JP6635052B2 - 構造化照明顕微鏡、及び観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、構造化照明顕微鏡、観察方法、及び制御プログラムに関する。

顕微鏡装置において、光学系の分解能を越えた観察を可能とする超解像顕微鏡がある。この超解像顕微鏡の一形態として、構造化照明により標本を照明して変調画像を取得し、その変調画像を復調することにより、標本の超解像画像を生成する構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ：Structured Illumination Microscopy）が知られている（例えば、特許文献１を参照）。この手法においては、光源から射出された光束を回折格子等により複数の光束に分岐し、それらの光束を標本の近傍で互いに干渉させることで形成された干渉縞で標本を照明することにより、標本の変調画像を取得している。

米国再発行特許発明第３８３０７号明細書

ところで、構造化照明顕微鏡において撮像された変調像には、焦点深度内の領域からの光（信号）および焦点深度外の領域からの光が含まれている。焦点深度外の領域のからの光による画像成分が持つ構造化照明のコントラストは低いので、試料の厚みが結像光学系の焦点深度を超えて厚くなるほど、撮影画像中における構造化照明のコントラストが減少し、例えば撮像素子のデバイス特性によっては、復調に使われる信号のレベルを確保することが難しくなる。本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、結像光学系の焦点深度を超える厚みの試料に対して超解像画像を生成できる構造化照明顕微鏡、観察方法、及び制御プログラムを提供することを目的とする。

本発明の態様に従えば、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射する第１照明光学系と、対物レンズを有し、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、対物レンズを介して干渉縞で試料に照射する第２照明光学系と、干渉縞の方向および位相を制御する制御部と、対物レンズを有し、干渉縞が照射された試料の像を形成する結像光学系と、結像光学系が形成した像を撮像して画像を生成する撮像素子と、撮像素子により生成された複数の画像を用いて、試料の画像を生成する復調部と、を備え、第２照明光学系は、励起光を回折により複数の回折光に分岐する分岐部と、複数の回折光のうち、＋１次回折光または−１次回折光の通過状態と遮断状態とを切り替え可能な遮光部と、を備える、ことを特徴とする構造化照明顕微鏡が提供される。
また、本発明の態様に従えば、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射することと、対物レンズを有する第２照明光学系によって、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、対物レンズを介して干渉縞で試料に照射することと、干渉縞の方向および位相を制御することと、対物レンズを有する結像光学系によって、干渉縞が照射された試料の像を形成することと、像を撮像して画像を生成することと、撮像により生成された複数の画像を用いて、試料の画像を生成することと、第２照明光学系によって、励起光を回折により複数の回折光に分岐し、複数の回折光のうち、＋１次回折光または−１次回折光の通過状態と遮断状態とを切り替えることと、を含むことを特徴とする観察方法が提供される。
本発明の態様に従えば、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射する第１照明光学系と、対物レンズを有し、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、対物レンズを介して干渉縞で試料に照射する第２照明光学系と、干渉縞の方向および位相を制御する制御部と、対物レンズを有し、干渉縞が照射された試料の像を形成する結像光学系と、結像光学系が形成した像を撮像して画像を生成する撮像素子と、撮像素子により生成された複数の画像を用いて、試料の画像を生成する復調部と、を備えることを特徴とする構造化照明顕微鏡が提供される。
本発明の態様に従えば、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射することと、対物レンズを有する第２照明光学系によって、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、対物レンズを介して干渉縞で試料に照射することと、干渉縞の方向および位相を制御することと、対物レンズを有する結像光学系によって、干渉縞が照射された試料の像を形成することと、像を撮像して画像を生成することと、撮像により生成された複数の画像を用いて、試料の画像を生成することと、を含むことを特徴とする観察方法が提供される。
本発明の態様に従えば、コンピュータに、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射することと、対物レンズを有する第２照明光学系によって、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、対物レンズを介して干渉縞で試料に照射することと、干渉縞の方向および位相を制御することと、対物レンズを有する結像光学系によって、干渉縞が照射された試料の像を形成することと、像を撮像して画像を生成することと、撮像により生成された複数の画像を用いて、試料の画像を生成することと、を実行させることを特徴とする制御プログラムが提供される。
本発明の第１の態様に従えば、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射する第１照明光学系と、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を試料に照射し、励起光の干渉縞で試料を照明する第２照明光学系と、干渉縞の方向および位相を制御する制御部と、干渉縞が照射された試料の像を形成する結像光学系と、結像光学系が形成した像を撮像して第１画像を生成する撮像素子と、撮像素子により生成された複数の第１画像を用いて、第２画像を生成する復調部と、を備えることを特徴とする構造化照明顕微鏡が提供される。

本発明の第２の態様に従えば、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射することと、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、干渉縞で試料に照射することと、干渉縞の方向および位相を制御することと、干渉縞が照射された試料の像を形成することと、像を撮像して第１画像を生成することと、撮像により生成された複数の第１画像を用いて、第２画像を生成することと、を含むことを特徴とする観察方法が提供される。

本発明の第３の態様に従えば、コンピュータに、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射することと、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、干渉縞で試料に照射することと、干渉縞の方向および位相を制御することと、干渉縞が照射された試料の像を形成することと、像を撮像して第１画像を生成することと、撮像により生成された複数の第１画像を用いて、第２画像を生成することと、を実行させることを特徴とする制御プログラムが提供される。

本発明によれば、結像光学系の焦点深度を超える厚みの試料に対して超解像画像を生成できる構造化照明顕微鏡、観察方法、及び制御プログラムを提供することができる。

第１実施形態に係る構造化顕微鏡を示す図である。 マスクの例を示す図である。 第２照明光学系における回折光の偏光状態を示す図である。 瞳面における集光領域の位置および偏光状態を示す図である。 活性化照明部からの活性化光および励起照明部の照明領域を示す図である。 構造化照明顕微鏡の動作の一例を示すフローチャートである。 蛍光色素の活性化のレベルを検出する処理を示すフローチャートである。 蛍光色素の不活性化のレベルを検出する処理を示すフローチャートである。 活性化照明部の第１変形例を示す図である。 活性化照明部の第２変形例を示す図である。 活性化照明部の第３変形例を示す図である。 活性化照明部の第４変形例を示す図である。 活性化照明部の第５変形例を示す図である。 活性化照明部の第６変形例を示す図である。 活性化照明部の第７変形例を示す図である。 活性化照明部の第８変形例を示す図である。 活性化照明部の第９変形例を示す図である。 活性化照明部の第１０変形例を示す図である。 活性化照明部の第１１変形例を示す図である。 不活性化照明部の変形例を示す図である。 第２実施形態に係る構造化顕微鏡を示す図である。

［第１実施形態］
図１は、本実施形態に係る構造化照明顕微鏡１（観察システム）を示す図である。構造化照明顕微鏡１は、蛍光色素（蛍光物質）で染色された試料Ｓの観察に使われる。試料Ｓは、例えば、平行平板状のガラス表面に配置された蛍光性の細胞（蛍光色素で染色された細胞）や、シャーレ内に存在する蛍光性の生体細胞（蛍光色素で染色された動く細胞）などの細胞である。

試料Ｓに含まれる蛍光色素は、活性化光を受けて活性化され、活性化状態で励起光を受けて蛍光を発する。また、この蛍光色素は、活性化された状態で不活性化光を受けると、蛍光を発して不活性化状態になる。不活性化光の波長は、例えば励起光の波長と同じでよい。このような蛍光色素としては、例えば、２種類のシアニン染料を結合させた染料対（例、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対、Ｃｙ２−Ｃｙ５染料対、Ｃｙ３−Ａｌｅｘａ６４７染料対など）がある。例えばＣｙ３−Ｃｙ５染料対ではＣｙ３がＣｙ５を活性化させる部位となっており、５３２ｎｍの緑色光を照射することでＣｙ５が活性化される。また、Ｃｙ５の吸収波長に対応する６４０ｎｍの赤色光を照射すると、Ｃｙ５が蛍光を放って不活性化する。

構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓの厚さ方向の一部の二次元的な超解像画像を生成する２Ｄ−ＳＩＭモードを有する。構造化照明顕微鏡１は、ステージ２、活性化照明部３、励起照明部４、撮像部５、復調部６、及び制御部７を備える。構造化照明顕微鏡１は、概略すると以下のように動作する。ステージ２は、試料Ｓを保持する。活性化照明部３は、試料Ｓにシート状の活性化光を照射する。活性化照明部３は、試料Ｓの厚み方向の一部を選択的に活性化し、試料Ｓの他の部分を不活性な状態に維持する。励起照明部４は、励起光で干渉縞を形成する。励起照明部４は、活性化照明部３の光照射方向に垂直な方向から、試料Ｓのうち活性化された部分を干渉縞で照明する。撮像部５は、干渉縞で変調された試料Ｓの変調像を撮像する。復調部６は、撮像部５が撮像した変調像を復調し、試料Ｓの像（超解像画像）を生成する。制御部７は、構造化照明顕微鏡１の各部を制御し、各種処理を実行させる。

次に、構造化照明顕微鏡１の各部について説明する。以下の説明において、活性化照明部３が試料に光を照射する第１方向（光照射方向）をＸ方向とする。また、励起照明部４が試料Ｓに光を照射する第２方向（光照射方向）をＺ方向とする。また、Ｘ方向およびＺ方向のそれぞれに垂直な第３方向をＹ方向とする。Ｘ方向およびＹ方向は、例えば水平方向に設定され、Ｚ方向は、例えば鉛直方向に設定される。なお、各方向に＋または−を付して、適宜、方向および向きを表す。

ステージ２は、その上面に試料Ｓを載置可能である。ステージ２は、上面に試料Ｓが載置された状態で、上面をＺ方向に移動可能である。ステージ２は、制御部７に制御され、上面のＺ方向の位置を調整可能である。制御部７は、ステージ２を制御することで、上面に配置されている試料ＳのＺ方向の位置（高さ）を制御できる。なお、ステージ２は、Ｘ方向とＹ方向の少なくとも１方向に試料Ｓを移動可能であってもよいし、Ｚ方向に試料Ｓを移動しなくてもよい。

活性化照明部３は、光源部１０、及び第１照明光学系１１を備える。光源部１０は、制御部７に制御され、活性化光を発する。活性化光は、所定の蛍光物質（蛍光色素）を活性化する第１波長帯の光を含む。光源部１０は、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）を含むが、発光ダイオード（ＬＥＤ）を含んでいてもよい。光源部１０は、活性化光としてコヒーレント光とインコヒーレント光のいずれを発してもよい。光源部１０は、活性化光として直線偏光、楕円偏光、無偏光のいずれを発してもよい。なお、構造化照明顕微鏡１は、光源部１０を備えていなくてもよい。例えば、光源部１０は、構造化照明顕微鏡１に交換可能（取り外し可能）に設けられ、構造化照明顕微鏡１の外部の装置であってもよい。

第１照明光学系１１は、光源部１０からの活性化光を試料Ｓへ導く。本実施形態において、活性化照明部３の光照射方向がＸ方向となるように、第１照明光学系１１の光軸ＡＸ１が設定されている。第１照明光学系１１は、光源部１０の光出射側に、集光レンズ１２、光ファイバ１３、コリメータレンズ１４、シリンドリカルレンズ１５、スリット１６、及びレンズ群１７を備える。

集光レンズ１２は、光源部１０からの活性化光を、光ファイバ１３の入射端面に収まるように集光する。光ファイバ１３は、入射端面に入射した光を出射端面に導く導光部材である。コリメータレンズ１４は、光ファイバ１３の出射端面から出射した活性化光を平行化する。シリンドリカルレンズ１５は、ＸＺ平面における屈折力（パワー）がＸＹ平面における屈折力よりも強い光学部材である。コリメータレンズ１４およびシリンドリカルレンズ１５は、試料Ｓ（活性化照明部３の照明領域）における活性化光の断面形状を、Ｙ方向とＺ方向のうちＺ方向を短手方向とする形状に成形する。

スリット１６は、視野絞り（絞り部材）であり、活性化照明部３の照明領域と光学的に共役な位置に配置されている。スリット１６は、光源部１０からの活性化光の少なくとも一部が通る開口部を有する。開口部の形状は、Ｚ方向の寸法がＹ方向の寸法よりも短い形状に設定され、例えばＺ方向に平行な短辺を有する矩形状である。スリット１６の開口率は、固定値であってもよいし、可変値であってもよい。例えば、スリット１６の開口部の形状と寸法の少なくとも一方は、可変であってもよい。例えば、スリット１６の開口部は、Ｙ方向とＺ方向の少なくとも一方において内寸が可変なものであってもよい。

レンズ群１７は、例えば投影光学系であり、スリット１６の開口部の像を活性化照明部３の照明領域に投影する。スリット１６の開口部を通った活性化光は、レンズ群１７を介して試料Ｓに照射される。第１照明光学系１１の光出射側（例、レンズ群１７）の開口数（ＮＡ）を小さくしておくことで、第１照明光学系１１から出射する際の活性化光の広がり角を小さくすることができる。その結果、試料Ｓにおいて活性化光の厚み（光路のＺ方向の幅）の変化を減らすことができる。

このように、活性化照明部３は、試料ＳのうちＺ方向の一部に活性化光を照射し、試料Ｓのうちシート状の部分を選択的に活性化できる。活性化されたシート状の部分を、以下の説明において活性化層という。

本実施形態において、構造化照明顕微鏡１は、不活性化照明部２０を備える。不活性化照明部２０は、活性化光により活性化された蛍光色素を不活性化する不活性化光を、試料Ｓに照射する。不活性化照明部２０は、光源部２１、ミラー２２、ダイクロイックミラー２３、及び第１照明光学系１１を備える。光源部２１は、所定の蛍光色素を活性化された状態から不活性な状態へ遷移させる第２波長帯の光を含む不活性化光を発する。

光源部２１から出射した不活性化光は、ミラー２２で反射し、ダイクロイックミラー２３に入射する。ミラー２２およびダイクロイックミラー２３は、光源部２１から出射した不活性化光を第１照明光学系１１へ導く導光部である。ダイクロイックミラー２３は、光源部１０と集光レンズ１２との間の光路に配置されている。ダイクロイックミラー２３は、その内部に波長選択膜を有する。この波長選択膜は、光源部１０からの活性化光が透過し、光源部２１からの不活性化光が反射する特性を有する。ダイクロイックミラー２３に入射した不活性化光は、波長選択膜で反射し、光源部１０からの活性化光とほぼ同じ光路を通って、第１照明光学系１１に入射する。第１照明光学系１１に入射した不活性化光は、活性化光と同様に、シート状に成形されて試料Ｓに照射される。なお、構造化照明顕微鏡１は、光源部２１を備えていなくてもよい。例えば、光源部２１は、構造化照明顕微鏡１に交換可能（取り外し可能）に設けられ、構造化照明顕微鏡１の外部の装置であってもよい。

本実施形態において、不活性化照明部２０が不活性化光を照射する範囲（以下、不活性化照明部２０の照明領域という）は、活性化照明部３が活性化光を照射する範囲（以下、活性化照明部３の照領域という）とほぼ一致する。不活性化照明部２０の照明領域は、活性化照明部３の照明領域よりも広域に設定されていてもよい。例えば、第１照明光学系１１のスリット１６の開口部が可変である場合、スリット１６の開口幅（例、Ｚ方向の内径）は、第１照明光学系１１を不活性化光が通る際に、第１照明光学系１１を活性化光が通る際よりも大きく設定されてもよい。この場合、試料Ｓにおいて活性化された部分に不活性化されない部分が残ることを抑制できる。なお、制御部７は、スリット１６の開口部を駆動する駆動部（図示せず）を制御し、スリット１６の開口率を制御してもよい。

励起照明部４は、励起光で形成される干渉縞で試料を照明する。励起照明部４は、光源部３０、及び第２照明光学系３１を備える。光源部３０は、制御部７に制御され、励起光を発する。励起光は、所定の蛍光色素を励起する波長帯の光を含み、例えば不活性化光と同じ波長の光を含む。光源部３０は、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）などを含み、励起光としてコヒーレント光を発してもいいし、あるいは、発光ダイオード（LED）などを含み、励起光としてインコヒーレント光を発してもよい。ここでは、光源部３０は、活性化光として直線偏光を発する。なお、構造化照明顕微鏡１は、光源部３０を備えていなくてもよい。例えば、光源部３０は、構造化照明顕微鏡１に交換可能（取り外し可能）に設けられ、構造化照明顕微鏡１の外部の装置であってもよい。

第２照明光学系３１は、対物レンズ３２を介して励起光を試料Ｓに照射し、試料Ｓを落射照明する。対物レンズ３２の光軸（第２照明光学系３１の光出射側の光軸）は、Ｚ方向に設定されている。第２照明光学系３１の光軸ＡＸ２は、対物レンズ３２よりも光源部３０側においてダイクロイックミラー３３により折り曲げられている。第２照明光学系３１の光軸ＡＸ２は、ダイクロイックミラー３３よりも光源部３０側の光路において任意に設定され、例えばＸＹ平面と平行な方向に設定される。

第２照明光学系３１は、光源部３０の光出射側に、集光レンズ３５、光ファイバ３６、及びコレクタレンズ３７を備える。集光レンズ３５は、光源部３０からの励起光を、光ファイバ３６の入射端面に収まるように集光する。光ファイバ３６は、入射端面に入射した光を出射端面に導く導光部材である。光ファイバ３６は、例えば、偏波面保存型のシングルモードファイバであり、励起光の偏光状態をほぼ変化させないで、励起光を導く。光ファイバ３６から出射する励起光は、例えば、Ｚ方向の直線偏光である。コレクタレンズ３７は、光ファイバ３６の出射端面から出射した励起光を平行化する。

第２照明光学系３１は、コレクタレンズ３７の光出射側に、偏光板３８、回折格子３９、１／２波長板４０、及びレンズ４１を備える。本実施形態において、第２照明光学系３１の光軸ＡＸ２は、コレクタレンズ３７からダイクロイックミラー３３に至る光路において、Ｘ方向と平行に設定されている。偏光板３８は、その透過軸に平行な直線偏光を通し、透過軸に垂直な直線偏光を遮断（遮光）する。偏光板３８は、例えば、その透過軸がＺ方向と平行に設定され、励起光のうち偏光状態が乱れた成分や、偏光板３８よりも光源部３０側からの迷光などを遮断する。

回折格子３９は、光源部３０からの励起光を分岐する分岐部である。回折格子３９は、励起光を回折により、複数の光束に分岐する。本実施形態において、第２照明光学系３１は、回折格子３９で発生する＋１次回折光と−１次回折光との２光束干渉により、標本中で干渉縞を生成する。図１には、０次回折光を実線で示し、＋１次回折光を鎖線、−１次回折光を２点鎖線で示した。

回折格子３９は、例えば１次元の周期構造を持つものである。この周期構造は、濃度（透過率）が周期的に変化する構造であってもよいし、段差（位相差）が周期的に変化する構造であってもよい。回折格子３９が位相型である場合、±１次回折光の回折効率が高く、干渉縞の形成に±１次回折光を用いる場合に光のロスをへらすことができる。なお、試料Ｓに形成される干渉縞の周期は、撮像部５の結像光学系５５（後述する）の解像限界よりわずかに小さい周期とするとよい。干渉縞の空間変調周波数を結像光学系５５で形成できる限界にできるだけ近づけることで、復調処理により得られる試料像の解像度をより高めることができる。

ところで、２Ｄ−ＳＩＭにおいて１枚の試料の像を取得する場合、復調処理における演算（復調演算）に、例えば、９枚の変調像が使われる。そのため、２Ｄ−ＳＩＭにおいては、干渉縞の向きを３通りに変化させ、かつ干渉縞の各向きに対して干渉縞の位相を３通りに変化させて、干渉縞の向きと位相との組み合わせが異なる９通りの各状態で変調像を撮像する。

本実施形態に係る構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓのうち活性化層の像を取得する際の復調演算に９枚の変調像を用いる（後述する）。干渉縞の向きは、干渉縞において光強度が周期的に変化する方向（光強度がほぼ変化しない方向の直交方向）に相当する。干渉縞の向きは、例えば、回折格子３９を第２照明光学系３１の光軸ＡＸ２の周りで回転（回動）させることで、変更可能である。また、干渉縞の位相は、干渉縞における明部の位置、暗部の位置に相当する。干渉縞の位相は、例えば、回折格子３９を第２照明光学系３１の光軸ＡＸ２に交差する方向に移動することで、変更可能である。

本実施形態において、第２照明光学系３１は、回折格子３９を光軸ＡＸ２の周りで回転させる回転駆動部４２を備える。回転駆動部４２は、例えば電動モータなどのアクチュエータを含む。回転駆動部４２は、制御部７によって制御され、回折格子３９を回転させる。制御部７は、回転駆動部４２を制御することにより、回折格子３９の回転位置を、第１の回転位置と第２の回転位置と第３の回転位置とで切り替える（後に図３に示す）。例えば、第２の回転位置は、第１の回転位置から１２０°回転した回転位置であり、第３の回転位置は、第２の回転位置から１２０°（第１の回転位置から２４０°）回転した回転位置である。

本実施形態において、第２照明光学系３１は、回折格子３９を光軸ＡＸ２に垂直な方向に駆動する平行駆動部４３を備える。平行駆動部４３は、例えばピエゾ素子などのアクチュエータを含む。平行駆動部４３は、制御部７によって制御され、回折格子３９を平行移動させる。制御部７は、平行駆動部４３を制御することにより、ＹＺ平面に平行な方向において回折格子３９の位置を制御する。制御部７は、例えば、回折格子３９の位置を変更するたびに、干渉縞の位相が所定量だけ変化するように、平行駆動部４３を制御する。この所定量は、例えば、干渉縞の周期の約１／３（例、２π／３の位相）に設定される。

１／２波長板４０は、試料Ｓに入射する際の励起光の偏光状態がＳ偏光になるように、回折格子３９からの励起光の偏光状態を調整する（後に図３および図４に示す）。レンズ４１は、１／２波長板４０からの励起光を瞳共役面４４に集光する。励起光は、レンズ４１によって、回折光の次数の応じた位置に集光される。例えば、励起光のうち０次回折光は、瞳共役面４４上の光軸ＡＸ２に向かって集光される。励起光のうち＋１次回折光は、瞳共役面４４上の光軸ＡＸ２からずれた位置に向かって集光される。励起光のうち−１次回折光は、瞳共役面４４上の光軸ＡＸ２に対して、＋１次回折光の集光位置と対称的な位置に向かって集光される。

第２照明光学系３１は、レンズ４１の光出射側に、マスク４５、レンズ４６、視野絞り４７、レンズ４８、励起フィルタ４９、ダイクロイックミラー３３、及び対物レンズ３２を備える。

マスク４５（光束選択部）は、回折格子３９からの複数の回折光のうち、干渉縞の形成に使われる次数の回折光を通し、干渉縞の形成に使われない次数の回折光を遮断する。本実施形態において、干渉縞の形成に使われる回折光は±１次であり、マスク４５は、±１次回折光を通すとともに、０次回折光およびその他の回折光を遮断する。マスク４５は、例えば、瞳共役面４４（開口絞りの位置）に配置される。マスク４５は、０次回折光の光路、＋１次回折光の光路、及び−１次回折光の光路がいずれも重ならない位置に配置されていればよく、例えば瞳共役面４４の近傍に配置されていてもよい。

図２（Ａ）は、マスク４５の一例を示す図である。マスク４５において光軸ＡＸ２を含む部分は、０次回折光が入射する部分であり、遮光部になっている。マスク４５は、第２照明光学系３１の光軸ＡＸ２から離れて配置された複数の開口部４５ａ〜開口部４５ｆを有する。開口部４５ａ〜開口部４５ｄは、光軸ＡＸ２の周りに６０°おきに配置されている。開口部４５ａ、開口部４５ｄは、それぞれ、回折格子３９が第１の回転位置に配置されている場合の＋１次回折光Ｌ１、−１次回折光Ｌ２が通る位置に配置されている。開口部４５ｃ、開口部４５ｆは、それぞれ、回折格子３９が第２の回転位置に配置されている場合の＋１次回折光、−１次回折光が通る位置に配置されている。開口部４５ｂ、開口部４５ｅは、それぞれ、回折格子３９が第３の回転位置に配置されている場合の＋１次回折光、−１次回折光が通る位置に配置されている。開口部４５ａ〜開口部４５ｆの内寸は、それぞれ、干渉縞の形成に使われる光束が通過する有効径を確保するように設定される。

図２（Ｂ）は、マスク４５の他の例を示す図である。このマスク４５は、光軸ＡＸ２およびその周囲が円盤状の遮光部５０になっている。マスク４５は、環状の外縁部５１を有し、遮光部５０は帯状の支持部５２によって外縁部５１に支持されている。支持部５２は、回折格子３９が第１〜第３の回転位置のいずれに配置されている場合においても±１次回折光が通らない位置に、配置されている。

レンズ４６は、マスク４５からの励起光（±１次回折光）を、回折格子３９の各位置で発生した回折光ごとに同じ位置に集光する。また、レンズ４１およびレンズ４６は、回折格子３９の像を形成する。視野絞り４７は、回折格子３９と光学的に共役な位置に配置されている。視野絞り４７は、励起光が通る開口部を有し、開口部の形状および寸法によって、第２照明光学系３１の照明領域を規定する。

励起フィルタ４９は、レンズ４６からの光のうち励起波長以外の光の少なくとも一部を遮断する。例えば、励起フィルタ４９は、励起フィルタ４９よりも光源部３０側からの迷光をカットする。ダイクロイックミラー３３は、光源部３０からの励起光が反射し、試料Ｓからの蛍光が透過する特性を有する。ダイクロイックミラー３３は、例えば、Ｘ方向と約４５°の角度で傾斜して設けられる。励起フィルタ４９からの励起光は、ダイクロイックミラー３３で反射して光路が約９０°折れ曲がり、＋Ｚ方向に進行して対物レンズ３２に入射する。対物レンズ３２は、視野絞り４７と光学的に共役な位置に回折格子３９の像を形成する。

ここで、回折格子３９の回転位置による励起光の光路および偏光状態について説明する。図３は、回折格子３９の各回転位置における励起光の光路および偏光状態を示す図である。図４は、回折格子３９の各回転位置において、対物レンズ３２の瞳面３２ａにおける集光領域と励起光の偏光状態を示す図である。図３および図４において、丸枠の矢印は、励起光の偏光状態を示す。

符号Ｑ１は、回折格子３９が第１の回転位置に配置された状態を示す。第１の回転位置は、任意に設定されるが、例えば、回折格子３９の周期方向Ｄ１がＺ方向と平行になる回転位置とする。偏光板３８の透過軸３８ａは、例えば、Ｚ方向と平行に設定され、偏光板３８を通った励起光の偏光状態Ｑ１ａは、Ｚ方向の直線偏光である。回折格子３９で発生した＋１次回折光Ｌ１と−１次回折光Ｌ２は、回折格子３９の周期方向Ｄ１に互いに離れるように、分岐する。回折格子３９と１／２波長板４０との間の光路において、各回折光の偏光状態Ｑ１ｂは、例えばＺ方向の直線偏光である。状態Ｑ１において、１／２波長板４０の進相軸４０ａは、例えばＹ方向と−４５°の角度をなす方向に設定される。１／２波長板４０を通った各回折光のうち０次回折光は、マスク４５に遮られ、試料Ｓへ向かう光路から除かれる。マスク４５を通った＋１次回折光Ｌ１および−１次回折光Ｌ２の偏光状態Ｑ１ｃは、それぞれ、回折格子３９の周期方向Ｄ１に直交する方向（Ｙ方向）の直線偏光である。

図４の状態Ｑ１に示すように、＋１次回折光Ｌ１および−１次回折光Ｌ２は、それぞれ、対物レンズ３２の瞳面３２ａ上の集光領域に集光される。ここで、光軸ＡＸ２の周りの回転位置θを、Ｘ方向と平行な径方向の回転位置を０°とし、−Ｚ方向から見た場合に時計回りを正とする角度で表す。＋１次回折光Ｌ１の集光領域は、θ＝０°の回転位置に配置され、−１次回折光Ｌ２の集光領域は、θ＝１８０°の回転位置に配置される。＋１次回折光Ｌ１の集光領域と−１次回折光Ｌ２の集光領域とを結ぶ方向Ｄ４は、Ｘ方向に平行であり、試料Ｓに対する±１次回折光の入射面は、光軸ＡＸ２を含み方向Ｄ４に平行な面（ＸＺ面）である。±１次回折光は、Ｙ方向の直線偏光になっており、試料Ｓに対するＳ偏光になっている。

また、図３および図４において符号Ｑ２は、回折格子３９が第２の回転位置に配置された状態を示す。状態Ｑ２において、回折格子３９の周期方向Ｄ２とＺ方向との角度は、例えば１２０°である。偏光板３８を通った励起光の偏光状態Ｑ２ａは、例えばＺ方向の直線偏光である。回折格子３９で発生した＋１次回折光Ｌ１と−１次回折光Ｌ２は、回折格子３９の周期方向Ｄ２に互いに離れるように、分岐する。回折格子３９と１／２波長板４０との間の光路において、各回折光の偏光状態Ｑ２ｂは、例えばＺ方向の直線偏光である。状態Ｑ２において、１／２波長板４０の進相軸４０ａは、例えばＹ方向と１５°の角度をなす方向に設定される。１／２波長板４０を通った各回折光のうち０次回折光は、マスク４５に遮られ、試料Ｓへ向かう光路から除かれる。マスク４５を通った＋１次回折光Ｌ１および−１次回折光Ｌ２の偏光状態Ｑ２ｃは、それぞれ、回折格子３９の周期方向Ｄ２と直交する方向の直線偏光である。

図４の状態Ｑ２に示すように、＋１次回折光Ｌ１および−１次回折光Ｌ２は、それぞれ、対物レンズ３２の瞳面３２ａ上の集光領域に集光される。＋１次回折光Ｌ１の集光領域は、θ＝１２０°の回転位置に配置され、−１次回折光Ｌ２の集光領域は、θ＝３００°の回転位置に配置される。＋１次回折光Ｌ１の集光領域と−１次回折光Ｌ２の集光領域とを結ぶ方向Ｄ５は、＋Ｘ方向から時計回りを正として１２０°の角度の方向である。試料Ｓに対する±１次回折光の入射面は、光軸ＡＸ２を含み方向Ｄ５に平行な面である。±１次回折光は、方向Ｄ５に直交する方向の直線偏光になっており、試料Ｓに対するＳ偏光になっている。

また、図３および図４において符号Ｑ３は、回折格子３９が第３の回転位置に配置された状態を示す。状態Ｑ３において、回折格子３９の周期方向Ｄ３とＺ方向との角度は、例えば２４０°である。偏光板３８を通った励起光の偏光状態Ｑ３ａは、例えばＺ方向の直線偏光である。回折格子３９で発生した＋１次回折光Ｌ１と−１次回折光Ｌ２は、回折格子３９の周期方向Ｄ３に互いに離れるように、分岐する。回折格子３９と１／２波長板４０との間の光路において、各回折光の偏光状態Ｑ３ｂは、例えばＺ方向の直線偏光である。状態Ｑ３において、１／２波長板４０の進相軸４０ａは、例えばＹ方向と７５°の角度をなす方向に設定される。１／２波長板４０を通った各回折光のうち０次回折光は、マスク４５に遮られ、試料Ｓへ向かう光路から除かれる。マスク４５を通った＋１次回折光Ｌ１および−１次回折光Ｌ２の偏光状態Ｑ３ｃは、それぞれ、回折格子３９の周期方向Ｄ３と直交する方向の直線偏光である。

図４の状態Ｑ３に示すように、＋１次回折光Ｌ１および−１次回折光Ｌ２は、それぞれ、対物レンズ３２の瞳面３２ａ上の集光領域に集光される。＋１次回折光Ｌ１の集光領域は、θ＝２４０°の回転位置に配置され、−１次回折光Ｌ２の集光領域は、θ＝６０°の回転位置に配置される。＋１次回折光Ｌ１の集光領域と−１次回折光Ｌ２の集光領域とを結ぶ方向Ｄ６は、＋Ｘ方向から時計回りを正として２４０°の角度の方向である。試料Ｓに対する±１次回折光の入射面は、光軸ＡＸ２を含み方向Ｄ６に平行な面である。±１次回折光は、方向Ｄ６に直交する方向の直線偏光になっており、試料Ｓに対するＳ偏光になっている。

なお、回折格子３９の回転位置に応じて±１次回折光の偏光状態を調整するには、１／２波長板４０を回転させてもよい。例えば、制御部７は、回転駆動部４２を制御して回折格子３９を１２０°回転させる際に、１／２波長板４０を６０°回転させてもよい。また、図２（Ａ）に示したマスク４５において、回折格子３９の回転位置に応じて±１次回折光が通る開口部ごとに、１／２波長板４０を固定しておいてもよい。この場合、開口部の位置に応じて、開口部ごとに１／２波長板４０の進相軸の方向を設定すればよい。

以上のようにして、図１に示した励起照明部４は、試料Ｓの活性化層に設定される照明領域に、±１次回折光による干渉縞を形成し、試料Ｓの活性化層において活性化された蛍光物質は、励起光によって蛍光を発する。この蛍光により、試料Ｓの蛍光密度分布を干渉縞で変調した変調像が得られる。

撮像部５は、試料Ｓが干渉縞で変調された変調像を撮像する。撮像部５は、結像光学系５５、及び撮像素子５６を備える。結像光学系５５は、対物レンズ３２、ダイクロイックミラー３３、バリアフィルタ５７、及びレンズ５８を備える。

試料Ｓからの蛍光は、対物レンズ３２を通って平行光に変換されたのち、ダイクロイックミラー３３を透過して、バリアフィルタ５７に入射する。バリアフィルタ５７は、試料Ｓからの蛍光の波長以外の波長帯の光の少なくとも一部を遮断する。レンズ５８は、対物レンズ３２とともに試料Ｓ（励起照明部４の照明領域）を物体面とする像面を形成する。すなわち、対物レンズ３２およびレンズ５８は、試料Ｓの変調像を形成する。結像光学系５５の焦点位置は、例えば、Ｚ方向において活性化照明部３の照明領域内に設定される。

撮像素子５６は、例えば、ＣＣＤセンサやＣＭＯＳセンサなどのイメージセンサを含む。撮像素子５６は、複数の画素が配列される受光面を有する。受光面は、結像光学系５５の像面（試料Ｓと光学的に共役な面）に配置されている。受光面において、各画素にフォトダイオードなどの光電変換部が配置されており、撮像素子５６は、試料Ｓからの蛍光を光電変換部により電荷に変換し、試料Ｓからの蛍光を検出する。

このようにして、撮像部５は、変調像を撮像し、その撮像結果（以下、変調画像という）を復調部６に供給する。復調部６は、変調像の撮像結果を使って復調処理を実行し、試料Ｓの像を生成する。復調部６は、干渉縞の向きおよび方向が互いに異なる状態で撮像された、複数の変調像を用いて、復元画像を生成することができる。復調部６は、例えば、米国特許第８１１５８０６号明細書に開示された方法で復調処理を行ってもよいが、この方法に限られない。例えば、米国特許第８１１５８０６号明細書に開示された方法で行ってもよい。

本実施形態において、構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓの厚み方向において観察対象とする部分（以下、観察対象面という）を活性化照明部３の照明領域に保持し、活性化照明部３によって観察対象面を選択的に活性化できる。また、構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓのうち観察対象面以外の厚み部分の少なくとも一部を不活性な状態に保持しながら、励起照明部４によって干渉縞を観察対象面に照射できる。このようにして、構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓのうち観察対象面から選択的に蛍光を発生させ、観察対象面の変調像を撮像部５によって撮像できる。そして、この変調像を復調することによって、結像光学系５５の解像限界を超えた超解像画像が得られる。

本実施形態に係る構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓのうち観察対象面以外の部分における蛍光の発生を抑制できるので、観察対象面からの蛍光に対して背景光を小さく抑えることができる。その結果、構造化照明顕微鏡１は、結像光学系５５の焦点深度を超える厚みの試料Ｓに対して超解像画像を生成する際に、画質の低下を抑制することができる。

図５は、活性化照明部３からの活性化光Ｌ４および励起照明部４の照明領域ＩＲを示す図である。図５には、活性化照明部３の光軸ＡＸ１が、励起照明部４の光軸ＡＸ２を通るように設定された状態を示した。本実施形態において、活性化照明部３の光軸ＡＸ１は、励起照明部４の光軸ＡＸ２を通るように固定されている。

励起照明部４の照明領域ＩＲは、例えば、撮像素子５６の受光面と光学的に共役な位置に設定される。活性化照明部３が活性化光Ｌ４を照射する範囲は、例えば、照明領域ＩＲを含む範囲に設定される。例えば、活性化照明部３は、ＸＹ平面に平行な面において、照明領域ＩＲよりも広い範囲にわたりシート状の活性化光Ｌ４を照射する。

なお、活性化照明部３が活性化光Ｌ４を照射する範囲は、Ｚ方向において照明領域ＩＲとずれた位置に設定されていてもよい。この場合、Ｚ方向における試料Ｓの一部を活性化した後、ステージ２によって試料ＳをＺ方向に移動させて、活性化層を励起照明部４の照明領域ＩＲに配置し、活性化層への励起光の照射および活性化層の変調像の撮像を実行してもよい。また、構造化照明顕微鏡１は、活性化照明部３が活性化光を照射する範囲と、励起照明部４の照明領域ＩＲとの相対位置が可変であってもよい（変形例で説明する）。

励起照明部４の照明領域ＩＲにおける活性化光Ｌ４の厚みＢは、例えば１μｍ以下に設定され、Ｚ方向における試料Ｓの厚み以下に設定される。活性化光Ｌ４の、また、ステージ２のＺ方向の位置（高さ）を変更することにより、試料ＳのうちＺ方向の位置が異なる複数の観察対象面のそれぞれの変調像を取得できる。ステージ２のＺ方向の位置をステップ的に変化させながら観察を行う場合、Ｚ方向におけるステージ２の位置のステップ量は、例えば活性化光の厚みＢと同じ値に設定されていてもよいし、厚みＢより大きい値に設定されていてもよく、厚みＢ未満の値に設定されていてもよい。また、活性化光Ｌ４の厚みＢは、例えば、結像光学系５５の焦点深度以下の範囲に設定してもよい。この場合、試料Ｓのうち観察対象面以外の部分、からの蛍光が検出されにくい。

本実施形態において、構造化照明顕微鏡１は、制御装置ＣＯＮＴを備える。制御部７および復調部６は、制御装置ＣＯＮＴに設けられている。制御装置ＣＯＮＴは、例えば、コンピュータシステムを含み、図示しない記憶装置から読み込まれる制御プログラムに従って各種の処理を実行する。この制御プログラムは、例えば、コンピュータに、試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、試料に第１方向から照射することと、第１方向と異なる第２方向から、蛍光物質を励起するための励起光を、干渉縞で試料に照射することと、干渉縞の方向および位相を制御することと、干渉縞が照射された試料の像を形成することと、像を撮像して第１画像を生成することと、撮像により生成された複数の第１画像を用いて、第２画像を生成することと、を含む処理の制御を実行させる。

制御装置ＣＯＮＴは、例えば液晶ディスプレイなどの表示装置５９が接続され、観察結果を示す画像（例、超解像画像）、構造化照明顕微鏡１の設定を示す画像などを表示装置５９に表示させることができる。また、制御装置ＣＯＮＴには、例えばキーボード、マウス、タッチパネルなどの入力装置（図示せず）が接続される。この入力装置は、例えばユーザーから観察条件、構造化照明顕微鏡１の設定、指令などの情報の入力を受け付ける。観察条件は、例えば、試料Ｓのうち観察対象の部分の位置を含む。構造化照明顕微鏡１の設定は、例えば観察モードの設定を含む。指令は、例えば、観察の開始、中断、再開、終了などを含む。

次に、上述のような構造化照明顕微鏡１の動作に基づき、試料Ｓの観察方法について説明する。図６は、構造化照明顕微鏡１の動作を示すフローチャートである。構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ１において試料Ｓの高さ（Ｚ方向の位置）を設定する。例えば、制御装置ＣＯＮＴの制御部７は、ユーザーから指定された試料Ｓの観察対象面を、ステージ２を制御することによって、活性化照明部３の照明領域に配置する。

構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ２において、活性化照明部３から試料Ｓに活性化光を照射する。例えば、制御部７は、光源部１０を制御し、予め定められた光量の活性化光を試料Ｓに照射させる。光量の設定値は、例えば、照射時間、光源部１０の発光強度、光源部１０への供給電力などで規定される。光量の設定値は、例えば、試料Ｓの観察対象面における蛍光色素の活性化を飽和できるレベルに設定される。構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ３において、例えば制御部７が光源部１０を制御することにより、活性化照明部３から試料Ｓへの活性化光の照射を停止する。

構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ４において、励起照明部４が形成する干渉縞の条件を設定する。干渉縞の条件は、干渉縞の位相と向きの少なくとも一方を含む。例えば、制御部７は、次回の撮像において干渉縞の位相を変更する場合、平行駆動部４３を制御して、回折格子３９の位置を制御する。また、制御部７は、次回の撮像において干渉縞の向きを変更する場合、回転駆動部４２を制御して、回折格子３９の回転位置を制御する。なお、ステップＳ４の処理は、ステップＳ２の処理と並行して行ってもよいし、ステップＳ２の処理と重複しない期間に行ってもよい。

構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ３の処理およびステップＳ４の処理が終了した後に、ステップＳ５において励起照明部４から試料Ｓに励起光を照射する。また、構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ６において、励起光が照射されている試料Ｓを撮像部５により撮像する。例えば、制御部７は、光源部３０を制御して励起照明部４に励起光を照射させ、励起光の照射に対して予め定められたタイミングで撮像部５に試料Ｓを撮像させる。

構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ７において、所定数の撮像が完了したか否かを判定する。例えば、制御部７は、復調部６による復調演算に必要とされる変調画像が９枚である場合、これら９枚の変調画像が撮像済であるか否かを判定する。制御部７は、所定数の撮像が完了していないと判定した場合（ステップＳ７；Ｎｏ）、ステップＳ２からステップＳ６の処理を実行させる。制御部７は、所定数の撮像が完了したと判定した場合（ステップＳ７；Ｙｅｓ）、取得された変調画像を元に、復調部６に復調処理を実行させる（ステップＳ８）。

また、制御部７は、ステップＳ９において、試料Ｓの深さ方向の観察領域において撮像が完了したか否かを判定する。深さ方向の観察領域は、例えば、ユーザーが指定する観察条件に規定される。例えば、ユーザーは、深さ方向において、観察開始位置と観察終了位置の２か所を指定することにより、観察領域を指定することができる。本実施形態において、制御装置ＣＯＮＴの制御部７は、ユーザーにより指定された観察終了位置に達するまでステージ２を移動させ、観察対象面を変更して変調画像の取得する処理を繰り返すことにより、所定の厚みの部分の超解像画像を生成する。制御部７は、所定の深さ方向の観察領域に対する撮像が完了していないと判定した場合（ステップＳ９；Ｎｏ）、ステップＳ１０において、試料Ｓに対して不活性化照明部２０から不活性化光を照射させる。制御部７は、例えば、不活性化照明部２０から、予め定められた光量の不活性化光が照射された後に、不活性化照明部２０による不活性化光の照射を停止させる（ステップＳ１１）。また、構造化照明顕微鏡１は、ステップＳ１１の処理の終了後、ステップＳ１からステップＳ８の処理を行って、次の観察対象面の超解像画像を生成する。制御部７は、深さ方向の観察領域の部分に対する撮像が完了したと判定した場合（ステップＳ９；Ｙｅｓ）、一連の処理を終了する。

上述した実施例では、１枚の変調画像を撮像する毎に試料Ｓに活性化光を照射する場合を説明した。励起光を当てると、蛍光物質の一部が不活性化状態になる場合があるので、変調画像を撮像する毎に試料Ｓに活性化光を照射することにより、励起光により不活性化した蛍光物質を再度活性化して変調画像を撮像することができる。
例えば、干渉縞の方向を３通りに変更し、干渉縞の各方向について干渉縞の位相を３通りに変更する場合においては、構造化照明顕微鏡１は、干渉縞の方向と位相の９通りの組み合わせのそれぞれにおいて変調画像を撮像し、１枚の変調画像を撮像する毎に試料Ｓに活性化光を照射する。

なお、構造化照明顕微鏡１は、複数の変調画像を撮像するたびに試料Ｓに活性化光を照射してもよい。例えば、構造化照明顕微鏡１は、干渉縞の位相を変更しながら３枚の変調画像を撮像する処理に対して、活性化光を照射する処理の回数が１回であってもよい。また、構造化照明顕微鏡１は、干渉縞の方向と位相の組み合わせを９通りに変更し、９枚の変調画像を撮像する処理に対して、活性化光を照射する処理の回数が１回であってもよい。また、構造化照明顕微鏡１は、活性化照明部３により活性化光を試料Ｓに照射するとともに励起照明部４により励起光を試料Ｓに照射し、試料Ｓを撮像部５により撮像してもよい。

なお、ここでは、１つの試料Ｓがおける複数の観察対象面を含む場合を説明したが、観察対象面の数は１つでもよい。この場合、試料Ｓの蛍光色素を不活性化させなくてもよく、不活性化照明部２０を省略可能である。また、不活性化照明部２０は、活性化照明部３と第１照明光学系１１が共通化されているが、第１照明光学系１１と別の光路から不活性化光を試料に照射してもよい。不活性化照明部２０が照射する不活性化光は、シート状でなくてもよい。また、構造化照明顕微鏡１は、励起照明部４を不活性化照明部２０として利用したものでもよい。

なお、制御部７は、ステップＳ３において、予め設定された活性化光の光量に基づいて活性化光の照射を停止するが、試料Ｓにおける蛍光色素の活性化のレベルを検出して、その検出結果に基づいて活性化光の照射を停止してもよい。

図７は、試料Ｓにおける蛍光色素の活性化のレベルを検出する処理の一例を示すフローチャートである。制御部７は、ステップＳ２０において、励起照明部４において＋１次回折光を遮断する。例えば、図２に示したマスク４５の開口部にシャッタを設けておき、制御部７は、シャッタを閉じることによって、＋１次回折光が試料Ｓに照射されないようにする。また、制御部７は、ステップＳ２１において、光源部３０を制御することにより励起照明部４から試料Ｓに−１次回折光を照射させる。この場合、＋１次回折光が遮断されているので試料Ｓに干渉縞が形成されず、励起照明部４は、＋１次回折光を遮断しない場合と比較して均一な明るさで試料Ｓを照明できる。

制御部７は、例えば、試料Ｓへの励起光の照射を継続させながら、ステップＳ２２において試料Ｓからの蛍光を撮像素子５６によって検出させる。制御部７は、ステップＳ２３において、撮像素子５６の検出値の時間変化量が閾値以下であるか否かを判定する。撮像部５の検出値の時間変化量が閾値以下であることは、試料Ｓにおける蛍光色素の活性化のレベルがほぼ飽和していることに相当する。制御部７は、撮像素子５６の検出値の時間変化量が閾値よりも大きいと判定した場合（ステップＳ２３；Ｎｏ）、ステップＳ２２およびステップＳ２３の処理を繰り返す。制御部７は、撮像素子５６の検出値の時間変化量が閾値以下であると判定した場合（ステップＳ２３；Ｙｅｓ）、ステップＳ３において活性化光の照射を停止させる。このように、制御部７は、蛍光物質の活性化状態が飽和状態となったと判定されるまで、活性化光を照射させる。この場合、構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓにおける蛍光色素の活性化のレベルがほぼ飽和している状態で、試料Ｓを撮像できる。なお、制御部７は、撮像素子５６の検出値が閾値以上の場合、蛍光物質の活性化状態が飽和状態となったと判定し、活性化光の照射を停止させてもよい。

なお、構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓを干渉縞で照明しながら試料Ｓにおける蛍光色素の活性化のレベルを検出してもよい。この場合、ステップＳ２０の処理を行わなくてもよい。また、構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓにおける蛍光色素の活性化のレベルが飽和していない状態で、励起光を試料Ｓに照射して、試料Ｓの変調像を撮像してもよい。例えば、試料Ｓにおける蛍光色素の活性化のレベルが飽和していると変調画像の明るさが過剰になる場合がある。また、例えば、試料Ｓに対する活性化光の照射の影響を減らすため、蛍光色素の活性化のレベルが飽和する前に、活性化光の照射を停止する場合がある。このような場合、ステップＳ２３の判定処理の代わりに、あるいはステップＳ２３の判定処理に加えて、撮像素子５６の検出値が閾値以下であるか否かを判定してもよい。

なお、制御部７は、図６に示したステップＳ１１において、予め設定された不活性化光の光量に基づいて不活性化光の照射を停止するが、試料Ｓにおける蛍光色素の不活性化のレベルを検出して、その検出結果に基づいて活性化光の照射を停止してもよい。

図８は、試料Ｓにおける蛍光色素の不活性化のレベルを検出する処理の一例を示すフローチャートである。制御部７は、ステップＳ２５において、励起照明部４において＋１次回折光を遮断する。制御部７は、ステップＳ２６において、励起照明部４から試料Ｓに−１次回折光を照射させる。ステップＳ２５およびステップＳ２６の処理は、図８に示したステップＳ２０およびステップＳ２１の処理と同様でよい。

制御部７は、例えば、試料Ｓへの励起光の照射を継続させながら、ステップＳ２７において試料Ｓからの蛍光を撮像素子５６によって検出させる。制御部７は、ステップＳ２８において、撮像素子５６の時間変化量が閾値以下であるか否かを判定する。撮像素子５６の検出値の時間変化量が閾値以下であることは、試料Ｓにおける蛍光色素の不活性化のレベルがほぼ飽和していることに相当する。制御部７は、撮像素子５６の検出値の時間変化量が閾値よりも大きいと判定した場合（ステップＳ２８；Ｎｏ）、ステップＳ２７およびステップＳ２８の処理を繰り返す。制御部７は、撮像素子５６の検出値の時間変化量が閾値以下であると判定した場合（ステップＳ２８；Ｙｅｓ）、ステップＳ１１において不活性化光の照射を停止させる。この場合、構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓにおける蛍光色素の不活性化のレベルがほぼ飽和している状態で、次の観察対象面に対する変調像の撮像を行うことができる。そのため、次の観察対象面に励起光を照射した際に、前回の観察対象面から蛍光が発生することを抑制できる。なお、制御部７は、ステップＳ２８において、撮像素子５６の検出値の時間変化が閾値以下であるか否かを判定する代わりに、撮像素子５６の検出値が閾値以下であるか否かを判定してもよい。

なお、活性化照明部３は、試料Ｓのうちシート状の領域を選択的に照明できるものであればよく、上述の実施形態の構成に限定されない。以下、活性化照明部３の変形例について説明する。

図９（Ａ）は、第１変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図９（Ｂ）は第１変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４およびシリンドリカルレンズ１５を備え、図１に示した構成からスリット１６、及びレンズ群１７を省略した構成である。このように、活性化照明部３は、スリット１６によるビーム成形を行わなくてもよく、この場合、スリット１６の像を投影するレンズ群１７は省略可能である。

図１０（Ａ）は、第２変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１０（Ｂ）は第２変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３側から試料Ｓ側に向かって、コリメータレンズ１４、集光レンズ６０、ピンホール６１、コリメータレンズ６２、及びシリンドリカルレンズ１５を備える。ピンホール６１は、例えば円形の開口を有する。集光レンズ６０は、コリメータレンズ１４からの活性化光をピンホール６１の開口に向けて集光する。コリメータレンズ６２は、ピンホール６１からの活性化光を平行化する。シリンドリカルレンズ１５は、コリメータレンズ６２からの活性化光を、ＸＺ平面に平行な面において屈折させるとともに、ＸＹ面に平行な面においてほぼ屈折させない。この第１照明光学系１１も、活性化光をシート状に成型できる。このように、シリンドリカルレンズ１５を使ってシート状の活性化を形成する場合、シリンドリカルレンズ１５の配置は変更可能である。

図１１（Ａ）は、第３変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１１（Ｂ）は第３変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、スリット１６、コリメータレンズ６２、及びレンズ６３を備える。スリット１６は、Ｚ方向において、コリメータレンズ１４からの不活性光のビーム径よりも狭い開口部１６ａを有する。また、スリット１６は、コリメータレンズ６２の後側焦点位置に配置されている。開口部１６ａ（図１０（Ｄ）参照）は、Ｙ方向とＺ方向のうちＺ方向を短手方向とする形状（例、Ｚ方向に平行な短辺を有する矩形状）である。レンズ６３の前側焦点位置と、コリメータレンズ６２の後側焦点位置が一致するように配置され、コリメータレンズ６２およびレンズ６３は、スリット１６の開口部１６ａを通った活性化光をシート状にして照明領域に集光する。

図１２（Ａ）は、第４変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１２（Ｂ）は第４変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、スリット１６、及びレンズ６３を備える。スリット１６の開口部１６ａは、Ｙ方向とＺ方向のうちＹ方向を短手方向とする形状である。スリット１６の開口部１６ａの寸法は、例えば長手方向（Ｚ方向）において、コリメータレンズ１４からの活性化光のビーム径よりも小さく設定される。スリット１６は、レンズ６３の後側焦点位置に配置されている。レンズ６３は、スリット１６の開口部１６ａを通った活性化光を照明領域に集光する。このように、第１照明光学系１１は、スリット１６によって活性化光を成形してもよく、シリンドリカルレンズを含まなくてもよい。

図１３（Ａ）は、第５変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１３（Ｂ）は第５変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、光軸ＡＸ１上の頂角が鈍角である三角プリズム６４、レンズ群６５を備える。三角プリズム６４は、第１照明光学系１１の光軸ＡＸ１に関して、軸対称な形状である。三角プリズム６４は、レンズ群６５（レンズ６５ａおよびレンズ６５ｂ）の瞳面の位置において、活性化光を２か所に集光させる。これらの集光した活性化光を、レンズ６５ｂで試料に投影すると、試料に投影された光は、Ｚ方向にベッセルビームであるシート光となる。このように、第１照明光学系１１は、活性化光としてＺ方向にベッセルビームであるシート光を試料Ｓに照射する。このような第１照明光学系１１は、焦点深度を長くとることができ、照明領域の厚みを減らすことができる。また、第１照明光学系１１は、活性化光の一部を遮光してビーム成形を行う構成と比較して、光のロスを減らすことができる。なお、この際の光ファイバの出射端の径を大きくしておくとよく、そうすることでＺ方向のベッセルビーム状照明光の光軸上における光密度を高めることができる。

図１４（Ａ）は、第６変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１４（Ｂ）は第６変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、スリット１６、及びレンズ６６を備える。例えば、スリット１６の開口部１６ａおよび開口部１６ｂは、それぞれ、内縁の形状が円形でその内径が波長に比べて十分大きな貫通孔である。開口部１６ａと開口部１６ｂは、第１照明光学系１１の光軸ＡＸ１から離れており、光軸ＡＸ１に関して対称的に設けられている。このような第１照明光学系１１は、上述した三角プリズム６４を使わなくともＺ方向にベッセルビームであるシート光を形成することができる。

図１５（Ａ）は、第７変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１５（Ｂ）は第７変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、ミラー６７、及びレンズ６３を備える。ミラー６７は、コリメータレンズ１４とレンズ６３との間の光路に配置されている。ミラー６７は、Ｚ方向に平行な軸の周りで回転可能に設けられている。ミラー６７は、ミラー駆動部６８に駆動されて、回転する。ミラー６７およびミラー駆動部６８は、例えば、ガルバノミラー、ＭＥＭＳミラーなどである。制御部７は、ミラー駆動部６８を制御することにより、ミラー６７の回転位置を制御できる。コリメータレンズ１４により平行化された活性化光は、ミラー６７で反射することにより、ミラー６７の回転位置に応じてＹ方向に偏向し、レンズ６３により集光する。このように、活性化照明部３は、ＹＺ平面において集光した活性化光（直線状の活性化光）で試料ＳをＹ方向に走査することにより活性化光を照射してもよい。

図１６（Ａ）は、第８変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１６（Ｂ）は第８変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、集光レンズ１５、ピンホール６１、コリメータレンズ６２、ミラー６７、及びレンズ６３を備える。集光レンズ１５は、コリメータレンズ１４によって平行化された活性化光を、ピンホール６１の開口部に向けて集光する。コリメータレンズ６２は、ピンホール６１からの活性化光を平行化する。ミラー６７は、コリメータレンズ６２により平行化された活性化光を偏向する。レンズ６３は、ミラー６７で反射した活性化光を照明領域に集光する。このように、第１照明光学系１１は、ピンホール６１でビーム成形することにより、ＹＺ平面において集光した活性化光（直線状の活性化光）で、試料Ｓを走査してもよい。

図１７（Ａ）は、第９変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１７（Ｂ）は第１変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、アキシコンレンズ６９、レンズ群６５、及びミラー６７を備える。アキシコンレンズ６９とレンズ群６５は、コリメータレンズ１４により平行化された活性化光をベッセルビームに成形する。ミラー６７は、レンズ群６５の瞳面に配置されており、レンズ群６５を通る活性化光をＹ方向に偏向させる。このように、第１照明光学系１１は、アキシコンレンズ６９を用いてベッセルビームに成形された活性化光で試料Ｓを走査してもよい。

図１８（Ａ）は、第１０変形例の第１照明光学系１１を示す斜視図、図１８（Ｂ）は第１変形例の第１照明光学系１１の光路を示す図である。この第１照明光学系１１は、光ファイバ１３の光出射側に、コリメータレンズ１４、スリット１６、レンズ群６５、及びミラー６７を備える。本変形例のスリット１６の開口部１６ａは、第１照明光学系１１の光軸ＡＸ１を中心とする輪帯状（円環状）である。スリット１６およびレンズ群６５は、コリメータレンズ１４により平行化された活性化光をベッセルビームに成形する。ミラー６７は、レンズ群６５の瞳面に配置されており、レンズ群６５を通る活性化光を偏向させる。このように、第１照明光学系１１は、スリット１６を用いてベッセルビームに成形された活性化光で試料Ｓを走査してもよい。

図１９は、第１１変形例の活性化照明部３を示す図である。本変形例の活性化照明部３は、Ｚ方向において活性化光の光路を変更する光路調整部７０を備える。なお、図１９（Ａ）には、活性化光の光路が変更される前の状態を示し、図１９（Ｂ）には、活性化光の光路が変更された後の状態を示した。

光路調整部７０は、例えば、活性化光が透過する平行平板７１と、平行平板７１を駆動する駆動部７２とを備える。平行平板７１は、例えば、第１照明光学系１１内の光路において、活性化光が平行化されている位置に配置される。本変形例において、平行平板７１は、レンズ群１７の間の光路に配置されている。

駆動部７２は、Ｙ方向に平行な軸の周りで平行平板７１を回転駆動し、Ｚ方向に対する平行平板７１の角度（傾斜角）を変化させる。制御部７は、駆動部７２を制御することにより、Ｚ方向に対する平行平板７１の角度を制御する。図１９（Ｂ）に示すように、平行平板７１が傾斜すると、活性化光は、平行平板７１の入射側の界面および出射側の界面のそれぞれで屈折し、活性化光の光路がＺ方向にシフトする。活性化光の光路のシフト量は、平行平板７１の屈折率、平行平板７１の厚み、平行平板７１の傾斜角により定まる。制御部７は、平行平板７１の傾斜角を制御することにより、光路のシフト量を制御できる。

ところで、構造化照明顕微鏡１は、対物レンズ３２と試料Ｓとの間に浸液（例、油）が配置された状態で、液浸型（油浸型）の顕微鏡として利用できる。この場合、一般には浸液と試料の屈折率が異なることから、対物レンズ３２を固定しつつステージ２をＺ方向に移動すると、光学的距離が変化する。そのため、励起照明部４により形成される構造化照明のコントラストの高い領域、および、対物レンズ２の焦点があっている面がＺ方向にシフトし、活性化照明部３の照明領域とＺ方向の位置が合わなくなる。このような場合、制御部７は、駆動部７２を制御して、活性化光の光路をＺ方向においてシフトさせることにより、活性化照明部３の照明領域を励起照明部４の照明領域に合わせることができる。活性化照明部３および不活性化照明部２０を励起照明部４および撮像部５に対して、相対的にＺ方向にシフトさせてもよい。

図２０は、第１２変形例の活性化照明部３を示す図である。本変形例において、励起照明部４の光源部３０は、不活性化照明部２０の光源部２１を兼ねている。不活性化照明部２０は、光源部３０と集光レンズ３５との間の光路に挿脱可能なミラー７５を備える。図２０（Ａ）には、光源部３０と集光レンズ３５との間の光路からミラー７５が退避された状態（以下、退避状態という）を示し、図２０（Ｂ）には、光源部３０と集光レンズ３５との間の光路にミラー７５が挿入された状態（以下、挿入状態という）を示した。

図２０（Ａ）に示すように、ミラー７５の退避状態において、光源部３０から出射した励起光は、集光レンズ３５に入射し、第２照明光学系３１を介して試料Ｓに照射される（図１参照）。また、図２０（Ｂ）に示すように、ミラー７５の挿入状態において、光源部３０から出射した励起光は、ダイクロイックミラー２３の波長選択膜で反射して、集光レンズ１２に入射する。集光レンズ１２に入射した励起光は、第１照明光学系１１を介して、不活性化光として試料Ｓに照射される（図１参照）。

制御部７は、ミラー７５の駆動部（図示略）を制御し、ミラー７５の退避状態と挿入状態とを切り替え可能である。なお、試料Ｓの変調像を撮像する際の励起光の光量は、例えば、試料Ｓを不活性化する際の不活性化光の光量よりも少なく設定される。制御部７は、ミラー７５の退避状態において、ミラー７５の挿入状態よりも光源部３０の発光量を減らすこともできる。

［第２実施形態］
次に、第２実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図２１は、本実施形態に係る構造化照明顕微鏡１を示す図である。この構造化照明顕微鏡１は、試料Ｓの厚み方向（Ｚ方向）の超解像画像を生成する３Ｄ−ＳＩＭモードを有する。

本実施形態において、マスク４５は、回折格子３９で発生した０次回折光が通る開口部を有する。励起照明部４は、±１次の２光束による干渉縞と、０次と＋１次の２光束による干渉縞と、０次と−１次の２光束による干渉縞とが合成された合成干渉縞を、照明領域に形成する。この合成干渉縞は、照明領域において、ＸＹ平面に平行な面内で光強度が周期的に変化するとともに、ＹＺ平面に平行な面内においても光強度が周期的に変化する。

本実施形態において、変調画像に重畳される変調成分は、−２次変調成分、−１次変調成分、０次変調成分、＋１次変調成分、＋２次変調成分の５種類になる。制御部７は、例えば、回転駆動部４２を制御して干渉縞の向きを複数（例えば３種類）に変化させ、干渉縞の各向きに対して、平行駆動部４３を制御して干渉縞の位相を複数（例えば５種類）に変化させながら、各位相における変調像を撮像部５に撮像させる。復調部６は、複数（上記例では１５枚）の変調画像を使って、５種類の変調成分を分離し、超解像画像を生成する。なお、復調演算には、"Super-Resolution Video Microscopy of Live Cells by Structured Illumination", Peter Kner, Bryant B. Chhun, Eric R. Griffis, Lukman Winoto, and Mats G. L. Gustafsson, NATURE METHODS Vol.6 NO.5, pp.339-342, (2009)に記載されている手法を用いることもできるが、この方法に限られない

なお、本実施形態に係る構造化照明顕微鏡１は、マスク４５において０次回折光が通る開口部を開閉可能にすることで、第１実施形態で説明した２Ｄ−ＳＩＭモードを実行することもできる。例えば、構造化照明顕微鏡１は、ユーザーの指令により２Ｄ−ＳＩＭモードと３Ｄ−ＳＩＭモードとを切り替え可能である。２Ｄ−ＳＩＭモードは、例えば、活性化照明部３の照明領域の厚みが閾値以下（例、１μｍ以下）の場合に選択される。３Ｄ−ＳＩＭモードは、例えば活性化照明部３の照明領域の厚みが閾値を超える場合に選択される。

なお、本発明の技術範囲は、上記の実施形態あるいは変形例に限定されるものではない。例えば、上記の実施形態あるいは変形例で説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上記の実施形態あるいは変形例で説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１・・・構造化照明顕微鏡、２・・・ステージ、３・・・活性化照明部、
４・・・励起照明部、５・・・撮像部、６・・・復調部、７・・・制御部
Ｓ・・・試料、１０・・・光源部、１１・・・第１照明光学系
２０・・・不活性化照明部、２１・・・光源部、３０・・・光源部
３１・・・第２照明光学系、５５・・・結像光学系

Claims (20)

1. 試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、前記試料に第１方向から照射する第１照明光学系と、
   対物レンズを有し、前記第１方向と異なる第２方向から、前記蛍光物質を励起するための励起光を、前記対物レンズを介して干渉縞で前記試料に照射する第２照明光学系と、
   前記干渉縞の方向および位相を制御する制御部と、
   前記対物レンズを有し、前記干渉縞が照射された前記試料の像を形成する結像光学系と、
   前記結像光学系が形成した前記像を撮像して画像を生成する撮像素子と、
   前記撮像素子により生成された複数の前記画像を用いて、前記試料の画像を生成する復調部と、
   を備え、
   前記第２照明光学系は、
   前記励起光を回折により複数の回折光に分岐する分岐部と、
   前記複数の回折光のうち、＋１次回折光または−１次回折光の通過状態と遮断状態とを切り替え可能な遮光部と、を備える
   ことを特徴とする構造化照明顕微鏡。
2. 前記第１照明光学系は、シート状の前記活性化光を照射する
   ことを特徴とする請求項１に記載の構造化照明顕微鏡。
3. 前記第１照明光学系は、シリンドリカルレンズを含む
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の構造化照明顕微鏡。
4. 前記第１照明光学系は、前記活性化光を、前記第１方向および前記第２方向と異なる第３の方向に走査する
   ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
5. 前記蛍光物質を不活性化するための不活性化光を、前記試料に照射する第３照明光学系をさらに有する
   ことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
6. 前記励起光の波長と、前記不活性化光の波長とが同じである
   ことを特徴とする請求項５に記載の構造化照明顕微鏡。
7. 前記制御部は、
   前記第１方向から前記活性化光を照射させて、前記蛍光物質を活性化させ、
   活性化された前記蛍光物質に、前記第２方向から前記励起光を照射し、
   前記励起光を照射した後、前記不活性化光を前記試料に照射させる
   ことを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の構造化照明顕微鏡。
8. 前記第３照明光学系は、前記不活性化光を、前記試料に第１方向から照射する
   ことを特徴とする請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
9. 前記第３照明光学系は、前記不活性化光を、前記試料に第２方向から照射する
   ことを特徴とする請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
10. 前記第１照明光学系と、前記第３照明光学系との光路とは、少なくとも一部において共通である
    ことを特徴とする請求項５から請求項９のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
11. 前記第２照明光学系と、前記第３照明光学系との光路とは、少なくとも一部において共通である
    ことを特徴とする請求項５から請求項９のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
12. 前記不活性化光の強度は、前記励起光の強度よりも大きい
    ことを特徴とする請求項５から請求項１１のいずれか一項に記載の構造化照明顕微鏡。
13. 前記第１照明光学系は、前記試料と光学的に共役な位置に配置される絞り部材を備え、
    前記絞り部材の開口幅は、前記第１照明光学系を前記不活性化光が通る際に、前記第１照明光学系を前記活性化光が通る際よりも大きく設定される
    ことを特徴とする請求項５から請求項１２のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
14. 前記制御部は、前記撮像素子の検出値が閾値以下の場合に、前記不活性化光の照射を停止させる
    ことを特徴とする請求項５から請求項１３のいずれか一項に記載の構造化照明顕微鏡。
15. 前記制御部は、前記撮像素子の検出値の時間変化量が閾値以下の場合に、前記不活性化光の照射を停止させる
    ことを特徴とする請求項５から請求項１３のいずれか一項に記載の構造化照明顕微鏡。
16. 前記制御部は、前記蛍光物質の活性化状態が飽和状態となるまで、前記活性化光を照射させることを特徴とする請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の構造化照明顕微鏡。
17. 前記制御部は、前記撮像素子の検出値が閾値以上の場合に、前記活性化光の照射を停止させる
    ことを特徴とする請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の構造化照明顕微鏡。
18. 前記制御部は、前記撮像素子の検出値の時間変化量が閾値以下の場合に、前記第１照明光学系からの前記活性化光の照射を停止させる
    ことを特徴とする請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の構造化照明顕微鏡。
19. 前記制御部は、前記遮光部を前記遮断状態に設定し、前記第１照明光学系から前記活性化光を照射させながら、前記撮像素子に前記試料からの光を検出させる
    ことを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の構造化照明顕微鏡。
20. 試料に含まれた蛍光物質を活性化するための活性化光を、前記試料に第１方向から照射することと、
    対物レンズを有する第２照明光学系によって、前記第１方向と異なる第２方向から、前記蛍光物質を励起するための励起光を、前記対物レンズを介して干渉縞で前記試料に照射することと、
    前記干渉縞の方向および位相を制御することと、
    前記対物レンズを有する結像光学系によって、前記干渉縞が照射された前記試料の像を形成することと、
    前記像を撮像して画像を生成することと、
    前記撮像により生成された複数の前記画像を用いて、前記試料の画像を生成することと、
    前記第２照明光学系によって、前記励起光を回折により複数の回折光に分岐し、前記複数の回折光のうち、＋１次回折光または−１次回折光の通過状態と遮断状態とを切り替えることと、
    を含むことを特徴とする観察方法。

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