、抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣとともにインキュベーションした。Ｅタンパク質変異体の発現を試験するために、ＤＥＮＶ−２ ＥＤＩＩＩ（ＡＴＣＣから）に特異的な抗体３Ｈ５を用い、次いで、抗−マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣとともにインキュベーションした。以下の式は、相対的な結合を計算するために用いた：Ｅタンパク質変異型ｘにおける３Ｃの相対的な結合＝［（３Ｃで染色した％ＦＩＴＣ−陽性細胞／変異型ｘに対する抗−ヒトＩｇＧ）／（３Ｈ５で染色した％ＦＩＴＣ−陽性細胞／変異型ｘに対する抗−マウスＩｇＧ）］／［（３Ｃで染色した％ＦＩＴＣ−陽性細胞／ｗｔ Ｅタンパク質に対する抗−ヒトＩｇＧ）／（３Ｈ５で染色した％ＦＩＴＣ−陽性細胞／野生型Ｅタンパク質に対する抗−マウスＩｇＧ）］。

ＥＬＩＳＡに関しては、「ＥＬＩＳＡ」の節に説明したように、Ｓ２細胞において、大量のＥタンパク質変異型（Ｅタンパク質の可溶性部位）が発現した。変異をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（アジレントゲノミクス）を用いて導入した。Ｅタンパク質構造体は、Ｖ５タグも含む。Ｅタンパク質変異型を、キレートセファロースビーズを用いて精製した。Ｎｕｎｃ免疫−アッセイＥＬＩＳＡプレートをマウス抗−Ｖ５タグ抗体でコーティングした。ＰＢＳＴ中の３％ミルドでブロッキングしたのち、Ｅタンパク質変異型を５μｇ／ｍｌでウェルに２時間添加した。洗浄した後、抗体３Ｃを全てのＥタンパク質変異型に２反復で添加し、ＲＴで１時間インキュベーションした。３Ｃを抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出した。ＴＭＢ基質を、発色反応を起こすために用いた。ポジティブコントロールとして、異なるエピトープを有する３つのヒトデング熱抗体の混合物を用いた。このポジティブコントロールの結合は、全てのＥタンパク質変異型について類似していたため、各変異型への３Ｃの結合の値は野生型のＥタンパク質へ結合している３Ｃの値によってのみ分けられた。

大量のＤＥＮＶ−２の全長のＥタンパク質変異型が、ＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現され、３Ｃのそれらの形質導入したＨＥＫ細胞への結合をフローサイトメトリーによって試験した。加えて、Ｅタンパク質の可溶性部位は、Ｓ２細胞においても発現した。ＤＥＮＶ−２（株ＴＳＶ０１）から種々の変異型及び野生型が発現し、精製され、ＥＬＩＳＡに用いられた。Ｅタンパク質は、Ｖ５タグを含み、プレートを抗−Ｖ５抗体でコーティングし、次いで、個々のＥタンパク質を加えた。このサンドイッチアプローチによって、おそらくＥタンパク質の多量化のために、Ｅタンパク質がプレートに直接コーティングされているＥＬＩＳＡと比較して３Ｃの結合が増加する。

図２０において、３ＣのＥタンパク変異体への相対的な結合が、ｘ軸に示されている。野生型タンパク質（ｗｔ Ｅタンパク質）への結合は、変異型への結合を標準化するために用いた。ＨＥＫ細胞アプローチを用いて観察された結合を灰色のバーで示し、ＥＬＩＳＡにおいて観察された結合を黒色のバーで示す。Ｋ６４Ａ、Ｇ１００Ａ、Ｆ１０８Ａ、Ｑ１６７Ａ、及びＳ２７４Ａに関しては、ＥＬＩＳＡのみ行った。Ｋ１２２Ａ、Ｉ１６２Ａ、Ｑ２００Ａ、Ｅ２０２Ａ、Ｋ３１０Ａ、Ｗ３９１Ａ、及びＦ３９２Ａに関しては、ＨＥＫ細胞発現アッセイのみ行った。破線は、変異による結合の喪失のためのカットオフとして任意に選択されたｗｔ Ｅタンパク質と比較して、７５％の結合の減少を示す。

まとめ
３Ｃ Ｈ５Ｌ１抗体は、インビトロで、ＤＥＮＶ−２に結合し及び中和し、ＤＥＮＶ−１、３、４には、より少ない程度であるが、依然として強力に（ｍＭからｎＭまでの範囲のＥＣ５０で）結合し及び中和する。３ＣＨ５Ｌ１抗体は、ウイルス粒子全体に結合し、組み換えＥタンパク質には効率的に結合しない。３ＣＨ５Ｌ１抗体は、インビボにおける４つのＤＥＮＶ血清型全てに対する顕著なインビボ有効性を有し、致死のＤＥＮＶ−２株に由来する死から保護する。３ＣＨ５Ｌ１のＦｃ部位における修飾（例えば、ＬＡＬＡ変異）を導入することによって、インビボでの効果を損なうことなく、観察された３ＣＨ５Ｌ１の低い程度の抗体依存性増強（即ち、ＡＤＥ）を完全に阻止することができた。観察された４つの血清型に対する有効性及び致死のＤＥＮＶ−２に対する保護は、デングウイルス（即ち、ＤＥＮＶ）に対する他の知られた抗体では満たされたい。本技術分野で知られる非常に効力のある中和抗体は、通常１つの血清型に対して特異的である一方で、本明細書に記載される抗体は、複数のＤＥＮＶ血清型に対して中和能を有することが示された。事実、インビボでは、本明細書に記載される抗体は４つのＤＥＮＶ血清型全てに対して効力を示す。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又は配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２配列、
（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又は配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３配列、
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む１つの重鎖アミノ酸配列、
又は抗体、若しくはその抗原結合フラグメント
を少なくとも含む単離された抗体、又は抗原結合フラグメント。
［２］
単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又は配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１配列、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又は配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２配列、
（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又は配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３配列、
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む１つの軽鎖アミノ酸配列、
又は抗体、若しくはその抗原結合フラグメント
を少なくとも含む単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［３］
前記抗体は、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又は配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又は配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２配列,
（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又は配列番号５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３配列、
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む１つの重鎖アミノ酸配列、及び
（ｄ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又は配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又は配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２配列、
（ｆ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又は配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３配列、
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖アミノ酸配列
又はデングウイルス粒子全体を認識する抗体、若しくはその抗原結合フラグメント
を少なくとも含む［１］又は［２］に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［４］
単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、
（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列、
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む１つの重鎖アミノ酸配列、及び／又は
（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、
（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、又はそれとは１つ若しくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列、
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖アミノ酸配列
又はデングウイルス粒子全体を認識する抗体、若しくはその抗原結合フラグメント
を少なくとも含む単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［５］
単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
デングウイルス粒子全体を認識する、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、及び
（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、
からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列
を含む単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［６］
単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
デングウイルス粒子全体を認識する、
（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、
（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、
からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列
を含む、単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［７］
単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
デングウイルス粒子全体を認識する、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、
からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む重鎖アミノ酸配列、及び
（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、
（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、
からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列
を含む単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［８］
Ｋ１２２、Ｉ１６２、及びＳ２７４からなる群から選択される、デングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも１つを含むエピトープに特異的である抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［９］
前記エピトープが、Ｋ１２２、Ｉ１６２、及びＳ２７４からなる群から選択される、デングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも１つを含む場合、前記エピトープが、Ｇ１００、Ｗ１０１、Ｋ３１０、Ｗ３９１、及びＦ３９２からなる群から選択されるデングウイルス糖タンパク質の少なくとも１つを更に含む［８］に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１０］
前記エピトープが、Ｇ１００、Ｗ１０１、Ｋ１２２、Ｉ１６２、Ｓ２７４、Ｋ３１０、Ｗ３９１及びＦ３９２からなる群から選択される、デングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも３つを含む［８］又は［９］に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１１］
前記抗体は、デングウイルス表面の糖タンパク質への結合よりも、デングウイルス粒子全体により結合することができる［１］〜［１０］の何れか１つに記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１２］
前記糖タンパク質は、Ｅタンパク質である、［１］〜［１１］の何れか１つに記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１３］
前記デングウイルス粒子は、ＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮＶ−１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮＶ−２）、ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮＶ−３）、及びＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮＶ−４）からなる群から選択される少なくとも１つのデングウイルスである［１］〜［１２］の何れか１つに記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１４］
前記抗体は、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、［１］〜［１３］の何れか１つに記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１５］
前記抗体は、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む［１４］に記載の単離された抗抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１６］
前記抗体は、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、［１］〜［１５］の何れか１つに記載の単離された抗抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１７］
前記抗体は、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む［１６］に記載の単離された抗抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１８］
前記抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列又は、それとは少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む［１］〜［１７］の何れか１つに記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［１９］
前記抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列又は、それとは少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む［１］〜［１８］の何れか１つに記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［２０］
前記抗体がモノクローナル抗体である、上記の何れか１つに記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［２１］
前記抗体は、修飾されたＩｇＧ１抗体、修飾されたＩｇＧ２抗体、修飾されたＩｇＧ３抗体、又は修飾されたＩｇＧ４抗体である上記の何れか１つに記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［２２］
前記修飾は、抗体のＦｃ−ガンマ−受容体（ＦｃγＲ）への結合を阻止する［２１］に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［２３］
治療に用いるための、上記の何れか１つに記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
［２４］
［１］〜［２２］の何れか１つに記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントを含む組成物。
［２５］
［１］〜［２２］の何れか１つに記載の単離された抗体を含むキット。
［２６］
［１］〜［２２］の何れか１つに記載の単離された抗体、又は［２４］に記載の組成物、又は［２５］に記載のキットを含むデングウイルス血清型の少なくとも１つに対する受動ワクチン。
［２７］
治療対象体におけるデングウイルス感染症の治療方法であって、
［１］〜［２２］の何れか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント、又は［２４］に記載の組成物、又は［２６］に記載のワクチンの有効量を前記治療対象体に投与することを含む方法。
［２８］
治療対象体におけるデングウイルス感染症を処置するための医薬品の製造における、［１］〜［２２］の何れか１つに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント、又は［２４］に記載の組成物、又は［２５］に記載のキット、又は［２６］に記載のワクチンの使用。
［２９］
試料におけるデングウイルス血清型の少なくとも１つを検出する方法であって、
ａ．前記試料を、［１］〜［２２］の何れか１つに記載の単離された抗体又は［２５］に記載のキットの少なくとも１つとともにインキュベーションすること、及び
ｂ．抗体−デングウイルス複合体を検出すること（ここで、前記複合体の存否は、前記試料におけるデングウイルスの存否を意味する）
を含む方法。
［３０］
ａ．［１］〜［２２］の何れか１つに記載の単離された抗体、又は抗体フラグメントをコードする核酸配列、
ｂ．配列番号１及び２に示す核酸配列、
ｃ．（ａ）又は（ｂ）］に記載の何れか１つの配列に相補的な核酸、及び
ｄ．厳しい条件下で、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）にハイブリダイズすることができる核酸配列
からなる群から選択される単離された核酸分子。
［３１］
［３０］に記載の核酸配列を含むベクター。
［３２］
［３１］に記載のベクターで形質転換した宿主。
［３３］
［３２］に記載の宿主から抗体を得る工程を含む、［１］〜［２２］の何れか１つに記載の抗体、又は抗原結合フラグメントを製造する方法。

Claims (26)

1. 単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントであって、
   デングウイルス粒子全体を認識する、
   （ａ）配列番号３に示されるＣＤＲＨ１、
   （ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲＨ２、
   （ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲＨ３、
   からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む重鎖アミノ酸配列、及び
   （ａ）配列番号６に示されるＣＤＲＬ１、
   （ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲＬ２、
   （ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲＬ３、
   からなる群から選択される全てのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列
   を含む単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
2. 前記抗体は、Ｋ１２２、Ｉ１６２、及びＳ２７４からなる群から選択される、デングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも１つを含むエピトープに特異的である、請求項１に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
3. 前記エピトープが、Ｋ１２２、Ｉ１６２、及びＳ２７４からなる群から選択される、デングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも１つを含む場合、前記エピトープが、Ｇ１００、Ｗ１０１、Ｋ３１０、Ｗ３９１、及びＦ３９２からなる群から選択されるデングウイルス糖タンパク質の少なくとも１つを更に含む請求項２に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
4. 前記エピトープが、Ｇ１００、Ｗ１０１、Ｋ１２２、Ｉ１６２、Ｓ２７４、Ｋ３１０、Ｗ３９１及びＦ３９２からなる群から選択される、デングウイルス糖タンパク質のアミノ酸の少なくとも３つを含む請求項２又は３に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
5. 前記抗体は、デングウイルス表面の糖タンパク質への結合よりも、デングウイルス粒子全体により結合することができる請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
6. 前記糖タンパク質は、Ｅタンパク質である、請求項１〜５の何れか１項に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
7. 前記デングウイルス粒子は、ＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮＶ−１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮＶ−２）、ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮＶ−３）、及びＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮＶ−４）からなる群から選択される少なくとも１つのデングウイルスである請求項１〜６の何れか１項に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
8. 前記抗体は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の抗体、又はその抗原結合フラグメント。
9. 前記抗体は、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む請求項８に記載の単離された抗抗体、又はその抗原結合フラグメント。
10. 前記抗体は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の単離された抗抗体、又はその抗原結合フラグメント。
11. 前記抗体は、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む請求項１０に記載の単離された抗抗体、又はその抗原結合フラグメント。
12. 前記抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列又は、それとは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む請求項１〜１１の何れか１項に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
13. 前記抗体、又はその抗体結合フラグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列又は、それとは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項１〜１２の何れか１項に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
14. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１３の何れか１項に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
15. 前記抗体は、修飾されたＩｇＧ１抗体、修飾されたＩｇＧ２抗体、修飾されたＩｇＧ３抗体、又は修飾されたＩｇＧ４抗体である請求項１〜１４の何れか１項に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
16. 前記修飾は、抗体のＦｃ−ガンマ−受容体（ＦｃγＲ）への結合を阻止する請求項１５に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
17. 治療に用いるための、請求項１〜１６の何れか１項に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメント。
18. 請求項１〜１６の何れか１項に記載の単離された抗体、又はその抗原結合フラグメントを含む組成物。
19. 請求項１〜１６の何れか１項に記載の単離された抗体を含むキット。
20. 請求項１〜１６の何れか１項に記載の単離された抗体、又は請求項１８に記載の組成物、又は請求項１９に記載のキットを含むデングウイルス血清型の少なくとも１つに対する受動ワクチン。
21. 治療対象体におけるデングウイルス感染症を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜１６の何れか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント、又は請求項１８に記載の組成物、又は請求項１９に記載のキット、又は請求項２０に記載のワクチンの使用。
22. 試料におけるデングウイルス血清型の少なくとも１つを検出する方法であって、
    ａ．前記試料を、請求項１〜１６の何れか１項に記載の単離された抗体又は請求項１９に記載のキットの少なくとも１つとともにインキュベーションすること、及び
    ｂ．抗体−デングウイルス複合体を検出すること（ここで、前記複合体の存否は、前記試料におけるデングウイルスの存否を意味する）
    を含む方法。
23. ａ．請求項１〜１６の何れか１項に記載の単離された抗体、又は抗体フラグメントをコードする核酸配列、
    ｂ．配列番号１及び２に示す核酸配列、及び
    ｃ．（ａ）又は（ｂ）に記載の何れか１つの配列に相補的な核酸、
    からなる群から選択される単離された核酸分子。
24. 請求項２３に記載の核酸配列を含むベクター。
25. 請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
26. 請求項２５に記載の宿主細胞から抗体を得る工程を含む、請求項１〜１６の何れか１項に記載の抗体、又は抗原結合フラグメントを製造する方法。

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