JP6187065B2 - 細胞培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、受精卵などの個別管理が必要な細胞を培養するための細胞培養容器に関する。

培養系で精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製して、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が、家畜領域のみならずヒトの不妊医療でも確立されている。

しかし、体外受精による妊娠成功率は必ずしも高くはなく、たとえばヒトにおいては、その妊娠成功率は、依然として２５〜３５％程度に留まっている。その原因の一つとして、培養において子宮への移植に適した良質な受精卵を得られる確率が高くないことが挙げられる。培養された受精卵は、専門家が顕微鏡で個別に観察することにより、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否か判別されている。

体外受精においては、容器中に培養液のドロップを作り、この中に受精卵を入れて体外培養するマイクロドロップ法が用いられることが多い。従来、このマイクロドロップ法には、細胞培養容器として、底面が単一平面であり、直径が３０〜６０ｍｍのシャーレが使用され、シャーレの底面に、培養液のドロップを、間隔をあけて複数個作製し、その中で細胞を培養する方法が使用されてきた。

通常のシャーレでドロップを作成すると、受精卵自身の細胞運動やドロップ内の対流によって受精卵の位置が変わってしまい、その中で培養して観察していた受精卵の特定が難しくなるという問題があった。したがって、受精卵の位置を制御できる手段が求められていた。

受精卵の培養効果をより効率的にするためには受精卵同士の相互作用（パラクライン効果）を利用することが好ましいとされている。これらの効果を利用しつつ、受精卵の位置を制御する目的で、シャーレの底面に受精卵のサイズと同程度のマイクロウェルを形成し、複数個のマイクロウェルを覆うように培養液のドロップを添加し、培養液で満たされたマイクロウェルに受精卵を配置して培養を行うシステムが知られている。それにより複数の受精卵の位置を制御して個別観察を可能としつつ、少量の培養液の中で複数の受精卵の培養を行うことができ、パラクライン効果を利用できる。

特許第４７２４８５４号公報

本発明者らは、受精卵培養を行う際に、マイクロウェルを有する細胞培養容器を利用すると、ウェルのサイズが小さいため培養液を入れる際に気泡がウェル内に残ってしまい、気泡を抜くための作業が必要で作業が煩雑であること、一方、気泡が抜けやすい構造とすると、マイクロウェル内から受精卵が外に飛び出るといったリスクがあるという課題を見出した。

したがって本発明は、細胞を収容するためのマイクロウェルを有する培養容器を用いたマイクロドロップ法による細胞培養において、マイクロウェル内に気泡が残りにくく、かつ細胞をマイクロウェル内に安定的に保持することができ、培養作業性と観察作業性を向上させることが可能な細胞培養容器を提供することを目的とする。

本発明者らは、傾斜角度の異なる２種類の側面を有し、傾斜角度の大きい方が液体進入路として機能するようなマイクロウェルをその底部に形成した細胞培養容器を用いることにより、上記課題が解決できることを見出した。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）底部と側壁を有する細胞培養容器であって、
底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
マイクロウェルが、底面と第１側面と第２側面とを有し、
第１側面は、マイクロウェルの底面に対して垂直に、または底面に対して傾斜して形成され、
第２側面は、マイクロウェルの底面に対して傾斜して形成され、
マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第１側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第１側面とのなす角度をθ１とし、マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第２側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第２側面とのなす角度をθ２としたとき、θ１＜θ２である、
細胞培養容器。
（２）θ１が０°以上２０°以下であり、θ２が２５°以上４５°以下である、（１）に記載の細胞培養容器。
（３）第１側面と第２側面が交互に存在し、第１側面と第２側面が４個以上１２個以下ずつ存在する、（１）または（２）に記載の細胞培養容器。
（４）マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅の最小値が１５０μｍ以下である、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（５）マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅が外縁側ほど広くなっている、（４）記載の細胞培養容器。
（６）マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅の最大値が１５０μｍ以下であり、第２側面の幅が外縁側ほど狭くなっている、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。

本発明により、培養作業性と観察作業性が向上した細胞培養容器が提供される。

本発明の細胞培養容器の一実施形態の上面図を示す概略図である。 本発明の細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。 本発明の一実施形態のマイクロウェルの上面視を示す概略図である。 図３の実施形態のマイクロウェルの垂直断面図を示す概略図である。 本発明の一実施形態のマイクロウェルの上面視を示す概略図である。 図５の実施形態のマイクロウェルの垂直断面図を示す概略図である。 本発明の一実施形態のマイクロウェルの上面視を示す概略図である。 図７の実施形態のマイクロウェルの垂直断面図を示す概略図である。 本発明の細胞培養容器を用いた細胞培養方法の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。

以下、本発明について説明する。

本発明の細胞培養容器の一実施形態の概略図を図１〜３に示す。図１は上面図を、図２は垂直断面図を示す。図３はマイクロウェルの拡大図の上面視を、図４はマイクロウェルの拡大図の垂直断面図を示す。

図１〜４に示されるように、本実施形態の細胞培養容器1は、
底部２と側壁３を有し、
底部２に、細胞を収容するためのマイクロウェル４が一つ以上配置されており、
マイクロウェル４が、底面５と第１側面６と第２側面７とを有し、
第１側面６は、マイクロウェル４の底面５に対して垂直に、または底面に対して傾斜して形成され、
第２側面は、マイクロウェル４の底面５に対して傾斜して形成され、
マイクロウェル４の底面５に垂直でマイクロウェルの中心と第１側面６とを通る切断面において、マイクロウェル４の底面５に垂直な線８と第１側面６とのなす角度をθ１とし、マイクロウェル４の底面５に垂直でマイクロウェルの中心と第２側面７とを通る切断面において、マイクロウェル４の底面５に垂直な線８と第２側面７とのなす角度をθ２としたとき、θ１＜θ２である、ことを特徴とする。

なお、図１および図２には、複数のマイクロウェルを囲む内壁９が記載されているが、内壁は必須の構成要件ではない。

例えば、図４（ａ）に示すように、マイクロウェルの第１側面は、底面に対して垂直に、または底面に対して傾斜して形成される。底面に対して傾斜して形成されるとは、図４、図６および図８に示すようなマイクロウェルの垂直切断面（マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心を通る切断面）において、マイクロウェルの底面から、開口端に向かって所定の傾斜構造をもって高くなっていることをいう。ここでマイクロウェルの中心とは、後述するマイクロウェルの底面の重心と同義である。マイクロウェルの外縁は、マイクロウェルの開口端と同義である。マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第１側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第１側面とのなす角度θ１は、好ましくは２０°以下、より好ましくは１０°以下、さらに好ましくは５°以下であり、好ましくは０°以上である。第１側面は第２側面よりも傾斜角度が小さく、マイクロウェル内の細胞を保持する機能を有する。第１側面の傾斜角度を一定以下とすることにより、マイクロウェルに収容された細胞がマイクロウェルから飛び出すのを防止することができ、多少の振動や横揺れを与えても細胞をマイクロウェル内に保持することができる。細胞を安定に保持する観点から、θ１は０°であり、すなわち第１側面は、マイクロウェルの底面に対して垂直であることが特に好ましい。

例えば、図４（ｂ）に示すように、マイクロウェルの第２側面は、マイクロウェルの第１側面よりも傾斜角度が大きい側面であり、第１側面がマイクロウェルの底面に対し垂直に形成される場合（θ１＝０°）、垂直よりもマイクロウェルの外側に傾斜している側面は、すべて第２側面となる。第２側面は、マイクロウェルの外側に傾斜したテーパー部分であり、培養液の進入路および気泡抜け通路として機能する。マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第２側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第２側面とのなす角度θ２は、θ１より大きく、好ましくは２５°以上、より好ましくは３０°以上、さらに好ましくは３５°以上であり、好ましくは５５°以下であり、より好ましくは４５°以下である。マイクロウェルが、このような角度θ２で傾斜した第２側面を有することにより、培養液を添加したときにマイクロウェル内に気泡が入りにくく、また、たとえ気泡が入ったとしても気泡が抜けやすく、マイクロウェル内に気泡が残るのを防止できる。したがって、作業効率が高い。一方、角度θ２を５５°以下とすることにより、第２側面の部分から細胞が飛び出すのを防止することができ、多少の振動や横揺れを与えても細胞をマイクロウェル内に保持することができる。

図３にマイクロウェルの拡大図の上面視を示す。本実施形態のようなマイクロウェルの上面視において、第２側面の占める面積Ｚ（各第２側面が占める面積の総和）の割合は、好ましくは上面視におけるマイクロウェル全体が占める面積の、好ましくは５０％以下、より好ましくは３３％以下であり、好ましくは１０％以上である。第２側面は、マイクロウェルの外側に傾斜していることから、傾斜分だけマイクロウェルの容積が大きくなる。したがって、マイクロウェル全体に占める第２側面の割合を一定以下とすることで、マイクロウェルの容積を一定の範囲内とすることができ、細胞培養の際のオートクライン効果の維持が期待できる。

第１側面と第２側面の数は特に制限されず、少なくとも１個ずつ存在すればよい。図５および図６は、第２側面７が１個だけ存在し、その他の部分が第１側面を形成している実施形態を示す。図５は、マイクロウェルの拡大図の上面視を示し、図６は、マイクロウェルの垂直切断面を示す。第１側面と第２側面は、マイクロウェルの外周方向に交互に存在し、したがって、第１側面と第２側面は、通常、同数存在する。第１側面と第２側面は、それぞれ好ましくは４個以上、より好ましくは６個以上、さらに好ましくは８個以上ずつ存在し、好ましくは１２個以下、より好ましくは１０個以下ずつ存在する。図３および図４は、第１側面と第２側面が４個ずつ、マイクロウェルの外周方向に交互に存在する実施形態を示す。第２側面によって形成される進入路の数を一定以上とすることにより、培養液が注入しやすく、また気泡抜けの効果も高い。一方、第２側面によって形成される進入路の数を一定以下とすることにより、マイクロウェルの製造工程の複雑化や、マイクロウェルの側面の強度の低下を回避できる。

第２側面によって形成される進入路の幅を、一定以下、好ましくは細胞の直径より狭くすることにより、マイクロウェルに収容された細胞が、外側に傾斜した第２側面をつたわって、マイクロウェルの外に転げ出ることを防止できる。ここで、第２側面によって形成される進入路の幅は、第１側面と第２側面の形状ごとに定義される。例えば、図７および８に示すような、第２側面によって形成される進入路の幅が、マイクロウェルの外側ほど広いような実施形態においては、進入路の幅の最小値が１５０μｍ以下となるようにマイクロウェルを形成することが好ましい。ここで進入路の幅の最小値とは、マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅Ｘ、すなわち、マイクロウェルを底面と平行な面で切断した切断面の上面視において、マイクロウェルの外周によって形成される図形における各第２側面の幅Ｘであって、マイクロウェルの中心Ｏから外周に向かう直線と直行する幅Ｘと定義できる（例えば、図７のＸ_１およびＸ_２）。マイクロウェルを底面と平行な面で切断した切断面の上面視におけるマイクロウェルの外周は、マイクロウェルを底面と平行な面で切断したと仮定したときのマイクロウェルの開口端と同義である。その幅Ｘの最小値（図７のＸ_１）が１５０μｍ以下、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは８０μｍ以下となるように第２側面を形成することにより、細胞が外側に傾斜した第２側面をつたわって、マイクロウェルの外に転げ出ることを防止できる。幅Ｘは、底面と平行ないずれかの切断面の上面視において、最小値が１５０μｍ以下であればよく、すべての切断面の上面視において最小値が１５０μｍ以下でなくてもよい。幅Ｘの最小値が１５０μｍ以下であるとは、第２側面が複数存在する場合は、いずれの第２側面についても、幅Ｘの最小値が１５０μｍ以下であることを意味する。ここで、マイクロウェルの中心Ｏは、マイクロウェルの底面の重心、すなわち、マイクロウェルの底面が形成する図形の重心であり、マイクロウェルの底面が円形の場合はその中心である。切断面の上面視におけるマイクロウェルの中心Ｏは、マイクロウェルの底面の重心を通る底面と垂直な線と切断面とが交わる点とする。

図７は、マイクロウェルを底面と平行な面で切断した切断面の上面視において、第２側面の幅Ｘが外縁側ほど広くなっている実施形態を示している。このような実施形態においては、例えば、幅Ｘ_２が１５０μｍより大きくても、幅Ｘの最小値、すなわち切断面の上面視においてマイクロウェルの底面と第２側面とが接する部分の幅Ｘ_１が１５０μｍ以下であれば、幅Ｘ_１の部分で細胞をブロックすることができるため、細胞をマイクロウェル内に安定に保持することができる。ここで、マイクロウェルの底面と第２側面と接する部分とは、切断面において接する部分をさす。また、幅Ｘ_１は、培養液の進入路および気泡抜けの機能を持たせる観点から、好ましくは１０μｍ以上である。好ましくはマイクロウェルの底面と第２側面とが実際に接する部分の幅も１０μｍ以上１５０μｍ以下であることが好ましい。

一方、図３〜６は、マイクロウェルを底面と平行な面で切断した切断面の上面視において、第２側面の幅が、外縁側ほど狭くなっている実施形態を示している。このような実施形態においては、マイクロウェルの切断面の上面視において、マイクロウェルの外周によって形成される図形における各第２側面の幅であって、マイクロウェルの中心から外周に向かう直線と直行する幅の最大値Ｘ、すなわち切断面においてマイクロウェルの底面と第２側面とが接する部分の幅Ｘが１５０μｍ以下となるように第２側面を形成することにより、第２側面によって形成される進入路に細胞が進入するのをブロックすることができるため、細胞をマイクロウェル内に安定に保持することができる。第２側面が複数存在する場合は、いずれの第２側面についても、幅Ｘが１５０μｍ以下となるように第２側面を形成することを意味する。図７の実施形態と同様に、好ましくはマイクロウェルの底面と第２側面とが実際に接する部分の幅も１５０μｍ以下であることが好ましい。

マイクロウェルの底面の形状は特に制限されず、第１側面および第２側面の数などによって左右されるが、好ましくは円状（円形、略円形、楕円形、略楕円形、および半円形を含む）であり、特に好ましくは円形である。例えば図７に示すように、第１側面と第２側面がそれぞれ８個ずつ存在するような実施形態においては、マイクロウェルの底面は、好ましくは略１６角形あるいは略円形である。

マイクロウェルの底面のサイズも特に制限されない。マイクロウェルの底面の面積は、好ましくは３ｍｍ^２以下、より好ましくは１ｍｍ^２以下、さらに好ましくは０．５ｍｍ^２以下であり、好ましくは０．０３ｍｍ^２以上である。マイクロウェルの底面が円形である場合、その直径（例えば、図４、図６および図８のＲ）は、好ましくは０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下である。好ましくは０．２５ｍｍ以上、より好ましくは０．２６ｍｍ以上、さらに好ましくは０．２７ｍｍ以上であり、好ましくは０．７ｍｍ未満、さらに好ましくは０．４５ｍｍ未満である。細胞培養容器により受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、円形の底面の直径は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいものであることが望ましい。

図４、図６および図８に示すようなマイクロウェルの垂直切断面において、底面と第１側面の接続部、底面と第２側面の接続部、およびマイクロウェルの開口端は、丸みを帯びていること、すなわち曲率を有することが好ましい。その場合、曲率は、それぞれ好ましくは０．０１ｍｍ以上、より好ましくは０．０２ｍｍ以上であり、好ましくは０．１ｍｍ以下、より好ましくは０．０７ｍｍ以下である。曲率を持たせることにより、気泡がより抜けやすくなることで作業性が改善すること、およびプラスチックによる射出成形加工が容易になり歩留まりが向上するなどの効果が期待できる。

マイクロウェルの第１側面および第２側面の表面粗さは、大きい値であると、顕微鏡で透過観察を行った画像を輪郭抽出処理に付す際に、傾斜面上の凹凸に起因して明瞭な輪郭が得られない恐れがあるため、可能な限り小さい値であることが好ましい。具体的には、最大高さＲｙ（粗さ曲線からその平均線の方向に基準長さだけを抜き取り、この抜き取り部分における山頂線と谷底線との間隔をいう）が１μｍ未満、特に０．５μｍ未満であることが好ましい。なお、傾斜面の表面粗さは、培養容器の鋳型を作製する際に磨き処理を施す等して、鋳型の加工精度を高めることにより小さくすることができる。

マイクロウェルの深さは、マイクロウェルの開口部から最深部までを垂直に測った深さ（図４、図６および図８のＬ）をいい、０．０５ｍｍ以上、好ましくは０．１ｍｍ以上であり、０．５ｍｍ以下、好ましくは０．４ｍｍ以下である。マイクロウェルの深さは、浅過ぎると、培養容器の輸送時や細胞の分裂時などに細胞が動き、細胞がマイクロウェルの範囲外に出てしまう恐れがあるため、確実に細胞をマイクロウェル内に保持できるように設定される。例えば、細胞をマイクロウェル内に保持するには、深さが細胞の最大径の１／３以上であることが好ましく、１／２以上であることがさらに好ましい。一方、深過ぎると、マイクロウェル内に培養液や細胞を導入することが難しくなるため、細胞をマイクロウェル内に保持しつつ、深過ぎない値になるよう適宜設定される。

マイクロウェルは、細胞培養容器の底部に、少なくとも１個形成され、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは８個以上が、近接して形成される。さらに近接していないマイクロウェルが別途形成されていてもよい。また、近接して形成されたマイクロウェルの群が、複数群配置されていてもよく、それらの群は互いに近接していなくてもよい。近接するマイクロウェル間のピッチは１ｍｍ以下である。ただし、上記ピッチは収容する細胞の種類に依存して異なる。上記のようなピッチでマイクロウェルを密に配置することにより、細胞を個別に管理しつつ多くの細胞を同時に培養でき、さらに顕微鏡の一視野に多くの細胞が入るため、一度に多くの細胞の画像を取得することができる。

細胞培養容器のサイズは、特に制限されないが、開口部が好ましくは円形で、開口幅（例えば、図２のｒ）が、好ましくは３０〜６０ｍｍ、特に３５ｍｍのものが用いられる。これは従来の細胞培養に用いられているシャーレと同等のサイズであり、汎用のシャーレから簡便に作製できること、および既存の培養装置等に適合しやすいことから、上記のようなサイズのものが好ましい。マイクロウェルは、細胞培養容器の底部に形成され、底部は通常平面上であり、細胞培養容器は、通常、その底部平面が水平となる状態で配置されて使用される。

１個または複数近接して形成されたマイクロウェルは、それらを囲む内壁（例えば、図１および図２の９）により、培養容器内のその他の部分と隔てられていてもよい。当該実施形態では、近接したマイクロウェル（細胞収容部）の群ごとに内壁で囲まれており、複数のマイクロウェルの群が細胞培養容器の底面に存在する場合は、群ごとに内壁で囲まれることが好ましい。通常、受精卵等の培養においては、培養容器に受精卵を含む培養液の液滴を形成し、液滴をオイルで覆うことにより培養液の乾燥が防止されている。１個または複数マイクロウェルをさらに内壁で囲むことにより、その内部に培養液を収容して安定なドロップを形成し、培養液の分散を防ぐことができる。培養液をミネラルオイル等のオイルで覆う場合も同様である。

本実施形態の細胞培養容器の材質は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。本実施形態の細胞培養容器は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。

本実施形態の細胞培養容器は、培養細胞の非特異的接着を防止し、また培養液のドロップが表面張力によって偏ることを防止する観点から、プラズマ処理などの表面親水化処理することが好ましい。製造後の容器に付着している菌数（バイオバーデン数）が１００ｃｆｕ／容器以下であることが好ましい。また、さらにγ線滅菌などの滅菌処理を施されていることがより好ましい。

本実施形態の細胞培養容器は、受精卵の発育を促進するような表面処理または表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞をあらかじめ培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。

培養対象となる細胞は、特に制限されないが、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）およびｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚および８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞および脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性または全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本実施形態において細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。

本実施形態の細胞培養容器は、好ましくは哺乳動物および鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。本実施形態の細胞培養容器は、ヒトの受精卵の培養に特に好適である。

通常、マイクロウェルを覆うように培養液１０を添加した後、培養液を覆うようにオイル１１を添加し、さらに培養液中に細胞１２を添加する。これらの作業は、通常ピペットやガラスキャピラリー等の器具を用いて実施される。本実施形態の細胞培養容器は、開口が大きいので、これらの操作を比較的容易に実施できる（図９）。

培養は、通常、細胞培養容器を培養細胞の発育および維持に必要なガスを含む環境雰囲気および一定の環境温度をもたらすインキュベータに入れることにより実施される。必要なガスには、水蒸気、遊離酸素（Ｏ_２）および二酸化炭素（ＣＯ_２）が含まれる。環境温度とＣＯ_２含有量を調節することにより、培養液のｐＨを一定時間内に安定させることができる。安定なＣＯ_２含有量と安定な温度により安定なｐＨが得られる。画像比較プログラムにより、培養中の細胞の画像を予め保存された画像と比較することにより、培養の際の温度、ガスおよび培養液などの培養条件を調節することもできる。

例えば受精卵を培養する場合には、通常、培養後に、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否かが判別される。判別は自動で行ってもよいし、顕微鏡等により手動で行ってもよい。培養細胞の自動判別においては、顕微鏡により取得された培養容器内の細胞の画像をＣＣＤカメラ等の検出装置によって撮像し、得られた像を輪郭抽出処理に付し、画像中の細胞に該当する部分を抽出し、抽出された細胞の画像を画像解析装置で解析することによりその質を判別することができる。画像の輪郭抽出処理については、例えば、特開２００６−３３７１１０に記載された処理を利用できる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

＜実施例１＞
図７および図８において、θ１が０°であり、θ２が３０°であり、円形の底面の直径が２８５ｍｍであり、深さが１６０ｍｍであり、第２側面の幅の最小値（図７のＸ_１）が、それぞれ１０μｍ、５０μｍ、１００μｍまたは１５０μｍであるマイクロウェルを有する細胞培養容器を作製した。

まず、培養液を分注した際に、マイクロウェル内に気泡が残りやすいかを、Ｎ＝２０回で評価した。その結果、Ｘ_１が１０μｍはほとんど気泡が残ったが、容器を叩くことで気泡を取り除くことができた。５０μｍのものは気泡が数回残ったが、それらも容器を数回たたくことで簡単に気泡を抜くことができた。残りの容器は気泡が残ることはなかった。

次に受精卵と同様のサイズである樹脂ビーズ（粒径１５０μｍ）をモデルとして、細胞をマイクロウェル内に安定的に保持できるか（細胞保持性）を確認した。マイクロウェルに培養液を分注後、さらに樹脂ビーズを添加し、震度４〜６の横揺れに相当する加速度をＪＩＳ６００６８−３−３に従って加えた後に、樹脂ビーズが保持されているか確認した。その結果、いずれのマイクロウェルについても問題なく保持できていた。

＜実施例２＞
実施例１と同様のマイクロウェルであって、ただし、Ｘ_１が２００μｍであるマイクロウェルを有する細胞培養容器を作製した。実施例１と同様に、培養液を分注後、さらに樹脂ビーズを添加し、震度４〜６の横揺れに相当する加速度をＪＩＳ６００６８−３−３に従って加えた後に、樹脂ビーズが保持されているか確認した。その結果、樹脂ビーズが何個かマイクロウェルから外に出てしまう場合があった。

＜実施例３＞
実施例１と同様のマイクロウェルであって、第１側面と第２側面を交互に、それぞれ２個ずつ、４個ずつ、８個ずつ、１２個ずつ、または１６個ずつ有し、θ１が０°であり、θ２が３０°であり、円形の底面の直径が２８５ｍｍであり、深さが１６０ｍｍであり、Ｘ_１が５０μｍであるマイクロウェルを有する細胞培養容器を作製し、気泡残りと細胞保持性を実施例１と同様に評価した。第２側面の数が増えるほど容易に液体が入ることが確認された。また細胞保持性も確認された。

ただし、第２側面を１６個有するマイクロウェルは、加工が困難であり成形精度が悪くなってしまったため、気泡が残りやすくなった。

１：細胞培養容器
２：底部
３：側壁
４：マイクロウェル
５：マイクロウェルの底面
６：第１側面
７：第２側面
８：マイクロウェルの底面に垂直な線
９：内壁
１０：培養液
１１：オイル
１２：細胞
ｒ：細胞培養容器の開口幅
Ｒ：マイクロウェルの底面の直径
Ｌ：マイクロウェルの深さ
θ１：第１側面の傾斜角度
θ２：第２側面の傾斜角度
Ｘ：第２側面の幅
Ｚ：マイクロウェル上面視における第２側面が占める面積

Claims (9)

1. 底部と側壁を有する細胞培養容器であって、
   底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
   マイクロウェルが、底面と第１側面と第２側面とを有し、
   第１側面は、マイクロウェルの底面に対して垂直に、または、底面に対して傾斜して形成され、
   第２側面は、マイクロウェルの底面に対して傾斜して形成され、
   マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第１側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第１側面とのなす角度をθ１とし、マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第２側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第２側面とのなす角度をθ２としたとき、θ１＜θ２であり、
   第１側面と第２側面のそれぞれが、マイクロウェルの底面に接している、細胞培養容器。
2. θ１が０°以上２０°以下であり、θ２が２５°以上４５°以下である、請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 第１側面と第２側面がマイクロウェルの外周方向に交互に存在し、第１側面と第２側面が４個以上１２個以下ずつ存在する、請求項１または２に記載の細胞培養容器。
4. マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅の最小値が１５０μｍ以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
5. マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅が外縁側ほど広くなっている、請求項４記載の細胞培養容器。
6. マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅の最大値が１５０μｍ以下であり、
   第２側面の幅が外縁側ほど狭くなっている、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
7. 底部と側壁を有する細胞培養容器であって、
   底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
   マイクロウェルが、底面と第１側面と第２側面とを有し、
   第１側面は、マイクロウェルの底面に対して垂直に、または、底面に対して傾斜して形成され、
   第２側面は、マイクロウェルの底面に対して傾斜して形成され、
   マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第１側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第１側面とのなす角度をθ１とし、マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第２側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第２側面とのなす角度をθ２としたとき、θ１＜θ２であり、
   第１側面と第２側面がマイクロウェルの外周方向に交互に存在し、第１側面と第２側面が４個以上１２個以下ずつ存在する、細胞培養容器。
8. 底部と側壁を有する細胞培養容器であって、
   底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
   マイクロウェルが、底面と第１側面と第２側面とを有し、
   第１側面は、マイクロウェルの底面に対して垂直に、または、底面に対して傾斜して形成され、
   第２側面は、マイクロウェルの底面に対して傾斜して形成され、
   マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第１側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第１側面とのなす角度をθ１とし、マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第２側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第２側面とのなす角度をθ２としたとき、θ１＜θ２であり、
   マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅の最小値が１５０μｍ以下である、細胞培養容器。
9. 底部と側壁を有する細胞培養容器であって、
   底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
   マイクロウェルが、底面と第１側面と第２側面とを有し、
   第１側面は、マイクロウェルの底面に対して垂直に、または、底面に対して傾斜して形成され、
   第２側面は、マイクロウェルの底面に対して傾斜して形成され、
   マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第１側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第１側面とのなす角度をθ１とし、マイクロウェルの底面に垂直でマイクロウェルの中心と第２側面とを通る切断面において、マイクロウェルの底面に垂直な線と第２側面とのなす角度をθ２としたとき、θ１＜θ２であり、
   マイクロウェルの底面と平行な面と交わる第２側面の幅の最大値が１５０μｍ以下であり、
   第２側面の幅が外縁側ほど狭くなっている、細胞培養容器。

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