JP3592811B2

JP3592811B2 - Low-temperature active alkaline protease, microorganism producing the same, and method for producing the alkaline protease

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Publication number: JP3592811B2
Application number: JP28043995A
Authority: JP
Inventors: 勝久佐伯; 光美奥田; 美喜雄高岩; 啓森; 徹小林; 進伊藤; ブイ．マガロネスマリエッタ
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2015-10-27
Also published as: JPH09121856A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く分布している。その応用範囲としては、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤あるいは消炎剤があり、多分野で盛んに利用されてきた。
【０００３】
その中で最も大量に工業生産され、市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、例えばアルカラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム（ノボ・ノルディスク社製）、マクサカル（ギスト・ブロケイデス社製）、ＡＰＩ−２１（昭和電工社製）、ブラップ（ヘンケル社製）及びプロテアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）などが知られている。
【０００４】
しかしながら、これらの大半は最適温度が高温側にあるため、水道水をそのまま用いて低温領域で衣料等の洗浄を行う場合には、その酵素特性が充分に発揮されているとは言いがたい。また、前述のプロテアーゼは、その応用分野のほとんどにおいて、体温、室温又は低温条件下で使用されるため、高温至適酵素の使用はなじまない。加えて、高温至適酵素を用いて高温処理工程を行うことは、省エネルギーの観点からも好ましいとは言えない。一方、低温至適プロテアーゼは、反応系に熱を加えられないようなケース、すなわちチーズの熟成や肉の軟化等の食品の改質に有効であると思われる。
【０００５】
近年、洗剤をはじめとしてプロテアーゼの商品への配合や工業的プロセスなどにおける利用が考えられているが、この場合、室温から低温領域で有効に作用する酵素を見出すことは、省エネルギー化に加えて酵素の機能を十分発揮させるうえで、必須の条件である。これまでに、寒冷地土壌等の寒冷環境に棲息する生物、海水あるいは冷蔵中のミルク等から分離されたプロテアーゼ生産菌及び生産されるプロテアーゼに関しては数多くの報告例がある。すなわち、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｎｏ．５４８株（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６巻，１１８５頁，１９７０年）、エシェリヒアフロインディ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｒｅｕｎｄｉｉ）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４巻，８７頁，１９７４年）、キサントモナスマルトフィラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）０４７／０８株（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７９巻，２５７頁，１９９１年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｔ１６が（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６巻，３３３頁，１９８３年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＦＴ３６株（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７１７巻，３７６頁，１９８２年）、シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）１４５−２株（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ．，３６巻，７頁，１９８２年）、アエロモナスサルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５３巻，２８９頁，１９８３年）、シュードモナスパウシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｕｃｉｎｏｍｏｂｉｌｉｓ），バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）（Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１巻，３７７頁，１９９１年）、ビブリオエスピー（Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．）ＳＡ１株（ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，４４巻，１５７頁，１９７８年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＮＣＤＯ２０８５株（Ｊ．ＤａｉｒｙＲｅｓ．，５３巻，４５７頁，１９８６年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｊ．ＤａｉｒｙＲｅｓ．，５３巻，９７頁，１９８６年）、シュードモナスフルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＧＲ８３株（Ｌｅｂｅｎｓｍ．−Ｗｉｓｓ．ｕ．−Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２３巻，１０６頁，１９９０年）、ペシロミセスマルクアンディ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｍａｒｑｕａｎｄｉｉ）（ＷＯ８８／０３９４８）及びキサントモナスエスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−１（特開平５−２１１８６８号）などの低温で生育できる微生物が種々のプロテアーゼを生産する。また、好冷細菌（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈ）が生産するプロテアーゼに関しては、Ｆａｉｒｂａｉｎらが要領よく総説にまとめている（Ｊ．ＤａｉｒｙＲｅｓ．，５３巻，１３９頁，１９８６年）。しかしこれらのプロテアーゼについても、低温域における作用は、必ずしも満足できるものではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、低温条件下においても高い活性を保持するプロテアーゼ、及びこれを生産する微生物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、斯かる問題点を解決するため、低温領域において十分作用するプロテアーゼを自然界に求め、探索してきた。その結果、茨城県水戸市の土壌から、２０℃という低温条件下においても良好な生育を示す細菌を分離し、これらの中で菌体外に、低温領域においても活性を有するプロテアーゼを分泌する微生物を見出し、更に得られたプロテアーゼは低温領域で優れた活性を有するだけでなく、アルカリ側に至適ｐＨを有するものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の酵素学的性質を有する低温活性アルカリプロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリプロテアーゼの製造法を提供するものである。
【０００９】
１）作用温度及び最適温度
０〜４０℃で作用し、最適温度は約３０℃にある。Ｃａ^２＋イオンが存在すると作用最適温度は４０℃に移行する。０℃（氷水中）においても最適温度活性値の約１５％の活性を保持する。
２）温度安定性
ｐＨ１０、１５分間の処理条件で３０℃まで安定であり、Ｃａ^２＋イオンが存在すると安定性が向上する。
３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ
作用ｐＨ範囲は５〜１２以上で、最適ｐＨは１１である。ｐＨ１２においても、最大活性値の８５％以上の活性を保持する。
４）ｐＨ安定性
２０℃、１５分間の処理条件でｐＨ５〜１２までの各ｐＨで安定である。
５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、約３７，５００である。
６）基質特異性
天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、アゾカゼイン、ヘモグロビン、ケラチン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン及びアゾアルブミンに対して作用する。
合成基質であるＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＭ−ｐＮＡ）、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）及びＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＬ−ｐＮＡ）（ここでＳｕｃはスクシニル基を、ｐＮＡはｐ−ニトロアニリニル基を示す）に対して作用し、ｐ−ニトロアニリンを遊離させる。
７）金属イオンの影響
Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋及びＨｇ^２＋イオンによって阻害される。
８）阻害剤
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及びキモスタチンによって阻害される。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸（ＰＣＭＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、５，５′−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチン及びホスホラミドンによって阻害を受けない。
９）界面活性剤の影響
アルカン硫酸ナトリウム（ＳＡＳ）、α−オレフィン硫酸ナトリウム（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム（ＥＳ）、ソフタノール７０Ｈ及びα−スルホ脂肪酸エステル（α−ＳＦＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ）に対しても安定である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の低温アルカリプロテアーゼは、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。
【００１１】
かかるアルテロモナス属に属する本発明プロテアーゼ生産菌としては、バチルス属に属し、上記の本発明プロテアーゼを生産する限り特に制限されないが、例えば次の分類学的性質を示すＫＳＭ−ＳＰ３６５９株が挙げられる。
【００１２】
本発明のプロテアーゼ生産菌の分離に用いられる培地を以下に示す。
【００１３】
使用培地の組成（重量％で表示）
培地１．ニュートリエントブロス，０．８；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地２．ニュートリエントブロス，０．８
培地３．ニュートリエントブロス，０．８；ゼラチン，２．０；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地４．バクトリトマスミルク，１０．５
培地５．ニュートリエントブロス，０．８；ＫＮＯ_３，０．１
培地６．バクトペプトン，０．７；ＮａＣｌ，０．５；ブドウ糖，０．５
培地７．ＳＩＭ寒天培地（栄研化学社製），指示量
培地８．ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製），指示量
培地９．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．５；可溶性澱粉，２．０；Ｋ_２ＨＰＯ_４，０．１；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地１０．Ｋｏｓｅｒの培地（栄研化学社製），指示量
培地１１．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地（栄研化学社製），指示量
培地１２．
（１）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；Ｎａ_２ＳＯ_４，０．１
（２）酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ，０．０５；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．００１；ＭｎＳＯ_４・４−６Ｈ_２Ｏ，０．００１；窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムを各々０．２５，０．２，０．１６，０．２％となるように、上記（１）及び（２）の培地に加えて用いた。
培地１３．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１４．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１５．尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量
培地１６．チトクロム・オキシダーゼ試験紙濾紙（日水製薬社製）
培地１７．３％過酸化水素水
培地１８．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．５；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；ブドウ糖，１．０；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２
培地１９．バクトペプトン，２．７；ＮａＣｌ，５．５；ブドウ糖，０．５；Ｋ_２ＨＰＯ_４，０．１；ブロムチモールブルー，０．０６；寒天末（和光純薬社製），１．５
培地２０．（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４，０．１；ＫＣｌ，０．０２；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２；酵母エキス，０．０５；糖１．０
培地２１．カゼイン，０．５；酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；ＫＨ_２ＰＯ_４，０．１；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５
【００１４】
ＫＳＭ−ＳＰ３６５９株の分類学的性質を以下に示す。
【００１５】
［分類学的性質］
（ａ）顕微鏡的観察結果：
菌体の大きさは、０．５〜０．８μｍ×１．５×６．０μｍの桿菌であり、周鞭毛を有し、運動性及び楕円形の胞子の形成が認められる。
（ｂ）グラム染色性：
陽性。
（ｃ）各種培地における育成状態：
（１）肉汁寒天平板培養（培地１）；
生育状態は良い。集落の周縁は葉状あるいは樹根状である。また、集落の色調は、黄色である。
（２）肉汁寒天斜面培養（培地１）；
生育する。
（３）肉汁液体培養（培地２）；
生育は良好である。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３）；
生育し、ゼラチンの液化が認められる。
（５）リトマスミルク培地（培地４）；
アルカリ化し、液化する。
（ｄ）生理学的性質
（１）硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）；
硝酸塩の還元は認められず、脱窒反応は不定である。
（２）ＭＲテスト（培地６）；
陰性。
（３）ＶＰテスト（培地６）；
陰性。
（４）インドールの生成（培地７）；
陰性。
（５）硫化水素の生成（培地８）；
陰性。
（６）澱粉の加水分解（培地９）；
陰性。
（７）クエン酸の利用（培地１０、１１）；
陰性。
（８）無機窒素源の利用（培地１２）；
アンモニウム塩及び硝酸塩の利用は認められない。
（９）色素の生成（培地１３、１４）；
生育するが、色素は産生しない。
（１０）ウレアーゼ（培地１５）；
陰性。
（１１）オキシダーゼ（培地１６）；
陽性。
（１２）カタラーゼ（培地１７）；
陽性。
（１３）生育の範囲（培地１８）；
生育の温度範囲は２０〜４０℃である。
生育のｐＨ範囲は７〜１２である。
（１４）酸素に対する態度（培地１９）；
好気的。
（１５）Ｏ−Ｆテスト（培地２０）；
酸化型。
（１６）糖の利用性；
Ｄ−ガラクトース、シュクロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、マルトース、ラフィノース、トレハロース、グリセリン及びメリビオースを利用することができる。
（１７）食塩含有培地における生育（培地１中）；
食塩濃度７％まで生育するが、１０％では生育できない。
（１８）カゼインの分解（培地２１）；
陽性。
【００１６】
以上の分類学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版を参照し、比較検討した結果、本菌株は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一種と判断された。
【００１７】
従って、本菌株をバチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ−ＳＰ３６５９と命名し、ＦＥＲＭＰ−１５１３６号として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００１８】
上記の菌株を用いて、本発明のプロテアーゼを得るには、培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。
【００１９】
培養に用いる培地中には、資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例えば炭素源としてグルコース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、マルトース、ラフィノース、トレハロース、グリセリン、メリビオースや資化しうる有機酸、例えばクエン酸などが挙げられる。また、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティプリカー、カザミノ酸、酵母エキス、フーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーンミール、綿実油粕やカルチベータなどの有機窒素源が有効である。更に、燐酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要とあれば、無機又は有機微量栄養素やビタミン類を培地中に適宜添加することができる。
【００２０】
培養温度は２０〜４０℃、特に２５〜３０℃が好ましく、ｐＨは６〜１２、特に８〜１０が好ましく、この条件下において通常３〜５日間で培養が完了する。
【００２１】
斯くして得られた培養液の中から目的の酵素であるアルカリプロテアーゼを採取するには、一般の酵素採取の手段に準じて行うことができる。すなわち、培養後、菌体を遠心分離又は濾過等の通常の分離手段により菌体を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて限外濾過あるいは沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一般的な手段、例えば、適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及びゲル濾過などを適宜組み合せることによって精製することができる。
【００２２】
斯くして得られる本発明低温アルカリプロテアーゼの酵素化学的性質について以下に説明する。
【００２３】
〔酵素活性測定法〕
カゼイン法；
カゼイン１％を含む５０ｍＭの各種緩衝液１ｍｌを１ｍｌの酵素溶液と混合し、３０℃、１５分間反応させた後、反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、３０℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５頁，１９５１年）によって測定した。
また、上記反応条件下において、１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００２４】
合成基質法；
０．９ｍｌの５５．５ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に５０ｍＭの各種合成基質溶液（ジメチルスルホキシドに溶解）０．０５ｍｌを混合し、３０℃で５分間保温した後、０．０５ｍｌの酵素液を加え３０℃で５分間反応させた。反応停止液（５％クエン酸）２ｍｌを加えた後、分光光度計を用いて直ちに４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。
酵素１単位（１Ｕ）は上記反応条件において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００２５】
〔酵素学的性質〕
（１）基質特異性：
５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に各種蛋白質を０．１％又は１％になるように加えた後、精製酵素を適当量添加して３０℃で１５分間反応を行った。カゼインを基質とした場合の分解活性を１００として、それぞれの基質に対する分解酵素を表１に示す。表１から明らかなように、本酵素は天然基質であるカゼイン、ジメチルカゼイン、アゾカゼイン、ヘモグロビン、ケラチン、ゼラチン、エラスチン、コラーゲン及びアゾアルブミンに対して作用するが、リボヌクレアーゼ、リゾチーム及びアルブミンには作用しなかった。
【００２６】
【表１】

【００２７】
また、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）が結合したオリゴペプチド−ｐ−ニトロアニリド（合成オリゴペプチド基質）を用いて、これらの分解活性を調べたところ、表２に示すように、Ｎ−スクシニル化したＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＭ−ｐＮＡ）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＬ−ｐＮＡ）に対して作用し、ｐ−ニトロアニリンの遊離が認められた。
【００２８】
【表２】

【００２９】
（２）作用ｐＨ及び至適ｐＨ：
各種緩衝液（５０ｍＭ）中に最終濃度０．９１％となるようにカゼインを加え、３０℃で１５分間反応を行い、各ｐＨでの活性を相対的に表した。図１から明らかなように、本プロテアーゼの至適ｐＨは１１付近にあると認められる。また、その作用ｐＨは、ｐＨ５〜１２以上と幅広く、ｐＨ１２においても最大活性の８５％以上の活性を保持している。尚、使用した各種緩衝液及びそのｐＨ範囲は次のとおりである。
【００３０】
酢酸緩衝液：ｐＨ５〜６
燐酸緩衝液：ｐＨ６〜８
ホウ酸緩衝液：ｐＨ８〜１０
炭酸緩衝液：ｐＨ９〜１１
燐酸緩衝液：ｐＨ１０〜１２
【００３１】
（３）ｐＨ安定性：
ブリットロビンソン緩衝液（５ｍＭ、各ｐＨ）中に本酵素を加え、２０℃で１５分間放置した。この処理液について、カゼインを基質として残存活性をｐＨ１０、３０℃で測定をした。その結果、図２に示すとおり、本酵素はｐＨ５〜１２の範囲で極めて安定であった。
【００３２】
（４）作用温度及び至適温度：
基質として０．９１％のカゼインを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）に本酵素を加え、１５分間各温度で反応を行った。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、本酵素の最適温度は３０℃であった。また、Ｃａ^２＋イオンが存在すると、最適温度は４０℃に移行し、Ｃａ^２＋イオン非存在下の最適温度に比べ、約２倍の活性促進が認められた。また、本酵素は０℃（氷水中）でも最適温度における活性の約１５％の活性を示し、低温条件下でも十分に作用することがわかる。
【００３３】
（５）温度安定性：
５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に本酵素を加え、各温度で１５分間熱処理した後、氷冷した。カゼインを基質として、残存活性を求めた。その結果を図４に示す。本酵素はＣａ^２＋イオン非存在下で３０℃で安定であり、Ｃａ^２＋イオンが存在すると、更に安定性が改善されることがわかる。
【００３４】
（６）分子量：
本酵素の分子量をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した。分子量マーカーには、低分子量用マーカーキット（ファルマシア社製）である、ホスホリラーゼ（分子量：９４，０００）、牛血清アルブミン（分子量：６７，０００）、卵白オボアルブミン（分子量：４３，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：３０，０００）、大豆トリプシンインヒビター（分子量：２０，１００）、α−ラクトアルブミン（分子量：１４，４００）を用いた。図５から明らかなように、本精製プロテアーゼ標品は、ＳＤＳ電気泳動的に単一であり、その分子量は約３７，５００と推定される。
【００３５】
（７）金属イオンの影響
各種金属塩が１ｍＭになるように添加した２０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に本酵素溶液を添加し、２０℃で２０分間放置した。その後、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）で適当に希釈を行い、残存活性を測定した。金属塩無添加系で同様に処理した酵素活性を１００％として処理群の残存活性を求めた。表３に示すように、本酵素活性は、Ｈｇ^２＋、Ｆｅ^２＋やＦｅ^３＋による阻害作用が認められる。
【００３６】
【表３】

【００３７】
（８）阻害剤の影響
２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７）に各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本酵素を添加し、２０℃で２０分間放置した。その後５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）で適当に希釈を行い、残存活性を測定した。結果を表４に示す。表４から、本プロテアーゼは、セリン酵素の阻害剤であるＰＭＳＦにより完全に阻害され、キレート剤であるＥＤＴＡやＥＧＴＡでも強い阻害を受けることから、金属依存性セリンプロテアーゼであると考えられる。
【００３８】
【表４】

【００３９】
（９）界面活性剤の影響
本酵素を、０．２％の界面活性剤を含有する５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）に加え、２０℃で２０分間放置した後、残存活性を測定した。結果を表５に示す。表５から、本酵素はＳＤＳ、ＡＯＳ、ＳＡＳ、ＥＳ、α−ＳＦＥ、ソフタノール７０ＨやＬＡＳ（それぞれ０．２％濃度）などの界面活性剤と長時間接触させてもほとんど失活せず、むしろ活性化することから強力な界面活性剤耐性を有していることがわかる。
【００４０】
【表５】

【００４１】
前述したように、低温至適を有するプロテアーゼに関しては、数多くの報告があり、その中には金属依存性セリンプロテアーゼについての報告もある。しかし、バチルス属細菌によって生産され、低温至適、高アルカリ至適を示し、界面活性剤に対して安定な金属セリン依存性プロテアーゼについての報告はないことから、本酵素は新しいタイプのプロテアーゼであると考えられる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼは、作用最適温度を低温領域に有し、種々の界面活性剤によってもほとんど阻害を受けず、また、酸性から高アルカリ溶液中で幅広く安定である。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として、低温下で有利に使用できるものである。また、低温条件下における、食肉の軟化あるいはチーズの熟成といった食品の改質にも有効である。また、本低温活性プロテアーゼ生産菌がバチルス属細菌の一種であることから、培養条件の検討、突然変異やホスト−ベクター系（ＥＫ系やＢＳ系）などの育種により著量の酵素を菌体生産することが可能になった。
【００４３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本願発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１
茨城県水戸市より採取した土壌サンプル約１ｇを生理食塩水（１０ｍｌ）に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理を行った後、以下に示す組成を有するプロテアーゼ生産判定プレートに塗抹して、２０℃で５〜７日間培養した。生育した集落の周囲にスキムミルクの分解によって生じた透明帯を指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。得られた分離株の中から、低温活性プロテアーゼ生産性を調べ、バチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株を選抜した。
【００４５】
【表６】
プロテアーゼ生産判定プレート（ｐＨ１０．０）
（成分）（配合量）
酵母エキス（ディフコ社製）２ｇ
燐酸１カリウム１ｇ
硫酸マグネシウム０．２ｇ
グルコース（別滅菌）５ｇ
ケラチン１０ｇ
カルボキシメチルセルロース５ｇ
寒天１５ｇ
炭酸ナトリウム（別滅菌）２ｇ
イオン交換水１０００ｍｌ
【００４６】
実施例２
実施例１で得られたバチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株を以下に示す液体培地で好気的に２０℃で２日間培養した。培養後、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分間）して得られた上清液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；２ｍＭＣａＣｌ_２含有）で５℃において一昼夜透析した。透析内液のプロテアーゼ活性を、カゼインを基質として２０℃で測定したところ（５０ｍＭ炭酸緩衝液中、ｐＨ１０）、約１．５Ｕ／ｌ培養液に相当するプロテアーゼの生産が認められた。
【００４７】
【表７】
液体培地（ｐＨ９．３）
（成分）（配合量）
ポリペプトンＳ１０ｇ
酵母エキス０．５ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ
ＭｇＳＯ_４０．２ｇ
グルコース（別滅菌）５ｇ
炭酸ナトリウム（別滅菌）２ｇ
イオン交換水１０００ｍｌ
【００４８】
実施例３
バチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株を実施例２の液体培地に接種し、２０℃で４０時間培養した。培養後、遠心分離して得られた上清液を限外濾過膜（分画分子量３，０００；アミコン社製）で濃縮した。この濃縮液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；２ｍＭＣａＣｌ_２含有）に対し５℃で一昼夜透析した。この透析内液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；２ｍＭＣａＣｌ_２含有）で平衡化したＤＥＡＥ−バイオゲルＡ（バイオラッド社製）のカラムを通過させ、その非吸着画分をプールした。再度、ＤＥＡＥ−バイオゲルＡのカラムを通過させて非吸着画分を限外濃縮した。この濃縮液を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５；２ｍＭＣａＣｌ_２含有）で平衡化したＣＭ−バイオゲルＡ（バイオラッド社製）のカラムに添着した後、０〜１００ｍＭ塩化カリウムを用いて濃度勾配溶出を行った（ｐＨ７．５；２ｍＭＣａＣｌ_２含有）。更に、活性画分を限外濾過膜上で約１ｍｌまで濃縮した後、平衡化したセファクリルＳ−２００スーパーファイン（ファルマシア社製）のカラムでゲルクロマトグラフィーを行い、得られた活性画分を最終精製酵素標品として使用した。この結果、本精製標品は約５４Ｕ／ｍｇタン白（仔牛血清アルブミン単位）の比活性を有していた。
得られた酵素は前記の酵素学的性質を有していた。
【図面の簡単な説明】
【図１】バチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株が産するプロテアーゼのｐＨ−活性曲線を示す図である。
【図２】バチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株が産するプロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】バチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株が産するプロテアーゼの温度−活性曲線を示す図である。
【図４】バチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株が産するプロテアーゼの温度安定性を示す図である。
【図５】バチルスエスピーＫＳＭ−ＳＰ３６５９株が産するプロテアーゼの分子量測定結果を示す図であり、（ａ）は分子量とＳＤＳ電気泳動距離の相関を示す図、（ｂ）は完全精製標品のＳＤＳ電気泳動写真（１２％アクリルアミドゲル）を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel alkaline protease, a microorganism producing the same, and a method for producing the alkaline protease.
[0002]
[Prior art]
Protease is a general term for a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds, and is widely distributed in microorganisms, animals and plants. Its application range is detergents for clothing, detergents for automatic dishwashers, contact lens cleaners, bath agents, exfoliating cosmetics, food modifiers (bread making, meat softening, seafood processing), beer There are fining agents, leather tanning agents, gelatin removers for photographic films, digestion aids and anti-inflammatory agents, and have been widely used in various fields.
[0003]
Among them, the proteases for detergents which are industrially produced in the largest quantities and have a large market scale are, for example, Alcalase, Sabinase, Durazyme (Novo Nordisk), Maxacal (Gist Brocades), API-21 ( Known are Showa Denko Co., Ltd., Blapp (Henkel) and Protease K (KAP; Kao).
[0004]
However, most of them have an optimum temperature on the high temperature side, and it is hard to say that the enzyme properties are sufficiently exhibited when washing clothing or the like in a low temperature region using tap water as it is. Moreover, since the above-mentioned proteases are used under the conditions of body temperature, room temperature or low temperature in most of the application fields, the use of high-temperature-optimized enzymes is not compatible. In addition, performing a high-temperature treatment step using a high-temperature-optimized enzyme is not preferable from the viewpoint of energy saving. On the other hand, the low-temperature-optimized protease is considered to be effective in the case where heat is not applied to the reaction system, that is, in the modification of food such as aging of cheese and tenderization of meat.
[0005]
In recent years, the use of detergents and other proteases in commercial products and in industrial processes has been considered. In this case, finding enzymes that work effectively in the range from room temperature to low temperature requires not only energy saving but also enzyme use. It is an indispensable condition to fully demonstrate the function of. To date, there have been many reports on protease-producing bacteria isolated from living organisms living in cold environments such as cold district soil, seawater or refrigerated milk, and proteases produced. In other words, Pseudomonas sp. (Pseudomonas sp.) No. 548 strain ( Agric. Biol. Chem., 36, 1185, 1970), Escherichia freundii ( Eur. J. Biochem. , 44, 87, 1974, xanthomonas Xanthomonas Xanthomonas X). Strain 047/08 ( FEMS Microbiol. Lett . , Vol . 79, p . 257, 1991), Pseudomonas fluorescens T16 was published in Appl. Environ. Pseudomonas fluorescens AFT36 strain ( Biochim. Bi) ophys. Acta, 717, pp. 376 pp., 1982), Pseudomonas sp. (Pseudomonas sp.) 145-2 strain (Microbios., 36, pp. 7, pp., 1982), Aeromonas salmonicida (Aeromonas salmonicida) (J. Appl. Bacteriol., 53, pp. 289 pp., 1983), Pseudomonas paucimobilis (Pseudomonas paucinomobilis), Bacillus sp. (Bacillus sp.) (J. Basic Microbiol., 31 , pp. 377 pp., 1991), Vibrio sp. (Vibrio sp. ) SA 1 strain (Antonie van Leeuwenhoek, 44, pp. 157 pp., 1978), pseudo Eggplant fluorescens (Pseudomonas fluorescens) NCDO 2085 strain (J. Dairy Res., 53, pp. 457 pp., 1986), Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) (J. Dairy Res ., 53 , pp. 97 pp., 1986 year), Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) GR83 shares (Lebensm.-Wiss. u.-Technol ., 23 , pp. 106 pp., 1990), Paecilomyces Marc Andy (Paecilomyces marquandii) (WO 88/03948) and Xanthomonas SP ( Xanthomonas sp. ) Microorganisms that can grow at low temperatures, such as S-1 (JP-A-5-212868), produce various proteases. The proteases produced by psychrotrophs are summarized in a comprehensive review by Fairbain et al . ( J. Dairy Res. , 53, 139, 1986). However, the action of these proteases in the low temperature range is not always satisfactory.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a protease that retains high activity even under low temperature conditions, and a microorganism that produces the protease.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve such a problem, the present inventors have naturally searched for and searched for a protease that works sufficiently in a low-temperature region. As a result, bacteria showing good growth under low temperature conditions of 20 ° C were isolated from soil in Mito City, Ibaraki Prefecture, and microorganisms secreting extracellularly active proteases even in the low temperature region among these bacteria Further, they have found that the obtained protease not only has excellent activity in the low-temperature region, but also has an optimum pH on the alkaline side, and has completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention provides a low-temperature active alkaline protease having the following enzymatic properties, a microorganism producing the same, and a method for producing the alkaline protease.
[0009]
1) Working temperature and optimum temperature 0-40 ° C, the optimum temperature is about 30 ° C. When Ca ²⁺ ions are present, the optimum temperature for operation shifts to 40 ° C. Even at 0 ° C (in ice water), the activity of about 15% of the optimum temperature activity value is maintained.
2) Temperature stability It is stable up to 30 ° C. under treatment conditions of pH 10 and 15 minutes, and the stability is improved when Ca ²⁺ ions are present.
3) Working pH and optimum pH
The working pH range is 5 to 12 or more, and the optimum pH is 11. Even at pH 12, the activity is maintained at 85% or more of the maximum activity value.
4) pH stability Stable at each pH from 5 to 12 under treatment conditions of 20 ° C. and 15 minutes.
5) Molecular weight The estimated molecular weight by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis is about 37,500.
6) Substrate specificity It acts on natural substrates such as casein, dimethyl casein, azocasein, hemoglobin, keratin, gelatin, collagen, elastin and azoalbumin.
Synthetic substrates Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA (Suc-AAPM-pNA), Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Suc-AAPF-pNA) and Suc-Ala-Ala-Pro- It acts on Leu-pNA (Suc-AAPL-pNA) (where Suc represents a succinyl group and pNA represents a p -nitroanilinyl group) to release p -nitroaniline.
7) Influence of metal ions ^Inhibited by Fe ²⁺ , Fe ³⁺ and Hg ²⁺ ions.
8) Inhibited by inhibitors EDTA, EGTA, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) and chymostatin. Dithiothreitol (DTT), p -chloromercurybenzoic acid (PCMB), N -ethylmaleimide (NEM), 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), bestatin, leupeptin, pepstatin and Not inhibited by phosphoramidon.
9) Effect of surfactant Sodium alkane sulfate (SAS), α-olefin sodium sulfate (AOS), sodium polyoxyethylene alkyl sulfate (ES), sophthanol 70H and α-sulfo fatty acid ester (α-SFE), sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium linear alkylbenzene sulfonate (LAS).
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The low-temperature alkaline protease of the present invention can be produced, for example, by culturing a protease-producing bacterium belonging to the genus Bacillus and collecting the bacterium from the culture.
[0011]
The protease-producing bacterium of the present invention belonging to the genus Alteromonas belongs to the genus Bacillus and is not particularly limited as long as the protease of the present invention is produced. For example, a KSM-SP3659 strain exhibiting the following taxonomic properties can be mentioned.
[0012]
The medium used for separating the protease-producing bacteria of the present invention is shown below.
[0013]
Composition of medium used (expressed in weight%)
Medium 1. Nutrient broth, 0.8; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1.5
Medium 2. Nutrient broth, 0.8
Medium 3. Nutrient broth, 0.8; gelatin, 2.0; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1.5
Medium 4. Bactri Thomas Milk, 10.5
Medium 5. Nutrient broth, 0.8; KNO ₃ , 0.1
Medium 6. Bactopeptone, 0.7; NaCl, 0.5; glucose, 0.5
Medium 7. 7. SIM agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 8. TSI agar medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium Bacto peptone, 1.5; yeast extract, 0.5; soluble _{_{starch, 2.0; K 2 HPO 4,}} 0.1; MgSO 4 · 7H 2 O, 0.02; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) , 1.5
Medium 10. 10. Koser's medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 11. Christensen's medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium
(1) Yeast extract, 0.05; glucose, 1.0; KH ₂ PO ₄ , 0.1; Na ₂ SO ₄ , 0.1
(2) Yeast extract, 0.05; glucose, 1.0; KH ₂ PO ₄ , 0.1; MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.02; CaCl ₂ .2H ₂ O, 0.05; FeSO _4. _{_{_{7H 2 O, 0.001; MnSO 4}}} · 4-6H 2 O, 0.001; as the nitrogen source, sodium nitrate, sodium nitrite, ammonium chloride and ammonium phosphate respectively 0.25,0.2,0 0.16 and 0.2% were used in addition to the above-mentioned media (1) and (2).
Medium 13. 13. King A medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 14. King B medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium 13. Urea medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), indicated amount medium Cytochrome oxidase test paper filter paper (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
Medium 17.3% aqueous hydrogen peroxide 18. Bacto peptone, 1.5; yeast _{_{extract, 0.5; KH 2 PO 4,}} 0.1; _{_{glucose, 1.0; MgSO 4 · 7H 2}} O, 0.02
Medium 19. Bactopeptone, 2.7; NaCl, 5.5; Glucose, 0.5; K ₂ HPO ₄ , 0.1; Bromthymol blue, 0.06; Agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 1.5
Medium 20. (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ , 0.1; KCl, 0.02; MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.02; yeast extract, 0.05;
Medium 21. Casein, 0.5; yeast extract, 0.05; _{_{glucose, 1.0; KH 2 PO 4,}} 0.1; MgSO 4 · 7H 2 O, 0.02; agar powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 .5
[0014]
The taxonomic properties of the KSM-SP3659 strain are shown below.
[0015]
[Taxonomic properties]
(A) Microscopic observation results:
Bacteria are rods of 0.5 to 0.8 μm × 1.5 × 6.0 μm, have periflagellate, and have motility and oval spore formation.
(B) Gram stainability:
Positive.
(C) Growth conditions in various media:
(1) gravy agar plate culture (medium 1);
The growing condition is good. The periphery of the village is leaf-like or tree-root-like. The color tone of the settlement is yellow.
(2) gravy agar slope culture (medium 1);
Grow.
(3) broth liquid culture (medium 2);
Growth is good.
(4) gravy gelatin stab culture (medium 3);
It grows and liquefaction of gelatin is observed.
(5) litmus milk medium (medium 4);
Alkaline and liquefied.
(D) physiological properties (1) reduction and denitrification of nitrate (medium 5);
No reduction of nitrate was observed, and the denitrification reaction was undefined.
(2) MR test (medium 6);
negative.
(3) VP test (medium 6);
negative.
(4) production of indole (medium 7);
negative.
(5) Production of hydrogen sulfide (medium 8);
negative.
(6) hydrolysis of starch (medium 9);
negative.
(7) Utilization of citric acid (medium 10, 11);
negative.
(8) Use of an inorganic nitrogen source (medium 12);
The use of ammonium salts and nitrates is not allowed.
(9) production of pigment (medium 13, 14);
It grows but does not produce pigment.
(10) urease (medium 15);
negative.
(11) oxidase (medium 16);
Positive.
(12) catalase (medium 17);
Positive.
(13) Growth range (medium 18);
The temperature range for growth is 20-40 ° C.
The pH range for growth is 7-12.
(14) Attitude toward oxygen (medium 19);
Aerobic.
(15) OF test (medium 20);
Oxidation type.
(16) availability of sugar;
D-galactose, sucrose, D-glucose, D-fructose, maltose, raffinose, trehalose, glycerin and melibiose can be used.
(17) growth in medium containing salt (in medium 1);
It grows up to a salt concentration of 7%, but cannot grow at 10%.
(18) Casein degradation (medium 21);
Positive.
[0016]
Based on the above examination on the taxonomic properties, the strain was compared with the eighth edition of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, and as a result, the strain was found to be Bacillus ( Bacillus). ) It was determined to be a genus.
[0017]
Therefore, this strain was named Bacillus sp. KSM-SP3659 and deposited as FERM P-15136 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0018]
In order to obtain the protease of the present invention using the above strains, the medium may be inoculated with the strains and cultured according to a conventional method.
[0019]
It is desirable that the medium used for the cultivation contain appropriate amounts of assimilable carbon and nitrogen sources. The carbon source and the nitrogen source are not particularly limited. Examples of the carbon source include glucose, galactose, fructose, sucrose, maltose, raffinose, trehalose, glycerin, melibiose, and assimilable organic acids such as citric acid. In addition, as a nitrogen source, corn gluten meal, soy flour, corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, fumamedia, meat extract, tryptone, soytone, polypeptone, soybean meal, organic nitrogen sources such as cottonseed oil cake and cultivator Is valid. Further, inorganic salts such as phosphates, magnesium salts, calcium salts, manganese salts, zinc salts, cobalt salts, sodium salts, potassium salts, and if necessary, inorganic or organic micronutrients and vitamins are appropriately added to the medium. can do.
[0020]
The cultivation temperature is preferably from 20 to 40 ° C., particularly preferably from 25 to 30 ° C., and the pH is preferably from 6 to 12, particularly preferably from 8 to 10, and culturing is usually completed under these conditions in 3 to 5 days.
[0021]
The alkaline protease, which is the target enzyme, can be collected from the culture solution obtained in this manner according to a general enzyme collection method. That is, after culturing, the cells are removed from the culture solution by ordinary separation means such as centrifugation or filtration to obtain a crude enzyme solution. This crude enzyme solution can be used as it is, but if necessary, it can be recovered by means such as ultrafiltration or precipitation, and then powdered using an appropriate method. In addition, a general means of enzyme purification, for example, appropriate cation exchange resin, anion exchange resin, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography and gel filtration can be appropriately combined by appropriately combining. Can be.
[0022]
The enzymatic properties of the low-temperature alkaline protease of the present invention thus obtained will be described below.
[0023]
(Enzyme activity measurement method)
Casein method ;
After mixing 1 ml of various 50 mM buffers containing 1% casein with 1 ml of the enzyme solution and reacting at 30 ° C. for 15 minutes, a reaction stop solution (0.11 M trichloroacetic acid-0.22 M sodium acetate-0.33 M acetic acid) ) 2 ml was added and left at 30 ° C for 20 minutes. Next, the mixture was filtered through filter paper (manufactured by Whatman, No. 2), and the protein hydrolyzate in the filtrate was analyzed by the Foreign-Lowry method (Lowry, OH et al., J. Biol. Chem. , 193, 265, 1951). Year).
Further, under the above reaction conditions, the amount of an enzyme that produces an acid-soluble protein hydrolyzate corresponding to 1 mmol of tyrosine per minute was defined as 1 unit (1 U).
[0024]
Synthetic substrate method ;
After mixing 0.05 ml of various 50 mM synthetic substrate solutions (dissolved in dimethyl sulfoxide) with 0.9 ml of 55.5 mM carbonate buffer (pH 10), keeping the mixture at 30 ° C. for 5 minutes, and adding 0.05 ml of the enzyme solution. The reaction was performed at 30 ° C. for 5 minutes. After adding 2 ml of a reaction stop solution (5% citric acid), the absorbance at 420 nm was immediately measured using a spectrophotometer, and the released p- nitroaniline was quantified.
One unit (1 U) of the enzyme was the amount of enzyme required to release 1 μmol of p -nitroaniline per minute under the above reaction conditions.
[0025]
(Enzymatic properties)
(1) Substrate specificity:
After various proteins were added to 50 mM carbonate buffer (pH 10) so as to be 0.1% or 1%, an appropriate amount of the purified enzyme was added, and the reaction was carried out at 30 ° C. for 15 minutes. Assuming that the degradation activity when using casein as a substrate is 100, the degrading enzymes for each substrate are shown in Table 1. As is clear from Table 1, the present enzyme acts on the natural substrates casein, dimethyl casein, azocasein, hemoglobin, keratin, gelatin, elastin, collagen and azoalbumin, but acts on ribonuclease, lysozyme and albumin. Did not.
[0026]
[Table 1]

[0027]
Further, p - using oligopeptide -p- nitroanilide which nitroaniline (pNA) is bound (synthetic oligopeptide substrates), was examined these degrading activity, as shown in Table 2, N - was succinylated Ala-Ala-Pro-Met-pNA (Suc-AAPM-pNA), Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Suc-AAPF-pNA), Ala-Ala-Pro-Leu-pNA (Suc-AAPL-pNA) And release of p- nitroaniline was observed.
[0028]
[Table 2]

[0029]
(2) Working pH and optimum pH:
Casein was added to various buffers (50 mM) to a final concentration of 0.91%, reacted at 30 ° C. for 15 minutes, and the activity at each pH was relatively expressed. As is clear from FIG. 1, the optimum pH of the present protease is found to be around 11. Further, its working pH is as wide as 5 to 12 or more, and at pH 12, it maintains an activity of 85% or more of the maximum activity. The various buffers used and their pH ranges are as follows.
[0030]
Acetate buffer: pH 5-6
Phosphate buffer: pH 6-8
Borate buffer: pH 8-10
Carbonate buffer: pH 9-11
Phosphate buffer: pH 10-12
[0031]
(3) pH stability:
The enzyme was added to a Brit Robinson buffer (5 mM, each pH) and left at 20 ° C. for 15 minutes. The residual activity of this treatment solution was measured at 30 ° C. and pH 10 using casein as a substrate. As a result, as shown in FIG. 2, the present enzyme was extremely stable in the pH range of 5 to 12.
[0032]
(4) Working temperature and optimum temperature:
The enzyme was added to a 50 mM borate buffer (pH 10) containing 0.91% casein as a substrate, and the reaction was carried out at each temperature for 15 minutes. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 3, the optimum temperature of the present enzyme was 30 ° C. In addition, when Ca ²⁺ ions were present, the optimum temperature shifted to 40 ° C., and the activity was promoted about twice as much as the optimum temperature in the absence of Ca ²⁺ ions. In addition, this enzyme shows an activity of about 15% of the activity at the optimum temperature even at 0 ° C. (ice water), which indicates that the enzyme works sufficiently even under low temperature conditions.
[0033]
(5) Temperature stability:
The enzyme was added to a 50 mM carbonate buffer (pH 10), heat-treated at each temperature for 15 minutes, and then cooled on ice. The residual activity was determined using casein as a substrate. The result is shown in FIG. This enzyme is stable at 30 ° C. in the absence of Ca ²⁺ ions, and the stability is further improved in the presence of Ca ²⁺ ions.
[0034]
(6) Molecular weight:
The molecular weight of this enzyme was measured by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight markers include a low molecular weight marker kit (Pharmacia), phosphorylase (molecular weight: 94,000), bovine serum albumin (molecular weight: 67,000), egg white ovalbumin (molecular weight: 43,000), carbonic Anhydrase (molecular weight: 30,000), soybean trypsin inhibitor (molecular weight: 20,100), and α-lactalbumin (molecular weight: 14,400) were used. As apparent from FIG. 5, the purified protease preparation is single by SDS electrophoresis, and its molecular weight is estimated to be about 37,500.
[0035]
(7) Influence of metal ions The present enzyme solution was added to 20 mM carbonate buffer (pH 10) to which various metal salts were added to 1 mM, and left at 20 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the mixture was appropriately diluted with a 50 mM carbonate buffer (pH 10), and the residual activity was measured. The residual activity of the treated group was determined by setting the enzyme activity treated in the same manner in the system without the metal salt as 100%. As shown in Table 3, the activity of the present enzyme is inhibited by Hg ²⁺ , Fe ²⁺ and Fe ³⁺ .
[0036]
[Table 3]

[0037]
(8) Influence of inhibitor Various inhibitors were added to a 20 mM phosphate buffer (pH 7) to a predetermined concentration, the enzyme was added, and the mixture was left at 20 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the mixture was appropriately diluted with a 50 mM carbonate buffer (pH 10), and the residual activity was measured. Table 4 shows the results. From Table 4, it is considered that this protease is a metal-dependent serine protease because it is completely inhibited by PMSF, which is a serine enzyme inhibitor, and is strongly inhibited by chelating agents EDTA and EGTA.
[0038]
[Table 4]

[0039]
(9) Influence of Surfactant The enzyme was added to 50 mM carbonate buffer (pH 10) containing 0.2% surfactant, left at 20 ° C. for 20 minutes, and the residual activity was measured. Table 5 shows the results. From Table 5, it can be seen that this enzyme hardly deactivates even after prolonged contact with a surfactant such as SDS, AOS, SAS, ES, α-SFE, sophthanol 70H or LAS (each having a concentration of 0.2%). The activation indicates that it has strong surfactant resistance.
[0040]
[Table 5]

[0041]
As described above, there are many reports on proteases having a low-temperature optimum, including a report on metal-dependent serine protease. However, there is no report on a metal serine-dependent protease that is produced by Bacillus bacteria, exhibits low-temperature optimality, high-alkaline optimality, and is stable to detergents. it is conceivable that.
[0042]
【The invention's effect】
The protease of the present invention has an optimum temperature of action in a low temperature range, is hardly inhibited by various surfactants, and is widely stable in acidic to highly alkaline solutions. Therefore, the present enzyme can be advantageously used at a low temperature as a component of a detergent composition. It is also effective for modifying foods such as softening of meat or aging of cheese under low temperature conditions. In addition, since this low-temperature-active protease-producing bacterium is a kind of Bacillus bacterium, a considerable amount of enzyme is produced by examination of culture conditions, mutation, or breeding of host-vector system (EK system or BS system). It became possible to do.
[0043]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0044]
Example 1
About 1 g of a soil sample collected from Mito City, Ibaraki Prefecture was suspended in physiological saline (10 ml), heat-treated at 80 ° C. for 10 minutes, and then smeared on a protease production determination plate having the following composition, and then spread at 20 ° C. For 5 to 7 days. Protease-producing bacteria were isolated around the grown colonies using the zona pellucida produced by the decomposition of skim milk as an indicator. From the obtained isolates, the low temperature active protease productivity was examined, and Bacillus sp. KSM-SP3659 strain was selected.
[0045]
[Table 6]
Protease production determination plate (pH 10.0)
(Components) (Blending amount)
Yeast extract (Difco) 2g
Potassium phosphate 1g
Magnesium sulfate 0.2g
Glucose (separate sterilization) 5g
Keratin 10g
5g carboxymethylcellulose
Agar 15g
Sodium carbonate (separate sterilization) 2g
Ion exchange water 1000ml
[0046]
Example 2
The Bacillus sp. KSM-SP3659 strain obtained in Example 1 was aerobically cultured in the following liquid medium at 20 ° C. for 2 days. After the culture, the supernatant obtained by centrifugation (12,000 × g, 20 minutes) was dialyzed overnight at 5 ° C. against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5; containing 2 mM CaCl ₂ ). When the protease activity of the inner dialysis solution was measured at 20 ° C. using casein as a substrate (in a 50 mM carbonate buffer, pH 10), production of a protease equivalent to about 1.5 U / l of the culture solution was observed.
[0047]
[Table 7]
Liquid medium (pH 9.3)
(Components) (Blending amount)
Polypeptone S 10g
Yeast extract 0.5g
KH ₂ PO ₄ 1g
MgSO ₄ 0.2g
Glucose (separate sterilization) 5g
Sodium carbonate (separate sterilization) 2g
Ion exchange water 1000ml
[0048]
Example 3
Bacillus sp. KSM-SP3659 strain was inoculated into the liquid medium of Example 2 and cultured at 20 ° C. for 40 hours. After the culture, the supernatant obtained by centrifugation was concentrated with an ultrafiltration membrane (molecular weight cut-off 3,000; manufactured by Amicon). This concentrated solution was dialyzed overnight at 5 ° C. against a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5; containing 2 mM CaCl ₂ ). The dialysate was passed through a column of DEAE-Biogel A (manufactured by Bio-Rad) equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, containing 2 mM CaCl ₂ ), and the non-adsorbed fraction was pooled. Again, it passed through the column of DEAE-Biogel A, and the non-adsorbed fraction was ultra-concentrated. This concentrated solution was applied to a column of CM-Biogel A (manufactured by Bio-Rad) equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5; containing 2 mM CaCl ₂ ), and then concentrated using 0 to 100 mM potassium chloride. gradient elution was performed (pH7.5; 2mM CaCl ₂ containing). Further, the active fraction was concentrated to about 1 ml on an ultrafiltration membrane, and then subjected to gel chromatography using an equilibrated Sephacryl S-200 Superfine (manufactured by Pharmacia) column. It was used as a purified enzyme preparation. As a result, the purified sample had a specific activity of about 54 U / mg protein (calf serum albumin unit).
The resulting enzyme had the enzymatic properties described above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a pH-activity curve of a protease produced by Bacillus sp. KSM-SP3659 strain.
FIG. 2 is a view showing the pH stability of a protease produced by Bacillus sp. KSM-SP3659 strain.
FIG. 3 is a view showing a temperature-activity curve of a protease produced by Bacillus sp. KSM-SP3659 strain.
FIG. 4 is a diagram showing the temperature stability of protease produced by Bacillus sp. KSM-SP3659 strain.
5 shows the results of measuring the molecular weight of the protease produced by Bacillus sp. KSM-SP3659 strain, (a) showing the correlation between the molecular weight and the SDS electrophoresis distance, and (b) showing the SDS of a completely purified sample. It is a figure which shows an electrophoresis photograph (12% acrylamide gel).

Claims

A cold-active alkaline protease with the following enzymatic properties:
1) Working temperature and optimum temperature 0-40 ° C, the optimum temperature is about 30 ° C. When Ca ²⁺ ions are present, the optimum temperature for operation shifts to 40 ° C. Even at 0 ° C (in ice water), the activity of about 15% of the optimum temperature activity value is maintained.
2) Temperature stability
It is stable up to 30 ° C. under the treatment conditions of pH 10 and 15 minutes, and the stability is improved in the presence of Ca ²⁺ ions.
3) Working pH and optimum pH
The working pH range is between 5 and 12 and the optimum pH is 11. Even at pH 12, the activity is maintained at 85% or more of the maximum activity value.
4) pH stability Stable at each pH from 5 to 12 under treatment conditions of 20 ° C. and 15 minutes.
5) Molecular weight The estimated molecular weight by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis is about 37,500.
6) Substrate specificity It acts on natural substrates such as casein, dimethyl casein, azocasein, hemoglobin, keratin, gelatin, collagen, elastin and azoalbumin.
Synthetic substrates Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA and Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA (where Suc is a succinyl group, pNA is p -nitroanilinyl group) to liberate p -nitroaniline.
7) Influence of metal ions ^Inhibited by Fe ²⁺ , Fe ³⁺ and Hg ²⁺ ions.
8) Inhibited by inhibitors EDTA, EGTA, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) and chymostatin. Dithiothreitol (DTT), p -chloromercurybenzoic acid (PCMB), N -ethylmaleimide (NEM), 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), bestatin, leupeptin, pepstatin and Not inhibited by phosphoramidon.
9) Influence of surfactant Sodium alkane sulfate (SAS), α-olefin sodium sulfate (AOS), polyoxyethylene alkyl sodium sulfate (ES), sophthanol 70H, α-sulfo fatty acid ester (α-SFE), sodium dodecyl sulfate Extremely stable against (SDS) and sodium linear alkyl benzene sulfonate (LAS).

The microorganism producing a low-temperature-active alkaline protease according to claim 1, which is named Bacillus sp. KSM-SP3659 and deposited as FERM P-15136.

The method for producing a low-temperature alkaline protease according to claim 1, wherein the microorganism according to claim 2 is cultured, and the low-temperature alkaline protease is collected from the culture.